BÜRO EURISOTOP Kommission der Europäischen Gemeinschaften

Rue de la Loi, 200 B- 1049 Brüssel / Belgien

1

101 KOMMISS ION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN

Serie:

Monographien - 40

BESTRAHLUNG ••

INFORMATIONSHEFT DES BÜRO

EURISOTOP .'.J 3

J.F. DIEHL

VON ENZYMPRAPARATEN AUGUST 1975

HINWEIS

Die Kommission der Europi!ischen Gemeinschaften und die in ihrem Namen handelnden Personen übernehmen keine Gewähr fllr die Voll­ständigkeit der in diesem » Informationsheft« enthaltenen Informa­tionen und haften nicht fllr Schäden, die aus der Verwendung der in diesem »Informationsheft« enthaltenen Informationen oder der in ihm bekanntgegebenen technischen Anordnungen, Methoden oder Verfahren entstehen könnten.

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KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN

INFORMATIONSHEFT DES BÜRO

EURISC>TC>P

Serie: Monographien - 40

BESTRAHLUNG .. VON ENZYMPRAPARATEN

J.F. DIEHL

Bundesforschungsanstalt für Ernährung

Karlsruhe

Studie durchgeführt im Rahmen eines Kontrakte s mit der Kommis sion der Europäischen Gemeins chaften

Herausgegeben von der Gruppe •Information und Dokumentation"

des Büro EURISOTOP 1975

101

Vorwort

Die Strahlungskonservierung und Strahlungshygienisierung

von Lebensmitteln gewinnt mehr und mehr an Boden. Wenn der Prozess

auch langsam vor sich geht, es wird nicht ausbleiben, daß eine

Technik dort, wo ihre wirtschaftlichen und gesundheitlichen Vor­

teile nicht mehr zu übersehen sind, auch die bisher noch da und

dort bestehenden Voreingenommenheiten gegen jede Art der Strahlungs­

anwendung überwinden wird.

Diese Broschüre enhält eine Untersuchung, inwiefern

es, sinnvoll ist, Enzyme mit Strahlung zu behandeln, um dadurch

ihre bakterielle Kontamination zu vermindern, .ohne die enzymati­

sche Wirksamkeit dieser Substanzen zu beeinträchtigen. Der Leser

möge die klaren Uberlegungen von Herrn Professor Diehl prüfen

und entscheiden , ob die Enzymbestrahlung nicht in verschiedenen

praktischen Fällen angebracht und technologische Untersuchungen

im Hinblick auf die Einführtlng des Bestrahlungsprozesses in diesen

Bereich von öffentlichem Interesse ist.

Prof.Dr.G. Pröpstl

Leiter des Büro EURISOTOP

- 1 -

Bestrahlung von Enzympräparaten

von J.F. Diehl

Zusammenfassung

Eine Ubersicht zu den Themen: Verwendung von Enzymen in der Lebens­

mittelindustrie und in anderen Industriezweigen, mikrobielle Konta­

mination technischer Enzympräparate, Keimzahlverminderung durch Be­

strahlung, Strahlenwirkung auf Enzyme, Immobilisierung von Enzymen

durch Strahlenpolymerisation. Die Studie schließt mit Vorschlägen

fUr eine vom Büro EURISOTOP zu tragende Gemeinschaftsaktion.

Irradiation of Enzyme Preparations

by J,F, Diehl

Summary

A review of the topica: use of enzymes in the food indus try and in

other industries, microbial contsmination of industrial enzyme pre­

parations, reduction of microbial counts by irradiation, radiation

effecta on enzymea, imnobilization of enzymes by radiopolymerization.

The study is concluded with proposala for a joint action program,

to be sponsored by Bureau EURISOTOP.

- 2 -

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung. Aufgabe des Berichts

2. Verwendung von Enzymen in der Lebensmittelindustrie

3. Verwendung von Enzymen in sonstigen Industriezweigen

4 . Mikrobielle Kontamination technischer Enzympräparate

5. Keimarme Enzympräparate durch Bestrahlung

6 . Strahlenwirkung auf Enzyme

7. Immobilisierung von Enzymen durch Strahlenpoly­

merisation

8. Vorschläge für eine Gemeinschaftsaktion

9. Bibliographie

s. 3

s. 3

s. 8

s. 10

s. 14

s. 20

s . 27

s. 28

s. 30

- 3 -

1 • Einleitung

Enzympräparate werden in zunehmendem Umfang in der Lebensmittelin­

dustrie, in der Pharmaindustrie und in verschiedenen anderen Indu­

striezweigen verwendet. Aus den Vereinigten Staaten liegt für das

Jahr 1971 die Angabe vor, daß allein für die Verwendung in der Le­

bensmittelindustrie etwa 5000 t mit einem Wert von 40 Millionen ;

produziert wurden (Anonym 1972) . Der Wert der Weltproduktion von

Enzymen im Jahr 1972 wird auf 600 Millionen rtl geschätzt (Uhlig,

1975). Seither ist die Produktion erheblich gewachsen.

Für vie l e Anwendungszwecke werden keimfreie oder mindestens keim­

arme Präparate verlangt. Auf keinen Fall dürfen pathogene Mikro­

organismen in den Präparaten vorhanden sein . Wegen der Hitzeempfind­

l i chkeit der Enzyme kann dieses Ziel nicht durch Hitzesterilisation

erreicht werden; man bedient sich meist der Sterilfiltration, die

jedoch erhebliche technische Schwierigkeiten bietet ,

Es besteht daher großes Interesse an der Entwicklung sonstiger

Methoden zur Gewinnung von mikrobiologisch einwandfreien Enzymprä­

paraten. Als besonders aussichtsreich gilt die Anwendung ionisieren­

der Strahlen: es komnen Gamma-, Elektronen- und Röntgenstrahlen

infrage .

Aufgabe Ge• vorliegenden Berichts ist es, eine Übersicht der bisher

auf diesem Gebiet geleis teten Forschungsarbeit zu liefern, die Mög­

lichkeiten und Probleme der techni schen Anwendung des Bestrahlungs­

verfahrens zu diskutie ren und Vors chläge für eine Gemeinschafts­

aktion zu unterbreiten.

2. Verwendung von Enzymen in de r Lebensmittelindustrie

Enzymatische Prozesse sind in de r Lebensmitteltechnologie sei t sehr

langer Zeit genutzt worden - lang ehe es den Begriff "Enzym" (oder

"Ferment") gab, Es sei hie r nur an die wichtige Rolle der Mälzerei

bei der Herste llung von Bier und anderen alkoholischen Getränken auf

Ge~reidebasis erinnert: Abbau von Stärke zu Oligosacchariden durch

die Amylase des keimenden Getreidekorns .

- 4 -

Die erfolgreiche Verwendung gereinigter Enzympräparate bei der

Lebensmittelverarbeitung nahm vor etwa 40 Jahren ihren Anfang,

als Pektinasepräparate zur schnellen Klärung von Apfelsäften in

Gebrauch kamen Ulld die Firma Rohm und Haaa in Philadelphia aus

Schimmelpilzen gewonnene Amylase als Backhilfsmittel auf den Markt

brachte (1936), Seither hat die Enzymtechnologie einen stUrmischen

Aufschwung genommen, der auf folgende vorteilhafte Eigenschaften

von Enzympräparaten zurückzuführen ist (Villadsen, 1972):

1) Da Enzyme Naturprodukte sind und als nicht-toxisch gelten,

bestehen keine gesundheitlichen Bedenken gegen ihre Anwendung;

2)

3)

Enzyme sind sehr spezifisch in ihrer Wirkungsweise;

Sie wirken am besten bei mäßigen Temperaturen und mittleren

pH-Werten, d.h. daß Enzymreaktionen keine drastischen Bedin­

gungen erfordern, die kostspielige Apparate bedingen und zu

unerwünschten Nebenreaktionen Anlaß geben wurden;

4) Sie wirken schnell Ulld in geringer Konzentration Ulld die

Reaktionsgeschwindigkeit kann durch Steuerung von Temperatur,

pH- Wert und Enzymmenge kontrolliert werden;

5) Sie lassen sich durch Erhitzen leicht inaktivieren, wenn die

Reaktion weit genug abgelaufen ist,

Eine Ubersicht über die für lebensmitteltechnologische Zwecke in­

frage kommenden Enzyme, ihre Herkunft, die Anwendungsmöglichkeiten

und die Wirkungsweise gibt Tab. 1. Vollständigkeit wird fUr diese

Aufzählung nicht beansprucht - die Enzymtechnologie befindet sich

noch im Stadium ständiger Weiterentwicklung, Auf Einzelheiten der

Verfahren kann hier nicht eingegangen werden; aus der großen Zahl

von Veröffentlicht.ngen auf diesem Gebiet seien jedoch beispielhaft

einige Ubersichtsreferate erwähnt.

