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Aufbau eines Assays zur Detektion yon Ascaris suum-Antigenen auf der Basis yon Ig Y

Anne Schniering, Riidiger Schade I,Theo Hiepe?'Institut fur Pharmakologie und Toxikologie, Universitatsklinikum Charite der Humboldt-Universitat, D-Berlin2Institut fur Parasitologie und Tropenveterinarmedizin, Freie Universitat, D-Berlin

ZusammenfassungGegenstand del' vorliegenden Arbeit ist es, die Entwicklungeines Kopro-Antigen-Testes zum Nachweis von Askariden-antigen in Faeces unter Verwendung vitelliner Antikorpervon Legehennen zu beschreiben.Als Untersuchungsverfahren wurde del' indirekte Zwei-Seiten-Enzymimmunoassay (EIA) gewiihlt, del' folgenderma-fsen aufgebaut war: Affinitdtschromatographiscn gereinigteAntikorper wurden. als Fangantikorper an die Mikrotiter-platte gekoppelt. Auf den zu testenden Kotprobenextraktfolgte del' Primarantikorper, ein aus dem Dotter isolierter,grob gereinigter polyklonaler, avidrer Antikorper (Ig Y), del'schliejJlich durch einen enrymkonjugierten Anti-Spezies-Antikorper erkannt werden konnte.Bei hoher Sensitivitdt (5 Nanogramm Antigen pro MilliliterPuffer) erwies sich der Test hinsichtlich anderer beimSchwein vorkommender Intestinalparasiten als ausreichendspezifisch. Kreuzreaktionen mit Spulwurmern andererTierarten traten erwartungsgemafi aufDie Verwendung von avidren Antikorpern neben Saugeran-tikorpern in einem Zwei-Spezies-El/i verspricht eine hoheSensitivitat, da aufgrund des phylogenetischen Unterschie-des von Vogel und Sduger unspezifische Reaktionen vermin-dert auftreten.

1 Einleitung

Bei der Schlachtkorperuntersuchung aneinheimischen Schlachthofen werdenseit Jahren nahezu unverandert 10-15%der Schweinelebern aufgrund von He-patitis interstitialis parasitaria multi-plex chronica, den sogenannten Mi1ch-flecken, verworfen (Kraneburg, 1993).Die Ursache dafur sind im wesentli-chen Spulwurmlarven von Ascarissuum auf ihrer Wanderung durch denWirtsorganismus. Auch beim Reini-gungsprozess der Schweinedunndarmein den Kutteleien sind Spulwurrner einalltaglicher Anblick. Demgegeniiberstehen nur relativ wenige Spulwurmei-befunde bei koproskopischen Untersu-chungen, d.h. bei der traditionell ubli-chen Untersuchung auf Spulwurmer.Wahrend der 6-9-wbchigen Prapa-

tenzperiode ist eine Infektion kopro-

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Summary: Development of an IgY-based assay for thedetection of ascaris-suum-antigens.The presented paper describes the development of a co-proantigen-test for the detection of ascariosis in pigs usingvitelline chicken antibodies.The method used for these investigations was an indirecttwo-sided-enzyme-immuno-assay (EIA), which was set up asfollows: Affinity-purified rabbit antibody was bound to themicrotiter-plate as the catching antibody. After the faecesextract to be tested followed the primary antibody, whichwas a roughly purified avian antibody (JgY). This againcould be detected by an enzyme-conjugated antispeciesantibody.Sensitivity was high as 5 nanograms antigen per milliliterbuffer could be detected. Cross-reactions with antigen ofother intestinal parasites occuring in pigs did not becomeobvious. Cross-reactions with ascarids of other species weredemonstrated as expected.The employment of avian antibodies in a two-species EIApromises high sensitivity as unspecific reactions seldomoccur because of the phylogenetic difference between birdsand mammals.

Keywords: copro antigen, 19 Y, ascaris suum, EIA

skopisch nicht nachweisbar. Daniberhinaus scheiden weibliche Spulwiirmerdiskontinuierlich, mannliche gar keineEier aus. Da dieser Kopro-Antigen-Nachweis nicht Eier, sondern Spul-wurmantigen im Kot nachweist, laEtdieses neue Verfahren eine Verbesse-rung der Sensitivitat erwarten.Zunachst in der Virologie angewen-

det (Middelton et aI., 1976; Yolken etal., 1977), fand der Kopro-Antigen-Nachweis zunehmend Aufmerksamkeitvon parasitologischer Seite. Inzwi-schen ist er moglich fur protozoareKrankheitserreger (Root et al., 1978;Grundy, 1982; Ungar et al., 1985;Anand et al., 1985; Baumann undGottstein, 1987; Grundy et aI., 1987;Craft und Nelson, 1982; Ungar et aI.,1984; Stibbs et al., 1988; Vinayak etaI., 1991; Hopkins et al., 1993; ElShewy et al., 1994), fur einige Cesto-

