...Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis I THEORETISCHER TEIL 1 1. Einleitung 1 1.1 Zur...

Analytik und Vorkommen von Paralytic Shellfish Poisoning

(PSP)-Toxinen in marinen Organismen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr.rer.nat.)

vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät

der Friedrich-Schiller-Universität Jena

von

Dipl. Troph. Elke Jaime

geboren am 27.05.1975 in Dresden

Gutachter:

1. Prof. Dr. Bernd Luckas (Friedrich-Schiller-Universität Jena)

2. Prof. Dr. Matthias Hamburger (Friedrich-Schiller-Universität Jena)

3. Prof. Dr. Dr. Hans Steinhart (Universität Hamburg)

Tag der Doktorprüfung: 05. April 2003

Tag der öffentlichen Verteidigung: 12. Mai 2003

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

I THEORETISCHER TEIL 1

1. Einleitung 1

1.1 Zur Problematik der Algentoxine 1

1.1.1 PSP-Toxine 3

1.1.1.1 Vorkommen 3

1.1.1.2 Chemische Struktur, Eigenschaften und Biosynthese 6

1.1.1.3 Toxizität 9

1.1.1.4 Gesetzliche Regelungen 12

1.2 Analytische Erfassung von PSP-Toxinen 13

1.2.1 Nichtchromatographische Bestimmungsverfahren 14

1.2.1.1 Bioassays 14

1.2.1.2 Immunologische Assays 15

1.2.1.3 Fluorimetrische Verfahren 16

1.2.1.4 Kapillarelektrophorese 17

1.2.2 Chromatographische Bestimmungsverfahren 19

1.2.2.1 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenpaarchromatographie 19

1.2.2.2 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie 20

1.2.2.3 Detektion nach HPLC-Trennung 21

1.2.2.3.1 Fluorimetrische Detektion 21

1.2.2.3.2 Elektrochemische Detektion 22

1.2.2.3.3 Massenspektrometrische Detektion 23

2. Zielstellung 27

Inhaltsverzeichnis II

II EXPERIMENTELLER TEIL 29

3. Optimierung eines ionenpaarchromatographischen Verfahrens zur Bestimmung von PSP-Toxinen 29

3.1 Analytische Ausgangslage 29

3.2 Optimierung der Methode nach Thielert et al. 29

4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens zur Bestimmung von PSP-Toxinen 32

4.1 Wahl der stationären und mobilen Phase 32

4.2 Einfluß verschiedener Elutionsbedingungen auf die Toxintrennung 33

4.2.1 Variation der Pufferstärke 33

4.2.2 Variation der Art des Puffers 34

4.2.3 Variation des pH-Wertes 35

4.2.4 Einfluß organischer Modifier 37

4.2.5 Optimierung der Trennleistung durch Gradientenelution 38

4.3 Detektion 40

4.4 Linearität und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzdetektion 41

4.5 Anwendbarkeit des entwickelten HPLC-Verfahrens zur PSP-Bestimmung aus komplexen Matrizes 42

4.5.1 Methodenvergleich bei der Bestimmung von PSP-Toxinen aus marinen Organismen 42

4.5.2 Gewinnung von PSP-Toxinen aus kontaminiertem biologischen Material 44

4.6 Diskussion der Ergebnisse 46

Inhaltsverzeichnis III

5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS 48

5.1 Einführende Untersuchungen zur massenspektrometrischen Detektion von PSP-Toxinen 48

5.2 Applikation der entwickelten HPLC-Trennmethode in der Massenspektrometrie 51

5.3 Modifizierung der LC/MS-Methode 52

5.3.1 Substitution des Puffersalzes 52

5.3.2 Verwendung organischer Modifier 53

5.4 Linearität und Nachweisempfindlichkeit der MS-Detektion 55

5.5 Anwendung der entwickelten LC/MS-Kopplung 55

5.6 Entwicklung einer schnellen Screening-Methode 59

5.7 Diskussion der Ergebnisse 62

6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen in kommerziell genutzten Muschel- und Schneckenarten der Nordsee 63

6.1 Einleitung 63

6.2 In vivo Fütterungsversuch 65

6.2.1 Versuchsdurchführung 65

6.2.1.1 Wahl der Algen- und Muschelspezies 65

6.2.1.2 Kultivierung der Algenspezies 66

6.2.1.3 Fütterungsregime und Entnahme der Schalentiere 66

6.2.1.4 PSP-Toxinanalyse der Muschel- und Schneckenproben 67

Inhaltsverzeichnis IV

6.2.2 Ergebnisse und Diskussion 67

6.2.2.1 Toxizität und Toxinprofil von Alexandrium fundyense 67

6.2.2.2 Speziesspezifische Toxinaufnahme 68

6.2.2.3 Akkumulation und Verteilung der PSP-Toxine im Organismus 69

6.2.2.4 Detoxifikation 74

6.2.2.5 Änderungen der PSP-Profile 76

6.2.2.6 Individuelle Variabilitäten 81

6.3 In vitro Inkubationsversuch 83

6.3.1 Versuchsdurchführung 83

6.3.2 Ergebnisse und Diskussion 84

6.3.2.1 Metabolisierung der PSP-Toxine 84

6.3.2.2 Entwicklung der PSP-Profile 89

6.3.2.3 Entwicklung der Gesamt-PSP-Gehalte 91

6.4 Schlußfolgerungen und Ausblick 93

III ZUSAMMENFASSUNG 96

IV LITERATURVERZEICHNIS 101

V ANHANG 115

Verzeichnis der Abbildungen V

Verzeichnis der Abbildungen

Abb. 1: Weltweite Verbreitung von PSP-Toxinen (schwarz markierte Regionen) 4

Abb. 2: Verschiedene PSP-Produzenten 5

Abb. 3: Chemische Struktur von Saxitoxin und verwandten Verbindungen 7

Abb. 4: Übersicht der in vivo Transformationen von PSP-Toxinen in Schalentieren 8 (vgl. Abb. 3 für individuelle Toxinstruktur). 1. Epimerisierung von β zu α- Epimeren; 2. Reduktion: (a) von GTX1/4 und Neo zu GTX2/3 und STX, (b) von GTX1-4 zu STX und Neo; 3. Saure Hydrolyse; 4. Enzymatische Hydrolyse: Umwandlung von N-Sulfocarbamoyl- (4a) oder Carbamoyltoxinen (4b) zu Decarbamoyltoxinen

Abb. 5: Modell zur Bindung von PSP-Toxinen an die Oberfläche erregbarer 11 Nervenmembranen

Abb. 6: Oxidation von Saxitoxin 16

Abb. 7: Prinzip der Kapillarzonenelektrophorese 18

Abb. 8: Prinzip eines FAB-Interfaces für die LC/MS-Kopplung 24

Abb. 9: Prinzip eines ESI-Interfaces für die LC/MS-Kopplung 25

Abb. 10: Optimierung der PSP-Bestimmungsmethode: Chromatogramme 30 einer PSP-Standardlösung 1. Thielert-Methode

2. optimierte Methode

Abb. 11: Reproduzierbarkeit der GTX1/GTX4-Trennung anhand der 31 Retentionszeiten nach 5facher Injektion in Folge (MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung)

Abb. 12: Einfluß der Pufferkonzentration bei pH 6,9 auf die Elution von 34 1. STX und 2. GTX2/GTX3 (GTX2/GTX3-Standard enthält Spuren dcGTX2/dcGTX3, vorderer Peak) 1. A = 450 mmol/L Ammoniumacetat, B = 350 mmol/L, C = 300 mmol/L,

D = 250 mmol/L 2. A = 150 mmol/L Ammoniumacetat, B = 50 mmol/L, C = 20 mmol/L

Abb. 13: Einfluß der Pufferart auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 35 (kleinerer Peak C1) bei pH 6,9 1. A = 300 mmol/L Ammoniumacetat, B = 300 mmol/L Ammoniumformiat

C = 300 mmol/L Trifluoressigsäure 2. A = 35 mmol/L Ammoniumacetat, B = 35 mmol/L Ammoniumformiat

C = 35 mmol/L Trifluoressigsäure

Abb. 14: Einfluß des pH-Wertes auf die Elution von 1. STX mit 300 mmol/L 36 Ammoniumacetat und 2. C1/C2 mit 20 mmol/L Ammoniumacetat 1. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5; D = pH 9,5 2. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5

Verzeichnis der Abbildungen VI

Abb. 15: Einfluß von Acetonitril bei pH 6,9 auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 37 1. A = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v) B = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril 2. A = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v)

B = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril (keine Elution von C2 nach 60 min)

Abb. 16: HPLC-Chromatogramm der Alge Alexandrium fundyense, 39 dotiert mit einem PSP-Standardgemisch

Abb. 17: Korrelation der Gesamt-PSP-Gehalte, gemessen mit der optimierten 43 Thielert- und der neu entwickelten Methode

Abb. 18: Korrelation der Gehalte an Neo, gemessen mit der optimierten 43 Thielert- und der neu entwickelten Methode

Abb. 19: Massenspektren von STX, GTX2 und GTX3 (nach „flow injection analysis“) 49

Abb. 20: Abhängigkeit der Signalintensität von der Pufferkonzentration (13,4 ng 50 GTX1 bzw. 15,0 ng dcSTX injiziert)

Abb. 21: LC/MS-Chromatogramm einer PSP-Mischstandardlösung im TIC-Mode 51 (oben); GTX2, Neo und STX extrahiert (SIM-Mode)

Abb. 22: Einfluß der Pufferart auf die Signalintensität bei gleicher injizierter 52 Toxinmenge A = Ammoniumacetat B = Ammoniumformiat

Abb. 23: Einfluß von Acetonitril auf die Signalintensität bei gleicher injizierter 53 Toxinmenge A = mobile Phase mit 30% ACN (vgl. Tab. 13)

B = mobile Phase ohne ACN (vgl. Tab. 6)

Abb. 24: HPLC/Fluoreszenz/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen (Standardgemisch): 56 C1, C2, GTX1 (34,4 ng), GTX4 (17,8 ng), dcGTX2/3, GTX2 (57,4 ng), GTX3 (20,8 ng), Neo (69,6 ng), dcSTX (50,0 ng), STX (79,8 ng). 1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm

Abb. 25: HPLC/FLD/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen in Muscheln (Mytilus 57 chilensis)

1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm

Abb. 26: HPLC-System mit Ionenaustauschersäulen und paralleler MS-Detektion bzw. 58 elektrochemischer Oxidation mit Fluoreszenzdetektion und optionalem Fraktionssammler

Abb. 27: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Standardlösung unter Anwendung 60 der LC/MS-Screening-Methode (SIM-Mode)

Abb. 28: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Muschelprobe unter Anwendung 61 der LC/MS-Screening-Methode (TIC- und SIM-Mode)

Abb. 29: Mittleres Toxinprofil von A. fundyense (links), Entwicklung des Toxinprofils 68 von A. fundyense während der Fütterung (rechts)

Abb. 30: Gesamt-PSP-Gehalte während der Fütterung und der Entgiftung (E), rechts: 70 vergrößerte Darstellung und gesetzlicher Grenzwert

Abb. 31: PSP-Gehalte der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe 73

Abb. 32: Prozentualer Anteil der einzelnen Kompartimente am Gesamt-PSP-Gehalt 75 der Tiere während der gesamten Versuchsdauer (E = Entgiftungsperiode)

Verzeichnis der Abbildungen VII

Abb. 33: PSP-Profile der Einzelgewebe von M. edulis und C. gigas exemplarisch 77 für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)

Abb. 34: PSP-Profile der Einzelgewebe von C. edule und L. littorea exemplarisch 78 für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)

Abb. 35: Variationen der Gesamt-PSP-Gehalte der untersuchten Spezies (links) und 82 der Toxingehalte der einzelnen Kompartimente am Bsp. von M. edulis (rechts) in der 6. Fütterungswoche ―— Median, ----- Mittelwert

Abb. 36: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX1-4, Neo, STX im Verdauungs- 85 gewebe (links) und im Muskelgewebe (rechts)

Abb. 37: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX2, GTX3, C1, C2 im Verdauungs- 87 gewebe (links) und im Muskelgewebe (rechts)

Abb. 38: Toxinprofile von A. fundyense und vom Muskelgewebe einiger Mollusken 89 nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)

Abb. 39: Toxinprofile von A. fundyense und vom Verdauungsgewebe einiger 90 Mollusken nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)

Abb. 40: Veränderung des Gesamt-PSP-Gehaltes während der Inkubation in 91 Abhängigkeit von der Tierspezies (links: Verdauungsgewebe, rechts: Muskelgewebe)

Verzeichnis der Tabellen VIII

Verzeichnis der Tabellen

Tab. 1: Ausgewählte Vergiftungen durch Algentoxine 2

Tab. 2: LD50-Werte von PSP-Toxinen nach einmaliger oraler Verabreichung 10

Tab. 3: Toxizitäten der PSP-Toxine 12

Tab. 4: Relative Fluoreszenzintensitäten und relative Toxizitäten der PSP-Toxine 17

Tab. 5: Chromatographische Bedingungen der optimierten Thielert-Methode 31

Tab. 6: Chromatographische Bedingungen der neu entwickelten HPLC-Methode 39 auf Basis von Ionenaustauschern zur Bestimmung von PSP-Toxinen

Tab. 7: LODs (S/N = 3:1) bei elektrochemischer Oxidation im Vergleich zur 41 chemischen Oxidation einer konventionellen HPLC-Methode

Tab. 8: Linearität der Fluoreszenzdetektion nach elektrochemischer Oxidation 41 (5 Kalibrierpunkte pro Toxin)

Tab. 9: Korrelationskoeffizienten für den Vergleich der optimierten Thielert- 42 Methode mit der neu entwickelten PSP-Methode (alle Proben sowie aufgeteilt in Algen- und Muschelproben)

Tab. 10: Wiederfindungsraten und relative Standardabweichungen von in 44 Ammoniumacetat eingedampften Lösungen von Toxinstandards (3fach- Wiederholung)

Tab. 11: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP- 48 Toxinen

Tab. 12: Massenspektrometrische Detektion der PSP-Toxine 50

Tab. 13: Chromatographische Bedingungen für die Bestimmung von PSP-Toxinen 54 mittels MS-Detektion

Tab. 14: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP- 54 Toxinen bei 30% Acetonitril im Eluenten

Tab. 15: Linearität und LODs (S/N = 3:1) der MS-Detektion von PSP-Toxinen 55 (5 Kalibrierpunkte)

Tab. 16: Anteil der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe am Gesamtgewicht 71

Verzeichnis der Tabellen im Anhang

Tab. 17: Einzelergebnisse des Vergleiches zwischen der optimierten Thielert- und 118 der neu entwickelten HPLC-Methode (in ng/µL Probenextrakt)

Tab. 18-43: Einzeldaten des in vivo Fütterungsexperimentes 122

Tab. 44-46: Einzeldaten des in vitro Inkubationsversuches 132

Verzeichnis der Abkürzungen IX

Verzeichnis der Abkürzungen

Allgemeine Abkürzungen

Abb. Abbildung

ACN Acetonitril

AOAC Association of Official Analytical Chemists

API Atmospheric Pressure Ionisation

ASP Amnesic Shellfish Poisoning

BCR Referenzbüro der Europäischen Gemeinschaften

CE Kapillarelektrophorese

CZE Kapillarzonenelektrophorese

DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning

E Entgiftung

ELCD Elektrochemischer Detektor

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ESI Electrospray Ionisation

FAB-MS Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

FIA Flow Injection Analysis

FLD Fluoreszenzdetektor

GTX Gonyautoxine

HP Hepatopankreas

HPLC High Performance Liquid Chromatography

ID Innendurchmesser

LD50 Letale Dosis für 50% der Versuchstiere

LC Liquid Chromatography (Flüssigkeitschromatographie)

LOD Limit of detection (Detektionsgrenze)

MD Mitteldarm

MS Massenspektrometrie

MU Mouse Unit (Mauseinheit)

m/z Massenzahl

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Kernspinresonanz) Spectroscopy

NSP Neurotoxic Shellfish Poisoning

N-1-H-Toxine STX, GTX2, GTX3, dcSTX, dcGTX2, dcGTX3, B1, C1, C2

N-1-OH-Toxine Neo, GTX1, GTX4, dcNeo, dcGTX1, dcGTX4, B2, C3, C4

PBS-Puffer Phosphate buffer salin

Verzeichnis der Abkürzungen X

PSP Paralytic Shellfish Poisoning

rel. E. relative Einheiten

RP Reversed Phase (Umkehrphase)

SIM Single Ion Monitoring

Tab. Tabelle

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

TIC Total Ion Current

UV Ultraviolett

Wo Woche

Abkürzungen der PSP-Toxine

Gebräuchlicher Name Chemische Bezeichnung

STX Saxitoxin Saxitoxin

Neo Neosaxitoxin N-1-Hydroxysaxitoxin

GTX1 Gonyautoxin 1 C-11α-Hydroxyneosaxitoxinsulfat

GTX2 Gonyautoxin 2 C-11α-Hydroxysaxitoxinsulfat

GTX3 Gonyautoxin 3 C-11β-Hydroxysaxitoxinsulfat

GTX4 Gonyautoxin 4 C-11β-Hydroxyneosaxitoxinsulfat

dcSTX Decarbamoylsaxitoxin

dcNeo Decarbamoylneosaxitoxin

dcGTX1 Decarbamoyl-C-11α-Hydroxyneosaxitoxinsulfat

dcGTX2 Decarbamoyl-C-11α-Hydroxysaxitoxinsulfat

dcGTX3 Decarbamoyl-C-11β-Hydroxysaxitoxinsulfat

dcGTX4 Decarbamoyl-C-11β-Hydroxyneosaxitoxinsulfat

B1 N-21-Sulfosaxitoxin

B2 N-21-Sulfoneosaxitoxin

C1 N-21-Sulfo-C-11α-Hydroxysaxitoxinsulfat

C2 N-21-Sulfo-C-11β-Hydroxysaxitoxinsulfat

C3 N-21-Sulfo-C-11α-Hydroxyneosaxitoxinsulfat

C4 N-21-Sulfo-C-11β-Hydroxyneosaxitoxinsulfat

1. Einleitung 1

I THEORETISCHER TEIL

1. Einleitung

1.1 Zur Problematik der Algentoxine

Meerestiere und Fische stellen einen delikaten und gesunden Bestandteil der menschlichen Nah-

rung dar. Es ist jedoch bekannt, daß viele Weichtiere mit toxischen Substanzen belastet sein

können, und daß es nach ihrem Verzehr zu Vergiftungen kommen kann 1,2. Viele der giftigen

Spezies treten in Verbindung mit verstärkten Algenblüten auf. Das deutet darauf hin, daß nicht

nur angereicherte anthropogene Schadstoffe (z.B. polyzyklische Kohlenwasserstoffe) und mikro-

bieller Verderb der Lebensmittel, sondern auch die Aufnahme und Akkumulation von Algen-

toxinen durch die Schalentiere Ursache der Muschelvergiftungen sein können 3,4. Mehrere Arten

von Vergiftungen durch Algentoxine sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Toxine werden von verschiedenen Spezies des Phytoplanktons synthetisiert 5. Unter optima-

len Bedingungen (Temperatur, Licht, Nährstoff-Konzentration) sind z.B. Mikroalgen zu einer

massenhaften Vermehrung fähig und bilden sogenannte Algenblüten mit mehr als 10 Millionen

Organismen pro Liter Wasser. Durch Filtration des Wassers können sich große Toxinmengen in

Muscheln und durch Sekundärtransfer auch in den nachfolgenden Gliedern der aquatischen Nah-

rungskette anreichern 6,7.

1. Einleitung 2

Tab. 1: Ausgewählte Vergiftungen durch Algentoxine 8,9

Name der Ver-giftung

Toxine Toxinbildner Wirkprinzip Effekt

DSP Okadasäure Dinophysis Inhibierung von Gastrointestinale Diarrhetic Pectenotoxin Prorocentrum Protein- Beschwerden Shellfish Poisoning Yessotoxin Protoceratium phosphatasen PSP Saxitoxin und Alexandrium Blockade von Parästhesien Paralytic Derivate Gymnodinium Natrium-Kanälen Lähmungen Shellfish Poisoning Pyrodinium ASP Domoinsäure Pseudonitzschia Exzitatorischer Gedächtnisver- Amnesic Neurotransmitter lust Shellfish Poisoning Gastrointestinale Beschwerden NSP Brevetoxine Gymnodinium Aktivierung von Parästhesien Neurologic breve Natrium-Kanälen Ichthyotoxisch Shellfish Poisoning Ciguatera Ciguatoxin Gambierdiscus Aktivierung von Parästhesien Maitotoxin toxicus Natrium-Kanälen Gastrointestinale Beschwerden Tetrodotoxin Tetrodotoxin Shewanella alga Blockade von Parästhesien Poisoning und Derivate Natrium-Kanälen Lähmungen Hepatotoxine Nodularin Nodularia Inhibierung von Schädigungen Microcystine Microcystis Protein- der Leber phosphatasen Palytoxin Palytoxin und Ostreopsis Zerstörung von Hämolyse Poisoning Derivate Zellen Spirolide Verschiedene Alexandrium unbekannt Neurotoxische Spirolidderivate ostenfeldii Wirkungen AZP Verschiedene unbekannt unbekannt Gastrointestinale Azaspiracid Azaspirazid- Beschwerden Poisoning derivate

1. Einleitung 3

Obwohl von toxischen Algenblüten seit langer Zeit berichtet wird 10, deutet sich eine Zunahme

ihres Auftretens an, welche nicht nur auf eine intensivere Überwachung zurückzuführen ist. Die

Frequenz, Intensität und Dauer spontaner Massenvermehrungen von Mikroalgen scheinen sich

zu erhöhen und toxische Algen in neue geographische Gebiete vorzudringen. Als Hauptursache

für die Stimulation von Algenblüten werden die zunehmende Verschmutzung und Eutrophierung

von Gewässern sowie Klimaveränderungen verantwortlich gemacht 11-13. Der Transport von

Dauerformen (Cysten) im Ballastwasser von Schiffen und die Versetzung von mit Cysten

infizierten Muschelstöcken im Rahmen der Aquakultur ermöglichen die Ausbreitung toxischer

Spezies in bisher unbetroffene Gebiete 14-16.

1.1.1 PSP-Toxine

1.1.1.1 Vorkommen

PSP-Toxine werden von marinen Dinoflagellaten der Gattungen Alexandrium, Gymnodinium

und Pyrodinium produziert 17. Dinoflagellaten sind einzellige, 20-200 µm große, Photosynthese

betreibende Meeresalgen. Sie treten in kugelförmiger Gestalt auf, mit einem quer und längs

gefurchten, aus 4 apikalen Zelluloseplatten zusammengesetzten Panzer mit kleinen Farbkörper-

chen, welche die Zelle rotbraun färben 18,19.

Die Anpassung an eine Vielzahl unterschiedlicher Milieus ermöglicht diesen Mikroalgen eine

weltweite Verbreitung von gemäßigten bis tropischen Küstengewässern (Abb. 1). Dabei besitzen

die zur PSP-Produktion befähigten Arten unterschiedliche Verbreitungsschwerpunkte. An der

Westküste Nordamerikas und der Küste Japans dominiert Alexandrium catenella, während im

Atlantik, an der Ostküste Nordamerikas und in Europa Alexandrium tamarensis die vorherr-

schende Spezies darstellt. Pyrodinium bahamense ist dagegen eine charakteristische Alge

tropischer Gewässer. Gymnodinium catenatum tritt vorzugsweise im Mittelmeer, an der Atlantik-

küste Südeuropas und Marokkos sowie in Mexiko und Argentinien auf 19,20.

Neben Dinoflagellaten werden PSP-Toxine auch von einigen Cyanobakterien-Arten synthetisiert

(Abb. 2). Als Verursacher giftiger Wasserblüten sind in Nordamerika und Europa Aphanizome-non flos-aquae und Lyngbya wollei sowie Anabaena circinalis in Australien identifiziert worden 21-23. Eine Gefährdung des Menschen kann auch hier nicht ausgeschlossen werden, obwohl

bisher nur bei Haustieren Fälle von Vergiftungen beobachtet wurden 24.

1. Einleitung 4

Abb. 1: Weltweite Verbreitung von PSP-Toxinen (schwarz markierte Regionen) 20,25

Die Toxinprofile der PSP-Produzenten sind von der Genetik und den Umweltbedingungen ab-

hängig, und sie können stark voneinander abweichen 26-29.

Seit einigen Jahren wird eine mögliche Produktion von PSP-Toxinen durch mit Dinoflagellaten

assoziierten Bakterien kontrovers diskutiert. Die breite Variation der toxischen Potenz in Algen-

kulturen sowie das Vorkommen von toxischen und nichttoxischen Stämmen der gleichen Spezies

suggerieren die Anwesenheit eines gemeinsamen Vektors in Form eines bakteriellen Kontami-

nanten 30,31. Teilweise konnten Bakterien von toxischen Algen isoliert werden, die PSP-Symp-

tome bei Mäusen hervorriefen und durch Kreuzimpfung in nichttoxischen Dinoflagellaten Toxi-

zität erzeugten 32-34. Andere in vitro Untersuchungen ergaben jedoch, daß die geringe Toxizität

dieser Organismen nicht für eine Erklärung hoher Toxizitäten in Algen und Muscheln ausreicht,

und meist fand keine weitere PSP-Produktion in den isolierten Bakterienkulturen statt. Auch

zeigte sich, daß einige toxische Algen keine Bakterien enthielten, diese aber dennoch im Labor-

versuch PSP-Toxine bildeten 35-38.

1. Einleitung 5

Alexandrium tamarensis Aphanizomenon flos-aquae Pyrodinium

bahamense

Anabaena circinalis Lyngbya wollei Gymnodinium

catenatum Abb. 2: Verschiedene PSP-Produzenten 39,40

Die Toxizität von Schalentieren ergibt sich aus einem komplexen Prozess über die Aufnahme

durch Filtration und die Verdauung toxischer Algen sowie der anschließenden Akkumulation,

Biotransformation (vgl. Kap. 1.1.1.2) und Detoxifikation der PSP-Toxine. Dabei weisen einzelne

Muschelarten eine unterschiedliche Sensitivität bei der Aufnahme toxischen Phytoplanktons auf 41. Außerdem sind sie in der Lage, Toxine über einen unterschiedlich langen Zeitraum zu spei-

chern, womit die Anreicherung von PSP-Toxinen ein seltenes Beispiel für die Akkumulation

wasserlöslicher Stoffe in der Nahrungskette darstellt 42. Als Speichermechanismen werden hier-

bei neben physikalischer Adsorption die Bindung an nichtspezifische Proteine (z.B. Melanin)

diskutiert 43-45. Hauptspeicherort ist der Verdauungsapparat, aber auch Siphon, Ovar, Kiemen

und Muskelfleisch können PSP-Toxine enthalten 42,46,47.

Neben der Kontamination von Muscheltieren findet ein Transfer von PSP-Toxinen zu höheren

Gliedern der aquatischen Nahrungskette wie Schnecken, Tintenfische, Krabben, Seesterne,

Hummer und, ausgehend vom Phytoplankton, über das Zooplankton bis zu Krebsen und Fischen

statt 6,48,49.

1. Einleitung 6

1.1.1.2 Chemische Struktur, Eigenschaften und Biosynthese

Der bekannteste Vertreter der PSP-Toxine ist Saxitoxin. Es war das erste Toxin, das 1957 aus

der in Alaska heimischen Venusmuschel Saxidomus giganteus isoliert wurde und von ihr den

Namen erhielt 50,51. Erst 1975 gelang die Strukturaufklärung nach Berechnung der Kristall-

struktur durch Schantz et al. 52,53. Mittels röntgenkristallographischer Analyse wurde das para-

Brombenzolsulfonsäure-STX-Derivat als heterozyklisches Tetrahydropurin-Alkaloid charakteri-

siert. Die 20 weiteren bisher isolierten PSP-Toxine lassen sich strukturell von Saxitoxin ableiten

(Abb. 3).

Charakteristisch für PSP-Toxine sind ein hoher Stickstoffanteil (35%), zwei Guanidinogruppen

sowie eine hydratisierte Carbonylfunktion am C12-Atom.

Während die Totalsynthese von STX bereits kurz nach dessen Strukturaufklärung gelang, ist nur

wenig über die Biosynthese der PSP-Toxine bekannt 54. Fütterungsexperimente mit radioaktiv

markierten Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen deuten auf eine Synthese des Grundkörpers

aus Arginin und Acetat hin 55-57. Der Syntheseprozeß, die involvierten Enzyme und die bio-

chemische Funktion der PSP-Toxine sind bisher jedoch noch ungeklärt.

PSP-Toxine sind stark hygroskopisch, sehr leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und

Ethanol, jedoch nahezu unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln. Im schwach sauren

Milieu sind sie stabil, aber unter alkalischen Bedingungen leicht oxidierbar.

PSP-Toxine zeigen weder eine UV-Absorption bei Wellenlängen über 220 nm noch eine natür-

liche Fluoreszenz.

Durch Variationen des Restes R4 werden 4 Gruppen von PSP-Toxinen unterschieden: N-Sulfo-

carbamoyl-, Carbamoyl-, Decarbamoyltoxine und Deoxydecarbamoyltoxine. Die unterschied-

liche Besetzung der Reste R1-R3 mit Wasserstoff-, Hydroxy- und Sulfatgruppen unterteilt wie-

derum jede dieser Gruppen in weitere verwandte Verbindungen. Mit der Konfiguration der Reste

ist die Stabilität und Toxizität der PSP-Toxine eng verbunden 58,59.

Alle Carbamoyltoxine reagieren basisch, da ihre Guanidinogruppen im physiologischen pH-

Bereich in protonierter Form vorliegen. Allerdings nimmt ihre Basizität von STX über Neo

(jeweils doppelt positiv geladen) zu den Gonyautoxinen (eine positive Nettoladung) ab.

Die Titration von STX ergab Dissoziationspunkte an pKa 8,22 und 11,28, während die pKa-

Werte von Neo bei 6,75 und 8,65 liegen 58,60.

Die Gonyautoxine zeigen Epimerisierungen am C11-Atom, wobei das Gleichgewicht zwischen

den α- und β- Epimeren im sauren Milieu ungefähr 3:1 beträgt 58.

1. Einleitung 7

Toxin R1 R2 R3 R4 Molekulargewicht [g/mol]

STX H H H 301 NEO OH H H 317 GTX1 OH H OSO3

- H2N-COO 412 GTX2 H H OSO3

- (Carbamoyl-) 396 GTX3 H OSO3

- H 396 GTX4 OH OSO3

- H 412 B1 H H H 380 B2 OH H H 396 C3 OH H OSO3

- -O3S-NH-COO 492 C1 H H OSO3

- (N-Sulfo- 476 C2 H OSO3

- H carbamoyl-) 476 C4 OH OSO3

- H 492 dcSTX H H H 258 dcNEO OH H H 274 dcGTX1 OH H OSO3

- OH 369 dcGTX2 H H OSO3

- (Decarbamoyl-) 353 dcGTX3 H OSO3

- H 353 dcGTX4 OH OSO3

- H 369 doSTX H H H H 242

doGTX2 H H OSO3- (Deoxy- 337

doGTX3 H OSO3- H decarbamoyl-) 337

Abb. 3: Chemische Struktur von Saxitoxin und verwandten Verbindungen

Die Decarbamoyltoxine leiten sich chemisch von den Carbamoyltoxinen durch Abspaltung der

Carbamatgruppe ab. So entsteht unter Einwirkung von 7,5 N Salzsäure bei 110°C dcSTX aus

STX mit einer Ausbeute von 75% 61. Dc-Toxine zeichnen sich durch eine hohe chemische und

enzymatische Stabilität aus 58.

1. Einleitung 8

Analog den Decarbamoyltoxinen lassen sich auch die N-Sulfocarbamoyltoxine von den Carba-

moyltoxinen ableiten. Sie reagieren jedoch kaum noch basisch, da ihre Guanidinogruppen

deprotoniert vorliegen. Bei pH-Werten von 7-9 tragen C3 und C4 sogar eine Nettoladung von

–1. Im sauren Milieu sind N-Sulfocarbamoyltoxine instabil und ausgesprochen hydrolyse-

empfindlich 58,62.

Erst in den letzten Jahren wurde eine weitere Gruppe von PSP-Toxinen diskutiert, und zwar die

der Deoxydecarbamoyltoxine. Die in der australischen Population von Gymnodinium catenatum

nachgewiesenen doSTX, doGTX2 und doGTX3-Toxine stellen bisher die einzigen bekannten

Vertreter dieser Gruppe dar 63,64.

Abb. 4: Übersicht der in vivo Transformationen von PSP-Toxinen in Schalentieren (vgl. Abb. 3

für individuelle Toxinstruktur). 1. Epimerisierung von β zu α- Epimeren; 2. Reduktion: (a) von GTX1/4 und Neo zu GTX2/3 und STX, (b) von GTX1-4 zu STX und Neo; 3. Saure Hydrolyse; 4. Enzymatische Hydrolyse: Umwandlung von N-Sulfocarbamoyl- (4a) oder Carbamoyltoxinen (4b) zu Decarbamoyltoxinen 42

+ 10 11

OH

OH

H2N

NH

N

-OSO3

N

NH

H2N

OH

OH

10 11+

H

(Cys, GLH etc.)Reduktion

2b

HNH

1N

O+

13

O

H2N

O

13

+

O

N1

H NH

13

+

N1

H NH

HONH

O3S- 21

Muschelenzym

Muschelenzymneutraler pH

niedriger pH

4b

4a

3

N

NH

H2N

OSO3

H

OH

OH

10 11 neutraler pH

1

+ + 10 11

OH

OH

HOSO3

H2N

NH

N

--

+

O

NHO 1

H NH

Reduktion(Cys, GLH etc.)

2aO

H2N H2N

OH

O

N 1

H NH

1. Einleitung 9

Theoretisch können von nahezu allen PSP-Toxinen mit -CO-NH2, -OH, -H und -SO3- –Gruppen

an den C-Atomen des Puringrundgerüstes Metabolite gebildet werden, wobei die Umwandlun-

gen der PSP-Toxine durch Umlagerungen und/oder Abspaltungen das Ergebnis biochemischer

Prozesse in höheren Gliedern der marinen Nahrungskette sind (Abb. 4). Die instabilen N-Sulfo-

carbamoyltoxine und 11β-Epimere der Gonyautoxine bilden die Hauptkomponenten in verschie-

denen Algenspezies 55,63. Nach der Aufnahme der Toxine in Muscheln können sowohl Epimeri-

sierungen als auch Dehydroxylierungen, Esterspaltungen und teilweise sogar Decarboxylierun-

gen erfolgen 42,65,66. So können in Muscheln durch Epimerisierung der OSO3--Gruppe am

C11-Atom die instabileren β-Formen C2, GTX3 und GTX4 in die stabileren α-Formen C1,

GTX2 und GTX1 überführt werden, und durch Spaltung der Esterbindung durch O-Sulfatase und

N-Hydroxylase entsteht aus den Gonyautoxinen und Neo das STX.

Daneben bewirken natürlich vorkommende chemische Reduktanden mit SH-Gruppen, wie

Glutathion und Cystein, unter anaeroben Bedingungen eine Metabolisierung. Beispiele hierfür

sind die Reduktion der N-1-OH-Gruppe zu N-1-H und die Umwandlung der Gonyautoxine zu

Neo bzw. STX durch Abspaltung der OSO3--Gruppe am C11-Atom.

Die Bildung von Carbamoyl- und Decarbamoyltoxinen aus N-Sulfocarbamoyltoxinen ist enzy-

matisch und durch saure Hydrolyse möglich.

1.1.1.3 Toxizität

Gegenüber DSP, ASP und NSP nehmen die durch PSP-Toxine verursachten Muschelvergiftun-

gen einen drastischeren und schnelleren Verlauf (Tab. 1). Als primäre Symptome treten periphe-

re Parästhesien auf. Innerhalb von 5-30 min nach dem Verzehr kontaminierter Muscheln entwik-

keln sich Kribbeln und brennende Empfindungen um Lippen, Zunge und Gesicht mit fortschrei-

tender Ausbreitung in den Nacken sowie in die Arme, Finger, Beine und Zehen, die sich später

in Taubheit und Lähmungen umwandeln. Der Verlust der Muskelkoordination wird begleitet von

Gleichgewichtsstörungen, Kreislaufschwäche sowie Artikulations- und Schluckschwierigkeiten.

Bei höheren Dosen kann sich die Paralyse auf die Atemmuskulatur ausdehnen und innerhalb von

2-12 Stunden zum Tod führen. Sofern der Vergiftete die ersten 24 Stunden überlebt, ist die

Prognose günstig, und es kann von einer vollständigen Rekonvaleszenz ohne erkennbare Dauer-

schäden ausgegangen werden. Bis heute existiert kein Antidot; nur durch Unterstützung der

Atmung und rechtzeitiger Verabreichung von Laxantien kann der Patient die kritischen Stunden

überstehen 58,67,68.

1. Einleitung 10

PSP-Toxine wirken vor allem in Warmblütern, wobei die einzelnen Tierarten Unterschiede in

ihren Empfindlichkeiten zeigen. In Tabelle 2 sind einige LD50-Werte für Warmblüter dargestellt.

Tab. 2: LD50-Werte von PSP-Toxinen nach einmaliger oraler Verabreichung 69 Tier LD50 µg PSP/kg Körper-

gewicht Tier LD50 µg PSP/kg Körper-

gewicht

Maus Affe Hase Meerschwein

260-263 277-800 181-200 128-135

Ratte Katze Hund Taube

192-212 254-280 180-200 91-100

Der Mensch reagiert verhältnismäßig empfindlich auf PSP-Toxine. Die für ihn ermittelten LD50-

Werte liegen zwischen 15 und 50 µg Toxin/kg Körpergewicht, so daß eine Dosis von ca. 1-4 mg

PSP-Toxine für einen erwachsenen Menschen tödlich sein kann. Eine gewisse Resistenz kann

durch die häufige Aufnahme kleiner Mengen an PSP-Toxinen erzeugt werden. Personen, die

regelmäßig Muscheln konsumieren, entwickeln somit eine Toleranz gegenüber Dosen, die bei

empfindlichen Menschen bereits schwere Symptome hervorrufen 70,71.

PSP-Toxine sind potente Nervengifte, welche die Erregungsleitung in Nerven- und Muskelzellen

blockieren. Die Reizübertragung erfolgt über Aktionspotentiale, die durch Änderungen im Ver-

hältnis von Natrium- und Kalium-Ionen an erregbaren Membranen erzeugt und über sie weiter-

geleitet werden. Wird eine Nervenzelle erregt, ändert sich die Permeabilität der Membranen für

Na+-Ionen. Durch spezifische Na-Kanäle strömen Na+-Ionen in die Zelle ein und bewirken eine

Depolarisation der Zellmembran (Aufbau des Aktionspotentials). PSP-Toxine sind in der Lage,

reversibel die Na-Kanäle zu blockieren und so die Entstehung und Weiterleitung von neuronalen

Impulsen zu verhindern 72,73.

Nach dem Bindungsmodell von Shimizu assoziieren die Guanidinogruppen der PSP-Toxine mit

anionischen Zentren auf der Membranoberfläche, während die geminalen Diolgruppen am

C12-Atom Wasserstoffbrücken zu Zentren mit hoher Elektronegativität ausbilden (Abb. 5) 74.

Daraus leiten sich auch die beträchtlichen Unterschiede in der toxischen Potenz der einzelnen

PSP-Toxine ab. Differenzen im Molekülaufbau, wie die Zahl der positiven Guanidinogruppen

und die chemische Struktur der Seitenkette, haben Einfluß auf die Stabilität der Anlagerung an

die Zelloberfläche 75-77.

Carbamoyltoxine, insbesondere STX und Neo, zeigen die höchste Toxizität aller PSP-Toxine, da

bei ihnen die Bindung an die Membranoberfläche am stärksten ausgebildet werden kann. Im

Vergleich dazu weisen die dc-Toxine eine deutlich geringere Toxizität auf.

1. Einleitung 11

Die Anwesenheit von Sulfatestern in der Seitenkette bewirkt aufgrund der zwischen der negativ

geladenen Sulfatgruppe und den anionischen Gruppen auf der Membranoberfläche auftretenden

Abstoßungskräfte einen weiteren Verlust der toxischen Aktivität.

Abb. 5: Modell zur Bindung von PSP-Toxinen an die Oberfläche erregbarer Nervenmembranen 78

Zur besseren Vergleichbarkeit der individuellen Toxizitäten wurden sogenannte STX-

Äquivalente (STXeq) mit STX als Bezugsgröße eingeführt. 1,0 mg STX entspricht 5500 Maus-

einheiten (MU, vgl. Kap. 1.2.1.1), so daß 1 MU 0,18 µg STX äquivalent ist 79. Die Toxizitäten

sind in Tabelle 3 dargestellt.

Nervenzelle außen

Signal

Nervenzelle innen

Na-Kanal

Carbamoyltoxin (STX)

Na+

1. Einleitung 12

Tab. 3: Toxizitäten der PSP-Toxine 79

Toxin MU/µmol µg STXeq/µmol Relative Toxizität

STX Neo

GTX1 GTX2 GTX3 GTX4 dcSTX dcNeo

dcGTX1 dcGTX2 dcGTX3 dcGTX4

B1 B2 C1 C2 C3 C4

2100 2300 1900 1000 1600 1900 900 900 950 380 380 950 150 150 17 -

17 -

378 414 342 180 288 342 162 162 171 68 68

171 27 27 <1 - 1 -

100 110 90 48 76 90 43 43 45 18 18 45 7 7

<1 - 1 -

1.1.1.4 Gesetzliche Regelungen

Schalentiere sind wichtige, kommerziell genutzte Nahrungsmittellieferanten in der ganzen Welt.

