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Aus dem Medizinischen Zentrum für Hygiene und Infektionsbiologie

Institut für Virologie Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

Die Rolle der Homooligomerisierung des Polymerasekofaktors VP35 im

Vermehrungszyklus des Marburg-Virus

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie

(Dr. rer. physiol.)

dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Peggy Möller aus Ilmenau

Marburg, 2005

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 03. Juli 2006. Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Dekan: Herr Prof. Dr. Bernhard Maisch Referent: Herr Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk 1. Korreferent: Frau Prof. Dr. Monika Löffler 2. Korreferent: Herr Prof. Dr. Karl-Klaus Conzelmann

Für meine Eltern

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis I

1 Einleitung 1

1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren 1

1.2 Klinik und Pathogenese der Marburg-Virus-Infektion 4

1.3 Morphologie des Marburg-Virus 6

1.4 Genomaufbau des Marburg-Virus 7

1.5 Proteine des Marburg-Virus 8

1.6 Replikationszyklus des Marburg-Virus 11

1.7 Interaktionen der Nukleokapsidproteine des Marburg-Virus 12

1.8 Coiled-Coil-Strukturen 13

1.9 Fragestellung 13

2 Material 15

2.1 Geräte 15

2.2 Chemikalien 16

2.3 Verbrauchsmaterialien 18

2.4 Kits 19

2.5 Puffer und Lösungen 20

2.5.1 Puffer 20

2.5.2 Lösungen 24

2.6 Wachstumsmedien 24

2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien 24

2.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen 25

2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide 25

2.7.1 Nukleinsäuren 25

2.7.2 Nukleotide 26

2.7.3 DNA-Oligonukleotide 26

2.8 Vektoren und rekombinante Plasmide 27

Inhaltsverzeichnis II

2.9 Proteine 29

2.9.1 Enzyme 29

2.9.2 Antikörper und Peptide 29

2.9.3 Proteinmarker 29

2.10 Radioaktiv markierte Substanzen 30

2.11 Zellen und Viren 30

2.11.1 Prokaryotische Zellen 30

2.11.2 Eukaryotische Zellen 30

2.11.3 Viren 30

3 Methoden 31

3.1 Molekularbiologische Methoden 31

3.1.1 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen durch

Polymerase-Ketten-Reaktion

31

3.1.2 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA 33

3.1.3 Anlagerung komplementärer Oligonukleotide 34

3.1.4 Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren 34

3.1.4.1 Analytische DNA-Agarosegele 35

3.1.4.2 Präparative DNA-Agarosegele 35

3.1.4.3 Formaldehyd-RNA-Agarosegele 35

3.1.5 Isolierung von Nukleinsäuren 36

3.1.5.1 Isolierung von DNA aus Agarosegelen 36

3.1.5.2 Isolierung replizierter RNA aus transfizierten Huh-T7-Zellen 36

3.1.6 Verdau von Nukleinsäuren 36

3.1.6.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukelasen 36

3.1.6.2 Verdau von RNA mit Mikrokokken-Nuklease 37

3.1.7 Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA 37

3.1.8 Reinigung von Nukleinsäuren 38

3.1.8.1 Reinigung von DNA-Fragmenten 38

Inhaltsverzeichnis III

3.1.8.2 Ethanolfällung von DNA-Fragmenten 38

3.1.8.3 Reinigung und Fällung von RNA-Fragmenten 39

3.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren 39

3.1.10 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterienzellen 40

3.1.11 Anzucht und Selektion rekombinanter Bakterien 40

3.1.12 Plasmidpräparation kleinen Maßstabes 40

3.1.13 Plasmidpräparation großen Maßstabes 40

3.1.14 Konzentrations- und Reinheitsbestimmungen von Nukleinsäuren 41

3.1.15 Sequenzanalyse mit dem Kapillarsequenzer MegaBASETM 500 41

3.2. Zellbiologische Methoden 42

3.2.1 Kultivierung von Vero-, Huh7- und Huh-T7-Zellen 42

3.2.2 Transfektion von Huh7-Zellen mit Lipofectamine PlusTM 42

3.2.3 Marburg-Virus-spezifisches Replikations- und Transkriptionssystem 43

3.2.4 Anzucht und Vermehrung von Marburg-Virus 45

3.3 Biochemische und immunologische Methoden 45

3.3.1 Radioaktive Markierung und Lyse von Huh7-Zellen 45

3.3.2 Vernetzung von Proteinen 46

3.3.3 CAT-Reportergenassay 46

3.3.4 Elektrotransfer von RNA (Northern Blot) 47

3.3.5 Elektrotransfer von Proteinen (Western Blot) 48

3.3.6 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse 49

3.3.7 In vitro Translation 50

3.3.8 Immunpräzipitation 50

3.3.9 Elektrophoretische Auftrennung und Visualisierung von Proteinen 52

3.3.9.1 SDS-PAGE 52

3.3.9.2 Autoradiographie und Bio-Imager-Analyse 53

4 Ergebnisse 54

4.1 Homooligomerisierung des Marburg-Virus VP35 54

Inhaltsverzeichnis IV

4.1.1 Homooligomerisierung des Marburg-Virus VP35 in Huh7-Zellen 54

4.1.2 Lokalisation der Homooligomerisierungsdomäne des VP35 55

4.1.2.1 Einfluss des N-Terminus auf die Homooligomerisierung des VP35 56

4.1.3 Charakterisierung der Homooligomerisierungsdomäne des VP35 57

4.1.3.1 In silico-Mutationsanalysen des Coiled-Coil-Motivs des VP35 57

4.1.3.2 Interaktionsstudien der VP35-Substitutionsmutanten 58

4.1.3.3 Übertragung der Coiled-Coil-Domäne des Marburg-Virus VP35

auf ein monomeres Reporterprotein

59

4.2 Funktionelle Charakterisierung der Homooligomerisierung

des Marburg-Virus VP35

62

4.2.1 Funktionelle Untersuchungen der VP35-Substitutionsmutanten 62

4.2.1.1 Titration der VP35-Substitutionsmutanten 62

4.2.1.2 Analyse der Replikations- und Transkriptionsaktivität

der VP35-Substitutionsmutanten

64

4.3. Interaktion der Marburg-Virus Nukleokapsidproteine VP35 und L 66

4.3.1 Lokalisation der L-Interaktionsdomäne auf dem VP35 66

4.3.1.1 Einfluss des N-Terminus des VP35 auf die

Interaktion mit dem L-Protein

67

4.3.2 Einfluss der Homooligomerisierung des VP35 auf die

Komplexbildung mit dem L-Protein

67

4.4 Hemmung der Marburg-Virus-Transkription durch

gemischte VP35-Oligomere

69

4.5 Interaktion der Marburg-Virus Nukleokapsidproteine VP35 und NP 72

4.5.1 Einfluss der Homooligomerisierung des VP35

auf die Interaktion mit NP

72

4.5.1.1 Immunfluoreszenzanalyse der Flag-markierten VP35-Substitutions-

mutanten nach Einzel- und Koexpression mit dem NP

72

4.5.1.2 Immunpräzipitationsanalyse des VP35Flag und der Flag-markierten

VP35-Substitutionsmutanten L90/104AFlag nach Koexpression mit

dem NP

74

Inhaltsverzeichnis V

4.5.2 Lokalisation der NP-Interaktionsdomäne auf dem VP35 76

4.5.2.1 Einfluss des N-Terminus des VP35 auf die Struktur der vom

NP-induzierten intrazytoplasmatischen Einschlusskörper

77

4.5.3 Einfluss der Coiled-Coil-Struktur des VP35 auf die Ausbildung der

vom NP-induzierten intrazytoplasmatischen Einschlusskörper

78

4.5.3.1 Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Mutante NP∆C1

nach Koexpression mit dem VP35Flag

79

4.5.3.2 Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Mutante NP∆C1 nach

Koexpression mit der VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag

80

4.6 Stöchiometrie der Marburg-Virus VP35-Homooligomere 82

4.6.1 Stöchiometrie des VP35 im Marburg-Virus-Partikel 82

4.6.2 Stöchiometrie des VP35 nach rekombinanter Expression 82

5 Diskussion 86

6 Zusammenfassung 96

7 Literaturverzeichnis 97

8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 108

9 Abkürzungsverzeichnis 111

10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen 113

11 Curriculum Vitae 117

12 Verzeichnis der akademischen Lehrer 118

13 Danksagung 119

14 Ehrenwörtliche Erklärung 120

1 Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Taxonomie und Epidemiologie der Filoviren

Das Marburg-Virus (MARV) bildet gemeinsam mit dem Ebola-Virus (EBOV) die Familie

der Filoviridae. Diese hochpathogenen Erreger rufen sowohl beim Menschen als auch

bei Primaten schwere fieberhafte, hämorrhagische Erkrankungen hervor, die mit hohen

Letalitätsraten einhergehen. Aufgrund ähnlicher serologischer, biochemischer und

molekularer Eigenschaften und der fadenförmigen Gestalt wurden MARV und EBOV

zur Familie der Filoviridae1 zusammen gefasst (Kiley et al., 1982).

