Untersuchungen zur Cyclooxygenase-abhängigen Nephrogenese ... · Diese wird beim menschlichen...

Aus dem Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. H.W. Seyberth

Jetzt: Prof. Dr. R.F. Maier

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

AG Molekulare und Experimentelle Pharmakologie

Leiter: Prof. Dr. R.M. Nüsing

(jetzt: Klinische Pharmakologie, Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt)

in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH,

Standort Marburg

Untersuchungen zur Cyclooxygenase-abhängigen

Nephrogenese bei der Maus

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin

dem Fachbereich Medizin der

Philipps-Universität Marburg

vorgelegt

von

Andreas Herud

aus Offenbach am Main

Marburg, 2008

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 26.02.09.

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund

Referent: Prof. Dr. R.M. Nüsing

Korreferent: PD Dr. U. Kuhlmann

Inhaltsverzeichnis I_____________________________________________________________________________________________________________

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung ……………………………………………………...1

I.1. Die physiologische Nierenentwicklung ��...................1

I.2. Einfluss von NSAIDs auf die Nephrogenese ��..��.8

I.3. Die Cyclooxygenase ��.....9

I.4. Das COX-2-/--Mausmodell .��...13

I.5. Prostaglandin-Rezeptoren .��16

I.6. Ziel der Arbeit ��19

II. Material und Methoden ……………………………………...20

II.1. Material ��...20

II.1.1. Chemikalien ��20

II.1.2. Medikamente ��...20

II.1.3. Enzyme und Primer ��.21

II.1.4. Instrumente und Apparaturen ��..21

II.1.5. Sonstige Materialien ��...22

II.1.6. Software ��..22

II.1.7. Tiere ��22

II.2. Methoden ��23

II.2.1. Spritzschema ��...23

II.2.2. Zusammensetzung der Medikamente ��.23

II.2.2.1. ONO AE1-329 (EP-4-Agonist) ................��23

II.2.2.2. ONO AE1-259-01 (EP-2-Agonist) ....�...........23

II.2.2.3. ONO AE1-329 (EP-4-Agonist) plus

ONO AE1-259-01 (EP-4-Agonist) ..................24

II.2.2.4. NOC-12 (NO-Donator) ...................................24

II.2.2.5. Spermine NONOate (NO-Donator) .................24

II.2.2.6. Troglitazone (PPAR�-Agonist) ........................25

Inhaltsverzeichnis II_____________________________________________________________________________________________________________

II.2.2.7. ONO AE3-208 (EP-4-Antagonist) ...................25

II.2.2.8. SC-236 (COX-2-Inhibitor) ...............................26

II.2.2.9. Parecoxib (COX-2-Inhibitor) ...........................26

II.2.2.10. GW 501516 (PPARd-Agonist) ........................26

II.2.2.11. Rofecoxib (COX-2-Inhibitor) (Tränke) …....…26

II.2.2.12. SC-236 (COX-2-Inhibitor) (Tränke) ………....26

II.2.2.13. Spermine NONOate (NO-Donator) (Tränke) ...26

II.2.3. Verabreichen der Medikamente ………………………….27

II.2.3.1. Spritzen der Mäuse ……………………………27

II.2.3.2. Versuche über die Tränke ……………………...27

II.2.4. Genotypisierung ………………………………………….28

II.2.4.1. Isolation der DNA .…………………………...28

II.2.4.2. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .…………..29

II.2.4.3. Gelzubereitung ………………………………...30

II.2.4.4. Gelelektrophorese ……………………………..30

II.2.5. Präparation der Mäuse ……………………………………32

II.2.6. Fixieren der Organe ………………………………………32

II.2.7. Parafineinbetten der Organe ……………………………...33

II.2.8. Schneiden der Organe ……………………………………34

II.2.9. Färben der Organe ………………………………………..34

II.2.10. Mikroskopieren der Organe ……………………………...36

II.2.11. Statistische Auswertung ………………………………….36

III. Ergebnisse …………………………………………………….37

III.1. COX-2-/- .………………………………………………………….37

III.1.1. Zusammenfassung der histomorphologischen Daten …....39

III.2. COX-2-Inhibitoren .……………………………………………...40

III.2.1. Applikation von SC-236 über die Tränke ..………..……...40

Inhaltsverzeichnis III_____________________________________________________________________________________________________________

III.2.1.1. Applikation von SC-236 intraperitoneal ……...43

III.2.1.2. Zusammenfassung der histomorphologischen

Daten ………………………………………….45

III.2.2. Applikation von Parecoxib …………….……………….45

III.2.3. Applikation von Rofecoxib ………………..……………47

III.2.4. Zusammenfassung der histomorphologischen Daten .….49

III.2.5. Vergleichende Zusammenstellung ……………………….49

III.3. PGE2-Rezeptoren ..……………………………………………….51

III.3.1. Applikation eines EP-2-Rezeptor-Agonisten ……………51


Daten ………………………………………....54

III.3.2. Applikation eines EP-4-Rezeptor-Agonisten ……....…….55


Daten ……………………….………………...58

III.3.3. Applikation von EP-2- plus EP-4-Rezeptor-Agonisten …..59


Daten ………………………….……………...61

III.3.4. Applikation eines EP-4-Rezeptor-Antagonisten ……..…...61


Daten ………………….……………………...63

III.3.5. Vergleichende Zusammenstellung ……………………….63

III.4. NO – Substanzen …………………………………………………65

III.4.1. Applikation von Spermine NONOate (NOC-22) ….……..65

III.4.1.1. Applikation von NOC-22 ab Tag E6 ….…..….68


Inhaltsverzeichnis IV_____________________________________________________________________________________________________________

Daten ��..��.70

III.4.2. Applikation von NOC-12 ��.��..70


Daten ��.��..72

III.4.3. Vergleichende Zusammenstellung ��.72

III.5. PPAR-Agonisten ..��.��.74

III.5.1. Applikation des PPAR�-Agonisten Troglitazone ��...74

III.5.2. Applikation des PPAR�-Agonisten GW501516 .�..�.�.75

III.5.3. Zusammenfassung der histomorphologischen Daten �.�77

III.5.4. Vergleichende Zusammenstellung ��.77

IV. Diskussion …………………………………………………….79

IV.1. Einfluss von COX-2-Inhibitoren auf die Nephrogenese ��...80

IV.2. Einfluss von EP-Agonisten auf die Nephrogenese .��...82

IV.3. Einfluss eines EP-4-Antagonisten auf die Nephrogenese ��.84

IV.4. Einfluss von NO-Substanzen auf die Nephrogenese ��.84

IV.5. Einfluss von PPAR-Agonisten auf die Nephrogenese ��..85

V. Zusammenfassung …………………………………………...88

VI. Literaturverzeichnis …………………………………………90

VII. Abkürzungsverzeichnis ………………….………...………..98

VIII. Anhang ……………………………………………….……..100

Inhaltsverzeichnis V_____________________________________________________________________________________________________________

VIII.1. Verzeichnis der akademischen Lehrer …………………………..100

VIII.2. Danksagung ……………………………………………………..100

Einleitung 1_____________________________________________________________________________________________________________

I. Einleitung

I.1. Die physiologische Nephrogenese

Das Genital-, und auch das Harnsystem mit Niere, entwickeln sich aus dem interme-

diären Mesoderm. In der 4. Woche beginnt der Embryo sich abzufalten. Dabei wird

das intermediäre Mesoderm nach ventral verlagert und in der Leistenregion entsteht

durch eine längliche Vorwölbung die Nierenleiste, die, zusammen mit der Genital-

leiste, die Urogenitalfalte bildet. Über ein Mesenterium, sind beide Leisten mit der

dorsalen Leibeswand verbunden.

Es entwickeln sich nun 3 Generationen von Nieren, die sich sowohl in ihrem lokalen

und zeitlichen Auftreten als auch in ihrem Differenzierungsgrad voneinander unter-

scheiden. Es findet sich ein Wachstum in kraniokaudaler Richtung und ein Über-

schneiden in der zeitlichen Abfolge, wobei nie alle drei Generationen gleichzeitig

angelegt sind. Dabei darf allerdings nicht der Eindruck entstehen, dass diese sich völ-

lig unabhängig voneinander entwickeln. So haben beispielsweise alle drei einen ein-

heitlichen Nierengang, der als Vornierengang entsteht, sich als Urnierengang bzw.

Wolff-Gang fortsetzt, und aus dem die spätere Ureterknospe entspringt, gemeinsam.

Im Einzelnen setzen sich die unterschiedlichen Nierengenerationen aus der Vorniere

(Pronephros), die der Niere einiger primitiver Fische entspricht, der Urniere (Meso-

nephros), die ähnlich der Niere von Amphibien und Fischen ist, und der Nachniere

(Metanephros) zusammen (s. Abb. 1).

Vorniere (Pronephros). Diese wird beim menschlichen Embryo Anfang der 4. Wo-

che im Zervikalbereich angelegt. Sie ist rudimentär und hat bei höheren Vertebraten

keine Funktion. Es werden zwar 5 – 7 Tubuli und Glomeruli gebildet, am Ende der 4.

Woche haben sich diese aber schon wieder zurückgebildet. Einzig der Vornierengang

bleibt erhalten. Dieser entsteht aus dorsal gelegenen aussprossenden Mesenchymzel-

len des intermediären Mesoderms. Er wird epithelialisiert, bekommt ein Lumen und

zieht nach kaudal. In Höhe der Urniere erhält er Anschluss an die Urnierenkanälchen

und mündet um den 26. Tag in die Kloake. Dieser Gang wird nun als Wolff-Gang

bezeichnet.

Einleitung 2_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 1; Schema der drei embryonalen Nierengenerationen imBereich der dorsalen Rumpfwand. H = Herzbeutel, L = Leber-anlage, ZNS = Zentrales Nervensystem (nach Rohen, Lütjen-Drecol; Funktionelle Embryologie; Schattauer [2003])

Urniere (Mesonephros). Sie entsteht in direktem Anschluss an die Vorniere am

Ende der 4. Woche im Thorakal- bzw. Lumbalbereich und wird dabei durch den

Wolff-Gang induziert. Bei einigen Säugetieren erlangt die Urniere eine Funktion,

beim Menschen dagegen wird eine Funktion von sehr geringem Ausmaß zwischen

der 6. und 10. Woche angenommen. Durch Zellverdichtungen und Lumenbildung im

mesonephrogenen Gewebe werden Urnierenbläschen gebildet, die zu S-förmigen

Schläuchen, den Urnierenkanälchen, heranwachsen (s. Abb. 2a-c). Dabei wachsen

sie soweit nach lateral vor, bis sie den Wolff-Gang erreichen und mit diesem ver-

schmelzen. An ihrem medialen Ende bilden die Kanälchen bzw. Tubuli zweischich-

tige epitheliale Becher, die so genannte Bowman-Kapsel, in die sich Kapillarschlin-

gen mesenchymaler Herkunft einstülpen (s. Abb. 2d-e). Die Entwicklung dieser

Strukturen geschieht nacheinander von kranial nach kaudal. So kommt es dazu, dass

sich lumbal gelegene Urnierenkanälchen gerade erst bilden, während thorakal gele-

gene bereits wieder degenerieren. Auf diese Weise gibt es nie mehr als 40 Tubuli zur

gleichen Zeit. Mit Eintritt in die Fetalzeit ist meist schon die gesamte Urniere zu-

rückgebildet. Beim Mann bildet der Wolff-Gang den ableitenden Samenweg.

Einleitung 3_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 2; A: Querschnitt durch einen 5 Wochen alten Embryo zur Darstellung des meso-nephrogenen Gewebes, aus dem sich die Urnierenkanälchen entwickeln. B-E: Querschnitt-schemata der verschiedenen Entwicklungsstadien der Urnierenkanälchen. (nach: Moore, Persaud; Embryologie - Lehrbuch und Atlas der Entwicklungsgeschichte des Menschen; Schattauer [1996])

Nachniere (Metanephros). Die Nachniere beginnt sich am Anfang der 5. Woche in

Höhe des ersten Sakralsegments zu entwickeln. Dazu fängt die Ureterknospe kurz

vor dem Übergang in die Kloake an, aus dem Wolff-Gang nach dorsokranial in das

metanephrogene Blastem auszusprossen. Dieser Vorgang induziert die umliegenden

Mesenchymzellen sich zu verdichten und sich wie eine Kappe über die Knospe zu

legen. Dies wiederum induziert die Ureterknospe sich kontinuierlich dichotom zu tei-

len. In dessen Folge entstehen Ureter, Nierenbecken, Nierenkelche und aufeinander

folgende Generationen von Sammelrohren. Dabei bilden die ersten drei bis vier Ge-

Einleitung 4_____________________________________________________________________________________________________________

nerationen dieser Rohre, durch Vergrößerung und Konfluenz, die Calices maiores,

und die zweiten vier die Calices minores (s. Abb. 3).

Abb. 3; Vier aufeinander folgende Stadien der Nachnierenentwicklung. (nach: Moore, Persaud; Embryologie - Lehrbuch und Atlas der Entwick-lungsgeschichte des Menschen; Schattauer [1996])

Alle weiteren Generationen bilden die definitiven Sammelrohre. Weiter induziert

diese immer weiter fortschreitende dichotome Teilung am Ende der 6. Woche die

mesenchymalen Zellverdichtungen, um das Ende der blind endenden Sammelrohre

zu epithelialisieren und Bläschen zu bilden. Diese entwickeln sich dann zu sog.

Comma-shaped bodies und anschließend zu S-shaped bodies weiter (s. Abb. 4). Da-

bei formt dieser, durch Eindringen von Endothel- und vermutlich von Mesangium-

vorläufer-Zellen in den unteren Spalt des S-shaped body, das Glomerulum (s. Abb.

5). Anschließend kommt es bis zum Verschmelzen mit dem jeweiligen Sammelrohr

um die 10. Woche, zu einem Längenwachstum dieses S-förmigen Tubulus, in dessen

Verlauf proximaler Tubulus, Henle-Schleife und distaler Tubulus entstehen. In die-

sem Prozess entstehen 500.000 - 1.000.000 Nephrone in der Nierenrinde von außen

nach innen, ehe die Entwicklung in der 34. bzw. 35. Woche abgeschlossen ist.

Einleitung 5_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 4; Schematische Präsentation der Nephrogenese. A: lockeres Mesenchym B: Kon-densation; 1: Ureterepithel 2: Blutgefäße 3: undifferenziertes Epithel 4: in Epithel differen-zierendes kondensiertes Mesenchym C: Comma-shape Tubulus D: S-shape Tubulus E: Tubulus Längenwachstum F: Podozytenfalten; Epithelial ureter bud: epithelialisierte Ure-terknospe; Capsule: Kapsel (nach Gomez et al.; Recent advances in renal developement; Current Opinion in Pediatrics 11 [1999])

Einleitung 6_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 5; Wichtige Schritte in der Vaskularisation eines Nephrons. UB: Ureterknospe; JG cell: Juxtaglomeruläre Vorläuferzelle; smooth muscle cell: Zelle glatter Muskulatur; endo-thelial cell: Endothelzelle; mesenchymal cell: Mesenchymzelle (nach Gomez et al.; Recent advances in renal developement; Current Opinion in Pediatrics 11 [1999])

Einleitung 7_____________________________________________________________________________________________________________

In viele der oben beschriebenen Vorgänge scheinen unterschiedliche Gene involviert

zu sein. Eine Auflistung bekannter Gene, die für eine reibungslose Nierenentwick-

lung in den einzelnen Differenzierungsstadien von Bedeutung zu sein scheinen und

was bei einem Defekt zu beobachten ist, gibt Tabelle 1 und Abb. 6.

Gen Gewebe-

expression

Defekt

Proteoglykane und ihre biosynthetischen EnzymeHs2st UK, MM Fehlende Nierenanlage durch fehlende UK-Teilung und

mesenchymale Kondensation

Gpc3 UK,MM Selektive Degeneration d. medullären Sammelrohre

TranskriptionsfaktorenEmx2 UK, MM Fehlen von Niere, UK, Genitaltrakt

Eya1 MM Fehlendes UK-Wachstum und MM-Induktion

Foxc1 MM Zwei Nieren und doppelte UKs

Foxd1 S Kleine Nieren mit wenigen Nephronen

Pax2 UK, MM Fehlerhaftes UK-Wachstum, MM wird nicht induziert

Rara, Rarb UK, S, MM Hypoplasie/Agenesie

Sall1 MM Fehlerhaftes UK-Wachstum

Wt1 MM MM begeht Apoptose

WachstumsfaktorenBmp4 (het) MM Hypo-/Dysplastische Niere, Hydroureter, Doppelsammel-

rohre

Bmp7 UK, MM Schwere Hypoplasie mit wenigen Nephronen und Sam-

melrohren

Fgf7 S Kleine Nieren, wenig UK-Verzweigungen und Neph-

ronen

Gdnf MM Agenesie, da fehlerhaftes UK-Wachstum

Wnt4 MM Fehlerhafte Tubulusformationen

Wachstumsfaktoren/-rezeptorenGfra1 UK, MM Agenesie, da fehlerhaftes UK-Wachstum

Notch2 MM Glomeruläre Defekte

Ret UK Fehlerhafte UK-Wachstum

Tab. 1; MM: Metanephrogenes Mesenchym; S: Stromazellen; UK: Ureterknospe

Einleitung 8_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 6; Schrittweise Differenzierung des Ureter und des Mesenchym in Abhängigkeit ver-schiedener Gene (nach Kuure et al.; Kidney morphogenesis: cellular and molecular regu-lation; Mechanism of development 92 [2000])

I.2. Einfluss von NSAIDs auf die Nephrogenese

Im klinischen Alltag sind non steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) wie Ace-

tylsalicylsäure (ASS) und Indomethacin häufig verwandte Arzneimittel. Dabei reicht

die Indikation von einfachem Kopfschmerz, über Infarktprophylaxe in Herz und Ge-

hirn, bis hin zur Tokolyse und Polyhydramnion-Therapie.

Hieraus ergibt sich auch direkt das Problem, welches erstmals von Novy [1978] am

Rhesusaffenfetus nach Indomethacineinnahme gezeigt wurde. Nimmt eine Schwan-

gere Indomethacin für mehr als 48 h aus z.B. einem der oben genannten Gründe ein,

kann hieraus in utero ein Oligohydramnion mit postnataler Anurie und im schlimms-

ten Fall der perinatale Tod resultieren [van der Heijden et al., 1994]. Hervorgerufen

wird dies unter anderem durch eine Nierenfehlentwicklung mit folgender tubulärer

Dysfunktion und Niereninsuffizienz, bis hin zum akuten Nierenversagen [Restaino et

al., 1991; Niebyl und Witter, 1986; Simeoni et al., 1989; Heuden et al., 1988]. Dabei

kann neben der glomerulären Filtrationsrate (GFR) auch der renale Blutfluss (RBF)

reduziert sein [Kaplan et al., 1994]. Dies ist deutlich zu sehen am gestiegenen Se-

rum-Kreatinin Wert [Norton et al., 1993]. Beim Erwachsenen deutet dies auf ein hä-

Einleitung 9_____________________________________________________________________________________________________________

modynamisches Problem hin und ist gehäuft bei Patienten mit ohnehin geschwächter

Nieren-, Herz- und Leberfunktion zu verzeichnen [Leone et al., 1999].

