6. UV/Vis- und...

Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen

Instrumentelle Bioanalytik

12.12.2011

Instrumentelle Bioanalytik6. UV/Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie

6.1 Grundlagen6.2 Probenvorbereitung und Aufnahme der Spektren6.3 Chromophore6.4 Anwendungen der UV/VIS-Spektroskopie6.5 Fluoreszenzspektroskopie6.6 Weitere Anwendungen

6-1



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6. UV/Vis-Spektroskopie

6-2

6.1 Grundlagen

Einteilung Spektralbereich:Ultraviolettstrahlung: elektromagnetische Strahlung im Wellenbereich von 200 bis 400 nm(UV-A: Wellenlängenbereich von 400 bis 320 nm, UV-B: 320 bis 280 nm, UV-C: 280 bis 200 nm.)Sichtbarer Bereich: erstreckt sich 400 bis 780 nm (für das menschlichen Auge sichtbares Licht)

Elektronenübergänge (Anregung)Wechselwirkung von elektromagnetischen Wellen und Molekülen führt bei Absorption Im UV/Vis zur Anregung von Elektronen, im allgemeinen Valenzelektronen.Grundvoraussetzung: Die Energie der eingestrahlten Photonen muss ≥ der Energiedifferenz zwischen dem Singulett-Grundzustand S0 und dem ersten elektronisch angeregten Singulett S1-Zustand sein.Auswahlregeln∗ Multiplizität darf sich nicht ändern (Spin-Verbot,Gesamtspin muss erhalten bleiben)∗ Übergänge zwischen Orbitalen gleicher Parität sind verboten (Symmetrie-Verbot)Elektronische Übergänge der Elektronen in den Orbitalen geschehen vornehmlich durch elektrische Dipolstrahlung. Für Einelektronenübergänge gelten folgende Auswahlregeln:Δl = +-1, Δm = 0, +-1. ∗ Beteiligte Orbitale müssen sich räumlich überlagern (Überlappungsverbot) Am striktesten gilt das Spinverbot. Doch häufig treten auch verbotene Übergänge auf, jedoch mit kleiner Übergangswahrscheinlichkeit (kleiner Intensität) Abb.: einfaches Jablonski-Termschema

Zur Anzeige wird der QuickTime™ Dekompressor „TIFF (Unkomprimiert)“

benötigt.

200 280 320100 780400 VIS (sichtbares Spektrum)

IRVUV UV-C UV-B UV-AEUV



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6.1 Grundlagen

Elektronenübergänge Organischer Moleküle sind im Wesentlichen:

Abb.: Absorptionsbereiche der verschiedenen Elektronenübergänge

Abb.: Molekülorbitale und Elektronenübergänge

n π ∗→

π π ∗→

Anregung eines nichtbindenden Elektrons (aus einem freien Elektronenpaar) in eine antibindendes π*-MO

verbotener Übergang

Anregung eines Elektrons aus bindendem π*-MO) in eine antibindendes π*-MO



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6-4

6.1 GrundlagenLichtabsorption und Spektrum

d

c

cε

Lichtstrahls der Intensität I0 wird durch Absorption beim Durchstrahlen eines homogen isotropen Mediums der Schichtdicke d durch Absorption abgeschwächt: (Reflexions- und Streuverluste nicht berücksichtigt)

0I c dI

ln 2,303 ε= ⋅ ⋅ ⋅

0IA c dI

log ε= = ⋅ ⋅

f ( )ε λ=

Lambert-Beer´sche Gesetz

Gilt für monochromatische Strahlung und verdünnte LösungenAbsorptionskoeffizient ist eine substanzspezifische Größe und ist eine Funktion der Wellenlänge

ε: molarer Absorptionskoeffizient [l.mol-1.cm-1, cm2.mmol-1)c: Konzentration der absorbierenden Spezies [mol.l-1]d: Schichtdicke, optische Weglänge [cm]

