Antikörperanbindung auf plasmapolymerisierte ...€¦ · Shankaran, D.R. and N. Miura, Trends in...

Antikörperanbindung auf

plasmapolymerisierte

Maleinsäureanhydrid-Filme

Diplomarbeit

zur Erlangung des Grades

eines Diplomchemikers

dem Fachbereich Chemie der

Johannes Gutenberg-Universität Mainz

vorgelegt von

Véronique Schwartz,

geboren in Bernkastel-Kues

Mainz 2008

ii

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Februar 2008 bis September 2008 am Max-

Planck-Institut für Polymerforschung unter der wissenschaftlichen Betreuung von Prof. Dr.

Wolfgang Knoll und Dr. Renate Förch angefertigt.

Beginn der Diplomarbeit: 01. Februar 2008

Diplomarbeit beim Prüfungsausschuss eingereicht: 30. September 2008

Ich versichere, dass ich die Diplomarbeit selbstständig verfasst habe und keine anderen als die

angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.

Mainz, den 30. September 2008

Véronique Schwartz

iii

Die Neugier steht immer an erster Stelle eines Problems, das gelöst werden will.

Galileo Galilei

iv

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung……………………………………………………………………..1

1.1 Motivation………………………………………………………………………….2

1.2 Zielsetzung…………………………………………………………………………3

Literaturverzeichnis…………………………………………………………………….4

2 Theoretische Grundlagen……………………………………………………5

2.1 Plasmapolymerisation……………………………………………………………...5

2.2.1 Plasmen…………………………………………………………………..5

2.2.2 Erzeugung von Niederdruckplasmen………………………………….…6

2.2.3 Plasmapolymerisation……………………………………………………6

2.2 Oberflächenplasmonenspektroskoptie……………………………………………10

2.2.1 Theoretischer Hintergrund……………………………………………....11

2.2.2 Messprinzip…………………………………………………………......13

2.3 Optische Wellenleitermodenspektroskopie……………………………………….15

2.4 Oberflächenplasmonenfluoreszenzspektroskopie…………………………..…….17

Literaturverzeichnis…………………………………………………………………...20

3 Materialien und Methoden…………………………………………………21

3.1 Plasmapolymerisation…………………………………………………………….21

3.1.1 Aufbau der Plasmapolymerisationsanlage…………………………..….21

3.1.2 Probenherstellung…………………………………………………….…22

3.1.3 Flussratenbestimmung des Monomers……………………………...…..22

3.2 Probenvorbereitung……………………………………………………………….24

3.2.1 Substrate………………………………………………………………...24

3.2.2 Substratreinigung………………………………………………………..24

3.2.3 Substratbedampfung………………………………………………...…..24

3.2.4 Assemblierungslösungen…………………………………………….….25

3.3 Chemikalien und experimentelle Methoden……………………………………...25

3.3.1 Chemikalien…………………………………………………………..…25

3.3.2 Antikörper……………………………………………………………….26

v

3.3.3 Experimentelle Methoden……………………………………………....26

3.4 Charakterisierungsmethoden……………………………………………………...27

3.4.1 SPR/OWS/SPFS………………………………………………………...27

3.4.2 Bestimmung der Filmdicke mit dem Oberflächenprofilometer……...…30

3.4.3 Kontaktwinkelmessungen…………………………………….…………31

3.4.4 Fourier-Transformation-Infrarot-Reflektions-Absorptions-Spektroskopie

(FT-IRRAS)…………………………………………………………...………32

3.4.5 UV-VIS-Spektroskopie………………………………………………....32

3.4.6 Rasterkraftmikroskopie…………………………………………………33


4 Ergebnisse und Diskussion………………………………………………....35

4.1 Allgemeine Eigenschaften plasmapolymerisierterMaleinsäureanhydridfilme in

Luft und wässriger Lösung…………………………………………………………....35

4.1.1 Charakterisierung plasmapolymerisierter Maleinsäureanhydrid-Filme mit

Hilfe von Schichtdicken-, AFM-, Kontaktwinkelmessungen und FT-IR-

Spektroskopie in Luft…………………………………………………………36

4.1.2 Charakterisierung plasmapolymerisierter Maleinsäureanhydrid-Filme mit

UV-VIS-Spektroskopie, SPR- und OWS-Messungen in Luft und wässriger

Lösung ………………………………………………………………………..44

4.2 Immobilisierung von IgG-Antikörpern auf plasmapolymerisierten

Maleinsäureanhydridfilmen…………………………………………………………..60

4.2.1 Kopplungsstrategien…………………………………………………….61

4.2.2 SPR-Messoptimierung…………………………………………………..63

4.3.3 Ergebnisse……………………………………………………………….65


5 Fazit………………………………………………………………………….80

6 Danksagung………………………………………………………………….81

7 Abkürzungsverzeichnis……………………………………………………..82

Kapitel 1 - Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Motivation

Plasmabeschichtungsverfahren haben sich in den letzten Jahrzehnten in vielfältigen

industriellen Anwendungsprozessen etabliert [1], u. A. in der Fahrzeugtechnik als

Vorbehandlung zu Lackierungsprozessen, in der Textilindustrie bei der Erzeugung von

wasserabweisenden Oberflächen, bei der Abscheidung von isolierenden Filmen auf

mikroelektronischen Bauteilen sowie in der Medizintechnik zur Sterilisierung von

medizinischen Geräten. Bei der Plasmapolymerisation handelt es sich um einen Spezialfall

der Plasmabeschichtung, bei dem überwiegend organische Precursormoleküle bei niedrigen

Temperaturen plasmaaktiviert und als dünne Filme auf einer Substratoberfläche abgeschieden

werden. Der aktuelle Stand der Technik erlaubt eine weitgehend zerstörungsfreie

Fragmentierung des Monomergases unter Erhaltung struktureller Eigenschaften. Durch das

breite Spektrum an Precursorn wird eine chemisch strukturelle Vielseitigkeit in einem

sauberen, lösemittelfreien Prozess gewährleistet. Die resultierenden Filme zeichnen sich

durch eine, durch den hohen Vernetzungsgrad bedingte, gute mechanische und chemische

Stabilität, gute Adhesionseigenschaften zum Substrat sowie eine weitgehend flache, lochfreie,

hoch spezifische funktionelle Oberfläche aus. Aufgrund dieser Eigenschaften bieten

Plasmapolymere eine hervorragende Grundlage zum Design von Biosensorgrenzflächen [1-3].

Die Entwicklung von SPR-Biosensoren zur Detektion chemischer und biologischer Spezies in

der medizinischen Diagnostik, in der Lebensmittelindustrie sowie der Umweltanalytik hat in

den letzten Jahrzehnten rapide zugenommen. Der grundlegende Aufbau eines Biosensors

umfasst ein Signalumwandlungsbauteil, auf dem ein biologisches Erkennungselement

assembliert ist, welches mit einem spezifischen Analyten interagieren kann. Ein SPR-

Biosensor nutzt das evaneszente Feld des an einem dünnen Metallfilm generierten

Oberflächenplasmons, um die jeweilige Zunahme des Brechungsindexes zu detektieren,

welche die Anlagerung eines spezifischen Analyts auf dem an der Metalloberfläche

immobilisierten biologischen Erkennungselement bewirkt. SPR-Immunosensoren gehören zu

den am häufigsten verwendeten Sensortypen, da sie eine hohe Affinität und Spezifität zum

Zielanalyten aufweisen.[4, 5].


2

Das menschliche C-reaktive Protein (CRP) spielt eine bedeutende Rolle in der medizinischen

Diagnostik als biologischer Marker für infektiöse und nichtinfektiöse Erkrankungen. Im Falle

einer akuten Entzündung ist eine rapide Zunahme der CRP-Konzentration im Blutplasma zu

verzeichnen. Klinische Studien zeigten, dass das Risiko zur Ausbildung von u. A.

Herzgefäßerkrankungen bei Patienten mit nachweislich erhöhten CRP-Plasma-Werten steigt.

CRP wird standardmäßig über ELISA-Tests (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

nachgewiesen. Diese Methode zeichnet sich zwar durch eine hohe Sensitivität aus, ist aber

relativ teuer und zeitaufwendig [6-8]. Schnellere, ebenso sensitive Nachweistechniken, z. B.

auf der Basis von SPR-Biosensoren, sind daher gefragt. Bisherige Arbeiten berichten über

erste Erfolge modifizierter Dextran-, SAM- und Gold-basierter Sensoroberflächen [7-9].

Über SPR-Biosensoren, insbesondere Immunosensoren, auf der Basis von Plasmapolymeren

ist in der Literatur relativ wenig bekannt [10]. Bisherige Arbeiten berichten über die

Verwendung plasmapolymerisierter Hexamethyldisiloxan- sowie Ethylendiamin-basierter

Immunosensoren zur Detektion von BSA und HSA [11-13].

Plasmapolymerisierte Maleinsäureanhydridfilme (pp-MA) haben sich in der Vergangenheit

als geeignete Plattform für die Anbindung von Biomaterialien bewährt. Die

Polymeroberfläche konnte dabei erfolgreich als Unterlage für Lipid-Doppelschichten [14]

sowie für die Anbindung und Freisetzung von in Phospholipid-Doppelschicht-Vesikeln

eingekapselten Fluoreszenzfarbstoffen genutzt werden [15]. Über die erfolgreiche

Verwendung von pp-MA-Filmen als Grundlage für einen Immunosensor zum Nachweis von

CRP ist in der Literatur nichts bekannt.

1.2 Zielsetzung

Im Rahmen dieser Arbeit sollen pp-MA-Filme auf ihre Kapazität als Plattform für potentielle

SPR-CRP-Sensoren untersucht werden. Hierfür sollen pp-MA-Filme mit einer hoch

funktionalisierten Oberfläche synthetisiert werden, die sich durch eine gute Stabilität in

wässriger Lösung auszeichnen (Kapitel 4.1). Im Anschluss sollen Anti-CRP-IgG-Proteine auf

der Polymeroberfläche immobilisiert und auf ihre Stabilität hin getestet werden (Kapitel 4.2).

Das entwickelte pp-MA-anti-CRP-System soll als Modellsystem eine Grundlage für

nachfolgende Arbeiten zur Entwicklung eines SPR-CRP-Biosensors schaffen.


3

Ein Erfolgsschlüssel für die Entwicklung eines SPR-Biosensors ist die Kopplungseffizienz

des biologischen Erkennungselements auf der Metalloberfläche [10]. Die Kopplungseffizienz

ist stark von der Benetzbarkeit und Ladungsdichte der Oberfläche abhängig [2]. Das

Plasmapolymer stellt hierbei das Bindeglied zwischen Metalloberfläche und Antikörper dar.

Der Polymerfilm muss daher durch gezielte Einstellung der Prozessbedingungen im Plasma

entsprechend funktionalisiert werden und gleichzeitig einen ausreichenden Vernetzungsgrad

beibehalten, um die Stabilität des Grundgerüsts in wässriger Lösung zu gewährleisten.

Proteine tendieren dazu unspezifisch, infolge von attraktiven elektrostatischen, van-der-

Waals– oder über Wasserstoffbrücken induzierte Wechselwirkungen, auf einer festen

Oberfläche zu adsorbieren [5]. Physikalisch adsorbierte IgG-Moleküle bieten eine schlechte

Sensorgrundlage, da die Antikörper weder einheitlich orientiert noch stabil auf der pp-MA-

Oberfläche aufliegen. Im Rahmen dieser Arbeit wird daher eine kovalente Verknüpfung der

Antikörper mit den funktionellen Gruppen der pp-MA-Oberfläche angestrebt, auf deren

Grundlage Orientierung bzw. Aktivität und Belegungsdichte des Antikörpers weiter optimiert

werden können.


4

Literaturverzeichnis

1. R. Förch, Z.Z., W. Knoll, Soft Plasma Treated Surfaces: Tailoring of Structure and

Properties for Biomaterial Applications. Plasma Processes and Polymers, 2005. 2(5): p. 351-372.

2. R. Förch, A.N.C., A. Bousquet, H. L. Khor, M. Jungblut, L. Q. Chu, Z. Zhang, I. Osey-Mensah, E.-K. Sinner, W. Knoll, Recent and Expected Roles of Plasma-

Polymerized Films for Biomedical Applications. Chemical Vapor Deposition, 2007. 13(6-7): p. 280-294.

3. Muguruma, H. and I. Karube, Plasma-polymerized films for biosensors. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 1999. 18(1): p. 62-68.

4. Homola, J., Surface Plasmon Resonance Sensors for Detection of Chemical and

Biological Species. Chem. Rev., 2008. 108(2): p. 462-493.

5. Shankaran, D.R. and N. Miura, Trends in interfacial design for surface plasmon

resonance based immunoassays. Journal of Physics D-Applied Physics, 2007. 40(23): p. 7187-7200.

6. Shrive, A.K., et al., Three dimensional structure of human C-reactive protein. Nat Struct Mol Biol, 1996. 3(4): p. 346-354.

7. Albrecht, C., N. Kaeppel, and G. Gauglitz, Two immunoassay formats for fully

automated CRP detection in human serum. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008. 391(5): p. 1845-1852.

8. Hu, W.P., et al., Immunodetection of pentamer and modified C-reactive protein using

surface plasmon resonance biosensing. Biosensors and Bioelectronics, 2006. 21(8): p. 1631-1637.

9. Juk J. S., Y.S.-J., Jung S.-H., Han J.-A., Kim Y.-M., Ha K.-S., Ex Situ Analysis of

Protein Arrays by SPR Spectroscopy for the Application of Immunorsensors. J. Kor. Phys. Soc., 2004. 44(4): p. 967-972.

10. Muguruma, H., Plasma-polymerized films for biosensors II. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2007. 26(5): p. 433-443.

11. Akimoto, T., K. Ikebukuro, and I. Karube, A surface plasmon resonance probe with a

novel integrated reference sensor surface. Biosensors & Bioelectronics, 2003. 18(12): p. 1447-1453.

12. Nakamura, R., et al., A Plasma-Polymerized Film for Surface Plasmon Resonance

Immunosensing. Anal. Chem., 1997. 69(22): p. 4649-4652.

13. Muguruma, H., et al., Sensor Chip Using a Plasma-polymerized Film for Surface

Plasmon Resonance Biosensors: Reliable Analysis of Binding Kinetics. Analytical Sciences, 2000. 16(4): p. 347-348.

14. Bender K., F.S., Förch R., Jenkins A. T. A., Köper I., Naumann R., Schiller S. M. S. , Knoll W., ed. Plasma Polymer Supported Lipid Bilayers. Plasma Polymers & Related Materials. 2005, Hacettepe University Press 2008. 32-34.

15. Chifen, A.N., et al., Attachment and Phospholipase A2-Induced Lysis of Phospholipid

Bilayer Vesicles to Plasma-Polymerized Maleic Anhydride/SiO2 Multilayers. Langmuir, 2007. 23(11): p. 6294-6298.

Kapitel 2 – Theoretische Grundlagen

5

2 Theoretische Grundlagen

Im folgenden Kapitel werden die theoretischen Grundlagen der im Rahmen dieser Arbeit

verwendeten Prozesstechniken vorgestellt.

2.1 Plasmapolymerisation

2.1.1 Plasmen

Als Plasma bezeichnet man ein quasineutrales Gasgemisch wechselwirkender Spezies

aus Elektronen, Ionen und Molekülen oder Molekülfragmenten. Die physikalischen

Eigenschaften dieses sogenannten „vierten Aggregatzustandes“ werden durch die Anzahl

an freien Ladungsträgern bestimmt, welche für die simultan ablaufenden Prozesse wie die

Ionisation von Gasmolekülen und daraus resultierenden Fragmentierungs- und

Rekombinationsprozessen verantwortlich sind. Die charakteristische Farbe eines

bestimmten Plasmas lässt sich auf die Emission von Strahlung relaxierender angeregter

Zustände zurückführen.

Man unterscheidet zwischen thermischen Hochdruckplasmen, bei denen Elektronen und

Ionen sich im thermischen Gleichgewicht befinden, und nicht-thermischen

Niederdruckplasmen, bei denen die Ionentemperatur im Vergleich zur

Elektronentemperatur um einiges geringer ist. Hochdruckplasmen finden insbesondere

Anwendung bei thermischen Spritz- und Schweißtechniken, Niederdruckplasmen werden

in einer Vielfalt von Beschichtungsprozessen eingesetzt, wie z. B. in Sputterprozessen,

PECVD, Plasmaätzprozessen und insbesondere der in dieser Arbeit verwendeten

Plasmapolymerisation [1].


6

2.1.2 Erzeugung von Niederdruckplasmen

Niederdruckplasmen werden technisch durch elektronenstoßinduzierte, photo- oder

thermisch induzierte Ionisation von Gasmolekülen bei niedrigen Drücken (p<1mbar)

erzeugt. Dabei werden die freien Ladungsträger entweder durch eine

Gleichstromentladung oder eine Hochfrequenzanregung generiert.

Bei der Gleichstromentladung wird eine Gleichspannung zwischen zwei Elektroden

angelegt. Bei genügend hoher Spannung sind die aus der Glühkathode

herausgeschlagenen Elektronen auf ihrem Weg zur Anode in der Lage, Gasmoleküle zu

ionisieren bzw. Sekundärelektronen herauszureißen.

Die Hochfrequenzentladung kann zum einen kapazitiv mit Hilfe von zwei Elektroden

oder induktiv über ein von einer Spule erzeugtes Wirbelfeld eingeleitet werden. Da bei

der HF-Wechselstromentladung nur Verschiebungsströme fließen, so dass der

Nettostromfluss nach außen hin annähernd Null beträgt, ist es im Gegensatz zur

Gleichstromentladung möglich, die Elektroden bzw. Spulen durch dielektrische

Reaktorwände vom Plasma zu trennen, beispielsweise über eine außen an einem

Glasreaktor anliegende Induktionsspule. Die HF-Methode wird vorwiegend für PECVD-

Prozesse oder auch Plasmapolymerisationsprozesse eingesetzt, da das Plasma nur

minimal durch im Zuge der Reaktion auf den Elektroden abgeschiedenes Material

beeinträchtigt wird. Die verwendete Arbeitsfrequenz von 13,56 MHz liegt oberhalb der

Ionenplasmafrequenz, so dass nur die Elektronen in der Lage sind dem zeitlichen Verlauf

der Spannung zu folgen [1].

2.1.3 Plasmapolymerisation

Die Plasmapolymerisation ist ein Verfahren zur Abscheidung organischer und

anorganischer Filme auf unterschiedlichsten Oberflächen. Dabei wird ein

organisches/anorganisches Precursorgas in einer speziell konstruierten Reaktionskammer

plasmaaktiviert, so dass die hierbei erzeugten reaktiven Spezies ein sich ebenfalls im

Reaktor befindendes Substrat bombardieren. An der Substratoberfläche konkurrieren


7

simultan ablaufende Prozesse, die sowohl Oberflächenabtragungsreaktionen, durch

Bindungsdissoziation an der Oberfläche bzw. Oberflächenätzprozesse, als auch eine

Filmabscheidung, durch chemische Reaktionen zwischen aktivierten Oberflächenspezies

und plasmaaktivierten Molekülfragmenten an Radikalen, Ionen, metastabilen Spezies und

Elektronen, ermöglichen. Welcher der beiden Prozesse bevorzugt stattfindet, hängt von

den gewählten Prozessbedingungen, d. h. der Monomerflussrate, dem Monomerdruck,

der Eingangsleistung und der Reaktorgeometrie ab [2].

Die Auswahl der zu behandelnden Substrate wird nur durch die Reaktortauglichkeit des

Materials eingegrenzt. Typische Substrate sind Glas-Objektträger, Si-Wafer,

Kunststoffteile oder auch Textilstreifen.

Im Gegensatz zu konventionellen Polymerisationsverfahren, in denen die

Monomerstruktur den entsprechenden Polymerisationsmechanismus diktiert, ist die

Plasmapolymerisation ein mechanistisch unspezifisches Verfahren, welches keine

besonderen Anforderungen an die Monomerstruktur stellt. Prinzipiell ist jedes

organisches Molekül plasmachemisch polymerisierbar, sofern es sich beim

entsprechenden Arbeitsdruck in die Gasphase überführen lässt. Gasmischungen des

Monomers mit einem Aktivatorgas (O2, Ar) sind ebenfalls möglich. Das Aktivatorgas

kann, aber muss dabei nicht zwangläufig an der Polymerisation beteiligt sein. Schwer

sublimierbare Substanzen können mit Hilfe eines inerten Carriergases in den Reaktor

überführt werden. Im Gegensatz zu den klassischen Polymeren genau definierter

Kettenlängen und Wiederholungseinheiten ähnelt die Filmmorphologie der resultierenden

Plasmapolymere eher einem bunt zusammengewürfelten Netzwerk aus unterschiedlichen

Fragmenten, welches jedoch gleichzeitig einen hohen Anteil an funktionalen

Wiederholungseinheiten enthält.

Der Polymerisationsmechanismus lässt sich am besten mit Hilfe eines schnellen

bizyklischen Stufenwachstumsprozesses beschreiben, welcher simultan über

monofunktional aktivierte Spezies •iM (Zyklus 1, Abb.2.1) und bifunktional aktivierte

Spezies •• iM (Zyklus 2, Abb.2.1) abläuft, deren Interaktion in einem 3D-Netzwerk

willkürlicher Knotenpunkte resultiert [3]. Die Bindungsbildung erfolgt gleichzeitig zu

Ionisierungsprozessen, welche für einen Nachschub an reaktiven Spezies sorgen. Mit


8

steigender eingespeister Leistung erhöht sich auch das Ausmaß an

Oberflächenmodifizierung. Nach dem Abbruch der Plasmareaktion enthält das

resultierende Netzwerk u. A. noch freie Radikalstellen sowie eingelagerte, nichtkovalent

gebundene Fragmente, welche in Kontakt mit Luft oder Flüssigkeit weitere Reaktionen

und/oder Konformationsänderungen eingehen können.