Bei mikroskopischer Betrachtung fällt auf, dass in der Frühphase der Nierenentwick-

lung die S-shaped bodies verformt und die sich entwickelnden Tubuli aufgerollt er-

scheinen. Im weiteren Verlauf stellen sich die Glomeruli als zu klein bzw. als multip-

le Anlage in dillatierten Bowman-Kapseln dar, denen sich atrophische Tubuli an-

schließen [van der Heijden et al., 1994]. Dabei sind die Glomeruli von kuboidalen

oder zapfenförmigen Podozyten bedeckt [Kaplan et al., 1994]. Bei der Übersichtsbe-

trachtung der von van der Heijden [1994] als normal groß und von Novy [1978] als

zu klein beschriebenen Nieren sind zahlreiche zystische und fibrotische Veränderun-

gen zu sehen [Kaplan et al., 1994]. Durch den reduzierten renalen Blutfluss (RBF)

sieht der tiefe Kortex ischämisch aus [van der Heijden et al., 1994].

Weitere beobachtete Nebenwirkungen unter NSAID-Einnahme sind der zu frühe

Verschluss des Ductus arteriosus, der Hydrops fetalis, die Ileumperforation, diverse

Blutungen, eine pulmonale Hypertonie, äußerstenfalls eine Totgeburt [Kaplan et al.,

1994].

I.3. Die Cyclooxygenase

NSAIDs wirken durch Hemmung des Enzyms Cyclooxygenase (COX). Prostaglan-

dine sind das Produkt der Cyclooxygenase (Prostaglandinsynthase).

Ausgangspunkt der Synthese ist die Arachidonsäure. Diese ist eine essentielle, mehr-

fach ungesättigte Fettsäure, die entweder erst aus anderen essentiellen, mehrfach un-

gesättigten Fettsäuren vom Körper gebildet oder mit der Nahrung zugeführt wird. Sie

wird dann in Phospholipide der Plasmamembranen eingebaut, um dann bei Bedarf

durch die Phospholipase A2 wieder freigesetzt zu werden. Damit steht sie als essen-

tielles Substrat der Synthese von Eicosanoiden zur Verfügung. Diese können auf

zwei unterschiedlichen Wegen produziert werden. Zum einen über den Cyclooxyge-

naseweg, hier entstehen Prostacycline, Prostaglandine und Thromboxane, und zum

anderen über den Lipoxygenaseweg, durch den Leukotriene produziert werden.

Die COX ist ein membrangebundenes Haem- und Glycoprotein, das sowohl Bisoxy-

genase- als auch Peroxydaseaktivität besitzt. Aus Arachidonsäure synthetisiert sie

Einleitung 10_____________________________________________________________________________________________________________

�ber PGG2 das Endoperoxid PGH2, welches seinerseits Substrat f�r die Bildung der

Prostaglandine (PGE2, PGF2�, PGD2), des Prostacyclins (PGI2) und des Thrombo-

xans (TXA2) ist [Smith, Marnett, DeWitt, 1991] (s. Abb. 7). Diese geh�ren zusam-

men mit den Leukotrienen zur Gruppe der Eicosanoide, den so genannten Gewebs-

hormonen. Sie k�nnen von fast allen K�rperzellen synthetisiert werden und ihre

Funktion ist vielf�ltig. Diese reichen von der Tonuskontrolle glatter Muskulatur

(Blutdruck, Bronchien, Uterus), �ber die Beeinflussung der Zellwanderung und -

aggregation (Leukozyten, Thrombozyten), bis hin zu wirkungsvollen Schmerzsigna-

len an Nociceptoren. Dabei entfalten sie ihre Wirkung in unmittelbarer N�he ihrer

Entstehung sowohl auto- als auch parakrin. Jedoch werden sie innerhalb von Sekun-

den bis Minuten durch enzymatische Reduktion von Doppelbindungen und Dehyd-

rierung von Hydroxygruppen oder spontaner Umsetzung wieder inaktiviert.

Es gibt zwei Isoformen der Cyclooxygenase, COX-1 und COX-2, die in der Maus

und auch beim Menschen durch zwei unterschiedliche Gene kodiert werden, Ptgs1

und Ptgs2.

Die COX-1 stellt die konstitutive Form dar und wird in den meisten Geweben der

S�uger exprimiert, speziell jedoch in Magen, Thrombozyten und glatter Gef��mus-

kulatur. In der Niere findet man sie im Gef��endothel, in medull�ren Sammelrohren

und in medull�rem Interstitium [Smith und DeWitt, 1995; Crofford, 1997]. Damit ist

die COX-1 f�r die Prostaglandinversorgung im zellul�ren Haushalt verantwortlich

und �bernimmt insbesondere Aufgaben in der Magenzytoprotektion, der vaskul�ren

Homeostase und der normalen Nierenversorgung mit weitgehend konstanter Enzym-

aktivit�t [DeWitt et al., 1993; Smith und DeWitt, 1995] und wird daher auch als

„housekeeping enzyme“ bezeichnet.

Dem gegen�ber steht die COX-2, deren wesentlicher Unterschied zur COX-1 die

gr��ere Promotorregion am 5�-Ende des COX-2-Gens und das geh�ufte Vorkommen

der AU-Instabilit�tssequenzen im nichtkodierenden 3�-Ende der mRNA ist. Die

Promoterregion enth�lt wichtige Kontrollelemente, an die Transkriptionsfaktoren

binden und damit die Transkription steuern k�nnen. Dabei kann die Induktion von

zahlreichen intra- und extrazellul�ren Stimuli ausgehen:

Cytokine (Interleukin-1� und -2, Tumornekrosefaktor-�, Interferon-�), Wachstums-

faktoren (Transforming growth factor-� und -�, Platelet derived growth factor, Epi-

dermal growth factor), Gewebshormone (Pl�ttchenaktivierender Faktor, Endothelin),

Einleitung 11_____________________________________________________________________________________________________________

Hormone (Progesteron, FSH, LH, HCG), Tumorpromotoren (Phorbolester, Forsko-

lin), Viren und Bakterienbestandteile (Lipopolysaccharide). Im Zuge der Induktion

des COX-2-Proteins nimmt auch die Prostanoidproduktion zu [Williams und Du-

Bois, 1996]. Aufgrund dieser vielfältigen Induzierbarkeit spricht man bei der COX-2

auch von der induzierbaren COX-Form.

Abb. 7; Der Cyclooxygenaseweg

Gehemmt wird die Induktion durch Glukokortikoide und Interleukin-10 [Mertz et

al., 1994; Kujubu und Herschmann, 1992]. NSAID dagegen senken die Prosta-

noidproduktion durch Hemmung der Cyclooxygenaseaktivität. Das Bekannteste un-

ter den NSAID, ASS, acetyliert eine Seringruppe an der Substratbindungsstelle und

blockiert irreversibel die Substratverarbeitung [Meade et al., 1993].

Arachidonsäure

Phospholipide

PGG2

PGH2

Thromboxan A2(TXA2)

Prostaglandine(PGE2, PGF2a, PGD2)

Prostacyclin(PGI2)

Leukotriene

Phospholipase A

Cyclooxygenase Lipoxygenase

Einleitung 12_____________________________________________________________________________________________________________

Die COX-2 ist in den meisten Geweben nicht nachweisbar bzw. wird nicht konstant

exprimiert [Smith und DeWitt, 1995; Kömhoff et al., 2000]. Sie kann aber, wie be-

reits erwähnt, durch diverse Stimuli induziert werden, sodass sie beim Erwachsenen

besonders während des Zellwachstums und in der Entzündungsphase in Erscheinung

tritt [O’Banion et al., 1991; Masferrer et al., 1992; Mitchel et al., 1993]. Eine Aus-

nahme stellt dabei die Niere dar. In dieser wird sowohl im Fetus als auch im Erwach-

senen bei allen Spezies COX-2 exprimiert [Harris et al., 1994; Kömhoff et al., 1997;

Zhang et al., 1997; Khan et al., 1998].

Eine COX-2-mRNA Expression in der sich entwickelnden Mäuseniere konnte in den

ersten epithelialen Strukturen des metanephritischen Mesenchyms, den renalen Blä-

schen, entdeckt werden [Dressler, 1995]. Darüber hinaus konnte die COX-2-mRNA

Expression in den comma- und S-shaped bodies, besonders bzw. vorherrschend in

den sich entwickelnden Tubulusepithelien nahe der Glomeruli gezeigt werden. Eine

deutliche Expression an der juxtamedullären Macula densa ist ab dem Tag E14,5 zu

beobachten. In der reifen Niere bleibt sie auf Zellen dieser Region beschränkt.

Postnatal ist im Immunoblot ein Anstieg der COX-2-Protein Expression vom Tag P0

bis P4, wo es einen Peak erreicht, zu verzeichnen, der aber anschließend schnell wie-

der sinkt [Kömhoff et al., 2000].

Im Rattenmodell konnte ebenfalls eine entwicklungsabhängige COX-2 Expression

gezeigt werden [Zhang et al., 1997]. So ist dessen Ausmaß am Tag P0 vergleichbar

mit der einer erwachsenen Ratte. Dies ändert sich jedoch ab Tag P1, ab dem das Sig-

nal erst stärker und dann von Tag P3 bis P7 beträchtlich ansteigt. Von Tag P7 bis

P14 hält es das Level, um danach wieder abzufallen (Nothern Analysis). Im Immu-

noblot ist bis zum Peak an P14 ebenfalls ein Anstieg zu beobachten. Eine erste diffu-

se cytoplasmatische COX-2-Expression zeigt sich ab Tag E16 in sich verzweigenden

Sammelrohren und S-shaped bodies. Im weiteren Verlauf kann man im dicken auf-

steigenden Schenkel der Henle-Schleife eine diffuse und in Zellen nahe der Macula

densa eine starke COX-2-Expression feststellen. Die Macula bleibt jedoch COX-2

negativ. Dabei wandert die COX-2-Expression von juxtamedullär nach außen in den

Kortex, wobei aber die COX-2-Zellzahl konstant bleibt. Dies deutet auf eine ent-

wicklungsabhängige Hoch- und Runterregulation hin. In entwickelten Abschnitten

wird die COX-2-Expression runterreguliert und umgekehrt in noch zu entwickelnden

Einleitung 13_____________________________________________________________________________________________________________

hochreguliert. Interessant ist auch die fünffach höhere PGE2-Bindung in den ersten

fünf Lebenstagen, verglichen mit den Nieren erwachsener Tiere [Zhang et al., 1997].

In der humanen fetalen Niere sieht das Bild sehr ähnlich aus. Auch hier zeigt sich ei-

ne starke COX-2-Expression im Bereich der Macula densa und den assoziierten di-

cken aufsteigenden Schenkeln der Henle-Schleife, am stärksten in den Nephronen

des äußeren Kortex. Es findet sich auch hier eine progressive Abnahme der COX-2-

Expression von den äußeren unentwickelten zu den inneren weiterentwickelten

Nephronen. Einen Zusammenhang zwischen der Intensität der COX-2-Expression

und dem Gestationsalter gibt es allerdings nicht bzw. konnte nicht gezeigt werden

[Khan et al., 2001].

I.4. Das COX-2-/--Mausmodell

Durch den selektiven Knockout des Cyclooxygenase-2-Gens in der Maus fallen zu-

nächst einmal Phänomene auf, die die Vitalität dieser Tiere betreffen. Zu diesen Phä-

nomenen findet man in der Literatur allerdings unterschiedliche Beobachtungen. So

wurde zwar von einer erwarteten Anzahl an COX-2-/--Nachkommen berichtet, aber

nur 60% überlebten bis zur Entwöhnung. Von diesen wiederum überlebten lediglich

75% das erste Lebensjahr [Langenbach et al., 1999]. Demgegenüber steht die Beo-

bachtung, dass die Zucht nur ungefähr 35% der erwarteten Nachkommen brachte.

Hierfür wird die neonatale Mortalität als essentiell angesehen [Dinchuk et al., 1995].

Die durchschnittliche Lebenserwartung einer COX-2-/--Maus beträgt 3,5 Monate

[Dinchuk et al., 1995; Norwood et al., 2000], wobei nur wenige älter als 6 Monate

werden [Dinchuk et al., 1995]. Ungefähr 20% der COX-2-/--Nachkommen versterben

zwischen der 7. und 23. Woche [Norwood et al., 2000]. Dabei ist eine erhöhte Ster-

berate um die 8. Woche zu verzeichnen [Morham et al., 1995; Norwood et al., 2000].

Bei Versuchen mit COX-2-/--Weibchen stellte sich deren Infertilität heraus. Die Fer-

tilität der Männchen bleibt davon unbeeinflusst [Dinchuk et al., 1995; Lim et al.,

1997; Davis et al., 1999], sodass, um entsprechende Nachkommen zu erzeugen, hete-

rozygote Weibchen mit homozygoten Männchen verpaart werden.

Versuche zur Entzündungsreaktion zeigten keinen Unterschied in der Reaktion auf

TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat) oder AA (Arachidonsäure) zwischen

Einleitung 14_____________________________________________________________________________________________________________

COX-2-/- und Wildtyp (WT) [Morham et al., 1995]. Des Weiteren belegten diese

Versuche COX-2 als Hauptproduzent von Prostaglandinen in der frühen Entzün-

dungsphase [Langenbach et al., 1999].

In der COX-2-/--Maus sind neben Veränderungen im Herz, wie diffuse myocardiale

Fibrosen, und in den Ovarien, insbesondere Gewebeabnormalitäten in der Niere zu

sehen. Dabei fällt die adulte COX-2-/--Maus durch chronisches Nierenversagen auf,

zu erkennen am gestiegenen Serum-Kreatinin Spiegel und der Urämie, was auf eine

reduzierte glomeruläre Filtrationsrate (GFR) schließen lässt. Natrium- und Wasser-

haushalt bleiben dabei unberührt [Dinchuk et al., 1995; Norwood et al., 2000].

Sowohl bei makroskopischer als auch bei mikroskopischer Betrachtungsweise sind

ab der 6. Woche zahlreiche signifikante und beständige genotypabhängige Verände-

rungen der Niere gegenüber dem WT zu beobachten. So fällt bei Betrachtung der zu

klein geratenen Nieren mit dem bloßen Auge die blasse und granuläre Erscheinung

der Kapseloberfläche auf. Unter dem Mikroskop bietet sich dem Betrachter das Bild

eines multifokal subkapsulär abnormalen Parenchyms mit glomerulärer Hypoplasie

des äußeren Kortex. Dabei finden sich sowohl Tubulusatrophien als auch diffuse tu-

bulärer Dilatationen. Im inneren Kortex erscheint das einzelne Nephron hy-

pertrophiert. Zusätzlich ist in dem teilweise dünnen Kortex häufig auch die Anzahl

der Glomeruli reduziert. Periglomerulär stellen sich vielfach sklerotische Verände-

rungen dar [Morham et al., 1995; Norwood et al., 2000]. Es wird vermutet, dass

durch die Reduktion der Glomerulizahl, die angelegten Glomeruli ihre Arbeitsleis-

tung erhöhen und dass dadurch die beschriebene Hypertrophie und Sklerose erklärt

werden kann [Brenner, 1985]. Bei Betrachtung des Interstitiums sind dort diffuse

fibrotische und zystische Veränderungen zu erkennen [Morham et al., 1995; Nor-

wood et al., 2000].

Doch all diese Veränderungen sind nicht etwa schon in utero oder direkt nach der

Geburt zu beobachten. Es hat sich vielmehr gezeigt, dass die Nieren am Tag E14 völ-

lig normal aussehen und am Tag P3 nicht vom Wildtyp (WT) zu unterscheiden sind.

Selbst am Tag P7 gelingt dies nicht [Langenbach et al., 1999; Morham et al., 1995;

Norwood et al., 2000]. Erst am Tag P10 sind in einigen Nieren zystische Verände-

rungen und zusammengedrängte, kleine, subkapsulär gelegene Glomeruli zu beo-

bachten, jedoch nicht bei allen Nieren. Gleichzeitig lässt sich dieses gehemmte Nie-

renwachstum auch am Nierengewicht ablesen. Ab P10 ist nämlich auch das Verhält-

Einleitung 15_____________________________________________________________________________________________________________

nis von Nierengewicht zu Körpergewicht im Vergleich zum WT nachhaltig gesenkt.

Beim Körpergewicht gibt es allerdings keine Differenzen. Ab P14 lassen sich alle

COX-2-/--Nieren vom WT abgrenzen. Im einzelnen bedeutet dies, dass nun in allen

COX-2-/--Nieren progressive Dysplasien des äußeren Kortex mit zystischen sub-

kapsulären Glomeruli unter dem Mikroskop zu sehen sind. Weiterhin zeigen sich

jetzt Tubulusatrophien und zystische Formationen des Interstitiums. Hypertrophien

juxtamedulärer Glomeruli wurden erst ab P28, also nach 4 Wochen, gesehen [Nor-

wood et al., 2000]. COX-2+/--Mäuse unterscheiden sich nicht vom WT [Morham et

al., 1995].

Bei pharmakologischen Untersuchungen mit dem selektiven COX-2-Inhibitor

SC-236 haben sich keine quantitativen Unterschiede in der Glomerulumgröße zum

COX-2-/- ergeben. So zeigte sich nach Gabe des SC-236 ab Tag E0,5 sowohl ein

deutlich reduziertes kortikales Volumen an Tag P21 als auch ein deutlich reduzierter

glomerulärer Durchmesser von 29,35 ± 0,42 µm im Vergleich zu 47,01 ± 0,41µm

beim Kontrolltier. An P0 gab es jedoch keinen Unterschied. Der glomeruläre

Durchmesser eines COX-2-/--Tieres beträgt hier 29,35 ± 0,68 µm. In der gleichen

Versuchsreihe wurden dichter stehende glomeruläre Zellen und cuboidal geformte

Podozyten beobachtet. Bei Gabe des SC-236 erst ab P0 bis P21 fällt der Effekt nicht

ganz so deutlich aus. So betrug der gemessene Durchmesser nunmehr 37,31 ± 0,68

µm im Vergleich zu 47,01 ± 0,41 µm beim Kontrolltier. Jedoch gab es auch in die-

sem Modell keine Veränderung vor P8. Auf das erwachsene Tier hatte SC-236 kei-

nen wesentlichen Effekt. Indiz dafür, dass der COX-2 Hemmer auch diaplazentar ü-

bertragen wird, ist zum Einen die deutliche Hochregulation des COX-2 Proteins am

Tag P0, die durch SC-236 hervorgerufen wird, und sind zum Anderen die deutlich

besseren Ergebnisse im Zeitraum von E0,5 bis P21, als von P0 bis P21 [Kömhoff et

al., 2000]

All die bis hierher beschriebenen Phänomene ergeben das Bild einer COX-2 korre-

lierten Nephrogenese.