Die Filoviridae gehören mit den Rhabdoviridae, Paramyxoviridae und Bornaviridae zur

Ordnung der Mononegavirales (Abb. 1). Sequenzanalysen haben gezeigt, dass die

Filoviridae den Paramyxoviridae phylogenetisch am nächsten stehen (Mühlberger et

al., 1992; Sanchez et al., 1992).

Ausbrüche von Filoviren wurden erstmals 1967 in Marburg, Frankfurt am Main und

Belgrad beobachtet (Siegert et al., 1967). Bei den erkrankten Personen handelte es

sich hauptsächlich um Laborarbeiter und Tierpfleger, die Kontakt mit Blut oder

Organen von aus Uganda importierten grünen Meerkatzen (Cercopithecus aethiops)

hatten. Insgesamt wurden 32 Krankheitsfälle registriert. Sieben von 26 primärinfizierten

Personen verstarben, wobei die 6 aufgetretenen Sekundärinfektionen durch einen

wesentlich milderen Krankheitsverlauf gekennzeichnet waren (Martini et al., 1968a,

Slenczka 1999). Das Virus wurde nach der Stadt Marburg benannt, da es hier isoliert

1 lat.: filum = Faden

Abbildung 1: Taxonomie der Filoviren. In Anlehnung an van Regenmortel et al. (2000), ICTVdB Management (2003)

Mononegavirales

Paramyxoviridae Filoviridae BornaviridaeRhabdoviridae

Ordnung

Familie

Genus

Spezies

Marburg-Virus (MARV)

Ebola-Virus (EBOV)

Marburg-VirusIvory Coast Ebola-Virus (CIEBOV)

Reston Ebola-Virus

(REBOV)

Sudan Ebola-Virus

(SEBOV)

Zaire Ebola-Virus

(ZEBOV)

Mononegavirales

Paramyxoviridae Filoviridae BornaviridaeRhabdoviridae

Ordnung

Familie

Genus

Spezies

Marburg-Virus (MARV)

Ebola-Virus (EBOV)

Marburg-VirusIvory Coast Ebola-Virus (CIEBOV)

Reston Ebola-Virus

(REBOV)

Sudan Ebola-Virus

(SEBOV)

Zaire Ebola-Virus

(ZEBOV)

1 Einleitung 2

und morphologisch charakterisiert wurde (Siegert et al., 1968). Tabelle 1 zeigt alle seit

1967 bekannten Filovirusinfektionen. Nach 1967 wurden zunächst vereinzelte MARV-

Fälle in Zimbabwe, Südafrika (1975) und Kenia (1980, 1987) dokumentiert (Gear et al.,

1975; Smith et al., 1982; Johnson et al., 1996).

Virus Genus Jahr Ort

humane Krankheitsfälle

(Todesfälle) Isolat

Marburg 1967 Deutschland /

Jugoslawien

32 (7) Rataycak / Popp

1975 Zimbabwe 3 (1) Ozolin

1980 Kenia 2 (1) Musoke

1987 Kenia 1 (1) Ravn

1998-2000 Republik Kongo 154 (128) ?

2004-2005 Republik Angola 374 (329) Angola

Ebola Sudan 1976 Sudan 284 (141) Boniface

Zaire 1976 Zaire 318 (280) Mayinga

Zaire 1977 Zaire 1 (1) Bonduni

Sudan 1979 Sudan 34 (22) Maleo

Reston 1989 USA 4 (0) Philippines

Reston 1992 Philippinen 0 Philippines

Reston 1992 Italien 0 Siena

Zaire 1994 Gabun 49 (29) Gabon

Ivory

Coast 1994 Elfenbeinküste 1 (0) Cote d’Ivoire

Zaire 1995 Zaire 315 (243) Kikwit



Reston 1996 USA 0 Pennsylvania

Sudan 2000-2001 Uganda 425 (224) ?

Zaire 2001-2 Gabun/Kongo 122 (110) ?

Zaire 2003 Republik Kongo 143 (128) ?

Zaire 2003-2004 Republik Kongo 35 (29) ?

Sudan 2004 Süd-Sudan 25 (6) ?

Zaire 2005 Republik Kongo 12 (9) ?

Tabelle 1: Ausbrüche von Filovirusinfektionen. In Anlehnung an CDC, 1996; Feldmann et al., 1996a; WHO 1978a, 1978b, 1992, 1996, 1997, 1999, 2000, 2001, 2003a, 2003b, 2004a, 2004b, 2005a, 2005b.

1 Einleitung 3

Seit Ende 1998 wurde aus Durba in der Demokratischen Republik Kongo (ehemals

Zaire) wiederholt von durch MARV verursachten hämorrhagischen Fiebererkrankungen

berichtet (Bertherat et al., 1999; WHO, 1999). Jedoch schien die Erkrankung, die in der

Bevölkerung unter dem Namen Durba disease bekannt ist, schon längere Zeit in dieser

Region endemisch zu sein, wobei die dokumentierten Fälle auf den Aufenthalt der

infizierten Personen in einer nahe gelegenen Goldmine zurückzuführen waren. Die

bisher größte durch das MARV verursachte Epidemie mit einer Mortalitätsrate von

88 Prozent ereignete sich von November 2004 bis Juli 2005 in der Provinz Uige der

Republik Angola, wobei von 374 infizierten Menschen 329 verstarben (WHO, 2005a). Das EBOV wurde erstmals 1976 anlässlich zweier annähernd zeitgleicher, aber

voneinander unabhängiger Ausbrüche fieberhafter Erkrankungen in Zaire und im

Sudan beschrieben. Das Virus wurde nach einem Fluss, der sich in der Nähe der

Epidemiegebiete befindet, benannt (Johnson et al., 1977). Die isolierten Erreger

konnten in zwei unterschiedliche Subtypen (Zaire und Sudan) eingeteilt werden. Mehr

als 600 Menschen wurden infiziert und die Mortalitätsraten lagen in Zaire bei

88 Prozent und im Sudan bei 53 Prozent. Ähnlich dem MARV traten nach 1976 eher

kleinere Episoden von EBOV-Infektionen auf. Anfang 1995 kam es in Kikwit (Zaire)

durch den EBOV-Subtyp Zaire zu einer bedeutenden Epidemie von hämorrhagischen

Fiebern, bei der von 315 infizierten Menschen 244 starben (CDC, 1995; Khan et al.,

1999; Sanchez et al., 1995). Im Jahre 1989 erkrankten in Reston (Virginia/USA) eine

Reihe von Cynomolgus-Affen (Macaca fascicularis), die von den Philippinen in die USA

importiert worden waren, an einem hämorrhagischen Fieber. Im Zusammenhang mit

dieser Epidemie wurde der EBOV-Subtyp Reston entdeckt, der für Affen hochpathogen

ist (Jahrling et al., 1990).

