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Anti-inflammatorische Signalwege nach der Phagozytose

apoptotischer Zellen in Makrophagen

vom Fachbereich Biologie der Technischen Universität Kaiserslautern

zur Verleihung des akademischen Grades

doctor rerum naturalis (Dr. rer. nat.)

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Dipl. Biol. Axel Martin Johann

1. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Brüne

2. Gutachter: PD Dr. Gerhard Erkel

Frankfurt, Dezember 2005

Zeichen der Universität Kaiserslautern im Bibliotheksverkehr: D386

Eingereicht am 19.01.2006

Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Regine Hakenbeck

1. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Brüne

2. Gutachter: PD Dr. Gerhard Erkel

der Dissertation und der mündlichen Prüfung.

Im Kosmos wimmelte es überall von Ignoranz, und der Wissenschaftler verhielt sich wie ein

Goldsucher, der im Bach der Unwissenheit nach den Nuggets der Erkenntnis fischte.

Gelegentlich fand er einen kleinen Klumpen im Kies der Unvernunft und im Sand der

Ungewissheit, zwischen den haarigen, achtbeinigen und schwimmenden Dingen des

Aberglaubens.

Terry Pratchet

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 1

1.1 Apoptose und Nekrose 1 1.2 Phagozytose apoptotischer Zellen 2 1.2.1 Erkennung apoptotischer Zellen 3 1.2.2 Phagozytose von AZ und deren Einfluss auf das Immunsystem (Desensitivierung) 5 1.3 ROS-Produktion in Makrophagen 7

1.4 PPARγ 9 1.5 NO und Arginase 13 1.5.1 L-Arginin-Metabolismus 13 1.5.2 Wirkung von NO 15 1.6 Cyclooxygenase-2 16 1.7 Zielsetzung 19

2 MATERIAL UND METHODEN 20

2.1 Material 20 2.1.1 Chemikalien 20 2.1.2 Puffer und Lösungen 23 2.1.3 Medien und Reagenzien für die Zellkultur 28 2.1.4 Oligonukleotide 28 2.1.4.1 Primer für die PCR 28 2.1.4.2 DIG-markierte Oligonukleotide für EMSA-Analysen 29 2.1.5 Antikörper 29 2.1.6 Kits 29 2.1.7 Vektoren 30 2.1.7.1 Vektoren für den Retroviralen Gentransfer 30

2.1.7.1.1 pLXIN-PPARγ1-AF2 30 2.1.7.1.2 pHIT 60 30 2.1.7.1.3 pcz-VSV-G 31 2.1.7.2 Sonstige Vektoren 31 2.1.7.2.1 pGL2B-mpCD36 31 2.1.7.2.2 pZeo/Luc+shortARE 32 2.1.7.2.3 pZeo/Luc+3´UTR 32

Inhaltsverzeichnis II

2.1.7.2.4 pcDNA3 PPARγ1 wt 32

2.1.7.2.5 pcDNA3 PPARγ1 AF2mut 32 2.1.8 Zelllinien und Bakterienstämme 33 2.1.9 Geräte und sonstige Materialien 33 2.1.10 Software 34 2.2 Methoden 35 2.2.1 Zellkultur 35 2.2.2 Isolation primärer humaner Makrophagen 35 2.2.3 Herstellung apoptotischer und nekrotischer Zellen 36 2.2.4 Durchflusszytometrische Bestimmung des Zelltods (Annexin V/PI-Färbung) 36 2.2.5 Phagozytose-Assay und Fluoreszenzmikroskopie 37 2.2.6 Messung von Sauerstoffradikalen im Durchflusszytometer (HE Assay) 38 2.2.7 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 38 2.2.8 Agarose-Gelelektrophorese 39 2.2.9 Hitzeschocktransformation von Bakterien 39 2.2.10 Bakterienkultur 40 2.2.11 Plasmidpräparation 40 2.2.12 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 40 2.2.13 Retroviraler Gentransfer 41 2.2.14 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen 42 2.2.15 Luziferase-Assay 42 2.2.16 Quantifizierung des mRNA-Gehalts in RAW264.7-Makrophagen 43 2.2.16.1 mRNA-Isolation 43 2.2.16.2 Reverse Transkription 43 2.2.16.3 Quantitative PCR 44 2.2.17 Griess-Assay 45 2.2.18 Western-Immunoblotting 45 2.2.18.1 Proteinisolation 45 2.2.18.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Lowry 46 2.2.18.3 SDS-PAGE und Proteintransfer auf die Membran 46 2.2.18.4 Detektion 47 2.2.18.5 Zellfraktionierung 48 2.2.19 EMSA 48 2.2.19.1 Herstellung von Kernextrakten für den EMSA 48 2.2.19.2 Durchführung des EMSA 49 2.2.19.3 EMSA Transfer und Detektion 49 2.2.20 Citrullin-Assay 50

Inhaltsverzeichnis III

3 ERGEBNISSE 51

3.1 Etablierung des Modellsystems zum Studium des Einflusses von AZ auf Makrophagen 51 3.1.1 Überprüfung der Zellvitalität 51 3.1.2 Phagozytose von AZ in RAW264.7-Makrophagen 52 3.1.3 Ausschluss eines Einflusses von AZ-Bestandteilen auf die Testergebnisse 53 3.1.4 AZ-vermittelte Hemmung der Nitritproduktion in Makrophagen 54 3.2 Einfluss von AZ auf die ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen 55 3.2.1 AZ hemmen die ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen 55

3.2.2 AZ hemmen die PKCα-Translokation in RAW264.7-Makrophagen 57

3.2.3 PPARγ moduliert die PKCα-Aktivierung in Makrophagen 59

3.2.4 PPARγ hemmt die ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen 62

3.2.5 PKCα spielt eine Rolle bei der Hemmung der ROS-Produktion 64

3.2.6 Zell-Zell-Kontakt von AZ und Makrophagen ist ausreichend zur Hemmung der PKCα-

Aktivierung 65

3.2.7 Modulation der PKCα Aktivierung durch TPA und AZ in primären humanen Makrophagen 67 3.3 Arginase-vermittelte Inhibition der NO-Produktion 67 3.3.1 AZ hemmen die NO-Produktion in Makrophagen ohne Modulation der iNOS-Expression 68 3.3.2 Arginase moduliert die NO-Produktion in AZ-stimulierten Makrophagen 69 3.3.3 AZ führen zur erhöhten Arginase II-Expression in RAW264.7-Makrophagen 71 3.3.4 NO wird durch einen von AZ sekretierten löslichen Faktor inhibiert 73 3.4 Stabilisierung der COX-2-mRNA in Makrophagen durch Inkubation mit AZ 74 3.4.1 AZ induzieren eine schnelle COX-2-Expression in RAW264.7-Makrophagen 75 3.4.2 AZ-vermittelte COX-2-Expression durch mRNA-Stabilisierung 76 3.4.3 COX-2 wird durch einen von AZ sekretierten löslichen Faktor induziert 78

4 DISKUSSION 81

4.1 Etablierung des Phagozytosemodellsystems 81 4.2 Inhibition der ROS-Produktion in Makrophagen nach AZ-Kontakt 82 4.3 Arginase II-vermittelte Inhibition der NO-Produktion 87 4.4 COX-2-Expression in Makrophagen nach AZ-Stimulation 90

5 ZUSAMMENFASSUNG 93

6 LITERATURVERZEICHNIS 96

Inhaltsverzeichnis IV

ANHANG 110

A1 Danksagung 110 A2 Curriculum Vitae 111 A3 Publikationen 112 A4 Erklärung 113

weitere Verzeichnisse IV

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Mechanismen zur Erkennung von AZ durch Makrophagen. 4

Abbildung 1.2: Aktivierung des NADPH-Oxidasekomplexes in Phagozyten. 8

Abbildung 1.3: Struktur- und Liganden-induzierte Aktivierung von PPARγ. 10

Abbildung 1.4: Negative Regulation von Transkriptionsfaktoren durch PPARγ. 12

Abbildung 1.5: L-Arginin Stoffwechselwege. 14

Abbildung 1.6: PGE2 Synthese. 17

Abbildung 3.1: Verifizierung des Zelltods in Jurkat-Zellen. 51

Abbildung 3.2: Phagozytose apoptotischer Teilchen durch RAW264.7-Makrophagen. 52

Abbildung 3.3: Abwaschen der AZ nach Inkubation der Makrophagen. 53

Abbildung 3.4: Gehemmte Nitritproduktion nach Stimulation mit AZ und TGFβ. 54

Abbildung 3.5: ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen nach Inkubation mit AZ, NZ oder

TGFβ. 56

Abbildung 3.6: PKCα-Aktivierung nach TPA und AZ. 58

Abbildung 3.7: Einfluss von Jurkat-Zellen auf die isolierte Gesamtproteinmenge. 59

Abbildung 3.8: PPARγ-Aktivierung in RAW264.7-Makrophagen nach Stimulation mit AZ. 60

Abbildung 3.9: PKCα-Aktivierung in d/n PPARγ-Makrophagen. 61

Abbildung 3.10: Erfolgreiche Transduktion der d/n PPARγ-Mutante in RAW264.7-Makrophagen. 62

Abbildung 3.11: ROS-Produktion nach Stimulation mit AZ in RAW264.7- oder d/n PPARγ-

Makrophagen. 63

Abbildung 3.12: ROS-Produktion in PKCα-überexprimierenden Zellen. 65

Abbildung 3.13: Rolle von Phagozytose und parakrinen Signalen in der Modulation der PKCα-

Aktivierung. 66

Abbildung 3.14: PKCα in humanen Makrophagen nach TPA und AZ. 67

Abbildung 3.15: Nitritproduktion und iNOS-Expression nach AZ. 68

Abbildung 3.16: Citrullin- und Ornithinproduktion nach Stimulation mit AZ. 70

Abbildung 3.17: Nitritproduktion als Antwort auf AZ- und nor-NOHA-Stimulation. 71

Abbildung 3.18: Arginase I und II mRNA-Expression nach Stimulation mit AZ. 72

Abbildung 3.19: Arginase II-Expression nach Coinkubation mit AZ. 73

Abbildung 3.20: Einfluss von Cytochalasin D und AZ-konditioniertem Medium auf Nitritproduktion

und iNOS-Expression. 74

Abbildung 3.21: COX-2-Expression in RAW264.7-Makrophagen nach Stimulation mit AZ und IFNγ.

75

Abbildung 3.22: COX-2-mRNA-Stabilisierung in RAW264.7-Makrophagen nach Inkubation mit AZ.

77

weitere Verzeichnisse V

Abbildung 3.23: COX-2-Expression in RAW264.7-Makrophagen nach Stimulation mit AZ. 78

Abbildung 3.24: Die Rolle von Phagozytose und parakrinen Signalen in der Modulation der COX-2-

Expression. 79

Abbildung 4.1: Mögliche spekulative Mechanismen zur Inhibition von PKCα durch PPARγ. 85

Abbildung 4.2: TPA-vermittelte Aktivierung des NADPH-Oxidasekomplexes in Phagozyten und der

Einfluss von AZ. 86

Abbildung 4.3: Inhibition der IFNγ-induzierten NO-Produktion durch AZ. 90

Abbildung 5.1: Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse. 90

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Apoptose und Nekrose

Der programmierte Zelltod ist eine wichtige Komponente der normalen Entwicklung eines

Organismus und spielt ebenso bei zahlreichen Krankheiten eine tragende Rolle (1). Die

klassischen ultrastrukturellen Studien von Kerr et al. (2) lieferten Beweise, dass zumindest

zwei Typen von Zelltod existieren:

Der erste Typ des Zelltods ist die Apoptose (vom griechischen Begriff für das Fallen der

Blätter im Herbst). Sie ist eine physiologische und programmierte Form des Zelltods und ist

charakterisiert durch das Schrumpfen der betroffenen Zelle, Bildung von sog. ‘apoptotic

bodies’ durch Abschnürung der Plasmamembran, Erhalt der Organellintegrität sowie

Kondensation und Fragmentierung der DNA. Die Zellmembranintegrität bleibt hier zunächst

erhalten und in vivo kommt es normalerweise zu einer schnellen und sicheren Entsorgung

durch professionelle Phagozyten (3).

Der zweite Typ, die Nekrose, stellt eine gewaltsame und schnelle Form der Degeneration

umfangreicher Zellpopulationen dar und ist charakterisiert durch Anschwellen des

Zytoplasmas sowie Zerstörung von Organellen und Aufhebung der Zellmembranintegrität,

welches zur Freisetzung intrazellulärer Bestandteile ins umliegende Gewebe und damit zur

Entzündung desselben führen kann.

Unter sekundärer Nekrose versteht man die Desintegration von ursprünglich apoptotischen

Zellen (AZ), die nicht von Phagozyten aufgenommen wurden. Sie tritt in vivo wahrscheinlich

nur dann auf, wenn in soliden Geweben die Anzahl von AZ die Phagozytosekapazität bei

weitem übersteigt (4).

Im Wesentlichen gibt es drei Hauptsignalwege, die zur Apoptose führen können: Die

Todesrezeptor-vermittelte Apoptose, die über Mitglieder der Todesrezeptorfamilie (wie z.B.

CD95) vermittelt wird und zu einer Aktivierung von Caspase-8 führt, sowie den

endoplasmatischen Reticulum-Stresssignalweg über Caspase-12 und den mitochondriellen

Signalweg, der z.B. als Antwort auf Schädigungen der DNA aktiviert wird und zu einer

Aktivierung von Caspase-9 und zur späteren Spaltung von Caspase-3, -6 oder -7 führt (1, 5).

Einleitung 2

1.2 Phagozytose apoptotischer Zellen

Während der Morphogenese und Embryogenese sterben Millionen von Zellen den

programmierten Zelltod und eine große Anzahl von Zellen entsteht und stirbt während der

Lebensspanne eines Organismus durch normale physiologische Prozesse. Diese beinhalten

z.B. die Beseitigung von Effektorlymphozyten nach Antigenkontakt, Beseitigung

inflammatorischer Zellen, die in entzündete oder verletzte Gewebe rekrutiert wurden oder

z.B. bei Geweberemodulation in der sich entwickelnden Brustdrüse. Daher erscheint es

logisch, dass in vielzelligen Organismen der größte Anteil an phagozytiertem Material aus

eigenen Zellen und nicht etwa aus Pathogenen besteht (6).

Die Erkennung und die Phagozytose der sterbenden Zellen wird in vivo durch eine Vielzahl

von Rezeptoren vermittelt, von denen einige auch zur Pathogenerkennung dienen (4). Der

schnellen und sicheren Beseitigung von AZ kommt dabei eine wichtige Bedeutung zu, da

diese einer Freisetzung von zellulären Bestandteilen wie z.B. DNA oder Proteasen nach

Verlust der Membranintegrität vorbeugt, welche sonst das umliegende Gewebe schädigen

könnten (3, 7, 8).

Die Phagozytose apoptotischer Zellen ist ein einzigartiger komplexer Vorgang, bei dem im

Gegensatz zur Pathogenphagozytose ein aktiver, anti-inflammatorischer Prozess stattfindet,

der in Makrophagen zur verminderten Ausschüttung pro-inflammatorischer Mediatoren und

zur erhöhten Freisetzung anti-inflammatorischer Stoffe führt (9). Diese Selbstregulation

schützt den Organismus vor unkontrollierten inflammatorischen Prozessen und

Autoimmunreaktionen, die sonst durch die Phagozytose sterbender Zellen induziert würden.

Im Gegensatz dazu können AZ unter ganz besonderen Bedingungen scheinbar auch zu einer

pro-inflammatorischen Antwort führen. Es wurde z.B. beschrieben das dendritische Zellen

(DZ) AZ-Antigene über den ‚major histocompatibility complex I’ (MHC I) präsentieren und

so CD8+ zytotoxische T –Zellen (CTLs) stimulieren können (10).

Die Mechanismen, wie AZ zur Reprogrammierung von Makrophagen führen, sind noch nicht

vollständig erforscht und finden scheinbar über einen komplexen Prozess statt, der durch die

Erkennung, Bindung und/oder Phagozytose sterbender Zellen vermittelt wird (6). Ein tieferes

Verständnis der pro- und anti-inflammatorischen Effekte nach der Phagozytose von AZ

könnte helfen, die Pathogenese von autoimmun- und infektiösen Krankheiten, chronischen

Entzündungen und Krebs besser zu verstehen (4).

Einleitung 3

1.2.1 Erkennung apoptotischer Zellen

Seit der Identifizierung des Makrophagen-Vitronectin-Rezeptors (αvβ3 Integrin) als erstem

beschriebenem Faktor, der an der Phagozytose von AZ beteiligt ist (11), haben in vitro-

Studien gezeigt, dass es sich bei der Erkennung apoptotischer Zellen um einen Vorgang

handelt, bei dem eine Vielzahl verschiedener Rezeptoren, Brückenmoleküle sowie

Oberflächenmarker sterbender Zellen beteiligt sind. Es ist anzunehmen, dass das Repertoire

an beteiligten Rezeptoren zu einer spezifischen Erkennung, verbesserten Bindung und

schließlich zur Phagozytose und Interpretation von sogenannten ‚apoptotic cell-associated

molecular patterns’ (ACAMPs) führt (12, 13). Die Namensgebung der ACAMPs erfolgte in

Anlehnung an die Phagozytose von Pathogenen, die unter anderem über so genannte

‚pathogen-associated molecular patterns’ (PAMPs) vermittelt wird.

Ein bedeutender Marker auf der Zelloberfläche von AZ ist das Phosphatidylserin (PtdSer) (8,

14), ein Phospholipid, das sich bei vitalen Zellen auf der Innenseite der Zellmembran

befindet. Gelegentlich gelangen PS-Moleküle auf die Zellaußenseite, werden jedoch durch

das Enzym Aminophospholipid-Translokase wieder zurücktransportiert. Beim Zelltod kommt

es zur Inaktivierung dieses Enzyms, was eine Anhäufung von PtdSer an der

Membranaußenseite zur Folge hat (15). Das Vorhandensein eines spezifischen

Phosphatidylserinrezeptors (PtdSerR) an der Oberfläche professioneller Phagozyten wurde in

der Vergangenheit des Öfteren beschrieben und mit der Phagozytose apoptotischer Zellen in

Zusammenhang gebracht (16-20). Andere Arbeiten an PtdSerR ‚knock out’-Mäusen schildern

jedoch einen immunmodulatorischen Effekt des Rezeptors, ohne Einfluss auf die Phagozytose

von AZ (21) oder eine ausschließliche Lokalisation des Rezeptors im Nukleus und nicht in

der Plasmamembran (22), was die zunächst angenommene Funktion als Phagozytosemediator

in Frage stellt.

Neben PtdSer gibt es weitere Signale auf der Zelloberfläche von AZ, die von spezifischen

Rezeptoren der Phagozyten erkannt werden können, wie z.B. Oberflächenzucker, das

Adhäsionsmolekül ICAM-3, modifiziertes CD31 und oxidierte Oberflächenmoleküle (z.B.

Phospholipide) und ACAMPs (4). Moleküle mit Brückenfunktion zwischen der Oberfläche

der AZ und der Phagozyten sind z.B. das Thrombospondin (TSP), der ‚milk-fat globule

epidermal growth factor 8’ (MFGE8) oder der Komplementfaktor 1 (C1q) (4, 23, 24).

Beispiele für Phagozytenrezeptoren sind Integrine, CD14, Mer-Kinase oder Scavenger-

Rezeptoren (4, 25, 26).

Einleitung 4

Abbildung 1.1: Mechanismen zur Erkennung von AZ durch Makrophagen. Die Erkennung bzw. Bindung

von AZ wird über eine Vielzahl von Rezeptoren, Brücken- und Biomoleküle vermittelt. Involviert sind CD14,

β2-Integrine (die das opsonisierte inaktivierte Komplementfragment C3b (iC3b) binden), der CD91-Calretikulin-

Komplex (der die erste Komponente des Komplements (C1q) oder Mannose-bindendes Lectin (MBL) binden

kann, die wiederum ACAMPs an der Oberfläche von AZ erkennen können), Scavenger-Rezeptoren (wie der

Klasse-A Scavenger-Rezeptor (SRA), CD68, ‚oxidized low-density lipoprotein receptor 1’ (LOX1) und CD36,

welche oxidierte Stellen auf AZ erkennen und ‚oxidized low-density lipoprotein’ (oxLDL) ähnlich sind). Die

Präsentation von Phosphatidylserin (PtdSer) an der Oberfläche von AZ ist ein Schlüsselereignis zur Erkennung

durch professionelle Phagozyten. Es wird erkannt durch den Phosphatidylserinrezeptor (PtdSerR), dessen

Beitrag zur Phagozytose von AZ allerdings in letzter Zeit in Zweifel gezogen wurde (siehe Text), Rezeptoren für

das Brückenplasmaprotein β2-Glykoprotein I (β2-GPI), den Mer-Kinaserezeptor für das Brückenprotein Gas6,

und αvβ3-Integrin (das an das Brückenprotein ‚milk-fat globule epidermal growth factor 8’ (MFGE8) bindet).

Reorganisation von Plasmamembranlipiden durch ‚ATP-binding cassette transporter’ (ABC1) in AZ und

Phagozyten können ebenfalls zur Erkennung beitragen. Weiterhin involviert sind Modifikationen von CD31 der

AZ und eventuell ähnliche Veränderungen eines anderen Mitglieds der Immunglobulinfamilie, dem ‚intercellular

adhesion molecule 3’ (ICAM3). Das modifizierte CD31 bindet fest an CD31 des Phagozyten, was eine Bindung

des Brückenproteins ‚Thrombospondin-1’ (TSP1) an Makrophagenintegrine bewirken könnte (4).

Einleitung 5

Für die Phagozytose von Pathogenen, nekrotischen Zellen (NZ) und AZ konnten in

elektronenmikroskopischen Untersuchungen auch unterschiedliche Mechanismen zur

Aufnahme der jeweiligen Partikel nachgewiesen werden. Pathogene werden meist über

Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen, während AZ über einen Reißverschluss-

ähnlichen ‚zipper’-Mechanismus und NZ sowie sekundäre NZ durch Makropinozytose

phagozytiert werden (27, 28). Die Komplexität und strenge Regulation der verschiedenen

Phagozytosemechanismen und deren Auswirkungen auf das Verhalten von Phagozyten

kommen unter anderem auch dadurch zum Ausdruck.

Eine detaillierte Aufstellung der an der Phagozytose beteiligen Faktoren ist in Abbildung 1.1

dargestellt.

1.2.2 Phagozytose von AZ und deren Einfluss auf das Immunsystem (Desensitivierung)

Während man ursprünglich glaubte, die Beseitigung von AZ durch Phagozyten sei ein

Prozess, bei dem lediglich tote Zellen entfernt werden, bevor das umliegende Gewebe durch

sekundäre Nekrose und die Freisetzung pro-inflammatorischer Mediatoren geschädigt wird,

ist heute klar, dass Makrophagen nach der Phagozytose von AZ zusätzlich einen aktiven anti-

inflammatorischen Phänotyp ausbilden (29, 30).

Einer der ersten Befunde dafür zeigte, dass LPS-stimulierte Monozyten, die zwar AZ binden

aber diese nicht aufnehmen (31), nach Coinkubation mit AZ keinen ‚tumor necrosis factor’

(TNF) mehr freisetzten, dafür jedoch die anti-inflammatorischen Zytokine ‚transforming

growth factor-β1’ (TGF-β) und Interleukin-10 (IL-10) (32). Dies konnte später mit einem

anderen Typ von AZ bestätigt werden (33). Danach konnten Fadok et al. zeigen, dass in

humanen Makrophagen zwar die Produktion von IL-10 verringert, TNF jedoch ebenso

vermindert und die TGFβ-Produktion erhöht war (9). Der Einsatz von Inhibitoren zeigte, dass

sowohl TGFβ und Prostaglandin E2 (PGE2), als auch der ‚platelet activating factor’ (PAF)

eine parakrine oder autokrine Rolle bei der Inhibition von TNF spielten. Für TGFβ wurde

auch angenommen, dass es in diesem Kontext zur Aktivierung von ERK beiträgt und über

eine dadurch ausgelöste Erhöhung der MAPK-Phosphatase-1 zur Inhibition von p38-MAPK

führt und so die Hemmung pro-inflammatorischer Mediatoren bewirkt (34).

Außerdem wurde beschrieben, dass AZ in der Lage sind, die NO- (35, 36) und ROS-

Induktion (37) in Makrophagen zu inhibieren. Die Autoren vermuteten hier ebenfalls einen

Einleitung 6

Einfluss von TGFβ. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Phagozytose von AZ zur Freisetzung

von Wachstums- und Überlebensfaktoren wie VEGF führen kann (38). Des Weiteren sind AZ

anscheinend in der Lage, die IFNγ/LPS- oder TNFα-induzierte Apoptose in Makrophagen zu

hemmen (39). Die Mer-Rezeptor-Tyrosinkinasen spielen wahrscheinlich bei der Erkennung

von AZ und der anschließenden Signalweiterleitung ebenfalls eine Rolle (26).

Die genauen zugrunde liegenden Mechanismen bei der Erkennung/Phagozytose von AZ sind

noch weitestgehend unbekannt.

Zusammenfassend kann also folgendes festgehalten werden:

• Der Prozess der Phagozytose von AZ ist ein evolutionär konservierter und

einzigartiger Mechanismus.

