Analytische Differenzierung von Extrakten aus den...
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Ethanolische Extrakte (67-70% V/V) aus Radix Rhodiola rosea haben seit über 15 Jahren in der EU ihre Anwendung als mentales Stärkungsmittel und Adaptogen. Es existieren viele Nahrungsergänzungsmittel auf dieser Basis [1]. Parallel gibt es seit 2012 eine HMPC-Monographie [2], wonach die Möglichkeit einer Registrierung als traditionelles pflanzliches Arzneimittel besteht. Derzeit ist eine parallele Vermarktung dieser Extrakte als Lebensmittel oder als traditionelles Arzneimittel möglich. Der echte Rosenwurz hat sein natürliches Habitat in den Hochgebirgslagen Europas, und Asiens. Die ursprünglichen Bestände der Rhodiola rosea kommen aus dem Altai, Tibet, dem Ostkaukasus, aber auch aus den Alpen und dem Balkangebirge [1]. Dementsprechend sind aufwendige Wildsammlungen und nachfolgende Weiter- verarbeitungen inkl. Transporte notwendig, die in einer hochpreisigen R. rosea- Droge resultieren. Im preisgetriebenen Lebensmittelbereich wurden daher bereits Rhodiola-Extrakte mit niedrigen Gehalten an Rosavin analysiert, welche aus Mischungen mit Extrakten anderer Rhodiola species entstammen. Aber auch reine Extrakte aus R. crenulata kommen in der EU vor, wie sie in der BELFRIT-Liste für Lebensmittelextrakte notiert sind [3]. R.crenulata zeichnet sich nach chinesischem Arzneibuch dadurch aus, das nur auf Salidrosid analysiert wird, da Rosavin praktisch nicht vorkommt [4]. Ziel der hier vorgestellten Untersuchungen ist die Bereitstellung von Analysen- methoden, welche die Identität und eine gleichbleibende Qualität von R.rosea- Droge wie Extrakten gewährleistet. Analytische Differenzierung von Extrakten aus den Wurzeln von Rhodiola rosea vs. R. crenulata Björn Feistel ,Hermann Kurth, Christoph Schlicht (Finzelberg GmbH & Co. KG, Koblenzer Strasse 48-56, D - 56626 Andernach) Internationale Tagung Phytotherapie 2014 - Klinik und Praxis 18.-21. Juni 2014, Winterthur Extrakte aus Rosenwurz – Rhodiola rosea [1] Rhodiola rosea L. – Vitalstoffe 4/2013, S. 36-40 [2] EMA/HMPC/232091/2011 (vom 27.03.2012) http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/herbal/medicines /herbal_med_000080.jsp&mid=WC0b01ac058001fa1d [3] BELFRIT-Liste Italien 2014, S. 27 http://www.unerbe.it/attivita/2014/decreto_27_marzo_2014_all_%201_bis.pdf [4] Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. 144 th edition. Beijing: Chemical Industry Press; p.376-377, 2010– Monographie Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma (chin.: Hongjingtian) [5] USP - Rhodiola rosea related monographs; 13.01.2014 https://hmc.usp.org/family/rhodiola-rosea?destination=taxonomy/term/1011 Danksagung: Gilt der Martin Bauer GmbH für die Bereitstellung von identischem Drogenmaterial. Fotos © by Finzelberg GmbH & Co. KG / Martin Bauer GmbH Zusammenfassung / Diskussion Literatur / Referenzen Rhodiola rosea Nur echte Rhodiola rosea-Extrakte (bevorzugt aus Kultivierung) ermöglichen einen stabilen Fingerprint und Rosavin-Gehalte von 2-4%. R. crenulata enthält kein Rosavin, ebenso kein Rosiridin. DC-Verfahren zeigen zudem abgrenzende Peaks in R. crenulata auf. Für die Spezifizierung von R. rosea-Extrakten sind diese Ergebnisse gut geeignet. Eine DC-Prüfung des gesamten Fingerprints sollte bevorzugt bei 365 nm erfolgen. Ideal ergänzend hierzu ist die HPLC-Detektion. Jedoch muss wegen der verschiedenen Strukturen der Marker bei 203 nm (Rosiridin) und 250 nm (Rosavine) ausgewertet