Einleitung 16_____________________________________________________________________________________________________________

I.5. Prostaglandin-Rezeptoren

Prostaglandin-Rezeptoren sind eine Gruppe von Plasmamembranrezeptoren, deren

Wirkungen über G-Proteine vermittelt werden. Jedem Metaboliten des Arachidon-

säurestoffwechsels, der über die Cyclooxygenase synthetisiert wird, ist dabei ein

spezifischer Rezeptor zuzuordnen. Für den Prostaglandin E2-Rezeptor unterscheidet

man zudem vier Subtypen, EP-1 - EP-4, deren Expression von Morath et al. [1999]

an verschiedenen Stellen der Niere nachgewiesen werden konnte:

EP-1: - in Verbindungsstücken

- in kortikalen und medullären Sammelrohren

- in der Media der Arterien, Vasa recta und peritubulärer Kapillare

- in Zellen der Vas afferens und efferens

- in den Glomeruli

EP-2: - in der Media der Arterien und glomerulärer Arteriolen

- im kortikalen und medullären Interstitium

EP-3: - im spät distalen Tubuluskonvolut

- in Verbindungsstücken

- in kortikalen und medullären Sammelrohren

- im distalen Tubulus

- in der Media und im Endothel der Arterien, Vasa recta und peritubulärer

Kapillare

- in juxtaglomerulären afferenten Arteriolen

- in den Glomeruli

EP-4: - in der Media der Arterien und Vasa recta

- in den Glomeruli

Neben den endogenen Liganden, der Prostaglandine, sind auch einige exogene Li-

ganden bekannt. Während Sulproston als PGE2-Derivat eher unspezifisch an die ein-

zelnen EP-Rezeptoren bindet, weisen die Substanzen aus der ONO-Gruppe eine hö-

here Spezifität auf. So ist ONO-8713 für den EP-1-Rezeptor, ONO-AE1-259 für den

EP-2-Rezeptor, ONO-AE-248 für den EP-3-Rezeptor und ONO-AE-329 für den EP-

4-Rezeptor ein spezifischer Ligand [Narumiya et al., 2001]. Durch die Bindung der

einzelnen Liganden an ihre Rezeptoren, werden verschiedene intrazelluläre Trans-

Einleitung 17_____________________________________________________________________________________________________________

duktionssysteme in Gang gesetzt (Tab. 2). Die Funktionen, die dabei von PGE2 ver-

mittelt werden, sind vielf�ltig. So haben Breyer MD und Badr KF [1996] gezeigt,

dass diese Einfluss auf den Tonus der glatten Gef��muskulatur der Niere und damit

auf den renalen Blutfluss (RBF) haben [Pallone TL, 1994; Lemley KV et al., 1984

und Silldorf EP et al., 1995]. Als weitere PGE2-vermittelte Funktionen in der Niere

sind bekannt: eine Beteiligung an der Regulation der GFR [Schlondorff D und Ar-

daillou R, 1986], der Reninfreisetzung [Henrich WL, 1981] und der Elektrolyt- und

Wasserregulation [Breyer MD et al., 1996; Stokes JB, 1979; Kaji DM et al., 1996].

Die einzelnen Funktionen der verschiedenen Subtypen des EP-Rezeptors in der Niere

sind im Detail noch nicht aufgekl�rt.

Tab. 2; Rezeptoren der Arachidons�uremetaboliten

Es konnte gezeigt werden, dass Prostaglandine auch Liganden an Kernrezeptoren,

speziell an PPAR� und PPAR�, sind [Forman et al., 1995; Kliewer et al., 1995; Mital

Rezeptor Subtyp Transduktionssystem

PGD2 DP cAMP �

Ca2+ �

PGE2 EP EP-1 Ca2+ �

EP-2 cAMP �

EP-3 cAMP �

EP-4 cAMP �

PGF2� FP Ca2+ �

PGI2 IP cAMP �

TXA2 TP Ca2+ �

Einleitung 18_____________________________________________________________________________________________________________

et al., 2002]. Peroxisome proliferator activated receptors (PPARs) sind eine Gruppe

von Zink-Finger enthaltenden Transkriptionsfaktoren, eine Unterfamilie der Kern-

hormonrezeptorfamilie [Keller und Wahli, 1993; Mandrup und Lane, 1997; Schoon-

jans et al., 1996]. Man unterscheidet drei Isoformen: PPAR�, PPAR�/� und PPAR�.

Die einzelnen Isoformen der PPARs werden an unterschiedlichen Stellen und in un-

terschiedlichen Geweben unseres K�rpers exprimiert [Vamecq und Latruffe, 1999].

Eine gesonderte Stellung nimmt dabei die Niere ein, in der alle drei Isoformen zu

finden sind [Braissant et al., 1996; Guan et al., 1997].

Bei den Liganden der einzelnen PPARs kann zwischen endogenen und exogenen Ak-

tivatoren differenziert werden (s. Tab. 3).

Die folgenden Versuche wurden mit Hilfe der PPAR-Agonisten Troglitazone, als

PPAR�-Agonist und GW501516, als PPAR�-Agonist durchgef�hrt.

Tab. 3; Endogene und exogene Liganden der PPARs

Rezeptor endogene exogeneLiganden Liganden

PPAR� Leukotrien B4

PPAR� 15-d-PGJ2, 15-HETE Troglitazone

PPAR� PGI2 GW501516

Einleitung 19_____________________________________________________________________________________________________________

I.6. Ziel der Arbeit

Es konnte gezeigt werden, dass durch selektiven Knockout des COX-2-Gens eine

Störung der Nierenentwicklung hervorgerufen wird. Die zugrunde liegenden COX-2-

abhängigen Mechanismen einer normal ablaufenden Nierenentwicklung sind nicht

aufgeklärt. Eine Beteiligung bestimmter Prostanoide wird vermutet. Es werden aber

auch NO-Substanzen und PPAR-Liganden als Signalmediatoren diskutiert.

Ein Ziel der Arbeit wird sein zu überprüfen, ob der bei einer COX-2-/--Maus beo-

bachtete Nierenschaden auch pharmakologisch mit Hilfe verschiedener COX-2-

Hemmer bei Wildtyp-Mäusen erzeugt werden kann. Hierfür werden Wildtyp-Mäuse

über drei Wochen mit SC-236, Parecoxib und Rofecoxib behandelt.

Primäres Ziel der Arbeit soll aber sein, ein Rescue der Nephrodysgenese infolge de-

fekten COX-2-Gens mittels verschiedener Prostanoidrezeptorliganden, NO-

Freisetzern oder PPAR-Liganden zu erreichen. Dazu werden COX-2-/--Mäuse über

drei Wochen mit EP-2- und EP-4-Liganden, diversen NO-Freisetzern und PPAR-

Liganden behandelt. Bei allen Versuchsreihen erfolgt am Tag P22 die Organentnah-

me zur histomorphologischen Untersuchung. Die Nieren werden dabei auf das Vo-

lumen ihrer Glomeruli, die Distanz dieser Glomeruli von der Nierenkapsel, den An-

teil der Glomeruli innerhalb einer Kortexzone von 58 µm und das Verhältnis des

Nierengewichts zum Körpergewicht hin untersucht.

Material und Methoden 20_____________________________________________________________________________________________________________

II. Material und Methoden

II.1. Material

II.1.1. Chemikalien

Agarose Cambrex Bio Science, Rockland (USA)

Bromophenol blue Roth, Karlsruhe

Chloroform Merck, Darmstadt

DMF Serva, Heidelberg

DMSO Roth, Karlsruhe

EDTA Roth, Karlsruhe

Eisessig Roth, Karlsruhe

Essigsäure Merck, Darmstadt

Ethanol absolut Roth, Karlsruhe

Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe

ISO propanol Merck, Darmstadt

Methanol Merck, Darmstadt

PEG 200 Sigma, Taufkirchen

PFA Merck, Darmstadt

RNase freies H2O Ambion, Austin (USA)

SDS Sigma, Taufkirchen

Sucrose Sigma, Taufkirchen

TRIS Roth, Karlsruhe

Triton X-100 Sigma, Taufkirchen

Tween 20 Sigma, Taufkirchen

Xylene cyanol ff Sigma, Taufkirchen

Xylol Merck, Darmstadt

II.1.2. Medikamente

Dynastat® Pharmacia, Erlangen

Forene® Abbott, Wiesbaden

GW 501516 Merck, Darmstadt

Ketavet® Pharmacia, Erlangen


NaCl 0,9% Fresenius Kabi, Bad Homburg

NOC-12 Merck, Schwalbach

ONO AE1-259-01 ONO Pharmaceutica, Osaka (J)

ONO AE1-329 ONO Pharmaceutica, Osaka (J)

ONO AE3-208 ONO Pharmaceutica, Osaka (J)

Rompun® Bayer, Leverkusen

SC-236 Merck, Schwalbach

Spermine NONOate Merck, Schwalbach

Troglitazone Merck, Schwalbach

VIOXX® Merck Sharp & Dohme, Hertfordshire

(UK)

II.1.3. Enzyme und Primer

10x PCR Puffer Sigma, Taufkirchen

100 Base-Pair-Ladder Amersham, Buckinghamshire (UK)

dNTP Amersham, Buckinghamshire (UK)

F-Primer Eurogentec, Seraing (B)

Neo-Primer Eurogentec, Seraing (B)

Proteinkinase K Invitrogen, Karlsruhe

R-Primer Eurogentec, Seraing (B)

Taq DNA Polymerase Sigma, Taufkirchen

II.1.4. Instrumente und Apparaturen

Einwegmesser Heraeus Kulzer, Wehrheim /Ts.

Feinwaage Sartorius, Göttingen

Gelbild-Dokumentationseinrichtung Vilber Lourmat, Marne la Vallére (F)

Gelelektrophoresekammer Owl Scientific, Woburn (USA)

Labor(kühl)zentrifuge Heraeus Instruments, Hanau

Magnetrührer IKA Labortechnik, Staufen

Mikroskop Leica, Wetzlar

Minishaker IKA Labortechnik, Staufen

Ofen Hybaid, Teddington (UK)

PCR-Gerät Biometra, Göttingen


Präparierbesteck Aesculap, Tuttlingen

Schneidemaschine Leica Instruments, Nussloch

Spritzen B.Braun, Melsungen

Stromversorgungsgerät Consort, Turnhout (B)

Thermomixer Eppendorf, Hamburg

Tischwaage Kern & Sohn, Bulingen – Frommern

Trockenschrank Heraeus Instruments, Hanau

Wasserbad Leica Instruments, Nussloch

II.1.5. Sonstige Materialien

Deckgläser Menzel-Gläser, Braunschweig

Einbettkasten medite, Burgdorf

Eosin Y Sigma, Taufkirchen

Hematoxylin Sigma, Taufkirchen

Objektglas – Kleber Merck, Darmstadt

Objektträger Menzel-Gläser, Braunschweig

Parafin medite, Burgdorf

II.1.6. Software

BioCapt MW V.11.01 Vilber Lourmat, Marne la Vallére (F)

Prism 4 GraphPad Software, San Diego (USA)

SPOT Advanced V.3.4.5. Diagnostic Instruments, Sterling

Heights (USA)

II.1.7. Tiere

Die verwendeten Tiere waren Standardlabormäuse, die unter Standardbedingungen

gehalten wurden. Für die hier beschriebenen tierexperimentellen Untersuchungen lag

eine Tierversuchsgenehmigung durch das Regierungspräsidium Gießen vor (V54-

19CL0-15MR20/14).

Zum Einsatz kamen hier: C57BL6-Männchen und -Weibchen

COX-2-/--Männchen

COX-2+/--Weibchen

EP-2-/--Männchen und -Weibchen


II.2. Methoden

II.2.1. Spritzschema

Es hat sich gezeigt, dass das Gewicht der Mäuse linear zunimmt und jedem Tag PX

ein Gewicht Y zugeordnet werden kann. Um einen schonenden Umgang mit den Tie-

ren zu gewährleisten, wurde zur Bestimmung des zu injizierenden Volumens folgen-

des Schema benutzt. Dies gilt, wenn nicht anders angegeben, für alle Versuchsreihen.

Tag Gewicht Volumen

P1 - 3 2 g KG 20 µl/Maus

P4 - 6 3 g KG 20 µl/Maus

P7, P8 4 g KG 25 µl/Maus

P9, P10 5 g KG 25 µl/Maus

P11 - 14 6 g KG 30 µl/Maus

P15 - 18 7 g KG 35 µl/Maus

P19 - 21 8 g KG 35 µl/Maus

II.2.2. Zusammensetzung der Medikamente

II.2.2.1. ONO AE1-329 (EP-4-Agonist)

Die Stammlösung (SL) [20 µg/µl] ist 1:100 bzw. 1:25 mit Ethanol zu verdünnen.

Daraus ergeben sich Arbeitslösungen (AL) von 200 ng/µl bzw. 800 ng/µl. Um eine

Konzentration von 40 ng/g KG bzw. 160 ng/g KG zu erhalten, sind diese erneut nach

folgendem Schema mit NaCl zu verdünnen und das angegebene Volumen zu spritzen

(s. Tab. 1).

II.2.2.2. ONO AE1-259-01 (EP-2-Agonist)

Für diesen Versuch ist die Stammlösung (SL) [20 µg/µl] 1:100 bzw. 1:25 mit Ethanol

zu verdünnen. Es resultieren Arbeitslösungen (AL) in Konzentrationen von 200 ng/µl

bzw. 800 ng/µl. Für eine Dosis von 40 ng/g KG bzw. 160 ng/g KG, sind diese erneut


nach folgendem Schema mit NaCl zu verdünnen und das angegebene Volumen zu

spritzen (s. Tab. 1).

Tab. 1; Verdünnungsschema ONO AE1-329 bzw. ONO AE1-259-01

II.2.2.3. ONO AE1-329 (EP-4-Agonist) plus ONO AE1-259-01 (EP-2-Agonist)

Die Stammlösungen [20 µg/µl] sind im Verhältnis 1:25 (ONO-AE1-329) bzw. 1:6,25

(ONO-AE1-259-01) mit Ethanol zu verdünnen. So ergibt sich eine Arbeitslösung

von 800 ng/µl (ONO-AE1-329) bzw. 3,2 µg/µl (ONO-AE1-259-01). Für eine Kon-

zentration von 160 ng/g KG (ONO-AE1-329) bzw. 640 ng/g KG (ONO-AE1-259-

01) ist die AL erneut nach folgendem Schema mit NaCl zu verdünnen und das ange-

gebene Volumen zu spritzen (s. Tab. 1).

II.2.2.4. NOC-12 (NO-Donator)

Die SL (2mg NOC pro 100 µl NaOH 0,1 M) wird 100x mit 0,9% NaCl verdünnt. 1

µl dieser AL (200 µg/ml) sind pro g KG auf das entsprechende Gesamtvolumen mit

0,9% NaCl aufzufüllen (s. II.2.1.).

II.2.2.5. Spermine NONOate (NO-Donator)

Die SL (2,5 mg Spermine pro 100 µl NaOH 0,1 M bzw. pro 25 µl NaOH 0,1 M) ist

1:100 mit NaCl 0,9% zu verdünnen. 1 µl der entstandenen AL (250 µg/ml bzw. 1

mg/ml) füllt man pro g KG mit 0,9 % NaCl auf das Gesamtvolumen auf (s. II.2.1.).

Tag Gewicht Verhältnis Volumen

1-3 2g KG 1:50 20 µl/Maus

4-6 3g KG 1:33,3 20 µl/Maus

7,8 4g KG 1:31,25 25 µl/Maus

9,10 5g KG 1:25 25 µl/Maus

11-14 6g KG 1:25 30 µl/Maus

15-18 7g KG 1:25 35 µl/Maus

19-21 8g KG 1:21,9 35 µl/Maus


II.2.2.6. Troglitazone (PPAR�-Agonist)

Die SL (0,8 mg Troglitazone + 160 µl PEG 200 + 8 µl Triton 100) lag in einer Kon-

zentration von 5 µg/µl vor. Diese wurde nach folgender Tabelle mit 0,9% NaCl ver-

dünnt und das angegebene Volumen wurde gespritzt (s. Tab. 2).

Tab. 2; Verdünnungsschema Troglitazone

II.2.2.7. ONO AE3-208 (EP-4-Antagonist)

Die SL [20 µg/µl] ist 1:10 mit Ethanol zu verdünnen. Daraus ergibt sich eine AL von

2 µg/µl. Diese wurde zu folgenden Verhältnissen mit 0,9% NaCl verdünnt und das

angegebene Volumen gespritzt (s. Tab. 3).

Tab. 3; Verdünnungsschema ONO AE3-208


1-3 2g KG 1:250 20 µl/Maus

4-6 3g KG 1:166 20 µl/Maus

7,8 4g KG 1:156 25 µl/Maus

9,10 5g KG 1:125 25 µl/Maus

11-14 6g KG 1:125 30 µl/Maus

15-18 7g KG 1:125 35 µl/Maus

19-21 8g KG 1:110 35 µl/Maus


1-3 2g KG 1:50 20 µl/Maus

4-6 3g KG 1:36 20 µl/Maus

7,8 4g KG 1:29 25 µl/Maus

9,10 5g KG 1:25 25 µl/Maus

11-14 6g KG 1:27 30 µl/Maus

15-18 7g KG 1:25 35 µl/Maus

19-21 8g KG 1:22 35 µl/Maus


II.2.2.8. SC-236 (COX-2-Inhibitor)

Die SL (10 mg SC + 1 ml DMSO) ist 1:2 mit Ethanol zu verdünnen. Von dieser re-

sultierenden AL [5 mg/ml] sind 0,5 µl pro g KG auf das entsprechende Gesamtvolu-

men mit 0,9 % NaCl aufzufüllen (s. II.2.1.).

II.2.2.9. Parecoxib (COX-2-Inhibitor)

Die SL (20 mg Parecoxib + 1 ml NaCl) ist 1:16 mit 0,9 % NaCl zu verdünnen. Von

der sich ergebenden AL [1,25 µg/µl] sind 2 µl pro g KG auf das entsprechende Ge-

samtvolumen mit 0,9 % NaCl aufzufüllen (s. II.2.1.).

II.2.2.10. GW 501516 (PPARd-Agonist)

Die SL (1 mg GW + 500 µl DMSO) ist 1:5 mit Ethanol zu verdünnen. 0,5 µl pro g

KG der resultierenden AL [400 ng/µl] sind auf das entsprechende Gesamtvolumen

mit 0,9 % NaCl aufzufüllen (s. II.2.1.).

II.2.2.11. Rofecoxib (COX-2-Inhibitor ) (Tränke)

Die SL (25 mg/5 ml Suspension) wird 1:10 mit H2O verdünnt. Die sich ergebende

AL [500 µg/ml] ist in eine Tränke zu füllen.

II.2.2.12. SC-236 (COX-2-Inhibitor ) (Tränke)

Für diesen Versuch muss die Stammlösung (5 mg SC + 1,5 ml PEG 200 + 83 µl

TWEEN 20) im Verhältnis 1:250 bzw. 1:100 mit H2O verdünnt werden. So erge-

ben sich Arbeitslösungen von 12 µg/ml bzw. 30 µg/ml. Diese sind in Tränken zu fül-

len.

II.2.2.13. Spermine NONOate (NO-Donator) (Tränke)

40 µl der SL (1 mg Spermine + 1 ml NaOH 0,1 M) sind mit 20 ml H2O zu mischen

und in eine Tränke zu geben.


II.2.3. Verabreichen der Medikamente

II.2.3.1. Spritzen der Mäuse

Bis auf wenige Ausnahmen (s. II.2.3.2.) bekamen die Tiere alle Präparate i.p. bzw.

s.c. verabreicht. Dazu wurden die Mäuse meist gegen 8 Uhr morgens das erste Mal,

und ca. 10 Stunden später am Abend das zweite Mal gespritzt. Hierzu wurden die

Jungen für diese Zeit von der Mutter getrennt und direkt nach erfolgtem Spritzvor-

gang wieder zurückgesetzt.

Von Tag P1 bis P5 erfolgte die Injektion mittels Insulinspritze subcutan in eine Haut-

falte zwischen den Schulterblättern, nachdem die Einstichstelle zuvor mit Alkohol

desinfiziert wurde. Ab Tag P6 bis P21 wurde die Spritze intraperitoneal verabreicht,

ebenfalls nach vorheriger Desinfektion. Dazu sind die Mäuse durch Griff in den Na-

cken und Fixieren des Schwanzes geschickt in der Hand aufzuspannen.