Absorption vs. Konzentration

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 2 4 6 8 10 12

Anteile Mutterlösung

Abs

orpt

ion

1cm Küvettemm Küvette 4)Linear (1cm Küvette)Linear (4 mm Küvette

Additivität der Absorptionen bei mehreren absorbierenden SpeziesBandenspektrum (breite Banden, mehr oder weniger strukturiert): aufgrund Linienverbreiterung durch zahlreiche Schwingungsniveaus und Wechselwirkung mit den Lösemittelmoleküle (in Lösung machen sich Rotationsbanden nicht bemerkbar, jedoch in Dampfspektren).Lage der Absorptionsbanden hängt von der Art des Elektronenübergangs statt (s. isolierte Chromophore). Durch sterische, induktive und mesomere Effekte wird die Absorption stark beeinflusst.Lösemittel kann bei bestimmten Chromophoren einen charakteristischen Einfluss haben.



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6.2 Probenvorbereitung und Aufnahme der Spektren

Zweistrahl-Spektrometerschematischer Aufbau

Dioden-Array-Systemschematischer Aufbau

Abb.: DA-Spektrophotometer

Gerätetypen



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6.3 ChromophoreChromophor ist ein Molekülteil, der UV-Strahlung oder sichtbares Licht absorbiert.

(z.B. in Aceton: Carbonylgruppe)

Auxochrom: Substituent an einem chromophortragendenen Molekül, der die Absorptionswellenlängen und/oder deren Intensität beeinflusst; z.B. Atomgruppen mit n-Orbitalen. Inkrementsysteme zur Berechnung der Verschiebung des Absorptionsmaximums.

Tabelle: Absorptionen isolierter chromophorer Gruppen (energieärmste Elektronenübergänge)



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Modulation von Chromophoreigenschaften

Hochkonjugierte Polyene mit n Doppelbindungen:

Effekt der Konjugation

6.3 Chromophore

Art des Shifts Bezeichnunghöhere Wellenlänge bathochromniedrigere Wellenlänge hypsochromhöherer Extinktionskoeffizient hyperchromniedrigerer Extinktionskoeffizient hypochrom

max 134 31nλ = ⋅ +

HOMO-LUMO-Übergänge

Längstwellige erlaubte Absorption in konjugierten all-trans-Polyenena aufgenommen in Petrolether bzw. Etherb aufgenommen in Benzol



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Langwellige Absorptionsbanden der all-E-konfigurierten Oligo(2,5-dipropoxyphenylenvinylen)e in Chloroform(n = 1, 2, 3, 4, 6, 8, 11)

Korrelation der Übergangsenergien E(n) mit derreziproken Anzahl der Benzolringe

Konjugierte Oligo/Polyenelangwellige Absorptionsbande: systematischer bathochromer undhypsochromer Effektmit wachsender Zahl n der Wiederholungseinheiten

Konvergenzgrenze:effektive Konjugationslänge: bathochrome Verschiebung erreicht Grenzwert von Δλ = ± 1 nm

6.3 Chromophore



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Chromophore in der Natur

6.3 Chromophore



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Tiefgrüne Chinhydrone sind typische CT-Komplexe. Die π,π-Wechselwirkung des elektronenreichen Hydrochinons mit dem elektronenarmen 1,4-Benzochinon bewirkt die Farbvertiefung.

Charge-Transfer-Komplexe und Aggregate

− Eigenassoziation von Molekülen durch elektrostatische Wechselwirkungen, H-Brückenbindung oder Van der Waalsche Kräfte → temperatur- und konzentrationsabhängige Banden.

− Bei Elektronen-Donor-Akzeptor-Komplexen, auch Charge-Transfer-Komplexe genannt, ist der Elektronenübergang S0→S1 in diesen 1:1-Komplexen mit einem partiellen Ladungstransfer vom Donor auf den Akzeptor verbunden.

