Änderungen der Zellzyklusparameter chinesischer Hamsterfibroblasten unter chronischer Hypoxie,...
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464 Specialia ]~XPERIENIIA29]4 shows that the yolk sac bound iron from serum nearly as well as from FeC13. The bottom curve in the Figure shows that chorioallantoic tissue had low capacity to bind iron from serum. In 1 h yolk sac tissue had bound 0.90 ng/mg iron while chorioallantoic tissue had bound only 0.03 ng/mg. This discrimination did not appear between the 2 placentM tissues when iron was taken up from FeC13. The effects of metabolic inhibitors on in vitro iron binding from rat serum by chorioallantoic and yolk sac tissues are shown in the Table. In one set of experiments FeC13 was substituted for serum. Yolk sac binding was reduced by sodium arsenite, rotenone and ethacrynie acid 95% (P < 0.001) 82% (P < 0.001) and 46% (P< 0.001) respectively. 1Rotenone and ethacrynic acid did not affect binding significantly in chorioallantoic tissue and sodium arsenite produced an unexpected 390/o increase (P < 0.01). Ethacrynic acid and rotenone were dissolved in 0.4% ethyl alcohol. This concentration of alcohol did not significantly modify control values. Yolk sac iron binding from FeC13 decreased somewhat (19%) with sodium arsenite, but chorioallantoic binding was relatively unaffected. The effects of proteolytic enzymes on in vitro iron binding from serum are shown also in the Table. Trypsin reduced binding in chorioallantoic and yolk sac tissues 39% (P < 0.01) and 65% (P < 0.001), and papain reduced binding 29% (P < 0.025) and 77% (P < 0.001), respectively. Chymotrypsin was the least effective, reducing binding in chorioallantoic and yolk sac tissues 23% (P < 0.05) and 29% (P < 0.025). It is not likely that the enzymes produced their effects through prote- olysis of transferrin since AZARI and FEENY 1~ have show n that transferrin is resistant to trypsin and chymo- trypsin. Although iron and iron-transferrin have been reported to chelate with several compounds n, no work has shown that iron-transferrin chelates with metabolic inhibiting or proteolytic agents. The responses to these agents by the y01k sac resembles the process which has been described for the reticulocyte by JANDL et al 1~. These have been used as arguments for cellular reception of iron from irontransferrin as being a process requiring metabolic energy and a protein receptor. Previous in vivo experiments indicate that the rat yolk sac on days 14, 16, 18 and 20 has a relatively short-span capability of transmitting iron to the fetus (42% of intracardiac injected iron on day ~6 only)s. There was no appreciable storage of iron either in the yolk sac or chorioallantois on those days. The present in vitro experiments demonstrate that yolk sac tissue has a high binding affinity for iron on day 16. This may be related to the apparent, ability of the organ to transfer iron to the fetus on that day. The binding seems to be metabolically sensitive and is decreased by proteolytic enzymes, indicating the possibility of a receptor relationship. Chorioallantoic tissue on day 16 has a low binding affinity for iroli from serum. The binding is metabolically insensitive and is only mildly affected by proteolytic enzymes. Nevertheless, the chorioallantois, as pre- viously shown on day 16, still apparently conveys the major portion of iron to the fetus (58%). At this time the physical size or bulk of the chorioallantois is about 10 times greater than the yolk sac. These results are made more interesting in light of the recent suggestion of MANSOUR et al. 13 that an iron transport system matures in the rat placental cell membrane between days 14 and 17 and becomes efficient by day 20. Zusammen/assung. Nachweis, dass das Eisenbindungs- verm6gen der Dottersackplacenta bedeutend gr6sser ist als bei der chorioallantoiden Placenta und dass diese auch unter der Einwirkung yon den Stoffwechsel beeinflussen- den Stoffen ein verschiedenes Verhalten zeigt. R. J. 13. GARRETT 14, •. E. GARRETT and J. W. ARCHDEACON 15 Department o/ Physiology and Biophysics, Medical Center, University o/Kentucky, Lexington, (Kentucky 40505, USA), 25 September 7972. 