Abb. 2.1 Schematische Darstellung des bicyclischen Stufenwachstumsmechanismus der

Plasmapolymerisation

Mx: neutrales Monomermolekül oder Fragment; •M : monofunktional aktivierte Spezies

(Radikal, Kation, Anion ) ; •• M : bifunktional aktivierte Spezies (Radikalkation, -anion)

i,j,k: unterschiedliche Kettenlängen

Die Filmmorphologie wird maßgeblich von der Reaktorgeometrie sowie den

Prozessbedingungen beeinflusst. Die Reaktorgeometrie definiert sich hauptsächlich über

den Durchmesser, Art und Abstand der Elektroden, dem Monomereinlass und dem

Plasmafluss. Letztere beide Faktoren üben einen nicht zu vernachlässigenden Einfluss auf

die Filmhomogenität aus. Für die Synthese homogener Schichten ist es wichtig, dass alle

Monomermoleküle nach Einlass in den Reaktor die gleiche Wegstrecke bis zur

Abscheidung auf dem Substrat zurücklegen.

Neben der Reaktorgeometrie wirkt sich die Position des Substrats im Reaktor ebenfalls

auf die Filmmorphologie aus, da zwischen den Elektroden Zonen unterschiedlicher


9

Plasmaaktivität existieren. Daher sollte die Probe nach Möglichkeit immer an der

gleichen Stelle in der Reaktionskammer platziert werden. Je nachdem, ob das Substrat

parallel oder senkrecht zum Plasmastrom angeordnet ist, sind laterale Dickegradienten

auf der Probe nicht zu vermeiden.

Eine gewisses Maß an Kontrolle über strukturelle und chemische Zusammensetzung der

Filme lässt sich durch gezielte Einstellung der Prozessbedingung realisieren,

insbesondere dem Monomerbasisdruck sowie der eingespeisten Leistung. Das Plasma

kann kontinuierlich oder nach Einführung einer Frequenzmodulation der HF-Leistung im

gepulsten Zustand betrieben werden.

Grundsächlich sind in Abhängigkeit von der Eingangsleistung bei kontinuierlichem

Plasmabetrieb einige Trends zu beobachten: Mit steigender Eingangsleistung erhöht sich

die Fragmentierung des Monomers sowie der Vernetzungsgrad der Polymerschicht. Die

resultierenden Filme weisen daher wenig Ähnlichkeit zur ursprünglichen

Monomerstruktur auf. Umgekehrt verhält es sich für niedrige Eingangsleistungen: hier

bleibt die Monomerstruktur im Hinblick auf Funktionalität teilweise erhalten, allerdings

auf Kosten des Vernetzungsgrades bzw. der Formstabilität [2].

Bei der gepulsten Plasmapolymerisation wird die Eingangsleistung mit Hilfe eines

Pulsgenerators in „Plasma-An-Phasen“ (ton) und „Plasma-Aus-Phasen“(toff) im Bereich

von Millisekunden aufgeteilt. Quantitativ lässt sich dies durch den Betriebszyklus („duty

cycle“, DC) beschreiben, welcher folgendermaßen definiert ist:

offon

on

tt

tDC

+= (1)

Das Substrat ist somit einer equivalenten Leistung ausgesetzt, die sich aus der

Eingangsleistung, multipliziert mit dem Betriebszyklus, errechnet:

Peakeq PDCP ⋅= (2)

Peq: equivalente Leistung; PPeak: Eingangsleistung

Im Vergleich zum kontinuierlichen Plasmabetrieb nimmt der Ablauf der gepulsten

Plasmapolymerisation etwas geordnetere Formen an: Während der ton-Phase werden die

Reaktionsvorgänge an der Substratoberfläche durch das volle Maß an generierten aktiven


10

Spezies dominiert. In der toff-Phase dagegen sind nur noch Spezies relativ langer

Lebensdauer aktiv. Dabei handelt es sich vorwiegend um Radikalteilchen, welche die

Polymerisation an der Oberfläche fortsetzen. Aufgrund der relativ niedrigen

Konzentration an reaktiven Teilchen ist der zur Filmbildung simultan ablaufende

Abtragungsprozess an der Substratoberfläche vernachlässigbar klein. Zusätzlich ist die

Fragmentierung des Monomers im Vergleich zum kontinuierlichen Plasmabetrieb nicht

so ausgeprägt, da bevorzugt labile Stellen des Monomers, insbesondere

Doppelbindungen, angegriffen werden, so dass Monomerfunktionalitäten bis zu einem

gewissen Grad erhalten bleiben. Hier sind Parallelen zur klassischen radikalischen

Polymerisation erkennbar.

Aufgrund der im vorigen Abschnitt beschriebenen vielseitigen Abhängigkeiten von

äußeren Parametern sind bei der Erforschung plasmapolymerisierter Filme streng

genommen nur Ergebnisse vergleichbar, die unter den gleichen Bedingungen sowie unter

Verwendung von Reaktoren gleicher Bauart zustande gekommen sind.

2.2 Oberflächenplasmonenspektroskopie (SPR)

Bei der Oberflächenplasmonenspektroskopie handelt es sich um ein analytisches

Verfahren zur Untersuchung von Prozessen an Metall/Dielektrikumsgrenzflächen.

Die Anregung des Oberflächenplasmons erfolgt durch das evaneszente Feld eines

totalreflektierten parallel zur Einfallsebene polarisierten Lasers, welcher auf eine an ein

Prisma angrenzende Metallschicht trifft. Die Intensität des reflektierten Lichts wird

hierbei in Abhängigkeit vom Einfallswinkel detektiert. Mit einer Sensitivität von bis zu

150 nm über der Metalloberfläche lassen sich so Brechungsindex- und Dickeänderungen

einer an die Metallschicht angrenzenden Analytschicht erfassen sowie dynamische

Prozesse an der Oberfläche zeitaufgelöst aufnehmen.


11

2.2.1 Theoretischer Hintergrund

Trifft ein Lichtstrahl auf die Grenzfläche zweier Medien mit unterschiedlichem

Brechungsindex wird dieser teilweise gebrochen bzw. reflektiert. Oberhalb eines

charakteristischen Winkels, dem sogenannten Grenzwinkel der Totalreflektion θc , erfolgt

beim Übergang von einem optisch dichteren zu einem optisch dünneren Medium nur

noch eine Reflektion des Lichtstrahls.

Die totalreflektierte Lichtwelle dringt dabei zu einem gewissen Anteil in das optisch

dünnere Medium ein und propagiert in Form einer Oberflächenwelle entlang der

Grenzfläche. Das elektromagnetische Feld dieser Oberflächenwelle, auch Evaneszentfeld

genannt, nimmt dabei sowohl in Ausbreitungsrichtung (x-Richtung) als auch in

Abhängigkeit von der Eindringtiefe (z-Richtung) exponentiell ab.

Unter bestimmten Vorraussetzungen lässt sich das Evaneszentfeld an einer

Metall/Dielektrikumsgrenzfläche zur Anregung von kollektiven longitudinalen

Schwingungen definierter Ausbreitungslänge und exponentiell abfallender

Feldamplitude, sogenannten Oberflächenplasmonen, im angrenzenden

Leitungselektronengas nutzen. Aus Mangel an direkten Nachbarn bzw. Atomrümpfen an

der Grenzfläche breiten sich diese nur entlang der Oberfläche aus. Daher kann die

Anregung auch ausschließlich mit parallel zur Einfallsrichtung polarisiertem (p-

polarisiertem) Licht erfolgen. Hierbei gelten Energie- und Impulserhaltung, d. h. die x-

Komponente des einfallenden Lichtimpulses wird am Resonanzwinkel direkt auf das

Plasmon übertragen. Wie man Abb. 2.2a entnehmen kann reicht der Impuls eines freien

Photons phk in Luft betragsmäßig nicht aus, um ein entsprechendes Plasmon spk anregen

zu können. In Abb. 2.2b sind die Dispersionskurven eines Photons in Luft (1) sowie eines

Oberflächenplasmons (2) an der Metall/Luft-Grenzfläche mit den zugehörigen

Ausbreitungsgeschwindigkeiten im jeweiligen Medium eingetragen. Für die resonante

Anregung eines Oberflächenplasmons müssen sich beiden Kurven schneiden. Durch

Einfügen eines hochbrechenden Mediums, z. B. eines Prismas, erfolgt eine

Impulsangleichung des Photons an das Oberflächenplasmon (Abb. 2.2c), so dass eine

Überlappung der Dispersionskurven realisiert werden kann (Abb. 2.2b (3)).


12

Abb. 2.2: (a) Impulsrelation eines auf eine Metall/Dielektrikumsgrenzfläche unter dem Winkel θ

eintreffenden Photons phk und eines sich in x-Richtung ausbreitenden Oberflächenplasmons

spk . Die für die Anregung des Plasmons relevante x-Komponente des Photonimpulses ist in

jedem Fall betragsmäßig kleiner als die des Oberflächenplasmons. (b) Dispersionrelation eines

sich in Luft (1) und in einem Prisma (3) fortbewegenden Photons. (2) Dispersionsrelation des

sich entlang der Metall/Dielektrikum-Grenzfläche fortbewegenden Oberflächenplasmons; c:

Lichtgeschwindigkeit im Vakuum; ωl: Energie bzw. Frequenz des Anregungslichts; εl :

Dielektrizitätskonstante in Medium 1 (Licht), ε2: Dielektrizitätskonstante in Medium 2 (Prisma);

εm: Dielektrizitätskonstante des Metalls

(c) Impulsrelation nach Einfügen eines hochbrechenden Dielektrikums am Resonanzwinkel θ0:

Beide Impulse stimmen betragsmäßig überein.

Für eine detaillierte Behandlung der Ausbreitung elektromagnetischer Wellen in Materie

mit Hilfe der Maxwell-Theorie sei auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen [5].


13

2.2.2 Messprinzip

Die resonante Kopplung des einfallenden Photons mit einem Oberflächenplasmons an der

Metall/Dielektrikumsgrenzfläche kann nur unter Einbau bestimmter experimenteller

Konfigurationen zur Impulsangleichung realisiert werden. Die Impulsangleichung kann

sowohl über Gitter- als auch Prismenkopplung erfolgen.

Bei der Prismenkopplung unterscheidet man zwischen der weniger verbreiteten Otto-

Konfiguration und der von Kretschmann und Raether eingeführten am weitesten

verbreiteten Methode [6]. Da im Rahmen dieser Arbeit ausschließlich die Kretschmann-

Konfiguration verwendet wurde, sei hier für eine detaillierte Beschreibung der anderen

Methoden auf weiterführende Literatur verwiesen [5].

Abb. 2.3 zeigt einen schematischen Aufbau der Kretschmann-Konfiguration. Der

Anregungslaser trifft auf ein Glasprisma, an dessen Unterseite ein dünner Metallfilm von

ca. 50 nm aufgebracht ist, so dass dessen Evaneszentfeld noch in der Lage ist, ein

Oberflächenplasmon auf der dem Prisma abgewandten Metallseite zu induzieren. ( In der

Praxis wird der Metallfilm meist nicht direkt auf das Prisma, sondern auf ein dem

Brechungsindex des Prismas angepasstes Glassubstrat aufgebracht.)

Abb. 2.3: Schematischer Aufbau der Kretschmann-Konfiguration

Der Detektor zeichnet die Lichtintensität des reflektierten Strahls in Abhängigkeit vom

Einfallswinkel θ auf. In Abb. 2.4 sind zwei typische Reflektivitätskurven dargestellt.

Kurve a in Abb. 2.4 zeigt eine Reflektivitätsaufnahme in Luft eines mit 2 nm Chrom und

50 nm Gold bedampften LaSFN9-Glases. Nähert man sich dem Grenzwinkel der

Totalreflektion θc, steigt die reflektierte Intensität an, erreicht dann ihr Maximum bei θc


14

(hier: Abweichungen in Abb.2.4a durch zusätzliche Chromschicht) und sinkt dann bei

Anregung eines Oberflächenplasmons am Resonanzwinkel θ0 im Idealfall auf Null. Die

relativ hohe Startintensität lässt sich auf den Spiegelcharakter der Goldoberfläche

zurückführen. Nicht ganz zu unterdrückende Effekte, wie z. B. Oberflächenstreuung

aufgrund von Oberflächenrauhigkeit der Metall/Glas-Grenzfläche und Dämpfungseffekte

im Metallinnern durch Energiedissipation, beeinflussen sowohl Breite als auch Minimum

der Resonanzkurve, so dass in der Praxis immer eine Restintensität am

Resonanzminimum verbleibt.

Die Abscheidung eines dünnen dielektrischen Films auf die Goldoberfläche des Substrats

(Abb. 2.4, Kurve b) führt zu Änderungen der Dispersionsrelation des Oberflächen-

plasmons an der Grenzschicht, so dass der Resonanzwinkel zu höheren Werten

verschoben wird. Die Winkelverschiebung (Abb. 2.4: θ0�θ1) ist sowohl von der

Filmdicke als auch vom optischen Kontrast des Umgebungsmediums abhängig.

20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Refle

ktivität

R

θ / °

ab

θo

θ1

θc

Abb. 2.4 Darstellung zweier typischer Reflektivitätskurven

a SPR-Scan in Luft eines mit 2 nm Chrom und 50 nm Gold bedampften LaSFN9-Glas

b SPR-Scan in Luft von a mit einer zusätzlichen pp-MA-Schicht von 8 nm

θc: Grenzwinkel der Totalreflektion


15

Mit Hilfe der Fresnel-Theorie, welche die Kurve als Komplex homogener Multischichten

behandelt, lassen sich Brechungsindex und Dicke des auf das Metall aufgebrachten

Analytfilms in Abhängigkeit voneinander berechnen. Ist z. B. die Dicke des Analyts aus

unabhängigen Messungen bekannt, lässt sich somit der Brechungsindex bestimmen und

umgekehrt. Alternativ können beide Parameter mit Hilfe eines Variationsexperiments

unabhängig voneinander bestimmt werden, indem man eine Messung in zwei Medien

unterschiedlicher optischer Eigenschaften, z. B. Luft und Wasser, durchführt. Dies ist

allerdings nur für Filme möglich, die ihre strukturellen Eigenschaften in beiden Medien

nicht ändern [7].

Für Details zur Fresnel-Theorie sei auf die entsprechenden Fachliteratur verwiesen [8, 9].

2.3 Optische Wellenleitermodenspektroskopie (OWS)

Die optische Wellenleitermodenspektroskopie stellt einen Spezialfall der im vorigen

Abschnitt beschriebenen Oberflächenplasmonenspektroskopie dar, die sich insbesondere

zur Charakterisierung anisotroper Filme eignet.

Für den experimentellen Aufbau gelten die in Abschnitt 2.2.2 beschriebenen Prinzipien

mit dem Unterschied, dass nun auf der Goldoberfläche dickere Analytfilme (d > 200 nm)

abgeschieden werden, die als Wellenleiter im Substrat-Metall/Film/Luft-System

(Abb. 2.4a ) fungieren. Je nach Dicke und dielektrischen Eigenschaften des

abgeschiedenen Films lassen sich Wellenleitermoden verschiedener Ordnung (m) in

Abhängigkeit vom Einfallswinkel θ detektieren (Abb.2.4b ).

Das Prinzip der Wellenleitung beruht auf der Fortpflanzung von Licht innerhalb eines

optisch abgegrenzten, transparenten Mediums durch Totalreflektion an dessen

Grenzflächen. Für die Realisierung einer derartigen Konstruktion gibt es mehrere

Möglichkeiten, auf deren detaillierte Beschreibung mit Verweis auf die entsprechende

umfangreiche Fachliteratur verzichtet wird [10, 11].


16

Im Folgenden beschränken wir uns auf die im Rahmen dieser Arbeit relevante Struktur

des asymmetrischen planaren Wellenleiters. Abb. 2.5a zeigt die Geometrie eines solchen

Wellenleiters: Der Wellenleiterfilm ist auf beiden Seiten durch optisch dünnere Medien

eingegrenzt, so dass für den Brechungsindex des Wellenleiters n2 an jeder Stelle folgende

Randbedingungen gelten: 312 , nnn > . Nach Einkopplung des Lichts oberhalb von θc

propagiert dieses nun entlang der Grenzflächen.

Abb. 2.4

(a) Schematische Darstellung der

experimentellen Konfiguration für

OWS. Zusätzlich zum Oberflächen-

plasmon sind Wellenleitermoden

der 1.-3. Ordnung dargestellt.

(b) Zugehöriger Reflektivitätscan zu

dem in Abb.2.4a gezeigten

Wellenleiter. Die verschiedenen

Wellenleitermoden erscheinen als

scharfe Minima im Spektrum, wobei

die Mode höchster Ordnung den

niedrigsten Resonanzwinkel θm

besitzt.

θc: Grenzwinkel der Totalreflektion

Abb. 2.5

(a)Schematischestrahlenoptische

Darstellungeines asymmetrischen

planaren Wellenleiters folgender

Geometrie:

Substrat(Glas/Au)/Film/Luft.

Es gilt: 312 , nnn > ; 21 nn ≠ ;

(b) Optische Feldverteilung des in

Abb.2.5adargestelltenWellen-

leiters für die s-polarisierten

Moden 1.-3. Ordnung


17

Eine genauere Analyse des geschilderten 3-Lagen-Systems unter Einbeziehung der

Maxwell-Gleichungen zeigt, dass konstruktive Interferenz der elektromagnetischen

Wellen unter den gegebenen Randbedingungen und bei fixierter Wellenlänge nur für

bestimmte Kombinationen an optischen Eigenschaften, mathematisch mit Hilfe der

Eigenwertgleichung für Wellenleitermoden m’ter Ordnung beschrieben, existieren kann

[5]. Die sich so ergebenen Eigenmoden entsprechen der in Abb. 2.5b dargestellten

optischen Feldverteilung senkrecht zur Wellenleiterachse (z-Achse). Genauer betrachtet

zerlegt man eine Mode in zwei Komponenten unterschiedlicher Polarisation, sogenannte

TE- (transversal elektrisch, p-) und TM-Moden (transversal magnetisch, s-), da diese zur

Erfüllung der Phasenregel für konstruktive Interferenz unterschiedliche

Ausbreitungsgeschwindigkeiten im Wellenleiter besitzen. Dies lässt sich insbesondere für

die Charakterisierung anisotroper Filme nutzen:

Zur Illustration dieses Sachverhaltes kehren wir zu Abb. 2.4a zurück. Die ‚nullte’ Mode

entspricht dem Oberflächenplasmon, dessen Resonanzwinkel aufgrund des

exponentiellen Abfalls in z-Richtung nur von nz, dem mittleren Brechungsindex des

Filmdurchmessers, abhängig ist. Die Anregung von Moden höherer Ordnung erfolgt mit

s- oder p-polarisierten Licht. Daher hängen diese sowohl von den Brechungsindices aller

drei Raumrichtungen nx, ny, und nz, als auch der Filmdicke d ab. Die Mode höchster

Ordnung hat aufgrund ihrer erhöhten Feldverteilung an den Grenzflächen zu den optisch

dünneren Medien (vgl. Abb. 2.4a, m = 3) die höchste Sensitivität in Bezug auf die

Filmdicke. Die Auswertung unter Bestimmung der Parameter n und d ermöglicht die

Erstellung eines Profils optischer Eigenschaften für anisotrope Filme.

2.4 Oberflächenplasmonenfluoreszenzspektroskopie (SPFS)

In bestimmten Fällen reicht die Sensitivität der Oberflächenplasmonenspektroskopie

allein nicht aus, um Prozesse an Grenzflächen zu untersuchen. Dies trifft vor allem für

die Untersuchung von Grenzflächenanbindungsprozessen niedrig konzentrierter, relativ

kleiner Analytmoleküle geringen Molekulargewichts zu. Hier ist es notwendig, das

Signal mit Hilfe von Fluoreszenzmarkierung zu erhöhen [12].


18

Das Evaneszentfeld eines Oberflächenplasmons oder einer Wellenleitermode ermöglicht

die Anregung eines Fluorophors im entsprechenden Einzugsgebiet, unter der

Vorraussetzung, dass die Wellenlänge des Anregungslasers im Bereich des

Absorptionsspektrums des verwendeten Farbstoffs liegt.

Abb. 2.6 zeigt eine Reflektivitätskurve für ein System aus

Substrat(Glas/Gold)/Polymerfilm/farbstoffmarkierter Analyt. Die Photonenstromdichte

des fluoreszierenden Farbstoffs wird mit Hilfe eines Photomultipliers zeitgleich zur

Reflektivitätsscan winkelabhängig aufgenommen. Verglichen mit dem

Resonanzminimum des Oberflächenplasmons ist der Emissionspeak aufgrund einer

minimalen Phasenverschiebung von Plasmonen- und Photonenfeld zu kleineren

Einfallswinkeln verschoben.

45 50 55 60 65 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Einfallswinkel θ / °

Reflektivität / re

l. E

.

0

100000

200000

300000

400000

500000

Flu

ore

sze

nzin

ten

sitä

t (Co

unts

)

Abb. 2.6

SPFS-Scan des folgenden Systems: LaSFN9/Cr/Au/pp-MA/Cy5-IgG/PBS

Gefüllte Quadrate: Reflektivtitätsscan in Abhängigkeit vom Einfallswinkel

Leere Quadrate: Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit vom Einfallswinkel

Eine erfolgreiche Anregung eines Fluorophors kann nur dann erfolgen, wenn das

farbstoffmarkierte Analytmolekül einen Mindestabstand zur Metalloberfläche besitzt.

Unterhalb von ca. 25 nm treten störende Kopplungseffekte zwischen den elektronischen


19

Metallzuständen und den Molekülorbitalen des Chromophors auf, die in Quenching der

Fluoreszenz bzw. Energiedissipation im Metall resultieren.

Für die kinetische Untersuchung von Bindungsprozessen an der Filmoberfläche ist zu

beachten, dass die aufgenommene Fluoreszenzintensität nicht linear mit einer

korrespondierenden Dickenzunahme bei Anbindung des farbstoffmarkierten Analyten

korreliert.