werden. Grobe Verfälschungen von R. rosea sind damit detektierbar. Der Vergleich der aktuellen USP- Methode (Bild 5a) mit der Finzelberg- Methode (Bild 5b) erfolgte auf HPTLC-Platten gemäß den Vorgaben USP [5]. Ferner beschreibt die USP eine Detektion im Weißlicht nach Derivatisierung. Sowohl die Rf-Verteilung der typischen Rhodiola-Markersubstanz- en als auch die Entwicklung des Gesamtfingerprints sind verschieden. Beide Detektionen zeigen das Fehlen von Rosiridin und Rosavin bei R.c. an, jedoch ist eine Detektion bei 365nm gemäß Bild 4b in der Aussagekraft für den Gesamtfingerprint überlegen. Probenzuordnung je Bahn: 1–R.rosea, Wildsammlung Hochland 2-Rosavin 3-R.rosea, Wildsammlung Hochland 4-Rosarin 5-R.rosea; internat. Handelsware 6-Rosiridin / 7-Salidrosid / 8-Rosin 9-R. crenulata; Kaufware China 10/11/12 - R.rosea, Anbauware EU 2 – Getrockneter, geschnittener Wurzelstock; R. rosea, Wildsammlung - 4 Jahre Gehalts-und Identitätsprüfung per HPLC Zur Quantifizierung für die Marker Salidrosid und Tyrosol eignen sich UV 220 nm oder 203 nm. Mittels DAD-Detektor kann man parallel die Gruppe der Rosavine bei 250 nm detektieren. Ausgenommen hiervon ist Rosiridin, das wegen seiner Struktur nur um 203 nm anzeigt. Entsprechend sind Fingerprintanalysen bei 203 nm sinnvoll, um fehlende Rosiridin-Peaks als Verfälschung von R. rosea-Extrakten anzuzeigen. DC-Prüfung Rhodiola-Inhaltsstoffe Stationäre Phase: Kieselgel 60 F 254 Laufmittel: Ethylacetat : Ethylmethylketon: Ameisensäure, wasserfrei : Wasser (50 : 30 : 10 : 10 V/V/V/V) incl. ca. 20 min. Kammersättigung Trennstrecke: 15 cm Derivatisierung: 10%ige methanolische Schwefelsäure; anschließend auf dem DC-Plattenheizer ca. 5 min bei 120°C bis zur optimalen Farbentwicklung der Zonen erhitzt. Prüflösung: 1,0 g pulverisierte Droge werden mit 10 mL Ethanol 70% (V/V) 10 min. lang im Wasserbad bei 80 °C extrahiert. Nach dem Abkühlen wird die Lösung filtriert und unter Nachwaschen mit Ethanol 70% (V/V) im Meßkolben auf 10,0 mL aufgefüllt und zur DC ver-wendet. Das Auftragsvolumen beträgt 5 μL bei 10mm Breite. Rhodiola crenulata 3 – Getrockneter, geschnittener Wurzelstock; R. crenulata, Wildsammlung - 4 Jahre Mehrjährige Pflanze von Rhodiola rosea 1a- Oberirdischer Teil; buschig-blühend (linke Abb.) 1b - Unterirdischer Teil – Wurzelstock (rechte Abb.) Identitätsprüfung per DC Bislang gibt es keine verabschiedete Drogen-Monographie zu R.rosea in der Pharm. Eur. Daher haben wir eine firmeneigene Methode auf Rhodiola-Inhaltsstoffe entwickelt und diese der einzig offizinell verfügbaren Methode aus der USP 2014 gegenübergestellt. 4a-nach dem Besprühen im Weißlicht 4b-nach dem Besprühen im UV Licht, 365 nm Bild 4a+b: Bahnzuordnung analog Legende Bild 5 5a – HPTLC nach USP-Methode ; Derivatisierung mit Diphenylamin-Anilin-Phosphorsäure, 120°C, 5 min 5a-nach dem Besprühen im Weißlicht 5b-nach dem Besprühen im Weißlicht 5b – HPTLC nach FB-Methode ; Derivatisierung mit methanolischer Schwefelsäure, 120°C, 5 min R.c. R.c. Rosavin Rosiridin HPLC-Bedingungen Stationäre Phase: Prodigy ODS-3, 250 x 4.6 mm, 5μm Temp. 30°C Mobile Phase: A: Wasser B: Acetonitril 90% / Wasser 10% V/V Gradient: 0 -12 min 14 % B, isokrat., 12-32 min linear 26% B, 32-36 min isokrat. 26% B, 36-47 min linear 100 % B. Fluss: 1 ml/ min Konzentration für Extrakte: 10 mg/mL MeOH 80% V/V Salidrosid R.rosea Extrakt Rosarin Tyrosol Rosavin Rosiridin Rosin UV 250 nm Salidrosid R.rosea Extrakt Rosarin Tyrosol Rosavin Rosiridin Rosin UV 203 nm Salidrosid
