Antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vitro und in ... · Salvarsans in die Therapie der...

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Aus der Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerb randverletzte,

Handchirurgiezentrum, Operatives Referenzzentrum fü r Gliedmaßentumore

der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannshe il – Universitätsklinik -

der Ruhr – Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. H. U. Steinau

Antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vitro

und in infizierten Brandwunden

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrad es der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr – Universität Bochum

vorgelegt

von Alexander Baraniskin

aus Donezk

2005

2

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Juniorprofessor Dr. med. Lars Steinsträss er

Korreferent: PD Dr. rer. nat. Anneliese Bohn

Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2007

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Inhaltsverzeichnis: Seite

1. EINFÜHRUNG

1. 1. Verbrennungen und ihre Folgen

1. 1. 1. Epidemiologie der Verbrennungen

1. 1. 2. Pathophysiologie des Verbrennungstraumas

1. 2. Haut ist das größte Immunorgan

1. 2. 1. Elemente der Immunantwort

1. 2. 2. Rolle des angeborenen Immunsystems nach

Verbrennungen

1. 3. Probleme der Antibiotikatherapie

1. 4. Antimikrobielle Peptide

1. 4. 1. Entdeckung der antimikrobiellen Peptide

1. 4. 2. Einteilung der antimikrobiellen Peptide

1. 4. 3. Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems

1. 4. 4. Klinische Studien mit antimikrobiellen Peptiden

1. 5 Humanes Histon

1. 4. 5. Histonproteine als weitere Effektormoleküle der angeborenen

Immunabwehr

1. 5. 2. Intranukleäre Aufgaben der Histonproteine

1. 5. 3. Funktionen des Histon H1

1. 6. Ziel dieser Studie

2. MATERIAL UND METHODEN

2. 1. Getestete Substanzen

2. 2. Verwendete Mikroorganismen

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Inhaltsverzeichnis: Seite

2. 3. In vitro Untersuchungen

2. 3. 1. Radiale-Diffusion-Verfahren

2. 3. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon-Verdünnungs-Verfahren

2. 3. 3. Hämolytische Aktivität des Histon H1.2

2. 3. 4. Zytotoxische Aktivität des Histon H1.2

2. 4. In vivo Untersuchung: Infiziertes Ratt enverbrennungsmodell

2. 5. Statistische Analyse

3. ERGEBNISSE

3. 1. In vitro Aktivität von Histon H1.2

3. 1. 1. Radiale-Diffusion-Verfahren

3. 1. 1. 1. Grampositive Bakterien

3. 1. 1. 2. Gramnegative Bakterien

3. 1. 1. 3. Pilze

3. 1. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon-Verdünnungs-Verfahren

3. 1. 3. Hämolytische Aktivität

3. 1. 4. Zytotoxische Aktivität

3. 2. In vivo Aktivität von Histon H1.2

4. DISKUSSION

5. ZUSAMMENFASSUNG

6. LITERATUR

7. DANKANSAGUNG

8. LEBENSLAUF

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Alexander Baraniskin Einführung

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1. EINFÜHRUNG

1. 1 Verbrennungen und ihre Folgen

1. 1. 1 Epidemiologie der Verbrennungen

Brandwunden zählen unter den traumatisch bedingten Verletzungsarten zu den

schwersten. In Deutschland erleidet alle siebzehn Sekunden ein Mensch eine

Brandverletzung. Im Raum der Europäischen Union werden statistisch jedes

Jahr ca. 3.500.000 Menschen Opfer einer thermischen Verletzung 26. Diese

Zahl erfasst lediglich die ärztlich versorgten Patienten, wobei die Dunkelziffer

vermutlich bei 10.000.000 im Jahr liegt 26. Allein in Deutschland sind jährlich

zwischen 6.000 und 10.000 Menschen von schwersten Verbrennungen

betroffen, davon sind ungefähr 2.000 Kinder 26. Ungefähr 700 Menschen

sterben jedes Jahr an den Folgen der Verbrennungen, wobei nicht die

Verletzungen selbst, sondern die Infektionen der Wunden durch

Mikroorganismen heutzutage immer noch das größte Mortalitätsrisiko bei

Schwerbrandverletzten darstellen 26.

Das Ausmaß der Schädigung durch die Verbrennung wird von der

Verbrennungstiefe und der Höhe bzw. der Einwirkungsdauer der Temperatur

bestimmt. Ist die intrakutan auftretende Wärme relativ niedrig, also geringer als

100 °C (z. B. bei Kontakt mit heißen oder ko chenden Flüssigkeiten sowie mit

Wasserdampf), so spricht man von einer Verbrühung. Eine Verbrennung ist

eine durch thermische Einflüsse, z.B. durch Flammenwirkung (900 °C mittlere

Flammentemperatur) ausgelöste schwere Schädigung der Haut und zum Teil

der darunter liegenden Geweben, mit nachhaltigen Auswirkungen auf den

gesamten Organismus 4,13.


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Die Haut ist aufgrund ihres hohen Wassergehaltes ein schlechter Wärmeleiter.

Allerdings erfolgt auch die Abgabe der einmal aufgenommenen Wärme

entsprechend langsam, so dass es zum Phänomen des "Nachbrennens"

kommt. Die Hitzeeinwirkung im Gewebe hält dabei wesentlich länger an, als

die Dauer der äußeren Einwirkung. Daraus resultiert, dass die thermische

Schädigung der Haut auch nach Beendigung der äußeren Hitzeeinwirkung

fortschreitet 66.

1. 1. 2 Pathophysiologie des Verbrennungstraumas

Eine Verbrennung löst gravierende pathophysiologische Veränderungen aus.

Aufgrund von Kapillarschädigung durch die lokale Brandverletzung bzw.

systemisch durch eine Freisetzung von vasoaktiven Mediatoren, z. B. von

Prostaglandinen, Kininen und Histaminen kommt es zu einer Permeabilitäts-

erhöhung für Moleküle bis 106 Dalton 4. Es entsteht ein massives Ödem mit

einem generalisierten, intravasalen Wasser-, Elektrolyt- und Proteinverlust.

Zusätzlich wird der Flüssigkeitsverlust durch Exsudation über die Wunden nach

außen verstärkt. Die intravasale Hypovolämie führt durch eine reaktive

Vasokonstriktion und Erhöhung der Blutviskosität zu einer Mikrozirkulations-

störung mit peripherer Minderperfusion und metabolischer Azidose 4,66.


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1. 2 Haut ist das größte Immunorgan

1. 2. 1 Elemente der Immunantwort

Die Verbrennung führt zur lokalen Zerstörung der Haut, die als ein großes

Immunorgan des Menschen eine wichtige Barriere zwischen Umwelt und

Körper darstellt. Das angeborene Immunsystem der Haut sorgt für eine

geringe Inzidenz von Infektionen und inflammatorischen Komplikationen bei

gesunden Hautoberflächenstrukturen und stellt die wichtigste Waffe der

epithelialen Abwehr dar 71. Es wird durch das thermische Trauma komplett

eliminiert.

In jüngster Zeit rückt das angeborene Immunsystem zunehmend in den

Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Das angeborene Immunsystem

ist das phylogenetisch ältere Immunsystem 39. Es stellt die erste, schnelle und

unspezifische Abwehr gegen Mikroorganismen dar.

Die Basis des angeborenen Immunsystems bilden die antimikrobiellen Peptide,

wie zum Beispiel Defensine und Lysozym (Tab I).

Medizinhistorisch ist Lysozym das Effektormolekül des angeborenen

Immunsystems welches erstmalig 1929 durch einen Zufall von dem

schottischen Wissenschaftler Alexander Fleming entdeckt und beschrieben

wurde. Als Alexander Fleming, der später auch das Penicillin entdeckte, eines

Morgens mit einem starken Schnupfen seine Agarplatten kontrollierte, fiel

versehentlich ein Tropfen Nasensekret auf eine Platte, die eine große Kolonie

einer Verunreinigung enthielt. Dort, wo das Sekret auf die Verunreinigung

getropft war, wurde die Kolonie heller. Fleming schloss aus dieser

Beobachtung, dass das Nasensekret eine Substanz enthalten muss, die diese

Bakterien lysieren kann 86.


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1963 wurde Lysozym von Canfield und von Jolles sequenziert und 1965 die

Struktur röntgenkristallographisch aufgeklärt 86.

Tabelle I: Bestandteile des angeborenen Immunsystems.

Elemente des angeborenen Immunsystems Beispiele

� anorganische Moleküle HCl, NO 39

� kleine organische Moleküle Fett-, Milchsäure 39

� antimikrobielle Peptide Defensin, Lysozym 62

� bindende Proteine Mannose-Bindende-Proteine 45,87

� Zytokine IL-10, IL-12 4

� Carbohydrate PGG-glucan 45,57

� Zellen Makrophagen, Neutrophile 62

Das angeborene Immunsystem der Haut verfügt über weitere mechanische,

chemische und biologische Mechanismen, um eine Invasion von pathogenen

Mikroben zu verhindern 62. Die Hornschicht und die Tight Junctions zwischen

den Hautzellen verkörpern ein physiologischerweise vorhandenes mechanisches

Hindernis gegen Erreger 71. Neben der mechanischen Barriere verfügt die Haut

über den so genannten Schutzmantel, der als eine natürliche, chemische

Permeabilitätsschranke dient. Es ist die interzelluläre Lipidschicht der Hornhaut,

die aufgrund ihres Gehaltes an Milch - und Fettsäuren einen niedrigen pH –

Wert von 5,5 aufweist 4. Die primär apathogene, symbiotische Hautflora

bewahrt ihrerseits das Hautorgan vor einer Besiedelung mit pathogenen

Keimen 13.


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Bei Insekten und Amphibien stellt das angeborene Immunsystem die

Hauptabwehr gegen Erreger dar. Höherentwickelte Spezies wie die Säugetiere

besitzen zusätzlich das phylogenetisch jüngere erworbene Immunsystem,

dessen Hauptkomponenten T- und B-Lymphozyten sind und das für die

spätere, spezifische Immunantwort zuständig ist 39. Nach Stimulation durch ein

Antigen oder durch T-Lymphozyten differenzieren sich B-Lymphozyten zu

Plasmazellen und sezernieren dann antigenspezifische Antikörper in das

umgebende Milieu. Damit das erworbene Immunsystem seine maximale Aktivität

entfalten kann, muss es beim Erstkontakt erst zur klonalen Expansion von B-

und T-Lymphozyten kommen, die Tage bis Wochen in Anspruch nimmt.

Infolgedessen steht das angeborene Immunsystem sowohl zeitlich als auch

räumlich vor dem erworbenen Immunsystem 71.

1. 2. 2. Rolle des angeborenen Immunsystems nach Verbrennungen

Die thermische Schädigung führt zum Kollaps des angeborenen Immunsystems

mit verminderter Produktion antimikrobieller Peptide, die als erste Hürde gegen

Mikroorganismen eine bedeutsame Rolle in der Vermeidung von

Wundkontaminationen spielen 31. Ortega untersuchte die Expression der

antimikrobiellen Peptide: der humanen Defensine 1 und 2 gesunder und

verbrannter Haut, und stellte fest, dass in der verbrannten Haut keine

Defensine mehr vorkommen 49.

Die großflächige Zerstörung der Hautbarriere bei Schwerbrandverletzten führt in

der Regel zur Kolonisierung der Wundfläche mit pathogenen Mikroorganismen.

Zur Entstehung von systemischen Infektionen kommt es durch die hämatogene

Invasion von Mikroorganismen aus einer lokalen Infektionsquelle.


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Die Freisetzung der Erregerbestandteile und Toxine löst eine

Mediatorenkaskade aus, die zum Versagen der Organsysteme und damit zum

fulminanten septischen Schock führen kann. Aus diesem Grund ist die

großzügige Nekrektomie der verbrannten Areale mit anschließender

Spalthauttransplantation derzeit der Goldstandard in der klinischen Versorgung

von Schwerbrandverletzten. Eine erfolgreiche Spalthauttransplantation ist jedoch

nur dann möglich, wenn die Haut weniger als 106 Bakterien pro Gramm

Gewebe enthält 75.

Die Letalitätsrate bei Schwerbrandverletzten mit systemischen Infektionen liegt

in Europa zwischen 50 und 75 Prozent, abhängig vom Schweregrad der

Verbrennung und vom Alter der Betroffenen 13. Bei Patienten, die zusätzlich

ein Lungenversagen (ARDS) erleiden, steigt die Letalitätsrate auf bis zu 90

Prozent 13.

1. 3. Probleme der Antibiotikatherapie

Von einer gezielten Chemotherapie gegen Infektionen wurde erstmals 1630

aus Peru berichtet, wo Eingeborene Malaria erfolgreich mit der Rinde des

Chinabaums behandelten. Den ersten Erfolg im Bereich der antibakteriellen

Therapie schaffte Paul Ehrlich (1854 – 1915) mit der Einführung des

Salvarsans in die Therapie der Syphilis. Den Durchbruch in der Therapie der

bakteriellen Infektionen erzielte der Bakteriologe Alexander Fleming (1881 -

1955) mit der Entdeckung des Penicillins, eines Wirkstoffes, der aus einem

Schimmelpilz gewonnen wird.


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Die entzündungshemmende Wirkung von Schimmelpilzen war früher schon im

alten Ägypten bekannt. Dort versorgte man Wunden mit verschimmeltem Brot.

Dieses Wissen ging aber im Laufe der Zeit wieder verloren, bis am 5.