denspezies (Machnicka und Krawczuk,1988; Deplazes et aI., 1990; Allan undCraig, 1989; Allan et al., 1990; Maasset al., 1991; Deplazes et al., 1991;Allan et al., 1992; Maass et aI., 1992;Deplazes et al., 1992; Allan et aI.,1993) und fur den Trematoden Fascio-la gigantica (Youssef et aI., 1991).Ein wichtiges Anliegen der Untersu-

chungen war die Klarung der Frage, obHuhnerantikorper zum Nachweis vonKopro-Antigen erfolgreich eingesetztwerden konnen. In einem Zwei-Spezi-es-EIA ist die Verwendung von aviarenAntikorpern neben Saugerantikorpern- anstatt von Antikorpern von zweiverschiedenen Saugerspezies - vonVorteil, da aufgrund des phylogeneti-schen Unterschiedes von Huhn undKaninchen unspezifische Reaktionenvermindert auftreten (Larsson und Sjo-quist, 1990).

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Abgesehen davon, daf die Produkti-on von IgY den alternativen Tierver-suchsmethoden zugerechnet wird, ver-dienen diese Ak auch und nicht zuletztBeachtung unter dem Aspekt der spezi-esbedingten Vorzuge.

2 Versuchstiere, Material undMethoden

2.1 Zur Antigengewinnungkonnten sowohl mannliche als auchweibliche Askariden in der Kutteleieines Schlachthofes aus noch warmemDarminhalt entnommen und eingesetztwerden. Diese wurden in steriles prote-infreies Nahrmedium uberfuhrt. DerWechsel des Mediums erfolgte alle 6bis 8 Stunden, bis die Askariden einensterilen Status erreicht hatten. Zweiverschiedene Antigene wurden zur An-tikorpergewinnung erprobt: Zur Her-stellung von Somatischem-AG (So-AG) wurden mehrere Ascariden homo-genisiert, zentrifugiert und der fli.issigeUberstand nach Sterilfiltration tiefge-froren. Exretorisch-Sekretorisches-AG(ES-AG) enthielt losliche Parasitenan-tigene und wurde aus dem Nahrmedi-urn nach Filtration und Konzentrierunggewonnen.

2.2 Zur Antlkorpergewinnungwurden 12 Htihner und 3 Kaninchenmit verschiedenen Dosierungen beiderAntigene in Freundschem KomplettenAdjuvans immunisiert und die Injektio-nen an den Tagen 28, 63 und 160 nachder Primarimmunisierung wiederholt.Die Huhnerantikorper wurden aus demEidotter isoliert, die Kaninchenantikor-per wie iiblich aus dem Serum.

2.3 Aufarbeitung der KotprobenKot wurde zu gleichen Teilen miteinem detergenzhaltigen Puffer ver-mischt, mit einem Ultraschalldesinte-grator behandelt und anschlieBend zen-trifugiert. Der Uberstand wurde 1:I mitfetalem Kalberserum (FKS) versetztund bis zum Einsatz im EIA tiefgefro-ren.

2.4 Untersuchung von ProbenUber 900 Schweinekotproben, die zumTeil Eier von Ascaris suum, Trichurissuis und Magen-Darm-Strongylidenenthielten, wurden sowohl koprosko-pisch als auch im EIA untersucht.

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Ebenso wurden 96 humane Stuhlpro-ben im Koproantigentest eingesetzt. Da-von enthielten 44 Proben Eier von einemoder mehreren Intestinalparasiten.Zur genaueren Abklarung von

Kreuzreaktionen fanden auch Kotpro-ben von Hunden mit verschiedenenIntestinalparasiten Verwendung, sowieeine Antigen-Sammlung aus dem Ziiri-cher Institut fur Parasitologie mit di-versen, meist parasitaren Antigenen.