1994 erkrankte eine Wissenschaftlerin bei der Untersuchung eines toten Schimpansen

an einem schweren hämorrhagischen Fieber. Das als Krankheitserreger isolierte Virus

wurde als ein weiterer EBOV-Subtyp Ivory Coast klassifiziert (Formenty et al, 1999; Le

Guenno et al., 1999). Ende 2000 ereignete sich ein EBOV-Ausbruch im Gulu-Distrikt

im Norden Ugandas. Diese Epidemie wurde erstmals seit 1979 wieder durch den

EBOV-Subtyp Sudan verursacht und forderte von 425 infizierten Menschen 224

Todesopfer (CDC, 2001).

Das natürliche Reservoir von Filoviren ist trotz ausgedehnter Untersuchungen noch

nicht identifiziert. Bei der Verbreitung filoviraler Infektionen spielen Affen als

Zwischenwirte eine wichtige Rolle, können aber aufgrund der für sie außerordentlich

hohen Pathogenität der Viren als natürliche Wirte ausgeschlossen werden.

Experimentell infizierte Affen verstarben ausnahmslos an der Infektion (Fisher-Hoch

and McCormick, 1999; Fisher-Hoch et al., 1992; Ryabchikova et al., 1999; Simpson,

1 Einleitung 4

1977). Fledermäuse werden als mögliche Kandidaten in Betracht gezogen, da sie das

Virus nach Infektion mit dem Kot ausscheiden, jedoch keine Anzeichen einer

Erkrankung aufweisen (Swanepoel et al., 1996). Asymptomatische EBOV-Infektionen

konnten bei drei verschiedenen Fledermausspezies nachgewiesen werden, die

möglicherweise als Reservoir in Frage kommen, da diese von der in Endemiegebieten

lebenden Bevölkerung verzehrt werden (Leroy et al., 2005). Des Weiteren können

Arthropoden nicht ausgeschlossen werden, da gezeigt werden konnte, dass MARV in

Moskitos der Spezies Aedes aegypti mehrere Wochen persistieren kann (Kunz et al.,

1968; Monath et al., 1999). Allerdings scheint dieser Übertragungsweg auf Grund des

eher seltenen Auftretens filoviraler Infektionen als unwahrscheinlich.

Eine Vielzahl von serologischen Studien belegte das endemische Vorkommen von

Filoviren im zentralafrikanischen Raum. Ausgangspunkt der meisten bekannt

gewordenen Ausbrüche waren die Länder des sogenannten Ebola-Gürtels (Sudan,

Zaire, Kenia und Uganda), die das Zentrum filoviraler Aktivität zu sein scheinen. Etwa

10 Prozent der untersuchten Personen hatten Filovirus-spezifische Antikörper, was

darauf hindeutet, dass Filovirusinfektionen ohne klinische Symptome auftreten und

somit unbemerkt bleiben könnten (Slenczka et al., 1984; Hughes et al., 1986).

Untersuchungen zum EBOV-Ausbruch 1996 in Gabun haben gezeigt, dass tatsächlich

Erkrankungen mit asymptomatischen Verläufen vorkommen können (Baize et al.,

1999; Leroy et al., 2000). In den USA, Deutschland und auf den Philippinen konnten

Antikörper bei Menschen, die in keinem Zusammenhang mit filoviralen Infektionen

standen, nachgewiesen werden. Entweder kursieren weltweit Filoviren geringer

Pathogenität oder es handelt sich um serologische Kreuzreaktionen mit anderen

Vertretern der Mononegavirales (Becker et al., 1992).

Filoviren gelangen über kleine Haut- und Schleimhautläsionen in den Körper und

werden durch Kontakt mit infizierten Personen und deren Ausscheidungsprodukten wie

Blut, Speichel und Sperma von Mensch zu Mensch übertragen (Simpson et al., 1977).

Für das MARV konnte experimentell eine Übertragung durch Aerosole gezeigt werden,

die allerdings unter natürlichen Bedingungen als unwahrscheinlich gilt (Pokhodiaev et

al., 1991). Das Ausmaß der 1989 durch den EBOV-Subtyp Reston verursachten

Epidemie bei Affen ist möglicherweise zum Teil auf Tröpfchen- und Aerosolinfektionen

zurückzuführen. Eine aerogene Infektionsübertragung wurde beim Menschen jedoch

nicht nachgewiesen (Jaax et al., 1995; Johnson et al., 1995).

1.2 Klinik und Pathogenese der Marburg-Virus-Infektion

MARV verursacht beim Menschen und bei nichtmenschlichen Primaten ein schweres

hämorrhagisches Fieber. Die Erkrankung beginnt beim Menschen abrupt nach einer

Inkubationszeit von fünf bis neun Tagen mit schwerem Krankheitsgefühl, hohem

1 Einleitung 5

Fieber, Kopf- und Gliederschmerzen. Im weiteren Verlauf treten Übelkeit, Erbrechen,

abdominale Schmerzen sowie wässrige, nichtblutige Durchfälle auf (Martini et al.,

1968a). Zum Teil kommt es schon im Anfangsstadium zu neurologischen Begleit-

symptomen, wie Verwirrtheitszuständen und Bewusstseinstrübungen bis hin zur

Bewusstlosigkeit. Am Ende der ersten Krankheitswoche entwickelt sich ein

charakteristisches makulopapulöses Exanthem, welches im weiteren Krankheitsverlauf

eine Hautschuppung zur Folge hat. Ferner werden Lymphknotenschwellungen und

Konjunktividen beobachtet. Charakteristisch für diese Infektionskrankheit ist eine

extreme Thrombopenie, die symptomatisch mit hämorrhagischen Diathesen, Blutungen

des Zahnfleisches, der Nase, des Gaumens und des gesamten Gastrointestinaltraktes

einhergeht. Der Tod tritt ein bis zwei Wochen nach Krankheitsbeginn ein und ist durch

schwere Hämorrhagien, Verbrauchskoagulopathie, hypovolämischen Schock und

Multiorganversagen gekennzeichnet. Die Letalitätsrate der Epidemie von 1967 betrug

25 Prozent und reichte bei dem erst kürzlich beendeten Ausbruch in der Republik

Angola bis zu 88 Prozent (WHO, 2005a). Da in den Entwicklungsländern eine intensiv-

medizinische Betreuung nicht möglich ist, liegt hier die Letalitätsrate wesentlich höher.

Bei Überlebenden beträgt die Dauer der Erkrankung bei unkompliziertem Verlauf

zwischen 12 und 22 Tagen (Martini et al., 1968a; Stille and Böhme, 1971). Die

Rekonvaleszenzzeit dauert fünf Wochen und länger, und ist durch Erschöpfung,

Gewichtsverlust und Amnesie bezüglich der akuten Krankheitsphase gekennzeichnet.

Das MARV kann bis zu drei Monaten nach der Infektion in der Samenflüssigkeit

nachgewiesen werden (Martini et al., 1968b).

Die Zellen des monozytären phagozytischen Systems (MPS) stellen vermutlich die

primären Zellen der Virusinfektion dar. Die Ausbreitung im infizierten Organismus

erfolgt durch infizierte Monozyten und Makrophagen über die Lymphe und das

Blutgefäßsystem (Feldmann et al., 1996b; Ryabchikova et al., 1996; Ströher et al.,

2001). Histopathologisch sind ausgeprägte Organnekrosen charakteristisch. Im frühen

Stadium der Infektion sind vor allem Lymphknoten, Milz und Leber betroffen

(Feldmann, et al., 1996b; Peters et al., 1996). Später weitet sich der Befall auf Nieren

und Lunge aus (Martini et al., 1971; Rippey et al., 1984; Zaki and Peters, 1997). Die

Ursache für das Auftreten von Hämorrhagien und des Schocksyndroms scheint die

vaskuläre Instabilität des Endothels zu sein. Infizierte Makrophagen schütten unter

anderem vermehrt den Tumornekrosefaktor α (TNFα), einen Mediator der Schock-

symptomatik, aus (Ströher et al., 2001). Die Freisetzung der Zytokine führt vermutlich

zur Erhöhung der Permeabilität der Endothelzellen, ohne dass diese direkt infiziert sein

müssen (Schnittler et al., 1993; Strieter et al., 1993; Feldmann et al., 1996b).

