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4.1 Proteine als biotechnologische Produkte – Eine Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

4.2 Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

4.3 Proteinstrukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

4.4 Proteinproduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

4.5 Methoden zur Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

4.6 Verifizierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

4.7 Proteinkonservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

4.8 Maßstabsvergrößerung bei der Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

4.9 Analysenmethoden für die Zeit nach der Aufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

4.10 Proteomik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

Übungsaufgaben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

Weiterführende Literatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

Web-Links . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

4

Proteine als Produkte

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

118

Proteine als biotechno-logische Produkte – Eine Einführung 4.1Tropische Regenwälder, die tiefsten Abgründe des

Ozeans, die kochenden Geysire auf Island und die Rie-

senskelette von Walen – sie alle sind Abschnitte an der

wissenschaftlichen Front, an der um ein Verständnis

der Proteine gerungen wird. Proteine sind Makromole-

küle, die für die Struktur, die Funktion und die Regu-

lation jeder einzelnen lebenden Zelle unabdingbar

sind. Jede Proteinsorte erfüllt eine einzigartige Funktion

im biochemischen Reaktionsgeflecht bei der Aufrecht-

erhaltung des Lebens. In dem Maß, in dem die Forscher

die in der Natur vorkommenden Proteine erforschen,

entlocken sie ihr Stück um Stück die Geheimnisse des

Wachstums, der chemischen Zersetzung und den Schutz

vor Krankheit.

Die Anwendungen von Proteinen sind beinahe so

zahlreich wie die Proteine selbst. Betrachten wir bei-

spielsweise das Skelett eines Wals. Im Verlauf seiner

natürlichen Zersetzung nach dem Ableben des Tieres

werden die Knochen regelmäßig von Bakterien besie-

delt, von denen einige sich im Verlauf ihrer Evolution

darauf spezialisiert haben, die Fettbestandteile des Kno-

chengewebes zu verdauen. Die Proteine, die diese Bak-

terien erzeugen, um die Fette und fettähnlichen Mole-

küle abzubauen, sind an das kalte Wasser der Tiefsee

adaptiert. Findigen Forscher ist aufgefallen, dass eine

chemische Substanz mit der Fähigkeit, Fette bei niedri-

gen Temperaturen aufzulösen, einen großartigen Spül-

mittelzusatz ergeben würde.

Selbst wenn ein Protein in der Natur aufgespürt und

eine potenzielle Anwendung für seine physikalisch-che-

mischen Eigenschaften gefunden worden ist, ist noch

eine gehörige Menge Erfindungsreichtum und Können

erforderlich, um das Protein für die geplante Anwen-

dung in hinreichender Menge und Güte zu produzie-

ren. Natürlich können wir uns – wenn wir planen, einen

tollen neuen kaltwassertauglichen Spülmittelzusatz zu

entwickeln – nicht auf einen natürlichen Nachschub

durch Bakterien auf Walskeletten stützen. Wir müs-

sen also eine andere Quelle für solche Proteine finden.

Glücklicherweise ist die Biotechnologie imstande, die

Produktion praktisch jedweden Proteintyps zu ermög-

lichen. In diesem Kapitel werden wir uns auf diese Pro-

teinproduktionsverfahren konzentrieren.

Wir wollen das Kapitel mit einem kurzen Überblick

über die vielen Anwendungsmöglichkeiten von Pro-

teinprodukten in einer Vielzahl von Industriezweigen

Nachdem Sie dieses Kapitel durchgearbeitet haben, sollten Sie in der Lage sein:

� In allgemeinen Begriffen den molekularen Aufbau eines Proteins zu beschreiben.

� Drei Beispiele für medizinische Anwendungen von Proteinen zu geben.

� Die Einsatzgebiete industriell hergestellter Enzyme zu erläutern.

� Gebräuchliche Dinge des alltäglichen Lebens aufzuführen, in denen gezielt hergestellte Protei-

ne als Inhaltsstoffe enthalten sein könnten.

� Die Vor- und Nachteile des Einsatzes von Mikroorganismen, Pilzen, Pflanzen und Tieren für die

Proteinexpression zu benennen und abzuschätzen.

� Zu erklären, warum Escherichia coli so oft für die Proteinproduktion eingesetzt wird.

� Zu erklären, warum die Glykosylierung eines Proteins die Auswahl des Expressionssystems be-

stimmen kann.

� Ein allgemeines Schema für die Aufreinigung des Proteins Hämoglobin anzugeben.

� Zu erklären, wie ein gesuchtes Zielprotein in einer bestimmten Folge von Reinigungsschritten

von allen anderen Zellproteinen abgetrennt wird.

� Die Proteomik und die mutmaßliche Zukunft der Proteinforschung zu erörtern.

4.2 Proteine

119

auf Proteine zurückgegriffen hat. Heutzutage sind jedoch

dank der Biotechnik die Proteinquellen oftmals andere.

Obwohl der Wert von Proteinen für Herstellungsver-

fahren seit langem klar ersichtlich gewesen ist, war man

bis in die 70er-Jahre des 20. Jahrhunderts kaum in der

Lage, dieses Wissen praktisch anzuwenden. Zu dieser Zeit

wurden die Techniken der rekombinanten DNA in ihrer

Grundform entwickelt. Dadurch wurde es nach und nach

möglich, spezifische Proteine auf Bestellung zu pro-

duzieren. Seit der Zeit dieses Umbruchs ist die Pro-

duktion von Proteinen die treibende Kraft für die Ent-

wicklung neuer Produkte und Verfahren in zahlreichen

Industriezweigen (Lebensmittel-, Pharma-) gewesen.

Viele dieser Anwendungen hängen von den Fähigkei-

ten einer Gruppe von Proteinen ab, die Enzyme genannt

werden. Enzyme beschleunigen chemische Reaktionen.

Zahllose Industriezweige sind auf Enzyme angewiesen,

die große Moleküle zu kleineren abbauen – ein Vorgang,

der Depolymerisation genannt wird. Zu diesen Enzy-

men gehören Carbohydrasen (Kohlenhydrate spaltende

Enzyme) wie die Amylasen, die Stärke abbauen, Pro-

teasen, die Eiweiß (= Protein) abbauen, und die Lipasen,

die Lipide (Fette und fettähliche Stoffe) abbauen. Solche

Enzyme (wie das Rennin = Chymosin, ein eiweißspal-

tendes Enzym, das bei der Käseherstellung Verwendung

findet) werden ausgiebig in der Nahrungsmittelindus-

trie sowie in verschiedenen anderen Industriezweigen

eingesetzt (siehe �Abbildung 4.2).

biologischesRohmaterial

Extraktion einer grobgereinigten Protein-

fraktion aus demAusgangsmaterial

Bioreaktor

chromatographi-sche Reinigung(falls erforderlich)

Konzentrierungund ersteReinigungsschritte

Verpackung undEtikettierungdes Endprodukts

Trocknung des Produkts(falls erforderlich

und möglich)

Stabilisierung des End-produkts und Ein- stellen der biologi-

schen Aktivität auf das erforderliche Niveau

WeiterführendeVerarbeitung(„downstreamprocessing”)

Endprodukte

Zellen

Enzyme

Abbildung 4.1: Grundlegende Schritte bei der Bioprozessierung. Eine Aufreinigung kann von einem Rohstoff oder dem Material aus einem Bioreaktoraus erfolgen. Die Schritte jedes Verfahrens müssen für den Einzelfall experimentell ermittelt werden und sind oft von einmaligem, nur für den speziellenFall anwendbarem Charakter (und somit patentierbar).

beginnen. Danach werfen wir einen Blick auf die Prin-

zipien der Strukturbildung von Proteinmolekülen; da-

bei werden wir besonderes Augenmerk auf den Vorgang

der Proteinfaltung lenken. Mit diesem Hintergrund wer-

den wir einige der Kernprobleme bei der Proteinprozes-

sierung beleuchten; dabei beginnen wir mit einer Erör-

terung der Methoden der Proteinexpression. Danach

werden wir lernen, wie Proteine aufgereinigt werden,

und wir werden die Verfahren zur Analyse und Verfi-

zierung des Endproduktes kennen lernen. Obgleich es

keine universelle „beste Methode“ zur Verarbeitung

von Proteinen gibt, stehen mehrere allgemein anwend-

bare Techniken zur Verfügung, die in �Abbildung 4.1

schematisch zusammengefasst sind. In dem vorliegen-

den Kapitel werden wir diesem allgemein gültigen Weg

folgen, wobei wir immer im Hinterkopf behalten wol-

len, dass die spezifischen Einzelheiten von Fall zu Fall

variieren können.

Proteine 4.2Die Verwendung von Proteinen in Fabrikationsprozessen

ist eine althergebrachte Technologie. Das Brauen von Bier

und das Keltern von Wein – zwei der geschichtlich ältes-

ten Verfahren der Nahrungsmittelproduktion – sind ab-

hängig von Proteinen. Die Käseherstellung ist ein weite-

rer Zweig der Lebensmittelindustrie, der schon immer

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

120

Bestimmte Hormone (Peptidhormone), die chemische

Botschaften übermitteln, und Antikörper, die den Kör-

per vor Infektionskrankheiten schützen, sind zwei wei-

tere Gruppen von Proteinen, die kommerziell hergestellt

werden. Dies vollzieht sich in erster Linie in der phar-

mazeutischen Industrie. Hormone finden auch Verwen-

dung in der Landwirtschaft. So können Hormone (auch

wenn diese keine Proteine sind) das Wurzelwachstum

von Stecklingspflanzen anregen und/oder ein rasche-

res Wachstum von Tieren in der Fleischproduktion be-

wirken. (Wir werden den Einsatz von Hormonen in der

Landwirtschaft in weiter reichenden Einzelheiten in

den Kapiteln 6 und 7 erörtern.)

Medizinische Anwendungsgebiete

Die Gesundheits- und die Pharmaindustrie sind durch

die Proteinbiotechnologie wahrhaft revolutioniert wor-

den. Viele Krankheiten – von Volkskrankheiten wie der

Zuckerkrankheit (Diabetes mellitus) bis hin zu seltenen

Erbkrankheiten – können dadurch behandelt werden,

dass man fehlende oder fehlerhafte Proteine von außen

ersetzt. Im Fall der Zuckerkrankheit vom Typ I ist das feh-

lende Protein das Hormon Insulin. Vor nicht allzu langer

Zeit musste das dazu notwendige Insulin aus geschlach-

teten Schweinen oder Kühen isoliert werden. Diese Lö-

sung war jedoch alles andere als ideal, da viele Patien-

ten im Lauf der Zeit eine allergische Reaktion auf das

Fremdeiweiß entwickelten. Man überwand dieses Pro-

blem schließlich, indem man auf eine ungewöhnlich

erscheinende Quelle auswich, das Bakterium Escherichia

coli. Durch die Einpflanzung eines menschlichen Insulin-

gens in die Bakterien verwandelte man diese in mikro-

skopisch kleine Insulinfabriken. Wir werden uns dem

bemerkenswerten Einsatz gentechnisch veränderter Or-

ganismen als Quelle für bestimmte Proteine im weiteren

Verlauf dieses Kapitels noch eingehender zuwenden. Die

zuständige Zulassungsbehörde in den USA erlaubte 1982

die Markteinführung dieses „neuen“ Insulins, welches

dadurch zum ersten zugelassenen gentechnisch herge-

stellten Medikament wurde. Die Möglichkeit, einen prak-

tisch unbegrenzten Nachschub an echtem Humaninsulin

sicherzustellen, hat das Leben und die Gesundheit von

Millionen Menschen verbessern geholfen. Einige wei-

tere pharmazeutische Produkte auf der Grundlage von

Proteinen sind in �Tabelle 4.1 zusammengestellt.

Ein anderes Beispiel für einen potenziellen Einsatz

von Proteinen in der Gesundheitsversorgung ist die Be-

handlung von Patienten, die am Morbus Gaucher leiden.

Bei dieser seltenen Erkrankung führt eine Mutation des

Erbgutes zu einem Anstau von Fetten in den Organen

des Körpers einschließlich des Gehirns. Unbehandelt

führt diese Krankheit für gewöhnlich schon beim Säug-

ling innerhalb des ersten halben Lebensjahres zum Tod.

Die Behandlung durch eine lebenslange Gabe des auf-

grund der Mutation fehlenden Enzyms ist extrem kost-

spielig. Die einzige Quelle für das Protein waren bislang

menschliche Placenten. Von diesen wurden zwischen

400 und 2000 Stück benötigt, um eine einzige Dosis des

Enzyms zu isolieren. Dank der modernen Biotechnolo-

gie ist es vielleicht in naher Zukunft möglich, das En-

zym aus gentechnisch modifizierten Tabakpflanzen zu

gewinnen.

Isolierung der Prochymosin-mRNA Kälberzellen

Biochemische Synthesevon Prochymosin-DNA

Insertion der cDNA ineinen geeigneten Vektor

Expression und Ausscheidung desProchymosins in das Kulturmedium

Überführung des (enzymatisch inaktiven) Prochymosinsin aktives Chymosin bei niedrigem pH-Wert

Einschleusung des Vektorsin einen geeigneten(Mikro-)Organismus

Transkription der mRNA in einecDNA (Reverse Transkriptionmit Reverser Transkriptase)

Ermittlung derAminosäuresequenz des

Prochymosinmoleküls

Aufreinigung des Chymosinsund Herstellung

kommerzieller Produkte

Chymosin

entfernteOberflächen-Glykopeptide

freigelegteCasein-teilchen

Ca2+

Aggregierte Calcium-paracaseinatteilchen in der

geronnenen Milch

Abbildung 4.2: Käseherstellung. Casein, der Hauptbestandteil des Käses,ist das Produkt einer chemischen Umwandlung, die renninabhängig ver-läuft. Das Enzym Rennin wurde über Jahrhunderte hinweg aus der Magen-wand säugender Kälber gewonnen („Labferment“). Heute werden 80% deszur Käseherstellung verwendeten Rennins aus gentechnisch dafür herge-richteten Zellen gewonnen.

4.2 Proteine

121

Die produzierende Industrie profitiert ebenfalls von der

leichten Verfügbarkeit von Proteinen. Proteine verbes-

sern die Eigenschaften von Detergenzien, verbessern die

Fließeigenschaften des Öls bei Bohrungen und helfen,

Kontaktlinsen zu reinigen. Vom Klebstoff bis hin zu Tex-

tilien werden die Produkte des täglichen Lebens durch

industriell erzeugte Proteine verbessert, wie �Tabelle 4.2

verdeutlicht.

Nahrungsmittelverarbeitung

Es lassen sich zahlreiche Beispiele für den industriel-

len Einsatz von Enzymen in jedem Küchenschrank fin-

den. Die Nahrungsmittelindustrie setzt Proteine ein,

um Säuglingsnahrung, Dosenfrüchte, Käse, Backwaren,

Bier, Desserts und diätetische Lebensmittel zu verarbei-

ten und zu verbessern. Die erreichten Verbesserungen

sind ziemlich unterschiedlich.

Bei der Brotherstellung können zugesetzte Enzyme

die Stärke für die Gärorganismen (Hefen, Sauerteigbak-

terien) vorverdauen und so leichter angreifbar machen.

Der Teig geht dann schneller auf. Er lässt sich dadurch

rascher weiterverarbeiten, und die Beschaffenheit des

Brotes wird einheitlicher. Derselbe Laib Brot verdankt

seine appetitliche braune Kruste vielleicht zugesetzten

Enzymen, die Stärkemoleküle zerkleinern und so die

Karamellisierung – die die goldene bis dunkelbraune

Farbe erzeugt – fördern (auch der Zusatz von Keratin in

Form von Haaren ist gesetzlich erlaubt!).

Die Früchte, die man im Joghurt findet, sind fester;

Erfrischungsgetränke erlangen eine höhere Haltbarkeit

und Eiscreme erlangt eine glattere Beschaffenheit so-

wie bessere Gefriereigenschaften – all dies durch den

Zusatz von Proteinen während der Herstellung.