Uber die Verwendung von Enzymen in der Milch- und Käsetechnologie

haben Kiermeier (1972), Puhan (1973) Ulld Cserhlti und Holl5 (1972,

1974) berichtet. Der Einsatz von Enzymen bei der Herstellt.ng von

Stärkehydrolysaten wurde von De !foord (1972) und Woelk (1973) be­

schrieben, Uber die vielseitigen Verwendungsmöglichkeiten von

- 5 -

Tab, 1 Bei der Lebensmittelverarbeitung verwendete Enzyme

Enzym Herkunft Anwendung

A. Enzyme mikrobieller Herkunft

a-Amylase

Amylo­glucosidase

Cellulase

Glucose­isomerase

Glucose­oxidase

Invertase

Katalase

Laktase (•ß-Galak­tosidase)

Bacillus subtilis

Bacillus amylolique­faciens

Aspergillus oryzae

Aapergi llus niger

Rhizopus sp.

A. oryzae

A. niger u,a,

Lactobaci llua brevis

Peni ci lli um notatum

Bacillus megaterium

A. niger

P, notatum

s. cerevisiae

A. niger

Micrococcus lysodeicticua

P. notatum

s. fragilia

A, niger

Gewinnung von Glucosesirup, Brauerei, Gärungs­gewerbe (Maiseh­zusatz), Backhilfs­mittel

Gärungsgewerbe (Maisehzusatz), Glucosegewinnung

Glucosegewinnung, Produktion von Obst und GemUsesäften, von leichtverdauli­chen Diäterzeugnissen

Süßwaren, Fructose­gewinnung für Dia­betikerdiä t

Trockeneiherstellung (Entfernung von Glu­cose), Bierbrauerei, Konserven, Fruchtsäfte (Entfemtmg von Sauer­stoff)

Süßwaren, Schokolade­erzeugnisse

Sterilisation von Milch mittels H202, Käserei, Trockenei­hera te llUDg

Molkereiprodukte, Speiseeis, Diäter­zeugnisse (bei Lak­tasemange l)

Reaktion

Stärke • Dextrine

Dextrine + Glucose

Cellulose • Glucose

Glucose + Fructose

Glucose + o2 • Gluconsäure + H2o

2

Saccharose +

Glucose + Fructose

2 H2o2 + 2 H

2o + o

2

Lactose • Glucose + Galactose

~ Fortsetzung

Enzym

Lipase

Mikrobiel­les Lab

Herltunft

A. oryzae

Hefen

Mucor m1 chei

Mucor pusi llus

Irpex lacteus

Endothia para­sitica

Bacillus cereus

Naringinase A, niger

Pektinasen A. niger (Pektinme-thylesterase Penicillium sp. + Polygalak-turonase)

Penicilli- Actino111Yces nase candidus

Proteasen

B. subtilis

A. oryzae

A. niger

A. parasiticus

S trep tomyces griseus

B. subtilis

Ribonuclease B. subtilis

Hefen

- 6 -

Anwendung

Aromave rs tä rltung, Käserei

Käserei (Ersatz von Kälberlab)

Beseitigung von Bi ttergeschmack bei Herstellung von Citrussäften

Obstsaftherstellung (Ausbeuteverbesse­rung, Saftklärung)

Käserei (falls penici llinhaltige Milch verwendet werden soll)

Klärung von Bier, Zartmachen von Fleisch, Gewinnung von Proteinhydroly­saten (Sojasoase}, Backhilfsmittel

Aromengewiaowig

B. Enzyme tierischer Herkunft

Katalase

Lab

Lipase

Rindsleber Käserei

Labmagen (Kalb) Käserei

Vormagen (Kalb, Käserei Lamm}, Pankreas versch. Tiere

Reaktion

Fettabbau

Casein + Paracasein

Naringin + Naringenin

Pektinabbau

Inaktivierung von Penicillin

Proteinabbau

Mucleins!ureabbau

2 H2o2 + 2 H20 + 02

Casein + Paracasein

Triglyceride + Di­und Monoglyceride und Fettsäuren

:I

- 7 -

1.!2.:...1. Fortsetzung

-Enzym Herkunft Anwendung

Pepsin Schweinemagen Käserei (zusammen mit Lab}, Fisch-mehlherstellung

Trypsin Pankreas von Zartmachen von Rind, Schwein Fleisch, Backhilfs-

mittel, Gewinnung von Proteinhydroly-saten

C. Enzyme pflanzlicher Herkunft

Bromelin

Ficin

Hemicellu-lase

Lipoxidase

Malz (a-Amylase + ß-All!Y lase}

Papain

Ananas

Feigen

Weizenkleie

Sojabohnen

keimende Gerate

Papaya

Zartmachen von Fleisch, Klärung von Bier, Herstellung von Cerealien mit kurzer Kochzeit, Her­stellung von Protein­hydrolysaten

Backhilfsmittel, Klärung von Bier, Zartmachen von Fleisch

Backhilfsmittel

Aufhellung von WeiB­mehl

Brauerei, Gärungs­gewerbe (Maisehzu­satz}, Backhilfs­mittel

Klärung von Bier, Zartmachen von Fleisch, Herstellung von Cerealien mit kurzer Kochzeit, Herstellung von Proteinhydrolysaten

Reaktion

Proteinabbau

Proteinabbau

Proteinabbau

Proteinabbau

Abbau von llemi­cel lulose

Oxidation von un­gesättigten Fett­säuren, Karotin

Stärke + Dextrine + Maltose

Proteinabbau

- 8 -

Pektinasen und Cellulasen bei der Obst- und Genilseverarbeitung

haben Grampp (1972), Pilnik (1972) und Heimann (1973) informiert.

Wismer-Pedersen (1972) hat Uber Enzyme in der Fleischwirtschaft

berichtet ind Guilbot (1972) über Enzyme bei der Herstelling von

Backwaren. InfoI111ationen Uber die Verwendung von Enzymen in der

Bierbrauerei findet man bei Holl& et al. (1972). Eine gute Gesamt­

übersicht ist unter dem Titel "Food Related Enzymes" in Advances

in Chemistry Series (1974) erschienen. Das Buch "Principles of

Enzymology for the Food Sciences" von Whitacker, 1972, ist eben­

falls erwähnenswert.

3. Verwendung von Enz}'!Den in sonstigen Industriezweigen

Bedeutende Mengen von Enzymen werden bei der Waschmittelherstellung

eingesetzt. Obwohl dieser Verwendungszweck bereits seit 1913 bekannt

ist, als das mit Pankreas-Enzym versetzte Waschmittel BURNUS auf den

Markt kam, haben schmutzlösende Enzyme erst in neuerer Zeit auf

breiter Basis in der Waschmittelherstellung Eingang gefunden. Es

handelt sich dabei u.a. um "Subtilisin", eine Gruppe von Proteinasen

von Bacillus subtilus-Stämmen, "Pronase", eine als Nebenprodlkt der

Streptomycinherstellung aus Streptomyces griseus gewonnene Protease,

Kollagenase aus Clostridium-Arten und Keratinase aus Streptomyces

fradiae. Zum Teil werden auch Enzympräparate mit Amylase-Wirkung

eingesetzt. Die Waschmittel enthalten etwa 0,02 - 0,05 % Enzym. Es

wird geschätzt, daß allein in der deutschen Waschmittelindustrie

1974 etwa 1700 t Enzyme verbraucht wurden (Verbeek, 197 5).