10 p. R. AZARIand R. E. FEENEu J. biol. Chem. 232, 293 (1958). 11 G. BATES, C. BILLUPSand P. SALTMAN, J. biol. Chem. 242, 2816 (1967). 12 j. H. JANDL, J. K. INMAN, R. I. SIM~ONDSand D. W. ALLEN,J. olin. Invest. 38, 161 (1959). 18 M. M. MA~so~:R, A. R. SCHULERTand S. R. GLASSER,Am. J. Physiol. 222, 1628 (1972). i~ Present address: College of Pharmacy, Medical Center, University of Kentucky, Lexington (Kentucky 40506, USA). 15 This work was supported by U.S. Public Health Service Grant No. HD 05016 and Predoctoral Fellowship Grant No. FO1-DE41063 to R.J.B.G. ~nderun~en der Zellzyklusparameter chinesischer gernessen am Impulszytophotometer Unter hypoxischen Bedingungen treten Anderungen im Proliferationsverhalten chinesischer Hamsterfibro- blasten in vitro auf. Autoradiographische Untersuchungen der Flussraten yon einer Zyklusphase zur anderen ergaben, dass such die Verteilung der Zellen auf die einzelnen Zyklusphasen verschoben wird. Mit Hilfe der Impuls- zytophotometrie kann die Verteilung der Zellpopulatio n auf die verschiedenen Zellzyklusphasen nach zunehmen- den Zeiten der Hypoxie gemessen werden. Material und Methode. Chinesische Hamsterzellen vom Stamm /3-14 wurden als Monolayer in Glas-Vierkant- flaschen (Schott) kultiviert. Das N/ihrmedium bestand aus Eagle's MEM und 10% K~lberserum. Zur Herstellung der hypoxischen Bedingungen wurden die Zellkulturen konfinuierlich mit einem wasserdampf- gesAttigten Stickst0ff-Kohlendioxid-Gasgemisch begast. Hamsterfibroblasten unter chronischer Hypoxie, Zur Messung des DNS-Gehaltes der Zellen im Impuls- zytophotometer wurden die Zellen zun~ichst vom Boden der Kulturflaschen dutch Trypsineinwirkung abgel6st, abzentrifugiert und mit 0, 9 %iger NaC1-L6sung gewaschen (Zentrifugation bei 200 g fiir 5 min). Ca 106 bis 108 Zellen wurden dann durch Eintropfen in 20 ml absoluten Alko- hols fixiert. Dabei wurde die Probe zur Vermeidung yon Zellverklumpungen apparativ geschfittelt. Nach 20 min wurden die Zellen durch Zentrifugation vom Alkohol getrennt und wieder mit physiologischer I4ochsalzl6sung gewaschen. Anschliessend erfolgte eine Resuspension und lstiindige Inkubation der Zellen in 10 ml einer 0,1%igen RNase-LSsung (50 E/mg, I)Nasefrei) bei 37 ~ im Wasser- bad. Nach erneuter Waschung der Zellen mit physiolo- gischer Kochsalz!6sung wurden die Zellen in 10 ml einer 0,001%igen gepufferten Ethidiumbromidl6sung gef&rbt.
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464 Specialia ]~XPERIENIIA 29]4
shows tha t the yolk sac bound iron from serum near ly as well as from FeC13. The bo t tom curve in the Figure shows t h a t chorioal lantoic tissue had low capaci ty to bind iron f rom serum. In 1 h yolk sac tissue had bound 0.90 ng /mg iron while chorioal lantoic t issue had bound only 0.03 ng/mg. This discr iminat ion did not appear be tween the 2 p lacen tM tissues when iron was t aken up f rom FeC13.
The effects of metabol ic inhibi tors on in v i t r o iron binding from rat serum by chorioal lantoic and yolk sac tissues are shown in the Table. In one set of exper iments FeC13 was subst i tu ted for serum. Yolk sac binding was reduced by sodium arsenite, ro tenone and e thacrynie acid 95% (P < 0.001) 82% (P < 0.001) and 46% ( P < 0.001) respectively. 1Rotenone and e thacrynic acid did not affect binding signif icantly in chorioal lantoic tissue and sodium arsenite produced an unexpected 390/o increase (P < 0.01). E thac ryn ic acid and rotenone were dissolved in 0.4% ethyl alcohol. This concent ra t ion of alcohol did not s ignif icantly modi fy control values. Yolk sac iron binding f rom FeC13 decreased somewhat (19%) wi th sodium arsenite, bu t chorioal lantoic binding was re la t ive ly unaffected.