Textilien und Lederwaren

Weitere Beispiele für den industriellen Einsatz von Pro-

teinen finden Sie vermutlich in Ihrem Kleiderschrank.

Seit mehr als einem Jahrhundert verwendet man in der

Textilindustrie Enzyme zum Abbau von Stärke, mit de-

nen man während des Herstellungsprozesses die Tex-

tilien „gestärkt“ hatte. Im Verlauf der letzten 20 Jahre

hat die Entwicklung neuer Produkte durch die Protein-

biotechnologie in dieser Industrie geradezu zu einer

Explosion innovativer Verwendungen geführt.

Tabelle 4.1

Ausgewählte pharmazeutische Produkte auf der Grundlage von Proteinen; die meisten werden in Form rekombinanter Proteine hergestellt

Protein Anwendung

Erythropoietin („Epo“) Behandlung der Anämie

Interleukine 1, 2, 3, 4 Behandlung von Krebs, AIDS, strahlen- oder chemikalieninduzierter Knochen-marksschwäche

Monoklonale Antikörper Behandlung von Krebs, rheumatoider Arthritis (Gelenkrheuma); diagnostischeNachweise

Interferone (a, b, g) Behandlung von Krebs, Allergien, Asthma, Arthritis und Infektionen

Koloniestimulierende Faktoren Behandlung von Krebs, Anämien; Adjuvans in der Chemotherapie von Tumoren;AIDS

Blutgerinnungsfaktoren Behandlung von Hämophilie („Bluterkrankheit“) und verwandten Gerinnungs-störungen

Menschliches Wachstumshormon (hGH) Behandlung von Kleinwüchsigkeit beim Kind; „Doping“ bei Sportlern

Epidermaler Wachstumsfaktor Behandlung von Wunden, Hautgeschwüren, Krebs

Insulin Behandlung der Zuckerkrankheit (Diabetes mellitus, Typ I)

Gewebeplasminogenfaktor Behandlung nach Herzinfarkten und Schlaganfällen (thrombotische Insulte)

Tumornekrosefaktor (TNF) Behandlung von Krebs

Impfstoffe Impfung gegen Hepatitis B (Virus), Malaria (spekulativ), Herpes simplex (Viren)

Insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF) Behandlung von Diabetes mellitus, Typ II („Alterszucker“)

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

122

Enzyme verdrängen auch aggressivere Chemikalien bei

der Bleiche und beim Weichmachen von Fasern und

Geweben. Der Einsatz enzymatischer „Bio“-Bleichmittel

vermindert die Nachfrage nach gewöhnlichen Bleichmit-

teln. Dies erleichtert die nach dem Produktionsprozess

notwendige Abwasserreinigung. Eine weitere Verwen-

dung finden Enzyme beim so genannten Bio-stoning,

bei dem sie den Einsatz vulkanischen Gesteins bei der

Herstellung von „stone-washed“ Jeans überflüssig ma-

chen. Auch hierbei ergibt sich ein Gewinn für die Um-

welt: Für den gesamten Herstellungsprozess ist weniger

Wasser notwendig als früher. Der Endverbraucher ge-

winnt ebenfalls: Da das „Bio-stoning“ weniger belastend

für die Fasern ist als das Waschen mit Steinen, verspricht

die Industrie eine längere Lebensdauer der Produkte

(Änderungen der Mode bleiben natürlich vorbehalten).

Falls Sie unter Ihren Kleidungsstücken solche aus

Wolle haben, sind auch diese vielleicht durch den Ein-

satz von Enzymen aufgebessert worden. Zunächst kann

die Wolle mit Hilfe von Enzymen gereinigt werden

(Wolle muss vor der Weiterverarbeitung entfettet wer-

den). Erstaunlicher ist die Tatsache, dass durch eine en-

zymatische Behandlung verhindert werden kann, dass

Wollstoffe später einlaufen. Außerdem wird das Woll-

gewebe weniger kratzig. Falls Sie Kleidungsstücke oder

Schuhe aus Leder besitzen, so ist das Leder vermutlich

ebenfalls bei seiner Fabrikation mit Enzymen behandelt

worden. Tatsächlich haben bei der Lederherstellung

Proteine immer eine Rolle gespielt, etwa zur Entfernung

von Haaren von den Häuten oder beim Weichmachen

des Materials. Es gab jedoch Raum für Verbesserungen

dieser althergebrachten Technologie. Das heutige Le-

der ist als Folge des Einsatzes biotechnologisch er-

zeugter Proteine weicher, sauberer und fester. Wieder

einmal hat die Industrie von besseren Prozessen, nied-

rigeren Betriebskosten und weniger Umweltverschmut-

zung profitiert.

Der Textilindustrie kommen neben der Bestückung

unserer Kleiderschränke noch andere Aufgaben zu. Nicht-

gewebte Produkte einschließlich von Erdtextilien, die

zur Mulchung, der Erosionskontrolle und beim Straßen-

bau eingesetzt werden, enthalten allesamt Fasern aus

Flachs, Hanf oder Jute, die enzymatisch behandelt wur-

den. Diese Fasern finden auch in den lärmdämmenden

Verkleidungen vieler Automobile Verwendung. Zukünf-

tig werden vielleicht auch die Luftfilter von Automobi-

len aus enzymbehandelten Fasern bestehen.

Oberflächenaktive Substanzen

Wenn Enzyme Präparaten aus oberflächenaktiven Sub-

stanzen (Detergenzien) zugesetzt werden, erlangen die-

se Stoffgemische bessere Reinigungseigenschaften und

sind besser biologisch abbaubar. Waschpulver nutzen

die chemischen Wirkungen von Proteasen, Lipasen und

Amylasen, um Flecken bei niedrigeren Temperaturen

aufzulösen. Enzyme in Waschmitteln sind auch leis-

tungsfähiger geworden, so dass sie unsichtbare Reste

entfernen können, die es den Fasern ermöglichen, schnel-

ler wieder zu beschmutzen. Wenn Sie die Etiketten vie-

ler Fleckentferner lesen, werden Sie sehen, dass Enzy-

me an erster Stelle der aktiven Inhaltsstoffe genannt

werden, machmal als alleinige. Geschirrspülmittel ent-

halten Enzyme, die Proteine und Stärke zersetzen. Ohne

die Enzyme können Beläge und Flecken auf dem Ge-

schirr zurückbleiben.

Papierherstellung undPapierwiederaufarbeitung

Heutige Hochgeschwindigkeitsdruckmaschinen können

langsamer laufen oder ganz zum Stehen kommen, falls

sich Druckerschwärze auf den beweglichen Teilen an-

Tabelle 4.2

Ausgewählte Enzyme und ihreindustriellen Einsatzgebiete

Enzym Einsatzgebiet

Amylasen Stärkeverdau bei Fermentationsvorgän-gen und Verarbeitungsschritten

Proteasen Proteinabbau in Waschmitteln, bei der Lederherstellung, in der Lebensmittel-wirtschaft (Fleisch, Käse, Bier, Brot);Verdauungshilfen für Tiere einschließlichdes Menschen

Lipasen Lipidspaltung in Milchprodukten undPflanzenölprodukten

Pektinasen Abbau von Zellwandmaterial in Frucht-säften (Klärung des Trubs), Papierher-stellung (Pulpeverarbeitung)

Lactasen Verdau von Milchzucker (z.B. für „Katzenmilch“)

Glucose- Herstellung von fruktosereichen Sirupenisomerase

Cellulasen/ Herstellung von Tierfutter, Fruchtsäften Hemicellulasen (Klärung), Brauwesen

Penicillinacylase Penicillinherstellung

4.2 Proteine

123

sammelt. Proteinhaltige Produkte sind in der Lage, die

klebrige Masse zu entfernen, so dass die Fabrik weiter

„brummen“ kann. Proteinhaltige Produkte haben die

Umweltbelastungen durch die Papierindustrie (die sehr

viel Wasser verbraucht) reduziert. In der Vergangenheit

wurde zur Aufhellung der Papiergrundmasse mit Chlor

gebleicht. Heute verrichten Enzyme dieselbe Aufgabe

bei stark herabgesetzter Umweltbelastung. Die Papier-

wiederverwertung ist ein weiterer Bereich, in dem En-

zyme eine wichtige Rolle spielen. „Büropapier“ muss

beispielsweise von Tinte und Druckerschwärze befreit

werden; diese Vorgänge können durch Enzyme verein-

facht werden. Ein Ergebnis ist eine größere Nachfrage

nach „Recyclingpapier“.

Natürliche Klebstoffe

Falls Sie jemals versucht haben, eine Muschel oder

eine Entenmuschel von einem Stein in der Gezeiten-

zone abzulösen, sind Sie Zeuge der ausgezeichneten

Leistungsfähigkeit von Proteinklebstoffen in der freien

Natur geworden. Der wasserfeste Klebstoff, der fest-

sitzende Muscheln an ihr Substrat bindet, besteht aus

mehreren Sorten von Proteinen. Natürliche Proteinkleb-

stoffe sind von hoher Festigkeit und wasserunlöslich,

was sie attraktiv für vielerlei biotechnologische An-

wendungen macht. Ein wichtiges Beispiel tritt auf dem

Feld der Medizin auf. Da diese Klebstoffe ungiftig und

biologisch abbaubar sind und nur selten eine allergi-

sche Reaktion des Immunsystems hervorrufen, können

sie eingesetzt werden, um abgerissene Sehnen wieder

zu befestigen, Platzwunden zu kleben, Löcher in Zäh-

nen zu füllen und gebrochene Knochen wieder zu ver-

leimen. Die Forschung über natürliche Klebstoffe mag

noch anderen Nutzen zeitigen. Die Schiffsreeder wer-

den vom Problem der biogenen Korrosion geplagt, das

entsteht, wenn sich Muscheln und andere Weichtiere

an Schiffsrümpfe und andere Unterwassergerätschaf-

ten und -bauten heften. In dem Maß, in dem die Wis-

senschaft die von diesen Wasserbewohnern erzeugten

Klebstoffe besser versteht, ergibt sich vielleicht ein Weg,

dieses Problem umweltfreundlich zu bekämpfen, zum

Beispiel durch die Entdeckung eines biologisch abbau-

baren Hemmstoffes – eine weitere Gelegenheit für die

Proteinbiotechnologie, eine Lösung für ein kommerzi-

ell wie ökologisch bedeutendes Problem zu liefern.

Biologische Umweltsanierung: Die Behandlung von Umweltverschmut-zungen mit Proteinen

Jenseits der Verminderung des Ausstoßes an die Umwelt

belastenden Abfällen bei industriellen Herstellungs-

prozessen können Proteine darüber hinaus auch dazu

eingesetzt werden, schädliche Abfälle aufzuarbeiten. Or-

ganische Abfälle aus Mastbetrieben, Haushalten und Fa-

briken stellen eine immer weiter wachsende Gefahr für

die Umwelt dar – insbesondere für aquatische Ökosyste-

me. Enzyme können eingesetzt werden, um solche orga-

nischen Abfälle abzubauen, bevor sie zu Problemen wer-

den. Sie können sogar Enzymen dafür danken, dass sie

helfen, die Fettauffangbehälter Ihres örtlichen Schnell-

imbissladens zu reinigen.

Eine weitere vielversprechende neue Anwendung

für Proteine ist die Neutralisierung schwermetallhalti-

ger Abfälle, die beispielsweise Quecksilber oder Cad-

mium enthalten. Diese giftigen Elemente sind in der

Umwelt stabil, können sich anreichern und über die

Nahrungskette in Lebewesen einwandern. Da es sich

um chemische Elemente handelt, widerstehen sie na-

türlich jedem enzymatischen Abbau, doch bedeutet

dies nicht, dass man nicht mit der Hilfe von Proteinen

gegen sie vorgehen kann. Durch biotechnische Eingrif-

fe kann man Mikroorganismen erschaffen, die auf der

Zelloberfläche einen Überzug aus Metallothioneinen

besitzen. Metallothioneine sind Proteine mit stark ent-

wickelten metallbindenden Eigenschaften. In diesem Fall

wird der kontaminierende Stoff nicht freigelegt oder ab-

gebaut, sondern durch Festlegen un- oder doch weniger

schädlich gemacht. Falls giftige Metalle auf diese Weise

an Bakterienzellen gebunden sind, ist die Wahrschein-

lichkeit geringer, dass sie von Pflanzen und/oder Tieren

aufgenommen werden.

Augenblicklich sind Forscher damit beschäftigt, die

Gentechnik einzusetzen, um neue und bessere biologi-

sche „Werkzeuge“ zu erfinden, mit deren Hilfe man gif-

tige Stoffe angreifen und zerstören kann. Da dieser For-

schungsansatz sich darauf stützt, manchmal Gene in den

Bakterien in zufälliger Weise zu vermischen, können

die dabei aus den umgelagerten Genen entstehenden En-

zyme aktiver oder weniger aktiv als ihre durch natürliche

Selektion evolvierten sein. In gewisser Weise beschleuni-

gen also die Wissenschaftler bloß die Vorgänge der zufäl-

ligen Mutationen und der Selektion, indem sie die Mu-

tationsrate erhöhen und anstelle der natürlichen die

künstliche (durch den Menschen erfolgende) Selektion

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

124

setzen. Dies geschieht mit der Hoffnung, dabei neue,

effizientere Schadstoffe umsetzende Proteine zu ent-

decken. Wir werden dies in Abbildung 4.5 vertiefen.

Proteinstrukturen 4.3In Kapitel 2 haben wir die Rolle der Ribonucleinsäuren

(RNA) bei der biogenen Proteinsynthese diskutiert. Wir

haben gelernt, dass die Ribosomen die Proteinfabriken

lebender Zellen sind. Um den Vorgang der Expression

und Ernte von Proteinen in der Biotechnologie besser

verstehen zu können, müssen wir einen tieferen Blick

auf die Molekülstrukturen von Proteinen werfen.

Proteine sind äußerst komplex gebaute Moleküle, die

aus Ketten von Aminosäureresten bestehen. Wie alle Mo-

leküle besitzen auch die Proteine kennzeichnende Mol-

massen. Sie weisen außerdem fast immer eine elektrische

Nettoladung auf, die eine der Ursachen für die Wechsel-

wirkungen mit anderen Molekülen oder Atomen ist. Die-

se Fähigkeit zur gezielten Wechselwirkung ist der Schlüs-

sel zur biologischen Aktivität von Proteinen. Machen Sie

sich beispielsweise klar, wie die Molekülstruktur und die

elektrische Ladung eines Aminosäuremoleküls dessen

Wechselwirkungen mit Wassermolekülen beeinflusst:

Das Molekül kann entweder hydrophil (wasserliebend)

oder hydrophob (wasserabweisend) sein. Im ersten Fall

gibt es eine Attraktion zwischen der Aminosäure und

dem Wasser, im zweiten Fall stoßen sich die Wasser-

moleküle und das Aminosäuremolekül gegenseitig ab.

Strukturelle Anordnung

Proteine weisen vier Ebenen des strukturellen Baus auf,

die in letzter Konsequenz alle von der Abfolge der chemi-

schen und physikalischen Eigenschaften der beteiligten

Aminnosäurereste abhängen. �Abbildung 4.3 illustriert

die vier Strukturebenen dieser Makromoleküle.

Primärstruktur

Die 20 verschiedenen proteinogenen Aminosäuren sind

die Bausteine, aus denen sich Proteine aufbauen. Bis

zu 10000 Aminosäurereste können in einer „Kopf-an-

Schwanz“-Abfolge zusammengeknüpft sein. Die Abfol-

ge – die Sequenz – der Aminosäurereste wird als die Pri-

märstruktur des Proteins bezeichnet. Die Abänderung

eines einzigen Aminosäurerestes in der Primärstruktur

kann zum vollständigen Verlust der Funktion des Prote-

ins führen. Erbkrankheiten sind oft die Folge von Muta-

tionen in den proteincodierenden Bereichen von Genen.