Schon 1907 wurden von 0, Röhm, DaI111stadt, Enzympräparate für das

Beizen von Häuten in die Gerberei eingeführt, Durch die enzymatische

Entfernung von Haaren und Haarwurzeln ergibt sich gegenüber älteren

Verfahren eine Qualitätsverbesserung der Häute, bessere Erhaltung

der Wolle (bzw. sonstiger Tierhaare) und eine geringere Belastung

des Abwassers. Verwendet werden Proteasen aus Bakterien (Bacillus

cereus, Bacillus subtilis, Streptanyces griseus) und Schimmelpilzen

<Aspergillus saitoi, Aspergillus oryzae, Aspergillus usamii, Rhizo­

pus sp.).

- 9 -

In der Textilindustrie spielen Enyzme ebenfalls eine Rolle: beim

Weben werden die Kettenfäden mit Stärkelösung getränkt ("Schlich­

ten") - nach dem Weben wird mit Bakterienamylase (Bacillus subti­

lus u.a.) entschlichtet.

In der chemischen Industrie spielt die Verwendung von Enzymen bei

der Produktion bestin:mter Substanzen eine erhebliche Rolle. Eine

klare Abgrenzung zu den im Kapitel "Lebensmittelindustrie" be­

schriebenen Verfahren ist in vielen Fällen nicht möglich. Die Um­

wandlung von Stärke in Dextrine und Glucose mit Hilfe von Amylase

und Amyloglucosidase liefert Produkte, die nicht nur in der Lebens­

mittelindustrie, sondern für viele technische Zwecke von Interesse

sind. Ähnliches gilt für die Spaltung von Laktose mittels Laktase,

fUr die Modifizierung von Fetten durch Einwirkung von Lipase usw.

Wachsendes Interesse kODIDt der Gewinnung von L-Aminosäuren aus

Racematen zu. Man kann z.B. die racemische Mischung acylieren, die

acylierte L-Aminosäure mit einem geeigneten Enzym selektiv hydro­

lysieren und die freie L-Aminosäure von der noch acylierten D-Amino­

säure abtrennen (Tosa et al. 1966). Mit Hilfe des Enzyms D-<>xynitri­

lase kann man aus Aldehyden \Dld Cyanwasserstoff in hoher Ausbeute

D-o-Hydroxynitrile herstellen, z.B. D-(+)-Mandelonitril aus Benzal­

dehyd (Becker und Pfeil 1966). Die Hydroxynitrile dienen als Aus­

gangsprodukt für die Synthese von D-o-Hydroxycarbonsäuren, substi­

tuierten Äthanolaminen, Acyloinen u.a. Diese wenigen Beispiele mögen

zeigen, das die Enzymtechnologie in der chemischen Industrie ein

großes Potential besitzt.

Auch aus dem Bereich der Pharmaindustrie können nur wenige Beispiele

genannt werden. Das aus Schimmelpilzen gewonnene Benzylpenicillin

wird durch enzymatische Hydrolyse (Penicillinacylase) in 6-Amino­

penicillin umgewandelt - ein wichtiges Ausgangsprodukt für die Syn­

these modifizierter Penicilline (Heuser et al. 1969). Durch Behand­

lung mit Yroteinasen können nichtpeptidische Antibiotica-Präparate

von antigenwirkenden Proteinen befreit werden (Schaltiel et al. 1970).

Eine ganz wichtige Rolle spielt die Enzymtechnologie bei der Steroid­

aynthese. Um auch hier nur ein Beispiel zu geben: Mittels

- 10 -

3-Ketosteroiddehydrogenase aus Arthrobacter simplex können Keto­

steroide zu dem medizinisch wichtigen Corticosteroid Triamcinolon

dehydrogeniert werden (Ryu und Lee, 1975) .

Groß ist die Zahl der Arzneimittel, die selbst Enzympräparate

enthalten: Proteinasen, Lipasen, Amylasen , Cellulasen in verdau-

1.mgsfördernden Präparaten, Proteinasen in Mitteln zur Bekämpfung

von Darmparasiten und in Mitteli)'zur Behandlung entzilndlicher

Venenerkrankungen, in kosmetischen Präparaten usw.

Zunehmende Bedeutung haben Enzyme in der klinischen Chemie als

diagnostische Hilfsmittel - sowohl im Schnelltest (z.B. entspre­

chend präparierte Papierstreifen zur Bestimmung von Zucker im

Urin) als auch filr die Analyse im Laboratorium (z . B. Bestimmung

von Cholesterin) .

Weiterfilhrende Literatur zum Thema Enzymte chnologi e findet man

in den Ubersichtsartikeln von Wingard (1972} und von Edwards (1972) .

4. Mikrobielle Kontamination technischer Enzympräparate

Bei den aus Mikroorganismen gewonnenen Enzymen ist die Trennung des

Enzyms von diesen Organismen ein wesentlicher Schritt des Verfahrens.

Aber auch bei den aus tierischem Rohmate rial (z.B. Kälbermagen) oder

aus Pflanzenteilen (z.B. Papaya} ex t rahierten Enzymen besteht die

Gefahr, daß aus dem Rohmater ial - einem gilnstigen Nährboden filr das

Wachstum von Mikroorganismen - Keime in das Enzympräparat ge langen.

Soweit es sich um Enzyme für die Herstellung von Lebensmitteln und

Medikamenten handelt, wird selbstverständlich gefordert, daß die

Präparate frei sind von pathogenen Keimen . Aber auch für andere

Zwecke eingesetzte Enzyme müssen hohen hygienischen Anforderungen

genUgen - z.B. verlangen Waschmittelhers teller, daß die von ihnen

eingesetzten Enzyme frei sind von Bacillus anthracis, Salmonellen

und Staphylococcus aureus, und daß sie weniger als 10 Bacillus

cereus-Keime oder Enterobacteriaceae pro g Enzympräparat enthalten

(Wallhäusser 1971). In vielen Fällen spielt nicht nur die Frage des

- 11 -

Vorhandenseins pathogener Keime eine Rolle, sondern auch die Frage des

Vorhandenseins gesundheitlich harmloser Keime , die jedoch den ra­

schen Verderb sowohl des Enzympräparates selbst als auch des mit

dem Enzym versetzten Lebensmittels oder Rohstoffs verursachen kön­

nen. Manche technisch angewendete Enzymreaktion verlangt relativ

lange Zeiten (Sttmden oder sogar Tage), während derer das Reaktions­

gemisch auf einer Temperatur gehalten wird (35 - 50°), die ideale

Bedingungen filr die Vermehrung der Verderbsflora bietet. Man ist

daher bemliht, möglichst ke imarme Präparate herzustellen. Soweit

dies rechtlich zulässig i st und im Einzelfall sinnvoll, stabili­

siert man ferner die Enzympräparate durch chemische Konservierungs­

mittel . Aus Abb. 1 geht hervor, daß ein kommerzielles Präparat von

a-Amylase in 8,25 %iger Löstmg innerhalb 3 Tagen 50 % seiner Enzym­

aktivitä t verlor. Durch Zusatz von Sorbinsäure/PHB-Ester konnte der

Verlust auf ca. 15 % reduziert werden.

100 t

:0 ~ 90 ~ "{

~ 80 1

70

60

----....... ________ ___ -<>- __ _

----- ........ '""O ········'··'

·•···•··············•·•·····•······················•

so~-------.--------.------=:::::,z; 2, '8 72'

--Lagerzeit-

~ Stabilisierung einer Alpha-Amylase-Lösung (8,25 %ig}

durch -- Sorbinsäure/PHB-Ester 20°, ••••• Sorbin­

säure/PHB-Ester 60°, -- ohne Zusatz 20° (Woelk, 1973).

- 12 -

Da der Stlirlteabbau durch a-Amylase relativ lange Reaktionszeiten

erfordert. spielt der Verlust der a-Amylase durch mikrobiellen

Angriff eine große wirtschaftliche Rolle. Je reiner das eingesetzte

Enzymprilparat ist. desto länger bleibt es wirksam und desto weniger

muß (teueres!) Enz}'lll nachgegeben werden.

