Praktikumsprotokoll Instrumentelle Analytik

Bestimmung des Fettsäurenmustersvon Kokosflocken

von Annika Hornberger

Aufgabenstellung:

Ziel des Praktikums war die Bestimmung des Fettsäuremusters von Kokosfett.

Fettsäuren sind wichtige Bestandteile lebender Zellen und damit auch der Nahrung. Eine genaue Kenntniss der Bestandteile ist u.a. wichtig für eine gezielte ernährungsphysiologische Beurteilung.

Verwendete Geräte:

Extraktionsapparatur/ Soxhletapparatur:

Funktion: Extraktion der Fette aus den Kokosflocken durch das Lösungsmittel n-Hexan.

Das Extraktionsmittel (1) wird im Kolben (2) vorgelegt, der z.B. mit einem Heizpilz erhitzt wird. Es destilliert, steigt durch die Soxhlet-Apparatur (3-7) nach oben, kondensiert am Rückflußkühler (9) und tropft zurück in die Hülse mit dem Extraktionsgut im Soxhlet. Ist der Soxhletkörper gefüllt, läuft der Extrakt über einen Überlauf (3) zurück in den Kolben. Ein neuer Zyklus beginnt, das Extrahierte verbleibt wegen des deutlich höheren Dampfdrucks im Kolben.

Rotationsverdampfer:

Funktion: Trennung des Lösungsmittels vom Extrakt.

Der Kolben mit dem Extrakt (1) wird an dem Dampfdurchführungsrohr (3) der Appararur befestigt zur Rotation gebracht. Das Extraktionsmittel verteilt sich als dünner Flüssigkeitsfilm auf der Kolbeninnenseite. Zur Erhöhung des Dampfdrucks des Lösungsmittels wird in einem Heizbad (2) unter Vakuum gleichmäßig erhitzt. Durch die Oberflächenvergrößerung verdampft das Lösungsmittel schnell und gleichmäßig, strömt zur Kühlspirale (4) und kondensiert dort aus. Das Kondensat läuft in den Auffangkolben (5). Nach abgeschlossener Destillation liegen nur noch die hochsiedenden Substanzen im Verdampferkolben vor.

Wheaton Vial:

Funktion: Druckstabiles Gefäß zur Umesterung der Probe.

Gaschromtatopraph: HP 6890GC mit 7683 Autosampler und Split/Splitness Injektor

Funktion: gaschromatische Auftrennung der Probenbestandteile und Detektion.

Das Trägergas – die mobile chromatographische Phase (1) – strömt über eine Druckregelung in das Inlet (2). Gleichzeitig wird dort die Probenlösung eingespritzt und verdampft im aufgeheizten Liner. Bevor das Analytengas mit der mobilen Phase auf die Säule – die stationäre chomatographische Phase (3) – geleitet wird, wird der Gasstrom im Verhältnis 50:1 aufgesplittet. Nur ein Bruchteil der eigentlichen Substanzmenge gelangt so auf die Säule und garantiert eine gute Auflösung. Beim Durchlaufen der Säule verteilen sich die Substanzkomponenten unterschiedlich zwischen mobiler und der stationärer Phase und trennen sich. Bei starker Interaktion mit der mobilen Phase erfolgt die Elution schneller, bei starker Interaktion mit der stationären Phase langsamer. Die Konzentration der aufgetrennten, am Ende der Säule austretenden Komponenten wird durch einen Detektor (4) erfasst und an das Auswertesystem (5) weitergegeben.

Verwendete Chemikalien:

Kieselgel 60 Merck 0,063-0,200 nm nHexan UniSolv®, Merck :

H-Sätze: H225: Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar.H304: Kann bei Verschlucken und Eindringen in die Atemwege tödlich sein.H315: Verursacht Hautreizungen.H336: Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen.H361f: Kann vermutlich die Fruchtbarkeit beeinträchtigen.H373: Kann die Organe schädigen bei längerer oder wiederholter Exposition.H411: Giftig für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.

10% v/v methanolische BF3 LösungH-Sätze: H225

H301, H311, H331: Giftig bei Verschlucken, Hautkontakt oder EinatmenH314: Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden.H370: Schädigt die Organe.