Die PSP-Belastung in vielen Bereichen der marinen Nahrungskette stellt somit ein ernstzu-

nehmendes Risiko für die öffentliche Gesundheit dar. Dabei ergibt sich das Problem, daß

toxische Muscheln am Phänotyp nicht erkennbar sind, die tödliche Dosis nur wenige Milligramm

beträgt und kein Antidot für die kochstabilen PSP-Toxine existiert. Verheerend sind auch die

Auswirkungen auf Aquakulturen und die verarbeitende Industrie, denn die Ernte ökonomisch

relevanter Spezies wird oft über Monate bis Jahre verhindert 46,80.

Um den Verbraucher gesundheitlich unbedenkliche, d.h. toxinfreie Ware anzubieten, haben 21

Länder (USA, Kanada, einige Länder Mittelamerikas und Ozeaniens, Australien, Japan, Süd-

korea und die meisten europäischen Länder) Monitoring-Programme und Regelungen zur Kon-

trolle bestimmter Algenspezies und/oder Muscheln eingeführt, wobei sich als geduldete Höchst-

mengen 40-80 µg PSP bzw. STXeq/100g Muschelfleisch in den meisten Ländern durchsetzte.

Als Analysenverfahren ist der Maus-Bioassay, unterstützt von der HPLC, vorgeschrieben. Bei

Grenzwertüberschreitungen erfolgen ein sofortiger Stop und die Vernichtung der belasteten Ern-

te sowie die Verhängung von Export- bzw. Importverboten 81,82. In einigen Ländern werden die

Art und Anzahl der Algen pro Liter Wasser in regelmäßigen Abständen kontrolliert. Beim

vermehrten Auftreten von potentiell giftigen Algenarten werden die Untersuchungsabstände

1. Einleitung 13

verkürzt und nach Erreichen einer Obergrenze an Dinoflagellaten pro Liter Wasser die Ernte von

Muscheln untersagt 80,83.

Nach Einführung der Monitoring-Programme ging die Anzahl der Vergiftungen stark zurück.

Einzelne Fälle traten dann meist nach Mißachtung offizieller Warnungen auf.

In den Küstengebieten der Bundesrepublik Deutschland wurde seit Jahren keine massenhafte

Vermehrung PSP-produzierender Algen mehr beobachtet, so daß PSP-Analysen stets negative

Ergebnisse erbrachten 84. Nachdem es aber mehrfach zu Vergiftungsfällen nach dem Verzehr

PSP-belasteter importierter Muschelkonserven gekommen war, legte der deutsche Gesetzgeber

in der Fisch-Verordnung vom 8. August 1988 einen Grenzwert für PSP-Toxine von 40 µg/100 g

Schalentierfleisch fest 85,86. Dieser Wert wurde am 31. März 1994 im §16 der neuen Fisch-

hygiene-Verordnung auf 80 µg/100 g Lebensmittel korrigiert 87. Als Untersuchungsverfahren ist

ein fluorimetrisches Verfahren vorgeschrieben, und bei positivem Befund soll eine Absicherung

durch den Bioassay oder eine HPLC-Methode erfolgen 88.

Die Europäische Union harmonisierte in ihrer am 1. Januar 1993 in Kraft getretenen EU-

Verordnung 91/492/EEU die Bedingungen für die Produktion und den Verkauf von lebenden

Mollusken, inklusive PSP-Höchstmengen und Überwachungsmethoden.

1.2 Analytische Erfassung von PSP-Toxinen

Die Einhaltung der gesetzlichen Regelungen zum Schutz der Gesundheit durch Kontrollen und

Monitoring-Programme sowie die Durchführung von Forschungsvorhaben auf dem Gebiet der

PSP-Toxine erfordern entsprechende analytische Methoden, mit denen die Phytotoxine eindeutig

nachgewiesen und quantifiziert werden. Dazu stehen eine Vielzahl biologischer, biochemischer

und chemischer Verfahren zur Verfügung, für deren Einschätzung die Unterteilung in nicht-

chromatographische und chromatographische Bestimmungsmethoden von Vorteil ist.

Nichtchromatographische Verfahren, zu denen Bioassays, Immunoassays und fluorimetrische

Assays zählen, erlauben, mit Ausnahme der Kapillarelektrophorese, nur die summarische Erfas-

sung mehrerer PSP-Toxine (Gesamttoxizität).

Um Aussagen über individuelle Toxinkomponenten zu treffen, wurden in den letzten 15 Jahren

chromatographische Verfahren entwickelt, die es gestatten, einzelne Verbindungen empfindlich

und eindeutig nachzuweisen.

1. Einleitung 14

Während die summarisch arbeitenden Bestimmungsmethoden beim schnellen routinemäßigen

Erfassen des vom Probenmaterial ausgehenden Gefährdungspotentials vorteilhaft einsetzbar

sind, ermöglichen chromatographische Verfahren Aussagen zur Entstehung toxischer Algen-

blüten und zum Verbleib der PSP-Toxine in der marinen Nahrungskette.

1.2.1 Nichtchromatographische Bestimmungsverfahren

1.2.1.1 Bioassays

Den Grundstein zur PSP-Bestimmung legten 1937 Sommer et al. mit der Entwicklung des Maus-

Bioassays 89. Dieses Verfahren wurde von der Association of Official Analytical Chemists

(AOAC) standardisiert und bildet noch heute die Basis vieler Monitoring-Programme 81,90.

Das zu untersuchende Probenmaterial wird nach Homogenisierung und Zugabe von 0,1 N Salz-

säure erhitzt (5 min Wasserbad), anschließend auf einen pH-Wert von 2-4 eingestellt und zentri-

fugiert. Der saure Extrakt wird den Mäusen intraperitoneal injiziert und die Zeit bis zum Tod der

Tiere gemessen. Parallel hierzu wird die Kalibrierung mit einer STX-Standardlösung durchge-

führt.

Bei logarithmischem Auftrag der STX-Dosis gegen den reziproken Wert der Zeit bis zum Tod

der Versuchstiere ergibt sich eine lineare Abhängigkeit. Das Optimum der Analysengenauigkeit

wird erreicht, wenn der Tod zwischen der 5. und 8. Minute eintritt. Hochtoxische Extrakte

müssen dementsprechend verdünnt werden.

Eine Mauseinheit (MU) wird als die Menge an Toxin definiert, die ausreicht, eine 20 g schwere,

weiße, männliche Maus innerhalb von 15 min zu töten, wenn 1 mL des sauren Probenextraktes

injiziert wird. 1 MU entspricht 0,18 µg Saxitoxin. Die Nachweisgrenze des Maus-Bioassays liegt

mit ca. 400 µg STXeq/kg Muschelfleisch nahe der in vielen Ländern gesetzlichen Höchstmenge

(vgl. Kap. 1.1.1.4) 91.

Neben der geringen Empfindlichkeit des Maus-Bioassays ist die große Streuung der Ergebnisse

von bis zu 20% von Nachteil. Insbesondere hochtoxische Extrakte können stark variierende

Ergebnisse liefern, und die Feststellung des Todeszeitpunktes einer Maus ist zudem mit

Unsicherheiten behaftet 92. Auch unterdrücken hohe Salzkonzentrationen, wie sie in Muschel-

konserven zu finden sind, die toxischen Effekte und können zu Fehlinterpretationen führen 93.

Verläßliche Aussagen sind nur bei Einsatz einer großen Anzahl von Versuchtieren zu erhalten,

deren Haltung mit erheblichem Aufwand verbunden ist.

1. Einleitung 15

Beim Bioassay mit erregbaren Muskelfasern der Ratte wird die Eigenschaft der PSP-Toxine,

selektiv und reversibel die Natriumkanäle zu blockieren, genutzt. Dieser Test gestattet die

getrennte Messung einzelner Toxine, da die durch das jeweilige Toxin ausgelöste Reaktion einer

spezifischen Toxizität entspricht. Die Analyse von Toxinmischungen jedoch erfordert einen sehr

großen Aufwand 58.

Der wachsende Widerstand gegen Tierversuche führte zur Entwicklung von Bioassays unter

Verwendung von Invertebraten wie Austernembryonen und Fischlarven bzw. zu in vitro Zell-

kultur-Assays mit Neuroblastoma-Zellen, Rezeptor-based Assays und Voltage-clamp Verfahren 94-98.

1.2.1.2 Immunologische Assays

Immunoassays zählen zu den biochemischen Techniken, die auf einer Erkennung der Toxine auf

molekularer Ebene beruhen.

Für Immunoassays werden aus Versuchstieren, die zuvor mit der zu untersuchenden Substanz

immunisiert wurden, Antikörper gewonnen. Diese Antikörper dienen im eigentlichen Test dann

als substratspezifische Erkennungssubstanzen. Die spezifischen Antikörper für STX werden aus

mit einem kovalent gebundenen Protein-STX-Komplex immunisierten Kaninchen erhalten.

Im Testsystem werden die Antigene auf einer Mikrotiterplatte fixiert. Anschließend wird die

STX-Standardlösung bzw. die Probenlösung gemeinsam mit einer Verdünnung der Antikörper

ebenfalls auf die Platte aufgebracht und die Menge der an die Antigene gebundenen Antikörper

bestimmt, indem Ziege-Antikaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat zugegeben und inkubiert wird.

Dabei bildet sich entsprechend der gebundenen Enzymmenge ein farbiges Reaktionsprodukt, das

spektralphotometrisch bestimmbar ist. Die Nachweisgrenze des Tests liegt bei 0,1-0,5 ng

STX/mL für Standardlösungen und damit deutlich unterhalb der des Maus-Bioassays.

Dieser von Chu et al. entwickelte enzymgekoppelte Immunoassay (ELISA) wurde bis heute

mehrfach modifiziert und bietet Vorteile aufgrund der schnellen Durchführbarkeit und geringerer

Kosten 99-101.

Daneben finden sogenannte Radioimmunoassays (RIA) Anwendung, bei denen die Mikro-

titerplatten mit STX-Antikörpern und radioaktiv markiertem STX (STX-H3) präpariert sind. Der

RIA ist ein kompetitiver Assay, bei dem das STX der zugegebenen Probe mit dem radioaktiven

STX um die Bindungsstellen der Antikörper konkurriert. Die Menge des nichtgebundenen

STX-H3 ist proportional dem STX in der Probe und wird mit einem Scintillator ermittelt 102.

1. Einleitung 16

Beide Verfahren weisen nur eine geringe Bindungsspezifität für STX auf, und es kommt zu

Kreuzreaktionen mit anderen PSP-Toxinen, insbesondere mit Neo und dcSTX 103. Die geringe

Empfindlichkeit des Testes bei der Analyse PSP-haltiger Muschelextrakte sowie die geringe

Affinität der Antikörper für andere PSP-Toxine als STX limitieren den Einsatz von immuno-

logischen Assays bei Routinemessungen 103,104.

1.2.1.3 Fluorimetrische Verfahren

Eine wesentliche Voraussetzung zur Entwicklung chromatographischer Bestimmungsverfahren

(vgl. Kap. 1.2.2) war die Entwicklung eines Verfahrens zur Oxidation des Saxitoxins im Alka-

lischen zu fluoreszierenden Produkten mit nachfolgender fluoreszenzspektrometrischer Bestim-

mung durch Bates und Rappoport 105,106.

Bei der Oxidation der PSP-Toxine in alkalischer Lösung kommt es zu einem Bruch der C12/C4-

Bindung mit anschließender Reorganisation des Moleküls zu einem planaren aromatischen

System (8-Amino-6-hydroxymethyl-2-aminopurin-3-propionsäure). Wird die Reaktionslösung

danach angesäuert, resultiert eine stark erhöhte Fluoreszenz, da sich im Sauren (pH 5) das

korrespondierende Laktam (ein Pyrimidinopurin) bilden kann (Abb. 6). Die Fluoreszenzmessung

erfolgt bei Wellenlängen von 330 nm (Ex.) und 390 nm (Em.).

sauer alkalisch Abb. 6: Oxidation von Saxitoxin

HN

NH2N

O

O

H2N

N

NNH2

H

+

HOH

OH

NaOH

H2O2

N

N+H2N

HO

N

NNH2

COOH

H

H

H

N

N

N

NNH2

N

O

OH

H

H

H+

1. Einleitung 17

Das anfänglich als Oxidationsagens eingesetzte H2O2 wurde später aufgrund höherer Fluores-

zenzausbeuten für N-1-OH-Toxine durch Perjodsäure ergänzt bzw. substituiert 107,108.

Um eine niedrige Erfassungsgrenze zu gewährleisten und falsch-positive Ergebnisse durch inter-

ferierende Matrixbestandteile weitgehend auszuschließen, wurden PSP-haltige Extrakte zunächst

an Kationenaustauschern gereinigt 88,106. Allerdings kann ohne Auftrennung der PSP-Gemische

vor der Fluoreszenzmessung die Bestimmung der Gesamttoxizität aufgrund der unterschied-

lichen Fluoreszenzintensitäten der PSP-Toxine (die nicht mit den relativen Toxizitäten korrelie-

ren) nur semiquantitativ erfolgen (Tab. 4).

Tab. 4: Relative Fluoreszenzintensitäten und relative Toxizitäten der PSP-Toxine 79,109

Toxin Rel. Fluoreszenz Rel. Toxizität Toxin Rel. Fluoreszenz Rel. Toxizität

STX 1,00 1,00 Neo 0,04 – 0,30 1,10 GTX1 0,05 0,90 GTX2 1,80 0,48 GTX3 1,80 0,76 GTX4 0,05 0,90

dcSTX 0,71 – 0,42 0,43 B1 0,41 0,07 B2 0,05 0,07 C1 0,48 <0,01 C2 0,48 0

1.2.1.4 Kapillarelektrophorese

Das Trennprinzip der Elektrophorese beruht auf der unterschiedlichen Migration von geladenen

Teilchen in Abhängigkeit vom pH-Wert in einem elektrischen Feld.

Bei der Kapillarelektrophorese (CE) findet die Elektrophorese in engporigen, puffergefüllten

Quarzkapillaren (25-100 µm ID) mit einer Länge von 0,2-2 m statt.

Wird eine hohe Spannung angelegt (20-30 kV), bewegen sich die Komponenten der Probe in

Abhängigkeit von ihrer Größe und Ladung durch die Trennkapillare und können anschließend

detektiert werden. Überlagert wird diese Migration vom elektroosmotischen Fluß (EOF), der bei

der PSP-Trennung eine kathodengerichtete Strömung des Puffers darstellt und durch die Ladun-

gen an der inneren Kapillarwand verursacht wird 110.

Wegen der einfachen Handhabung und Vielseitigkeit ist die Kapillarzonenelektrophorese (CZE)

die meistgenutzte Variante der CE, die vor allem bei der Trennung von kleineren, wasser-

löslichen Molekülen, wie die der PSP-Toxine, zum Einsatz kommt 111. Bei der CZE ist die

Kapillare nur mit Pufferlösung gefüllt, und die Trennung erfolgt durch Migration in diskreten

Zonen mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Dadurch wird auch die gleichzeitige Analyse von

unterschiedlich geladenen Substanzen ermöglicht (Abb. 7) 110.

1. Einleitung 18

Nach dem Prinzip der CZE eluieren somit zuerst die zweifach positiv geladenen Carbamattoxine

STX, Neo, dcSTX, nachfolgend die Gonyautoxine und B-Toxine vor den C-Toxinen. Die Selek-

tivität in der CZE kann sehr leicht durch Änderung des pH-Wertes des Puffers und der angeleg-

ten Spannung sowie durch Zusatz von Additiva variiert werden 110,112.

Abb. 7: Prinzip der Kapillarzonenelektrophorese 110

Die Kapillarelektrophorese ist eine relativ neue Technik, welche eine hohe Trennleistung auf-

weist. Sie ermöglicht einen hohen Grad an Automatisierung und die Kopplung an moderne

Detektoren auf der Basis der laserinduzierten Fluoreszenz und an das Massenspektrometer 113-118.

CE-Trennungen erfordern hoch gereinigte Extrakte, um reproduzierbare Trennungen zu erhalten.

Außerdem resultiert die Begrenzung auf sehr kleine Probenvolumina in einer um mehrere

Größenordungen geringeren Sensitivität der CE/MS im Vergleich zur HPLC mit Fluoreszenz-

detektion (vgl. Kap. 1.2.2.3.1) 119.

Verbesserungen der Nachweisgrenzen für PSP-Toxine lassen sich durch eine Vorkonzentrierung

mittels Kapillarisotachophorese (CITP) und einem diskontinuierlichen Puffersystem vor der CZE

erreichen 120,121. Die CITP stellt eine Kombination von 2 Puffersystemen dar, bei der die einzel-

nen Fraktionen mit abnehmender elektrophoretischer Mobilität hintereinander mit der gleichen

Geschwindigkeit wandern. Die Zonen befinden sich dabei sandwichartig zwischen dem vorlau-

fenden („leading“) und dem abschließenden („terminating“) Elektrolyten 110.

1. Einleitung 19

1.2.2 Chromatographische Bestimmungsverfahren

Als Chromatographie wird ein physikalisch-chemisches Verfahren zur Stofftrennung bezeichnet,

bei dem Wechselwirkungen zwischen einer stationären Phase und den in einer mobilen Phase

gelösten Substanzen zur Trennung ausgenutzt werden. Die Wechselwirkungen sind substanz-

spezifisch, so daß es zu unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten durch mit der statio-

nären Phase gefüllte Trennsäulen kommt.

Die hochdruckflüssigkeitschromatographische Trennung (HPLC) der PSP-Toxine basiert auf-

grund ihres ionischen Charakters auf der Ionenchromatographie. Dabei kann sowohl das Prinzip

der Ionenpaarchromatographie als auch das der Ionenaustauschchromatographie angewendet

werden. Die große Herausforderung besteht darin, über 20 strukturell sehr ähnliche PSP-

Komponenten chromatographisch möglichst vollständig in einem Lauf (Run) zu trennen.

1.2.2.1 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenpaarchromatographie

In der Ionenpaarchromatographie wird der mobilen Phase ein ionogener Stoff zugegeben, der mit

einer entgegengesetzt geladenen Probenkomponente ein Ionenpaar bildet. Diese Ionenpaare

verhalten sich chromatographisch wie nicht-ionogene organische Moleküle, so daß sie mit Hilfe

einer Reversed-Phase-Säule (RP-Säule) getrennt werden können.

Die meisten bisher entwickelten HPLC-Methoden zur PSP-Bestimmung beruhen auf der Ionen-

paarchromatographie, wobei fast immer Alkylsulfonsäuren als Ionenpaarbildner zur Trennung

der kationischen PSP-Toxine im Eluenten eingesetzt werden.

Das erste ionenpaarchromatographische HPLC-Verfahren zur PSP-Trennung wurde von Sullivan

et al. veröffentlicht und lange Zeit bei vielen Monitoring-Programmen eingesetzt 79,122. Dabei

erfolgt die Trennung der Toxine an einer Styren-Divinylbenzen-Copolymer-Phase (PRP-1). In

der mobilen Phase verwendeten Sullivan et al. ein Gemisch aus Hexan- und Heptansulfonsäuren

in wäßrigem Ammoniumphosphatpuffer als Ionenpaarreagenz versetzt mit Acetonitril als Modi-

fier, um stärker basische Toxine (Neo, dcSTX, STX) ebenfalls zu eluieren. Zur Verbesserung der

ionenpaarchromatographischen Trennung erfolgt die Elution der PSP-Toxine mit zwei Gradien-

ten; einem Modifiergradienten (durch Variation des Acetonitrilanteils) und einem Ionenstärke-

gradienten (durch Variation des pH-Wertes und der Phosphatkonzentration).

1. Einleitung 20

Ein Nachteil dieser Methode ist die Koelution von dcSTX und STX, so daß es aufgrund der

unterschiedlichen Toxizitäten beider Verbindungen zu Fehlern bei der Berechnung der Gesamt-

toxizität, ausgedrückt in STXeq/kg, kommt 85.

Lawrence et al. entwickelten ein HPLC-Verfahren mit pre-column Derivatisierung (vgl. Kap.

1.2.2.3.1), bei dem die Trennung der Reaktionsprodukte an einer RP-C18-Phase mit Hilfe eines

Phosphatpuffers und Ammoniumformiat in der mobilen Phase sowie eines linearen Acetonitril-

Gradienten (0-5%) erfolgt. Zuvor ist eine aufwendige Aufreinigung der Probenextrakte mittels

Ionenaustauscher vorgesehen, um störende Matrixbestandteile zu entfernen 123,124.

Oshima et al. benötigten drei getrennte chromatographische Runs mit unterschiedlichen Eluenten

zur PSP-Trennung an einer RP-C8-Säule. Hierbei werden die PSP-Toxine vor der HPLC-

Trennung mit Hilfe eines Ionenaustauschers in 3 Gruppen unterschiedlicher Basizität fraktioniert

(1. Gruppe: C1-C4, 2. Gruppe: GTX1-GTX4, dcGTX1-dcGTX4, B-Toxine, 3. Gruppe: Neo,

dcSTX, STX). Die Eluenten für die Trennung der Decarbamoyl- und Carbamoyltoxine enthalten

Heptansulfonsäure, der Eluent für die Trennung der anionischen C-Toxine jedoch Tetrabutyl-

ammoniumphosphat als Ionenpaarreagenz 125,126.

Thielert et al. orientierten sich an Sullivan et al., jedoch wurde die PRP-1-Säule durch eine RP-

C18-Säule substituiert und ausschließlich Oktansulfonsäure als Ionenpaarbildner eingesetzt. Bei

Verwendung von zwei Phosphatpuffern (Eluent A: 98,5% (v:v) Ammoniumphosphat (40

mmol/L) und Oktansulfonsäure (11 mmol/L), 1,5% (v:v) THF, pH = 6,6; Eluent B: 83,5% (v:v)

Ammoniumphosphat (50 mmol/L) und Oktansulfonsäure (13 mmol/L), 15% (v:v) ACN, 1,5%

(v:v) THF, pH = 6,6) erfolgt die Elution isokratisch in zwei Stufen. Die Gehalte an N-Sulfo-

carbamoyltoxinen werden nach Hydrolyse des essigsauren Probenextraktes (Umwandlung zu

ihren korrespondierenden Carbamattoxinen) und einem zweiten chromatographischen Run durch

Differenzmessung ermittelt 127.

1.2.2.2 Trennverfahren auf dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie

Bei der Ionenaustauschchromatographie wird als stationäre Phase eine polymere Matrix aus Harz

oder Kieselgel eingesetzt, an deren Oberfläche sich saure oder basische Gruppen befinden. Die

zu analysierenden Ionen werden von den funktionellen Gruppen des Austauscherharzes unter-

schiedlich stark gebunden und dann von der mobilen Phase eluiert.

1. Einleitung 21

Derzeit wird diese Form der Ionenchromatographie hauptsächlich zur Probenaufbereitung vor

der eigentlichen PSP-Bestimmung eingesetzt, und zwar zur Abtrennung unerwünschter Matrix-

bestandteile oder zur Fraktionierung der PSP-Toxine vor ihrer weiteren chromatographischen

Auftrennung 88,106,124,128.

Die ersten Versuche, PSP-Toxine vor ihrer Detektion underivatisiert chromatographisch zu

trennen, basierten ebenfalls auf dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie 129,130. Sie

wurden aber in der Folgezeit von den oben angeführten leistungsfähigeren ionenpaarchromato-

graphischen HPLC-Verfahren abgelöst. Es gab jedoch weiterhin Versuche, PSP-Toxine auf

Ionenaustauschern, insbesondere im Hinblick auf eine Kopplung der HPLC an das Massen-

spektrometer, zu trennen.

Pleasence et al. verwendeten eine PRP-1-Polymerphase (200 x 1 mm ID und 150 x 4,1 mm ID)

zur Trennung von PSP-Toxinen. Die Trennung erfolgte isokratisch mit einem Ammonium-

formiat-Eluenten (10 mmol/L), der geringe Mengen an Acetonitril (5%) enthielt. Eine vollstän-

dige Auftrennung der PSP-Toxine konnte jedoch nicht erreicht werden (Neo/STX bzw.

Neo/GTXs eluierten gemeinsam) 115.

1995 publizierten Kirschbaum et al. eine HPLC-Methode, die eine teilweise Trennung der PSP-

Toxine ermöglichte, ohne das auf Ionenpaarbildner oder nichtflüchtige Puffer zurückgegriffen

werden mußte. Die PSP-Toxine wurden an einem schwachen Kationenaustauscher auf Poly-

styren-Divinylbenzen-Basis (Hamilton PRP X-200) getrennt, wobei zuerst PSP-Toxine mit

Sulfatgruppen (C- und B-Toxine sowie Gonyautoxine), dann Neo und dcSTX sowie schließlich

STX eluierten. Als Eluent wurde ein Ammoniumacetatpuffer (0,25 mmol/L) mit pH 6,5 verwen-

det. Neo, dcSTX und STX waren gut voneinander getrennt, während GTX2 und GTX3 koeluier-

ten 131.

1.2.2.3 Detektion nach HPLC-Trennung

1.2.2.3.1 Fluorimetrische Detektion

Die alkalische Oxidation der PSP-Toxine zu fluoreszierenden Verbindungen bildete die Voraus-

setzung, die Toxine nach chromatographischer Trennung selektiv und empfindlich zu detek-

tieren. Hierfür boten sich zwei methodische Varianten der HPLC-Verfahren mit Derivatisierung

an: die Umsetzung der PSP-Toxine vor der HPLC-Trennung (pre-column) als auch nach der

HPLC-Trennung (post-column).

1. Einleitung 22

Die Vorteile der pre-column Derivatisierung (Lawrence et al.) liegen in der leichten Durchführ-

barkeit und direkten Kontrolle der Derivatisierungsreaktion. Zudem kann auf die aufwendige

Apparatur zur Nachsäulenderivatisierung verzichtet werden.

Für eine Anwendung in der Routineanalytik ist ein pre-column Verfahren jedoch wenig geeignet,

da bei der Oxidation einiger PSP-Toxine identische Reaktionsprodukte gebildet werden bzw.

mehrere Reaktionsprodukte entstehen und somit im Chromatogramm mehrere Signale für die

gleiche Verbindung angezeigt werden. Durch Variation der Oxidationsbedingungen läßt sich

zwar die Reaktion auf nur ein Reaktionsprodukt hin verschieben, jedoch kann nicht das gleiche

Oxidationsmittel für alle Toxine eingesetzt werden, so daß zweimal mit unterschiedlichen Oxi-

dationsmitteln (H2O2 und Perjodsäure) derivatisiert und chromatographiert werden muß 107,132.

Bei den HPLC-Verfahren mit Nachsäulenderivatisierung (Sullivan et al., Oshima et al., Thielert

et al.) ist die Anzahl der entstandenen Oxidationsprodukte unerheblich, da die chromato-

graphische Trennung beendet ist und die Oxidationsprodukte eines PSP-Toxins bei der Detektion

summarisch erfaßt werden. Trotz des höheren apparativen Aufwandes sind HPLC-Verfahren mit

post-column Derivatisierung als „on-line“ Verfahren leicht automatisierbar 133.

Bei der Nachsäulenderivatisierung erfolgt die Oxidation der PSP-Toxine ebenfalls überwiegend

auf chemischem Wege mit Hilfe von Perjodsäure.

1.2.2.3.2 Elektrochemische Detektion

Eine vielversprechende Alternative zur chemischen Oxidation stellt die Substitution durch einen

elektrochemischen Detektor bzw. die Kombination der elektrochemischen Oxidation mit der

Fluoreszenzdetektion dar.

Die elektrochemische Oxidation basiert auf der Reaktion des Analyten bei einem definierten

Oxidationspotential. Befindet sich ein oxidierbares Molekül im Eluenten zwischen der Referenz-

und der Arbeitselektrode, werden von diesem Elektronen abgegeben und es fließt ein meßbarer

Strom. Im allgemeinen steigt mit Zunahme des angelegten Potentials das Ausmaß der oxidierten

Komponenten und damit die Intensität des erzeugten Signals.

Zur Oxidation von PSP-Toxinen wird ein positives Potential angelegt. Hydrodynamische

Voltammogramme zeigen für Saxitoxin eine signifikante Oxidation bei Potentialen > +0,8 V.

Die erzeugten Oxidationsprodukte der PSP-Toxine sind ebenfalls fluoreszenzaktiv, so daß auch

ein Fluoreszenzdetektor zur PSP-Bestimmung eingesetzt werden kann 131,134,135.

1. Einleitung 23

Elektrochemische Zellen können nach zwei Funktionsprinzipien arbeiten, und zwar in coulo-

metrischer und amperometrischer Arbeitsweise. Bei den auf dem Markt befindlichen elektro-

chemischen Detektoren mit coulometrischer Arbeitsweise fließt der Eluent durch eine poröse

Graphitelektrode, so daß an dieser Arbeitselektrode ein Stoffumsatz von nahezu 100% resultiert 104. Mit Hilfe der selektiv und empfindlich arbeitenden elektrochemischen Oxidation wird die

Nachsäulenderivatisierung apparativ vereinfacht, und Verdünnungseffekte durch Zufluß von

zusätzlichen Reagenzien werden vermieden. Ihr Einsatz bei ionenpaarchromatographischen

Verfahren ist jedoch aufgrund der ungeeigneten Zusammensetzung der mobilen Phasen limitiert.

1.2.2.3.3 Massenspektrometrische Detektion

Im Gegensatz zur Kopplung Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS), die technisch

ausgereift und seit langem im Einsatz ist, befinden sich Methoden, die auf der Kopplung der

Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie (LC/MS) beruhen, immer noch in der

Entwicklung 136,137.

Das Vorhandensein von stark polaren und ionisierbaren Gruppen macht die PSP-Toxine theore-

tisch zu idealen Kandidaten nicht nur für Trennverfahren, die auf der Mobilität in wäßrigen

Puffern beruhen, sondern auch für LC/MS Kopplungstechniken auf der Basis dieser wäßrigen

Eluenten. Dabei stellt das Massenspektrometer ein alternatives Detektionssystem dar, mit dem

der spezifische Nachweis einzelner PSP-Toxine möglich ist.

Die Analyten müssen mit dem Eluenten vor der massenspektrometrischen Detektion in die Gas-

phase überführt und ionisiert werden. Dazu sind folgende Voraussetzungen unabdingbar: 137

1. Größere Lösungsmittelvolumina (Flußraten bis 1 mL/min) müssen in den Bereich des

Hochvakuums gebracht werden.

2. Die Moleküle der mobilen Phase als auch des Analyten müssen verdampfbar sein. Dabei

sollte die Ionisierung des Analyten weitgehend zerstörungsfrei erfolgen, um Informatio-

nen bzgl. der molaren Masse zu erhalten.

Wegen der thermischen Instabilität der PSP-Toxine haben sich schonende Ionisierungstechniken

wie FAB (Fast Atom Bombardment) –Ionisierung und API (Atmospheric Pressure Ionisation) als

geeignet für die Analyse von PSP-Toxinen erwiesen.

1. Einleitung 24

Die FAB-Ionisierung ist die ältere Ionisierungstechnik für PSP-Toxine. Hierbei erfolgt die Ioni-

sierung durch hochenergetische Atome (z.B. Xenon), die die Moleküle aus einer viskosen Matrix

(Glycerol) herauslösen. Die Bombardierung der Probe führt zur Bildung positiver und negativer

Ionen, die in einem Desorptionsprozeß von der Oberfläche gelöst werden. Diese Ionen entstehen

am häufigsten durch Protonierung von basischen oder durch Deprotonierung von sauren funktio-

nellen Gruppen.

Die FAB-Matrix wird dem LC-Eluat zugesetzt und das Gemisch über eine Kapillare in die

Ionenquelle eingeführt. Im dort herrschenden Hochvakuum verdampft das Laufmittel, evtl. un-

terstützt durch eine erhöhte Ionenquellentemperatur. Durch diesen Ansatz sind die Flußraten auf

0,5–15 µL/min beschränkt. Bei der in der PSP-Analytik eingesetzten „continuous flow“ FAB-

Ionisierung läuft das LC-Eluat in der Ionenquelle über eine Targetoberfläche, überschüssiges

Laufmittel wird von einem Filterpapierpaket aufgesaugt (Abb. 8) 138-140.

Abb. 8: Prinzip eines FAB-Interfaces für die LC/MS-Kopplung 141

Es zeigte sich jedoch, daß API-Interfaces für sehr polare Komponenten, die bereits in wäßriger

Lösung eine Ladung tragen, weitaus leistungsfähiger sind 142. Bei der API resultiert die Ionen-

bildung aus einer „Ionenevaporation“ mit Hilfe eines Spannungsfeldes. Durch Versprühen des

Eluenten und der in ihm gelösten Analyten werden Ionen aus Mikrotröpfchen (Aerosol) unter

Atmosphärendruck erzeugt und in den Hochvakuumbereich des Massenspektrometers gelenkt.

Mit Unterstützung eines Nebulizer-Gases kann dieses Ionenspray-Verfahren bei Flußraten bis zu

2 mL/min eingesetzt werden.

Glycerol

HPLC-Eluat

Target

Probe gelöst in Matrix Filter

Moleküle an der Oberfläche

10-15 kV Linsensystem der Ionenquelle

1. Einleitung 25

Für die API stehen heute zwei Techniken zur Verfügung: die API mit chemischer Ionisierung

(Atmospheric Pressure Chemical Ionisation, APCI) sowie die API mit Elektrospray-Ionisierung

(ESI), wobei letztere vorrangig zur Bestimmung von PSP-Toxinen Anwendung findet 115,143-145.

Bei der ESI wird das Eluat mit den Analyten durch eine Kapillare, an deren Ende eine Spannung

von mehreren Kilovolt anliegt, mit Druckluft versprüht. Das starke elektrische Feld und das

Versprühen bewirken die Bildung geladener Tröpfchen, die dann in Richtung Vakuumbereich

(Analysatoreintrittsöffnung des MS) driften. Dabei verringert sich die Größe der Tröpfchen

stetig durch Verdampfung des Lösungsmittels, verbunden mit einem Anstieg der elektrischen

Ladungsdichte. Die Ladung der Tröpfchen bewirkt, daß Ionen an die Tröpfchenoberfläche treten

(Coulomb-Effekt). Ab einem kritischen Wert werden die Ionen durch die Coulomb-Abstoßung

spontan in die Gasphase emittiert. In Abhängigkeit von der Anzahl basischer oder saurer

Gruppen im Analytenmolekül werden dabei einfach oder mehrfach geladene Ionen erzeugt

(Abb. 9). Die Temperatur des Inertgases hat keinen Einfluß auf die Stabilität des Analyten, da

selbst bei sehr hoher Gastemperatur die Temperatur der Tröpfchen aufgrund der Abkühlung

durch Verdampfung 50°C nicht übersteigt. Somit stellt die ESI eine schonende Ionisierungs-

technik dar, die auch für thermisch labile Moleküle wie PSP-Toxine geeignet ist. Von Nachteil

ist, daß ein sehr hoher Wasseranteil und auch eine hohe Konzentration an Elektrolyten im Eluat

die ESI erschweren 137,146.

Abb. 9: Prinzip eines ESI-Interfaces für die LC/MS-Kopplung

Je nach Meßbedingung (positive oder negative Ionisierung) werden Molekülionen wie (M+H)+

oder (M-H)- erhalten, die anschließend nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis im magnetischen

oder elektrischen Feld aufgetrennt werden. Dazu finden in der PSP-Analytik vorzugsweise

Quadrupolmassenspektrometer Anwendung. Während bei der LC/MS mit Single-Quadrupol-

HPLC-Eluat

Nebulizer Gas 3-6 kV

Stickstoff-Fön

Curtain Gas

N2

N2

1. Einleitung 26

geräten meist nur Aussagen zu molaren Massen gegeben werden können, liefern bei der LC/MS-

MS sogenannte Triple-Geräte (auch als Tandem-Massenspektrometer bezeichnet) durch charak-

teristische Fragmentierungen der Molekülionen zusätzliche Informationen zur Struktur unbe-

kannter Verbindungen.

Quilliam et al. wandten die MS-Detektion mittels ESI erstmals 1989 zum Nachweis von STX an

und erzielten mittels „direct flow injection“ Nachweisgrenzen von ca. 30 pg STX, d.h. es konn-

ten noch 0,1 µmol STX aus 1 µL injiziertem Extrakt nachgewiesen werden, welches einer dem

Maus-Bioassay gegenüber fünffach höheren Sensitivität entspricht 147. Die Vorgehensweise der

„direct flow injection“ ohne direkt gekoppelte chromatographische Trennung wird bereits viel-

fach zur eindeutigen Identifizierung von zuvor aus Probenmaterial fraktionierten PSP-Toxinen

herangezogen 21,148-150. Hingegen wird die LC/MS-Kopplung bisher nur wenig eingesetzt, da die

Volatilität der Eluenten als wesentlichste Voraussetzung für die ESI-Technik bei den derzeit in

der Routineanalytik angewandten ionenpaarchromatographischen HPLC-Verfahren nicht gege-

ben ist (vgl. Kap. 1.2.2.1). Allerdings wurden durch Kirschbaum et al., Pleasance et al. und

Quilliam et al. (vgl. Kap. 1.2.2.2) in den letzten Jahren Fortschritte hinsichtlich des Einsatzes der

Kopplung LC/MS erzielt, obwohl noch keine befriedigende chromatographische Trennung der

wichtigsten PSP-Toxine vor der MS-Detektion gelungen war 115,131,132,151.

2. Zielstellung 27

2. Zielstellung

Im Hinblick auf einen effektiven Verbraucherschutz und um die betroffenen Wirtschaftszweige

vor erheblichen finanziellen Verlusten zu bewahren, ist die Kontrolle der Interaktion von PSP-

Toxinen mit biologischem Material, nicht zuletzt wegen der offensichtlichen Zunahme toxischer

Algenblüten und der damit verbundenen steigenden Kontamination von Nahrungsmitteln

mariner Herkunft mit PSP-Toxinen, unerläßlich. Voraussetzung für ein besseres Verständnis der

Rolle von Algentoxinen in der marinen Umwelt ist jedoch das Vorhandensein bzw. die Entwick-

lung leistungsfähiger analytischer Verfahren.

Die bisher entwickelten Methoden zur quantitativen Bestimmung der PSP-Toxine weisen jedoch

eine Reihe von Nachteilen auf. So sind biologische und biochemische Tests verhältnismäßig

unspezifisch und erlauben auch nach Ionenaustauscheraufreinigung, ebenso wie die Fluoreszenz-

messung, nur die summarische Bestimmung von PSP-Toxinen.

Zur Quantifizierung einzelner PSP-Toxine werden die Kapillarelektrophorese (CE) und HPLC-

Verfahren mit Fluoreszenzdetektion eingesetzt. CE-Verfahren weisen wegen der Begrenzung auf

extrem kleine Injektionsvolumina eine geringe Sensitivität sowie eine ungenügende Reprodu-

zierbarkeit bei der Analyse von Muschelextrakten auf. Die Nachteile der in der Routineanalytik

eingesetzten HPLC-Verfahren liegen in der unbefriedigenden Trennung einzelner PSP-Toxine

sowie in der chemischen Derivatisierung, d.h. in der post-column Oxidation der PSP-Toxine zu

fluoreszierenden Derivaten, welche apparativ aufwendig und sehr störanfällig ist (schwankende

Flußraten, häufiges Verstopfen des Reaktionscoils). Außerdem sind die verwendeten Ionenpaar-

bildner nicht nur kostenintensiv, sondern sie verhindern zusammen mit dem Phosphat im Eluen-

ten auch die Kopplung an ein Massenspektrometer. Die LC/MS-Kopplung ist jedoch eine

conditio sine qua non, um selektiv detektierte Toxine spezifisch nachzuweisen sowie bisher noch

nicht bekannte Strukturen potentiell toxischer Verbindungen in toxischen Extrakten aufzuklären.

Im Rahmen der Arbeiten zur Promotion stellte sich somit zunächst die Aufgabe, die an der

Universität Jena zur PSP-Bestimmung eingesetzte HPLC-Methode nach Thielert et al. zu

optimieren. Im Anschluß daran sollte eine leistungsfähigere und kostengünstigere HPLC-

Methode erarbeitet werden, wobei an eine Substitution der chemischen Oxidation durch eine

elektrochemische gedacht war. Gleichzeitig sollte durch Einsatz von ausschließlich flüchtige

Verbindungen enthaltende HPLC-Eluenten die Kopplung an ein Massenspektrometer ermöglicht

werden.

2. Zielstellung 28

Außerdem mußte die neue Methode die exakte Bestimmung einzelner PSP-Toxine in Algen- und

Muschelextrakten erlauben und nach Möglichkeit auch zur Gewinnung dringend benötigter PSP-

Standardsubstanzen einsetzbar sein.

Neben diesen rein methodischen Arbeiten waren Experimente zur Abschätzung des für den

Verbraucher bestehenden Gefährdungspotentials durch kommerziell genutzte und mit PSP-

Toxinen belastete Schalentiere sowie zur Aufklärung metabolischer Prozesse, welche das

Schicksal der PSP-Toxine in der marinen Nahrungskette bestimmen, durchzuführen. Deshalb

sollten PSP-haltige Algenzellen verschiedenen Muschel- und Schneckenarten unter kontrollier-

ten Bedingungen als Nahrung angeboten werden, um neue Erkenntnisse hinsichtlich der artspezi-

fischen Toxinaufnahme und Detoxifikation sowie bzgl. der Entstehung charakteristischer Toxin-

profile, die durch die in den Mollusken ablaufenden Metabolisierungen beeinflußt werden, zu

gewinnen.

Ergänzend zu den Fütterungsexperimenten sollten durch in vitro Inkubationsversuche mit aus

Muscheln und Schnecken gewonnenen Gewebehomogenisaten nach Zugabe eines essigsauren

PSP-haltigen Algenextraktes genauere Aussagen über die art- und gewebespezifischen Toxin-

umwandlungen in den Tieren ermöglicht werden, zumal Experimente dieser Art bisher kaum

durchgeführt worden waren.