Uber mikrobiologische Verunreinigungen von 92 handelsüblichen En­

zympräparaten. die teils aus Mikroorganismen • teils aus pflanz­

lichen oder tierischen Quellen gewonnen worden waren. haben Lott

und Frank (1973) berichtet. Salmonellen. Pseudomonas und Staphylo­

kokken wurden nicht gefunden.

Bei 18 Amylasen schwankte die aerobe Gesamtkeimzahl zwischen 10

und 2.4 x 107; Enterobakte~ceen waren l 2inal nicht nachweisbar und

erreichten in einem Fall einen Maxiinalwert von 9,5 x 103/g; Clo­

stridien fehlten gänzlich; 5 Präparate waren frei von Schimmelpil-4 zen. bei den übrigen wurden bis zu s.6 x 10 gefunden.

Von 32 Pektinasen waren 2 keimfrei - ein Flüssigpräparat und eine

pulverförmige Zubereitung - . Die Zahl der aeroben Bakterien erreichte

in 4 Fällen 105; Enterobakteriaceen fehlten. Clostridien konnten 25

mal nicht nachgewiesen werden und überschritten bei den übrigen 30/g

nicht. Schimmelpilze fehlten nur in 3 Präparaten - außer den beiden 4 keimfreien -. bei den restlichen stieg die Zahl bis zu 3 x 10 /g.

Von 27 Proteasen waren 2 keimfrei. 5mal waren mehr als 107 /g aerobe

Bakterien vorhanden und 5 Präparate hatten bis au 21 1 x 103/g l!fttero­

bakteriaceen. Clostridien traten in dieser Gruppe gehäuft auf und

zwar llmal mit 2.4 x 103/g als Höchstwert; Schimmelpilze fehlten nur

7mal und wurden in einem Falle bis zu 105/g gefunden.

3 Invertasen. 5 Cellulasen, 2 Lipasen. 3 Lab-Proben und eine Urease

lagen bezüglich der genannten Keimgruppen vollkommen im Rahmen der

Enzyme. die in größerer Zahl geprüft worden waren.

Die Wlufiglteitsverteilung der aeroben Bakterien und der Schimmel­

pilze bei allen Proben geht aus den Abb. 2 und 3 he rvor.

20

c:: 15 ... -<:>

~ -- 10 -c:: ~ c:: "' 5

ff

4

- 13 -

19

17

1J IJ

8 7

01 m ~ ~ ~ ~ m m ~ < 10 10' 102 101 to 4 105 106 101

aerobe Gtsamtktime/g

~ Häufigkeitsverteilung der aeroben Ges amtke imzahl von

92 Enzymproben (Lott und Frank 1973) .

25

~ 20

~ l 15

10

5

16

10

16

17

10

, ol VA V4 1'13 1?,1 VA 1.!!

w' w' w1 wf w' w1 w' Schimmelpllu/g

< 10

~ Häufigkeitsverteilung der Schi mme lpilzzahl von 90

Enzymproben (Lo t t und Frank 1973) .

- 14 -

Uber den Keimgehalt h1111delsü1>Ucher Enzympräparate. die ausschließ­

lich aus Mikroorgmiamen gewonnen wurden. gibt Tab. 2 Auskunft.

Deanach sind keimarme Produkte mehr die Ausnahme als die Regel.

!!l!.!._l Keimgehalt einiger mikrobieller Enzyme (Wallhäusser 1971)

Enzym

Hemicellulasen

Proteasen

Lipasen

Waschmittel-Enzyme (Proteasen. 8 Hera te ller)

Zahl der

Proben <100

42 2

25 2

5 -24 -

Gessmtkeimzahl/g

100-1000 104-105-105.:10° >IOo >!07

4 10 22 4

7 3 13

- 1 1 3

- - 5 10 9

In der Arbeit. aus der diese Zahlen entnOlllllen wurden. hat Wallhäusser

(1971) die Möglichkeit der Bestrahlung erwähnt. Er bezeichnet die Be-6 9 strahlung von Rohenzymen (mit 10 - 10 Keimen/g) als unwirtschaH-

lich, da die erforderliche hohe Strahlendosis von etwa 2.5 Krad Akti­

vitätsverluste bei den Enzymen verursacht. Er empfiehlt daher die

mechanische Vorreinigung (Zentrifugieren. Filtrieren). um die Kultur­

lösung auf 104 - 105 Keime/ml zu bringen. Bei Bestrahlung dieses Pro­

duktes mit Dosen bis zu 1 Krad werden ohne nennenswerte Enzymverluste

Keimzahlen unter 102 Keime/g - also keimarme Präparate - erhalten.

Das folgende Kapitel soll hierzu nähere Auskünfte geben.

5. Keimarme Enzympräparate durch Bestrahlung

Die Anforderungen der Verwender von Enzympräparaten hinsichtlich der

mikrobiologischen Qualität dieser Präparate werden i11111er höher. zu­

gleich stellen nationale und internationale Geaundheitsbehörden i11111er

strengere Anforderungen an die hygienische Beschaffenheit aller Le­

bensmittel-Zueatzetoffe. Wegen der Hitzeempfindlichkeit der Enzyme

und den begrenzten Möglichkeiten zur Anwendung der chemischen Ent­

keimung bleibt für die Sterilisierung von Enzympräparaten praktisch

nur die Möglichkeit der Sterilfiltration. Diese bereitet bei den

:!:

- 15 -

viskosen Flüasigkeiten. um die es sich bei den Kulturlösungen han­

delt. erhebliche Schwierigkeiten. Außerdem besteht die Gefahr der

Reinfektion bei der Abfüllung von flüssigen oder beim Abpacken von

getrockneten Präparaten.

Auf dem medizinischen Sektor hat sich die Bestrahlung als Sterili­

sationsmethode außerordentlich gut bewährt. Chirurgisches Nahtma­

terial und eine Vielzahl von medizinischen Artikeln. wie Injektions­

spritzen aus Plastik. Kanülen. Schläuche usw. werden seit Jahren

bevorzugt durch Bestrahlung sterilisiert. Gegenüber anderen Methoden

hat die Bestrahlung vor allem den Vorteil• daß in der verschlossenen

Packung sterilisiert und so eine Reinfektion vermieden werden kann.

Vom produktionstechnischen Standpunkt aus ist es vorteilhaft. daß

dieses Verfahren nicht chargenweise. sondern kontinuierlich arbeitet.

In die Herstellung technischer Enzyme hingegen hat die Bestrahlung

bisher nur in begrenztem Umfang Eingang gefunden. In den Vereinigten

Staaten werden seit Jahren Waschmittel-Enzyme durch Bestrahlung

hygienisiert. Im Jahre 1968 wurden in den USA ca. 1000 t Enzyme für

die Waschmittelherstellung gebraucht und mindestens die Hälfte da­

von durch Bestrahlung s terilisert (Anonym. 1969). Der Anwendung des

Verfahrens bei denjenigen Enzymen. die in der Lebensmittel- und

Pharmaindustrie zum Einsatz kommen sollen, stehen jedoch die in den

Lebensmittel- und Arzneigesetzen verankerten Bestrahlungsverbote

entgegen. Theoretisch könnten zwar von den Gesundheitsbehörden ent­

sprechende Ausnahmegenehmigungen erteilt werden. Die Industrie scheut

jedoch vermutlich den Aufwand. der erforderlich wäre. um solche Ge­

nehmigungen zu erhalten. tlber wissenschaftliche Untersuchungen. in

denen die Möglichkeiten der Hygienisierung von Enzymen durch Bestrah­

lung geprüft wurden. soll im folgenden berichtet werden.