Sekundärstruktur

Die Sekundärstrukturelemente der Konformation eines

Proteins bilden sich aus, wenn sich die Aminosäurekette

an bestimmten Punkten oder Abschnitten in einer regel-

mäßigen Weise zusammenlegt. Die beiden häufigsten Se-

kundärstrukturbildungen sind die alpha-Helix (a-Helix)

und das beta-Faltblatt (b-Faltblatt). Sie werden im Detail

im Abschnitt über die Proteinfaltung beschrieben. So-

wohl die Helix- als auch die „Blatt“strukturen kommen

zustande, weil sie die stabilsten Konformationen sind,

die die Molekülkette in diesen Bereichen lokal einneh-

men kann. Es sind dies also Konformationen geringster

potenzieller Energie.

Einigen Abschätzungen zufolge kostet es bis zu 450 Millio-nen Euro, ein Medikament (Protein) auf den Markt zu brin-gen. In diesen Durchschnittswert fließen die Entwicklungs-kosten für solche Wirkstoffe und Medikamente mit ein, diees infolge von Nebenwirkungen oder Wirkungslosigkeit nichtbis zur Marktreife schaffen.

Für gewöhnlich ist der Fertigungs- und Aufreinigungs-prozess weitgehend entwickelt und der Stoff befindet sichin der Erprobung am Menschen, wenn dieser Fall eintritt.Obwohl sich alle über die hohen Kosten für Medikamentebeschweren, macht man sich oft nicht klar, dass in die End-preise die vergeblichen Investitionen in Produkte einflie-

S I E E N T S C H E I D E N !

� Die Suche nach dem besten Produkt: Wer bezahlt?

ßen, die es nicht bis zur Marktreife schaffen. Falls wir dieFähigkeit, zu ermitteln, welches Medikament am besten füreinen bestimmten Patienten ist (Pharmakogenetik, Kapitel 1),zu den Entwicklungskosten hinzuaddieren, steigen die Auf-wendungen noch weiter an.

Da die Biotechnologiefirmen gehalten sind, für ihre Ak-tionäre Profit zu erwirtschaften, zahlt es sich für ein Unter-nehmen aus, wenn jederman sein Medikament kauft – sogarwenn das Medikament nicht ganz und gar für ihn oder siegeeignet ist. Was ist Ihrer Meinung nach die beste Lösung:Höhere Preise und bessere Medikamente oder niedrigere Prei-se für solche, die nicht immer helfen?

4.3 Proteinstrukturen

125

Tertiärstruktur

Die Tertiärstruktur beschreibt die gesamte Raumstruk-

tur einer Polypeptidkette, die sich aus den Elementen

der Sekundärstruktur und deren räumlicher Lage rela-

tiv zueinander ergibt. Die Tertiärstruktur gibt also die

Ausrichtung der Sekundärstrukturbereiche zueinander

wieder. Als Beispiel sei das Pflanzenenzym Ribulose-

bisophosphatcarboxylase (Rubisco) genannt, das eine

wichtige Rolle im Rahmen der Photosynthese der Pflan-

zen spielt. Ohne dieses Enzym könnten die Pflanzen

nicht existieren und die Erde sähe erheblich anders aus.

Quartärstruktur

Eine Quartärstruktur bilden solche Proteine aus, die

aus mehreren Polypeptidketten bestehen. Die Quartär-

struktur beschreibt die Lage der das Protein konstitu-

ierenden Polypeptide. Hämoglobin, das Sauerstoff trans-

portierende Protein des Blutes, ist ein Beispiel für ein

Protein mit Quartärstruktur. Hämoglobin besteht aus

vier Polypeptidketten. Die einzelnen Polypeptidketten

werden als Untereinheiten bezeichnet. Jede Unterein-

heit besitzt eine eigenständige Tertiärstruktur.

Proteinfaltung

Alles, was in Bezug auf ein Protein von Bedeutung ist –

seine Raumstruktur, seine Funktion –, hängt von der

Faltung der Polypeptidkette ab, also von der Art und

Weise, wie sich die Kette der Aminosäurereste zusam-

menknäuelt. Falls die Molekülkette sich auf nicht kor-

rekte Weise zusammenlegt, wird vermutlich nicht nur

die Funktion des Proteins verlorengehen, fehlgefaltete

Proteine können sich sogar als schädlich für den Orga-

nismus erweisen, falls sie sich in den Zellen ansam-

meln. Beispiele hierfür sind, wie jüngere Forschungen

ergeben haben, degenerative Hirnkrankheiten wie die

Alzheimer’sche Krankheit oder der Rinderwahnsinn

BSE, bei denen sich die Krankheit wahrscheinlich als

Folge von Fehlern bei der Proteinfaltung ergibt. Die

Erbkrankheit Mukoviszidose (auch zystische Fibrose ge-

nannt), manche Krebsformen und selbst Herzkrankhei-

ten sollen ursächlich mit der Anhäufung fehlgefalteter

Proteine in Zusammenhang stehen. Da sogar die native

Faltung von Proteinen mit Problemen behaftet ist, ist

leicht verständlich, dass eine der größten Herausforde-

rungen der Biotechnologie darin besteht, die Faltung von

Proteinmolekülen zu verstehen und schließlich kontrol-

lieren zu können.

Der erste entscheidende Durchbruch auf dem Weg zu

einem Verständnis der außerordentlich komplizierten

Molekülstrukturen von Proteinen ergab sich im Jahr

1951. Damals wurden zwei regelmäßige, periodische

Strukturtypen beschrieben, die als a (alpha) und b (beta)

bezeichnet wurden und die die häufigsten Ergebnisse

von Proteinfaltungsvorgängen sind. Beide Konforma-

tionstypen hängen von der Ausbildung von Wasser-

stoffbrückenbindungen ab.

Eine kurze chemische Rückblende

Ein Wasserstoffatom ist das einfachste Atom; es besteht

aus einem Proton als Atomkern, das von einem einzigen

Elektron umkreist wird. Stickstoff- und Sauerstoffatome

sind beides „elektronenhungrige“ Gebilde. Wenn die

Atome dieser beiden Elemente mit Wasserstoffatomen

in Kontakt kommen, ziehen sie die Elektronenwolke des

Wasserstoffatoms zu sich herüber, so dass der Atomrumpf

positiv polarisiert wird. Wenn das positiv polarisierte

H-Atom in die Nähe eines anderen, negativ polarisierten

Atoms kommt, kommt es zu einer anziehenden elektro-

statischen Wechselwirkung. Diese Anziehung wird als

Wasserstoffbrückenbindung bezeichnet.

Die Sekundärstruktur eines Proteinsbildet sich aus, wenn Teile der Poly-peptidkette sich zu einer geordnetenStruktur zusammenlegen, die durchschwache Wechselwirkungen wieWasserstoffbrückenbindungenzusammengehalten wird.

Die Primärstruktur eines Proteinsist die Abfolge (Sequenz) derAminosäuren in der Molekülkette.

Die Tertiärstruktur eines Proteinsbildet sich aus, wenn sich dieSekundärstrukturbereiche in einerfür den Proteintyp charakteristischenund für die Funktion notwendigenArt und Weise räumlich arrangieren.

Die Quartärstruktur eines Proteinsbildet sich durch die nichtkovalenteZusammenlagerung mehrerer Poly-peptidketten zu einem aus mehrerenUntereinheiten bestehendenGesamtproteinmolekül.

Amino-säuren

Beta-faltblatt(b-Falt-blatt)

Alpha-helix(a-Helix)

a-Helix

b-Faltblatt

Abbildung 4.3: Die vier Ebenen der Proteinstruktur. Die richtige Faltungvon Proteinmolekülen ist eine notwendige Voraussetzung für die Erlangungder vollen funktionellen Leistungsfähigkeit. Aufreinigungsmethoden müs-sen sicherstellen, dass der korrekte Faltungszustand erhalten bleibt.

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

126

Bei einer alphahelikalen Anordnung bilden die Amino-

säurereste eine rechtsgängige Spirale aus. Die Was-

serstoffbrücken stabilisieren diese Struktur, indem sie

Stickstoff- und/oder Sauerstoffatome unterschiedlicher

Aminosäurereste miteinander durch die verbrückenden

H-Atome verbinden. Da diese Verbrückungen in regel-

mäßigen Abständen anzutreffen sind, bildet sich die

Spiralstruktur der a-Helix aus.

Im Fall des b-Faltblatts verbinden die Brückenwas-

serstoffatome ebenfalls Stickstoff- und Sauerstoffatome.

Da jedoch bei dieser Anordnung die Atome der Amino-

säurereste Seite an Seite aneinanderliegen, bildet sich

eine leicht gefältelte, flächige Gesamtstruktur aus. Die

Stränge dieser „Blätter“ können entweder parallel (die

durch H-Brücken verbundenen Abschnitte laufen in die

gleiche Richtung) zueinander oder antiparallel zueinan-

der (die durch H-Brücken verbundenen Abschnitte lau-

fen in entgegengesetzte Richtungen) liegen. Ein weiteres

grundlegendes Element von Proteinmolekülstrukturen

ist die Haarnadelkurve (auch b-Haarnadel genannt).

Es wird ausgebildet, wenn die Aminosäurekette einen

scharfen Knick macht, um in Form eines antiparalle-

len b-Faltblatts in Gegenrichtung an sich selbst zurück-

zulaufen. Obwohl sie nicht wirklich vollkommen zu-

fällige Bildungen sind, werden andere Anordnungen

als Zufallsknäuel bezeichnet. Vielleicht wäre es besser,

sie als nichtperiodische Knäuel zu bezeichnen, aber der

Begriff Zufallsknäuel hat sich etabliert.

Egal, welche Struktur das Protein einnimmt, es ist

wichtig, sich immer daran zu erinnern, dass es sich um

fragile Gebilde handelt. Wasserstoffbrückenbindungen

lassen sich leicht – mit wenig Energieaufwand – auflö-

sen. Ein vielleicht wertvolles Protein büßt mit der Ge-

stalt seine einzigartige Funktion ein.

Glykosylierung

Nachdem ein Protein von einem Ribosom synthetisiert

worden ist, können nachfolgend über hundert verschie-

dene posttranslationale Modifikationen stattfinden,

die die biologische Aktivität oder den Aufenthaltsort

des fertigen Proteins beeinflussen. Bei der Glykosylie-

rung („Verzuckerung“) eines Proteins werden Kohlen-

hydratmoleküle an bestimmten Stellen kovalent an die

Polypeptidkette angeknüpft (�Abbildung 4.4). Die Än-

derungen können profunde Wirkungen auf die Aktivität

eines Proteins haben: Die Löslichkeit kann erhöht sein,

die Ausrichtung in der Membran kann dadurch festge-

legt werden, der Endpunkt des intrazellulären Trans-

ports wird festgelegt, oder die Halbwertszeit des Pro-

teins im Organismus wird beeinflusst. Die Glykosylie-

rung erfolgt im endoplasmatischen Retikulum und wird

gegebenenfalls im Golgi-Apparat der Zelle erweitert. Die

Proteinglykosylierung ist daher auf eukaryontische Zel-

len, die diese Organellen beherbergen, beschränkt (Bak-

terien besitzen weder Golgi-Apparat noch ER). Da die

Glykosylierung Einfluss auf die biologische Aktivität

eines Proteins ausüben kann, wird die Auswahl mögli-

cher Expressionssysteme durch die Frage, ob eine Gly-

kosylierung stattfindet, mitbestimmt.

Protein-„Engineering“

Manchmal ist es von Nutzen, spezifische, vorherbestimm-

te Änderungen an der Aminosäurefolge eines Proteins

vorzunehmen. Dies kann durch ortspezifische Mutation

oder in einer für die Biotechnologie besonders interes-

santen Strategie, durch gerichtete Evolution, geschehen.

Dazu induziert man – anders als bei der gerichteten Mu-

tation – zufällige Mutationen und selektiert aus dem

erhaltenen Mutantenspektrum auf solche mutantenpro-

teine-exprimierende Stämme, die Proteine mit den ge-

wünschten Änderungen der Aktivität, Spezifität, Sta-

bilität u.a.m. hervorbringen. Man hat mit Hilfe dieser

Strategie beispielsweise Lebewesen evolviert, die in der

Lage sind, eine Cyanidionenkonzentration von 1 M und

mehr auszuhalten.

Abbildung 4.4: Raumstruktur eines Proteins mit Glykosidseitenketten.Die Glykosylierung von Proteinen findet in eukaryontischen Zellen statt undbeeinflusst dessen Transport innerhalb der Zelle und vermutlich auch dieHalbwertszeit eines Proteins.

4.4 Proteinproduktion

127

Der Vorteil der gerichteten Evolution – die nichts wei-

ter ist eine forcierte Form der konventionellen Züch-

tung – gegenüber der natürlichen Selektion besteht in

der Beschleunigung der Vorgänge durch den Eingriff des

Forschers. Die ortsspezifische, gerichtete Mutation ist

die Einführung gezielter Änderungen der Nucleotidfol-

ge eines bestimmten Gens (Mutation und Selektion sind

gerichtet). Bei der gerichteten Evolution erfolgt die Mu-

tation in zufälliger Weise, nur die Selektion ist – vorge-

geben durch die Wünsche des ausführenden Experimen-

tators – gerichtet (�Abbildung 4.5).

Nachdem das mutierte Gen in eine Wirtszelle ein-

geschleust worden ist, wird diese das Gen zur Expres-

sion bringen. Falls das neue Genprodukt stabil ist, lässt

es sich mit einigem Geschick isolieren. Diese Vorgehens-

weise erlaubt es Forschern, Proteine mit veränderten

Eigenschaften zu kreieren. Anders als bei der natürli-

chen Selektion wirkt bei der gerichteten Evolution im

Labor der Forscher als Selektionsfaktor, der eine Ent-

scheidung trifft, bei der ein mit der Mutation verbunde-

ner Selektionsvorteil für den betroffenen Organismus in

einer natürlichen Umgebung natürlich vollkommen ir-

relevant ist. Das Labor ist die Umwelt, und der Mensch

ist die selektive Instanz. So können auch solche Muta-

tionen überdauern, die für die Reproduktionsfähigkeit

des Lebewesens nachteilig sind und in der Natur schnell

ausselektiert werden würden. Werden beispielsweise

Bakterien gezwungen, Insulin herzustellen, hat das na-

türlich keinen unmittelbaren Nutzen für das Funktio-

nieren der Zelle. Die Produktion des Fremdproteins ist

aber in der Laborumwelt ein sehr starker Selektionsvor-

teil, da jede Zelle, die dieses Merkmal nicht trägt, vom

Forscher aus dem Evolutionsprozess entfernt wird. Der

gerichtete Evolutionsprozess funktioniert also ganz ge-

nauso wie die natürliche Evolution in der freien Natur,

nur sind die Verhältnisse überschaubarer und das Evo-

lutionsziel ist festgelegt. Es ist diese Vorgabe des Evolu-

tionsziels, die den einzigen und entscheidenden Unter-

schied zur ungerichteten Evolution der Lebewesen durch

natürliche Selektion in der Natur darstellt. Beachten

Sie aber, dass ähnlich subjektive und individuelle Se-

lektionskriterien auch bei der sexuellen Selektion in der

Natur am Werk sind. Der Unterschied schrumpft damit

auf den Vorsatz bei der gerichteten Evolution im Labor

zusammen.

Über die in der Natur vorkommenden und vorsätz-

lich mutativ veränderten Proteine hinaus ist die mo-

derne Molekularbiologie in der Lage, völlig neuartige

Proteinsorten zu kreieren. Auch in der Natur gibt es

Vorbilder für solche Vorgänge: Fusionsprotein durch il-

legitime Rekombination („Exon-shuffling“ u.Ä.). Diese

neuen Proteinsorten, die im Labor erdacht und erschaf-

fen werden, legen die Vermutung nahe, dass es möglich

sein sollte, Proteine zu „erfinden“, die für bestimmte bio-

technologische Anwendungen maßgeschneidert sind.

Proteinproduktion 4.4An diesem Punkt unseres Streifzuges angelangt sollte

Folgendes klar ersichtlich geworden sein: Über ihren

Wert als biotechnologische Produkte hinaus sind Pro-

teine komplexe und oftmals fragile Produkte. Mit die-

ser Erkenntnis als Ausgangspunkt wollen wir die rea-

le Arbeit eines Biotechnologen bei der Herstellung von

Proteinen näher betrachten.

