Biotechnologische Laborübungen2004

Ziele des Seminars

• Aseptisch Arbeiten lernen

• Richtige Nährmedienbereitung und Kontrolle

• Lebensmittel mikrobiologisch und chemisch untersuchen

• Untersuchungsergebnisse richtig beurteilen können

• Kontrolle von Hygienemaßnahmen durchführen können

• Beschaffung wichtiger Materialien

Biologie, Chemie und Technik

Bildungs- und Lehraufgabe

Der Schüler soll elementare mikrobiologische Arbeitsmethoden selbstständig

durchführen können.

die hygienische Unbedenklichkeit von Lebensmitteln und daraus abgeleiteten Erzeugnissen in allen Produktions- und Vermarktungsstufen beurteilen können.

aufbauend auf den Kenntnissen der Biologie und Chemie den interdisziplinären Charakter der Biotechnologie kennen lernen.

die Ergebnisse seiner Untersuchungen interpretieren können.

sich seiner Verantwortung für die menschliche Gesundheit bewusst sein.

Überblick

Theorie zu den einzelnen Workshops Bereitung der Nährmedien Rohmilch / past. Milch Mittagessen Wasser, Frischkäse Stammhaltung, Hygiene

Begriffe und Definition des aseptischen Arbeitens: Keim: vermehrungsfähiger Mikroorganismus Steril: frei von vermehrungsfähigen Mikroorganismen

jeglicher Art (Phagen, Viren, Sporen miteinbezogen) Aseptisch: arbeiten unter Bedingungen, die

Fremdorganismen ausschalten Kontamination: Anwesenheit von Fremdorganismen Desinfektion: weitgehende Abtötung von Mikro-

organismen auf Oberflächen Dekontamination: weitgehende Abtötung von Mikro-

organismen in Nährmedien

Nährmedienbereitung - Fehler

Unterscheide: autoklavierbare und nicht autoklavierbare Substanzen

Achtung: auch autoklavierbare NM halten Hitze nur begrenzt aus

Erhitzung: Selektivitätsverlust des NMs durch zu langes oder zu hohes Erhitzen bzw. durch mehrmaliges Aufschmelzen des NMs

Wasser: entionisiert (Ionen des Wassers + Peptone Trübung) frisch zubereitet (Achtung vor Aufnahme von CO2 und anderen Substanzen aus der Luft) pH-Wert-Verschiebung, durch Trübung erschwerte Auswertung, durch Ausfällen der Salze ev. Wachstumshemmung der MO

Nährmedienbereitung - Fehler

Agar: zu starke Erhitzung Gelstruktur des Agars wird zerstört Erhitzung im sauren Bereich Depolymerisation

• Lösungen neigen zum Sedimentieren bei Herstellung von NM ist auf die Homogenität durch Rühren zu achten (Gefahr des Anbrennens, ev. nicht Festwerden des NMs bei Inhomogenität)

Peptone: sind hygroskopisch Verklumpung enthalten Phosphate + Ca /Mg Trübung, Ausfällung durch zu starke Erhitzung chem. Veränderungen

Salze: Gallensalze empfindlich bei zu tiefen pH Sulfit wird zu Sulfat oxidiert unwirksam

Azid zersetzt sich bei stärkerer Hitzeeinwirkung

Nährmedienbereitung - Fehler

Kohlenhydrate: Karamelisierung, Maillardreaktion, Hydroxymethylfurfurolbildung

pH-Wert: deionisiertes Wasser falsche Einwaage des NM-Pulvers falsche Lagerung des NMs (hohe Luftfeuchtigkeit) pH-Verschiebung

Lagerung des fertig hergestellten NMs: zu lang Austrocknungsgefahr, Kontamination durch psychrotrophe MO, Verlust der Wirksamkeit

Einfluss der Temperatur des Wasserbades:

zu heiß MO sterben ab zu kalt Festwerden des NMs Inhomogenität, schlechte Verteilung der Nährstoffe

zu lange Lagerung Selektivitätsverlust des NMs

Arbeitsablauf Vorbereitungen - saubere Ansatzgefäße Nährmedienansatz

ausreichend großes Ansatzgefäß,

Pulver genau einwiegen, dest. Wasser genau abmessen, gut mischen und quellen lassen, NM vollständig lösen ~100°C,

portionieren und abfüllen Autoklavieren pH-Wert überprüfen Supplementierung Gießen von Platten bei <50°C Qualitätskontrolle, Lagerung, ev. Trocknung Protokoll

Kultivierung von MO

Bouillonkulturen Agarstrich-/Stichkultur Kultivierung auf Agarplatten Koch`sches Plattengussverfahren Spatel-Verfahren Petrifilm-Methode MPN-Technik / Titer

Fraktionierter Ausstrich

1

2

3

45

1 2

3

Koch´sches Plattengussverfahren

Most probable number MPN

1 ml 1 ml 1 ml

1 ml1 ml1 ml

V0

V1 V2 V3

V1 V2 V3

Probe

1 ml

1 ml 1 ml

Titer - Presence/Absence

1 ml

V0

Probe

Beispiel Milch

GKZ: Koch, PCA, 150.000K/ml Psychrotrophe: Koch, PCA, 10.000K/ml Coliforme: Koch, VRB+OL, 2.000K/ml Coliforme: MPN, LS-B, 2.000K/ml Antibiotika-Nachweis

Beispiel Wasser

Untersuchtes Produkt: Trinkwasser nicht aufbereitet

Kriterium Grenzwerte

Gesamtkeimzahl bei 22°C 100/mlGesamtkeimzahl bei 37°C 20/mlColiforme Negativ/100mlE. coli Negativ/100mlEnterokokken Negativ/100ml

Frischkäse

Probenvorbereitung: 10±1g Probe mit Citratlösung auf 100g auffüllen, 2min stomachen

Säurebildner: Koch, CBL, >100.000K/g Coliforme/E.coli: MPN, FC-LS, <10K/g He + SchiPi: Koch, YGC, <1.000K/g

Methoden zur Bestimmung der KZ von Oberflächen

Abklatschverfahren: Schwämmen,

RODAC-Platten, Bacto-Strip-Streifen,

Agaroid-Stangen

Abstrichverfahren

Abschwemmverfahren

Überschichtungsverfahren

Bestimmung der Luftkeimzahl

Sedimentationsverfahren

Impaction-Verfahren

DANKE

für ihre Aufmerksamkeit