Vas hat anläßlich des Internationalen Kongresses Uber Lebensmittel­

wissenschaft und Technologie in London 1962 erstmalig über die mikro­

biologische Stabilisierung von Pektinenzyqiräparaten referiert. Die

Versuche wurden mit pektinolytischen Konzentraten aus Aapergillus­

und Penicillium-Stämmen und mit dem Handelspräparat "Polizim" durch­

geführt. Mit einer Strahlendosis von 1 Mrad wurden sowohl bei flUs­

aigen wie bei trockenen Präparaten Keimzahlreduktionen auf 10-4 bis

- 16 -

10-6 des Ausgangswertes erzielt. Die Aktivitätsverluste lagen bei

2 - 18 %. Bestrahlte Proben waren noch nach !-jähriger Aufbewah­

rung unverändert, unbestrahlte waren nach 6 Tagen verdorben. Bei

der Bestrahlung hochgereinigter Enzymlösungen ergeben sich höhere

Aktivitätsverluste als bei der Bestrahlung des Handelspräparats

(Vas und Proszt, 1965),

Die Bestrahlung von Cellulasepräparaten ergab eine sehr hohe Strah­

lenresistenz bei Bestrahlung des trockenen Enzymes. Um eine 63 %ige

Inaktivierung zu erzielen (D37), war eine Dosis von 25,3 Mrad er­

forderlich. Bei Bestrahlung einer 14 mg Enzym/ml enthaltenden Lösung

war die D37 2,7 Mrad (Vas, 1969) , Angeben über die mikrobiologische

Kontamination der Cellulasepräparate tmd über die antimikrobielle

Wirksamkeit der Bestrahlung enthält diese Arbeit nicht.

Die Untersuchung von Amylasepräparaten (aus Aspergillus-, Rhizopus­

und Bacillus-Arten und aus Malz), die mit Strahlendosen von etwa

J,O Mrad bestrahlt worden waren, ergab eine Keimzahlreduktion um

etwa 4 Zehnerpotenzen (vgl. Abb, 4). Von 10 Präparaten bilßten 7

durch die Bestrahlung mit dieser Dosis weniger als 10 % der Aktivi­

tät ein, 2 etwa 20 % und eine etwa 30 % (Kawashima et al., 1973).

Die Abnahme der mikrobiellen Kontamination von Proteasen (aus Asper­

gillus-, Rhizopus-, Bacillus-Arten und aus Schweinepankreas) mit

zunehmender Strahlendosis geht aus Abb , 5 hervor. Von 9 untersuchten

Proben verloren 7 bei Anwendung einer Dosis von 0,75 - 1 Mrad weniger

als 5 % ihrer Aktivität, bei den beiden anderen lag der Verlust bei

5 - 20 % (Kawashima et al., 1974).

Tschechische Autoren beobachteten nach Bestrahlung von Labpräparaten,

die teils aus Bacillus subtilis-Kulturen, teils aus Kälber-, Ziegen­

oder Schweinemagen gewonnen worden waren, Aktivitäts verluste zwischen

0 und 60 % bei Anwendung einer Dosis von 4 Mrad, Wurde mit der Dosis

1 Mrad bestrahlt, so lagen die Verluste maximal bei 15 %. Bei einem

Präparat wurde durch die Bestrahlung eine erheb liehe Zunahme der En­

zymaktivität verursacht (Masek et al., 1971),

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- 17 -

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~ Abnahme des Keimgehalts verschiedener Amylasepräparate

durch Bestrahlung. Bestrahlungstemperatur o° C,

(Kawashima et al., 1973)

10°

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Dosis [ Mrad 1

Abb. 5 Abnahme des Keimgehalts verschiedener Proteasepräparate

durch Bestrahlung. Bestrahlungstemperatur o° C.

(Kawashima et al., 1974)

- 18 -

Ein Labpräparat polnischer Produktion enthielt vor der Bestrahlung

20000 Keime/g wd wurde durch Bestrahlwg mit der Dosis 1 Mrad keim­

frei. Ein Aktivitätsverlust trat dabei nicht auf (Bachman et al.,

1969). Wurde das Enzym vor der Bestrahlung mittels Sephadex Gel G-75

gereinigt, so verursachte die Dosis von 1 Mrad einen Aktivi tätsver­

lust von 30 % (Bachman wd Borkowska, 1972).

Im hiesigen Institut wurden Untersuchwgen an Handelspräparaten von

Pektinase, Bakterienprotease, Pilzprotease und Pilz-a-Amylase durch­

gefUhrt (MUnzner und Delincee, 1975). Einige Ergebnisse der mikro­

biologischen Prüfwg gehen aus Tab. 3 hervor. Die Bestiamung der

Enzymaktivitäten ergab nach Bestrahlung mit der Dosis 1 Mrad Ver­

luste, die bei 0 bis 10 % lagen.

6. Strahlenwirkung auf Enzyme

Aus den in voi:hergehenden Kapiteln geschilderten Untersuchungen geht

hervor, daß die Gewinnung keimarmer oder "praktisch steriler" Enzym­

präparate ohne nennenswerte Beeinträchtigung der Enzym-Aktivität mög­

lich ist. Unter ungUnstigen Bedingungen kann jedoch durch die Be­

strahlung ein nicht unerheblicher Aktivitätsverlust eintreten. Es

gilt also, die Bedingungen festzulegen, bei denen ein minimaler Akti­

vitätsverlust eintritt. Es interessiert femer die Frage, ob durch

die Bestrahlung die Enzymspezifität verändert wird UDd ob sich son­

stige Eigenschaften der Enzyme (Hitzeempfindlichkeit, pH-<>ptimwn usw,)

verändern. Hierauf soll im folgenden näher eingegangen werden.

Die durch den G-Wert (Zahl der pro 100 eV absorbierter Strahlenener­

gie zerstörten MolekUle) ausgedrückte Strahlenwirkwg ist recht un­

terschiedlich, je nachdem, ob das Enzym in trockenem Zustand oder in

wässriger Lösung bestrahlt wird. Für trockene Enzyme liegt der G-Wert

bei 1 - 3, falls in sauerstoffreier Atmosphäre bei Raumtemperatur be­

strahlt wird. Die in Tab, 4 wiedergegebene Zusmmnenstellung von G­

Werten, die an verdünnten Lösungen besti111Dt wurden, zeigt bei den

meisten Enzymen sehr •viel niedrigere G-Werte (Sanner et al., 1974).

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- 20 - - 21 -

..., = o 0 o o .!!!?.:....i Strahlenempfindlichkeit von in verdünnter Löaung in ... - - - -S! 1 1 1 ' Gegenwart von Luft beatrahlten Enzymen (Sanner et al., 1974) ~ V V V V

..., Enzyme -G-Wert

= 8 g .w ' - 1 - • • • • Papain 1,2 0 V V

~ DNase I o,7

..., "' "' "' ~ Chymotrypsin o,5 u1• oo oo oo oo 0 .:: IC IC w IC - - - - RNaae 0,5 ,.... i.n ,.... N i.n

"" 8 .,; ""• ..; .: v v v v Milchsäuredehydrogenaae 0,5 "' Isoci tratdehydrogenase 0,5 ..., ... "" ... "' = 0 2 2 2 8 8 8 8 DNase II 0,4 .W ctf 1C IC 1C - - - -

8 • '°.. -. -. v v v v Pectylmethylesterase 0,4 ,..._ M -.:t ,.._

"" ~ pusillus Protease 0,4 . - - - - -"' l "'o ~o "'o ,...o "'o "'o "'o "'o R.ennin o, 4

~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Enolase o, 3 0

..; .; ~ .; .,; .,; ..; - Glutamatdehydrogena.se o, 3

~ DNA-abhängige RNA Polymerase 0,2

!j Trypsin 0, 14 1 1 1 1 1 1 1 g Aldolaae 0, 14

Phosphorylaae b 0, 19

~ o o Amylase 0,08 M - -

,.. 1 1 1 1 1 1

Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase 0,07 0 V V

u 1 ~ Phoaphofructokinase o,06 ~ ~ g 8 2 ~ 2 2 2 Alcoboldehydrogena.se o,06

.w - - " 1 Aapartokinase-Homoserindebydrogenase 0,02 8 V V V ~· V V V (Kinaae Aktivität)

"' Fructoae-1,6-diphosphatase 0,02 ..., "' "' ~ ~ o o g 2 g 8 8 2 Lysozym 0,02 ,>ol IC IC - IC - - -