20


1. Haeter, R.A., ed. Oberflächen- und Dünnschichttechnologie. 1987, Springer-Verlag: Berlin. 56 ff.

2. Renate Förch, Z.Z.W.K., Soft Plasma Treated Surfaces: Tailoring of Structure

and Properties for Biomaterial Applications. Plasma Processes and Polymers, 2005. 2(5): p. 351-372.

3. Yasuda, H., ed. Plasma polymeristation. 1985, Academic Press, Inc: Orlando.

4. Hirotsugu Yasuda, T.Y., The competitive ablation and polymerization (CAP)

principle and the plasma sensitivity of elements in plasma polymerization and

treatment. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 2000. 38(6): p. 943-953.

5. Knoll, W., Interfaces and thin films as seen by bound electromagnetic waves. Ann. Rev. Phys. Chem., 1998. 49: p. 569-638.

6. Kretschmann E., R.H., Z. Naturforsch. Teil A, 1968. 23: p. 2135-2136.

7. Bunjes, N., et al., Thiopeptide-Supported Lipid Layers on Solid Substrates. Langmuir, 1997. 13(23): p. 6188-6194.

8. E., H., ed. Optik. 3. Auflage ed. 2001, Oldenbourg Wissenschaftsverlag GmbH: Wien.

9. H., R., ed. Surface Plasmons on Smooth and Rough Surfaces and on Gratings. Vol. 111. 1988, Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

10. Boisdé G., H.A., ed. Chemical and biochemical sensing with optical fibers and

waveguides. 1996, Artech House, Inc.: Norwood.

11. H.-G., U., ed. Optische Wellenleiter. Vol. Teil 1. 1984, Hüthig: Heidelberg.

12. Liebermann, T. and W. Knoll, Surface-plasmon field-enhanced fluorescence

spectroscopy. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2000. 171(1-3): p. 115-130.

Kapitel 3 – Materialien und Methoden

21

3 Materialien und Methoden

3.1 Plasmapolymerisation

3.1.1 Aufbau der Plasmapolymerisationsanlage

Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmapolymere wurden in einem hausgebauten

zylinderförmigen, ca. 30 cm langen Pyrex-Glaskolben mit einem Durchmesser von 10 cm,

hergestellt (siehe Abb. 3.1). Die Einspeisung der 13,56 MHz-HF-Spannung erfolgt induktiv

über eine um die Reaktionskammer gewickelte Spule mit Hilfe eines Verstärkers RFG-150

Coaxial Power System Ltd mit einer maximalen Leistung von 150 W. Der Puls wird durch

einen hausgebauten Pulsgenerator eingestellt. Eine Leybold BCS 16 Vakuumpumpe evakuiert

die Reaktionskammer, deren Basisdruck von ca. 3106 −⋅ mbar durch ein MKS-Baratron,

welches in der Nähe des Monomergaseinlasses angebracht ist, gemessen wird. Eine mit

flüssigem Stickstoff gekühlte Kühlfalle zwischen Reaktor und Pumpe verhindert das eventuell

verbleibende Monomerrückstände in die Vakuumpumpe gelangen können.

Abb. 3.1 : Schematischer Aufbau der verwendeten Plasmapolymerisationsanlage


22

Fein gemörsertes Maleinsäureanhydrid-Pulver wurde in einen Kolben eingefüllt und dieses

direkt an das System angeschlossen. Die verwendeten Substrate wurden auf eine Glasplatte

ungefähr in der Mitte der Plasmazone platziert. Vor bzw. nach jedem Polymerisationszyklus

wurde der Reaktor bei kontinuierlichem Plasmabetrieb mit einer O2/Ar-Gasmischung (1:9)

zwischen 20-90 Minuten, in Abhängigkeit vom Verschmutzungs-grad, gereinigt. Die

Gasflussbestimmung erfolgte an einem ähnlich aufgebauten Reaktor mit Hilfe eines dort

angeschlossenen MKS 647 Gasflusskontrollsystems.

3.1.2 Probenherstellung

Maleinsäureanhydrid wurde je nach Kolbenfüllstand bei Drücken zwischen 0,5-0,8 mbar

direkt in das System eingespeist. Für den Plasmabetrieb wurden Spitzenleistungen von 50 W

bzw. 100 W bei einem Betriebszyklus von DC=1/41 gewählt. Dies entspricht einer

Equivalentleistung von 1,22 W bzw. 2,44 W.

Für die Herstellung dünner pp-MA-Filme von ca. 25-30 nm genügten Polymerisationszeiten

von 5-10 Minuten in Abhängigkeit vom Monomerausgangsdruck. Dickere pp-MA-Filme im

Bereich von 0,5-1 µm erforderten Polymerisationszeiten von 2-3 Stunden.

Die mit pp-HMDSO-beschichteten Proben wurden zunächst 8 s lang mit Sauerstoff bei einem

Druck von ca. 0,3 mbar aktiviert, anschließend ca. 18 s bei einer Eingangsleistung von 120-

130 W einem kontinuierlichen HMDSO/O2-Plasma im Verhältnis 1:10 ausgesetzt. Dies ergab

Filmdicken von 50-60 nm. Der HMDSO-Fluss wurde mit Hilfe eines Nadelventils der Firma

Edwards kontrolliert und auf 0,1 mbar eingestellt. Nach erneuter Aktivierung mit Sauerstoff

wurden mikrometerdicke pp-MA-Filme auf die pp-HMDSO-Unterlage abgeschieden. Die

frisch hergestellten Proben wurden in PS-Gelboxen gelagert und innerhalb von 2 Stunden für

weitere Reaktionen verwendet.

3.1.3 Flussratenbestimmung des Monomers

Die Monomerflussrate lässt sich mit Hilfe einer Leckgasflussmessung bestimmen, deren

Grundlage das ideale Gasgesetz darstellt. Da in der Plasmapolymerisation bei niedrigen

Drücken gearbeitet wird, ist die Behandlung aller Reaktorgase als ideale Gase zulässig. Bei

vorgegebenem Reaktorvolumen VReaktor und Raumtemperatur T sind demnach der


23

Systemdruck p sowie dessen zeitliche Änderung dp/dt direkt proportional zur Anzahl der

Moleküle n bzw. zur zeitlichen Änderung der Molekülanzahl, dem Fluss dn/dt :

RTV

dt

dp

dt

dnaktor

1Re ⋅⋅

=

R: universelle Gaskonstante 3.1

Die praktische Bestimmung der Monomerflussrate funktioniert folgendermaßen: Nach Öffnen

des Monomerventils strömt das Monomer in den Reaktor ein, bis sich ein konstanter

Basisdruck einstellt. Anschließend trennt man das System von der Vakuumpumpe und

registriert den resultierenden Druckanstieg im Reaktor in Abhängigkeit von der Zeit, welcher

zunächst linear ansteigt, bis sich ein Sättigungsgleichgewicht einstellt. Setzt man die Steigung

des linearen Bereichs (dp/dt) in Gleichung 3.1 ein und multipliziert 3.1 zusätzlich mit einem

Kalibrierungsfaktor ΘRT zur Einhaltung der Standardbedingungen, so erhält man den

Monomerfluss dn/dt in [ ]slmbar /⋅ :

T

TV

dt

dp

dt

dnaktor

Θ

⋅⋅

= Re 3.2

ΘT : Temperatur bei Standardbedingungen (273K); T : Raumtemperatur (293K)

Dabei wird die Flussrate eines Gases üblicherweise in cm3STP/min bzw. sccm („standard cubic

centimeters per minute) bei Standardbedingungen angegeben. Es gilt:

s

lmbarcmatmsccm

⋅⋅=

⋅= −2

3

1069,1min1

111 bzw. sccm

s

lmbar2,591 =

⋅

Bei einem Basisdruck von 0,06 mbar erhält man für Maleinsäureanhydrid eine mittlere

Flussrate von 2107,3 −⋅ sccm. Für Hexamethyldisiloxan beträgt der mittlere Fluss 2,5 sccm

bei einem Basisdruck von 0,1mbar.


24

3.2 Probenvorbereitung

3.2.1 Substrate

In Tabelle 3.1 sind die verwendeten Substrate für die jeweilige Charakterisierungsmethode

aufgelistet.

Substrat Größe Anwendung

Einfach polierter Si-Wafer 10 x 20 mm2

Kontaktwinkel- und Dicke-

messung, AFM

BK7-Glas (Firma Berliner Glas, B270)

mit 2 nm Cr und 80 nm Au

20 x 35 mm2 FT-IR-Messung

Quarzglas 20 x 35 mm2 UV-VIS-Messung

LaSFN9-Glas (Firma Hellma, n = 1,845)

mit 2 nm Cr und 50 nm Au

20 x 25 mm2

SPR/OWS/SPFS- Messung

Tabelle 3.1: Verwendete Substrate

3.2.2 Substratreinigung

Die Glas- und Siliziumsubstrate wurden für jede Anwendung sorgfältig nach folgendem

Protokoll gereinigt:

1. Wiederholtes Spülen (10x) mit Milli-Q-Wasser in der Färberbox,

2. 15 Minuten Ultraschallbehandlung in einer alkalischen Tensidlösung (Firma Hellma,

Hellmanex II),

3. Spülen mit Milli-Q-Wasser, bis keine Schaumbildung mehr zu beobachten ist,

4. Abschließendes Spülen mit absolutem Ethanol (Chromasolv-Qualität)

Die gereinigten Gläser wurden anschließend im Stickstoffstrom getrocknet und über Nacht im

Trockenschrank bei 50°C aufbewahrt. Die LaSFN9-Gläser wurden nach jeder Anwendung

durch mehrstündige Einlagerung in einer Gold- (wässrige KI/I2-Lösung) sowie einer

Chromentfernungslösung (wässrige Ammoniumcer(IV)-nitrat-Lösung) regeneriert.

Anschließend wurden sie nach obigem Protokoll gereinigt und neu bedampft.

3.2.3 Substratbedampfung

Die trockenen BK7- und LaSFN9-Gläser wurden in einer Aufdampfanlage (Firma Edwards,

Model FL 400) bei einem Druck von ca. 8 x 10-6 mbar mit einer Aufdampfrate von 0,2 nm/s

zunächst mit 2 nm Chrom und anschließend, je nach Anwendung, mit 50 bzw. 80 nm Gold

bedampft. Die so präparierten Substrate wurden, wenn möglich, sofort verwendet bzw. bis zur


25

Anwendung bei maximaler Lagerungszeit von einer Woche unter Inertgasatmosphäre (Ar, N2)

aufbewahrt.

3.2.4 Assemblierungslösungen

Zur Verbesserung der Filmadhesion wurden die mit Gold bedampften Substrate für

Messungen in wässrigen Medien mit einer SAM („self-assembled-monolayer“)-Schicht

belegt. Die Substrate wurden hierfür 24 h in eine 5 mM Allylmercaptan/Ethanollösung oder

alternativ in eine 5 mM 1-Dodecanethiol/Ethanollösung eingetaucht. Anschließend wurden

sie mit Ethanol gespült, im Stickstoffstrom trocken geblasen und direkt in den Plasmareaktor

überführt.

3.3 Chemikalien und experimentelle Methoden

3.3.1 Chemikalien

Monomere

Maleinsäureanhydrid-Plättchen wurden von der Firma Fluka bezogen; die

Maleinsäureanhydrid-Presslinge wurden von Sigma-Aldrich verwendet. Hexamethyldisiloxan

wurde von der Firma Alfa Aesar bezogen. Die Monomere wurden ohne weitere Aufreinigung

verwendet.

Thiole

1-Dodecanthiol und 1-Octanthiol wurden von Sigma-Aldrich, Allylmercaptan wurde von Alfa

Aesar bezogen.

Crosslinker

TSTU (O-(N-Succinimidyl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium tetrafluoroborat ) und Sulfo-NHS

(N-hydroxysulfosuccinimide) wurden von der Firma Fluka bezogen - EDC (N-3-

Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Hydrochlorid) wurde Sigma Aldrich geliefert.

Detergenzlösung


26

Puffer

- PBS (Tablets, Zymed Laboratories):10 mM Phosphat, 150 mM NaCl; pH = 7,2-7,3

- MES : 0,05 M MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, Sigma-Aldrich), 0,5 M

NaCl; pH = 5-6

3.3.2 Antikörper

Anti-Human C-Reactive Protein

Entwickelt im Hase; IgG Fraktion aus Antiserum; lyophiliertes Pulver; Firma: Sigma-Aldrich

Rabbit anti-Mouse IgG

Cy5 Konjugat , polyklonaler sekundärer Antikörper; Fluorophor/Protein-Verhältnis: ca. 2,2;

Absorptionsmaximum = 650 nm, Emissionsmaximum = 680 nm; lyophiliertes Pulver; Firma:

Chemicon International

3.3.3 Experimentelle Methoden

Kopplungsprotokolle mit TSTU :

(a) Nach 12 h Hydrolyse in Milli-Q-Wasser wurde die pp-MA-Probe in einer Petrischale unter

zehnminütiger Einwirkzeit einer Lösung aus 60 mg (0,2 mmol) TSTU, 85 µl (0,5 mmol)

DIPEA in 5 ml einer 2:2:1-DMF/Dioxan/Milli-Q-Wasser-Mischung aktiviert. Die Probe

wurde kurz mit Milli-Q-Wasser abgespült und unter Stickstoffstrom getrocknet. Nach Einbau

in das SPR-Setup wurden 5 ml IgG-Lösung ( 0,001 mg/ml; 0,2 mg/ml) in Milli-Q-Wasser bei

einer Pumprate von 10 µl/min unter Rücklauf 1 h lang durch die Flusszelle gepumpt. Die

Probenoberfläche wurde nachfolgend 1 h mit Milli-Q-Wasser gespült.

(Protokoll angepasst nach Bannwarth [1])

(b) Die in das SPR-Setup eingebaute pp-MA-Probe wurde 12 h lang mit Milli-Q-Wasser bei

einer Pumprate von 90 µl/min hydrolysiert. Im Anschluss wurden 5 ml einer Lösung aus 5 mg

(16,6 µmol) TSTU, 1,39 µl (10 µmol) Triethylamin in einer 4:1 Dioxan/Milli-Q-Wasser-

Mischung unter Rücklauf bei einer Pumprate von 10 µl/min 40 min lang zugegeben. Nach 10

min Spülen mit Milli-Q-Wasser wurden 5 ml einer IgG-Lösung ( 1 mg/ml) in Milli-Q-Wasser

bei 10 µl/min unter Rücklauf 1 h lang durch die Flusszelle gepumpt. Die Probenoberfläche


27

wurde nachfolgend 15-60 min mit Milli-Q-Wasser gespült. (Protokoll angepasst nach

Andersson [2])

Kopplungsprotokolle mit EDC/Sulfo-NHS

Die in das SPR-Setup eingebaute pp-MA-Probe wurde 4-12 h lang mit PBS bei einer

Pumprate von 30 µl/min hydrolysiert. Im Anschluss wurden 5 ml einer Lösung aus 96 mg

(0,2 mol) EDC, 27 mg (0,05 mol) Sulfo-NHS in MES (pH = 5-6) oder PBS (pH= 7,2-7,3)

unter Rücklauf bei einer Pumprate von 30 µl/min 30-50 min lang zugegeben. Nach 20 min

Spülzeit (10 min mit MES, 10 min mit PBS) wurden 5 ml einer IgG-Lösung ( 0,1 mg/ml) in

PBS bei 30 µl/min unter Rücklauf 1 h lang durch die Flusszelle gepumpt. Die

Probenoberfläche wurde nachfolgend 1-12 h mit PBS bzw. nachfolgend mit 0,1%iger

Tween20-Lösung (Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaurat) gespült.

(Protokoll angepasst nach [3, 4])

3.4 Charakterisierungsmethoden

3.4.1 SPR/OWS/SPFS

Aufbau der Messapparatur

Ein schematischer Aufbau des im Rahmen dieser Arbeit hauptsächlich genutzten

kombinierten SPR/OWS/SPFS-Setups ist in Abb. 3.2 dargestellt.

Ein Helium-Neon-Laser (λ=633 nm) wird durch einen Chopper, zwei Polarisatoren und eine

Blende auf die Probe fokussiert. Der Chopper dient dazu den Anregungsstrahl in zeitgleiche

Licht- und Dunkelphasen aufzuteilen, damit der Lock-In-Verstärker das Detektorsignal im

gleichen Takt auslesen kann. Mit Hilfe der beiden Polarisatoren wird p-polarisiertes Licht für

SPR- bzw. p- und s-polarisiertes Licht für OWS-Messungen eingestellt sowie die

Lichtintensität des Anregungsstrahls reguliert. Die Probe ist in Kretschmann-Konfiguration

(vgl. Kapitel 2, Abb. 2.3) in einer Halterung auf einem schrittmotorgesteuerten Drehtisch

(Goniometer) aufgebracht. Der an der Prisma/Gold-Grenzfläche reflektierte Laserstrahl wird

von einer Linse auf die Detektorfläche fokussiert. Vor Beginn jeder Messung ist der Laser

innerhalb des Drehwinkelbereichs des Goniometers (20-90°) auf den Detektoreinlass zu

justieren.


28

Abb. 3.2: Schematische Darstellung des Messaufbaus für kombinierte SPR/OWS/SPFS-

Messungen

Für SPFS-Messungen wird im Anregungsstrahlengang noch ein Shutter zwischengeschaltet,

welcher den Laser während der Messung in einer bestimmten zeitlichen Abfolge ausblendet,

um Photobleaching des Farbstoffes zu minimieren. Auf der Rückseite der Probenhalterung

wird das emittierte Fluoreszenzlicht mit Hilfe eines Photomultipiers aufgenommen. Zur

Minimierung von Laserstreulicht sind vor dem Eingang des Photomultipliers zwei Filter

angebracht. Der erste Filter blockiert die Laserwellenlänge von 633 nm, während der zweite

nur den Emissionsbereich des im Experiment verwendeten Farbstoffs durchlässt. Das gesamte

Setup ist von einem schwarzen Käfig umschlossen zur Ausblendung jeglicher äußerer

Lichtquellen, welche das Photomultipliersignal verfälschen könnten.

Abb. 3.3 zeigt den schematischen Aufbau des Probenhalters mit einer eingebauten

Flüssigkeitszelle. Prisma und Glassubstrat besitzen den gleichen Brechungsindex und werden

zur Vermeidung von Lufteinlagerung an der Grenzfläche mit einem optisch angepassten

Immersionsöl aufeinander gepresst. Die gesamte Konstruktion wird mit einer Drehschraube

festgestellt. Eine über Tygonschläuche angeschlossene Pumpe (Regio Pumpe Digital 4/8,


29

Ismatec) befördert die verwendete Flüssigkeit durch die Flusszelle. Für nähere Informationen

zum Design der verwendeten Flusszellen vergleiche Kapitel 4.2.2 unter Messoptimierung.

Abb. 3.3: Schematischer Aufbau der Probenhalterung mit eingebauter Flüssigkeitszelle

Durchführung einer Messung

Bei der Messung eines Reflektivitätsscans werden Proben- und Detektormotor des

Goniometers über den zu untersuchenden Winkelbereich gerastert und das reflektierte Licht

wird im Detektor registriert. Die Motorsteuerung erfolgt über eine hauseigene Software

(Wasplas). Bei den Messungen in Luft wird die Probe direkt mit dem Prisma in der

Probenhalterung festgeschraubt (vgl. Abb. 3.3), so dass die Filmoberfläche an der Luft liegt.

Bei den Messungen in Flüssigkeit wird zusätzlich, wie in Abb. 3.3 dargestellt, eine

Flüssigkeitszelle in die Probenhalterung eingebaut, welche mit wässriger Lösung gesättigt

wird.

Für kinetische Messungen gibt es zwei Möglichkeiten:

a) Bei fixierter Winkelposition wird die Änderung der reflektierten Intensität

zeitabhängig registriert. Hierfür wird ein Winkel gewählt, welcher sich im linearen

Kurvenbereich gerade unterhalb des Resonanzwinkels befindet. Für kleine

zeitabhängige Verschiebungen des Resonanzminimums ist die Reflektivitätsänderung

direkt proportional zu Änderung der optischen Dicke (∆nd).

b) Man verfolgt die zeitliche Änderung des Resonanzminimums.


30

Methode (a) eignet sich besser zur Untersuchung von breiten Resonanzkurven, eines

Oberflächenplasmons, während Methode (b) leichter die zeitabhängige Verfolgung schmaler

Wellenleitermoden gestattet.

Auswertung der SPR-Reflektivitätskurven

Zur Auswertung der Messergebnisse wird eine hauseigene Software namens Winspall

verwendet. Die gemessenen Reflektivitätskurven lassen sich manuell oder iterativ mit einem

auf der Fresnel-Theorie basierenden Multischichtsystem anfitten. Eine typische Multischicht

beinhaltet das Prismenmaterial, die Metallbeschichtung, eine Thiolmonolage, das

Plasmapolymer und das umgebende Medium (Luft oder Flüssigkeit). Gibt man für jede

einzelne Lage Schichtdicke, Real- und Imaginärteil der Dielektrizitätskonstanten an, so

erstellt die Software unter Anwendung der Maxwellgleichungen einen simulierten

Intensitätsverlauf der Reflexion. Nach Anpassung an den experimentellen Intensitätsverlauf,

erhält man die optische Dicke (∆nd) des interessierenden Plasmapolymers. Es ist sinnvoll eine

Referenzmessung des Substrats vor Abscheidung des Polymers durchzuführen, so dass die

Substratparameter für die nachfolgende Simulation mit Polymerschicht schon bekannt sind.