September 1928 Alexander Fleming eine erstaunliche Entdeckung machte: in

einer Petrischale, in der er den Schimmelpilz "Penizillium notatum" züchtete,

waren ringsum alle Bakterien abgestorben. Auf diese Weise wurde das

Penicillin entdeckt. Erst 13 Jahre später im Jahre 1941 folgte der erste

dokumentierte Einsatz des Penicillin bei einem Menschen durch den

englischen Arzt Charles Fletcher. Während des zweiten Weltkrieges avancierte

Penicillin schlagartig zum "Wundermittel" bei stark infizierten Verwundungen,

das Tausenden von Soldaten das Leben rettete 39,85. 1935 gelang dem

Biochemiker Gerhard Domagk (1895 – 1964), Professor an der Universität

Münster, ein weiterer Durchbruch. Er fand heraus, dass der orangene

Farbstoff Prontosil wirksam gegen die gefürchteten Streptokokkeninfektionen ist.

Aus dem Farbstoff wurden bald die noch heute eingesetzten Sulfonamide

entwickelt. Die Einführung der Antibiotika revolutionierte die Medizin. Sie

erlaubte sowohl die Behandlung von Infektionen als auch den präventiven

Einsatz dieser Medikamente zur Infektionsprophylaxe 86.

Die Breitbandantibiotika sind in der nachfolgenden Zeit übermäßig und oft

unnötig eingesetzt worden. So wurden in den USA im Jahr 1995 4,1 kg

Antibiotika pro 100 Personen verschrieben 38. Dies führte zur Entstehung und

rasanten Verbreitung multiresistenter Keime. Der Einsatz von

Breitbandantibiotika führt durch das Abtöten aller nicht resistenten Keime zur

Selektion der resistenten, die aufgrund der verringerten intraspezifischen

Konkurrenz verbesserte Wachstumsbedingungen mit vielen Nährstoffen und viel

Raum erhalten.


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Laut den Daten aus dem National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS)

System Report von 2003 sind der multiresistente Pseudomonas aeruginosa,

der Methicillin - resistente Staphylococcus aureus (MRSA) und die Vancomycin -

resistenten Enterococci (VRE) die gefährlichsten Erreger von nosokomialen

Infektionen. Mehr als die Hälfte der Staphylococcus aureus - Keime der

Intensivstationen in den USA sind Methicillin – resistent (Tab. II).

Durch den rapiden Anstieg der Resistenzen gegen die klinisch angewandten

Antibiotika (Tab II) sind unsere Chancen, die Verbreitung der multiresistenten

Keime mit Hilfe von Antibiotika einzuschränken, gesunken. So steigt die

Resistenzrate von Staphylococcus aureus gegen Methicillin nach Angaben des

NNIS System Report jährlich um 29 %, von Enterococcus spp gegen

Vancomycin um 31 % und von Pseudomonas aeruginosa gegen Ciprofloxacin

sogar um 53 % (Tab. II).

Auch in den deutschen Kliniken bleiben infizierte Brandwunden trotz

intensivmedizinischer Fortschritte und der Entwicklung neuer Antibiotika ein

ernsthaftes Risiko mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten für den

Schwerverbrannten. Die anzutreffenden Mikroorganismen sind zunehmend

resistent gegen Lokalantibiotika wie z. B. Flammazine, Mafenide oder

Gentamicin, die seit 1960 unverändert in der Klinik eingesetzt werden 70.

Seit 1950 ist der Verbrauch von Penicillin pro therapierte Infektion um das

fünffache gestiegen 4. Durch die rapide Resistenzentwicklung entstehen

zusätzliche gravierende Folgen für die Klinik: aufgrund der Übertragungsgefahr

auf MRSA - negative Patienten müssen MRSA - positive Patienten in isolierte

Einzelzimmer verlegt werden.


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Dieser Umstand und der durch die multiresistenten Keime verursachte längere

Krankenhausaufenthalt stellen ein immenses sozioökonomisches Problem dar,

verbunden mit einer höheren Patientenmorbidität.

Tabelle II: Anteil der resistenten Keime an den Erregern, die den größten Teil

der Wundinfektionen auf Intensivstationen verursachen, und Anstieg der

Resistenzen innerhalb eines Jahres nach den Daten des NNIS System Report

(USA) vom Juni 2002.

In deutschen Kliniken kostet die Behandlung eines Schwerbrandverletzten

nämlich zwischen 3.500 und 4.500 Euro pro Tag und allein in der

Universitätsklinik Bergmannsheil in Bochum beliefen sich die Kosten für die

Versorgung von Schwerbrandverletzten im Jahr 2003 auf 5,3 Millionen Euro.

Erreger Antibiotikum Anteil der Resistenzen (%)

Resistenzsteigerung innerhalb 2000 (%) (N)

Staphylococcus aureus Methicillin 51,5 29 (5070)

Koagulase-negative

Staphylococci Methicillin 75,5 1 (5622)

Ciprofloxacin, Ofloxacin

36,3 53 (2530) Pseudomonas

aeruginosa Imipenem

19,6

23 (1848)

Enterococcus spp Vancomycin 12,8 31 (2575)

Enterobacter spp Ceftacidim, Ceftriaxon, Cefotaxim

26,3 -1 (1811)


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Das Center for Disease Control and Prevention in den USA schätzte, dass im

Jahr 2002 in den Vereinigten Staaten rund 5 % aller stationären Patienten an

nosokomialen Infektionen litten, die jährliche Kosten von 4,5 Milliarden Dollar

verursacht haben 78. Die rasche Zunahme und Verbreitung der multi-resistenten

Bakterien und Pilze stellt ein alarmierendes und globales Problem dar, das die

Suche nach alternativen Therapiemöglichkeiten zwingend notwendig macht.

Die Entwicklung neuer Antibiotika scheint in der letzten Zeit zu stagnieren. In

den letzten Jahrzehnten wurden keine neuen Klassen von Antibiotika

eingeführt. So sind beispielsweise neue Dritt- und Viertgenerations-

cephalosporine (z.B. Cefixim, Cefpodoxim, Ceftibuten), Imipenem und neue

Fluorochinolone (z.B. Lomefloxacin, Gatifloxacin) lediglich Derivate älterer

Grundsubstanzen 13. Die Entwicklung neuer Antibiotika ist äußerst

kostenintensiv: 500 Millionen US$ pro erfolgreiches Medikament, und ebenso

zeitaufwendig. 10 – 15 Jahre vergehen in den meisten Fällen bis zur

Zulassung für die Food and Drug Administration (FDA) 79. Für die

Pharmaindustrie bedeutet das hohe Risiken bei den Investitionen 79. Ein

Therapieansatz, der in den letzten Jahren zunehmend verfolgt wird, sind die

Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems.


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1. 4 Antimikrobielle Peptide

1. 4. 1 Entdeckung der antimikrobiellen Peptide

Auf der Suche nach neuen Technologien macht man sich zunehmend die

Natur zum Vorbild und Ideengeber. Zum Bespiel wurde die Technologie der

Hochhäuser Pflanzen nachempfunden, die der Hubschrauber Insekten. Auch

die medizinische Forschung lässt sich gerne durch Beobachtungen der Natur

inspirieren. Beispielsweise wurde bemerkt, dass Frösche keine Hautinfektionen

bekommen, obwohl sie in einem Milieu leben, das von Bakterien und Pilzen

überfüllt ist. Rinder verletzen sehr oft ihre Zungen durch Äsen scharfer Gräser

und dennoch kommt es niemals zu Infektionen. Angeregt durch diese

Phänomene entdeckte erstmals 1979 Hans Boman aus Stockholm bei der

Seidenraupe natürlich vorkommende Peptide, die antibakterielle Eigenschaften

besaßen. 1987 beobachtete dann Michael Zasloff in den USA, dass

frischoperierte Laborfrösche, die in einen schlammigen Teich gesetzt wurden,

keine Wundinfektionen aufwiesen und keiner Antibiotika zur Wundheilung

bedurften 62. Als man ihnen aber einen Hautlappen entfernte, starben sie

innerhalb von Stunden an einer Wundinfektion. Es lag die Vermutung nahe,

die intakte Haut müsse etwas enthalten, das sie vor Infektionen schützt.

Daraufhin ist es M. Zasloff gelungen, aus Froschhaut ein antimikrobielles

Peptid zu isolieren, das als „Magainin“ (hebräisch: Schutzschild) bezeichnet

wurde 89. Magainin ist auch das erste antimikrobielle Peptid, das in einer

klinischen Studie getestet wurde.

Seitdem wurden mehr als 700 weitere antimikrobielle Peptide aus diversen

Spezies isoliert, z. B. aus Pflanzen, Insekten, Reptilien, Fischen und Säugern.


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1. 4. 2 Einteilung der antimikrobiellen Peptide

Man kann eine Unterteilung der antimikrobiellen Peptide anhand der Sekundär-

struktur vornehmen. Unterschieden werden soll dabei zwischen Peptiden, die

ausschließlich aus linearen α–Helices aufgebaut sind und solchen, deren

wesentliches Strukturmerkmal die β–Faltblattkonfiguration darstellt.

So besitzen unter anderem die Magainine und das Peptid LL-37 / hCAP-18

eine α - Helixstruktur. LL-37 / hCAP-18 ist ein Peptid mit 37 Aminosäuren, das

erst 1995 charakterisiert wurde und durch die Spaltung des humanen

Cathelicidins entsteht 35. Cathelicidin wurde 1989 erstmals isoliert 60. Beim

Menschen konnte dieses Peptid aus neutrophilen Granulozyten und

Keratinozyten isoliert werden 62.

Im Wesentlichen aus β-Faltblattanordnungen aufgebaut sind dagegen Protegrine

und Defensine. Protegrine sind Peptide mit 18 Aminosäuren, die 1993 aus

Schweineleukozyten isoliert wurden und in vitro eine hohe antimikrobielle

Aktivität zeigten 67,73. Die Defensine, die beim Menschen vorkommen, entdeckte

1995 eine Arbeitsgruppe des Peptidforschungsinstituts in Hannover 62. Sie

bestehen aus 29 bis 40 Aminosäuren und konnten aus neutrophilen

Granulozyten, CD8 T-Lymphozyten, Paneth-Zellen des Dünndarms sowie aus

Epithelien des Urogenital- und des Respirationstraktes isoliert werden 62.

1. 4. 3 Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems

Als essentieller Bestandteil des angeborenen Immunsystems von Vertebraten

besitzen die antimikrobiellen Peptide neben ihrer direkten antimikrobiellen

Funktion auch andere Aufgaben.


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Eine Funktion der antimikrobiellen Peptide ist die Aktivierung des erworbenen

Immunsystems, wodurch sie als Vertreter der angeborenen Immunabwehr eine

Verknüpfung zwischen den beiden Immunsystemen herstellen 31. LL37 und

humane Defensine locken T-Lymphozyten, reife dendritische Zellen und

Monozyten zum geschädigten Gebiet und stimulieren T-Lymphozyten zur

Freisetzung von inflammatorischen Substanzen wie Interferon–γ, Interleukin-10

(Il-10) und Interleukin-6 (IL-6) 31. Außerdem haben humane Defensine und

LL37 die Eigenschaft Lipopolysaccharid (LPS) zu binden, welches ein

Bestandteil der Zelloberfläche gramnegativer Bakterien ist und als Endotoxin

wirkt 72. Durch diese Bindung wird LPS neutralisiert und die Gefahr des fatalen

septischen Schocks reduziert. 31.

PR-39, ein Cathelizidin aus den neutrophilen Granulozyten des Schweins,

stimuliert die Angiogenese durch eine Verlangsamung der Eliminierung des

Hypoxie-induzierten Faktors (HIF-1α). Dieser Faktor führt wiederum zu einer

erhöhten Expression von angiogenesestimulierenden Faktoren, wie zum Beispiel

des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) 31. Zusätzlich sind die

antimikrobiellen Peptide in der Lage die Wundheilung zu beschleunigen 2.

Bei einer Klasse der antimikrobiellen Peptide wurde auch eine antivirale

Wirkung nachgewiesen: Zhang zeigte in seiner Studie, dass die α-Defensine 1-

3 zur längeren Überlebenszeit von HIV-Infizierten beitragen. Diese Wirkung

wird auf die Blockade von CCR-5 Rezeptoren zurückgeführt, die von HIV-Viren

zum Eintritt in die Zielzellen benutzt werden 92.

Bei Haien scheinen die hochpotenten antimikrobiellen Peptide die Fähigkeit zu

besitzen, entartete Zellen zu zerstören. Dies führt zu einem sehr seltenen

Auftreten von Krebskrankheiten bei diesen Lebewesen 16,29.


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1. 4. 4 Klinische Studien mit antimikrobiellen Peptiden

Mehrere Abkömmlinge der antimikrobiellen Peptide Magainin und Protegrin-1

werden derzeit in klinischen Studien getestet. In einer bereits abgeschlossenen

Studie zeigte ein Abkömmling des Magainin, Pexiganan, dessen topische

Anwendung an polymikrobiellen diabetischen Ulzera getestet wurde, die gleiche

Wirkung wie das oral applizierte Antibiotikum Ofloxacin, bei fehlenden Neben-

wirkungen (Locilex; Magainin Pharmaceuticals Inc., Plymouth Meeting,

Pennsylvania, USA). Diese Studie wurde jedoch von der Food and Drug

Administration (FDA) nicht zugelassen, weil das orale Antibiotikum bei den

diabetischen Ulzera aufgrund erheblicher Minderperfusion kaum seine Wirkung

entfalten kann.

Protegrine sind Peptide, die im Vergleich zu anderen antimikrobiellen Peptiden

eine hohe antimikrobielle Aktivität zeigen, wobei sie gleichzeitig eine starke

hämolytische Wirkung aufweisen 69,70.

1. 5 Humanes Histon

1. 5. 1. Histonproteine als weitere Effektormoleküle der angeborenen

Immunabwehr

Die Gemeinsamkeit aller antimikrobiellen Peptide ist die positive Ladung. Diese

Eigenschaft ist verantwortlich für die Assoziation der Peptide mit der negativ

geladenen Bakterienmembran und für das darauf folgende Abtöten des

Erregers. Weitere beim Menschen physiologischerweise vorkommende

kationische Proteine sind Histonproteine.