Bei der Herstellung eines Proteins kann man zwei

wesentliche Phasen unterscheiden. Aus Gründen der

Anschauung wollen wir diese beiden Phasen als die

stromaufwärts stattfindenden Vorgänge (upstream pro-

cessing) und die stromabwärts stattfindenden Vorgänge

(downstream procesing) bezeichnen. Das upstream pro-

cessing umfasst die eigentliche Herstellung der Proteine

in den Zellen. Im Verlauf des downstream processing

werden die Zielproteine von den übrigen Zellbestand-

teilen, einschließlich aller anderer Proteine, abgetrennt.

Dann müssen der Reinheitsgrad und die biologische Ak-

tivität der Proteinpräparation ermittelt werden. Schließ-

Sammlung von Starterzellen/über-lebenden Zellen

induzierte Mutationen

Sammlung durchmusterter„Überlebender“

Filter 1

Filter 2

Filter 3

Filter 4

Abbildung 4.5: Gerichtete Molekülevolution. Gene, die für wertvolle Pro-teine codieren, werden einer absichtlichen Mutation unterworfen. DieserVorgang erzeugt eine verzweigte Gruppe verwandter neuer Gensequen-zen. Die Genprodukte der mutierten Gene müssen eines nach dem ande-ren auf ihre Eigenschaften hin untersucht werden. Nachdem eine messba-re Verbesserung im Sinne des gesteckten Zieles erreicht worden ist, kannder Vorgang wiederholt werden, bis ein Maximalwert erreicht ist (weitereVeränderungen führen dann in allen Fällen wieder zu Verschlechterungen).

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

128

M E T H O D E N

� Die Zusammenfügung des menschlichen Proteoms

Proteome – die Gesamtheiten aller Proteine, die von be-stimmten Organismen, Organen oder Zellen hergestellt wer-den – sind nach der Sequenzierung des Humangenoms undanderer Genome immer mehr in den Brennpunkt des Inter-esses gerückt. Wie schon verschiedentlich erwähnt, belaufensich die Kosten für die Entwicklung eines Medikamentesbis zur Marktreife auf durchschnittlich etwa 450 MillionenEuro, die dafür benötigte Zeit beläuft sich auf fünf bis achtJahre. Da die meisten von der biotechnologischen Industriehergestellten Medikamentenwirkstoffe Proteine sind (z.B.Wachstumsfaktoren, Antikörper, Hormone), die fehlende odernicht ordnungsgemäß funktionierende Proteine des Körpersersetzen, haben diese Firmen ein ausgeprägtes Interesse anEntwicklung und Einsatz von Proteinmikrochips gezeigt.Ähnlich wie die schon diskutierten DNA-Mikrochips dienendiese Miniaturgeräte zum Aufspüren von Proteinen, die inihrer Menge oder Form auf Krankheitsprozesse hindeuten.In ihrer Frühzeit waren diese Biochips (Mircroarrays) auchdafür vorgesehen, die Vorhaben biotechnologischer Unter-nehmen zur Entwicklung von Proteinen als Substitutions-therapie zu evaluieren, bevor große Mengen an Geld undZeit aufgewendet werden.

Proteinchips haben viele Vorzüge. Da die Zahl der imRahmen des Humangenomprojekts entdeckten Gene hin-ter der Erwartung zurückgeblieben ist, nehmen manche, diean ihren Ursprungsschätzungen hängen, an, dass viele Genemehr als ein Genprodukt hervorbringen, obwohl ein expe-rimentelles Fundament für die Erhärtung dieser Spekula-tion bislang gänzlich fehlt (wir haben in Kapitel 3 erörtert,wie ein Gen mehr als ein Genprodukt hervorzubringen ver-mag). Die meisten heute eingesetzten Wirkstoffe wirken aufder Ebene der Proteine, indem sie mit Rezeptoren wechsel-wirken (dasjenige Protein, an dem ein Wirkstoff seine Wir-kung entfaltet, ist dann der Rezeptor für diesen Stoff), diedann ihrerseits irgendwelche Vorgänge im Körper in Gangsetzen.

Dabei spielen dann oft noch andere Proteine eine Rolle.Wir alle haben schon von Proteinen profitiert, die das Im-munsystem als fremd erkennt und die es angeregt haben,Abwehrmaßnahmen gegen bestimmte Infektionen zu tref-fen – die Rede ist von Impfungen. Proteinstrukturelle Diffe-

renzen machen sie schwieriger zu entdecken als unterschied-liche DNA-Moleküle.

Neben der Tatsache, dass es mehr unterschiedliche Pro-teine als Gene gibt, haben Proteine einen breiten Bereich vonKonzentrationen (von Pikogramm bis Mikrogramm) im Kör-per. Wie früher in diesem Kapitel erörtert, haben Proteinedrastisch unterschiedliche chemische Eigenschaften infolgeder Typen und Mengen der verschiedenen Arten von Amino-säuren. Da die Form jedes Proteins für gewöhnlich seineFunktion bestimmt (oder Nichtfunktion), sind Proteine auchempfindlicher für strukturelle Änderung als DNA. Falls wirBiochips entwickeln sollen, die unterschiedliche Proteinein unterschiedlichen Mengen detektieren, müssen alle die-se Faktoren in die Betrachtung einbezogen werden.

Biochips können aus Glasplättchen aufgebaut sein, diemit einem Stoff überzogen sind, der Proteine an sich bin-det. Für gewöhnlich haben diese Glasplättchen einen ange-hefteten Antikörper, der für das zu detektierende Protein spe-zifisch ist, sowie einen Signalisierungsmechanismus, deranzeigt, das ein Einfang stattgefunden hat. Die Firma Cam-bridge Antibody Technology in England hat eine Antikör-perbibliothek von über 100 Milliarden Antikörpern, die ausdem Blut gesunder Personen gesammelt wurden. Die FirmaPackard BioScience (USA) hat Glasträger entwickelt, die mitAcrylamid beschichtet sind, und die es erlauben, dass dieangeknüpften Proteine ihre Raumstruktur beibehalten, wäh-rend sie gleichzeitig in das Beschichtungsmaterial einge-bettet sind. Die Auftragung der Flüssigkeiten, die detektiertwerden sollen, gründet sich auf die Tintenstrahltechnik undhat bis 2004 etwa 20000 Punkte pro Standardmikroskopob-jektträger erreicht. Schließlich hat die Firma Ciphergen Bio-systems (USA) die Massenspektrometrie adaptiert, um einerasche Auf-dem-Chip-Trennung, -Detektion und -Analysevon Proteinen unmittelbar aus biologischem Probenmate-rial zu erreichen. Was gibt es also noch zu tun?

Wie wir in Kapitel 11 lernen werden, harren noch zahl-lose Proteine aus zahlreichen Krankheitszuständen der Ent-deckung. Die Fähigkeit zur chemischen Diagnose einer Krank-heit und die Festlegung der effektivsten Behandlung wirddavon abhängen, ob es gelingt, Proteine aufzureinigen undAntikörper zu entwickeln, die mit Krankheit verwandt sind.

lich muss eine geeignete Form der Lagerung unter Er-

haltung der Funktion für das Protein gefunden werden.

All dies ist ein langwieriger und steiniger Weg, und

an jedem Punkt gibt eine Auswahl von Methoden, aus

denen jeweils die am besten geeignete gewählt werden

muss. Experten in dieser Disziplin beschreiben die Auf-

gabe oder besser Herausforderung im besten Fall als

anstrengende Arbeit, im schlimmsten Fall als nerven-

aufreibend und auszehrend. Doch am Ende stellt sich

eine Belohnung ein. Gelingt es, ein erfolgreiches Sys-

tem für die Produktion des gewünschten Proteins auf-

zubauen, wiegen die Ergebnisse den Ärger und die An-

strengung auf.

Bevor wir uns mit den Einzelheiten der Proteinauf-

arbeitung auseinandersetzen wollen, müssen wir uns

mit den Entscheidungen befassen, die während der

Phase des upstream processing zu fällen sind. Die dort

gefällten Entscheidungen können nachfolgende Arbeits-

4.4 Proteinproduktion

129

schritte erleichtern oder erschweren. Der Entwurf des Ge-

samtprozesses macht ein Verständnis beider Phasen des

Vorgangs notwendig.

Proteinexpression: Die erste Phase derProteinverarbeitung

Wir werden damit beginnen, einen Blick auf die erste

Entscheidung zu werfen, die beim upstream processing

zu fällen ist, der Auswahl des Zelltyps, der als Protein-

fabrik dienen soll. Mikroorganismen, Pilzzellen, Pflan-

zenzellen und Tierzellen besitzen alle einmalige Qua-

litäten, die sie unter bestimmten Umständen zu einer

guten Wahl machen können.

Mikroorganismen

Mikroorganismen sind aus mehreren Gründen attraktive

Proteinquellen. Zunächst sind viele Gärungen gut unter-

sucht und verstanden. Mikroorganismen lassen sich au-

ßerdem in großen Mengen kultivieren, und das in ver-

gleichsweise sehr kurzen Zeiträumen. Im industriellen

Umfeld ist diese Fähigkeit zur Erzeugung von Produk-

ten im großen Maßstab oft wesentlich. Ein weiterer wich-

tiger Gesichtspunkt ist die relative Einfachheit, mit der

viele Mikrobenarten genetisch verändert werden können.

Die Technik der rekombinanten DNA kann einge-

setzt werden, um die von einem Mikroorganismen er-

zeugte Menge eines erwünschten Proteins zu erhöhten.

Dazu stehen mehrere Wege zur Verfügung. Ein solcher

Weg ist die Erhöhung der Kopienzahl des zu exprimie-

renden Gens. Ein weiterer besteht darin, das gewünsch-

te Gen unter der Kontrolle eines starken Promotors in

die Wirtszellen einzuführen (siehe Kapitel 3).

Die Bakterienart, die bei der Produktion rekombinan-

ter Proteine am weitesten verbreitet ist, ist das Darmbak-

terium Escherichia coli. Da ein Großteil der frühen Grund-

lagenforschung zur Genetik der Bakterien an Escherichia

coli durchgeführt worden ist, sind die genetischen Eigen-

schaften dieses Bakterientyps sehr gut untersucht.

In einigen Fällen wird das Fremdgen (das heterologe

Gen in der Sprache der Genetik) direkt an ein vollständi-

ges Gen oder einen Teil eines Gens aus den Bakterien-

zellen angefügt. Ein solches rekombiniertes Gen mit An-

teilen verschiedener Gene wird Fusionsgen genannt,

das zugehörige Translationsprodukt Fusionsprotein.

Das Ergebnis wird sein, dass die gentechnisch her-

gestellten Bakterienzellen nun versuchen werden, das

vom Biotechnologen gewünschte Protein herzustellen.

Gelingt dies – was nicht immer der Fall ist –, liegt es als

Fusionsprotein vor, so dass ein zusätzlicher Arbeits-

schritt notwendig ist, um das Zielprotein vom Rest des

Fusionsproteins abzulösen.

Die Mehrheit der nativen („hauseigenen“) Proteine

einer Bakterienzelle wie der von Escherichia coli sind

intrazelluläre (cytoplasmatische) Proteine. In vielen Fäl-

len der erzwungenen Synthese rekombinanter Proteine

sammeln sich diese in Form so genannter Einschluss-

körper in den Zellen an. Einschlusskörper sind Zusam-

menballungen (Aggregate) der in überhöhtem Maß an-

gefertigten Fremdproteine. Sie sind vielfach nur schwer

löslich und stellen deshalb ein weiteres Problem für

den Biotechnologen dar.

Der Einsatz von Mikroorganismen für die Produk-

tion rekombinanter Proteine stößt jedoch an Grenzen.

Alle Bakterien, so auch die beispielhaft vorgestellte Art

Escherichia coli, sind Prokaryonten (primitive Einzel-

ler). Die fortgeschritteneren, komplizierter gebauten

Zellen der Eukaryonten finden sich bei allen echten

Vielzellern und auch bei einer großen Zahl einzelliger

Lebensformen (Protozoen, einzellige Algen usw.). Pro-

karyonten sind nicht in der Lage, bestimmte biochemi-

sche Reaktionen durchzuführen. Das Beispiel der Gly-

kosylierung von Proteinen wurde schon erwähnt. Aus

diesen Gründen können manche Proteine nur in euka-

ryontischen Zellen hergestellt werden (�Tabelle 4.3).

Obgleich es möglich ist, den gesamten Ablauf in ei-

nem kleinen Kolben im Laboratorium durchzuführen,

Tabelle 4.3

Vor- und Nachteile der Produk-tion rekombinanter Proteinein Escherichia coli

Vorteil

Die Genetik von E. coli ist gut untersucht.

Beinahe unbegrenzteMengen an Zellen/Proteinlassen sich gewinnen.

Die Fermentationstechnikfür diesen Mikrobentyp ist sehr gut bekannt undtechnisch beherrscht.

Nachteil

Proteine, die in Einschlusskör-pern abgelegt werden, müs-sen wieder getrennt werden(gelingt nicht in jedem Fall).

Aufgrund abweichender posttranslationaler Modifi-kationen werden manche eukaryontischen Proteinenicht korrekt gefaltet odersind nicht stabil.

Einige bakteriell erzeugte Proteine sind in Eukaryonten(Mensch etc.) inaktiv.

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

130

lassen sich gentechnisch veränderte Mikroorganismen

auch im großen Maßstab in Bioreaktoren anzüchten;

dies ist ja eine Voraussetzung für eine wirtschaftlich loh-

nende biotechnologische Ausnutzung dieser Verfahren.

Unter einem Bioreaktor versteht man ein geschlossenes

System, in dem zum Zweck der Produktion biologische

Vorgänge ablaufen. Die Bioreaktoren zur Herstellung

rekombinanten Humaninsulins können mehrere Stock-

werke hoch sein.

Computer überwachen heute vollautomatisch das

Milieu in solchen Reaktoren, halten die notwendigen

Sauerstoffkonzentrationen, die Temperatur, den pH-Wert

und andere Stellgrößen aufrecht (�Abbildung 4.6). Die

Vermehrung der Zellen wird ebenfalls sorgfältig über-

wacht, weil es oft eine Wachstumsphase gibt, in der die

Konzentration der Proteine am höchsten ist.

Pilze

Pilze (Mycota, Fungi) sind eine Quelle für ein breites

Spektrum von Proteinen, die in so verschiedenartigen

Produkten wie Tierfutter und Bier zum Einsatz kom-

men. Die natürlicherweise in manchen filamentösen

Pilzen vorkommenden Proteine werden als Nahrungs-

mittel eingesetzt. Über die natürlicherweise in Pilzen

vorkommenden Proteine hinaus eignen sich zahlrei-

che Pilze gut als Quelle für rekombinante, mit gentech-

nischer Unterstützung hergestellte Proteine. Anders als

Bakterien sind Pilze aufgrund ihrer eukaryontischen

Natur zu vielen posttranslationalen Modifikationen fä-

hig (z.B. zur Glykosylierung von Proteinen), doch sind

die Details dieser Prozesse in manchen Fällen auf sub-

tile Weise verschieden von den entsprechenden Vor-

gängen in Tier- oder Pflanzenzellen (�Tabelle 4.4).

Pflanzen

Pflanzenzellen lassen sich ebenfalls als Orte der Protein-

expression nutzen. Tatsächlich sind Pflanzen eine er-

giebige Quelle für natürlicherweise vorkommende, bio-

logisch aktive Substanzen. Ca. 85% aller heute auf dem

Markt befindlichen Wirkstoffe stammen aus Pflanzen.

Ein Beispiel für ein pflanzliches Enzym, das in industriel-

lem Maßstab hergestellt wird, ist die Protease Papain.