3.4.2 Bestimmung der Filmdicke mit dem

Oberflächenprofilometer

Die Schichtdicke der pp-Filme wurden mit Hilfe eines Nadelprofilometers der Firma Tencor

(Modell P 10 Surface Profilometer α-Stepper) bestimmt. Hierbei wird der auf einem Si-Wafer

abgeschiedene Film mit einer Kanüle bis zur Si-Oberfläche angeritzt. Alternativ wird der Si-

Wafer vor der Filmabscheidung teilweise mit Kaptonklebeband abgedeckt, so dass man nach

Entfernen des Klebestreifens ein Höhenprofil zwischen behandeltem und abgedecktem,

unbehandeltem Substrat erhält. Anschließend tastet die Nadel des Step-Profilers, welche mit

einem kapazitiven Messsensor versehen ist, die Substratoberfläche ab und liefert die

entsprechende Höheninformation an einen angeschlossenen Computer. Der Fehler bei der

Schichtdickenbestimmung beträgt mindestens 2 nm und steigt mit zunehmender

Oberflächenrauhigkeit.


31

3.4.3 Kontaktwinkelmessungen

Der Kontaktwinkel zwischen einer Flüssigkeit und einem Festkörper ist ein Maß für die

energetische Wechselwirkung zwischen dem Festkörper und der Flüssigkeit. Mit dieser

Methode lassen sich demnach Rückschlüsse auf die Benetzbarkeit der Substratoberfläche

ziehen, so dass Oberflächenmorphologie und –polarität beurteilt werden können. Der

Kontaktwinkel ist als Winkel zwischen der Festkörperoberfläche und der and den

Dreiphasenpunkt von Flüssigkeit, Luft und Festkörperoberfläche angelegten Tangente

definiert (Abb. 3.4).

�

Die in dieser Arbeit experimentelle Bestimmung des Wasserkontaktwinkels erfolgte nach der

Methode des liegenden Tropfens. Die Messungen wurden von einem Gerät der Firma Krüss,

dem Krüss Drop Shape Analysis System DSA 10-Mk2, aufgenommen. Mit Hilfe einer Nadel

wurde ein Wassertropfen (4 µl Volumen) mit einer Rate von ca. 20 µl pro Minute auf einen

plasmapolymer-beschichteten Si-Wafer aufgetragen. Nach Aufnahme der Tropfenform mit

einer CCD-Kamera bestimmte eine entsprechende Software (Drop Shape Analysis) den

Kontaktwinkel durch Mittelung der beiden Werte, die man durch Anlegen einer Tangente auf

beiden Seiten der Tropfenkontur erhält. Diese Prozedur wurde an mindestens vier Stellen auf

dem Substrat wiederholt und die Ergebnisse für den Kontaktwinkel gemittelt.

Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur bei ca. 30-40% Luftfeuchtigkeit durchgeführt.

Die Proben, insbesondere die pp-MA-Filme, wurden bis zum Messzeitpunkt in möglichst

trockener Umgebung gelagert (Reaktor bzw. Gelbox unter N2-Atmosphäre), um eine

Verfälschung der Messergebnisse durch Aufnahme von Luftfeuchtigkeit zu minimieren.

Abb. 3.4: Schematische Darstellung der

Flüssigkeit/Festkörpergrenzflächezur-

Bestimmung des Kontaktwinkel θ nach

Young �


32

3.4.4 Fourier-Transformation-Infrarot-Reflektions-Absorptions-

Spektroskopie (FT-IRRAS)

Eine qualitative Analyse der Oberflächenfunktionalität der hergestellten Plasmapolymere

erfolgte mittels FT-IR-Spektroskopie. Hierfür wurde ein Fourier-Transform-Spektrometer

(Magna IR850 Spectrometer Series II) der Firma Nicolet verwendet. Dessen Kernstück, ein

Michelson-Interferometer, erzeugt ein Interferenzmuster im Detektor, welches durch

Fouriertransformation in ein frequenzabhängiges Spektrum umgewandelt wird. Die Anregung

der zu untersuchenden Proben liegt im mittleren Infrarotbereich bei einem

Wellenzahlenbereich von 400-4000 cm-1. Durch ein spezielles Belüftungssystem werden

Temperatur und relative Feuchtigkeit in der Messkammer konstant gehalten.

Die Aufnahme der Spektren erfolgt nach der Reflektions-Absorptions-Methode (Abb. 3.5).

Vorraussetzung dafür ist ein reflektierendes Substrat, auf dem die zu untersuchende Probe

(Plasmapolymer) aufgebracht wird. Als reflektierendes Medium diente ein mit 80 nm Gold

bedampftes Glassubstrat.

3.4.5 UV-VIS-Spektroskopie

Die in dieser Arbeit aufgenommenen UV-VIS-Spektren wurden mit einem UV/VIS/NIR-

Spektrometer (Lambda 900, Boston USA) auf Quarzglas aufgenommen. Dabei wurde die

Transmission T = I/I0 der filmbeschichteten Gläser gemessen. Mit einem Monochromator

wurde der relevante Bereich von 200-860 nm abgefahren. Das Spektrometer wurde über eine

Software angesteuert und ausgelesen. Bei der Auftragung der Spektren wurde die Extinktion

verwendet, die sich aus der Transmission gemäß A = -log(T) = log (I0/I) berechnet.

Abb. 3.5: Schematische Darstellung

des Strahlengangs bei der IRRAS


33

3.4.6 Rasterkraftmikroskopie

Die auf die Rauhigkeit untersuchten Proben wurden von Sascha Pihan mit einem AFM-Gerät

(Dimension 3100 CL) vermessen. Die 3x3 und 5x5 µm-Scans eines dicken und dünnen pp-

MA-Films auf Si-Wafern wurden im Tapping Mode aufgenommen.


34


1. Bannwarth, W. and R. Knorr, Formation of carboxamides with N,N,N',N'-tetramethyl

(succinimido) uronium tetrafluoroborate in aqueous / organic solvent systems. Tetrahedron Letters, 1991. 32(9): p. 1157-1160.

2. Andersson, M., S. Oscarson, and L. Öhberg, Synthesis of oligosaccharides with

oligoethylene glycolspacers and their conversion into glycoconjugates using

N,N,N′,N′-tetramethyl(succinimido) tetrafluoroborate as coupling reagent. Glycoconjugate Journal, 1993. 10(6): p. 461-465.

3. Hermanson, G.T., ed. Bioconjugate Techniques. 2nd ed. 1996, Elsevier Science, USA.

4. Su X., W.Y.-J., Robelek R., Knoll W., Surface Plasmon Resonance Spectroscopy and

Quartz Crystal Microbalance Study of Streptavidin Film Structure Effects on

Biotinylated DNA Assembly and Target DNA Hybridization. Langmuir, 2005. 21: p. 348-353.

Kapitel 4 – Ergebnisse und Diskussion

35

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Allgemeine Eigenschaften plasmapolymerisierter-

Maleinsäureanhydridfilme in Luft und wässriger Lösung

Die Immobilisierungseffizienz biologischer Moleküle auf einer Analytoberfläche ist stark von

deren Oberflächeneigenschaften abhängig. Benetzbarkeit und Ladungsdichte der Oberfläche

werden durch die Natur und Anzahl der funktionellen Gruppen determiniert. Für die Synthese

der pp-MA-Filme bedeutet dies konkret, die Prozessbedingungen so zu steuern, dass eine

hohe Funktionalität erhalten bleibt. Schiller et al. stellten fest, dass die strukturellen

Eigenschaften von pp-MA-Filmen stark von den Prozessbedingungen im Plasma abhängig

sind [1]. Mit sinkender Eingangsspannung und Einführung eines niedrigen Betriebszyklus

wurde eine Erhöhung der Funktionalität, allerdings auf Kosten des Vernetzungsgrades,

beobachtet. Die Einstellung der Prozessbedingung ist daher keinesfalls trivial, da ein

ausreichender Vernetzungsgrad zur Stabilisierung der Gesamtstruktur beibehalten werden

muss. In Anlehnung an frühere Arbeiten wurde für die Synthese der pp-MA-Filme eine

Eingangsleistung von 50 W und ein Betriebszyklus von 1/41 ausgewählt [1-3].

Der nachfolgende Abschnitt dient dazu, einen Überblick über die strukturellen Eigenschaften

der hergestellten Plasmapolymere in Luft und in wässriger Lösung zu verschaffen. Hierfür

wurden die pp-MA-Filme mittels Dicken- und Kontaktwinkelmessungen, FT-IR-, SPR-/OW-

und UV-VIS-Spektroskopie sowie AFM-Messungen charakterisiert. Im Hinblick auf die

nachfolgend angestrebte IgG-Anbindung wurde eine detaillierte Analyse des Lösungs-

verhaltens nm- und µm-dicker pp-MA-Filme durchgeführt.


36

4.1.1. Charakterisierung plasmapolymerisierter Maleinsäure-

anhydrid-Filme mit Schichtdicken-, AFM-, Kontakt-

winkelmessungen und FT-IR-Spektroskopie in Luft

Zusammenhang zwischen MA-Basisdruck, Depositionszeit und Filmdicke

Die Filmdicke lässt sich auf einfache Art mit Hilfe des Profilometers bestimmen. Durch

Korrelation mit dem Monomerbasisdruck und der Depositionszeit bei gegebenen

Prozessbedingungen lässt sich ein Konturplot erstellen, der eine Abschätzung der Filmdicken

in einem bestimmten Basisdruckbereich ermöglicht.

Abb. 4.1: Konturplot zur Darstellung des Zusammenhangs zwischen Filmdicke d (nm), Monomerbasisdruck p (mbar)und Depositionszeit t (min) für pp-MA Plasmabedingungen: 50 W, DC = 1/41; Basisdruckbereich: 0,02-0,09 mbar Links: Dünne Filme (d<100 nm) Rechts: Dicke Filme (d<1,2 µm) Abb. 4.1 zeigt einen solchen Konturplot sowohl für dünne Filme (<100 nm) als auch für

mikrometerdicke Filme bei einer Eingangsleistung von 50 W und einem Betriebszyklus von

1/41.


37

Betrachtet man zunächst nur die dünnen Filme (Abb. 4.1 links), so lässt sich ein innerhalb der

Fehlergrenzen stetiger Schichtdickenzuwachs mit steigendem Druck und steigender

Polymerisationszeit erkennen, was auf eine konstante Depositionsrate hindeutet. Dies steht im

Einklang mit früheren Ergebnissen, bei denen die Filmformation im Plasma in situ mittels

WaMS für Filmdicken von maximal 4 nm untersucht wurde. Jacobsen et al. [4] nahmen an,

dass die anfängliche Filmformation durch Ausbildung und Zusammenwachsen kleiner

Fragmentinseln auf der Substratoberfläche erfolgt. Daraus folgt, dass sich zur Ausbildung

eines homogenen Films ein gewisses dynamisches Gleichgewicht zwischen

Oberflächenbeschuss und Vernetzung bzw. Zusammenwachsen der Inseln einstellen muss.

Betrachtet man das Filmwachstum im Bereich von 0,5-1 µm lässt sich der Trend hinsichtlich

einer konstanten Depositionsrate nur noch begrenzt bestätigen, da hier größere Abweichungen

von der Stetigkeit zu verzeichnen sind (Abb. 4.1 rechts).

In den in Abb. 4.1 dargestellten Konturplots sind aus Übersichtsgründen keine Fehler

eingetragen. Für eine quantitative Auswertung der Dickenmessung mit dem Profilometer ist

ein Fehler von mindestens 2 nm zu berücksichtigen, welcher tendenziell mit zunehmender

Rauhigkeit steigt. Bei längerer Plasmaexposition wurde eine erhöhte Rauhigkeit der

Filmoberfläche registriert (siehe nächster Abschnitt). Daher muss bei der Korrelation der

Filmdicken im Mikrometerbereich eine mittlere Standardabweichung von 32 nm einkalkuliert

werden. Außerdem sollte man bedenken, dass bei der in dieser Arbeit verwendeten

Reaktorgeometrie nur eine waagerechte Platzierung des Substrats parallel zum

Monomerstrom möglich ist. Des Weiteren ist die zurückgelegte Wegstrecke der Teilchen im

Plasma aufgrund des seitlichen Monomereinlasses in die Reaktionskammer unterschiedlich.

Daher ist die Ausbildung eines lateralen Beschichtungsgradienten auf dem Substrat nicht zu

vermeiden. Die Filmdicke variiert somit in Abhängigkeit von der Messposition der

Profilometernadel, was insbesondere bei der Auswertung der dicken Filme ins Gewicht fällt.

Für statistische Betrachtungen sei angemerkt, dass der Korrelationsgraph in Abb. 4.1 links aus

27 Probendaten und in Abb. 4.2 rechts aus 19 Probendaten erstellt wurde.


38

Charakterisierung der Oberflächenmorphologie

und Oberflächenrauhigkeit mittels AFM

Die Oberflächenrauhigkeit eines Plasmapolymers wird hauptsächlich von drei Faktoren

beeinflusst:

i) den Prozessbedingungen,

ii) dem verwendeten Monomer,

iii) der Plasmaexpositionsdauer.

I) und iii) sind darauf zurückzuführen, dass sich mit steigender Eingangsleistung und

Plasmadauer zum einen der Fragmentierungsgrad des Monomers und zum anderen die Anzahl

und Vielfalt aktiver Spezies im Plasma erhöht, so dass die Oberfläche insgesamt einem

stärkeren Materialbeschuss an unterschiedlichsten Formen ausgesetzt ist.

Bei der Interpretation der nachfolgenden Messergebnisse richtet sich das Hauptaugenmerk auf

die Expositionsdauer, da i) und ii) konstant gehalten wurden. Daher können Rückschlüsse auf

das Wachstumsverhalten des Films in Abhängigkeit von der Zeit gezogen werden.

Erste Eindrücke zur Oberflächenbeschaffenheit lassen sich aus den Profilometeraufnahmen

der Proben gewinnen. Hierbei wurde eine Zunahme der Oberflächenrauhigkeit mit steigender

Filmdicke registriert. Eine genauere AFM-Analyse der Oberflächenrauhigkeit eines dünnen

und eines dicken Films bestätigt diesen Trend.

In Abb. 4.2 ist eine 5x5 µm-Höhenaufnahme eines 30 nm dicken Films mit dem zugehörigen

Höhenprofil dargestellt. Die Abbildung zeigt speerspitzenförmige Strukturen, die ca. 50 nm

aus der Oberfläche herausragen, bei einer RMS-Rauhigkeit von 56,004,7 ± nm. In früheren

Arbeiten wurden die pp-MA-Filme als blumenkohlartige Strukturen mit einer mittleren

Rauhigkeit von 0,641 nm in Luft beschrieben [5]. Diese Angaben sind mit den aktuellen

Ergebnissen allerdings nur begrenzt vergleichbar, da die Aufnahme auf einem kleineren

Ausschnitt (1x1 µm) erstellt wurde und die Literaturproben bei anderen Prozessbedingungen

(90 W, DC=5/100) und anderen Plasmaexpositionszeiten synthetisiert wurden.


39

Abb. 4.2: AFM-Aufnahme von pp-MA in Luft (50 W, DC =1/41, 231±=d nm, 56,006,7 ±=RMS nm)

Links: 5x5 µm Höhenbild Rechts: 5x5 µm Oberflächenprofil Wie schon bei den Profilometermessungen für dicke Filme beobachtet, zeigt der 500 nm Film

eine signifikant höhere Rauhigkeit von 99,000,18 ± nm. Die 3x3 µm-Höhenaufnahme

(Abb. 4.2) sowie das zugehörige Höhenprofil zeigen eine kraterähnliche

Oberflächenmorphologie mit kristallartigen Ausbuchtungen.

Abb. 4.3: AFM-Aufnahme von pp MA in Luft (50W,DC=1/41, 31507 ±=d nm, 99,000,18 ±=RMS nm)

Links: 3x3 µm Höhenbild Rechts: 3x3 µm Oberflächenprofil


40

Korreliert man die AFM-Aufnahmen mit den Konturplots für dünne und dicke Filme, so

lassen sich gewisse Parallelen erkennen. Die teilweise sehr unregelmäßig verlaufende

Schichtdickenzunahme der dicken Filme in Abb. 4.1. links zeugt von einer hohen Rauhigkeit,

die durch die AFM-Aufnahme in Abb. 4.3 bestätigt werden kann. Dagegen deuten die im

Vergleich dazu gleichmäßig verteilten Spitzen auf der Oberfläche des dünnen Films (vgl.

Abb. 4.2) auf ein kontrolliertes Filmwachstum hin, welches durch die stetig verlaufenden

Schichtdickenzunahme in Abb. 4.1 links bestätigt werden kann.

Damit lässt sich für den Filmwachstumsprozess im Plasma folgende Theorie aufstellen: Nach

anfänglicher Filmformation durch Inselbildung und Vernetzung [4] verläuft die Anlagerung

von Molekülfragmenten an die Oberfläche durch den fortlaufenden Beschuss an reaktiven

Spezies schneller als der Vernetzungsprozess. Dies hat zur Folge, dass die so aufgestapelten

Molekülfragmente stalagmitenähnlich aus der Oberfläche herauswachsen. Mit steigender

Plasmaexpositionszeit ist die Oberfläche einer zunehmenden Belastung durch im Plasma

formierte große Molekülbrocken ausgesetzt. Diese schlagen auf der Oberfläche auf und

werden erst nachträglich vernetzt, so dass die Oberfläche einer wie in Abb. 4.3 dargestellten

Kraterlandschaft ähnelt.

Chemische Zusammensetzung der pp-MA-Filme - Untersuchung der pp-MA-

Filmeigenschaften mit Kontaktwinkelmessungen und FT-IR-Spektroskopie

In Abb. 4.4 ist ein typisches FT-IR-Spektrum eines frisch hergestellten pp-MA-Films

dargestellt. In Übereinstimmung mit der Literatur sind die beiden für Anhydride

charakteristischen Absorptionsbanden bei 1871 und 1793 cm-1 im Spektrum mit einer hohen

Signalintensität vertreten [1]. Weiterhin sind Säureanteile (1722 cm-1) sowie in geringem

Maße CHx- Absorptionsbanden gesättiger Kohlenwasserstoffreste (<3000 cm-1) erkennbar.

Eine Zuordnung der auftretenden Schwingungsbanden ist in Tabelle 4.1 zusammengestellt.


41

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25E

xtinktion

Wellenzahl / cm-1

18

71

179

3

172

2

12

37

10

94 9

45

Abb. 4.3: FT-IR-Spektrum eines frisch hergestellten pp-MA-Films auf einem mit 80 nm Gold bedampftem Glassubstrat (Probe 04 März 08; 50 W, DC = 1/41, 67 nm) Tabelle 4.1: Zuordnung der Infrarot-Absorptionsbanden in Abb. 4.3 und Abb. 4.5

Wellenzahlenbereich /cm-1

Schwingung

3500-3050 O-H-Streckschwingung, Carboxylgruppe

2980-2850 C-Hx-Streckschwingung, aliphatische Kohlenwasserstoffanteile

1871 C=O Streckschwingung, Anhydridgruppe

1793 C=O Streckschwingung, Anhydridgruppe

1737 C=O Streckschwingung, Carboxylgruppe

1722 C=O Streckschwingung, Carboxylgruppe

1408 O-H-Biegeschwingung, Carboxylgruppe

1237-1200 C-O-Streckschwingung, Anhydridgruppe, Carboxylgruppe, Ether, Alkohol

1094 C-O-Streckschwingung, Anhydridgruppe, Carboxylrest, Ether, Alkohol

945 O-H-Biegeschwingung, Alkohol

Aus der Zuordnung der Absorptionsbanden und unter Berücksichtigung von XPS-

Untersuchungen früherer Arbeiten [1] lässt sich ein qualitatives Bild zur chemisch-

strukturellen Komposition der pp-MA-Filme aufstellen:

Die Filmmorphologie umfasst ein dreidimensionales Kohlenwasserstoff-Netzwerk, welches

neben Anhydridgruppen auch Säurefunktionen, Etherfunktionen Alkoholgruppen sowie

aliphatische Kohlenwasserstoffreste enthält (Abb. 4.4).


42

Abb. 4.4: Schematische Darstellung eines auf einem mit Chrom und Gold bedampften Glassubstrat abgeschiedenen pp-MA-Films

Das im FT-IR-Spektrum auffallende Fehlen der für Doppelbindungen charakteristischen

Absorptionsbanden bei 3095-3075 cm-1 (=C-H-Streckschwingung) und 1660-1580 cm-1

(C=C-Streckschwingung) impliziert, dass die im Monomer enthaltene Doppelbindung im

Plasma vorwiegend fragmentiert wird. Dies zeugt von einer gewissen Selektivität der im

Plasma generierten reaktiven Spezies. Die Wahrscheinlichkeit für einen selektiven Angriff

steigt, wenn die Konzentration an aktiven Spezies relativ gering gehalten wird. Dies wird

durch den Pulsbetrieb des Plasmas bzw. die Einführung einer toff-Phase (vgl. Kapitel 2)

gewährleistet, so dass hauptsächlich Radikale an der Modifizierung der Substratoberfläche

beteiligt sind. Die in Kapitel 2 diskutierten mechanistischen Parallelen zwischen der gepulsten

Plasmapolymerisation und der klassischen radikalischen Polymerisation werden hier deutlich.

Grundsätzlich zeigen frisch synthetisierte Plasmapolymere Alterungserscheinungen, sobald

sie äußeren Einflüssen wie Luftfeuchtigkeit, Temperatur, UV-Licht, Druck, etc. ausgesetzt

werden. Die Plasmapolymerfilme sind als eine Art dynamisches Netzwerk zu verstehen, in

dem freie Kettenenden Konformationsänderungen und eingelagerte Radikale oder andere

aktive Spezies Reaktionen mit der äußeren Umgebung eingehen können [5].

Sobald die pp-MA-Filme aus dem Vakuum in die Atmosphärenluft gelangen, absorbieren sie

Luftfeuchtigkeit. Dieser Vorgang vollzieht sich innerhalb von wenigen Stunden, wie sich mit

Hilfe von Kontaktwinkelmessungen beweisen lässt. So beträgt der mittlere Kontaktwinkel

über neun verschiedene pp-MA-Proben, die bis wenige Minuten vor der Messung in trockener

Umgebung gelagert wurden, °± 1,66,52 . Zum Vergleich wurde der Kontaktwinkel einer

Probe, die bereits sechs Stunden der Luftfeuchtigkeit ausgesetzt worden war, mit °± 4,00,37

gemessen. Die Benetzbarkeit steigt demnach mit zunehmender Expositionsdauer in Luft.


