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Assoziationen in dicht gepackter Umgebung und

Excluded Volume Effekt

22.06.2004Ina Meiser

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Gliederung

Einleitung Was ist excluded volume? Modell für makromolekulare dicht gepackte

Umgebungen Beobachten von makromolekularen Reaktionen in

dicht gepackter Umgebung Effekte von dicht gepackten Umgebungen auf

Proteinfaltung Ausblicke

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Crowded Environment(dicht gepackte Umgebung)

Zellen enthalten viele Makromoleküle die einen Großteil des Gesamtvolumens besetzen (10-40%), sie sind also dicht gepackt

→ crowded media oder auch: volume-occupied media

crowded ≠ konzentriert

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Probleme bei Experimenten

in vivo: bis zu einigen hundert g/l von verschiedenen Makromolekülen in einem biologischen Medium

in vitro: Medien stark verdünnt, selten ist die Konzentration höher als 1g/l und weniger Makromoleküle insgesamt

→ Crowding kann durch Zufügen von synthetischen

oder natürlichen Molekülen nachgeahmt werden

(genannt: crowders oder crowding agents)

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Excluded Volume(ausgeschlossenes Volumen)

Grundlegendes Prinzip: Gegenseitige Undurchdringlichkeit von Molekülen

→ nur sterische Abstoßung als fundamentale Wechselwirkung

Anschaulich: Bechermodell

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Excluded Volume:Konsequenzen

Für kleine T:

Erreichbares Volumen ist fast gleich dem unbesetzten

Für große T:

erreichbares Volumen wird kleiner, Beitrag der räuml. Abstoßung zur reduzierten Entropie und steigenden freien Energie wird entsprechend größer

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Excluded Volume:Entropische Konsequenzen

Minimierung des ausgeschlossenen Volumens bedeutet Reduzierung der freien Energie

→ Konsequenz von Crowding:

Erleichterung von Prozessen die zu einer Abnahme des excluded volume führen

Crowding wird die Assoziation von Molekülen erleichtern die schon die Tendenz haben sich zusammenzulagern, es wird diese Tendenz aber nicht de novo erzeugen

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Thermodyn. Modell für Vorhersage von Einflüssen des excluded volume effects

D.Hall, A. Minton: Einfaches Modell mit starren globulären Proteinen die nur durch räumliche Abstoßung miteinander interagieren

→ Experimentell gemesse Aktivitätskoeffizienten können erstaunlich korrekt geschätzt werden konnten

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Thermodyn. Modell für Vorhersage von Einflüssen des excluded volume effects

Allgem. Reaktionsgleichung r = stöchiometrischer

Koeffizient des Eduktes R p =stöchiometrischer

Koeffizient des Produktes P ‚nicht idealer Faktor‘ , ein

zusammensetzungsabhängiges Maß für Interaktionen von gelösten Stoffen

Thermodynamischer Aktivitätskoeffizient

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Anwendung des Modells

Gelöstes globuläres Protein T dessen Aktivitätskoeffizient bestimmt werden soll

Ein zweites globuläres Protein C als crowder, das einen Teil Ф des Gesamtvolumens besetzt

→Starkes Ansteigen der Aktivitätskoeffizienten bei zunehmendem ausgeschlossenen Volumen

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Beispiel:Einfache Isomerisationsreaktion

Reactant ↔ Product

Jede Konformationsänderung die das effektive Volumen des gelösten Stoffes erhöht (z.B. Proteinentfaltung) wird schrittweise mit Zunahme des crowding inhibiert

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Beispiel:Reaktion von n Monomeren zum n-Mer

n Reactants ↔ Product

Zusammenlagerung wird mit zunehmendem crowding erleichtert

Ausmaß des crowding Effekts wächst mit zunehmendem Grad der Zusammenlagerung

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Zusammenfassung der Effekte auf Reaktionen in crowded media

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Grenzen des Modells und mögliche Verbesserungen (I)

Solvent wird als Kontinuum angenommen

→ effektives Interaktionspotential zwischen gelösten Stoffen ist unempfindlich gegenüber der molekularen Natur des Solvents

Einfluss von ‘soften‘ Interaktionen

→ können durch Vergrößerung der Partikelradien in das Modell eingebaut werden

Nicht-Additivität von soften Interaktionen

→ z.B. elektostatische Abstoßung

Modell gibt keine realistische Beschreibung der Interaktionen

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Grenzen des Modells und mögliche Verbesserungen (II)

Einfluss von strukturellen Details

→ brauchbare Schätzungen von excluded volume benötigen eine gute Auflösung von Größe und Form der interagierenden Partikel

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Wie beobachtet man makromolekulare Reaktionen in crowded media? (I)

Fluoreszenzbasierte Methoden

→ messen die Abnahme der brownschen Bewegung eines fluoreszenzmarkierten Protein, wenn es mit anderen Proteinen assoziiert

FRET (Fluorescence resonace energy transfer)

→spürt durch crowding eingeleitete Konformations-änderungen auf

FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)

→misst die Verteilungsbewegung von fluoreszenzmarkierten Molekülen

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Wie beobachtet man makromolekulare Reaktionen in crowded media? (II)

NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

→ Charakterisieren makromolekulare Bewegungen und Konformationen in crowded media in lebenden Zellen

Cryoelektronenmikroskopie

→Sichtbarmachen des Zellinneren und Aufspüren von komplexen makromolekularen Zusammenlagerungen

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Effekte von Crowding auf Proteinfaltung an einem Beispiel

A. Elcock (Iowa,USA) simulierte die ‘Flucht‘ von einem Rhodanese-Molekül aus dem GroEL-Käfig (Chaperon)

Experimentelle Durchführung von Martin und Hartl (Tübingen)

→ hohe crowder Konzentration zwingt die Faltungszyklen in dem gleichen GroEL-Käfig abzulaufen

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GroEL/GroES Aufbau

2 heptamere Ringe die einen Zylinder bilden (GroEL)

Heptamere Kappe die sich anlagert und den Innenraum vergrößert (GroES)

Lewin, Molekularbiologie der Gene

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GroEl/GroES Mechanismus

Schrittweiser Prozess Mit jedem Schritt geht

ATP-Hydrolyse einher GroES für Freisetzung des

Proteins Protein wird nach jedem

Faltungszyklus freigesetzt und wieder eingefangen

Lewin, Molekularbiologie der Gene

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Methoden

Brownsche Dynamiksimulation Das Profil der freien Energie wird berechnet, wenn

ein Rhodanese-Molekül aus dem GroEL-Käfig in Umgebungen mit verschiedenen Crowder-Konzentrationen entlassen wird

Rhodanesestruktur aus PDB

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Methoden bezüglich der Molekülstrukturen

GroES aus den Simulationen ausgelassen Rhodanese-Struktur: Kristallstruktur des komplett

gefalteten Proteins, weil die Simulationsmethode keine interne Flexibilität abdeckt

→ Ergebnisse werden höchstens unterschätzt Keine detaillierte Struktur für den crowder Ficoll 70

→modelliert als kugelförmiges Molekül (Radius: 30Å), alle Moleküle sind gleich

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Methoden

Interaktionen zwischen den Oberflächenatomen von Ficoll 70, GroEL und Rhodanese werden durch das Lennard-Jones-Potential modelliert

Jedes hinzugefügte crowder-Molekül wird zunächst an 10 zufällig gewählten Positionen platziert. Die Position mit der günstigsten Energie wird genommen

Verteilungskoeffizienten abhängig vom Molekulargewicht wählen

Bewegung der crowder simuliert durch den Ermak -McCammon - Algorithmus

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Berechnung von ∆G

Rhodanese wird in 0.5 Å Schritten von der Ausgangsposition im Käfig zu der Endposition (150 Å entfernt vom Käfigzentrum) bewegt

Änderung der freien Energie berechnet durch:

∆E = Differenz der Systemenergien, wenn sich Rhodanese an den Positionen x und x+0.5 Å befindet

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Ergebnisse (I)

Je größer die Konzentration an crowder-Molekülen, desto größer wird die zum Entfernen von Rhodanese benötigte Energie

→größere Konzentration an crowdern macht die ‘Flucht‘ von Rhodanese unwahrscheinlicher

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Ergebnisse (II)

Je größer die Konzentration an crowdern desto größer ist der Betrag an komplett gefalteten Rhodanesemolekülen

Experimentelle und berechnete Daten stimmen sehr gut überein

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Ergebnisse (III)

Crowder durch Ladungs-patches modifiziert

→ benötigte freie Energie erhöht sich beträchtlich, allerdings erst bei sehr hohen crowder-Konzentrationen

∆∆G‡ = freie Energie bei Anwesenheit der crowder minus freie Energie bei Abwesenheit der crowder

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Analogie zum Hydrophoben Effekt

Wenn crowder-Moleküle am liebsten miteinander interagieren:

→ Störungen der crowder-crowder Interaktionen werden begrenzt

→Dissoziation der gelösten Proteine wird verhindert

Eisberg Modell, Kauzberg 1959

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Ausblicke

Makromoleküle die die günstigsten Wechselwirkungen mit sich selbst eingehen als effektive crowder, die schwache Protein-Protein-WW stabilisieren

→ muss über excluded volume effect hinaus gehen

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Zusammenfassung der Effekte von Crowding:

Vergrößert die Reaktivität von Makromolekülen Proteinfaltung wird unterstützt Beeinflusst biochemische, biophysische und

physiologische Prozesse Bsp.: Nukleinsäure und Proteinkonformation Protein-Protein- und Protein-DNA- Assoziationsgleichgewichte und Kinetik katalytische Aktivität von Enzymen Regulation des Zellvolumens

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Referenzen

Rivas, G., Ferrone, F., and Herzfeld, J., (2004) EMBO Reports, 5, 23-27. Life in an Crowded World: Workshop on the Biological Implications of Macromolecular Crowding.

Hall, D. and Minton, A.P., (2003), Biochim. Biophys. Acta, 1649, 127-139. Macromolecular Crowding: Qualitative and Semi-Quantitative Successes, Quantitative Challenges.

Elcock, A.H., (2003) Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 2340-2344. Atomic-Level Observation of Macromolecular Crowding Effects: Escape of a Protein from the GroEL Cage.