": o. V "".. V V V V Urease 0,015 52 "' "' "' <1i Aspartattranscarbamylaae 0,010

..., ~o ~0 ~0 "'0 "'o "'o "'o ~0 Aapartokinase-Homoserindehydrogenaae 0,006 = 'H 'M 'M 'H " )C ~ "H C:O (Dehydrogenase Aktivität)

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- 22 -

Die höhere Strahlenresiatenz des trockenen Enzyms Ulld die geringere

Strahlenresistenz, je verdUnnter die bestrahlte Enzymlösung ist,

zeigen die Abbild11Dgen 6 UDd 7 am Beispiel von Pektinase und Cellu­

lue (Vas, 1969). Man muß sich jedoch darüber im klaren sein, daß

zwar der Anteil der Enzymmoleküle, die durch eine bestimmte Dosis

zerstört wurden, in Lösung höher ist als im trockenen Enzym und in

verdUnnter Lös11Dg höher als in konzentrierter, daß jedoch die abso­

lute Zahl der zerstörten Moleküle mit zunehmender Konzentration der

Lösung bzw. bei Bestrahlung von Festsubstanz statt von Lösung zu­

nimmt. Sanner und Mitarbeiter (1974) haben dies mit folgendem Bei­

spiel erläutert: Angenommen ein Enzym mit Molekulargewicht 25000

werde in Lösung mit G • 0,2 und im trockenen Zustand mit G • 2,0

inaktiviert. Wenn 1 ml einer 2 x I0-5 M-Lösung bestrahlt wird, ist

die D37 60 krad. Diese Dosis zerstört 7,5 x 1015 Moleküle. Falls

1 g des Enzyms der gleichen Dosis in trockenem Zustand ausgesetzt

wird, werden IOmal soviel Enzymmoleküle zerstört. Da jedoch 1 g

trockenes Enzym 2,4 x 1019 Moleküle enthält, stellen die zerstörten

7,5 x 1016 Moleküle nur 0,3 % der vorhandenen dar - ein Anteil, der

110 gertng ist, daß man ihn analytisch kaum wird nachweisen können.

Die Tatsache, daß unterschiedliche Enzyme bei Bestrahlung in glei­

cher Konzentration eine sehr unterschiedliche Strahlenresistenz

zeigen können, ist auf die Verschiedenartigkeit der Molekülstruktur

zurückzuführen. Enthält das aktive Zentrum eines Moleküls besonders

strahlene~findliche (z.B. schwefelhaltige) Aminosäuren, so wird es

durch Bestrahlung besonders leicht inaktiviert. Die Ursache für die

hohe Strahlenempfindlichkeit des Papains z.B. (G • 1,2, siehe Tab . 4)

ist darin zu sehen, daß es eine für die Enzymaktivität wesentliche

SR-Gruppe enthält, während z.B. im Molekül der Glyceraldehyd-3-phos­

phatdehydrogenase (G • 0,07) 3 - 4 SH-Gruppen zerstört werden müssen,

ehe die Enzymaktivität verloren geht (Lange, Pihl, Eldjarn, 1959;

Pihl 11Dd Sanner, 1963).

llber die Strahlenempfindlichkeit der einzelnen Aminosäuren im Mole­

kUlverband der Enzyme, über daa Ausmaß der strahleninduzierten Pep­

tidapaltung und Aggregatbildung (Quervernetzung zwischen Enzymmole­

kUlen) liegt eine sehr umfangreiche Literatur vor, die hier nicht

im einzelnen zitiert werden kann.

- 23 -

2,0 A

1,5

1,0

o.s~\ \z4.oo 8.20

1 1 0 5 10 15 20

Dosis [MradJ

~ Strahlenwirkung auf trockene Pektinase und auf Pektinase­

lösungen der Konzentration 24,80 und 8,20 mg/ml (Vas, 1969).

A • Aktivität

A

2.0

0,5 L 0 10 20 30 40 50

Dosis [Mr ad]

~ Strahlenwirkllllg auf feste Cellulase und auf Cellulase­

lös11Dgen der Konzentration 14,00 und 3,61 mg/ml (Vas, 1969),

A • Aktivität

- 24 -

Eine für die Praxis der Enzymbestrahlmg aehr wichtige Festatell1111g

ist die Zunahn der Strahleneq>findlichkeit mit zunehmender Rein­

heit der Enzympräparate. Die in der Literatur zu findenden G-Werte

wurden an hochgereinigten Präparaten ermittelt, während es sich bei

den z.B. in der Lebensmittelindustrie verwendeten Präparaten um Ex­

trakte von mikrobiellen Kulturen, Tierorganen oder Pflanzenmaterial

handelt, die meist aus einer Mischung mehrerer Enzyme bestehen und

einen erheblichen Anteil enzymatisch nicht aktiven Materials ent­

halten. In Fällen, in denen hochgereinigte Enzympräparate mit einem

Minimum an Aktivitätsverlust bestrahlt werden sollen, wäre an den

Zusatz von Schutzsubstanzen zu denken, deren Gegenwart bei der Ver­

wendung des Enzyms nicht stört.

Infrage kommt z.B. das Dipeptid Glycylglycin . Seine mit zunehmender

Konzentration zunehmende Schutzwirkung auf Trypsin geht aus Abb. 8

hervor( Sann er, Pihl ),Die Strahlenschutzwirkung von Leucylglycin und

von verschiedenen Kohlenhydraten auf D-Aminosäureoxidase hat Dale

{1942) beschrieben. Katalase wird durch Fumarsäure, Cystein, Cystin

300

--;:; 250 2! ~ c:

iLi 200

"' .::: :§ ~ 150

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100.

00 1 2 3 4 Protektor !10-1MJ

5

M?.!!.:._! Schutzeffekt zunehmender Konzentrationen von Glycylglycin

auf die Strahleneq>findlichkeit vonTrypsin (Sanner u.Pihl, 1969)

- 25 -

1111d Glutathion geschlitzt (Dale und Russell, 1956). Bei Untersuchun­

gen Uber die Schutzwirkung der D- Isoascorbinsäure auf Pepsin fanden

Procter und Goldblith (1952), daß die Dosis 500 krad in reiner Pep­

sinlösung 80 % Inaktivierung verursachte . Waren O,I mg Ascorbin­

säure/ml zugegen, so gingen 63 % der Pepsinaktivität verloren, bei

o, 25 mg/ml noch 42 %, bei 1 mg/ml nur noch 18 %.

Besaiders im Hinblick auf die im nächsten Kapitel zu beschreibende

Verwendung inmobilisierter Enzyme ist die Feststellung wichtig, daß

auch durch Adsorption an unlöslichem Trägermaterial eine Schutzwir­

kung erreicht werden kann. So fanden Fletcher und Okada (1955), daß

eine Strahlendosis, die bei reiner Lösung von Desoxyribonuclease zu

vollständiger Inaktivierung fUhrt, wirkungslos bleibt, wenn das En­

zym an einer ausreichenden Menge Cellulose absorbiert ist.

Wichtig ist femer der Einfluß der Temperatur bei der Bestrahlung

auf die Erhaltung der Enzymaktivität. Da die Anwendung tiefer Tem­

peraturen eine geringere Schutzwirkung auf Mikroorganismen ausUbt

als auf die Enzyme (Sanner et al., 1974), ist in denjenigen Fällen,

in denen die Bestrahlung eines Enzympräparates bei Raumtemperatur

einen nennenswerten Anteil der Aktivität zerstört, an die Bestrah­

lung bei Temperaturen unter dem Gefrierpunkt zu denken .

Neben Verlusten an Enzymaktivität interessiert auch die Frage, ob

durch die Bestrahlung Veränderungen ausgelöst werden, die sich z.B.

auf die EnzymspezUität auswirken. Bei Papain (Pihl und Sanner, 1963)

und bei Protease aus Mucor pusillus (Kov5cs-Proszt und Sanner, 1973)

wi rd die Enzymspezifität durch Bestrahlung nicht ve rändert .

Die Angaben in Tab. 1 zeigen, daß die Kinaseaktivität der Aaparto­

kinase- Homoserindehydrogenase (-G • 0,02) mit etwa 3mal höherem G­

·wert inaktiviert wird als die Dehydrogenaseaktivität (-G • 0,006).