Ablagerungen von Fibrin und Fibrinspaltprodukten in den Nierentubuli deuten auf eine

1 Einleitung 6

generelle Störung der Blutgerinnung hin (Martini et al., 1971). Eine Verzögerung bzw.

das Ausbleiben der humoralen Immunantwort auf eine MARV-Infektion ist

möglicherweise auf die massive Infektion der Zellen des MPS sowie eine

Lymphozytendepletion zurückzuführen (Ksiazek et al., 1999).

Eine spezifische Therapie gegen eine MARV-Infektion existiert derzeit nicht. Die

Behandlung erfolgt, sofern möglich, symptombezogen, wobei eine intensivmedi-

zinische Therapie des hämorrhagischen Schocks und der Verbrauchskoagulopathie im

Vordergrund stehen. Der Einsatz von Rekonvaleszentenblut oder –plasma im

Frühstadium schien eine positive therapeutische Wirkung auf den Krankheitsverlauf zu

haben (Mupapa et al., 1999). Die Verabreichung von Inhibitoren der S-Adenosyl-

homocystein-Hydrolase führte zu einem therapeutischen Effekt bei EBOV-Infektionen

im Tierversuch (Bray et al., 2000; Bray et al., 2002; Huggins et al., 1999). Ferner

zeigten EBOV-infizierte Makaken eine gute Reaktion auf die Gabe von einem

rekombinanten Inhibitor des Gewebefaktors VIIa (rNAPc2). Die Anzahl der

überlebenden Tiere stieg von null auf 33 Prozent (Geisbert et al., 2003). Eine Impfung

ist zurzeit nicht verfügbar, allerdings konnten sowohl für das MARV als auch für das

EBOV erste Erfolge mit neu entwickelten Impfstoffen im Tiermodell erzielt werden. Die

Verwendung von DNA-Vakzinen, rekombinanten Adenoviren oder Virus-ähnlichen

Partikeln (VLPs) konnte im Tiermodell einen Schutz vor MARV- und EBOV-Infektionen

erzeugen (Baize et al., 2001; Sullivan et al., 2000; Swenson et al., 2004; Warfield et al.,

2004). Ein viel versprechender Ansatz war die Anwendung einer rekombinanten

attenuierten Vakzine, deren Herstellung auf der Grundlage von replikationsfähigen

vesikulären Stomatitis-Virus-Vektoren, die das Glykoprotein des MARV oder EBOV

exprimieren, beruht (Garbutt et al., 2004). Eine einzelne intramuskuläre Injektion löste

in Affen (Macaca fascicularis) eine Immunantwort aus und hatte einen vollständigen

Schutz bei einer Infektion mit MARV oder EBOV zur Folge (Jones et al., 2005).

1.3 Morphologie des Marburg-Virus

Die Virionen des MARV sind umhüllte filamentöse Partikel mit einer extrem

pleomorphen Gestalt. Sie treten sowohl in langgestreckten und verzweigten als auch in

zirkulären und gebogenen Formen auf. Die durchschnittliche Länge des MARV beträgt

einen Mikrometer, die im Gegensatz zu einem einheitlichen Durchmesser von 80 nm

stark variiert (Feldmann and Kiley, 1999; Feldmann et al., 1993). In Abbildung 2 sind

der schematische Aufbau (A) und eine elektronenmikroskopische Aufnahme (B) eines

MARV-Partikels dargestellt. Die Virionen sind aus sieben Strukturproteinen aufgebaut.

Das einzige viruskodierte Oberflächenprotein GP ist als Homotrimer in die

Hüllmembran, die von der Plasmamembran der Wirtszelle abstammt, inseriert

(Feldmann et al., 1991). Im Inneren des Virus befindet sich der helikale Nukleokapsid-

1 Einleitung 7

komplex, der aus den Nukleokapsidproteinen NP, VP35, VP30 und L sowie dem

viralen RNA-Genom zusammengesetzt ist. Die Verbindung des Nukleokapsidkom-

plexes mit der Hüllmembran wird über die Matrixproteine VP40 und VP24 hergestellt

(Bamberg et al., 2005; Becker et el., 1998; Kiley et al., 1988; Kolesnikova et al., 2002).

1.4 Genomaufbau des Marburg-Virus

Das MARV besitzt ein einzelsträngiges, nicht segmentiertes RNA-Genom negativer

Polarität mit einer Länge von 19,1 Kilobasen. Die genomische RNA ist nicht infektiös

und kodiert für sieben Strukturproteine (Abb 3.). An den Enden des Genoms befinden

sich der 3’-Leader und der 5’-Trailer. Dabei handelt es sich um nicht transkribierte

Sequenzen, deren Enden zueinander komplementär sind und vermutlich stabile

Sekundärstrukturen ausbilden können. In diesen Bereichen des Genoms befinden sich

die Signale für den Replikationsstart und für die Verpackung der RNA (Mavrakis et al.,

2002; Mühlberger et al., 1998). Die offenen Leserahmen (ORF) der linear angeord-

neten Gene sind von langen, nicht kodierenden, hochkonservierten Sequenzen

flankiert, die nicht transkribiert werden und die Signale für den Transkriptionsstart und

-stopp enthalten (Mühlberger et al., 1996; 1998; Weik et al., 2005). Die Gene sind von

kurzen nicht transkribierten, intergenischen Regionen separiert oder überlappen wie

zwischen dem VP30 und dem VP24 (Feldmann et al., 1992).

Abbildung 2: Struktur des Marburg-Virus. A: Schematische Darstellung eines MARV-Partikels. B: Elektronenmikroskopische Aufnahme des MARV, Negativkontrastierung mit Phosphorwolframsäure. Vergrößerung: 50000fach. Zur Verfügung gestellt von Dr. Larissa Kolesnikova

Oberflächenprotein GP

Ribonukleoproteinkomplex(vRNA, NP, VP35, VP30 und L)

MatrixVP40 und VP24

1 µm

80 nmA B

Oberflächenprotein GP

Ribonukleoproteinkomplex(vRNA, NP, VP35, VP30 und L)

MatrixVP40 und VP24

1 µm

80 nmA B

1 Einleitung 8

1.5 Proteine des Marburg-Virus

NP Das mengenmäßig am stärksten vertretene Nukleoprotein (NP) ist die

Hauptkomponente des Nukleokapsidkomplexes. Es ist mit einer Länge von 695

Aminosäuren das Produkt des ersten Gens. Das NP enkapsidiert die virale RNA und

spielt eine zentrale Rolle bei der Virusreplikation (Becker et al., 1998; Kolesnikova et

al., 2000; Mavrakis et al., 2002). Es besteht aus einem hydrophoben N-Terminus und

einer hydrophilen C-terminalen Domäne. Der N-Terminus zeigt Sequenzhomologien zu

den Nukleoproteinen der anderen Vertreter der Mononegavirales, wobei der saure C-

Terminus hochvariabel ist (Longhi et al., 2003; Sanchez et al., 1992). Das NP zeigt an

Serin- und Threoninresten der C-terminalen Domäne eine starke Phosphorylierung, die

entscheidend für die Regulation der Funktion des NP während der Transkription ist (Di

Carlo, 2004; Lötfering et al., 1999). In infizierten Zellen liegt das NP in einer phospho-

rylierten (94 kDa) und in einer nicht phosphorylierten (92 kDa) Form vor, wobei nur die

phosphorylierte Form in die Virionen eingebaut wird (Becker et al., 1994).

VP35 Das VP35 (36 kDa) ist 329 Aminosäuren lang und wird durch das zweite Gen

des MARV-Genoms kodiert. Es fungiert als Kofaktor der RNA-abhängigen RNA-

Polymerase und spielt somit eine essentielle Rolle bei der Transkription und

Replikation der viralen RNA. Trotz seiner vergleichsweise schwachen Phosphory-

lierung bildet das VP35 das funktionelle Analogon zu den Phospho(P)-Proteinen der

Rhabdo- und Paramyxoviridae (Mühlberger et al., 1998; 1999). Des Weiteren fungiert

das VP35 als Typ I Interferonantagonist und ist somit in der Lage, die unspezifischen

zellulären Abwehrmechanismen gegen eine Virusinfektion abzuschwächen (Basler et

al., 2000; 2003; persönliche Mitteilung).