Auf Grundlage des oben aufgeführten Schemas (s II.2.1.) wurde den Mäusen an den

jeweiligen Tagen das entsprechende Gesamtvolumen gespritzt.

II.2.3.2. Versuche über die Tränke

Neben Versuchen, bei denen die Präparate direkt den Jungen injiziert wurden, erfolg-

ten auch Versuche, bei denen die Präparate über die Tränke in das Muttertier und

weiter über die Muttermilch in die Jungtiere gelangte.

SC-236 und Rofecoxib wurden in den oben angegebenen Konzentrationen in eine

lichtschutzverpackte Trinkflasche gegeben und alle 3 Tage erneuert. Um die Suspen-

sion des Rofecoxibs aufrechtzuerhalten, musste zusätzlich ein Magnetrührer einge-

setzt werden, der dauerhaft lief.

Da Spermine NONOate in wässrigem Milieu eine relativ kurze Halbwertszeit (t½ =

230 min) hat, wurden diese Tränken täglich sowohl morgens als auch abends erneu-

ert. Im Unterschied zu SC-236 und Rofecoxib bekam hier das Muttertier bereits ab

Tag E6 bis Tag P21 die mit Spermine NONOate versetzte Tränke.


II.2.4. Genotypisierung

Da bei Zucht der Nachkommen immer ein COX-2-/--Männchen mit einem COX-2+/--

Weibchen verpaart wurde, waren auch die Jungen nach den Mendel’schen Regeln

entweder homo- oder heterozygot. Um den Genotyp der Jungtiere unterscheiden zu

können, wurden um den Tag P14 den Mäusen Ohrmarken gesetzt und eine Schwanz-

biopsie entnommen.

II.2.4.1. Isolation der DNA

1a) Zunächst werden die Gewebeproben in jeweils einem 1,5 ml Eppendorf-Cup mit

500 µl Schwanz-Lyse-Puffer versetzt

Schwanz-Lyse-Puffer auf 100 ml

100 mM Tris-HCl (pH 8,5) 1,576 g5 mM EDTA 0,1461 g0,2 % SDS 0,2 g200 mM NaCl 1,1688 g

1b) Zugabe von 5 µl 1/100 vol. Proteinase K (10 mg/ml)

2) Nun wird das Ganze bei 55°C über Nacht in einem Thermomixer geschüttelt

3) Am nächsten Tag entnimmt man die Cups dem Thermomixer und zentrifugiert

sie 10 Minuten bei Raumtemperatur und 13000 rpm

4) Währenddessen Vorbereiten neuer Eppendorf-Cups und Befüllen mit 500 µl

ISOpropanol

5) Entnahme der Cups aus der Zentrifuge (s. Schritt 3). Der Überstand, der sich hier

gebildet hat, wird abpipettiert und in das jeweilige neue Eppendorf-Cup aus

Schritt 4 gegeben

6) Die Cups werden nun solange auf einem Mini-Shaker gedreht, bis das DNA-

Pellet sichtbar wird

7) Bei 12000 rpm 10 - 20 Sekunden die Cups abzentrifugieren


8) Der Überstand, der hierbei entsteht, wird abpipettiert und verworfen. Das zu-

rückbleibende DNA-Pellet wird durch Zugabe von 500 µl 70 %igen Ethanol

und durch Drehen mit dem Mini-Shaker gewaschen

9) Erneutes Zentrifugieren des Cups für 5 Minuten bei 4°C und 13000 rpm

10) Der entstandene Überstand ist ebenfalls zu verwerfen und das DNA-Pellet min-

destens 10 Minuten, bis alles Ethanol verdampft ist, an der Luft zu trocknen

11) Abschließend muss das Pellet in 250 µl TE durch Drehen auf dem Mini-Shaker

bei Raumtemperatur gelöst werden, um es dann für 1 - 2 Stunden bei 55°C im

Thermomixer zu schütteln

II.2.4.2. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht es, gezielte DNA-Abschnitte, die

von zwei bekannten DNA-Sequenzen eingerahmt werden, zu amplifizieren. Die

Stränge der Ziel-DNA werden durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt. Danach wird

die Reaktion abgekühlt, um die Hybridisierung der Primer zu erlauben. Von diesen

ausgehend synthetisiert die DNA-Polymerase in Gegenwart von dNTP neue kom-

plementäre DNA-Stränge. Dieser Zyklus wird 35-mal wiederholt, sodass es zu einem

exponentiellen Anstieg der Produkte kommt.

1) Zunächst werden entsprechende PCR-Cups beschriftet und mit jeweils 2 µl

DNA befüllt

2) Ansetzen des Mastermixes auf Eis bzw. Kühlplatte (n+1)

Taq-Puffer 2 µl2 mM dNTP 2 µlF-Primer (1:10) 1 µlR-Primer (1:10) 1 µlNeo-Primer (1:10) 1 µlRNase-freies Wasser 10 µlTaq-Polymerase 1 µl

3) Zugabe von 18 µl Mastermix zur DNA in die Cups


4) PCR-Ansatz auf Kühlplatte stehen lassen und Programm am Thermocycler star-

ten. Wenn die Blocktemperatur 95°C erreicht hat, können die Cups in den

Thermocycler gestellt und der Deckel geschlossen werden. Die PCR startet nun

mit folgendem Programm:

94°C 5 Minuten95°C 30 Sekunden58°C 30 Sekunden72°C 30 Sekunden72°C 5 Minuten

4°C Pause35 Zyklen

II.2.4.3. Gelzubereitung

Zum Gießen eines Gels von mittlerer Größe fügt man zu 75 ml 1x TAE, 1 g Agaro-

se hinzu. Nun kocht man die Mischung solange in der Mikrowelle, bis keine Schlie-

ren mehr zu erkennen sind und die Lösung völlig klar ist.

Anschließend sind noch 0,75 µl Ethidiumbromid hinzuzufügen, bevor man dazu

übergeht, es in eine entsprechende Form zu gießen und einen passenden Proben-

kamm einzustecken.

Nach ca. 30 Minuten ist das Gel erstarrt und kann befüllt werden, um die Gele-

lektrophorese zu starten.

50x TAE

Tris-Base 242 g100% Eisessig 57,1 ml0,5 M EDTA (pH 8) 100 mlad ddH2O 1000 ml

II.2.4.4. Gelelektrophorese

Das vollkommen erstarrte Gel wird nun in die Trennkammer gelegt, wobei auf die

korrekte Ausrichtung des Gels zu achten ist. Die Trennkammer wird dann solange

mit 1x TAE befüllt, bis das Gel leicht damit bedeckt ist.


Die fertigen PCR-Produkte sind, ehe sie für die Elektrophorese verwendet werden

können, noch mit jeweils 4 µl eines 6x Probenpuffers zu versetzen.

Bevor die Elektrophorese gestartet werden kann, müssen zuerst die mit dem Proben-

kamm geschaffenen Taschen befüllt werden. Dazu gibt man mit einer Pipette in die

beiden äußeren Geltaschen 10 µl 100 Base-Pair-Ladder und in die dazwischen lie-

genden Taschen 7 µl des PCR-Produkts. Jetzt kann der Deckel der Trennkammer

geschlossen und der Vorgang mit 140 V und 100 mA gestartet werden. Nach 30 -

40 Minuten sollten die Banden soweit gelaufen sein, dass sie ein verwertbares Bild

ergeben.

6x Probenpuffer

Bromophenol blue 0,25% 0,025 gXylene cyanol ff 0,25% 0,025 gSucrose (w/v) 4 gad ddH2O 100 ml

Abb. 1; Bild der Gelelektrophorese von drei COX-2+/--Tieren mit Doppelbande und von dreiCOX-2-/--Tieren mit Einzelbande

COX-2+/-

COX-2+/-

COX-2+/-

COX-2-/-

COX-2-/-

COX-2-/-


Dieses Bild wird nun unter UV-Licht mit der Dokumentationseinrichtung der Firma

Vilber Lourmat dokumentiert und ausgewertet.

Dabei stellt das Bild mit einer Bande bei 905 bp ein COX-2-/--Tier, bzw. eine Bande

bei 905 bp und bei 760 bp das Bild eines COX-2+/--Tieres dar. (s. Abb. 1)

II.2.5. Präparation der Mäuse

Am Tag P22 erfolgte die Präparation der Tiere. Dazu wurden die Mäuse zunächst

mit Forene® durch Inhalation narkotisiert. Anschließend wurden sie mit ca. 20 µl ei-

nes 1:1 Gemisches aus Ketavet® und Rompun® anästhesiert bzw. sediert.

Nun konnten die Tiere auf einer Styroporplatte mit Kanülen an den Extremitäten fi-

xiert werden. Es erfolgte die sagitale Laparotomie mit anschließendem Aufsuchen

und Durchtrennen der Vena cava inferior, um die Nieren weitgehend blutleer zu be-

kommen. Nach dem Ausbluten wurden nacheinander die Nieren aufgesucht, der Nie-

renpol durchtrennt, die Nieren entnommen und auf Eis gelegt. Zusätzlich erfolgte

noch auf gleiche Art und Weise die Entnahme des Herzens.

Um die Ratio aus Nieren- und Körpergewicht zu bestimmen, wurden die Organe mit

einer Analysenfeinwaage direkt abgewogen. Die Kadaver wurden der entsprechen-

den Verwertung zugeführt.

II.2.6. Fixieren der Organe

Bevor die Organe fixiert werden, teilt man die Nieren zuerst in der Mitte. Jeweils ei-

ne Hälfte der linken, wie auch eine Hälfte der rechten Niere wurden in mit 4% Para-

formaldehyd befüllte Eppendorf-Cups gegeben. Die jeweils anderen beiden Hälften

wurden in ein Carnoy-Gemisch gelegt bzw. kryofixiert. Die Herzen sind ebenfalls in

einem Kryo-Tube kryofixiert.

Während die kryofixierten Organe anschließend direkt bei -80°C gelagert werden

können, lässt man die Organe in Paraformaldehyd bzw. Carnoy über Nacht fixieren,

ehe sie am nächsten Tag in Alkohol umgebettet werden. Dabei gibt man die mit Pa-

raformaldehyd fixierten Präparate in mit 70% Ethanol gefüllte Eppendorf-Cups, mit


Carnoy fixierte in mit 100% Ethanol gefüllte Cups. Nun können auch diese Präparate

auf Dauer im Kühlschrank gelagert oder zur weiteren Bearbeitung in Parafin einge-

bettet werden.

Carnoy’s Fix

100% Ethanol 150 mlChloroform 75 ml100% Essigsäure 25 ml

4% Paraformaldehyd

Paraformaldehyd 4gPBS 100 mlbei 70°C

II.2.7. Parafineinbetten der Organe

Zum Parafineinbetten und demnach zur weiteren Auswertung wurden die mit Para-

formaldehyd fixierten linken Nierenhälften verwendet. Da diese in 70% Ethanol la-

gerten, zum Parafineinbetten jedoch frei von Wasser sein müssen, erfolgte zunächst

eine aufsteigende Alkoholreihe. Dabei wurden sie jeweils in Falcon-Tubes hin und

her geschwenkt.

1) Einlegen der Nieren für 1 Stunde in 80% Ethanol



4) Einlegen der Nieren für 1 Stunde in neues 100% Ethanol (Schritt 3 wiederholen)

5) Einlegen der Nieren für 1 Stunde Xylol

6) Einlegen der Nieren für 1 Stunde neues Xylol (Schritt 5 wiederholen)

7) Nun werden die Nieren aus den Falcon-Tubes geholt und in entsprechende Ein-

bettkästen gelegt. Jetzt werden alle Kästen in ein Gefäß mit 62°C heißem Parafin

gegeben und für eine Stunde in einem Ofen mit ebenfalls 62°C gestellt

8) Nach dieser Zeit holt man das Gefäß mit den Kästen wieder aus dem Ofen,

nimmt die Kästen nacheinander aus dem Gefäß und gibt diese in ein zweites, mit


frischem, 62°C heißem Parafin gefülltes Gefäß. Auch dieses neue Gefäß mit den

Kästen darin wird für 1 Stunde bei 62°C in den Ofen gestellt

9) Nach dieser weiteren Stunde werden die Kästen mit den Nieren aus dem Ofen

und nacheinander aus dem Parafin genommen. Man stellt die Organe dann mit

der Schnittfläche nach unten in eine Gussform und gießt die Form mit heißem

Parafin aus. Als spätere Haltevorrichtung im Mikrotom dient ein Teil des Ein-

bettkastens, den man auf dem noch flüssigen Parafin platziert und mit dem Para-

finblock aushärten lässt. Die Aushärtung geschieht auf einer Kühlplatte. Nach

ca. 15 Minuten können die Parafinblöcke mit den Nieren darin aus der Gussform

befreit werden und sind nun zum Schneiden bereit.

II.2.8. Schneiden der Organe

Zum Anfertigen histologischer Schnitte werden die Parafinblöcke in eine entspre-

chende Haltevorrichtung des Mikrotoms gespannt. Nun wird der Block mehrfach

vertikal über ein Messer gezogen. Die ca. 4 µm starken Schnitte sind dann mittels

Pinzette und Pinsel vorsichtig vom Messer zu trennen und auf ein ca. 44°C heißes

Wasserbad zu legen. Dies dient der Streckung der Schnitte.

Vor und zwischen den Schnittvorgängen ist darauf zu achten, dass die Blöcke stets

mit Eis oder einem feuchten Tuch gekühlt werden. Sollten die Schnitte einmal nicht

exakt gelingen, empfiehlt es sich, den Parafinblock kurz anzuhauchen.

Um die fertigen Schnitte auf einen Objektträger zu bekommen, taucht man diesen in

das Wasserbad ein, fährt unter den Schnitt und lässt ihn durch vorsichtiges Anheben

sachte darauf gleiten.

II.2.9. Färben der Organe

Bevor die Schnitte jedoch gefärbt werden können, müssen sie zunächst einmal in ei-

nem Trockenschrank bei 37°C über Nacht getrocknet werden. Am folgenden Tag

sind die Präparate dann in mehreren Schritten zu färben. Zuerst befreit man sie vom


Parafin. Dazu stellt man die Objekttr�ger in eine spezielle Halterung, mit deren Hilfe

mehrere Tr�ger in die entsprechenden Medien getaucht werden k�nnen.

1) Eintauchen der Schnitte f�r 5 Minuten in Xylol

2) Eintauchen der Schnitte f�r 5 Minuten in neues Xylol

Das Xylol aus den jeweiligen Schritten kann mehrfach verwendet werden

3) Eintauchen der Schnitte f�r 2 Minuten in Methanol

4) Eintauchen der Schnitte f�r 2 Minuten in frisches Methanol

Die 2 Minuten sind genau einzuhalten

5) Eintauchen der Schnitte f�r 2 Minuten in Leitungswasser

6) Eintauchen der Schnitte f�r 2 Minuten in neues Leitungswasser

Es erfolgt nun der eigentliche F�rbeschritt.

1) Eintauchen der Pr�parate f�r 50 Sekunden in Hematoxylin Gill � 1

2) Pr�parate 1 - 2 Minuten unter flie�endem Wasser bl�uen

3) Eintauchen der Pr�parate f�r 30 Sekunden in Eosin Y

4) Pr�parate in ein leeres Gef�� stellen und dieses 3 - 4 mal mit Leitungswasser

aussp�len

Es schlie�t sich die Entw�sserung der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe

an.

1) Eintauchen der Schnitte f�r 1 Minute in 50% Ethanol




5) Eintauchen der Schnitte f�r 3 Minute in frischen 100% Ethanol

6) Eintauchen der Schnitte f�r 1 Minute in Xylol


Abschließend werden die Objektträger noch mit einem Deckglas versehen, das mit

Entellan®-Kleber befestigt wurde. Sobald der Kleber getrocknet ist, können die

Schnitte unter dem Mikroskop betrachtet werden.

II.2.10. Mikroskopieren der Organe

Die Nieren wurden bei 200 facher Vergrößerung mit einem Mikroskop der Firma

Leica betrachtet, wobei das Mikroskop an eine Kamera angeschlossen war, die wie-

derum mit einem Computer verbunden wurde. Über diesen Computer erfolgte an-

hand des Bilds der Kamera und mit Hilfe der Software SPOT Advanced V.3.4.5. die

Auswertung der Schnitte. Dazu habe ich durch Fällen des Lots die einzelnen Durch-

messer der Glomeruli und deren radiären Abstand von der Nierenkapsel bestimmt

und dokumentiert. Hierbei gingen allerdings nur Abstände kleiner 58 µm in die

Auswertung mit ein. Auf Grundlage der Formel V = 0,5236 * d3 wurden die Volu-

mina der einzelnen Glomeruli errechnet.

Mit Hilfe der erwähnten Apparatur wurden auch Photos zur weiteren Dokumentation

angefertigt.

II.2.11. Statistische Auswertung

Die statistische bzw. graphische Auswertung der gewonnenen Daten erfolgte mittels

der Software PRISM 4. Wie bereits erwähnt, flossen hier alle Kapseldistanzen klei-

ner 58 µm in die Berechnung ein.

Der Vergleich der Glomerulumvolumina und der Glomerulumdistanzen von der Nie-

renkapsel erfolgte mit Hilfe des U-Tests nach Whitney-Mann, der deshalb gewählt

wurde, weil weder symmetrische noch Normalverteilung für die Durchführbarkeit

gefordert wird. Der U-Test vergleicht die zentrale Tendenz zweier unabhängiger

Stichproben. Ist er signifikant, ist davon auszugehen, dass sich die Mediane der

zugrunde liegenden Populationen unterscheiden. Im 95% - Konfidenzintervall mit

einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% im zweiseitigen Test.

Ergebnisse 37_____________________________________________________________________________________________________________

III. Ergebnisse

III.1. COX-2-/-

Für die histomorphologische Beschreibung der Niere wurden folgende Parameter he-

rangezogen: 1. Das Verhältnis bzw. die Ratio von Gesamtnierengewicht zum Kör-

pergewicht der Maus, 2. Das Volumen der Glomeruli, 3. Der Abstand der Glomeruli

vom kortikalen Rand, 4. Die relative Verteilung der Glomeruli.

Die Nieren der COX-2-/--Mäuse zeigen am Tag P22 eine Ratio des Gesamtnierenge-

wichts zum Körpergewicht von durchschnittlich 8,5 • 10-3 ± 0,6 • 10-3. Der Wildtyp

weist eine Ratio von 14,2 • 10-3 ± 0,9 • 10-3 auf.

Die histomorphologische Analyse der Nieren ergab Volumina von 16600 ± 1045

µm3 für die unbehandelten COX-2-/--Tiere und 25440 ± 1422 µm3 für die Wildtyp-

Tiere (p < 0,001, N = 330) (s. Abb. 1-4).

Bezüglich der Distanzen der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel zeigte sich

ein im Mittel signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen: unbehandelte

COX-2-/--Tiere 22,39 ± 1,38 µm, Wildtyp-Tiere 50,42 ± 1,48 µm (p < 0,001, N =

330) (s. Abb. 1-4).