6.3 Chromophore

Hydrochinon Chinon Chinhydron

CT-Komplex



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→ Quantitative Analyse (Konzentrationsbestimmung)→ Bestimmung von Gleichgewichten und Dissoziationskonstanten.→ Schmelzkurven von DNA, RNA → kinetische Untersuchungen zum Verfolgen von chemischen Reaktionen.→ Detektionsmethode (z.B. HPLC)

charakteristische Erhöhung der Absorption: Basenstapelung (base stacking)⇒ Bestimmung Schmelztemperatur

6.4 Anwendungen der UV/Vis-Spektroskopie

Absorptionsmessungbei 260 nm



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6-12

6.4 Anwendungen UV/VispH-Wert-Abhängigkeit der Absorption⇒ optischer pH-Sensor Reflexions-Spektrophotometrie

Durch (De)Protonierung des Farbstoffes/Indikators kommt eszur Veränderung im (Reflexions-)SpektrumHBTB + H2O BTB- + H3O+

pH nimmt abIsosbestischer

Punkt

Bromthymolblau

pKs = 7,1

pH-Farbskala von Bromthymolblau



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6-13

6.4 Anwendungen UV/VisPhotofragmentation

eines heterocyclischen Spirans

Transmissions-Reaktionspektrum(Photolyse bei 365 nm in Acetonitril)

irreversible Reaktion

Extinktionsdifferenzen-Diagramm

Einheitlichkeit der Reaktion:- isosbestische Punkte- lineare Extinktionsdifferenzen-Diagramme



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6-14

6.4 Anwendungen UV/VisProteinbestimmungPhotometrische KonzentrationsbestimmungPeptidbindung: starke Absorption mit Maximum bei rund 190 nmJedoch: VUV-Wellenlängenbereich (O2, wässr. Puffer absorbieren ebenfalls; Interferenz mit anderen Chromophoren; Output Spektrometer klein)

⇒ Messungen bei 205 nm (ε ≈ 30-35, 1 mg/ml) oder 210 nm (ε ≈ 20-24, 1 mg/ml)

Jedoch: manche Seitenketten absorbieren ebenfalls bei 205 (210) nm (Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, Arg)

Absorptionsspektren des Peptid-RückgratsChromophore (im UV-Bereich) in Aminosäuren/Peptiden



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Absorptionsspektren aromatischer AS(Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin)(Logarithmische Auftragung des Extinktionskoeffizienten)

UV-Absorption bei 280 nmdurch Tyrosin und Tryptophan (aromatische Seitenketten; geringer: Phenyalanin und Disulfidbindungen)A280 ist für verschiedene Proteine unterschiedlich (1 mg/ml: 0 bis 4, meist 0,5 bis 1,5)

theoretische Berechnungsformel: A280 (1 mg/ml) = 5690nTrp + 1280nTyr + 120nCys

n: Anzahl der Aminosäureinheiten im Polypeptid

Quantitative Proteinbestimmung6.4 Anwendungen UV/Vis



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6-16 Schematisches Absorptionsspektrum von DNA

Problem: Extinktion von Nukleinsäuren etwa um den Faktor 10 größer

⇒ Interferenz mit Nukleinsäuren

Protein (mg/mL) = 1.55 A280 – 0.76 A260Formel nach WARBURG u. CHRISTIAN

in Gegenwart von Nukleinsäuren:

auch: Protein (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51 Formel nach WHITAKER u. GRANUM

viele weitere Formeln, Eignung muss geprüft werden

Probleme mit Proteinen:- Proteine treten in Abhängigkeit von ihrer Konzentration miteinander in WW- Proteine verändern konzentrationsabhängig ihre Sekundär-und Tertiärstruktur (partielle Denaturierung in verdünnter Lösung)- Streuung und Reflexion durch kolloidale Proteinlösungen