43

Dies ist nicht allein auf die Einlagerung von Wassermolekülen in das Polymernetzwerk

zurückzuführen. Aufgrund ihrer hohen Carbonylaktivität sind Anhydridgruppen im

Allgemeinen sehr reaktiv. Die Feuchtigkeitsaufnahme aus der Luft bewirkt daher eine

sofortige Hydrolyse der Anhydridgruppen. Aus einer Anhydridgruppe werden zwei

entsprechende Carbonsäurereste generiert, so dass sich insgesamt die Dichte an hydrophilen

Resten auf der Oberfläche erhöht.

Die Hydrolyse der Anhydridgruppen lässt sich durch eine FT-IR-Analyse auf einfache Art

beweisen. In Abb. 4.5 ist eine Überlagerung mehrerer FT-IR-Spektren dargestellt, die zu

unterschiedlichen Zeitpunkten von einer in feuchter Luft gelagerten pp-MA-Probe

aufgenommen wurden. Ein Vergleich des frisch nach der Synthese aufgenommenen

Spektrums mit den nachfolgenden Aufnahmen zeigt, dass die Hydrolyse bereits nach

eintägiger Exposition in Atmosphärenluft abgeschlossen ist. Die Carbonsäurereste sind

eindeutig über den charakteristisch breiten Absorptionspeak der O-H-Streckschwingung bei

3260 cm-1, der Verschiebung der C=O-Streckschwingung zu niedrigeren Wellenzahlen

(1737 cm-1) sowie dem neu auftretenden Absorptionspeak der O-H-Biegeschwingung bei

1408 cm-1 identifizierbar. Eine detaillierte Zuordnung der Schwingungsbanden ist in Tabelle

4.1. zusammengestellt.

3500 3000 2500 2000 1500 1000

24 h

3 Tage

Extin

ktio

n

Wellenzahl / cm-1

5 Tage

frisch

pp-MA, 50 W, 1/41

Anhydridgruppen und Carboxylgruppen bieten eine ideale Basis für weitergehende chemische

Modifizierung, von einfachen Derivatisierungsreaktionen bis hin zum Aufbau komplexer

Strukturen bzw. der Anbindung unterschiedlichster Moleküle. Das Anwendungspotential für

pp-MA-Filme ist demnach sehr weitläufig.

Abb. 4.5 : Überlagerung der FT-IR-Spektren eines der Atmosphärenluft ausgesetzten pp-MA-Films über einen Zeitraum von 5 Tagen (Probe 29 Juli 08, 50 W, DC = 1/41, 51 nm)


44

4.1.2. Charakterisierung plasmapolymerisierter Maleinsäure-

anhydrid-Filme mit UV-VIS-Spektroskopie, SPR- und OWS-

Messungen in Luft und wässriger Lösung

Wie bereits im vorangegangenen Abschnitt festgestellt wurde, hydrolysieren die

Anhydridgruppen der pp-MA-Filme beim Kontakt mit Luftfeuchtigkeit innerhalb von

mehreren Stunden. Bei der Immersion der pp-MA-Filme in wässrige Lösung erfolgt die

Hydrolyse der Anhydridgruppen bereits innerhalb von wenigen Minuten [6]. Gleichzeitig

werden kleine Fragmente an nichtkovalent gebundenem, im Polymer eingelagertem Material,

aus den Zwischenräumen herausgespült. Durch Einlagerung von Lösemittelmolekülen in das

Polymernetzwerk lässt sich ein über die Dicke messbarer Schwellungsprozess registrieren. Je

nach pH-Wert und Salzkonzentration der verwendeten Lösung können ladungskontrollierte

Reorganisationsprozesse zusätzliche Konformationsänderungen innerhalb der Ketten einleiten

[5]. Das Verhalten der pp-MA-Filme weist hierbei markante Ähnlichkeiten zu einem

Polyelektrolyten auf.

Je nach Art und Effizienz des verwendeten Adhesionsvermittlers sind Delaminationsprozesse

zwischen Substrat und Polymer möglich. Dies ist ein nicht zu unterschätzendes Problem, da

für die Anbindung von Biomolekülen ein stabiles Grundgerüst in wässriger Lösung

unerlässlich ist. In der Vergangenheit hat sich die Verwendung einer Thiolmonolage bewährt

[3]. Wie in Abb. 4.6 schematisch dargestellt, nutzt man auf der einen Seite die Affinität des

Schwefels zur Goldoberfläche des Substrats aus, während auf der anderen Seite eine

plasmachemische Vernetzung des Alkylrests mit dem Polymer angestrebt wird.

Abb. 4.6: Schematische Darstellung eines pp-MA-Films, der über ein Thiol mit der Goldoberfläche des Substrats verlinkt ist.


45

SPRS und OWS haben sich in der Vergangenheit bei der Untersuchung der pp-MA-

Filmeigenschaften in wässriger Lösung sowie bei der Erforschung von Anbindungsprozessen

biologischer Moleküle vielfach bewährt [5-8]. Hierbei wurden die pp-MA-Eigenschaften in

wässriger Lösung bereits umfangreich diskutiert. Nichtsdestotrotz ist es sinnvoll, das

Lösungsverhalten der eigens synthetisierten Filme zu untersuchen. Zum einen ist es wichtig,

die Konformität der eigenen Ergebnisse mit der Literatur zu überprüfen. Zusätzlich dient die

Erfassung des eigenen Datensatzes als Basis für die Auswertung weiterführender Experimente

sowie zur Demonstration einer stabilen Unterlage bei der Anbindung von Biomolekülen (vgl.

Abschnitt 4.2). Daher wurde das Verhalten dünner und dicker pp-MA-Filme in Luft und

wässriger Lösung mittels SPR- und OWS-Messungen charakterisiert.

Verglichen mit SPRS-Messungen liefert eine OWS-Analyse der korrespondierenden µm-

dicken Proben genauere Erkenntnisse über die Filmmorphologie. Durch die unterschiedlichen

Anregungsmöglichkeiten mittels p- und s-polarisiertem Lichts lassen sich Rückschlüsse auf

die optische Homogenität und Isotropie der untersuchten Schichten ziehen. Zusätzlich können

bei einer Anregung von mindestens zwei Wellenleitermoden Schichtdicke und

Brechungsindex unabhängig voneinander bestimmt werden. Bei der Auswertung von

Oberflächenplasmonen-resonanzkurven dünner Filme kann der zuvor ermittelte

Brechungsindex zur Kalkulation der Schichtdicke eingesetzt werden. Die mit Hilfe des

Surface Profilers gemessene Dicke dient nur als Richtwert und ist nicht direkt mit den SPR-

Simulationswerten für die Schichtdicke vergleichbar, da für beide Messtechniken Substrate

unterschiedlicher Oberflächenrauhigkeit (Si, Au) verwendet werden. Beide Substrate wurden

zwar in einem Plasmazyklus behandelt, wurden allerdings an unterschiedlichen Stellen im

Reaktor positioniert. Zusätzlich ist noch der Beschichtungsgradient im Reaktor zu

berücksichtigen. Unter diesen Gesichtspunkten, können beide Substrate durchaus

abweichende Schichtdicken aufweisen.

Charakterisierung dünner und dicker pp-MA-Filme

mittels UV-VIS-Spektroskopie

Bei der Anregung eines Oberflächenplasmons bzw. einer Wellenleitermode können

Dämpfungseffekte aufgrund von Absorption und Streuung die Resonanz und Breite der

Reflektivitätskurve beeinträchtigen [9]. Für pp-MA-Filme sind Absorptionseffekte im

Wellenlängenbereich des für SPR und OWS-Messungen verwendeten Anregungslasers


46

(633 nm) eher unwahrscheinlich, da für die hauptsächlich vorhandenen Carbonylspezies

schwache nπ*-Übergänge zwischen 200 und 300 nm zu erwarten sind [10]. Zur Überprüfung

dieses Sachverhalts wurden UV-VIS-Spektren eines dünnen und dicken pp-MA-Films

aufgenommen (Abb. 4.7). Während der dünne Film annähernd keine Absorption zeigt, lässt

sich für den dicken Film ein starker Anstieg der absorbierten Intensität unterhalb von 350 nm

vermerken. Dies könnte sowohl auf interne Streueffekte als auch auf nπ*-Übergänge von

Anhydrid- oder Carboxylfunktionen zurückzuführen sein.

Der für OWS und SPRS-Messungen relevante Anregungsbereich von 633 nm ist für beide

Filme absorptionsfrei. Daher können Absorptionseffekte bei der nachfolgenden Diskussion

der SPRS/OWS-Ergebnisse vernachlässigt werden.

200 300 400 500 600 700 800 900

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Extinktio

n

Wellenlänge / nm

pp-MA, 50 W, 1/41

40 nm

787 nm

Charakterisierung der dicken Filme in Luft und

wässriger Lösung mittels OWS

In feuchterLuft

Die Anregung von mindestens zwei Wellenleitermoden erfordert Schichtdicken von über

500 nm. In Abb. 4.8 sind zwei mit p- und s-polarisiertem Licht aufgenommene OWS-

Spektren eines pp-MA-Films in Luft inklusive Fitkurven dargestellt. Aus der Feldverteilung

der Wellenleitermoden (vgl. Kapitel 2) folgt, dass Moden höherer Ordnung sensitiver auf

Abb. 4.7: UV-VIS-Spektrum eines dünnen und dicken pp-MA-Films auf Quarz (Probe: 22 August 08, 50 W, DC = 1/41) Blaue Linie: Dünner Film, 40 nm Rote Linie: Dicker Film, 787 nm


47

Änderungen der Schichtdicke bzw. Moden niedrigerer Ordnung sensitiver auf

Brechungsindexänderungen reagieren. Ein Vergleich der experimentellen Kurven mit den

Simulationskurven zeigt eine gute Übereinstimmung der Resonanzminima. Die in Abb. 4.8a

auffallende Anomalie bei 45 ° ist auf Mehrfachreflexionen innerhalb der Messgeometrie

zurückzuführen, da der Brechungsindex des zwischen Prisma und Glassubstrat aufgebrachten

Immersionsöls minimal von dem der beiden angrenzenden Medien abweicht.

Abb. 4.8: P- und s-polarisierte OWS-Spektren eines pp-MA-Films in Luft Quadrate: Experimentelle Kurve (Probe: 16 Juli 08, 50 W, DC = 1/41) Durchgezogene Linie: Simulation (a) p-polarisiertes Spektrum Simulationsergebnisse: 6572 ±=d nm, 087,0572,1 ±=n

(b) s-polarisiertes Spektrum Simulationsergebnisse: 6567 ±=d nm, 071,0576,1 ±=n

In Tabelle 4.2 sind die aus der Simulation der Kurven in Abb. 4.8 sowie aus zwei weiteren

Messungen berechneten Parameter zusammengefasst. Die aus den p- und s-Spektren

ermittelten Werte für d und n einer Probe korrelieren im Rahmen der Fehlergrenzen relativ

gut miteinander.

Aus der Konformität der experimentellen und gefitteten Resonanzminima sowie der

berechneten Parameter bei unterschiedlich polarisiertem Anregungslicht folgt, dass die innere

Filmstruktur als relativ isotrop betrachtet werden kann, da die simulierten Kurven auf einem

einfachen Einschichtmodell unter Annahme eines über die gesamte Schicht homogenen

Brechungsindex basieren. Der aus zehn p-polarisierten Spektren in einem Filmdickenbereich

20 30 40 50 60 70 80

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Refle

ktivität / re

l. E

.


(a)

20 30 40 50 60 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

R

efle

ktivitä

t / re

l. E

.


(b)


48

von 530-1200 nm berechnete mittlere Brechungsindex beträgt 012,0581,1 ± . Dies steht im

Einklang zu früheren Studien, in denen der Brechungsindexbereich zwischen 1,575 und 1,600

für bei 15 W und DC = 10/90 [4] und bei 37 W und DC =1/41 [8] hergestellte pp-MA-Filme

festgelegt wurde.

Tabelle 4.2: d- und n-Parameter aus der Simulation der Reflektivitätskurven in Abb. 4.8 und zwei weiteren Messungen Schichtdicke d / nm Brechungsindex n

Probe 16/07/08 p-Spektrum s-Spektrum

6572 ± 6567 ±

087,0572,1 ±

071,0576,1 ±


7668 ± 7658 ±

084,0572,1 ±

071,0585,1 ±


6587 ± 6577 ±

100,0573,1 ±

077,0582,1 ±

Eine detaillierte Analyse der Filmstruktur ist durch Anregung zusätzlicher Wellenleitermoden

möglich. In Abb. 4.9 links ist ein p-polarisiertes OWS-Spektrum eines µm-dicken pp-MA-

Films unter Anregung von vier Wellenleitermoden dargestellt. Ein Vergleich der

experimentellen Daten mit der Simulation zeigt, dass die Positionen der Resonanzminima

zwar gut korrelieren, Breite und Minimumsreflektivität jedoch stark voneinander abweichen.

Mit steigender Ordnung lässt sich eine signifikante Verbreiterung der Moden erkennen.

Derartige Beobachtungen lassen durch Dämpfungseffekte innerhalb des Evaneszentfeldes

erklären. Eine Dämpfung der resonanten Anregung kann grundsätzlich durch folgende

Faktoren hervorgerufen werden: i) Absorption, ii) Oberflächenstreuung, iii)

Volumenstreuung. Bei der Untersuchung der Filme mittels UV-VIS-Spektroskopie konnte

eine Absorption im Anregungsbereich ausgeschlossen werden. Es sind daher nur

Streuungseffekte zu berücksichtigen.

In der Maxwell-Betrachtung der Filmgeometrie werden Dämpfungseffekte im Imaginärteil

der Dielektrizitätskonstante ε’’ berücksichtigt. Durch Variation von ε’’ lässt sich, wie in

Abb. 4.9 links für die Mode niedrigster Ordnung dargestellt, jeweils nur eine Mode

zufriedenstellend simulieren. Beim Versuch alle vier Moden einzeln anzufitten, ergibt sich für

jede Mode ein unterschiedlicher Wert für ε’’ (Abb. 4.9, rechts). Das Dämpfungsprofil ist

demnach relativ inhomogen. Aus der Auftragung geht hervor, dass die Moden höherer


49

Ordnung, deren Energie eher im Randbereich der wellenleitenden Schicht konzentriert ist,

von den Dämpfungseffekten stärker betroffen sind als Moden niedrigerer Ordnung. Dies

deutet darauf hin, dass ein Großteil des Anregungslichts an der Oberfläche gestreut wird. Wie

bereits im vorigen Abschnitt gezeigt wurde, zeichnet sich die Filmoberfläche durch ein sehr

unregelmäßiges Profil und eine beträchtliche Rauhigkeit aus. Dies lässt sich durch die

Beobachtungen aus der OWS-Messung bestätigen.

Abb. 4.9: P-polarisiertes OWS-Spektrum eines µm-dicken pp-MA-Films in Luft Quadrate: Experimentelle Kurve (Probe: 10 Juni 08, 50 W, 1/41) Durchgezogene Linie: Simulation Links: Simulation der TM1-Mode mit 003,0'' =ε ; 61197 ±=d nm, 063,0583,1 ±=n

Rechts: Übersicht über die jeweils einzeln mit ε’’ simulierten Moden TM1-TM4. Die angefitteten Moden sind jeweils mit einem Pfeil markiert. Links oben: 003,0)1('' =TMε ; Rechts oben: 012,0)2('' =TMε ;

Links unten: 033,0)3('' =TMε , Rechts unten 079,0)4('' =TMε

Die Fehler bei der Bestimmung von n und d wurden manuell, anhand der simulierten Kurven,

abgeschätzt. Hierbei ergibt sich ein mittlerer Fehler für die Schichtdicke von 6± nm und für

den Brechungsindex von 090,0± . Die aus den Simulationen bestimmten Werte für n und d

sind als Richtwerte anzusehen, da die Filme, je nach Feuchtigkeitsgehalt der Luft, einem

Schwellungsprozess unterliegen [11].

20 30 40 50 60 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Reflektivität / re

l. E

.



50

In wässriger Lösung

Zhang et al. registrierten in einer früheren SPR-Studie zum Schwellungsverhalten von niedrig

gepulsten pp-MA-Filmen in PBS-Lösung einen Anstieg der optischen Dicke in Abhängigkeit

von der Immersionszeit. Da eine detaillierte Interpretation auf der Grundlage der SPR-

Messergebnisse nicht möglich war, gingen die Autoren von einem relativ komplexen

Schwellungsmechanismus aus [6].

Abb. 4.10 zeigt zwei Reflektivitätsaufnahmen der in Abb. 4.9 dargestellten Probe in Milli-Q-

Wasser bei Hydrolysestart (Abb. 4.10a) und nach mehrstündiger Immersion in Lösung

(Abb. 4.10b). Die zugehörigen Simulationswerte, inklusive prozentualen Abweichungen, sind

in Tabelle 4.3 zusammengefasst. Unter Annahme eines einfachen Schwellungsprozesses ist

eine Zunahme der Schichtdicke unter gleichzeitiger Abnahme des Brechungsindexes zu

erwarten, da die Kettenenden im expandierenden Netzwerk weniger dicht angeordnet sind

bzw. die zuvor von Polymerfragmenten eingenommenen Zwischenräume mit optisch

dünneren Wassermolekülen besetzt werden. Dies lässt sich durch die experimentellen

Ergebnisse bestätigen: Im Vergleich zu den Scanaufnahmen in Luft ist zu Beginn der

Hydrolyse bereits ein Dickenzuwachs von 3,2 %, deutlich außerhalb der Fehlergrenzen sowie

ein minimaler Abfall im Brechungsindex zu verzeichnen. Die Wasseraufnahme in das

Polymernetzwerk erfolgt demnach innerhalb von wenigen Minuten. Eine kinetische

Untersuchung des Lösemittelverhaltens schlug fehl, da innerhalb der ersten Minuten bereits

eine beträchtliche Verschiebung der Resonanzwinkelposition auftrat, welcher die einstellbare

Motorschrittweite des Messprogramms überstieg. Die in früheren Studien [8] beobachtete

Ablösung von nichtkovalent gebundenem Material lässt sich hier nicht bestätigen, da über die

Reflektivitätskurven nur der Schwellungsprozess registriert werden konnte. Die

Resonanzkurven wurden jedoch in einem Zeitintervall von mehreren Stunden aufgenommen,

so dass eventuelle Ablösungsprozesse von nichtkovalent gebundenen Fragmenten nicht

erfasst werden konnten und daher nicht ausgeschlossen werden können.

Bei längerer Exposition in Wasser über mehrere Stunden ist ein weiteres Anschwellen mit

einem Gesamtdickenzuwachs von über 15 % sowie einem Brechungsindexabfall von 3 %

(Abb. 4.10 rechts) zu beobachten. Betrachtet man die Scanaufnahme in Abb. 4.10 rechts, so

ist trotz übereinstimmender Minimumspositionen von experimenteller und simulierter

Auftragung eine deutliche Diskrepanz in Bezug auf Breite und Tiefe der Resonanzkurven zu

erkennen. Die Wellenleitermoden erscheinen asymmetrisch verbreitert, was auf beträchtliche


51

Dämpfungseffekte hindeutet. Dieses Phänomen lässt sich in mehreren Experimenten

beobachten.

Abb. 4.10 : P-polarisierte OWS-Spektren eines pp-MA-Films in Milli-Q-Wasser Quadrate: experimentelle Kurve (Probe 10Juni08, 50 W, 1/41) Durchgezogene Linie: Simulation (a) Scan bei Hydrolysestart in Milli-Q-Wasser Simulationsergebnisse: 121235 ±=d nm, 071,0581,1 ±=n , 003,0)1('' =TMε

(b) Scan nach 17h 19min in Milli-Q-Wasser Simulationsergebnisse: 101383 ±=d nm, 071,0535,1 ±=n , 0)1('' =TMε ,000

Probe 10Juni08 Schichtdicke d / nm Brechungsindex n

Scan in Luft

61197 ± 063,0583,1 ±

Scan in H2O

( ) 0=Hydrolyset min 121235 ±

+ 3,2% 071,0581,1 ±

Scan in H2O

( ) =Hydrolyset 17 h 19 min 101383 ±

+15,5% 071,0535,1 ±

-3,0%

Tabelle 4.3: d- und n-Werte aus der Simulation der in Abb. X und Abb. Y dargestellten Reflektivitätsscans

Mit Hilfe der OWS-Messergebnisse lassen sich keine qualitativen Aussagen über die

Polymer-Lösemittelwechselwirkungen machen. Man kann daher nur mutmaßen, dass die

Einlagerung von Wasser in das Polymernetzwerk deutliche Konformationsänderungen unter

Schaffung vielseitiger Streuzentren bewirkt.

40 45 50 55 60 65 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Re

fle

ktivitä

t / re

l. E

.


(a)

40 45 50 55 60 65 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

R

efle

ktivitä

t /

rel. E

.


(b)


52

Wie bereits in der Einleitung erwähnt ist die Stabilität der Filme in wässriger Lösung

unerlässlich für weitere Anwendungen. Bei der Immersion dicker pp-MA-Filme in wässriger

Lösung scheinen die gängigen Stabilisierungsmethoden mit Hilfe von Thiollinkern nicht

auszureichen. Von insgesamt dreizehn untersuchten Proben in Wasser oder Pufferlösung

gleichen pH-Werts waren sechs Proben stabil im Hinblick auf Auf- oder Ablösungsprozesse;

die restlichen sieben Proben delaminierten ganz oder größtenteils von der Substratoberfläche

innerhalb der ersten 30 Minuten in Lösung. In der Literatur sind nur geringfügige

Ablösungsprozesse nichtkovalent gebundener Molekülfragmente verzeichnet [6, 11, 12].