• Erkennung und Aufnahme von AZ sind wichtig für die Prävention der Freisetzung

zytotoxischer und potentiell auto-immunogener Bestandteile sterbender Zellen.

• Interaktion von Phagozyten mit AZ und nicht notwendigerweise die Phagozytose führt

zur Freisetzung anti-inflammatorischer Zytokine und supprimiert somit aktiv eine

mögliche Entzündung im umliegenden Gewebe.

• Die Präsentation AZ-spezifischer Signale an deren Oberfläche und die Erkennung

derselben durch Makrophagenrezeptoren ist wichtig für die Phagozytose. Dabei

können die Makrophagenrezeptoren nicht nur anti-inflammatorische Signale

weiterleiten, sondern auch die Bindung verstärken oder den Phagozytosevorgang

vermitteln.

Einleitung 7

1.3 ROS-Produktion in Makrophagen

Schon 1933 wurde beobachtet, dass neutrophile Zellen nach der Phagozytose von Bakterien

einen erhöhten Sauerstoffverbrauch oder ‚respiratory burst’ aufwiesen (40, 41). Später fand

man dann heraus, dass dieser ‚respiratory burst’ zur Abtötung von phagozytierten Pathogenen

in phagozytisch aktiven Zellen nötig ist (42). Heute ist die Produktion von

Sauerstoffradikalen, auch ‚reactive oxigen species’ (ROS) genannt, von professionellen

Phagozyten wie Neutrophilen oder Makrophagen in Folge der Pathogenphagozytose ein

relativ gut untersuchter Prozess, der als korrelativer Marker für die Zellaktivierung angesehen

werden kann (43). Ihre bakterizide Wirkung entfalten ROS durch die hohe Reaktivität und die

Fähigkeit zur Oxidation zahlreicher organischer Verbindungen.

Diese Sauerstoffradikalproduktion, heute auch ‚oxidative burst’ genannt, wird vermittelt

durch einen Multikomponenten-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphatase (NADPH)-

Oxidaseproteinkomplex (44, 45). Stimulation von Makrophagen mit dem Phorbolester

2-O-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Azetat (TPA) führt zur Phosphorylierung von p47phox, einer

der zytosolischen Komponente der NADPH-Oxidase (46). Die Phosphorylierung initiiert die

Translokation eines p47phox/p67phox/ p40phox-Komplexes an die Zellmembran, wo dieser mit

Flavocytochrom b558 interagiert (45) und zur Aktivierung des NADPH-Oxidasekomplexes

führt. Jüngste Berichte zeigen die Existenz eines weiteren zytosolischen Proteins, das mit

p67phox coimmunopräzipitiert wurde, dem p29 Peroxiredoxin (p29prx), dessen Funktion

allerdings noch nicht verstanden ist (47). Für humane Monozyten und RAW264.7-

Mausmakrophagen konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von p47phox von der

Proteinkinase Cα (PKCα) vermittelt wird (48, 49). Kürzlich wurde in unserer Arbeitsgruppe

nachgewiesen, dass eine verminderte Expression von PKCα oder die Expression einer

Kinase-inaktiven PKCα-Mutante den TPA-induzierten ‚oxidative burst’ inhibiert (50). Der

Mechanismus der NADPH-Oxidaseaktivierung ist in Abbildung 1.2 detailliert dargestellt.

Der Einfluss von AZ auf die Sauerstoffradikalproduktion in Makrophagen war bis dato

weitestgehend unbekannt. Vor kurzem konnte jedoch gezeigt werden, dass in RAW264.7-

Makrophagen nach AZ-Kontakt die ROS-Produktion über einen PtdSer-abhängigen, aber

noch unbekannten Mechanismus gehemmt ist (37). Die Hemmung des ‚oxidative burst’ ist

Teil der Makrophagenreprogrammierung vom pro- zum anti-inflammatorischen Phänotyp

nach AZ-Kontakt und ein Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen könnte helfen,

den Reprogrammierungsvorgang als Ganzes besser zu verstehen.

Einleitung 8

Abbildung 1.2: Aktivierung des NADPH-Oxidasekomplexes in Phagozyten. Die Aktivierung des NADPH-

Oxidasekomplexes resultiert aus dem Zusammenschluss im Zytosol befindlicher regulatorischer Proteine

(p40phox, p47phox und p67phox) mit Flavocytochrom b558 (bestehend aus der Membran-assoziierten katalytischen

Untereinheit gp91phox und p22phox). Dies wird hauptsächlich vermittelt durch Aktivierung von PKCα und di

Aktivität Lipid-metabolisierender Enzyme, wie z.B. der Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) und der

Aktivierung der GTPase ‚ras-related C3 botulinum toxin substrate’ (RAC). PKCs katalysieren verschiedene

Phosphorylierungen der autoinhibitorischen Region (AIR) von p47phox, was zu einer Freilegung der SRC

Homologie 3 (SH3) Domäne führt, woraufhin p47phox an p22phox binden kann. Außerdem wird die Inhibition der

phox-Homologie-(PX)-Domäne aufgehoben, wodurch p47phox an Lipide binden kann. Da p47phox auch an p67phox

bindet, wurde es in der Vergangenheit oft als Organisatorprotein beschrieben. PI3K und Phospholipase D

produzieren 3-phosphoryliertes Phosphatidylinositol (PtdIndP3) und stellen damit Lipide zur Verfügung, an

welche die PX-Domänen von p47phox und p40phox binden. Die Funktion des p67phox-assoziierten p29

Peroxiredoxins (p29Prx) ist noch unklar (43, 51).

Einleitung 9

1.4 PPARγ

PPAR bedeutet ‚peroxisome proliferator-activated receptor’ und steht für eine Familie von

Liganden-aktivierten nuklearen Hormonrezeptoren (52, 53). Bis heute sind 3 verschiedene

PPARs identifiziert (PPARα, PPARβ/δ und PPARγ), wobei PPARγ ursprünglich als ein

entscheidender Faktor in der Adipogenese und im Glukosemetabolismus beschrieben wurde

(54, 55). Es gibt vier mögliche Splice-Varianten, aus denen zwei verschiedene Proteine

(PPARγ1 und PPARγ2) resultieren (56, 57). Humanes PPARγ1 besteht aus 477 Aminosäuren

(AA), während PPARγ2 28 zusätzliche AA am N-Terminus besitzt (58). Dabei gilt es zu

beachten, dass in Zellen des Immunsystems überwiegend PPARγ1 exprimiert wird (59, 60).

Funktionell kann PPARγ in fünf verschiedene Domänen unterteilt werden, deren Aufbau und

Funktion in Abbildung 1.3a dargestellt sind (61). Diese Domänenstruktur ist auch bei anderen

nukleären Hormonrezeptoren bekannt (57).

Die Aktivierung von PPARγ resultiert aus der Bindung eines Agonisten und der

Dimerisierung mit dem ‚retinoic X receptor’ (RXR) (62). Einmal aktiviert, kann das

Heterodimer an ‚peroxisome proliferator response elements’ (PPRE) in der Promoterregion

entsprechender Gene binden und deren Transkription modulieren (56). Im Gegensatz dazu

bindet das PPARβ/RXR Heterodimer scheinbar konstitutiv an die DNA. Eine detaillierte

Darstellung des Aktivierungsprozesses von PPARγ ist in Abbildung 1.3b dargestellt (61).

Neben der transkriptionellen Regulation durch direkte DNA-Bindung ist PPARγ auch in der

Lage, die Genexpression zu hemmen, indem es an andere Transkriptionsfaktoren wie z.B.

NFκB (63) bindet oder transkriptionelle Cofaktoren daran hindert, ihre costimulatorische

Funktion auszuführen (61). Diese Effekte werden wahrscheinlich über direkte Protein-

Protein-Wechselwirkungen vermittelt (64). Ein weiterer Mechanismus zur Transrepression

besteht in der Fähigkeit des PPARγ/RXR-Heterodimers, die Phosphorylierung und

Aktivierung von ‚mitogen activated protein kinases’ (MAPK) zu inhibieren. PPARγ-

Agonisten können sowohl die Aktivierung der ‚c-Jun N-Terminal Kinase’ (JNK), als auch der

p38-MAPK hemmen (65). Abbildung 1.4 zeigt diese Transrepressionsmechanismen.

Einleitung 10

Abbildung 1.3: Struktur- und Liganden-induzierte Aktivierung von PPARγ. (a) Wie andere nukleäre

Hormonrezeptoren besitzen die PPARs fünf verschiedene Regionen. Die zwei am stärksten konservierten sind

Region C und E, die aus einer hochkonservierten DNA-Bindedomäne (DBD) und einer weniger konservierten

Ligandenbindedomäne (LBD) bestehen. Die Amino-terminale A/B-Domäne beinhaltet die Liganden-

unabhängige Aktivierungsdomäne ‚activation function 1’ (AF1), während sich die Liganden-abhängige

Aktivierungsdomäne (AF2) in der F-Region befindet. Die D-Region besteht aus einer variablen ‘hinge domain’

(HD). (b) Die PPARγ-Aktivierung geschieht generell nach der Bindung eines Liganden an die LBD. Im

Gegensatz zu anderen Hormonrezeptoren können PPARs, also auch PPARγ, an eine Vielzahl unterschiedlicher

natürlicher Liganden binden. Beispiele für PPARγ-spezifische Liganden sind 13-Hydroxy-9,11-

Octadecadiensäure (13-HODE) oder 15-Desoxy-∆12,14-Prostaglandin J2 (15d-PGJ2). Nach der Ligandenbindung

kann PPARγ den Corepressorkomplex (‚nuclear receptor co-repressor/silencing mediator for retinoid and thyroid

hormone receptors’, NCoR/SMRT) verlassen, der durch seine Assoziation mit Histondeazetylasen die

Gentranskription reprimiert. Nach der Dissoziation des Corepressorkomplexes bindet PPARγ an ein ‚peroxisome

proliferator response element’ (PPRE) der DNA. Es kann dann mehrere Coaktivatoren, wie z.B. den ‚steroid

receptor co-activator 1’ (SRC1) und das ‚cAMP response element (CREB)-binding protein’ (CBP)/p300 binden.

Diese Coaktivatorkomplexe reorganisieren durch ihre Histonazetyltransferaseaktivität die Chromatinverpackung

und erlauben so der Transkriptionsmaschinerie den Zugang zur Promotorregion. RXR: 9-cis-retinoic acid

receptor (61).

Einleitung 11

Kürzlich wurde gezeigt, dass PPARγ durch den ‚Small Ubiquitin-like Modifier-1’ (SUMO-1)

modifiziert werden und so seine transkriptionelle Aktivität gehemmt werden kann (66).

Außerdem kann eine PPARγ-Modifikation durch SUMO dazu führen, dass dieser an den

‚nuclear receptor co-repressor’ (NcoR)-Histondeazetylase-3 (HDAC3)-Komplex bindet und

so den Zugriff des Proteasoms auf den HDAC3-Komplex verhindert, wodurch

inflammatorische Gene, wie z.B. das iNOS Gen, transreprimiert werden (67).

In den letzten Jahren wurde immer deutlicher, dass PPARγ z.B. durch seine anti-

inflammatorische und desensitivierende Wirkung in Makrophagen einen wichtigen

immunmodulatorischen Faktor darstellt (56, 59, 68). Er ist in Monozyten nur schwach

exprimiert, wird aber während der Differenzierung zu Makrophagen stark induziert (69, 70).

Eine Rolle von PPARγ für die Kontrolle der Monozyten/Makrophagenaktivierung wurde

erstmals 1998 von zwei unabhängigen Gruppen beobachtet (59, 68). Es konnte gezeigt

werden, dass eine Aktivierung von PPARγ nach oraler Verabreichung sowohl von

synthetischen antidiabetischen Agonisten, bekannt als Thiazolidindione, als auch natürlich

vorkommenden Substanzen, wie Fettsäuren oder 15-Desoxy-∆12,14-Prostaglandin J2 (15d-

PGJ2), die Expression pro-inflammatorischer Zytokine inhibiert (56). PPARγ-spezifische

Liganden können z.B. die Produktion von TNFα, Interleukin-1β (IL-1β) und IL-6 sowie die

induzierte Produktion von NO oder die Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9) hemmen (61).

Darüber hinaus konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass PPARγ die TPA-induzierte

ROS-Produktion in Makrophagen über eine verminderte Expression von p47phox zu inhibieren

vermag (71).

PPARγ ist also ein vielseitiges Protein, das wesentlich zur Immunregulation in Makrophagen

beiträgt.

Einleitung 12

Abbildung 1.4: Negative Regulation von Transkriptionsfaktoren durch PPARγ. Die inflammatorischen und

immunregulatorischen Eigenschaften von PPARγ resultieren nicht allein aus dessen

Transaktivierungseigenschaften als Trankriptionsfaktor, sondern auch aus dessen Fähigkeit, antagonistisch auf

einige wichtige Signalkaskaden einzuwirken. Drei verschiedene Transrepressionsmechanismen wurden in Zellen

des Immunsystems beschrieben. (a) Der erste Mechanismus besteht darin, das PPARγ in der Lage ist, limitierte

Coaktivatoren wie CBP oder SRC1 zu binden und diese so nicht mehr für andere Transkriptionsfaktoren (TF)

zur Verfügung stehen. (b) Der zweite Mechanismus der Transrepression ist bekannt als ‚cross coupling’ oder

‚mutual receptor antagonism’ und basiert auf der Fähigkeit von PPARγ, direkt verschiedene andere

Transkriptionsfaktoren zu binden und so deren Bindung an die DNA und die anschließende Transkription von

deren Zielgenen zu verhindern. (c) Des Weiteren ist PPARγ in der Lage, die Aktivierung von ‚mitogen-activated

protein kinase’ (MAPK) zu hemmen und so die Phosphorylierung und damit die Aktivierung verschiedener

MAPK-abhängiger Transkriptionsfaktoren zu inhibieren (61).

Einleitung 13

1.5 NO und Arginase

1.5.1 L-Arginin-Metabolismus

NO ist ein wichtiges bioregulatorisches Molekül im Nerven-, Kardiovaskular- sowie dem

Immunsystem und wird in vivo über das Enzym NO-Synthase (NOS) gebildet. Es gibt 3

Isoformen der NOS: neuronale NOS (nNOS), endotheliale NOS (eNOS) und die induzierbare

NOS (iNOS) (72, 73). Von den verschiedenen Enzymen wird nur die iNOS stark über ihren

Expressionsgrad (z.B. durch IFNγ, TNFα oder LPS in Makrophagen) reguliert, während

eNOS und nNOS normalerweise konstitutiv exprimiert sind und über post-translationale

Mechanismen durch Ca2+/Calmodulin reguliert werden (72-74).

Nach der Translation müssen sich die Monomere der iNOS zunächst zu aktiven

Homodimeren zusammenlagern. Nach der derzeitigen Meinung produziert die iNOS bei

ausreichender Cofaktor- und Substratverfügbarkeit bis zu ihrem Abbau permanent NO (72).

In Gegenwart molekularen Sauerstoffs und verschiedener Cofaktoren setzen alle drei NOS-

Isoenzyme L-Arginin über das Zwischenprodukt Nω-Hydroxy-L-Arginin zu Citrullin und NO

um (75). Die Aktivierung des iNOS-Promotors ist besonders in Makrophagen ein wichtiger

Schritt für die Regulation der iNOS-Expression und der NO-Bildung als Antwort auf

mikrobielle Bestandteile, Pathogene und Zytokine (72). Trotzdem gibt es andere bekannte

Mechanismen, welche die NO-Produktion beeinflussen können.

Zu den ersten Substanzen, denen eine hemmende Wirkung auf die NO-Produktion

zugesprochen wurde, zählte TGFβ. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass TGFβ zur

iNOS-Proteindegradation führt, dessen mRNA-Transkription und –Stabilität verringert und

post-translational die iNOS-Proteinsynthese und die iNOS-Aktivität hemmt (76). Außerdem

wurden inhibitorische Proteine wie das ‚NOS-associated protein’ (NAP110) in Makrophagen

(77), oder Kalirin (78), das im zentralen Nervensystem vorkommt, beschrieben, welche die

Dimerisierung des iNOS-Proteins hemmen und somit dessen Aktivität unterbinden (79, 80).

Ein weiterer Mechanismus zur Inhibition der NO-Produktion besteht in der Limitierung der

Substratverfügbarkeit durch eine Erhöhung der Arginaseaktivität (79, 80).

Einleitung 14

Abbildung 1.5: L-Arginin Stoffwechselwege. Die Aktivität der iNOS wird durch Zytokine und bakterielle

Bestandteile (wie LPS) reguliert (siehe weiße Kästchen), welche die Aufnahme von L-Arginin (L-Arg) durch

kationische Aminosäuretransporter (CAT), die Synthese von Cofaktoren (wie z.B. BH4 durch Cyclohydrolase I),

die Expression der iNOS-mRNA und des Proteins und das enzymatische Recycling von Citrullin zu L-Arg (über

die Arginosuccinatsynthetase (AS) und die Arginosuccinatlyase (AL) mit Arginosuccinat als Zwischenprodukt)

sowie die Metabolisierung von L-Arginin durch die Arginase beeinflussen. Die in der Grafik aufgezeigten

positiven Stimuli für die Arginase beziehen sich vorwiegend auf Arginase I. Die Signalwege, die zur Induktion

von Arginase II führen, sind noch kaum erforscht. Polyamine wie z.B. Spermidin und Spermin (Produkte des

Arginase/Ornithindecarboxylase (ODC)-Metabolismus), wirken immunsupprimierend und können außerdem die

Produktion von NO inhibieren. Eine hohe Arginaseaktivität in Abwesenheit der iNOS kann außerdem zu einer

Produktion von Prolin über die Ornithin-Aminotransferase (OAT) führen, welches zur Kollagensynthese (z.B. in

Fibroblasten) benötigt wird.

Zur Zeit sind zwei Arginaseisoformen bekannt. Die hepatische Arginase (Arginase I) wird

hauptsächlich in der Leber exprimiert und katalysiert den letzten Schritt der

Harnstoffsynthese, während Arginase II in verschiedenen extrahepatischen Geweben

vorkommt (81). Arginase katalysiert die Umsetzung von L-Arginin zu Ornithin und Harnstoff

und konkurriert damit mit der iNOS um deren Substrat (82). So konnte unter anderem gezeigt

Einleitung 15

werden, dass in murinen RAW264.7-Makrophagen eine erhöhte Arginase II-Expression die

NO-Produktion zu inhibieren vermag (79, 83).

Eine hohe NO-Produktion durch die iNOS ist wesentlich von der Menge an extrazellulärem

L-Arginin abhängig (72). Durch kationische Aminosäuretransporter (CAT1, CAT2A, CAT2B

und CAT3), die z.B. durch LPS und IFN-γ reguliert werden können, wird L-Arginin in den

Intrazellulärraum transportiert (72, 84). Die Menge an extrazellulärem L-Arginin ist unter

anderem abhängig von der Arginase, welche auch in den Extrazellulärraum sezerniert werden

kann (72). Beide bekannten Isoformen (Arginase I und II) können in Makrophagen exprimiert

werden. Arginase I kann durch verschiedene Zytokine wie IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β oder

durch LPS induziert werden (79, 85, 86) und Arginase II z.B. durch den ‚interferon regulatory

factor 3’ (IRF-3) (87), PGE2, LPS (88) oder IL-10/Isoproterenol (89). Der Einfluss von iNOS

und Arginase auf den L-Argininstoffwechsel in der Zelle ist in Abbildung 1.5 dargestellt.

1.5.2 Wirkung von NO

NO ist ein kleines gasförmiges, diffusionsfähiges Molekül, das in Makrophagen von der

iNOS in großen Mengen produziert wird. Es besitzt anti-virale, anti-mikrobielle, anti-

parasitäre sowie tumorizide Eigenschaften und hat immunmodulatorische Funktionen (72,

73).

Eine Schädigung von Pathogenen kann entweder durch einen direkten Effekt von NO-

Radikalen auf den Erreger oder aber indirekt durch die Bildung weiterer reaktiver

Verbindungen ausgeübt werden. Dies geschieht z.B. durch die Reaktion von NO mit ROS

oder anderen Molekülen (90). Seine tumorizide Wirkung entfaltet NO unter anderem dadurch,

dass es einen Zellzyklusarrest bewirkt (91) und so das Tumorwachstum inhibiert oder sich

hemmend auf die Metastasenbildung auswirkt (92). Die immunmodulatorische Wirkung von

NO beinhaltet z.B. die Induktion der Apoptose in den Effektorzellen nach einer

Entzündungsreaktion (93) oder die Hemmung der Antigenpräsentation über den MHC-II-

Komplex (94). Außerdem kann NO mit zahlreichen Biomolekülen reagieren und so z.B. durch

kovalente Modifizierung mittels Nitrosylierung von SH-Gruppen an Cysteinresten eine

Aktivierung oder Deaktivierung bewirken. NO kann frei diffundieren und ist so in der Lage,

direkt mit seinem jeweiligen Zielmolekül zu interagieren. Zusätzlich kann NO die

Einleitung 16

Enzymaktivität verändern, indem es mit Eisen-Schwefel-Clustern (z.B. bei Proteinen der

Elektronentransport-Kette) oder Häm-Proteinen reagiert (95).

NO wirkt aber nicht nur post-translational auf die Aktivität verschiedener Enzyme, sondern

hat auch einen modulatorischen Einfluss auf Transkriptionsebene. Einige Transkriptions-

faktoren wie NF-κB oder AP-1 können an Zysteinresten nitrosyliert werden, wodurch sich die

DNA-Bindungsaffinität verändert (96).

Darüber hinaus ist NO in der Lage, direkt auf die DNA einzuwirken, indem es diese

deaminiert oder durch Verbindungen wie Stickstoffdioxid oder Peroxynitrit oxidativ

beschädigt. Außerdem kann NO mit Enzymen des DNA-Reparatursystems reagieren und

diese inaktivieren (90).

1.6 Cyclooxygenase-2

Prostaglandine, bedeutende bioaktive Signalmoleküle, wurden zum ersten Mal in den 30er

Jahren aus Sperma und der Prostata extrahiert und mit einer Verminderung des Blutdrucks

und der Kontraktion von glattem Muskelgewebe in Verbindung gebracht (97). Prostaglandine

werden in verschiedenen Geweben synthetisiert und dienen als auto- oder parakrin wirkende

Mediatoren. Heute weiß man, dass eine Vielzahl verschiedener Prostaglandine über die

Arachidonsäurekaskade synthetisiert werden können. Die erste Aufreinigung der

Cyclooxygenase (COX), die die Umsetzung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen

synthetisiert, erfolgte erst 1976. Bis dahin wurden Gewebehomogenisate als Quelle für die

COX-Aktivität genutzt und das verantwortliche Enzym Prostaglandinsynthethase genannt (98,

99). Da COX-Enzyme kein Adenosintriphosphat (ATP) benötigen, wurde die Nomenklatur

später zu Prostaglandinsynthase geändert. Als Sir John Vane 1971 zellfreie Lysate von

Meerschweinchenlungen benutzte und zeigte, dass Aspirin, Indometazin und Salizylate die

COX hemmen, und so deren Wirkmechanismus entdeckte, geriet dieses wichtige

immunregulatorische Enzym mehr und mehr in das Interesse der Forschung (97).

Heute sind zwei COX-Isoenzyme bekannt (COX-1 und COX-2), die beide über ihre

Expression reguliert werden (97, 100). Darüber hinaus sind verschiedene Splicing-Varianten

wie z.B. COX-3 im Zerebrum oder ‚partial COX’ (PCOX)-1a, die aufgrund der fehlenden

katalytischen Domäne kein PG produziert, beschrieben (97). Die COX-1 wird eher konstitutiv

in ruhenden Zellen und bei der Differenzierung exprimiert, während das COX-2-Enzym bei

Zellaktivierung schnell über eine große Zahl Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine und

Einleitung 17

durch physischen Stress exprimiert werden kann und in Entzündungsreaktionen eine wichtige

Rolle spielt (100).

Ein weiterer Regulationsmechanismus der COX-2 ist eine Stabilisierung oder

Destabilisierung der mRNA (100-102). Das COX-2-Gen besitzt eine große ‚3´-untranslated

region’ (UTR), die mehrere konservierte Regionen und 22 Kopien eines AUUUA-Motivs

enthält (103). Untersuchungen der 3´-UTR haben gezeigt, dass alternative Polyadenylierung

in dieser Region zu zwei unterschiedlichen COX-2-mRNA-Isoformen führen kann (COX-24.6

und COX-22.8), die eine unterschiedliche Stabilität aufweisen (100, 104).

Die post-transkriptionelle Regulation der Genexpression über eine Veränderung der mRNA-

Stabilität ist ein gut regulierter Mechanismus, der über stabilisierende und destabilisierende

Faktoren ausgelöst wird (z.B. TIAR, TTP, AU-A, TIA-1 wirken destabilisierend und HuR,

HuD, Hel-N1 dagegen stabilisierend, während AUF-1 beides bewirken kann), die mit der

mRNA interagieren (105). Viele dieser Faktoren sind heute bekannt und für das COX-2-Gen

konnte in RAW264.7-Makrophagen gezeigt werden, dass z.B. TIAR, AUF-1, HuR, und TIA-

1 mit der 3´-UTR interagieren können (102, 106).