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In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass Histonproteine eine Rolle in

der epithelialen Abwehr spielen und eine weitere Gruppe der Effektormoleküle

der angeborenen Immunabwehr bilden 61. Im Gegensatz zu antimikrobiellen

Peptiden kommen Histonproteine ausnahmslos in jeder eukaryotischen Zelle

vor. Die bisher entdeckten humanen antimikrobiellen Peptide werden nur von

bestimmten Zellarten produziert, und zwar von neutrophilen Granulozyten und

Epithelien der Haut, des Darms, des Urogenital – und des Respirationstraktes

62.

1. 5. 2. Intranukleäre Aufgaben der Histonproteine

Histone sind relativ kleine basische Proteine (21 kDa), die 1946 erstmals von

Stedman E. beschrieben wurden 27. Histonproteine sind ein Bestandteil von

jedem eukaryotischen Zellkern. Sie sind involviert in die hochorganisierte

Struktur der Nukleosomenpartikel, der untersten Organisationsebene des

Chromatins. Die positive Ladung ermöglicht es den Histonen sich fest an die

DNA, die stark negativ geladen ist, zu binden, unabhängig von deren

Nukleotid - Sequenz. Histone dissoziieren nur selten von der DNA, und deshalb

haben sie auf jede Reaktion, die am Chromosom stattfindet, einen Einfluss.

Eine 1,8 – fache DNA – Schleife (146 Basenpaare lang) windet sich um das

Oktamer herum, das aus jeweils zwei Molekülen von jedem der folgenden

Kern – Histone gebildet wird: H2A, H2B, H3 and H4 56,74. Die Verbindung der

Kern - Histone mit der DNA ermöglicht die DNA - Kondensation. Das Histon H1

verschließt gewissermaßen das Nukleosom (Abb. 1) und trägt zusätzlich zur

Kompaktheit der DNA - Organisation bei 9,46.


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1

Diese Struktur des Nukleosoms ermöglicht die Chromosomenteilung in der

Meiose und Mitose. Zusätzlich verstärkt sie den Polymorphismus der DNA–

Struktur 10. Mit Ausnahme des Histon H4 sind bei allen Histon-Klassen

mehrere Subgruppen bekannt 1.

Abbildung 1: Ein stark vergrößerter

Ausschnitt der Chromatinstruktur. In dieser

Abbildung sieht man die DNA (1), die um

die Nukleosome (2) gewunden ist. Die Nukleosome

bestehen aus den Histonen H2A, H2B, H3 und H4 und sind wiederum

spiralförmig um das Histon H1 (3) organisiert, das in unserer Studie unter-

sucht wurde. Histon H1 verschließt gewissermaßen das Nukleosom.

Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen, dass Histone eine Schlüsselrolle in der

Genregulation spielen. Im euchromatischen Grundzustand sind die Histone

acetyliert. Angelagerte Acetyl - Gruppen, die sauren Charakter haben, verringern

die positive Ladung der basischen Histone, was dazu führt, dass die Faltung

der DNA durch die lockereren Bindungen „aufgeweicht“ wird. Damit wird die

Genexpression erleichtert, da die Transkriptionsenzyme in der lockeren DNA –

Struktur viel leichter ansetzen können.

1 3

3


21

Die Methylierung der Histone lockt hingegen die Deacetylasen an, was zum

Verlust der Acetyl – Gruppen führt, sodass die Histone eine positivere Ladung

erhalten. Die Bindung zwischen Histonen und DNA wird stärker, wodurch die

Genexpression erschwert wird 15,30,34,46,82. Es konnte gezeigt werden, dass

Methyltransferasen zur Tumorsuppression beitragen und ihr Mangel mit einer

erhöhten Tumorinzidenz einhergeht 82. Eine Minderung der Deacetylasen und

eine verstärkte Acetylierung führen zur Kortikosteroidresistenz bei chronisch

entzündlichen Krankheiten und bei COPD 3,40, zur erhöhten Lungenkrebs-

inzidenz und zur Verstärkung der kardialen Remodeling – Prozesse 41,76.

Außerdem erfüllen die Histone für die DNA eine wichtige Schutzfunktion.

Obwohl die DNA außen um die Histone gewickelt ist, wird sie nicht von

Nukleasen abgebaut. DNasen können nur an den Abschnitten zwischen den

Nukleosomen angreifen, die durch die Histone nicht geschützt sind 47,77.

1. 5. 3. Funktionen des Histon H1

Das Histon H1 repräsentiert die am stärksten heterogene Klasse der

Histonproteine. In den somatischen Zellen der Säuger sind bisher sechs

unterschiedliche H1 - Subtypen identifiziert worden, deren Länge zwischen 210

und 230 Aminosäuren beträgt 52. Fünf davon haben eine hochkonservierte

zentrale, globuläre Domäne. Die C- und N- Enden zeigen eine Mikrohetero-

genität, die zur Multifunktionalität dieses Proteins beiträgt 20.

Eine andere intranukleäre Funktion des Histon H1 ist die von Wolffe gezeigte

Regulation der Genexpression 14,20,64,85,89. Es gibt immer mehr Hinweise dafür,

dass Histone zu einer Proteingruppe gehören, die an multiplen biologischen

Prozessen teilnimmt: sowohl an intrazellulären, als auch an extrazellulären.


22

Das rekombinante humane Histon H1° und H1.2 offenbart eine relativ starke

toxische Wirkung gegenüber Zelllinien von entarteten humanen leukämischen

Zellen 12,54. Daraufhin wurde von Class gezeigt, dass das aus dem Rind

isolierte Histon H1 in der Lage war, das Tumorwachstum in vivo zu

supprimieren 12. Beim extrazellulären Histon H1 handelt es sich um ein

Thyreoglobin – bindendes Protein, das an der Oberfläche von Makrophagen zu

finden ist und die Endozytose des Thyreoglobulins vermittelt 9.

An der Zelloberfläche befindliche Histone stellen außerdem ein potentielles Ziel

für die Autoantikörper bei Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes

(SLE) dar 26,32,44,83. Sie sind darüber hinaus in die Pathogenese mehrerer

anderer autoimmuner Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Diabetes mellitus

und rheumatoide Arthritis involviert 36,43,50. Weitere bereits entdeckte Funktionen

des Histon H1 sind die Stabilisierung der Mikrotubuli in den Geißeln von

Seebengeln 44 und der Schutz gegenüber einer Infektion mit dem Parasiten

Leishmania major bei Mäusen 65. Bolton zeigte eine Up - Regulation des

Histonproteins H1 bei Scrapies und bei der Alzheimerschen Krankheit 6.

1. 6. Ziel dieser Studie.

Im Rahmen dieses Forschungsvorhabens wurde das antimikrobielle Potential

des humanen Histonproteins H1.2 in vitro und in vivo charakterisiert. In vitro

wurde die antimikrobielle Aktivität gegen klinisch isolierte Bakterien- und

Pilzstämme getestet. Zusätzlich wurden sowohl die hämolytische als auch die

zytotoxische Wirkung des Histonproteins H1.2 in epithelialen Zellen analysiert.

Für die in vivo Untersuchung wurde ein mit Pseudomonas aeruginosa

infiziertes Rattenverbrennungsmodell verwandt.

Alexander Baraniskin Material und Methoden

23

2. MATERIAL UND METHODEN

2. 1. Getestete Substanzen

Das humane Histon H1.2, das in den durchgeführten Experimenten verwendet

wurde, stellte uns Strathmann Biotec GmbH, Hamburg, Deutschland

freundlicherweise zur Verfügung. Es wurde rekombinant in Escherichia coli

BL21 (DE3) hergestellt. Aus den Zellüberständen der Bakterien wurde die

Histon H1.2 enthaltende Schicht mittels 0,75 M Perchlorsäure extrahiert und

durch eine 0,45 µm Zellulosemembran (Satorius, Göttingen, Germany) filtriert.

Weitere Purifikation erfolgte mit Hilfe der Umkehrphasen – HPLC (high

performance liquid chromotography). Als stationäre Phase wurde die C18 –

Phase verwendet. Die Kieselpartikelgröße betrug 5 µm. Als mobile Phase

diente 0,1 % Trifluoressigsäure mit Methanol. Die Reinheit der Histonfraktion

wurde mit SDS – Page nach Laemmli 33 und mittels der Umkehrphasen – HPLC

mit Vydac 218TP54 bestimmt. Die erreichte Homogenität betrug 98 %.

Histon H1.2 wurde mit dem antimikrobiellen Peptid Protegrin-1 verglichen. Das

verwendete Protegrin-1 wurde bei Dr. Henklein, Charité, Institut für Biochemie

der Humboldt – Universität Berlin, Deutschland synthetisiert. Die Peptidsynthese

wurde nach der Fmoc (9 – fluorenylmethoxycarbonyl) - Methode in Lösung

durchgeführt. Die Purifikation erfolgte mittels der Umkehrphasen – HPLC. Als

stationäre Phase diente die C18 – Phase. Als mobile Phase wurde 0,1 %

Trifluoressigsäure mit Acetonitril verwendet. Die Reinheit wurde mit der

Umkehrphasen – HPLC charakterisiert.


24

2. 2. Verwendete Mikroorganismen

Elf Bakterienstämme wurden in den in vitro Untersuchungen verwendet. Acht

der Stämme sind ATCC (American Type Culture Collection) - und DSMZ

(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) - gelistet:

Staphylococcus aureus (ATCC 25923; DSMZ 1104); Staphylococcus

epidermidis (ATCC 12228; DSMZ 1798); Enterococcus faecalis (ATCC 29212;

DSMZ 2570;) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853; DSMZ 1117);

Escherichia coli (ATCC 25922; DSMZ 1103); Proteus mirabilis (ATCC 29906;

DSMZ 4479); Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031; DSMZ 681) und

Acinetobacter baumanii (ATCC 19606; DSMZ 30008). Ein klinisches Isolat von

C-MRSA wurde freundlicherweise von Prof. Sören Gatermann, Institut der

Mikrobiologie, Ruhr-Universität, Bochum zur Verfügung gestellt. Drei

Bakterienisolate von Pseudomonas aeruginosa aus menschlichen Brandwunden

erhielten wir von der Universitätsklinik der Plastischen Chirurgie, BG Kliniken,

Bergmannsheil, Ruhr-Universität, Bochum. Für das „Infizierte

Rattenverbrennungsmodell“ wurde Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853;

DSMZ 1117) verwendet.

Vier Pilzstämme wurden in dem Radiale – Diffusion - Verfahren eingesetzt:

Candida albicans (ATCC 24433; DSMZ 11948); Candida albicans (ATCC 9928;

DSMZ 11984); Candida parapsilosis (ATCC 22019; DSMZ 5784); und Candida

krusei (ATCC 6258; DSMZ 6128).


25

2. 3. In vitro Untersuchungen

2. 3. 1. Radiale - Diffusion - Verfahren (Radial Diffusion Assay / RDA)

Die Bestimmung der minimalen effektiven Konzentration (MEC) wurde mittels

eines modifizierten zweilagigen Radiale – Diffusion - Verfahrens (RDA) durch-

geführt 67.

Zur Vermehrung der verwendeten Bakterien wurden 100 ml Trypticase Soya

Bouillon (TSB) (Unipath Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) mit einer einzelnen

Kolonie des zu verwendeten Bakteriums beimpft und für 18 – 24 Stunden bei

37°C im Wasserbad (B. Braun Melsungen AG, Me lsungen, Deutschland) unter

Schütteln (200 rpm) inkubiert. Daraufhin wurden 500 µl der Kultur mit

Bakterien, die sich in der stationären Phase befanden, mit 50 ml frischem

TSB für 2,5 Stunden bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert.

Die Subkultur wurde in ein 50 ml – Falcon - tube übertragen und für 15 min.

bei 880 x g, bei 4°C zentrifugiert (Megafuge 3OR, Heraeus Instruments GmbH,

Hanau, Deutschland). Das Bakterienpellet wurde danach in kaltem 10 mM

Phosphatpuffer (J.T.Baker, Deventer, Niederlande), pH 7,4 gewaschen (für 15

min. bei 880 x g, bei 4°C) und in 5 ml des gleichen kalten Puffers

resuspendiert. Daraus wurde 1 ml entnommen, um über die Messung der

optischen Dichte (UV – V – IS - Spektrometer, Perkin Elmer 555, Boston,

Massachusetts, USA) (OD) bei 620 nm die Konzentration der Bakterien oder

Pilze mit folgender Gleichung zu ermitteln:


26

Colony forming Units / ml = OD620nm x 2,5 x 108 (Bakterien)

Colony forming Units / ml = OD620nm x 0,5 x 108 (Pilze)

(Um die Bakterienkonzentration in einem definierten Probenvolumen zu

quantifizieren setzt man die Anzahl der nach der Inkubation entstandenen

Kolonien: CFU = colony forming units bzw. KBE = koloniebildende Einheiten in

Verhältnis zum ausgeimpften Probevolumen (ml) : Colony forming unit / ml)

Aus der errechneten Konzentration konnte das Volumen ermittelt werden, das

2 x 107 CFU Bakterien oder Pilze enthält und das mit dem Unterlage - Agar

für eine Platte gemischt wurde. Der sterile, geschmolzene Unterlage – Agar

besteht aus 1 % (w / v) Agarose (Agarose NEEO Ultra-Qualität, Carl Roth

GmbH, Karlsruhe, Deutschland). Fünfzehn ml Unterlage – Agar, der auf 45 -

50°C vorgewärmt wurde, wurden in ein Falcon - tube gegeben, mit 2 x 107

CFU Bakterien oder Pilzen beimpft und 15 s gemischt. Danach wurde das

Gemisch vom Unterlage – Agar mit der Bakterien – oder Pilzsuspension in einer

Petrischale (9 x 9 cm) (Greiner-Bio-one, Kremsmünster, Österreich) auf einem

Nivelliertisch gleichmäßig verteilt (1,3 mm Schicht) (Abb. 2). Die Schale wurde

für 30 min. bei 4°C kaltgestellt, damit der Agar sich verfestigt.