3. Optimierung eines ionenpaarchromatischen Verfahrens... 29

II EXPERIMENTELLER TEIL

3. Optimierung eines ionenpaarchromatographischen Verfahrens zur Bestimmung

von PSP-Toxinen

3.1 Analytische Ausgangslage

An der Universität Jena wird zur PSP-Bestimmung die in den letzten Jahren mehrfach modifi-

zierte HPLC-Methode nach Thielert et al. (vgl. Kap. 1.2.2.1) sowohl für Routinemessungen als

auch für Analysen zu Forschungszwecken angewendet. So steigerte zunächst Hummert die

Effizienz der Nachsäulenderivatisierung durch eine Temperaturerhöhung auf 50 °C. Auch schlug

er einen pH-Wert von 6,9 statt des bisherigen Wertes von 6,6 für beide Eluenten vor 152. Yu et al.

gelang die Trennung der häufig vorkommenden und damit lebensmittelrechtlich relevanten

Gonyautoxine 1 und 4 (die bei der Methode nach Thielert et al. nicht getrennt werden) durch

eine Verringerung der Konzentration der Oktansulfonsäure im Starteluenten A um 50% 153.

Diese Konzentrationsabsenkung war jedoch mit einer geringen Reproduzierbarkeit der Ergebnis-

se verbunden bzw. Messungen in Serie waren nur nach Einschaltung einer sehr langen

Equilibrierungszeit von 80 Minuten möglich. Um die modifizierte Thielert-Methode dennoch zur

PSP-Bestimmung in der Routineanalytik einsetzen zu können, war eine Optimierung der

chromatographischen Bedingungen dringend erforderlich.

3.2 Optimierung der Methode nach Thielert et al.

Die erforderliche sehr lange Equilibrierungszeit ließ auf eine starke Wechselwirkung des nur im

Eluenten B enthaltenen Acetonitrils mit der stationären Phase schließen, welche sich nachteilig

auf die GTX-Trennung im nächsten Lauf auswirkte. Deshalb wurde zunächst versucht, den

Anteil des organischen Modifiers im Eluenten B ohne Verlust an Trennleistung hinsichtlich der

2fach positiv geladenen PSP-Toxine zu verringern. Es waren aber nur geringfügige Änderungen

möglich (Absenkung des Acetonitrilanteils von 15% auf 12%), die keine wesentlichen Verbes-

serungen brachten. Der Austausch von Acetonitril durch THF bzw. Oktansulfonsäure ver-

schlechterte die Trennung von Neo, dcSTX und STX.

Die Tatsache, daß bei der originalen Thielert-Methode 12minütiges Spülen der Säule mit einem

Oktansulfonsäure in höherer Konzentration enthaltenden Eluenten A zur Herstellung der Aus-

gangsbedingungen ausreicht, führte zu der Überlegung, zunächst die Equilibrierung mit diesem

Eluenten A auch bei der modifizierten Thielert-Methode durchzuführen. Anschließend sollte mit


dem modifizierten Starteluenten A die Wiederherstellung der Ausgangsbedingungen in deutlich

kürzerer Zeit als bei Yu et al. möglich sein, denn diese beiden Eluenten weisen nur geringe

Unterschiede in der Zusammensetzung auf. Die Umsetzung dieser Überlegungen in die Praxis

brachte den gewünschten Erfolg (Abb. 10 und 11).

Abb. 10: Optimierung der PSP-Bestimmungsmethode: Chromatogramme einer PSP-

Standardlösung 1. Thielert-Methode 2. optimierte Methode

Die gegenüber der originalen Thielert-Methode um 12 Minuten verlängerte Meßdauer war tole-

rierbar, machte jedoch die Einführung eines dritten Eluenten notwendig. Neben den Eluenten A

und B wird bei der optimierten Methode ein Eluent C, welcher der Zusammensetzung von Eluent

A ohne Oktansulfonsäure entspricht, zur „Verdünnung“ des Starteluenten eingesetzt (Tab. 5).

Nach dieser Optimierung wurde die modifizierte Thielert-Methode als robustes und effizientes

HPLC/FLD-Verfahren zur PSP-Bestimmung im Routinebetrieb eingesetzt 154.

1.

2.


Tab. 5: Chromatographische Bedingungen der optimierten Thielert-Methode

Stationäre Phase: RP-C18, Phenomenex, Luna 5 µm, 4,6 x 250 mm mit 30 mm Vorsäule Eluent A: 98,5% Phosphorsäure (40 mmol/L) und Oktansulfonsäure (11 mmol/L, Na-Salz), pH 6,9 eingestellt mit konz. NH3 (v:v) 1,5% Tetrahydrofuran (v:v)

Eluent B: 83,5% Phosphorsäure (50 mmol/L) und Oktansulfonsäure (13 mmol/L, Na-Salz), pH 6,9 eingestellt mit konz. NH3 (v:v) 1,5% Tetrahydrofuran (v:v) 15% Acetonitril (v:v)

Eluent C: 98,5% Phosphorsäure (40 mmol/L), pH 6,9 eingestellt mit konz. NH3 (v:v) 1,5% Tetrahydrofuran (v:v) Flow: 1,0 mL/min Gradient: Zeit (min) Eluent A (%) Eluent B (%) Eluent C % 0 50 0 50 11 50 0 50 13 0 100 0 33 0 100 0 34 100 0 0 46 100 0 0 47 50 0 50 57 50 0 50

Abb. 11: Reproduzierbarkeit der GTX1/GTX4-Trennung anhand der Retentionszeiten nach 5facher

Injektion in Folge (MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung)

Nummer der Messung

1 2 3 4 5

Ret

entio

nsze

it, m

in

9,0

9,2

9,4

9,6

9,8

10,0

GTX4

GTX1MW = 9,71 min SD = 0,03 min

MW = 9,19 min SD = 0,03 min

4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens... 32

4. Entwicklung eines ionenaustauschchromatographischen Verfahrens zur Bestim-

mung von PSP-Toxinen

4.1 Wahl der stationären und mobilen Phase

Zur routinemäßigen Quantifizierung von PSP-Toxinen existieren eine Reihe von HPLC-

Methoden, die alle auf den Zusatz von Ionenpaarbildnern und der Trennung an C18-Umkehr-

phasen basieren (vgl. Kap. 1.2.2.1). Da sich eine hohe Konzentration an nichtflüchtigen Alkyl-

sulfonsäuren und Phosphat im Eluenten als nachteilig für die elektrochemische Oxidation und

die direkte Kopplung der HPLC mit der Massenspektrometrie erwies, sollte für die HPLC-

Bestimmung der PSP-Toxine nicht auf die Ionenpaarchromatographie zurückgegriffen werden.

Allerdings gelingt bei Verzicht auf Ionenpaarbildner im Eluenten die chromatographische Tren-

nung der PSP-Toxine mit den üblichen Umkehrphasen und auch mit Cyano-, Phenyl- und Diol-

phasen sowie an Aminophasen nicht 127,155.

Aufgrund des ionischen Charakters der PSP-Toxine bietet sich ihre Trennung mit Hilfe von

Ionenaustauschermaterialien an. In bisherigen Arbeiten kamen dabei fast ausschließlich schwa-

che Kationenaustauscher (PRP-X-200, Hamilton) auf Polystyren-Divinylbenzen Basis zur

Anwendung. Aber auch hiermit gelang die vollständige Trennung der PSP-Toxine, insbesondere

von GTX2/GTX3, nicht 131,152. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde bei den eigenen Untersuchun-

gen hauptsächlich mit starken Ionenaustauschern gearbeitet, um mit breiteren Variations-

möglichkeiten innerhalb des pH-Wertes bessere Trennungen zu erreichen. Am leistungsfähigsten

erwiesen sich die Säulen Source 15S PE100/4.6 (starker Kationenaustauscher) sowie Source 15Q

PE100/4.6 (starker Anionenaustauscher) der Firma Pharmacia Biotech auf Polystyren-

Divinylbenzen-Basis. Das 15 µm-Material gewährleistet eine gute Auflösung bei gleichzeitiger

Robustheit und Belastbarkeit, so daß die Säulen ihr Trennverhalten über längere Zeit beibehal-

ten.

Für eine optimale Trennung wurden jeweils zwei der relativ kurzen Säulen miteinander verbun-

den. Es wurde dabei sowohl mit Kationenaustauschern als auch mit Anionenaustauschern gear-

beitet, um neben den positiv geladenen Carbamoyl- und Decarbamoyltoxinen auch die neutralen

bzw. negativ geladenen C-Toxine zu erfassen. Letztere standen, da nicht als kommerzielle

Toxinstandards erhältlich, in Form eines C-Toxine enthaltenden Algenextraktes (Alexandrium fundyense CCMP 1719) zur Verfügung.

Als Puffersubstanz im wäßrigen Eluenten wurde zunächst Ammoniumacetat gewählt, dessen

Pufferwirkung im Bereich von pH 4 bis pH 9 liegt, wobei die PSP-Toxine in unterschiedlich

protonierter Form vorliegen. Anschließend wurden weitere Puffersubstanzen getestet.


4.2 Einfluß verschiedener Elutionsbedingungen auf die Toxintrennung

Die Ionenaustauschchromatographie bietet zahlreiche Möglichkeiten, das Retentionsverhalten

der zu trennenden Verbindungen durch die Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase

zu beeinflussen. Dies geschieht durch

• die Art des Puffers,

• die Konzentration der Pufferlösung (Ionenstärke),

• die Variation des pH-Wertes des Eluenten,

• die Art des organischen Modifiers,

• die Konzentration des organischen Modifiers,

• die Verwendung eines Gradientenprogrammes.

4.2.1 Variation der Pufferstärke

Bei der Ionenaustauschchromatographie führt eine Erhöhung der Pufferkonzentration zu einer

Verkürzung der Retentionszeiten, wobei gleichzeitig schärfere Peaks erhalten werden. In Anleh-

nung an die Arbeiten von Hummert et al. und Kirschbaum et al., die hohe Konzentrationen an

Puffersalzen zur Elution der PSP-Toxine benötigten (500 mmol/L Ammoniumformiat bzw.

250 mmol/L Ammoniumacetat), wurde eine ähnlich hohe Ionenstärke gewählt und schrittweise

abgesenkt 131,152. Abb. 12 verdeutlicht diesen Effekt am Beispiel der Elution von GTX2/GTX3

und STX. Hierbei zeigte sich, daß die erforderliche Ionenstärke zur Elution der einfach und

zweifach positiv geladenen PSP-Toxine um eine Zehnerpotenz divergiert. Pufferkonzentrationen

von 10 mmol/L und weniger lieferten keine reproduzierbaren Retentionszeiten und Peakformen

mehr.

1.

STX


2.

Abb. 12: Einfluß der Pufferkonzentration bei pH 6,9 auf die Elution von 1. STX und 2. GTX2/GTX3 (GTX2/GTX3-Standard enthält Spuren dcGTX2/dcGTX3, vorderer Peak) 1. A = 450 mmol/L Ammoniumacetat, B = 350 mmol/L, C = 300 mmol/L, D = 250 mmol/L 2. A = 150 mmol/L Ammoniumacetat, B = 50 mmol/L, C = 20 mmol/L

Zur optimalen Retention von C-Toxinen auf dem Anionenaustauscher war eine niedrigere

Pufferkonzentration von 20-50 mmol/L Ammoniumacetat erforderlich (Elution nach 10-25 min),

wobei C2 im Vergleich zu C1 eine deutlich stärkere Affinität zur stationären Phase aufwies.

4.2.2 Variation der Art des Puffers

Die Substitution von Ammoniumacetat durch Ammoniumformiat ergab sowohl auf dem

Anionenaustauscher als auch auf dem Kationenaustauscher Verlängerungen der Retentions-

zeiten. Während jedoch die Nachweisempfindlichkeit der PSP-Toxine mit Formiat bei chemi-

scher Oxidation im Vergleich zu Acetat bis um das Doppelte höher lag, traten Probleme auf,

wenn die PSP-Toxine elektrochemisch oxidiert wurden (Schwankungen der Stromstärke,

beschleunigte Belegung der Elektrodenoberfläche).

Trifluoressigsäure zeigte als starke, fast vollständig dissoziierte Säure bei ihrer Verwendung als

Elutionsmittel auf Anionenaustauschern die stärkste Elutionskraft (Abb. 13). Sie besitzt jedoch

im neutralen pH-Bereich keine Pufferwirkung, so daß eine schlechte Reproduzierbarkeit bei der

Injektion von Extrakten mit hoher Ionenstärke resultierte.

GTX2/GTX3


1.

2.

Abb. 13: Einfluß der Pufferart auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 (kleinerer Peak C1) bei

pH 6,9 1. A = 300 mmol/L Ammoniumacetat, B = 300 mmol/L Ammoniumformiat

C = 300 mmol/L Trifluoressigsäure 2. A = 35 mmol/L Ammoniumacetat, B = 35 mmol/L Ammoniumformiat

C = 35 mmol/L Trifluoressigsäure

4.2.3 Variation des pH-Wertes

Mit dem pH-stabilen Säulenmaterial wurde das Elutionsverhalten der PSP-Toxine von pH 2,5 bis

9,5 untersucht. Eine signifikante Verlängerung der Retentionszeit trat beim Kationenaustauscher

bei niedrigen pH-Werten nicht auf, aber schon bei pH-Werten <6 kam es zu einem starken Ver-

lust an Detektionsempfindlichkeit (durch Inhibierung der Öffnung des Ketonringes). Für pH-

Werte zwischen 7 und 8 ergab sich eine leichte Zunahme der Sensitivität, jedoch zeigten sich bei

Neo bereits Doppelpeaks. Erst bei pH-Werten >9 verringerten sich die Retentionszeiten für die

positiv geladenen PSP-Toxine auf dem Kationenaustauschermaterial deutlich (Abb. 14/1.).

STX

C1/C2


1.

2.

Abb. 14: Einfluß des pH-Wertes auf die Elution von 1. STX mit 300 mmol/L Ammoniumacetat

und 2. C1/C2 mit 20 mmol/L Ammoniumacetat 1. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5; D = pH 9,5 2. A = pH 6,9; B = pH 4,5; C = pH 8,5

Hingegen beschleunigten niedrige pH-Werte die Elution der C-Toxine auf Anionenaustauscher-

materialien (allerdings nur bis herab zu pH 4,5), während pH-Werte >8 hier in einer deutlichen

Retentionszeitverlängerung für C1 und C2 resultierten (Abb. 14/2.).

Im Gegensatz zu Ammoniumformiat und Ammoniumacetat weist Trifluoressigsäure in wäßriger

Lösung einen sehr niedrigen pH-Wert (pH 1,7) auf. Bei diesem niedrigen pH-Wert fand auf

Anionenaustauschern keine Retention von PSP-Toxinen statt, während auf Kationenaustauschern

für die Elution der stärker basischen Toxine ähnlich hohe Konzentrationen von Trifluoressig-

säure wie für Ammoniumacetat und Ammoniumformiat erforderlich waren.

STX

C1/C2


4.2.4 Einfluß organischer Modifier

Zum Erreichen einer besseren Trennleistung werden in der Chromatographie häufig Acetonitril

(ACN) oder Methanol als Modifier eingesetzt. 1.

2.

Abb. 15: Einfluß von Acetonitril bei pH 6,9 auf die Elution von 1. STX und 2. C1/C2 1. A = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v) B = 250 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril 2. A = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 30% Acetonitril (v:v)

B = 10 mmol/L Ammoniumacetat, 0% Acetonitril (keine Elution von C2 nach 60 min) Nach Hummert wird beim Übergang von reinem Formiatpuffer (500 mmol/L, pH 6,5) auf

Formiatpuffer/ACN = 50/50 die Retentionszeit von STX auf einer PRP-X-200 Säule mehr als

verdoppelt 152. Die mit Acetonitril bewirkte Änderung der Polarität der mobilen Phase führte hier

jedoch zu einer beschleunigten Elution der PSP-Toxine auf Ionenaustauschermaterialien (Abb.

15). Aber im Hinblick auf eine massenspektrometrische Detektion könnte durch Substitution von

Puffer durch ACN eine zu hohe Pufferkonzentration im Eluenten (Ionisierungssupression) ver-

mieden werden.

STX

C1/C2

C1/C2


Zur Aufrechterhaltung der Stabilität des eingesetzten Säulenmaterials war die Verwendung von

Acetonitril auf anteilig 30% begrenzt, und diese Konzentration führte zu einer Halbierung der

Retentionszeiten für PSP-Toxine. C2 eluierte bereits bei 10 mmol/L Ammoniumacetat.

Die Elutionskraft von Methanol ist im Vergleich zu Acetonitril zwar geringer, das Säulen-

material ließ jedoch eine fast vollständige Substitution von Wasser durch Methanol zu. Ein ho-

hes Mischungsverhältnis zugunsten von Methanol (75:25) verringerte signifikant die Retentions-

zeiten (Halbierung für Neo, dcSTX, STX), resultierte aber in einer Verschlechterung der Trenn-

leistung (z.B. für GTX1/GTX4) und der Peakform, in einem starken Druckanstieg im gesamten

System sowie in einer schnellen Belegung der Elektrodenoberfläche in der elektrochemischen

Zelle.

4.2.5 Optimierung der Trennleistung durch Gradientenelution

In natürlich kontaminierten Proben liegen oft komplexe PSP-Toxingemische von bis zu 12

Einzelsubstanzen mit unterschiedlicher Polarität vor, wodurch eine Gradientenelution unum-

gänglich wird.

Aufgrund der sehr unterschiedlich starken Affinität von einfach und zweifach positiv geladenen

PSP-Toxinen zur stationären Phase lag es nahe, mit Hilfe eines Pufferstärkegradienten zu

eluieren. Da es nicht gelang, sowohl anionische als auch kationische PSP-Toxine auf einem

Säulenmaterial zu trennen, wurde versucht, durch Kombination beider Austauschermaterialien

die chromatographische Trennung aller PSP-Toxine in einem Run zu erreichen. Mit der Kopp-

lung eines Anionen- und zweier Kationenaustauscher in Reihe wurde die optimale Variante

gefunden, wobei die Reihenfolge von An- und Kationenaustauschern eine Rolle spielte.

Der optimale Pufferstärkegradient erstreckt sich über 25 Minuten linear von 20 mmol/L bis

450 mmol/L Ammoniumacetat (Tab. 6). Ein nur schwacher Anstieg des Gradienten war für die

Trennung der Gonyautoxine unerläßlich, und ein sich an die GTX-Trennung anschließender

steilerer Gradient hätte zu starker Basisliniendrift im Elutionsbereich von Neo/dcSTX/STX

geführt. Auch war ein pH-Gradient wegen auftretender Sensitivitätsverschlechterung und Basis-

liniendrift zu vermeiden.


Tab. 6: Chromatographische Bedingungen der neu entwickelten HPLC-Methode auf Basis von Ionenaustauschern zur Bestimmung von PSP-Toxinen

Stationäre Phase: 1x Source 15Q PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-31) 2x Source 15S PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-32) 15 µm Korngröße, Polystyren-Divinylbenzen-Polymer (Pharmacia Biotech) Eluent A: 20 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9 Eluent B: 450 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9 Flow: 0,8 mL/min Gradient: Zeit (min) Eluent A (%) Eluent B (%) 0 100 0 5 100 0 30 0 100 38 0 100 39 100 0 65 100 0 Post-column Derivatisierung: elektrochemisch, +1,05 V Detektion: Fluoreszenzdetektion bei Ex.: 330 nm, Em.: 395 nm

Das Chromatogramm in Abb. 16 zeigt die Elutionsfolge der am häufigsten vorkommenden PSP-

Toxine. Die Dauer eines Runs beträgt inklusive der Equilibrierungszeit 65 min.

Abb. 16: HPLC-Chromatogramm der Alge Alexandrium fundyense, dotiert mit einem PSP-Standardgemisch


4.3 Detektion

Die einfache Zusammensetzung der mobilen Phase sowie der unkomplizierte Gradient eröffne-

ten bei der Nachsäulenderivatisierung die Möglichkeit, die chemische Oxidation der PSP-Toxine

durch eine elektrochemische Oxidation zu substituieren und hierzu einen elektrochemischen

Detektor einzusetzen (ELCD).

Zur Gewährleistung eines nahezu vollständigen Stoffumsatzes ist ein nach dem coulometrischen

Prinzip arbeitender ELCD verwendet worden. Der Coulochem II der Firma ESA diente in den

vorliegenden Untersuchungen lediglich als Potentiostat, wobei die elektrochemische Oxidation

in einer „Guard cell“ stattfand. Diese besitzt im Vergleich zur Arbeitselektrode einer analy-

tischen Zelle eine größere Elektrodenoberfläche, die einen höheren Stoffumsatz ermöglicht und

gleichzeitig aufgrund größerer Poren weniger anfällig gegen Belegungen ist.

Die Messung der elektrochemisch erhaltenen Oxidationsprodukte der PSP-Toxine erfolgt im

Fluoreszenzdetektor bei Wellenlängen von 330 nm (Ex.) und 395 nm (Em.). Die Detektion mit

dem Fluoreszenzdetektor hat gegenüber der direkten Detektion mit dem ELCD den Vorteil einer

höheren Nachweisempfindlichkeit und Selektivität.

Die Wahl des angelegten Potentials ist als Kompromiß aus möglichst langer Lebensdauer der

„Guard cell“ und ausreichender Nachweisempfindlichkeit zu werten. Die Oxidation der PSP-

Toxine findet ab +0,8 V statt, jedoch resultiert bei einer weiteren Erhöhung des Oxidationspoten-

tials eine höhere Nachweisempfindlichkeit. Die Festlegung auf +1,05 V ergibt sich aus einer bei

diesem Potential mit der chemischen Derivatisierung vergleichbaren Empfindlichkeit. (Tab. 7).

Die unterschiedliche Elutionskraft von Ammoniumacetat und Ammoniumformiat wird durch das

Gradientenprogramm und die Kopplung von An- und Kationenaustauschern weitestgehend aus-

geglichen, jedoch sollte der Acetatpuffer für die elektrochemische und der Formiatpuffer für die

chemische Oxidation bevorzugt werden.

Die Verwendung von 30% Acetonitril im Eluenten ermöglicht eine deutliche Verminderung der

Pufferkonzentration. Sie führt jedoch bei der fluorimetrischen Detektion zu einer Basislinien-

drift. Da dieses Problem bei der massenspektrometrischen Detektion nicht auftritt, sollte beim

Betreiben der LC/MS-Kopplung zur PSP-Bestimmung der ACN-haltige Eluent eingesetzt wer-

den (vgl. Kap. 5.3).


4.4 Linearität und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzdetektion

Zur Kontrolle der Linearität und Reproduzierbarkeit der Fluoreszenzdetektion nach elektro-

chemischer Oxidation wurden 5 verschiedene Konzentrationen der als Standardlösungen verfüg-

baren PSP-Toxine je 3 mal in die HPLC-Apparatur injiziert. Die Detektionsgrenze (LOD) wurde

durch zweimalige Injektion der Toxinmenge bestätigt, die einem Signal-Rausch-Verhältnis von

3:1 im Chromatogramm des geringsten Kalibrationspunktes entsprach.

Die erhaltenen Ergebnisse ergaben eine gute Linearität bei guter Reproduzierbarkeit, wobei die

erreichten Nachweisgrenzen vergleichbar mit konventionellen HPLC-Verfahren, basierend auf

der Ionenpaarchromatographie mit chemischer Oxidation und Fluoreszenzdetektion, waren (Tab.

7 und 8).

Entsprechend der chemischen Oxidation zeigten auch die elektrochemischen Oxidationsprodukte

der N-1-OH-Toxine eine über 10fach geringere Fluoreszenzsensitivität als die STX-Analoga.

Tab. 7: LODs (S/N = 3:1) bei elektrochemischer Oxidation im Vergleich zur chemischen Oxida-tion einer konventionellen HPLC-Methode

Limit of detection (LOD, pg pro Injektion) Toxin

Chemische Oxidation 153 Elektrochemische Oxidation

GTX1 247 800 GTX2 10 10 GTX3 17 20 GTX4 218 550 Neo 800 600

dcSTX 16 20 STX 7 30

Tab. 8: Linearität der Fluoreszenzdetektion nach elektrochemischer Oxidation (5 Kalibrierpunkte pro Toxin)

Toxin Kalibrierbereich

Min – Max (ng) Kalibrierkurve

(y = mx+n) Korrelations- koeffizient r2

Rel. Standardabw. Min – Max (%)*

GTX1 3,450 – 15,500 28976 x + 0 0,937794 0,7 – 6,0 GTX2 0,600 – 4,800 2376510 x + 0 0,995834 1,7 – 3,4 GTX3 0,145 – 1,160 2864030 x + 0 0,994521 1,9 – 4,3 GTX4 1,720 – 6,100 46144 x + 0 0,964935 4,7 – 8,9 Neo 7,000 – 56,000 36891 x + 0 0,999620 2,0 – 4,5

dcSTX 0,500 – 4,000 2261770 x + 0 0,996341 1,1 – 4,2 STX 0,700 – 5,600 954390 x + 0 0,996337 0,7 – 2,7

* Die rel. Standardabweichung wurde für jeden Kalibrierpunkt ermittelt.


4.5 Anwendbarkeit des entwickelten HPLC-Verfahrens zur PSP-Bestimmung aus

komplexen Matrizes 4.5.1 Methodenvergleich bei der Bestimmung von PSP-Toxinen aus marinen Organismen

Die Leistungsfähigkeit der entwickelten Methode zur PSP-Bestimmung wurde bei der Unter-

suchung toxischer Algenproben und kontaminierter Muscheln im Rahmen von Forschungs-

projekten und Routineuntersuchungen offenbar. Stellvertretend für die Vielzahl von Messungen

sollen an dieser Stelle die Ergebnisse eines Vergleichs zwischen der im Rahmen dieser Arbeit

optimierten Thielert-Methode (ionenpaarchromatographische Trennung und Fluoreszenz-

detektion nach chemischer Oxidation) und des neu entwickelten Verfahrens (Ionenaustausch-

chromatographie mit elektrochemischer Oxidation und Fluoreszenzdetektion) vorgestellt wer-

den.

Bei dem analysierten Untersuchungsmaterial handelte es sich um 7 Algenproben auf Filtern

(„A“) und 12 Muschelproben („M“), die aus verschiedenen Forschungsprojekten stammten und

unter Berücksichtigung eines möglichst breiten Konzentrations- und Toxinspektrums für die

vorliegende Untersuchung zusammengestellt worden waren.

Die Bedingungen für die Probenaufbereitung nach dem Protokoll von Hummert et al. waren für

beide Verfahren identisch 156. Es wurde mit jeder Methode eine Doppelbestimmung der Essig-

säureextrakte der Proben durchgeführt und die Mittelwerte dieser Ergebnisse (in ng Toxin/µL

Extrakt) für den Vergleich und die statistische Auswertung herangezogen (Tab. 9 sowie Abb. 17

und 18). Die Herkunft der verwendeten Proben sowie die Ergebnisse aller Messungen sind im

Anhang aufgeführt.

Tab. 9: Korrelationskoeffizienten für den Vergleich der optimierten Thielert-Methode mit der neu

entwickelten PSP-Methode (alle Proben sowie aufgeteilt in Algen- und Muschelproben)

STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 PSP STXeq

Gesamt Algenproben

Muschelproben

0,9538

0,9996

0,9304

0,9983

0,9999

0,9959

0,9940

0,9997

0,9908

0,9916

0,9989

0,9816

0,9911

0,9999

0,9867

0,9950

0,9999

0,8918

0,9758

0,9995

0,9588

0,9976

0,9996

0,9899

0,9978

0,9997

0,9884


Abb. 17: Korrelation der Gesamt-PSP-Gehalte, gemessen mit der optimierten Thielert- und der neu

entwickelten Methode Abb. 18: Korrelation der Gehalte an Neo, gemessen mit der optimierten Thielert- und der neu ent-

wickelten Methode

Anhand der Korrelationskoeffizienten der einzelnen, direkt quantifizierbaren PSP-Toxine zeigte

sich sowohl bei Muschelproben als auch bei der Analyse toxischer Algen eine sehr gute Über-

einstimmung zwischen beiden Methoden. Die niedrigeren Koeffizienten der Muschelextrakte

waren auf den störenden Einfluß von Matrixbestandteilen, insbesondere auf die früh eluierenden

Gonyautoxine, zurückzuführen. STX zeigte nur in einer Muschelprobe voneinander abweichende

Werte, während für GTX3 die beste Korrelation bei höheren Konzentrationen beobachtet wurde.

Bei den Gesamt-PSP-Gehalten (in ng PSP/µL und ng STXeq/µL) war ebenfalls eine gute Über-

einstimmung beider Meßreihen gegeben.

Die mit der neuen Methode erhaltenen PSP-Gehalte aus komplexen Matrizes sind also mit den

Werten vergleichbar, die bei Anwendung der etablierten ionenpaarchromatographischen Verfah-

ren resultieren.

y = 1,0816x-0,065 r2 = 0,9976

y = 0,9693x+0,0048r2 = 0,9983


4.5.2 Gewinnung von PSP-Toxinen aus kontaminiertem biologischen Material

Die Applikation der Ionenaustauschchromatographie eröffnet auch die Möglichkeit der Gewin-

nung einzelner PSP-Toxine aus kontaminiertem biologischen Material. Die Voraussetzungen

dafür wurden durch den Einsatz von ausschließlich flüchtige Substanzen enthaltender Eluenten

sowie die vollständige chromatographische Trennung aller relevanten PSP-Toxine geschaffen.

Im Rahmen dieser Arbeit gelang bereits die Fraktionierung von Einzelsubstanzen aus PSP-

Standardgemischen und biologischen Proben. Die Fraktionen wurden anschließend in einer

leistungsfähigen Vakuumzentrifuge (SpeedvacR, Fa. ThermoLifeSciences) konzentriert, wobei

auch Ammoniumacetat entfernt wurde. Durch das schonende Abdampfen des Lösungsmittels im

Vakuum blieben die einzelnen PSP-Toxine nahezu verlustfrei erhalten. Im dargestellten Beispiel

(Tab. 10) wurden die Toxinrückstände aus 1 mL eingedampfter Pufferlösung in 100 µL (Kon-

zentrationsfaktor 10) bzw. 300 µL (Konzentrationsfaktor 3,3) 0,03 N Essigsäure aufgenommen.

Tab. 10: Wiederfindungsraten und relative Standardabweichungen von in Ammoniumacetat ein-

gedampften Lösungen von Toxinstandards (3fach-Wiederholung)

Toxin Kontrollstandard % SD %*

Konzentrationsfaktor 3,3 % SD %

STX 100 2,5 92,3 93,0 91,4 ∅ 92,2 1,7 Neo 100 2,1 93,5 94,3 85,9 ∅ 91,2 5,1 GTX2 100 4,2 86,7 92,7 82,5 ∅ 87,3 5,4 GTX3 100 3,2 143,9 138,0 166,7 ∅ 149,5 9,3 dcGTX2 100 2,3 89,4 72,4 66,7 ∅ 76,2 11,8 dcGTX3 100 7,6 139,9 136,3 137,6 ∅ 137,9 1,8 GTX1 100 12,9 85,6 86,4 79,1 ∅ 83,7 4,8 GTX4 100 2,5 130,0 121,6 152,1 ∅ 134,6 13,8

∅ 106,6

Toxin Kontrollstandard % SD %

Konzentrationsfaktor 10 % SD %

STX 100 2,5 89,8 85,1 77,7 ∅ 84,2 6,5 Neo 100 2,1 85,6 80,5 88,7 ∅ 84,9 4,4 GTX2 100 4,2 86,1 79,8 76,3 ∅ 80,7 5,6 GTX3 100 3,2 143,4 154,0 146,8 ∅ 148,1 3,4 dcGTX2 100 2,3 77,3 68,0 66,5 ∅ 70,6 8,3 dcGTX3 100 7,6 124,8 130,5 135,2 ∅ 130,2 4,0 GTX1 100 12,9 87,6 73,7 72,8 ∅ 78,0 10,3 GTX4 100 2,5 136,7 126,8 133,8 ∅ 132,4 8,2 ∅ 101,4 * SD % = relative Standardabweichung


Zu beachten waren jedoch die durch Milieuänderungen (neutraler pH-Wert, Vakuum, Vorhan-

densein zusätzlicher Ionen) bedingten Toxinumwandlungen. Diese Bedingungen reichten aus,

um das in den Toxinstandardlösungen (schwach saurer pH-Wert) vorliegende stabile Gleich-

gewicht von 3:1 zwischen den Toxinepimeren GTX2/GTX3, GTX1/GTX4 und

dcGTX2/dcGTX3 zugunsten der thermodynamisch instabileren β-Epimere zu verschieben (neue

Epimerenverhältnisse: 2,5:1 bis 2,0:1) 58,157. Zersetzungen, die sich in zusätzlichen Peaks

bemerkbar machen würden, wurden nicht beobachtet, wie anhand der Eindampfung von Einzel-

standardlösungen überprüft werden konnte. Allerdings ist zu erwarten, daß die Ausgangswerte

der Epimerengleichgewichte in 0,03 N Essigsäure nach einer gewissen Zeit wieder erreicht wer-

den.

Diese Beobachtungen bzgl. einer geänderten Keto-Enol-Gleichgewichtseinstellung wurden an-

schließend genutzt, die durch das Fehlen von Einzelstandards bisher nicht bestätigte Vermutung

über die Elutionsfolge der Decarbamoylgonyautoxine 2 und 3 bei der (mod.) Thielert-Methode

zu verifizieren.

Im Vergleich zur Ionenaustauschchromatographie eluieren die (Decarbamoyl-)Gonyautoxine bei

der (mod.) Thielert-Methode anders, d.h. es findet ein „Wechsel“ der Elutionsfolge zwischen

α- und β- Epimeren statt: 1. (β) GTX4, 2. (α) GTX1, 3./4. dcGTX2/dcGTX3, 5. (α) GTX2,

6. (β) GTX3. Da sich bei der Vakuumeindampfung der PSP-Toxine in Ammoniumacetatlösung

das Epimerengleichgewicht zugunsten der β-Epimere verschiebt, konnten anhand der Größen-

veränderungen der dcGTX-Peaks bei der Aufkonzentrierung eines verdünnten GTX2/GTX3

Standards (welcher geringe Mengen dcGTXs enthielt) dcGTX2 und dcGTX3 bestimmten Peaks

in den Chromatogrammen eindeutig zugeordnet werden: (α) dcGTX2 eluiert demnach bei der

Thielert-Methode vor (β) dcGTX3.

Die Gewinnung von „reinen“ Fraktionen und ihre problemlose Konzentration mittels Vakuum-

evaporation bieten sich für eine wirtschaftliche Gewinnung von PSP-Standardlösungen im

präparativen Maßstab an. Derzeit wird das upscaling durch die Verwendung (semi-)präparativer

Säulen im Rahmen einer Diplomarbeit optimiert und sowohl bei der Gewinnung von PSP-

Einzelsubstanzen als auch bei der Isolierung von unbekannten Verbindungen bzw. noch nicht

identifizierten PSP-Metaboliten bereits erfolgreich durchgeführt. Damit bildet die im (semi-)

präparativen Maßstab betriebene Ionenaustauschchromatographie die Basis, die Struktur von

durch Fraktionssammlung isolierten Substanzen mit Hilfe leistungsfähiger, moderner Analysen-

verfahren, wie MS-MS und NMR, aufzuklären.


4.6 Diskussion der Ergebnisse

Im Hinblick auf die angestrebte HPLC-Trennung möglichst aller PSP-Toxine mittels einfacher,

kostengünstiger und MS-kompatibler Eluentensysteme bei Vermeidung der angeführten Nach-

teile der HPLC-Methoden mit post-column Derivatisierung versprach der Einsatz der Ionen-

austauschchromatographie die größte Aussicht auf Erfolg, insbesondere da in den letzten Jahren

erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung leistungsfähiger Austauschermaterialien erzielt wur-

den.

Die Wahl fiel auf die Polymerphasen Source 15S und Source 15Q (Fa. Pharmacia Biotech), die

sich durch die weitgehende Trennung aller in kontaminiertem Probenmaterial relevanten PSP-

Toxine und eine hohe Belastbarkeit auszeichnen, jedoch auch durch höhere Anschaffungskosten

gekennzeichnet sind.

Die Optimierung des Eluenten zur Trennung der PSP-Toxine sowohl an Anionen- als auch an

Kationenaustauschern erfolgte über die Abstimmung verschiedener, Retention und Auflösung

beeinflussender Parameter. Dazu zählen die Art und die Konzentration der Puffersubstanzen

(Ionenstärke), der pH-Wert des Eluenten sowie die Art und die Konzentration der organischen

Modifier.

Mit Ammoniumacetat als alleinigem Bestandteil der wäßrigen mobilen Phase und einem

einfachen linearen Gradienten können sowohl N-Sulfocarbamoyl- als auch Carbamoyl- und

Decarbamoyltoxine mit einer Kombination aus Anionen- und Kationenaustauschern in einem

chromatographischen Lauf von vertretbarer Dauer getrennt werden. Die Elutionsfolge ist (mit

Ausnahme des Wechsels zwischen GTX1 und GTX4) identisch mit der modifizierten Thielert-

Methode, jedoch können zusätzlich auch C1 und C2 im gleichen Run bestimmt werden. Die

Quantifizierung der N-Sulfocarbamoyltoxine sollte jedoch wegen des Fehlens von Standard-

lösungen über ihre indirekte Messung nach der salzsauren Hydrolyse des Essigsäureextraktes

erfolgen.

Durch die Verwendung eines einfachen Eluentensystems konnte die aufwendige und störanfälli-

ge chemische Oxidation in einer Nachsäulenderivatisierungseinheit durch eine elektrochemische

Oxidation mit Hilfe eines ELCD ersetzt werden. Dadurch wird der Verbrauch an Chemikalien

deutlich reduziert, eine Verdünnung der eluierten Toxine, die zur Bandenverbreiterung führt,

vermieden und das Grundrauschen der Basislinie wegen des Fehlens der Pulsation zusätzlicher

Pumpen signifikant verringert.

Die entwickelte HPLC-Methode mit elektrochemischer Oxidation und nachfolgender Fluores-

zenzdetektion der derivatisierten PSP-Toxine konnte erfolgreich zur Bestimmung von PSP-


Toxinen in unterschiedlichen Matrizes eingesetzt werden. Dabei erwiesen sich die Trennleistung

der Ionenaustauschersäulen und die Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens als ausreichend,

um im Rahmen der Lebensmittelüberwachung PSP-Toxine schnell und eindeutig nachzuweisen

und Studien über den Verbleib der PSP-Toxine in der marinen Nahrungskette sowie über ihre

Metabolisierungsprozesse durchzuführen.

Erhöhte Aufmerksamkeit muß jedoch der Pflege der elektrochemischen Zelle gewidmet werden.

Während die Analyse von Extrakten aus Algenzellen einen hohen Probendurchsatz erlaubten,

führte die routinemäßige Untersuchung von Muschelproben zu einer schnellen Belegung der

Elektrodenoberfläche und damit zu Druckanstieg und Verlust an Sensitivität. Das macht eine

tägliche Reinigung der Zelle mit Methanol erforderlich. Bei stärkerer Kontamination ist die

Regeneration der Zelle durch Spülen mit 6 N HNO3 notwendig, um die optimalen Bedingungen

für die elektrochemische Oxidation der PSP-Toxine wiederherzustellen.

Als Nachteil erweist sich, daß Vorsäulen mit gleichem Ionenaustauschermaterial zur Verlänge-

rung der Lebensdauer der analytischen Säulen nicht kommerziell erhältlich sind. Als Alternative

zur kostenintensiven Eigenherstellung bzw. zum häufigen Spülen der Säulen mit NaCl bietet sich

der Einsatz von leicht austauschbaren und preiswerten C18 Guardfritten mit kleinerer Poren-

größe (5 µm, Fa. Phenomenex) an, wodurch unerwünschte Matrixbestandteile von der stationä-

ren Phase und der elektrochemischen Zelle zurückgehalten werden.

Die Verwendung einer elektrochemische Zelle vereinfacht den Ausschluß falsch positiver

Ergebnisse, denn die von der HPLC-Säule eluierten PSP-Toxine können sowohl underivatisiert

(Oxidationspotential = 0) als auch in oxidierter Form (Oxidationspotential = 1,05 V) zum

Fluoreszenzdetektor gelangen und so von natürlich fluoreszierenden Verbindungen unter-

schieden werden. Dieses Vorgehen erschließt zusätzlich die Möglichkeit, PSP-Toxine und weite-

re Substanzen, die von Interesse sind, aus kontaminiertem biologischen Material nach der

HPLC-Trennung mit Hilfe eines Fraktionssammlers underivatisiert für die Herstellung von

Toxinstandards oder für weitere Untersuchungen zu gewinnen.

Allerdings beruht der entscheidende Vorteil des neu entwickelten chromatographischen Systems

auf Ionenaustauscherbasis gegenüber den etablierten Verfahren der Ionenpaarchromatographie

darauf, daß die Ionenaustauschchromatographie ideal für eine Kopplung mit einem Massen-

spektrometer geeignet ist.


5. Der Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in der Kopplung LC/MS

Die Ionenaustauschchromatographie erlaubt den Verzicht auf nichtflüchtige Puffersubstanzen

und Ionenpaarbildner, und dadurch ergibt sich neben der Vereinfachung der Nachsäulen-

derivatisierung durch eine elektrochemische Oxidation auch die Möglichkeit des Einsatzes eines

Massenspektrometers als weiteren selektiven Detektor.

Mit dem für die Kopplung LC/MS tauglichen Eluenten, der nur Ammoniumacetat enthält, kön-

nen die Ergebnisse fluoreszenzspektrometrischer Detektion zusätzlich mit Hilfe der Massen-

spektrometrie abgesichert werden.