Abb. 4.11 links zeigt den Auflösungsprozess einer pp-MA-Probe in PBS in Form von SPR-

Resonanzkurven zu unterschiedlichen Immersionszeiten. Wie man unschwer erkennen kann,

ist bereits nach 20 Minuten Immersion in PBS-Lösung ein beträchtlicher Positionsshift der

Wellenleitermoden von Kurve a nach Kurve b zu beobachten. Eine Simulation der beiden

Kurven (a und b) ergibt einen Schichtdickenzuwachs von 19,4 % sowie einen

Brechungsindexabfall von 2,9 % in einem Immersionszeitraum von nur 19 Minuten. Das

Polymer quillt demnach innerhalb von kürzester Zeit schwammartig auf. Nach weiterer 20-

minütiger Immersion in Lösung hat die Schichtdicke jedoch so weit abgenommen, dass nur

noch ein Oberflächeplasmon angeregt werden kann (Abb. 4.11, Kurve c). Die Simulation des

Plasmons zeigt, dass der Polymerfilm komplett delaminiert ist (Abb. 4.11 rechts). Bei der

Untersuchung weiterer Proben in PBS lösten sich die Filme in noch kürzeren Zeitabschnitten

vom Substrat ab.

Abb. 4.11: Links: Überlagerung von p-polarisierten OWS/SPR-Spektren eines pp-MA-Films in PBS zu unterschiedlichen Hydrolysezeiten t (Probe 11 Juli 08, 50 W, 1/41) Kurve a: t = 5 min ; Kurve b: t = 24 min ; Kurve c: t = 42 min Rechts : OWS/SPR-Spektren inklusive Simulation für Scan c

50 55 60 65

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Re

fle

ktivität / re

l. E

.


a

b

c

47,5 50,0 52,5 55,0 57,5 60,0 62,5 65,0

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

R

efle

ktivitä

t /

rel. E

.



53

Aus den oben beschriebenen Beobachtungen lässt sich das Verhalten der pp-MA-Filme in

wässriger Lösung folgendermaßen interpretieren: Sobald das Polymer in Kontakt mit

wässriger Lösung gerät, quillt es schwammartig auf, bis zu dem Punkt, an dem die

Adhesionskräfte zwischen Substrat und Polymer dem Oberflächendruck des gequollenen

Polymers nicht mehr standhalten können, so dass sich die Schicht ablöst und teilweise

fortgeschwemmt wird. Dies legt die Vermutung nahe, dass die bei der relativ geringen

Eingangspannung von 50 W synthetisierten pp-MA-Filme nur geringfügig vernetzt sind, so

dass genügend Hohlräume existieren, welche die Einlagerung von Lösemittelmolekülen

begünstigen. Eine schematische Darstellung der Delaminationsprozess ist in Abb. 4.12

dargestellt.

Betrachtet man die tieferen Bereiche der Gesamtschicht, so sollte man erwarten, dass sie

aufgrund der längeren UV-Bestrahlung im Plasma einen höheren Vernetzungsgrad aufweisen

als darüber liegende Bereiche. Dies würde allerdings in einem über die Gesamtschicht

verlaufenden Dichte- bzw. Brechungsindexgradienten resultieren, so dass die zugehörigen

OWS-Spektren nicht mehr durch einen einheitlichen Brechungsindex simulierbar wären. Die

OWS-Spektren in Abb. 4.9-4.11 stimmen jedoch mit ihren Simulationskurven in Bezug auf

die Resonanzwinkelposition der Moden überein. Daher ist bei der Beschreibung der

Filmstruktur eher von statistisch verteilten Dichteschwankungen stark vernetzter sowie

weniger vernetzter Abschnitte auszugehen, die sich jedoch im Mittel aufheben, so dass eine in

der Gesamtheit isotrope Schicht resultiert.

Abb. 4.12: Schematische Darstellung des Quellungs- und Delaminationsprozesses eines mit Wasser vollgesogenen pp-MA-Films

(1) Immersion des Films in Wasser mit anschließenden Quellungsprozess (2) Delamination des aufgequollenen Films von der Substratoberfläche


54

Diese Theorie lässt sich bestätigen, wenn man das Substrat im Anschluss an die Messung

bzw. nach Entfernen der Flusszelle betrachtet. Auf der Substratoberfläche sind kleine

Filmbruchstücke mit dem bloßen Auge zu erkennen. Bläst man diese im Stickstoffstrom

herunter, so zeichnet sich in dem zuvor von der Flusszelle eingenommenen Bereich eine

makellose Goldoberfläche von der restlichen dunkleren Polymerfläche auf dem gesamten

Substrat ab.

Chifen et al. stellten eine verbesserte Stabilität von pp-MA-Filmen in wässriger Lösung fest,

wenn anstelle des Thiolinkers ein mit Sauerstoff aktivierter, bei hoher Eingangsleistung

abgeschiedener, pp-HMDSO/O2-Film als Adhesionsvermittler zwischen pp-MA und der

Goldoberfläche eingesetzt wird. Infolge der doppelten Sauerstoffaktivierung der Gold- und

der pp-HMDSO-Oberfläche werden reaktive Radikalstellen generiert, welche im folgenden

Plasmapolymerisationsprozess kovalent mit dem pp-MA-Film vernetzt werden können [12].

Abb. 4.13a zeigt die Reflektivitätskurve eines mit pp-HMDSO unterlegten pp-MA-Films in

Luft. Die Bestimmung der optischen Dicke des pp-HMDSO/O2-Films erfolgte mittels SPR-

Scanaufnahmen eines aus dem gleichen Plasmazyklus wie die eigentliche Probe beschichteten

Zweitsubstrats. Für die Simulation der Resonanzkurve wurde der Brechungsindex von

Quarzglas eingesetzt, da den pp-HMDSO/O2-Filme nachweislich eine SiOx-artige Struktur

zugeschrieben wird [12]. Die berechneten Werte dienten als Basis für den Fitprozess der

eigentlichen pp-MA-Resonanzkurven. Wie man Abb. 4.13a entnehmen kann, weist das

Resonanzminimum der mittleren Mode eine geringfügige Abweichung von der simulierten

Minimumsposition auf, welche jedoch im Rahmen der Fehlergrenzen tolerierbar ist.

In Abb. 4.13b ist eine Überlagerung der Reflektivitätsaufnahmen mit unterschiedlich

polarisiertem Licht in PBS-Lösung bei Immersionsstart dargestellt. Die aus den

Luftaufnahmen abgeleiteten zugehörigen Simulationskurven für wässrige Lösung sind

ebenfalls eingetragen, um die Abweichung zwischen erwarteten und experimentellen Befund

zu verdeutlichen. Anstelle der aufgrund der Schichtdicke in Luft zu erwarteten

Wellenleitermoden, wird nur noch ein Oberflächenplasmon angeregt. Die Ablösung des

Polymerfilms erfolgt demnach sofort nach Immersion in Lösung. Zum Beweis, dass das hier

dargestellte Reflektivitätsminimum wirklich auf der Anregung eines Oberflächenplasmons

basiert bzw. nicht einer durch Streueffekte verbreiterten Wellenleitermode entspricht, wurde

ein Spektrum mit s-polarisiertem Licht aufgenommen. Wie erwartet zeigt das s-Spektrum

keine Veränderung in der reflektierten Intensität, da Oberflächenplasmonen nur mit p-


55

polarisiertem Licht angeregt werden können (vgl. Kapitel 2). Aus der Resonanzwinkel-

position des Oberflächenplasmons geht hervor, dass der Film nicht komplett delaminiert ist,

sondern ein Restfilm von ca. 30 nm auf der Substratoberfläche verbleibt. Dabei handelt es

sich höchstwahrscheinlich um eine pp-HMDSO/O2-Restschicht, da die Simulation des pp-

HMDSO/O2-Gesamtfilms auf dem Zweitsubstrat (siehe oben) eine Schichtdicke von ca.

55 nm ergab.

Abb. 4.13 : (a) P-polarisierte OWS-Spektrum eines pp-HMDSO-pp-MA-Films in Luft (Probe: 11 August 08, 50 W, DC = 1/41) Quadrate: experimentelle Kurve Durchgezogene Linie: Simulation Simulationsergebnisse für die pp-MA-Schicht: 7747 ±=d nm,

084,0567,1 ±=n , 003,0)1('' =TMε

(b) Überlagerung von p- und s-polarisierten SPR-Spektren wenige Minuten nach Immersion in PBS-Lösung mit den erwarteten Simulationskurven Schwarze Quadrate: Experimentelles p-Spektrum Rote durchgezogene Linie: Erwartete Simulation mit p-polarisiertem Licht Grüne Dreiecke: Experimentelles s-Spektrum Blaue durchgezogene Linie: Erwartete Simulation mit s-polarisiertem Licht Die oben beschriebenen Ergebnisse ließen sich für mehrere mit pp-HMDSO/O2 unterlegte

Proben beobachten. Chifen et al. stellten bei der Untersuchung der pp-HMDSO/O2-Filme fest,

dass die Filmstruktur u. A. durch Erhöhung des Sauerstoffanteils der HMDSO/O2-Mischung

in Richtung einer harten SiOx-ähnlichen Struktur gesteuert werden kann [12]. Bei der

Einstellung der Prozessbedingungen für die pp-HMDSO/O2-Filme konnte der

Sauerstoffgehalt nur näherungsweise kontrolliert werden, da der Gasfluss am verwendeten

20 30 40 50 60 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Re

fle

ktivitä

t /

rel. E

.


(a)

45 50 55 60 65 70 75

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Reflektivität / re

l. E

.


(b)


56

Reaktor nur manuell eingestellt werden konnte. FT-IR-Spektren der so synthetisierten pp-

HMDSO/O2-Filme ließen einen beträchtlichen Kohlenwasserstoffanteil erkennen, der als

Indiz für einen zu geringen Sauerstoffanteil gewertet werden kann [12]. Die in dieser Arbeit

synthetisierten pp-HMDSO/O2-Filme waren demnach nicht hart genug, um eine nachhaltige

Stabilisierung der dicken pp-MA-Filme zu gewährleisten. Versuche zur Verbesserung der

Adhesionseigenschaften für dicke pp-MA-Filme über pp-HMDSO/O2-Filme sind daher noch

ausbaufähig. Alternativ wäre auch die Synthese von pp-MA-Gradientenfilmen denkbar.

Hierbei wird ein Plasma bei einer hohen Eingangsleistung initiiert, welche dann im Laufe der

Plasmaexposition kontinuierlich verringert wird, so dass die resultierenden Filme in den

tieferen Schichtbereichen härtere Eigenschaften aufweisen als in der oberen Randschichten

[5].

Charakterisierung der dünnen Filme in Luft

und wässriger Lösung mittels SPR

Da sich bei SPR-Messungen immer nur Änderungen der kombinierten Eigenschaften von

Filmdicke und Brechungsindex erfassen lassen, ist eine verlässliche Interpretation der

Ergebnisse nur bei Kenntnis von mindestens einem der Parameter möglich. Die Auswertung

der pp-MA-OWS-Analyse liefert einen Brechungsindexbereich von 012,0581,1 ± , welcher im

Folgenden verwendet wird, um die Schichtdicke der dünnen Filme zu bestimmen. Unter

Einbeziehung der Standardabweichung für den Brechungsindex lässt sich die Schichtdicke

mit einer Genauigkeit von 0,1 nm berechnen.

Abb. 4.14 zeigt eine Überlagerung der Resonanzkurven eines unbehandelten Substrats (a)

sowie eines mit pp-MA-beschichteten Substrats (b). Bei der Simulation der Kurven lässt sich

ein gewisses Trendverhalten beobachten, welches sich über mehrere Proben erstreckt: Die

berechneten Schichtdicken sind im Schnitt etwa 6-7 nm geringer als die mit dem Surface

Profiler gemessenen Werte. Wie bereits erwähnt, lässt sich dieses Phänomen zum Teil auf die

Verwendung unterschiedlicher Substrate für beide Messprozesse zurückzuführen. Auffällig

ist, dass die Schichtdickenabweichung zwischen beiden Messtechniken in etwa im Bereich

der im vorigen Abschnitt gemessenen Oberflächenrauhigkeit liegt. Die Schichtdicken aus den

Profilometermessungen werden durch den direkten Kontakt von Nadel und Oberfläche stärker

von der Rauhigkeit beeinflusst. Daher liegt die Abweichung der aus beiden Messtechniken

ermittelten Schichtdicken durchaus im Bereich der Bestimmungsgrenzen.


57

20 25 30 35 40 45 50

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

R

eflektivität / re

l. E

.

Einfallswinkel θ /°

a b

Abb. 4.14: Überlagerung von SPR-Spektren eines unbehandelten (a) sowie eines mit pp-MA beschichteten Substrats (b) (Probe: 27August08, 50 W, DC = 1/41) Quadrate: Experimentelle Kurve Durchgezogene Linie: Simulation Kurve (b): Simulationsergebnisse: 1,02,22 ±=d nm, 012,0581,1 ±=n

Im Gegensatz zu den dicken Filmen ist bei Immersion der pp-MA-Filme in wässriger Lösung

anstelle eines Schwellungsprozesses eine Abnahme der optischen Dicke mit steigender

Immersionszeit zu beobachten. Abb. 4.15 zeigt eine Überlagerung der SPR-

Reflektivitätskurven eines pp-MA-Films bei Start und nach mehrstündiger Immersion in PBS-

Lösung (a) sowie die zugehörige Kinetik in einen Immersionszeitraum von 16 Stunden. Die

zugehörigen Simulationskurven wurden aus Übersichtsgründen ausgelassen.

Wie wir bei der Untersuchung der dicken pp-MA-Filme in Lösung gesehen haben, ist in

einem vergleichbaren Immersionszeitraum die Änderung der Schichtdicke hoch im Verhältnis

zur Änderung des Brechungsindexes (vgl. Abb. 4.10). Betrachtet man Abb. 4.15a, so ist nach

15 h Immersionszeit in Lösung nur eine minimale Verschiebung des Resonanzminimums zu

kleineren Winkeln zu verzeichnen. Daher ist es bei der Simulation der optischen Dicken

durchaus berechtigt, den Brechungsindex als konstant zu betrachten. Hierbei ergibt sich eine

Abnahme der Schichtdicke von 1,1 nm (-5,5%) nach 15-stündiger Einlagerung des Films in

wässriger Lösung. Wie man am Verlauf der kinetischen Messung erkennen kann, ist die

Reflektivitätsänderung innerhalb der ersten sechs Stunden Immersionszeit doppelt so groß

wie in der restlichen Zeit. Daraus folgt, dass eine anfängliche Immersionsphase von etwa


58

sechs Stunden zur Stabilisierung des Films notwendig ist. Anschließend lässt sich die optische

Dicke des Films in wässriger Lösung als annähernd konstant interpretieren. Dieses Verhalten

konnte in mehreren Experimenten für verschiedene dünne pp-MA-Proben bestätigt werden.

Abb. 4.15: Überlagerung von SPR-Spektren eines pp-MA-Films in PBS-Lösung zu unterschiedlichen Immersionszeiten t (links) sowie zugehörige Kinetik (rechts) (Probe: 27August08, 50 W, DC = 1/41) (a) Schwarze Quadrate: t = 1 min ; Simulationsergebnisse: 012,0581,1 ±=n , 1,01,21 ±=d nm

Blaue Dreiecke: t = 15 h ; Simulationsergebnisse: 012,0581,1 ±=n , 1,00,20 ±=d nm

(b) Kinetische Verfolgung der Reflektivitätsänderung bei θ = 64,355° über 16 h

In Bezug auf die Filmmorphologie lassen sich folgende Schlussfolgerungenziehen:

Im Gegensatz zu den dicken Filmen erscheinen die dünnen pp-MA-Filme kompakter und

weniger flexibel, so dass Lösemittelmoleküle nur schwer in das dichte Netzwerk eindringen

können. Da der durch Schwellungseffekte aufgebaute Druck auf das Netzwerk entfällt,

reichen die Adhesionskräfte zwischen Substrat und Polymernetzwerk für eine Stabilisierung

des Films in wässriger Lösung aus. Teilweise im Polymer eingelagerte nichtkovalent

gebundene Fragmente niedrigen Molekulargewichts werden in der anfänglichen

Immersionsperiode weggespült.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

∆ R

/ r

el. E

.

Zeit / h

(b)

50 55 60 65 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

61 62 63 64 65 66 67

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Reflektiv

ität

/ re

l. E

.


Reflektivitä

t / re

l. E

.


(a)


59

Zusammenfassung der strukturellen Eigenschaften der pp-MA-Filme

Die chemische Komposition der pp-MA-Filme wurde mittels FT-IR-Spektroskopie als ein

dreidimensionales Kohlenwasserstoffnetzwerk mit hoher Dichte an Anhydridgruppen neben

Carboxy-, Alkohol- und Etherfunktionen charakterisiert. Die Filme weisen stark hydrophile

Eigenschaften auf: Bei Kontakt mit Luftfeuchtigkeit oder wässriger Lösung hydrolysieren die

Anhydridgruppen in die entsprechende Carbonsäure.

Die Oberflächenbeschaffenheit zeigt eine relativ hohe Rauhigkeit, welche mit dem

Wachstumsmechanismus im Plasma korreliert werden kann.

Bei der Charakterisierung der strukturellen Eigenschaften dünner (d<100 nm) und dicker pp-

MA-Filme (0,5-1 µm) mittels SPR und OWS wurde ein teilweise abweichendes Verhalten in

Lösung festgestellt. Die Makrostruktur der im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten dicken

Filme scheint einem kovalent verbundenen porösen Netzwerk zu ähneln. Inhomogenitäten im

Vernetzungsgrad sind dabei statistisch verteilt, so dass der Film nach außen hin isotrop

erscheint. Durch Diffusion von Lösemittelmolekülen in die Hohlräume und damit verbundene

Konformationsänderungen quillt das Polymer schwammartig auf und löst sich von der

Substratoberfläche, da die Adhesionskräfte dem steigenden Druck des vollgesogenen

Netzwerks nicht mehr standhalten können. Im Gegensatz dazu erscheinen die im Rahmen

dieser Arbeit synthetisierten dünnen Filme komprimiert und gleichmäßig vernetzt zu sein. Sie

sind stabil in wässriger Lösung und zeigen keine Quelleigenschaften. Vielmehr werden kurze

nichtkovalent gebundene Fragmente in Lösung herausgespült.

Die Abweichungen im Aufbau dünner und dicker Filme lassen sich auf die unterschiedlich

lange Plasmaexpositionszeit zurückführen. Mit steigender Plasmabehandlungszeit erhöht sich

die Vielfalt an aktiven Spezies im Plasma und damit die Unordnung des Systems. Das

bedeutet konkret, dass ständig neu im Plasma generierte Fragmente durch Kollision mit

anderen Spezies dichter und weniger dicht gepackte unregelmäßige Strukturen formen, die

sich auf der Substratoberfläche niederschlagen. Die Substratoberfläche ist damit einer

größeren Belastung ausgesetzt.


60

4.2 Immobilisierung von IgG-Antikörpern auf

plasmapolymerisierten Maleinsäureanhydridfilmen

Der Immobilisierungsprozess von Antikörpern auf Substratoberflächen unter Erhaltung der

biologischen Aktivität ist nicht trivial. Wie bereits erwähnt, tendieren biologische Moleküle

dazu, unspezifisch auf einer festen Oberfläche zu adsorbieren. Im Hinblick auf potentielle

Sensorfunktionen ist aus Stabilitätsgründen eine kovalente Verknüpfung des Antikörpers mit

der Polymermatrix zu bevorzugen. In beiden Fällen kann durch Konformationsänderungen,

chemische Modifizierung oder eine ungünstige Orientierung auf oder in der Polymermatrix

das Epitop des Antikörpers deaktiviert werden. Daher ist eine sorgfältige Planung der

Immobilisierungsstrategie erforderlich [13].

Die Struktur eines IgG-Antikörpers umfasst zwei

armähnliche Antigen-Bindungsfragmente (Fab-

Region), welche über die sogenannte Hinge-

Region mit dem Fc-Stamm der insgesamt Y-

förmigen Struktur verbunden sind (vgl.

Abb. 4.16). Die Fab-Fragmente setzen sich aus

zwei identischen schweren Ketten und zwei

ebenfalls identischen leichten Ketten zusammen,

welche über Disulfidbrücken miteinander

verknüpft sind. Die Höhe der Y-förmigen

Struktur beträgt in etwa 12 nm bei einem

mittleren Molekulargewicht von 156 kDa [14].

Die Effizienz einer Antigendetektion ist von der

Orientierung bzw. der Zugänglichkeit der antigenbindenden Fab-Regionen der, auf den pp-

MA-Filmen immobilisierten, Antikörper abhängig.

Wie wir im vorangegangenen Abschnitt gesehen haben, zeigen dünne pp-MA-Filme eine gute

Stabilität in wässriger Lösung. Zusätzlich sind sie im hydrolysierten Zustand mit einer hohen

Dichte an Carboxylfunktionen innerhalb und an der Oberfläche der Polymermatrix

ausgestattet. Die Carboxylgruppen bieten eine exzellente Basis für biochemische

Kopplungsreaktionen mit N-terminalen Aminosäuren bzw. Aminosäureresten des

Antikörpers. Bei der im Folgenden beschriebenen Immobilisierungsstrategie von IgG-

Abb. 4.16: Schematische Darstellung der IgG-Struktur


61

Antikörpern auf pp-MA-Filmen wird unser Modellsystem in Bezug auf Stabilität bzw.

Bindungsart und Orientierung hin untersucht.

4.2.1 Kopplungsstrategien

Standardverfahren zur kovalenten Kopplung von Carboxyl- an Aminogruppen bedienen sich

der Aktivesterchemie, da die Carbonylaktivität der Carboxylgruppe für die

Kondensationsreaktion zum entsprechenden Amid nicht ausreicht. Die am häufigsten

verwendeten Kopplungsreagenzien zur Aktivierung von Carboxylgruppen ( engl. Crosslinker)

basieren auf Pentahalogenphenyl-, und Hydroxysuccinimidoestern [15]. Diese sogenannten

„Zero-Length-Crosslinker“ leiten einen direkte kovalente Verknüpfung zwischen den

beteiligten Partnern ein, ohne dass zusätzliche Brückenatome eingebaut werden müssen[16].