VP40 Das Matrixprotein VP40 (38 kDa) besteht aus 303 Aminosäuren und ist neben

dem NP das mengenmäßig am stärksten vertretene Protein. Es befindet sich im Virion

zwischen dem Nukleokapsid und der Virushülle (Becker et al., 1998; Elliot et al., 1985;

Kolesnikova et al, 2002). Das VP40 bindet sehr effizient an zelluläre Membranen und

Abbildung 3: Genomstruktur des Marburg-Virus. Ausgehend vom 3’-Leader werden auf der genomischen RNA die Proteine NP, VP35, VP40, GP, VP30, VP24 und L kodiert, gefolgt von dem 5’-Trailer. Zwischen den einzelnen Gene befinden sich nicht transkribierte intergenische Sequenzen, die zwischen VP30 und VP24 überlappen.

TrailerLeader

LNP VP35 GP VP24VP40'3’ 5’VP30

TrailerLeader

LNP VP35 GP VP24VP40'3’ 5’VP30

1 Einleitung 9

zeigt die Eigenschaften eines peripheren Membranproteins (Kolesnikova et al., 2002;

Ruigrok et al., 2000). Im Gegensatz dazu scheint nur ein geringer Anteil des VP40 mit

den Nukleokapsiden zu assoziieren (Geisbert et al., 1995; Kolesnikova et al., 2002).

Mittels Röntgenkristallographie konnte für die Struktur des EBOV-VP40 gezeigt

werden, dass der C-Terminus über hydrophobe Bereiche verfügt, die für die

Membranbindung notwendig sind (Dessen et al., 2000a; 2000b). Ultrastruktur- und

Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass das MARV VP40 mit internen Membranen

des späten endosomalen Kompartiments (multivesicular bodies, MVB) interagiert

(Kolesnikova et al, 2002; 2004). Des Weiteren ist das VP40 nach solitärer Expression

in der Lage, seine eigene Freisetzung in Form von Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) zu

induzieren (Kolesnikova et al, 2004; Swenson et al., 2004; Timmins et al., 2001). Für

das VP40 des EBOV konnte gezeigt werden, dass ein prolinreiches Motiv, eine so

genannte Late-Domäne, innerhalb des N-Terminus für diesen Prozess essentiell ist.

Das MARV VP40 besitzt ebenfalls ein Motiv für eine Late-Domäne im N-Terminus,

dessen Funktion allerdings noch nicht geklärt ist. Möglicherweise dienen diese Late-

Domänen zur Interaktion mit zellulären Proteinen, wie Tsg101 oder der Ubiquitin-

Ligase Nedd4, die bei der Sortierung von Proteinen sowie der Abschnürung von

Vesikeln in die MBV eine Rolle spielen (Harty et al., 1999; Licata et al., 2003; Martin-

Serrano et al., 2004; Timmins et al., 2003). Diese Eigenschaften sowie die

Genomlokalisation weisen darauf hin, dass das VP40 das Äquivalent zu den Matrix-

Proteinen der anderen Vertreter der Mononegavirales ist.

GP Das virale Glykoprotein GP (220 kDa) ist als einziges Oberflächenprotein in

Form eines Homotrimers in die Virushülle des MARV eingelagert (Feldmann et al.,

1991). Es hat eine Länge von 695 Aminosäuren und gehört zur Klasse der Typ I

Membranproteine (Will et al., 1993). Das GP gliedert sich in eine N-terminale luminale

Domäne (643 AS), eine Transmembrandomäne (29 AS) und eine C-terminal gelegene

zytoplasmatische Domäne (11 AS). Während das EBOV-GP durch einen kotrans-

kriptionalen RNA-Editing-Mechanismus exprimiert wird, wird das MARV-GP von einem

durchgängigen Leserahmen kodiert (Sanchez et al., 1996; Volchkov et al., 1995). Der

N-Terminus fungiert als Signalpeptid und wird nach Expression und Translokation in

das endoplasmatische Retikulum abgespalten (Will et al., 1993). Neben einer starken

N- und O-Glykosylierung wird das GP durch Acylierung und Phosphorylierung

posttranslational modifiziert (Feldmann et al., 1991; Funke et al., 1995; Geyer et al.,

1992; Sänger et al., 2002). Eine weitere Modifikation des GP ist die proteolytische

Aktivierung durch die zelluläre Prohormonkonvertase Furin im trans-Golgi-Netzwerk

(TGN). Furin spaltet das 220 kDa große GP in zwei über Disulfidbrücken miteinander

1 Einleitung 10

verbundene Untereinheiten GP1 (170 kDa) und GP2 (40 kDa), wobei das GP2 den

Membrananker trägt (Volchkov et al., 2000a).

VP30 Das VP30 (33 kDa) ist ein stark phosphoryliertes Protein und gehört neben dem

NP, VP35 und dem L zum Nukleokapsidkomplex (Becker et al., 1998; Mühlberger et

al., 1998; Modrof et al., 2001). Innerhalb der Ordnung der Mononegavirales besitzen

nur noch die Pneumovirinae ein viertes Nukleokapsidprotein. Allerdings wird dieses

M2-Protein aufgrund einer anderen Position seines Gens nicht als Homolog zum VP30

betrachtet (Collins et al., 1996; Garcia et al., 1993; Huang et al., 1985). Die Funktionen

des MARV VP30 sind bislang nicht bekannt. Obwohl es für die Replikation und

Transkription in einem artifiziellen Minigenomsystem nicht notwendig ist, scheint das

MARV VP30 einen Einfluss auf diese Prozesse zu haben. Das Abschalten des MARV

VP30 mittels RNA Interferenz hatte eine Reduktion der Proteinlevel aller anderen

viralen Proteine zur Folge (Fowler et al., 2005). Im Falle des EBOV fungiert das VP30

als Transkriptionsaktivator und ist in die Strukturgebung des Nukleokapsidkomplexes

involviert (Modrof et al., 2003; Mühlberger et al., 1999; Weik et al., 2002). Ferner

konnte gezeigt werden, dass das EBOV VP30 ein Zinkfingermotiv besitzt, dessen

Intaktheit für die transkriptionsaktivierende Funktion des Proteins notwendig ist (Modrof

et al., 2003). Die Phosphorylierung des VP30 stellt ein wichtiges regulatorisches

Element in Bezug auf die Wirkungsweise des Proteins während der Vermehrung des

EBOV dar (Modrof et al., 2002, 2003).

VP24 Das VP24 (24 kDa) ist mit einer Länge von 253 Aminosäuren als weiteres

Matrixprotein zwischen dem Nukleokapsidkomplex und der Virushülle lokalisiert (Elliott

et al., 1985). Da kein anderer Vertreter dieses Protein besitzt, stellt das VP24 innerhalb

der Ordnung der Mononegavirales eine Besonderheit dar. Das VP24 ist in der Lage,

mit der zytoplasmatischen Domäne des GP und negativ geladenen Membranen zu

interagieren (Sänger et al., 1998; Bamberg, 2000). Es wird in die vom VP40 gebildeten

Virus-ähnlichen Partikel (VLPs) rekrutiert und scheint die Inkorporation des GP in diese

VLPs zu beeinflussen. Ferner scheint das VP24 des MARV als auch des EBOV für den

Aufbau der Nukleokapside eine Bedeutung zu haben. (Bamberg et al., 2005; Huang et

al., 2002). Durch das Abschalten des VP24 mittels RNA Interferenz konnte gezeigt

werden, dass es keine Rolle bei der viralen Transkription und Replikation spielt, jedoch

für den Zusammenbau reifer Virionen notwendig ist. Auf Grund dieser Ergebnisse wird

postuliert, dass das VP24 eine wichtige Rolle bei der Morphogenese reifer Virionen

spielt. Die Assoziation mit dem NP deutet auf eine Beteiligung an der Reifung der

Nukleokapside sowie deren Transport zur Plasmamembran hin (Bamberg et al., 2005).