5.1 Einführende Untersuchungen zur massenspektrometrischen Detektion von PSP-

Toxinen

Die Versuche wurden an einem Single-Quadrupol-Massenspektrometer (PE/Sciex API 150EX)

durchgeführt. Die Kopplung der HPLC-Apparatur an das Massenspektrometer erfolgte mittels

Atmospheric Pressure Ionisation (API) mit einem Elektrospray-Interface (ESI).

Zunächst erfolgte die Überprüfung der Ionisierbarkeit aller als Standardlösungen verfügbaren

PSP-Toxine mittels „flow injection analysis“ (FIA) direkt in das Elektrospray-Interface des

Massenspektrometers. Da die Mehrzahl der PSP-Toxine bei neutralem pH-Wert eine positive

Nettoladung aufweist, wurde der positive Ionisierungsmodus gewählt.

Zur Optimierung der Ionisierungsbedingungen (Ionisierungsspannung, Orifice-Spannung, Ring-

Spannung, Temperatur des Stickstofföns etc.) wurde das HPLC-System ohne stationäre Phase an

das ESI des Massenspektrometers gekoppelt und die Analyten direkt in die mobile Phase

injiziert. Die ermittelten optimalen Ionisierungsparameter sind in Tab. 11 dargestellt.

Tab. 11: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP-Toxinen

Parameter Wert Parameter Wert

Ionisierungsspannung

5200 V

NEB

14 rel. E. Ring-Spannung 160 V CUR 10 rel. E. Orifice-Spannung

10 V Temperatur N2 400°C


Die gewählte Temperatur des Nebulizergases von 400°C hat keinen Einfluß auf die Stabilität der

PSP-Toxine, da die Temperatur der Lösungsmitteltröpfchen aufgrund der Abkühlung durch

Verdampfung 50°C nicht übersteigt. Sie ist jedoch für die möglichst vollständige Desolvation

des wäßrigen Eluates unerläßlich.

m/z, amu

200 300 400 500

Inte

nsity

, cps

0

2e+5

4e+5

6e+5

8e+5

300.2Saxitoxin(M+H)+

6.95e5 cps

279.2 329.2394.2 459.3

231.1214.1

175.1158.1

138.1200.1

+Q1: 0.18 min from 08.02.02 PSP EJ 10

m/z, amu

260 280 300 320 340 360 380 400 420

Inte

nsity

, cps

0

2e+4

4e+4

6e+4

8e+4

1e+5316.2

GTX2

(M-SO3+H)+

GTX3

(M+H)+

396.2

279.2271.2 298.2

361.2

8.30e4 cps+Q1: 2.49 min from 08.02.02 PSP EJ 109

Abb. 19: Massenspektren von STX, GTX2 und GTX3 (nach „flow injection analysis“)

Anhand der im Scan-Mode aufgenommenen Massenspektren (Abb. 19) zeigte sich, daß alle

PSP-Metaboliten einfach geladen detektiert werden. Bei einigen Toxinen (N-Sulfocarbamoyl-

und Carbamoyltoxine) kommt es jedoch zur Abspaltung der OSO3--Gruppe am R2 bzw. R3

(Tab. 12). Hingegen traten Dehydratisierungen [M-H2O]+ und Acetatanlagerungen [M+Ac]+

nicht auf, und es wurden auch keine Natriumaddukte [M+Na]+ beobachtet 115,145,158.


Tab. 12: Massenspektrometrische Detektion der PSP-Toxine

Toxin Detektiertes Molekül

Massenzahl m/z

Toxin Detektiertes Molekül

Massenzahl m/z

STX

[M+H]+

300,1

dcGTX2

[M+H]+

352,1 dcSTX [M+H]+ 257,1 dcGTX3 [M+H]+ 352,1 Neo [M+H]+ 316,1 C1 [M-SO3+H]+ 396,2 GTX1 [M-SO3+H]+ 332,1 C2 [M-SO3+H]+ 396,2 GTX2 [M-SO3+H]+ 316,1 C3 [M+H]+ 492,3 GTX3 [M+H]+ 396,2 C4 [M+H]+ 492,3 GTX4 [M+H]+ 412,2

Die Ionisierungsparameter wurden stets so gewählt, daß eine Fragmentierung möglichst aller

Moleküle von GTX2, GTX1, C1 und C2 auftrat. Die OSO3--Abspaltung scheint bei GTX2 und

GTX1 leichter stattzufinden als bei GTX3 und GTX4. Wahrscheinlich hat die relative Stabilität

dieser [M-SO3+H]+ Produkte ihre Ursache in der α-Stellung der 11-Hydroxysulfatgruppe, die

eine stabilisierende Wechselwirkung mit dem ähnlich orientierten Guanidino-Kation erlaubt 115,151. Die zur Detektion herangezogenen Massenzahlen der C-Toxine wurden durch Injektion

von Algenextrakten, die hohe Konzentrationen an diesen Toxinen aufwiesen, ermittelt.

Mit der Applikation des neu entwickelten HPLC-Trennverfahrens findet ein Gradient mit relativ

hoher Ionenstärkedifferenz in der massenspektrometrischen Detektion Anwendung. Da die

Konzentration an Puffersalzen in der mobilen Phase Einfluß auf das Ionisierungsverhalten hat

und hohe Pufferkonzentrationen die Ionisierung unterdrücken, ist ihr Effekt bei der Festlegung

der Arbeitsbedingungen für das Erreichen einer hohen Nachweisempfindlichkeit von großer

Bedeutung. Es wurden die Peakflächen bei Ammoniumacetatkonzentrationen von 450 mmol/L

bis 5 mmol/L durch Injektion ohne Säule ermittelt und ein Anstieg der Empfindlichkeit, insbe-

sondere ab Puffersalzkonzentrationen von <50 mmol/L, festgestellt (Abb. 20).

Abb. 20: Abhängigkeit der Signalintensität von der Pufferkonzentration (13,4 ng GTX1 bzw. 15,0

ng dcSTX injiziert)


5.2 Applikation der entwickelten HPLC-Trennmethode in der Massenspektrometrie

Für den Betrieb der LC/MS-Kopplung wurden die chromatographischen Bedingungen (HPLC-

Säulen, mobile Phase, Gradient) zunächst von der neuen HPLC/FLD-Methode übernommen.

Nach Injektion eines PSP-Mischstandards wurden unter Beibehaltung der Flußrate die PSP-

Toxine weiterhin gut getrennt, jedoch war die Nachweisempfindlichkeit im Massenspektrometer

nur gering. Außerdem trat bei der Retentionszeit von STX im TIC-Chromatogramm (Totalionen-

strom, Summe der Massenspuren aller detektierten PSP-Toxine) ein größerer Interferenzpeak

auf, der später auch bei Messungen von Proben beobachtet wurde. Die Analyse der einzelnen

Massenspuren (SIM-Mode, Single Ion Monitoring) ergab für diesen Peak die Massenzahl

m/z = 316, so daß die Detektion von Neo, dcSTX und STX nicht beeinträchtigt wurde (Abb. 21).

Abb. 21: LC/MS-Chromatogramm einer PSP-Mischstandardlösung im TIC-Mode (oben); GTX2,

Neo und STX extrahiert (SIM-Mode)


Die Quantifizierung der PSP-Toxine bereitet aufgrund der geringeren Empfindlichkeit der MS-

Detektion im Vergleich zur Fluoreszenzdetektion und der kleineren Peakhöhen im LC/MS-

Chromatogramm Schwierigkeiten. Werden aber aus diesen Chromatogrammen nur die Massen-

spuren der einzelnen PSP-Toxine extrahiert, so ist eine eindeutige Identifizierung und Quantifi-

zierung der Toxine im Bereich lebensmittelrechtlich relevanter PSP-Konzentrationen möglich.

Auch können größere Injektionsvolumina (bis zu 100 µL) die mangelnde Sensitivität der MS-

Detektion zumindest teilweise ausgleichen, zumal keine durch die höhere Ionenstärke größerer

Injektionsvolumina hervorgerufenen Retentionszeitverschiebungen auftreten.

Bei längerer Betriebsdauer der LC/MS-Kopplung traten Probleme im Bereich der Einlaß-

kapillare des Interfaces (unregelmäßiges Spray) auf, und die hohe Temperatur des parallel zum

Eluat strömenden Nebulizergases führte an kritischen Punkten zur Auskristallisation von

Ammoniumacetat. Zur Stabilisierung des Elektrosprays wurde deshalb ein geringes Splitverhält-

nis der mobilen Phase im T-Stück vor dem ESI von 3:1 (Abfall:transferierte Menge) gewählt, so

daß ca. 200 µL Eluat/min in das ESI gelangten.

5.3 Modifizierung der LC/MS-Methode

5.3.1 Substitution des Puffersalzes

Auf der Suche nach Möglichkeiten, die Ionisierung und damit die Empfindlichkeit der Detektion

zu verbessern, wurde Ammoniumacetat durch Ammoniumformiat unter Beibehaltung des

Gradienten ersetzt (vgl. Kap. 4.2.2 und 4.3). Die Injektion einzelner PSP-Toxine offenbarte

jedoch eine um das 2-3fache geringere Sensitivität für fast alle PSP-Verbindungen (Abb. 22).

Abb. 22: Einfluß der Pufferart auf die Signalintensität bei gleicher injizierter Toxinmenge A = Ammoniumacetat B = Ammoniumformiat


Weiterhin wurde der Einfluß von Trifluoressigsäure als MS-gängiges Elutionsmittel auf die

Detektionsempfindlichkeit getestet. Da die Elution der PSP-Toxine auf den Ionenaustauschern

nur bei vergleichsweise hoher TFA-Konzentration erfolgte (vgl. Kap. 4.2.2), war auch dadurch

eine Sensitivitätssteigerung (selbst bei niedrigem pH-Wert und ohne die Zugabe von NH4+-

Ionen) nicht zu erreichen.

5.3.2 Verwendung organischer Modifier

Bereits im Kapitel zur Entwicklung des HPLC-Verfahrens war auf die hohe Elutionskraft von

Acetonitril bei Verwendung von Ionenaustauschern hingewiesen worden (vgl. Kap. 4.2.4). Der

Anteil von ACN in der mobilen Phase war jedoch auf 30% begrenzt, so daß lediglich eine

Halbierung der zur Trennung notwendigen hohen Pufferstärke erfolgte. Aber die Erhöhung des

organischen Anteils im Eluenten hat prinzipiell positive Auswirkungen auf die Ionisierung von

Analyten im ESI-Verfahren 144.

Abb. 23: Einfluß von Acetonitril auf die Signalintensität bei gleicher injizierter Toxinmenge

A = mobile Phase mit 30% ACN (vgl. Tab. 13) B = mobile Phase ohne ACN (vgl. Tab. 6)

Wasser besitzt einen hohen Siedepunkt und eine sehr hohe Verdampfungsenthalpie. Dadurch

kommt es bei der Vernebelung zur Bildung großer Tröpfchen, deren Desolvation im API meist

unvollständig bleibt. Organische, unpolarere Lösungsmittel, wie Acetonitril, gehen dagegen auf-

grund ihres wesentlich niedrigeren Siedepunktes und geringeren Oberflächenspannung leichter

und schneller in die Gasphase über. Die Verdampfung der Eluattröpfchen und die Ionisierung

sind vollständiger, d.h. der Anteil des Analyten, der durch ungenügend verdampfte Lösungs-

mittel für die Messung verloren geht, ist geringer 143. Die Erhöhung des organischen Anteils auf


30% brachte in unserem Fall zwar keine empfindlichere massenspektrometrische Detektion der

PSP-Toxine, dafür eine deutliche Verbesserung des Sprayverhaltens des Eluats an der Einlaß-

kapillare mit sich (Abb. 23).

Die im Hinblick auf den Einsatz des Massenspektrometers vorgenommenen Änderungen der

chromatographischen Bedingungen betrafen aber nur die Zusammensetzung der mobilen Phase,

während das Gradientenprogramm und die Flußraten ohne Beeinträchtigung der Toxintrennung

beibehalten werden konnten (Tab. 13).

Tab. 13: Chromatographische Bedingungen für die Bestimmung von PSP-Toxinen mittels MS-

Detektion

Stationäre Phase: 1x Source 15Q PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-31) 2x Source 15S PE 4.6/100 (Nr. 71-5002-32) Eluent A: 10 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9, 30% Acetontril (v:v) Eluent B: 250 mmol/L Ammoniumacetat, pH 6,9, 30% Acetonitril (v:v) Gradient: Zeit (min) Eluent A (%) Eluent B (%) Flow (mL/min) 0 100 0 0,8 5 100 0 0,8 30 0 100 0,8 38 0 100 0,8 39 100 0 0,8 65 100 0 0,8

Um weiterhin die gewünschte, möglichst vollständige Abspaltung von OSO3

- bei GTX1, GTX2,

C1 und C2 zu erreichen, war durch die veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase eine

Neueinstellung der Ionisierungsparameter unumgänglich (Tab. 14).

Tab. 14: Ionisierungsparameter für die massenspektrometrische Detektion von PSP-Toxinen bei

30% Acetonitril im Eluenten

Parameter Wert Parameter Wert

Ionisierungsspannung

5200 V

NEB

12 rel. E. Ring-Spannung 160 V CUR 9 rel. E. Orifice-Spannung

10 V Temperatur N2 250°C


5.4 Linearität und Nachweisempfindlichkeit der MS-Detektion

Zur Überprüfung der Linearität der MS-Detektion wurden 5 unterschiedlich konzentrierte PSP-Toxinstandardgemische (GTX1-GTX4, Neo, STX) bzw. Einzelstandards (dcSTX) je zweimal in die HPLC-Apparatur injiziert, wobei die MS-Detektion aus den oben beschriebenen Gründen im SIM-Mode erfolgte. Die empfindlichsten Signale wurden für STX erhalten, und am unempfindlichsten wurde Neo detektiert. Diese Rangfolge der Nachweisempfindlichkeit entspricht im wesentlichen der der Fluoreszenzdetektion, jedoch sind die Unterschiede der LODs zwischen den einzelnen PSP-Toxinen bei der MS-Detektion deutlich geringer. Für alle 7 PSP-Toxine ergab sich aber eine gute Linearität innerhalb der analysierten Konzentrationen (Tab. 15). Die in der Literatur zitierten Nachweisgrenzen von PSP-Toxinen im Massenspektrometer wur-den hauptsächlich nach FIA ermittelt und sind dadurch nicht zum direkten Vergleich geeignet. Die auf diese Weise erhaltenen Werte bewegen sich im Bereich 10-30 pg STX/µL und damit auf einem deutlich niedrigeren Level 115,147.

Tab. 15: Linearität und LODs (S/N = 3:1) der MS-Detektion von PSP-Toxinen (5 Kalibrierpunkte)

Toxin Kalibrierbereich Min – Max (ng)

Kalibrierkurve y = mx+n

Korrelations- koeffizient r2

LODs (ng pro Injektion)

GTX1

1,0 – 33,5

61508 x + 0

0,9936

1,0 GTX2 1,5 – 54,0 114890 x + 0 0,9992 1,5 GTX3 0,5 – 13,0 160160 x + 0 0,9981 0,5 GTX4 1,5 – 14,5 30174 x + 0 0,9999 1,5 Neo 2,0 – 64,0 96729 x + 0 0,9995 2,0

dcSTX 1,0 – 7,0 56299 x + 0 0,9980 1,0 STX 0,5 – 64,0 396710 x + 0 0,9987 0,5

5.5 Anwendung der entwickelten LC/MS-Kopplung Der Einsatz der LC/MS-Kopplung bei der Analyse von PSP-Toxinen aus biologischem Proben-material verlief sehr zufriedenstellend. Abb. 24 zeigt das TIC-Chromatogramm eines C-toxin-reichen Algenextraktes, der mit PSP-Standardlösungen angereichert wurde, und in Abb. 25 ist das TIC-Chromatogramm einer Muschelprobe (Mytilus chilensis, Fjord Aysen, Chile XI, 2000) dargestellt. Für die Messungen wurden 50 µL bzw. 100 µL Extrakt injiziert. Der im Vergleich zur Fluoreszenzdetektion und im Verhältnis zu den übrigen gemessenen PSP-Toxinen signifikant höhere Peak für STX ist auf die Überlagerung mit dem oben beschriebenen Interferenzpeak mit m/z = 316 zurückzuführen. Die Quantifizierung von STX über die Massenspur von m/z = 300,1 wurde dadurch aber nicht beeinträchtigt.


1.

2.

Abb. 24: HPLC/Fluoreszenz/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen (Standardgemisch): C1, C2, GTX1 (34,4 ng), GTX4 (17,8 ng), dcGTX2/3, GTX2 (57,4 ng), GTX3 (20,8 ng), Neo (69,6 ng), dcSTX (50,0 ng), STX (79,8 ng). 1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm


1.

2.

Abb. 25: HPLC/FLD/MS-Bestimmung von PSP-Toxinen in Muscheln (Mytilus chilensis) 1. Fluoreszenz-Chromatogramm 2. TIC-Chromatogramm


Die Vermeidung der chemischen Oxidation mit nichtflüchtigen Reagenzien ermöglichte nun

auch die Parallelschaltung zweier selektiver und empfindlicher Detektoren, d.h. die Detektion

konnte sowohl mit dem Fluoreszenzdetektor als auch mit dem Massenspektrometer erfolgen.

Dadurch wurde die parallele Messung von Proben nach der chromatographischen Trennung

möglich (Abb. 26).

Abb. 26: HPLC-System mit Ionenaustauschersäulen und paralleler MS-Detektion bzw. elektro-chemischer Oxidation mit Fluoreszenzdetektion und optionalem Fraktionssammler

Der vor dem ESI-Interface geteilte Fluß wird zu einem Teil direkt in das Massenspektrometer

und zum anderen Teil zunächst in die elektrochemische Zelle zur Derivatisierung und danach

zum Fluoreszenzdetektor geleitet. Die veränderte Kapillarlänge nach dem Split als auch der von

der elektrochemischen Zelle und dem Fluoreszenzdetektor verursachte Gegendruck (ca. 5-7 bar)

verringerten das Splitverhältnis von 3:1 auf ca. 2:1, wodurch sich das in das MS transferierte

Eluatvolumen auf bis zu 270 µL/min erhöhte, das jedoch vom ESI-Interface problemlos aufge-

nommen werden konnte. Die daraus resultierenden Verringerungen von Flußrate und Analyt-

konzentration bei der Fluoreszenzdetektion führten aber nicht zu einer Peakverbreiterung, und

sie waren für zuverlässige Ergebnisse ausreichend, da die Injektionsvolumina zum Ausgleich der

niedrigeren Sensitivität der MS-Messung bewußt hoch angesetzt wurden.


Unerläßlich für eine gute Reproduzierbarkeit der bei Einsatz der HPLC/FLD/MS-Kopplung

erhaltenen Ergebnisse ist die sorgfältige Wartung der elektrochemischen Zelle. Die Belegung der

Elektrodenoberfläche ist in einem hohen Maße auch mit einem Druckanstieg in der Zelle (wegen

des Durchflusses der mobilen Phase durch porösen Graphit) verbunden. So sollte eine tägliche

Regeneration der Zelle (durch Spülen mit Methanol oder bei stärkerer Verschmutzung durch

Spülen mit 6 N Salpetersäure) vorgenommen werden, um weiterhin optimale Meßbedingungen

zu gewährleisten.

Elektrochemische Zelle und Fluoreszenzdetektor können aber auch vor den MS-Split geschaltet

werden. Dann muß für die MS-Detektion lediglich die elektrochemische Zelle ausgeschaltet

werden (Oxidationspotential = 0), um die PSP-Toxine underivatisiert in das Massenspektrometer

zu überführen. Eine parallele Erfassung der PSP-Toxine ist in diesem Fall jedoch nicht möglich.

Die Fluoreszenzdetektion der PSP-Toxine erfolgt in einem zweiten Run.

Unabhängig vom jeweiligen Meßaufbau ist jedoch mit der MS-Absicherung der durch Fluores-

zenzdetektion erhaltenen Ergebnisse die eindeutige und genaue Bestimmung von PSP-Toxinen

im Rahmen der lebensmittelrechtlichen Überwachung problemlos möglich.

5.6 Entwicklung einer schnellen Screening-Methode

Das breite Spektrum der bei der PSP-Bestimmung zur Verfügung stehenden Massenzahlen

führte zu der Überlegung, die Meßdauer eines Runs unter Inkaufnahme des Verlustes an Trenn-

leistung zu verkürzen und dadurch eine schnelle Screening-Methode für Routineanalysen in der

Lebensmittelüberwachung bereitzustellen.

Bei einer Pufferkonzentration von 250 mmol/L Ammoniumacetat und 30% Acetonitril erfolgt

unter isokratischen Bedingungen (Flußrate 0,8 mL/min) eine sehr schnelle Elution der Toxine,

wobei gleichzeitig schärfere und für spät eluierende PSP-Toxine (Neo) auch höhere Peaks im

Vergleich zu Messungen mit einem Gradienten erhalten werden. Allerdings findet unter diesen

chromatographischen Bedingungen eine Trennung lediglich zwischen einfach und zweifach

positiv geladenen PSP-Toxinen statt. GTX2 und Neo, die bei gleicher Massenzahl (m/z = 316)

detektiert werden, können somit getrennt erfaßt werden (Abb. 27 und 28). Wichtig ist eine voll-

zählige Fragmentierung von GTX1 und GTX2 gegenüber GTX3 und GTX4, da die jeweiligen

Epimere eine unterschiedliche Toxizität aufweisen. Die Fragmentierung von GTX2 und GTX1

sollte deshalb vor Meßbeginn durch Injektion einer PSP-Standardlösung überprüft und

gegebenenfalls durch Optimierung der Ionisierungsparameter erfolgen.


N-Sulfocarbamoyltoxine können mit dieser Screening-Methode nicht gemessen werden und

stören die Erfassung der Carbamoyltoxine mit gleicher Massenzahl (z.B. GTX3). In der Lebens-

mittelkontrolle spielen aber B- und C-Toxine keine Rolle, denn sie werden bei der Proben-

aufarbeitung durch Erhitzen mit Salzsäure in die korrespondierenden Carbamoyltoxine umge-

wandelt 90. Damit entfällt auch die chromatographische Trennung der anionischen PSP-Toxine,

so daß die stationäre Phase nur noch aus den Kationenaustauschern besteht. Der Zeitraum bis zur

vollständigen Elution der lebensmittelrechtlich relevanten PSP-Toxine, d.h. die Dauer des Meß-

vorgangs, beträgt bei diesem Bestimmungsverfahren nur noch 15 Minuten. Allerdings muß zur

eindeutigen Identifizierung der PSP-Toxine ausschließlich im SIM-Mode gearbeitet werden.

Abb. 27: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Standardlösung unter Anwendung der LC/MS-

Screening-Methode (SIM-Mode)


Abb. 28: Bestimmung von PSP-Toxinen aus einer Muschelprobe unter Anwendung der LC/MS-

Screening-Methode (TIC- und SIM-Mode)


5.7 Diskussion der Ergebnisse

Aus den nach Einsatz der Ionenaustauschchromatographie in Verbindung mit der Massen-

spektrometrie erhaltenen Ergebnissen wird ersichtlich, daß mit diesem neuen HPLC-Verfahren

nicht nur PSP-Standardlösungen analysiert werden können, sondern PSP-Toxine auch aus

kontaminiertem biologischen Material bestimmbar sind, wobei mit dem Fluoreszenzdetektor

(nach elektrochemischer Oxidation) und dem Massenspektrometer die Detektion parallel erfolgt.

Mit Hilfe der HPLC/FLD/MS-Kopplung können einzelne PSP-Toxine eindeutig identifiziert,

Metabolisierungsprozesse innerhalb der marinen Nahrungskette untersucht und sichere Kontrol-

len von Meeresfrüchten in der Lebensmittelüberwachung durchgeführt werden. Allerdings ist der

alleinige Einsatz der Massenspektrometrie durch eine im Vergleich zu konventionellen HPLC-

Verfahren mit Fluoreszenzdetektion deutlich geringere Sensitivität, die im hohen Wasser- und

Elektrolytanteil des Eluenten begründet ist, auf die Untersuchung von höher kontaminiertem

Probenmaterial begrenzt. Die chemische Natur der PSP-Toxine und die Säulenstabilität lassen

diesbezüglich nur einen engen Spielraum zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit zu,

jedoch kann durch höhere Injektionsmengen (bis zu 100 µL) dieser Nachteil teilweise ausgegli-

chen werden. Da noch ca. 2 ng Toxin pro Injektion detektierbar sind, ist die Nachweisempfind-

lichkeit des Verfahrens als ausreichend für seinen Einsatz in der Lebensmittelkontrolle zu bewer-

ten, zumal durch die Parallelschaltung eines Fluoreszenzdetektors die zusätzliche Absicherung

der Ergebnisse möglich ist.

Aufgrund der Möglichkeit, chromatographisch nicht getrennte PSP-Toxine bei der MS-

Detektion durch Messung im SIM-Mode hochselektiv zu bestimmen, konnte eine schnelle

Screening-Methode für Routineanalysen entwickelt werden. Die chromatographische Trennung

beschränkt sich hierbei auf Toxine mit gleicher Massenzahl. Dadurch kann die Rundauer stark

verkürzt werden, und bei ausschließlicher MS-Detektion ist ein sehr hoher Probendurchsatz ge-

währleistet. Diese sogenannte „Kurzrun-Methode“ ist durch den Einsatz von nur zwei Kationen-

austauschersäulen auch kostengünstiger.

6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen... 63

6. Untersuchungen zur Akkumulation und Metabolisierung von PSP-Toxinen in

kommerziell genutzten Muschel- und Schneckenarten der Nordsee

6.1 Einleitung

PSP-Toxine sind potente Neurotoxine, die von toxischen Stämmen bestimmter Dinoflagellaten-

Arten produziert werden. Der Transfer dieser Toxine in die marine Nahrungskette führt zu

Problemen für die Muschelindustrie und zur Gefährdung der Konsumenten von Schalentieren.

Dem Verständnis der Interaktionen zwischen Algen und Schalentieren, d.h. zwischen PSP-

Toxinen und der marinen Umwelt, kommt deshalb besondere Bedeutung zu, wobei vor allem die

Akkumulation und Metabolisierung der PSP-Toxine in den Speicherorganismen im Mittelpunkt

der Untersuchungen stehen.

Zwar existieren bereits viele ökophysiologische Studien, welche die Toxinanreicherung und

Toxinumwandlung in verschiedenen Meerestieren beschreiben, jedoch gibt es nur wenige Arbei-

ten über Detoxifikationswege und Exkretionsmechanismen. Auch wurden die meisten kommer-

ziell genutzte Muschelarten diesbezüglich bisher noch nicht näher untersucht.

Diese Versäumnisse wiegen schwer, denn die Ergebnisse solcher Grundlagenforschungen kom-

men den betroffenen Wirtschaftszweigen und damit dem Verbraucher direkt zugute. So können

z.B., wenn die Toxinanreicherung, welche von der jeweiligen Muschelart abhängig ist, bekannt

ist, artspezifische Detoxifikationszeiten berücksichtigt und bisher unbekannte Quellen für

Intoxikationen (neue Spezies, neue Regionen) aufgedeckt werden. Auch sind Aussagen über die

gefahrlose Nutzung einzelner Organe (Muskelfleisch, Gonaden) nach der PSP-Kontamination

ganzer Tiere möglich. Die Identifizierung weiterer, bisher nicht beachteter PSP-Metaboliten ist

ebenfalls von Interesse, wie die erst kürzlich erfolgte Entdeckung der Deoxycarbamoyl-Derivate

in australischen Dinoflagellaten zeigt. Allerdings wurden diese Erkenntnisse erst gewonnen,

nachdem qualitativ neue analytische Meßverfahren zur Verfügung standen.

Eine bewährte Methodik bei zahlreichen Laborstudien stellen in vivo Fütterungsexperimente dar,

bei denen verschiedenen Muschel- oder Schneckenarten unter gleichen kontrollierten Bedingun-

gen bzw. den natürlichen Bedingungen nachempfundenen Gegebenheiten definierte Algen-

spezies als Nahrung angeboten werden. An die Fütterung schließt sich, je nach Untersuchungs-

gegenstand, eine mehr oder weniger lange Entgiftungsphase an. Danach soll die Analyse ganzer

oder in einzelne Kompartimente zerlegter Tiere zu bestimmten Zeitpunkten Aufschluß über den

Toxintransfer und die Kinetik der Toxinkonversion unter Berücksichtigung allgemeiner und art-

spezifischer Charakteristika und individueller Streubreiten geben.


Im Gegensatz zu den in vivo Studien sind in der Literatur nur wenige in vitro Experimente zitiert,

bei denen z.B. ganze Muscheln bzw. nur einzelne Organe nach Homogenisation mit PSP-

haltigen Algenextrakten oder einzelnen PSP-Toxinen geimpft und inkubiert wurden. Nach einem

festgelegten Zeitraum werden die danach aufgetretenen Veränderungen im Toxinprofil analy-

tisch erfaßt. Durch diese Vorgehensweise werden gewebespezifische Metabolisierungen, die

nicht das Ergebnis des Toxintransfers zwischen den Organen sind, meßbar. Der Einfluß der

Toxinakkumulation, inklusive schwankender Filtrationsraten und Toxingehalte der aufgenom-

menen Algenzellen, sowie der Einfluß der Toxinexkretion auf das PSP-Profil werden bei in vitro

Experimenten ebenfalls ausgeschlossen.

Beide Formen der Versuchsdurchführung gelangten bei den Untersuchungen im Rahmen dieser

Arbeit zum Einsatz. Es war dabei das Ziel, die Akkumulation, Biotransformation und Detoxifi-

kation von PSP-Toxinen in bisher kaum untersuchten Schnecken- und Muschelarten der Nordsee

zu erforschen. Die Durchführung dieser Studien erfolgte am Alfred-Wegener-Institut auf Helgo-

land im Frühjahr und Sommer 2001.

Im in vivo Fütterungsversuch sollten vor allem die artspezifische Toxinaufnahme und die zu

erwartenden Toxizitäten, die Mechanismen der Entgiftung sowie die Verteilung der Toxine im

Organismus meßtechnisch verfolgt werden. Außerdem sollten Ausmaß und Art der Änderungen

des PSP-Profils in den einzelnen Muschelarten, d.h. welche PSP-Toxine besonderen Anteil an

der jeweiligen Gesamtkontamination haben, gemessen werden, um Hinweise auf art- und

gewebespezifische Metabolisierungsaktivitäten zu erhalten.

Bei den in vitro Experimenten standen dagegen die Erfassung der Metabolisierungsleistungen

einzelner Organe sowie die Charakterisierung der spezies- und gewebespezifischen Umwand-

lungsprozesse der PSP-Toxine im Vordergrund.


6.2 In vivo Fütterungsversuch

6.2.1 Versuchsdurchführung

6.2.1.1 Wahl der Algen- und Muschelspezies

Mit Alexandrium fundyense CCMP 1719 wurde ein Algenstamm gewählt, der in den europä-

ischen Gewässern des Atlantiks Verbreitung findet und sich leicht kultivieren läßt. Das Toxin-

spektrum ist vor allem durch hohe Konzentrationen an C1, C2, GTX4 und Neo gekennzeichnet,

während GTX3, GTX1, GTX2, B1/B2, dcGTX2/3 und STX nur in geringen Mengen vorhanden

sind.

Als Untersuchungsobjekte wurden die Pazifische Auster (Crassostrea gigas), die Herzmuschel

(Cardium edule), die Miesmuschel (Mytilus edulis) und die Gemeine Strandschnecke (Littorina

littorea) verwendet.

Von der Pazifischen Auster werden jährlich ca. 3,9 Mio t weltweit erzeugt, davon 85 t in

Deutschland 159. Trotz ihres hohen wirtschaftlichen Nutzens gibt es nur wenige Untersuchungen

bzgl. der Kontamination mit PSP-Toxinen unter kontrollierten experimentellen Bedingungen.

Die Herzmuschel ist eine in Nord- und Ostsee dominant vorkommende Muschelart, deren wirt-

schaftliche Bedeutung jedoch weitaus geringer ist als die der Auster (Erzeugung 130 t weltweit) 159,160. Obwohl einige, im Rahmen von Monitoring-Programmen gezogene Proben PSP-Toxine

enthielten, fanden noch keine PSP-Toxine betreffende Studien mit Herzmuscheln statt 161.

Mit der Strandschnecke gelangte eine ebenfalls herbivore, jedoch „grasende“ Art zur Unter-

suchung. Sie fällt in ihrer Größe und Anzahl besonders um Helgoland auf und stellt dort eine

traditionelle kulinarische Spezialität („Hölker“) dar 160.

Die Miesmuschel ist bzgl. der Akkumulation von PSP-Toxinen am besten erforscht, und sie ist

die wirtschaftlich bedeutendste (weltweite Erzeugung ca. 1,7 Mio t) Muschelart 42,159. Die Mies-

muschel wurde bei den Untersuchungen als Vergleichsmodell herangezogen, um die Ergebnisse

(Ausmaß und Geschwindigkeit der Metabolisierungsvorgänge) für die übrigen Spezies besser

beurteilen und einordnen zu können.

Die Herzmuscheln stammten aus dem Watt vor der Wilhelmshavener Küste, während die

Schnecken und Miesmuscheln vor Helgoland gefangen wurden. Die Austern stellte ein Aqua-

kultur-Betrieb auf Sylt zur Verfügung. Alle Individuen waren vorher nicht mit PSP-Toxinen

bzw. toxischen Algen in Berührung gekommen. Es wurden jeweils ca. 50 Tiere annähernd

gleicher Größe gesammelt und zur Akklimatisierung ein bis zwei Wochen unter Versuchs-

bedingungen gehältert.


6.2.1.2 Kultivierung der Algenspezies

Die Algenkultur wurde in einem F/2 Kulturmedium angesetzt und bei 15 °C sowie einem

12h/12h Licht/Dunkel-Regime (2500 ± 200 Lux) inkubiert162. Von dieser Batchkultur wurden

nacheinander Isolate in mehreren 10 Liter Bottichen hergestellt und nach jeweils 2-3 Wochen,

bei Erreichen einer Zellzahl von 3000-6000 Zellen pro mL, die benötigte Algenmenge zur

Fütterung entnommen.

6.2.1.3 Fütterungsregime und Entnahme der Schalentiere

Austern, Miesmuscheln, Herzmuscheln und Strandschnecken wurden in einem 150 L Becken mit

ca. 135 L ungefiltertem, 16°C warmen Seewasser, in dem ein Sprudler für die notwendige Sauer-

stoffzufuhr und Wasserbewegung sorgte, eingesetzt. Dabei wurden die einzelnen Arten in

getrennten Gruppen angeordnet. Alle 2 Tage erfolgte ein Wasserwechsel mit ungefiltertem, von

der Nordsee zugeleitetem Seewasser und die Zufütterung mit Alexandrium fundyense. Es wurde

die Algenmenge aus den Kultivierungsgefäßen zugesetzt, die zu einer Zelldichte von ca.

100 Zellen pro mL im Versuchsbecken führte. Dies entsprach natürlichen Algenblüten von

Alexandrium sp. in der Nordsee, wie sie auf Forschungsfahrten von Mitarbeitern der Jenaer

Arbeitsgruppe beobachtet wurden. Die mit dem ungefilterten Seewasser zugeführten untoxischen

Algen dienten insbesondere den Muschelarten mit hoher Sensitivität gegenüber PSP-Toxinen als

Stimulation zur Nahrungsaufnahme und wurden alle 4 Tage durch 1 Liter Feinplankton aus

Netzproben (Netzdichte 20 µm) ergänzt.

Für die Ermittlung der dem Versuchsbecken zuzugebenden Menge des toxischen Algenisolates

wurden jeweils 10 mL für die Zellzahlbestimmung (vgl. Anhang) und für die Überprüfung des

PSP-Gehaltes und des Toxinprofils der Algenkultur mittels HPLC aus den Kulturansätzen ent-

nommen (Dreifachanalyse).

Die Intoxikation der Schalentiere mit Alexandrium fundyense fand über einen Zeitraum von

6 Wochen statt, wobei alle 7 Tage 5 Individuen jeder Art zur Analyse auf PSP-Toxine entnom-

men wurden.

An die Fütterung mit Alexandrium fundyense schloß sich eine Entgiftungsphase über 2 Monate

an, in der die Fütterung mit untoxischen Algen (Seewasserzufuhr und Feinplankton aus der

Netzprobe alle 48 h) erfolgte und die Muscheln und Schnecken 14tägig zur Toxinanalyse

(jeweils 3 Individuen) entnommen wurden.


6.2.1.4 PSP-Toxinanalyse der Muschel- und Schneckenproben

Die entnommenen Muscheln und Schnecken wurden sofort in einzelne Kompartimente zerlegt:

die Austern in Hepatopankreas, Mantel, Kiemen, Adduktor, Gonaden und den verbleibenden

Rest; die Strandschnecken in Darmgewebe, Muskelgewebe und Rest; die Herzmuscheln in

Hepatopankreas, Fuß, Rest sowie die Miesmuscheln in Hepatopankreas, Mantel, Kiemen,

Adduktoren, Fuß, Gonaden und Rest. Der als Rest bezeichnete Teil enthielt bei Austern und

Miesmuscheln alle weiteren nicht zugeordneten Organe sowie den Hepatopankreas umgebendes

Gewebe. Bei den Herzmuscheln und Strandschnecken wurden mit dem Rest alle inneren Organe

erfaßt. Die separierten Teile wurden mit Seewasser gespült, gewogen und bis zur Analyse bei

minus 20°C tiefgefroren.

Aus Gründen eines vertretbaren Arbeits- und Zeitaufwandes wurden die Kompartimente von

Individuen einer Art aus den Fütterungswochen 1-5 sowie aus der Entgiftungsphase gepoolt. Die

Variation des PSP-Gehaltes und -Profils zwischen Individuen einer Art wurde exemplarisch

durch die Einzelanalyse der Individuen nach der 6. Fütterungswoche ermittelt.

Die Bestimmung der PSP-Toxine aus den Algen- und Muschelproben fand auf zwei HPLC-

Anlagen statt, wobei sowohl die optimierte Methode nach Thielert als auch die neu entwickelte

HPLC-Methode auf Basis der Ionenaustauschchromatographie zum Einsatz kamen. Die Proben-

aufarbeitung erfolgte nach dem Protokoll von Hummert et al. 156.

6.2.2 Ergebnisse und Diskussion

6.2.2.1 Toxizität und Toxinprofil von Alexandrium fundyense

Die zur Fütterung verwendeten Alexandrium-Zellen wiesen eine mittlere Toxizität von 23 ± 5 pg

STXeq/Zelle und einen Toxingehalt von 41 ± 13 pg PSP/Zelle (Mittelwert ± SD, n = 22) auf. Als

Haupttoxinkomponenten traten Neo (15,3% ± 1,7)1, GTX4 (37,6% ± 4,5), C1 (8,3% ± 2,4) und

C2 (32,0% ± 4,3) hervor, die zusammen mehr als 93% des Gesamt-PSP-Gehaltes bildeten.

Daneben wurden geringe Mengen an GTX3 (3,0% ± 1,8), GTX2 (0,2% ± 0,1), GTX1 (2,2% ±

1,1), STX (0,4% ± 0,4), dcGTX2/3 (0,2% ± 0,2) und B1/B2 (0,8% ± 0,5) nachgewiesen. Das

charakteristische Toxinmuster blieb während des gesamten Versuches stabil, die größeren

1 Die prozentualen Anteile der einzelnen PSP-Toxine am Gesamttoxingehalt sind im Fütterungsversuch als Masse% angegeben, um hervorzuheben, in welchem Maße die jeweiligen Toxine zur Gesamtbelastung (angegeben in µg PSP/100g) beitrugen.


Schwankungen von GTX1/GTX4 und C1/C2 glichen sich innerhalb einer Sammelperiode wieder

aus (Abb. 29).

Abb. 29: Mittleres Toxinprofil von A. fundyense (links), Entwicklung des Toxinprofils von A.

fundyense während der Fütterung (rechts)

6.2.2.2 Speziesspezifische Toxinaufnahme

Alle Spezies (M. edulis, C. gigas, C. edule, L. littorea) akkumulierten während der Fütterungs-

periode signifikante Mengen an PSP–Toxinen. Die höchsten Toxingehalte wurden in C. edule

gefunden, in einem deutlichen Abstand folgten M. edulis und C. gigas. L. littorea wies nur ge-

ringe PSP–Kontaminationen auf. Dabei konnte in allen Kompartimenten (außer im Muskel von

L. littorea) PSP–Toxine nachgewiesen werden, wobei erwartungsgemäß das Verdauungsgewebe

die höchsten und das Muskelgewebe (Fuß, Adduktor) die geringsten Toxingehalte aufwies.

Die Unterschiede in der Toxinaufnahme waren hauptsächlich auf die Art der Algenaufnahme,

speziesspezifische physiologische Faktoren, die in unterschiedlichen Ingestions- und Assimila-

tionsraten resultierten, sowie auf Differenzen bzgl. der Sensitivität gegenüber toxinhaltigen

Algen zurückzuführen 42.