Ebenfalls: Zellzahl bzw. –dichtenbestimmung in Fermentationslösungen

Proteinbestimmung6.4 Anwendungen UV/Vis



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6-17

6.4 Anwendungen UV/Vis

Quantitative Bestimmung von Proteinen – Bradford-Methode

- Proteinlösung wird mit Coomassie-Blau (definierter Konzentration) versetzt.⇒ Absorptionsmaximum wird durch Komplexbildung mit den Proteinen von

465 nm nach 595 nm verschoben.- Quantifizierung: Kalibriergerade der Absorption bei 595 nm

alternativ: Standardaddition (mehr Probenmenge, unempfindlicher gegen Verunreinigungen)

Coomassie Brilliant Blue G-250(auch zur Proteinfärbung)

Kalibriergerade zur Proteinbestimmung



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Nucleotide Extinctioncoefficient ε at 260 nmdAMP 15200 lmol-1cm-1

dTMP 8400 lmol-1cm-1

dGMP 12000 lmol-1cm-1

dCMP 7100 lmol-1cm-1

Desinfektion durch UV-C

DNA (Nukleinsäuren) und UV-C⇒ Bildung von Thymin-Dimerenkann zu bösartigem Hauttumoren führenEnzymatisches DNA-RepairsystemDeoxyribodipyrimidin-Photolyase(reversible Spaltung)(bei Säugern nicht nachgewiesen)

Wert zwischen 1,8 und 2,0 ⇒ DNA in reiner Form

Interferenz mit ProteinenReinheitsfaktor

Störung der helikalen Struktur

Absorptionsmessung bei 260 nm

A260 = 1 ⇒ 30 μg/ml einsträngige DNA⇒ 40 μg/ml RNA⇒ 50 μg/ml doppelsträngige DNA

Nukleinsäuren (quantitative Analyse)6.4 Anwendungen UV/Vis



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ELISAEnzymgekoppelter ImmunadsorptionstestEnzyme-linked Immunosorbent AssayNachweis von: Proteinen, Viren, Krankheitserregern, auch nieder-molekularen Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide

FestphaseMikrotiterplatten aus Kunststoff, 96-Well-Format.

QuantifizierungsassaysBeispiel:

Hepatitis-B-Virus

Nachweisreaktion mit Peroxidase und Photometrie

2,2'-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsäure)

Bsp.: Bestimmung der Aktivität mit ABTSIndikatorreaktion durch Zugabe einer peroxidhaltigenEntwicklungslösung mit ABTS (Cosubstrat) Das durch die Enzymreaktion gebildete ABTS+ wird (im sichtbaren Spektrum) photometrisch bestimmt.

6.4 Anwendungen UV/Vis



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6. Spektroskopie

6-20

Franck-Condon-Prinzip

IC

IC

S0

S2

S1

ES2

ES1

ES0

3

E

1

2

1 S0-S2 Absorption2 S0-S1 Absorption3 S1-S0 Fluoreszenz

IC = Internal Conversion

strahlungslose Übergänge

Jablonski-Termschema

(Schwingungsrelaxation)

6.5 Fluoreszenzspektroskopie



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6. Spektroskopie

6-21

6.5 Fluoreszenzspektroskopie

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400wavelength [nm]

Absorption

Fluoreszenz

λexc=276 nm λem=320 nm

Stokes shift

44 nm

(für kleine Fluorophorkonzentrationen)P0 Intensität des eingestrahlten LichtesΦ Fluoreszenzquantenausbeuteε Molarer Absorptionskoeffizient des Analytenc Konzentration des Analytend Schichtdicke

Absorptions- und Fluoreszenzspektrum von Naphthalin (C10H8)

Anzahl emittierter PhotonenΦ = ————————————— (≤ 1)

Anzahl absorbierter Photonen

FluoreszenzintensitätF ≈ P0 × Φ × (2.303 × ε × c × d)



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6. Spektroskopie

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StrahlungsübergängeStrahlungslose Übergänge