Anschließend wurden mit einem Stempel neun (3 x 3) Löcher in den Agar

gestanzt. Die Löcher hatten einen Durchmesser von 3 mm und eine Kapazität

von ungefähr 8 µl. In diese Vertiefungen wurden 5 µl der vorbereiteten

verdünnten Peptidlösung gefüllt. Die gereinigten Peptide wurden mit einer 0,01 %

Essigsäure (J.T.Baker, Deventer, Niederlande) zu folgenden Konzentrationen

seriell verdünnt: 250 µg / ml, 79,1 µg / ml, 25 µg / ml, 7,91 µg / ml, 2,5 µg / ml,

0,791 µg / ml und 0,25 µg / ml.


27

Sieben der neun Vertiefungen wurden mit den sieben Peptidkonzentrationen

gefüllt, eine Vertiefung mit einem gegen die entsprechenden Erreger

eingesetzten Antibiotikum bzw. Antimykotikum als Positivkontrolle und eine mit

der 0,01 % Essigsäure als Negativkontrolle. Die Antibiotika wurden in

folgenden Konzentrationen verwendet: Ampicillin (Carl Roth GmbH, Karlsruhe,

Deutschland) in 2 mg / ml; Vancomycin (Eli Lilly Company, Indianapolis,

Indiana, USA) in 6 ml / ml; Imipenem (Merck&Co KGaA, Darmstadt,

Deutschland) in 2 mg / ml und das Antimykotikum Amphotericin B (Carl Roth

GmbH, Karlsruhe, Deutschland) in der Konzentration von 2 mg / ml (Abb. 2).

Abbildung 2: Radiale – Diffusion – Verfahren – Testplatte von E. coli bei der

Histon H1.2 – Testung: 1 – 250 µg / ml, 2 - 79,1 µg / ml; 3 – 2 µg / ml; 4 - 7,91 µg /

ml; 5 - 2,5 µg / ml; 6 - 0,791 µg / ml; 7 - 0,25 µg / ml; S - 0,01 % Essigsäure

(Negativkontrolle); A – Ampicillin (Positivkontrolle).


28

Die Platten wurden für 3 Stunden bei 37°C i nkubiert. Danach wurde der

vorgewärmte sterile Auflage – Agar (10 ml) darübergegossen und gleichmäßig

verteilt. Der nährstoffreichere Overlay – Agar besteht aus 6 % Trypticase Soya

Bouillon Pulver, 1 % Agarose und 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7.4).

Nach Verfestigung des Agars wurden die Petrischalen bei 37°C über 16 – 18

Stunden inkubiert (Heraeus, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland).

Am nächsten Tag wurden die entstandenen Hemmhöfe mit Hilfe eines

Millimeter – Lineals mit einer Genauigkeit bis auf 0,1 mm ausgemessen.

Danach wurden 3 mm als Durchmesser der gestempelten Löcher vom

Durchmesser der entstandenen Hemmhöfe subtrahiert (Abb. 2). Die Ergebnisse

wurden an einer semi - logarithmischen Skala dargestellt und mit Hilfe der

linearen Regressionsanalyse die Schnittpunkte mit der X – Achse ermittelt.

Diese Schnittpunkte entsprechen der minimalen effektiven Konzentration (MEC).

Alle Bestimmungen wurden als Triplikate durchgeführt.

2. 3. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs - Verfahren

Die Bestimmung der minimalen inhibitorischen (MIC) und bakteriziden

Konzentration (MBC) wurde mittels Modifiziertem NCCLS (National Committee

for Clinical standards) Mikrobouillon – Verdünnungs - Verfahren durchgeführt

(Modified Microbroth dilution Assay) 65.

Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des

National Committee for Clinical standards (NCCLS) ausgeführt. Die einzige

vorgenommene Veränderung ist der Ersatz von Trypticase - Soya - Bouillon

durch Müller - Hinton - Bouillon (Merck GmbH, Hohenbrunn, Deutschland) bei

der Vorbereitung des Bakterieninokulates.


29

Zur Vermehrung der verwendeten Bakterien wurde eine einzelne Kolonie des

zu verwendeten Bakteriums in 50 ml Müller – Hinton – Bouillon für 18 - 24

Stunden bei 37°C im Wasserbad (B. Braun Melsu ngen, Melsungen

Deutschland) schüttelnd (200 rpm) inkubiert. Daraufhin wurde eine 1 : 20

Verdünnung der Kultur in 1 ml frischen Müller - Hinton – Bouillon durchgeführt.

Es folgte die Messung der optischen Dichte (UV – V – IS - Spektrometer, Perkin

Elmer 555, Boston, Massachusetts, USA) bei 600 nm. Die benötigte Menge

der Bakteriensuspension wurde folgendermaßen errechnet:

OD600nm x n CFUs 7ml / 0,2 = Colony forming Unit / ml

(CFU / ml x 20 CFUs / ml) / (4 x 105 CFU / ml) = Verdünnungsfaktor

Für eine 96 Well Mikrotiterplatte benötigt man 10 ml der Bakteriensuspension

mit 4 x 105 CFU / ml. Die zu testenden Substanzen Histon H1.2, Protegrin-1

und die Antibiotika wurden mit einer Peptidverdünnungslösung verdünnt. Diese

Lösung enthält 0,01 % Essigsäure (J.T.Baker, Deventer, Niederlande) und 0,1 %

humanes Serumalbumin (Fraktion V, SERVA Electrophoresis GmbH,

Heidelberg, Deutschland). Danach folgte eine serielle 1 : 2 Verdünnungsreihe

von der höchsten Konzentration von 1000 µg / ml bis zur niedrigsten von 1

µg / ml, d.h. insgesamt 11 unterschiedliche Konzentrationen. In jeweils drei

Reihen der 96 well Polypropylen - Mikrotiterplatte (Ushape, Greiner, Solingen,

Deutschland) wurden 100 µl der Bakteriensuspension mit 4 x 105 CFU / ml

vorgelegt (Abb. 3). Aus der Peptidverdünnungsreihe wurden dann mittels

Mehrkanalpipette jeweils 11 µl der Peptidverdünnungen in jedes Well mit

Bakteriensuspension überführt. In die drei Wells, die als Negativkontrolle

galten, wurde keine Peptidlösung verteilt.


30

Anschließend wurden die Miktrotiterplatten über 16 – 18 Stunden bei 37°C

inkubiert (Heraeus, Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland). Am nächsten Tag

konnte die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) durch die Feststellung

des letzten Wells in der Reihe ohne sichtbares Wachstum ermittelt werden.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Abbildung 3: Mikrobouillon - Verdünnungs - Verfahren – Mikrotiterplatte zur

Ermittlung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC) des Histon H1.2

gegen MRSA: 1 - 100 µg / ml, 2 – 50 µg / ml; 3 – 25 µg / ml; 4 – 12,5 µg / ml; 5

– 6,25 µg/ml; 6 – 3,125 µg / ml; 7 – 1,6 µg / ml; 8 – 0,8 µg / ml; 9 – 0,4 µg / ml;

10 – 0,2 µg / ml; 11 – 0,1 µg / ml; 12 – Negativkontrolle.

Um die minimale bakterizide Konzentration (MBC) zu ermitteln, wurden 200 µl

Trypticase Soya Bouillon (Unipath Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) auf einer

Mikrotiterplatte vorgelegt. Danach erfolgte die Zugabe von je 10 µl aus den

getesteten MIC - Wells, 2 x MIC – Wells und 4 x MIC – Wells (Abb. 3). Die

Mikrotiterplatte wurde nochmals über 16 – 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Am

nächsten Tag entsprachen die Wells mit höchsten Peptidkonzentrationen der

jeweiligen Reihe und ohne sichtbares Wachstum der minimalen bakteriziden

Konzentration (MBC). Das Modifizierte NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs –

Verfahren wurde nur mit Bakterien durchgeführt. Alle Bestimmungen wurden

als Triplikate durchgeführt.


31

2. 3. 3. Hämolytische Aktivität des Histon H1.2

Vollblut wurde aus der Armvene einer freiwilligen Probandin mittels EDTA -

Röhrchen entnommen. Durch Zentrifugation (Megafuge 3OR, Heraeus

Instruments GmbH, Hanau, Deutschland) erfolgte eine sofortige Trennung von

Erythrozyten und Plasma. Im Anschluss wurden mehrere Waschschritte mit

isotonischer 0,9 % Kochsalzlösung (Delta-Pharma GmbH, Pfullingen,

Deutschland) durchgeführt, bis der Überstand keine Färbung mehr aufwies. Für

die Messung wurde eine 2,8 %ige (v / v) Erythrozyten – Suspension in

Phosphat gepuffte Kochsalzlösung (PBS) (PAA Laboratories GmbH, Linz,

Österreich) hergestellt.

Alle verwendeten Substanzen wurden in Phosphat gepuffter Kochsalzlösung

gelöst. Es wurden folgende Konzentrationen verwendet: 250 µg / 100 µl, 79,1 µg

/ 100 µl, 25 µg / 100 µl, 7,91 µg / 100 µl, 2,5 µg / 100 µl, 0,79 µg / 100 µl und

0,25 µg / 100 µl. Die 2,8 % Erythrozyten – Suspension wurde mit den

verschiedenen Testsubstanzen für 30 Minuten bei 37°C inkubiert (Heraeus,

Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland).

Als Negativ – Kontrolle diente Phosphat gepuffte Kochsalzlösung anstelle der

Testsubstanz. Für die Positiv – Kontrolle wurde die Erythrozyten - Suspension

mit 0,1 % Triton – X – 100 - Lösung behandelt. Nach Zentrifugation erfolgte die

photometrische Messung der Überstände bei 540 nm mittels eines ELISA -

Platereaders.


32

Zur Berechnung der hämolytischen Aktivität diente folgende Gleichung:

Hämolytische Aktivität in % = ((ExtProbe – Extneg-Ko.) / (Extpos-Ko. – Extneg-Ko )) x 100

ExtProbe = Extinktion der behandelten Zellen

Extneg-Ko = Extinktion der unbehandelten Zellen

Extpos-Ko = Extinktion der mit Triton – X - 100 behandelten Zellen

Alle Bestimmungen wurden als Triplikate durchgeführt.

2. 3. 4. Zytotoxische Aktivität des Histon H1.2

Um den zytotoxischen Effekt vom humanen antimikrobiellen Peptid LL37 zu

untersuchen, wurden primäre humane Keratinozyten isoliert und die BrdU

Zellproliferation ELISA mit biolumineszentem Detectionssystem (Roche

Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) durchgeführt.

Man überführte primäre humane Keratinozyten in eine 96 – Well Mikrotiterplatte

(Ushape, Greiner, Solingen, Deutschland) mit einer Dichte von 85.000 Zellen /

cm2 und inkubierte sie für 24 Stunden bei 37°C mit 5 % CO2 - Gehalt in

einer befeuchteten Atmosphäre. Anschließend folgte die Inkubation der

primären humanen Keratinozyten für 6 h, 12 h oder 24 h mit

unterschiedlichen Konzentrationen des Histon H1.2 in einem serumfreien

Medium. Folgende Histon H1.2 - Konzentrationen wurden getestet: 250 µg / ml,

79,1 µg / ml, 25 µg / ml, 7,91 µg / ml, 2,5 µg / ml, 0,791 µg / ml und 0,25 µg /

ml. Jeder einzelne Arbeitsschritt wurde entsprechend den Herstellungs-

anweisungen durchgeführt. Die Biolumineszenz wurde nach der automatischen

Injektion der Substratlösung mir einem Mikroplatten – Luminometer gemessen

(Orion, Berthold Detection Systems, Pforzheim, Deutschland).


33

2. 4. In vivo Untersuchung: Infiziertes Rattenverbren nungsmodell

Um die antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vivo zu untersuchen, wurde

im infizierten Rattenverbrennungsmodell eine Vergleichsstudie zwischen dem

Histon H1.2, Protegrin-1 als Positivkontrolle und Phosphat gepuffte

Kochsalzlösung (PBS) als Trägerkontrolle durchgeführt.

Das unten beschriebene Versuchsprotokoll entsprach den Vorgaben, die in

dem „Leitfaden zur Pflege und Nutzung der Labortiere“ des

Bundestierschutzgesetzes niedergelegt sind (Tierantrag: Nr. 102/6; Aktenzeichen

508735.1; Bezirksregierung Arnsberg). Die Tiere für das in unserer

Arbeitsgruppe etablierte Rattenverbrennungsmodell wurden in der

Labortieranlage der Universitätsklinik der Plastischen Chirurgie, BG Kliniken,

Bergmannsheil, Ruhr-Universität, Bochum untergebracht 68. Der Gesamtversuch

wurde in zwei Versuchsgruppen zu je 17 Tieren (15 + 2 Ausgleich)

randomisiert. Die Sprague Dawley Ratten (Charles - River, Sulzfeld,

Deutschland) wurden zwei Wochen vor Versuchsbeginn eingestallt und täglich

kontrolliert. Die Tiere befanden sich stets in einem 12 Stunden währenden

Tag – Nacht Rhythmus und wurden bei konstanter Temperatur von 22°C und

Luftfeuchte von 65 % gehalten. Das Körpergewicht der Tiere lag zu

Versuchsbeginn zwischen 220 und 260 g.

Vierundzwanzig Stunden vor der Verbrennung wurde in LB - Medium (IDGLPC,

Lancashire, Großbritannien) eine 3 ml Übernachtschüttelkultur von

Pseudomonas aeruginosa angeimpft und bei 37°C, im Wasserbad (B. Br aun

Melsungen, Melsungen, Deutschland) schüttelnd (250 rpm) inkubiert. Die

Übernachtschüttelkultur wurde auf 45 ml LB - Medium überimpft und für weitere

2,5 Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert.