Bivalvia sind für ihre unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber PSP-Toxinen bekannt, wobei

Mytilus sp. als hochresistent gilt und demzufolge in kürzester Zeit extrem hohe Toxinmengen

aufnehmen kann 163,164. Crassostrea sp. gehören dagegen zu den sensitiven Arten, die durch

Abwehrmechanismen (z.B. Flucht, Schließen der Schalen, Einschränkung der Filterleistung) die

Exposition gegenüber toxischen Algenzellen reduzieren 41,165. Deshalb kann die Toxizität von

Crassostrea sp. im Vergleich zu den am gleichen Ort gesammelten Mytilus-Exemplaren um ein

Vielfaches niedriger sein. Im Fütterungsbecken reagierten einige Austernindividuen nach Zuga-

be von A. fundyense mit sofortigem Schließen der Schalen, die sie erst nach ca. 1-2 Stunden

wieder öffneten. Eine Sensibilität von C. edule gegenüber toxischen Algen wurde in der Literatur

bisher nicht beschrieben. Ihre relativ hohe Toxinakkumulation, ohne sichtbare adverse

STX Neo GTX1/GTX4 GTX2/GTX3 dcGTX2/3 B1/B2 C1/C2

STX0,4%

GTX1/GTX439,8%GTX2/GTX3

3,2%

C1/C240,3%

dcGTX2/30,2%

Neo15,3%

B1/B20,8%

Tage

0 10 20 30 40

% A

ntei

l

0

20

40

60


Reaktionen auf toxische Alexandrium-Zellen, deutet jedoch auf eine gewisse STX-Resistenz hin.

Allerdings traten bei C. edule während der Fütterungszeit Todesfälle auf.1

6.2.2.3 Akkumulation und Verteilung der PSP-Toxine im Organismus

Während der gesamten Fütterungsphase war der PSP-Gehalt in C. edule signifikant höher als in

den übrigen Spezies, wobei der Abstand mit der Zeit stetig zunahm. Obwohl die Toxifikations-

raten in den ersten 2 Wochen relativ gering waren und erst später deutlich anstiegen, wurde der

gesetzliche Grenzwert von 80 µg PSP/100g bereits nach 7 Tagen mit 171 µg PSP/100g2 über-

schritten. Nach Ende der Algenzufuhr wurden Werte von 1066 µg PSP/100g gemessen, was eine

13fache Höchstmengenüberschreitung bedeutete. Somit lagen die Werte für C. edule 4-6fach

über dem Toxingehalt in M. edulis und C. gigas, wobei zu berücksichtigen ist, daß nur wenige

Zellen mit nur mittlerer Zelltoxizität bei C. edule bereits zur Anreicherung hoher Toxinmengen

in geringer Biomasse (ca. 1 g) führten. Bei ad libitum Verzehr hochtoxischer Algenzellen wür-

den bei C. edule u.U. extreme PSP-Gehalte nachweisbar werden.

M. edulis überschritt erst ab der 2. Woche den Grenzwert (159 µg PSP/100g). Im weiteren Ver-

lauf der Algenzufütterung kam es zunächst zu keinem weiteren Anstieg des PSP-Gehaltes und

der Toxizität, und teilweise sanken die Werte wieder unter den Grenzwert von 80 µg PSP/100g.

Erst in der letzten Woche trat eine weitere signifikante Zunahme der Kontamination bis zum

2-3fachen der zulässigen Höchstmenge auf (263 µg PSP/100g).

Von Feldstudien ist bekannt, daß C. gigas deutlich langsamer PSP–Toxine akkumuliert und

deshalb am gleichen Ort erst mehrere Wochen später als Mytilus edulis toxisch wird166-168. Hier

verlief die Kontamination ebenfalls langsam und relativ linear (1. bis 5. Woche Anstieg um ca.

60%). Die gesundheitliche Unbedenklichkeit war erst ab der 3. Woche (91 µg PSP/100g) nicht

mehr gegeben. Das Toxifikationsmaximum lag, wie auch bei M. edulis und C. edule, in der

6. Woche (140 µg PSP/100g). Die durchschnittliche Gesamtintoxikation der Austern betrug

damit etwas mehr als die Hälfte als die von M. edulis. Aus Literaturdaten ist eine meist 2-3fache,

1 Als Folge der Verluste an C. edule konnte ihre Detoxifikation nur bis zur 6. Woche (3. Analysenpunkt) verfolgt werden. 2 Der Grenzwert kann sich sowohl auf den Toxingehalt in µg PSP/100g als auch auf die Toxizität in µg STXeq/100g beziehen, wobei letzterer Wert häufig bevorzugt wird. Die Entscheidung für µg PSP/100g ist auf die angewandte Probenaufarbeitung zurückzuführen, die die Erfassung aller individuellen PSP-Toxine berücksichtigt. Die kalkulier-ten STXeq-Werte würden hier aufgrund des hohen Anteils an mindertoxischen N-Sulfocarbamoyltoxinen deutlich niedriger ausfallen als bei der Probenaufarbeitung in der Lebensmittelüberwachung (Tab. 3), da hier diese Toxine nicht berücksichtigt (AOAC-Vorschrift), sondern größtenteils in die höhertoxischen Carbamoyltoxine umwandelt werden.


oft jedoch auch eine über 10fache Divergenz bzgl. der Kontamination beider Spezies 169-171

bekannt. C. gigas ist offensichtlich in der Lage, während sogenannter „Mischblüten“ (bestehend

aus toxischen und untoxischen Algenspezies) höhere Mengen an PSP-Toxinen zu akkumulieren.

Todesfälle durch Austernverzehr sind jedoch bisher nicht bekannt.

Im Gegensatz zu den filtrierenden Arten M. edulis, C. gigas und C. edule konsumiert L. littorea

Alexandrium-Zellen nicht direkt, sondern abgestorbene oder ins Sediment gesunkene Zellen

werden beim „Grasen“ mit aufgenommen. Schnecken sind zudem sehr mobil und halten sich oft

Stunden bis Tage außerhalb des Wassers auf, so daß die Aufnahme von toxischen Algenzellen

nicht kontinuierlich und innerhalb der Population sehr unterschiedlich erfolgt. Die PSP-Gehalte

schwankten in diesen Mollusken während der Fütterungsperiode um das 10fache. Grundsätzlich

wurden jedoch nur geringe PSP-Kontaminationen festgestellt. Der höchste PSP-Gehalt wurde

mit 73 µg PSP/100g in der 5. Woche gefunden. Damit wäre L. littorea zu jedem Zeitpunkt

verkehrsfähig gewesen. Es ist aber noch in weiteren Untersuchungen zu klären, ob die Schnecke

bei einer deutlich höheren Zelldichte und Zelltoxizität von A. fundyense signifikant mehr PSP-

Toxine akkumuliert oder die Flucht ergreift, denn andere Mollusken mit vergleichbarer Lebens-

weise, wie z.B. Haliotis tuberculata, können hochtoxisch werden und sind Ursache vieler PSP-

Vergiftungen 6,150,172.

Die Veränderungen der Gesamttoxingehalte während der Fütterung und der Entgiftung sind für

alle untersuchten Spezies in Abb. 30 dargestellt.

Abb. 30: Gesamt-PSP-Gehalte während der Fütterung und der Entgiftung (E), rechts: vergrößerte

Darstellung und gesetzlicher Grenzwert Die Gesamttoxizität und der Gesamt-PSP-Gehalt waren in allen Muschel- und Schneckenarten

durch die Toxizität und den Toxingehalt des Verdauungsgewebes geprägt, da hier der sofortige

und unmittelbare Kontakt mit den toxischen Algenzellen erfolgte. In den ersten 2 Wochen der

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

8.Wo (

E)

µg P

SP

/100

g

0

200

400

600

800

1000

1200

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

8.Wo (

E)

µg P

SP/

100g

0

50

100

150

200

250

300

M. edulis C. gigas C. edule L. littorea 80 µg PSP/100g


Toxinaufnahme betrug der Toxinanteil des Hepatopankreas (HP) am Gesamttoxingehalt in

M. edulis und C. gigas über 70%, während der Hepatopankreas nur 15% des Muschelgewichtes

ausmachte (Abb. 32 und Tab. 16). Bis Ende der 6wöchigen Fütterungszeit sank jedoch, trotz

weiterer Toxinaufnahme, der HP-Anteil am Gesamt-PSP-Gehalt bei beiden Spezies (durch den

Toxintransfer in umliegende Gewebe) auf 60%. Hingegen wies das Verdauungsgewebe von

C. edule und L. littorea während der gesamten Algenaufnahme einen konstanten Toxinanteil von

80% bzw. fast 100% auf.

Tab. 16: Anteil der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe am Gesamtgewicht HP Rest Kiemen Mantel Gonaden Adduktor Fuß M. edulis 15% 17% 9% 32% 9% 15% 3% C. gigas 15% 18% 20% 24% 7% 16% C. edule 20% 59% 21% L. littorea 38% 19% 43%

Im HP aller Muschelarten war von der 1. bis 6. Woche eine signifikante Überschreitung des

gesetzlichen Grenzwertes zu beobachten, wobei C. edule nach 6 Wochen mit 4482 µg PSP/100g

die höchste Toxinkontamination zeigte. In M. edulis wurden 1355 µg PSP/100g, in C. gigas

445 µg PSP/100g und in L. littorea 171 µg PSP/100g (5. Woche) nachgewiesen. Der Hepato-

pankreas war somit immer 3-5fach toxischer als der Gesamtorganismus.

C. edule wies im Vergleich zu den anderen Spezies auch in den übrigen Kompartimenten eine

deutlich höhere Toxinspeicherung auf, die zur hohen Gesamttoxizität beitrug (Abb. 31). Der Rest

überschritt die Unbedenklichkeitsgrenze ab der 2. Woche und enthielt am Ende der Fütterung

(linearer Kontaminationsverlauf bis 5. Woche) mit 318 µg PSP/100g die doppelte PSP-Toxin-

menge wie der von M. edulis (186 µg PSP/100g) und C. gigas (123 µg PSP/100g). Sogar der

PSP-Gehalt des Cardium-Fußes lag nach exponentiell verlaufender Kontaminationskurve ober-

halb von 80 µg PSP/100g, während bei L. littorea im Rest nur Toxinspuren zu finden waren und

der Muskel vollkommen untoxisch blieb.

Die Zunahme der Toxizität im Verdauungsgewebe war demzufolge mit einer Zunahme der

Toxizität in den anderen Kompartimenten verbunden. Insbesondere der HP von C. gigas zeigte

einen effizienten Toxintransfer in die umliegenden Gewebe, denn sein Anteil an der PSP-

Kontamination des gesamten Organismus nahm im Vergleich zu den anderen Spezies am


schnellsten ab. Auf der anderen Seite lagen die Intoxikationen von Mantel, Kiemen und Gonaden

der Auster in der Kontaminationsphase (bis 5. Woche) sogar leicht über denen der entsprechen-

den Mytilus-Gewebe. Die Toxizitätsmaxima von Mantel und Kiemen traten dabei bereits in der

3. und 4. Fütterungswoche auf, wobei lediglich in den Kiemen der Grenzwert von 80 µg

PSP/100g in der 4. Woche überschritten wurde. Die übrigen Gewebe, außer dem Rest und dem

HP, blieben bei der Auster verkehrsfähig. In M. edulis wurde zwar in der 6. Woche ein PSP-

Gehalt von ca. 100 µg PSP/100g in Kiemen, Mantel und Gonaden erreicht, aber nur in den

Gonaden und im Mantel war (neben dem HP) diese höhere Belastung gegenüber der Auster

signifikant (t-Test, α = 0,05)1.

Den größten Anteil am Gesamt-PSP-Gehalt in M. edulis und C. gigas hatten in der 6. Woche

vom Nichtverdauungsgewebe jeweils der Rest und der Mantel (11-13%, Abb. 32).

Der Adduktor von C. gigas wies noch einen Anteil von 3-4% an der Gesamtkontamination auf,

während der Anteil des Fußes von C. edule und M. edulis weniger als 2% betrug. Das Muskel-

gewebe zeigte sich damit erwartungsgemäß als wenig effizienter Toxinspeicher, dessen Toxin-

belastung mit <5% am Gesamtgehalt um mehr als eine Größenordnung unterhalb der des HP-

Gewebes und, mit Ausnahme von C. edule, auch im verkehrsfähigen Bereich lag 47,173.

Damit ergab sich für alle Spezies folgende übereinstimmende Rangfolge bzgl. der PSP-

Kontamination am Ende der Fütterungsperiode: HP >> Rest > Kiemen, Mantel, Gonaden > Ad-

duktoren > Fuß. Die PSP-Gehalte der einzelnen Kompartimente sind in Abb. 31 dargestellt.

Alle untersuchten Muscheln und Schnecken dienen der menschlichen Ernährung und werden

ohne Schale als ganze Tiere verzehrt. Dabei ist das Entfernen des Verdauungsgewebes unüblich

und würde bei höherer PSP-Kontamination die Verkehrsfähigkeit nicht gewährleisten (Ausnah-

me: L. littorea).

1 Diese t-Tests sowie alle nachfolgenden statistischen Tests wurden mit Hilfe des Statistikprogrammes SPSS 10.0 für Windows durchgeführt.


HP Rest Fuß

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (E

)

6.Wo (E

)

µg P

SP

/100

g H

P

0

1000

2000

3000

4000

5000

µg P

SP

/100

g so

nstig

e G

eweb

e

0

50

100

150

200

250

300

350C. edule

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

µg P

SP/1

00g

HP

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

µg P

SP

/100

g so

nstig

e G

eweb

e

0

5

10

15

20

25

30L. littorea

Abb. 31: PSP-Gehalte der einzelnen Muschel- und Schneckengewebe

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (E

)

4.Wo (E

)

6.Wo (E

)

8.Wo (E

)

µg P

SP

/100

g H

P

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

µg P

SP

/100

g so

nstig

e G

eweb

e

020406080100120140160180200

M. edulis

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (E

)

4.Wo (E

)

6.Wo (E

)

8.Wo (E

)

µg P

SP

/100

g H

P

0

100

200

300

400

500

µg P

SP

/100

g so

nstig

e G

eweb

e0

20

40

60

80

100

120

140C. gigas

HP Rest Kiemen Mantel Gonaden Adduktor Fuß 80 µg PSP/100g

HP Rest Kiemen Mantel Gonaden Adduktor 80 µg PSP/100g

HP Rest Fuß 80 µg PSP/100g


6.2.2.4 Detoxifikation

An die Fütterung der Muscheln und Schnecken mit Alexandrium fundyense schloß sich eine

zweimonatige Entgiftungsphase an. Im allgemeinen werden Muscheln in schnell entgiftende

(Unterschreitung der tolerierbaren PSP-Höchstmenge nach mehreren Tagen bis Wochen) und

langsam entgiftende Spezies (Entgiftung Monate bis Jahre andauernd) eingeteilt 42. Zu den

Langzeitspeicherern von PSP-Toxinen zählen z.B. Saxidomus giganteus, Placopecten magella-

nicus und Spisula solidissima 174-176. M. edulis ist als Kurzzeitspeicherer bekannt und auch

C. gigas wurde in Feldbeobachtungen als relativ rasch detoxifizierend charakterisiert 42,167. Die

Dauer der Entgiftung von PSP-Toxinen ist jedoch nicht nur speziesspezifisch, sondern auch von

biologischen Faktoren, der Stärke der Bindung der Toxine an das jeweilige Gewebe und von der

Ausgangstoxizität abhängig 177-179.

Im Fütterungsversuch waren M. edulis und C. gigas bei moderater Toxinbelastung am Ende der

Fütterung bereits innerhalb von 14 Tagen (erster Analysenpunkt) wieder verkehrsfähig (M. edu-lis: 78 µg PSP/100g, C. gigas: 46 µg PSP/100g), während dies bei C. edule nach 6 Wochen

Entgiftung noch nicht der Fall war. Hingegen fielen die ohnehin geringen PSP-Gehalte von

L. littorea weiterhin kontinuierlich ab (Abb. 31). In der 8. Entgiftungswoche wurde die Analyse

der Schnecke aufgrund der sehr niedrigen Gesamtkontamination nicht mehr durchgeführt.

Die Detoxifikation von Muscheln ist im allgemeinen durch 2 Phasen gekennzeichnet. In der

meist kurzen Initialphase wird der Darminhalt, der ganze und nicht absorbierte Algenzellen

sowie nicht assimilierte Toxine enthält, abgegeben. In einer zweiten Phase folgt dann ein länger

andauernder Prozeß der Entfernung der an das Gewebe gebundenen oder inkorporierten PSP-

Toxine. Deshalb resultiert eine exponentiell abfallende Detoxifikationskurve 178,180.

Bei der ersten Analyse nach Beginn der Entgiftung (14 Tage) war somit bereits die zweite

Detoxifikationsphase eingetreten.

Unabhängig davon zeigte C. edule die höchste Detoxifikationsrate mit einem Toxinverlust von

83% in den ersten zwei Wochen, gefolgt von M. edulis mit 70% und C. gigas mit 68%. Während

bei C. edule die Dekontamination anschließend einige Wochen stagnierte, setzte sie sich bei den

anderen Muschelspezies fort. Am Ende der Versuchsdauer war jedoch keine der analysierten

Muscheln vollständig toxinfrei. Folgende Entgiftungsmechanismen werden diskutiert: 42,181

• Rücktransport der PSP-Toxine in das Verdauungsgewebe und Exkretion in gelöster Form

• Verluste durch Lecks im Gewebe,

• Diffusion von PSP-Toxinen von der Gewebeoberfläche in das Wasser,

• Inaktivierung oder Abbau zu untoxischen Komponenten.


Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

8.Wo (

E)

Ant

eil %

0

20

40

60

80C. gigas

Die Entgiftung war mit einem fortschreitenden Toxintransfer durch die Gewebe verbunden, so

daß die PSP-Verteilung im Gesamtorganismus nach Fütterungsende starken Änderungen unter-

worfen war. Am Ende der Fütterungsperiode war der HP-Anteil an der Gesamtkontamination mit

60% (Miesmuschel, Auster), 80% (Herzmuschel) und 90% (Strandschnecke) relativ hoch. Die

schnelle Ausscheidung des toxischen Darminhalts und der Transfer in umliegende Gewebe ließ

eine beschleunigte Toxinabgabe aus dem Verdauungsgewebe erwarten. Bei C. edule und

C. gigas blieb jedoch der HP-Anteil noch bis 1½ Monate auf diesem hohen Niveau bevor er bei

C. edule auf 19% und bei C. gigas auf 37% sank. Der HP von M. edulis enthielt, zugunsten der

umliegenden Gewebe Rest und Mantel, bereits nach ca. 3 Wochen Entgiftung nur noch 50% der

PSP-Toxine (Abb. 32).

Abb. 32: Prozentualer Anteil der einzelnen Kompartimente am Gesamt-PSP-Gehalt der Tiere wäh-

rend der gesamten Versuchsdauer (E = Entgiftungsperiode) Der Toxintransfer während der Detoxifikation ist oft mit einem erneuten Toxizitätsanstieg im

Zielgewebe verbunden. Fuß und Rest von C. edule zeigten deutlich diese verstärkte Toxin-

aufnahme, die bis zum Ende des Versuches anhielt. Dabei stiegen sowohl der PSP-Gehalt als

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

Ant

eil %

0

20

40

60

80

100

120L. littorea

HP/Darm Rest

Kiemen Mantel

Gonaden Adduktor

Fuß

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

8.Wo (

E)

Ant

eil %

0

20

40

60

80

100M. edulis

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

Ant

eil %

0

20

40

60

80

100C. edule

Zeit

1.Wo

2.Wo

3.Wo

4.Wo

5.Wo

6.Wo

2.Wo (

E)

4.Wo (

E)

6.Wo (

E)

8.Wo (

E)

Ant

eil %

0

20

40

60

80

100M. edulis


auch die Toxizität um das 2 bis 3fache an, wobei der Rest mit 90 µg PSP/100g den Grenzwert

erneut überschritt.

Die nonintestinalen Kompartimente von M. edulis offenbarten nach starker Toxinabnahme inner-

halb der ersten Entgiftungstage ebenfalls eine stagnierende Entgiftung oder einen geringfügigen

Anstieg des PSP-Gehaltes bzw. der Toxizität, jedoch weit unterhalb des Grenzwertes. Bei Crass-

ostrea-Geweben konnte ein solcher Verlauf der Detoxifikation nicht beobachtet werden.

Unabhängig vom Toxintransfer war der Hepatopankreas aber stets das Gewebe mit der höchsten

Konzentration an PSP-Toxinen.

In L. littorea sank die Kontamination im Verdauungsgewebe kontinuierlich, während Rest und

Muskel toxinfrei waren. Hingegen waren alle Kompartimente von M. edulis, C. gigas und

C. edule bis zum Ende der Dekontaminationsphase mit PSP-Toxinen belastet.

6.2.2.5 Änderungen der PSP-Profile

Während der Fütterungsperiode reflektierten die Muscheln in ihren Geweben weitestgehend das

PSP-Toxinprofil der zugeführten Alge A. fundyense, d.h. es dominierten Neo, GTX1/4 und

C1/C2 (Abb. 33, 34). Die Toxinmuster waren offensichtlich von einer Balance zwischen der

ständigen Aufnahme von PSP-Toxinen mit konstantem Verhältnis zueinander und möglichen

Toxinumwandlungen charakterisiert, wobei letztere durch die permanente Aufnahme zunächst

maskiert wurden. Kennzeichnend waren jedoch leichte Veränderungen bei den Toxinverhältnis-

sen, die später während der Detoxifikation zunahmen und zu gravierenden Änderungen im

Toxinmuster der Muschelkompartimente führten. So waren Neo und GTX1/4 bereits kurze Zeit

nach der Fütterung mit A. fundyense in vielen Geweben durch Verlust und/oder Umwandlung zu

den N-1-H-Toxinen (STX, GTX2, GTX3) nicht mehr nachzuweisen. Eine Ausnahme bildeten

die Verdauungsgewebe, in denen aufgrund der höheren Gesamtkontamination die weniger

fluoreszenzaktiven N-1-OH-Toxine erst später (M. edulis, C. gigas nach der 6. Entgiftungs-

woche; C. edule, L. littorea nach der 4. Entgiftungswoche) unter ihre Detektionsgrenze sanken.

Im Gegenzug stieg der relative Anteil von STX und GTX2/3 an. Bereits bis zur 6. Fütterungs-

woche war von diesen Toxinen eine Zunahme im PSP-Profil der Mollusken im Vergleich zu

A. fundyense zu verzeichnen (α = 0,05, STX signifikant für alle Gewebe außer Fuß von C. edule

sowie Mantel, Gonaden von M. edulis; GTX2/3 sigifikant für HP und Rest aller Spezies)1. Gegen

Ende der Dekontaminationsphase dominierten in allen Tierarten STX (bis zu 22%, Max.:

Adduktoren von M. edulis) und GTX2/3 (bis zu 35%, Max.: Gonaden von C. gigas), neben

C1/C2. 1 Student-Newman-Keuls-Test


Abb. 33: PSP-Profile der Einzelgewebe von M. edulis und C. gigas exemplarisch für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)

M. edulis 2. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.

HP Rest Kie Man Gon Add Fuß

Gewebe

Ante

il %

C2C1GTX3GTX2GTX4GTX1NeoSTX

C. gigas 2. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.

HP Rest Kie Man Gon Add

Gewebe

Ante

il %


M. edulis 6. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.


Gewebe

Ante

il %


C. gigas 6. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.


Gewebe

Ante

il %


C. gigas 3. Wo

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.


Gewebe

Ante

il %


M. edulis 3. Wo

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.


Gewebe

Ante

il %


M. edulis 6. Wo

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.


Gewebe

Ante

il %


C. gigas 6. Wo

0

20

40

60

80

100

120

A.fund.


Gewebe

Ante

il %



Abb. 34: PSP-Profile der Einzelgewebe von C. edule und L. littorea exemplarisch für die 3. und 6. Fütterungswoche und die 2. und 6. Entgiftungswoche (E = Entgiftung)

C. edule 3. Wo

0

20

40

60

80

100

120

A. fund. HP Rest Fuß

Gewebe

Ante

il %


L. littorea 3. Wo

0

20

40

60

80

100

120

A. fund. Darm Rest

Gewebe

Ante

il %


C. edule 2. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120


Gewebe

Ante

il %


L. littorea 2. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120

A. fund. Darm

Gewebe

Ante

il %


C. edule 6. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120


Gewebe

Ante

il %


L. littorea 6. Wo (E)

0

20

40

60

80

100

120

A. fund. Darm

Gewebe

Ante

il %


L. littorea 6.Wo

0

20

40

60

80

100

120

A. fund. Darm Rest

Gewebe

Ante

il %


C. edule 6.Wo

0

20

40

60

80

100

120


Gewebe

Ante

il %



Interessanterweise wiesen alle Kompartimente der Muscheln und teilweise der Schnecke

während der gesamten Versuchsdauer, d.h. auch während der Entgiftungsphase, einen hohen

Anteil an den mindertoxischen N-Sulfocarbamoyltoxinen von meist >30% an der Gesamt-

kontamination auf, obwohl diese Toxine Ausgangspunkt verschiedener Metabolisierungswege in

Schalentieren sind (hydrolytische und enzymatische Umwandlung zu (dc-)Carbamaten). Offen-

bar laufen solche Transformationen nicht nur langsam ab, sondern die C-Toxine scheinen auch

stabiler gegenüber einem Abbau zu sein als einige Carbamoyltoxine. Das Verhältnis Carbamoyl-

toxine zu N-Sulfocarbamoyltoxine, welches oftmals zur Abschätzung des Zeitpunktes der letzten

PSP-Toxinaufnahme in Muscheln herangezogen wird, sollte deshalb in Monitoring-Programmen

mit Vorsicht interpretiert oder durch weitere Parameter (z.B. durch das Epimerenverhältnis)

untermauert werden.

Änderungen der Epimerenverhältnisse zugunsten der thermodynamisch stabileren α-Epimere

(C1, GTX1, GTX2) traten ubiquitär schon während der Fütterungsperiode auf, obwohl ein

Verhältnis von >1 in den Muscheln erst in der Detoxifikationsphase bobachtet wurde. Im

Verdauungsgewebe und in den meisten anderen Geweben wurde das stabile Gleichgewicht von

3:1 am Ende der Dekontamination zwischen GTX2 und GTX3 sowie C1 und C2 erreicht

(Ausnahmen: C. edule Fuß [C1:C2 1,4:1], Rest [C1:C2 1,5:1; GTX2:GTX3 1,8:1]; M. edulis

Kiemen und Fuß [GTX2:GTX3 1,4:1 bzw. 1,7:1], Gonaden und Adduktoren [C1:C2 2:1]).

Die B-Toxine und dcGTX2/3 spielten in der Gesamtkontamination mit PSP-Toxinen nur eine

untergeordnete Rolle. Die in einigen Kompartimenten (6. Entgiftungswoche: C. gigas HP;

C. edule HP, Rest; M. edulis Fuß, Adduktoren) beobachtete relative Zunahme von dcGTX2/3

kann der Anreicherung dieser Toxine, die in den Alexandrium-Zellen in Spuren gebildet wurden,

oder ihrer vergleichsweise hohen chemischen Stabilität zugeordnet werden. Eine Neubildung

von Decarbamoyltoxinen (z.B. dcSTX) ist auf nur wenige Muschelspezies, wie z.B. Mactra chinensis, Peronida venulosa und Protothaca staminea, begrenzt und wurde im vorliegenden

Versuch nicht festgestellt 65,182.

Die beobachteten Veränderungen waren jedoch nicht in allen Geweben und Spezies gleichen

Ausmaßes. So bildete das Verdauungsgewebe von M. edulis und C. gigas sowie der Rest von

C. edule mit dem Absinken des relativen Anteils von C-Toxinen unterhalb des der Fütterungs-

alge eine Ausnahme zwischen den hohen N-Sulfocarbamoyltoxinkontaminationen anderer

Gewebe (insbesondere der des Muskelgewebes der Muscheln, 6. Wo). Auf der anderen Seite

stieg die Dominanz der C-Toxine in einigen Geweben bis zur 6. Entgiftungswoche auf Werte

>60% (C. edule HP, C. gigas Mantel), z.T. auch >70% (C. edule Fuß, C. gigas Adduktor) an.

Diese Beobachtung resultiert möglicherweise auch aus einer selektiven Retention beim Transfer

der PSP-Toxine in die einzelnen Gewebe. So nahm zwar der PSP-Gehalt im Fuß der Herz-


muschel während der Entgiftung wieder zu (von 14 auf 38 µg PSP/100g), nicht aber die Toxizi-

tät (Abfall von 4 auf 2 µg STXeq/100g).

Die Verdauungsgewebe zeigten die schnellsten Epimerisierungen, während sie in den meisten

Muskelgeweben (M. edulis, C. edule) langsamer abliefen. Auf der anderen Seite wurde mit

zunehmender Entgiftungsdauer in Übereinstimmung mit allgemeinen Literaturdaten im Muskel-

gewebe von M. edulis und C. gigas die höchste (relative) Anreicherung von STX gefunden (bis

>30%, 8. Entgiftungswoche) 163,183,184.

L. littorea spiegelte zu keinem Zeitpunkt das Toxinprofil von A. fundyense wider. Das in der

Alge reichlich produzierte Neo konnte in der Schnecke nicht nachgewiesen werden, GTX1/4

jedoch noch während der Entgiftungsphase. Am Ende der Dekontamination charakterisierten,

wie auch bei den Muscheln, STX, GTX2/3 und C1/C2 die Gesamt-PSP-Belastung.

In Feldstudien und in kontrollierten Fütterungsexperimenten mit toxischen Alexandrium-Zellen

haben bereits frühere Arbeiten demonstriert, daß die Toxinprofile von Muscheln signifikante

Unterschiede im Vergleich zu dem Toxinprofil der Fütterungsalge aufweisen können 171,175,185,186. Dabei sind die Toxinmuster speziesspezifisch, gewebespezifisch und zeitabhängig.

Als Ursachen für diese Unterschiede sind eine selektive Retention oder Elimination individueller

PSP-Toxine in den einzelnen Kompartimenten sowie die Umwandlung von Toxinen als Ergebnis

metabolischer Prozesse, einschließlich enzymatischer Umwandlungen und physikalisch-

chemischer Vorgänge (vgl. Kap. 1.1.1.2 und 6.3.2.1) zu nennen.

Insgesamt ist es schwierig, die einzelnen metabolischen Vorgänge voneinander zu trennen,

manche Biotransformationen laufen außerdem so kurzzeitig ab, daß sie in den Sammelinter-

vallen (1-2 Wochen) meßtechnisch nicht erfaßt werden konnten. Da auch der Einfluß der Akku-

mulation neuer PSP-Toxine in den einzelnen Organen, der Verlust als auch der chemische

Abbau einzelner Toxine auf die Entwicklung des Toxinprofils nicht klar von den Umwandlungs-

prozessen abgetrennt und nur spekulativ eingeschätzt werden könnte, lag der Schwerpunkt im

vorliegenden Versuch auf einer beschreibenden Darstellung der Verhältnisse der Einzeltoxine

bzw. ihres Anteils an der Gesamtkontamination, wie sie auch bei lebensmittelchemischen Unter-

suchungen erfolgt.

Eine genaue Analyse der charakteristischen Biotransformationsvorgänge in verschiedenen

Schalentieren wurde im nachfolgenden Inkubationsversuch unternommen.

Trotz Schwierigkeiten bei der Erfassung biochemischer Abläufe ist eine Charakterisierung der

Biotransformationsaktivität der einzelnen Molluskenarten anhand des Ausmaßes und der

Geschwindigkeit der Änderungen in den Toxinmustern gegenüber A. fundyense möglich.


Im vorliegenden Fütterungsversuch waren während der Algenzugabe und größtenteils auch

während der Detoxifikation keine gravierenden Unterschiede zwischen den Toxinprofilen der

Muschelarten, sondern offenbar miteinander vergleichbare Biotransformationskapazitäten bei

M. edulis, C. gigas und C. edule festzustellen. Im Gegensatz zu den Muscheln war im Toxin-

spektrum der Schnecke L. littorea keine gerichtete Entwicklung der Toxinverhältnisse zu erken-

nen. Das PSP-Profil war durch eine sporadische Aufnahme von Algenzellen geprägt, wodurch

sich die Biotransformationsvorgänge, einschließlich Verlust und chemischer Abbau der PSP-

Toxine, zeitlich und individuell überlagerten.

Die Verdauungsgewebe aller Mollusken und der Rest von C. edule zeigten sich als besonders

aktive Kompartimente bzgl. der PSP-Umwandlung. Bedingt sind diese gewebespezifischen

Differenzen hauptsächlich durch das unterschiedliche Vorkommen von Reduktanden und eine

charakteristische Enzymausstattung.

Oshima unternahm eine Klassifizierung der Muschelarten nach ihren Metabolismusraten für

PSP-Toxine, bei der für M. edulis und C. gigas eine nur gering ausgeprägte Toxintransformation

postuliert wurde 66,187. In den vorliegenden Untersuchungen wurde dies bestätigt. Da die unter-

suchten Muschelarten das Toxinprofil der PSP-verursachenden Algenspezies relativ lange reflek-

tierten, können ihre PSP-Profile für retrospektive Aussagen zu Algenblüten, d.h. zum Vorkom-

men bestimmter Dinoflagellaten zu einer bestimmten Zeit in einer Region, herangezogen wer-

den.

6.2.2.6 Individuelle Variabilitäten

Die gesammelten Individuen der 6. Fütterungswoche (n = 5) wurden einzeln analysiert, um

intrapopulative Schwankungen zu ermitteln. Eine inverse Beziehung zwischen PSP-Gehalt und

Variation, wie in der Literatur oftmals erwähnt, ließ sich dabei nicht feststellen 176,188. Die

Schwankungen der Gesamttoxingehalte waren bei M. edulis (176-303 µg PSP/100g), %SD =

22%), bei C. edule (714-1309 µg PSP/100g, %SD = 24%) und unerwartet auch bei L. littorea

(33-60 µg PSP/100g, %SD = 23%) nicht sehr ausgeprägt. C. gigas zeigte dagegen eine große

Variabilität, denn neben nahezu untoxische Individuen waren relativ hoch mit PSP-Toxinen be-

lastete Tiere zu finden, von denen einige sogar den durchschnittlichen PSP-Gehalt von M. edulis

überschritten (7-351 µg PSP/100g, %SD = 92%, Abb. 35). Offenbar ist das Abwehrverhalten

PSP-sensitiver Muschelarten (wie die Auster) individuell sehr unterschiedlich ausgeprägt.

Weitere Ursachen für die Variabilität zwischen Individuen einer Spezies am gleichen Ort sind

neben biologischen Faktoren wie Alter, Größe und Reproduktionsstatus 47,173


• die physiologische Kondition,

• genotypische Differenzen, die nicht nur die Sensitivität, sondern auch die Bindungs-

kapazität und die Biotransformation von PSP-Toxinen beeinflussen,

• die ungleichmäßige Verteilung der toxischen Algen im Wasser (horizontal, vertikal),

• eine mikrogeographische Variation der Individuen in der Exposition zu toxischen Zellen.

Abb. 35: Variationen der Gesamt-PSP-Gehalte der untersuchten Spezies (links) und der Toxinge-

halte der einzelnen Kompartimente am Bsp. von M. edulis (rechts) in der 6. Fütterungs-woche —— Median, ----- Mittelwert

Die PSP-Gehalte einzelner Kompartimente variierten in ähnlichen Größenordnungen wie der

Gesamttoxingehalt der jeweiligen Spezies, wobei das Muskelgewebe (Adduktoren, Fuß) bei

allen Spezies zu höheren Schwankungen tendierte. So wurden auch in diesen eher gering belaste-

ten Kompartimenten Höchstmengenüberschreitungen festgestellt: C. gigas: 112 µg PSP/100g

Adduktor, M. edulis: 91 µg PSP/100g Adduktor, 106 µg PSP/100g Fuß, C. edule: 319 µg

PSP/100g Fuß.

Hinsichtlich der Variationen einzelner PSP-Toxine lagen die Werte in den einzelnen Geweben

von 6% bis über 100% relative Standardabweichung, wobei die Einzeltoxine in der Auster am

stärksten schwankten.

Insgesamt stimmen die beobachteten Schwankungsbreiten innerhalb der Gesamt-PSP-Gehalte

und der PSP-Profile, die auch das Resultat individueller Metabolismusleistungen sind, mit

verfügbaren Literaturdaten überein und weisen auf die Wichtigkeit einer umfassenden und reprä-

sentativen Probennahme von Schalentieren im Hinblick auf die Kontrolle von Lebensmitteln

mariner Herkunft auf Algentoxine hin 173,188,189.

Gewebe

HP Rest Kie Man Gon Add Fuß Gesamt

HP

(µg

PS

P/10

0g)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

wei

tere

Org

ane

(µg

PS

P/1

00g)

0

50

100

150

200

250

300

350

Spezies

M.edulis C.gigas C.edule L.littorea

µg P

SP

/100

g

0

200

400

600

800

1000

1200

1400


6.3 In vitro Inkubationsversuch

6.3.1 Versuchsdurchführung

Von 10 wirtschaftlich genutzten oder im Rahmen von Monitoring-Programmen relevanten

Muschelarten (Mytilus edulis, Crassostrea gigas, Cardium edule, Arctica islandica, Ensis ensis,

Modiolus modiolus, Mactra stultorum, Pecten maximus) und Schneckenarten (Buccinum

undatum, Littorina littorea) der Nordsee wurde jeweils der Verdauungstrakt (außer P. maximus,

bei B. undatum der Hepatopankreas [HP] sowie der Mitteldarm [MD]) und das Muskelgewebe

als Beispiele für Gewebe mit unterschiedlicher metabolischer Aktivität bzw. Enzymausstattung

separiert. Nach Zugabe von PBS-Puffer (Phosphate buffer salin) zur Stabilisierung (Verdau-

ungsgewebe/Puffer 1:1, Muskelgewebe/Puffer 1:2, jeweils im Massenverhältnis)1 wurden die

Gewebe homogenisiert (Zerstörung der Zellstruktur und Freisetzung von Enzymen) und das

Homogenisat im Verhältnis 10:1 mit einem hochkonzentrierten Extrakt von Alexandrium

fundyense CCMP 1719 versetzt. Dabei wurden Toxinkonzentrationen von ca. 34,4 nmol PSP/g

Verdauungsgewebe (VG) und 51,5 nmol PSP/g Muskelgewebe (MG) erreicht.

Die Hälfte des gut durchmischten Ansatzes wurde 48 Stunden bei 16 °C inkubiert. Der andere

Teil wurde sofort zentrifugiert, der Überstand filtriert und zur PSP-Toxinanalyse in die HPLC-

Apparatur injiziert (= T0).

Nach 48 Stunden erfolgten erneut die Zentrifugation, Filtration und PSP-Bestimmung des

Homogenisates (= T48). Die Inkubationsdauer von 48 Stunden stellte einen Kompromiß

zwischen der möglichst vollständigen Erfassung der metabolischen Aktivität der Mollusken und

dem Beginn von Bakterienwachstum mit den dadurch bewirkten Toxinumwandlungen dar.

Während der Versuchsvorbereitung und vor den HPLC-Bestimmungen wurden die Proben mit

Eis gekühlt, um eine Enzyminaktivierung durch Erwärmung des Substrates während des Homo-

genisierens zu vermeiden und die Enzymaktivität außerhalb der geplanten Inkubationszeit auf

einem Minimum zu halten. Eine wirksame Enzyminaktivierung vor den T0 und T48 Messungen,

z.B. durch kurzes Erhitzen oder Zugabe chemischer Inhibitoren, war nicht möglich, da uner-

wünschte Toxinumwandlungen und Artefaktbildungen auftraten.

Der detaillierte Versuchsablauf sowie die Einzelergebnisse sind im Anhang dargestellt.

1 Aufgrund der festeren und zäheren Konsistenz wurde das Muskelgewebe mit einem höheren Flüssigkeitsanteil versetzt, um die weitere Probenvorbereitung zu erleichtern.


6.3.2 Ergebnisse und Diskussion

Während des in vitro Versuches konnten gewebe- und speziesspezifische Umwandlungs-

prozesse, die bereits nach 48 Stunden (T48) zu signifikanten Änderungen des PSP-Profils im

Vergleich zur inkubierten Alge Alexandrium fundyense (GTX4 48,3 mol%, C2 23,4 mol%, Neo

20,2 mol%, C1 5,1 mol%, GTX1 1,6 mol%, GTX3 0,6 mol%, B1/B2 0,5 mol%, STX, GTX2

und dcGTX2/3 je 0,1 mol%) führten, nachgewiesen werden. Die Veränderungen wurden durch

reduktive Transformationen, Epimerisierungen und hydrolytische Abspaltungen funktioneller

Gruppen hervorgerufen, jedoch ist auch hier die Trennung einzelner biochemischer Vorgänge

mit Schwierigkeiten behaftet.

6.3.2.1 Metabolisierung der PSP-Toxine

Reduktive Umwandlungsprozesse

Bei den reduktiven Umwandlungen handelt es sich um Transformationen zwischen Carbamoyl-

toxinen, die durch natürlich vorkommende Reduktanden, wie z.B. Cystein und Glutathion, und

durch in den Muscheln vorhandenen Bakterien (enzymatisch) ausgelöst werden. Sie sind durch

eine Entfernung der Sulfatgruppe am C11-Atom, bei der STX aus GTX2/3 und Neo aus GTX1/4

entstehen, als auch durch eine Abspaltung der N-1-OH-Gruppe an GTX1/4 und Neo, wobei

GTX2/3 bzw. STX resultieren, gekennzeichnet 173,173,190,191,191 .

Ein Abfall im Gehalt der N-1-OH-Toxine bei gleichzeitiger deutlicher Zunahme von GTX2/3

und STX wurde besonders im Verdauungsgewebe von L. littorea, B. undatum (HP) und A. islan-dica deutlich (Abb. 36). Der Verlust an Neo und GTX1/4 betrug hier 90% gegenüber T0 bzw.

waren diese Toxine in L. littorea überhaupt nicht mehr nachweisbar. STX und GTX3 entwickel-

ten sich in L. littorea, B. undatum (HP) und A. islandica zu Haupttoxinen, während A. islandica

auch die stärkste GTX2-Anreicherung aller Spezies zeigte.