Abb. 1; Balkendiagramm der Glomerulumvo- Abb. 2; Balkendiagramm der Kapseldi-lumina einer COX-2-/--Niere gegenüber einer stanzen einer COX-2-/--Niere gegenüberWT-Niere, * p < 0,05 versus Wildtyp einer WT-Niere, * p < 0,05 versus Wild-

typ

-/-

COX-2Wild

typ0

10000

20000

30000

*

�m

3

-/-

COX-2Wild

typ0

10

20

30

40

50

60

*�m

Ergebnisse 38_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 3; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus in H.E.-F�rbungam Tag P22. Zu sehen sind die deutlich verkleinerten Glomeruli, die subkapsul�r liegen und damit einen zu geringen Kapselabstand aufweisen. Im Organinneren ein gut ent-wickeltes Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Abb. 4; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer Wildtyp-Maus in H.E.-F�rbungam Tag P22. Zu sehen sind gut entwickelte Glomeruli mit ausreichendem Kapselab-stand; � Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Ergebnisse 39_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 5; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser einer COX-2-/--Niere imVergleich zu einer WT-Niere

Trägt man die erhobenen Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-

Achse und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse auf, so ergibt sich für das unbe-

handelte COX-2-/--Tier ein charakteristisches Bild mit einem Peak bei 29,08 µm und

einem zweiten bzw. einer „Schulter“ bei 40,71 µm. Beim Wildtyp-Tier zeigt sich nur

ein Peak bei 40,71 µm (s. Abb. 5).

III.1.1. Zusammenfassung der histomorphologischen Daten

COX-2-/- Wildtyp

Glomerulumvolumen (µm3) 16600 ± 1045 25440 ± 1422

Kapseldistanz (µm) 22,39 ± 1,38 50,42 ± 1,48

% Glomeruli innerhalb 58µm 49 % 6 %

Ratio (Niere : Körper) (• 10-3) 8,5 ± 0,6 14,2 ± 0,9

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häuf

igke

it

Ergebnisse 40_____________________________________________________________________________________________________________

III.2. COX-2-Inhibitoren

Ziel dieser Versuchsreihe war es zu überprüfen, ob selektive COX-2-Hemmer die

Nephrogenese bei Wildtyp-Mäusen nachhaltig stören bzw. behindern und ob so phar-

makologisch das Bild einer COX-2-/--Niere erzeugt werden kann. Zum Einsatz ka-

men dabei der experimentelle COX-2-Hemmer SC-236, sowie die klinisch genutzten

Hemmstoffe Parecoxib und Rofecoxib. SC-236 wurde in zwei verschiedenen Kon-

zentrationen, 12 µg/ml und 30 µg/ml, über die Wassertränke, und in einem anderen

Versuch intraperitoneal (i.p.) verabreicht. Parecoxib wurde mit einer Dosis von 2,5

µg/g KG und Rofecoxib mit 500 µg/ml gegeben.

III.2.1.1. Applikation von SC-236 über die Tränke

In einer Konzentration von 12 µg/ml in der Wassertränke ergab sich nach Entnahme

der Nieren am Tag P22 eine Ratio des Gesamtnierengewichts zum Körpergewicht

von durchschnittlich 12,87 • 10-3 ± 0,57 • 10-3.

Die histomorphologische Untersuchung der Nieren ergab für die Glomerulumvolu-

mina Werte von: 22460 ± 1273 µm3 (behandelte Wildtyp-Tiere), 25440 ± 1422 µm3

(unbehandelte Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (COX-2-/--Tiere). Dies ergibt

eine signifikante Differenz sowohl zwischen behandelten Wildtyp-Tieren und COX-

2-/--Tieren (p < 0,001, N = 340) als auch zwischen den behandelten und den unbe-

handelten Wildtyp-Tieren (p < 0,001, N = 340) (s. Abb. 6, 16, 17).

Bei der histomorphologische Auswertung der Glomerulumdistanzen von der Nieren-

kapsel misst man folgende Werte: 20,49 ± 1,01 µm (behandelte Wildtyp-Tiere),

50,42 ± 1,48 µm (unbehandelte Wildtyp-Tiere) und 22,39 ± 1,38 µm (COX-2-/--

Tiere). Damit zeigt sich zwischen den unbehandelten und den behandelten Wildtyp-

Tieren ein signifikanter Unterschied (p < 0,001, N = 136) (s. Abb. 6, 16, 17).


Achse und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse auf, so zeigt sich für die behan-

delten Wildtyp-Tiere ein sowohl vom COX-2-/--Tier als auch vom unbehandelten

Wildtyp-Tier abweichendes Bild. Die Verteilungskurve verläuft zudem deutlich

niedriger (s. Abb. 7).

Ergebnisse 41_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 6; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer Wildtyp-Maus, behandelt mit 12 �g/ml SC-236 �ber Wassertr�nke, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigtverkleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand.Im Inneren ein gut entwickeltes Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser, � Kapsel-distanz

Abb. 7; Relative H�ufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 12 �g/ml SC-236 (Tr�nke), im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 SC-236_T-12

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 42_____________________________________________________________________________________________________________

In einer Konzentration von 30 µg/ml in der Wassertränke ergab sich nach Entnahme


von im Schnitt 11,2 • 10-3 ± 0,5 • 10-3.

Die Analyse der Histomorphologie der Nieren in diesem Versuchsansatz ergab für

die Glomerulumvolumina: 17620 ± 446 µm3 (behandelte Wildtyp-Mäuse), 25440 ±

1422 µm3 (unbehandelte Wildtyp-Mäuse) und 16600 ± 1045 µm3 (COX-2-/--Mäuse).

Dies stellt einen signifikanten Unterschied sowohl zwischen behandelten und unbe-

handelten Tieren dar (p < 0,001, N = 372) als auch zwischen den behandelten und

den COX-2-/--Tieren (p < 0,001, N = 372) (s. Abb. 8, 16, 17).

Bei der histomorphologische Untersuchung der Nieren zeigte sich für die Distanzen

der Glomeruli von der Nierenkapsel: 16,06 ± 1,32 µm (behandelte Wildtyp-Tiere),


Tiere). Damit unterscheiden sich die behandelten Tiere sowohl signifikant von den

unbehandelten (p < 0,001, N = 153) als auch von den COX-2-/--Tieren (p = 0,001,

N = 153) (s. Abb. 8, 16, 17).

Abb. 8; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer Wildtyp-Maus, behandelt mit30 �g/ml SC-236 �ber Wassertr�nke, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigtdeutlich verkleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapsel-abstand. Im Inneren ein gut entwickeltes Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser,� Kapseldistanz

Ergebnisse 43_____________________________________________________________________________________________________________

Auftragen der erhobenen Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-

Achse und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse ergibt für die behandelten Wild-

typ-Tiere ein sowohl vom COX-2-/--Tier als auch vom unbehandelten Wildtyp-Tier

abweichendes Bild. (s. Abb. 9)

Abb. 9; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 30 µg/ml SC-236 (Tränke), im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

III.2.1.2. Applikation von SC-236 intraperitoneal

In einem weiteren Versuchsansatz wurde die Wirkung des i.p. verabreichten COX-2-

Hemmers SC-236 untersucht.

In einer Konzentration von 2,5 µg/g KG zeigte sich nach Entnahme der Nieren am

Tag P22 eine Ratio des Gesamtnierengewichts zum Körpergewicht von durchschnitt-

lich 12,73 • 10-3 ± 0,11 • 10-3.

Die Auswertung der histomorphologischen Daten der Glomeruli ergab Volumina

von: 19450 ± 503 µm3 (behandelte Wildtyp-Mäuse), 25440 ± 1422 µm3 (unbehandel-

te Wildtyp-Mäuse) und 16600 ± 1045 µm3 (COX-2-/--Mäuse). Daraus ergibt sich so-

wohl ein signifikanter Unterschied zwischen den behandelten und den unbehandelten

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 SC-236_T-30

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 44_____________________________________________________________________________________________________________

Tieren (p < 0,001, N = 321) als auch zwischen den behandelten und den COX-2-/--

Tieren (p < 0,001, N = 321) (s. Abb. 10, 16, 17).

Untersuchungen zur Histomorphologie der Glomerulumdistanzen von der Nieren-

kapsel ergaben: 40,18 ± 1,48 µm (behandelte Wildtyp-Mäuse), 50,42 ± 1,48 µm (un-

behandelte Wildtyp-Mäuse) und 22,39 ± 1,38 µm (COX-2-/--Mäuse). Auch hier er-

gibt sich daraus sowohl ein signifikanter Unterschied zwischen den behandelten und

den unbehandelten Tieren (p = 0,001, N = 57) als auch zwischen den behandelten

und den COX-2-/--Tieren (p < 0,001, N = 57) (s. Abb. 10, 16, 17).

Abb. 10; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer Wildtyp-Maus, behandelt mit2,5 �g/g KG SC-236 (i.p.), in H.E.-F�rbung am Tag P22. Zu sehen sind verklein-erte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit m��igem Kapselabstand; � Glomerulum-durchmesser, � Kapseldistanz



delten Wildtyp-Mäuse ein sowohl von den COX-2-/--Mäusen als auch von den unbe-

handelten Wildtyp-Mäusen abweichendes Bild. (s. Abb. 11)

Ergebnisse 45_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 11; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 2,5 µg/g KG SC-236 (i.p.), im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

III.2.1.3. Zusammenfassung der histomorphologischen Daten

COX-2-Hemmer SC-236 (Tränke)

(12 µg/ml)

SC-236 (Tränke)

(30 µg/ml)

SC-236 (i.p.)

(2,5 µg/g KG)

Glomerulumvolumen (µm3) 22460 ± 1273 17620 ± 446 19450 ± 503

Kapseldistanz (µm) 20,49 ± 1,01 16,06 ± 1,32 40,18 ± 1,48

% Glomeruli innerhalb 58µm 37 % 45 % 18 %

Ratio (Niere : Körper) (• 10-3) 12,87 ± 0,57 11,2 ± 0,5 12,73 ± 0,11

III.2.2. Applikation von Parecoxib

Im Folgenden wurde die differenzierungsstörende Wirkung zweier klinisch genutzter

COX-2-Inhibitoren, Parecoxib und Rofecoxib, untersucht.

Nach Applikation von Parecoxib in einer Konzentration von 2,5 µg/g KG ergab sich

nach Entnahme der Nieren am Tag P22 eine Ratio des Gesamtnierengewichts zum

Körpergewicht von durchschnittlich 14,27 • 10-3 ± 0,8 • 10-3.

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 SC-236

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 46_____________________________________________________________________________________________________________

Die histomorphologische Untersuchung der Nieren ergab für die Glomerulumvolu-

mina Werte von: 17520 ± 377 µm3 (behandelte Wildtyp-Tiere), 25440 ± 1422 µm3

(unbehandelte Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (COX-2-/--Tiere). Dies ergibt

eine signifikante Differenz sowohl zwischen behandelten Tieren und unbehandelten

Tieren (p < 0,001, N = 373) als auch zwischen den behandelten und den COX-2-/--

Tieren (p < 0,001, N = 373) (s. Abb. 12, 16, 17).

Abb. 12; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer Wildtyp-Maus, behandelt mit2,5 �g/g KG Parecoxib, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Zu sehen sind verkleinerteGlomeruli, mit m��igem Kapselabstand; � Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz


kapsel misst man folgende Werte: 42,02 ± 0,93 µm (behandelte Wildtyp-Tiere),


Tiere). Neben einer signifikanten Differenz zwischen behandelten und unbehandelten

Tieren (p = 0,003, N = 59), bedeutet dies zudem einen signifikanten Unterschied

zwischen behandelten und COX-2-/--Tieren (p < 0,001, N = 59) (s. Abb. 12, 16, 17).

Ergebnisse 47_____________________________________________________________________________________________________________


Achse und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse ergibt für die behandelten Wild-

typ-Tiere ein sowohl von den COX-2-/--Tieren als auch von den unbehandelten Wild-

typ-Tieren abweichendes Bild. (s. Abb. 13)

Abb. 13; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 2,5 µg/g KG Parecoxib, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

III.2.3. Applikation von Rofecoxib

In einer weiteren Versuchsserie wurde Rofecoxib hinsichtlich seiner Wirkung auf die

Nephrogenese untersucht. Rofecoxib wurde in einer Konzentration von 500 µg/ml

der Wassertränke zugefügt.

Nach Entnahme der Nieren am Tag P22 ergab sich eine Ratio des Gesamtnierenge-

wichts zum Körpergewicht von durchschnittlich 12,92 • 10-3 ± 0,43 • 10-3.

Die Auswertung der Histomorphologie der Nieren in diesem Versuchsansatz ergab

folgende Glomerulumvolumina: 17250 ± 717 µm3 (behandelte Wildtyp-Tiere),

25440 ± 1422 µm3 (unbehandelte Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (COX-2-/--

Tiere). Daraus folgt eine signifikante Differenz sowohl von behandeltem versus un-

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 Parecoxib

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 48_____________________________________________________________________________________________________________

behandeltem Tier (p < 0,001, N = 352) als auch von behandelten versus COX-2-/--

Tieren (p < 0,001, N = 352) (s. Abb. 14, 16, 17).

Bei der histomorphologische Untersuchung der Nieren zeigte sich für die Distanzen

der Glomeruli von der Nierenkapsel: 31,52 ± 1,3 µm (behandelte Wildtyp-Tiere),


Tiere). Damit unterscheiden sich die behandelten Tiere sowohl signifikant von den

unbehandelten (p = 0,001, N = 118) als auch von den COX-2-/--Tieren (p < 0,001, N

= 118) (s. Abb. 14, 16, 17).

Abb. 14; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer Wildtyp-Maus, behandelt mit500 �g/ml Rofecoxib �ber Wassertr�nke, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigt verkleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand.Im Inneren ein gut entwickeltes Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser, � Kapsel-distanz



delten Wildtyp-Mäuse ein gering von den COX-2-/--Mäusen abweichendes Bild. Je-

doch ist die charakteristische „Schulter“ bei 40 µm nicht ausgeprägt. (s. Abb. 15)

Ergebnisse 49_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 15; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 500 µg/ml Rofecoxib (Tränke), im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-


COX-2-Hemmer Parecoxib

(2,5 µg/g KG i.p.)

Rofecoxib

(500 µg/ml im Trinkwasser)





III.2.5. Vergleichende Zusammenstellung

Im Folgenden sind jeweils alle Glomerulumvolumina und Kapseldistanzen der Glo-

meruli in einem Balkendiagramm dargestellt.

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 Rofecoxib

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 50_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 16; Balkendiagramm der Glomerulumvolumina, * p < 0,05 versus Wildtyp, - p < 0,05 versus COX-2-/-

Abb. 17; Balkendiagramm der Kapseldistanzen, * p < 0,05 versus Wildtyp, - p < 0,05 versus COX-2-/-

SC-236 (i.p

.)g/m

l�

SC-236_

T-12g/m

l�

SC-236_

T-30

Pareco

xib

Rofeco

xib-/-

COX-2Wild

typ0

10

20

30

40

50

60

*

**

**

*

-

-

-

-

�m

SC-236 (i.p

.)g / m

l

�

SC-236_

T-12g / m

l

�

SC-236_

T-30 Pare

coxib

Rofecoxib

-/-

COX-2Wild

typ0

10000

20000

30000

* * * * *

--*

- - -

� m3

Ergebnisse 51_____________________________________________________________________________________________________________

III.3. PGE2-Rezeptoren

Für das Prostaglandin E2 sind vier verschiedene Rezeptoren bekannt: EP-1, EP-2,

EP-3, EP-4. Agonisten an EP-2-Rezeptoren, sowie Agonisten an EP-4-Rezeptoren

wirken über einen Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration.

III.3.1. Applikation eines EP-2-Rezeptor-Agonisten

Zunächst wurden die Effekte des EP-2-Agonisten ONO-AE1-259-01 in zwei ver-

schiedenen Konzentrationen, 40 ng/g KG und 160 ng/g KG, auf die Entwicklung der

Niere untersucht. Auf die phänotypische Vitalität der Versuchstiere hatte die Sub-

stanzgabe über 21 Tage keinen Einfluss. Alle Tiere überlebten.

In einer Konzentration von 40 ng/g KG ergab sich nach Entnahme der Nieren am


lich 10 • 10-3 ± 0,42 • 10-3.

Die histomorphologische Analyse der Glomerulumvolumina ergab einen signifikan-

ten Unterschied zwischen den behandelten COX-2-/--Tieren und Wildtyp-Tieren (p <

0,001, N = 628): 12920 ± 304 µm3 (behandelte COX-2-/--Tiere), 25440 ± 1422 µm3

(Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (unbehandelte COX-2-/--Tiere) (s. Abb. 20,

32, 33).

Bei der histomorphologischen Untersuchung der Glomerulumdistanzen von der Nie-

renkapsel zeigte sich, dass sich das behandelte COX-2-/--Tier signifikant vom Wild-

typ-Tier unterscheidet (p < 0,001, N = 304): 20,12 ± 0,67 µm (behandelte COX-2-/--

Tiere), 50,42 ± 1,48 µm (Wildtyp-Tiere) und 22,39 ± 1,38 µm (unbehandelte COX-

2-/--Tiere) (s. Abb. 20, 32, 33).

Trägt man diese Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-Achse und

der relativen Häufigkeit auf der y-Achse auf, so zeigt sich für die behandelten COX-

2-/--Mäuse ein kaum vom unbehandelten COX-2-/--Tier abweichendes Bild. Jedoch

verschwindet die charakteristische „Schulter“ bei 40 µm. (s. Abb. 21)

Ergebnisse 52_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 20; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit40 ng/g KG ONO-AE1-259-01, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigt deutlichverkleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand. ImOrganinneren ein gut entwickeltes Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser, � Kapsel-distanz

Abb. 21; Relative H�ufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 40 ng/g KG ONO-AE1-259-01, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 EP-2A

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 53_____________________________________________________________________________________________________________



lich 11,8 • 10-3 ± 0,15 • 10-3.

Beim Vergleich der histomorphologischen Daten bezüglich der Glomerulumvolumi-

na zeigen sich keine signifikanten Differenzen zwischen den behandelten COX-2-/--

Tieren und den Wildtyp-Tieren (p = 0,108, N = 418): 26700 ± 484 µm3 (behandelte

COX-2-/--Tiere), 25440 ± 1422 µm3 (Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (unbe-

handelte COX-2-/--Tiere) (s. Abb. 22, 32, 33).

Abb. 22; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit160 ng/g KG ONO-AE1-259-01, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Zu sehen sind gut ent-wickelte Glomeruli, aber mit zu geringem Kapselabstand; � Glomerulumdurchmesser,� Kapseldistanz

Es finden sich aber signifikante histomorphologische Unterschiede zwischen den be-

handelten COX-2-/--Tieren und den Wildtyp-Tieren in Bezug auf die Distanzen der

Glomeruli von der Nierenkapsel (p < 0,001, N = 191): 22,43 ± 0,79 µm (behandelte

COX-2-/--Tiere), 50,42 ± 1,48 µm (Wildtyp-Tiere) und 22,39 ± 1,38 µm (unbehan-

delte COX-2-/--Tiere) (s. Abb. 22, 32, 33).

Ergebnisse 54_____________________________________________________________________________________________________________

Das Auftragen der Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-Achse

und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse, zeigt ein für die behandelten COX-2-/--

Mäuse kaum vom Wildtyp-Tier abweichendes Bild. (s. Abb. 23)

Abb. 23; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 160 ng/g KG ONO-AE1-259-01, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-


Agonist EP-2A ONO-AE1-259- 01

(40 ng/g KG)

EP-2A ONO -AE1-259-01

(160 ng/g KG)




Ratio (Niere : Körper) (• 10-3) 10 ± 0,42 11,8 ± 0,15

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 EP-2A

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 55_____________________________________________________________________________________________________________

III.3.2. Applikation eines EP-4-Rezeptor-Agonisten

Auch die Effekte des EP-4-Agonisten ONO-AE1-329 wurden hinsichtlich der Nie-

renentwicklung in zwei verschiedenen Konzentrationen, 40 ng/g KG und 160 ng/g

KG, untersucht.



lich 12,1 • 10-3 ± 0,16 • 10-3.