The effects of pro teoly t ic enzymes on in v i t ro iron binding f rom serum are shown also in the Table. Tryps in reduced binding in chorioal lantoic and yolk sac tissues 39% (P < 0.01) and 65% (P < 0.001), and papain reduced binding 29% (P < 0.025) and 77% (P < 0.001), respect ively. Chymot ryps in was the least effective, reducing binding in chorioal lantoic and yolk sac tissues 23% (P < 0.05) and 29% (P < 0.025). I t is not l ikely t h a t the enzymes produced thei r effects th rough prote- olysis of t ransferr in since AZARI and FEENY 1~ have show n tha t t ransferr in is res is tant to t ryps in and chymo- t rypsin. Al though iron and iron-transferr in have been repor ted to chelate wi th several compounds n, no work has shown tha t i ron-transferr in chelates wi th metabol ic inhibi t ing or pro teoly t ic agents. T h e responses to these agents by the y01k sac resembles the process which has been described for the re t iculocyte by JANDL et al 1~. These have been used as a rguments for cellular recept ion of iron from irontransferr in as being a process requir ing metabol ic energy and a protein receptor.
Previous in v ivo exper iments indicate t ha t the ra t yolk sac on days 14, 16, 18 and 20 has a re la t ive ly short-span capabi l i ty of t r ansmi t t ing i ron to the fetus (42% of in t racardiac injected iron on day ~6 only)s. There was no
appreciable storage of iron ei ther in the yolk sac or chorioal lantois on those days. The present in v i t ro exper iments demons t ra te t ha t yolk sac tissue has a high binding aff in i ty for iron on day 16. This m a y be related to the apparent , abi l i ty of the organ to t ransfer iron to the fetus on t h a t day. The binding seems to be metabol ica l ly sensi t ive and is decreased by pro teo ly t ic enzymes, indicat ing the possibil i ty of a receptor relationship.
Chorioal lantoic tissue on day 16 has a low binding aff ini ty for iroli f rom serum. The binding is metabol ical ly insensi t ive and is only mi ld ly affected by proteoly t ic enzymes. Nevertheless , the chorioallantois, as pre- viously shown on day 16, still apparen t ly conveys the major por t ion of iron to the fetus (58%). At this t ime the physical size or bulk of the chorioal lantois is about 10 t imes greater t han the yolk sac. These results are made more interes t ing in l ight of the recent suggestion of MANSOUR et al. 13 tha t an iron t ranspor t sys tem matures in the ra t p lacental cell membrane be tween days 14 and 17 and becomes efficient by day 20.
Zusammen/assung. Nachweis, dass das Eisenbindungs- verm6gen der Dot te r sackp lacen ta bedeu tend gr6sser ist als bei der chorioal lantoiden P lacen ta und dass diese auch un te r der E inwi rkung yon den Stoffwechsel beeinflussen- den Stoffen ein verschiedenes Verha l ten zeigt.
R. J. 13. GARRETT 14, •. E. GARRETT and J. W. ARCHDEACON 15
Department o/ Physiology and Biophysics, Medical Center, University o/Kentucky, Lexington, (Kentucky 40505, USA), 25 September 7972.
10 p. R. AZARI and R. E. FEENEu J. biol. Chem. 232, 293 (1958). 11 G. BATES, C. BILLUPS and P. SALTMAN, J. biol. Chem. 242, 2816
(1967). 12 j . H. JANDL, J. K. INMAN, R. I. SIM~ONDS and D. W. ALLEN, J.
olin. Invest. 38, 161 (1959). 18 M. M. MA~so~:R, A. R. SCHULERT and S. R. GLASSER, Am. J.
Physiol. 222, 1628 (1972). i~ Present address: College of Pharmacy, Medical Center, University
of Kentucky, Lexington (Kentucky 40506, USA). 15 This work was supported by U.S. Public Health Service Grant
No. HD 05016 and Predoctoral Fellowship Grant No. FO1-DE41063 to R.J.B.G.
~ n d e r u n ~ e n der Z e l l z y k l u s p a r a m e t e r c h i n e s i s c h e r g e r n e s s e n a m I m p u l s z y t o p h o t o m e t e r
Unte r hypoxischen Bedingungen t re ten Anderungen im Prol i fera t ionsverhal ten chinesischer Hamster f ibro- blasten in v i t ro auf. Autoradiographische Unte rsuchungen der Flussra ten yon einer Zyklusphase zur anderen ergaben, das s such die Ver te i lung der Zellen auf die einzelnen Zyklusphasen verschoben wird. Mit Hilfe der Impuls- zy tophotomet r ie kann die Verte i lung der Zellpopulat io n a u f d i e verschiedenen Zel lzyklusphasen nach zunehmen- den Zei ten der Hypox ie gemessen werden.
Material und Methode. Chinesische Hamsterze l len v o m S t a m m /3-14 wurden als Monolayer in Glas-Vierkant- flaschen (Schott) kul t ivier t . Das N/ ihrmedium bestand aus Eagle ' s MEM und 10% K~lberserum.