Neben Umwandlungsprozessen unterlagen Neo und GTX1/4 bevorzugt einem chemischen

Abbau, der vor allem im Verdauungsgewebe von C. edule (-86% GTX1/4, -85% Neo gegenüber

T0) und E. ensis (-47% GTX1/4, -42% Neo) offensichtlich wurde, da hier keine dement-

sprechende Zunahme der N-1-H Toxine zu verzeichnen war. Ein chemischer Abbau (insbes. von

GTX1/4) ist auch bei A. islandica, L. littorea, B. undatum und anderen Spezies bzw. Geweben

nicht auszuschließen, da der Verlust dieser Toxine die Zunahme von GTX2/3 und STX oftmals

überstieg und die GTX2/3-Neubildung auch einer Hydrolyse der C-Toxine zugeschrieben

werden kann.


Abb. 36: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX1-4, Neo, STX im Verdauungsgewebe (links) undim Muskelgewebe (rechts)

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und. (M

D)

B. und. (H

P)

M. stult.

nmol

PS

P/g

Ver

dauu

ngsg

eweb

e

0

5

10

15

20

25 GTX4GTX1

T0

T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und.

P. max.

M. stult.

nmol

PS

P/g

Mus

kelg

eweb

e

0

5

10

15

20

25

30 GTX4GTX1

T0

T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und. (M

D)

B. und. (H

P)

M. stult.

nmol

PS

P/g

Ver

dauu

ngsg

eweb

e

0

2

4

6

8

10

12 GTX3GTX2

T0

T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und. (M

D)

B. und. (H

P)

M. stult.

nmol

PS

P/g

Ver

dauu

ngsg

eweb

e

0

2

4

6

8

10 Neo_T0 Neo_T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und. (M

D)

B. und. (H

P)

M. stult.

nmol

PS

P/g

Ver

dauu

ngsg

eweb

e

0

1

2

3

4

5

6 STX_T0 STX_T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und.

P. max.

M. stult.

nmol

PS

P/g

Mus

kelg

eweb

e

0

2

4

6

8

10

12 Neo_T0 Neo_T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und.

P. max.

M. stult.

nmol

PS

P/g

Mus

kelg

eweb

e

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 GTX3GTX2

T0

T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und.

P. max.

M. stult.

nmol

PS

P/g

Mus

kelg

eweb

e

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4 STX_T0 STX_T48


Insgesamt konnten reduktive Prozesse bei nahezu allen Mollusken und Geweben beobachtet

werden. So nahm die GTX1/4-Konzentration in allen Homogenisaten ab (Ausnahme: B. unda-tum [HP], A. islandica [MG]) und die GTX2/3-Konzentration zu, wobei das Verdauungsgewebe

aktiver als das Muskelgewebe einzuschätzen ist. Die durchschnittliche Zunahme von GTX2/3

betrug im Verdauungsgewebe (ohne die Extremwerte von L. littorea, A. islandica, B. undatum,

C. edule, E. ensis) 119%, im MG dagegen nur 37% und auch Neo zeigte überwiegend im VG

Verluste. Auf der anderen Seite verzeichnete STX in allen Geweben (Ausnahme: L. littorea

[MG]) einen Zuwachs. Beim Verdauungsgewebe fand dieser konsequenterweise stärker als im

Muskelgewebe statt, in welchem STX einen Anteil von 0,6 mol% am Gesamttoxingehalt auch

nach 48 h Inkubation nicht überstieg.

Die Ergebnisse lassen auch darauf schließen, daß, wie aus in vivo Untersuchungen bekannt, die

Reduktion am N1-Atom leichter erfolgt als die OSO3- -Abspaltung am C11-Atom 190.

Hydrolytische Abspaltungen

Bei der Hydrolyse wird die N-Sulfo-Gruppe am N21-Atom aufgrund ihrer Instabilität bei

neutralem bis saurem pH-Wert nichtenzymatisch abgespalten. Dabei entstehen im Gewebe von

Meerestieren aus den gering toxischen B- und C-Toxinen die korrespondierenden, stärker toxi-

schen Carbamoyltoxine 65,192.

Mit auffälligen Abnahmen im C-Toxingehalt nach 48 h Inkubation hoben sich im vorliegenden

Versuch nur L. littorea (VG), C. edule (VG, MG), B. undatum (HP) und teilweise A. islandica

(MG, VG) hervor. In B. undatum (HP), A. islandica (VG) und L. littorea (MG) war dabei die

Neubildung von GT2/3 höher als C-Toxine metabolisiert wurden, womit die Reduktion von

GTX1/4 zu GTX2/3 in diesen Geweben bestätigt wurde (Abb. 37). In L. littorea (VG), C. edule

(VG, MG) sowie in A. islandica (MG) überstieg die Abnahme an C1 und C2 eine mögliche

Hydrolyse zu den Gonyautoxinen, was auf einen chemischen Abbau schließen läßt. Insbesondere

L. littorea (VG) zeigte von allen Spezies mit –88% den stärksten Verlust, vor allem auch von C1,

dem keine Zunahme von GTX2 gegenüberstand. Der C-Toxingehalt von C. edule (VG) blieb

trotz deutlichen Verlustes (-28%) auf hohem Niveau, so daß das Toxinprofil nach 48 h

Inkubation mit 66 mol% von diesen Toxinen dominiert wurde.

Bis auf L. littorea (VG) erwiesen sich die C-Toxine, wie schon im Fütterungsversuch, als relativ

persistent, und die hydrolytische Abspaltung der N-Sulfo-Gruppe wurde damit erneut als lang-

samer Prozeß bestätigt.


Abb. 37: Absolute Änderungen im Gehalt von GTX2, GTX3, C1, C2 im Verdauungsgewebe

(links) und im Muskelgewebe (rechts)

Die B-Toxine waren im Algenextrakt gegenüber den C-Toxinen in vergleichsweise geringer

Menge vorhanden. Ihre Metabolisierung würde deshalb zu weniger deutlichen Veränderungen

im Toxinmuster führen und leicht durch andere Toxinumwandlungen überlagert werden.

Möglicherweise kann jedoch mit ihrer hydrolytischen Transformation die Neubildung von Neo

in einigen Geweben (Muskelgewebe von A. islandica, M. edulis, C. gigas) begründet werden.

Epimerisierungen

Bei allen PSP-Toxinen mit 11-Hydroxysulfat-Gruppen werden nach ihrer Aufnahme in Mu-

scheln Änderungen der Epimeren-Verhältnisse durch eine mögliche thermodynamische Equi-

librierung beobachtet, wobei die vorrangig in toxischen Dinoflagellaten gebildeten β-Epimere in

die stabileren α-Epimere umgewandelt werden. Die Einstellung des stabilen Gleichgewichtes

von 3:1 (α:β) wird in vivo innerhalb von 2-5 Wochen erreicht und im allgemeinen durch hohe

Temperatur und hohen pH-Wert beschleunigt 65,175,177.

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und. (M

D)

B. und. (H

P)

M. stult.

nmol

PS

P/g

Ver

dauu

ngsg

eweb

e

0

2

4

6

8

10

12 GTX3GTX2

T0

T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und. (M

D)

B. und. (H

P)

M. stult.

nmol

PS

P/g

Ver

dauu

ngsg

eweb

e

02

468

10121416

18 C2C1

T0T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und.

P. max.

M. stult.

nmol

PS

P/g

Mus

kelg

eweb

e

0

5

10

15

20

25 C2C1

T0T48

Spezies

M. edul.

M. mod.

C. gigas

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und.

P. max.

M. stult.

nmol

PS

P/g

Mus

kelg

eweb

e

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 GTX3GTX2

T0

T48


Im vorliegenden Versuch traten sowohl im Verdauungsgewebe als auch im Muskelgewebe deut-

liche Epimerisierungen auf. Besonders umfangreich liefen sie im Muskelgewebe von L. littorea

(GTX1:GTX4 1,1:1 [A. fundyense 1:30,1]; GTX2:GTX3 1,4:1 [A. fundyense 1:12,2]; C1:C2

1,8:1 [A. fundyense 1:4,6]), P. maximus (GTX2:GTX3 1:1,3; C1:C2 1,8:1) und B. undatum

(GTX1:GTX4 1:1,9; GTX2:GTX3 1:1,3) sowie im Verdauungsgewebe von M. edulis

(GTX1:GTX4 1:2,5; GTX2:GTX3 1:1,8; C1:C2 1,3:1), B. undatum (MD: GTX1:GTX4 3,5:1;

GTX2:GTX3 1:1,6; C1:C2 1,3:1; HP: GTX1:GTX4 8,0:1) und L. littorea (C1:C2 3,5:1) ab. Es

wurde jedoch von keiner Spezies innerhalb der 48 h Inkubation das stabile Gleichgewicht von

3:1 (α:β) erreicht (Ausnahme: GTX1:GTX4 bei B. undatum MD, HP), und nur bei der Schnecke

L. littorea (MG) und teilweise zwischen C1 und C2 konnte ein Verhältnis von >1 für die

α-Epimere festgestellt werden (Abb. 36, 37).

C. edule zeichnete sich in beiden Geweben durch die geringste Keto-Enol Gleichgewichtsein-

stellung aus. Da jedoch rein thermodynamisch kontrollierte Vorgänge zwischen PSP-Toxinen

mit gleicher Geschwindigkeit ablaufen müßten, kann der Einfluß von gewebe- und artspezi-

fischen Enzymen in diesem Zusammenhang nicht ausgeschlossen werden.

Die Umwandlung der β-Epimere zu ihren korrespondierenden α-Epimeren überlagerte oftmals

die parallelen Reduktions- und Hydrolysevorgänge. So z.B. nahm GTX1 in vielen Geweben zu

oder blieb konstant, obwohl der GTX1/4-Gehalt drastisch gesunken war (z.B. VG von A. islan-

dica, M. edulis, E. ensis). Auf der anderen Seite wirkten die einzelnen biochemischen Reaktio-

nen auch synergistisch, wie anhand der starken Neubildung von GTX2 in A. islandica (VG)

deutlich wurde.

Enzymatische Toxinumwandlungen

Die enzymatische Umwandlung von N-Sulfocarbamoyl- und Carbamoyltoxinen zu den jeweili-

gen Decarbamoyltoxinen ist bei den Muscheln auf nur wenige Spezies begrenzt, während sie bei

Schnecken häufiger beobachtet wird 65,172,182,193. Hydrolysen mittels Carbamoylasen sind dabei

hoch substratspezifisch und laufen vorrangig im Verdauungsgewebe ab 113.

Die Bildung von dcSTX ließ sich in keinem Homogenisat feststellen, obwohl eine enzymatische

Decarbamoylierung bei Mactra chinensis, verwandt mit der hier verwendeten Mactra stultorum,

postuliert wurde, und auch dcGTX2/3 wurde nur vereinzelt in geringen Mengen (z.B. im

Muskelgewebe der Schnecken) gebildet.


6.3.2.2 Entwicklung der PSP-Profile

Insgesamt war die Biotransformation von PSP-Toxinen im Verdauungsgewebe intensiver als im

Muskelgewebe, und sie hatte bei den beiden Schneckenarten (mit sowohl herbivorer [L. littorea]

als auch carnivorer [B. undatum] Lebensweise) eine stärkere Ausprägung als bei Muscheln.

Die differenzierten Toxinumwandlungen schlugen sich in einer breiten Vielfalt charakteristischer

Toxinprofile nieder (Abb. 38, 39). So reflektierten das Muskelgewebe der Muscheln und einige

Verdauungsgewebe (z.B. das von M. edulis und C. gigas) auch nach 48 h Inkubation die PSP-

Verteilung des zugesetzten Algenextraktes, wobei Neo, GTX4, C1, C2 und GTX1 dominierten.

Epimerisierungen am C11-Atom und auch Verluste an GTX1/4 kennzeichneten die gering-

fügigen Unterschiede.

Abb. 38: Toxinprofile von A. fundyense und vom Muskelgewebe einiger Mollusken nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)

Die Vielfalt der erhaltenen Toxinprofile lag dagegen im Verdauungsgewebe höher, und bei der

Schnecke B. undatum wurden zudem die gravierenden Unterschiede in der metabolischen Kapa-

zität zwischen einzelnen Abschnitten des Verdauungsapparates auf interessante Weise deutlich.

Während am Ende der Inkubationszeit durch reduktive Umwandlungen GTX3 (36,2 mol%), C2

(23,7 mol%) und STX (22,3 mol%) den Hauptteil der PSP-Toxine im Hepatopankreas bestimm-

A. fundyenseSTX

0,1%Neo

20,2%

dcGTX2/30,1%

B1/B20,5%

GTX448,3%

C223,4%

GTX11,6%

C15,1%

GTX30,6%

GTX20,1%

M. edulisSTX

0,2%Neo

18,0%

GTX111,5%

GTX432,1%

GTX30,6%

C1 18,5%

C217,0%

dcGTX2/30,2%

B1/B21,6%

GTX20,3%

C. gigasSTX

0,1%Neo

19,6%

GTX19,5%

GTX433,2%

C1 15,9%

C220,1%

B1/B20,5%

dcGTX2/30,2%

GTX20,2%

GTX30,7%

L. littoreaSTX

1,1%Neo

13,9%

GTX119,0%

GTX416,9%

C1 26,8%

C215,3%

dcGTX2/32,5%

B1/B22,4%

GTX30,9%

GTX21,2%


B. undatum (HP)

GTX336,2%

C1 4,6%

C223,7%

GTX15,3%

B1/B20,7%

dcGTX2/33,0%

GTX40,7%

GTX21,2%

Neo2,3%

STX22,3%

ten, dominierten im Mitteldarm nach starken Epimerisierungen GTX1 (39,5 mol%), C1 (16,1

mol%), C2 (12,4 mol%) und GTX4 (11,4 mol%).

Die auffälligsten Veränderungen gegenüber dem PSP-Profil von A. fundyense ergaben sich

neben B. undatum (HP) auch in L. littorea (VG), A. islandica (VG) und C. edule (VG). Bis auf

das letztgenannte Gewebe war das jeweilige Toxinspektrum durch die stabilen PSP-Derivate

GTX2, GTX3 und STX charakterisiert.

Abb. 39: Toxinprofile von A. fundyense und vom Verdauungsgewebe einiger Mollusken nach 48 h Inkubation (Angaben in mol%)

A. fundyenseSTX

0,1%Neo

20,2%

dcGTX2/30,1%

B1/B20,5%

GTX448,3%

C223,4%

GTX11,6%

C15,1%

GTX30,6%

GTX20,1%

C. edule

C1 27,6%

C238,8%

STX0,7%

dcGTX2/30,5%Neo

7,8%GTX13,1%

GTX415,2%

GTX20,9%

GTX32,3%

B1/B23,1%

M. modiolusSTX

1,2%

GTX440,8%

GTX31,5%

C1 15,0%

C217,9%

Neo16,7%

B1/B20,3%

dcGTX2/30,6%

GTX15,3%

GTX20,7%

L. littorea

STX42,6%

GTX26,4%

GTX337,5%

C1 7,8%

C22,2%

B1/B21,5%

dcGTX2/32,0%

B. undatum (MD)STX

4,3%Neo

8,1%

dcGTX2/31,7%

B1/B20,3%

GTX139,5%GTX4

11,4%GTX22,4%

GTX33,7%

C1 16,2%

C212,4%


6.3.2.3 Entwicklung der Gesamt-PSP-Gehalte

Bei Betrachtung der Entwicklung der PSP-Gehalte der einzelnen Gewebe während der Inkuba-

tion fällt auf, daß sich insbesondere bei den Spezies mit den größten Änderungen im Toxinprofil

signifikante Abnahmen der Gesamttoxizität (nmol STXeq/g) und des Gesamt-PSP-Gehaltes

(nmol PSP/g, Abb. 40) gegenüber T0 ergaben.

Offenbar waren einige Spezies bzw. Gewebe in der Lage, sehr schnell PSP-Toxine abzubauen

und/oder in weniger toxische PSP-Toxine zu konvertieren. Diese rasche Entgiftung ging dabei

vor allem zu Lasten der sehr toxischen Derivate Neo, GTX1 und GTX4.

Abb. 40: Veränderung des Gesamt-PSP-Gehaltes während der Inkubation in Abhängigkeit von der

Tierspezies (links: Verdauungsgewebe, rechts: Muskelgewebe)

Ähnliche Beobachtungen machte bereits Shimizu bei einem in vitro Experiment mit Muskel-

geweben von Placopecten magellanicus, die mehr als 50% ihrer Toxizität innerhalb von 3 Tagen

verloren 194.

Spezies mit einer weniger ausgeprägten Biotransformation, wie M. edulis, M. modiolus und

C. gigas zeigten dagegen kaum eine Abnahme des Toxingehaltes und der Toxizität, andererseits

kam es auch vereinzelt zu einer Zunahme im Vergleich zu T0. Hierbei könnte eine Rolle spielen,

daß zugesetzte PSP-Toxine sofort an Proteine der Gewebe gebunden wurden. Dadurch wurden

sie bei der T0-Analyse (ohne Säureaufschluß durchgeführt) nicht erfaßt. Dagegen könnte nach

48 h Inkubationszeit die Bindung der PSP-Toxine unter Enzymeinfluß teilweise wieder gelockert

sein, so daß bei der T48-Analyse höhere Werte gefunden wurden.

Bis zu den Startanalysen (T0) kam es bereits zu Änderungen im PSP-Profil einiger Mollusken

gegenüber dem von A. fundyense. Das liegt möglicherweise in der Schnelligkeit einiger enzyma-

SpeziesM. e

dul.

M. mod.

C. giga

s

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und.

(H)

B. und

. (M)

M. stult.

nmol

/g V

erda

uung

sgew

ebe

0

10

20

30

40

50

60 T0 T48

SpeziesM. e

dul.

M. mod.

C. giga

s

A. islan.

L. litto

r.

C. edul.

E. ens.

B. und

.

P. max

.

M. stult.

nmol

/g M

uske

lgew

ebe

0

10

20

30

40

50

60

70 T0 T48


tischer und chemischer Reaktionen begründet, die innerhalb weniger Minuten ablaufen können.

Auch ist es möglich, daß die oben angesprochene anfängliche Bindung der PSP-Toxine an

Proteine selektiv für bestimmte Derivate erfolgte. Im Blindversuch (A. fundyense plus PBS-

Puffer 1:1) waren nach 20 min (Zeit für die Aufarbeitung des Homogenisats zur HPLC-Analyse)

noch keine Veränderungen sichtbar.

Die differenzierte Entwicklung des Toxinprofils während der Inkubation beweist die spezies-

spezifische und gewebespezifische Metabolisierung von PSP-Toxinen unabhängig von Absorp-

tionseffizienz, Sensitivität und Bindungskapazität. Einige Transformationsprozesse, darunter vor

allem die reduktiven Vorgänge, sind jedoch auch auf mit den Mollusken assoziierte Bakterien

zurückzuführen 190,195. Da jedes Gewebe eine spezifische Mikroflora besitzt (im HP mehr als im

MG), ist ihr Einfluß als charakteristisch zu beurteilen. Eine bakterielle Fremdkontamination mit

Auswirkungen auf den Toxinkatabolismus ist natürlich nicht auszuschließen, jedoch deuten die

breitgefächerten Veränderungen im Toxinprofil auf eine nur minimale und zufällige Fremd-

kontamination hin.

In der Literatur werden nur wenige in vitro Experimente zu PSP-Toxinen erwähnt 65,190,194,196. In

den dort dargestellten Versuchen, durchgeführt mit gleichen und anderen Spezies, wurde meist

bei höherer Temperatur und über längere Zeit inkubiert. Teilweise wurden Bakterizide zugesetzt,

die jedoch auch molluskenspezifische Mikroorganismen hemmen bzw. es wurden Bakterien und

Enzyme isoliert und mit einzelnen PSP-Toxinen inkubiert. Insofern sind die Ergebnisse der vor-

liegenden Arbeit nur eingeschränkt mit den Literaturdaten vergleichbar. Dennoch werden diese

im wesentlichen bestätigt sowie an wichtigen Punkten ergänzt.

Shimizu postulierte für Muskelgewebe das Vorhandensein großer Mengen an Enzymen, die an

Redoxreaktionen und damit besonders an der Abspaltung der Sulfat-Gruppe beteiligt sind 194.

Bei den vorliegenden Versuchen konnte dieses Postulat wegen der beobachteten vergleichsweise

geringen Zunahmen an STX, GTX2/3 experimentell nicht untermauert werden.

Bei den Experimenten mit isolierten Bakterien und Enzymen waren die PSP-Toxinumwand-

lungen (vor allem Reduktionen) in Isolaten aus dem Verdauungsgewebe, im Gegensatz zu denen

aus dem übrigen Gewebe, schon nach wenigen Stunden abgeschlossen, wobei C11-β-Epimere

schneller als die entsprechenden α-Epimere metabolisiert wurden 113,190,196. Außerdem wurde

behauptet, daß die in den Geweben vorhandenen Bakterien mittels Sulfotransferasen z.B.

Gonyautoxine in ihre korrespondierenden C-Toxine „rückführen“ 190. Damit könnte der hier in


vielen Geweben beobachtete, meist gleichbleibende und teilweise sogar ansteigende Gehalt der

N-Sulfocarbamoyltoxine gegenüber T0 ebenfalls erklärt werden.

Oshima publizierte hingegen, daß beide reduktiven Umwandlungsprozesse (N-1-OH- und C11-

OSO3-–Abspaltung) bei 30 °C innerhalb von 24 Stunden auch ohne bakterielle Beteiligung ab-

laufen 65.

Für vier Gewebe (2x HP, 2x MG) von vier Spezies (M. edulis, M. modiolus, C. gigas, L. littorea)

wurden 3 Inkubationsexperimente parallel durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der Ergeb-

nisse und die Schwankungsbreite der Toxinanalysen stellvertretend für die übrigen Homogenisa-

te abschätzen zu können. Dabei unterschieden sich die Schwankungsbreiten der T0-Werte nicht

signifikant von denen der T48-Werte (t-Test, α = 0,05, Ausnahme: MG von M. modiolus, der

größere Schwankungsbreiten für die T0-Werte zeigte). Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse

war sowohl für das Muskel- als auch für das Verdauungsgewebe als gut zu bewerten. Meist

lagen die relativen Standardabweichungen der Einzeltoxine unter 15%, bei 60% der Analysen

sogar unter 10%.

Nicht zu unterschätzen ist, daß im jeweiligen Homogenisat eine Vielzahl von Einzelindividuen

verarbeitet wurde. Interessant wäre in weiteren Experimenten die Inkubation von PSP-Toxinen

mit Geweben von Einzelindividuen in einer größeren Anzahl paralleler Ansätze zu untersuchen,

um Erkenntnisse hinsichtlich der individuellen Biotransformationskapazität zu erhalten.

6.4 Schlußfolgerungen und Ausblick

C. gigas, C. edule und die Schnecke L. littorea sind bereits bei einer moderat toxischen Misch-

algenblüte fähig, PSP-Toxine zu akkumulieren und kommen somit für den Toxintransfer in der

marinen Nahrungskette in Frage. Es zeigte sich aber, daß L. littorea nach PSP-Exposition und

Entfernung des Darmabschnittes keine Gefahr für den Verbraucher darstellt, während C. edule

sehr effektiv PSP-Toxine speichert. Unabhängig davon sollte für beide Spezies das Verhalten

gegenüber hochtoxischen Monoblüten untersucht werden.

C. gigas erreicht bei moderat toxischen Mischblüten Toxinbelastungen in ähnlicher Größen-

ordnung wie M. edulis, was aber aufgrund einer für C. gigas nachgewiesenen Sensibilität gegen-

über PSP-Toxinen nicht auf hochtoxische Monoblüten übertragbar ist. Innerhalb von wenigen

Wochen wurde, in Abhängigkeit von der Ausgangstoxizität, die Verkehrsfähigkeit von M. edulis,

C. gigas, C. edule und L. littorea wieder erreicht, die deshalb zu den Kurzzeitspeicherern gezählt

werden müssen.


Die Kapazität der Muscheln zur Metabolisierung von PSP-Toxinen ist als relativ gering einzu-

schätzen, da signifikante Veränderungen gegenüber dem Toxinmuster der Algen erst während

der Detoxifikation deutlich wurden. Der Gehalt an PSP-Toxinen in den Muscheln und Schnek-

ken war insgesamt zu niedrig, um ihr tatsächliches Potential zur Biotransformation zu verfolgen.

Trotz Ähnlichkeiten bei den Toxinprofilen deuteten sich auch Unterschiede in der Metabolisie-

rung von PSP-Toxinen zwischen den Spezies und den einzelnen Geweben an. Außerdem wurde

ein ausgeprägter, speziesspezifischer, von der Versuchsdauer abhängiger Toxintransfer, insbe-

sondere vom Verdauungsgewebe in das umliegende Gewebe, festgestellt. Auch ergaben die

Untersuchungen, daß die Entfernung besonders belasteter Gewebe (z.B. Hepatopankreas) keine

absolute Sicherheit für den Verbraucher gewährleistet.

In weiterführenden in vivo Experimenten sollten C. gigas, C. edule und L. littorea in getrennten

Behältnissen mit toxischen Algen in höherer Zahl gefüttert werden, um genauere Analysen der

aufgenommenen Algenmengen durchführen zu können und neue Erkenntnisse bzgl. zu erwar-

tender Toxizitäten und der Metabolisierungsleistung bei höherer PSP-Belastung zu gewinnen.

Dabei könnten Individuen einer Spezies auch während bzw. gegen Ende der Entgiftung auf eine

Entwicklung ihrer intrapopulativen Variationen hin untersucht und gleichzeitig auf speziesspezi-

fische Unterschiede überprüft werden.

In in vitro Experimenten wurde die Metabolisierung der PSP-Toxine in einzelnen Geweben (Verdauungsgewebe, Muskelgewebe) speziesabhängig direkt, d.h. ohne Berücksichtigung von Toxintransfer und Akkumulationskinetik, ermittelt. Dabei wurde beim Muskelgewebe, welches bei durchschnittlichen Algenblüten oft nur gering kontaminiert ist, nach Zugabe großer Mengen an PSP-Toxinen das eigentliche Potential der Biotransformation deutlich. Es wurde nicht nur im Hepatopankreas eine hohe Transformationsaktivität aufgrund der hohen Konzentration an Verdauungsenzymen erwartet, sondern auch im stoffwechselaktiven Muskel-gewebe. Die Inkubationsexperimente ergaben jedoch nur bei den marinen Schnecken signifikan-te Änderungen im PSP-Profil des Muskelgewebes nach 48 h, wobei diese Schnecken auch im Verdauungsgewebe die höchsten Biotransformationskapazitäten aufwiesen. So kann beispiels-weise das Fehlen von Neo bei L. littorea im Fütterungsexperiment mit dem Ergebnis des in vitro Versuches erklärt werden. Der beim in vivo Versuch miteinander vergleichbare, gering ausgeprägte Toxinmetabolismus in M. edulis und C. gigas wurde mit den geringen Metabolisierungsraten der PSP-Toxine in beiden Spezies während der Inkubation bestätigt. Hingegen konnten auch hier bei C. edule die schwache Epimerisierungsleistung und im Hepatopankreas hohe Gehalte an N-Sulfocarbamoyltoxinen nachgewiesen werden. Beim Fütterungsversuch schien vom HP der selektive Transfer von


C-Toxinen in den Fuß auszugehen. Desweiteren zeigte sich in beiden Versuchsanordnungen bei einem Großteil der Gewebe eine hohe Persistenz der C-Toxine im Vergleich zu den Carbamoyl-toxinen. Die Rolle der Mikroflora im Verdauungsgewebe und in anderen Kompartimenten der Mollusken bei der Umwandlung und bei dem Abbau von PSP-Toxinen zu nichttoxischen Derivaten ist noch nicht ausreichend erforscht. Hierzu sind weitere in vitro Experimente notwendig, z.B. eine Parallelinkubation von Molluskenhomogenisaten mit und ohne Bakterizide, um gewebeeigene Metabolisierungen von denen unter Mitwirkung von Bakterien erfolgenden abzugrenzen. Eben-falls durchgeführt werden sollten aerobe und anaerobe Versuchsansätze und die Inkubation mit einzelnen PSP-Toxinen. Um die zeitliche Abfolge der Umwandlungsprozesse besser zu doku-mentieren, sind die Zeitabstände der Toxinanalysen während der Inkubation zu verkürzen. Die Experimente im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden durchgeführt, um weitere und genauere Daten bzgl. der Akkumulation und Biotransformation der von Dinoflagellaten produ-zierten PSP-Toxine in Schalen- und Krustentieren zu gewinnen. Diese Daten, bisher nur unzu-reichend vorhanden, sind eine wichtige Hilfe bei der Abschätzung zu erwartender Toxizitäten einzelner Muschel- und Schneckenarten und bilden die Grundlage für Entscheidungen im Hinblick auf den Schutz des Verbrauchers vor gesundheitlichen Gefährdungen durch Algen-toxine in Lebensmitteln mariner Herkunft.

III Zusammenfassung 96

III ZUSAMMENFASSUNG

Als Paralytic Shellfish Poisoning (PSP) -Toxine werden eine Gruppe potenter Neurotoxine, die

von marinen Dinoflagellaten und einigen Cyanophyceen produziert werden, bezeichnet. Mit der

Aufnahme toxischer Algen, z.B. durch filternde Muscheln, können sich PSP-Toxine in der mari-

nen Nahrungskette anreichern, so daß es zu Vergiftungen nach Verzehr von mit PSP-Toxinen

kontaminierten Schalentieren kommen kann. Zur Bestimmung von PSP-Toxinen aus Krusten-

und Schalentieren wurden deshalb sowohl Bioassays und biochemische als auch physikalisch-

chemische Nachweisverfahren entwickelt.

Bioassays (z.B. der Maus-Bioassay) sind schnell und einfach durchführbar, jedoch erlauben sie

keine Aussagen zum Vorkommen einzelner PSP-Toxine bzw. zur chemischen Struktur.

Mit biochemischen Methoden können Toxine spezifisch bestimmt werden, jedoch kommt es

häufig zu Kreuzreaktionen bzw. einige toxikologisch relevante PSP-Toxine werden mit diesen

Verfahren (ELISA, Voltage-clamp-Verfahren) nicht erfaßt.

Hingegen gestatten chromatographische Verfahren - unabhängig davon, ob eine Vorsäulen- oder

Nachsäulenderivatisierung erfolgt - den selektiven und empfindlichen Nachweis von in Bio-

materialien nebeneinander vorliegenden PSP-Toxinen.

Zur HPLC-Bestimmung von PSP-Toxinen werden gegenwärtig ionenpaarchromatographische

Methoden mit oxidativer post-column Derivatisierung und anschließender Fluoreszenzdetektion

eingesetzt. Als nachteilig erweist sich hierbei die störanfällige chemische Nachsäulenderivatisie-

rung, die zusätzliche Chemikalien und einen hohen apparativen Aufwand erfordert. Außerdem

verhindern die kostenintensiven Ionenpaarbildner und der Phosphatpuffer im Eluenten die Kopp-

lung der HPLC-Apparatur an das Massenspektrometer.

Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, ein HPLC-Verfahren zur

Bestimmung von PSP-Toxinen zu entwickeln, bei dem durch die Verwendung flüchtiger

Substanzen im Eluenten die chemische Derivatisierung durch eine elektrochemische Oxidation

ersetzt werden kann und die Kopplung der HPLC-Apparatur an ein Massenspektrometer möglich

ist. Allerdings mußte zunächst die in Jena bereits in der Routineanalytik eingesetzte ionenpaar-

chromatographische HPLC-Methode hinsichtlich Trennleistung und Reproduzierbarkeit opti-

miert werden.


Leistungsfähige Analysenverfahren, die die Erfassung einzelner Toxine und ihrer Metaboliten

gestatten, sind essentiell für das Verständnis der Biochemie der PSP-Toxine sowie ihrer Inter-

aktion in der Umwelt. Außerdem sind profunde Kenntnisse über den Verbleib von PSP-Toxinen

in der Nahrungskette Grundlage für die Entwicklung effektiver Monitoring-Programme zum

Schutz der Konsumenten vor Vergiftungen durch PSP-kontaminierte Lebensmittel mariner

Herkunft. Deshalb waren Studien zur Anreicherung und Metabolisierung von PSP-Toxinen in

Krusten- und Schalentieren durchzuführen, um neue Erkenntnisse bzgl. der für bestimmte

Spezies charakteristischen Transformationsprozesse zu gewinnen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden anhand von in vivo Fütterungsstudien und von in

vitro Inkubationsexperimenten die Akkumulation, Detoxifikation und Biotransformation von

PSP-Toxinen in verschiedenen kommerziell genutzten Muschel- und Schneckenarten der Nord-

see untersucht. Mit diesem Vorgehen konnten sowohl chemisch-analytische Aspekte im Zusam-

menhang mit PSP-Toxinen als auch die Bedeutung dieser Algentoxine in der marinen Umwelt

miteinander verknüpft und gleichzeitig die Praxistauglichkeit des optimierten bzw. neu entwik-

kelten HPLC-Verfahrens überprüft werden.

Das optimierte HPLC-Verfahren zur PSP-Bestimmung basiert auf der ionenpaarchromato-

graphischen Methode von Thielert et al., das bereits von Yu et al. hinsichtlich einer Trennung

von GTX1 und GTX4 unter Inkaufnahme nicht reproduzierbarer Retentionszeiten und längerer

chromatographischer Runs modifiziert wurde. Nach Erhöhung der Effizienz der Equilibrierung

der zur Toxintrennung eingesetzten RP-C18 Säule und einem veränderten Gradientenprogramm

resultierte eine robuste HPLC-Methode für die Routineanalytik von PSP-Toxinen auf der Basis

der Ionenpaarchromatographie.

Bei der Entwicklung des neuen HPLC-Verfahrens zur Bestimmung von PSP-Toxinen wurde auf

das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie zurückgegriffen, um eine Kopplung mit dem

Massenspektrometer zu ermöglichen. Dabei gelang die Trennung von anionischen und kationi-

schen PSP-Toxinen durch die Verbindung einer starken Anionenaustauschersäule mit zwei

starken Kationenaustauschersäulen und einem ausschließlich Ammoniumacetat enthaltenden

wäßrigen Eluenten. Die Optimierung der Elutionsbedingungen erfolgte durch Abstimmung der

Ammoniumacetatkonzentration und des pH-Wertes des Eluenten sowie durch Variation des

organischen Modifiers.


Nach Vereinfachung der chromatographischen Bedingungen konnte die mit Oxidationslösungen

durchgeführte Nachsäulenderivatisierung durch eine elektrochemische Oxidation in der „Guard

cell“ eines elektrochemischen Detektors erfolgen. Die Leistungsfähigkeit dieses neuen HPLC-

Verfahrens wurde im Rahmen von vergleichenden Messungen PSP-belasteter Algen und

Muscheln überprüft, wobei das Probenmaterial zusätzlich mit der optimierten HPLC-Methode

auf Basis der Ionenpaarchromatographie analysiert wurde.

Die ausschließliche Verwendung von Ammoniumacetat im wäßrigen Eluenten ermöglichte nicht

nur eine einfachere und preiswertere PSP-Bestimmung, sondern aufgrund der Volatilität der

mobilen Phase auch den Einsatz der LC/MS-Kopplung, jedoch wirkte sich hierbei zunächst die

hohe Ionenkonzentration des Puffers nachteilig auf die Nachweisempfindlichkeit der massen-

spektrometrischen Detektion aus. Allerdings konnte durch teilweise Substitution des Ammo-

niumacetates mit Acetonitril und durch höhere Injektionsmengen die geringere Nachweis-

empfindlichkeit der MS-Detektion ausgeglichen werden, so daß jetzt auch PSP-Konzentrationen

unterhalb der gesetzlich zulässigen Höchstmenge an PSP-Toxinen in Lebensmitteln eindeutig

mit Hilfe der Massenspektrometrie bestimmt werden können.

Durch den Verzicht auf die chemische Derivatisierung wurde die Kopplung HPLC/FLD/MS

möglich. Dabei wird das von der Säule kommende Eluat über einen Split geleitet, und die

underivatisierten PSP-Toxine gelangen sowohl direkt in das Massenspektrometer als auch über

eine elektrochemische Zelle in den Fluoreszenzdetektor. Die parallele Messung von Proben mit

unterschiedlichen Detektoren garantiert eine hohe Zuverlässigkeit bei der Identifizierung der

jeweils zu analysierenden einzelnen PSP-Toxine.

Aufgrund der unterschiedlichen Toxizität der einzelnen PSP-Toxine müssen alle in einer Probe

vorhandenen PSP-Toxine eindeutig bestimmt werden, um die Gesamttoxizität möglichst exakt

berechnen zu können. Mit dem Massenspektrometer ist nicht nur eine eindeutige Identifizierung

und Quantifizierung der PSP-Toxine möglich, sondern es können auch Aussagen zur Struktur

von Substanzen gemacht werden, die als bisher nicht näher identifizierte Peaks in den Chromato-

grammen auftauchen

Ein weiterer Vorteil der massenspektrometrischen Detektion besteht darin, daß die chromato-

graphische Trennung nur für PSP-Toxine notwendig ist, die bei gleicher Massenzahl detektiert

werden. Dadurch kann durch isokratische Elutionsbedingungen und Verzicht auf den Anionen-

austauscher (die Messung von N-Sulfocarbamoyltoxinen ist für die Lebensmittelüberwachung

nicht erforderlich) die zur PSP-Bestimmung notwendige Analysenzeit signifikant verkürzt


werden, und gleichzeitig steht ein schnelles (Runzeit = 15 Minuten) HPLC-Verfahren mit MS-

Detektion für PSP-Analysen im Rahmen von Monitoring-Programmen und zur Lebensmittel-

kontrolle zur Verfügung.

Für jede Methode zur PSP-Bestimmung ist die Verfügbarkeit einzelner PSP-Toxine als reine

Standardsubstanzen essentiell. Durch die einfache Zusammensetzung der mobilen Phase und die

ausschließliche Verwendung flüchtiger Puffersubstanzen ist das neue HPLC-Verfahren auch zur

Gewinnung von PSP-Standardlösungen geeignet. Mit dem upscaling der chromatographischen

Trennung unter Verwendung präparativer Ionenaustauschersäulen wurde bereits begonnen.

Im in vivo Fütterungsexperiment wurden zum menschlichen Verzehr geeignete Muschel-

(Miesmuscheln, Austern, Herzmuscheln) und Schneckenarten (Strandschnecken) bzgl. der

Akkumulation von PSP-Toxinen sowie der Toxinumwandlungsaktivität untersucht. Während

einer sechswöchigen Fütterungsphase mit PSP-produzierenden Alexandrium fundyense-Zellen

und einer achtwöchigen Entgiftungsperiode wurde die Kontamination mit PSP-Toxinen sowie

die Detoxifikation verfolgt. Alle Spezies konnten als Speicherorganismen für PSP-Toxine und

damit als potentielle Verursacher von PSP-Vergiftungen identifiziert werden.

Nach Simulation einer moderat toxischen Mischblüte akkumulierten Herzmuscheln besonders

große Mengen an PSP-Toxinen. Miesmuscheln und Austern speicherten weniger und wiesen

Toxizitäten auf niedrigerem Niveau, jedoch deutlich über dem gesetzlichen Grenzwert auf.

Strandschnecken akkumulierten nur geringe Toxinmengen, wobei das Muskelgewebe untoxisch

blieb.

Erwartungsgemäß zeigte das Verdauungsgewebe bei allen Tieren die höchste und das Muskel-

gewebe die niedrigste PSP-Kontamination, jedoch erfolgte ein Toxintransfer zwischen den

Geweben. Bei Austern erfolgte er am schnellsten.

Die Detoxifikationsdauer war von der Initialtoxizität der Gewebe abhängig, jedoch konnten alle

untersuchten Spezies als schnell detoxifizierend charakterisiert werden, da sie innerhalb von

wenigen Wochen entgifteten.

Muscheln zeigten eine miteinander vergleichbare moderate Kapazität hinsichtlich der Toxin-

biotransformation. Metabolisierungen der PSP-Toxine wurden insbesondere nach Beendigung

der Fütterung mit toxischen Algen deutlich. Bei den Strandschnecken waren aufgrund einer nur

sporadischen Nahrungsaufnahme keine charakteristischen Veränderungen im Toxinprofil er-

kennbar.


Die Ergebnisse der Analysen von Einzeltieren zeigten, daß starke Unterschiede im Toxingehalt

zwischen Individuen gleicher Gebiete und Individuen, die unter gleichen Bedingungen PSP-

haltige Algen aufnehmen, auftreten können.

Bei den in vitro Inkubationsexperimenten wurde von 10 verschiedenen, zum Verzehr tauglichen

Muschel- und Schneckenarten (inklusive der beim Fütterungsversuch eingesetzten Spezies) das

Muskel- und Verdauungsgewebe mit einem PSP-haltigen Extrakt von Alexandrium fundyense

über einen Zeitraum von 48 Stunden inkubiert. Dabei konnten nach Analyse der Veränderungen

der PSP-Profile die speziesspezifischen und gewebespezifischen Metabolisierungen erfaßt wer-

den.

Insgesamt wurden in Schnecken und in den meisten Verdauungsgeweben besonders starke

Aktivitäten bei der Umwandlung von PSP-Toxinen beobachtet. So waren Reduktionsvorgänge

hauptsächlich hier zu beobachten. Hingegen fanden Umwandlungen von N-Sulfocarbamoyl-

toxinen zu ihren korrespondierenden Carbamoyltoxinen nur in begrenztem Umfang statt.

Speziell die C-Toxine blieben länger als einige Carbamoyltoxine in den Geweben nachweisbar.

Epimerisierungen erfolgten sowohl im Muskel- als auch im Verdauungsgewebe, während

Decarbamoylierungen kaum auftraten.