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Ethanolische Extrakte (67-70% V/V) aus Radix Rhodiola rosea haben seit über 15 Jahren in der EU ihre Anwendung als mentales Stärkungsmittel und Adaptogen. Es existieren viele Nahrungsergänzungsmittel auf dieser Basis [1]. Parallel gibt es seit 2012 eine HMPC-Monographie [2], wonach die Möglichkeit einer Registrierung als traditionelles pflanzliches Arzneimittel besteht. Derzeit ist eine parallele Vermarktung dieser Extrakte als Lebensmittel oder als traditionelles Arzneimittel möglich. Der echte Rosenwurz hat sein natürliches Habitat in den Hochgebirgslagen Europas, und Asiens. Die ursprünglichen Bestände der Rhodiola rosea kommen aus dem Altai, Tibet, dem Ostkaukasus, aber auch aus den Alpen und dem Balkangebirge [1]. Dementsprechend sind aufwendige Wildsammlungen und nachfolgende Weiter-verarbeitungen inkl. Transporte notwendig, die in einer hochpreisigen R. rosea-Droge resultieren. Im preisgetriebenen Lebensmittelbereich wurden daher bereits Rhodiola-Extrakte mit niedrigen Gehalten an Rosavin analysiert, welche aus Mischungen mit Extrakten anderer Rhodiola species entstammen. Aber auch reine Extrakte aus R. crenulata kommen in der EU vor, wie sie in der BELFRIT-Liste für Lebensmittelextrakte notiert sind [3]. R.crenulata zeichnet sich nach chinesischem Arzneibuch dadurch aus, das nur auf Salidrosid analysiert wird, da Rosavin praktisch nicht vorkommt [4]. Ziel der hier vorgestellten Untersuchungen ist die Bereitstellung von Analysen-methoden, welche die Identität und eine gleichbleibende Qualität von R.rosea- Droge wie Extrakten gewährleistet.
Analytische Differenzierung von Extrakten aus den Wurzeln von Rhodiola rosea vs. R. crenulata
Björn Feistel ,Hermann Kurth, Christoph Schlicht (Finzelberg GmbH & Co. KG, Koblenzer Strasse 48-56, D - 56626 Andernach)
Internationale Tagung Phytotherapie 2014 - Klinik und Praxis 18.-21. Juni 2014, Winterthur
Extrakte aus Rosenwurz – Rhodiola rosea
[1] Rhodiola rosea L. – Vitalstoffe 4/2013, S. 36-40 [2] EMA/HMPC/232091/2011 (vom 27.03.2012) http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/herbal/medicines/herbal_med_000080.jsp&mid=WC0b01ac058001fa1d [3] BELFRIT-Liste Italien 2014, S. 27 http://www.unerbe.it/attivita/2014/decreto_27_marzo_2014_all_%201_bis.pdf [4] Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. 144th edition. Beijing: Chemical Industry Press; p.376-377, 2010– Monographie Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma (chin.: Hongjingtian) [5] USP - Rhodiola rosea related monographs; 13.01.2014 https://hmc.usp.org/family/rhodiola-rosea?destination=taxonomy/term/1011
Danksagung: Gilt der Martin Bauer GmbH für die Bereitstellung von identischem Drogenmaterial. Fotos © by Finzelberg GmbH & Co. KG / Martin Bauer GmbH
Zusammenfassung / Diskussion
Literatur / Referenzen
Rhodiola rosea
Nur echte Rhodiola rosea-Extrakte (bevorzugt aus Kultivierung) ermöglichen einen stabilen Fingerprint und Rosavin-Gehalte von 2-4%. R. crenulata enthält kein Rosavin, ebenso kein Rosiridin. DC-Verfahren zeigen zudem abgrenzende Peaks in R. crenulata auf. Für die Spezifizierung von R. rosea-Extrakten sind diese Ergebnisse gut geeignet. Eine DC-Prüfung des gesamten Fingerprints sollte bevorzugt bei 365 nm erfolgen. Ideal ergänzend hierzu ist die HPLC-Detektion. Jedoch muss wegen der verschiedenen Strukturen der Marker bei 203 nm (Rosiridin) und 250 nm (Rosavine) ausgewertet werden. Grobe Verfälschungen von R. rosea sind damit detektierbar.