Die Calciumabhängigkeit der Pektinmethylesterase wird durch Bestrah­

l ung verändert: Sanner et al. (1972) fanden im unbestrahlten Enzym

maximale Aktivität bei e iner CaC12-Konzentration von ca. 25 m Mol/l,

in dem mit 100 k rad bestrahlten Enzym dagegen bei ca. 6 m Mol/l.

Sanner e t al. (1974) haben darauf hingewiesen, daß derartige Wirkun­

ge n der Bestrahlung praktisch genutzt we rden könnten. Da Rohextrakte

~ 60

Ii :~ 40 .:g E >. N

~ 20

10

50

- 26 -

20 40 60 so 100 Erhitzungszeit [min l

~ Inaktivierung von Mucor pusillus-Proteaae durch Erhitzen

auf s2.s° C, Du Enzym war entweder unbestrshlt ("Kontrolle"}

oder mit einer Dosis bestrahlt. bei der noch 62 % bzw, 32 %

der Enzymaktivität vor dem Erhitzen erhalten blieben,

(Kovlcs-Proszt und Sanner. 1973}

aus mikrobiellen Kulturen i11111er ein Gemisch verschiedener Enzyme ent­

halten. könnten z,B, unerwUnschte Enzyme gezielt inaktiviert werden;

oder wenn Pektinmetbylesteraae bei beaondera niedriger Ca-Konzentra­

tion wi:dtsam sein soll. könnte dies durch Bestrahlung erreicht werden ,

Wichtig ist in diesem Zusammenhang auch. daß in Gegenwart von Substrat

die Strahlenresis tenz eines Enzyms selektiv erhöht werden k ann. z , B,

Fructose-1.6-dipboapbataae in Gegenwart von Fructoae-1.6-dipbospbat

{Little et al, • 1969} oder Aapartat Transcarbamylase in Gegenwart von

Ca rbamylphoapbat {Kleppe und Spaeren. 1967},

Wiederholt sind Nacheffekte ("after effects"} in bestuhlten -Enzymen

beachrieben worden• d,h, Veränderungen, die erst nach längerer Lage­

rung auftraten oder sich beim Erhitzen des Enzyms beme:dtbar machen ,

Eine weitere AbnaluPe der Aktivität bei der Aufbewahrung ht z.B.

- 27 -

bei trocken beatrahlten Amylaaepräparaten beobachtet worden (Kawa­

shima et ai •• 1973}, Bei bestrahlter Meerrettich-Peroxidase wurden

latente Schäden durch Behandlung mit denaturierenden Reagenzien

O>elincle und Radola. 1974} oder durch Erhitzen festgestellt (De­

lincle et al •• 1973), Die erhöhte Hitzeempfindlichkeit von bestrahl­

ter Mucor pusillus-Proteaae geht aus Abb, 9 hervor, Ähnliche Fest­

stellungen wurden bei Invertase (Bra81D8. 1963; Pauly und Eggert.

1968} und Pektinmetbylesteraae (Delincle. 1970} gemacht,

Zusa111111mfaasend ist zu bemerken. daß es bei einer praktischen An­

wendung der Bestrahlung zur Entkeimung von Enzyqiräparaten in den

meisten Fällen nicht genUgen wird festzustellen. dall das Enzym in

seiner Aktivität nicht (oder um soundsoviel %} beeinträchtigt wurde,

Man wird auch klären mUsaen, ob Nacheffekte auftreten und ob die

Enzymspezifi tll.t und sonstige Eigenschaften verändert wurden,

7, Immobilisierung von Enzymen durch Strahlenpolymeriaation

Die Möglichkeiten der in den Kapite ln 2 und 3 beschriebenen techni­

schen Nutzung von Enzympräparaten haben sich durch die Entwicklung

von ttägergebundenen (immobilisierten} Enzympräparaten enorm gestei ­

gert, Die Enzyme können in dieser Form in kontinuierlichen Prozessen.

z,B, in Säulen. eingesetzt und mehrmals wiederverwendet werden. In

vielen Fällen ist die industrielle Nutzung der Enzyme dadurch erst

wirtschaftlich interessant geworden, Enzyme können auf folgende Weise

immobilisiert werden {Manecke. 1974}:

durch Adsorption auf Oberflächen.

durch Einschluß in vernetzte Gele,

durch Einkapselung in Mikrokapseln.

durch kovalente Bindung an polymere Träger,

Die Methode des Einachluaaes in vernetzte Gele bat den Vortei l • dall

aie keine speziellen funktionellen Gruppen am EnzymmolekUl erfordert

und: •uch mit ungereinigtem Enzym. ja sogar mit dem Kulturmedium

durchgeführt werden kann, Nschteilig war bhher die Notwendigkeit

des Zusatzes von die Vernetzungsreaktionen katalysierenden Subatan­

zen. die unter Umständen zur Inaktivierung des Enzymes führen.

-28 -

Einer kürzlich erschienenen Arbeit japanischer Autoren. in der vou

der erfolgreichen Herstellung strahlenpolymeriaierter Enzymgele

berichtet wird. kommt daher besonderes lntere1Se zu (Kawashima und

Umeda. 1974). Glucoseoxidaae. Invertase. D-Aminosäureoxidase,

Aminoacylase. a- und 8-Amylase. Glucoamylaae. alkalische und neu­

trale Protease wurden durch aerobische Strahlenpolymerisatiou von

Acrylamid immobilisiert. Die verwendete Strahlendosis lag meist

bei 50 krad. Die Autoren nennen folgende Vorteile des Verfahrens:

Keine Enzyminaktivierung durch chemische Katalysatoren;

Gefrorene Lösungen können polymerisiert werden - keine

Inaktivierung durch Polymerisationswärme;

Schwammige und texturierte immobilisierte Enzympräparate

mit groBer Oberfläche können ohne Zusätze von Trägermaterial

in Form von Filmen, Membranen. Beuteln oder Schläuchen ber­

aeeC.l lt: werden;

Die Immobilisierung erfolgt leicht und schnell (4 - 5 min.),

In der Diskussion Uber Möglichkeiten der Bestrahlung von Enzymen

sollte das Thema Strahlenpolymerisation auf alle Fälle mitberück­

sichtigt werden.

8. Vorschläge fUr eine Gemeinschaftsaktion

Es wird vorgeschlagen, daB durch das Büro EURISOTOP folgende Arbeits­

tagungen in Brüssel organisiert werden:

I. Eine Zusammenkunft von Vertretern der Industrie mit Vertretern

der Forschung, in der klargestellt werden soll. wie stark das

Interease der enzymherstellenden und der enzymverwendenden In­

dustrie am Bestrahl1111gsverfahren ist und bei welchen Enzymen

besonderes Interesse besteht.

(Erläuterung: es ist anzunehmen, daB hinsichtlich einiger Enzyme ein

sehr viel stärkeres Interesse besteht als hinsichtlich anderer. Bei

den Amylasepräparaten z.B., die bei fUr mikrobielles Wachstum idealen

- 29 -

Temperaturen tagelang in groBen Reaktoren auf Stärke einwirken. ist

Keimfreiheit viel wichtiger als bei Pektinasepräparaten. die z.B.

Fruchtsäften zugegeben werden. Sobald der Zweck des Zusatzes. die

Klärung des Saftes, erreicht ist, wird durch Erhitzen das Enzym

inaktiviert und zugleich der Saft pasteurisiert).

II. Eine Zusmmnenkuuft von Vertretern der Gesundheitsbehörden mit

Vertretern der Forschung. in der klargestellt werden soll.

welche Möglichkeiten bestehen. Genehmigungen fUr die Enzymbe­

strahluug zu erhalten,

(Erläuterung: die Verwendung bestrahlter Zusatzstoffe, zu denen auch

die Enzyme zählen. in Lebensmitteln und Pharmaka ist verboten, solange

nicht Ausnahmegenehmigungen erteilt wurden, Im Hinblick auf die sehr

geringen Enzymmengen. die den Lebensmitteln zugesetzt werden, muB ge­

prüft werden, ob für die Zulassung bestrahlter Enzyme Tierfütterungs­

versuche, wie sie für bestrahlte Lebensmittel verlangt werden, als

notwendig erachtet werden. Bei bestrahlten immobilisierten Enzymen,

die nicht im Lebensmittel verbleiben und infolgedessen den Verbraucher

nicht erreichen. wäre eine solche Forderung erstrecht unbegründet.