Des Weiteren wird der Einfluss des EBOV VP24 als Pathogenitätsfaktor hinsichtlich

1 Einleitung 11

der Adaptation und Veränderungen in der Virulenz diskutiert (Volchkov et al., 2000b).

Es wird vermutet, dass das EBOV-VP24 die Interferon (IFN) β-vermittelte Induktion von

IFN-responsiven Genen inhibieren kann und somit in die Signalkaskade der IFN-

Antwort bei Virusinfektionen eingreift (Basler and Palese, 2003).

L Das L-Protein ist mengenmäßig am wenigsten im Nukleokapsid vertreten und

ist mit einem Molekulargewicht von 220 kDa sowie einer Länge von 2331 Aminosäuren

das größte Protein des MARV. Es repräsentiert den katalytischen Teil der RNA-

abhängigen RNA-Polymerase (Mühlberger et al., 1992; 1998). Im Vergleich mit den

anderen Vertretern der Mononegavirales, insbesondere der Familie der Paramyxo-

viridae, sind drei hochkonservierte Bereiche charakteristisch, die vermutlich mit den

enzymatischen Funktionen korrelieren (Mühlberger et al., 1992; Poch et al., 1990;

Volchkov et al., 1999).

1.6 Replikationszyklus des Marburg-Virus

Der Replikationszyklus des MARV beginnt mit dem Eintritt des Virus in die Zielzelle,

der über das Oberflächenprotein GP vermittelt wird. Filoviren können eine Vielzahl von

menschlichen Zelltypen infizieren und verwenden dabei höchstwahrscheinlich

verschiedene Rezeptormoleküle (Becker et al., 1995; Ito et al., 2001; Schnittler et al.,

1993; Ströher et al., 2001; Wool-Lewis and Bates, 1998; Yang et al., 2000). Als

möglicher Rezeptorkandidat für Hepatozyten wurde der Asialoglykoproteinrezeptor

(ASGP-R) identifiziert (Becker et al., 1995). Der ubiquitär vorkommende Folatrezeptor

alpha (FR-alpha) wurde als Kofaktor für den Eintritt von EBOV in die Zelle beschrieben

(Chan et al., 2001). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass dieser beim Eintritt in

primäre Zelllinien offensichtlich keine Rolle spielt (Simmons et al., 2003a; Sinn et al.,

2003). Die C-Typ Lektine DC-SIGN, DC-SIGNR, hMGL und LSECtin, die unter

anderem auf Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert werden, wurden als

mögliche Kofaktoren für den Eintritt von Filoviren beschrieben (Gramberg et al., 2005;

Lin et al., 2003; Marzi et al., 2004; Simmons et al., 2003b; Takada et al., 2004). Die

Aufnahme der Viren erfolgt durch rezeptorvermittelte Endozytose (Empig and

Goldsmith, 2002; Mar’iankova et al., 1993). Nach Fusion der Virushülle mit der

endosomalen Membran kommt es zur Freisetzung der Nukleokapside in das

Zytoplasma der Zelle, wo die Transkription und die Replikation der viralen RNA

stattfinden. Das EBOV benötigt für die Transkription und Replikation alle vier

Nukleokapsidproteine, während für das MARV die Nukleokapsidproteine NP, VP35 und

L ausreichend sind (Mühlberger et al., 1998; 1999). Zunächst werden mono-

cistronische, polyadenylierte, nichtenkaspidierte mRNAs der einzelnen Strukturproteine

synthetisiert (Feldmann et al., 1992; Mühlberger et al., 1996; Sanchez et al, 1993).

1 Einleitung 12

Diese Transkripte enthalten lange, nichttranslatierte Bereiche, die regulatorische

Funktionen bei der Proteinsynthese ausüben (Mühlberger et al., 1996; Weik et al.,

2002). Die synthetisierten viralen mRNAs werden vom zellulären Proteinsynthese-

apparat translatiert, wobei die entstehenden Proteine posttranslational modifiziert

werden. Welcher molekulare Mechanismus für die Umstellung von Transkription auf

Replikation verantwortlich ist, ist bislang nicht bekannt. Bei der Replikation wird die

genomische RNA zunächst in antigenomische RNA umgeschrieben, die wiederum als

Matrize für die Synthese neuer viraler Genome dient. Sowohl das Genom als auch das

Antigenom liegen in enkapsidierter Form vor. Die genomische RNA wird durch die

Nukleokapsidproteine zu Nukleokapsidkomplexen verpackt, die etwa zehn Stunden

nach Infektion in typischen intrazytoplasmatischen Einschlusskörpern erscheinen und

vermutlich deren Syntheseorte darstellen (Kolesnikova et al., 2000). Die neu

synthetisierten Nukleokapsidkomplexe werden zur Zelloberfläche transportiert und

treten über die Matrixproteine in Kontakt zu dem in der Plasmamembran eingelagerten

GP. Die Freisetzung von MARV-Partikeln erfolgt etwa 22 Stunden nach Infektion.

1.7 Interaktionen der Nukleokapsidproteine des Marburg-Virus

Die Nukleokapsidproteine NP, VP35, VP30 und L sind als strukturelle Komponenten

am Aufbau des Nukleokapsids beteiligt. Ferner sind sie in verschiedene Protein-

komplexe involviert, über deren Funktionen bisher wenig bekannt ist. Mit Hilfe eines

artifiziellen Transkriptions- und Replikationssystems konnte gezeigt werden, dass die

Nukleokapsidproteine NP, VP35 und L für die Transkription und Replikation der viralen

RNA des MARV notwendig und ausreichend sind (Mühlberger et al., 1998). Da die

Nukleokapsidproteine somit strukturelle und funktionelle Aufgaben erfüllen, wird

vermutet, dass die Ausbildung der unterschiedlichen Proteinkomplexe eine wichtige

Rolle für die Regulation der Transkription und Replikation spielt.

Die zentrale Komponente bei den Interaktionen der Nukleokapsidproteine ist das NP.

Es ist in der Lage, mit sich selbst zu interagieren und Nukleokapsid-ähnliche helikale

Strukturen auszubilden, die die Grundgerüste neuer Nukleokapside repräsentieren (Di

Carlo, 2004; Kolesnikova et al., 2000). Neben der Homooligomerisierung des NP

konnten eine Reihe weiterer Interaktionen der Nukleokapsidproteine gezeigt werden.

Das NP interagiert sowohl mit dem VP35 als auch mit dem VP30 (Becker et al., 1998;

Modrof et al., 2001). Des Weiteren wurden trimere Komplexe aus NP, VP35 und L

identifiziert, wobei das VP35 als Brücke zwischen dem NP und L agiert. Eine direkte

Interaktion von NP und L wurde nicht nachgewiesen (Becker et al., 1998). In

Anlehnung an die anderen Vertreter der Ordnung der Mononegavirales handelt es sich

bei dem Proteinkomlex aus VP35 und L um die aktive RNA-abhängige RNA-

Polymerase des MARV (Banerjee and Barik, 1992; Horikami et al., 1992; Mühlberger

1 Einleitung 13

et al., 1992; 1998; 1999; Parks, 1994; Walker et al., 2000). Das VP35 ist über eine

Coiled-Coil-Struktur in der Lage, mit sich selbst zu interagieren (Möller, 2002).

1.8 Coiled-Coil-Strukturen

Coiled-Coil-Strukturen gehören in der Natur zu den am weitesten verbreiteten

Interaktionsdomänen und sind, trotz ihrer einfach strukturierten Interaktionsoberfläche,

in der Lage, höchst spezifische Wechselwirkungen zu vermitteln. Coiled-Coil-

Strukturen bestehen aus zwei oder mehr amphiphatischen α-Helices, die umeinander

gewunden sind und somit eine so genannte Superhelix formen. Sie kommen in den

verschiedensten Proteinkomplexen vor und sind an der Ausbildung von Homo- und

Heterooligomeren beteiligt. Die Anordnung kann dabei in paralleler oder antiparalleler

Form erfolgen. Charakteristisch für die Aminosäuresequenz eines Coiled-Coil-Motivs

ist die Wiederholung eines konservierten Musters von sieben Resten (a-b-c-d-e-f-g)n.