Zur Hers te l lung der hypoxischen Bedingungen wurden die Zel lkul turen konfinuier l ich mi t einem wasserdampf- gesAtt ig ten St ickst0ff-Kohlendioxid-Gasgemisch begast.
H a m s t e r f i b r o b l a s t e n u n t e r c h r o n i s c h e r H y p o x i e ,
Zur Messung des DNS-Geha l tes der Zellen im Impuls- zy topho tomete r wurden die Zellen zun~ichst v o m Boden der Kul turf laschen du tch Tryps ine inwirkung abgel6st, abzentr i fugier t und mi t 0, 9 %iger NaC1-L6sung gewaschen (Zentr ifugat ion bei 200 g fiir 5 min). Ca 106 bis 108 Zellen wurden dann durch Ein t ropfen in 20 ml absoluten Alko- hols fixiert . Dabei wurde die Probe zur Vermeidung yon Zel lverk lumpungen appara t iv geschfittelt . Nach 20 min wurden die Zellen durch Zentr i fugat ion v o m Alkohol ge t rennt und wieder mi t physiologischer I4ochsalzl6sung gewaschen. Anschliessend erfolgte eine Resuspension und ls t i indige Inkuba t ion der Zellen in 10 ml einer 0,1%igen RNase-LSsung (50 E /mg, I)Nasefrei) bei 37 ~ im Wasser- bad. Nach erneuter Waschung der Zellen mi t physiolo- gischer Kochsalz!6sung wurden die Zellen in 10 ml einer 0,001%igen gepuffer ten E th id iumbromid l6sung gef&rbt.
15.4.1973 Specialia 465
Frfihestens 20 min nach der Fluorochromierung wurde der DNS-Gehalt der Zellen im Impulszytophotometer (ICP) der Fa. Phywe i, G6ttingen, gemessen. Die Arbeitsweise dieses Fluoreszenz- und Durchflusszytophotometers ist yon DITTRICI~ und G6I~DE 2 beschrieben worden. Jede Kurve setzt sich aus 200000-300000 Einzelimpulsen zusammen.
Ergebnisse. Die Histogramme zeigen die Verteilung der Zellpopulationen nach ihrem DNS-Gehalt zu verschiede- hen Zeiten chronischer Hypoxie. Die Kontrollkurve der Abbildung hat zwei ausgepr~igte Maxima. Der linke Gipfel, der sich im wesentlichen aus 2n, d.h. Gl-Phase- zellen, zusammensetzt, ist ca. doppelt so hoch, jedoch schmaler als der zweite Gipfel der Kurve, dell Zellen mit dem doppelten DNS-Gehalt, also sp/ite S- und G~-Phase- zellen aufbauen. Die Zellen, die sich in der S-Phase befinden, weisen einen DNS-Gehalt zwischen 2n und 4n auf. Sie sind anteilm~tssig in beiden: Gipfeln enthalten und bilden die fiberwiegende Fraktion in der Senke zwischen den zwei Gipfeln.
Es existiert derzeit noch keine allgemein verwendbare Methode, aus dem Histogramm der Fluoreszenz die Ver- teilung der Zellen auf die einzelnen Zellzyklusphasen quant i ta t iv zu erfassen. Schwierigkeiten bereitet insbe- sondere die Abtrennung der Zellen der G2-Phase yon denen der sp~tten S-Phase. Mit der Methode der markierten Mitosen nach Pulsmarkierung mit Tri t ium-Thymidin Wurde die mittlere Dauer der Zellzyklusphasen der chinesischen Hamsterzellen unter Normalbedingungen bestimmt. Die Gl-Phase dauert im Mittel 3 h, die S-Phase 7, 5 h, die G2-Phase 1, 5 h. Da die Kontrollpopulation sich zum Zeitpunkt der impulszytophotometrischen Unter- suchungen in logarithmischer Wachstumsphase befunden hat, l~sst sich aus den mittleren Phasendauern folgende prozentuale Verteilung der Zellen auf die einzelnen Zyklusphasen berechnen: 32% der Zellen befinden sich in Gl-Phase, 58% in S-Phase und 10% in G~-Phase.