Ohne Klärung dieser rechtlichen Fragen erscheint es nicht sinnvoll,

viel in die wissenschaftlich-technische Weiterentwicklung zu inve­

stieren).

Die Vertreter der nationalen Forsch1111gseinrichtungen sollten aufgrund

der Ergebnisse der Konferenzen I und II prüfen. welche Möglichkeiten

bei ihnen für Forschungs- und Entwicklungsarbeiten auf diesem Gebiet

bestehen. Falls die beiden Konferenzen ein ausreichendes IntereHe

und eine Notwendigkeit für weitere Untersuchungen ergeben haben, sollte

schlieBlich organisiert werden

III. Eine Zusammenkunft von Vertretern der Forschung mit dem Ziel

der Koordinierung der weiteren Untersuchungen.

(Erläuterung: durch diese Koordinierung soll unnötige Doppelarbeit

vermieden md eine möglichst schnelle Klärung der noch offenen Fragen

_ erreicht werden).

- 30 -

9. Bibliographie

ANONYM• 1969

Nucleonics Week, 5. Juni 1969, s. 5

ANONYM• 1972

Chemical Engin. News, 3. Jan. 1972. s. 24

S. BACHMAN. J. GIESZCZYNSKA. A. SZYLKO• 1969

Przemysl Spozywczy ~. 147

Zit. Chem. Abatr. IJ.. (1972) 8511 lz

S. BACHMAN, M. BORKOWSKA. 1972

Rocz. Technol. Chem. Zywn. E • 121

Zit. Nucl. Sei. Abstr. ~ (1974) 26969

W. BECKER und E. PFEIL, 1966

J . Am. Chem. Soc. ~. 4299

R. BRAAMS • 1963

Int. J. Radiat. Biol. !• 297

T. CSERBAn und J. ROLLO. 1974

Gordian !!!.• 257

T. CSERHATI und J. ROLLO, 1972

Nahrung _!!, 431

Gordian J:b 226. 405

W.M. DALE• 1942

Biochem. J . ~. 80

W.M. DALE und C. RUSSELL. 1956

Biochem. J . 62• 50

H. DELINCEE• 1970

Confructa 12.• 366

H. DELINCEE und B.J. RADOLA, 1974

Radiat. Res. 58. 9

H. DELINCEE, B.J. RADOLA. F. DRAWERT. 1973

Acta Aliment. b 259

K.G. DE NOORD, 1972

in: Lebensmittel-Fortschritte in der Verfahrenstechnik der

Lebensmittelverarbeitung

Dechema-Monographien 10. 247

V.H. EDWARDS. 1972

in : Enzyme Engineering. L. B. Wingard, edit.

J. Wiley. New Yotk, s. 343

- 31 -

G.L. FLETCHER UDd S. OKADA• 1955

Nature .!l!.• 882

E. GRAMPP • 1972

in: Lebensmittel-Fortschritte in der Verfahrenstechnik der

Lebensmittelverarbeitung

Dechema Monographien 70• 175

A. GUILBOT• 1972

Ann. Technol. agric. 11... 237

W. HEIMANN

in: Aktuelle Probleme der Lebensmitteltechnologie

z. Emährungswissensch. Suppl. _!!. 16

L.J. HEUSER• C. CRIANG. C.F. ANDERSEN. 1969

u.s. Patent 3 446 705

Zit. Chem. Abstr. l!. (1969) 90049r

J. ROLLO• E. LASZLO• M. TOTR• A. J. WIEG• 1972

in: Lebensmittel-Fortschritte in der Verfahrenstechnik der

Lebensmittelverarbeitung

Dechema-Monographien J.2, 231

K. KAWASHIMA. Y. NANGO• T. DOI, K. UMEDA, 1973

J. Food Sei. Technol. (Tokyo) ~. 9

K. KAWASHIMA und K. UMEDA. 1974

Biotechnol. Bioeng. _!!, 609

K. KAWASRIMA, Y. TANAKA. K. UMEDA, 1974

J. Food Sei. Technol. (Tokyo) 11... 592

F. KIERMEIER, 1972

in: Lebensmittel-Fortschritte in der Verfahrenstechnik der

LebenB111ittelverarbeitung

Dechema-Monographien .!!!• 203

K. KLEPPE und U. SPAEREN. 1967

Biochem. !• 3497

G. KOVACS-PROSZT und T. SANNER. 1973

Radiat. Res. g, 444

R. LANGE, A. PIHL, L. ELDJARN• 1959

Int. J. Radiat. Biol. ! • 73

C •. LITTLE, T. SANNER• A. PIHL. 1969

Biochim. Biophys. Acta~. 83

- 32 -

G. LOTr und H.K. FRANK. 1973

Dtsch. Lebensmittel-Rundsch . ~. 73

G. MANECKE• 1974

Chimia 28. 467

J. MASEK• L. MIKOVA. M. TEPLY. 1971

Prumysl Potravin E• 220

11.. KtlNZN!!R und H. DELINCEE • 197 5

unveröffentlichte Ergebnisse

H. PAULY und C. EGGERT, 1968

Stud. Biophys. l• 31

A. PIHL und T. SANNER, 1963

Radiat. Res. ,!!. 27

W. PILNIK, 1972

in: Lebensmittel-Fortschritte in der Verfahrenstechnik der

Lebensmittelverarbeitung

Dechema-Monographien 12_, 187

B.E. PROCTER und S.A. GOLDBLITH• 1952

Nucleonics .!.Q.. Nr. 4. 64

z. PUHAN• 1973

Lebensm.-Wiss. u. Technol. ~. 195

D.D.Y. RYU und B.K. LEE, 1975

Process Biochemistry .!.Q.. 15

T. SANNER, G. KOVACS-PROSZT, K. VAS, 1972

Radiat. Res. 49, 300

T. SANNER, G. KOVACS-PROSZT, S. WITKOWSKI, 1974

in: Improvement of Food Quality by Irradiation

IAEA, Vienna 1974, S. 101

T. SANNER, A. PIHL, 1969

in: Enzymological Aspects of Food Irradiation

IAEA, Vienna 1969, S.23

s. SCHALTIEL, R. MIZRABI, Y. STIJPP, M, SEU., 1970

Eur. J. Biochem. Ji, 509

T. TOSA, T. MORI• N. FUSE, 1966

Enzymologia 11. 214

- 33 -

H. UHLIG, 1975

Vortrag, 216. Dechema Kolloquium. Frankfurt. 30.1.1975

K. VAS• 1962

Proc. First Int. Congr. Food Sei. Technol. London 1962

Gordon and Bread, New York (1965) 29

K. VAS und G. PROSZT, 1965

Ber, Wissensch.-Techn. Komm. Internat. Fruchtsaft-Union !• 449

K. VAS, 1969

in: Enzymological Aspects of Food Irradiation

Proceedings of a Panel. Int. Atomic Energy Agency, Vienna 1969

K.J.S. VILU.DSEN, 1972

in: Lebensmittel-Fortschritte in der Verfahrenstechnik der

Lebensmittelverarbeitung

Dechema-Monographien 12_, 135

K,H, WALLHÄUSSER, 1971

Chemie-Ing.-Techn. 43, 72

J.R. WHITAKER, 1972

Principles of Enzymology for the Food Sciences

Dekker, New York

L. B. WINGARD, Jr., 1972

Adv. Biochem. Enging • .!_, 1

J, WISMER-PEDERSEN, 1972

in: Lebensmittel-Fortschritte in der Verfahrenstechnik der

Lebensmittelverarbeitung

Dechema-Monographien 70, 215

H.B. VERBEEK, 1975

persönliche Mitteilung

H.U . WOELK, 1973

in: Aktuelle Probleme der Lebensmitteltechnologie

z. Ernährungswissensch. Suppl. J!, 136