Papain, das auch als „pflanzliches Pepsin“ bezeichnet

wird, wird als „Weichmacher“ in der fleischverarbei-

tenden Industrie eingesetzt; man nutzt also die proteo-

lytische Wirkung, um zähe Bestandteile wie das vom

menschlichen Verdauungssystem schlecht angreifbare

Kollagen der Sehnen und des Bindegewebes (z.B. in den

Wandungen der Blutgefäße) vorzuverdauen. Überlegen

Sie bei Ihrem nächsten Besuch in der Mensa einmal, in

welchen Gerichten Papain zum Einsatz gekommen sein

könnte.

Pflanzen können genetisch modifiziert werden, um

wünschenswerte Proteine herzustellen, die sie von Na-

tur aus nicht enthalten. Wenn dies der Fall ist, können

das rasche Wachstum und die Vermehrungsraten von

Pflanzen ein klarer Vorteil sein. Der Tabak (Nicotiana

tabacum) gehörte zu den ersten gentechnisch verän-

derten Pflanzen. Eine einzige Tabakpflanze vermag bis

zu einer Millionen Samen hervorzubringen. Nachdem

Motor

Rührwerk

Entschäumer

Flügelrad

Schikane(zur Erzeugungvon Turbulenzen)

Belüftungsdüse

SterilerEinlass

Abbildung 4.6: Mikrobieller Fermenter. Die Kultivierung der Mikroorga-nismen geschieht in einem geschlossenen System, das vor der Befüllungsterilisiert wird. Durch Einlässe, in die Sterilfilter eingeschaltet sind, könnenvon außen während des Betriebs Stoffe zugesetzt werden, beispielsweiseum den pH-Wert, die Sauerstoffkonzentration oder andere Parameter ein-zustellen. Diese Stellgrößen werden mit Hilfe von im System befindlichenSensoren erfasst.

Tabelle 4.4

Einige rekombinante Proteineaus Pilzen

Protein Pilzart(en)

Humaninterferon(e) Apergillus niger, Aspergillus nidulans

Humanlactoferrin Apergillus oryzae, Apergillus niger

Rinderchymosin Apergillus niger, Apergillus nidulans

Aspartatproteinase Apergillus oryzae

Triglyzeridlipase Apergillus oryzae

4.4 Proteinproduktion

131

einmal die harte Arbeit der Einschleusung des erfor-

derlichen genetischen Materials vollbracht ist, könn-

ten theoretisch eine Million neuer pflanzlicher Protein-

fabriken die Felder füllen (Einzelheiten in Kapitel 6).

Der Einsatz von Pflanzen zur Erzeugung von Protei-

nen hat auch gewisse Nachteile. Nicht alle Proteine las-

sen sich in Pflanzen herstellen (ein Problem, mit dem

alle heterologen Expressionssysteme behaftet sind), und

aufgrund der stabilen Zellwände, die Pflanzen mit Pilzen

und Bakterien gemein haben, kann sich die Extraktion

langwierig und schwierig gestalten. Die posttranslationa-

len Modifikationen von Proteinen unterscheiden sich in

Pflanzen ebenfalls in manchen Aspekten von denen in

Tieren und Pilzen. Dies schließt also Pflanzen für die

Herstellung bestimmter Proteine aus anderen Organis-

menreichen aus. Mit transgenen Pflanzen werden wir

uns eingehender in Kapitel 6 befassen.

Säugetierzellsysteme

Manchmal ist es möglich, Tierzellen zu kultivieren –

sie also in einem Nährmedium weiterzuzüchten, bis die

Zeit gekommen ist, die Proteine zu ernten. Dieses Verfah-

ren stellt jedoch eine Herausforderung dar, da die Hal-

tungs- und Nährstoffansprüche von Tierzellen oft hoch

und regelmäßig komplizierter als die von Mikroorganis-

men sind. Tierzellen vermehren sich darüber hinaus

relativ langsam und es bedarf eines größeren Inokulums,

um einen Bioreaktor anzufahren. Da sich die Tierzellen

in Kultur nur langsam vermehren, sind die notwendi-

gen Standzeiten der Systeme wesentlich länger. Damit

wächst die Gefahr der Kontamination durch Mikroorga-

nismen, die die Tierzellen rasch überwuchern. Ungeach-

tet dieser Schwierigkeiten sind Tierzellen in manchen

Fällen erste Wahl, wenn nicht sogar eine unvermeidli-

che, um spezielle Proteine herzustellen.

Ganze Tiere als Produktionssysteme

Zellkulturen sind nicht die einzige Möglichkeit, will

man Tierzellen nutzen. Manchmal bietet sich das ganze

Tier als Proteinproduzent an. Betrachten wir als ein Bei-

spiel für die Nutzung ganzer Tiere als biotechnologische

Reaktoren die Herstellung monoklonaler Antikörper.

Antikörper sind Proteine, die als Reaktion auf ein An-

tigen (in den Körper eingedrungenes Fremdmaterial,

zum Beispiel ein Infektionserreger wie ein Virus oder

ein Bakterium) von weißen Blutkörperchen erzeugt wer-

den. Antikörper verbinden sich mit dem eingedrunge-

nen Antigen und neutralisieren es. Dadurch wird der

Wirtsorganismus vor der Schadwirkung durch das An-

tigen geschützt. Die Produktion von Antikörpern ist ein

Teil der Immunantwort, der es Wirbeltieren ermöglicht,

sich gegen Infektionskrankheiten zur Wehr zu setzen.

Wenn die Herstellung monoklonaler Antikörper das

Ziel ist, wird zunächst Mäusen das Antigen, gegen das

ein Antikörper erzeugt werden soll, gespritzt. Die wei-

ßen Blutkörperchen der Maus werden dann gewonnen

und in Kultur genommen. Zellen mit der gesuchten

Spezifität ihrer Antikörper werden selektiert und wei-

tergezüchtet. Schließlich wird ein passender Zellklon

mit einer unbegrenzt teilungsfähigen Krebszelllinie zur

Fusion gebracht.

Es entsteht eine Hybridzelllinie, die sich immer wei-

ter teilt und dabei Antikörper in das umgebende Medi-

um ausschüttet. Aus dem Kulturüberstand lassen sich

dann die monoklonalen Antikörper gewinnen, da die

Zellkultur ein Klon mit nur einer Antigenspezifität ist.

Eigentlich ist also doch wieder eine Zellkultur die Quel-

le für die Proteine und nicht das ganze Tier! Eine ande-

re Methode, wirklich ganze, intakte Tiere für die Herstel-

lung bestimmter Proteine zu nutzen, ist die Erzeugung

transgener Tiere, die das Zielprotein mit der Milch oder

in Eiern abgeben.

Transgene sehen ganz genauso aus wie ihre konven-

tionell durch Kreuzung gezüchteten Verwandten, und

sie verhalten sich natürlich auch genauso. Ein trans-

genes Schaf wie „Tracy“, das wir in Kapitel 7 kennen-

lernen werden, frisst Heu und gibt Milch. Der große

Unterschied besteht darin, dass in seiner Milch für den

Menschen wertvolle Proteine enthalten sind, die man

normalerweise nicht in der Schafsmilch findet. Kapi-

tel 7 befasst sich eingehender mit der Herstellung mo-

noklonaler Antikörper in transgenen Tieren.

Insektensysteme

Insektenzellen sind eine weitere Variante für die Her-

stellung von Proteinen in Tierzellen. Bis vor kurzem

stützte sich diese Methode auf Insektenzellkulturen, doch

wurden in jüngster Zeit neue Techniken entwickelt, die

sich der Larven von Insekten bedienen. In beiden Fällen

wird das heterologe Gen mit Baculoviren (Viren, die In-

sekten befallen) als Vektoren eingeschleust. Wie immer

gibt es auch hierbei Fälle, in denen die posttranslatio-

nale Modifizierung der rekombinanten Proteine in den

Insektenzellen nicht genauso verläuft wie in anderen Zel-

len, so dass auch das Insektenexpressionssystem in man-

chen Fällen funktioniert, in anderen jedoch zu nicht

brauchbaren Endprodukten führt.

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

132

Methoden zur Protein-aufreinigung 4.5Der nächste Schritt nach der Herstellung eines Proteins

ist die Ernte desselben. Falls das Protein im Inneren der

Zellen vorliegt, müssen die ganzen Zellen geerntet wer-

den. Liegt es dagegen außerhalb der Zellen im Medium

vor (sekretiertes Protein), so wird dieses abgeschöpft. In

beiden Fällen ist dieser „Ernteschritt“ nur der Anfang. Die

Proteinaufreinigung ist ein Teil der stromabwärts erfol-

genden Schritte des Produktionsprozesses. Dies sind

die Schritte, durch die das Zielprotein von den zahl-

reichen anderen Zellbestandteilen abgetrennt werden.

Damit es nutzbringend eingesetzt werden kann, muss

ein Protein je nach Verwendungszweck mehr oder we-

niger stark aufgereinigt werden. „Reinheit“ ist jedoch

ein relativer Begriff und muss daher für die jeweiligen

Anwendung quantitativ definiert werden. Die Gesund-

heitsbehörden verlangen regelmäßig eine Reinheit von

99,99% oder besser, falls das Zielprotein als Medika-

ment am Menschen eingesetzt werden soll. Die Abtren-

nung des Proteins von allen anderen Zellbestandtei-

len – insbesondere den vielen anderen Proteinen – ist

kein leichtes Unterfangen. Um die dabei ablaufenden

Vorgänge verstehen zu können, werden wir im Folgen-

den einige der dabei gebräuchlichen Verfahren näher

betrachten.

Herstellung von Extraktionfür die Aufreinigung

Die Menge des Überstandes an Kulturmedium, auch

Filtrat genannt, das aus einem großen Industriebioreak-

tor gewonnen wird, kann leicht ein mittleres Schwimm-

becken füllen. Die Entziehung von darin enthaltenen

Proteinen und das Aufkonzentrieren der Flüssigkeit ist

eine herausfordernde Aufgabe. Selbst wenn man das

Wunschprotein in viel kleinerem Maßstab zur Expres-

sion bringt – zum Beispiel in einer Laborkultur –, kann

die Aufreinigung des Proteins sich zu der sprichwörtli-

chen „Suche nach der Nadel im Heuhaufen“ ausweiten.

Falls das Protein intrazellulär vorliegt, ist der erste

Weiterverarbeitungsschritt nach der Zellernte das Auf-

brechen der Zellen, die Zelllyse. Bei Tierzellen muss nur

die Membran zum Platzen gebracht werden, bei Pflan-

zen-, Pilz- und Bakterienzellen muss zuvor die mecha-

nisch stabilere Zellwand überwunden werden. Es gibt

zahlreiche Methoden, um dies zu bewerkstelligen. Man

kann Zellen einfrieren und wieder auftauen, das schä-

digt die Membranen. Man kann Detergenzien einsetzen,

das zerstört ebenfalls die Membranen und denaturiert

manche anderen Zellinhaltsstoffe. Beide Verfahren kön-

nen jedoch Zellwände nicht oder nur unzureichend

durchlässig machen. Zu diesem Zweck empfehlen sich

mechanische Verfahren wie Scherung (Zermörsern, ggf.

in Anwesenheit eines chemisch inerten, abrasiven Ma-

terials wie Sand; starkes Schütteln), die Anwendung

von Ultraschall (Kavitation im Medium) oder ein che-

mischer Abbau des Zellwandmaterials (sehr schonende

Methode, die den Protoplasten intakt lässt). In Anbe-

tracht der Empfindlichkeit von Proteinen gegen Stör-

einflüsse ist die Herauslösung aus der Zelle ohne Verlust

der Aktivität eine große Herausforderung. Die Zerstö-

rung der Zellen setzt das gesuchte Protein frei, dane-

ben aber auch alle anderen Inhaltsstoffe der Zelle, da-

runter auch proteolytisch wirkende Enzyme. Bei diesem

Homogenisierungsschritt müssen daher je nach Zell-

typ mehr oder weniger große Mengen Proteasehemmer

zugesetzt werden.

In das für die Ruptur der Zellen verwendete Medium

werden oberflächenaktive Substanzen (Detergenzien)

und Salze gegeben. Die Detergenzien sind Lösungsver-

mittler, die die zahlreichen Lipide einer Zelle löslich

machen und eine unerwünschte Phasenbildung vermin-

dern. Man versucht, dadurch Membranproteine besser

löslich und besser isolierbar zu machen. Die Ionen der

Salze wirken ähnlich, indem sie die elektrostatischen

Wechselwirkungen zwischen Proteinmolekülen und zwi-

schen Proteinmolekülen und anderen Ionen oder po-

laren Stoffen herabsetzen. Außerdem werden manche

Enzyme durch hohe Konzentrationen gewisser Ionen

gehemmt.

Stabilisierung von Proteinen in Lösung

Nach der Herstellung der Lösung oder einer Suspensi-

on müssen die Proteine stabilisiert werden. Sie wissen,

dass es von höchster Wichtigkeit ist, die biologische

Funktionsfähigkeit der Proteine zu erhalten – sonst ist

der ganze Arbeitsaufwand am Ende vergebens. Protei-

ne sind, wie wir gelernt haben, relativ fragile Gebilde.

Folglich müssen Vorkehrungen getroffen werden, um

die Proteine während der Aufreinigungsphase und da-

rüber hinaus zu beschützen.

Wärme ist eine große Gefahrenquelle für Proteine.

Falls Sie jemals ein Ei gekocht haben, dann haben Sie

gesehen, wie rasch sich das Eiweiß (dt. für „Protein“) in

der Hitze verfestigt. Dies ist eine Folge der Hitzedena-

4.5 Methoden zur Proteinaufreinigung

133

turierung der Proteinmoleküle im Eiklar. Ein weiteres

essbares Beispiel für Hitzedenaturierung sind die Fäden,

die der Käse auf einer Pizza zieht. Diese entstehen bei der

Vernetzung von Proteinmolekülen in der Hitze des Ofens.

Selbst normale Zimmertemperatur schädigt viele Pro-

teine, wenn sie aus ihrer natürlichen Umgebung der le-

benden Zelle herausgerissen worden sind. Da das Ziel

ein aktives Protein ist und der Aufreinigungsvorgang

Zeit braucht, muss während der gesamten Prozedur re-

gelmäßig gekühlt werden. Vollständiges Einfrieren mit

nachfolgendem Auftauen kann jedoch die Proteine ge-

nauso schädigen wie Erwärmen. Proteine sind also im

Vergleich zur DNA, die wir schon kennen gelernt haben,

sehr schwierig zu bearbeitende Chemikalien.

Wie schon erwähnt sind die in allen Zellen anwe-

senden Proteasen eine weitere große Gefahrenquelle.

Deshalb setzt man bei der Aufreinigung Hemmstoffe für

solche Enzyme zu. Des Weiteren kommen insbeson-

dere bei der Lagerung von Zellextrakten und aufgerei-

nigten Proteinpräparationen antimikrobiell wirksame

Stoffe zum Einsatz, damit keine mikrobielle Verderb-

nis die Arbeit zunichte macht. Welche Wirkung die mi-

krobielle Zersetzung auf Proteine hat, sieht man leicht

an überlagerter, sauer gewordener Milch. Bei human-

oder veterinärmedizinischer Anwendung der Produk-

te kann eine Entfernung dieser Stoffe vonnöten sein. Bei

Proteinen, die einer pharmazeutischen Benutzung zu-

geführt werden sollen, verbieten die Regularien mancher

Behörden sogar den Zusatz von Proteasehemmern, weil

eventuell verbleibende Reste dieser Stoffe für die Pa-

tienten giftig wären.

Eine weitere mögliche Gefahr für die wertvollen

Proteine geht von mechanischen Schädigungen wie zu

starker Scherung oder Schaumbildung aus. Auch hier-

bei kann der Zusatz von die Schaumbildung verhin-

dernden Additiven helfen. Auch solche Zusätze müs-

sen gegebenenfalls später wieder entfernt werden (wenn

ein Protein beispielsweise als Impfstoff verwendet wer-

den soll; bei Enzymen für Waschmittel ist das natür-

lich überflüssig).