Es ist m6glich, beN Kenntnis dieser Relation das Histo- gramm so in die 3 Phasen zu zerlegen, dass die Teilfl~ichen dem berechneten Verh~iltnis weitgehend entsprechen. Dabei zeigt sich, dass im vorliegenden Fall der rechte Gipfel des Verteilungsdiagramms zum fiberwiegenden Teil Zellen der sp/tten S-Phase enth~Llt, und die Zellen der G~-Phase praktisch nur den fiber die mittlere Senke herausragenden zweiten Gipfel aufbauen. Der Anteil yon Zellen der G1-Phase l~isst sich durch spiegelbildliche Ver- doppelung der Anstiegsflanke des Verteilungsdiagramms bestimmen. Von dieser Deutung des normalen Verteilungs-
0.8
0.C
0.4
0,2
i
t • ............ Kontrolle 3h Hypoxie
i - - - - - 12h Hypoxie
i ,
~i: : ' ,
\
Relativer DNS-Gehatt
Verteilung des DNS-Gehaltes ehinesiseher Hamsterzellen in vitro unter normalen Waehstumsbedingungen, naeh 3 h Hypoxie und nach 12 h Hypoxie.
diagramms der Fluoreszenz ausgehend, k6nnen wir die Anderungen des Histogramms unter andauernder Hypoxie beschreiben. Schon nach 30stfindiger Hypoxie ist der zweite Gipfel stark verkleinert, nach 6stfindiger Hypoxie ist er bereits nicht mehr nachweisbar (Figur). BeN l~nger an- dauernder Hypoxie nimmt die rechte Flanke der Kurve, d.h. der Anteil yon S-Phasezellen mit bereits h6herem DNS-Gehalt, immer weiter ab. Dieser Effekt ist nach 6 und 9 h bereits zu erkennen, nach 12 h am ausgepr~gtesten (Figure. Nach 30stfindiger Hypoxie n immt die Zahl der Zellen in der S-Phase wieder zu.
Diskussion. Unter dem Einfluss andauernder Hypoxie verAndert sich die Verteilung der Zellen der Population auf die verschiedenen Zellzyklusphasen. Am frfihesten und am stXrksten ist der Anteil yon Zellen der G2-Phase ver- mindert, sp~ter nimmt auch der Anteil yon S-Phasezellen und dabei besonders yon Zellen der sp/~ten S-Phase voriibergehend ab und steigt dann wieder an. Eine chronisch hypoxische Zellpopulation in vitro besteht somit zunehmend aus Zellen der G 1- und der friihen S- Phase. Die Zahl der Zellen der G2-Phase ist schliesslich so gering, dass sie mit dem Impulszytophotometer nicht mehr nachgewiesen werden k6nnen. Autoradiographische Untersuchungen der Proliferationskinetik hypoxischer Zellen in vitro haben eine Verl~ngerung der G1-Phasen- dauer sowie der DNS-Synthesel~nge auf etwa das 6fache ergeben (BORN et al., in Vorbereitung). Die G2-Phasen- l~inge ver~Lnd,ert sich dagegen unter chronisch hypoxischen Bedingungen nur unwesentlich. Somit besteht ein stark verlangsamter Einstrom yon Gl-Phasezellen in die S-Phase und auch der S-Phasezellen in die G2-Phase, wghrend der Einstrom yon G2-Phasezellen ill die Gl-Phase normal schnell verl~Luft.
Die Verschiebungen innerhalb des DNS-Gehaltes yon S-Phasezetlen mit zunehmender Dauer der Hypoxie lassen vermuten, dass Zellen zu Beginn der DNS-Synthese st~Lrker verlangsamt werden als Zellen der spgten S-Phase. Die Impulszytophotometrie erscheint somit geeignet, schnell ablaufende Verschiebungen in der Verteilung der Zellen einer Population auf verschiedene Zellzyklusphasen nachzuweisen. Es bedarf jedoch eingehender autoradio- graphischer Untersuchungen, um die Einzelheiten der Proliferationskinetik unter den dargestellten Bedingun- gen festzustellen.
Summary. By means of a pulse cytophotometer, changes in the distribution of chronically hypoxic Chinese hamster cells in vitro in the different phases of the cell cycle, were measured. Within a few hours, the fracti~ia of cells in G2 phase and late S phase decreases to a value which is no longer measurable, indicating a partial synchronization in G 1 and early S phase.
REINHILD BORN, P. DAHR, P. DORMER u n d K.-R. TROTT 3
Abteilung liar Strahlenbiologie und Biophysik des Institutes/iir Biologie und Institut liar HEmatologie der Gesellscha/t /~r Strahlen- und Umwelt/orschung, Ingolstiidter Landstrasse 1, D-Neuherberg, (Deutschland), 18. August J972.
1 Wir danken der Firma ftir die zeitweilige Oberlassung eines Photo- meters. W. DITTRIC~I und W. G6HDE, Z. Naturforseh. 24b, 360 (1969).
3 Wir danken Herrn Dr. W. G6~D~, Miinster, ffir wertvolle Hinweise zur Interpretation der impulszytophotometrisehen Histogramme.