Abbildung 1.6: PGE2 Synthese. Arachidonsäure wird über COX-Isoenzyme zu Prostaglandin G2 (PGG2) und

weiter zu Prostaglandin H2 umgesetzt. Durch die PGE-Synthase kann dann PGE2 synthetisiert werden. Die

dargestellte Produktion von PGE2 ist nur ein kleiner Teil der Arachidonsäurekaskade, welche viele weitere

Reaktionsschritte und Verbindungen umfasst (97).

Einleitung 18

Die Signale der unter anderem durch die COX-synthetisierten Prostaglandine werden

hauptsächlich über zwei verschiedene Wege weitergeleitet. So interagiert ein Teil der

Prostaglandine mit Zellrezeptoren, die der Gruppe der G-Protein gebundenen Rezeptoren

zuzuordnen sind (107). Diese sind wiederum an zytosolische Signalwege gekoppelt, welche in

diversen physiologischen Antworten (z.B. Relaxation/Kontraktion glatter Muskelzellen,

Plättchenaggregation, Gefäßpermeabilität) resultieren. Außerdem können G-Protein-

gekoppelte Signalwege andere Prozesse wie z.B. die Angiogenese induzieren (108).

Weitere Studien zeigten, dass der EP2-Subtyp des PGE-Rezeptors in den

GS/cAMP/Proteinkinase A-Signalweg involviert ist, welcher vermutlich zu einer erhöhten

‚vascular endothelial growth factor’ (VEGF)-Transkription beiträgt (109). Im Gegensatz dazu

können Prostanoide wie 15d-PGJ2 oder PGA2 mit PPARs interagieren und diese aktivieren

(100, 110).

In Makrophagen spielt PGE2 scheinbar auch eine wichtige Rolle bei der Desensitivierung

nach Phagozytose von AZ (9). In der Tat konnte in diesem Kontext gezeigt werden, dass

COX-Inhibitoren die anti-inflammatorische Antwort von Makrophagen reduzieren können

(35).

Der Syntheseweg von PGE2 ist in Abbildung 1.6 dargestellt.

Einleitung 19

1.7 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war es, die Aufnahme/Erkennung von AZ durch Makrophagen bzw. deren

dadurch ausgelöste anti-inflammatorische Antwort näher zu untersuchen. Dabei sollten nach

Möglichkeit tiefere Kenntnisse über die zugrunde liegenden Mechanismen und Signalwege

erlangt werden. Folgende Schwerpunkte sollten dabei experimentell bearbeitet werden:

• Im Rahmen meiner Studien sollte zunächst ein geeignetes und repräsentatives

Testsystem zum Studium der Phagozytose apoptotischer Zellen gefunden und etabliert

werden.

• Anschließend sollte der Einfluss der Phagozytose apoptotischer Zellen auf die

Sauerstoffradikalproduktion in aktivierten Makrophagen untersucht und mögliche

Mechanismen, die zu einer Veränderung der Zellantwort führen, erforscht werden.

• Während meiner Arbeit wurde klar, dass die NO-Inhibition nicht wie vermutet TGFβ-

vermittelt abläuft, und so sollte als weiterer Aufgabenpunkt auch hier der zugrunde

liegende Mechanismus näher erforscht werden.

• Die Beobachtung einer sehr frühen COX-2-Expression und die mangelnde Existenz

entsprechender Beobachtungen in der Literatur führten schließlich dazu, dass ich mich

im letzten Teil meiner Arbeit mit dem hierfür verantwortlichen Mechanismus befasste.

Material und Methoden 20

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

Acrylamid-Bis-Fertiglösung (40%, 37,5:1) Roth GmbH, Karlsruhe

Adenosin-Triphosphat (ATP) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Agar-Agar Roth GmbH, Karlsruhe

Agarose peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen

Ammoniumchlorid (NH4CL) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Ampicillin Biomol GmbH, Hamburg

BH4 Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Bromphenolblau Fluka GmbH, Buchs

Calmodulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Chloroform Merk Eurolab GmbH, Darmstadt

Ciglitazon Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Diethylpyrocarbonat (DEPC) Roth GmbH, Karlsruhe

1,1´Dioctadecyl-3,3,3´,3´-Tetramethyl- Molecular Probes Inc., Oregon

Indocarbocyanin-Perchlorat (DiI)

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth GmbH, Karlsruhe

Dithiothreitol (DTT) Roth GmbH, Karlsruhe

D-Luziferin AppliChem GmbH, Darmstadt

Ethanol Roth GmbH, Karlsruhe


Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Ethylendiamintetraazetat (EDTA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Ethylenglykoltetraazetat (EGTA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

FAD Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

FMN Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Ficoll-Lösung / Lymphozyten Trennmedium PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Glyzerin Roth GmbH, Karlsruhe

Glyzin Serva GmbH, Heidelberg

Hefeextrakt Life Technologies, Paisley

Hepes Roth GmbH, Karlsruhe

Hydroethidin (HE) Molecular Probes Inc., Oregon

Isoamylalkohol Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

JetPEITM Polyplus-Transfection, Illkirch

Kaliumchlorid (KCl) Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Kanamyzin Biomol GmbH, Hamburg

LB-Broth (Lennox) Roth GmbH, Karlsruhe

L-Arginin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

[U-14C]-L-Arginin MP Biochemicals Inc., Eschwege

L-Glutamin PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Luminol Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Magermilchpulver Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Magnesiumcarbonat-Hydroxid Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Magnesiumsulfat-Heptahydrat Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Methanol (MeOH) Roth GmbH, Karlsruhe

NADPH Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen


Natriumazetat Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Natriumbutyrat Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Natriumborat Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Natriumchlorid (NaCl) Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck EuroLab GmbH, Darmstadt

Neomyzin (G 418) PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Nonidet P-40 ICN Biomedicals GmbH, Eschwege

Nω-Hydroxy-nor-L-Arginin Calbiochem GmbH ,Bad Soden

Orange G 6 x Gelladepuffer MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Penizillin / Streptomyzin Lösung PAA Laboratories GmbH, Cölbe

peqGold RNApureTM PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen

Phenol Roth GmbH, Karlsruhe

Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix UDG Invitrogen Corp., Carlsbad

Polybren Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Ponceau S Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Proteaseinhibitormix (PIM) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Staurosporin Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Tetraethylendiamin (TEMED) Roth GmbH, Karlsruhe

12-Tetra-Decanoyl-Phorbol-13-Azetat (TPA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

TGFβ1 R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt

Tris-HCl Roth GmbH, Karlsruhe

Triton-X-100 Roth GmbH, Karlsruhe

Trizin Roth GmbH, Karlsruhe

Trypton Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

Tween 20 Roth GmbH, Karlsruhe

Wasserstoffperoxid (H2O2) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen


β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

2.1.2 Puffer und Lösungen

p53-Lysepuffer:

Tris 50 mM

EDTA 5 mM

NaCl 150 mM

NP-40 150 mM

pH 8,0

Kurz vor Gebrauch zugeben:

PMSF [350 mM] 3,5 µl/ml

DTT [0,1 M] 10 µl/ml

PIM 1-fach

PBS:

NaCl 137 mM

KCl 2,7 mM

Na2HPO4 8,1 mM

KH2PO4 1,5 mM

pH 7,4

Leukozytenwaschpuffer:

EDTA 2 mM

in PBS

Luziferasesubstratlösung:

Trizin 20 mM

Magnesiumcarbonat-Hydroxid 1,07 mM

Magnesiumsulfat-Heptahydrat 2,67 mM

EDTA-K+ 100 µM

DTT 33,3 mM

ATP 530 µM

Coenzym A-Lithiumsalz 21,3 mg/l

D-Luziferin 470 mM


5-fach Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE):

Tris 445 mM

Natriumborat 445 mM

EDTA 10 mM

2-fach HBS:

Hepes 50 mM

KCl 10 mM

Dextrose x H2O 12 mM

NaCl 280 mM

Na2HPO4 1,5 mM

pH 7,1

10-fach SDS-Laufpuffer:

Tris-HCl 250 mM

Glyzin 1,9 M

SDS 7 mM

pH 8,3

10-fach Blotting-Puffer:

Tris-HCl 250 mM

Glyzin 1,9 M

pH 8,3

10-fach TBS:

Tris-HCl 500 mM

NaCl 1,5 M

pH 7,4

1-fach TTBS:

TBS 1 x

Tween 20 0,06% (v/v)


Ponceau S-Lösung:

Ponceau S 0,1% (w/v)

Essigsäure 5% (v/v)

4-fach SDS-Probenpuffer:

0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 1,25 ml

10% SDS 2 ml

Glyzerin 5 ml

Bromphenolblau 10 mg

ddH2O 1,25 ml

DTT 771 mg

ECL-Lösung:

0,1 M Tris 200 ml

Luminol 50 mg

Hydroxykumarinsäure:

DMSO 10 ml

para-Hydroxykumarinsäure 11 mg

TE (Trypsin/EDTA):

Trypsin 0,5 g/l

EDTA 0,2 g/l

5-fach Reporter-Lysepuffer:

Tris-H3PO4 125 mM

DTT 10 mM

Triton-X-100 5% (v/v)

Glyzerin 50% (v/v)

pH 7,8

Fraktionierungs-Lysepuffer:

HEPES 20 mM

EDTA 2 mM


EGTA 2 mM

pH 7,5


DTT 1 mM

PMSF 100 µM

Proteaseinhibitormix 1 x

Lysepuffer C:

Tris-HCl 25 mM

EDTA 1 mM

EGTA 1 mM

Citrullin-Reaktionspuffer (Endkonzentration):

FAD 5 µM

FMN 5 µM

BH4 3 µM

NADPH 1 mM

U[14C]-L-arginin 10 µM

kaltes L-ARGININ 100µM

Calmodulin 0,4 µM

Tris-HCl 25 mM

pH 7,4

EMSA-Lysepuffer:

Hepes 10 mM

MgCl2 2 mM

EDTA 100 µM

KCl 10 mM


DTT 1 mM

PMSF 500 µM

pH 7,9


Kernextraktionspuffer:

Hepes 50 mM

KCl 50 mM

NaCl 300 mM

EDTA 100 µM

Glycerin 10%


DTT 1 mM

PMSF 500 µM

pH 7,9

Puffer F:

Ficoll 20%

Hepes 100 mM

KCl 300 mM

DTT 10 mM

PMSF 500 µM

pH 7,9

Puffer D:

Hepes 20 mM

Glycerin 20%

KCl 100 mM

EDTA 500 µM

NP-40 0,25%

DTT 2 mM

PMSF 500 µM

pH 7,9

EMSA-Laufpuffer:

Laufpuffer (Glocerol-Tolerant) Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg


2.1.3 Medien und Reagenzien für die Zellkultur

Fötales Kälberserum (FCS) PAA Laboratoris GmbH, Cölbe

Humanes AB-positives Serum (off the Clot) PAA Laboratoris GmbH, Cölbe

L-Glutamin PAA Laboratoris GmbH, Cölbe

Lymphozytentrennmedium PAA Laboratoris GmbH, Cölbe

Phosphat-buffered Saline (Instamed 9,55 g/ml) Biochrom AG, Berlin

Penizillin/Streptomyzin PAA Laboratoris GmbH, Cölbe

RPMI 1640, ohne L-Glutamin PAA Laboratoris GmbH, Cölbe

DMEM PAA Laboratoris GmbH, Cölbe

2.1.4 Oligonukleotide

Alle Oligonukleotide wurden von Eurogentec SA, Seraing (Belgien) bezogen.

2.1.4.1 Primer für die PCR

Maus-β2-Mikroglobulin (βMG) (298 bp), TA = 52°C

5´-ACT GAC CGG CCT GTA TGC-3´

5´-AGA CGG TCT TGG GCT CG-3´

Maus-COX-2 (427 bp), TA = 52°C

5´-ATGCTCTTCCGAGCTGTGCTGC-3´

5´-CCCATGGGAGTTGGGCAGTCA-´3

Maus-Arginase I (201 bp), TA = 60°C (111)

5´-AAG AAA AGG CCG ATT CAC CT-3´

5´-CAC CTC CTC TGC TGT CTT CC-3´

Maus-Arginase II (298 bp), TA = 60°C (111)

5´-ACA GGG TTG CTG TCA GCT CT-3´

5´-TGA TCC AGA CAG CCA TTT CA-3´


2.1.4.2 DIG-markierte Oligonukleotide für EMSA-Analysen

PPRE (fett gedruckt: Konsensussequenz) (112) 5´-GGT AAA GGT CAA AGG TCA ATC GGC-3´

3´-CCA TTT CCA GTT TCC AGT TAG CCG-5´.

2.1.5 Antikörper

anti-mPKCα (mous-IgG) BD Biosciences GmbH, Heidelberg

anit-mArginase I (rabbit-IgG) Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz

anti-mArginase II (rabbit-IgG) Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz

anti-Aktin (rabbit-IgG) Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Deisenhofen

anti-mCOX-2 (rabbit IgG) Cell Signaling Technology Inc., Beverly

anti-Maus (sheep IgG) Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg

anti-Rabbit (donkey IgG) Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg

2.1.6 Kits

Annexin V-FITC/Propidiumjodid Apoptose Kit Coulter-Immunotech GmbH, Hamburg

DIG Gel Shift Kit Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Griess Reagent System Promega GmbH, Heidelberg

HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen GmbH, Hilden

QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen GmbH, Hilden

Standard DC Protein Assay Kit Bio-Rad Laboratories GmbH, München


pLXIN-PPARg-AF27585 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

NgoMIV

5´MoMuSV LTR

Y+

MCS'

AF2

'MCS

IRESNeoR

3´MoMuLV LTR

AmpR

2.1.7 Vektoren

2.1.7.1 Vektoren für den Retroviralen Gentransfer

2.1.7.1.1 pLXIN-PPARγ1-AF2

Dieser Vektor für den retroviralen Gentransfer entspricht dem pLXIN-Vektor von Clontech,

in den die d/n PPARγ AF2-Mutante aus pcDNA3 PPARγ1 AF2mut kloniert wurde.

2.1.7.1.2 pHIT 60

Es handelt sich hierbei um einen retroviralen Vektor. pHIT 60 beinhaltet die retroviralen

Gene gag und pol des murine leukemia viruses (MLV), welche unter der Kontrolle eines

CMV-Promotors stehen (113).

pHIT 605000 bps

1000

20003000

4000

5000

CMV Promotor

MLV gag

pol

gpt

SV40 ori

ampR


2.1.7.1.3 pcz-VSV-G

Der Vektor kodiert für das G-Glykoprotein des Vesicular Stomatitis Virus (VSV), welches als

Oberflächenprotein Phospholipide der Wirtszellen erkennt und damit eine sehr große Breite

an Wirten abdeckt. Prinzipiell kann davon ausgegangen werden, dass durch VSV-G alle

Säugerzellen erkannt und damit auch infiziert werden (114).

2.1.7.2 Sonstige Vektoren

2.1.7.2.1 pGL2B-mpCD36

Es handelt sich um ein Reporterplasmid, das ausgehend von dem Vektor pGL2-Basic von

Promega kloniert wurde. Es beinhaltet den murinen Promotor von CD36, welcher

nachweislich über ein PPRE verfügt (115).

pGL2B-mCD366211 bps

1000

2000

3000

4000

5000

6000

SacI

HindIIImpCD36

Luciferase

AmpR

pczVSV-G6691 bps

1000

2000

30004000

5000

6000

CMV

VSV-G

AmpR


2.1.7.2.2 pZeo/Luc+shortARE

Dieses 6.832 bp große Plasmid ist ein auf pZEO (Invitrogen Corporation, Carlsbad)

basierender Luziferase-Expressionsvektor, bei dem die ARE des COX-2-Gens an das

Luziferasegen gekoppelt sind. Das Konstrukt wurde freundlicherweise von Dan Dixon

(University of Utah) zur Verfügung gestellt.

2.1.7.2.3 pZeo/Luc+3´UTR

Dieses 8.075 bp große Plasmid ist ein auf pZEO (Invitrogen Corporation, Carlsbad)

basierender Luziferase Expressionsvektor, bei dem die 3´-UTR des COX-2-Gens an das

Luziferasegen gekoppelt ist. Das Konstrukt wurde freundlicherweise von Dan Dixon

(University of Utah) zur Verfügung gestellt.

2.1.7.2.4 pcDNA3 PPARγ1 wt

Expressionsplasmid für den PPARγ wt, basierend auf dem pcDNA3-Plasmid der Invitrogen

Corporation, Carlsbad. Der Vektor wurde freundlicherweise von Krishna Chatterjee

(University of Camebridge) zur Verfügung gestellt.

2.1.7.2.5 pcDNA3 PPARγ1 AF2mut

Expressionsplasmid für die d/n PPARγ AF2-Mutante, die eine Mutation in der LBD besitzt.

Das Plasmid basiert auf dem pcDNA3-Plasmid der Invitrogen Corporation, Carlsbad, und

wurde freundlicherweise von Krishna Chatterjee (University of Camebridge) zur Verfügung

gestellt.


2.1.8 Zelllinien und Bakterienstämme

XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene GmbH, Amsterdam

Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZ.M15 Tn10

(Tetr)].

Jurkat-Zellen DSMZ: ACC 282

Jurkat-Zellen entstammen einem 14-jährigen Jungen, der an akuter lymphoblastärer Leukämie

(ALL) litt. Es ist eine T-Zelllinie, die 1977 isoliert wurde (116).

RAW264.7 ATCC: TIB-71

Die Mausmakrophagenzelllinie wurde durch einen Abelson-Maus-Leukemia-Virus etabliert

(117).

Primäre humane Monozyten Blutspendezentrale Saarbrücken

Primäre Monozyten wurden aus Buffy Coats, die von der Blutspendezentrale Saarbrücken zur

Verfügung gestellt wurden, isoliert.

293T ATCC: CRL-1573

Derivat der humanen embryonalen Nierenkarzinomzellen 293, sie tragen zusätzlich das SV40

T-Antigen. (118)

2.1.9 Geräte und sonstige Materialien

Autoklav HV 85 BPW GmbH, Süssen

Bakterieninkubator B5042 Heraeus GmbH, Hanau

Bakterienkultur Sterilbank UVUB 1200 Uniequip GmbH, Martinsried

BD VacutainerTM

BD Biosciences GmbH, Heidelberg

FACSCalibur Durchflusszytometer BD Biosciences GmbH, Heidelberg

Filmentwicklermaschine Optimax Typ TR MS Laborgeräte Schroeder OHG,

Wiesbaden

Holten LaminAir Sterilbank Jouan GmbH, Unterhaching


Hybond-C extra Nitrozellulose Membran Amersham Biosciences GmbH, Freiburg

i-CyclerTMMyiQTM Real-Time PCR System Bio-Rad Laboratories GmbH, München

IG 150 (Zellkulturinkubator) Jouan GmbH, Unterhaching

Magnetrührer Combimag RCH IKA Labortechnik GmbH & Co. KG,

Staufen

Mastercycler Thermocycler Eppendorf GmbH, Hamburg

Mini-PROTEAN 3 System (SDS-PAGE) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Multiscan RC Luminometer Thermo Labsystems, Vantaa

Pipetten (2 µl, 10µl, 100 µl, 1.000 µl) Eppendorf GmbH, Köln

Plastikmaterial (Zellkultur) Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Reinstwasseranlage Purelab Plus ELGA LabWater GmbH, Siershahn

Schüttelinkubator LabLine Orbit Shaker Uniequip GmbH, Martinsried

Sub-Cell® GT Elektrophorese System Bio-Rad Laboratories GmbH, München SUPERRX X-Ray Film Fuji Photo Film Europe GmbH,

Düsseldorf

Thermomixer 5436 Eppendorf GmbH, Hamburg

Trans-Blot SD Blot-Apparatur Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Ultraschallhomogenisator Ultra-Sonifier MSE, Loughborough

UV/Visible-Spektrometer Ultrospec 2100 pro Amersham Biosciences GmbH, Freiburg

UV-Transilluminator Geldokumentationssystem Raytest GmbH, Straubenhardt

Whatman Papier Schleicher & Schuell GmbH, Dassel

Zentrifuge 5415 R Eppendorf GmbH, Hamburg

Zentrifuge CR 3.22 Jouan GmbH, Unterhaching

Zentrifuge MR 23i Jouan GmbH, Unterhaching

Zentrifuge ZK380 Hermle GmbH, Wehingen

2.1.10 Software

Aida Image Analyzer, Version 3.11 Raytest GmbH, Straubenhardt

BD Cell Quest Pro BD Biosciences GmbH, Heidelberg

MyiQ Bio-Rad Laboratories GmbH, München

GenrelX Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Ascent, Version 2.4.2 Thermo Electron Corp., Greenbush


2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur

Die humane T-Zelllinie Jurkat und die Mausmakrophagenzelllinie RAW264.7 wurden in

RPMI 1640 Medium (293T-Zellen in DMEM high glucose), supplementiert mit 10% FCS

(hitzeinaktiviert für 30 min bei 56°C), 5 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penizillin und 100 µg/ml

Streptomyzin, kultiviert. Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO2-Gehalt und 95%

Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Passage der Zellkulturen erfolgte alle 3 bis 4 Tage nach

Zentrifugation (5 min bei 500 x g und RT) in einer 1:10 bis 1:20 Verdünnung.

Primäre humane Makrophagen wurden in RPMI 1640-Medium, supplementiert mit 10% AB-

positivem humanem Serum (hitzeinaktiviert für 30 min bei 56°C), 5 mM L-Glutamin,

100 U/ml Penizillin und 100 µg/ml Streptomyzin, kultiviert.

Alle Zellkulturarbeiten erfolgten unter sterilen Bedingungen. Die verwendeten Lösungen und

Medien wurden, sofern nicht anders erwähnt, auf 37°C vortemperiert.

2.2.2 Isolation primärer humaner Makrophagen

Zur Gewinnung von primären humanen Makrophagen wurde, mit geringfügigen Änderungen,

nach einem etablierten Protokoll verfahren (119). Humane Monozyten wurden aus Buffy

Coats isoliert, welche in 50 ml Falcon-Röhrchen überführt wurden, in die zuvor 15 ml Ficoll-

Lösung vorgelegt wurde. Bei der anschließenden Dichtezentrifugation (10 min, 1.000 x g,

Raumtemperatur) wurden die Bestandteile des Blutes in 3 Phasen aufgetrennt. Die untere

Phase bestand dabei aus der Ficoll-Lösung und den darin enthaltenen Erythrozyten und

Granulozyten, die mittlere Phase enthielt die Leukozyten und die obere Phase das Blutplasma.

Die Aufreinigung primärer Monozyten aus den Gesamtleukozyten erfolgte durch Aussäen

derselben in 10 cm Primaria Kulturgefäßen (BD Biosciences GmbH, Heidelberg) im

entsprechenden Medium (siehe 2.2.1). Nach 2 h wurden alle Zellen bis auf die inzwischen

adhärierenden Monozyten durch zweimaliges Waschen mit PBS entfernt. Zur

Ausdifferenzierung der Monozyten zu Makrophagen wurden die Zellen 6 bis 7 Tage bei 2- bis

3-tägigem Mediumwechsel weiterkultiviert. Diese zeigten nach dieser Zeit einen


Makrophagen-typischen Phänotyp (120) und wurden für die entsprechenden Experimente

eingesetzt.

Die Versuche mit primären Zellen wurden in einem Labor der Sicherheitsstufe S2

durchgeführt, da das Blut zuvor nicht auf Krankheitserreger untersucht worden war.

2.2.3 Herstellung apoptotischer und nekrotischer Zellen

Zum Generieren von AZ wurde die entsprechende Menge an Jurkat-Zellen in 10 cm

Zellkulturschalen in RPMI 1640 ohne FCS, supplementiert mit 100 U/ml Penizillin und

100 µg/ml Streptomyzin ausgesät. Es folgte eine Inkubation für 3 h mit 0,5 µg/ml

Staurosporin und zweimaliges Waschen mit Medium (Zentrifugation für 10 min bei 500 x g).

Die Zellen wurden dann in dem Medium der zu stimulierenden Zielzellen resuspendiert.

NZ wurden durch Erhitzen der entsprechenden Menge Jurkat-Zellen für 25 min bei 55°C

hergestellt (121).

In allen Versuchen betrug das Verhältnis von Makrophagen zu AZ 1:5. Bei allen

Experimenten, außer den Griess-Assays, wurden die AZ nach der Inkubationszeit mittels

zweimaligen Waschens mit PBS entfernt. Der Zelltod wurde mit Hilfe von Annexin V/PI-

Färbung im Durchflusszytometer kontrolliert und charakterisiert (siehe 2.2.4).

AZ-konditioniertes Medium (KM) wurde hergestellt, indem die entsprechende Menge AZ

(Makrophagen:AZ 1:5) in Medium gemäß des im Versuch verwendeten Volumens inkubiert

wurden. Nach 2 h wurden die Zellen für 10 min bei 500 x g zentrifugiert. Der Überstand

wurde abgenommen und durch einen 0,45 µm Zellulose-Spritzenfilter (Roth GmbH,

Karlsruhe) filtriert. Das Filtrat wurde als KM verwendet.

2.2.4 Durchflusszytometrische Bestimmung des Zelltods (Annexin V/PI-Färbung)

Während des Zelltods findet eine Translokation des PtdSer von der inneren in die äußere

Plasmamembran statt. Dies gilt sowohl für die Nekrose, als auch für die Apoptose (122, 123).