Der Vergleich der aktuellen USP-Methode (Bild 5a) mit der Finzelberg-Methode (Bild 5b) erfolgte auf HPTLC-Platten gemäß den Vorgaben USP [5]. Ferner beschreibt die USP eine Detektion im Weißlicht nach Derivatisierung. Sowohl die Rf-Verteilung der typischen Rhodiola-Markersubstanz-en als auch die Entwicklung des Gesamtfingerprints sind verschieden. Beide Detektionen zeigen das Fehlen von Rosiridin und Rosavin bei R.c. an, jedoch ist eine Detektion bei 365nm gemäß Bild 4b in der Aussagekraft für den Gesamtfingerprint überlegen. Probenzuordnung je Bahn: 1–R.rosea, Wildsammlung Hochland 2-Rosavin 3-R.rosea, Wildsammlung Hochland 4-Rosarin 5-R.rosea; internat. Handelsware 6-Rosiridin / 7-Salidrosid / 8-Rosin 9-R. crenulata; Kaufware China 10/11/12 - R.rosea, Anbauware EU
2 – Getrockneter, geschnittener Wurzelstock; R. rosea, Wildsammlung - 4 Jahre
Gehalts-und Identitätsprüfung per HPLC
Zur Quantifizierung für die Marker Salidrosid und Tyrosol eignen sich UV 220 nm oder 203 nm. Mittels DAD-Detektor kann man parallel die Gruppe der Rosavine bei 250 nm detektieren. Ausgenommen hiervon ist Rosiridin, das wegen seiner Struktur nur um 203 nm anzeigt. Entsprechend sind Fingerprintanalysen bei 203 nm sinnvoll, um fehlende Rosiridin-Peaks als Verfälschung von R. rosea-Extrakten anzuzeigen.
DC-Prüfung Rhodiola-Inhaltsstoffe Stationäre Phase: Kieselgel 60 F254
Laufmittel: Ethylacetat : Ethylmethylketon: Ameisensäure, wasserfrei : Wasser (50 : 30 : 10 : 10 V/V/V/V) incl. ca. 20 min. Kammersättigung Trennstrecke: 15 cm Derivatisierung: 10%ige methanolische Schwefelsäure; anschließend auf dem DC-Plattenheizer ca. 5 min bei 120°C bis zur optimalen Farbentwicklung der Zonen erhitzt. Prüflösung: 1,0 g pulverisierte Droge werden mit 10 mL Ethanol 70% (V/V) 10 min. lang im Wasserbad bei 80 °C extrahiert. Nach dem Abkühlen wird die Lösung filtriert und unter Nachwaschen mit Ethanol 70% (V/V) im Meßkolben auf 10,0 mL aufgefüllt und zur DC ver-wendet. Das Auftragsvolumen beträgt 5 µL bei 10mm Breite.
Rhodiola crenulata
3 – Getrockneter, geschnittener Wurzelstock; R. crenulata, Wildsammlung - 4 Jahre
Mehrjährige Pflanze von Rhodiola rosea
1a- Oberirdischer Teil; buschig-blühend (linke Abb.) 1b - Unterirdischer Teil – Wurzelstock (rechte Abb.)
Identitätsprüfung per DC Bislang gibt es keine verabschiedete Drogen-Monographie zu R.rosea in der Pharm. Eur. Daher haben wir eine firmeneigene Methode auf Rhodiola-Inhaltsstoffe entwickelt und diese der einzig offizinell verfügbaren Methode aus der USP 2014 gegenübergestellt.
4a-nach dem Besprühen im Weißlicht
4b-nach dem Besprühen im UV Licht, 365 nm
Bild 4a+b: Bahnzuordnung analog Legende Bild 5
5a – HPTLC nach USP-Methode ; Derivatisierung mit Diphenylamin-Anilin-Phosphorsäure, 120°C, 5 min
5a-nach dem Besprühen im Weißlicht
5b-nach dem Besprühen im Weißlicht
5b – HPTLC nach FB-Methode ; Derivatisierung mit methanolischer Schwefelsäure, 120°C, 5 min
R.c.
R.c.
Rosavin Rosiridin
HPLC-Bedingungen Stationäre Phase: Prodigy ODS-3, 250 x 4.6 mm, 5µm Temp. 30°C Mobile Phase: A: Wasser B: Acetonitril 90% / Wasser 10% V/V Gradient: 0 -12 min 14 % B, isokrat., 12-32 min linear 26% B, 32-36 min isokrat. 26% B, 36-47 min linear 100 % B. Fluss: 1 ml/ min Konzentration für Extrakte: 10 mg/mL MeOH 80% V/V
Salidrosid
R.rosea Extrakt
Rosarin
Tyrosol
Rosavin
Rosiridin
Rosin
UV 250 nm
Salidrosid
R.rosea Extrakt
Rosarin
Tyrosol
Rosavin
Rosiridin
Rosin UV 203 nm
Salidrosid