An erster (a) und vierter (d) Position befinden sich in der Regel hydrophobe

Aminosäuren, die die Interaktionsfläche zwischen den Helices ausbilden. Die restlichen

Aminosäuren sind vorwiegend polarer oder geladener Natur und tragen durch intra-

bzw. intermolekulare Wechselwirkungen zur Stabilität der ausgebildeten Protein-

komplexe bei (Burkhardt et al., 2001; Mason and Arndt, 2004).

1.9 Fragestellung

Die bisher identifizierten Proteinkomplexe der Nukleokapsidproteine haben eine

strukturelle Bedeutung bei der Virusmorphogenese. Andererseits dienen sie als

Funktionseinheiten bei der Replikation und Transkription der viralen RNA des MARV

(Becker et al., 1998; Mühlberger et al., 1998; 1999). Es wird angenommen, dass die

viralen Proteine durch die Interaktion mit unterschiedlichen Partnerproteinen auch

verschiedene Funktionen wahrnehmen können.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung des Polymerasekofaktors

VP35 des MARV. Ziel dieser Arbeit war es, die verschiedenen Proteinkomplexe, in die

das MARV VP35 involviert ist, hinsichtlich ihrer Funktion für die virale RNA-Synthese

und die Assemblierung des Nukleokapsidkomplexes zu untersuchen. Es konnte bereits

gezeigt werden, dass das VP35 in vitro in der Lage ist, Homooligomere auszubilden.

Ferner schien für diese Komplexbildung eine vorhergesagte Coiled-Coil-Struktur im N-

Terminus des Proteins notwendig zu sein (Möller et al., 2002). Im Mittelpunkt stand

zunächst die genaue Charakterisierung der Coiled-Coil-Domäne. Mit Hilfe von

Mutationsanalysen sollten in diesem Zusammenhang die potentiellen Aminosäuren, die

für die Ausbildung und die Stabilität der Coiled-Coil-Struktur und somit für die

Homooligomerisierung des VP35 verantwortlich sind, identifiziert werden. Des

1 Einleitung 14

Weiteren sollte geklärt werden, ob die Homooligomerisierung des VP35 einen Einfluss

auf die Interaktion mit dem L-Protein hat. Dieser Komplex repräsentiert die funktionelle

RNA-abhängige RNA-Polymerase des MARV. Da das VP35 eine strukturelle Kompo-

nente des Nukleokapsidkomplexes ist, bestand ferner die Frage, welche Bedeutung die

Homooligomerisierung des VP35 auf die Interaktion mit dem NP hat. Abschließend

sollte die Stöchiometrie der VP35-Homooligomere betrachtet werden. Es wird erwartet,

dass diese Untersuchungen zu wesentlichen Einsichten in die Regulation von viraler

RNA-Synthese und der Morphogenese des Nukleokapsidkomplexes führen.

2 Material 15

2 Material

2.1 Geräte

Biofuge A Heraeus Sepatech, Osterode

Biofuge 13 Heraeus Sepatech, Osterode

Bio-Imager Analyzer BAS-1000 Fuji, Kanagawa (Japan)

Branson Sonifier 450 Heinemann, Schwäbisch Gmünd

Brutschrank 6000 Heraeus Instruments, Hanau

Eppendorf Kühlzentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg

Eppendorf Reference® Pipetten

(0,1-2,5 µl; 0,5-10 µl; 10-100 µl; 100-1.000 µl)

Eppendorf, Hamburg

Eppendorf Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg

Eppendorf Tischzentrifuge 5145 Eppendorf, Hamburg

Fastblot B34 Biometra, Göttingen

Feinwaage Sartorius, Göttingen

Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena

Geiger-Müller-Zähler Berthold, Wildbad

GelDoc 2000 Biorad, Richmond (USA)

Genequant II DNA / RNA Calculator Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Horizontalschüttler HS 250 Basis IKA Labortechnik, Staufen

J2 21 Zentrifuge Beckmann, Palo Alto (USA)

Keutz®-Gel-Trocken-Rahmen von Keutz, Reiskirchen

Keutz®-Minigelkammer von Keutz, Reiskirchen

Kippschüttler von Keutz, Reiskirchen

Krups Vakupack plus Krups, Solingen

Liquid Scintillation System LS1801 Beckmann, Palo Alto (USA)

Magnetrührer IKA-COMBIMAG RCO IKA Labortechnik, Staufen

Maxi 14 Hybridisierungsofen HYBAID, Heidelberg

MegaBACETM 1000 Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Megafuge 1.0R Heraeus Instruments, Hanau

Metallblockthermostat TCS Lab Tech Barkey, Bielefeld

Microcomputer Electrophoresis, Power

Supply Consort

von Keutz, Reiskirchen

Mikroskop Milovert Will, Wetzlar

Mikrowellengerät Bosch

Minifuge RF Heraeus Sepatech, Osterode

2 Material 16

Optimax® 2010 Protec Medizintechnik, Oberstenfeld

pH-Meter CG 832 Schott Laborgeräte

Pipetus® Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt

Primus Thermocycler MWG Biotech AG, Ebersberg

Protean II Gelkammer Biorad, Richmond (USA)

Sicherheitswerkbank Heraeus Instruments, Hanau

Spot Kamera, Version 3.1.2 Diagnostic Instruments, Michigan (USA)

Überkopfrotierer Heidolph Instruments, Schwabach

UV-Schirm 302 nm Bachofer, Reutlingen

Vakuum-Blotter TransDNA ExpressTM Qbiogene, Heidelberg

Vakuum-Geltrockner von Keutz, Reiskirchen

Vakuum-Zentrifuge (Speed-Vac) von Keutz, Reiskirchen

Vortexer REAX 2000 Heidolph Instruments, Schwabach

Waage Sartorius, Göttingen

Wasserbad mwg lauda MT

2.2 Chemikalien

Aceton Merck Eurolab, Darmstadt

Agarose, ultrarein BRL, Neu-Isenburg

Agarose, NA Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Alconox Sigma-Aldrich, Deisenhofen

6-Amino-n-Capronsäure Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Ammoniumchlorid Merck Eurolab, Darmstadt

Ammoniumhydrogenkarbonat Merck Eurolab, Darmstadt

Ammoniumpersulfat (APS) Biorad, Richmond (USA)

Ampicillin (Natriumsalz) Serva, Heidelberg

Anti-Flag M2 Agarose Affinity Gel Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Bacto-Agar Difco Lab., Detroit (USA)

Blockierungsreagenz Roche, Mannheim

Borsäure Merck Eurolab, Darmstadt

Bovines Serumalbumin (BSA) Serva, Heidelberg

Bromphenolblau (BPB) Serva, Heidelberg

Calciumchlorid (CaCl2) Merck Eurolab, Darmstadt

Chloroform J. T. Baker, Deventer (NL)

DAPI (4’, 6-Diamidino-2-phenylindol) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Deconex Bohrer Chemie, Zuchwill (Schweiz)

2 Material 17

Desoxycholat Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Dextranblau Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck Eurolab, Darmstadt

Dinatriumcarbonat (Na2CO3) Merck Eurolab, Darmstadt

Dinatriummethylendiamintetraacetat

(EDTA)

Roth, Karlsruhe

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck Eurolab, Darmstadt

Dithiothreitol (DTT) Biorad, Richmond (USA)

Essigsäure (HAc) Riedel-de-Haën, Seelze

Ethanol (abs.) EtOH Riedel-de-Haën, Seelze

Ethidiumbromid Roche, Mannheim

Ethylacetat Merck Eurolab, Darmstadt

Ethylene Glycol Bis

[succinimidylsuccinate] (EGS)

Pierce, Rockford (USA)