Isooktan SupraSolv®, Merck: H-Sätze: H225, H304, H315, H336,

H410: Sehr giftig für Wasserorganismen mit langfristiger Wirkung. Natriumcarbonat-Lösung, Merck:

H-Sätze: H315H319: Verursacht schwere Augenreizung.H335: Kann die Atemwege reizen.

FAME Standard, SupelcoH-Sätze: H351 Kann vermutlich Krebs erzeugen.

PetroletherH-Sätze: H225, H304, H315, H336, H361f, H373, H411

EssigesterH-Sätze: H225, H319, H336,

EUH066: Wiederholter Kontakt kann zu spröder oder rissiger Haut führen. Helium

H-Sätze: H280: Enthält Gas unter Druck; kann bei Erwärmung explodieren.

Versuchsdurchführung:

1. Probenvorbereitung, Extraktion und Dünnschichtdestillation:

Durchführung:

In einen Mörser wurden ca. 10g (10,095g) Kokosflocken und 10g (10,000g) Kieselgel eingewogen und mit dem Pistill zerkleinert. Das Kokosflocken-Kieselgelgemisch wurde anschließend in eine Soxhlet-Hülse überführt (Verlust: 0,199g) und diese in den Extraktionsaufsatz gesetzt. Der Rundkolben der Soxhletapparatur wurde mit 150ml n-Hexan gefüllt, mit einem Rührfisch versehen und an die Apparatur geklemmt. Es wurde 3 Stunden extrahiert.

Beobachtung:

Durch die Erwärmung des Lösungsmittels über einen Heizpilz, begann dieses schließlich zu verdampfen. Der Dampf stieg durch das Dampfleitungsrohr in den Rückflusskühler, kondensierte dort an der wassergekühlten Spirale aus und tropfte in die Hülse. Hatte sich genug kondensiertes Extraktionsmittel angesammelt und den Überlaufpunkt des Heberohrs überstiegen, lief die Flüssigkeit in den Kolben zurück und wurde erneut verdampft. Die Lösung wies keinerlei optische Veränderung auf, sie blieb klar und farblos.

Im Anschluss an die Extraktion wird mit nun Hilfe eines Rotavators das Lösungsmittel aus dem Extrakt abdestilliert.

Beobachtung:

Durch die Evakuierung des rotierenden Kolbens begann das Lösungsmittel zu verdampfen, da der Siedepunkt immer dann erreicht ist, wenn der Dampfdruck dem äußeren Druck entspricht. Da sich der Kolben dabei abkühlte (Verdampfungsenthalpie), wurde der Kolben im Wasserbad erwärmt (50°C). Der aufsteigende Dampf kondensierte an der Glasspirale des Kühlers und lief in den Auffangkolben.

Sobald keine Kondensation mehr sichtbar war, wurde der gefüllte Auffangkolben durch einen neuen, leeren ersetzt und der Extrakt bis zur Lösungsmittelfreiheit (ca. 30 mbar) eingeengt. Das entstandene klare, fettige Rohprodukt (Gewicht: 4,927g) wurde ohne weitere Reinigung weiterverwendet.

2. Derivatisierung

Durchführung:

Für die Umesterung der Triacylglyceride in Methylester (FAME = fatty acid methyl ester) wurden zweimal ca. 10mg des Rohprodukts (Einwaage: je 11,5mg) in 2 Wheaton Vials eingewogen und jeweils mit 2ml 10%iger (v/v) methanolischer BF3-Lösung versetzt. Die Vials wurden mit Rührfischen versehen, geschlossen und der Reaktionsansatz für eine Stunde unter Rühren auf 60°C erhitzt.

Nach dem Abkühlen wurden die Proben mit jeweils 2ml Isooktan ausgeschüttelt. Das Isooktan extrahiert die entstandenen Methylester aus der methanolischen Phase. Die untere, methanolische Phase wurde abgenommen und verworfen. Die Isooktanphase wurde in einem Reinigungsschritt mit

2ml einer 10%igen Natriumcarbonatlösung versetzt und durch Schütteln gewaschen. Anschließend wurde die Phase mit den FAME im Isooktan separiert. Es lag nun die fertig aufbereitete Proben-Lösung vor.