Wie Sie sehen können, gleicht die erfolgreiche Extrak-

tion und Aufreinigung von Proteinen dem Balancieren

auf einem Hochseil. Obgleich es notwendig ist, Proteine

aufzureinigen, ist es ebenso wichtig, deren biologische

Funktionsfähigkeit aufrechtzuerhalten. Unglücklicher-

weise sind einige wirksame Methoden zur Aufreinigung

gleichzeitig auch geeignet, das Zielprotein und andere

Proteine zu schädigen. Behalten Sie das Bild von dem

auf dem Hochseil laufenden Zirkuskünstler im Hinter-

kopf, wenn wir im Folgenden die Schritte und Metho-

den der Proteinaufarbeitung erörtern.

Trennung der Bestandteile eines Extraktes

Das grundlegende Konzept, das hinter der Aufreinigung

steht, ist ein einfaches: Ähnlichkeiten in den Eigenschaf-

ten der Proteine erlauben es, diese von den Nichtprotein-

bestandteilen der Zellen (Lipide, Kohlenhydrate, Nu-

cleinsäuren, niedermolekulare Verbindungen), die bei

der Öffnung der Zellen ebenfalls freigesetzt werden, ab-

zutrennen. Unterschiede in den Eigenschaften der einzel-

nen Proteinsorten werden dann ausgenutzt, die Proteine

voneinander zu trennen.

Ausfällen von Proteinen

Wasserlösliche Proteine besitzen auf ihren Oberflächen

hydrophile Aminosäurereste, die mit den Wassermolekü-

len des Zellinneren oder des extrazellulären Milieus in

unmittelbarem Kontakt stehen. Diese Eigenschaft wird

ausgenutzt, um die Proteine von vielen anderen Substan-

zen im Zellextrakt abzutrennen. Man kann dem Zell-

extrakt Salze zusetzen – am gebräuchlichsten ist Am-

moniumsulfat ((NH4)2SO4) –, um die Proteine aus der

Lösung auszufällen. Die Ammoniumsulfatfällung ist

häufig der erste Schritt bei der Proteinaufreinigung.

Wenn die Konzentration des Salzes hoch genug einge-

stellt wird, trennt man damit nicht nur die Proteine von

anderen Zellbestandteilen, sondern erhält auch ein Prä-

zipitat, das recht gut löslich ist. Das Ausfällungsverhal-

ten der Proteine ist höchst unterschiedlich, das heißt,

die Ausfällung erfolgt bei unterschiedlichen Salzgehal-

ten. Es lassen sich so durch schrittweises Aussalzen ver-

schiedene Proteinfraktionen gewinnen.

Einige der Probleme, die im Zusammenhang mit der

Ammoniumsulfatfällung auftreten, lassen das Verfah-

ren unter manchen Umständen (in manchen industri-

ellen Situationen) als nicht gut geeignet erscheinen. So

greift Ammoniumsulfat sogar rostfreien Stahl an; ar-

beitet man im technischen Maßstab mit Anlagen aus

diesem Werkstoff, besteht Korrosionsgefahr. Im Labor

arbeitet man praktisch ausschließlich mit Glas- und

Kunststoffgefäßen; hier besteht diese Gefahr nicht. Wei-

tere „Lösungsmittel“, die häufig zur Proteinausfällung

eingesetzt werden, sind Ethanol, Isopropanol, Aceton

und Diethylether.

Filtration nach Größe

Es gibt viele Arten und Weisen, chemische Stoffe nach

der Größe der Moleküle oder nach der Dichte zu tren-

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

134

nen. Die Zentrifugation ist eine solche Methode. Beim

Zentrifugieren wird das Stoffgemisch durch schnelle

Kreisbewegung in einer Zentrifuge einer starken Win-

kelbeschleunigung unterworfen. Diese Beschleunigung

entspricht physikalisch exakt einer Schwerkraftein-

wirkung. Mit diesem Verfahren können bei niedriger

Geschwindigkeit Zellen und Zelltrümmer abgesetzt (se-

dimentiert) werden, bei sehr viel höheren Zentrifugal-

beschleunigungen sind auch Stoffgemische trennbar.

Wenn man weiß, wie groß der Sedimentationskoeffi-

zient des gesuchten Proteins ist, kann man in einem

Dichtegradienten die entsprechende Schicht anspre-

chen und nur die darin enthaltenen Stoffe absondern.

Dieses Verfahren ist aufwendig und teuer; auch eignet

es sich kaum für den Einsatz zur Proteintrennung im

Industriemaßstab.

Die im Labor üblichen Zentrifugen werden mit klei-

nen Probenvolumina definierter Größe beschickt. Im

besten Fall kann man in einem einzigen Lauf einige Liter

Flüssigkeit zentrifugieren, doch sind diese Großraum-

zentrifugen langsam und eignen sich nur zur Ernte von

Zellen. Bei industriellen Herstellungsprozessen können

leicht Volumina von hunderten oder tausenden von Li-

tern, die extrahiert werden müssen, anfallen (�Abbil-

dung 4.7). Die Zentrifugation in dieser Größenordnung

wird als kontinuierliches Verfahren durchgeführt. Der

gesamte Inhalt eines Reaktors wird so nach und nach

mit geringem Arbeitsaufwand der Zentrifugation unter-

worfen. Dies beschleunigt die Aufbereitung im Vergleich

zu den Laborzentrifugen.

Filter verschiedener Größe und Machart können

ebenfalls bei der Proteintrennung zum Einsatz kommen.

Manchmal wird eine Abfolge unterschiedlicher Filter-

techniken in Reihe nacheinander zum Einsatz gebracht.

Dabei werden dann zuerst die zellulären Bestandteile

abgetrennt, in einem späteren Schritt die größeren Pro-

teine von den niedermolekularen Stoffen. Bei der Mem-

branfiltration werden dünne Membranen aus Nylon oder

einem anderen Polymermaterial mit sehr kleinen Poren-

durchmessern verwendet, um aus einer Lösung alle Zel-

len und Zelltrümmer herauszufiltern. Diese Methode

wird oft zur Sterilfiltrierung von empfindlichen Medien

und Ähnlichem eingesetzt. Für eine großmaßstäbliche

Proteinaufreinigung ist die Methode nicht geeignet.

Durch Mikrofiltration entfernt man Ausfällungen und

Bakterien. Durch Ultrafiltration können Makromoleküle

wie Proteine oder Nucleinsäuren herausgefiltert werden.

Einige Ultrafiltrationsvarianten erlauben die Trennung

WeitwinkligerRotor

(a)

(b)

Festwinkelzentrifuge

Großraumzentrifuge

GepanzertesGehäuse

Kühlung

Antriebsmotor

Vakuum

ZelluläreProteinewandernnach innen

Zelltrümmer

Trennscheiben

Proteinüberstand

fragementiertesZellmaterial

vorher

Zellhomogenatvor derZentrifugation

Zentrifugation

Überstand;kleinere undweniger dichteBestandteile

Pellet(Zellkuchen);größere unddichtereBestandteilenachher

Zellhomogenat

Abbildung 4.7: Festwinkel- und Großraumzentrifuge. (a) Zentrifugen mit Festwinkel- oder Ausschwingrotoren können sehr hohe Schwerkraftbeschleu-nigungen (bis mehrere Hunderttausend g) erreichen. Sie sind jedoch auf kleinere Substanzmengen beschränkt und müssen für jeden Lauf neu befüllt wer-den. (b) Kontinuierliche Großraumzentrifugen sind entwickelt worden, um einen fortlaufenden Materialfluss zu ermöglichen und bei niedrigen Umdre-hungszahlen Zelltrümmer vom flüssigen Zellinhalt abzusetzen. Sie sind der Schleuder in einer Waschmaschine nicht unähnlich.

4.5 Methoden zur Proteinaufreinigung

135

von großen Proteinsorten von weniger hochmolekula-

ren. Einer der Hauptnachteile der Membranfiltration

ist die Neigung der Membranen, leicht zu verstopfen.

Auf der anderen Seite ist der Zeitaufwand – wenn es

funktioniert – geringer als bei der Zentrifugation.

Die Diafiltration und die Dialyse sind Filtrations-

methoden, die sich auf das thermodynamische Gleich-

gewicht stützen, also die Wanderung gelöster Substanzen

aus Bereichen höherer in solche niedrigerer Konzen-

tration bis zum Ausgleich der chemischen Potenziale des

betreffenden Stoffs. Wie in �Abbildung 4.8 zu sehen,

ist die Dialyse dabei von der Fähigkeit des zu filtrieren-

den Stoffes, durch die verwendete Membran hindurch-

zutreten, abhängig. Die Membran ist semipermeabel

(halbdurchlässig), lässt also manche Stoffe durch und

hält andere zurück. Ein Dialyseschritt wird oft einge-

schaltet, um Salze, Lösungsmittel und andere Zusätze,

die bei der Prozedur zum Einsatz gekommen sind, wie-

der abzutrennen. Diese werden dann durch eine Puffer-

substanz (einen schwachen Elektrolyten) ersetzt, die das

Milieu der Proteine für die Folgeschritte stabilisiert.

Bei der Diafiltration ist der Dialyse ein zusätzlicher Fil-

trationsschritt vorgeschaltet.

Chromatographie

Die Anfangsschritte einer jeden Aufreinigung setzen die

Proteine aus den Zellen frei, entfernen unerwünschte

Kontaminanten und gröbere Begleitsubstanzen. Die Pro-

teine werden dabei stärker konzentriert. Chromatogra-

phische Methoden erlauben das Auslesen von Proteinen

nach der Größe oder der Löslichkeit oder der Affinität

(Bindungsneigung) an bestimmte Substanzen oder Ober-

flächen. Bei der Chromatographie wird ganz allgemein

ein als Säule bezeichneter Behälter mit einer statio-

nären (nichtbeweglichen) Phase (zum Beispiel einem

Kunstharz) und einer Pufferlösung befüllt. Die Säule

kann ganz unterschiedliche Größen (von wenigen Zen-

timetern bis mehrere Meter) haben und mit ganz unter-

schiedlichen Stationärphasen befüllt sein. Ein geklär-

ter Proteinextrakt wird auf die Säule gegeben und fließt

unter der Schwerkraftwirkung durch die Säule; dabei

passiert der Extrakt das Säulenmaterial (die stationäre

Phase). Abhängig von dem verwendeten Säulenmate-

rial (chemische Beschaffenheit der stationären Phase)

treten dann einige der Proteine des Extraktes mit dem

Material in Wechselwirkung und werden zurückgehal-

ten, während der Rest durch die Säule hindurchläuft.

Die stationäre Phase, die für gewöhnlich in Form feinst-

verteilter Kügelchen vorliegt, ist hier das Filtrations-

medium.

Die Ausschlusschromatographie setzt ein feinkör-

niges Gel als Filtrationsmedium ein. Die kleineren Pro-

teinmoleküle fließen nur langsam durch die Gelmatrix,

weil sie auf ihrem Weg in kleinste Öffnungen der Gelpar-

tikel eindiffundieren und dadurch verlangsamt werden.

Größere Moleküle fließen mit dem Pufferstrom rascher

durch die Stationärphase, weil sie nicht in die Hohl-

räume der Gelpartikel eindringen können. Sie fließen um

das Netzwerk der Gelmatrix herum (�Abbildung 4.9).

Solche als Stationärphasen geeignete Gele gibt es in ver-

schiedenen, definierten Porenweiten. Der für eine Tren-

nung zu wählende Typ hängt von der Molmasse des

gesuchten Proteins und den Molmassen der abzutren-

nenen Kontaminanten ab. Diese Methode ist jedoch nur

zu einer Vorreinigung geeignet. Die Zeitdauer für solche

Trennungen kann erheblich sein, da sehr lange Säulen

(ein bis mehrere Meter) zum Einsatz kommen.

Die Ionenaustauschchromatographie ist eine für

die Proteinaufreinigung und -aufkonzentrierung extrem

nützliche Methode. Sie stützt sich auf elektrostatische

Protein

Salz

Proteinlösungmit hohemSalzgehalt

durch Klemmenabdichten

durchlässiger Beutelin Pufferlösung mitniedrigem Salzgehalt

nach mehrmaligem Pufferwechsel diffundiert immer mehr Salz aus dem Beutel, in dem sich nun verdünnter Puffer und die gelösten Proteine befinden

Protein

Puffer

Abbildung 4.8: Dialyse. Eine Dialyse wird eingesetzt, um niedermolekulare Stoffe (Ionen eines Salzes u.Ä.) abzutrennen (in der Schemazeichnung durchdie kleinen Punkte symbolisiert) und durch eine Puffersubstanz (ebenfalls ein Salz) zu ersetzen, die besser zur Stabilisierung der Proteine geeignet ist.

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

136

(a)

(b)

Probe mit Proteinenunterschiedlicher (hoherund niedriger) Molmasse

werden auf eineChromatographiesäule

aufgetragen.

Mit dem Pufferstromgelangen die nieder-molekularen Proteine

in die Gelphaseund werden von

Gelpartikeln gebremst.

Die höhermolekularenProteinsorten sind

weniger gut in der Lage, indie Gelphase einzudringen,so dass sie als Folge zuerst

eluiert werden.

OProteine

hoher Molmassen

Proteinemittlerer

Molmassen

Proteineniedriger Molmassen

geringeMolmasse

hoheMolmasse

Abbildung 4.9: Proteinaufreinigung durch Ausschlusschromatographie. (a) Proteine niedriger und hoher Molmassen wandern durch eine Ausschlusschro-matographiesäule. (b) Das Diagramm zeigt schematisch den Verlauf der Absorptionskurve bei 280 nm Wellenlänge. Man verfolgt den Trennungsvorgangspektrophotometrisch. Beachten Sie, dass die höhermolekularen Proteine rascher durch das Säulenmaterial wandern, während die Proteine geringererMolmassen in der Matrix der Stationärphase retardiert (zurückgehalten) werden.

(a)

(b)

(c)

O

Protein X Protein Y Protein Z

–

–

–

–

–

–

–

– –

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

––

–

–

–

–

–

–

–

+ +

+ +

++

+

+

positiv geladenerIonenaustauscherharz

negativ geladenesProtein

Zeit

Ko

nze

ntr

atio

n

Salz

kon

zen

trat

ion

ansteigender linearer Salz-konzentrationsgradient

********

*

** ****

Abbildung 4.10: Ionenaustauschchromatographie. (a) Aminosäurereste mit elektrischen Ladungen binden die Stationärphase der Säule. Eine Erhöhungder Ionenstärke im Spülpuffer verdrängt die Proteinmoleküle (auf der Grundlage ihrer Bindungsstärke) vom Säulenmaterial. (b) Protein X wird bei der nied-rigsten Konzentration des zur Ablösung eingesetzten Salzgradienten abgelöst; Protein Y besitzt eine höhere Bindungsstärke und wird als zweites abge-löst; Protein Z weist die höchste Bindungsstärke auf und erfordert die höchste Salzkonzentration, um vom Ionenaustauscherharz der Säule verdrängt wer-den zu können. (c) Ein Anionenaustauscherharz trägt positive Ladungen, während ein Kationenaustauscherharz negative elektrische Ladungen trägt.

4.5 Methoden zur Proteinaufreinigung

137

Wechselwirkungen (Anziehung/Abstoßung zwischen

elektrischen Ladungen), mit deren Hilfe Proteine an die

Stationärphase gebunden werden. Während die Proteine

so an das Säulenmaterial gebunden sind, fließen Konta-

minanten durch die Säule und aus ihr heraus, wie in

�Abbildung 4.10 schematisch dargestellt. Die Proteine

können nachfolgend eluiert (von der Stationärphase ab-

gelöst) werden. Dies geschieht durch Beschickung der

Säule mit Elektrolytlösungen steigender Ionenstärke.

Die Proteine lösen sich dann auf der Grundlage der Stär-

ke (Menge der Ladungen) der ionischen Wechselwirkun-

gen vom Säulenmaterial ab. Die Proteine werden also

durch die neuen Ionen verdrängt und können am Aus-

lauf der Säule aufgefangen werden.