Die Auswahl des Crosslinkers richtet sich nach der chemischen Spezifität der zu koppelnden

Reagenzien und der Kompatibilität der Reaktion in Bezug auf die Anwendung. Bei der

Immobilisierung von Antikörpern ist es im Hinblick auf spätere Antigensensoraktivität

notwendig, die native Struktur des Proteins weitgehend zu erhalten. Die Kopplungsreaktion

erfordert daher das Arbeiten bei physiologischen pH-Werten in gepufferten Systemen. Ein

IgG-Molekül enthält typischerweise mindestens 60 Aminosäurereste [17]. Die Konzentration

des Crosslinkers spielt daher eine entscheidende Rolle für die Retention der biologischen

Aktivität des Antikörpers, da eine hohe Anzahl an erfolgreichen Kopplungsprozessen

innerhalb des Proteins Denaturierungsvorgänge induzieren kann. Die Menge an verwendetem

Crosslinker sollte jedoch nicht zu gering sein, da eine hohe Proteinbelegungsdichte erwünscht

ist, zur Prävention unspezifischer Analytadsorption bei nachfolgender Antigenzugabe. Bei der

Konzentrationsabstimmung des Crosslinkers wurde sich an Literaturbespielen orientiert [18,

19].

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Crosslink-Routen getestet, die im

Folgenden beschrieben werden. Für die Aktivierung der Carboxylgruppen auf der pp-MA-

Oberfläche ist es nicht unbedingt erforderlich in wässrigem Medium zu arbeiten, sofern der

resultierende Aktivester noch ausreichend hydrophil ist. Eventuell verbleibende organische

Lösemittelrückstände lassen sich leicht von der Substratoberfläche waschen. Bannwarth und

Knorr demonstrierten die Effizienz von TSTU-Estern (O-(N-Succinimidyl)-N,N,N’,N’-

tetramethyluronium tetrafluoroborat) in einem DMF/Dioxan/Wasser-Gemisch für die schnelle


62

Kopplung von u. A. Biotin mit Aminoverbindungen innerhalb von nur zehn Minuten

Reaktionszeit [20]. Auf dieser Vorlage sowie einer Variation nach Andersson et al.

[21]basierend wurden erste Kopplungsversuche mit IgG-Antikörpern unternommen. Abb.

4.17 zeigt eine auf die pp-MA-Filmgeometrie angepasste schematische Darstellung der

Kopplungsreaktion mit Hilfe von TSTU.

O

O

O

R

O

OH

R

O

OHR

O

NH-IgG

R

O

NH-IgGRO

O

N O

O

R

O

ON

O

O

H2O TSTU/DIPEA

DMF/Dioxan/H2O

2:2:1

H2N-IgG

H2O

N

OC

+

N

O O

CH3CH3

N

CH3

CH3

BF4-

TSTU

Die Aktivierungs- und Kopplungsergebnisse wurden mittels FT-IR-Spektroskopie untersucht;

allerdings konnte eine IgG-Anbindung nicht eindeutig festgestellt werden (vgl. 4.2.3). Im

Folgenden wurde die Kopplungsstrategie auf das standardisierte, in wässriger Lösung

bewährte System aus EDC (N-3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Hydrochlorid)

und Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimid) umgestellt. Beide Komponenten sind

wasserlöslich. Durch die Zugabe von Sulfo-NHS lässt sich die Stabilität und

Wasserlöslichkeit des EDC-Aktivesters auf mehrere Stunden erhöhen, da auf EDC-basierende

Aktivester andernfalls innerhalb kürzester Zeit hydrolysieren. Die Amidierungsreaktion

funktioniert in einem pH-Bereich von 4,5-7,5. Detaillierte Studien zeigten, dass die Hydrolyse

des Esters für pH-Werte unterhalb von 6 langsamer verläuft. Der optimale pH-Bereich für die

Aktivierung liegt demnach im schwach sauren Bereich, während für die Kopplungsreaktion

mit Proteinen ein pH-Optimum von 7-7,5 festgestellt wurde [15, 22]. Der pH-Wert des

Reaktionsmediums für den Aktivierungsprozess wurde daher im Laufe der Arbeit von pH = 7

(Milli-Q-Wasser, PBS-Lösung) auf pH = 5 (MES-Pufferlösung) umgestellt. Abb. 4.18 zeigt

eine schematische Darstellung für die Aktivierung und Kopplung von pp-MA-Filmen mit

IgG-Antikörpern.

Abb. 4.17: Schematische Darstellung der Aktivierungs- und Kopplungsreaktion hydrolysierter pp-MA-Filme mit IgG-Antikörpern unter Verwendung von TSTU TSTU : O-(N-Succinimidyl)-N,N,N’,N-tetramethyluronium tetrafluoroborat DIPEA: Diisopropylethylamin


63

O

O

O

PBS

RO

-Na

+

O

R

O

O-Na

+EDC/Sulfo - NHS

MES

CH3

N N

Cl-HN+

CH3

CH3

NO O

SO3-Na

+

OH

R

O

O

NHEt

N

NHMe2

+Cl

-

R

O

O NHEt

N

NHMe2+Cl

-

Sulfo-NHS

EDC Sulfo-NHS

RO

O

N O

O

SO3-Na

+

R

O

ON

O

O

SO3-Na

+

R

O

NH-IgG

RNH-IgG

O

H2N-IgG

PBS

Abb. 4.18: Schematische Darstellung der Aktivierung- und Kopplungsreaktion von hydrolysierten pp-MA-Filmen mit IgG-Antikörpern unter Vewendung von einer EDC/Sulfo-NHS-Mischung EDC: (N-3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Hydrochlorid) Sulfo-NHS: (N-hydroxysulfosuccinimid)

4.2.2 SPR-Messoptimierung

Die Auswahl einer Flüssigkeitzelle für SPR-Messungen in Lösung erfolgt in Abstimmung auf

das jeweilige System, da die Sensitivität der Messung durch den Einsatz einer geeigneten

Zellgeometrie entschieden verbessert werden kann. Für die in situ-Verfolgung von Protein-

Immobilisierungsprozessen haben sich insbesondere kleine Zellvolumina bewährt, da diese

eine gute Durchmischung von beschichtetem Substrat und Analyt an der Grenzfläche

erlauben, so dass auch mit sehr geringen Proteinkonzentrationen gearbeitet werden kann.

Außerdem können eventuell auftretende Luftblasen leichter aus dem System gepumpt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden für die Messungen in wässriger Lösung zwei verschiedene

Flüssigkeitszellen verwendet. Abb. 4.19 zeigt eine schematische Zeichnung beider Modelle.

Modell A besteht aus einer in der Mitte kreisförmig ausgeschnittenen Teflonplatte mit

angebohrten Kanüleneinlässen an zwei Seiten. Die Zelle wird von beiden Seiten mit einem

Gummi-Ring abgedichtet und auf der Rückseite mit einem Deckglas verschlossen. Das

Substrat wird mit der polymerbeschichteten Seite auf dem O-Ring aufgelegt und die gesamte

Konstruktion wird festgeschraubt (vgl. Kapitel 3, Abb. 3.3). Dieses zunächst eingesetzte

Modell besitzt ein relativ großes Volumen, in dem sich leicht Luftblasen ausbilden können.


64

Daher wurde es im Laufe der Arbeit durch Modell B ersetzt. Modell B setzt sich aus einer

dünnen quadratischen Quarzplatte zusammen, die mit zwei Kanüleneinlässe durchbohrt ist.

Auf der Vorderseite der Quarzplatte liegt eine dünne PDMS-Membran auf, welche

gleichzeitig als Zellwand und als Dichtungselement fungiert.

Abb. 4.19: Schematische Zeichnung der verwendeten Flüssigkeitszellen

Der Einfluss der Flusszellengeometrie auf die Sensitivität der Messung wird beim Vergleich

von kinetischen Studien zweier ähnlicher Experimente deutlich. Abb. 4.20 zeigt zwei

Messdurchläufe einer SPR-in-situ-Verfolgung des Immobilisierungsprozesses von IgG-

Antikörpern auf zwei pp-MA-Filmen (Probe A und B). Bis auf die Tatsache, dass Probe B ca.

3 Stunden länger in PBS-Lösung eingelagert wurde als Probe A, ist die Behandlung beider

Proben identisch. Die Messung von Probe A wurde in der oben beschriebenen

Flüssigkeitszelle des Modelltyps A durchgeführt und Probe B wurde in Modell B vermessen.

Ein rein optischer Vergleich beider Kurvenverläufe, ohne auf qualitative Details einzugehen,

zeigt, dass in Versuch B sehr viel schärfere Übergänge zwischen den einzelnen

Behandlungsschritten zu erkennen sind. Demnach trägt die Verwendung einer

Flüssigkeitszelle des Modelltyps B zur Verbesserung der Messsensitivität bei. Für eine

qualitative Erklärung der Versuchsergebnisse sei auf den nächsten Abschnitt verwiesen.


65

Abb. 4.20: SPR-in-situ-Verfolgung des Immobilisierungprozesses von IgG-Antikörpern auf zwei mit EDC/Sulfo-NHS aktivierten dünnen pp-MA-Filmen in PBS-Lösung Versuch A : Probe 07 Juli 08, 50 W, 1/41, 23≈d nm Versuch B: Probe 04 August 08, 50 W, 1/41, 23≈d nm

4.2.3 Ergebnisse

In einem im Rahmen dieser Arbeit typischen SPR-Experiment für die in situ-Verfolgung des

Immobilisierungsprozesses wird die Veränderung des Oberflächenplasmons oder einer

Wellenleitermode der zuvor in Luft und wässrigen Lösung gemessenen Resonanzkurve in

Abhängigkeit von der Immersionszeit des Films in wässriger Lösung (Milli-Q-Wasser oder

Pufferlösung) verfolgt. Sobald sich ein stabiles Gleichgewicht einstellt, zu erkennen am

relativ konstanten Verlauf der Kinetikkurve, injiziert man die den Aktivester enthaltende

Lösung in das Messsystem. Die Einwirkzeit beträgt 30-50 Minuten in Abhängigkeit von der

Messkurve. Die durch die Veresterungsreaktion provozierte Änderung der Dispersionsrelation

des Oberflächenplasmons macht sich durch einen Anstieg in der Kinetikkurve bis zum

Erreichen der Sättigung bemerkbar. Anschließend wird zur Entfernung von Nebenprodukten

ein maximal 20 Minuten dauernder Spülvorgang mit wässriger Lösung durchgeführt (Abfall

der Kinetikkurve). Im Folgenden wird die Probenoberfläche mit Antikörperlösung gesättigt.

Hier sollte ein nur minimaler Anstieg der Reflektivitätsänderung zu beobachten sein, da

Proteine eine relativ geringe strukturelle Dichte aufweisen. Im Anschluss an die 1-2-stündige

Proteinkopplungsreaktion wird die Probenoberfläche zur Entfernung nichtkovalent


66

gebundener Produkte über längere Zeit mit wässriger Lösung bzw. einer nichtionischen

wässrigen Tensidlösung gespült. Zwischenzeitlich folgen kurze Unterbrechungsphasen der

kinetischen Messung zur Aufnahme von Resonanzkurven unmittelbar vor Start des

Aktivierungsvorganges, während des Spülvorgangs der Aktivierungs- und der

Kopplungsphase sowie nach Abbruch der kinetischen Messung. Bei einem erfolgreichen

Kopplungsprozess ist nach dem Spülvorgang ein minimaler Abfall der Kinetikkurve mit

nachfolgender Gleichgewichtseinstellung zu erwarten. Gleichzeitig ist eine Verschiebung des

Oberflächenplasmons zu höheren Resonanzwinkeln im Vergleich zu Ausgangswert zu

erwarten. Abb. 4.21 stellt den oben beschriebenen idealisierten Verlauf eines solchen

kinetischen Experiments dar.

Abb. 4.21: Idealisierte Darstellung der in situ-Verfolgung eines Proteinimmobilisierungs-prozesses (durchgezogene Linie) in Abhängigkeit von der Immersionszeit in wässriger Lösung a: Aktivierungsprozess durch Veresterung mit einem „Zero-Length-Crosslinker“ b: Spülvorgang zur Ablösung von Nebenprodukten c: Zugabe der Proteinlösung d: Spülvorgang zur Ablösung nichtkovalent gebundenen Materials e: Reflektivitätsverschiebung zwischen Anfangs- und Endzustand; entspricht der Positionsverschiebung der Resonanzminima vor und nach der Proteinanbindung

Bei der zunächst eingeschlagenen Aktivierungsroute über TSTU ist die Interpretation der

Ergebnisse schwierig, da die untersuchten Proben teilweise inkonsistentes Verhalten zeigten.

Abb. 4.18 zeigt die kinetische Verfolgung der TM1-Mode eines ca. 390 nm dicken pp-MA-

Films in Milli-Q-Wasser mit nachfolgender TSTU-Aktivierung und Anbindung von IgG-

Antikörpern. In der eingeblendeten Darstellung ist eine Überlagerung der Reflektivitätskurven

zum Startzeitpunkt (schwarze Kurve; t = 0 min) und Endzeitpunkt der kinetischen Messung

(rote Kurve; t = 17 h) dargestellt. Ein Vergleich der Resonanzminima liefert eine Winkel-

verschiebung von 0,3°. Dies könnte als erster Hinweis auf eine erfolgreiche Anbindung des


67

Antikörpers gedeutet werden. Eine genauere Betrachtung des Aktivierungs- und

Kopplungsprozesses zeigt die erwartungsgemäß deutliche Zunahme der optischen Dicke nach

Zugabe der Aktivesters und einen moderaten Anstieg nach Injektion der Antikörperlösung.

Der abschließende Spülvorgang ist etwas zu kurz um eine Gleichgewichtseinstellung

beobachten zu können. Nichtsdestotrotz deutet der Kurvenverlauf auf eine erfolgreiche

Anlagerung von Antikörpern an die Polymeroberfläche hin. Betrachtet man dagegen den

Kurvenverlauf der kinetischen Messung in den ersten drei Stunden der Immersionszeit, so

sind beträchtliche Veränderungen in der Reflektivität zu erkennen. Die eingeblendete

Resonanzkurve, welche am Kinetikstartzeitpunkt gemessen wurde, lässt sich daher nicht als

Basis für weitere Simulationsberechnungen der optischen Dicken verwenden. Aufgrund der

sprunghaften Veränderung der Kinetikkurve bei niedrigen Immersionszeiten besteht die

Möglichkeit, dass das Resonanzminimum der TM1-Mode so weit verschoben wurde, dass es

außerhalb des für die kinetische Verfolgung erforderlichen linearen Messbereichs an der

linken Kurvenflanke liegt. Die nachfolgenden Veränderungen entsprächen dann keiner realen

Darstellung der Grenzflächenprozesse. Eine Interpretation an dieser Stelle ist schwierig, da

während der kinetischen Messung keine winkelabhängigen Reflektivitätsaufnahmen

durchgeführt wurden.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

46 48 50 52 54 56 58 60

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Refle

ktivität

/ re

l. E

.


∆R

/ %

Zeit / h

Spülen mit H2

O

Immersion

in H2O

Aktivierung mit TSTU

in Dioxan/H2O 4:1

Zugabe IgG

Abb. 4.22: In situ-Verfolgung des Immersions-, Aktivierungs- und IgG-Immobilisierungs-prozesses auf einer ca. 390 nm dicken pp-MA-Probe in Abhängigkeit von der Immersionszeit t in Milli-Q-Wasser (Probe: 06 Mai 08, 50 W, DC = 1/41) Einschub: Überlagerung der am Start- (schwarze Kurve; t=0 min) und am Endzeitpunkt (rote Kurve; t = 17 h ) der kinetischen Messung aufgenommenen Resonanzkurven


68

Zum Nachweis erfolgreicher Aktivierungsversuche wurden vereinzelte Proben sowohl mit

SPR- als auch FT-IR-Spektroskopie untersucht. Ein Vergleich der SPR-Resonanzkurven von

hydrolysierten und nachfolgend aktivierten Proben in Luft zeigte sowohl eine Zunahme als

auch eine Abnahme der optischen Dicken im Bereich von 0,4°. Eine verlässliche

Interpretation ist daher nicht möglich.

In Abb. 4.23 ist eine Überlagerung der FT-IR-Spektren einer, wie im Folgenden beschrieben,

behandelten pp-MA-Probe dargestellt. Zunächst wurde ein FT-IR-Spektrum der frisch

synthetisierten Probe (Kurve a) aufgenommen. Die Probe wurde zur Hydrolyse der

Anhydridgruppen für mehrere Stunden in Wasser eingelagert und anschließend erneut

vermessen (Kurve b). Weiterhin wurde ein Spektrum der in einer DMF/Dioxan/Wasser-

Mischung mit TSTU frisch aktivierten Probe aufgenommen (Kurve c), welche abschließend

mit 4-Aminobenzonitril derivatisiert (Kurve d) wurde.

3500 3000 2500 2000 1500 1000

Extin

ktio

n

Wellenzahl / cm-1

pp-MA, 50 W, 1/41, 23 nm

a

b

c

d

Abb. 4.23: Links: Überlagerung der FT-IR-Spektren einer a) frischen pp-MA-Probe, b) der für 15,5 h in H2O eingelagerten Probe, c) der mit TSTU aktivierten Probe, d) der mit 4-Aminobenzonitril derivatisierten Probe (Probe: 08 April 08) Rechts: Reaktionsschema zur Behandlung der pp-MA-Probe

Wie man der Auftragung entnehmen kann sind außer der deutlichen Verschiebung der

Carbonylbanden zu niedrigeren Wellenzahlen infolge der Hydrolyse der Anhydridfunktionen

keine markanten Veränderungen in den Spektren zu sehen. Die für tertiäre Amide typische

Amid(I)-Bande im Bereich von 1670-1630 cm-1 könnte durch die Carbonylschwingung der

Carboxylgruppe überlagert sein. Die charakteristische Nitrilbande des Aminobenzonitrils im

H2O HOOC COOH

HOOC COOH TSTU/DIPEA HOOC

O

O

N

O

O

HOOC

O

O

N

O

O

4-Aminobenzonitril

CNNH2

HOOC

O

NH

CN

(b)

(c)

(d)

OO O

50 W, 1/41O

O O

OO O

(a)


69

Bereich von 2260-2210 cm-1 ist nicht zu erkennen. Die Aktivierung scheint demnach nicht

funktioniert zu haben; allerdings ist eine eindeutige Aussage schwer zu treffen, da aufgrund

von sterischer Hinderung möglicherweise nur an der Oberfläche liegende Carboxylfunktionen

derivatisiert wurden. Diese stellen nur einen kleinen Anteil an der Gesamtdichte der

funktionellen Gruppen dar, so dass sie außerhalb der Sensitivitätsgrenzen der FT-IR-Messung

liegen.

Aufgrund der oben beschriebenen Unklarheiten in Bezug auf eine erfolgreiche Aktivierung

und Kupplung wurde der TSTU-basierte Ester durch die wasserlösliche Kombination aus

EDC und Sulfo-NHS ersetzt. Die Effizienz beider Reagenzien wurde in einem Testdurchlauf

zur Anbindung von Ethanolamin an hydrolysierte pp-MA-Filme bewiesen. Abb. 4.24 zeigt

die Kinetik des Testdurchlaufs in PBS-Lösung. In der eingeblendeten Darstellung ist eine

Überlagerung der Reflektivitätsaufnahmen vor der Aktivierung mit EDC und Sulfo-NHS

(schwarze Quadrate) und nach der Anbindung von Ethanolamin (rote Dreiecke) mit einer

deutlichen Verschiebung zu höheren Resonanzwinkeln zu sehen. Unter Annahme des

allgemein für organische Moleküle eingesetzten Brechungsindexes von n = 1,581, lässt sich

die Positionsverschiebung des Minimums mit einem Dickenzuwachs von ca. 5 nm

quantifizieren. Der Kurvenverlauf entspricht ziemlich genau dem in Abb. 4.21 beschriebenen

erwarteten Verlauf. Die Anbindung von Ethanolamin auf der pp-MA-Oberfläche hat demnach

einwandfrei funktioniert. Der markante Abfall der Kinetikkurve beim Pufferwechsel von PBS

zu MES ist auf die abrupte pH-Erniedrigung (7,4 auf 5) zurückzuführen. Im schwach sauren

Bereich ist ein geringerer Anteil an Carboxylgruppen deprotoniert, so dass die elektrostatische

Abstoßung zwischen den funktionalisierten Resten abnimmt. Infolgedessen ist eine dichtere

Anordnung der Carboxylreste in der Polymermatrix favorisiert. Die Triebkraft dieser

Konformationsänderungen liegt in der Reduktion der freien Oberflächenenergie [7, 8].


70

14 15 16 17 18 19 20 21

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

50 55 60 65 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Re

flektivi

tät

/ re

l. E

.

Zeit / h

Spülen mit PBS

∆R

/ r

el. E

.