Die Auswertung der histomorphologischen Daten der Glomeruli zeigt keinen signifi-

kanten Unterschied von behandelten COX-2-/--Tieren versus Wildtyp-Tieren bezüg-

lich ihrer Volumina (p = 0,836, N = 333): 24570 ± 440 µm3 (behandelte COX-2-/--

Tiere), 25440 ± 1422 µm3 (Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (unbehandelte

COX-2-/--Tiere) (s. Abb. 24, 32, 33).

Abb. 24; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit40 ng/g KG ONO-AE1-329, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Zu sehen sind gut entwick-elte Glomeruli, aber mit m��igem Kapselabstand; � Glomerulumdurchmesser, � Kapsel-distanz

Ergebnisse 56_____________________________________________________________________________________________________________


kapsel misst man folgende Werte: 35,44 ± 0,77 µm (behandelte COX-2-/--Tiere),

50,42 ± 1,48 µm (Wildtyp-Tiere) und 22,39 ± 1,38 µm (unbehandelte COX-2-/--

Tiere). Daraus ergibt sich eine signifikante Differenz zwischen behandelten COX-2-/-

-Mäusen und Wildtyp-Mäusen (p < 0,001, N = 102). Zudem stellt dies eine signifi-

kante Differenz zwischen behandelten COX-2-/--Mäusen und unbehandelten COX-2-

/--Mäusen dar (p < 0,001, N = 102) (s. Abb. 24, 32, 33).

Das Auftragen der erhobenen Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der

x-Achse und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse zeigt für die behandelten

COX-2-/--Mäuse ein kaum von den Wildtyp-Mäusen abweichendes Bild. (s. Abb. 25)

Abb. 25; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 40 ng/g KG ONO-AE1-329, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 EP-4A

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 57_____________________________________________________________________________________________________________



lich 12,2 • 10-3 ± 0,8 • 10-3.


die Glomerulumvolumina: 29680 ± 637 µm3 (behandelte COX-2-/--Tiere), 25440 ±

1422 µm3 (Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (unbehandelte COX-2-/--Tiere).

Damit besitzen die behandelten COX-2-/--Mäuse ein signifikant höheres Glomeru-

lumvolumen als die Wildtyp-Mäuse (p < 0,001, N = 325) (s. Abb. 26, 32, 33).

Abb. 26; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit160 ng/g KG ONO-AE1-329, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigt gut ent-wickelte Glomeruli, mit gro�em Kapselabstand; � Glomerulumdurchmesser, � Kapsel-distanz

Bei der histomorphologische Untersuchung der Nieren ergaben sich für die Distan-

zen der Glomeruli von der Nierenkapsel: 34,67 ± 1,06 µm (behandelte COX-2-/--

Tiere), 50,42 ± 1,48 µm (Wildtyp-Tiere) und 22,39 ± 1,38 µm (unbehandelte COX-

2-/--Tiere). Damit unterscheiden sich die behandelten COX-2-/--Mäuse sowohl signi-

fikant von den Wildtyp-Mäusen (p < 0,001, N = 73) als auch von den unbehandelten

COX-2-/--Mäusen (p < 0,001, N = 73) (s. Abb. 26, 32, 33).

Ergebnisse 58_____________________________________________________________________________________________________________



delten COX-2-/--Mäuse ein kaum von der Wildtyp-Maus abweichenden Bild. (s. Abb.

27)

Abb. 27; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 160 ng/g KG ONO-AE1-329, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-


Agonist EP-4A ONO-AE1-329

(40 ng/g KG)

EP-4A ONO-AE1-329

(160 ng/g KG)





0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 EP-4A

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 59_____________________________________________________________________________________________________________

III.3.3. Applikation von EP-2- plus EP-4-Rezeptor-Agonisten

Um zu überprüfen, ob sich die Agonisten des EP-2- und EP-4-Rezeptors in ihrer

Wirkung additiv verhalten, wurden sowohl ONO-AE1-259-01 als EP-2-Agonist als

auch ONO-AE1-329 als EP-4-Agonist zusammen appliziert. Die eingesetzten Dosie-

rungen beliefen sich auf 640 ng/g KG bzw. 3,2 µg/µl für den EP-2-Agonisten und

160 ng/g KG bzw. 800 ng/µl für den EP-4-Agonisten.

Es ergab sich nach Entnahme der Nieren am Tag P22 eine Ratio des Gesamtnieren-

gewichts zum Körpergewicht von durchschnittlich 12 • 10-3 ± 0,26 • 10-3.

Die histomorphologische Untersuchung der Nieren zeigte Glomeruli mit einem Vo-

lumen von: 28750 ± 1172 µm3 (behandelte COX-2-/--Tiere), 25440 ± 1422 µm3

(Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (unbehandelte COX-2-/--Tiere). Damit ergibt

sich kein signifikanter Unterschied zwischen den behandelten COX-2-/--Tieren und

den Wildtyp-Tieren (p = 0,354, N = 289) (s. Abb. 28, 32, 33).

Analysiert man die Nieren auf die Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel er-

geben sich folgende Werte: 24,44 ± 1,66 µm (behandelte COX-2-/--Tiere), 50,42 ±

1,48 µm (Wildtyp-Tiere) und 22,39 ± 1,38 µm (unbehandelte COX-2-/--Tiere). Dies

stellt jedoch einen signifikanten Unterschied zwischen den behandelten COX-2-/--

Tieren und den Wildtyp-Tieren dar (p = 0,001, N = 98) (s. Abb. 28, 32, 33).

Trägt man diese Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-Achse und

der relativen Häufigkeit auf der y-Achse auf, so zeigt sich für die behandelten COX-

2-/--Tiere ein fast mit dem Wildtyp-Tier identisches Bild. (s. Abb.29)

Ergebnisse 60_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 28; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit640 ng/g KG ONO-AE1-259-01 und 160 ng/g KG ONO-AE1-329, in H.E.-F�rbungam Tag P22. Die Abb. zeigt gut entwickelte Glomeruli, aber mit zu geringem Kapselab-stand; � Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Abb. 29; Relative H�ufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 640 ng/g KG ONO-AE1-259-01 und 160 ng/g KG ONO-AE1-329, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 EP-2A und EP-4A

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 61_____________________________________________________________________________________________________________


Agonist EP-2A ONO-AE1-259-01 u. EP-4A ONO-AE1-329

(640 ng/g KG) (160 ng/g KG)

Glomerulumvolumen (µm3) 28750 ± 1172

Kapseldistanz (µm) 24,44 ± 1,66

% Glomeruli innerhalb 58µm 34 %

Ratio (Niere : Körper) (• 10-3) 12 ± 0,26

III.3.4. Applikation eines EP-4-Rezeptor-Antagonisten

Mit Hilfe des EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208 und EP-2-/--Mäusen sollte noch

einmal die essentielle Funktion der beiden PGE2-Rezeptoren, EP-2 und EP-4, für die

Nephrogenese nachgewiesen werden, indem man zeigt, dass durch selektives Aus-

schalten der EP-2- und der EP-4-Rezeptoren das Bild der COX-2-/--Maus erzeugt

werden kann.



lich 11,21 • 10-3 ± 0,4 • 10-3.

Histomorphologische Auswertungen der Nieren ergaben in diesem Versuchsansatz

Glomeruli mit einem Volumen von: 20270 ± 761 µm3 (behandelte EP-2-/--Tiere),

25440 ± 1422 µm3 (Wildtyp-Tiere) und 16600 ± 1045 µm3 (COX-2-/--Tiere). Damit

unterscheiden sich die EP-2-/--Tiere sowohl signifikant von den Wildtyp-Tieren (p <

0,001, N = 504) als auch signifikant von den COX-2-/--Tieren (p < 0,001, N = 504)

(s. Abb. 30, 32, 33).

Die Glomerulumdistanzen von der Nierenkapsel beliefen sich nach histomorphologi-

scher Untersuchung auf Werte von: 41,07 ±1,07 µm (behandelte EP-2-/--Tiere),

50,42 ± 1,48 µm (Wildtyp-Tiere) und 22,39 ± 1,38 µm (COX-2-/--Tiere). Auch hierin

unterscheidet sich das EP-2-/--Tier sowohl signifikant vom Wildtyp-Tier (p = 0,047,

N = 124) als auch signifikant vom COX-2-/--Tier (p < 0,001, N = 124) (s. Abb. 30,

32, 33).

Ergebnisse 62_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 30; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer EP-2-/--Maus, behandelt mit400 ng/g KG ONO-AE3-208, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Zu sehen sind m��ig ent-wickelte Glomeruli, mit m��igem Kapselabstand; � Glomerulumdurchmesser, � Kapsel-distanz

Abb. 31; Relative H�ufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 400 ng/g KG ONO-AE3-208, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6EP-4-Antagonist

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figk

eit

Ergebnisse 63_____________________________________________________________________________________________________________


Achse und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse zeigt für die behandelten EP-2-/--

Tiere ein sowohl von den COX-2-/--Tieren als auch von den Wildtyp-Tieren abwei-

chendes Bild. (s. Abb. 31)


EP-4-Antagonist ONO-AE3-208

(400 ng/g KG)




Ratio (Niere : Körper) (• 10-3) 11,21 ± 0,4




Ergebnisse 64_____________________________________________________________________________________________________________


Abb. 33; Balkendiagramm der Kapseldistanzen, * p < 0,05 versus Wildtyp,- p < 0,05 versus COX-2-/-

EP-2_40

ng/gKG

EP-2_16

0 ng/gKG

EP-4_40

ng/gKG

EP-4_16

0 ng/gKG

EP-2u. E

P-4

EP-4-Antag

onist -/-

COX-2Wild

typ0

10

20

30

40

50

60

* *

* *

* *

- - *-

�m

EP-2_40

ng / gKG

EP-2_16

0 ng / gKG

EP-4_40

ng / gKG

EP-4_16

0 ng / gKG

EP-2u. E

P-4

EP-4-Antag

onist -/-

COX-2W

ildtyp

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

**

*-

-

--

*-

� m3

Ergebnisse 65_____________________________________________________________________________________________________________

III.4. NO-Substanzen

Da Prostaglandin E2 auch eine gefäßdilatierende und durchblutungssteigernde Wir-

kung hat, sollte die Hypothese, dass dies zur normalen Nierenentwicklung beiträgt,

durch NO freisetzende Substanzen untersucht werden. Diese spalten ihre NO-Gruppe

in wässrigem Milieu ab und können hierdurch eine gefäßdilatierende Wirkung auslö-

sen. Es wurden zwei verschiedene Präparate verwendet: Spermine NONOate (NOC-

22) und NOC-12. Diese Unterscheiden sich in ihrer Halbwertszeit in wässrigem Mi-

lieu: 230 min (Spermine NONOate) und 327 min (NOC-12).

III.4.1. Applikation von Spermine NONOate (NOC-22)

Zunächst wurden die Effekte der NO-Substanz Spermine NONOate (NOC-22) in

zwei verschiedenen Konzentrationen, 250 µg/ml und 1000 µg/ml, auf die Entwick-

lung der Niere untersucht.

In einer Konzentration von 250 µg/ml bzw. 1 µl/g KG ergab sich nach Entnahme



Bei der histomorphologischen Untersuchung der Nieren auf ihre Glomerulumvolu-

mina zeigte sich bei den behandelten COX-2-/--Tieren mit 17690 ± 1158 µm3 ein sig-

nifikant geringeres Volumen gegenüber den Wildtyp-Tieren mit 25440 ± 1422 µm3

(p < 0,001, N = 301). Jedoch gibt es zu den unbehandelten COX-2-/--Tieren mit

16600 ± 1045 µm3 keinen signifikanten Unterschied (p = 0,105, N = 301) (s. Abb.

35, 44, 45).

Auch in Bezug auf die Distanzen der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel un-

terscheiden sich die behandelten COX-2-/--Tiere mit 19,17 ± 1,33 µm signifikant vom

Wildtyp-Tier mit 50,42 ± 1,48 µm (p < 0,001, N = 178). Jedoch gibt es zu den unbe-

handelten COX-2-/--Tieren mit 22,39 ± 1,38 µm keinen signifikanten Unterschied (p

= 0,075, N = 178) (s. Abb. 35, 44, 45).



Ergebnisse 66_____________________________________________________________________________________________________________

delten COX-2-/--Tiere ein fast mit dem unbehandelten COX-2-/--Tier identisches Bild

(s. Abb. 36).

Abb. 35; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit250 �g/ml Spermine NONOate, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigt deut-lich verkleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand;� Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Abb. 36; Relative H�ufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 250 �g/ml Spermine NONOate, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 NOC-22_250

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 67_____________________________________________________________________________________________________________

In einer Konzentration von 1000 µg/ml bzw. 1 µl/g KG ergab sich nach Entnahme



Die histomorphologische Analyse der Nieren zeigte für die Glomeruli der behandel-

ten COX-2-/--Mäuse mit 15440 ± 529 µm3 ein signifikant geringeres Volumen als für

die Wildtyp-Mäuse mit 25440 ± 1422 µm3 (p < 0,001, N = 214), sowie ein signifi-

kant geringeres Volumen als für die unbehandelten COX-2-/--Mäuse mit 16600 ±

1045 µm3 (p < 0,001, N = 214) (s. Abb. 37, 44, 45).

Abb. 37; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit1000 �g/ml Spermine NONOate, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigt deut-lich verkleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand.Im Inneren ein gro�es Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Bei der histomorphologischen Auswertung der Glomerulumdistanzen von der Nie-

renkapsel findet sich für die behandelten COX-2-/--Mäuse mit 18,78 ± 1,16 µm ein

signifikanter Unterschied gegenüber der Wildtyp-Maus mit 50,42 ± 1,48 µm (p <

0,001, N = 115) (s. Abb. 37, 44, 45).

Ergebnisse 68_____________________________________________________________________________________________________________

Auftragen dieser Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-Achse und

der relativen Häufigkeit auf der y-Achse zeigt für die behandelten COX-2-/--Tiere ein

gering vom unbehandelten COX-2-/--Tier abweichendes Bild. Jedoch verschwindet

die charakteristische „Schulter“ bei 40,71 µm (s. Abb. 38).

Abb. 38; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 1000 µg/ml Spermine NONOate, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

III.4.1.1. Applikation von NOC-22 ab Tag E6

In einem weiteren Versuchsansatz wurde versucht, die NO-Substanz Spermine

NONOate (NOC-22) den Jungtieren bzw. Feten schon im Mutterleib über die Tränke

und der Aufnahme der Mutter zu verabreichen. Dies geschah ab dem Tag E6. Die

Konzentration lag bei diesem Versuch bei 1000 µg/ml bzw. 500 ng/g KG.



Bei der histomorphologischen Untersuchung der Nieren auf ihre Glomerulumvolu-

mina zeigte sich bei den behandelten COX-2-/--Tieren mit 18910 ± 1590 µm3 ein sig-

nifikant kleineres Volumen als bei den Wildtyp-Tieren mit 25440 ± 1422 µm3 (p <

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 NOC-22_1000

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häuf

igke

it

Ergebnisse 69_____________________________________________________________________________________________________________

0,001, N = 201). Zu den unbehandelten COX-2-/--Tieren mit 16600 ± 1045 µm3 gibt

es jedoch keinen signifikanten Unterschied (p = 0,089, N = 201) (s. Abb. 39, 44, 45).

Die histomorphologische Analyse der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel er-

gab für die behandelten COX-2-/--Mäuse mit 17,13 ± 1,61 µm einen signifikanten

Unterschied, sowohl gegenüber der Wildtyp-Maus mit 50,42 ± 1,48 µm (p < 0,001,

N = 126) als auch gegenüber der unbehandelten COX-2-/--Maus mit 22,39 ± 1,38 µm

(p = 0,007, N = 126) (s. Abb. 39, 44, 45).

Abb. 39; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit1000 �g/ml Spermine NONOate ab E6, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Zu sehen sindverkleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand;� Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Nach dem Auftragen der erhobenen Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser

auf der x-Achse und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse zeigt sich für die be-

handelten COX-2-/--Tiere ein fast mit dem unbehandelten COX-2-/--Tier identisches

Bild. Jedoch ist die charakteristische „Schulter“ bei 40,71 µm nicht mehr zu beo-

bachten (s. Abb. 40).

Ergebnisse 70_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 40; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 1000 µg/ml Spermine NONOate ab Tag E6, im Vergleich zu WT-Kon-trolle und COX-2-/-


NO-Substanz Spermine NONOate

(250 µg/ml)

Spermine NONOate

(1000 µg/ml)

Spermine NONOate

(1000 µg/ml) ab E6

Glomerulumvolumen (µm3) 17690 ± 1158 15440 ± 529 18910 ± 1590

Kapseldistanz (µm) 19,17 ± 1,33 18,78 ± 1,16 17,13 ± 1,61

% Glomeruli innerhalb 58µm 59 % 54 % 63 %

Ratio (Niere : Körper) (• 10-3) 8,97 ± 0,25 9,52 ± 0,16 8,22 ± 0,59

III.4.2. Applikation von NOC-12

Spermine NONOate zeigte keine protektive Wirkung bezüglich der Glomerulumvo-

lumina bzw. der Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel. Daher wurde ein

zweites Präparat aus Gruppe der NO-Substanzen erprobt, das NOC-12. Dies besitzt

mit t½ = 327 min eine längere Halbwertszeit in wässrigem Milieu als Spermine NO-

NOate mit t½ = 230 min.

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 NOC-22_E6

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 71_____________________________________________________________________________________________________________

Dieser Versuch wurde mit einer Konzentration von 200 µg/ml bzw. 1 µl/g KG

durchgeführt.



Die histomorphologische Auswertung der Nieren ergab bei den behandelten COX-2-

/--Mäusen mit 19750 ± 599 µm3 ein signifikant geringeres Glomerulumvolumen als

bei den Wildtyp-Mäusen mit 25440 ± 1422 µm3 (p < 0,001, N = 318). Zudem gibt es

aber auch zu den unbehandelten COX-2-/--Mäusen mit 16600 ± 1045 µm3 eine signi-

fikante Differenz (p < 0,001, N = 318) (s. Abb. 41, 44, 45).

Abb. 41; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit200 �g/ml NOC-12, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigt verkleinerte Glo-meruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand; � Glomerulumdurch-messer, � Kapseldistanz

Bei den Distanzen der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel weisen die behan-

delten COX-2-/--Mäuse mit 16,49 ± 0,94 µm eine signifikant geringere Distanz, zum

einen als die Wildtyp-Mäuse mit 50,42 ± 1,48 µm (p < 0,001, N = 155), und zum an-

deren als die unbehandelten COX-2-/--Mäuse mit 22,39 ± 1,38 µm (p = 0,006, N =

155), auf (s. Abb. 41, 44, 45).

Ergebnisse 72_____________________________________________________________________________________________________________



delten COX-2-/--Mäuse ein sowohl vom unbehandelten COX-2-/--Tier als auch vom

Wildtyp-Tier abweichendes Bild (s. Abb. 42).