Annexin V bindet an PtdSer und kann daher zum Nachweis von dessen Translokation

verwendet werden.


Während bei apoptotischem Zelltod die Zellmembran noch intakt ist, verliert diese jedoch im

Falle des nekrotischen Zelltods ihre Integrität und wird durchlässig für Farbstoffe wie

Propidiumjodid (PI). PI ist ein mit der DNA interkalierendes Fluorochrom

(Ex 550 nm / Em 617 nm). Zur Messung der Apoptose/Nekrose wurde das Annexin V-

Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)/Propidiumjodid Apoptose Kit (Coulter-Immunotech GmbH,

Hamburg) eingesetzt. Das Absorptionsmaximum von FITC liegt bei 492 nm und das

Emissionsmaximum bei 520 nm.

Nach Zentrifugation (500 x g, 5 min, 4°C) wurde die Zellzahl der zu messenden Zellen auf

1x106 Zellen/ml Bindepuffer (1x) eingestellt. Zu je 100 µl der Zellsuspension wurden 5 µl

Annexin V-FITC Lösung (25 µg/ml) sowie 2,5 µl PI-Lösung (250 ng/µl) zupipettiert. Der

Reaktionsansatz wurde lichtgeschützt für 10 min bei 4°C auf Eis inkubiert. Dann wurde den

angefärbten Zellen weitere 200 µl eiskalter Bindepuffer (1x) hinzugefügt und der Ansatz bis

zur durchflusszytometrischen Messung lichtgeschützt auf Eis aufbewahrt. Messung und

Auswertung erfolgten am FACSCalibur mit Hilfe der BD Cell Quest Pro-Software. Mittels

Zweiparametermessung konnten parallel Annexin V-FITC (Fluoreszenz 1) und PI

(Fluoreszenz 2, Ex 488 nm / Em 585 nm) analysiert werden.

2.2.5 Phagozytose-Assay und Fluoreszenzmikroskopie

Zur mikroskopischen Untersuchung der Phagozytose wurden AZ, NZ oder vitale Zellen (VZ)

für 30 min mit einer Endkonzentration von 2,5 µg/ml 1,1´Dioctadecyl-3,3,3´,3´-Tetramethyl-

Indocarbocyanin-Perchlorat (DiI) gefärbt und nach zweimaligem Waschen, im Verhältnis von

5:1, zu den RAW264.7-Makrophagen zupipettiert, die auf Diagnostika-Objektträgern in einer

Konzentration von 1x104 Zellen/well ausgesät waren. RAW264.7-Makrophagen zupipettiert.

Die Coinkubation erfolgte, wenn nicht anders angegeben, für 2 h. Anschließend erfolgte die

fluoreszenzmikroskopische Untersuchung.


2.2.6 Messung von Sauerstoffradikalen im Durchflusszytometer (HE Assay)

RAW264.7-Makrophagen wurden in 3 cm Gewebekulturschalen in einer Dichte von 1x105

Zellen/Platte 24 h vor Versuchsbeginn ausgesät. Nach der entsprechenden Stimulation mit

AZ, NZ oder 5 ng/ml TGFβ wurde das Medium mit den AZ bzw. NZ durch zweimaliges

Waschen mit PBS entfernt und die Makrophagen in 1 ml PBS aufgenommen. Dann folgte

eine Stimulation mit 1 µM TPA für 30 min und eine Färbung mit 2 µM HE für weitere 30

min. Die durchflusszytometrische Analyse wurde mit Hilfe eines FACSCalibur

Durchflusszytometers (BD Biosciences, Heidelberg) unter Verwendung der Cell Quest Pro-

Software durchgeführt. HE wurde bei 630 nm Emission (Fluoreszenz 3) gemessen. Analysiert

wurde die Population der RAW264.7-Makrophagen durch spezifisches Setzen der Messregion

aufgrund deren ‚forward scatter/side scatter’ (FSC/SSC) Charakteristika. Um eine statistische

Signifikanz zu erreichen, wurden jeweils 1x104 Zellen gemessen. Die statistische Auswertung

erfolgte mit Hilfe des jeweiligen ‚peak’-Medians. Die Verschiebung des Medians bei

unstimulierten Zellen zu TPA-stimulierten wurde als 100%-Aktivierung definiert.

Der Median (M) einer Probe (x1, x2,…, xn) von n Werten berechnet sich bei gerader Anzahl

von Messwerten als:

)(21

122 xx nnM+

+=

Im Gegensatz zum arithmetischen Mittelwert, auch Durchschnitt genannt, verhält sich der

Median stabil gegenüber einzelnen stark abweichenden Werten und bietet im Vergleich zum

Durchschnitt einen aussagefähigeren Wert.

2.2.7 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA

Nach jeder erneuten Amplifikation von Plasmiden wurde ein Kontrollverdau durchgeführt.

Bei der Durchführung von Restriktionsverdauen wurden die jeweiligen Restriktions-

endonukleasen und die zugehörigen Puffer nach Angaben der Hersteller verwendet. Soweit

nicht anders beschrieben, erfolgten die Restriktionen für 2 h bei 37°C, anschließend wurden

die Endonukleasen 20 min bei 65°C inaktiviert. Beim Verdau eines Plasmids mit mehreren


Enzymen, wurden diese gleichzeitig in einem Ansatz inkubiert, und der entsprechende vom

Hersteller empfohlene Puffer verwendet.

2.2.8 Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.B. nach Kontrollverdau) wurde wie folgt

durchgeführt. Das Agarosegel wurde hergestellt, indem Agarose (1%) in 0,5-fachem TBE

aufgekocht wurde. Die Schmelze wurde in eine Form gegossen, in der sich Kämme zur

Probenbeladung befanden. Die Polymerisation des Gels erfolgte während der Abkühlung bei

Raumtemperatur. Die aufzutrennenden DNA-Proben wurden mit 6-fachem Gelladepuffer

gemischt und in jeweils eine Geltasche pipettiert. Zusätzlich wurde in eine separate Geltasche

5 µl eines Größenmarkers pipettiert (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder, GeneRulerTM 1.000

bp DNA Ladder oder GeneRulerTM DNA Ladder Mix, Fa. MBI Fermentas GmbH, St. Leon-

Rot). Die Auftrennung erfolgte 1 bis 2 h bei 5 bis 8 V/cm in 0,5-fachem TBE. Anschließend

wurde das Gel ca. 15 min in einer Ethidiumbromidlösung (1 µg/ml) gefärbt und die DNA-

Fragmente mit einem Geldokumentationssystem (UV-Transilluminator, Raytest GmbH,

Straubenhardt) unter UV-Licht mit 254 nm Wellenlänge detektiert.

2.2.9 Hitzeschocktransformation von Bakterien

Ein 50 µl Aliquot superkompetenter E. coli-Bakterien (XL1-blue, Stratagene) wurde auf Eis

aufgetaut und 0,85 µl 1,42 M β-Mercaptoethanol-Lösung zugegeben. Nach 10 min Inkubation

auf Eis mit gelegentlichem Schütteln wurden 0,5 bis 1 µg des entsprechenden Plasmids

zupipettiert und vorsichtig mit den Bakterien vermischt. Nach weiteren 30 min auf Eis

wurden die Bakterien für 45 s in einem auf 42°C vorgeheizten Wasserbad erhitzt und

anschließend sofort wieder auf Eis gestellt. Es folgte nach 2 min die Zugabe von 200 µl SOC-

Medium und ein Schütteln der Bakterien für 60 min bei 37°C und 300 U/min. Von der

Bakteriensuspension wurden anschließend 100 bis 250 µl auf einer LB-Agarplatte

ausgestrichen. Die Agarplatte enthielt ein Selektionsantibiotikum, gegen das eine Resistenz

auf dem zu amplifizierenden Vektor kodiert war. Dadurch konnten nur die Bakterien

wachsen, die erfolgreich mit dem Plasmid transformiert wurden. Nach Inkubation über Nacht


bei 37°C in einem Bakterieninkubator wurde die Platte mit den gewachsenen Kolonien bei

4°C gelagert.

2.2.10 Bakterienkultur

Vorbereitend für eine Plasmid-Mini-Präparation wurden 2 ml LB-Medium in einem sterilen

Bakterienkulturröhrchen mit je einer Bakterienkolonie einer bewachsenen LB-Agaroseplatte

angeimpft. Das LB-Medium enthielt zusätzlich ein Selektionsantibiotikum für das zu

amplifizierende Plasmid. Der Ansatz wurde über Nacht bei 37°C in einem Bakterieninkubator

bei 300 U/min geschüttelt.

Für den Ansatz einer Plasmid-Maxi-Präparation wurden 150 ml LB-Medium in einem sterilen

1 l Erlenmeyerkolben mit Bakterien einer vorherigen Plasmid-Mini-Präparation oder einer

Glyzerinkultur angeimpft. Das LB-Medium enthielt ebenfalls ein Selektionsantibiotikum und

die Kultivierung erfolgte wie zuvor beschrieben.

Zur längeren Lagerung von Bakterien wurde eine Glyzerinkultur angelegt, indem 500 µl einer

Bakterien-Übernachtkultur mit 500 µl Glyzerin vermischt und bei -80°C eingelagert wurde.

2.2.11 Plasmidpräparation

Zur Plasmidpräparation wurde je nach gewünschter Plasmidmenge eine Plasmid-Mini-

Präparation (bis 20 µg Plasmid: QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen GmbH, Hilden) oder

eine Plasmid-Maxi-Präparation (>20 µg Plasmid: HiSpeed Plasmid Maxi Kit, Qiagen GmbH,

Hilden) durchgeführt. Hierbei wurden die Bakterien einer Übernachtkultur nach

Herstellerangaben aufgeschlossen und das Plasmid aufgereinigt.

2.2.12 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren wurde mit Hilfe des

UV/Visible-Spektrometers Ultrospec 2100 pro (Amersham Biosciences GmbH, Freiburg)


durchgeführt. Dazu wurde die Absorption bei den Wellenlängen 230, 260 und 280 nm in

Quarzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm gemessen. Die Absorption bei 230 nm ist

dabei zum Proteingehalt, bei 260 nm zum DNA-Gehalt und bei 280 nm zum RNA-Gehalt

proportional. Der Quotient OD260/OD280 ist ein Maß für die Reinheit der gemessenen

Nukleinsäure-Lösung.

2.2.13 Retroviraler Gentransfer

Um Gene stabil im Genom einer Zelllinie zu integrieren, wurde die Methode des retroviralen

Gentransfers genutzt und prinzipiell wie zuvor beschrieben durchgeführt (124, 125). Hierzu

wurden am ersten Tag 1·106 293T-Zellen in einer 6 cm Kulturschale mit 4 ml DMEM-High-

Glukose ausgesät, die am zweiten Tag durch Calcium-Phosphat-Präzipitation transient mit je

5 µg der Plasmide pHIT60, pczVSV-G und pLXIN-PPARγ1-AF2 transfiziert wurden. Nach 7

bis 10 h Kultivierung wurde das Medium gewechselt und die Zellen über Nacht

weiterkultiviert.

Damit die im Genom des Wirts integrierten Virusgene transkribiert werden können, müssen

die das Gen flankierenden ‚long terminal repeats’ (LTR) azetyliert werden. Dies wird durch

die Histon-Deazetylase verhindert. Um diese zu hemmen, wurde am 3. Tag zu den

293T-Zellen 80 µl Na-Butyrat (500 mM) (Sigma B-5887) gegeben (Endkonzentration

10 mM), das Medium nach 8 bis 12 h abgenommen und gegen 3 ml frisches Medium

ausgetauscht. Am gleichen Tag wurden 4·104 Zellen der gewünschten Zielzelllinie in ein

Loch einer 12 Loch-Kulturplatte mit 1 ml des jeweiligen Mediums ausgesät.

Die Infektion der Zielzellen mit den Retroviren erfolgte am 4. Tag. Der 3 ml Retroviren-

Überstand der 293T-Zellen wurde mit einer Spritze abgesaugt und durch einen 0,45 µm-Filter

in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen mit 8µg/ml Polybren gegeben. Polybren ist ein positiv

geladenes Polymer, dessen kleine Moleküle an die Oberfläche von Zellen binden und deren

Oberflächenspannung neutralisieren. Virale Glykoproteine können daraufhin effektiver an

ihre Rezeptoren bzw. wie beim hier verwendeten VSV-G Glycoprotein an Phospholipide

binden. Der filtrierte Virusüberstand wurde anschließend zu den 1 ml Zielzellen gegeben und

für 4 bis 8 h inkubiert.


Die Herstellung der hier benutzten PKCα überexprimirenden RAW 264.7 Makrophagen

wurde bereits zuvor beschrieben (50).

2.2.14 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen

Die transiente Transfektion wurde mit Hilfe des jetPEITM-Transfektionsreagenz der Fa.

Polyplus-Transfection durchgeführt. Dabei schließt ein lineares Polyethylenimin (PEI) die zu

transfizierende DNA in positiv geladene Partikel ein, die mit den negativ geladenen

Proteoglykanen der Zelloberfläche interagieren und durch Endozytose von der Zelle

aufgenommen werden. Durch das positiv geladene jetPEI wird der endosomale pH-Wert

gepuffert und die Degradation der DNA verhindert.

Die Transfektion wurde in 24-Loch-Zellkulturplatten nach Angaben des Herstellers

durchgeführt. Die Stimulation der Zellen erfolgte 24 h nach deren Transfektion.

2.2.15 Luziferase-Assay

Das Luziferase-Assay ist ein Reportergen-Assay, bei dem Zellen mit einem Reporterplasmid

transient transfiziert werden (siehe 2.2.14). Versuchsspezifisch wird das auf dem

Reporterplasmid befindliche Enzym Luziferase exprimiert, welches die ATP-abhängige

oxidative Decarboxylierung von Luziferin katalysiert. Dabei wird Licht der Wellenlänge

562 nm freigesetzt, das im Luminometer nachgewiesen werden kann. Die Versuche wurden in

24-Loch-Zellkulturplatten durchgeführt.

Die versuchsspezifische Stimulation der Zellen erfolgte, sofern nicht anders angegeben, 24 h

nach Transfektion mit dem Reporterplasmid. 6 bis 7 h nach Stimulation wurden die Zellen

lysiert, indem die Zellen in 100 µl Reporter-Lysepuffer aufgenommen und über Nacht bei

-80°C schockgefroren wurden. Anschließend wurden sie bei Raumtemperatur aufgetaut und

15 min geschüttelt (750 U/min). Durch einen Zentrifugationsschritt von 2 min bei

13.000 U/min und Raumtemperatur wurden die lysierten Zellfragmente pelletiert, die

gebildete Luziferase blieb im Überstand.


Zur Messung der Chemilumineszenz wurden je Ansatz 50 µl des Überstandes in 5 ml

Kunststoffröhrchen (Sarstedt AG & Co, Nümbrecht) überführt, 100 µl Luziferase-

Substratlösung zugegeben und nach 20 s Inkubation im Luminometer gemessen.

2.2.16 Quantifizierung des mRNA-Gehalts in RAW264.7-Makrophagen

2.2.16.1 mRNA-Isolation

Für die mRNA-Isolation wurden 5x106 Makrophagen in 1 ml peqGold RNAPureTM lysiert.

Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 µl Chloroform zupipettiert, 10 s

kräftig geschüttelt und anschließend weitere 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurde das Gemisch durch Zentrifugation (5 min, 12.000 x g, 4°C) in eine obere

wässrige Phase und eine untere Phenol-Chloroform-Phase getrennt. Die untere Phase, in der

sich Proteine, DNA etc. befanden, wurde verworfen und die obere Phase, in der sich die RNA

befand, in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 500 µl Isopropanol

wurde bei einer 30 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die RNA präzipitiert und

anschließend pelletiert (5 min, 12.000 x g, 4°C). Das Isopropanol wurde verworfen und das

RNA-Pellet wurde zweimal mit 75% EtOH gewaschen (Schütteln, Zentrifugation 5 min,

12.000 x g, 4°C). Das Pellet wurde anschließend kurz bei Raumtemperatur getrocknet und

dann bei 65°C in mit DEPC behandeltem ddH2O resuspendiert.

Die Konzentration der gelösten RNA wurde wie beschrieben mittels Spektrometrie ermittelt.

Für eine längere Aufbewahrung der RNA-Lösung wurde diese bei -80°C gelagert.

2.2.16.2 Reverse Transkription

Zur Herstellung von cDNA aus mRNA wurde das Advantage® RT-for-PCR Kit der Fa. BD

Biosciences GmbH verwendet. Die Reaktion erfolgte nach Angaben des Herstellers, wobei

1 µg RNA für die Reaktion eingesetzt wurde. Die Lagerung der cDNA erfolgte bei -20°C.


2.2.16.3 Quantitative PCR

Für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurde der i-CyclerTM der Fa.

BioRad GmbH mit dem Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix UDG der Fa. Invitrogen

Corp., Carlsbad verwendet. Der enthaltene Fluoreszenzfarbstoff SYBR® Green der Fa.

Molecular-Probes diente hierbei zur Quantifizierung des amplifizierten PCR-Produkts. Mit

Hilfe der qPCR wurde untersucht, ob RAW264.7-Makrophagen nach verschiedenen Stimuli

Arginase I, Arginase II oder COX-2 auf mRNA-Ebene exprimieren. Hierzu wurde die cDNA

von entsprechend stimulierten Zellen in der qPCR mit den entsprechenden Primern (siehe

2.1.4.1) eingesetzt. Die PCR wurde mit einem Gesamtvolumen von 20 µl folgendermaßen

angesetzt:

Template (cDNA) 4 µl

Primer 1 [10 µM] 0,4 µl

Primer 2 [10 µM] 0,4 µl

Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix 10 µl

ddH2O 5,2 µl

Die Abfolge der Reaktionsschritte wurde nach Angaben des Herstellers folgendermaßen

gewählt:

Aktivierung der Polymerase 2 min 50°C

Denaturierung 15 min 95°C

Denaturierung 15 s 95°C

Primer-Anlagerung 30 s TA°C 50 x

Elongation 30 s 72°C

Finale Denaturierung 1 min 95°C

βMG, COX-2: TA = 52°C; ArgI, ArgII: TA = 60°C

Jeweils nach der Elongation wurde die Fluoreszenz gemessen und für die Auswertung

herangezogen. Sie ist ein Maß für die Anzahl der gebildeten PCR-Fragmente. Nach der

finalen Denaturierung wurde die Temperatur der Proben auf 55°C abgekühlt und schrittweise

alle 20 s um 0,5°C bis auf 95°C erhitzt. Nach jedem Temperaturanstieg wurde die


Fluoreszenz gemessen. Auf diese Weise konnte die Anzahl der in der Reaktion entstandenen

Produkte und deren Schmelzpunkte ermittelt werden. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der

von der BioRad GmbH mitgelieferten Software MyiQ.

2.2.17 Griess-Assay

In Zellkulturüberständen von RAW264.7-Makrophagen kann Nitrit als stabiles Abbauprodukt

des NO-Metabolismus mittels Griess-Assay nachgewiesen werden. Dazu wurden je 1x105

Zellen in 3 cm Kulturschalen ausgesät. Nach der jeweiligen individuellen Stimulation wurde

das Medium gewechselt und es folgte eine weitere Inkubation für 24 h. Der Nitritgehalt in

Überstand wurde dann mittels Griess Reagent System (Promega GmbH, Heidelberg) nach den

Angaben des Herstellers bestimmt.

2.2.18 Western-Immunoblotting

2.2.18.1 Proteinisolation

Für die Proteinisolation wurden 2,5 bis 5x106 Zellen in ein 15 ml Falcon-Röhrchen

übertragen, pelletiert (5 min, 500 x g, 4°C) und in 200 µl p53-Lysepuffer resuspendiert. Der

Ansatz wurde bei -80°C eingefroren und auf Eis wieder aufgetaut. Nach 30 min Inkubation

auf Eis mit häufigem kräftigem Schütteln wurde das Zelllysat durch Ultraschall (10 s,

Intensität MED, Amplitude 4) weiter aufgeschlossen und anschließend 20 min auf Eis

inkubiert. Zum Beseitigen der Zelltrümmer wurde das Lysat zentrifugiert (30 min,

13.000 U/min, 4°C) und der Überstand in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Bis zur

weiteren Verwendung wurde die Proteinlösung bei -80°C gelagert.


2.2.18.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Lowry

Die Messung der Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des Standard DC Protein Assay Kit

(Fa. BioRad GmbH, München) durchgeführt. Als Standard zum Ermitteln der

Proteinkonzentration wurde BSA in Lysepuffer in verschiedenen Konzentrationen gelöst

(0,625 µg/µl, 1,25 µg/µl, 2,5 µg/µl, 5 µg/µl, 10 µg/µl), als Nullprobe wurde Lysepuffer ohne

Proteine verwendet. Von den Standards, der Nullprobe und dem zu messenden Zellextrakt

wurden je 2 µl in je 2 Kammern einer 96-Loch-Platte pipettiert. Für die Farbreaktion wurden

zusätzlich in jede Kammer 20 µl Reagenz A und 160 µl Reagenz B des Assay Kit pipettiert

und die Platte 15 min auf einem Schüttler inkubiert. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte

durch photometrische Messung der Proben im Multiscan RC Luminometer bei einer

Wellenlänge von 750 nm und der Ascent Software, Version 2.4.2.

2.2.18.3 SDS-PAGE und Proteintransfer auf die Membran

Zum Auftrennen von Proteinen nach ihrer Größe wurde die SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Von den aufzutrennenden Proteinen wurden

50 bis 80 µg mit 4-fachem SDS-Probenpuffer versehen und 5 min bei 95°C denaturiert. Das

Polyacrylamidgel bestand aus einem 4% Sammelgel und einem 10% Trenngel und wurde

nach folgendem Schema angesetzt:

4% Sammelgel:

40% Acrylamid/Bis-Acrylamid 37,5:1 0,3 ml


10% SDS 30 µl

ddH2O 1,92 ml

10% APS 50 µl

TEMED 5 µl


10% Trenngel:

40% Acrylamid/Bis-Acrylamid 37,5:1 2,5 ml


10% SDS 0,1 ml

ddH2O 4,9 ml

10% APS 50 µl

TEMED 5 µl

Für die Durchführung der Proteintrennung und für das Gießen der Gele wurde das Mini-

PROTEAN 3 System der Fa. BioRad GmbH, München, verwendet, sowie 1-facher SDS-

Laufpuffer. Nach dem Aufbau der Apparatur wurde die denaturierte Proteinprobe in eine

Tasche des Sammelgels pipettiert. Zur Bestimmung der Proteingröße wurde in eine separate

Tasche der Marker Prestained Protein Ladder der Fa. MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot,

aufgetragen. Die Passage der Proteine durch das Sammelgel bis zur Phasengrenze zum

Trenngel erfolgte bei einer Spannung von 70 V, die Auftrennung im Trenngel bei einer

Spannung von 120 V. Anschließend wurden die Proteine für die weitere Analyse auf eine

Hybond C extra Nitrozellulose Membran (Amersham Biosciences GmbH, Freiburg)

transferiert. Dazu wurde das Sammelgel vom Trenngel entfernt und das Trenngel zwischen

Whatman-Papier in einer Blot-Apparatur (Trans-Blot SD, BioRad GmbH, München)

positioniert. Die Whatman-Papiere wurden zuvor in 1-fachem Blotting-Puffer / 20% MeOH

getränkt. Der Transfer erfolgte 90 min bei 70 mA je Gel. Anschließend wurden die auf der

Membran gebundenen Proteine mit Ponceau S-Lösung gefärbt, um den Erfolg des Transfers

zu überprüfen.

2.2.18.4 Detektion

Zur Detektion der Proteine auf der Membran wurde ein immunochemisches Verfahren

verwendet. Zuerst wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Membran durch 60 min

Inkubation in Blockierungspuffer (TTBS/5% Milchpulver) abgesättigt. Die Bindung des

primären Antikörpers, der 1:1.000 in 3 ml Blockierungspuffer verdünnt wurde, erfolgte über

Nacht bei 4°C. Die Antikörper stammen aus Maus oder Kaninchen und binden an das nachzu-

weisende Protein. Anschließend wurde die Membran dreimal je 10 min in Waschpuffer

gewaschen (TTBS) und der sekundäre Antikörper (1:2.000 in Blockierungspuffer) 45 bis

60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der sekundäre Antikörper bindet an den primären und


ist an das Enzym Meerrettichperoxidase gekoppelt. Nach erneutem Waschen (dreimal 10 min

in TTBS) wurde die Membran 2 min in 2,5 ml ECL-Lösung inkubiert, die zusätzlich 25 µl

Hydroxykumarinsäure und 1,5 µl 30% H2O2 enthielt. Die Meerrettichperoxidase des

sekundären Antikörpers katalysiert eine Chemilumineszenzreaktion, wodurch die markierten

Bereiche der Membran Licht emittieren und durch Exposition auf einem Röntgenfilm sichtbar

gemacht wurden. Die Expositionszeit war abhängig von dem zu untersuchenden Protein und

den verwendeten Antikörpern.