Zeit / h

PBS

Wechsel zu MES

Zugabe EDC/Sulfo-NHS

Spülen mit PBS

Zugabe Ethanolamin

1M

Abb. 4.24: In situ-Verfolgung des Aktivierungs- und Ethanolamin-Anbindungsprozesses auf einer ca. 31 nm dicken pp-MA-Probe in Abhängigkeit von der Immersionszeit t in PBS-Lösung (Probe: 18 August 08, 50 W, DC = 1/41) Einschub: Überlagerung der vor Aktivierungsstart (schwarze Kurve; t (PBS) = 14 h) und am

Endzeitpunkt (rote Kurve; t(PBS) = 21,4 h ) der kinetischen Messung aufgenommenen

Resonanzkurven

Die Wellenleitermodenspektroskopie liefert, wie bereits erwähnt, in den meisten Fällen

genauere Ergebnisse in Bezug auf die Filmgeometrie sowie eventuell ablaufende

Grenzflächenprozesse. Der IgG-Immobilisierungsprozess wurde daher auf einer in wässriger

Lösung stabilen, ca. 800 nm dicken pp-MA-Schicht untersucht. Abb. 4.25a zeigt den an der

TM1-Mode verfolgten Anbindungsprozess in Abhängigkeit von der Immersionszeit in Milli-

Q-Wasser. Trotz des schlechten Signal-Rausch-Verhältnisses ist der grobe Kurvenverlauf

noch relativ deutlich auszumachen. Wie man am Anstieg der Kurve erkennen kann, scheint

der Aktivierungsprozess erfolgreich gewesen zu sein. Da bei der Zugabe von IgG-

Antikörpern ein kontinuierlicher Abfall der Reflektivitätsänderung zu beobachten war, wurde

die Konzentration des Antikörpers kurzfristig um den Faktor zehn erhöht, allerdings ohne

einen sichtbaren Effekt zu produzieren. In der in Abb. 4.25b dargestellten Überlagerung der

vor Aktivierungsstart (schwarze Kurve) und am Endzeitpunkt der kinetischen Messung (rote

Kurve) aufgenommenen Resonanzkurven ist eine deutliche Verschiebung beider Wellenleiter-

moden zu höheren Resonanzwinkeln erkennbar, was einer Zunahme von Schichtdicke und

Brechungsindex entspricht. Aus der Simulation der Wellenleitermoden geht hervor, dass diese

große Verschiebung nicht durch Einfach- bzw. Mehrfachbelegung des Antikörpers auf der


71

Polymeroberfläche erklärt werden kann. Vielmehr scheint das Polymernetzwerk weiterhin

anzuschwellen, während gleichzeitig Antikörper teilweise in die Matrixhohlräume hinein

diffundieren. Für eine eindeutige Erklärung dieses Sachverhalts sind weitere detailliertere

Untersuchungen erforderlich.

Form und Breite beider Resonanzkurven signalisieren starke Dämpfungseffekte (vgl. Kapitel

4.1.2) innerhalb und an der Oberfläche der Polymermatrix. Das Signalrauschen der

kinetischen Messung ist daher auf die Deformation der TM1-Mode zurückzuführen, da der für

die Messung relevante Verlauf der linken Kurvenflanke leichte Abweichungen von der

Linearität aufweist.

Abb. 4.25: (a) In situ-Verfolgung des Aktivierungs- und IgG-Anbindungsprozesses auf einer ca. 680 nm dicken pp-MA-Probe in Abhängigkeit von der Immersionszeit t in Milli-Q-Wasser (Probe: 06 Juni 08, 50 W, DC = 1/41) (b) Überlagerung der vor Aktivierungsstart (schwarze Quadrate; t (H2O) = 0 min) und am Endzeitpunkt (rote Dreiecke; t(H2O) = 6,2 h ) der kinetischen Messung aufgenommenen Resonanzkurven

Im Folgenden wurden nur noch dünne pp-MA-Filme auf eine erfolgreiche Immobilisierung

von IgG-Antikörpern untersucht. In Abb. 4.26 ist die in situ-Verfolgung des

Immobilisierungsprozesses von IgG auf einem ca. 21 nm dicken pp-MA-Film in PBS-Lösung

dargestellt. Die einzelnen Behandlungsschritte sind in der Auftragung eingeblendet.

Aktivierungs- und Kopplungsreaktion wurden bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt.

40 45 50 55 60 65 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Re

flektivitä

t / re

l. E

.


(b)

0 1 2 3 4 5 6

0,054

0,055

0,056

0,057

0,058

0,059

0,060

0,061

0,062

Spülen mit H2O

Zugabe IgG

(0,1 mg/ml)

Spülen

mit H2O

Zugabe IgG

(1 mg/ml)

Zugabe EDC/Sulfo-NHS

∆ R

/ r

el. E

.

Zeit / h

(a)


72

Die scharfen Übergänge beim Pufferwechsel von MES nach PBS und umgekehrt

demonstrieren die pH-Sensitivität des Systems. Der Messverlauf zeigt eine klare Anlagerung

von IgG-Antikörpern an die pp-MA-Filmoberfläche. Zur Entfernung jeglichen nichtchemisch

gebundenen Materials wurde die Filmoberfläche mit einer 1%igen Detergenzlösung gespült,

zu erkennen am scharfen Abfall der Kurve gegen Ende der Messung.

15 16 17 18 19 20

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

∆ R

/ r

el. E

.

Zeit / h

PBS

Wechsel

zu MESZugabe EDC/Sulfo-NHS

Spülen mit PBS

Spülen mit MES

Zugabe Cy5-IgG

(0,1 mg/ml

Spülen mit PBS

Spülen mit

Tween 20

(0,1%)

Scan A

Scan B

Scan C

Abb. 4.26: In situ-Verfolgung des Aktivierungs- und IgG-Anbindungsprozesses auf einer ca. 22 nm dicken pp-MA-Probe in Abhängigkeit von der Immersionszeit t in PBS-Lösung (Probe: 27 August 08, 50 W, DC = 1/41) Die einzelnen Behandlungsschritte sowie kurve Unterbrechungsphasen zur Aufnahme der SPFS-Reflektivitätsscan A-C (siehe unten) sind eingetragen.

Wie man Abb. 4.26 entnehmen kann, bewirkt die Anlagerung des IgG-Antikörpers nur einen

geringen Anstieg in der Kinetikkurve. Zur Signalverstärkung wurde daher das Anti-CRP-IgG

kurzfristig durch einen farbstoffmarkierten (Cy5) Hase-Anti-Maus-IgG-Antikörper ersetzt,

dessen Anbindung zusätzlich über das Fluoreszenzsignal des Farbstoffs verfolgt werden kann.

In Abb. 4.27 sind SPFS-Aufnahmen des in Abb. 4.26 untersuchten Films im Anschluss an die

Kopplungsreaktion mit Cy5-IgG-Antikörpern zu unterschiedlichen Spülzeiten mit PBS und

Detergenzlösung dargestellt. Scan A wurde ca. 1,6 h nach Spülstart mit PBS-Lösung

aufgenommen (vgl. Abb. 4.26), Scan B wurde ca. 0,5 h nach Spülstart mit Detergenzlösung

und Scan C nach einstündiger Spülzeit mit Detergenzlösung aufgenommen. Aus den

Aufnahmen folgt, dass der Antikörper eindeutig auf der pp-MA-Oberfläche angebunden sein

muss, da selbst nach längerer Spülzeit in Detergenzlösung (vgl. Scan C) ein Fluoreszenzsignal

des farbstoffmarkierten Antikörpers detektiert werden kann.


73

Abb. 4.27: SPFS-Aufnahmen eines pp-MA-Films, auf dem Cy5-IgG-Antikörper immobilisiert wurden, bei unterschiedlich langen Spülzeiten t in wässrigen Medien (PBS-Lösung und Tween20-Lösung) (Probe: 27 August 08, 50 W, 1/41)

(A) t(PBS) = 1,6 h (B) t(Tween20) = 0,5 h (C) t(Tween20) = 1 h

Die Aufnahme von Scan A und B erfolgte am gleichen Messpunkt; die Aufnahme von Scan C wurde nach Neujustierung des Anregungslasers an einem anderen Messpunkt durchgeführt. Die Unterbrechungspausen zur Aufnahme der Resonanzkurven A-C sind in der kinetischen Messung (Abb. 4.22, grüne Markierung) widergegeben.

Eine detailliertere Betrachtung der Signalintensität zeigt einen deutlichen Abfall des

Fluoreszenzsignals von Scan A nach Scan B. Zusätzlich ist eine leichte Verschiebung des

Resonanzminimums zu kleineren Winkeln zu verzeichnen. Diese Beobachtungen sind auf

Ablösungsprozesse physikalisch adsorbierter Antikörper sowie auf Photobleachingseffekte

des Farbstoffs angebundener Antikörper zurückzuführen, da beide Aufnahmen am gleichen

Messpunkt erfolgten. Zur Einschätzung des Intensitätsverlusts infolge von Photobleaching

wurde der Anregungslaser für die Aufnahme von Scan C auf einen anderen Messpunkt

justiert. Aufgrund der Neujustierung ist eine direkte quantitative Korrelation der

Fluoreszenzintensitäten von Scan C und Scan B unzulässig. Dennoch lässt die in Scan C

50 55 60 65 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Re

fle

ktivitä

t /

rel. E

.

Einfallswinkel

0

200000

400000

600000

800000

1000000

Flu

ore

sze

nzin

ten

sitä

t (Co

un

ts)

(C)

50 55 60 65 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Re

flektivitä

t / re

l. E

.(A)

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Flu

ore

szen

zin

ten

sitä

t (Cou

nts

)

50 55 60 65 70

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0


Re

fle

ktivitä

t / re

l. E

.

(B)

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Flu

ore

szen

zin

tesitä

t (Co

un

ts)


74

gemessene hohe Signalintensität und die annähernd gleiche Position der Resonanzminima von

Scan C und B auf eine kovalente Anbindung markierter IgG-Antikörper auf der pp-MA-

Oberfläche schließen.

Abb. 4.28 zeigt eine Überlagerung der vor Aktivierungsstart (schwarze Quadrate) und kurz

vor dem Endzeitpunkt der kinetischen Messung (blaue Dreiecke; entspricht Scan B in

Abb. 4.27) aufgenommenen Resonanzkurven inklusive Simulation. Ein Vergleich der

Minimumspositionen liefert eine deutliche Verschiebung zu höheren Winkeln. Unter

Annahme eines relativ konstanten Lösungsverhaltens des pp-MA-Films mit homogener

Oberflächenbelegung durch IgG-Antikörper ist ein Schichtdickenzuwachs von ca. 6 nm zu

verzeichnen. Für die Simulation wurde der in der Regel für Proteine angenommene

Brechungsindex von 1,45 verwendet [23].

50 55 60 65 70

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Re

flektivität / re

l. E

.


Abb. 4.28: Überlagerung der vor Aktivierungsstart (schwarze Quadrate) und kurz vor dem Abbruch (blaue Dreiecke; Scan B aus Abb. 4.23) der kinetischen Messung (vgl. Abb. 4.22) aufgenommenen Resonanzkurven inklusive der Simulationsergebnisse. (Probe 27 August 08, 50 W, 1/41) Aus den oben beschriebenen Ergebnissen geht hervor, dass eine stabile Immobilisierung der

IgG-Antikörper auf den pp-MA-Filmen möglich ist.

Um nähere Aussagen über die Eigenschaften der bindenden Wechselwirkungen machen zu

können, wurde ein Kontrollversuch durchgeführt, bei dem IgG-Antikörper durch rein

physikalische Adsorption auf der pp-MA-Überfläche immobilisiert werden. Hierbei wurden

nichtaktivierte pp-MA-Filme 2 Stunden lang mit in PBS gelösten IgG-Antikörpern


75

gesättigt und anschließend 15 Stunden lang mit PBS-Lösung gespült. Aus der Verschiebung

der Resonanzminima der vor und nach Antikörperzugabe und subsequenten Spülvorgang

aufgenommen Reflektivitätskurven ist ein Schichtdickenzuwachs von ebenfalls 6 nm zu

verzeichnen. Dies entspricht den Ergebnissen der zuvor untersuchten kovalenten

Immobilisierungsversuche. Eine Unterscheidung zwischen physikalisch adsorbierten und

kovalent gebundenen Antikörpern scheint demnach zunächst nicht möglich zu sein. Die pp-

MA-Oberfläche wurde allerdings nicht mit Detergenzlösung gespült. Wie man der kinetischen

Messung des chemisch eingeleiteten Kopplungsversuchs in Abb. 4.24 entnehmen kann, ist ein

abschließendes Spülen mit PBS-Lösung nicht ausreichend, um physikalisch adsorbierte

Spezies von der pp-MA-Oberfläche abzulösen, da bei der nachfolgenden Zugabe von

Detergenzlösung nochmals ein deutlicher Abfall in der Kurve zu verzeichnen ist, der nur auf

eine Abtrennung nichtchemisch gebundener Spezies zurückzuführen ist. Die verbleibenden,

auf der pp-MA-Oberfläche immobilisierten, Antikörper sind demnach eindeutig kovalent mit

der Polymermatrix verknüpft.

Wie bereits in der Einleitung erwähnt, beträgt die Längsausdehnung der Antikörpermoleküle

in etwa 12 nm. Die oben beschriebenen Kopplungsversuche wurden bei einer relativ hohen

IgG-Konzentration von 0,1 mg/ml durchgeführt, so dass auch von einem relativ hohen

Belegungsgrad der Filmoberfläche ausgegangen werden kann. Ein mittlerer

Schichtdickenzuwachs von 6 nm deutet daher auf eine statistische Orientierung der

Antikörper auf der Filmoberfläche hin. Die reale Orientierung der Antikörper auf der pp-MA-

Oberfläche lässt sich aus den experimentellen Daten nicht determinieren, da diese von vielen

Faktoren abhängig ist, welche u. A. genauere Informationen zur Aminosäuresequenz bzw. zur

strukturellen Anordnung und Zugänglichkeit der Lysinreste erfordern.

4.2.4 Zusammenfassung und Ausblick

Aus den SPR-Untersuchungen geht hervor, dass eine kovalente Anbindung von IgG-

Antikörpern nach vorangegangener Aktivierung über EDC/Sulfo-NHS-basierte Aktivester auf

dünnen pp-MA-Filmen möglich ist. Plasmapolymerisierte Maleinsäureanhydridfilme sind

demnach als Bausteine für potentielle Biosensoren geeignet. Auf der Grundlage des

entwickelten pp-MA/IgG-Systems lassen sich nun im nächsten Schritt die

Sensoreigenschaften des Systems unter Zugabe von Antigenen untersuchen. Hierbei ist noch

viel Arbeit in die Optimierung des Kopplungsprozesses in Bezug auf eine Erhöhung der


76

Proteinbelegungsdichte, ein optimales Crosslinker/Proteinverhältnis sowie eine kontrollierte

Orientierung der Antikörper zu investieren.

Die Proteinbelegungsdichte lässt sich z. B. durch elektrostatische Voradsorption des Proteins

unterhalb seines isoelektrischen Punkts realisieren. Die kovalente Verknüpfung der

Sensorbasis unter Orientierung der Antikörper ist nicht trivial. Mögliche Ansätze werden im

Folgenden beschrieben: Eine bereits an anderen Systemen erfolgreich getestete Route

beinhaltet die Immobilisierung von Protein A oder G auf der Sensoroberfläche mit

subsequenter IgG-Anbindung, da diese aus Bakterien gewonnenen Proteine spezifische

bindende Wechselwirkungen mit der Fc-Region des Antikörpers eingehen, so dass beide

antigenbindende Fab-Fraktionen nach außen zeigen [13]. Für die Anwendung auf einer pp-

MA-Unterlage ist zu bedenken, dass der Erfolg dieser Methode von der Kontrolle über die

Orientierung und Aktivität des immobilisierten Proteins A oder G abhängt. Eine weitere

Möglichkeit besteht darin, sich die biochemische Affinität des Avidin-Biotin-Systems zunutze

zu machen. Hierbei wird Avidin auf der Sensoroberfläche immobilisiert, welches dann die

Bindungsstellen für einen biotinylierten Antikörper zur Verfügung stellt. Die Effizienz des

Systems ist wiederum von der Orientierung der Avidin-Moleküle und der

Biotinylierungsmethode des Antikörpers abhängig [24]. Eine alternative, vielversprechende

Route stellt die gezielte Verknüpfung aminderivatisierter Plasmapolymerreste mit dem, an der

Fc-Region anhängenden, modifizierten Kohlenhydratrestes dar, da dieser zu weit von den

antigenbindenden Fab-Regionen angeordnet ist, um deren Aktivität beeinflussen zu können

[17].


77


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Kapitel 5 - Fazit

79

5 Fazit

In der vorliegenden Arbeit wurden die strukturellen Eigenschaften niedrig gepulster

Maleinsäureanhydrid-Plasmapolymere auf ihre Eignung als Biosensorunterlage untersucht.

Im Anschluss daran wurde eine Biosensorplattform durch kovalente Immobiliserung von

Anti-CRP-Antikörpern auf der pp-MA-Oberfläche zur nachfolgenden Detektion von CRP-

Molekülen entwickelt.

Die bei milden Prozessbedingungen synthetisierten pp-MA-Filme zeigten eine relativ raue,

hydrophile Oberfläche mit einer hohen Dichte an funktionellen Gruppen, die eine

nachfolgende chemische Modifizierung zur Anbindung unterschiedlichster Biomoleküle

ermöglichen. Die Stabilität der dünnen pp-MA-Filme in wässriger Lösung wurde in

kinetischen SPR-Aufnahmen untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die dünnen pp-

MA-Filme trotz anfänglichem Materialverlust an unvernetzten Polymerfragmenten eine

stabile, kompakte Struktur aufweisen. Eine Vergleichsanalyse µm-dicker pp-MA-Filme in

wässriger Lösung zeigte, dass die Stabilisierung der Filmstruktur auf einen

Schichtdickenbereich von unter 100 nm begrenzt ist. Im Gegensatz zu den dünnen Filmen

zeigten die µm-dicken Filme poröse Strukturen, die in wässriger Lösung gelartig aufquellen.

Die Abweichungen im strukturellen Aufbau dünner und dicker pp-MA-Filme konnten mit der

unterschiedlich langen Plasmaexpositionszeit erklärt werden.

In nachfolgenden SPR-Experimenten konnte die chemische Immobilisierung von Anti-CRP-

IgG-Molekülen und farbstoffmarkierter Anti-Maus-IgG-Moleküle auf der Oberfläche dünner

pp-MA-Filme in situ verfolgt werden. Bei der kovalenten Verknüpfung der Antikörper mit

den Carbonsäureresten der hydrolysierten pp-MA-Filme wurde sich der Aktivesterchemie

bedient. Hierbei wurden verschiedene Crosslinkerreagenzien getestet, unter denen ein auf

EDC und Sulfo-NHS-basiertes System in wässriger Lösung die besten Ergebnisse erzielte.

Die Stabilität des pp-MA/IgG-Systems wurde durch mehrstündiges Spülen mit

Detergenzlösung demonstriert. Aus der Simulation der Resonanzkurven geht hervor, dass die

angebundenen Antikörper eine statistisch orientierte Monolage ausbilden.

Die pp-MA/Anti-CRP-Biosensorplattfom kann in nachfolgenden Testversuchen auf ihre

Effizienz bei der Detektion von CRP untersucht werden. Bei der entwickelten Biosensorbasis

handelt es sich um einen Prototypen, welcher weiter ausbaufähig ist.

Optimierungsmöglichkeiten in Bezug auf Belegungsdichte und Orientierung der Antikörper

auf der pp-MA- Oberfläche wurden vorgestellt.

Kapitel 5 - Fazit

80

Die Weiterentwicklung der pp-MA/Anti-CRP-Biosensorplattfom bis hin zum

funktionierenden CRP-Biosensor erfordert noch viel Arbeit, die jedoch im Hinblick auf das

hohe Anwendungspotential des Sensors im medizinischen Bereich lohnenswert ist.

81

6 Danksagung

In erster Linie gilt mein herzlichster Dank meinem Professor, Wolfgang Knoll, für die

freundliche Ermöglichung dieser Arbeit in seinem Arbeitskreis. Im Folgenden möchte ich

mich bei meiner Projektleiterin, Renate Förch, bedanken, für ihre Unterstützung und

Motivation und ihr jederzeit offenes Ohr für meine vielen Fragen und das schnelle

Korrekturlesen dieser Arbeit.

Weiterhin möchte ich mich bei Natalie Horn und Bernhard Menges für ihre Geduld und

Hilfestellung beim SPR-Messen sowie bei der Interpretation und Auswertung meiner

Ergebnisse bedanken.

Sascha Pihan möchte ich insbesondere für die fachmännische Einführung in die

Plasmatechnik, die Messung meiner AFM-Proben und das Korrekturlesen meiner Arbeit

danken. Weiterhin möchte ich an dieser Stelle noch Matthias Tamm und Sabir Okba nennen,

die mir bei diversen „Justageproblemen“ geholfen haben. Andreas Unger möchte ich

insbesondere für die Beantwortung all meiner physikalischen Fragen, für das Korrekturlesen

und die Hilfestellung beim UV-VIS-Spektrometer danken.

Bei Alex Lotz möchte ich mich für seine Hilfe und Geduld beim Formatieren dieser Arbeit,

Andreas Scheller und Marcus Schmelzeisen für ihre freundliche Unterstützung bei der

Behebung diverser Netzwerkprobleme und Walter Scholdei für seine Hilfe beim FT-IR-

Messen bedanken.

Mein herzlichster Dank gilt der Knoll-Gruppe für die freundliche Aufnahme in ihren Kreis,

besonders den Mitgliedern der „Plasmon Kitties“ für den unvergesslichen Spaß unserer

Trainingseinheiten und natürlich der Plasma Gruppe für die nette Arbeitsatmosphäre und

einen unvergesslichen Aufenthalt in Hirschegg.

Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinen Eltern, Stefan, Anne und Edith für ihre

unermüdliche Geduld und Motivation und ihren Glauben an mich und mein Projekt.

82

7 Abkürzungsverzeichnis

Abb. : Abbildung

AFM : Atomic Force Microscope

CRP: C-reactive Protein

DC: Duty cycle

FT-IR-Spektroskopie: Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

HF-: Hochfrequenz-

IgG: Immunglobulin G

OWS: Optical Waveguide Spectroscopy

PECVD: Plasma enhanced Chemical Vapour Deposition

pp-HMDSO: plasmapolymerisiertes Hexamethyldisiloxan

pp-MA: plasmapolymerisiertes Maleinsäureanhydrid

SAM: Self-assembled-Monolayer

SPFS: Surface-Plasmon Field-enhanced Fluorescence Spectrocopy

SPRS: Surface Plasmon Resonance Spectroscopy

WaMS : Waveguide Mode Spectroscopy

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