34

Anschließend wurden die Bakterien für 5 Minuten bei 4000 rpm und 20°C

zentrifugiert (Megafuge 1.0R, Haereus, Hanau, Deutschland).

Das Bakterienpellet wurde in einem adäquaten Volumen Dulbecco’s Phosphat

gepuffte Kochsalzlösung (PBS), (PAA Laboratories GmbH, Linz, Österreich)

resuspendiert und die OD600nm im BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg,

Deutschland) bestimmt. Die Bakterienanzahl pro Volumeneinheit wurde in CFU

(colony forming units) pro ml Medium über die folgende Gleichung berechnet:

Colony forming Unit / ml = OD600nm x 2,5 x 108 (Bakterien)

Diese Bakteriensuspension wurde mit Phosphat gepuffter Kochsalzlösung (PBS)

verdünnt, so dass sich die benötigte Menge (1 x 108 ) Bakterien in 250 µl

Medium befand. Die Tiere wurden vor Versuchsbeginn gewogen, um die

benötigte Menge an Anästhetika gemäß dem Standardprotokoll mit 100 mg / kg

Körpergewicht Ketamin (Ketamin ratiopharm ®, Ratiopharm, Ulm, Deutschland)

und 20 mg / kg Körpergewicht Xylazin (Rompun ®, Bayer, Leverkusen,

Deutschland) zu berechnen. Die Anästhetika wurden in 0,9 % isotonischer

Kochsalzlösung (Delta-Pharma, Pfullingen, Deutschland) verdünnt. Die

entsprechende Narkosemenge wurde den Tieren intraperitoneal appliziert.

Anschließend wurde das Rückenfell auf 0,1 mm gekürzt. Das rasierte Areal

wurde mit Enthaarungscreme (Veet, Reckitt Benckiser, Mannheim, Deutschland)

eingerieben. Nach 10 Minuten Einwirkzeit wurden die Tiere unter fließendem

warmen Wasser enthaart und gewaschen.

Vierundzwanzig Stunden nach der Enthaarung wurden die Tiere in Narkose

versetzt.


35

Dreißig Minuten vor Versuchsbeginn wurde jedem Tier 0,04 ml (2 units)

Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic ®, Essex Pharma, München, Deutschland)

subkutan appliziert.

Die folgende Narkose erfolgte in gleicher Form wie am Tag zuvor, und zwar

intraperitoneal mit 100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 20 mg / kg

Körpergewicht Xylazin. Der Rücken der Tiere wurde mit einem wasserfesten

Stift in Quadranten unterteilt, um bei jedem Tier ein vergleichbares Hautareal

zu verbrennen. Die Tiere wurden anschließend in einem vorbereiteten

Isolierschlauch eingeschlossen, der lediglich die zu verbrühenden Hautareale

aussparte (Abb. 4). Jedes Tier wurde beidseitig für 20 Sekunden in 60°C

heißem Wasser verbrüht (Abb. 5). Nach der Verbrühung wurden die beiden

Areale sofort abgetrocknet, markiert und mit Softasept ® (B. Braun Melsungen,

Melsungen, Deutschland) ausgiebig desinfiziert (Abb. 6). Nachdem das

Desinfektionsmittel abgetrocknet war, wurden die verbrannten Areale mit einer

sterilen Gaze (Johnson & Johnson, Gargrave, UK) bedeckt und mit 250 µl

Pseudomonas aeruginosa – Suspension benetzt (topische Applikation), um die

Infektion zu etablieren (Abb. 7). Um eine Kreuzkontaminierung zu vermeiden

und die Wachstumsbedingungen für die Bakterien zu verbessern, wurde

unmittelbar nach der Applikation der gesamte Rückenbereich mit dem Verband

Tegaderm ® (6 x 7 cm, 3M Health Care, Borken, Deutschland) und mit Peha –

haft ® (Hartmann, Heidenheim, Deutschland) okklusiv verbunden. Um die

Stabilität zu verstärken und einen mechanischen Schutz zu gewährleisten,

wurde zusätzlich viermal mit Klammern fixiert (Visistat ®, Weck Closure

Systems, Raleigh, North Carolina, USA). Im weiteren Verlauf wurde den Tieren

alle 12 Stunden 0,04 ml (2 units) Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic ®, Essex

Pharma, München, Deutschland) subkutan appliziert.


36

Abb. 4: Das Versuchstier im Isolierschlauch, der lediglich die zu verbrühenden

Hautareale ausspart.

Abb. 5: Das Hautareal unmittelbar nach der Verbrühung.

Abb. 6: Nach der Verbrühung wurden die beiden Areale für die P.aeruginosa-

Suspension markiert.


37

Abb. 7: Applikation der Bakteriensuspension auf die Wundgaze, um die

Infektion zu etablieren.

Abb. 8: Setzen der 1,5 x 1,5 cm Markierung – linke Bildhälfte, welche das

Areal für die Applikation anzeigt und die intradermale Applikation der

antimikrobiellen Peptide – rechte Bildhälfte.

Zwei Tage nach der Infektion wurde den Ratten die Testsubstanz Histon H1.2

appliziert. Jedem Tier wurde 30 Minuten vor Versuchsbeginn 0,04 ml (2 units)

Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic ®, Essex Pharma, München, Deutschland)

subkutan appliziert. Die folgende Narkose erfolgte in gleicher Form wie vor

der Enthaarung: intraperitoneal mit 100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 20

mg / kg Körpergewicht Xylazin.


38

Die Tiere wurden einzeln narkotisiert, um einen reibungslosen Ablauf zu

gewährleisten.

Es wurde bei jedem Tier je Flanke innerhalb des verbrannten Areals ein 1,5

x 1,5 cm großes Areal eingezeichnet, in welches die Applikation der

vorbereiteten Lösungen erfolgte (Abb. 8). Folgende Lösungen wurden

verabreicht: die Теstsubstanz Histon H1.2 in drei unterschiedlichen

Konzentrationen: 25 µg / ml, 250 µg / ml und 2500 µg / ml (gelöst in Phosphat

gepuffter Kochsalzlösung), Protegrin-1 in 250 µg / ml als Positivkontrolle und

Phosphat gepuffte Kochsalzlösung (PBS) als Trägerkontrolle. Je Areal wurden

250 µl der entsprechenden Lösung intradermal und weitere 250 µl der

gleichen Lösung topisch auf eine sterile Gaze (Johnson & Johnson, Gargrave,

Großbritannien) appliziert (Abb. 8). Unmittelbar nach erfolgter Applikation wurde

der Wundbereich mit Tegaderm ® (6 x 7 cm, 3M Health Care, Borken,

Deutschland) okklusiv verbunden, welcher dann zum Schutz mit Peha – haft ®

(Hartmann, Heidenheim, Deutschland) umwickelt und viermal mit Klammern

(Visistat ®, Weck Closure Systems, North Carolina, USA) fixiert wurde.

Nach 4 Stunden wurden die Tiere in zeitlicher Reihenfolge der Applikation

durch die intraperitoneale Gabe einer Lethaldosis von 1 ml Pentobarbital –

Natrium (Narcoren ®, Fa. Merial GmbH, Athen, Georgia, USA) getötet.

Dasjenige Hautareal, in das die Applikation erfolgte, wurde entnommen und in

ein 12 ml Flachbodenröhrchen (TPP, OmniLab AG, Berlin, Deutschland)

überführt, gewogen und bis zur Homogenisation bei 4°C auf Eis gehalten. Die

Hautareale wurden in 3 ml Phosphat gepuffter Kochsalzlösung mittels Polytron®

PT3100 (Kinematika, Luzern, Schweiz) bei 26.000 rpm unter Kühlung

homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenisat seriell (1 : 10; 1 : 100 und

1 : 1000) verdünnt.


39

Die Verdünnungen wurden daraufhin in Triplikaten auf Pseudomonas

Isolationsagarplatten (Beckton Dickinson, Cockeysville, Maryland, USA), sowie

in einfacher Ausführung auf Mueller – Hinton Agar mit 5% Schafsblut (Becton

Dickinson, Heidelberg, Germany) ausplattiert. Die Platten wurden für 18

Stunden bei 37°C inkubiert (Heraeus, Heraeus Holding GmbH, Hanau,

Deutschland).

Anschließend wurden die Platten quantitativ und qualitativ ausgewertet: Die

gezählten Kolonien pro Platte dienten der Bestimmung der CFU pro

Gesamtprobe, indem sie mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor

multipliziert wurden. Diese Gesamtbakterienzahl wurde zu den Gramm

entnommenen Gewebes in Bezug gesetzt und womit der Endwert in CFU / g

Gewebe ermittelt werden konnte.

2. 5. Statistische Analyse

Die Ergebnisse des Radiale – Diffusion - Verfahrens, des Modifizierten NCCLS

Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahrens und der Untersuchung der

hämolytischen Aktivität wurden mit dem Programm Stat - View (SAS Institute,

Cary, North Carolina, USA) ausgewertet. Die Daten des infizierten

Rattenverbrennungsmodells wurden mit dem Programm SPSS (SPSS Inc.,

Chicago, Illinois, USA) bearbeitet. Die Ergebnisse wurden bei p < 0,05 als

signifikant gewertet.

Alexander Baraniskin Ergebnisse

40

3. ERGEBNISSE

3. 1. In vitro Aktivität von Histon H1.2

3. 1. 1. Radiale – Diffusion – Verfahren

Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die antibakterielle und die

antimykotische Aktivität des Histon H1.2 gegen unterschiedliche

Mikroorganismen zu beurteilen, die für die meisten Infektionen der humanen

Brandwunden verantwortlich sind. Die Ergebnisse wurden mit dem natürlich

vorkommenden antimikrobiellen Peptid Protegrin-1 68,70 und mit den klinisch

angewandten Antibiotika und Antimykotika verglichen. Folgende Antibiotika

wurden verwendet: Imipenem wurde gegen Pseudomonas aeruginosa,

Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii und Proteus mirabilis eingesetzt.

Gegen drei bakterielle Isolate (Pseudomonas aeruginosa) von verbrannten

Patienten wurde ebenfalls Imipenem benutzt. Ampicillin wurde gegen

Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Enterococcus faecalis eingesetzt,

und Vancomycin gegen Staphylococcus epidermidis und C-MRSA. Als

Antimykotikum gegen Candida albicans 246, Candida albicans 248, Candida

parapsilosis und Candida crusei wurde Amphotericin B verwendet.

3. 1. 1. 1. Grampositive Bakterien

Gegen die besonders relevanten Erreger der humanen Brandwunden-

infektionen, Staphylococcus aureus und Enterococcus faecalis offenbarte

Histon H1.2 eine höhere antibakterielle Aktivität als die entsprechenden klinisch

angewandten Antibiotika:


41

Minimale effektive Konzentration (MEC) des Histon H1.2 3,178 µg / ml und

3,14 µg / ml versus minimale effektive Konzentration des Ampicillin 10,507 µg /

ml und 28,853 µg / ml (p <0,0001) (Abb. 9).

Verglichen mit Protegrin-1 zeigte Histon H1.2 gegen Staphylococcus

epidermidis und Enterococcus faecalis eine signifikant höhere Aktivität oder

eine niedrigere MEC; minimale effektive Konzentration des Histon H1.2 3,123

µg / ml und 3,14 µg / ml vs. minimale effektive Konzentration des Protegrin-1

4,48 µg / ml und 4,46 µg / ml (p < 0,005) (Abb. 9).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

S.aureus S.epidermidis E.faecalis MRSA

ME

C (

µg/m

l)

Histon 1.2

Protegrin 1

Antibiotikum

Abbildung 9: Radiale – Diffusion – Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen

Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit den klinisch angewendeten

Antibiotika gegen grampositive Bakterien. Es wurde die minimale effektive

Konzentration (MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2 versus Antibiotikum;

#,P < 0.05, Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05, Protegrin-1 versus

Antibiotikum.

* +

#* #* +


42

3. 1. 1. 2. Gramnegative Bakterien

Die antibakterielle Aktivität des Histon H1.2 gegen Escherichia coli und

Klebsiella pneumoniae ist zwar niedriger als die Aktivität des Protegrin-1, sie

ist jedoch wesentlich höher als die antibakterielle Aktivität der entsprechenden

angewandten Antibiotika (Abb. 10). Außerdem wies Histon H1.2 eine

vergleichbare minimale effektive Konzentration gegen alle getesteten

gramnegativen Bakterien und gegen die bakteriellen Isolate auf (Abb. 11).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

E.coli P.auroginosa A.baumanii K.pneumoniae P.mirabilis

ME

C (

µg/m

l)

Histon 1.2

Protegrin 1

Antibiotikum

Abbildung 10: Radiale - Diffusion - Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen

Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit den derzeit klinisch

angewendeten Antibiotika gegen gramnegative Bakterien. Es wurde die

minimale effektive Konzentration (MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2

versus Antibiotikum; #,P < 0.05, Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05,

Protegrin-1 versus Antibiotikum.

#* #* * * *

+

+ +

+

+


43

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Isolate 1 Isolate 2 Isolate 3

ME

C (µ

g/m

l)Histon 1.2

Protegrin 1

Imipenem

Abbildung 11: Radiale - Diffusion - Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen

Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit den derzeit klinisch

angewendeten Antibiotika gegen drei Bakterienisolate (Pseudomonas

aeruginosa) von verbrannten Patienten. Es wurde die minimale effektive

Konzentration (MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2 versus Antibiotikum;

#,P < 0.05, Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05, Protegrin-1 versus

Antibiotikum.

3. 1. 1. 3. Pilze

Die antimykotischen Eigenschaften des Histon H1.2 zeigten ähnliche Resultate

wie die des Protegrin-1 und eine stärkere Aktivität gegen alle getesteten Pilze

als das verwendete Antimykotikum Amphotericin B (Abb. 12).