2.2.18.5 Zellfraktionierung

Zur getrennten Analyse von zytosolischen und membrangebundenen Proteinen wurden

5x106 Zellen in 100 µl Fraktionierungs-Lysepuffer resuspendiert und fünfmal in flüssigem

Stickstoff eingefroren und bei 37°C aufgetaut. Die Trennung von Membran- und

Zytosolfraktion erfolgte durch Ultrazentrifugation (20 min, 100.000 x g, 4°C). Der Überstand

(zytosolische Fraktion) wurde abgenommen und bei -80°C gelagert. Das Pellet wurde mit

kaltem PBS gewaschen und zentrifugiert (10 min, 33.000 x g, 4°C) und in 100 µl

Fraktionierungs-Lysepuffer/0,5% SDS resuspendiert. Mittels Ultraschall (10 s, Intensität

LOW, Amplitude 4) wurden die Proteine von der Membran gelöst. Anschließend

wurden die Membranfragmente pelletiert (20 min, 33.000 x g, 4°C) und der Überstand

(Membranfraktion) bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

2.2.19 EMSA

Für die EMSA-Analyse wurde ein bekanntes Protokoll mit geringfügigen Modifikationen

verwendet (60).

2.2.19.1 Herstellung von Kernextrakten für den EMSA

Zur Präparation von Kernextrakten wurden 5 x 106 Zellen in 0,2 ml eiskaltem EMSA-

Lysepuffer resuspendiert, für 10 min unter gelegentlichem Schütteln auf Eis inkubiert und

anschließend zentrifugiert (30 s, 8000 x g, 4°C). Das Pellet wurde dann in 50 µl

Kernextraktionspuffer resuspendiert und 20 min auf Eis gelagert. Danach folgte eine


erneute Zentrifugation (5 min, 10.000 x g, 4°C). Im Überstand wurde dann die

Kernproteinkonzentration gemessen (siehe 2.2.18.2) und die Proteine gegebenenfalls bei

-80°C aufbewahrt.

2.2.19.2 Durchführung des EMSA

Die Einzelkomponenten für den EMSA wurden zusammenpipettiert und für 20 min bei RT

inkubiert. Die Separation der Protein/DNA-Komplexe erfolgte in einem 6% Polyacrylamidgel

mit EMSA-Laufpuffer für eine Stunde bei 80 V.

Ansatz für EMSA:

Kernprotein 20 µg

DIG-markiertes Oligonukleotid 0,5 ng

Poly[dl/dC] 1 µg/µl

Gelshift-Puffer D+ (10 x) 2 µl

Gelshift-Puffer F 4 µl

ddH2O 20 µl

2.2.19.3 EMSA Transfer und Detektion

Nach Beendigung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde das Gel im Semi-Dry-

Blotverfahren (1,3 mA/cm2, 90 min) auf eine Nylonmembran geblottet. Nachdem Whatmann-

Filter und Membran in TBE-Puffer (0,5 x) getränkt wurden, erfolgte der Aufbau des Blots in

folgender Reihenfolge: 3 Blatt Whatmann-Papier, Nylonmembran, Polyacrylamidgel, 2 Blatt

Whatmann-Papier. Im Anschluß an den Proteintransfer wurden die DNA-Proteinkomplexe

durch UV-crosslinken (4 J/cm2) auf die Membran fixiert. Diese wurde dann für die Detektion

mit CSPD (Roche), einem Chemilumineszenz-Substrat, nach folgendem Schema vorbereitet:


Detektionsschema:

Waschpuffer 5 min

Blockierungslösung 1 h

Antikörperlösung 1 h

Waschpuffer 15 min (3 x)

Detektionspuffer 5 min

CSPD® Arbeitslösung 5 min

Alle Lösungen wurden gemäß dem DIG Gel Shift Kit-Standardprotokoll (Roche) angesetzt

und verwendet.

2.2.20 Citrullin-Assay

Die Arginase- und iNOS-Aktivität wurde anhand eines Citrullin-Assays in Anlehnung an eine

etablierte Methode quantifiziert (126). Nach den entsprechenden Stimulationen wurden die

Zellen mit eiskaltem PBS geerntet, zentrifugiert, in 100 µl Lysepuffer C aufgenommen und

durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen in flüssigem Stickstoff, lysiert. Dann wurden die

Lysate 20 min auf Eis gelagert und abermals zentrifugiert (15.000 x g) und die

Proteinkonentration im Überstand wie in 2.2.18.2 beschrieben ermittelt. Dann wurden 50 µg

Protein zum Citrullin-Reaktionspuffer zugegeben (Gesamtvolumen 200 µl) und 1 h bei 37°C

inkubiert. Nor-NOHA wurde in einer Endkonzentration von 1 mM verwendet. Die Reaktion

wurde dann durch Zugabe von 200 µl eiskaltem Methanol abgebrochen und die Proben in

einem SpeedVac Vakuumtrockner eingeengt. Nach dem Trocknen wurden die Proben in 10 µl

ddH2O aufgenomen und auf einem Dünnschichtchromatogramm (DC) (Laufmittel:

Methanol:NH4OH:H2O; 0.5:4.4:2:1) aufgetrennt. Die DCs wurden anschließend mittels

Autoradiografie analysiert.

Ergebnisse 51

3 Ergebnisse

3.1 Etablierung des Modellsystems zum Studium des Einflusses von AZ auf

Makrophagen

3.1.1 Überprüfung der Zellvitalität

In einem ersten Experiment verifizierte ich die Methode zur Herstellung von AZ und NZ

mittels Annexin V/PI Assay. Als Zellsystem wählte ich humane Jurkat-T-Zellen, da bei

diesen leicht Apoptose induziert werden kann und Apoptosemechanismen hinreichend

beschrieben sind.

Abbildung 3.1: Verifizierung des Zelltods in Jurkat-Zellen. VZ (a), AZ (b) oder NZ (c) wurden mit Annexin

V/FITC und PI gefärbt, um die relative Menge der AZ bzw. NZ mittels FACS-Analyse zu bestimmen. Annexin

V/PI Färbung erfolgte nach 1 h Inkubation in Vollmedium. Die Daten sind repräsentativ für drei verschiedene

Experimente.

Die AZ und NZ wurden wie in 2.2.3 beschrieben hergestellt und vor der Annexin V/PI

Färbung 1 h in Vollmedium inkubiert. Während die VZ basal (Abbildung 3.1a) nur 7%

Ergebnisse 52

Apoptose und 5% Nekrose zeigten, wiesen die AZ (Abbildung 3.1b) 89% Apoptose und nur

geringfügig Nekrose (7%) auf. Erhitzen der Jurkat-Zellen auf 55°C führte zu 79% NZ

(Abbildung 3.1c) mit geringem apoptotischen (6%) Anteil. Die verwendeten Methoden sind

also zum Erzeugen von AZ und NZ geeignet und der Einfluss der jeweils anderen

Populationen kann als geringfügig und vernachlässigbar angesehen werden.

3.1.2 Phagozytose von AZ in RAW264.7-Makrophagen

Als Phagozytenmodellsystem wählte ich die Mausmakrophagenzelllinie RAW264.7, da diese

die größte Übereinstimmung von allen mir zur Verfügung stehenden Zelllinien mit einem

Makrophagenphänotyp zeigt und keine weiteren Schritte zur Differenzierung notwendig sind,

wie etwa bei der humanen prä-monozytären Zelllinie THP-1 (127).

Die Phagozytose apoptotischer Zellen wurde fluoreszenzmikroskopisch bestimmt. Dazu

wurden die Makrophagen mit 1,1´Dioctadecyl-3,3,3´,3´-Tetramethyl-Indocarbocyanin-

Perchlorat (DiI) gefärbten VZ, AZ oder NZ für 2 h auf Diagnostika-Objektträgern inkubiert,

anschließend mit PBS gewaschen und mikroskopiert (Abbildung 3.2). Während VZ nicht

phagozytiert wurden, wurden AZ und NZ von den Makrophagen aufgenommen. Die

Aufnahme von NZ erfolgte dabei allerdings in etwas geringerem Maße als die von AZ.

Abbildung 3.2: Phagozytose apoptotischer Teilchen durch RAW264.7-Makrophagen. 1x104 RAW264.7-

Makrophagen/Loch wurden auf Diagnostika-Objektträgern ausgesät und für 2 h mit (a) VZ, (b) AZ oder (c) NZ,

die zuvor 30 min mit DiI (roter Fluoreszenzfarbstoff) gefärbt wurden, inkubiert. Nach zweimaligem Waschen

mit PBS wurden die Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Abbildungen sind

repräsentativ für drei verschiedene Experimente.

Ergebnisse 53

3.1.3 Ausschluss eines Einflusses von AZ-Bestandteilen auf die Testergebnisse

Um einen möglichen Einfluss von Bestandteilen der AZ auf die Ergebnisse der von mir

durchgeführten Experimente auszuschließen, wurden die RAW 264.7-Makrophagen nach der

Coinkubation mit AZ vor der jeweiligen weiteren Verwendung routinemäßig zweimal mit

PBS gewaschen. Um zu beweisen, dass diese Methode ausreichend ist, um die AZ

abzuwaschen, coinkubierte ich RAW264.7-Zellen für 1 h mit DiI (roter Fluoreszenzfarbstoff)

gefärbten AZ und analysierte die Effektivität des Waschvorgangs unter dem

Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 3.3). Bis auf einige Partikel, die durch Phagozytose

aufgenommen worden waren, ließen sich alle AZ von den Makrophagen gut abwaschen.

Damit konnte ich ausschließen, dass Variationen in den verschiedenen gemessenen

Parametern aus Kontaminationen von AZ resultieren.

Abbildung 3.3: Abwaschen der AZ nach Inkubation der Makrophagen. Das erfolgreiche Abwaschen der

AZ wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie verifiziert. Die AZ wurden 30 min vor Zugabe zu den Makrophagen

mit DiI gefärbt. Nach 1 h Coinkubation wurden die Makrophagen zweimal mit PBS gewaschen. Eine

Rotfluoreszenz zeigt also das Vorhandensein von AZ an. Die Bilder zeigen die RAW264.7-Makrophagen

einerseits unbehandelt (a, Phasenkontrast; b, rot Fluoreszenz), andererseits während der Inkubation mit AZ

(c, Phasenkontrast; d, rot Fluoreszenz) sowie nach dem Herunterwaschen der AZ (e, Phasenkontrast; f, rot

Fluoreszenz). Die Daten sind repräsentativ für drei verschiedene Experimente.

Ergebnisse 54

3.1.4 AZ-vermittelte Hemmung der Nitritproduktion in Makrophagen

Nach der Etablierung des Phagozytosemodellsystems verifizierte ich zunächst den anti-

inflammatorischen Einfluss apoptotischer Jurkat-Zellen auf RAW264.7-Makrophagen. Ein

wichtiger pro-inflammatorischer Marker aktivierter Mausmakrophagen ist die Produktion von

NO, welches im Zellüberstand mittels Griess-Assay (siehe 2.2.17) als Nitrit, einem stabilen

Oxidationsprodukt des NO-Abbaus, nachgewiesen werden kann.

Wie erwartet, führte eine 24 h-Stimulation der RAW264.7-Makrophagen mit 1 µg/ml LPS

und 10 U/ml IFNγ zu einer deutlichen Erhöhung der Nitritproduktion im Vergleich zu den

unstimulierten Kontrollen (Abbildung 3.4). Die Inkubation der Makrophagen mit AZ

reduzierte signifikant sowohl die basale Nitritbildung, als auch die nach LPS/IFNγ-

Stimulation.

Abbildung 3.4: Gehemmte Nitritproduktion nach Stimulation mit AZ und TGFβ. Nitrit, ein stabiles NO-

Oxidationsprodukt, wurde mittels Griess-Assay im Überstand von RAW264.7-Makrophagen, wie in 2.2.17

beschrieben, nachgewiesen. RAW264.7-Makrophagen oder AZ wurden für 24 h mit 1 µg/ml LPS und 10 U/ml

IFNγ, 5 ng/ml TGFβ, AZ oder den entsprechenden Kombinationen wie angegeben induziert. Die Kontrollzellen

blieben unbehandelt. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.005

verglichen mit LPS/IFNγ-stimulierten Kontrollen).

Frühere Befunde, die zeigten dass die LPS/IFNγ-vermittelte NO-Produktion in Makrophagen

mittels 5 ng/ml TGFβ gehemmt werden kann, wurden bestätigt (35). Die Inkubation

Ergebnisse 55

aktivierter Makrophagen mit AZ oder TGFβ reduzierte die Bildung von Nitrit noch unter die

Kontrollwerte mit unbehandelten RAW264.7-Zellen. Weder AZ allein noch mit LPS/IFNγ

stimulierte AZ produzierten beachtenswerte Mengen an Nitrit. Während der folgenden

Versuche wurde die Hemmung der Nitritproduktion standardmäßig als Marker für die

Aktivierung anti-inflammatorischer Signalwege gemessen.

3.2 Einfluss von AZ auf die ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen

3.2.1 AZ hemmen die ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen

Zunächst untersuchte ich, ob AZ spezifisch die ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen

beeinflussen können (Abbildung 3.5). Die Messung der ROS-Bildung erfolgte dabei mittels

HE-Assay, wie in 2.2.6 beschrieben. Zunächst schloss ich erfolgreich die Möglichkeit aus,

dass AZ oder NZ an sich in der Lage sind, die Sauerstoffradikalproduktion zu induzieren

(Abbildung 3.5a und b), indem ich diese für 30 min mit den Makrophagen coinkubierte. Im

Gegensatz dazu führte eine Stimulation der Makrophagen mit TPA wie erwartet zu einer

deutlich erhöhten ROS-Produktion, erkennbar an der Rechtsverschiebung des HE-Signals.

Vorinkubation der Makrophagen mit AZ für 1 h mit anschließender TPA-Stimulation führte

zu einer um ca. 50% gehemmten Sauerstoffradikalbildung (Abbildung 3.5b), während NZ die

TPA-induzierte ROS-Produktion nicht beeinflussten (Abbildung 3.5d). Dieser Befund

unterstützt frühere Arbeiten, die zeigen dass NZ keinen Einfluss auf RAW264.7-

Makrophagen haben (128).

Inkubation der Makrophagen mit 5 ng/ml TGFβ für 1 h löste weder ROS-Produktion aus,

(Abbildung 3.5e) noch führte sie zu einer Inhibition des TPA-vermittelten ‚oxidative burst’

(Abbildung 3.5f). Die statistische Auswertung dieser Ergebnisse ist in Abbildung 3.5g

dargestellt.

Ergebnisse 56

Abbildung 3.5: ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen nach Inkubation mit AZ, NZ oder TGFβ.

Die ROS-Produktion in Makrophagen wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Dabei wurden die Zellen mit

2 µM HE als Redox-sensitivem Farbstoff, wie in 2.2.6 beschrieben, gefärbt. Die Zellen wurden mit 1 µM TPA

stimuliert (dunkelgraue Linien) oder verblieben unbehandelt als Kontrollen (schwarze Linien). (a) Coinkubation

mit AZ für 30 min (graue Fläche), (b) Coinkubation mit AZ für 1 h mit anschließender Stimulation mit TPA

(graue Fläche), (c) Coinkubation mit NZ für 30 min (graue Fläche), (d) Coinkubation mit NZ für 1 h mit

anschließender Stimulation durch TPA (graue Fläche), (e) Vorinkubation mit 5 ng/ml TGFβ für 30 min (graue

Fläche), (f) Vorinkubation mit 5 ng/ml TGFβ für 1 h mit anschließender Stimulation durch TPA (graue Fläche).

(g) Statistische Auswertung von a-f. Die Verschiebung des ‚peak’-Medians von unbehandelten Zellen zu TPA-

stimulierten Makrophagen wurde als 100%-Aktivierung definiert und die Inhibition proportional errechnet. Die

Daten stellen den MW ± SEM von drei verschiedenen Versuchen dar (* p ≤ 0.05 verglichen mit TPA

stimulierten Kontrollen).

Ergebnisse 57

3.2.2 AZ hemmen die PKCα-Translokation in RAW264.7-Makrophagen

Um zusätzliche Informationen über die durch AZ-vermittelte Hemmung der ROS-Produktion

zu erhalten, untersuchte ich nun die PKCα-Expression. Da bekannt ist, dass eine Aktivierung

der PKCα durch TPA nicht nur zur Sauerstoffradikalproduktion, sondern - als Folge der

Aktivierung - zu einer Translokation derselben an die Plasmamembran führt, ist eine

Abnahme der PKCα im Zytosol indikativ für eine vorangegangene Aktivierung (129).

Abbildung 3.6a zeigt die zytosolische PKCα-Proteinexpression in RAW264.7-Zellen, die sich

bei Cokultivierung von Makrophagen und AZ nicht änderte. Wie erwartet, führte eine

Stimulation mit 1 µM TPA für 1 bis 6 h zur Aktivierung und damit zur Translokation der

zytosolischen PKCα. Interessanterweise führte eine Costimulation der Makrophagen mit AZ

und TPA für 1 h zur kompletten Hemmung der PKCα-Migration zur Membran, während

dieser Effekt nach 3 h nur noch schwach und nach 6 h nicht mehr zu beobachten war.

Abbildung 3.6b zeigt eine statistische Auswertung der Menge an zytosolischer PKCα

während der ersten Stunde, in der die AZ-vermittelte Hemmung der PKC-Aktivierung am

prominentesten ist.

Um einen weiteren Beweis dafür zu erhalten, dass die PKCα-Aktivierung - und damit die

Translokation vom Zytosol in die Membran durch AZ - gehemmt ist, untersuchte ich die

zytosolische sowie die Membranfraktion (Abbildung 3.6c). Wie erwartet führte eine

Stimulation mit TPA zur PKCα-Translokation in die Membran, während die Coinkubation

von TPA und AZ die Proteintranslokation inhibierte.

Ergebnisse 58

Abbildung 3.6: PKCα-Aktivierung nach TPA und AZ. (a) Die zytosolische Expression von PKCα und Aktin

wurde mittels Western Blot in unbehandelten Kontroll-RAW264.7-Makrophagen, nach Zugabe von AZ, 100 nM

TPA oder einer Kombination aus AZ und TPA jeweils nach 1, 3 und 6 h bestimmt. (b) Statistische Auswertung

der Western Blot-Daten für die 1 h-Stimulation. (c) PKCα-Proteinmengen in der zytosolischen sowie der

Membranfraktion in unbehandelten RAW264.7-Zellen, nach Stimulation mit 100 nM TPA oder nach einer

Kombination aus AZ und TPA. Stimulation erfolgte für 1 h. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei

Versuchen dar oder sind repräsentativ für drei Experimente.

Um einen zusätzlichen Beweis zu dem in 3.1.3 erwähnten Versuch zu erhalten, dass keine

Jurkat-Proteine die Menge der im Western Blot beobachteten PKCα beeinflussen, verglich

ich die isolierte Gesamtproteinmenge der verwendeten Proben. Es war kein signifikanter

Unterschied zwischen den Proben mit und ohne AZ festzustellen (Abbildung 3.7).

Ergebnisse 59

Abbildung 3.7: Einfluss von Jurkat-Zellen auf die isolierte Gesamtproteinmenge. Um einen zusätzlichen

Beweis zu erhalten, dass keine Jurkat-Proteine die Menge der im Western Blot beobachteten PKCα beeinflussen,

wurde die isolierte Gesamtproteinmenge der verwendeten Proben verglichen. Es war kein signifikanter

Unterschied zwischen den Proben mit und ohne AZ festzustellen. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei

Versuchen dar.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass AZ in RAW264.7-Makrophagen die Aktivierung

der PKCα- und der ROS-Produktion hemmen. Dieser Effekt ist prominent nach 1 h und

verliert sich nach 3 bis 6 h.

3.2.3 PPARγ moduliert die PKCα-Aktivierung in Makrophagen

Nun versuchte ich Informationen über mögliche Signalwege herauszufinden, die bei der

Hemmung der Sauerstoffradikalbildung nach AZ involviert sind und zog den Einfluss des

etablierten anti-inflammatorischen Faktors PPARγ in Betracht, von dem allerdings bis heute

keine Kurzzeiteffekte auf die ROS-Bildung bekannt sind. Dabei konzentrierte sich mein

Interesse vor allem auf frühe Ereignisse der Makrophagenaktivierung (innerhalb der ersten

Stunde) und ich untersuchte eine mögliche PPARγ-Aktivierung mittels EMSA Analyse.

Ergebnisse 60

Abbildung 3.8: PPARγ-Aktivierung in RAW264.7-Makrophagen nach Stimulation mit AZ. (a) EMSA-

Analyse der PPARγ-Aktivierung in unbehandelten RAW264.7-Makrophagen (oberes Kästchen), Makrophagen

coinkubiert mit AZ (mittleres Kästchen) und in Makrophagen mit d/n PPARγ-Mutante coinkubiert mit AZ

(unteres Kästchen). (b) Statistische Auswertung der EMSA-Ergebnisse. Die Daten stellen den MW ± SEM von

drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05 verglichen mit unstimulierten RAW264.7).

Nach Coinkubation von RAW264.7-Makrophagen für 15 bis 60 min war deutlich eine

transiente Aktivierung von PPARγ erkennbar (Abbildung 3.8). Nach 15 min war diese am

stärksten. Während der ersten Stunde wurde die Aktivierung schwächer und erreichte,

verglichen mit unstimulierten Makrophagen, nach 45 bis 60 min statistisch irrelevante Werte.

Die statistische Auswertung der Daten ist in Abbildung 3.8 zu sehen.

Um eine Kausalität zwischen PPARγ-Aktivierung und der Hemmung der ROS-Produktion

herzustellen, benutzte ich RAW264.7-Makrophagen, die mit einer d/n PPARγ-Mutante

retroviral transduziert worden waren und in welchen somit eine erfolgreiche Aktivierung von

PPARγ verhindert war. Wurden diese d/n PPARγ-Makrophagen mit AZ coinkubiert, konnte

keine PPARγ-Aktivierung festgestellt werden (Abbildung 3.8).

In den folgenden Experimenten untersuchte ich die PKCα-Aktivierung an den d/n PPARγ-

Makrophagen mittels Western Blot-Analyse (Abbildung 3.9). Die zytosolische Expression der

PKCα blieb unverändert, wenn die Zellen für 1 h mit AZ coinkubiert wurden, während

Stimulation mit 100 nM TPA wie erwartet zu einer PKCα-Aktivierung führte. Dieses

Verhalten ist vergleichbar mit dem der RAW264.7-Zellen (Abbildung 3.6). Nach

gleichzeitiger Stimulation mit AZ und TPA zeigte sich jedoch ein Unterschied im Verhalten

der normalen RAW264.7- und dem in d/n PPARγ-Makrophagen. Während in normalen

RAW264.7-Zellen die PKCα-Translokation komplett gehemmt war (Abbildung 3.6b), war in

Ergebnisse 61

den d/n PPARγ-Makrophagen eine signifikant höhere PKCα-Aktivierung, verglichen mit den

Kontrollen, zu erkennen (Abbildung 3.9a). Die statistische Auswertung der Daten ist in

Abbildung 3.9 dargestellt.

Eine PPARγ-Aktivierung ist also für die Hemmung der PKCα-Aktivierung nach

Coinkubation der Makrophagen mit AZ notwendig.

Abbildung 3.9: PKCα-Aktivierung in d/n PPARγ-Makrophagen. (a) RAW264.7-Makrophagen, die eine d/n

PPARγ-Mutante exprimieren, blieben unbehandelt oder wurden für 1 h mit AZ und/oder 100 nM TPA

coinkubiert. Die zytosolische PKCα-Expression wurde mittels Western Blot bestimmt. (b) Statistische

Auswertung der PKCα-Western Blots aus a. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei Versuchen dar

(* p ≤ 0.05 verglichen mit unstimulierten Kontrollen).

Um zu verifizieren, dass die d/n PPARγ-Makrophagen wirklich die PPARγ-Aktivierung

verhindern, führte ich ein PPRE-Reportergen-Assay durch. Dazu cotransfizierte ich das

PPARγ-Reporterplasmid pGL2B-mpCD36 zusammen mit einem PPARγ-wt-

Expressionsplasmid transient in normale RAW264.7-Zellen und d/n PPARγ-Makrophagen.

Die Zellen wurden dann 24 h mit 10 µM Ciglitazon, einem Thiazolidindionderivat (TZD) und

bekannten PPARγ-Agonisten inkubiert und anschließend wurde die Luziferaseaktivität

bestimmt (Abbildung 3.10). Während die RAW264.7-Zellen eine erhöhte PPARγ-vermittelte

Luziferase-Aktivität zeigten, war bei den d/n PPARγ-Makrophagen, sogar mit dem PPARγ-

Expressionsplasmid, keine transkriptionelle Aktivität in die RAW264.7-Zellen festzustellen.

Ergebnisse 62

Abbildung 3.10: Erfolgreiche Transduktion der d/n PPARγ-Mutante in RAW264.7-Makrophagen.

PPARγ-Reportergen Assay in normalen und d/n PPARγ-transduzierten RAW264.7-Makrophagen nach

Stimulation mit 10 µM Ciglitazon für 24 h. Um die Funktionalität der d/n PPARγ-Mutante zu beweisen, wurde

ein PPARγ-wt-Expressionsplasmid cotransfiziert. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei Versuchen dar

(* p ≤ 0.05 verglichen mit RAW264.7-Makrophagen).