Abb. 42; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 200 µg/ml NOC-12, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-


NO-Substanz NOC-12

(200 µg/ml)




Ratio (Niere : Körper) (• 10-3) 10,01 ± 0,39




0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 NOC-12

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 73_____________________________________________________________________________________________________________



NOC-22_2

50µg

/ ml

NOC-22_1

000 µg

/ ml

NOC-22_E

6

NOC-12-/-

COX-2Wild

typ0

10000

20000

30000

**

* **

--

� m3

NOC-22_2

50µg / m

l

NOC-22_1

000 µg / m

l

NOC-22_E

6

NOC-12-/-

COX-2Wild

typ0

10

20

30

40

50

60

* * * **- -� m

Ergebnisse 74_____________________________________________________________________________________________________________

III.5. PPAR-Agonisten

III.5.1. Applikation des PPAR�-Agonisten Troglitazone

In einer Konzentration von 200 ng/g KG Troglitazone ergab sich nach Entnahme




die behandelten COX-2-/--Mäuse mit 10930 ± 375 µm3 ein signifikant kleineres

Glomerulumvolumen, sowohl gegenüber den Wildtyp-Mäusen mit 25440 ± 1422

µm3 (p < 0,001, N = 337) als auch gegenüber den unbehandelten COX-2-/--Mäusen

mit 16600 ± 1045 µm3 (p = 0,005, N = 337) (s. Abb. 46, 50, 51).

Abb. 46; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit200 ng/g KG Troglitazone, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Zu sehen sind deutlich ver-kleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand. Im In-neren ein gut entwickeltes Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Für die Distanzen der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel findet sich bei den

behandelten COX-2-/--Mäusen mit 16,65 ± 0,83 µm eine signifikant geringere Dis-

Ergebnisse 75_____________________________________________________________________________________________________________

tanz, sowohl gegenüber den Wildtyp-Mäusen mit 50,42 ± 1,48 µm (p < 0,001, N =

181) als auch gegenüber den unbehandelten COX-2-/--Mäusen mit 22,39 ± 1,38 µm

(p = 0,007, N = 181) (s. Abb. 46, 50, 51).

Das Auftragen dieser Daten in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-Achse

und der relativen Häufigkeit auf der y-Achse zeigt für die behandelten COX-2-/--

Mäuse ein fast mit den unbehandelten COX-2-/--Mäusen identisches Bild. Jedoch

verschwindet die charakteristische „Schulter“ bei 40,71 µm (s. Abb. 47).

Abb. 47; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 200 ng/g KG Troglitazone, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-

III.5.2. Applikation des PPARd-Agonisten GW501516

In einer Konzentration von 200 ng/g KG GW501516 ergab sich nach Entnahme der

Nieren am Tag P22 eine Ratio des Gesamtnierengewichts zum Körpergewicht von

durchschnittlich 10,95 • 10-3 ± 0,18 • 10-3.

Die Auswertung der histomorphologischen Daten der Nieren zeigte bei den behan-

delten COX-2-/--Tieren mit 7951 ± 292 µm3 ein signifikant kleineres Glomerulumvo-

lumen, sowohl gegenüber den Wildtyp-Tieren mit 25440 ± 1422 µm3 (p < 0,001, N =

275) als auch gegenüber den unbehandelten COX-2-/--Tieren mit 16600 ± 1045 µm3

(p < 0,001, N = 275) (s. Abb. 48, 50, 51).

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 Troglitazone

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 76_____________________________________________________________________________________________________________

Untersuchungen zu den Glomerulumdistanzen von der Nierenkapsel ergaben bei den

behandelten COX-2-/--Tieren mit 23,81 ± 0,89 µm eine signifikant geringere Distanz

als bei den Wildtyp-Tieren mit 50,42 ± 1,48 µm (p < 0,001, N = 135). Jedoch gibt es

zu den unbehandelten COX-2-/--Tieren mit 22,39 ± 1,38 µm keinen signifikanten Un-

terschied (p = 0,198, N = 135) (s. Abb. 48, 50, 51).

Trägt man die erhobenen Werte in einen Graphen mit dem Durchmesser auf der x-


delten COX-2-/--Tiere ein in der Form der COX-2-/--Maus fast identisches, jedoch

nach links verschobenes Bild (s. Abb. 49).

Abb. 48; Ausschnitt der 200x vergr��erten Niere einer COX-2-/--Maus, behandelt mit200 ng/g KG GW501516, in H.E.-F�rbung am Tag P22. Die Abb. zeigt deutlich ver-kleinerte Glomeruli, teils subkapsul�r gelegen mit zu geringem Kapselabstand. Im In-neren ein gut entwickeltes Glomerulum; � Glomerulumdurchmesser, � Kapseldistanz

Ergebnisse 77_____________________________________________________________________________________________________________

Abb. 49; Relative Häufigkeit der Glomerulumdurchmesser der Niere einer WT-Maus,behandelt mit 200 ng/g KG GW501516, im Vergleich zu WT-Kontrolle und COX-2-/-


Agonist PPAR�-Agonist Troglitazone

(200 ng/g KG)

PPAR�-Agonist GW501516

(200 ng/g KG)

Glomerulumvolumen (�m3) 10930 � 375 7951 � 292

Kapseldistanz (�m) 16,65 � 0,83 23,81 � 0,89

% Glomeruli innerhalb 58�m 54 % 49 %

Ratio (Niere : K�rper) (� 10-3) 9,28 � 0,37 10,95 � 0,18




0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 GW

COX-2-/-

Wildtyp

Durchmesser (�m)

rela

tive

Häu

figke

it

Ergebnisse 78_____________________________________________________________________________________________________________



GW

Troglita

zone -/-

COX-2Wild

typ0

10000

20000

30000

**

*

--

�m

3

GW

Troglita

zone -/-

COX-2Wild

typ0

10

20

30

40

50

60

**

*-�m

Diskussion 79_____________________________________________________________________________________________________________

IV. Diskussion

Die Niere des erwachsenen Menschen, als auch der Maus, ist ein Organ mit hoher

Prostaglandinsynthesekapazität. Dabei regulieren Prostaglandine verschiedene Auf-

gaben in der Niere. Dazu zählen der glomeruläre- und medulläre Blutfluss, die Re-

ninsekretion und der Salz- und Wassertransport im dicken Teil der Henle-Schleife

und in den Sammelrohren [Breyer und Badr, 1996]. Es hat sich zudem auch gezeigt,

dass Prostaglandine sowohl in der fetalen Niere als auch in der Niere des Neugebo-

renen synthetisiert werden [Day et al., 1974]. Der gezielte Knockout des COX-2-

Gens ergibt das Bild einer Abhängigkeit der Nephrogenese vom COX-2-Protein

[Morham et al., 1995; Dinchuk et al., 1995; Norwood et al., 2000].

So zeigten Morham et al. [1995], dass die Nieren einer COX-2-/--Maus makrosko-

pisch klein, blass und mit granulärer Erscheinung auf der Kapseloberfläche sind.

Nach dem Wiegen der Nieren konnte eine reduzierte Ratio aus Gesamtnierengewicht

und Körpergewicht von Norwood et al. [2000] beobachtet werden. Bei der histologi-

schen Betrachtung der Nierenschnitte stellten sich die subkapsulär gelegenen Glome-

ruli als zusammengedrängt, klein und unterentwickelt in einem, im Vergleich zum

Wildtyp, dünneren Kortex dar [Dinchuk et al., 1995; Morham et al., 1995; Norwood

et al., 2000]. Glomeruli außerhalb dieser Zone wirkten vergrößert [Morham et al.,

1995]. Zudem konnten kortikomedulläre Mikrozysten bzw. zystische Formationen

nachgewiesen werden [Dinchuk et al., 1995; Norwood et al., 2000].

Diese, von Morham et al. [1995], Dinchuk et al. [1995] und Norwood et al. [2000]

experimentell erhobenen deskriptiven Beschreibungen, konnten auch in dieser Studie

beobachtet werden. So stellten sich die an P22 entnommenen COX-2-/--Nieren eben-

falls als klein und blass dar. Jedoch die granuläre Erscheinung auf der Kapseloberflä-

che konnte nicht beobachtet werden. Nach dem Wiegen der Mäuse und der Nieren

zeigte sich wie bei Norwood et al. [1995] eine deutlich reduzierte Ratio aus Gesamt-

nierengewicht zum Körpergewicht. Im histologischen Schnitt ergab sich wie be-

schrieben das Bild einer unterentwickelten Niere mit kleinen zusammengedrängten,

subkapsulär gelegenen Glomeruli, in einem dünnen Kortex mit zystischen Formatio-

nen.

Diskussion 80_____________________________________________________________________________________________________________

Der genaue Mechanismus, für den das COX-2-/--Protein benötigt wird, um die ge-

zeigten Veränderungen abzuwenden, blieb bislang allerdings unklar.

IV.1. Einfluss von COX-2-Inhibitoren auf die Nephrogenese

Zunächst war es von Interesse, verschiedene, in der Klinik eingesetzte selektive

COX-2-Hemmer, auf ihre schädigenden Effekte während der Nephrogenese zu un-

tersuchen.

Kömhoff et al. [2000] konnten bereits die negativen Einflüsse von SC-236, eines

dem Celecoxib verwandten selektiven COX-2-Hemmers, beobachten. So zeigten sie

neben einem deutlich reduzierten kortikalen Volumen am Tag P21, auch ebenfalls

deutlich reduzierte Glomerulumdurchmesser. Nach Gabe des SC-236 vom Tag E0,5

bis zum Tag P21, in einer Konzentration von 0,6 µg/ml, reduzierte sich dort der

Glomerulumdurchmesser auf 61 % des Durchmessers eines Kontrolltiers. Wurde

SC-236 erst ab dem Tag P1 appliziert, so waren die beobachteten Effekte weniger

stark ausgeprägt. Hier betrug der Glomerulumdurchmesser nur 79 % des Durchmes-

sers gegenüber einem Kontrolltier. Für diesen Effekt machten sie einen diaplazenta-

ren Medikamententransfer verantwortlich. Bei einem COX-2-/--Tier stellten Kömhoff

et al. [2000] einen auf 62 % reduzierten Glomerulumdurchmesser fest.

In dieser Studie wurde, um eine bessere Vergleichbarkeit mit den zuvor gemachten

Experimenten zu haben, auf eine Gabe des SC-236 ab dem Tag E0,5 verzichtet. So

erfolgte die Gabe nur von Tag P1 bis Tag P21.

Neben einem dosisabhängigen Effekt sowohl der Glomerulumvolumina als auch der

Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel zeigte sich auch ein Unterschied der

Ergebnisse nach der Applikationsart. Wurde das SC-236 den Mausnachkommen

intraperitoneal (i.p.) injiziert, so verringerte sich das Glomerulumvolumen auf 76 %.

Durch Zufügen der Substanz der Wassertränke reduzierte sich das Glomerulumvo-

lumen bei einer Konzentration von 12 µg/ml nur auf 88 %, wohingegen es sich bei

einer Konzentration von 30 µg/ml auf 69 % gegenüber einer Wildtyp-Maus verrin-

gerte. Eine COX-2-/--Maus wies im Mittel eine Reduktion der Glomerulumvolumina

auf 65 % der Durchmesser der Wildtyp-Mäuse auf.

Diskussion 81_____________________________________________________________________________________________________________

Die Betrachtung der Ergebnisse in absoluten Zahlen ergibt keinen signifikanten Un-

terschied in der Behandlung mit 30 µg/ml SC-236, mit Parecoxib oder mit Rofeco-

xib, sodass davonzugehen ist, dass die beobachteten Effekte der applizierten Coxibe

auf der COX-2-Hemmung beruhen und nicht unspezifische Wirkungen darstellen.

Die Ergebnisse der Glomerulumdistanzen von der Nierenkapsel ergeben ein diffe-

renzierteres Bild. Hier ist schon in einer Konzentration von 12 µg/ml des SC-236

kein signifikanter Unterschied zum COX-2-/--Tier auszumachen, während es in der

Konzentration von 30 µg/ml darüber hinaus schädigend wirkt. Die intraperitoneale

Gabe liefert indifferente Ergebnisse. Die Effekte von Parecoxib und Rofecoxib sind,

was die Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel betrifft, weniger stark ausge-

prägt, verglichen mit den Effekten auf die Glomerulumvolumina. Bei Rofecoxib sind

diese am stärksten ausgeprägt.

Damit konnte gezeigt werden, dass auch in der Zeit von P1 bis P21 pharmakologisch

mit SC-236 das Bild einer COX-2-/--Niere erzeugt werden kann. Jedoch bei deutlich

höheren Konzentrationen als von Kömhoff et al. [2000] beschrieben. Zumindest in

Bezug auf die Glomerulumvolumina gilt dies auch für Parecoxib und Rofecoxib.

Offen bleibt jedoch die Frage nach der Vergleichbarkeit der mit SC-236 erlangten

Ergebnisse. Denn in der ersten Versuchsreihe wurde den Tieren die Substanz direkt

intraperitoneal injiziert, wodurch die gesamte Konzentration im Organismus wirken

konnte. In der zweiten Versuchsreihe wurde die Substanz dem Trinkwasser des Mut-

tertiers zugegeben und gelangte erst über die Muttermilch in den Körper des Jung-

tiers. Es sind zwar die jeweils eingesetzten Konzentrationen im Trinkwasser und mit

1 ml/d die durchschnittliche Trinkmenge des Muttertiers bekannt, der entscheidende

Aspekt ist jedoch, wieviel von der dem Trinkwasser zugesetzten Substanz auf das

Jungtier übertragen wird. Dafür wären Informationen über das Ausmaß der

Verstoffwechslung im Muttertier und den Grad des Übertritts in die Muttermilch,

und somit der in ihr erreichten Konzentration, nötig. Die höchste Aussagekraft besä-

ße jedoch eine Plasmabestimmung des Arzneimittels am Jungtier.

Die in der Arbeit von Kömhoff et al. [2000] beobachteten Nierenschäden unter der

Behandlung mit SC-236, in einer Dosis von 0,6 µg/ml in der Wassertränke, konnten

von mir nicht nachvollzogen werden. Unter meinen experimentellen Bedingungen

ergaben sich erst ab einer Dosis von 12 µg/ml in der Wassertränke Effekte auf die

Nierenentwicklung.

Diskussion 82_____________________________________________________________________________________________________________

Eine Übertragung meiner Beobachtungen auf den Menschen bedeutet, dass Cycloo-

xygenase-2-Hemmer zumindest im 3. Trimenon absolut kontraindiziert sind, da so-

wohl die hohe Dosis von 30 µg/ml als auch die geringere Dosis von 12 µg/ml in der

Wassertränke ausreicht, um signifikante Schäden während der Nephrogenese zu ver-

ursachen.

IV.2. Einfluss von EP-Agonisten auf die Nephrogenese

Da den Säugern durch den Wegfall der Cyclooxygenase-2 die darüber synthetisierten

Prostaglandine fehlen, lag es als erstes Versuchsziel nahe, den COX-2-/--Mäusen ent-

weder direkt PGE2 oder Agonisten an deren Rezeptoren zu substituieren. Christian

Breitbarth konnte in seiner Dissertation (beim Dekanat des Fachbereichs Medizin der

Philipps-Universität Marburg eingereicht) zeigen, dass PGE2 und klinisch genutzte

PGE2-Analoga keine bessere Wirkung bzw. nephroprotektiven Effekt aufweisen,

vermutlich aufgrund einer zu kurzen Halbwertszeit. So wurde die Studie mit EP spe-

zifischen Agonisten, die eine höhere Stabilität aufweisen, durchgeführt. Hier zeigte

sich bei den Glomerulumvolumina ein von der Dosis abhängiger Effekt. Während

nach Gabe von 40 ng/g KG des EP-2-Agonisten ONO-AE1-259-01 sogar geringere

Glomerulumvolumina als bei einer unbehandelten COX-2-/--Maus gemessen wurden,

waren die Nieren der behandelten COX-2-/--Tiere nach Applikation von 160 ng/g KG

ONO-AE1-259-01 nicht von der einer Wildtyp-Maus zu unterscheiden. Auf die Dis-

tanzen der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel hat ONO-AE1-259-01 sowohl

in niedriger als auch in hoher Dosis keinen signifikanten Effekt. Es konnte in diesem

Punkt keine signifikante Differenz zwischen behandelten und unbehandelten COX-2-

/--Tieren beobachtet werden. Neben dem EP-2-Rezeptor signalisiert auch der EP-4-

Rezeptoren einen intrazellulären cAMP-Anstieg. Daher wurden auch Untersuchun-

gen an diesem Rezeptor durchgeführt. Bei dieser Versuchsreihe am EP-4-Rezeptor

war ebenfalls ein dosisabhängiger Effekt zu beobachten. Im Unterschied zum EP-2-

Rezeptor hat sich hier schon bei der geringen Konzentration von 40 ng/g KG des EP-

4-Agonisten ONO-AE1-329 kein signifikanter Unterschied zur Wildtyp-Niere, be-

züglich der Glomerulumvolumina gezeigt. In der höheren Dosis von 160 ng/g KG

wurden signifikant größere Glomerulumvolumina gemessen als beim Wildtyp-Tier.

Diskussion 83_____________________________________________________________________________________________________________

Bei Betrachtung der Distanzen der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel ergab

sich ein von der Dosis unabhängiges Ergebnis. In beiden Dosierungen wichen die

behandelten Nieren signifikant von der COX-2-/--Niere als auch von der Wildtyp-

Niere ab. Das Ergebnis liegt genau in der Mitte zwischen beiden und ist somit als

Partialeffekt anzusehen.

Bei Kombination beider Agonisten, ONO-AE1-259-01 und ONO-AE1-329, in hoher

Konzentration konnte bei den Glomerulumvolumina ein minimal geringerer Effekt

als unter alleiniger hoher EP-4-Agonistengabe beobachtet werden. Bezüglich der

Entfernung der einzelnen Glomeruli von der Nierenkapsel zeigt sich ein minimal hö-

herer Effekt als unter alleiniger hoher EP-2-Agonistengabe.

Die gemachten Beobachtungen führen zu dem Schluss, dass sowohl Agonisten am

EP-2-Rezeptor als auch am EP-4-Rezeptor in der Lage sind, das Volumendefizit der

Glomeruli der COX-2-/--Mäuse zu beheben, und dass sie damit wichtige und ent-

scheidende Bausteine bzw. Faktoren während der Nephrogenese sind. Dabei erwies

sich der EP-4-Agonist als die Substanz mit der größeren rekonstituierenden Wirkung.

Dieser Unterschied war besonders bei einer Konzentration von 40 ng/g KG ausge-

prägt.

Im Laufe der Nierenentwicklung kommt es zu einer zentripetalen Wanderung der

Nephrone in Richtung Mark, sodass die juxtamedullär gelegenen Nephrone denen

der zuerst synthetisierten entsprechen und die subkapsulär gelegenen die zuletzt ent-

wickelten sind. Eine subkapsuläre Anhäufung der Glomeruli stellt eine Entwick-

lungsretardierung dar [Dinchuk et al., 1995; Morham et al., 1995; Norwood et al.,

2000].

Mit Bezug darauf fallen die Ergebnisse der Kapseldistanzen der Glomeruli eher er-

nüchternd aus. Hier scheint nur der EP-4-Agonist eine Partialwirkung zu besitzen,

während der EP-2-Agonist entweder gar keine, oder im Gemisch mit dem EP-4-

Agonist, eine hemmende Wirkung entfaltet. Diese Erkenntnis legt nahe, dass für die

richtige Entwicklung der Kapseldistanzen der Glomeruli entweder höhere Dosen,

insbesondere des EP-4-Agonisten, von Nöten sind, oder ganz andere zusätzliche Me-

chanismen dafür verantwortlich sind. Als erstes sollten daher zukünftige Studien die

Dosisfrage klären.