+ +

+

#*

#*

*


44

0

5

10

15

20

25

30

35

40

C.albic. 24433 C.albic.9928 C.parapsylosis C.krusei

ME

C (µ

g/m

l)Histon 1.2

Protegrin 1

Amphotericin B

Abbildung 12: Radiale – Diffusion - Verfahren. Vergleich der antimikrobiellen

Aktivität des Histon H1.2 mit Protegrin-1 und mit dem klinisch angewendeten

Antimykotikum Amphotericin B gegen verschiedene Pilzstämme, die

Wundinfektionen verursachen. Es wurde die minimale effektive Konzentration

(MEC) gemessen. *,P < 0.05, Histon H1.2 versus Antimykotikum; #,P < 0.05,

Histon H1.2 versus Protegrin-1; +,P < 0.05, Protegrin-1 versus Antimykotikum.

Ferner ist besonders hervorzuheben, dass Histon H1.2 annähernd eine

identische antibakterielle Aktivität sowohl gegen die grampositiven, wie auch

gegen die gramnegativen Bakterien, gegen die bakteriellen Isolate und sogar

gegen die getesteten Pilzstämme zeigte.

* #* #* +

+ +


45

3. 1. 2. Modifiziertes NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren

Das Modifizierte NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren wurde gemäß

den Leitlinien der National Committee for Clinical Standards 67 durchgeführt.

Die antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 wurde, abgesehen von den drei

Pilzstämmen, gegen die gleichen Mikroorganismen untersucht, die mit dem

Radiale - Diffusion - Verfahren getestet wurden. Die Ergebnisse, die das

Modifizierte NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahren ergab, korrelieren

mit den Ergebnissen des Radiale - Diffusion - Verfahrens und bestätigen somit

diese.

Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) des Protegrin-1 gegen Proteus

mirabilis und die minimalen bakteriziden Konzentrationen (MBC) gegen

Enterococcus faecalis, Acinetobacter baumanii, Proteus mirabilis und zwei von

den drei getesteten bakteriellen Isolaten konnten mit den höchsten

angewandten Konzentrationen nicht ermittelt werden. Im Gegensatz hierzu fallen

die minimalen inhibitorischen Konzentrationen und die minimalen bakteriziden

Konzentrationen des Histon H1.2 gegen die grampositiven Bakterien durch

konstante Werte auf: MIC 12,5 µg / ml und MBC 50 µg / ml (Tabelle III).

Ähnliche Ergebnisse wies Histon H1.2 gegen die gramnegativen Bakterien und

gegen die Bakterienisolate aus menschlichen Brandwunden auf. Die

Untersuchungen ergaben eine konstante minimale bakterizide Konzentration

(100 µg / ml). Die minimale inhibitorische Konzentration variierte zwischen 25

µg / ml und 100 µg / ml (Tabelle III).


46

Tabelle III: Die Ergebnisse des Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Ver-

dünnungs – Verfahren. Die minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) und

die entsprechenden minimalen bakteriziden Konzentrationen (MBC) des Histon

H1.2 sind aufgeführt.

Bakterien S.aureus S.epidermidis E.faecalis MRSA E.coli P.aeruginosa A.baumanii K.pneumoniae P.mirabilis Isolate 1a Isolate 2a Isolate 3a

MIC (µg/ml) 12,5 12,5 12,5 12,5 25 50 25 50 25 100 50 50

MBC (µg/ml)

50 50 50 50 100 100 100 100 100 100 100 100

a drei Bakterienisolate (Pseudomonas aeruginosa) von Schwerbrandverletzten

3. 1. 3. Hämolytische Aktivität

Die hämolytische Aktivität wurde durch die Aussetzung einer 2,8 % Suspension

der gewaschenen humanen Erythrozyten zu Peptiden in unterschiedlichen

Konzentrationen bestimmt. Es wurden die gleichen Konzentrationen wie im

Radiale - Diffusion - Verfahren eingesetzt.

Folgende Substanzen wurden untersucht: Histon H1.2, Protegrin–1 und die

klinisch angewendeten Antibiotika, die in den beiden in vitro Experimenten

benutzt wurden: Ampicillin, Imipenem und Vancomycin.


47

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

Peptidkonzentration (µg/100µl)

Häm

olyt

isch

e A

ktiv

ität (

%)

Protegrin-1

Vancomycin

Imipenem

Histon H1.2

Ampicillin

Abbildung 13: Hämolytische Aktivität. Eine 2.8 % - Suspension der

gewaschenen humanen Erythrozyten wurde mit verschiedenen seriell

verdünnten Peptiden für 30 min bei 37°C inku biert. Die untersuchten

Substanzen waren Histone H1.2, Protegrin-1 und klinisch angewendete Anti-

biotika, die in den beiden in vitro Untersuchungen benutzt wurden: Ampicillin,

Imipenem und Vancomycin.


48

Das Histon H1.2 weist fast gleich niedrige hämolytischen Eigenschaften wie

die drei getesteten klinisch zugelassenen Antibiotika auf (Abb. 13). Sogar aus

einer Erhöhung der Konzentration des Histon H1.2 bis auf 250 µg / ml

resultierte kein wesentlicher Anstieg der hämolytischen Aktivität: die hämo-

lytische Aktivität bei Histon H1.2 – Konzentration von 0,25 µg / ml betrug 1 %.

Bei der Konzentration von 250 µg / ml betrug die hämolytische Aktivität nur

2 %. Dieser sehr geringe konzentrationsabhängige Anstieg der hämolytischen

Wirkung des Histon H1.2 stimmt auch mit den hämolytischen Eigenschaften

der zugelassenen Antibiotika überein. Verglichen mit Histon H1.2 übte das

Peptid Protegrin-1 einen starken hämolytischen Effekt aus, der bereits bei der

Peptidkonzentration von 7,91 µg / ml 64 % betrug und bei 79,1 µg / ml bis auf

100 % anstieg. Die hämolytische Aktivität des Histon H1.2 liegt durchschnittlich

bei 2 % und ist nahezu konzentrationsunabhängig (Abb. 13).

3. 1. 4. Zytotoxische Aktivität

Die zytotoxischen Untersuchungen wurden an isolierten primären humanen

Keratinozyten durchgeführt. Diese Zellen wurden mit unterschiedlichen

Konzentrationen des Histon H1.2 inkubiert. Es wurden die gleichen

Konzentrationen eingesetzt, wie im Radiale - Diffusion - Verfahren. Die

zytotoxischen Aktivitäten des Histon H1.2 und des Peptids Protegrin-1 sind

vergleichbar (Abb. 14). So starben 50 % der Zellen (LD50) bei der Histon H1.2

– Konzentration von 7,91 µg / ml (Abb. 14), wobei Protegrin-1 bei der

Konzentration von 12,5 µg/ml die gleiche Zytotoxizität (LD50) erreichte.

Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass die Zytotoxizität stärker

von der Peptidkonzentration als von der Inkubationsdauer abhängt.


49

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

Peptidkonzentration (µg/ml)

vita

le K

erat

inoz

yten

(%)

6 h

12h

24h

Abbildung 14: Zytotoxizität des Histon H1.2 auf primäre humane

Keratinozyten. Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Histon

H1.2 für 6, 12 oder 24 Stunden inkubiert. Die y - Achse zeigt in Prozent den

Anteil der Zellen, die abhängig von den verschiedenen Peptidkonzentrationen

überlebt haben.

3. 2. In vivo Aktivität von Histon H1.2

Das infizierte Rattenverbrennungsmodell wurde angewendet, um die

antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vivo zu untersuchen. Das Histon

H1.2 wurde in drei unterschiedlichen Konzentrationen auf seine biologische

Aktivität überprüft: 25 µg / ml, 250 µg / ml und 2500 µg / ml.


50

Als Positivkontrolle wurde Protegrin-1 in der Konzentration von 250 µg / ml

eingesetzt und als Trägerkontrolle diente Phosphat gepuffte Kochsalzlösung

(PBS).

Um eine Infektion zu simulieren, wurde Pseudomonas aeruginosa (ATCC

27853; DSMZ 1117) appliziert. Die Sensibilität dieses Bakterienstammes gegen

Histon H1.2 und gegen Protegrin-1 wurde vorher mit dem Radiale - Diffusion -

Verfahren und mit dem Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs –

Verfahren kontrolliert.

Die Ergebnisse der mikrobiologischen in vivo Auswertung sind in der Abb. 15

dargestellt. Die niedrigste Histon H1.2 – Konzentration von 25 µg/ml ergab

keinen signifikanten Effekt verglichen mit den beiden anderen Versuchs-

gruppen. Histon H1.2 in der Konzentration von 250 µg / ml zeigte die höchste

antimikrobielle Aktivität. Die Anzahl der CFU pro Gramm Gewebe, das mit

dieser Histon H1.2 – Konzentration behandelt wurde, ist signifikant niedriger als

bei den mit der Trägerkontrolle (PBS) behandelten Geweben (p < 0,001) und

entsprach etwa den CFU - Mengen der mit der Positivkontrolle Protegrin-1

behandelten Geweben: 250 µg / ml Histon H1.2 8,93 x 1010 vs. 250 µg / ml

Protegrin-1 7,40 x 1010 CFU pro Gramm. Im Gegensatz zur 250 µg / ml –

Konzentration des Histon H1.2 wies die höchste eingesetzte Histon H1.2 –

Konzentration (2500 µg / ml) eine niedrigere antimikrobielle Aktivität auf (1,68 x

1011 CFU pro Gramm Gewebe).

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Histon H1.2 - Konzentration

von 250 µg / ml die optimale Konzentration für die Entwicklung einer effektiven

antimikrobiellen Wirkung zu sein scheint.


51

0

5

10

15

20

25

30

35

40

a b c Träger (PBS) Protegrin-1

Milli

onen

CF

U p

ro G

ram

m G

eweb

e

Abbildung 15: Antimikrobielle Bioaktivität im infizierten Rattenverbrennungs-

modell. Dieser Graph charakterisiert die Bakterienzahlen des Pseudomonas

aeruginosa in den Verbrennungswunden 4 Stunden nach intradermaler Injektion

von 25 µg / ml, 250 µg / ml oder 2500 µg / ml des Histon H1.2 und 250 µg /

ml des Protegrin-1 als Positivkontrolle und Phosphat gepuffte Kochsalzlösung

(PBS) als Trägerkontrolle. *,P < 0.05, Histon H1.2 (250 µg / ml) versus PBS

(Trägerkontrolle); #,P < 0.05, Histon H1.2 (2500 µg / ml) versus PBS (Träger-

kontrolle); +,P < 0.05, Protegrin-1 (250 µg / ml) versus PBS (Trägerkontrolle).

Histon H1.2

25 µg/ml

250 µg/ml

2500 µg/ml

#

* +

Alexander Baraniskin Diskussion

52

4. DISKUSSION

Es gibt eine zunehmende Anzahl von Erkenntnissen, die darauf hindeuten,

dass das angeborene Immunsystem eine Schlüsselrolle in der Infektabwehr

weit unterschiedlicher Spezies spielt. Diese Proteine sind essentielle

Komponenten des angeborenen Immunsystems. Sie agieren als

Effektorsubstanzen, die imstande sind ein breites Spektrum an Mikro-

organismen zu zerstören 7,21,37.

Das hochspezifische, erworbene Immunsystem ist nicht in der Lage effektiv

und schnell genug eine wirksame Schutzreaktion bei Konfrontation mit unter-

schiedlichen Erregerarten auszulösen. Es benötigt zur Aktivierung 4 bis 5

Tage 39. Im Gegensatz dazu hat das angeborene und phylogenetisch ältere Teil

des Immunsystems, die Fähigkeit rasch, und zwar innerhalb von Minuten, und

unspezifisch auf den Angriff eines Mikroorganismus zu reagieren 39. Auf diese

Weise ist das angeborene Immunsystem hauptsächlich für die „first line“ -

Abwehr verantwortlich. Es wird deutlich, dass im Gegensatz zum angeborenen,

das erworbene Immunsystem den Ausbruch einer Infektion nicht verhindern

kann. Eine effektive antimikrobielle Wirkung durch eine systemische Gabe von

bakteriziden Antibiotika tritt ebenfalls erst nach 6 bis 10 Stunden ein 13.

Viele der natürlich vorkommenden antimikrobiellen Proteine sind bereits

charakterisiert, wie z. B die Defensine, die Lysozyme und die Magainine 89. Auf

Grund der Ergebnisse dieser Studie müsste man in Zukunft auch das Histon

H1.2 zu den Effektormolekülen des angeborenen Immunsystems hinzurechnen.

Das Vorhandensein der antimikrobiellen Aktivität von Histonen ist nicht neu.

Bereits 1942 erwähnte Miller in „Antibacterial properties of protamines and

histone“, dass Histone eine antibiotische Aktivität besitzen 42.


53

Andere Studien bestätigten diese Tatsache anhand von Untersuchungen

unterschiedlicher Histonklassen. Park entdeckte das antimikrobielle Peptid

Buforin 1, das aus der Spaltung des Histon H2A durch eine spezifische

Protease entsteht 50,51. Über die potentielle Rolle des aus Epithelzellen

stammenden Histonproteins H1 in der angeborenen antimikrobiellen Abwehr

des humanen Gastrointestinaltraktes wurde bereits von Rose berichtet 22,61.

Die von unserer Arbeitsgruppe durchgeführten in vitro und in vivo

Untersuchungen bestätigten eindeutig die Existenz einer antimikrobiellen

Aktivität des Histon H1.2. Des weiteren konnte festgestellt werden, dass die

Wirksamkeit des Histon H1.2 weitgehend mit der des natürlich vorkommenden

antimikrobiellen Peptids Protegrin–1, welches über hervorragende antimikrobielle

Eigenschaften verfügt, übereinstimmt.