3.2.4 PPARγ hemmt die ROS-Produktion in RAW264.7-Makrophagen

Davon ausgehend, dass eine PPARγ-Aktivierung für die Hemmung der PKCα-Aktivierung

notwendig ist, benutzte ich nun die d/n PPARγ-Makrophagen, um die ROS-Produktion im

Vergleich zu normalen RAW264.7 nach gleichzeitiger Stimulation mit TPA und AZ zu

untersuchen (Abbildung 3.11). Die Inkubation normaler RAW264.7-Zellen mit AZ führte zu

einer Hemmung der TPA-induzierten ROS-Bildung. Die Hemmung war nach 1 h deutlich zu

erkennen und nahm mit zunehmenden Inkubationszeiten für 3 bis 6 h noch zu (Abbildung

3.11a, c und d).

Ergebnisse 63

Abbildung 3.11: ROS-Produktion nach Stimulation mit AZ in RAW264.7- oder d/n PPARγ-

Makrophagen. Die ROS-Produktion in normalen und d/n PPARγ-transduzierten RAW264.7-Makrophagen

wurde durchflusszytometrisch mittels Färbung mit 2 µM HE als Redox-sensitivem Farbstoff bestimmt (siehe

2.2.6). Die Zellen wurden mit 1 µM TPA stimuliert (dunkelgraue Linien) oder verblieben unbehandelt als

Kontrollen (schwarze Linien). AZ wurden vor Zugabe von TPA für 1, 3 oder 6 h mit den Makrophagen

coinkubiert. (a-b) AZ wurden für 1 h vor TPA-Stimulation coinkubiert (graue Flächen), (c-d) AZ wurden für 3 h

vor TPA-Stimulation coinkubiert (graue Flächen), (e-f) AZ wurden für 6 h vor TPA-Stimulation coinkubiert

(graue Flächen). (g) Statistische Auswertung von a-f. Die Verschiebung des Peak Medians zwischen

unbehandelten und TPA stimulierten Zellen wurde als 100%-Aktivierung definiert und die jeweilige Inhibition

Ergebnisse 64

proportional berechnet. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05 verglichen mit

RAW264.7-Makrophagen).

Coinkubation der d/n PPARγ-Makrophagen mit AC für 1 h und anschließender Stimulation

mit TPA führte zu keiner messbaren Inhibition der ROS-Produktion (Abbildung 3.11b). Das

Signal war nicht vom TPA-Effekt zu unterscheiden, unterschied sich aber wesentlich von den

in normalen RAW264.7-Zellen gemessenen Werten (vgl. Abbildung 3.11b und a). Mit

steigenden Inkubationszeiten der d/n PPARγ-Makrophagen mit AZ war eine geringfügige

Hemmung der ROS-Produktion zu erkennen. Dieser Effekt trat nach 3 h Coinkubation auf

und wurde nach 6 h noch deutlicher (Abbildung 3.11d und f). Die statistische Auswertung

dieser Ergebnisse ist in Abbildung 3.11g dargestellt.

Die TPA-vermittelte ROS-Produktion in Makrophagen wird also sehr schnell durch

Coinkubation mit AZ gehemmt. Der Effekt reicht von 40% Hemmung nach 1 h bis nahezu

60% nach 6 h. Eine andere Situation stellt sich in d/n PPARγ-Makrophagen dar. Kurze Zeit

nach AZ Stimulation (nach 1 h) ist keine Hemmung der ROS-Produktion zu erkennen. Die

Hemmung passt sich dann immer mehr der Situation in normalen RAW264.7-Zellen an, so

dass nach 6 h fast kein Unterschied mehr zu erkennen ist. Dies scheint auf einen biphasischen

inhibitorischen Effekt hinzuweisen, bei dem zumindest die Anfangsphase durch PPARγ-

vermittelt ist. Damit korreliert die TPA-vermittelte ROS-Produktion in d/n PPARγ-

Makrophagen zumindest zum Teil mit der Expressionsmodulation bzw. Aktivierung von

PKCα (Abbildung 3.9b).

3.2.5 PKCα spielt eine Rolle bei der Hemmung der ROS-Produktion

Um einen zusätzlichen Beweis für eine Rolle der PKCα bei der Hemmung der ROS-

Produktion zu erhalten, verwendete ich PKCα-überexprimierende RAW264.7-Zellen, um die

Sauerstoffradikalbildung zu untersuchen (50). Coinkubation mit AZ für 1 h vor Stimulation

mit TPA hatte in diesen Zellen keinen Einfluss auf die ROS-Bildung. Die

Sauerstoffradikalbildung war vergleichbar mit der TPA-stimulierten Positivkontrolle

(Abbildung 3.12a). Die statistische Auswertung der Daten ist in Abbildung 3.12b dargestellt.

Dies unterstützt die Theorie, dass die Hemmung der ROS-Produktion nach Inkubation mit AZ

eine Folge der inhibierten PKC-Aktivierung ist.

Ergebnisse 65

Abbildung 3.12: ROS-Produktion in PKCα-überexprimierenden Zellen. Die ROS-Produktion in PKCα-

überexprimierenden RAW264.7-Makrophagen wurde durchflusszytometrisch mittels Färbung mit 2 µM HE als

Redox-sensitivem Farbstoff bestimmt (siehe 2.2.6). (a) Die Zellen wurden mit 1 µM TPA stimuliert

(dunkelgraue Linien) oder verblieben unbehandelt als Kontrollen (schwarze Linien). AZ wurden vor Zugabe von

TPA für 1 h mit den Makrophagen coinkubiert (graue Fläche). (b) Statistische Auswertung von a. Die Daten

stellen den MW ± SEM von drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05 verglichen mit TPA-stimulierten Zellen).

3.2.6 Zell-Zell-Kontakt von AZ und Makrophagen ist ausreichend zur Hemmung der

PKCα-Aktivierung

Um herauszufinden, ob ein Zell-Zell-Kontakt für den Einfluss von AZ auf die PKCα-

Aktivierung notwendig ist, führte ich Transwell-Experimente durch, bei denen die AZ von

den Makrophagen durch eine Membran getrennt kultiviert wurden, welche die Passage

löslicher Faktoren erlaubt. Dies verhindert zwar einen Zell-Zell-Kontakt, aber nicht eventuell

auftretende parakrine Effekte. Wie in Abbildung 3.13a dargestellt, verhinderte die räumliche

Trennung von AZ und RAW264.7-Makrophagen die Hemmung der TPA-vermittelten PKCα-

Aktivierung, was parakrine Mechanismen als Ursache ausschließt.

Als nächstes untersuchte ich, ob die Phagozytose von AZ notwendig ist, um die PKCα-

Aktivierung zu modulieren oder ob interzellulärer Kontakt dafür ausreichend ist. Dafür

benutzte ich Cytochalasin D, einen Inhibitor der Aktinpolymerisierung, um die Phagozytose

der AZ zu verhindern (Abbildung 3.13b). Wie erwartet, führte Cytochalasin D allein weder zu

Ergebnisse 66

einer PKCα-Aktivierung, noch hemmte es deren TPA-vermittelte Translokation. Stimulation

der Makrophagen mit einer Kombination aus Cytochalasin D, AZ und TPA führte zu einer

Hemmung der PKCα-Translokation. Dies spricht dafür, dass die Phagozytose von

apoptotischem Material für die Signalweiterleitung nicht notwendig ist. Zell-Zell-Kontakt

reicht also für die Hemmung der PKCα-Aktivierung aus.

Abbildung 3.13: Rolle von Phagozytose und parakrinen Signalen in der Modulation der PKCα-

Aktivierung. Die zytosolische Expression von PKCα und Aktin wurde mittels Western Blot analysiert. (a)

Transwell-Versuche wurden benutzt, um AZ und Makrophagen zu separieren und einen direkten Zell-Zell-

Kontakt zu verhindern. Makrophagen wurden so mit AZ und/oder 100 nM TPA für 1 h coinkubiert oder

verblieben unstimuliert als Kontrollen. (b) RAW264.7-Makrophagen wurden mit AZ, 2 µM Cytochalasin D

(Cyto D) und/oder 100 nM TPA für 1 h stimuliert oder blieben unbehandelt. Im Falle einer Stimulation mit

Cyto D wurde dieses bereits 45 min vor den anderen Stimuli zugegeben. Die Western Blots sind repräsentativ

für drei verschiedene Experimente.

Ergebnisse 67

3.2.7 Modulation der PKCα Aktivierung durch TPA und AZ in primären humanen

Makrophagen

Um zu überprüfen, ob das Prinzip der PKCα-Regulation durch AZ auf ein humanes System

übertragbar ist, isolierte ich nun humane periphere Blutmonozyten. Diese wurden zu

Makrophagen ausdifferenziert. Um den regulatorischen Einfluss von AZ zu überprüfen,

benutzte ich, wie schon zuvor, Western Blot-Analysen zur Untersuchung der PKCα-

Translokation (Abbildung 3.14). Die zytosolische PKCα-Expression blieb nach 1 h

Stimulation der primären Makrophagen mit AZ unverändert, während die Stimulation mit

100 nM TPA zu einer partiellen Proteintranslokation führte. Simultane Stimulation mit AZ

und TPA für 1 h führte zu einer Hemmung der PKCα-Translokation. Auch wenn die

Regulation von PKCα in humanen Makropagen nicht so ausgeprägt zu sein scheint wie in

RAW264.7-Zellen (Abbildung 3.6), so ist die Reaktion generell doch vergleichbar.

Abbildung 3.14: PKCα in humanen Makrophagen nach TPA und AZ. Die zytosolische Expression von

PKCα und Aktin wurde mittels Western Blot analysiert. Primäre humane Makrophagen wurden so mit AZ

und/oder 100 nM TPA für 1 h coinkubiert oder verblieben unstimuliert als Kontrollen. Der Western Blot ist

repräsentativ für drei verschiedene Experimente.

3.3 Arginase-vermittelte Inhibition der NO-Produktion

Wie schon in 3.1.4 erwähnt, untersuchte ich während meiner Studien standardmäßig die

Hemmung der NO-Produktion in RAW264.7-Makrophagen nach Inkubation mit AZ als

Ergebnisse 68

Marker für deren anti-inflammatorische Wirkung. In diesem zweiten Teil meiner Promotion

widmete ich mich nun den zugrunde liegenden Mechanismen dieses Phänomens.

3.3.1 AZ hemmen die NO-Produktion in Makrophagen ohne Modulation der iNOS-

Expression

Um einen ersten Hinweis über mögliche NO-Regulationsmechanismen zu erhalten,

untersuchte ich zunächst die Nitritproduktion im Verhältnis zur iNOS-Expression in

RAW264.7-Zellen nach Stimulation mit IFNγ und AZ.

Abbildung 3.15: Nitritproduktion und iNOS-Expression nach AZ. RAW264.7-Makrophagen wurden mit AZ

(Verhältnis 1:5) für 15 h coinkubiert. Nach Zugabe von frischem Medium wurden die entsprechenden Proben

mit 100 U/ml IFNγ stimuliert. Nach 24 h wurde der Nitritgehalt im Überstand mittels Griess-Assay bestimmt

und durch Western Blot-Analyse die iNOS-Expression untersucht. Die Griess-Assay-Daten stellen den

MW ± SEM von drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05; verglichen mit IFNγ-stimulierten Kontrollen). Die Western

Blot-Ergebnisse sind repräsentativ für drei verschiedene Experimente.

Wie erwartet führte eine 24 h-Stimulation der RAW264.7-Makrophagen mit 100 U/ml IFNγ,

verglichen mit den unbehandelten Kontrollen oder Makrophagen, die mit AZ stimuliert

Ergebnisse 69

wurden, zu erhöhten Nitritwerten (Abbildung 3.15). Nach einer Coinkubation der

Makrophagen mit AZ für 15 h und anschließender Stimulation mit IFNγ waren die ermittelten

Nitritwerte deutlich reduziert. Im Gegensatz dazu bewirkten weder NZ noch VZ eine

Hemmung der Nitritproduktion (Daten nicht gezeigt).

Parallel zur Messung des gebildeten Nitrits untersuchte ich die iNOS-Expression mittels

Western Blot-Analyse. Wie angenommen, führte die Stimulation der Makrophagen mit IFNγ

zu einer stark erhöhten iNOS-Expression, verglichen mit den Kontrollen oder Zellen, die nur

mit AZ allein inkubiert wurden. Interessanterweise war die Menge an iNOS-Protein in

AZ/IFNγ-stimulierten Zellen vergleichbar mit denen, die nur mit IFNγ stimuliert wurden. Das

lässt darauf schließen, dass der Hemmung der NO-Produktion keine Modulation der iNOS-

Expression zugrunde liegt.

3.3.2 Arginase moduliert die NO-Produktion in AZ-stimulierten Makrophagen

Die Beobachtung, dass offensichtlich iNOS-Protein vorhanden war, ohne dass eine Aktivität

desselben beobachtet werden konnte, warf die Frage auf, ob eine direkte (z.B. durch Protein-

Protein-Wechselwirkungen) oder eine indirekte (z.B. durch verringerte Substratverfügbarkeit)

Hemmung vorlag. Um das herauszufinden, führte ich eine Messung der in vitro-

Enzymaktivität mittels radioaktivem Citrullin-Assay durch. Bei diesem Assay wird

U-[14C]-L-Arginin durch iNOS in Citrullin umgewandelt. Durch Dünnschicht-

chromatographie wird dann das Reaktionsgemisch aufgetrennt und die Menge des

entstandenen Citrullins kann als Maß der iNOS-Enzymaktivität mittels Autoradiographie

ermittelt werden.

In Kontrollen, bei denen kein Protein zum Reaktionsansatz zugegeben wurde, war eine

geringe basale Menge an Citrullin und Ornithin vorhanden (Abbildung 3.16). Wie an der

erhöhten Citrullinproduktion zu erkennen ist, zeigten die Lysate von RAW264.7-Zellen, die

mit 100 U/ml IFNγ stimuliert waren, wie erwartet eine signifikant erhöhte iNOS-Aktivität,

verglichen mit den Kontrolllysaten unstimulierter Makrophagen. Wenn Lysate mit AZ-

stimulierten Makrophagen verwendet wurden, zeigte sich zwar keine erhöhte Citrullin-

produktion, jedoch erschien interessanterweise eine zweite Bande, die ich anhand von

Vergleichskontrollen und aufgrund ihrer DC-Laufeigenschaften als Ornithin identifizieren

konnte. Dies deutete auf eine erhöhte Arginaseaktivität in diesen Proben hin. Eine Beteiligung

Ergebnisse 70

der Arginase konnte ich durch Einsatz des spezifischen Arginaseinhibitors nor-NOHA zu den

Lysaten der AZ-stimulierten Zellen verifizieren. Die Zugabe des Inhibitors zum Assay in

einer Endkonzentration von 1 mM verhinderte die Ornithinproduktion gänzlich. Die Spezifität

von nor-NOHA wird dadurch bestärkt, dass die IFNγ-induzierte iNOS-Aktivität trotz Zugabe

des Inhibitors unbeeinflusst blieb. Wurden RAW264.7-Makrophagen 15 h mit AZ

vorinkubiert und anschließend für 24 h mit 100 U/ml IFNγ stimuliert, konnte man sowohl

eine Erhöhung der iNOS- als auch der Arginaseaktivität beobachten. Als Folge dieser

Beobachtungen kann man den Einfluss eines inhibitorischen Proteins auf die iNOS-Aktivität

ausschließen. Als weitere Kontrolle, dass der beobachtete Effekt spezifisch als Antwort auf

AZ erfolgt, verwendete ich Lysate von Zellen, die mit VZ oder NZ inkubiert wurden. Weder

VZ noch NZ führten zu einer erhöhten Arginaseaktivität. Lysate von AZ allein bewirkten

ebenfalls weder erhöhte Citrullin- noch Ornithinproduktion (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 3.16: Citrullin- und Ornithinproduktion nach Stimulation mit AZ. RAW264.7-Makrophagen

wurden mit AZ, NZ oder VZ im Verhältnis 1:5 für 15 h vorinkubiert. Nach Mediumwechsel wurden die Zellen

für 24 h mit oder ohne 100 U/ml IFNγ weiterkultiviert. Dann wurden die Zellen geerntet und ein Citrullin-Assay

wie in 2.2.20 beschrieben durchgeführt. Nor-NOHA wurde dem in vitro Assay in einer Endkonzentration von

1 mM zugefügt. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei verschiedene Experimente.

Um meine Theorie zu unterstützen, dass die Arginase eine Rolle bei der Modulation der

iNOS-Aktivität spielt, untersuchte ich die Nitritproduktion in RAW264.7-Makrophagen unter

dem Einfluss von AZ und nor-NOHA in vivo. Für dieses Experiment tauschte ich nach der

Vorinkubation der AZ das Medium gegen PBS aus, um Einflüsse des im Medium

Ergebnisse 71

befindlichen L-Arginins auf die nor-NOHA-Aufnahme und/oder die Inhibition der

Arginaseaktivität auszuschließen. Wie erwartet, war die Nitritproduktion bei Makrophagen,

die für 2 h mit 100 U/ml IFNγ inkubiert worden waren, deutlich höher als bei den

unstimulierten Kontrollen oder bei mit AZ vorstimulierten Zellen (Abbildung 3.17). Nor-

NOHA führte weder allein zu einer Erhöhung der Nitritwerte, noch war die Produktion nach

gleichzeitiger Stimulation mit IFNγ gehemmt. Die bei Vorstimulation der Makrophagen mit

AZ erreichte Hemmung der Nitritproduktion konnte durch Zugabe von nor-NOHA partiell

aber signifikant aufgehoben werden.

Abbildung 3.17: Nitritproduktion als Antwort auf AZ- und nor-NOHA-Stimulation. RAW264.7-

Makrophagen wurden mit AZ im Verhältnis 1:5 für 15 h vorinkubiert. Danach wurde das Medium durch PBS

ersetzt und die Zellen für 24 h mit oder ohne 100 U/ml IFNγ weiterkultiviert. Nach 24 h wurde mittels Griess-

Assay das Nitrit im Überstand bestimmt. Im Falle einer Inkubation mit nor-NOHA wurde dieses über den

gesamten Zeitraum von 39 h in einer Endkonzentration von 20 mM auf den Zellen belassen. Die Daten stellen

den MW ± SEM von drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05; verglichen AC/IFNγ-stimulierten Zellen).

3.3.3 AZ führen zur erhöhten Arginase II-Expression in RAW264.7-Makrophagen

Um weitere Daten zum Beweis einer Erhöhung der Arginaseaktivität zu erhalten und den Typ

der involvierten Arginase genauer zu bestimmen, führte ich Real Time PCR-Experimente mit

mRNA von mit AZ stimulierten RAW264.7-Makrophagen durch (Abbildung 3.18). Die

Stimulation mit AZ löste eine ca. 1.000-fache Erhöhung der Arginase II-mRNA, verglichen

Ergebnisse 72

mit den unstimulierten Kontrollen aus, während sich die Arginase I-mRNA nicht signifikant

veränderte.

Davon ausgehend, dass in der Vergangenheit TGFβ als ein möglicher Inhibitor der NO-

Produktion nach AZ-Stimulation diskutiert wurde (35), untersuchte auch ich einen möglichen

Effekt auf die Arginase I- und II-mRNA-Expression (Abbildung 3.18). Die Inkubation von

RAW264.7-Makrophagen mit 5 ng/ml TGFβ führte weder zur Erhöhung der Arginase I noch

der Arginase II-mRNA. Obwohl ich bezüglich der TGFβ-vermittelten Hemmung der

LPS/IFNγ-induzierten NO-Produktion den in der Literatur beschriebenen inhibitorischen

Effekt bestätigen konnte (Abbildung 3.4), scheint dieser also bei der Arginase-vermittelten

Inhibition der NO-Produktion nach Stimulation mit AZ keine Rolle zu spielen.

Zusammenfassend kann man also sagen, dass die Stimulation von RAW264.7-Makrophagen

mit AZ zur Erhöhung der Arginase II-Expression und damit zur Hemmung der IFNγ-

induzierten NO-Produktion führt.

Abbildung 3.18: Arginase I und II mRNA-Expression nach Stimulation mit AZ. RAW264.7-Makrophagen

wurden 15 h mit AZ im Verhältnis 1:5 oder mit 5 ng/ml TGFβ coinkubiert. Die Zellen wurden geerntet und nach

mRNA-Isolation wurde eine quantitative PCR wie in 2.2.16 beschrieben durchgeführt. Die Daten stellen den

MW ± SEM von drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05; verglichen mit unstimulierten Kontrollen).

Zur Überprüfung, ob die Arginase auch auf Proteinebene reguliert wird, führte ich Western

Blot-Experimente durch, bei denen RAW264.7-Makrophagen für 6 h mit AZ coinkubiert

Ergebnisse 73

wurden oder als Kontrollen unstimuliert blieben (Abbildung 3.19). Die Experimente zeigten

eine deutliche Erhöhung der Arginase II, verglichen zur unbehandelten Kontrolle. Dies zeigt,

dass nicht nur die mRNA vermehrt exprimiert wird, sondern auch in einer Erhöhung der

Proteinmenge resultiert.

Abbildung 3.19: Arginase II-Expression nach Coinkubation mit AZ. RAW264.7-Makrophagen wurden mit

AZ (Verhältnis 1:5) coinkubiert oder verblieben unbehandelt als Kontrollen. Nach 6 h wurden die Zellen

geerntet und Western Blot-Analysen durchgeführt. Die dargestellten Daten sind repräsentativ für drei

verschiedene Experimente.

3.3.4 NO wird durch einen von AZ sekretierten löslichen Faktor inhibiert

Um die Frage zu klären, ob Zell-Zell-Kontakte, Phagozytose oder lösliche Faktoren bei der

beobachteten Hemmung der NO-Produktion nach Coinkubation von RAW264.7-

Makrophagen mit AZ eine Rolle spielen, benutzte ich abermals Cyto D als Inhibitor der

Phagozytose. Anstatt der Transwell-Experimente behandelte ich die Makrophagen mit KM

(siehe 2.2.3) zur Überprüfung eines möglichen Einflusses eines durch AZ sekretierten

Faktors. Nach der entsprechenden Behandlung führte ich Griess-Assays und Western Blot-

Analysen durch (Abbildung 3.20).

Die Zugabe von Cyto D zu IFNγ-stimulierten RAW264.7-Makrophagen in Gegenwart von

AZ beeinflusste weder die Fähigkeit der AZ, die Nitritproduktion zu hemmen, noch zeigte

sich eine Hemmung in der iNOS-Expression. Überraschenderweise führte eine Stimulation

mit KM zu einer ähnlichen Inhibition der Nitritfreisetzung wie AZ, bei ebenfalls nicht

vorhandener Reduktion der iNOS-Expression. Diese Experimente lassen darauf schließen,

dass weder Zell-Zell-Kontakt zwischen Makrophagen und AZ, noch Phagozytose notwendig

sind, um den beobachteten Effekt der NO-Hemmung auszulösen. Vielmehr deuten die Daten

Ergebnisse 74

darauf hin, dass ein von AZ sekretierter löslicher Faktor die NO-Produktion in IFNγ-

stimulierten RAW264.7-Makrophagen moduliert.

Abbildung 3.20: Einfluss von Cytochalasin D und AZ-konditioniertem Medium auf Nitritproduktion und

iNOS-Expression. RAW264.7-Makrophagen wurden 15 h mit AZ in Verhältnis 1:5 oder mit AZ-

konditioniertem Medium (KM) inkubiert. Nach Zugabe von frischem Medium wurden die entsprechenden

Proben mit 100 U/ml IFNγ stimuliert. Nach 24 h wurde der Nitritgehalt im Überstand mittels Griess-Assay

bestimmt und durch Western Blot-Analyse die iNOS-Expression untersucht. Im Falle einer Stimulation mit

Cyto D wurde dieses bereits 45 min vor den anderen Stimuli und dann über die gesamte Versuchszeit in einer

Endkonzentration von 2 µM zugegeben. Die Griess-Assay-Daten stellen den MW ± SEM von drei Versuchen

dar (* p ≤ 0.05; verglichen mit IFNγ-stimulierten Kontrollen). Die Western Blot-Ergebnisse sind repräsentativ

für drei verschiedene Experimente.

3.4 Stabilisierung der COX-2-mRNA in Makrophagen durch Inkubation mit AZ

Schon relativ früh während der Erforschung der anti-inflammatorischen Ereignisse nach der

Phagozytose von apoptotischen Zellen, wurde PGE2 als ein möglicher Mediator dieser Effekte

vorgeschlagen (9). Die Mechanismen, die in diesen Kontext zu einer Ausschüttung dieses

Ergebnisse 75

Prostaglandins führen, sind hingegen weitestgehend unbekannt. Im letzten Teil meiner

Promotion beschäftigte ich mich mit möglichen Mechanismen, die zur Ausschüttung von

PGE2 nach Phagozytose von AZ führen.