Um die Proben auf noch eventuell enthaltene Triglyceridreste zu testen, wurde eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt.

3. Dünnschichtchromatographie

Durchführung:

Die beiden oben hergestellten Proben wurden jeweils mit Hilfe von 2µl Kapillaren auf eine Trägerfolie aufgetragen. Als Vergleich dienten das Rohprodukt (extrahiertes Fett) und ein FAME-Standard.

Dabei wurde die erste Folie mit der Probe 1 und die zweite Folie mit der Probe 2 versehen. Als Fließmittel wurde eine im Verhältnis 19:1 gemischte Petrolether/ Essigester- Lösung verwendet. Nach einer Laufstrecke von ca. 2/3 der Dünnschichtplatte wurden die Folien der Chromatographiekammer entnommen und zur Anfärbung in eine Iodkammer gestellt. Anschließend erfolgte die genauere Betrachtung unter einer UV-Lampe.

Beobachtung:

Auf beiden Folien konnte man die drei gewanderten Substanzpunkte erkennen. Der Punkt des Rohprodukts war deutlich weniger weit als die Proben- und der FAME-Standard gewandert. Deren Wanderungsstrecken sind fast doppelt so lang und enden fast auf gleicher Höhe.

Die Berechnung der Retentionsfaktoren bestätigte diese Beobachtung. Bei einer Start-Frontdistanz von 4,7cm und den einzelnen Wanderungsstrecken (Probe1: 3,6cm; Rohprodukt: 1,3cm; Standard: 3,7cm) ergab sich für die Probe1 ein RF-Wert von 0,77, für den Standard 0,79 und für das Rohprodukt ein Wert von 0,28.

Für die Substanzen der zweiten Folie wurden ähnliche Werte berechnet.

Auf beiden Folien wurde links der Probenpunkt gesetzt, gefolgt vom Rohprodukt- und Standardpunkt

Um zu überprüfen ob die Probe vollständig umgeestert wurde, wurde die Wanderungsstrecke der Probe auf Höhe des Rohprodukpunkts betrachtet. Wäre an dieser Stelle eine Verfärbung zu erkennen gewesen, hätte die Probe noch Triglyceridreste enthalten. Das Rohprodukt diente hier als Vergleich, da es selbst einen reinen Triglycerid-Standard (Fett) darstellte.

Da auf beiden Folien kein solcher Punkt zu erkennen war, waren beide Proben triglyceridfrei.

Abbildung 1: DC-Folie mit Probe1, Rohprodukt und Standard

4.Gaschromatographie

Zur qualitativen Analyse der Probe wurde eine Gaschromatographie durchgeführt. Verwendet wurde ein HP 6890GC mit 7683 Autosampler und Split/ Splitness Injektor, der mit Hilfe eines massenselektiven Detektors die Probe analysierte. Als Trägergas wurde Helium eingesetzt, dessen Gasfluss bei 1ml/min lag. Die Analyten wurden an einer DB 225 Cyano Phase von J&W (30m, ID 0.25mm, 0.25µm Film) mit dem Temperaturprogramm (50°C 1min mit 25°C/min auf 175°C mit 4°C/min auf 230°C 5min) getrennt.

Gemessen wurde die Probe 1 und die vom Computer erstellten Peaks bearbeitet und ausgedruckt.

Auswertung

Um die einzelnen Essigsäuremethylester der Probe exakt zuordnen und bestimmen zu können, wurden die Probenpeaks mit den bekannten Peaks der einzelnen Fettsäuren des FAME- Standards (Abb.2) verglichen. Ausgewählte Literaturwerte dienten anschließend zur Überprüfung der Ergebnisse.

Das obere Chromatogramm in Abbildung 3 zeigte 37 Substanzpeaks des FAME-Standards und das untere neun Peaks der Probe mit den zugehörigen Retentionszeiten.Abbildung 2: Datenblatt mit Chromatogramm und Namen des FAME-37-Standards

Aufgrund unterschiedlicher Säulengeometrie zeigt der FAME Standard zu Abbildung 2 verschiedene Retentionszeiten; da es sich aber um die gleiche stationäre Phase handelt, ist die Abfolge der Peaks gleich und die Ester können somit namentlich zugeordnet werden. Da nun die Zeitachsen von Probe und Standard die gleiche Einteilung besaßen, war es möglich die Probenpeaks graphisch mit den Standardpeaks zu vergleichen und anhand der Retentionszeiten genauere Aussagen über die Übereinstimmung zu treffen.