ES0

ISC

S0

T1

ES2

ET2

ES1

ET1

4

E

IC

ICS2

S1

3

1

2

1 S0-S2 Absorption2 S0-S1 Absorption3 S1-S0 Fluoreszenz

IC = Internal Conversion

4 T1-S0 Phosphoreszenz

Phosphoreszenz (Exkurs)

ISC = Intersystem Crossing

strahlungsfreie Prozesse: Vibrationsrelaxation (VR), Interne Konvertierung (IC), Intersystem Crossing (ISC)

Jablonski-Diagramm für Benzophenon



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6. Spektroskopie

6-23

6.5 FluoreszenzspektroskopieFluoreszenz-Spektrophotometer

Bildquelle: http://www. edinst.com

Anregungs-monochromator

Strahlungsquelle, z.B. Xe-Strahler

Schlitzblenden

Emissionsmonochromator

Detektor (z.B. Photomultiplier, PMT)

ProbenkammerFaseroptik-Fluorometer

Faserkopf6-um-1 Anordnung

6 Emissionsfasern1 Anregungsfaser

90°-Anordnung (geringstes Streulicht)



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6. Spektroskopie

6-24

6.5 Fluoreszenz

Fluoreszenzspektren aromatischer Aminosäuren (λEx 257 nm, 274 nm, 278 nm) bei neutralem pH in Wasser bei RT

Tabelle: Fluoreszenzparameter von aromatischen Aminosäuren(neutraler pH, Wasser, RT)

Instrinsische Fluoreszenz von Polypetiden / Proteinen



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6. Spektroskopie

6-25

6.5 Fluoreszenz

Die Primärstruktur besteht aus 238 Aminosäuren mit einer Molekülmasse von 26,9 kDa. Der eigentliche Fluorophor des GFP bildet sich offenbar autokatalytisch aus der Tripeptidsequenz Ser65–Tyr66–Gly67 innerhalb der Polypeptidkette.

Aequorea victoriaQuallenart aus dem Pazifischen Ozean

benötigt werden, umfassen ein Ca2+ aktiviertes Photoprotein, genannt Aequorin, das ein blaues Licht ausstrahlt und ein zusätzliches fluoreszierendes Protein, welches das blaue Licht des Aequorins absorbiert (strahlungsloser Energietransfer ⇒ FRET) und dabei grünes Licht ausstrahlt. Das Licht wird in der Qualle in mehr als 100 dünnen lichtproduzierenden Organen produziert, die den äußeren Glockenkörper umlagern.

Im Jahr 2008 wurde der Nobelpreis für Chemie für die „Entdeckung und Weiterentwicklung des grün fluoreszierenden Proteins“ an Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien verliehen.

Bändermodell nach PDB

Anwendung in der Zellbiologie: liegt in der Möglichkeit, GFP mit beliebigen anderen Proteinen Gen-spezifisch zu fusionieren. Durch die Fluoreszenz des GFP kann so die räumliche und zeitliche Verteilung des anderen Proteins in lebenden Zellen, Geweben oder Organismen direkt beobachtet werden ⇒ Fluoreszenzmikroskopie

Aequorea victoria haben hell fluoreszierende Punkte um den Seiten-rand des Glockenkörpers. Die Bestand-teile, die für diese Biolumineszenz

Instrinsische Fluoreszenz von Proteinen

GFP (grün fluoreszierendes Protein)



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6. Spektroskopie

6-26

6.5 FluoreszenzOptische Enzym-Biosensoren / Opt(r)odenFluorimetrische OptodenNAD(P)H-Fluoreszenz: Dehyhrogenasen katalysierte ReaktionenFlavoproteine: Oxidasen und Oxygenasen

Laktatmonooxygenase: (Flavin-abhängig!)FMN: oxidierte Form: Emissionsmaximum bei 525 nm (Anregung mit 460 nm)

reduzierte Form: Emissionsmaximum bei 507 nm (Anregung mit 410 nm)



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6. Spektroskopie

6-27

Luciferin Oxyluciferin∗ Oxyluciferin + hνLuciferase

O2

Biolumineszenz

Leuchtkäfer-Luciferase:

ATP als Cosubstrat ⇒ ATP-BestimmungEmission bei 580 nm (grüngelb)

Bakterielle Luciferase:

FMNH2 und Fettsäurealdehyd (490 nm)

FMNH2 + RCHO + O2

FMN + R-COOH + H2O + hν

⇒ Bestimmung von NAD(P)H und

Dehydrogenase-abhängige Reaktionen



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6. Spektroskopie

6-28

Biolumineszenz-SensorModifizierung von Mikroorganismen mittels Gentechnik (Genmanipulation)Rekombinanten (für die Metallionenanalyse)

Reportergen: lux-Gene aus LeuchtbakterienPromoter Strukturgen: Metallresistenz-Gen



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6. Spektroskopie

6-29

6.5 FluoreszenzFRET - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Abb. : FRET, vereinfachtes JABLONSKI-Termschema

Elektronisch angeregtes Molekül, Energieabgabe:- in Form von Strahlung, - in Form von Wärme an die Umgebung oder - durch Übertragung auf ein anderes Molekül(Anmerkung: Elektronentransfer ausgeklammert)

unterschiedliche Prozesse:∗ Stoß oder Komplexbildung der Reaktionspartner ⇒ Wechselwirkungsabstand ≤ 10 Å∗ Energieübertragung zwischen Molekülen mit größeren Abständen: 20 - 100 Å

FÖRSTER-Transfer bzw. "Fluorescence Resonance Energy Transfer", FRET



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6. Spektroskopie

6-30

6.5 FluoreszenzFRET - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Übertragungsrate kET

strahlungslose Dipol-Dipol-Wechselwirkungen zwischen fluoreszenzfähigen Molekülen, Kriterien:

- Spektrum: Überlappung Emissionsspektrum des Donors und Absorptionsspektrum des Akzeptors - Schwingungsebenen (elektronisch): von Donor und Akzeptor müssen parallel zueinander stehen- Abstand: Wechselwirkung von Donor und Akzeptor nur innerhalb weniger Nanometer

Abb.: FRET, Abstands-abhängigkeit der Effizienz



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6. Spektroskopie

6-31

6.5 FluoreszenzAnwendungen FRET - „optisches Nanometermaß“

Anwendungsbeispiele des FRET in der Biochemie mit Hilfe der Fluorophore YFP und CFP.

a) Aufklärung von Konformationsänderungen von Proteinen. b) Aufklärung von Interaktionen (z. B. Dimerisierungen) von Proteinen.

YFP: modifizierte Version des Orginal-GFP, gelbe FluoreszenzFörsterradius GFP – YFG: 4,9 nm

FRET in der Biochemie- Nachweis der Interaktion, Homo- und Heterodimerisierung von Proteinen - Konformationsänderungen von Proteinen - Aufklärung von Signaltransduktionswegen



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6. Spektroskopie

6-32

1965 wurde entdeckt, dass Ethidiumbromid an DNA bindet und dass sich dabei sein Absorptionsspektrum verändert. 1972 wurde Ethidiumbromid erstmals zum Anfärben von DNA in Gelelektrophoresen eingesetzt

Das Emissionsspektrum bleibt nahezu unverändert. Durch die Interkalation von Ethidiumbromid in Nukleinsäuren nimmt die Intensität der Fluoreszenz-Emission um den Faktor 50 -100 zu.