Spezies mit hohen Biotransformationskapazitäten verzeichneten nach 48 Stunden eine signifi-

kante Reduktion des PSP-Gehaltes und der Toxizität. Damit verfügen diese Organismen über

einen effektiven Entgiftungsmechanismus, dessen Grundlage die Umwandlung der aus Algen

stammenden PSP-Toxine in weniger toxische und/oder besser ausscheidbare Metabolite bildet.

Der Einsatz der optimierten und der neu entwickelten HPLC-Methode bewährte sich bei der

Durchführung dieser biologischen Studien. Dabei konnte die neue HPLC-Methode mit Fluores-

zenzdetektion problemlos für die Analytik von Algenextrakten eingesetzt werden, jedoch erwies

sich eine zusätzlich MS-Absicherung der nach Fluoreszenzdetektion erhaltenen Ergebnisse

speziell bei der Analyse von Extrakten aus Muscheln als unbedingt notwendig.

Somit ist zu konstatieren, daß die Optimierung des HPLC/FLD-Verfahrens auf der Basis der

Ionenpaarchromatographie und die Entwicklung eines neuen HPLC/FLD/MS-Verfahrens auf der

Basis der Ionenaustauschchromatographie dazu führten, daß PSP-Toxine aus marinen Organis-

men schnell, empfindlich und eindeutig nachgewiesen werden können.

IV Literaturverzeichnis 101

IV LITERATURVERZEICHNIS

[1] Lipp EK, Rose JB (1997): The role of seafood in foodborne diseases in the United States of America. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 16, 620-640.

[2] Simon B, Mebs D, Gemmer H, Stille W (1977): Vergiftungserscheinungen nach dem Verzehr von Miesmuscheln. Deutsche Medizinische Wochenschrift 102, 1114-1117.

[3] Brown CK, Shepherd SM (1992): Marine trauma, envenomations, and intoxications. Environmental Emergencies 10, 385-408.

[4] Sommer H, Whedon WF, Kofoid CA, Stohler R (1937): Relation of paralytic shellfish poison to certain plankton organisms of the genus Gonyaulax. Arch. Pathol. 24, 537-559.

[5] Daranas AH, Norte M, Fernandez JJ (2001): Toxic marine microalgae. Toxicon 39, 1101-1132.

[6] Shumway SE (1995): Phycotoxin related shellfish poisoning: bivalve molluscs are not the only vectors. Rev. Fisheries Science 3, 1-31.

[7] Anderson DM, White AW (1992): Marine biotoxins at the top of the food chain. Oceanus 35, 55-61.

[8] Bürk C, Usleber E, Märtlbauer E (1998): Vergiftungen durch Toxine mariner Algen - eine Übersicht. Archiv für Lebensmittelhygiene 49, 1-24.

[9] Yasumoto T (2000): Historic considerations regarding seafood safety. Botana LM (ed.), Seafood and Freshwater toxins: Pharmacology, Physiology, and Detection, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 1-17.

[10] Kao CA (1966): Tetrodotoxin, saxitoxin and their significance in the study of excitation phenomena. Pharmacological Reviews 18, 997-1049.

[11] Hallegraeff GM (1993): A review of harmful algal blooms and their apparent global increase. Phycologia 32, 79-99.

[12] Viviani R (1992): Eutrophication, marine biotoxins, human health. Sci. Total Environ. (suppl.), 631-662.

[13] Fraga S, Bakun A (1993): Global climate change and harmful algal blooms: the example of Gymnodinium catenatum on the Galician coast. Smayda TJ, Shimizu Y (eds.), Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 59-65.

[14] Gosselin S, Levasseur M, Gauthier D (1993): Transport and introduction of toxic dinoflagellates via ballast water on the eastern Atlantic coast of North America. 6th International Conference on Toxic Marine Phytoplankton, 18.-22.10.1993, Nantes.

[15] Rigby GR, Taylor AH, Hallegraeff GM, Mills P (1995): Progress in research and managment of ship's ballast water to minimize the transfer of toxic dinoflagellates. Lassus P, Arzul G, Erard E, Gentien P, Marcaillou C (eds.), Harmful Marine Algal Blooms, Lavoisier Intercept Ltd., Paris, 821-824.


[16] Rigby G, Hallegraeff G (1996): Ballastwater controls to minimize the translocation and etablishment of toxic marine phytoplankton - What progress we made and where are we going? Yasumoto T, Oshima Y, Fukuyo Y (eds.), Harmful and Toxic Algal Blooms, IOC/UNESCO, Paris, 201-204.

[17] Steidinger KA (1993): Some taxonomic and biologic aspects of toxic dinoflagellates. Falconer IR (ed.), Algal Toxins in Seafood and Drinking Water, London Academic Press, London, 1-28.

[18] Taylor FJR (1987): The biology of dinoflagellates. Botanical Monographs 21, Blackwell Scientific Publications, Oxford.

[19] Steidinger KA, Baden DG (1984): Toxic marine dinoflagellates. Spector DL (ed.), Dinoflagellates, Academic Press Inc., Orlando, 201-261.

[20] Hallegraeff GM (1995): Harmful algal blooms: a global overview. Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD (eds.), Manual on Harmful Marine Microalgae, IOC-UNESCO, Paris, 1-24.

[21] Pereira P, Onodera H, Andrinolo D, Franca S, Araújo F, Lagos N, Oshima Y (2000): Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon 38, 1689-1702.

[22] Carmichael WW, Evans WR, Yin QQ, Bell P, Moczydlowski E (1997): Evidence for paralytic shellfish poisons in the freshwater cyanobacterium Lyngbya wollei (Farlow ex gomont) comb. Nov. Appl. Environ. Microbiol. 63, 3104-3110.

[23] Onodera H, Oshima Y, Watanabe MF, Watanabe M, Bolch CJ, Blackburn S, Yasumoto T (1996): Screening of paralytic shellfish toxins in freshwater cyanobacteria and chemical confirmation of the toxins in cultured Anabaena circinalis from Australia. Yasumoto T, Oshima Y, Fukuyo Y (eds.), Harmful and Toxic Algal Blooms, IOC/UNESCO, Paris, 563-566.

[24] Humpage AR, Rositano J, Bretag AH, Brown R, Baker PD, Nicholson BC, Steffensen DA (1994): Paralytic shellfish poisons from Australian cyanobacterial blooms. Aust. J. Mar. Freshwater Res. 45, 761-771.

[25] Van Dolah FM (2000): Diversity of marine and freshwater algal toxins. Botana LM (ed.), Seafood and Freshwater Toxins: Pharmacology, Physiology, and Detection, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 19-43.

[26] Anderson DM, Kulis DM, Sullivan JJ, Hall S (1990): Toxin composition variations in one isolate of the dinoflagellate Alexandrium fundyense. Toxicon 28, 885-893.

[27] Taroncher-Oldenburg G, Kulis DM, Anderson DM (1997): Toxin variability during the cell cycle of the dinoflagellate Alexandrium fundyense. Limnol. Oceanogr. 42, 1178-1188.

[28] Hwang DF, Lu YH (2000): Influence of environmental and nutritional factors on growth, toxicity, and toxin profile of dinoflagellate Alexandrium minutum. Toxicon 38, 1491-1503.


[29] Ichimi K, Suzuki T, Ito A (2002): Variety of PSP toxin profiles in various culture strains of Alexandrium tamarense and change of toxin profile in natural A. tamarense population. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 273, 51-60.

[30] Kodama M (2000): Ecobiology, classification, and origin. Botana LM (ed.), Seafood and Freshwater Toxins: Pharmacology, Physiology, and Detektion, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 125-149.

[31] Doucette GJ (1995): Interactions between bacteria and harmful algae: a review. Nat. Toxins 3, 65-74.

[32] Kodama M, Sakamoto S, Koike K (1996): Symbiosis of bacteria in Alexandrium tamarense. Yasumoto T, Oshima Y, Fukuyo Y (eds.), Harmful and Toxic Algal Blooms, IOC/UNESCO, Paris, 351-354.

[33] Gallacher S, Flynn KJ, Franco JM, Bruggemann EE, Hines HB (1997): Evidence for production of paralytic shellfish toxins by bacteria associated with Alexandrium spp. (Dinophyta) in culture. Appl. Environ. Microbiol. 63, 239-245.

[34] Ogata T, Kodama M, Komaru K, Sakamoto S, Sato S, Simidu U (1990): Production of paralytic shellfish toxins by bacteria isolated from toxic dinoflagellates. Graneli E, Sundstrom B, Edler L, Anderson DM (eds.), Toxic Marine Phytoplankton, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 311-315.

[35] Shimizu Y, Giorgio C, Koerting-Walker C, Ogata T (1996): Nonconformity of bacterial production of paralytic shellfish poisons - neosaxitoxin production by a bacterium strain from Alexandrium tamarense Ipswich strain and its significance. Yasumoto T, Oshima Y, Fukuyo Y (eds.), Harmful and Toxic Algal Blooms, IOC/UNESCO, Paris, 359-362.

[36] Abschlußkolloquium TEPS (Entstehung von Toxizität und Ausbreitung toxischer Euka-ryoten/Prokaryoten-Systeme (BMBF-No. 02 WT 9601/3) 1996-2000.

[37] Simon N, Biegala IC, Smith EA, Vanlot D (2002): Kinetics of attachment of potentially toxic bacteria to Alexandrium tamarense. Aquatic Microbiol. Ecology 28, 249-256.

[38] Kim CH, Sako Y, Ishida Y (1993): Variation of toxin production and composition in axenic cultures of Alexandrium catenella and A. tamarense. Nippon Suisan Gakkaishi 59, 633-639.

[39] Toxic algae species: http://www.redtide.whoi.edu/hab/species/alexandrium_images.html, unterstützt von National Office for Marine Biotoxins and Harmful Algal Blooms, Woods Hole Oceanographic Institution, Zugriff am 10.08.2002.

[40] Baker P, Fabbro L: Photomicrographs of Toxic Microalgae and Harmful Cyanobacteria in Australia. Fukuyo Y (ed.), 07.-11.02.2000, Hobart.

[41] Gainey LF, Shumway SE (1988): A compendium of the responses of bivalve molluscs to toxic dinoflagellates. J. Shellfish Res. 7, 623-628.

[42] Bricelj VM, Shumway SE (1998): Paralytic shellfish toxins in bivalve molluscs: occurrence, transfer kinetics and biotransformation. Critical Reviews in Fisheries Science 6, 315-383.

http://www.redtide.whoi.edu/hab/species/alexandrium_images.html,


[43] Llewellyn LE (1997): Hemolymph protein in xanthid crabs: its selective binding of saxitoxin and possible role in toxin bioaccumulation. Mar. Biol. (Berlin) 128, 599-606.

[44] Price RJ, Lee JS (1971): Interaction between paralytic shellfish poison and melanin obtained from butter clam (Saxidomus giganteus) and synthetic melanin. J. Fish. Res. Board Can. 28, 1789-1792.

[45] Mahar J, Luckas GL, Li Y, Hall S, Moczydlowski E (1991): Pharmacological and biochemical properties of saxiphilin, a saxitoxin binding protein from the bullfrog. Toxicon 29, 53-71.

[46] Shumway SE, Cembella AD (1993): The impact of toxic algae on scallop culture and fisheries. Rev. Fisheries Science 1, 121-150.

[47] Bricelj VM, Shumway SE (1998): An overview of the kinetics of PSP toxin transfer in bivalve molluscs. Reguera B, Blanco J, Fernandez ML, Wyatt T (eds.), Harmful Algae, Xunta de Galicia and IOC/UNESCO, Vigo, 431-436.

[48] Castonguay M, Levasseur M, Beaulieu JL, Gregoire F, Michaud S, Bonneau E, Bates SS (1997): Accumulation of PSP toxins in Atlantic mackerel: seasonal and ontogenetic variations. J. Fish. Biol. 50, 1203-1213.

[49] Kotaki Y, Oshima Y, Yasumoto T (1981): Analysis of paralytic shellfish toxins of marine snails. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 47, 943-946.

[50] Schantz EJ, Mold JD, Stanger DW, Shavel J, Riel FJ, Bowden JP, Lynch JM, Wyler RS, Riegel B, Sommer H (1957): Paralytic shellfish poison. VI. A procedure for the isolation and purification of the poison from toxic clam and mussel tissue. J. Am. Chem. Soc 79, 5230-5235.

[51] Mold JD, Bowden JP, Stanger DW, Maurer JE, Lynch JM, Wyler RS, Schantz EJ, Riegel B (1957): Paralytic shellfish poison. VII. Evidence for the purity of the poison from toxic clams and mussels. J. Am. Chem. Soc 79, 5235-5238.

[52] Schantz EJ, Ghazarossian VE, Schnoes HK, Strong FM (1975): The Structure of Saxitoxin. J. Am. Chem. Soc. 97, 1238-1239.

[53] Bordner J, Thiessen WE, Bates HA, Rapoport H (1975): The Structure of a Crystalline Derivative of Saxitoxin. J. Am. Chem. Soc. 97, 6008-6012.

[54] Tanino H, Nakata T, Kaneko T, Kishi Y (1977): A stereospecific synthesis of d,l-saxitoxin. J. Am. Chem. Soc. 99, 2818-2819.

[55] Shimizu Y (2000): Chemistry and mechanism of action. Botana LM (ed.), Seafood and Freshwater Toxins: Pharmacology, Physiology, and Detektion, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 151-172.

[56] Plumley FG (2001): Purification of an enzyme involved in saxitoxin synthesis. J. Phycol. 37, 926-928.

[57] Shimizu Y, Gupta S, Prasad A (1990): Biosynthesis of dinoflagellate toxins. Graneli E, Sunstrom B, Edler L, Anderson DA (eds.), Toxic Marine Phytoplankton, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 62-71.


[58] Hall S, Strichartz GR, Moczydlowski E, Ravindran A, Reichardt PB (1990): The saxitoxins: sources, chemistry, and pharmacology. Hall S, Strichartz GR (eds.), Marine Toxins, American Chemical Society, Washington, D.C., 29-65.

[59] Schantz EJ (1986): Chemistry and biology of saxitoxin and related toxins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 47, 15-23.

[60] Rogers RS, Rapoport H (1980): The pKa's of saxitoxin. J. Am. Chem. Soc. 102, 7335-7339.

[61] Ghazarossian VE, Schantz EJ, Schnoes HK, Strong FM (1976): A biologically active acid hydrolysis product of saxitoxin. Biochem. Biophys. Res. Comm. 68, 776-780.

[62] Hall S, Reichardt PB (1984): Cryptic paralytic shellfish toxins. Ragelis EP (ed.), Seafood Toxins, American Chemical Society, Washington D.C., 113-123.

[63] Oshima Y, Blackburn SI, Hallegraeff GM (1993): Comparative study on paralytic shellfish toxin profiles of the dinoflagellate Gymnodinium catenatum from three different countries. Mar. Biol. 116, 471-476.

[64] Yang LC, Kao Y, Oshima Y (1992): Actions of decarbamoyloxysaxitoxin and decarbamoyloxyneosaxitoxin on the frog skeletal muscle fiber. Toxicon 30, 645-652.

[65] Oshima Y (1995): Chemical and enzymatic transformation of paralytic shellfish toxins in marine organisms. Lassus P, Arzul G, Erard E, Gentien P, Marcaillou C (eds.), Harmful Marine Algal Blooms, Lavoisier Intercept Ltd., Paris, 475-480.

[66] Oshima Y (1991): Fate of paralytic shellfish toxins during accumulation and depuration by shellfish. Fremy JM (ed.), Proceedings of Symposium on Marine Biotoxins, CNEVA, Paris, 11.

[67] WHO (1984): Aquatic (Marine and Freshwater) Biotoxins. Enviromental Health Criteria 37, World Health Organization, Genf.

[68] Lagos NW, Andrinolo D (2000): Paralytic shellfish poisoning (PSP): toxicology and kinetics. Botana LM (ed.), Seafood and Freshwater Toxins: Pharmacology, Physiology, and Detection, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 203-215.

[69] Shimizu Y (1986): Biosynthesis and biotransformation of marine invertebrate toxins. Harris JB (ed.), Natural Toxins: Animal, Plant, and Microbial, Clarendon Press, Oxford, New York, 115-125.

[70] McFarren EF, Schafer ML, Campbell JE, Lewis KH, Jensen ET, Schantz EJ (1960): Public health significance of paralytic shellfish poison. Advanc. Food Res. 10, 135-179.

[71] Evans M (1974): Saxitoxin and related poisons: their actions on man and other animals. Locicero VR (ed.), Proceedings on 1st International Conference on Toxic Dinoflagellates, Massachusetts Science and Technology Fundation, Wakefield, MA, 337-345.

[72] Narahashi T (1989): Cellular mechanisms of action of paralytic shellfish poisons. Natori S, Hashimoto K, Ueno Y (eds.), Mycotoxins and Phycotoxins ´88, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 425-436.


[73] Marban E, Yamagishi T, Tomaselli GF (1998): Structure and function of voltage-gated sodium channels. J. Physiol. (London) 508, 647-657.

[74] Shimizu Y (1985): Recent progress in marine toxin research. Pure Appl. Chem. 54, 1973-1980.

[75] Shimizu Y, Kobayashi M, Genenah A, Oshima Y (1984): Isolation of side-chain sulfated saxitoxin analogs. Their significance in interpretation of the mechanism of action. Tetrahedron 50, 26-29.

[76] Strichartz GR, Hall S, Magnani B, Hong CY, Kishi Y, Debin JA (1995): The potencies of synthetic analogues of saxitoxin and the absolute stereoselectivity of decarbamoyl saxitoxin. Toxicon 33, 723-737.

[77] Strichartz G (1984): Structural determinants of the affinity of saxitoxin for neuronal sodium channels. J. Gen. Physiol. 84, 281-305.

[78] Hummert C (2000): personal communication.

[79] Sullivan JJ, Wekell MM, Kentala LL (1985): Application of HPLC for the determination of PSP toxins in shellfish. J. Food Sci 50, 26-29.

[80] Shumway SE, van Egmond HP, Hurst JW, Bean LL (1995): Managment of shellfish resources. Hallegraeff GM, Anderson DM, Cembella AD (eds.), Manual on Harmful Marine Microalgae, IOC/UNESCO, Paris, 433-453.

[81] Van Egmond HP, Speyers GJA, van den Top HJ (1992): Current situation on worldwide regulations for marine phycotoxins. J. Nat. Toxins 1, 67-85.

[82] Van Egmond HP, Aune T, Lassus P, Speijers GJA, Waldock M (1993): Paralytic and diarrhetic shellfish poison: occurence in Europe, toxicity, analysis and regulation. J. Nat. Toxins 2, 41-83.

[83] Lindahl O (1998): Occurrence and monitoring of harmful algae in the marine environment. Miraglia M, van Egmond H, Brera C, Gilbert J (eds.), Mycotoxins and Phycotoxins - Developments in Chemistry, Toxiciology, and Food Safety, Alaken, Fort Collins, 409-424.

[84] Luckas B, Thielert G, Peters K (1990): Zur Problematik der selektiven Erfasssung von PSP-Toxinen aus Muscheln. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 190, 491-495.

[85] Luckas B (1991): The occurrence of decarbamoylsaxitoxin in canned mussels. Bernoth EM (ed.), Public Health Aspects of Seafood-Borne Zoonotic Diseases, Institut für Vete-rinärmedizin des Bundesgesundheitsamtes, VetMed-Hefte 1, Hannover, 1-8.

[86] Verordnung über gesundheitliche Anforderungen an Fische und Schalentiere (Fisch-Verordnung) v. 08.08.1988. Bundesrepublik Deutschland Bundesgesetzblatt I; 1570.

[87] Verordnung über die hygienischen Anforderungen an Fischereierzeugnisse und lebende Muscheln (FischHV) v. 31.03.1994. Bundesrepublik Deutschland Bundesgesetzblatt I; 737.


[88] Bundesgesundheitsamt (1989): Bestimmung des Gehaltes an Algentoxinen in Muschel-tieren und Muscheltiererzeugnissen. Fluorimetrische Verfahren. Untersuchung von Lebensmitteln. Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG, L. 12.03/04-1.

[89] Sommer H, Meyer KF (1937): Paralytic shellfish poisoning. Arch. Pathol. 24, 560-598.

[90] Hollingworth T, Wekell MM (1990): 35. Fish and Other Marine Products. 959.08 Paralytic Shellfish Poison. Biological Method, Final Action. Hellrich K (ed.), Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, 881-882.

[91] Schulze K, Zimmermann T (1986): Zum Nachweis von Saxitoxin im Bioassay. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 99, 1-3.

[92] Park DL, Adams WN, Graham SL, Jackson RC (1986): Variability of mouse bioassay for determination of paralytic shellfish poisoning toxins. J. AOAC Int. 69, 547-550.

[93] Hellwig E, Petuely F (1980): Determination of saxitoxin in canned shellfish. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 171, 165-169.

[94] Suarez-Isla BA, Velez P (2000): Biological detection methods. Botana LM (ed.), Seafood and Freshwater Toxins: Pharmacology, Physiology, and Detection, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 187-202.

[95] Kogure K, Tamplin ML, Simidu U, Colwell RR (1988): A tissue culture assay for tetrodotoxin, saxitoxin and related toxins. Toxicon 26 , 191-197.

[96] Jellett JF, Stewart JE, Laycock MV (1995): Toxicological evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin II, gonyautoxin II plus III and decarbamoylsaxitoxin with the mouse neuroblastoma cell bioassay. Toxicol. in Vitro 9, 57-65.

[97] Powell CL, Doucette GJ (1999): A receptor binding assay for paralytic shellfish poisoning toxins: recent advances and applications. Nat. Toxins 7, 393-400.

[98] Velez P, Suarez-Isla BA, Sierralta J, Fonseca M, Loyola H, Johns DC, Tomaselli GF, Marban E (1999): Electrophysiological assay to quantify saxitoxins in contaminated shellfish. Biophys. J. 76, A82.

[99] Chu FS, Fan TSL (1985): Indirect enzyme-linked immunosorbent assay for saxitoxin in shellfish. J. AOAC Int. 68, 13-16.

[100] Chu FS, Hsu KH, Huang X, Barrett R, Allison C (1996): Screening of paralytic shellfish poisoning toxins in naturally occurring samples with three different direct competitive enzyme-linked immunosorbent assays. J. Agric. Food Chem. 44, 4043-4047.

[101] Usleber E, Dietrich R, Bürk C, Schneider E, Märtlbauer E (2001): Immunoassay methods for paralytic shellfish poisoning toxins. J. AOAC Int. 84, 1649-1659.

[102] Yang GC, Imagire SJ, Yasaei P, Ragelis EP, Park DL, Page SW, Carlson RE, Guire PE (1987): Radioimmunoassay of paralytic shellfish toxins in clams and mussels. Bull. Environ. Contam. Toxicol 39, 264-271.


[103] Cembella A, Parent Y, Jones D, Lamoureux G (1990): Specificity and cross-reactivity of an absorption-inhibition enzyme-linked immunoassay for the detection of paralytic shellfish toxins. Graneli E, Sundstrom B, Edler L, Anderson DM (eds.), Toxic Marine Phytoplankton, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 339-344.

[104] Burdaspal PA (1996): Bioassay and chemical methods for analysis of paralytic shellfish poisoning toxins. Gilbert J (ed.), Progress in Food Comtaminant Analysis, Blackie, London, 219-253.

[105] Bates HA, Rapoport H (1975): Chemical assay for saxitoxin, the paralytic shellfish poison. J. Agric. Food Chem. 23, 237-239.

[106] Bates HA, Kostriken R, Rapoport H (1978): A chemical assay for saxitoxin. Improvements and modifications. J. Agric. Food Chem. 26, 252-254.

[107] Lawrence JF, Menard C, Charbonneau CF, Hall S (1991): A study of ten toxins associated with paralytic shellfish poisoning using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection. J. AOAC Int. 74, 404-409.

[108] Sullivan JJ (1982): Paralytic Shellfish Poison. Ph.D. Thesis. University of Washington, Seattle.

[109] Botana LM, Rodruiguez-Vieytes M, Alsonso A, Louzao MC (1996): Phycotoxins: paralytic shellfish poisoning and diarrhetic shellfish poisoning. Food Sci. Technology 77, 1147-1169.

[110] Böcker J (1997): Chromatographie: instrumentelle Analytik mit Chromatographie und Kapillarelektrophorese. Vogel, Würzburg.

[111] Sciacchitano CJ, Mopper B (1993): Analysis of paralytic shellfish toxin (saxitoxin) in mollusks by capillary zone electrophoresis. J. Liq. Chromatogr. 16, 2081-2088.

[112] Thibault P, Pleasance S, Laycock MV (1991): Analysis of paralytic shellfish poisons by capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A 542, 483-501.

[113] Buzy A, Thibault P, Laycock MV (1994): Development of a capillary electrophoresis method for the characterization of enzymatic products arising from the carbamoylase digestion of paralytic shellfish poisoning toxins. J. Chromatogr. A 688, 301-316.

[114] Kok SJ, Velthorst NH, Gooijer C, Brinkman UAT (1998): Analyte identification in capillary electrophoretic separation techniques. Electrophoresis 19, 2753-2776.

[115] Pleasance S, Ayer SW, Laycock MV, Thibault P (1992): Ionspray mass spectrometry of marine toxins. III. Analysis of paralytic shellfish poisoning toxins by flow injection analysis, liquid chromatography/mass spectrometry and capillary electrophoresis/mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 6, 14-24.

[116] Pleasance S, Thibault P, Kelly J (1992): Comparison of liquid-junction and coaxial interfaces for capillary electrophoresis-mass spectrometry with application to compounds of concern to the aquaculture industry. J. Chromatogr. A 591, 325-339.


[117] Pineiro N, Leao JM, Martinez AG, Vazquez JAR (1999): Capillary electrophoresis with diode array detection as an alternative analytical method for paralytic and amnesic shellfish toxins. J. Chromatogr. A 847, 223-232.

[118] Bouaicha N, Hennion MC, Sandra P (1997): Determination of aquatic phytotoxins by capillary electrophoresis. C. R. Seances Soc. Biol. Ses Fil. 191, 313-327.

[119] Luckas B (2000): Chemical analysis of PSP toxins. Botana LM (ed.), Seafood and Freshwater toxins: Pharmacology, Physiology, and Detection, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, 173-186.

[120] Locke SJ, Thibault P (1994): Improvement in detection limits for the determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish tissues using capillary electrophoresis/ electrospray mass spectrometry and discontinuous buffer systems. Anal. Chem. 66, 3436-3446.

[121] Franca S, Alvito P, Sousa I, Gago A, Rodriguez-Vazquez JA, Leao JM, Comesana M, Thibault P, Burdaspal P, Bustos J, Legarda T (1996): The toxin profile of some PSP toxin producing dinoflagellates occurring in Portuguese coastal waters as determined by alternative analytical methods. Yasumoto T, Oshima Y, Fukuyo Y (eds.), Harmful and Toxic Algal Blooms, IOC/UNESCO, Paris, 519-522.

[122] Sullivan JJ, Wekell MM (1987): The application of HPLC in a paralytic shellfish poisoning monitoring program. Kramer DE, Liston J (eds.), Seafood Quality Determination, Anchorage, AK, 357-371.

[123] Lawrence JF, Menard C (1991): Liquid chromatographic determination of paralytic shellfish poisons in shellfish after pre-chromatographic oxidation. J. AOAC Int. 74, 1006-1012.

[124] Lawrence JF, Niedzwiadek B (2001): Quantitative determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish by using prechromatographic oxidation and liquid chromato-graphy with fluorescence detection. J. AOAC Int. 84, 1649-1659.

[125] Oshima Y, Sugino K, Yasumoto T (1989): Latest advances in HPLC analysis of paralytic shellfish toxins. Natori S, Hashimoto K, Ueno Y (eds.), Mycotoxins and Phycotoxins '88, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 319-326.

[126] Oshima Y (1995): Postcolumn derivatization liquid chromatographic method for paralytic shellfish toxins. J. AOAC Int. 78, 528-532.

[127] G. Thielert (1993): Entwicklung und Anwendung chromatographischer Methoden zur Untersuchung von Algen und Muscheln auf PSP-Toxine. Dissertation. Universität Hohenheim, Stuttgart.

[128] Oshima Y, Itakura H, Lee KC, Yasumoto T, Blackburn S, Hallegraeff G (1993): Toxin production by the dinoflagellate Gymnodinium catenatum. Dev. Mar. Biol. 3, 907-912.

[129] Oshima Y, Machida M, Sasaki K, Tamaoki Y, Yasumoto T (1984): Liquid chromato-graphic-fluorometric analysis of paralytic shellfish toxins. Agric. Biol. Chem 48, 1707-1711.


[130] Ikawa M, Wegener K, Foxall TL, Sasner JJ, Noguchi T, Hashimoto K (1982): Use of a strong cation exchange resin column for the study of paralytic shellfish poisons. J. Agric. Food Chem 30, 526-528.

[131] Kirschbaum J, Hummert C, Luckas B (1995): Determination of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins by application of ion-exchange HPLC, electrochemical oxidation, and mass detection. Lassus P, Arzul G, Erard E, Gentien P, Marcaillou C (eds.), Harmful Marine Algal Blooms, Lavoisier Intercept Ltd, Paris, 309-314.

[132] Quilliam MA, Janecek M, Lawrence JF (1993): Characterization of the oxidation products of paralytic shellfish poisoning toxins by liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 7, 482-487.

[133] Schleich W, Engelhardt H (1988): Nachsäulenderivatisierung. Post-column reaction detection. GIT-Fachz. Lab. 4, 401-405.

[134] Lawrence JF, Wong B (1995): Evaluation of a postcolumn electrochemical reactor for oxidation of paralytic shellfish poison toxins. J. AOAC Int. 78, 698-704.

[135] Boyer GL, Goddard GD (1999): High performance liquid chromatography coupled with post-column electrochemical oxidation for the detection of PSP toxins. Nat. Toxins 7, 353-359.

[136] Herderich M, Schreier P (1996): HPLC-MS/MS in der Naturstoff- und Lebensmittel-analytik. GIT-Fachz. Lab. 9, 841-845.

[137] Niessen WMA, Tinke AP (1995): Liquid chromatography-mass spectrometry: general principles and instrumentation. J. Chromatogr. A 703, 37-57.

[138] Maruyama J, Noguchi T, Matsunaga S, Hashimoto K (1984): Fast-atom-bombardment and secondary-ion mass spectrometry of paralytic shellfish poisons and tetrodotoxin. Agric. Biol. Chem 48, 2783-2788.

[139] White KD, Sphon JA, Hall S (1986): Fast atom bombardment mass spectrometry of twelve marine toxins isolated from Protogonyaulax. Anal. Chem 58, 562-565.

[140] Mirocha CJ, Cheong W, Mirza U, Kim YB (1992): Analysis of saxitoxin in urine by continuous-flow fast-atom bombardment mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 6, 128-134.

[141] Lehmann WD (1996): Massenspektrometrie in der Biochemie. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

[142] Bruins AP (1994): Atmospheric-pressure-ionization mass spectrometry. II. Applications in pharmacy, biochemistry and general chemistry. Trends in Anal. Chem. 13, 81-90.

[143] Bruins AP (1994): Atmosheric-pressure-ionization mass spectromerty. I. Instrumentation and ionization techniques. Trends in Anal. Chem. 13, 37-43.

[144] Quilliam MA (1996): LC-MS of seafood toxins. Harada K, Oka H (eds.), LC/MS no Jissai, Kodansha, Tokyo, 169-193.


[145] Poon GK, Griggs LJ (1993): Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry of cyanobacterial toxins. J. Chromatogr. A 628, 215-233.

[146] Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF (1990): Electrospray ionization-principles and practice. Mass Spectrom. Rev. 9, 37-70.

[147] Quilliam MA, Thomson BA, Scott GJ, Siu KWM (1989): Ion-spray mass spectrometry of marine neurotoxins. Rapid Commun. Mass Spectrom. 3, 145-150.

[148] Onodera H, Satake M, Oshima Y, Yasumoto T, Carmichael WW (1997): New saxitoxin analogues from the freshwater filamentous cyanobacterium Lyngbya wollei. Nat. Toxins 5, 146-151.

[149] Ciminiello P, Fattorusso E, Forino M, Montresor M (2000): Saxitoxin and neosaxitoxin as toxic principles of Alexandrium andersoni (Dinophyceae) from the Gulf of Naples, Italy. Toxicon 38, 1871-1877.

[150] Nagashima Y, Arakawa O, Shiomi K, Noguchi T (1995): Paralytic shellfish poisons of ormer, Haliotis tuberculata, from Spain. J. Food. Hyg. Soc. Japan 36, 627-631.

[151] Quilliam MA (1996): Liquid chromatography-mass spectrometry of seafood toxins. Barcelo D (ed.), Applications of LC-MS in Environmental Chemistry, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 415-444.

[152] Hummert C (1995): Der Einsatz chromatographischer Methoden mit selektiver Detektion zur Erfassung von Phycotoxinen aus Algen und Muscheln. Dissertation. Friedrich-Schiller-Universität Jena, Jena.

[153] Yu RC, Hummert C, Luckas B, Qian PY, Li J, Zhou MJ (1998): A modified HPLC method for analysis of PSP toxins in algae and shellfish from China. Chromatographia 48, 671-676.

[154] Talib H, Vale P, Jaime E, Blaghen M (2001): Study of paralytic shellfish poisoning toxin profile in shellfish from the Mediterranean shore of Morocco. Toxicon 39, 1855-1861.

[155] Sullivan JJ, Iwaoka WT, Liston J (1983): Enzymatic transformation of PSP toxins in the littleneck clam (Protothaca staminea). Biochem. Biophys. Res. Commun. 114, 465-472.

[156] Hummert C, Ritscher M, Reinhardt K, Luckas B (1997): Analysis of the characteristic PSP profiles of Pyrodinium bahamense and several strains of Alexandrium by HPLC based on ion-pair separation, post-column oxidation, and fluorescence detection. Chromatographia 45, 312-316.

[157] Louzao MC, Alfonso A, Botana AM, Goenaga X, Cabado AG, Vieytes MR, Botana LM (1994): Effect of lyophilization on the stability of gonyautoxins obtained from contaminated mussels. Toxicon 32, 807-817.

[158] Heeremans CEM, van der Hoeven AM, Niessen WMA, Tjaden UR, van der Greef J (1989): Acetic acid cluster ions for tuning and calibration in thermospray liquid chromatography/mass spectrometry. Organic Mass Spectrometry 24, 109-112.

[159] Fishery statistical databases, FISHSTAT+: http://www.fao.org/fi/statist/statist.asp, unter-stützt von FAO, Zugriff am 10.08.2002.

http://www.fao.org/fi/statist/statist.asp,


[160] Willmann R (1989): Naturführer Muscheln und Schnecken der Nord- und Ostsee. Verlag J. Neumann, Neudamm.

[161] DeSousa E, Silva E (1963): Les "red waters" a la Lagune D´Obidos. Ses causes probables et ses rapports avec la toxicite des bilvalves. Proc. 4th. Int. Seaweed Symp., Pergamon Press, New York, 265-275.

[162] Guillard RRL (1975): Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Smith WL, Chanley MH (eds.), Culture of Marine Invertebrate Animals, Plenum Press, New York, 26-60.

[163] Bricelj VM, Lee JH, Cembella AD, Anderson DM (1990): Uptake kinetics of paralytic shellfish toxins from the dinoflagellate Alexandrium fundyense in the mussel Mytilus edulis. Mar. Ecol. Prog. Ser. 63, 177-188.

[164] Shumway SE, Cucci TL (1987): The effects of the toxic dinoflagellate Protogonyaulax tamarensis on the feeding and behaviour of bivalve molluscs. Aquat. Toxicol. 10, 9-27.

[165] Wildish D, Lassus P, Martin J, Saulnier A, Bardouil M (1998): Effect of the PSP-causing dinoflagellate, Alexandrium sp., on the initial feeding response of Crassostrea gigas. Aquat. Living Resources 11, 35-43.

[166] Shumway SE, Barter J, Sherman-Caswell S (1990): Auditing the impact of toxic algal blooms on oysters. Environ. Auditor 2, 41-56.

[167] Oshima Y, Kodama M, Ogata T, Fukuyo Y, Matsuura F (1982): Features of paralytic shellfish poison occurring in Tohoku District. Bull. Jap. Soc. Scient. Fish. 48, 525-530.

[168] Sribhibhadh A (1963): Seasonal variations of paralytic shellfish toxicity in the California mussel, Mytilus californianus Conrad, and the Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg), along the strait of Juan de Fuca and in Willapa Bay. Ph.D. Thesis. University of Washington, Washington.

[169] Shin IS, Choi SH, Lee TS, Lee HJ, Kim JH, Lee JS, Kim YM (1996): Change of toxin composition and specific toxicity in paralytic shellfish toxins of blue mussel, Mytilus edulis and, oyster, Crassostrea gigas from Woepori, Koje, Korea during canning process. J. Korean Fish. Soc. 29, 900-908.

[170] Hallegraeff GM, Stanley SO, Bolch CJ, Blackburn S (1989): Gymnodinium catenatum blooms and shellfish toxicity in Southern Tasmania, Australia. Okaichi T, Anderson DM, Nemoto T (eds.), Red Tides: Biology, Environmental Science, and Technology, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 77-80.

[171] Lassus P, Fremy JM, Ledoux M, Bardouil M, Bohec M (1989): Patterns of experimental contamination by Protogonyaulax tamarensis in some French commercial shellfish. Toxicon 27 , 1313-1321.

[172] Bravo I, Reyero MI, Cacho E, Franco JM (1999): Paralytic shellfish poisoning in Haliotis tuberculata from the Galician coast: geographical distribution, toxicity by lengths and parts of the mollusc. Aquat. Toxicol. 46, 79-85.


[173] Cembella AD, Shumway SE, Lewis NI (1993): Anatomical distribution and spatio-temporal variation in paralytic shellfish toxin composition in 2 bivalve species from the Gulf of Maine. J. Shellfish Res. 12, 389-403.

[174] Madenwald ND (1985): Effect of water temperature on the loss of paralytic shellfish poison from the butter clam, Saxidomus giganteus. Anderson DM, White AW, Baden DG (eds.), Toxic Dinoflagellates, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 479-485.

[175] Cembella AD, Shumway SE, Larocque R (1994): Sequestering and putative biotrans-formation of paralytic shellfish toxins by the sea scallop Placopecten magellanicus: seasonal and spatial scales in natural populations. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 180, 1-22.

[176] Shumway SE, Sherman SA, Cembella AD, Selvin R (1994): Accumulation of paralytic shellfish toxins by surfclams, Spisula solidissima (Dillwyn, 1897) in the Gulf of Maine: seasonal changes, distribution between tissues, and notes on feeding habits. Nat. Toxins 2, 236-251.

[177] Bricelj VM, Lee JH, Cembella AD (1991): Influence of dinoflagellate cell toxicity on uptake and loss of paralytic shellfish toxins in the northern quahog Mercenaria mercenaria. Mar. Ecol. Progr. Ser. 74, 33-46.

[178] Blanco J, Morono A, Franco J, Reyero MI (1997): PSP detoxification kinetics in the mussel Mytilus galloprovincialis. One- and two-compartment models and the effect of some environmental variables. Mar. Ecol. Prog. Ser. 158, 165-175.

[179] Lassus P, Ledoux M, Bardouil M, Bohec M, Erard E (1994): Kinetics of Alexandrium minutum Halim toxin accumulation in mussels and clams. Nat. Toxins 2, 329-333.

[180] Silvert WL, Cembella AD (1995): Dynamic modelling of phycotoxin kinetics in the blue mussel, Mytilus edulis, with implications for other marine invertebrates. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 52, 521-531.

[181] Chen CY, Chou HN (2001): Accumulation and depuration of paralytic shellfish poisoning toxins by purple clam Hiatula rostrata Lighttoot. Toxicon 39, 1029-1034.

[182] Sullivan JJ, Simon MG, Iwaoka WT (1983): Comparison of HPLC and mouse bioassay methods for determining PSP toxins in shellfish. J. Food Sci 48, 1312-1314.

[183] Bricelj VM, Lee JH, Cembella AD, Anderson DM (1990): Uptake of Alexandrium fundyense by Mytilus edulis and Mercenaria mercenaria under controlled conditions. Graneli E (ed.), Toxic Marine Phytoplankton, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 269-274.

[184] Martin JL, White AW, Sullivan JJ (1990): Anatomical distribution of paralytic shellfish toxins in soft-shell clams. Granelli E, Sundstrom B, Edler L, Anderson DM, Eds., Toxic Marine Phytoplankton (Proc. 4th Int. Conf. on Toxic Marine Phytoplankton), Lund, Sweden.

[185] Asakawa M, Miyazawa K, Takayama H, Noguchi T (1995): Dinoflagellate Alexandrium tamarense as the source of paralytic shellfish poison (PSP) contained in bivalves from Hiroshima Bay, Hiroshima Prefecture, Japan. Toxicon 33, 691-697.


[186] Beitler MK, Liston J (1990): Uptake and tissue distribution of PSP toxins in butter clams. Graneli E (ed.), Toxic Marine Phytoplankton, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 257-262.

[187] Oshima Y, Sugino K, Itakura H, Hirota M, Yasumoto T (1990): Comparative studies on paralytic shellfish toxin profile of dinoflagellates and bivalves. Graneli E (ed.), Toxic Marine Phytoplankton, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 391-396.

[188] White AW, Shumway SE, Nassif J, Whittaker DK (1993): Variation in levels of paralytic shellfish toxins among individual shellfish. Smayda TJ, Shimizu Y (eds.), Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 441-446.

[189] Takatani T, Akaeda H, Kaku T, Miyamoto M, Mukai H, Noguchi T (1998): Paralytic shellfish poison infestation to oyster Crassostrea gigas due to dinoflagellate Gymno-dinium catenatum in the Amakusa Islands, Kumamoto Prefecture. J. Food. Hyg. Soc. Japan 4, 292-295.