Abbildung3: Vollständiges Chromatogramm mit den Standardpeaks und Probenpeaks im Vergleich

Im Bereich von 12,4 bis 15 Minuten waren die Retentionszeiten nicht eindeutig abzulesen, deswegen wurde dieser Abschnitt vergrößert (Abb.4).

Bei genauerer Betrachtung der Basislinie des Chromatogramms (Abb.5), fielen zwei weitere, wesentlich kleinere Peaks auf, die vorher nicht erkennbar gewesen waren. Diese beiden wurden als Bestandteile zehn und elf auch in die Analyse miteinbezogen.

Abbildung 4: Vergrößerter Bereich von 12,4 – 15min

Abbildung 5: Darstellung der Peaks 10 und 11 durch Vergrößerung des Chromatogramms

Durch den Vergleich der jeweiligen Retentionszeiten von Probe und Standard war es möglich den Peaks eins bis elf die Fette Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Undecansäure und Tridecansäure eindeutig zuzuordnen. Mit Hilfe der vom Auswertungsprogramm berechneten Flächenintegrale wurden die relativen Anteile der einzelnen Fettsäuren bestimmt, diese wurden in „Hauptbestandteile“ (>10%), „Nebenbestandteile“(1%-10%) und „Spuren“(<1%) aufgeteilt.

Da die Peaks der Undecan- und Tridecansäure einen zu geringen Anteil der Gesamtprobe darstellten, konnten keine genauen Prozentangaben über deren relativen Anteil gemacht werden. Allerdings konnte man anhand der Höhe der Substanzpeaks erkennen, dass es sich um Spuren handelte, da sie nur einen Bruchteil der Größe der anderen Peaks besaßen.

Zur besseren Übersicht sind in Tabelle 1 alle Werte, einschließlich der Literaturwerte, zusammengestellt.

Tabelle 1: Datenübersicht der Probenbestandteile 1 bis 11

Peaknr. Probe

Retentionszeit

[min]

Peaknr. FAME

Fettsäure Relativer Anteil [%]

Literaturwert[%]

Bestand-teil

1 3,688 2 Caproic acid methylester (C6:0)

0,412 0,2-0,8 Spur

2 4,899 3 Caprylic acid methyl ester (C8:0)

6,716 6-9 Neben

3 5,956 4 Capric acid methyl ester (C10:0)

5,738 6-10 Neben

4 7,026 6 Lauric acid methyl ester (C12:0)

50,773 46-50 Haupt

5 8,428 8 Myristic acid methyl ester (C14:0)

22,090 17-19 Haupt

6 10,397 12 Palmitic acid methyl ester (C16:0)

7,455 8-10 Neben

7 12,951 16 Stearic acid methyl ester (C18:0)

2,098 2-3 Neben

8 13,193 17 Oleic acid methyl ester (C18:1n9c)

4,228 5-7 Neben

9 13,723 19 Linoleic acid methyl ester (C18:2n6c)

0,490 1-2,5 Spur

10 - 5 Undecanoic acid methyl ester (C11:0)

- Spur

11 - 7 Tridecanoic acid methyl ester (C13:0)

- Spur

Im Vergleich mit den Literaturwerten fällt auf, dass die Probenwerte fast alle in dem angegebenen Bereich liegen. Lediglich die Werte der Öl-und Linolsäure liegen etwas weiter unterhalb.

Literatur: D.A. Skoog, J.J. Leary - Instrumentelle Analytik, Springer-Verlag 1996

M. Otto – Analytische Chemie, VCH Verlagsgesellschaft 1995

http://media.wiley.com/product_data/excerpt/68/04713854/0471385468.pdf

http://www.merckmillipore.de/

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/supelco/47885u?lang=de&region=DE

http://de.wikipedia.org/wiki/Soxhlet-Aufsatz