2.5 Aufbau und Durchfiihrung desEIA

Bei diesem Koproantigentest handeltes sich urn einen indirekten Zwei-Seiten-Enzymimmunoassay. Polyklo-nales Anti-Ascaris suum-IgG wurdenach einer Vorreinigung mit AbX,einer Mischbettionenchromatographie-matrix uber Eurocell-ONB-Carbonat Aaffinitatsgereinigt und in einer Protein-konzentration von 6 ug pro Milliliterals Fangantikorper an die Festphasegebunden. Es foIgte der fragliche Kot-probenextrakt. AIs Primarantikorperdiente aus Eidotter von hyperimmuni-sierten Huhnern gewonnenes Anti-As-caris suum-IgY und als Sekundaranti-korper ein kommerzieller peroxidase-markierter Kaninchen-Anti-Huhn-An-tikorper.Die Verwendung von fetal em Kal-

berserum als Probenzusatz ist fur die-sen Test unabdingbar. SpezieJl diepositiven Proben konnen sonst in ihrer

Aufbau des Kopro-Antigen-EIA

Sekundarantlkorper:Kan·Anli·HuhnPOD

Primarantlkorper:Huhn·Anti·SoAG·lgY

Spulwurmantigen

FanganUk6rper:Kan-Anf SoAG IgG

Abbildung 1: Aufbau des Koproantigen-EIAFanq-Antikorper = Kan-Anti-Ascarissuum-lgGo = SpulwurmantigenPrlrnarantikorper = Huhn-Anti-Ascarissuum-lgYSekundarantikcrper = Kan-Anti-Huhn-IgG, peroxidasemarkiert

Extinktion eine derartige Abschwa-chung erfahren, daf sie nicht mehr aIssolche erkannt werden. Dieses Phano-men wird in der Literatur mit einerproteolytischen Aktivitat von Kotin-haltsstoffen erklart, welche die Schichtmit den Fangantikorpern schadigt, DerZusatz von 50 % FKS vermindert dieseSchadigung erheblich.

3 Ergebnisse und Diskussion

Zunachst wurde der CutOff-Wert auseiner Anzahl Kotproben aus spulwurm-freien Schweinebestanden ermittelt.Dazu wurde der Durchschnitt der Ex-tinktion plus der 4-fachen Standardab-weichung berechnet. Dieser Wert isthier mit der durchgezogenen Liniegekennzeichnet. Zusatzlich wurde einBereich zwischen der zwei- und vierfa-chen Standardabweichung iiber demExtinktionsdurchschnitt der negativenProben ermittelt, in dem eine Probe alsfraglich bezeichnet wird. Dieser Be-reich liegt also zwischen den zweiLinien. Aile Proben unterhalb der un-terbrochenen Linie lassen auf ein Freis-ein von Spulwiirmem schlieBen.Es folgen die Extinktionswerte von

koproskopisch Ascaris-positiven Kot-proben. Die zwei .falschnegativen"Proben waren koproskopisch schwachpositiv, in einer davon konnte sogarnur ein Askaridenei gefunden werden.Die Moglichkeit von Spulwurmeiernals Darmpassanten ist hierbei zur Er-klarung des falsch-negativen Ergebnis-ses in Betracht zu ziehen.Die nachste Spalte stellt die Tester-

gebnisse von koproskopisch negativenKotproben von Schweinen aus spul-wurmbelasteten Bestanden dar. Dabeibleibt leider unklar, ob es sich wirklichum falsch-positive Ergebnisse in EIAoder urn falsch-negative in der Kopro-skopie handelt, da der Darminhalt derbetreffenden Schweine nicht auf Hel-minthen untersucht werden konnte.Aus der Literatur ist es jedoch bekannt,daB man bei der Koproskopie miteinem mehr oder weniger grofien An-teil falsch-negativer Ergebnisse rech-nen mull.Der EIA hat eine Empfindlichkeit

von unter 5 ng Protein So-AG proMilliliter Puffer. In Kotprobenextraktlag die Nachweisgrenze bei 50 ngAntigen pro Milliliter. So zeigte sich,

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1000

800 --- _

c: 600o~c:~ 400

:200

Gruppe 1 2

=. ••

3 4 5

Abbildung 2: Extinktionen im Koproantigen-EIA - Testung von Schweinekotprobenaus folgenden Gruppen:Gruppe 1: Kotproben aus Askariden-freien SchweinebestandenGruppe 2: Kotproben, welche koproskopisch Spulwurmeier enthieltenGruppe 3: koproskopisch negative Proben aus Bestanden mit SpulwurmproblemenGruppe 4: koproskopisch Eier von Magen-Darm-StrongylidenGruppe 5: koproskopisch Eier von Trichuris suis

daB mit dem Einsatz aviarer AntikorperTestsysteme mit hoher Empfindlichkeitaufgebaut werden konnen.Was die Spezifitat des Testes betrifft,

liegen folgende Untersuchungen vor:10 Proben enthielten Trichuris-, 21Proben MDS-Eier, davon zwei mas-senhaft. Eine Probe mit MDS-Eiernerschien fraglich, die ubrigen warennegativ. Kreuzreaktionen mit diesenParasiten sind demnach unwahrschein-lich.Zu den Ergebnissen der untersuchten