Bei der Affinitätschromatographie nutzt man die Fä-

higkeit der meisten Proteinsorten zur spezifischen Bin-

dung an spezielle Bindungspartner, die Liganden ge-

nannt werden, aus. Diese Trennmethode ist also die

spezifischste der bislang vorgestellten. Liganden sind

zumeist niedermolekulare Verbindungen, die eine bin-

dende Wechselwirkung mit einem oder einigen hoch-

molekularen Molekülsorten eingehen. Oft wird zur

vereinfachenden Versinnbildlichung dieses Vorgangs

der Vergleich eines Schlüssels mit seinem zugehörigen

Schloss bemüht (�Abbildung 4.11). Nach der Immo-

bilisierung der Proteine an die Stationärphase wird mit

einer gepufferten Waschlösung die Säule gewaschen.

Dabei werden die unerwünschten Begleitstoffe weit-

gehend entfernt. Schließlich wird mit einer speziellen

Pufferlösung, die gelöste Ligandenmoleküle in hoher

Konzentration enthält, das Zielprotein vom Säulen-

material abgelöst und eluiert. Die Affinitätschromato-

graphie kommt zu einem späten Zeitpunkt im Aufrei-

nigungsprozess zum Einsatz und führt nicht selten zu

elektrophoretisch reinen Proteinen.

Wie wir gelernt haben, werden Aminosäuren und Ami-

nosäurereste in Proteinen von Wassermolekülen entwe-

der angezogen oder abgestoßen. Bei der hydrophoben

Wechselwirkungschromatographie werden Proteine auf

der Grundlage ihrer Hydrophobizität (ihrer wasserabsto-

ßenden Neigung) getrennt. Das Säulenmaterial wird bei

dieser Methode mit hydrophoben Resten belegt. Beim

Trennvorgang lagern sich hydrophobe Proteine durch

schwache, hydrophobe Wechselwirkung an diese Sta-

tionärphase an (�Abbildung 4.12).

Affinitäts-ligand

Protein-ligand

weitereProteinliganden

Harzteilchen aus demSäulenfüllmaterial

Abbildung 4.11: Affinitätschromatographie. Affinitätsliganden sind da-rauf abgestimmt, mit bestimmten Teilen eines bestimmten, aufzureinigen-den Proteintyps spezifisch in Wechselwirkung zu treten. Eine Pufferlösung,die eine hohe Konzentration des freien Liganden enthält, kann das gebun-dene Protein (nach der präferentiellen Bindung) wieder verdrängen und sodie Affinitätssäule regenerieren. Das abgelöste (gereinigte) Protein kann nachder Elution von der Säule aufgefangen und weiter konzentriert werden.

Harzkügelchen des Säulen-füllmaterials

O

Proteine werden in der Reihenfolgeansteigender Hydrophobizitätdurch einen linear abfallendenSalzkonzentrationsgehaltvon der Säule eluiert

AusgerichteteWassermoleküle,die die hydrophobenBereiche umgeben

Proteine mit hydrophobenStellen auf der Oberfläche

Proteine werden in Gegenwarteiner hohen Salzkonzentrationdem Harz zugegeben

Salz-konzentration

Proteine binden an dasSäulenfüllmaterial infolgehydrophober Wechsel-wirkungen zwischen demLiganden und dem Protein

AbfallenderSalzkonzentrations-

gradient

Zeit(zunehmende

Hydrophobizitätder Proteine)

Ko

nze

ntr

atio

n

Abbildung 4.12: Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. DieErhöhung der Konzentration einer hydrophoben mobilen Phase kann durchLösungsvermittlung dazu beitragen, dass hydrophobe Proteine sich an hy-drophobe Oberflächen der Stationärphase anlagern. Eine weitere Vermin-derung der Ionenkonzentration löst die Proteine wieder von der Stationär-phase ab und führt zur Lösung in dem unpolaren Lösungsmittel. Bei derEluierung werden wie gehabt Fraktionen gesammelt und bei 280 nm Wel-lenlänge spektrophotometrisch vermessen.

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

138

Die isoelektrische Fokussierung wird oft in der Qua-

litätskontrolle eingesetzt, um zwei einander ähnliche

Proteine zu unterscheiden, die sonst nur schwer von-

einander zu trennen sind (zum Beispiel Isoformen ein

und desselben Enzyms). Jede Proteinsorte verfügt über

eine kennzeichnende Anzahl geladener Aminosäure-

reste, die an der Oberfläche an spezifischen Plätzen an-

geordnet sind. Aufgrund dieser einmaligen Kombina-

tion geladener chemischer Gruppen ist jede Proteinsorte

durch eine physikochemische Eigenschaft ausgezeich-

net, die man den isoelektrischen Punkt (IP) des Pro-

teins nennt. Der isoelektrische Punkt kann ausgenutzt

werden, um Proteine zu trennen, die sehr ähnliche Mol-

massen und chemische Eigenschaften aufweisen. Die

isoelektrische Fokussierung ist in vielen Fällen auch

der erste Schritt einer zweidimensionalen Proteinelek-

trophorese (also die „erste Dimension“).

Bei der zweidimensionalen Elektrophorese (2D-Elek-

trophorese) werden Proteine nacheinander zwei elektro-

phoretischen Trennungen unterworfen. Dies geschieht

nacheinander auf der Grundlage der Molekülgröße und

der elektrischen Nettoladung. Die Reihenfolge ist da-

bei für das Endergebnis unerheblich. Wie bei einer ge-

wöhnlichen eindimensionalen Elektrophorese wird ein

Zellextrakt oder eine andere Proteinpräparation in die

Probenkammer eines Gels gefüllt und eine elektrische

Gleichspannung angelegt. Die Proteine wandern durch

die Gelmatrix und werden auf der Grundlage ihrer Netto-

ladungen aufgetrennt. Als nächstes wird das Gel um 90°

gedreht oder ein Gelstreifen, in dem die erste Trennung

durchgeführt worden ist, an ein frisches Gel angelegt.

Eine elektrische Gleichspannung sorgt auch für die zwei-

te Trennung. Bei der Wanderung durch die Gelmatrix

werden die Moleküle nach ihren Molmassen getrennt.

Analytische Methoden

Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC; high

pressure liquid chromatography; auch: high performance

liquid chromatography) fügt den weiter oben beschrie-

benen chromatographischen Methoden einen zusätzli-

chen Aspekt hinzu. Die bisher beschriebenen Varianten

der Säulenchromatographie stützen sich für den Durch-

tritt der mobilen durch die stationäre Phase auf die

Schwerkraft oder auf Niederdruckpumpen. Bei diesen

Methoden mit niedrigen Flussraten kann ein einziger

Durchlauf mehrere Stunden in Anspruch nehmen. Die

(a) (b)

Vorsäule

Pumpe

In Reihegeschalteter

Lösungsmittel-filter

Lösungsmittel-reservoir

Säulen-vorfilter

Ventil zurProbeinjektion

HPLCSäule

Detektor

Rückschlag-ventil

Abfallsammelbehälter

elektrostatischerAnalysator

magnetischerAnalysator

Detektormit Verstärker

Ionenquelle

Abbildung 4.13: Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie. Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) wird oft im Ver-bund mit der Massenspektrometrie zur Analyse von Proteinen eingesetzt. (a) Bei der HPLC kommen nichtkomprimierbare Harzkügelchen als stationärePhase unter sehr hohem hydrostatischen Druck zum Einsatz, um Proteine aufzutrennen, die oft von sehr ähnlicher Größe sind. (b) Eine massenspektrome-trische Analyse folgt der initialen Trennung, um an den ionisierten und im elektrischen Feld beschleunigten Proteinmolekülionen subtile Unterschiede fest-zustellen, die die Grundlage der Analyse sind, nachdem sie eine Vakuumröhre durchlaufen haben.

4.6 Verifizierung

139

HPLC-Anlagen setzen höhere Drücke ein, um das zu

trennende Stoffgemisch durch die stationäre Phase zu

befördern, was dann in einer kürzeren Zeit möglich ist.

HPLC-System unterliegen jedoch wie jede Methode ih-

ren spezifischen Grenzen. Die Apparaturen sind sehr

teuer und die Auftrennung ist nur im analytischen Maß-

stab möglich. Großtechnischen Anlagen für die Massen-

herstellung stehen nicht zur Verfügung.

Die Massenspektrometrie (MS) ist eine hochemp-

findliche Analysemethode, die in der Organischen Che-

mie eine lange Tradition hat. Sie wird beispielsweise

in manchen Fällen in Kombination mit automatisier-

baren Chromatographieeinrichtungen wie HPLC-Gerä-

ten oder Gaschromatographen eingesetzt. Alle massen-

spektrometrischen Messungen umfassen drei immer

gleiche Schritte: Überführung der zu analysierenden

Probe in die Gasphase, Trennung des Gemisches auf der

Grundlage des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses, und

schließlich die Detektion der Signale der im elektri-

schen Feld getrennten Ionen. Eine Probe von nur einem

Pikogramm (einem Milliardstel Gramm) lässt sich so

analysieren (�Abbildung 4.13). Ein eindeutiger mole-

kularer „Fingerabdruck“ erlaubt eine sehr genaue Iden-

tifizierung der meisten Proteinbruchstücke, die beim

Verdampfen und Ionisieren gebildet werden. Eine wich-

tige Anwendung dieses Verfahrens ist die Sequenzie-

rung von Proteinen. Ein großes Protein kann in kleinere

Bruchstücke (Oligopeptide) zerlegt und diese analy-

siert werden.

Verifizierung 4.6Bei jedem durchgeführten Schritt einer Aufreinigungs-

prozedur muss man sicherstellen, dass das Zielprotein,

dem das Interesse gilt, nicht verlorengegangen ist, und

dass die Bemühungen um eine Aufkonzentrierung nicht

vergebens waren. Eine denaturierende Natriumdodecyl-

sulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wird

oft für diese Kontrollen eingesetzt. Bei dieser gängigen

Labormethode wird einem Protein(gemisch) ein Pro-

benpuffer zugesetzt, der unter anderem etwas von dem

Detergenz Natriumdodecylsulfat enthält. Die Mischung

wird dann für einige Minuten aufgekocht. Nach dieser

vorbereitenden Behandlung wird die Probe in eine Pro-

benkammer eines Polyacrylamidgels geladen. Durch

Anlegen einer Gleichspannung wird wie gewohnt die

Trennung durchgeführt. Die Proteine sammeln sich

dabei in der Reihenfolge ihrer Molmassen in mehr oder

weniger schmalen Bereichen, die Banden genannt wer-

den (�Abbildung 4.14). Nach der Trennung können die

Proteinbanden durch Anfärbung mit geeigneten Farb-

stoffen sichtbar gemacht werden. Im Routinebetrieb wird

hierzu bevorzugt Coomassie-Blau eingesetzt. Die Emp-

findlichkeit dieser Färbetechnik ist begrenzt, doch ist

sie relativ schnell, sehr einfach und billig. Die Molmas-

sen werden anhand eines Molmassenstandards aus Pro-

teinen bekannter Molmassen abgeschätzt. Tritt eine ein-

zelne oder zumindest stark hervortretende Bande der

erwarteten Größe (Molmasse) auf, ist dies ein Zeichen,

dass die Aufreinigung des gesuchten Proteins tatsäch-

lich stattgefunden hat. Bei der Proteinaufreinigung im

Labor verzichtet man regelmäßig auf diese zeitaufwän-

digen Kontrollen, da für das soeben beschriebene Ver-

fahren einige Stunden anzusetzen sind; in dieser Zeit

–

–

+

+

Proteinauftrag

1 2 3 4 5

Elektrophoresekammer

Wan

deru

ng

srichtu

ng

Stromquelle

Abbildung 4.14: Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese(SDS-PAGE). Durch Polyacrylamidgelelektrophorese können Proteine mit glei-cher mittlerer Nettoladung (die von den SDS-Molekülionen herrührt) nachihren Molmassen getrennt werden. Dies geschieht mittels eines angelegtenelektrischen Feldes (Gleichspannung). Dieses Verfahren kann bei industri-ellen Prozessen nach jedem Aufreinigungsschritt durchgeführt werden, umzu verifizieren, dass das gewünschte Protein sich immer mehr anreichertund bei der Aufarbeitung weder verlorengegangen ist noch abgebaut wur-de. Die Proteine mit der niedrigsten Molmasse erreichen den +-Pol (Ano-de) zuerst. Beachten Sie, wie sich von jedem Schritt zum nächsten die Kon-zentration des gesuchten Proteins immer weiter erhöht.

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

140

kann eine Proteinpräparation verderben. Man sammelt

daher im Forschungslabor kleine Proben von allen Schrit-

ten der Aufreinigung und untersucht diese abschließend

zusammen. Führt man diesen Kontrollschritt jedes Mal

im Verlauf einer Mehrstufenaufreinigung durch, sollte

die Bande des Wunschproteins immer intensiver wer-

den (dabei muss sorgfältigst auf Verdünnungen und

ähnliche, die Konzentration verändernde Handgriffe ge-

achtet und für die Probennahme immer neu normali-

siert werden). Eine denaturierende SDS-Gelelektropho-

rese ist für gewöhnlich der zweite Schritt (die „zweite

Dimension“) einer 2D-Elektrophorese.

Proteinkonservierung 4.7Nachdem das Zielprotein isoliert und konzentriert wor-

den ist, muss es so aufbewahrt werden, dass die Akti-

vität bis zu seiner schließlichen Verwendung erhalten

bleibt. Ein Verfahren zur Proteinkonservierung ist die

Lyophilisierung (Gefriertrocknung). Bei diesem Verfah-

ren wird das Protein, das sich meist in einer flüssigen

Phase (Lösung) befindet, zunächst eingefroren. Dann legt

man ein Vakuum an, um die Verdampfung des Wassers

aus dem Eis (Sublimation) zu forcieren. Die Eiskristal-

le gehen dabei ohne den Zwischenschritt der Verflüssi-

gung direkt in die Gasphase über. Nach der Entziehung

werden die die Proteine enthaltenden Behälter versie-

gelt, so dass das getrocknete Protein kein Wasser aus

der Luft ziehen kann. Viele gefriergetrocknete Proteine

können bei Zimmertemperatur für längere Zeit gelagert

werden. Es gibt aber viele Proteine, die so empfindlich

sind, dass sie sich nicht trocknen lassen.

Maßstabsvergrößerung bei der Proteinaufreinigung 4.8Die meisten Protokolle für die Aufreinigung von Pro-

teinen sind für den Labormaßstab konzipiert (kleiner

Präparationsmaßstab). Dies ist für den Biotechnologen

akzeptabel, falls das Endprodukt nur in kleinen Men-

gen benötigt wird und entsprechend teuer verkauft wer-

den kann. Die Nachfrage nach einzelnen monoklonalen

Antikörpern bewegt sich beispielsweise im Bereich von

Grammmengen pro Jahr. Ein einzelner Bioreaktor im La-

bormaßstab ist dann für gewöhnlich ausreichend, eine

ausreichende Menge zu produzieren. Andere Proteine

(Massenproteine) werden jedoch in viel größeren Men-

gen nachgefragt, was bedeutet, dass man den Maßstab der

Herstellungsmethoden entsprechend vergrößern muss.

Eine solche Maßstabsvergrößerung (engl. up-scaling)

ist nicht immer einfach zu erreichen. Labormethoden

funktionieren vielleicht im kleinen Maßstab gut, sind

aber auf einen technischen Maßstab nicht übertragbar

(zum Beispiel, weil keine ausreichende Durchmischung

oder Wärmeabfuhr möglich ist). Änderungen der Auf-

reinigungsprozedur können frühere Validierungsergeb-

nisse des Labormaßstabes unbrauchbar machen. Wenn

die zuständige Zulassungsbehörde ein biotechnisch

hergerichtetes Protein zulässt, wird damit immer auch

das Herstellungsverfahren zugelassen. Soll das Verfah-

ren später verändert werden, muss unter Umständen

eine neue behördliche Genehmigung für den Vertrieb

des Produkts eingeholt werden. Bioverfahrenstechni-

ker (spezialisierte Ingenieure der Verfahrenstechnik)

werden an den frühen Proteinaufreinigungsschritten

beteiligt, so dass eine ausreichend effiziente Auslegung

des Verfahrens durchgeführt werden kann.