3.4.1 AZ induzieren eine schnelle COX-2-Expression in RAW264.7-Makrophagen

In einem ersten Experiment untersuchte ich zunächst die COX-2-Expression in RAW264.7-

Makrophagen nach Coinkubation mit AZ und/oder IFNγ (Abbildung 3.21a). Wie erwartet,

zeigten die unbehandelten Kontrollen weder nach 2 h noch nach 4 h eine basale COX-2-

Expression. Wurden die Zellen mit 100 U/ml IFNγ stimuliert, war nach 2 h noch kein COX-2-

Signal erkennenbar, während nach 4 h die Expression langsam zunahm. Wurden die

RAW264.7-Makrophagen hingegen mit AZ coinkubiert, zeigte sich bereits nach 2 h eine

Zunahme der COX-2-Proteinmenge, die sich nach 4 h noch deutlich steigerte. In Proben, die

sowohl mit IFNγ als auch mit AZ stimuliert wurden, war ebenfalls nach 2 h eine Zunahme des

COX-2-Proteins zu erkennen. Nach 4 h Inkubationszeit war in diesen Proben das Signal am

stärksten.

Abbildung 3.21: COX-2-Expression in RAW264.7-Makrophagen nach Stimulation mit AZ und IFNγ. (a)

RAW264.7-Makrophagen wurden für verschiedene Zeiten mit AZ (Verhältnis 1:5) und/oder 100 U/ml IFNγ

Ergebnisse 76

stimuliert, geerntet und Western Blot-Analysen durchgeführt. (b) Western Blot-Zeitkinetik von RAW264.7-

Zellen, die für 30–180 min mit AZ inkubiert wurden oder als Kontrollen unstimuliert blieben. Die Western Blot-

Ergebnisse sind repräsentativ für drei verschiedene Experimente.

Um herauszufinden, innerhalb welcher Zeitspanne es zu einer COX-2-Zunahme kommt,

erstellte ich im Folgenden eine Western Blot-Zeitkinetik (Abbildung 3.21b). In unstimulierten

RAW264.7-Makrophagen zeigte sich wie erwartet keine Erhöhung der COX-2-Expression,

während in Proben, bei denen die Makrophagen mit AZ coinkubiert wurden, bereits nach

60 min eine deutliche COX-2-Bande zu erkennen war. Die Proteinkonzentration nahm dabei

über den gemessenen Zeitraum von 180 min noch weiter zu.

Die Inkubation von RAW264.7-Makrophagen mit AZ führt also zu einer sehr schnellen

Erhöhung (zwischen 30 und 60 min) der COX-2-Proteinexpression.

3.4.2 AZ-vermittelte COX-2-Expression durch mRNA-Stabilisierung

Unter Berücksichtigung der sehr schnellen Erhöhung der COX-2-Proteinmenge nach

Stimulation von RAW264.7-Makrophagen mit AZ erwog ich nun eine COX-2-mRNA-

Stabilisierung als möglichen zugrunde liegenden Regulationsmechanismus, da solche

Mechanismen für dieses Protein bereits in der Literatur beschrieben wurden (101).

Um diese Hypothese zu bestätigen, führte ich ein Luziferase-Assay durch. Dazu verwendete

ich die Luziferase-Expressionsplasmide (pZeo/Luc+3´UTR und pZeo/Luc+shortARE), bei

denen an das Luziferasegen jeweils entweder die 3`-UTR (‚3`-untranslated region’) oder ARE

(‚AU rich elements’) des COX-2-Gens gekoppelt ist. Bei einer der COX-2-Expression

zugrunde liegenden mRNA-Stabilisierung durch eines dieser beiden Elemente sollte es also

zu einer Erhöhung der Luziferase-Aktivität kommen, während im Falle eines anderen

beteiligten Mechanismus die Luziferaseexpression unverändert bleiben sollte.

RAW264.7-Makrophagen wurden mit pZeo/Luc+shortARE oder pZeo/Luc+3´UTR transient

transfiziert und anschließend für 2, 4, 6 und 24 h mit AZ inkubiert (Abbildung 3.22). In

beiden Fällen zeigte sich bereits nach 4 h eine signifikante Erhöhung der Luziferaseaktivität

auf das 2- bis 3-fache der unstimulierten Kontrolle, die im weiteren Verlauf des Versuchs

noch stetig zunahm und nach 24 h die ca. 8-fache Induktion erreichte. Dies unterstützt meine

Annahme, dass die COX-2-Expression in RAW264.7-Makrophagen nach Stimulation mit AZ

über eine ARE/3`-UTR-vermittelte Stabilisierung der mRNA erfolgt.

Ergebnisse 77

Abbildung 3.22: COX-2-mRNA-Stabilisierung in RAW264.7-Makrophagen nach Inkubation mit AZ.

RAW264.7-Makrophagen wurden entweder mit pZeo/Luc+shortARE (ARE) oder pZeo/Luc+3´UTR (UTR)

transient transfiziert, anschließend für 2, 4 ,6 oder 24 h mit AZ (Verhältnis 1:5) stimuliert und die

Luziferaseaktivität als Maß für die mRNA-Stabilisierung ermittelt. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei

Versuchen dar (* p ≤ 0.05; verglichen mit unstimulierten Kontrollen).

Um weitere Hinweise für die postulierte COX-2-mRNA-Stabilisierung zu erhalten, entschloss

ich mich, mittels Real Time PCR direkt die mRNA-Expression in mit AZ stimulierten

Makrophagen zu untersuchen. Dazu wurden RAW264.7-Zellen für verschiedene Zeiten mit

AZ inkubiert, die mRNA wie in 2.2.16 beschrieben isoliert und eine quantitative PCR

durchgeführt (Abbildung 3.23). Nach 15 bis 60 min war noch keine deutliche Veränderung

der mRNA-Menge messbar, während bereits nach 90 min in den mit AZ stimulierten

Makrophagen, im Gegensatz zu unstimulierten Zellen, eine signifikante, ca. 20-fache

Erhöhung der COX-2-mRNA-Menge zu erkennen war. Nach 120 min wurde dieser Effekt mit

ca. 100-facher Induktion noch deutlicher. Diese sehr schnelle Zunahme der COX-2-mRNA ist

ein weiteres Indiz für einen mRNA-stabilisierenden Mechanismus in Makrophagen nach

Stimulation mit AZ.

Ergebnisse 78

Abbildung 3.23: COX-2-Expression in RAW264.7-Makrophagen nach Stimulation mit AZ. RAW264.7-

Makrophagen wurden für 15, 60, 90 und 120 min mit AZ coinkubiert oder verblieben unstimuliert als

Kontrollen. Anschließend wurde eine quantitative PCR zur Messung der COX-2-mRNA-Menge wie in 2.2.16

beschrieben durchgeführt. Die Daten stellen den MW ± SEM von drei Versuchen dar (* p ≤ 0.05; verglichen mit

unstimulierten Kontrollen).

3.4.3 COX-2 wird durch einen von AZ sekretierten löslichen Faktor induziert

Um zu ermitteln, ob parakrine Effekte oder Zell-Zell-Kontakte bei der AZ-vermittelten

Stabilisierung der COX-2-mRNA eine spezifische Rolle spielen, führte ich einen Luziferase-

Assay mit dem bereits in 3.4.2 verwendeten 3´-UTR-Luziferasekonstrukt durch. RAW264.7-

Makrophagen wurden mit AZ und/oder Cyto D, NZ, VZ oder KM für 2 bis 24 h stimuliert

und danach die Luziferaseaktivität im Vergleich zu unstimulierten Kontrollen bestimmt

(Abbildung 3.24a). Wie bereits in 3.4.2 beschrieben, führte eine Stimulation mit AZ bereits

nach 4 h zu einer signifikanten Erhöhung der Luziferaseaktivität, die nach 6 und 24 h noch

weiter zunahm. Die Stimulation der RAW264.7-Makrophagen mit Cyto D, NZ oder VZ

bewirkte zu keiner Zeit eine maßgebliche Steigerung der Luziferaseaktivität.

Interessanterweise führte sowohl die Inkubation der Makrophagen mit Cyto D und AZ, als

auch eine Stimulation mit KM, wie bereits mit AZ allein beobachtet, nach 4 h zu einer

signifikanten, 2- bis 3-fachen Erhöhung der mRNA-Stabilität. Die Luziferaseaktivität stieg

dann weiter an und erreichte nach 24 h den 9- bis 10-fachen Wert der unstimulierten

Kontrollen. Dies deutet darauf hin, dass die COX-2-mRNA-Stabilisierung in Makrophagen

Ergebnisse 79

nach Stimulation mit AZ spezifisch für AZ ist und durch einen von diesen sekretierten Faktor

vermittelt wird.

Abbildung 3.24: Die Rolle von Phagozytose und parakrinen Signalen in der Modulation der COX-2-

Expression. (a) Um den Einfluss von parakrinen Signalen und Zell-Zell-Kontakt-abhängigen Effekten zu

bestimmen, wurden RAW264.7-Makrophagen mit dem Plasmid pZeo/Luc+3´UTR transient transfiziert,

anschließend für 2, 4, 6 oder 24 h mit AZ (mit oder ohne Cyto D), NZ, VZ, KM, im Verhältnis 1:5 stimuliert und

die Luziferaseaktivität als Maß für die mRNA-Stabilisierung ermittelt. Die Daten stellen den MW ± SEM von

3 Versuchen dar (* p ≤ 0.05; verglichen mit unstimulierten Kontrollen). (b) COX-2-Western Blot-Zeitkinetik

von RAW264.7-Zellen, die für 30–180 min mit KM inkubiert wurden oder als Kontrollen unstimuliert blieben.

Die Western Blot-Ergebnisse sind repräsentativ für drei verschiedene Experimente.

Um diese Theorie weiter zu bekräftigen, führte ich COX-2-Western Blot-Analysen von mit

KM stimulierten RAW264.7-Makrophagen durch. Diese wurden für 30 bis 180 min mit KM

inkubiert oder blieben als Kontrollen unbehandelt (Abbildung 3.24). In unstimulierten Zellen

Ergebnisse 80

zeigte sich wie erwartet keine Erhöhung der COX-2-Expression, während in Proben, bei

denen die Makrophagen in KM inkubiert wurden, bereits nach 90 min eine deutliche COX-2-

Bande zu erkennen war. Die Proteinkonzentration nahm dabei über den gemessenen Zeitraum

von 180 min noch weiterhin zu. Diese Western Blot-Ergebnisse sind durchaus vergleichbar

mit denen nach der Stimulation mit AZ (siehe 3.4.1) und bestärken den Befund eines AZ-

vermittelten auto- oder parakrinen Effekts auf die COX-2-Expression in Makrophagen.

Diskussion 81

4 Diskussion

4.1 Etablierung des Phagozytosemodellsystems

Die Entdeckung der Apoptose als programmierte und physiologische Form des Zelltods

führte in der Zellbiologie zu einem neuen und wichtigen Verständnis zur Regulation der

Homöostase von Geweben und Zellpopulationen. Die Phagozytose von AZ nimmt dabei

einen wichtigen Stellenwert ein. AZ werden in vivo schnell von professionellen Phagozyten

wie z.B. Makrophagen aufgenommen, bevor die Membranintegrität durch sekundäre Nekrose

verloren gehen kann und zelluläre Bestandteile wie z.B. DNA oder Proteasen das umliegende

Gewebe schädigen.

In den letzten Jahren wurde mehr und mehr klar, dass diesen Phagozyten neben der Aufgabe

der Beseitigung apoptotischen Materials weitere immunologisch wichtige Funktionen

zukommen. Nach der Phagozytose oder Erkennung von AZ bilden Makrophagen einen aktiv

anti-inflammatorischen Phänotyp aus (7, 30, 130). Während die hierbei beteiligten

Rezeptoren und ausgeschütteten Zytokine inzwischen relativ gut untersucht wurden, ist das

Wissen um die zugrunde liegende Signaltransduktion nach wie vor lückenhaft. Zur

Untersuchung dieser Mechanismen etablierte ich im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein

geeignetes Testsystem zur Untersuchung der Phagozytose apoptotischer Zellen.

Für die meisten Experimente in der vorliegenden Arbeit verwendete ich kurze

Coinkubationszeiten von AZ und Makrophagen. Während dieser Zeit wiesen die Jurkat-

Zellen fast ausschließlich apoptotische Marker auf. Dies zeigt, dass die untersuchten

Makrophagenantworten auf das Vorhandensein von AZ zurückzuführen sind und ein Einfluss

von VZ und sekundären NZ ausgeschlossen werden kann (Abbildung 3.1). Die Brauchbarkeit

der Techniken zur Erstellung von AZ und NZ wird durch frühere Arbeiten bestätigt, welche

ähnliche Methoden benutzten (128, 131).

Meine Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die Mausmakrophagenzelllinie RAW264.7 ein

geeignetes Modellsystem zur Untersuchung der Phagozytose von AZ darstellt, was durch

andere Arbeiten unterstützt wird, die ebenfalls diese Zellen zur Untersuchung anti-

inflammatorischer Effekte nach der Aufnahme von AZ verwendeten (37, 132). Der Gebrauch

von Zellen verschiedener Spezies (Jurkat = human; RAW264.7 = murin) ist dabei legitim, da

bereits frühe Arbeiten zeigten, dass die Erkennung von AZ zwischen den unterschiedlichen

Spezies stark konserviert ist (32, 133). Die Tatsache, dass in meinen Versuchen vitale Jurkat-

Diskussion 82

Zellen nicht von den RAW264.7-Makrophagen phagozytiert wurden, untermauert diese

Annahme. Die verringerte Aufnahme der NZ im Gegensatz zu AZ bestätigt frühere

Beobachtungen, die zeigen, dass RAW264.7-Makrophagen zum Studium der spezifischen

Aufnahme von NZ eher ungeeignet sind, da diese nur schlecht erkannt werden und unterstützt

die Annahme, dass bei der Phagozytose apoptotischer- und nekrotischer Zellen verschiedene

spezifische Mechanismen involviert sind (128). Weiterhin zeigten meine mikroskopischen

Untersuchungen, dass durch die von mir verwendete Methode zum Waschen der verwendeten

Makrophagen ein Einfluss von Bestandteilen der AZ auf die Versuchsergebnisse

ausgeschlossen werden kann.

Es ist bekannt, dass Makrophagen nach der Phagozytose von AZ ein verändertes

inflammatorisches Programm ausführen. Dies wird unter anderem durch eine verminderte

Produktion inflammatorischer Faktoren wie TNFα oder NO (3, 35), sowie einer erhöhten

Freisetzung anti-inflammatorischer Substanzen wie z.B. TGFβ1 und PGE2 deutlich (9). Die

Fähigkeit von AZ, die LPS/IFNγ-induzierte Nitritproduktion in Makrophagen zu inhibieren,

konnte in meinen Studien bestätigt werden. Dies belegt die Eignung des Testsystems zur

Untersuchung der Makrophagenveränderung vom pro- zum anti-inflammatorischen Phänotyp.

Mein Testsystem wurde weiterhin verifiziert durch den Befund, dass TGFβ - wie in der

Literatur beschrieben - in der Lage ist, die LPS/IFNγ-induzierte NO-Produktion zu hemmen

(76).

Zusammenfassend kann man sagen, dass das von mir gewählte Modellsystem zur

Untersuchung anti-inflammatorischer Effekte von AZ auf Makrophagen geeignet ist. Die AZ

wurden wie erwartet phagozytiert und bekannte pro- und anti-inflammatorische Effekte

vergangener Arbeiten konnten reproduziert werden.

4.2 Inhibition der ROS-Produktion in Makrophagen nach AZ-Kontakt

Die Formierung der NADPH-Oxidase und die darauf folgende ROS-Produktion kann als

Marker der Makrophagenaktivierung angesehen werden und stellt eine wichtige Komponente

der antibakteriellen Aktivität von Phagozyten dar (43). Eine Aktivierung der Membran-

gebundenen NADPH-Oxidase setzt eine PKCα-Aktivierung voraus, die eine

Phosphorylierung von p47phox und dadurch die Formierung des Oxidasekomplexes bewirkt

Diskussion 83

(46). Nach Aktivierung translokalisiert PKCα an die Plasmamembran. Dies kann als

korrelativer Marker für die Kinaseaktivierung angesehen werden (129).

Meine Daten erweitern das Wissen über die Fähigkeit von AZ, die TPA-induzierte ROS-

Produktion im Makrophagen zu hemmen und werden durch jüngste Berichte unterstützt, dass

AZ den ‚oxidative burst’ in RAW264.7-Zellen hemmen (37). In den von mir durchgeführten

Experimenten korrelierte die ROS-Produktion mit der unveränderten zytosolischen PKCα-

Expression, was darauf schließen lässt, dass in Anwesenheit von AZ keine TPA-induzierte

Kinaseaktivierung mehr stattfindet. Dies legt den Schluss nahe, dass der primäre Schritt der

NADPH-Oxidaseformation, die PKCα-Aktivierung, inhibiert wurde. Interessanterweise war

nach einer Behandlung der Makrophagen mit TGFβ keine Abnahme der

Sauerstoffradikalproduktion zu beobachten. Daraus lässt sich schließen, dass andere

Signalwege als bei der TGFβ-vermittelten Inhibition der NO-Produktion involviert sind.

Obwohl TGFβ als ein Hauptregulator der AZ-induzierten Makrophagenreprogrammierung

angenommen wurde (9, 35), befassten sich diese Arbeiten meist mit Langzeiteffekten der AZ-

Makrophagenwechselwirkung. Andere Studien zeigten hingegen, dass TGFβ keinen Einfluss

auf initiale anti-inflammatorische Antworten von Makrophagen hat, wie zum Beispiel die

Hemmung der NFκB-Aktivierung (121). Dies steht im Einklang mit meiner Beobachtung,

dass TGFβ für die frühe Regulation der Makrophagen-ROS-Produktion nach Kontakt mit AZ

keine Rolle spielt, sowie dem Befund, dass die Modulation der anti-inflammatorischen

Antwort von Makrophagen nicht notwendigerweise translationell reguliert wird (121). Dies

wirft die Frage nach frühen Signalen auf, die direkt auf Makrophagen einwirken, um die

Regulation einer inflammatorischen Makrophagenantwort zu beeinflussen.

Eine stetig wachsende Anzahl an Veröffentlichungen weist auf eine wichtige Rolle von

PPARγ in der Modulation der Immunantwort in Makrophagen hin. So konnte z.B. gezeigt

werden, dass PPARγ-spezifische Liganden sowohl die Produktion von inflammatorischen

Zytokinen wie TNFα oder IL-1β, als auch die iNOS-Expression (56) oder MMP9 (134)

inhibieren können. Eine Aktivierung von PPARγ kann durch verschiedene ungesättigte,

gesättigte oder verzweigte Fettsäuren einschließlich Metaboliten der Arachidonsäure-Kaskade

induziert werden (61). Die immunosuppressiven Effekte von PPARγ werden zum größten Teil

durch dessen Fähigkeit zur Transrepression verschiedener Transkriptionsfaktoren wie z.B.

NFκB, STATs oder NFAT vermittelt. Man könnte annehmen, dass die Erkennung

apoptotischer Zellen zur Generierung Lipid-basierender Signale führt, die für eine PPARγ-

Aktivierung notwendig sind. Diese Hypothese wird unterstützt durch den Befund, dass eine

Diskussion 84

Aufnahme von oxidierten Lipoproteinen (oxLDL), die zumindest teilweise unter Beteiligung

derselben Rezeptoren abläuft, die auch bei der Aufnahme von AZ eine Rolle spielen (z.B.

CD36), zu einer Aktivierung von PPARγ führt (135, 136). In der Tat gibt es Beweise für die

Oxidation von Lipidkomponenten in der äußeren Membran apoptotischer Zellen wie z.B.

PtdSer (137), die essentiell für die Phagozytose apoptotischer Zellen sind (138). Man könnte

also spekulieren, dass oxidierte Lipidkomponenten von AZ in Analogie zu oxidierten

Lipidkomponenten von oxLDL für die von mir beobachtete PPARγ-Aktivierung

verantwortlich sind und dass diese Signale ebenfalls über CD36 weitergeleitet werden.

Außerdem konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass AZ Phospholipide wie

Lysophosphatidylcholin (LPC) freisetzen und so das Verhalten von Makrophagen

beeinflussen können (139). Interessanterweise gibt es auch einige Arbeiten, die postulieren,

dass oxidierte Eicosanoide (140) oder Phospholipide wie z.B. Lysophosphatidylsäure (LPA)

(141, 142) zu einer Aktivierung von PPARγ führen können und so mögliche

Aktivierungssignale nach AZ-Kontakt darstellen.

Meine hier vorliegende Arbeit an Makrophagen zeigt eine schnelle und transiente Aktivierung

von PPARγ innerhalb der ersten Stunde nach AZ-Kontakt, die mit einer Hemmung der ROS-

Produktion und Inhibition der TPA-vermittelten Aktivierung von PKCα korreliert. Eine

direkte Rolle von PPARγ konnte ich in d/n PPARγ-exprimierenden RAW264.7-Makrophagen

nachweisen. Diese Zellen bildeten nach Kontakt mit AZ und Stimulation mit TPA weiterhin

ROS und zeigten eine verminderte zytosolische Expression von PKCα. Es ist interessant, dass

bereits früher berichtet wurde, dass Rosiglitazon, ein bekannter PPARγ-Aktivator, partiell die

oxLDL-induzierte PKCα-Aktivierung zu hemmen vermag (143) und PKCδ-vermittelte

Signalwege inhibiert (144). Die zentrale Rolle der PKCα in der Regulation des Makrophagen

‚oxidative burst’ nach AZ-Kontakt wird noch durch die Tatsache unterstrichen, dass in

PKCα-überexprimierenden Zellen nach Stimulation mit TPA und AZ keine Hemmung der

ROS-Produktion vorliegt. Zur Zeit liegen keine detaillierten Kenntnisse über den

Mechanismus vor, wie PPARγ die PKCα-Aktivierung und damit die Formierung des

NADPH-Oxidasekomplexes hemmen könnte. Dieser Punkt wird in der Zukunft Gegenstand

weiterer Untersuchungen sein müssen. Als mögliche Mechanismen könnte man jedoch

direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen von PPARγ und PKCα und/oder Veränderungen

im Grad der PKCα-Phosphorylierung durch Stimulation von Phosphatasen oder Inhibition

von Kinasen annehmen und entsprechend untersuchen (Abbildung 4.1). Kürzlich konnten

direkte Wechselwirkungen von PPARα mit anderen zytosolischen Proteinen gezeigt werden

Diskussion 85

(145), was die Annahme zulässt, dass ein ähnlicher Mechanismus der Hemmung der PKCα

durch PPARγ zugrunde liegt.

Abbildung 4.1: Mögliche spekulative Mechanismen zur Inhibition von PKCα durch PPARγ. (a) PPARγ

bindet direkt an PKCα und hemmt so die Phosphorylierung von p47phox (vgl. Abbildung 1.4b). (b) PPARγ führt

zur Inhibition von Kinasen oder Aktivierung von Phosphatasen, die den Phosphorylierungsstatus und damit die

Aktivität von PKCα beeinflussen (vgl. Abbildung 1.4c).

Neben der kurzzeitigen Aktivierung und der damit verbundenen Hemmung der ROS-

Produktion, wie in meiner vorliegenden Arbeit beschrieben, zeigen andere Arbeiten eine

Beteiligung von PPARγ in der Langzeitregulation der ROS-Bildung. Aktivierung von PPARγ

über einen Zeitraum von 24 h korrelierte mit einer Expressionsverminderung von NADPH-

Oxidasekomponenten wie p22phox (146) und/oder p47phox (71) und stellt damit einen

alternativen Mechanismus zur Regulation der Sauerstoffradikalproduktion dar. Dies könnte

als spätere Reaktion auf die Erkennung von AZ in Makrophagen in Frage kommen, und auch

diese Hypothese wird in Zukunft Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. Die Kontroverse,

ob RAW264.7-Makrophagen tatsächlich PPARγ exprimieren, wird in zahlreich vorhandener

Literatur beigelegt, die zeigt, dass diese Zellen sowohl PPARγ-mRNA (59, 147), als auch

Diskussion 86

Protein (148) exprimieren und ebenso durch eine Aktivierung von PPARγ als Antwort auf

LPS/IFNγ (119). Sowohl meine EMSA- und Reporteruntersuchungen, als auch die

Eliminierung PPARγ-abhängiger Effekte durch Transduktion einer d/n PPARγ-Mutante

bestätigen diese Befunde. Eine Übersicht über den Mechanismus der Aktivierung des

NADPH-Oxidasekomplexes und die sich aus meinen Daten ergebende Rolle von PPARγ ist

in Abbildung 4.2 dargestellt.

Abbildung 4.2: TPA-vermittelte Aktivierung des NADPH-Oxidasekomplexes in Phagozyten und der

Einfluss von AZ. Eine TPA-vermittelte Aktivierung der PKCα führt zu einer Phosphorylierung von p47phox mit

anschließender Formierung des NADPH-Oxidasekomplexes und damit zu einer Sauerstoffradikalproduktion.

Durch AZ aktiviertes PPARγ inhibiert die Aktivierung der PKCα. Der genaue Mechanismus hierfür ist unklar,

basiert aber wahrscheinlich auf direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen oder Veränderungen des

Phosphorylierungsstatus. Unsicher ist auch, wie es zu einer Aktivierung von PPARγ kommt. Lipidbasierende

Signale stellen hier jedoch einen möglichen Stimulus dar.