Konzentrationsbestimmung von NukleinsäurenEthidiumbromid (Interkalation)

6.5 Fluoreszenz



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6. Spektroskopie

6-33

The PHERAstar Plus is the premier multidetection HTS microplate reader with Simultaneous Dual Emission detectionin all modes and is able to perform all leading non-isotopicdetection technologies: ∗ Fluorescence Intensity incl. FRET ∗ Fluorescence Polarization∗ Time-Resolved Fluorescence∗ TR-FRET ∗ Luminescence∗ UV/Vis Absorbance

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6.5 Fluoreszenz



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6. Spektroskopie

6-34

Anwendungen FRET Konzentrationsbestimmung von NukleinsäurenIn der Molekularbiologie findet FRET bei der Quantifizierung von Nukleinsäuren mit Hilfe der Real time quantitative PCR Anwendung. Zu diesem Zweck werden zwei in Überschuss zugesetzte und mit Donor-und Akzeptorfluorophoren markierte Oligonukleotide als Hybridsonden (LightCycler®-Sonden) eingesetzt, die spezifisch an die DNA während eines PCR-Zyklus binden. Die Bindung der Hybridsonden an die DNA und die damit verbundene Annäherung der Sonden ermöglicht einen FRET. Das FRET-Signal nimmt dabei in Abhängigkeit von der DNA-Konzentration zu.

Quantifizierung von Nukleinsäuren mit Hilfe der Real time PCR und LightCycler®-Sonden. (1) Einsatz von LightCycler®-Sonden, die mit 2 verschiedenen FRET-Fluorophoren markiert wurden. (2) Während eines PCR-Zyklus hybridisieren die Sonden mit dem komplementären DNA-Strang und

ermöglichen somit eine Fluoreszenz des Akzeptors. (3) Die Akzeptor-Fluoreszenz steigt proportional mit der Konzentration komplementärer DNA.

6.5 Fluoreszenz



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6. Spektroskopie

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Prinzip: evaneszente Welleneffekte

Konfiguration eines faseroptischen Immunosensors

SPR – OberflächenplasmonenresonanzResonanzwinkel reagiert sehr empfindlich auf Brechungsindexänderungen

TIR – Total Internal Reflection

TIRF: Anregung von Fluoreszenzdurch evaneszente Welleneffekte

http://www.tirftechnologies.com/



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6. Spektroskopie

6-36

Chemically Modified TIRF slides andTIRF Microscopy lightguides

Principles of TIRF

TIRF Microscopy (TIRFM)

6.5 Fluoreszenz



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6. Spektroskopie

6-37

37

TIRF-EC

Schematics of TIRF-ElectroChemistry (TIRF-EC) SystemThe surface of TIRF slide is coated with transparent film of indium tinoxide (ITO), which is patterned to obtain several electrodes. In typical TIRF-EC experiment, electric field applied to central ITO electrode controls the behavior of molecules at and near theelectrode, while TIRF monitors the behavior.

6.5 Fluoreszenz



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6. Spektroskopie

6-38

38

Detektionsprinzipien

Surface Plasmon Resonance (SPR)

A large variety of bio-interactions can be monitored, such as antibody/antigen, peptide/antibody, DNA/DNA, antibody/bacteria etc.

* label-free biomolecular interaction analysis

* real time

6.6 Weitere Anwendungen



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6. Spektroskopie

6-39

Time

Res

pons

e

Completely blocked target - all target sites occupied

• All 4 compounds have the same affinity KD = 10 nM = 10-8 M• The binding kinetic constants vary by 4 orders of magnitude

kon koff

M-1s-1 s-1

106 10-2

105 10-3

104 10-4

103 10-5

Compounds with slow off-rates occupy the target for a longer time

Biacore T100

Surface Plasmon Resonance (SPR)

6.6 Weitere Anwendungen



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RAPid 4 (Resonance Acoustic Profiling)

http://www.ttplabtech.com/rapid4/index.htm

key applications:∗ optimising recombinant protein and antibodies affinities∗ assessing the concentration and integrity of recombinant proteins∗ antibody and antigen isotyping∗ improving protein expression, extraction and purification processes.

piezoelektrischer (akustischer) Transducer

Sensorkassette mit 2 Durchflusszellen

QMB (Quarz crystal Microbalance)

6. Spektroskopie6.6 Weitere Anwendungen

* label-free

* real time

Δ ffo

= Δmm

6. UV/Vis- und...

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