Analysenmethoden für die Zeit nach der Aufreinigung 4.9Im Verlauf eines Forschungsprojektes ist es oftmals sehr

nützlich, sich das aufgereinigte Protein sehr genau anzu-

schauen. Das Ziel ist vielleicht ein besseres Verständnis

der Molekülstruktur eines bestimmten Proteins oder die

Veränderung der Funktion eines Proteins. Die folgenden

beiden Methoden dienen diesen Zielen.

Proteinsequenzierung

Rufen Sie sich aus unserer Diskussion der Proteinstruk-

turen in Erinnerung, dass jede Proteinsorte über eine

spezifische Abfolge von Aminosäureresten verfügt, die

als Primärstruktur bezeichnet wird. Um ein Protein mög-

lichst vollständig verstehen zu können, ist es notwendig,

diese Primärstruktur zu kennen. Die Ermittlung der

Aminosäuresequenz fällt heute vielfach automatisier-

ten Sequenzierungsautomaten zu. Das Verfahren beruht

im Wesentlichen darauf, dass ein sehr großes Molekül

an das Ende des Proteins angeheftet wird. Es wird dann

abgebrochen, wobei es einen Teil des Proteins mit sich

nimmt. Das Fragment, das eine Aminosäure ist, wird

dann durch chromatographische Analyse identifiziert.

Der Vorgang wird wiederholt, bis alle Aminosäuren ge-

trennt und identifiziert sind.

4.10 Proteomik

141

Röntgenkristallographie

Die Röntgenkristallographie wird eingesetzt, um die

vollständige Tertiär- und die Quartärstruktur eines Pro-

teins zu ermitteln. Um die Methode anwenden zu kön-

nen, benötigt man reine Kristalle des Proteins, die mit

großer Sorgfalt aus einer gesättigten Lösung gezüchtet

werden müssen. Bei der Durchleuchtung mit Röntgen-

strahlen ergibt der Kristall eines reinen Proteins ein es

kennzeichnendes Beugungsmuster, aus dem durch ma-

thematische Analysen auf die Konfiguration und die

Konformation der Peptidkette zurückgeschlossen wer-

den kann (siehe Kapitel 2). Die heutzutage vollständig

computerisierte Analyse dieser Beugungsmuster erlaubt

die Erstellung eines Molekülmodells, das heute eben-

falls im Computer erzeugt und nur noch selten als reales

Modell gebaut wird. Anhand solcher Strukturanalysen

lassen sich potenzielle Modifikationen modellieren, mit

denen versucht werden kann, die biotechnologischen

Eigenschaften des betreffenden Proteins an seine Ver-

wendung anzupassen. Eine proteinkristallographische

Analyse eines biotechnologisch erzeugten Proteins ist

(in den USA) eine Voraussetzung für die Zulassung als

kommerzielles Produkt durch die zuständige Zulassungs-

behörde (FDA), da durch sie eine eindeutige Charakte-

risierung des zur Zulassung eingereichten Proteinpro-

dukts möglich ist.

Proteomik 4.10Viele Krankheiten beruhen auf Problemen bei der Pro-

teinexpression, doch lassen sich nicht alle diese Krank-

heitszustände auf einfache Weise als die Folge von

Mutationen verstehen. Da viele Proteine posttranslatio-

nalen Modifikationen unterliegen, kann sich die Analyse

solcher Krankheitsursachen sehr viel komplizierter ge-

stalten. Eine neue wissenschaftliche Teildisziplin, die

Proteomik, hat sich zum Ziel gesetzt, das komplizierte

Zusammenspiel von biologischen Vorgängen einschließ-

lich der pathologischen Abweichungen bei Krankheit

auf der Grundlage der von den Zellen erzeugten Pro-

teine zu erforschen. In der Proteomik untersucht und

vergleicht man ähnlich wie in der uns schon vertrauten

Genomik Gesamtausstattungen von Makromolekülen,

hier alle von einem Lebewesen, Gewebe oder Zelltyp her-

gestellten Proteintypen.

Das Proteom einer Zelle ist also die Gesamtheit al-

ler auf der Grundlage des in ihr enthaltenen Genoms

erzeugten Genprodukte. Das Proteom spiegelt den in der

Zelle aktuell aktiven Anteil des Erbguts wider. Ist man

an einem pathobiochemischen Problem interessiert, ver-

gleicht man die Proteinexpression gesunder mit der von

kranken Zellen, Organen oder Patienten. Diese Analyse

kann man auch mit dem Verlauf oder dem Schweregrad

einer Krankheit zu korrelieren versuchen. Das Ziel die-

ser Pathoproteomik ist es, bestimmte Proteine oder die

Mengen dieser Proteine als diagnostische Messlatten zu

nutzen und damit gegebenenfalls ein neues diagnosti-

sches Verfahren zu entwickeln oder diese Erkenntnis-

F R A G E U N D A N T W O R T

Frage

Können Sie das beste Aufreinigungsschema auswählen?Ein Beispiel eines gereinigten Proteins mit einem enormenPotenzial für einen Nutzen für den Menschen wird inKapitel 11 beschrieben. Das Protein ist das Hämoglobinaus dem Blut von Kühen (Rinderhämoglobin). Das aufge-reinigte Rinderhämoglobin bindet Sauerstoff und bringtes zu den Geweben des Körpers, ohne dabei – wie unternormalen Bedingungen – in Zellen eingeschlossen zu sein.Dieses „Kunstblut“ – oder besser dieser Blutbehelfsersatz –wird als Vollblutersatz eingesetzt und scheint keine dervon transfundiertem Rindervollblut ausgehenden akutenAbstoßungserscheinungen durch das Immunsystem desEmpfängers heraufzubeschwören. Wie Sie sich denkenkönnen, ist die Extraktion des Hämoglobins mit zahlrei-chen Problemen behaftet: Wie lässt sich aus einer großenMenge Blut das Hämoglobin gewinnen, ohne das Proteinzu zerstören? Wie lässt sich das Hämoglobin von den vielenanderen Blutproteinen abtrennen? Wie lässt sich sicher-stellen, dass bei der Prozedur keine Viren mitübertragenwerden? Wie kann die Tatsache, dass Hämoglobine Eisenenthalten, andere Blutproteine aber nicht, dazu ausgenutztwerden, eine Extraktionsmethode zu entwickeln, die fürdieses Protein spezifisch ist? Was kann man anstellen, umzu verifizieren, dass das Protein bei den Aufreinigungs-schritten nicht verlorengegangen ist?

Antwort

Schauen Sie sich die oben beschriebenen Techniken zurProteinaufreinigung daraufhin an, wie sie sich einset-zen lassen, um dieses intrazelluläre Protein von anderenProteinen vergleichbarer Molmassen abzutrennen, die sichebenfalls in den Blutzellen finden. Sie müssen erklären,warum Sie die jeweilige Technik ausgewählt haben. Es gibtmehr als einen möglichen Ablauf. Falls Sie Schwierigkei-ten haben, können Sie sich auf der Internetseite der FirmaBiopure (http://www.biopure.com) – das ist die Firma, diedieses Produkt anbietet – darüber informieren, wie es dortgemacht wird. Sie sollten in der Lage sein, mehr überseine Eigenschaften zu lernen, damit Sie die einzelnenSchritte der von Ihnen ausgearbeiteten Schrittfolge nochverbessern können.

F A&

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

142

se bei der Entwicklung von Behandlungen auszunutzen.

Es gab schon vielversprechende Durchbrüche beim Lun-

genkrebs, der Rinderseuche BSE und der Behandlung

von Nervenschädigungen.

Die Proteomik bedient sich bei der Erforschung von

Proteomen einiger der Experimentaltechniken, die wir

weiter oben in diesem Kapitel beschrieben haben. Die

zweidimensionale Gelelektrophorese wird eingesetzt,

um die ein Proteom konstituierenden Proteine voneinan-

der zu trennen, die Massenspektrometrie wird zur Iden-

tifizierung von Proteinen eingesetzt, und dabei neu gefun-

dene Proteine werden gegebenenfalls sequenziert. Ein

Teil dieser arbeitsintensiven Tätigkeiten kann in der Zu-

kunft vielleicht weiter automatisiert werden. Protein-

chips sind Biochips, die eingesetzt werden, um Proteine

zu identifizieren. Sie sind den weiter oben beschriebenen

Genchips sehr ähnlich. Proteine werden identifiziert,

wenn eine Probe in das Chiplesegerät eingebracht wird

und mit bekannten Proteinen, die auf dem Chip anwe-

send sein können, verglichen wird. �Abbildung 4.15

illustriert, wie Antikörper den Proteinaufbau detektieren.

Antikörper weisen eine Proteinbindung nach

Farbe erzeugendes Enzym

biotionylierter sekundärerAntikörper

Zielmolekül(hier: ein Cytokin)

Abfangantikörper

Abbildung 4.15: Proteinchips, die in einzigartiger Weise an einzelne Pro-teine binden, werden perfektioniert.Wenn das Protein bindet, wird ein elek-trischer Schaltkreis geschlossen oder ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Die Fä-higkeit, die Anwesenheit einzigartiger Proteine zu detektieren (Proteomik),wird es erlauben, richtige Entscheidungen in der Diagnose und/oder Thera-pie zu fällen.

Ein Bioverfahrenstechniker arbeitet im Herstellungsbereich.Er ist ein Ingenieur mit einem gediegenen Verständnis derProzesse und Abläufe, die in der Biotechnologie zur Pro-duktherstellung und -reinigung eingesetzt werden.

Herstellungsassistenten bekleiden Tätigkeiten, für dieeine Berufsausbildung als Laborant oder technischer Assis-tent notwendig ist. Arbeitgeber erwarten in der Regel min-destens zwei Jahre Berufserfahrung in einem relevanten Be-reich (wie immer besteht die Kunst darin, die von einemArbeitgeber geforderte Erfahrung erst einmal sammeln zukönnen). Herstellungsassistenten (Produktionsassistenten)arbeiten in einer biotechnologischen Fabrik, die mehrerekleinere oder größere Bioreaktoren betreibt. Einige sind auchmit der Herstellung medizinischer oder biotechnologischerGerätschaften oder Medien oder anderer Reagenzien für For-schung und Entwicklung befasst (spezielle Proteine, Zell-kulturmedien usw.). Manche Industriefermenter werden ein-gesetzt, um Nahrungsmittel oder Enzyme für industrielleProzesse herzustellen. Die genauen Aufgaben der Tätigkeithängen von dem hergestellten Produkt ab. Produktionsassis-tenten arbeiten oft in Reinräumen mit Sterilwerkbänken undÄhnlichem. Sie messen und wiegen Rohstoffe und andereChemikalien für die Herstellungsprozesse ab. An aseptischen

B E R U F S P R A X I S

� Tätigkeiten in der Proteinherstellung

Abfüllstationen richten Produktionsassistenten Apparate ein,die die gereinigten Endprodukte in die Verkaufsbehälter ab-füllen. Die Endreinigung der Produkte für die Abfüllung indie Behälter ist eine häufige Aufgabenstellung, die ein Ver-ständnis für die Aufreinigungsverfahren und ein Wissen umdie Problembeseitigung erfordert. Produktionsassistentenmüssen akkurate und detaillierte Aufzeichnungen über dieArbeitsgänge erstellen und ein Grundwissen über die recht-lichen Grundlagen und Bestimmungen haben, die sich auf ihrjeweiliges Produktionsgebiet beziehen (siehe Kapitel 12).

Produktionstechniker rekrutieren sich regelmäßig aus denReihen der Produktionsassistenten, nachdem diese ausrei-chende Erfahrung gesammelt und Geschicklichkeit bewie-sen haben. Die Gehälter sind hier wie zu erwarten etwas hö-her als auf der Ebene der Herstellungsassistenten. Für diesePositionen ist ein Bacherlorabschluss oder eine ähnliche Qua-lifikation (Diplom) in einer biologischen oder biologienahenDisziplin erforderlich (nebst Berufserfahrung). Für einen sol-chen Aufstieg kehren Herstellungsassistenten manchmal aneine Hochschule zurück, um den notwendigen Abschlussnachzuholen. Viele Firmen heißen solche Nachschulungengut und beurlauben qualifizierte Mitarbeiter für die Dauerder Weiterbildung.

Übungsaufgaben

143

Die Antworten finden Sie in Anhang A.

Wie unterscheidet sich eine proteomische Daten-

bank von einer genomischen?

Wie unterscheidet sich die gerichtete Evolution

von Molekülen im biotechnologischen Labor von

der Evolution durch natürliche Selektion?

2

1

Wie kann die proteomische Forschung von den Er-

gebnissen des Humangenomprojekts profitieren?

Warum sucht man nach neuen Proteinen vornehm-

lich mit Hilfe von cDNAs?

Warum sollte man Firmen erlauben, Proteine zu

patentieren, wo doch alle Lebewesen von Natur

aus selbst Proteine herstellen?

5

4

3

ÜBUNGSAUFGABEN

WEITERFÜHRENDE LITERATUR

Bücher

F. Baneyx (Hrsg.): Protein Expression Technologies: Cur-

rent Status and Future Trends. Horizon Bioscience

(2004); ISBN: 0-954-52325-3.

S. Brakmann und A. Schwienhorst (Hrsg.): Evolutionary

Methods in Biotechnology. Wiley-VCH (2004); ISBN:

3-527-30799-0.

H. Chmiel: Bioprozesstechnik. 2. Auflage, Spektrum Aka-

demischer Verlag (2005); ISBN: 3-8274-1607-8.

E. Golemis (Hrsg.): Protein-Protein Interactions – A Mo-

lecular Cloning Manual. Cold Spring Harbor Labora-

tory Press (2002); ISBN: 0-8796-9628-1.

G. Walsh: Proteins – Biochemistry and Biotechnology.

Wiley & Sons (2002); ISBN: 0-4718-9907-0.

D. Whitford: Proteins – Structure and Functions. Wi-

ley & Sons (2005); ISBN: 0-471-49894-7.

Artikel in Fachzeitschriften

D. Andersen und L. Krummen (2002): Recombinant pro-

tein expression for therapeutic applications. Current

Opinion in Biotechnology, vol. 13: 117–123.

H. Daniell, S. Streatfield und K. Wycoff (2001): Medi-

cal molecular farming: production of antibodies, bio-

pharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends

in Plant Science, vol. 6, no. 5: 219–226.

S. Dübel, P. Rohrbach und A. Schmiedl (2004): Rekom-

binante Antikörper: Werkzeuge gegen Krebs, Infektio-

nen und Autoimmunerkrankungen? Biologie in un-

serer Zeit, vol. 34, Nr. 6: 372–379.

P. Lorenz. und J. Eck (2004): Screening for novel indus-

trial biocatalysts. Engineering in Life Sciences, vol. 4,

no. 6: 501–504.

S. Nock und P. Wagner (2000): Proteomics: Die post-ge-

nomische Revolution. Chemie in unserer Zeit, vol. 34,

Nr. 6: 348–354.

C. Roodveldt, A. Aharoni und D. Tawfik (2005): Directed

evolution of proteins for heterologous expression and

stability. Current Opinion in Structural Biology, vol.

15: 50–56.

B. van den Burg (2003): Extremophiles as a source for

novel enzymes. Current Opinion in Microbiology,

vol. 6: 213–218.

PROTEINE ALS PRODUKTE 4

144

WEB-LINKS

Weitere Informationen zu diesem Buchkapitel

http://www.pearson-studium.de

Die Proteinstrukturinternetseite des Nationalen

Gesundheitsamtes der USA

http://www.genome.gov/Dir/Vip

Die Sequenzen bereits charakterisierter Proteine

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez

Firma Maxygen

http://www.maxygen.com

Ein biotechnologisches Unternehmen, das Produkte ver-

kauft, die durch gerichtete molekulare Evolution kreiert

wurden.

Firma Biopure

http://www.biopure.com

Ein Unternehmen, das die Reinigung von Rinderhämo-

globin geschafft hat.

Firma Sartorius

http://www.sartorius.com

Größter Hersteller von Geräten zur Aufarbeitung biolo-

gischen Materials in Deutschland.