Vermutungen folgend, dass von AZ sekretierte lösliche Faktoren das Verhalten von

Makrophagen beeinflussen können (4), führte ich Transwell-Experimente durch, welche die

Beteiligung parakriner Signale ausschlossen. Weitere Experimente mit dem

Phagozytoseinhibitor Cytochalasin D lassen darauf schließen, dass Zell-Zell-Kontakte

Diskussion 87

zwischen AZ und RAW264.7-Makrophagen und nicht der Vorgang der Phagozytose selbst

notwendig sind, um die verminderte Sauerstoffradikalproduktion zu vermitteln. Diese

Beobachtung wird durch andere Arbeiten unterstützt, die zeigen, dass die Bindung

apoptotischer Zellen an Makrophagen ausreicht, um anti-inflammatorische Effekte zu

vermitteln (121). Die Annahme, dass die Erkennung apoptotischen Materials in humanen und

murinen Zellen konserviert ist (32, 133), konnte ich dadurch untermauern, dass die

Modulation der PKCα-Aktivierung durch AZ und nach Stimulation mit TPA nicht nur in

RAW264.7-Zellen, sondern auch in primären humanen Makrophagen zu beobachten war. Der

Befund, dass die ROS-Produktion zu späteren Zeitpunkten (d.h. 6 h Coinkubation mit AZ)

nicht komplett gehemmt war, obwohl die PKCα zu dieser Zeit translokalisiert und damit

aktiviert vorlag, deutet auf einen weiteren, späten Mechanismus zur Hemmung der

Sauerstoffradikalbildung hin und schließt PKCα als ausschließlich verantwortlichen Faktor

aus. Unterstützt wird diese Annahme zusätzlich dadurch, dass in d/n PPARγ-Makrophagen

die späte Hemmung des ‚oxidative burst’ ebenfalls zu beobachten war. Es liegt also

offensichtlich ein früher PPARγ-abhängiger und ein später PPARγ-unabhängiger

Hemmungseffekt vor.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Bindung von AZ an Human- oder

Mausmakrophagen die TPA-vermittelte Aktivierung von PKCα inhibiert und so die NADPH-

Oxidaseaktivität und die damit verbundene ROS-Bildung verhindert. Dies wird unterstützt

durch die Aufhebung dieses Effekts in PKCα-überexprimierenden Zellen. Die frühe - aber

nicht die späte - Phase der ROS-Inhibition verläuft PPARγ-vermittelt, was dadurch deutlich

wird, dass in d/n PPARγ-Makrophagen der frühe Hemmungseffekt ausblieb. Dies zeigt

erstmals, dass PPARγ an der Reprogrammierung von Makrophagen nach Erkennung von

apoptotischem Material beteiligt ist.

4.3 Arginase II-vermittelte Inhibition der NO-Produktion

Wie die Sauerstoffradikalbildung, kann auch die NO-Produktion als ein Marker der

klassischen Makrophagenaktivierung angesehen werden, die eine fundamentale Komponente

von deren phagozytischen, antibakteriellen und tumoriziden Aktivitäten darstellt. Während

meiner Promotion beschäftigte ich mich auch mit AZ-vermittelten molekularen

Diskussion 88

Mechanismen, die zur Hemmung der NO-Produktion in klassisch, d.h. durch IFNγ-

aktivierten, Makrophagen führen. Während meiner Arbeit konnte ich den Befund einer AZ-

vermittelten Hemmung der NO-Produktion (35, 36, 149) bestätigen und zeigen, dass AZ

diesen Effekt durch eine Erhöhung der Arginase II-Aktivität ohne Beeinflussung der iNOS-

Expression hervorrufen. Unerwarteterweise wurde dieser Effekt, im Gegensatz zur Inhibition

der ROS-Produktion, bei der Zell-Zell-Kontakte beteiligt sind (siehe 4.2), durch einen von AZ

sekretierten löslichen Faktor vermittelt.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, wie eine Inhibition der NO-Produktion zustande

kommen kann: Neben einer Modulation der iNOS-Expression und mRNA durch TGFβ (76),

inhibitorischen Proteinen wie NAP-110 (150) oder Kalirin (78) wurde auch eine Modulation

der NO-Produktion über die Verfügbarkeit des iNOS-Substrats L-Arginin beschrieben (79,

80). In meinen Experimenten weisen die Erhöhung der Arginase II-mRNA und des Proteins,

die erhöhte Arginase-Aktivität sowie die Fähigkeit von nor-NOHA, die Hemmung der NO-

Produktion zumindest partiell rückgängig zu machen, darauf hin, dass AZ die IFNγ-induzierte

NO-Produktion über einen Arginase-abhängigen Mechanismus inhibieren. Die limitierte

Substratverfügbarkeit für die iNOS durch Erhöhung der Arginaseexpression ist also wichtig

für die Regulation der NO-Produktion in iNOS-exprimierenden Makrophagen.

Die Beobachtung, dass offenbar von AZ sekretierte Signalstoffe als potentielle Regulatoren

der Arginaseaktivität in Frage kommen, ist unerwartet und sehr interessant. Frühere Arbeiten

lassen vermuten, dass die Fähigkeit apoptotischer Zellen, die NO-Produktion in murinen

Peritonealmakrophagen zu inhibieren, TGFβ-vermittelt ablaufen könnte (35). Die Autoren

vermuteten eine TGFβ-abhängige Verschiebung des L-Arginin-Metabolismus in Richtung

Polyaminbiosynthese und eine dadurch vermittelte Hemmung der NO-Produktion. Diese

Ergebnisse basierten auf der Arbeit von Boultard et al. (151), der eine TGFβ-vermittelte

Induktion der Arginase oder eine Induktion von Faktoren vorschlug, die die Substrataffinität

der Arginase beeinflussen könnten. Allerdings beobachteten die Autoren, dass die Hemmung

der NO-Produktion in Peritonealmakrophagen aus der Ratte früher auftrat als die TGFβ-

vermittelte erhöhte Arginaseaktivität. Sie vermuteten einen frühen und einen späten

Mechanismus, von denen nur der spätere Arginase-vermittelt sei. Da ich eine sehr frühe

Arginaseinduktion beobachten konnte, ist eine Beteiligung von TGFβ folglich recht

unwahrscheinlich. Darüber hinaus konnte kürzlich eine andere Arbeitsgruppe - in

Übereinstimmung mit meinen Ergebnissen - zeigen, dass in RAW264.7-Makrophagen TGFβ

allein nicht zu einer Erhöhung der Arginaseexpression führt (89). Auch wenn ich einen

Einfluss von TGFβ bei der AZ-vermittelten Hemmung der NO-Produktion in RAW264.7-

Diskussion 89

Makrophagen nicht gänzlich ausschließen kann, zeigen meine Daten, dass die Arginase II-

vermittelte Inhibition der NO-Bildung nach Stimulation mit AZ TGFβ-unabhängig abläuft.

Meine Experimente zeigten, das KM für die Hemmung der IFNγ-vermittelten NO-Produktion

ausreicht und nicht, wie etwa bei der Hemmung der ROS-Produktion, Zell-Zell-Kontakte

zwischen AZ und Makrophagen notwendig sind. Dafür scheint ein von AZ sekretierter

löslicher Faktor verantwortlich zu sein, der zu einer Erhöhung der Arginase II-Expression

führt. Die Freisetzung löslicher Faktoren durch AZ wie z.B. das anti-inflammatorische

Zytokin IL-10 (4) oder Caspase-3-vermittelte Freisetzung lipidbasierender, chemokiner

Signale (139), die Makrophagen zu AZ leiten, wurden bereits in der Vergangenheit

beschrieben. Meine Daten werden weiterhin durch jüngste Western Blot-Daten aus unserem

Labor bestätigt (Daten nicht dargestellt). Diese zeigen, dass eine Zunahme der Arginase II-

Proteinexpression durch KM induziert wird. Weiterführende Studien werden die Identität des

Arginase II-induzierenden Faktors klären müssen und mögliche Signalmechanismen

untersuchen. Abbildung 4.3 zeigt den von mir vorgeschlagenen Ablauf der Inhibition der

IFNγ-induzierten NO-Produktion in Makrophagen nach Costimulation mit AZ durch erhöhte

Arginase II-Expression.

Im Gegensatz zum klassischen, durch LPS oder IFNγ-vermittelten, pro-inflammatorischen

Makrophagentyp (M1-Phänotyp), scheinen AZ einen alternativ aktivierten, anti-

inflammatorischen Makrophagenphänotyp zu vermitteln, der dem M2-Phänotyp, wie er als

Antwort auf TH2 Zytokine beschrieben wurde, sehr ähnelt (152, 153). In diesem

Zusammenhang wurde auch bereits beschrieben, dass Zytokine wie z.B. IL-13, IL-4 oder IL-

10 zur Arginase I-Expression führen und/oder abhängig von der Intensität des entsprechenden

Stimulus, die iNOS-Proteintranslation supprimieren können und so die Bildung von NO

verhindern (72, 154). Dies weist auf regulatorische Aufgaben von sowohl Arginase I als auch

Arginase II unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen hin.

Zusammenfassend kann man sagen, dass die Freisetzung eines bis dato unbekannten Faktors

durch AZ, die IFNγ-induzierte NO-Produktion in Makrophagen via Induktion der Arginase II-

Expression inhibiert. Die Arginase II reduziert dabei die Verfügbarkeit des iNOS-Substrats L-

Arginin ohne die iNOS-Proteinexpression zu beeinflussen und führt so zur verminderten NO-

Formation. Meine Ergebnisse zeigen erstmals, dass eine erhöhte Expression der Arginase II

an der Reprogrammierung von Makrophagen nach Erkennung eines von AZ sekretierten

Faktors beteiligt ist.

Diskussion 90

Abbildung 4.3: Inhibition der IFNγ-induzierten NO-Produktion durch AZ. Apoptotische Zellen sekretieren

einen oder mehrere noch unbekannte Faktoren, die zu einer erhöhten Arginase II-Expression in Makrophagen

führen und so den L-Arginin-Stoffwechsel in Richtung Polyaminbiosynthese verschieben. Durch Stimulation mit

IFNγ wird die iNOS zwar induziert, dies führt jedoch nicht zu einer Erhöhung der Produktion von NO und

Citrullin, da das dazu von der iNOS benötigte Substrat fast vollständig von der Arginase II verbraucht wird und

somit der iNOS nicht mehr zur Verfügung steht. Dafür werden vermehrt Polyamine produziert, die ihrerseits die

iNOS-Expression regulieren und den Hemmeffekt noch verstärken könnten. Eine erhöhte Polyaminbiosynthese

und Expression der ODC wurde bereits früher im Zusammenhang mit Stimulation durch AZ gezeigt (35). Die

Autoren vermuteten hier jedoch einen TGFβ-induzierten autokrinen Effekt. Eine Beteiligung von TGFβ bei der

Erhöhung der Arginase II-Expression ist jedoch aufgrund der von mir durchgeführten quantitativen PCR

weitestgehend auszuschließen.

4.4 COX-2-Expression in Makrophagen nach AZ-Stimulation

Einer der Faktoren, der schon früh für die Vermittlung anti-inflammatorischer Effekte nach

der Phagozytose von AZ verantwortlich gemacht wurde, ist das Prostaglandin PGE2 (9), das

hauptsächlich über die COX als Folge des Arachidonsäureabbaus (Abbildung 1.6) gebildet

wird (97). In der Tat konnten bereits frühere Arbeiten zeigen, dass eine Inhibition der COX-2

von AZ-induzierte anti-inflammatorische Effekte aufzuheben vermag (35) und auch in

Diskussion 91

unserem Labor vermochte eine Inhibition der COX-2 die AZ-vermittelte PGE2 Produktion

aufzuheben (nicht veröffentlichte Daten). Dennoch existieren darüber hinaus bis heute keine

Erkenntnisse oder Arbeiten, die sich mit der AZ-vermittelten COX-2-Induktion und/oder

deren zugrunde liegenden Mechanismen befassen. In der hier vorliegenden Arbeit, die eine

Vertiefung des Verständnisses des bei der Ausbildung eines anti-inflammatorischen

Makrophagenphänotyps nach der Phagozytose apoptotischer Zellen beteiligten Signalwegs

bezwecken sollte, beschäftigte ich mich daher fast zwangsläufig auch mit möglichen COX-2-

Regulationsmechanismen. Dabei konnte ich sowohl durch 3´-UTR-Luziferasereportergen-

Assays, als auch durch Western Blot-Versuche und quantitative PCR zeigen, dass eine

Costimulation von RAW264.7-Makrophagen mit AZ eine sehr schnelle Zunahme von

COX-2-Protein zur Folge hat und dies über einen noch unbekannten mRNA-stabilisierenden

Mechanismus geschieht. Dieser Effekt wird überraschenderweise, wie schon die Arginase II-

Expression und die damit verbundene Inhibition der NO-Produktion (siehe 4.3), von einem

bis dato unbekannten, von AZ sekretierten löslichen Faktor vermittelt.

Während meiner Arbeiten konnte ich nach Inkubation von Makrophagen mit AZ eine

wesentlich schnellere Induktion von COX-2-Protein (nach 1 h) als mit IFNγ (frühestens nach

4 h) feststellen. Dies lässt auf unterschiedliche zugrunde liegende Regulationsmechanismen

schließen. Frühere Studien, die sich mit den Effekten von Serum, Zytokinen und

Glukokortikoiden auf die COX-2-Expression befassten, konnten bereits zeigen, dass eine

Stabilisierung der COX-2-mRNA einen potentiell wichtigen Regulationsmechanismus dieses

Proteins darstellt (97). Verantwortlich dafür sind multiple Kopien des AUUUA-Elements in

der 3´-UTR des COX-2-Gens (101). Meine Ergebnisse bezüglich der mRNA-

Stabilisierung unterstützen die Theorie, dass solche post-transkriptionellen COX-2-

Regulationsmechanismen auch in RAW264.7-Makrophagen eine wichtige Rolle spielen

(106). Heute ist eine Vielzahl möglicher mRNA-stabilisierender und destabilisierender

Faktoren bekannt (105), von denen unter anderem TIAR, AUF1, HuR, und TIA-1 bereits mit

der post-translationellen Regulation der COX-2 in Verbindung gebracht wurden (106, 155).

Im Zusammenhang mit Zellstimulation durch Taxane wurde in der Vergangenheit eine unter

anderem durch p38-MAPK und ERK1/2-vermittelte Stabilisierung der COX-2-mRNA durch

HuR angenommen (102). Interessanterweise deuten jüngste Ergebnisse aus unserem Labor

darauf hin, dass eine Inhibition der p38-MAPK die AZ-vermittelte COX-2-Expression

zumindest teilweise inhibiert (Daten nicht dargestellt). Dadurch liegt die Vermutung nahe,

dass ähnliche Mechanismen an dem von mir beobachteten Phänomen beteiligt sein könnten.

Eine genaue Untersuchung der zur mRNA-Stabilisierung führenden Mechanismen und der

Diskussion 92

beteiligten mRNA-stabilisierenden Faktoren wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein

müssen. Auch wenn der Mechanismus der mRNA-Stabilisierung über viele Faktoren

vermittelt wird, die in ihrer Wirkung scheinbar relativ spezifisch sind (105), könnte man

spekulieren, dass es sich dabei um einen grundlegenden Mechanismus zur Entfaltung von

anti-inflammatorischen Kurzzeiteffekten nach der Erkennung von AZ durch Makrophagen

handelt, durch den auch die Expression anderer immunologisch relevanter Proteine reguliert

wird. Studien zur Sequenzkonservierung in der 3´-UTR von Vertebraten zeigten, dass über

30% der Vertebraten-mRNAs konservierte Elemente (definiert als über 70%

Übereinstimmung) in dieser Region aufweisen (156). Dies könnte darauf hinweisen, dass weit

mehr Proteine als bis heute bekannt über mRNA-stabilisierende Mechanismen reguliert

werden. In der Tat weisen jüngste, noch unveröffentlichte Ergebnisse aus unserer

Arbeitsgruppe - wie z.B. eine sehr schnelle Arginase II-Proteinzunahme - darauf hin, dass die

schnelle Expression verschiedener Faktoren nach Erkennung von AZ über einen ähnlichen

Mechanismus abläuft.

Zusammenfassend kann man also sagen, dass es in Makrophagen nach der Erkennung eines

von AZ sekretierten unbekannten Faktors zu einer sehr schnellen Erhöhung der COX-2-

Proteinmenge kommt. Dies wird über einen noch unbekannten Mechanismus, der zur COX-2-

mRNA-Stabilisierung beiträgt, vermittelt.

Zusammenfassung 93

5 Zusammenfassung

Die Phagozytose apoptotischer Zellen ist ein essentieller Schritt bei der Embryogenese und

dem Erhalt der Gewebehomöostase. Phagozyten beseitigen dabei nicht nur die sterbenden

Zellen und verhindern damit eine Freisetzung immunogener zellulärer Bestandteile ins

umliegende Gewebe, sondern unterdrücken aktiv pro-inflammatorische Antworten, wie die

Sekretion von TNFα oder die Produktion von NO. Das Wissen über die zugrunde liegenden

Prozesse und Mechanismen ist derzeit noch lückenhaft. Auch wenn bereits eine Vielzahl von

beteiligten Rezeptoren und Reaktionen der Phagozytenzellen auf AZ bekannt sind, sind die

verantwortlichen und vermutlich sehr komplexen Signalwege noch relativ wenig erforscht.

Die Produktion von kleinen reaktiven Molekülen wie NO oder ROS durch Makrophagen ist

ein grundlegender und initialer Schritt zur Bekämpfung von Pathogenen. Zu Beginn meiner

Promotion lagen noch keinerlei Daten bezüglich eines Einflusses apoptotischen Materials auf

die ROS-Produktion aktivierter Makrophagen vor. Der grundlegende anti-inflammatorische

Makrophagenphänotyp nach der Phagozytose von AZ führte zu meiner Hypothese, dass auch

diese durch AZ beeinflusst würde. Diese Überlegung bildete den Ausgangspunkt für meine

Studien:

• Zunächst gelang es mir ein geeignetes Testsystem zur Untersuchung anti-

inflammatorischer Effekte im Makrophagen nach der Phagozytose von AZ zu

etablieren. Dabei konnte ich zeigen, dass die von mir verwendeten apoptotischen

Jurkat-Zellen von murinen RAW264.7-Makrophagen aufgenommen werden und deren

pro-inflammatorische Antwort, gemäß der vorhandenen Literatur, zu hemmen

vermögen.

• In durchflusszytometrischen Untersuchungen konnte ich mittels eines Redox-

sensitiven Farbstoffs zeigen, dass AZ im Gegensatz zu NZ oder VZ die TPA-

vermittelte ROS-Produktion in Makrophagen inhibieren. Sowohl durch EMSA und

Western Blot-Analysen, als auch durch die Verwendung von d/n PPARγ und PKCα-

überexprimierenden Makrophagen, konnte ich nachweisen, dass die initiale Hemmung

des ‚oxidative burst’ (innerhalb einer Stunde) über eine PPARγ-induzierte Inhibition

der PKCα-vermittelt wird. Für diese reicht eine Bindung von AZ an die Makrophagen

Zusammenfassung 94

aus, während zu späteren Zeitpunkten andere, noch unbekannte Faktoren involviert zu

sein scheinen. Dieser Mechanismus scheint auch in primären humanen Makrophagen

von Bedeutung zu sein.

Die Beobachtung, dass es nach der Behandlung aktivierter Makrophagen mit AZ zu einer

verminderten IFNγ-vermittelten NO-Produktion bei stark exprimierter iNOS kommt, ließ die

Theorie zu, dass nicht - wie bisher vermutet - TGFβ für diesen Effekt verantwortlich ist. Auch

hier gelang es mir, neue Erkenntnisse über den zugrunde liegenden Mechanismus der AZ-

vermittelten NO-Inhibition zu erlangen:

• Mittels eines Aktivitäts-Assays und durch Einsatz des spezifischen Arginaseinhibitors

nor-NOHA konnte ich zeigen, dass der Einfluss von AZ auf aktivierte Makrophagen

nicht etwa deren iNOS-Aktivität verringert, sondern vielmehr aus einer erhöhten

Arginaseaktivität resultiert. Diese führt scheinbar zu einer verminderten

Substratverfügbarkeit für die iNOS und hemmt so die NO-Produktion. Western Blot-

und quantitative PCR-Versuche zeigten eine erhöhte Arginase II-Expression nach

Stimulation mit AZ (nicht aber mit TGFβ), welches ebenfalls meine Theorie

unterstützt. Ferner konnte ich durch den Einsatz von KM zeigen, dass ein noch

unbekannter von AZ sekretierter löslicher Faktor für die Hemmung der NO-

Produktion verantwortlich ist.

Die Beobachtung einer sehr frühen COX-2-Expression nach der Inkubation von Makrophagen

mit AZ und das Nichtvorhandensein entsprechender Beobachtungen in der Literatur führten

dazu, dass ich mich im letzten Teil meiner Arbeit mit dem hierfür verantwortlichen

Mechanismus befasste:

• Unter Verwendung eines Lucziferase-Assays, bei dem das Luziferasegen mit der

3´-UTR oder AREs des COX-2-Gens gekoppelt war, konnte ich zeigen, dass - wie

schon bei der Inhibition der NO-Produktion durch die Arginase II - ein von AZ

sekretierter löslicher Faktor für eine schnelle, AZ-spezifische und

höchstwahrscheinlich durch COX-2-mRNA-Stabilisierung vermittelte Protein-

expression verantwortlich war. Eine schnelle Erhöhung der COX-2-mRNA nach AZ-

Stimulus und jüngste Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe, welche eine erhöhte

COX-2-mRNA-Halbwertszeit zeigen, unterstützen diese Hypothese.

Zusammenfassung 95

Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in Abbildung 5.1 dargestellt.

Abbildung 5.1: Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse.

Die von mir gewonnenen neuen Erkenntnisse über die Makrophagenreprogrammierung nach

der Erkennung von AZ tragen zu einem tieferen Verständnis der zugrunde liegenden

Signalwege und Mechanismen bei.

Es besteht die hoffnungsvolle Aussicht, dass das Verstehen und die Manipulation der

ablaufenden Prozesse bei der Phagozytose von AZ eines Tages neue Therapiemöglichkeiten

zur Behandlung von Infektions- und Autoimmunkrankheiten auf der einen Seite und

verbesserte Strategien zur Bekämpfung von Krebs auf der anderen Seite ermöglichen werden.

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Anhang

Anhang

A1 Danksagung

Ich möchte mich bei allen Personen bedanken, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen

haben, insbesondere bei:

Prof. Bernhard Brüne für die Vergabe des Themas, die Zurverfügungstellung des

Arbeitsplatzes und die fachkundige Betreuung sowie für konstruktive Kritik und ständige

Diskussionsbereitschaft.

Dr. Andreas von Knethen für die intensive Betreuung und die hervorragende moralische

Unterstützung in finsteren Zeiten sowie für das ausgezeichnete Arbeitsklima in der Gruppe,

das so manchen missratenen EMSA oder Western Blot wieder wettmachte.

Meiner Familie, die mir mein Studium ermöglichte, mich stets sowohl finanziell als auch

moralisch unterstützte und meine Launen während der Promotion ertragen musste.

Kirstin Schäfer für die Hilfe bei der Korrektur und den seelischen Beistand während des

Zusammenschreibens der Arbeit und dafür, dass sie für mich da war, als ich sie brauchte.

Allen meinen Labormitstreitern für die schöne Zeit und die stetige Hilfe bei der Lösung

von Problemen, seien sie nun privater oder geschäftlicher Natur.

Meinen Freunden, die mich bei Bedarf wieder aufrichteten und stets Verständnis für die

teilweise mangelnde Zeit aufbrachten, die ich für sie übrig hatte.

Anhang

A2 Curriculum Vitae

Name: Axel Martin Johann

Anschrift: Jean-Ganss-Str. 30, 67227 Frankenthal

Telefon: (06233) 42633, 0174-9617382

e-mail [email protected]

Geburtstag: 19. März 1974

Geburtsort: Ludwigshafen (Rhein)

Familienstand: ledig

Ausbildung:

1980-1984 Friedrich-Ebert Grundschule, Frankenthal

1984-1989 Friedrich-Ebert Hauptschule, Frankenthal

1989-1990 Robert-Schumann Hauptschule, Frankenthal:

10. Klasse, Mittlere Reife

1990-1994 Boehringer Mannheim:

Ausbildung zum Chemielaboranten

1994-1996 Carl-Benz Schule, Mannheim (Technische Oberschule):

Fachgebundene Hochschulreife

1996-2001 Technische Universität Kaiserslautern:

Studium der Biologie mit Abschluss: Diplom-Biologe

seit 02/2002 Technische Universität Kaiserslautern:

Beginn des Promotionsstudiums, Institut für Zellbiologie

02/2006 Voraussichtliches Ende der Promotion

Frankfurt, Dezember 2005

Anhang

A3 Publikationen

Johann, A. M. , A. von Knethen, D. Lindemann und B. Brüne 2005. Recognition of apoptotic

cells by macrophages activates the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and

attenuates the oxidative burst. Cell Death Differ. in Press

Anhang

A4 Erklärung

Hiermit versichere ich, dass die vorliegende Dissertation von mir in allen Teilen selbständig

angefertigt wurde und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt

wurden.

Darüber hinaus erkläre ich, dass die Dissertationsschrift weder vollständig, noch teilweise,

einer anderen Fakultät mit dem Ziel vorgelegt wurde, einen akademischen Grad zu erwerben.

Kaiserslautern, den 26.11.2003

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