Sowohl die Ergebnisse des Radiale - Diffusion - Verfahrens als auch die

Ergebnisse des Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs – Verfahrens

zeigten eine signifikant höhere antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 im

Vergleich zur Aktivität der Antibiotika, die derzeit klinisch gegen die

entsprechenden Bakterienstämme eingesetzt werden (ausgenommen

Vancomycin gegen MRSA). Ebenfalls offenbarte die Gegenüberstellung des

Histon H1.2 und des getesteten Antimykotikums Amphotericin B eine signifikant

stärkere antimykotische Aktivität des Histon H1.2.

Die minimale effektive Konzentration (MEC), ermittelt mit dem zweilagigen

Radiale - Diffusion - Verfahren, erwies sich gegen alle getesteten Mikro-

organismen als konstant: sowohl gegen die grampositiven als auch gegen die

gramnegativen Bakterien und gegen die getesteten Pilze.


54

Aus der Auswertung des Modifizierten NCCLS Mikrobouillon – Verdünnungs –

Verfahrens resultierten annähernd gleiche minimale inhibitorische

Konzentrationen (MIC), sowie gleiche minimale bakterizide Konzentrationen

(MBC) sowohl für grampositive, als auch für gramnegative Bakterien. Daraus

kann man folgern, dass das Histon H1.2 eine erregerunabhängige Wirkung

besitzt.

Die in vitro und in vivo Daten dieser Untersuchung zeigten, dass Histon H1.2

nicht nur eine stärkere Wirkung gegen beinahe jeden Mikroorganismus besitzt,

sondern außerdem ein viel breiteres Wirkungsspektrum gegen Bakterien und

Pilze aufweist, als alle aktuell klinisch eingesetzten Antibiotika. Es gibt derzeit

kein klinisch eingesetztes Antibiotikum mit so einem breiten Wirkungsspektrum

wie Histon H1.2.

Ein weiterer Vorteil des Histon H1.2 ist sein physiologisches Vorkommen in

jeder menschlichen Zelle, d. h. Histone sind für die menschliche Zelle keine

Fremdsubstanzen. Im extremen Gegensatz dazu stehen die derzeit

eingesetzten Antibiotika. Sie sind Pilzderivate, Pflanzenderivate oder andere für

menschliche Zellen fremde Substanzen, die eine Menge Nebenwirkungen

verursachen: allergische Reaktionen, gastrointestinale Beschwerden,

Embryonalschäden, Hepatotoxizität, Nephrotoxizität und viele andere

Komplikationen. Außerdem sind natürlich Resistenzen und Kreuzresistenzen zu

befürchten 55.

Bezüglich der hämolytischen Eigenschaften stellte sich ein großer Vorteil des

Histon H1.2 gegenüber dem Peptid Protegrin-1 heraus. In den Untersuchungen

zur Überprüfung der hämolytischen Aktivität wies Histon H1.2 die gleiche

minimale Schädigung der menschlichen Erythrozyten auf wie die zugelassenen

klinisch angewendeten Antibiotika.


55

Im Gegenteil dazu zeigte Protegrin-1 beträchtliche hämolytische Wirkung schon

im Bereich der effektiven antimikrobiellen Konzentration (100 % Zellzerstörung).

Auch die hämolytische Aktivität anderer antimikrobieller Peptide ist höher als

die des Histon H1.2. So zum Beispiel die hämolytische Aktivität von

α-Defensin, Magainin und Temporin 57,58.

Andererseits stellte sich heraus, dass Histon H1.2 bereits in niedrigen

Konzentrationen zytotoxisch wirkt. Zur Bestimmung der Zytotoxizität wurden

primäre humane Keratinozyten unterschiedlichen Histon H1.2 – Konzentrationen

ausgesetzt. Protegrin-1 wirkte etwas weniger zytotoxisch. Es ist nach wie vor

ungeklärt, weshalb Histon H1.2 auf der einen Seite die primären Keratinozyten

zerstört und auf der anderen Seite aber die wesentlich fragileren humanen

Erythrozyten wenig gefährdet. Ein möglicher Erklärungsansatz wäre, dass die

physiologischen Konzentrationen der endogenen extrazellulären Histone im Blut

erheblich höher sind als in den peripheren Geweben. Es kommt also

vermutlich zum aktiven Schutz der fließenden Blutzellen, unter anderem auch

der Erythrozyten. Die Membran der Erythrozyten besteht zwar wie die anderer

humaner Zellen aus der typischen Lipiddoppelschicht, mit eingelagerten

Proteinen, weist aber durch das zusätzliche Vorhandensein eines

Membranskeletts eine Strukturbesonderheit auf, die möglicherweise für die

Resistenz gegenüber Histon H1.2 verantwortlich ist. Das Membranskelett

besteht aus spezifischen Proteinen der Erythrozyten, wie zum Beispiel Spektrin

und Ankyrin 39. Es verhindert eventuell die Bindung der Histonproteine an die

Erythrozytenmembran. Es ist aber wahrscheinlicher, dass das Membranskelett

die Zellmembran so weit stabilisiert, dass die Histonproteine nicht in der Lage

sind, Poren in dieser einzubilden und so den Zelltod herbeizuführen.


56

Ein weiterer Faktor, der die Erythrozyten schützen könnte, ist der erhöhte

Protein- und Kohlenhydratanteil sowie der erniedrigte Lipidanteil der

Zellmembran im Vergleich zu anderen humanen Zellen. Es besteht folgende

Membranzusammensetzung: bei den Erythrozyten: Protein 49%; Lipid 43%;

Kohlenhydrat 8%. Bei anderen humanen Zellen, z. B bei Hepatozyten,

Endothelzellen, Keratinozyten und Granulozyten: Protein 45 %; Lipid 53 %;

Kohlenhydrat 2 % 39.

Die Ergebnisse anderer Studien zeigen, dass die Zytotoxizität anderer

antimikrobiellen Peptiden mit der des Histonproteins H1.2 vergleichbar ist. Dies

gilt unter anderem für Magainin, Melittin, α-Defensine und PR-39 48,57,58,59,70.

Die Resultate des infizierten Rattenverbrennungsmodells bestätigten grund-

sätzlich die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen. Es wurde gezeigt, dass

das antimikrobielle Potential des Histonproteins H1.2 demjenigen des

Protegrin–1 entspricht, und dass bei der Applikation von Histon H1.2 vier

Stunden nach der Wundinfektion die Erregermenge signifikant reduziert wurde.

Für die Applikation der getesteten Substanzen wählte man den Zeitpunkt von

vier Stunden nach der Infektion, weil es zu einem späteren Zeitpunkt zum

Überwachsen der Wunden durch Bakterien kommen würde. Durch das in vivo

Experiment fanden wir auch einen Anhaltspunkt dafür, in welchem Bereich die

optimale Wirkungskonzentration des Histonproteins H1.2 liegt, und zwar im

Bereich von 250 µg / ml. Eine Konzentration von 25 µg / ml erwies sich für

eine starke antimikrobielle Aktivität als zu niedrig. Dieses deutet darauf hin,

dass eine Schwellendosis hinsichtlich der antimikrobiellen Wirkung existieren

muss. Die Datenlage dieser Versuchsreihe lässt vermuten, dass die

Schwellendosis von Histon H1.2 zwischen 25 µg / ml und 250 µg / ml liegt.

Diese Ergebnisse korrelieren mit den Daten der beiden in vitro Versuche.


57

Des weiteren konnte bei einer Konzentration von 2500 µg / ml keine effektive

antimikrobielle Wirkung erzielt werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass

es ein therapeutisches Fenster existiert, bei dem aus einer Erhöhung der

Peptidkonzentration keine Wirkungsverstärkung, sondern sogar Wirkungs-

abnahme resultiert. Die Ursache für dieses unerwartete Ergebnis haben wir im

Rahmen unseres Versuchsvorhabens nicht aufgeklärt.

Die im Rahmen unseres Forschungsvorhabens ermittelte antimikrobielle

Wirksamkeit und hämolytische Aktivität von Protegrin–1 korrelieren mit den

Daten vorheriger Studien unserer Arbeitsgruppe 68,69,70. Unterschiede in den

Ergebnissen dieser Studie im Vergleich zu vorherigen Arbeiten könnten vor

allem dadurch erklärt werden, dass bei den in vitro Versuchen wie auch bei

dem in vivo Versuch andere Bakterienstämme verwendet wurden. Zusätzlich

unterscheidet sich die Durchführung unserer in vivo Untersuchungen von

denen, die vorher beschrieben wurden, durch die Verabreichung einer 100 –

fach größeren Bakterienmenge. Wir applizierten 1 x 108 CFU (Pseudomonas

aeruginosa) pro Wunde, anstatt von 1 x 106, wie in den anderen Studien 68,69,70.

Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist der Umstand, dass die

Experimente an einem anderen Ort und mit anderen Tieren durchgeführt

wurden 68,69,70. Man muss auch beachten, dass in unserem in vivo Experiment

die Reduktion der Bakterienzahl in der Verbrennungswunde gemessen wurde.

Aus diesem Grund sind unsere Ergebnisse nicht mit denen von Chalekson et

al vergleichbar, in denen die Mortalität der Versuchstiere bestimmt wurde 11.

Dabei setzte man den Ratten stärkere Verbrennungen zu. Und zwar wurden

23 % der Körperoberfläche für 10 Sekunden in 100°C heißem Wasser

verbrüht 11.


58

Aus früheren Studien ist auch bekannt, dass im Rattenverbrennungsmodell

Protegrin-1 eine signifikant stärkere antimikrobielle Bioaktivität als das derzeit

klinisch eingesetzte Antibiotikum Gentamicin besitzt 69. Dementsprechend haben

wir in den in vivo Versuchen als Positivkontrolle nur Protegrin-1 eingesetzt,

um die Anzahl der verwendeten Versuchstiere zu reduzieren.

Eine Frage, die immer noch unbeantwortet bleibt, ist die Frage nach der

physiologischen Bedeutung der antimikrobiellen Aktivität des Histon H1. Es

könnte folgendes Erklärungsmodell in Betracht kommen: Histone und ihre

Fragmente werden aus den Zellen freigesetzt, die durch Apoptose oder

Nekrose untergehen 53. Dies wurde von Frohm in “Biochemical and

antibacterial analysis of human wound and blister fluid” durch den Nachweis

der Histone und ihrer Fragmente in menschlicher Wundflüssigkeit gezeigt 17.

Dementsprechend führen Verletzungen zum Zelltod und damit auch zur

Freisetzung von Histonen. Den nachgewiesenen antimikrobiellen Eigenschaften

der Histone zufolge, hemmen diese signifikant das Bakterien- bzw.

Pilzwachstum und verhindern dadurch eine mögliche Infektion oder eine

weitere Ausbreitung der Infektion auf die umgebenden Zellen. Daraus folgt,

dass der Tod einzelner Zellen den Zellverband vor dem Untergang schützt.

Derart könnte einer der potentiellen Mechanismen der angeborenen

antimikrobiellen Abwehr durch Histone aussehen. Eine andere Möglichkeit wäre

eine aktive Sekretion oder Freisetzung der Histone während der

infektionsbedingten Apoptose 55.

Eine weitere interessante und vermutlich nützliche Eigenschaft des Histon H1.2

ist seine Fähigkeit Membranbestandteile von gramnegativen Bakterien bzw.

Lipopolysaccharide (LPS) zu binden und damit zu neutralisieren5.


59

Lipopolysaccharide interagieren unter anderem mit den Rezeptoren CD14 und

TLR4. Dadurch werden vor allem Monozyten / Makrophagen stimuliert TNF-α,

IL-6, IL-12 und andere proinflammatorische Zytokine zu produzieren5,8,19,23,72.

Auf diese Weise könnte Histon H1.2 zur Verhinderung des fatalen septischen

Schocks beitragen. Die Daten über die Interaktion von Histon H1.2 mit

Membranbestandteilen von grampositiven Bakterien liegen nicht vor.

Bereits im Jahre 1958 erwähnte Hirsch in „Bactericidal action of histone“, dass

Histone eine ungefähr zweifach stärkere antimikrobielle Aktivität bei pH 5,6 als

bei pH 7 besitzen 24. Da entzündetes Gewebe grundsätzlich im Vergleich zum

gesunden Gewebe einen niedrigeren pH – Wert besitzt, entfalten die Histone

unter Ausnutzung dieser für sie günstigeren Voraussetzung eine stärkere

Aktivität im erkrankten bzw. infizierten Gewebe.

Der Mechanismus, durch welchen das Histon H1.2 Bakterien und Pilze abtötet,

ist bislang nicht bis ins letzte Detail erforscht. Einiges spricht dafür, dass

Histon H1.2 und die antimikrobiellen Peptide den gleichen Wirkungs-

mechanismus haben. Sowohl Histon H1.2 als auch die meisten der bisher

bekannten antimikrobiellen Peptide sind positiv geladene polykationische

Peptide, die obligatorisch eine amphiphile Struktur enthalten 81. Auf der einen

Seite könnte die Sekundärstruktur des Histon H1, die für eine potente Bindung

an die stark negativ geladene DNA sorgt, zusätzlich für die Bindung an die

negativ geladene Bakterienoberfläche verantwortlich sein. Auf der anderen

Seite haben die antimikrobiellen Peptide, die in der Lage sind an die

Bakterienoberflächen zu binden, außerdem die Fähigkeit sich mit DNA zu

verbinden. Yonezawa zeigte, dass das antimikrobielle Peptid Tachyplesin I, das

aus dem Serum des chinesischen Pfeischwanzkrebses Tachypleus tridentatus

isoliert wurde, an DNA binden kann 87.


60

Ein weiterer Hinweis darauf, dass Histon H1 und die antimikrobiellen Peptide

den gleichen oder einen ähnlichen Wirkungsmechanismus besitzen, kommt von

Richards 55. Er zeigte in Untersuchungen mit dem Elektronenmikroskop, dass

Histon H1 die Bakterienmembran des getesteten Escherichia coli in der

gleichen Weise beschädigt, wie das antimikrobielle Peptid Magainin II vom

afrikanischen Frosch Xenopus laevis. Nach dem Zelltod war die Morphologie

den beiden unterschiedlichen Peptiden ausgesetzter Bakterien nicht

voneinander zu unterscheiden.