Diskussion 84_____________________________________________________________________________________________________________

IV.3. Einfluss eines EP-4-Antagonisten auf die Nephrogenese

Mit dem Ziel die Bedeutung des EP-4-Rezeptors für die Nierenentwicklung noch

weiter aufzuklären, wurde der EP-2-/--Maus ein EP-4-Antagonist appliziert. Da der

EP-2-Knockout per se noch keine Nierenveränderungen liefert [Narumiya und Fitz-

Gerald, 2001], war es interessant zu beobachten, welche Effekte auftreten, wenn zu-

dem der EP-4-Rezeptor ausfällt und ob die Ergebnisse mit denen von selektiven

COX-2-Hemmern identisch sind.

Dieser Versuch zeigte eindeutig, dass die EP-4-Blockade beim renohistologisch un-

auffälligen EP-2-/--Tier eine Störung der Nephrogenese vergleichend zu der bei

COX-2-/--Tieren induziert. Allerdings waren die Effekte nicht so stark ausgeprägt.

Jedoch unterstrich er die Bedeutung des EP-4-Rezeptors für die Nephrogenese. Wei-

ter zeigt er, dass der Ausfall des EP-2-Rezeptors scheinbar durch den EP-4-Rezeptor

kompensiert werden kann. Denn erst nach dessen Ausfall sind Veränderungen sicht-

bar.

Das korrespondierende Experiment mit einem EP-2-Antagonisten an einer EP-4-/--

Maus war wegen mangelnder Verfügbarkeit des Antagonisten nicht durchführbar.

Interessant für weitere Studienmodelle wird herauszufinden sein, ob auch umgekehrt

der selektive Ausfall des EP-4-Rezeptors vom EP-2-Rezeptor kompensiert werden

kann, oder ob noch ganz andere Kompensationsmechanismen eine Rolle spielen.

Des Weiteren sollten zukünftige Arbeiten klären, welche zusätzlichen Prozesse wäh-

rend der fetalen bzw. kindlichen Entwicklung durch den Einsatz von COX-2-

Hemmern und durch das Fehlen der Prostaglandine beeinflusst werden. Aber auch

den Einsatz dieser Substanzgruppe bei Erwachsenen gilt es kritisch zu überdenken

und dessen Auswirkungen auf den Organismus weiter zu erforschen. Insbesondere

deswegen, weil erst kürzlich ein Vertreter dieser Gruppe wegen letaler Nebenwir-

kungen vom Markt genommen wurde.

IV.2. Einfluss von NO-Substanzen auf die Nephrogenese

Den Aspekt einer Vasodilatation und dessen Auswirkung auf die Nephrogenese zu

untersuchen, war das nächste Ziel. Hinreichend bekannt war bislang, dass geringe

Diskussion 85_____________________________________________________________________________________________________________

Konzentrationen an PGE2 einen vasodilatativen Effekt und hohe PGE2-

Konzentrationen einen vasokonstriktorischen Effekt aufweisen. Schweda et al.

[2004] konnten dar�ber hinaus diese zum einen dilatativen und zum anderen kon-

striktorischen Prozesse den jeweiligen Prostaglandinrezeptoren EP-1 bis EP-4 zuord-

nen. So konnte in EP-2-/-- und in EP-4-/--Nieren durch Gabe von PGE2 in unter-

schiedlichen Konzentrationen lediglich eine Vasokonstriktion beobachtet werden.

Eine Vasodilatation blieb aus. F�r EP-1-/-- und EP-3-/--Nieren verh�lt es sich genau

umgekehrt. Daraus schlie�t man, dass sowohl der EP-2- als auch der EP-4-Rezeptor

f�r die dilatativen Effekte verantwortlich sind.

Allerdings konnten in dieser Studie keine protektiven Effekte einer Vasodilatation

auf die Nephrogenese durch Gabe von systemisch wirksamen NO-Substanzen ge-

zeigt werden, weder beim Glomerulumvolumen, noch bei der Distanz der Glomeruli

von der Nierenkapsel. Beim letzten zeigte sich eher noch ein sch�digender Effekt.

Einzig die mit NOC-12 behandelten Tiere wiesen einen geringen, aber signifikant

positiven Effekt auf das Glomerulumvolumen auf.

Insgesamt bleibt die Bedeutung einer Vasodilatation f�r die Nephrogenese jedoch

fraglich. Trotzdem sollte, um diesen Aspekt v�llig auszuschlie�en, mit weiteren un-

terschiedlichen bzw. niedrigeren Konzentrationen experimentiert werden.

IV.3. Einfluss von PPAR-Agonisten auf die Nephrogenese

Da weder durch eine Vasodilatation, noch durch Agonisten an Plasmamembranre-

zeptoren ein vollkommener nephroprotektiver Effekt, speziell was die Distanzen der

Glomeruli von der Nierenkapsel angeht, erreicht wurde, wurden die Auswirkungen

von Liganden an Kernrezeptoren untersucht. Es ist bekannt, dass Prostaglandine

auch Liganden an Kernrezeptoren, speziell an PPAR� und PPAR�, sind [Forman et

al., 1995; Kliewer et al., 1995; Mital et al., 2002]. Des Weiteren konnten durch den

selektiven Knockout des Gens der PGE2-Rezeptoren EP-1 bis EP-4 histologisch kei-

ne Nierenver�nderungen festgestellt werden [Narumiya und FitzGerald, 2001]. Eine

Verbindung zum Cyclooxygenaseweg konnten Lim et al. [1999] herstellen, indem

sie beobachteten, dass die reproduktiven Probleme der COX-2-/--Maus durch Gabe

eines PPAR�-Liganden behoben werden konnten. Den Hinweis darauf, dass PPAR�

Diskussion 86_____________________________________________________________________________________________________________

und PPAR� auch bei der Organentwicklung eine entscheidende Rolle zu spielen

scheinen, gaben Yang et al. [1999] dadurch, dass sie erh�hte PPAR� mRNA Signale

zum Ende der Schwangerschaft und eine Progression der PPAR� mRNA Expression

w�hrend der Entwicklung, mit konstant hohen Levels auch nach der Geburt, gemes-

sen haben.

Leider konnten diese Erwartungen durch den Einsatz von Troglitazone als PPAR�-

Agonist und von GW501516 als PPAR�-Agonist in keiner Weise erf�llt werden.

Ganz im Gegenteil, sie sind sogar weiter sch�digend. So liegen die gemessenen Wer-

te signifikant unter denen der unbehandelten COX-2-/--Maus sowohl was die Glome-

rulumvolumina angeht als auch die Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel.

Einzig die mit GW501516 behandelten Tiere weisen bei den Kapseldistanzen der

Glomeruli �hnliche Werte auf wie das unbehandelte COX-2-/--Tier, jedoch keinen

nephroprotektiven Effekt.

Asano et al. [2000] beschrieben eine unterdr�ckte bzw. gehemmte Proliferation ver-

schiedener Zelltypen, unter anderem von Mesangiumzellen durch PPAR-Liganden.

Denkbar, dass NSAIDs als PPAR�-Liganden, wenn auch mit geringer Affinit�t

[Lehmann et al., 1997; Mital et al., 2002], einen Teil ihrer sch�digenden Wirkung

�ber diesen Weg entfalten. Dies sollte Gegenstand folgender Studien sein.

Die Glomerulumvolumina und die Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel

wurden als die entscheidenden bzw. spezifischen �Marker� der regelgerechten Neph-

rogenese angesehen. Dabei soll die Angabe des prozentualen Anteils der Glomeruli

innerhalb einer 58 �m Zone die Nephrodysgenese bzw. deren Rescue unterstreichen.

Die jeweils erhobene Ratio aus Gesamtnierengewicht zum K�rpergewicht korrelierte

selten mit dem beobachteten histologischen Nierenschaden. Sie erwies sich als sehr

fehleranf�llig, was an einer unpr�zisen Arbeitsweise bei der Nierenpr�paration liegen

kann. Daher wurden diese Werte zwar mit in die Arbeit aufgenommen, sollen aber

nicht weiter diskutiert werden.

Zusammenfassend l�sst sich sagen, dass nach meinen Untersuchungen die regelge-

rechte Nephrogenese scheinbar auf eine direkte Prostaglandin E2-Wirkung zur�ckzu-

f�hren ist. Hier haben sich speziell die PGE2-Rezeptoren EP-2 und EP-4 als beson-

ders wichtig f�r diesen Prozess erwiesen. Vor allem, was die Volumen der Glomeruli

Diskussion 87_____________________________________________________________________________________________________________

betrifft. Diesen Schluss lässt auch der umgekehrte Versuch mit COX-2-Hemmern an

Wildtyp-Mäusen zu. Allerdings sind hier auch, wie im COX-2-/--Modell, die Distan-

zen der Glomeruli von der Nierenkapsel reduziert. Da dieser Defekt jedoch weder

durch EP-2- bzw. EP-4-Agonisten, noch durch vasodilatative Prozesse, oder auf

Kernrezeptorebene ausgeglichen werden konnte, führt dies zu der Annahme, dass für

diesen Aspekt noch andere Mechanismen verantwortlich sein müssen. Denkbar sind

hier Effekte des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS). Möglicherweise

kommt es hier einfach auf die richtige Balance zwischen den einzelnen Systemen an.

Zusammenfassung 88_____________________________________________________________________________________________________________

V. Zusammenfassung

Die Einnahme von NSAIDs w�hrend der Schwangerschaft, speziell im 3. Trimenon,

stellt beim Menschen ein erhebliches Problem f�r die fetale Nierenentwicklung dar.

Zahlreiche tierexperimentelle Studien haben gezeigt, dass durch selektiven Knockout

des COX-2-Gens, aber auch durch pharmakologische Inhibition der Cyclooxygena-

se-2 von NSAIDs, die Nephrogenese nachhaltig beeintr�chtigt wird. So stellten sich

diese Nieren makroskopisch als klein und blass dar. Mikroskopisch konnte das Bild

einer unterentwickelten Niere mit kleinen, zusammengedr�ngten, subkapsul�r gele-

genen Glomeruli beobachtet werden. Diese Glomeruli liegen in einem d�nnen Kor-

tex mit zystischen Formationen. Die Tiere verstarben nach 4-5 Monaten aufgrund der

resultierenden Niereninsuffizienz.

In der vorliegenden Arbeit wurden, um die sch�digenden Einfl�sse der NSAIDs noch

einmal n�her zu beleuchten, Versuche mit verschiedenen, in der Klinik eingesetzten,

selektiven COX-2-Hemmern durchgef�hrt. Es wurde zudem der Frage nachgegan-

gen, �ber welche Mechanismen bzw. Rezeptoren Prostaglandine die Nephrogenese

beeinflussen. Dazu kamen neben Agonisten an EP-2- und EP-4-Rezeptoren auch sol-

che an PPAR�- und PPAR�-Rezeptoren zum Einsatz. Ein EP-4-Antagonist im EP-2-/-

-Modell sollte dessen besondere Bedeutung zeigen. Des Weiteren wurden die vasodi-

latativen Effekte diverser NO-Substanzen auf die Nephrogenese untersucht.

Es zeigte sich sowohl f�r Agonisten am EP-2-Rezeptor als auch f�r solche am EP-4-

Rezeptor ein in dosisabh�ngiger Weise �beraus positiver Effekt, was die Glomeru-

lumvolumina angeht, sodass die behandelten Tiere nicht von denen des Wildtyps un-

terschieden werden k�nnen. Dabei erwies sich der EP-4-Rezeptor als der mit den

deutlicheren Effekten. In puncto Distanzen der einzelnen Glomeruli von der Nieren-

kapsel, was ein Hinweis f�r die Kortexreifung darstellt, war nur vom EP-4-Agonisten

ein Partialeffekt zu verzeichnen. Dabei spielte die Konzentration keine Rolle.

Von den NO-Substanzen zeigte nur NOC-12 einen minimalen, wenn auch signifikant

positiven Effekt auf die Glomerulumvolumina. Die mit Spermine NONOate behan-

delten Tiere waren, au�er in einer Konzentration von 1000 �g/ml, hier nicht signifi-

kant vom unbehandelten COX-2-/--Tier zu unterscheiden. Bei den Distanzen der

Glomeruli von der Nierenkapsel war ein �ber das Bild der unbehandelten COX-2-/--

Maus hinaus signifikant sch�digender Effekt zu beobachten.

Zusammenfassung 89_____________________________________________________________________________________________________________

Auch die Ergebnisse der PPAR�- bzw. PPAR�-Agonisten sind durchweg ern�ch-

ternd. Keine der eingesetzten Substanzen, Troglitazone und GW 501516, konnte ein

positives Ergebnis, was die Glomerulumvolumina und die Distanzen der Glomeruli

von der Nierenkapsel angeht, aufweisen. Vielmehr zeigen sie sich noch �ber das

COX-2-/--Bild hinaus sch�digend. Einzig das mit GW501516 behandelte Tier war

von einem unbehandelten COX-2-/--Tier, in Bezug auf die Distanzen der Glomeruli

von der Nierenkapsel, nicht signifikant zu unterscheiden.

Der selektive COX-2-Hemmer SC-236 weist ein von der Dosis und von der Applika-

tionsart abh�ngiges Ergebnis auf. Dies gilt sowohl f�r die Glomerulumvolumina als

auch f�r die Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel. Die mit 30 �g/ml SC-

236, mit Parecoxib und mit Rofecoxib behandelten Nieren sind von der einer

COX-2-/--Maus, in puncto Glomerulumvolumina signifikant zu unterscheiden. Das

gilt jedoch nicht f�r die Distanzen der Glomeruli von der Nierenkapsel. Hier haben

Parecoxib und Rofecoxib nur einen Partialeffekt, wobei Rofecoxib das st�rker wirk-

same ist. Bei SC-236 reicht die Spannweite von Partialeffekt bis hin zu �ber das

COX-2-/--Bild hinaus sch�digend. Der eingesetzte EP-4-Antagonist zeigte im EP-2-/--

Modell in beiden Bereichen einen signifikanten Partialeffekt. Hier sind wahrschein-

lich h�here Konzentrationen n�tig, um ein volles COX-2-/--Bild zu erzeugen.

Insgesamt hat sich gezeigt, dass die regelgerechte Nierenentwicklung, speziell was

die Glomerulumvolumina angeht, sehr stark sowohl vom EP-2-Rezeptor als auch

vom EP-4-Rezeptor abh�ngig ist. F�r die richtigen Distanzen der Glomeruli von der

Nierenkapsel scheint nicht allein der EP-4-Rezeptor verantwortlich zu sein. Hier

m�ssen noch weitere Mechanismen eine Rolle spielen. Die Prozesse �ber die Kern-

rezeptoren PPAR� und PPAR� sind es wohl nicht, sodass dieser Sektor wieder ver-

lassen werden kann. Auch vasodilatative Mechanismen scheinen nicht zum Ziel zu

f�hren. M�glich, dass das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) eine ent-

sprechende Rolle spielt und es einfach auf die richtige Balance der einzelnen Syste-

me ankommt. Dies sollte in weiteren Untersuchungen nicht au�er Acht gelassen

werden. Der Einsatz von NSAIDs w�hrend der fetalen Nierenentwicklung, speziell

im 3. Trimenon, kann aufgrund der gezeigten erheblichen Sch�den nicht empfohlen

werden. Sie sind vielmehr kontraindiziert.

Literaturverzeichnis 90_____________________________________________________________________________________________________________

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Abkürzungsverzeichnis 98_____________________________________________________________________________________________________________

VII. Abkürzungsverzeichnis

A Ampère

AA Arachidonic acid (Arachidonsäure)

Abb. Abbildung

AL Arbeitslösung

ASS Acetylsalicylsäure

bp Basenpaare

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

COX Cyclooxygenase

d Durchmesser

ddH2O doppelt destilliertes Wasser (zweifach entionisiertes Wasser)

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

dNTP Desoxynucleosidtriphosphat

EDTA Ethylen Diamin Tetra-Acetat

EP-2A, EP-4A EP-2 Agonist, EP-4 Agonist

FSH Follikelstimulierendes Hormon

g Gramm

GFR glomeruläre Filtrationsrate

h Stunde

HCG Human Chorionic Gonadotropin

HCl Salzsäure

i.p. intraperitoneal

KG Körpergewicht

l Liter

LH Luteinisierendes Hormon

m Meter

M molar, Mol

min Minuten

MM Metanephrogenes Mesenchym

mRNA messenger Ribonukleinsäure

Abkürzungsverzeichnis 99_____________________________________________________________________________________________________________

NaCl (0,9%) (isotonische) Kochsalzlösung

NO Nitric Oxide (Stickoxid)

NSAID Non steroidal anti-inflammatory drug (nichtsteroidale Antirheu-

matika)

PBS Phosphate Buffered Saline (Phosphat-gepufferte Salzlösung)

PCR Polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion)

PEG Polyethylenglykol

PFA Paraformaldehyd

PGI2 Prostacyclin

PGxy Prostaglandin xy

PPAR Peroxisome proliferator activated receptor

RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

RBF Renaler Blutfluss

RNase Ribonuclease

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)

S Stromazelle

s.c. subcutan

SDS Dodecylschwefelsäure Natriumsalz

SL Stammlösung

T Tränke

Tab. Tabelle

TAE Tris-Acetat-EDTA Puffer

Taq Thermus aquaticus

TE Tris-EDTA

TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat

TRIS Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

TXA2 Thromboxan A2

UK Ureterknospe

UV Ultraviolett

V Volt, Volumen

WT Wildtyp

Anhang 100_____________________________________________________________________________________________________________

VIII. Anhang

VIII.1. Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer in Marburg waren die Damen und Herren

Arnold, Aumüller, Barth, Basler, Baum, Becker, Boudriot, Cetin, Christiansen, Czu-

bayko, Daut, Dünne, Feuser, Gerdes, Geus, Göke, Görg, Griss, Gudermann, Hasilik,

Herzum, Hofbauer, Hofmann, Jungclas, Klenk, Klose, Koolman, Krause, Kretsch-

mer, Krieg, Kroll, Kuni, Lang, Lill, Maier, Maisch, Moll, Moosdorf, Müller, Mut-

ters, Oertel, Remschmidt, Renz, Richter, Röhm, Rothmund, Schäfer, Schmidt,

Schnabel, Seitz, Seyberth, Steiniger, Studer, Wagner, Westermann, Zielke

VIII.2. Danksagung

Ich bedanke mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. R.M. Nüsing, Zentrum für Kinder-

und Jugendmedizin, für die Bereitstellung des Themas, die fachliche und kollegiale

Betreuung, sowie für die kritische Durchsicht der Arbeit.

Weiterer Dank gilt den Tierpflegerinnen und -pflegern des Mausstalls für die fachge-

rechte Betreuung und Versorgung der Mäuse.

Außerdem möchte ich mich bei allen Kollegen des Labors für molekulare und expe-

rimentelle Pharmakologie für die nette Einarbeitung und den gehabten Spaß, wäh-

rend der auch oftmals stressigen Arbeit, bedanken.

Nicht minderer Dank gilt meinen Korrekturlesern Patrick und meiner lieben Freun-

din Tina. Ich weiß, dass es für beide nicht leicht war sich durch dieses Werk zu ar-

beiten.

Allerdings der größte Dank gebührt meinen Eltern für ihre in jeder Lage großartige

Unterstützung, ohne die ich jetzt nicht hier sitzen würde, um diese Zeilen zu schrei-

ben.

Untersuchungen zur Cyclooxygenase-abhängigen Nephrogenese ... · Diese wird beim menschlichen...

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