[190] Smith EA, Grant F, Ferguson CMJ, Gallacher S (2001): Biotransformation of paralytic shellfish toxins by bacteria isolated from bivalve molluscs. Appl. Environ. Microbiol. 67, 2345-2353.

[191] Sakamoto S, Sato S, Ogata T, Kodama M (2000): Formation of intermediate conjugates in the reductive transformation of gonyautoxins to saxitoxins by thiol compounds. Fisheries Science 66, 136-141.

[192] Bricelj VM, Cembella AD (1995): Fate of Gonyautoxins in surfclams, Spisula solidissima, grazing upon toxigenic Alexandrium. Lassus P, Arzul G, Erard E, Gentien P, Marcaillou C (eds.), Harmful Marine Algal Blooms, Lavoisier Intercept Ltd., Paris, 413-418.

[193] Nagashima Y, Arakawa O, Shiomi K, Noguchi T (1996): Paralytic Shellfish Toxins in a trumpet shell, Charonia lampas, from Spain. Yasumoto T, Oshima Y, Fukuyo Y, (eds.), Harmful and Toxic Algal Blooms, Sendai, Japan.

[194] Shimizu Y, Yoshioka M (1981): Transformation of paralytic shellfish toxins as demonstrated in scallop homogenates. Science 212, 547-549.

[195] Kotaki Y, Oshima Y, Yasumoto T (1985): Bacterial transformation of paralytic shellfish toxins. Anderson DM, White AW, Baden DG (eds.), Toxic Dinoflagellates, Elsevier Science Publishers B.V., New York, 287-292.

[196] Kotaki Y, Oshima Y, Yasumoto T (1985): Bacterial transformation of paralytic shellfish toxins in coral reef crabs and a marine snail. Nippon Suisan Gakkaishi 51, 1009-1013.

V Anhang 115

V ANHANG

1. Geräte und Materialien

Pumpe: Gradientenpumpe LC-10Atvp, Shimadzu, Deutschland

Autosampler: SIL-10A Autosampler, Shimadzu, Deutschland

Säulenofen: CTO-10AC Säulenofen, Shimadzu, Deutschland

Pumpen für die LC-6A Pumpe, Shimadzu, Deutschland Nachsäulenderivatisierung: LC-9A Pumpe, Shimadzu, Deutschland

Reaktionseinheit: CRX 400 Post-column Reactor, Pickering Laboratories, USA

Elektrochemisches ESA Colouchem Detektor 5100A als Potentiostat mit Oxidationssystem: Guard Zelle 5020, ESA, USA

Detektor: RF-10AxL Fluoreszenzdetektor, Shimadzu, Deutschland

Interface: SCL-10Avp System Controller, Shimadzu, Deutschland

Datenauswertung: Class-vp 5.3 Software, Shimadzu, Deutschland

LC-MS: PE Series 200 Gradientenpumpe mit PE Series 200 Autosampler, single quadrupole API 165 PE Sciex Mass Spectrometer, API/ESI Turbo Ionspray Interface, Perkin-Elmer, Deutschland

HPLC-Säulen: Source 15S PE 4.6/100 (Kationenaustauscher) Source 15Q PE 4.6/100 (Anionenaustauscher) Pharmacia Biotech, Schweden

Vakuumzentrifuge: Speedvac SPD121P, ThermoLifeSciences, Großbritannien

Mikroskop: Axiovert 135, Zeiss, Deutschland

2. PSP-Toxinstandards

STX, NEO, GTX1-4: National Research Council, Marine Analytical Chemistry inkl. dcGTX2/3 Standards Program (NRC-PSP-1B, NRC-PSP-1C)

dcSTX: Europäische Kommission (BCR, The Community Bureau of Reference, Brussels), Standard vom Ringversuch von 1995-1996

C-Toxine: Extrakt von Alexandrium fundyense (CCMP 1719), kultiviert von G. Gerdts, Helgoland, Deutschland Extrakt von Alexandrium sp. (BAH-ME 220), isoliert von M. Delgado, Vigo, Spanien

V Anhang 116

3. Chemikalien

Acetonitril: Art.No. 8142, J.T. Baker, Niederlande

Ammoniumacetat: Art.No. 169880010, Arcos Organics, Belgien

Ammoniumformiat: Art.No. 5093.1, Roth, Deutschland

Ammoniaklösung: 25%, Art.No. 1.05432.1011, Merck, Deutschland

Essigsäure: 100%, Art.No. 1.00063, Merck, Deutschland

Methanol: Art.No. 7342.1, Roth, Deutschland

Oktansulfonsäure: Na-Salz, Art.No. O-8380, Sigma-Aldrich, Deutschland

Perjodsäure: Art.No. 8.22288.0100, Merck-Schuchardt, Deutschland

Phosphorsäure: 85% (ortho), Art.No. 1.00573.1000

PBS-Puffer: Phosphate buffer salin (Phosphat gepuffert in NaCl-Puffer)

Salpetersäure 65%, Art.No. 1.00456.2500, Merck, Deutschland

Tetrahydrofuran: Art.No. 9441, J.T. Baker, Niederlande

Trifluoressigsäure: 99,8%, Art.No. 34957, Sigma-Aldrich, Deutschland

Wasser: HPLC-Qualität, gereinigt mit Millipore-Q RG Ultra Pure Water System, Millipore, USA

4. Allgemeine Probenaufarbeitung nach Hummert

Direkte Bestimmung der Carbamoyl- und Decarbamoyltoxine

- 0,5 bis 1,0 g homogenisierte Muschel (Ultra Turrax) bzw. 1 Algenfilter jeweils mit 1 mL

0,03 N CH3COOH versetzen, gut durchmischen

- Probe mit Ultraschall behandeln: 1 min Ultraschallstab oder 10 min Ultraschallbad

- Probe 15 min zentrifugieren (14000 rpm)

- Überstand filtrieren (0,22 µm Nylonfilter), fertig zur Injektion

Indirekte Bestimmung der N-Sulfocarbamoyltoxine

- 300 µL vom fertigen Essigsäureextrakt abnehmen und mit 74 µL 1 M HCl versetzen

(Reacti-Vial), gut durchmischen

- 15 min im Heizblock bei 90°C erhitzen, danach auf Raumtemperatur abkühlen lassen

- Extrakt mit 150 µL 1 M CH3COONa neutralisieren, fertig zur Injektion

V Anhang 117

5. Methodenvergleich (Kapitel 4.5.1)

Herkunft der Proben:

Proben-Nr. Spezies Herkunft

M1 Crassostrea gigas, HP Fütterungsversuch 6.Woche M2 Mytilus edulis, HP Fütterungsversuch 6.Woche M3 Mytilus edulis, HP Fütterungsversuch 2. Woche (Entgiftung) M4 Mytilus edulis, HP Fütterungsversuch 1. Woche M5 Cardium edule, Rest Fütterungsversuch 6.Woche M6 Cardium edule, HP Inkubationsversuch M7 Crassostrea gigas, HP Fütterungsversuch 2.Woche M8 Modiolus modiolus, MG Inkubationsversuch M9 Pecten maximus, HP schottische Ostküste M10 Pecten maximus, HP schottische Ostküste M11 Cardium edule, HP Fütterungsversuch 2. Woche (Entgiftung) M12 Pecten maximus, HP schottische Ostküste A1 Alexandrium fundyense (CCMP1719) Fütterungsversuch A2 Alexandrium lusitanicum (AL8T) Dr. A. Beran, Laboratorio di Biologia,

Trieste, Italien A3 Alexandrium lusitanicum (AL1V) Dr. A. Beran, Italien A4 Alexandrium lusitanicum (AL5T) Dr. A. Beran, Italien A5 Alexandrium lusitanicum (AL9T) Dr. A. Beran, Italien A6 Gymnodinium catenatum (M34Y) Dr. J. Guzman, CIBNOR, Mexiko A7 Alexandrium fundyense (CCMP1719) Inkubationsversuch

V Anhang 118

Tab. 17: Einzelergebnisse des Vergleichs zwischen der optimierten Thielert- und der neu entwickelten HPLC-Methode (in ng/µL Probenextrakt)

M1 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert

0.162 0.165 0.164

0.609 0.626 0.618

0.297 0.301 0.299

0.167 0.168 0.168

1.056 1.030 1.043

0.673 0.727 0.700

0.029 0.028 0.029

2.993 3.045 3.019

neu entw. Methode

0.154 0.158 0.156

0.605 0.622 0.614

0.332 0.307 0.320

0.194 0.159 0.177

1.043 1.099 1.071

0.908 0.931 0.920

0.024 0.025 0.025

3.260 3.301 3.280


0.092 0.096 0.094

0.477 0.477 0.477

0.213 0.213 0.213

0.096 0.097 0.097

1.026 0.987 1.007

0.888 0.736 0.812

0.060 0.057 0.059

2.852 2.663 2.758

neu entw. Methode

0.093 0.089 0.091

0.471 0.469 0.470

0.232 0.229 0.231

0.112 0.101 0.107

1.016 0.994 1.005

1.004 0.983 0.994

0.022 0.026 0.024

2.950 2.891 2.921


0.097 0.095 0.096

0.157 0.153 0.155

0.238 0.229 0.234

0.081 0.078 0.080

0.468 0.372 0.420

0.448 0.504 0.476

0.027 0.030 0.029

1.516 1.461 1.489

neu entw. Methode

0.090 0.089 0.090

0.137 0.132 0.135

0.252 0.306 0.279

0.098 0.103 0.101

0.423 0.413 0.418

0.479 0.449 0.464

0.034 0.029 0.032

1.513 1.521 1.517


0.019 0.019 0.019

0.101 0.100 0.101

0.049 0.046 0.048

0.038 0.037 0.038

0.174 0.157 0.166

0.461 0.426 0.444

0,008 0,010 0.009

0.850 0.795 0.823

neu entw. Methode

0.020 0.018 0.019

0.092 0.070 0.081

0.042 0.057 0.050

0.047 0.055 0.051

0.153 0.186 0.170

0.172 0.178 0.175

0,010 0,016 0.013

0.536 0.580 0.558


0.027 0.028 0.028

0.180 0.193 0.187

0.088 0.088 0.088

0.063 0.065 0.064

0.218 0.212 0.215

0.410 0.496 0.453

0,012 0,010

0.0011

0.998 1.092 1.045

neu entw. Methode

0.026 0.022 0.024

0.182 0.137 0.160

0.088 0.074 0.081

0.058 0.045 0.052

0.278 0.256 0.267

0.718 0.464 0.591

0,005 0,023 0.014

1.355 1.021 1.188


0.020 0.020 0.020

0.722 0.747 0.735

0.060 0.061 0.061

0.022 0.020 0.021

1.084 1.152 1.118

0.648 0.660 0.654

0.128 0.124 0.126

2.684 2.784 2.734

neu entw. Methode

0.018 0.018 0.018

0.734 0.854 0.794

0.070 0.074 0.073

0.025 0.025 0.025

1.323 1.497 1.410

n.n.q. 1.241 1.241

n.n.q. 0.160 0.160

2.170 3.869 3.020

V Anhang 119


0.050 0.051 0.051

0.119 0.102 0.111

0.053 0.052 0.053

0.051 0.050 0.051

0.165 0.151 0.158

0.136 0.125 0.131

0.010 0.010 0.010

0.584 0.541 0.563

neu entw. Methode

0.047 0.050 0.049

0.125 0.125 0.125

0.050 0.063 0.057

0.065 0.074 0.070

0.151 0.163 0.157

0.210 0.212 0.211

n.n.q. 0.011 0.011

0.648 0.698 0.673


0.016 0.016 0.016

0.805 0.806 0.806

0.048 0.044 0.046

0.010 0.011 0.011

1.329 1.323 1.326

0.548 0.536 0.542

0.284 0.286 0.285

3.040 3.022 3.031

neu entw. Methode

0.014 0.014 0.014

0.784 0.795 0.790

0.055 n.n.q. 0.055

0.013 0.009 0.011

1.477 1.388 1.433

0.513 0.575 0.544

n.n.q. 0.218 0.218

2.856 2.999 2.928


0.116 0.113 0.115

n.n.q.

0.125 0.122 0.124

0.071 0.072 0.072

0 0

0.000

0 0

0.000

0.013 0.009 0.011

0.325 0.316 0.321

neu entw. Methode

0.118 0.119 0.119

0 0

0.000

0.145 0.180 0.163

0.074 0.071 0.073

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0.337 0.370 0.354


0.148 0.146 0.147

n.n.q.

0.147 0.142 0.145

0.094 0.092 0.093

0.106 0.110 0.108

0.115 0.097 0.106

0.015 0.037 0.026

0.625 0.624 0.625

neu entw. Methode

0.147 0.163 0.155

n.n.q.

0.169 0.196 0.183

0.107 0.113 0.110

0.232 0.257 0.245

0.109 0.118 0.114

n.n.q.

0.764 0.847 0.806


0.019 0.020 0.020

0 0

0.000

0.055 0.056 0.056

0.031 0.031 0.031

0.079 n.n.q. 0.079

0.086 n.n.q. 0.086

0 0

0.000

0.270 0.107 0.189

neu entw. Methode

0.019 0.016 0.018

0 0

0.000

0.052 0.052 0.052

0.028 0.029 0.029

0.089 0.078 0.084

0.100 0.066 0.083

0 0

0.000

0.288 0.241 0.265


0.135 0.131 0.133

0.035 0.041 0.038

0.021 0.022 0.022

0.015 0.015 0.015

0.413 0.369 0.391

0.238 0.286 0.262

0.014 0.024 0.019

0.871 0.888 0.880

neu entw. Methode

0.226 0.224 0.225

0.079 0.081 0.080

0.023 0.011 0.017

0.010 0.021 0.016

0.289 0.344 0.317

n.n.q.

n.n.q.

0.627 0.681 0.654

A1 STX Neo GTX2 GTX3 GTX1 GTX4 dcGTX2/3 Gesamt mod. Thielert

0 0

0.000

0.227 0.226 0.227

0.005 0.006 0.006

0.026 0.024 0.025

0.090 0.092 0.091

0.615 0.582 0.599

0.016 0.017 0.017

0.979 0.947 0.963

V Anhang 120

neu entw. Methode

0 0

0.000

0.226 0.192 0.209

0.005 0.005 0.005

0.024 0.021 0.023

0.107 0.097 0.102

0.620 0.590 0.605

0.020 n.n.q. 0.020

1.002 0.905 0.954


0 0

0.000

0 0

0.000

0.232 0.230 0.231

0.087 0.083 0.085

0.096 0.079 0.088

0.072 0.079 0.076

0 0

0.000

0.487 0.471 0.479

neu entw. Methode

0 0

0.000

0 0

0.000

0.235 0.227 0.231

0.089 0.083 0.086

0.102 0.092 0.097

0.092 0.105 0.099

0 0

0.000

0.518 0.507 0.513


0 0

0.000

0 0

0.000

0.614 0.583 0.599

0.234 0.222 0.228

1.589 1.520 1.555

1.062 0.937 1.000

0.015 0.016 0.016

3.514 3.278 3.396

neu entw. Methode

0 0

0.000

0 0

0.000

0.605 0.586 0.596

0.258 0.248 0.253

1.591 1.530 1.561

1.090 1.049 1.070

0 0

0.000

3.544 3.413 3.479


0 0

0.000

0 0

0.000

0.239 0.228 0.234

0.084 0.081 0.083

0.077 n.n.q. 0.077

n.n.q.

0 0

0.000

0.400 0.309 0.355

neu entw. Methode

0 0

0.000

0 0

0.000

0.229 0.212 0.221

0.086 0.082 0.084

0.081 n.n.q. 0.081

n.n.q.

0 0

0.000

0.396 0.294 0.345


0 0

0.000

0 0

0.000

0.032 0.034 0.033

0.021 0.026 0.024

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0.053 0.060 0.057

neu entw. Methode

0 0

0.000

0 0

0.000

0.048 0.029 0.039

0.026 0.021 0.024

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0.074 0.050 0.062


0.013 0.016 0.015

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0.487 0.481 0.484

0.500 0.497 0.499

neu entw. Methode

0.014 0.013 0.014

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0 0

0.000

0.326 0.307 0.317

0.340 0.320 0.330


0.006 0.006 0.006

1.729 1.735 1.732

0.005 0.005 0.005

0.083 0.068 0.076

0.354 0.352 0.353

6.142 5.918 6.030

0.021 0.004 0.013

8.340 8.088 8.214

neu entw. Methode

0.009 0.002 0.006

1.653 1.648 1.651

0.006 0.009 0.008

0.076 0.073 0.075

0.387 0.334 0.361

6.990 6.650 6.775

0.003 0.005 0.004

9.124 8.721 8.923

n.n.q. = nachweisbar, nicht quantifizierbar

V Anhang 121

6. Fütterungsversuch (Kapitel 6.2)

Untersuchte Muschel- und Schneckenarten:

Trivialname Lateinischer Name Größe (MW ± SD) Gewicht (MW ± SD)

Miesmuschel Mytilus edulis (6,3 ± 0,3) cm (7,4 ± 0,9) g n = 42

Pazifische Auster Crassostrea gigas (9,2 ± 0,6) cm (6,0 ± 1,6) g n = 42

Herzmuschel Cardium edule (2,1 ± 0,2) cm (0,5 ± 0,2) g n = 39

Strandschnecke Littorina littorea (2,6 ± 0,3) cm (1,2 ± 0,4) g n = 39

Zellzahlbestimmung von der Alexandrium fundyense-Kultur:

- Kulturprobe (10 mL) mit 2 bis 3 Tropfen Lugol´scher Lösung fixieren

- 3 mL der fixierten Kulturprobe in Sedimentationskammern (Uthermöhl-Kammern)

pipettieren und mit einem Deckglas abdecken

- 2 Stunden absedimentieren lassen

- Zählung mit Hilfe eines Invers-Mikroskopes (Axiovert 135 von Zeiss) bei einer

Vergrößerung von 10^10

- Für statistische Auswertung müssen mindestens 50 Individuen gezählt werden, hierfür

gibt es zwei Methoden:

1. Bei geringer Individuenzahl wird der ganze Boden ausgezählt.

2. Bei hoher Individuenzahl werden lediglich 1- 4 Streifen ausgezählt bis die 50

Individuen gezählt wurden. Das Ergebnis wird dann auf 3 mL hochgerechnet.

PSP-Bestimmung von der Alexandrium fundyense-Kultur:

10 mL der Kulturprobe wurden auf Filterpapier (Membranfilter, Fa. Waterman) aufgebracht und

nach 4. aufgearbeitet.

V Anhang 122

Tab. 18: Gesamt-PSP-Gehalte und Gesamttoxizitäten der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* 6. Woche: Mittelwerte von n=5

Tab. 19: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Verdauungsgewebe der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* Mittelwerte

Tab. 20: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Reste der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* Mittelwerte

M. edulis C. gigas C. edule L. littoreaPSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq

1.Wo 67,026 34,095 64,256 37,791 171,045 109,403 36,161 29,9112.Wo 159,131 87,269 70,599 39,843 184,000 113,625 17,500 11,1213.Wo 70,000 46,581 91,243 62,767 308,077 171,731 61,987 51,2184.Wo 143,459 83,183 99,937 69,877 571,395 309,535 7,568 2,0545.Wo 127,910 70,966 102,430 62,772 636,066 333,529 73,190 59,5096.Wo* 263,363 147,488 140,208 77,369 1065,747 530,160 46,361 19,5312.Wo (E) 77,569 35,412 45,706 24,859 177,308 83,846 35,949 24,5574.Wo (E) 58,023 28,686 20,860 8,001 187,813 95,313 17,935 12,6096.Wo (E) 17,687 7,540 12,451 5,597 90,000 31,304 9,605 2,8958.Wo (E) 11,162 4,326 4,936 1,838





V Anhang 123

Tab. 21: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Kiemen der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* Mittelwerte

Tab. 22: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Mantelgewebe der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* Mittelwerte ** Messungen mit Fehlern behaftet, nicht genügend Probenmaterial für weitere Analysen vorhanden

Tab. 23: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Gonaden der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* Mittelwerte

M. edulis C. gigasPSP STXeq PSP STXeq

1.Wo 11,00 4,00 20,00 7,002.Wo 46,00 28,00 29,00 18,003.Wo 52,00 38,00 67,00 50,004.Wo 56,00 34,00 86,00 68,005.Wo 56,75 36,00 48,60 30,406.Wo* 109,00 61,40 68,40 37,202.Wo (E) 19,00 10,00 24,00 8,004.Wo (E) 23,00 8,00 11,00 2,006.Wo (E) 10,00 6,00 7,00 2,008.Wo (E) 5,00 2,00 4,00 1,00


1.Wo 20,00 13,00 31,00 18,002.Wo 47,00 27,00 24,00 15,003.Wo 45,00 29,00 51,00 38,004.Wo 52,00 28,00 60,00 41,005.Wo 49,25 27,75 57,60 34,406.Wo* 110,20 52,80 53,00 25,002.Wo (E) 23,00 10,00 24,00 8,004.Wo (E) 25,00 13,00 8,00 2,006.Wo (E) 7,00 2,00 6,00 1,008.Wo (E) ** ** 3,00 1,00



V Anhang 124

Tab. 24: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Adduktoren der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* Mittelwerte

Tab. 25: PSP-Gehalte und Toxizitäten der Fußgewebe der im Fütterungsversuch verwendeten Mollusken (in µg/100g Gewebe)

* Messungen der 8. Wo (E) mit Fehlern behaftet, nicht genügend Probenmaterial für weitere Analysen vorhanden ** Mittelwerte

Tab. 26: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Hepatopankreas von M. edulis (in Masse%)

* Mittelwerte



M. edulis * C. edule L. littoreaPSP STXeq PSP STXeq PSP STXeq

1.Wo 6,00 2,00 22,00 8,00 0,00 0,002.Wo 11,00 2,00 26,00 10,00 0,00 0,003.Wo 21,00 13,00 42,00 17,00 0,00 0,004.Wo 25,00 13,00 90,00 46,00 0,00 0,005.Wo 44,60 28,00 132,50 71,50 0,00 0,006.Wo** 56,40 26,20 219,25 63,75 0,00 0,002.Wo (E) 15,00 6,00 14,00 4,00 0,00 0,004.Wo (E) 12,00 3,00 32,00 5,00 0,00 0,006.Wo (E) 6,00 3,00 38,00 2,00 0,00 0,00

STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,85 10,76 2,54 4,17 6,88 27,41 2,92 6,37 14,47 22,632.Wo 1,60 10,88 1,82 3,68 9,44 29,99 3,52 4,33 16,64 18,103.Wo 2,57 16,87 3,35 0,74 8,14 35,62 3,93 4,01 11,33 13,444.Wo 2,95 8,56 0,45 1,04 23,02 20,11 6,25 5,14 16,03 16,455.Wo 3,47 10,28 0,62 1,02 21,83 20,91 5,21 4,66 14,45 17,556.Wo* 2,28 8,33 0,54 4,07 11,29 35,79 4,46 3,13 17,06 13,042.Wo (E) 4,78 9,32 1,36 3,74 15,79 10,64 11,68 4,95 27,63 10,114.Wo (E) 7,42 5,86 2,37 3,82 11,74 20,43 15,07 4,70 21,94 6,656.Wo (E) 9,15 13,55 6,93 1,96 5,47 6,28 15,15 4,48 28,77 8,268.Wo (E) 23,23 0 0 0 0 0 29,34 8,42 36,62 2,39

V Anhang 125

Tab. 27: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von M. edulis (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 28: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Kiemen von M. edulis (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 29: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Mantel von M. edulis (in Masse%)

* Mittelwerte

STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,40 11,70 0,00 0,79 13,70 24,74 2,16 6,80 10,59 28,122.Wo 0,86 8,56 0,00 3,00 18,22 32,49 1,60 4,54 8,28 22,453.Wo 1,14 5,47 0,00 0,84 32,47 32,33 1,67 2,93 9,46 13,694.Wo 1,35 6,42 0,27 3,92 18,03 31,84 2,79 3,34 14,83 17,215.Wo 1,66 12,32 1,73 0,28 20,00 31,23 1,92 2,43 10,78 17,656.Wo* 2,14 11,71 0,17 1,40 13,34 19,42 3,52 3,32 17,86 27,122.Wo (E) 7,71 18,67 4,58 2,15 0,00 0,00 15,15 8,16 33,56 10,024.Wo (E) 9,20 17,12 3,13 0,89 0,00 0,00 15,46 6,46 29,37 18,376.Wo (E) 11,46 15,26 3,69 1,42 0,00 0,00 17,10 7,42 29,74 13,918.Wo (E) 19,64 0,00 0,00 2,32 0,00 0,00 19,52 9,38 35,73 13,41

STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C21.Wo 1,82 8,84 0,00 0,00 21,19 31,40 2,96 4,90 7,79 21,102.Wo 0,15 1,91 0,00 1,82 31,18 24,53 1,22 4,68 10,64 23,873.Wo 0,38 11,19 0,00 0,58 14,82 39,27 1,27 2,75 11,84 17,904.Wo 0,84 9,79 0,00 0,00 16,15 23,54 2,92 6,14 14,16 26,465.Wo 1,51 16,94 0,31 2,15 13,25 25,16 1,05 2,46 13,33 23,846.Wo* 0,95 14,69 0,51 1,28 9,04 21,74 1,65 2,40 17,32 30,422.Wo (E) 4,84 25,45 5,79 0,00 0,00 0,00 8,14 5,67 23,95 26,164.Wo (E) 2,71 8,74 0,81 4,37 14,46 27,22 2,40 1,93 23,55 13,816.Wo (E) 15,66 0,00 3,92 4,19 0,00 0,00 19,44 8,53 33,99 14,27


V Anhang 126

Tab. 30: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Gonaden von M. edulis (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 31: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Adduktoren von M. edulis (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 32: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Fuß von M. edulis (in Masse%)

* Mittelwerte




V Anhang 127

Tab. 33: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Hepatopankreas von C. gigas (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 34: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von C. gigas (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 35: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Kiemen von C. gigas (in Masse%)

* Mittelwerte




V Anhang 128

Tab. 36: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Mantel von C. gigas (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 37: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine in den Gonaden von C. gigas (in Masse%)

* Mittelwerte Tab. 38: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Adduktor von C. gigas

(in Masse%)

* Mittelwerte




V Anhang 129

Tab. 39: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Hepatopankreas von C. edule (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 40: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von C. edule (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 41: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Fuß von C. edule (in Masse%)

* Mittelwerte




V Anhang 130

Tab. 42: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Verdauungsgewebe von L. littorea (in Masse%)

* Mittelwerte

Tab. 43: Prozentuale Anteile der einzelnen PSP-Toxine im Rest von L. littorea (in Masse%)

* Mittelwerte

7. Inkubationsversuch (Kapitel 6.3)

Gewinnung des konzentrierten Algenextraktes:

Die Kultivierung erfolgte im F/2 Medium in 4 x 10 L Glaskolben. Durch Zentrifugation wurden

die Algenzellen konzentriert und in 25 mL 0,03 N Essigsäure aufgenommen. Anschließend

wurden die Zellen auf Eis gekühlt mittels Ultraschall (Stab, 60 Watt, 1 min) aufgeschlossen und

der Extrakt bis zu seiner Verwendung bei –20°C tiefgefroren.



V Anhang 131

Verwendete Muschel- und Schneckenarten:

• Miesmuschel - Mytilus edulis • Pazifische Auster - Crassostrea gigas • Herzmuschel - Cardium edule • Wellhornschnecke - Buccinum undatum • Strandschnecke - Littorina littorea • Pferdemuschel - Modiolus modiolus • Trogmuschel - Mactra stultorum • Schwertmuschel - Ensis ensis • Islandmuschel - Arctica islandica • Jakobsmuschel - Pecten maximus

M. edulis, B. undatum, L. littorea, M. modiolus, M. stultorum, E. ensis und A. islandica wurden

vor der Küste Helgolands gesammelt.

C. gigas stammte aus einer Aquakultur aus Sylt.

C. edule wurde im Watt vor Wilhelmshaven gesammelt.

P. maximus stammte aus schottischen Küstengewässern.

Versuchsdurchführung:

Separieren, ca. 1-2 g Gewebe ↓ Zufügen von PBS-Puffer (Verhältnis 1:1 für Verdauungsgewebe, m:m Gewebe:Puffer) (Verhältnis 1:2 für Muskelgewebe, m:m Gewebe:Puffer) ↓ Homogenisieren, ca. 1 min ↓ Einwiegen, 1,8 mg Gewebe + 0,2 mg konz. Algenextrakt (= Verd. 1:10) ↓ Durchmischen ↓ T0 ¬ T48 Zentrifugieren ← 48 h bei 16°C inkubieren 15 min, 14000 rpm ↓ Filtrieren, 0,22 µm Nylonfilter ↓ Injektion in die HPLC-Apparatur und Hydrolyse ⇒ Die Proben wurden während der gesamten Vorbereitung auf Eis gekühlt.

V Anhang 132

Tab. 44: Gehalte der einzelnen PSP-Toxine im Verdauungsgewebe zu Beginn und am Ende der Inkubation (nmol Toxin/g Gewebe)

M. edulis VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,025 5,293 0,095 0,545 1,068 15,438 0,022 0,209 2,788 8,444 33,927 T48 0,218 5,103 0,212 0,648 3,709 9,446 0,215 0,387 7,457 5,641 33,036 M. modiolus VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,053 6,858 0,156 0,187 1,090 17,342 0,043 0,318 2,998 10,015 39,060 T48 0,442 6,081 0,200 0,118 1,925 14,837 0,238 0,553 5,439 6,496 36,328 C. gigas VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,060 4,658 0,257 1,659 1,310 12,389 0,066 0,243 2,560 7,791 30,992 T48 0,686 4,453 0,426 0,779 2,104 8,027 0,331 0,759 5,404 6,294 29,263 A. islandica VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 1,343 6,610 0,120 1,283 0,922 15,640 0,308 2,099 4,155 10,992 43,471 T48 5,273 0,645 0,377 0,842 1,163 2,679 3,238 7,372 7,253 6,199 35,041 L. littorea VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,532 4,986 0,309 0,168 5,858 9,297 0,412 0,650 3,431 4,305 29,948 T48 3,958 0,000 0,190 0,147 0,000 0,000 0,592 3,483 0,723 0,206 9,298 C. edule VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,050 8,357 0,037 0,466 1,654 21,399 0,064 0,341 3,557 12,199 48,123 T48 0,120 1,344 0,080 0,533 0,534 2,607 0,151 0,401 4,741 6,660 17,171 E. ensis VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,143 4,463 0,491 0,538 0,559 9,819 0,059 0,276 2,173 7,382 25,903 T48 0,462 2,609 0,448 1,047 1,148 4,362 0,306 0,697 4,807 5,019 20,903 B. undatum VG-MD STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,046 5,044 0,337 0,176 0,704 15,437 0,041 0,238 3,769 7,759 33,550 T48 1,732 3,277 0,705 0,113 15,959 4,613 0,971 1,513 6,515 5,015 40,414 B. undatum VG-HP STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,052 5,347 0,481 0,465 1,646 14,093 0,118 0,334 3,211 10,128 35,876 T48 5,423 0,568 0,726 0,176 1,299 0,163 0,300 8,813 1,125 5,768 24,361 M.stultorum VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,053 6,641 0,094 0,931 0,998 19,004 0,035 0,295 2,744 9,987 40,782 T48 1,484 5,279 0,203 0,218 2,470 13,294 0,499 1,165 6,539 6,693 37,845

V Anhang 133

Tab. 45: Gehalte der einzelnen PSP-Toxine im Muskelgewebe zu Beginn und am Ende der Inkubation (nmol Toxin/g Gewebe)

M. edulis MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,043 9,651 0,051 1,327 2,701 22,497 0,037 0,381 4,529 15,359 56,577 T48 0,089 9,725 0,111 0,900 6,240 17,371 0,159 0,303 10,006 9,198 54,101 M. modiolus MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,042 7,662 0,047 2,593 1,284 16,664 0,032 0,296 4,139 11,384 44,144 T48 0,082 7,164 0,105 1,786 4,346 9,527 0,162 0,312 9,108 8,134 40,727 C. gigas MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,037 8,073 0,048 0,933 2,216 17,384 0,038 0,287 4,197 11,324 44,537 T48 0,055 8,365 0,096 0,197 4,066 14,154 0,102 0,283 6,782 8,582 42,682 A. islandica MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,061 9,312 0,041 2,924 1,583 20,719 0,066 0,376 5,189 16,616 56,886 T48 0,143 10,671 0,106 0,000 7,192 20,357 0,165 0,397 9,020 10,765 58,817 L. littorea MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 1,256 8,054 0,117 1,166 2,225 19,372 0,062 0,414 4,299 13,812 50,777 T48 0,467 5,907 1,047 1,037 8,057 7,164 0,528 0,390 11,371 6,486 42,452 C. edule MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,060 6,529 0,046 0,434 1,691 17,733 0,051 0,284 3,504 10,442 40,772 T48 0,070 5,748 0,080 0,111 0,980 11,273 0,092 0,306 3,990 6,022 28,672 E. ensis MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,030 5,739 0,035 0,805 0,733 15,905 0,021 0,157 3,076 8,824 35,324 T48 0,179 5,808 0,085 1,239 2,374 9,937 0,093 0,197 6,284 5,011 31,206 B. undatum MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,028 7,961 0,092 0,245 1,257 21,128 0,037 0,281 3,843 11,164 46,036 T48 0,159 7,002 0,417 1,635 5,549 10,478 0,201 0,270 11,662 8,373 45,747 P. maximus MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,037 5,233 0,025 1,115 1,235 14,083 0,037 0,209 3,522 6,949 32,445 T48 0,047 5,461 0,082 1,003 3,019 7,544 0,111 0,146 6,794 3,702 27,909 M.stultorum MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,021 8,646 0,057 2,561 1,039 19,333 0,035 0,329 3,938 8,779 44,737 T48 0,082 8,466 0,180 2,696 3,899 9,943 0,143 0,374 6,800 6,943 39,528

V Anhang 134

Tab. 46: Einzelwerte der mehrfach wiederholten Inkubationsansätze (nmol Toxin/g Gewebe)

M. edulis VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,021 5,719 0,051 0,513 0,778 16,360 0,021 0,232 3,404 10,343 37,442 0,033 5,017 0,181 0,683 1,259 14,837 0,018 0,195 2,286 7,714 32,223 0,023 5,144 0,055 0,438 1,166 15,117 0,025 0,199 2,674 7,274 32,116 T48 0,163 5,071 0,145 0,552 3,607 11,066 0,200 0,387 7,819 5,789 34,800 0,203 4,723 0,254 0,512 3,770 8,475 0,226 0,398 7,479 5,534 31,575 0,289 5,514 0,238 0,880 3,751 8,798 0,218 0,377 7,073 5,599 32,737 C. gigas VG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,056 4,589 0,229 1,574 1,326 12,656 0,075 0,245 2,225 6,517 29,492 0,035 4,852 0,273 1,720 1,428 12,538 0,079 0,248 2,614 8,572 32,358 0,088 4,533 0,269 1,682 1,176 11,972 0,043 0,236 2,842 8,283 31,124 T48 0,734 4,182 0,406 0,879 1,874 7,473 0,348 0,790 5,187 7,663 29,536 0,768 4,452 0,451 1,090 2,225 8,313 0,359 0,829 5,929 5,933 30,349 0,557 4,726 0,422 0,368 2,213 8,296 0,287 0,658 5,096 5,287 27,911 M. modiolus MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 0,047 7,830 0,048 1,759 1,051 16,432 0,035 0,277 4,118 10,777 42,374 0,040 6,886 0,040 3,484 1,186 15,939 0,029 0,269 3,494 9,997 41,365 0,040 8,270 0,053 2,537 1,615 17,621 0,034 0,341 4,805 13,377 48,692 T48 0,070 7,102 0,106 2,036 4,038 9,694 0,155 0,302 9,048 8,478 41,028 0,089 6,787 0,101 1,872 4,308 9,928 0,169 0,335 9,360 8,138 41,086 0,087 7,602 0,108 1,450 4,692 8,958 0,162 0,300 8,917 7,787 40,065 L. littorea MG STX Neo dcGTX2/3 B1/B2 GTX1 GTX4 GTX2 GTX3 C1 C2 Gesamt T0 1,157 8,352 0,108 1,314 2,020 16,857 0,054 0,374 4,020 14,110 48,367 1,265 9,218 0,141 0,692 2,515 18,945 0,067 0,421 4,459 13,562 51,285 1,347 6,591 0,104 1,493 2,140 22,313 0,066 0,448 4,417 13,763 52,681 T48 0,596 5,462 1,142 0,604 8,172 7,579 0,741 0,525 12,115 7,146 44,082 0,396 6,242 1,114 1,350 8,213 7,481 0,483 0,350 11,926 6,983 44,539 0,408 6,019 0,885 1,157 7,785 6,432 0,360 0,295 10,072 5,329 38,741

Danksagung

Mein Dank gilt Prof. Dr. Bernd Luckas, der mich für seine Forschungen begeistert und mir mit

der Überlassung dieses interessanten und vielseitigen Themas großes Vertrauen erwiesen hat.

Seine großzügige Unterstützung und die vielfältigen Anregungen waren von hohem Wert bei der

Verwirklichung dieser Arbeit. Hervorheben möchte ich auch seine Unterstützung, mit der er mir

die Forschungsaufenthalte in Schottland und auf Helgoland sowie die Teilnahme an wichtigen

nationalen und internationalen Fachtagungen ermöglichte.

Herrn Dr. Christian Hummert danke ich für seine außerordentlich engagierte und motivierende

Betreuung während der ersten zwei Jahre. Die Zusammenarbeit mit ihm hat mir großen Spaß

gemacht und den Fortgang der Arbeiten stark vorangebracht. Ebenso möchte ich Dr. Bernd

Christian für die anregenden und kritischen Diskussionen, insbesondere bei der Fertigstellung

der Dissertation, danken.

Für die ständige Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima sei außerdem allen ehemaligen und

derzeitigen Kollegen des Lehrbereiches gedankt: Katrin Reinhardt, Elke Stoll, Sebastian

Kastrup, Michael Reichelt, Marion Weichbrodt, Walter Vetter, Elena Winter, Alexander Rühl,

Jens Dahlmann, Steffen Ruppe und Trinh Phoung Lien.

Frau Dr. Susan Gallacher und ihrer Arbeitgruppe danke ich für die überaus freundliche Auf-

nahme und die fruchtbare Zusammenarbeit am FRS Marine Laboratory in Aberdeen, welches

mir einen unvergeßlichen Aufenthalt in Schottland ermöglichte.

Dr. Gunnar Gerdts und den Mitarbeitern des Alfred-Wegener-Institutes Bremerhaven, Außen-

stelle Helgoland, möchte ich meinen Dank für ihre Unterstützung bei der Durchführung meiner

biologischen Studien aussprechen, ebenso wie den Bewohnern des „Hacki“-Hauses, die Helgo-

land für mich zu einem schönen Aufenthalt werden ließen.

Mein größter Dank gilt aber meiner Familie und meinem Freund Klaus, die mir Kraft und Zuver-

sicht gegeben haben, diese Aufgabe zu Ende zu führen. Insbesondere meinem Bruder Ralf danke

ich für seine seelische und moralische Unterstützung, auch wenn er letztendlich das „Rennen“

für sich entscheiden konnte.

Ich danke dem Freistaat Thüringen für die finanzielle Unterstützung im Rahmen des Landes-

graduiertenstipendiums, ohne dem diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Selbständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der

angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.

Elke Jaime Jena, 02.02.2003

Erklärung zur Bewerbung

Hiermit erkläre ich, daß ich mich mit der vorliegenden Arbeit an keiner anderen Hochschule um

den akademischen Grad doctor rerum naturalium (Dr.rer.nat.) beworben habe und daß ich weder

früher noch gegenwärtig die Eröffnung eines Verfahrens zum Erwerb des o.g. akademischen

Grades an einer anderen Hochschule beantragt habe.

Elke Jaime Jena, 02.02.2003

Lebenslauf

Name: Elke Jaime

Geburtsdatum/-ort: 27.05.1975 in Dresden

Familienstand: ledig

Anschrift: Mühltal 24

07743 Jena

Schulausbildung

09/1981 - 07/1991 Besuch der Polytechnischen Oberschule in Dresden

08/1991 - 09/1993 Besuch des Gymnasiums „Dresden-Klotzsche“

Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife

Studium

10/1993 - 03/1998 Studium der Ernährungswissenschaften an der Friedrich-Schiller-

Universität Jena

Diplomarbeit zum Thema „Zum Vorkommen von PSP-Toxinen in marinen

Organismen aus dem Seegebiet der Orkney-Inseln“ am Lehrstuhl für

Lebensmittelchemie (Prof. Dr. B. Luckas)

03/1998 Abschluß als Diplom - Ernährungswissenschaftlerin

Postgraduale Ausbildung

06/1998 - 10/2000 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Lehrstuhl für Lebensmittelchemie

(Prof. Dr. B. Luckas) an der Biologisch-Pharmazeutischen-Fakultät der

FSU Jena

06/1998 Beginn der Arbeiten an der Dissertation am Lehrstuhl für Lebensmittel-

chemie

05/2000 - 12/2000 Forschungsaufenthalt am FRS Marine Laboratory in Aberdeen, Schottland

11/2000 - 03/2003 Stipendiatin des Freistaates Thüringen (Landesgraduiertenstipendium)

04/2001 - 08/2001 Forschungsaufenthalt am Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeres-

forschung Bremerhaven (Außenstelle Helgoland)

Elke Jaime

...Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis I THEORETISCHER TEIL 1 1. Einleitung 1 1.1 Zur...

Documents

Transcript of ...Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis I THEORETISCHER TEIL 1 1. Einleitung 1 1.1 Zur...