Humanstuhlproben: Eine deutlicheKreuzreaktion liegt erwartungsgemalsmit Ascaris lumbricoides, dem Spul-wurm beim Menschen vor. Es stelltesich die Frage, ob dieser Test mogli-cherweise auch zur Spulwurmdiagno-stik beim Menschen einsetzbar ist.Stuh1proben mit Wurmeiern auch vonHakenwurmern, Trichuris trichiura,Schistosomae, Strongyloides, Taeniasaginata und Hymenolepis nana wur-den im Test zur Klarung der Spezifi-tatsfrage untersucht. Den Ergebnissenzufolge ist eine Kreuzreaktion mit Hy-menolepis nana rnoglich und mitTaenia saginata sogar wahrscheinlich.Allerdings ist ein Spulwurmbefall die-ser Probanden nicht mit SicherheitauszuschlieBen, insbesondere da essich bei ihnen oft um Einreisende oder

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Ruckkehrende von Auslandsaufenthal-ten handelte, wo eine Spulwurminfek-tion wahrscheinlicher ist als inDeutschland.1m Rahmen von Spezifitatsuntersu-

chungen gelangten auch 54 Hundekot-proben zur Untersuchung. In vielenwaren koproskopisch Eier von divers enIntestinalparasiten nachgewiesen wor-den; und zwar Toxocara canis (10Proben), Trichuris vulpis (10), Ancylo-stoma caninum (5), Taenia hydatigena(4), Echinococcus multilocularis (5)und Echinococcus granulosus (5). Da-von lagen Kreuzreaktionen lediglichmit Toxocara canis vor. Die Extinkti-onswerte dieser Proben liegen imDurchschnitt deutlich iiber denen derProben, welehe Antigen von anderenParasiten beinhalten. Man kann jedochnur von einer teilweisen Kreuzreaktivi-tat sprechen, da die durchschnittlichenExtinktionswerte von Schweinekotpro-ben mit Spulwurmantigen nicht er-reicht werden.Bei der Untersuchung der Ziiricher

Antigene bestatigten sich Kreuzreak-tionen zu Ascaris lumbricoides, Toxo-cara canis, Ascaridia galli und iiberra-schenderweise Taenia saginata. AIleiibrigen Antigene, darunter auch vonHy-menolepis nana kreuzreagiertennicht.

Zur Immunisierung wurde FCA ver-wendet, um eine hohe spezifische Im-munantwort zu erhalten. Zudem gingman damals bei der Versuchsplanungnoch davon aus, daB die bei Saugernbeobachteten entzundlichen Lokalreak-tionen bei Huhnern in geringeremMaBe auftreten als bei Saugetieren.Wie die pathologischl histologischeUntersuchung ergab, bewirkte die Im-munisierung von FCA sehr wohl Ver-anderungen. Ausfuhrliche Untersu-chungen in dieser Richtung hat Christi-ne Schwarzkopf (BgVV, Berlin)durchgefiihrt.Auch die in dieser Arbeit festgesteIl-

te, teils drastische Verminderung derLegeleistung spricht fur eine Beein-trachtigung der Versuchstiere durch dieImmunisierungsprozesse; bei einigenHuhnern sistierte die Legeleistung uberWochen nach den Boosterimmunisie-rungen. Bisher wurde von soleh star-ken Einbriichen der Legeleistung nichtberichtet. Die Legeleistung scheintdurch den Einsatz von vira1en Antige-nen re1ativ schwacher beeinfluBt zuwerden als durch bakterielle oder para-sitare Antigene, am wenigsten jedochdurch Serumproteine. Es ist wahr-scheinlich, daB Extrakte und E/S-Pro-dukte von Ascaris suum mit zu dieseraufsergewchnlich starken Wirkung bei-tragen. Dafiir spricht auch die seitlangem bekannte Tatsache der Toxizi-tat von Ascaris-Extrakten.

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DanksagungDank gebuhrt Frau Dr. Hegenscheid,Frau Menninger, Frau Dr. Kohler undHerrn Dr. Deplazes fur die freundlicheUberlassung von koproskopisch unter-suchten Faeces.Diese Arbeit wurde finanziell mit Mit-teln des Bundesministeriums fur For-schung und Technologie (0310124A)untersttitzt.

KorrespondenzadresseDr. Anne Schnieringzu erreichen iiber:Institut fur Pharmakologie undToxikologieUniversitatsklinikum Charite derHumboldt- UniversitatDorotheenstr. 94D-lO 117 Berlin

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