Der Wirkmechanismus des antimikrobiellen Peptids Magainin II und

wahrscheinlich des Histon H1 könnte folgendermaßen aussehen: alle

antimikrobiellen Peptide, die beim Menschen entdeckt wurden, sind positiv

geladen. Diese Eigenschaft führt zur Bindung der Peptide an die negativ

geladene Zelloberfläche der Bakterien (Abb. 16). Die hydrophilen Regionen der

Peptide ermöglichen die Bildung von Poren in der Zellmembran der Bakterien

31,80, die zum Kollaps des Membranpotentials, zur Steigerung der Membran-

permeabilität, zum Verlust von Ionen und damit schließlich zum Tod der

Bakterien führen 31,63.

Die Frage, wieso die menschlichen Zellen dabei nicht zerstört werden, ist

auch bereits teilweise beantwortet. Der Grund für die relative Spezifität dieses

Wirkungsmechanismus liegt vermutlich in den Eigenschaften von Zell-

membranen der Säugetierzellen. Sie sind schwächer negativ geladen und

haben einen höheren Cholesteringehalt als die Zellmembranen der meisten

Bakterien 62.


61

Abbildung 16: Wirkmechanismus vom Antimikrobiellen Peptid Protegrin-1: In

der Abbildung ist der bakterizide

Mechanismus von Protegrin-1 darge-

stellt. Protegrin–1 lagert sich mit dem

positiv geladenen Teil innerhalb weni-

ger Minuten direkt an die negativ

geladene prokaryontische Zellmembran

an. Die darauf folgende Einlagerung

ermöglicht die Bildung von trans-

membranösen Poren, die eine

Trennung der Innen - und Außen-

membran hervorrufen (1), eine Des-

organisation des Zytoplasmas verur-

sachen (2) und schließlich zum

Zelltod des Bakteriums mit leeren

Membrangerüsten (3) und extra-

zellulärem Debris führen(4) 69.

Die Bildung resistenter Keime gegen antimikrobielle Peptide ist ein überaus

seltenes Ereignis. Man versuchte eine Resistenz bei mehreren Bakterienarten

zu provozieren, indem man sie mit niedrigen, subinhibitorischen Dosen des

antimikrobiellen Peptids Pexiganan, einem Abkömmling des Magainin,

konfrontierte. Diese Versuche blieben erfolglos 71. Der genaue Grund, warum

es nicht häufiger zu Resistenzen kommt, ist bislang noch ungeklärt.

Wahrscheinlich lassen der äußerst schnelle Eintritt der Wirkung und der

Wirkungsmechanismus über Porenbildung das Auftreten von Mutationen, die zu

Resistenzen führen könnten, nicht zu. Man vermutet auch, dass die

antimikrobiellen Peptide an konservativen Strukturen der Erreger angreifen, die

sich im Laufe der Evolution nur minimal verändert haben und deren Änderung

nicht mit Leben und Wachstum der Mikroorganismen vereinbar ist 31.


62

Dafür spricht auch die Tatsache, dass Histonproteine gemeinsam mit

Cytochrom C zu den am stärksten konservierten Proteinstrukturen der

Säugetiere gehören 39. Die Primärstruktur der Histone blieb im Zuge der

Evolution praktisch unverändert, sodass sie sich beim Vergleich zwischen

verschiedensten Spezies nur um wenige Aminosäuren unterscheiden39. Daher

war es auch möglich, beim Tierexperiment mit Ratten das humane Histon

H1.2 einzusetzen.

Es wurde außerdem gezeigt, dass Histon H2A, aus dessen enzymatischen

Spaltung die antimikrobiellen Peptide Buforin I und II der asiatischen Kröte

Bufo bufo gargarizans und das Parasin des Katzenfisches P. asotus entstehen

53, einen anderen antimikrobiellen Wirkmechanismus aufweist. Dabei kommt es

nicht zur Bildung von Poren in der Zellmembran der Bakterien und zum

Kollaps des Membranpotentials, sondern zur Ansammlung des Peptids in der

Zelle und zur daraus folgenden Interaktion mit der bakteriellen DNA 55.

Die Ergebnisse dieser Studie verstärken die Annahme, dass Histon H1.2 ein

Protein ist, das die eukaryonten Lebewesen schon seit Millionen von Jahren

vor gefährlichen Infektionen schützt. In Zukunft könnte daraus eine Ergänzung

oder eine Alternative zu den derzeit bekannten Antibiotika entstehen.

Ein besonderer Schwerpunkt in der klinischen Anwendung des Histon H1.2

könnten lokale oder systemische Infektionen mit unterschiedlichen

Mikroorganismen sein. So beispielsweise bei Infektionen mit unterschiedlichen

Bakterienstämmen oder sogar mit unterschiedlichen Erregerspezies: mit Pilzen

und Bakterien. Ein idealer Anwendungsbereich wäre die Behandlung von

Brandwunden – auch wegen des typischerweise breiten und vom Wundalter

abhängigen Erregerspektrums.


63

Denn direkt nach der Verbrennung ist die Wundoberfläche aufgrund der

Hitzeeinwirkung steril. Doch bereits innerhalb von 48 Stunden wird sie von

grampositiven Bakterien besiedelt, die von den Haarfollikeln und aus der

Umgebung einwandern. Zwischen dem vierten und dem siebten Tag werden

diese Bakterien durch stärker virulente gramnegative Bakterien ersetzt. Nach

ungefähr einer Woche kommt es meistens zur Besiedlung mit Pilzen, vor

allem mit Candida albicans 18.

Eine überaus niedrige hämolytische Aktivität des Histon H1.2 erhöht die

Wahrscheinlichkeit, dass dieses Protein bei einer systemischen Applikation

keine oder nur geringe Nebenwirkungen verursacht. Das infizierte

Rattenverbrennungsmodell war auf eine topische Applikationsform beschränkt.

Aus diesem Grund könnte der nächste Schritt der Histon H1.2 –

Untersuchungen ein Nachweis der antimikrobiellen Wirkung des Histonproteins

H1.2 bei systemischen Infektionen sein. Des weiteren müsste man zunächst

durch Tierversuche und später in klinischen Studien herausfinden, welche

unerwünschten Wirkungen eine systemische Anwendung des Histon H1.2 mit

sich bringt.

Wir wissen bereits, dass das Histon H1.2 und die meisten antimikrobiellen

Peptide denselben Wirkmechanismus besitzen. Aufgrund dessen könnte man

weiteren Vermutungen nachgehen, dass Histon H1.2 noch andere, für den

Menschen nützliche, Eigenschaften der antimikrobiellen Peptide besitzt. Man

könnte überprüfen, ob Histon H1.2 wie die Cathelizidine in der Lage ist, die

Angiogenese zu stimulieren und die Wundheilung zu beschleunigen oder ob

es wie LL37 und humane Defensine, das Immunsystem triggern kann 2,31.


64

Ein weiterer Forschungsschwerpunkt könnte die Untersuchung der antiviralen

Aktivität des Histon H1.2 sein, die bei α - Defensinen 1 bis 3 gegen HIV

demonstriert wurde 92.

Die aktuellen klinischen Studien und die Ergebnisse dieser Arbeit machen uns

sehr optimistisch, dass mit Hilfe der physiologisch im Körper vorkommenden

Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems in Zukunft eine wirkungsvolle

Therapiealternative für Wundinfektionen entwickelt werden kann.

Alexander Baraniskin Zusammenfassung

65

5. ZUSAMMENFASSUNG

Die Haut ist ein wichtiger Schutzschild des menschlichen Körpers gegen

pathogene Mikroorganismen. Verbrennungen, die diesen Schutzschild zerstören,

und die daraus resultierende Immunsuppression prädisponieren Schwerbrand-

verletzte zu Wundinfektionen durch unterschiedliche Mikroorganismen mit hoher

Sepsisgefahr.

Im Rahmen dieser Studie sollte untersucht werden, ob rekombinantes

humanes Histon H1.2 als Lokaltherapie von Wundinfektionen einsetzbar ist.

Es wurden die antimikrobiellen Eigenschaften des Histon H1.2 in vitro

charakterisiert. Zudem wurden sowohl die hämolytische als auch die

zytotoxische Aktivität des Histon H1.2 bestimmt. In diesen Versuchsreihen

verglichen wir das Histon H1.2 mit dem antimikrobiellen Peptid Protegrin-1 und

mit klinisch eingesetzten Antibiotika und Antimykotika. Im weiteren Verlauf

wurde in einem infizierten Rattenverbrennungsmodell die antibakterielle Aktivität

von Histon H1.2 (25 µg/ml, 250 µg/ml und 2500 µg/ml) mit derjenigen von

Protegrin–1 (Positivkontrolle) und PBS (Trägerkontrolle) verglichen.

Das humane Histon H1.2 zeigte ausnahmslos eine signifikant stärkere

antimikrobielle Aktivität im Vergleich zu den klinisch eingesetzten Antibiotika

und Antimykotika bei praktisch fehlender hämolytischer Aktivität. In den in vivo

Versuchen konnte eine signifikante Reduktion der Bakterienzahl in den

infizierten Verbrennungswunden gezeigt werden.

Aufgrund der Ergebnisse dieser Studie sollte das Histon H1.2 künftig zu den

Effektormolekülen des angeborenen Immunsystems gezählt werden.

Alexander Baraniskin Literatur

66

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Factor. Science 298: 995

Alexander Baraniskin Danksagung

81

7. DANKSAGUNG

An dieser Stelle möchte ich ganz besonders Herrn Juniorprofessor Dr. med

Lars Steinsträsser danken, der die vorliegende Arbeit sowohl im praktischen

als auch im schriftlichen Teil hervorragend betreut und unterstützt hat.

Ein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Hans - Ulrich Steinau und Herrn Prof. Dr. Sören

Gatermann für die Rahmenbedingungen, die diese Promotionsarbeit ermöglicht

haben.

Außerdem möchte ich für die Hilfe bei der Durchführung der Doktorarbeit Dr.

Frank Jacobsen, Janine Mertens, Dominik Mittler, Mohammadi – Tabrisi Ahmad,

Andrea Gerhards, und Michaela Soltau danken.

Ein besonderer Dank gilt Susanne Friedrich und Gottlieb Pazdzierny für die

Einführung und Hilfe bei der Durchführung der Experimente in der Abteilung

für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr – Universität – Bochum.

Alexander Baraniskin Publikationen

82

PUBLIKATIONEN Publikationen

- Jacobsen F, Baraniskin A , Mertens J, Mittler D, Mohammadi – Tabrisi

A, Soltau M, Steinau H. U, Steinstraesser L. Antimicrobial activity of

Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. Journal of

Antimicrobial Chemotherapy. 2005 März,16

Präsentationen auf wissenschaftlichen Kongressen

- Baraniskin A , Pazdzierny G, Tabresi A. M, Lehnhardt M, Steinau H. U,

Steinstraesser L: Antimikrobielle Akivität von Histonen. 34 Jahrestagung

der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen (VDPC), Freiburg 30

Sept. – 5 Okt 2003

- Steinstraesser L, Baraniskin A , Pazdzierny G, Lehnhardt M, Steinau H.

U: Antimikrobielle Aktivität von humanen Histonen im

Verbrennungsmodell. Deutsche Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungs-

verletzungen (DAV) 2004 Rottach – Egern 6.- 9. Januar 2004

- Jacobsen F, Baraniskin A , Lehnhardt M, Druecke D, Mittler D,

Mohammadi - Tabrisi A, Steinau H. U, Steinstraesser L: Antimicrobial

activity of human Histone H1.2 in vitro and in infected burn wounds. 2nd

World Union of Wound Healing Societies Meeting, N003 p. 33, Paris, 8

– 13 July 2004

Alexander Baraniskin Publikationen

83

- Baraniskin A , Jacobsen F, Lehnhardt M, Mertens J, Mittler D,

Mohammadi – Tabrisi A, Soltau A, Steinau H. U, Steinstraesser L:

Antimicrobial activity of recombinant human Histone H1.2 in vitro and in

infected burn wounds. The plastic Surgery Research Council 49th annual

meeting, Univeristy of Michigan, Ann Arbor, Abstract 94 B, P 323. June

9 - 12, 2004

- Jacobsen F, Baraniskin A , J. Mertens, D. Mittler, A. Mohammadi -

Tabrisi, S. Schubert, M. Soltau, B. Behnke, S. Gatermann, M.

Lehnhardt, H. U. Steinau, L. Steinsträßer: Antimikrobielle Aktivität von

humanem Histon H1.2 im infiziertem Verbrennungsmodell 34

Jahrestagung der Vereinigung der deutschen Plastischen Chirurgen

(VDPC), Düsseldorf 22 – 25 Sept 2004

Alexander Baraniskin Lebenslauf

84

8. LEBENSLAUF Name: Baraniskin Alexander Geburtsdatum: 03. 09. 1979 Geburtsort: Donezk, Ukraine Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: verheiratet mit Maria Baraniskin, geb. Molchan Schulische Ausbildung: 09. 1986 – 12. 1993 Mittelschule in Donezk, Ukraine

01. 1994 – 06. 1994 Mittelschule in Meerane

08. 1994 – 05. 2000 Gymnasium, Reinoldus – und - Schiller in

Dortmund

Hochschulausbildung: Ab 10. 2000 Studium der Medizin an der Ruhr –Universität-

Bochum

08. 2002 Ärztliche Vorprüfung 08. 2003 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Auszeichnungen: 01. 2004 Gewinner des Fakultätpreises 2003 der

Medizinischen Fakultät der Ruhr–Uni-Bochum

Antimikrobielle Aktivität des Histon H1.2 in vitro und in ... · Salvarsans in die Therapie der...

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