Ficoll Typ 400 Pharmacia LKB, Freiburg

Fluoprep bioMérieux, Nürtingen

Formaldehyd min 37 % Merck Eurolab, Darmstadt

Formamid BRL, Neu-Isenburg

FuGENE 6 Transfection Reagent Roche, Mannheim

Geneticin (50 mg/ml) Gibco BRL, Karlsruhe

L-Glutamin 200 mM (100×) Gibco BRL, Karlsruhe

Glutaraldehyd Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Glycerol BRL, Neu-Isenburg

Glycin Riedel-de-Haën, Seelze

Glykogen (20 mg/ml) Roche, Mannheim

Harnstoff (ultrarein) BRL, Neu-Isenburg

Hefeextrakt Merck Eurolab, Darmstadt

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N`-2-Ethan-

Sulfonsäure (HEPES)

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Isopropanol Merck Eurolab, Darmstadt

Kaliumchlorid (KCl) Merck Eurolab, Darmstadt

Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck Eurolab, Darmstadt

LipofectamineTM Plus Invitrogen, Karlsruhe

Magermilchpulver Töpfer, Dietmannsried

Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl2 × 6H2O) Merck Eurolab, Darmstadt

Magnesiumsulfat (MgSO4) Merck Eurolab, Darmstadt

2 Material 18

Maleinsäure Merck Eurolab, Darmstadt

β-Mercaptoethanol Serva, Heidelberg

Methanol (MeOH) Riedel-de-Haën, Seelze

3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Natriumacetat (NaOAc) Merck Eurolab, Darmstadt

Natriumazid (NaN3) J.T. Baker B.V., Deventer (Holland)

Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe

Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck Eurolab, Darmstadt

Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck Eurolab, Darmstadt

Natriumhydroxid (NaOH) Merck Eurolab, Darmstadt

N(onidet)P40 Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Paraformaldehyd (PFA) Merck Eurolab, Darmstadt

Penicillin/Streptomycin 5000 IU/ml Gibco BRL, Karlsruhe

Pepton Merck Eurolab, Darmstadt

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roche, Mannheim

PlusTM-Reagenz Invitrogen, Karlsruhe

Polyacrylamid-Lösung (29:1) Biorad, Richmond (USA)

Polyvinylpyrolidon PVP360 Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Protein-A-Sepharose Sigma-Aldrich, Deisenhofen

rotiphorese® Gel 30 Roth, Karlsruhe

Saccharose Merck Eurolab, Darmstadt

Salzsäure (HCl) Merck Eurolab, Darmstadt

Sephadex® G-50 Superfine Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

Tetracyclin Serva, Heidelberg

N, N, N´, N´, -

Tetramethylethylethylendiamin (TEMED)

Biorad, Richmond (USA)

Tri-Natrium-Citrat-Dihydrat Roth, Karlsruhe

Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Base) Roth, Karlsruhe

Triton X-100 Serva, Heidelberg

Tween 20 Serva, Heidelberg

Xylencyanol FF (XC) Serva, Heidelberg

2.3 Verbrauchsmaterialien

6 well-Zellkulturplatten Greiner, Nürtingen

75 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA)

2 Material 19

175 cm2 Zellkulturflaschen Costar, Cambridge (USA)

Bio-Image Screen: Imaging plate 2040S Fuji, Kanagawa (Japan)

Blottingpapier GB 002 (Whatman 3MM) Whatman, New Jersey (USA)

Gefrierfolie Krups, Solingen

Gewebekulturröhrchen (Polystyrol) Greiner, Nürtingen

Immobilon™ P, PVDF-Membran Millipore, Eschborn

Kapillarspitzen 200 µl Biozym Diagnostik, Hess. Oldendorf

Multiscreen-Platten Millipore, Eschborn

Nylon membrane, positively charged Roche, Mannheim

Objektträger Menzel GmbH, Braunschweig

Parafilm Pechiney Plastic Packaging, Neenah (USA)

PCR-tubes, 0,2 ml Biozym, Hess. Oldendorf

Petrischalen Greiner, Nürtingen

Pipetten 2 + 10 ml, Cellstar® bio-one Greiner, Nürtingen

Pipetten 5 ml, serological pipette Sarstedt, Nümbrecht

Pipettenspitzen, oberflächenoptimiert Nerbe Plus, Winsen/Luhe

Polypropylen-Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml) Greiner, Solingen

Reaktionsgefäße 1,5/2 ml Eppendorf, Hamburg

Präzisions-Küvetten aus Quarzglas Hellma, Müllheim

Röntgenfilme (BiomaxTM MR) Kodak, Rochester (USA)

Skalpell PfM AG, Köln

Zellschaber, greiner bio-one Greiner, Nürtingen

2.4 Kits

CDP-Star Roche, Mannheim

E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit I Peqlab, Erlangen

DYEnamic ™ ET Dye Terminator Kit Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg

HiSpeed Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden

QIAfilter® Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden

QIAquick® Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden

QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen, Hilden

QuikChange Site-Directed Mutagenesis

Kit

Stratagene, Heidelberg

RNeasy® Mini Kit Qiagen, Hilden

SuperSignal Ultra® West Dura Extended

Duration Substrate

Pierce, Rockford (USA)

2 Material 20

TNT® T7 Quick Coupled

Transcription/Translation Kit

Promega GmbH, Mannheim

Z-Competent E.coli Transformation Kit™

and Buffer Set

Zymo Research, Orange (USA)

2.5 Puffer und Lösungen

2.5.1 Puffer

Annealing-Puffer 1 M

100 mM

160 mM

Tris/HCl (pH 7,5)

MgCl2

DTT

Blockierungspuffer für

Immunfluoreszenzanalysen

2 %

5 %

0,2 %

0,05 %

in

BSA

Glycerol

Tween 20

NaN3

PBSdef

Blockierungsreagenz für Northern

Blot-Analysen

2 %

in

Blockierungsreagenz

Chemolumineszenzpuffer I

Blockierungspuffer für Western

Blot-Analysen

10 g

ad 100 ml

Magermilchpulver

PBSdef

Chemolumineszenzpuffer I

(pH 7,5)

0,1 M

150 mM

Maleinsäure

NaCl

Chemolumineszenzpuffer II

(pH 9,5)

100 mM

100 mM

50 mM

Tris

NaCl

MgCl2

DC-Laufpuffer 95 ml

5 ml

Chloroform

Methanol

6x DNA-Probenpuffer 0,25 %

40 %

10 %

Bromphenolblau

Saccharose

Glycerol

2 Material 21

FA-Agarosegel-Auftragspuffer 2 µl

1 µl

1,75 µl

5 µl

H2O

5x FA-Laufpuffer

37 % Formaldehyd

Formamid

5x FA-Laufpuffer 100 mM

40 mM

0,5 mM

MOPS, pH 7,0 (zuerst einstellen)

NaOAc, pH 7,0

EDTA

Glycin-Puffer, sauer 100 mM Glycin, pH 2,5

in PBSdef

HEPES-Puffer 50 mM

100 mM

1 mM

1 %

HEPES

NaCl

β-Mercaptoethanol

NP40

KoIP-Puffer

(Koimmunpräzipitations-Puffer)

20 mM

100 mM

5 mM

1 %

1 mM

1 mM

Tris/HCl, pH 7,6

NaCl

EDTA

NP40

PMSF

DTT

Mikrokokken-Nuclease(MCN)-

Puffer

10 mM

10 mM

1,5 mM

10 mM

5 %

0,3 %

Tris/HCl, pH 7,5

NaCl

MgCl2

CaCl2

Triton X-100

Desoxycholat

PBSdef, pH 7,5

(Phosphatpuffer deficient)

8 g

0,2 g

1,15 g

0,2 g

ad 1 l

NaCl

KCl

Na2HPO4

KH2PO4

dH2O

2 Material 22

10× Proteingellaufpuffer 10 g

30 g

250 g

ad 1 l

SDS

Tris-Base

Glycin

dH2O

4× Proteinprobenpuffer 10 ml

10 ml

15 ml

12,5 ml

1,25 ml

ad 50 ml

Glycerin

ß-Mercaptoethanol

40 % SDS

3 M Tris-Base

gesättigte BPB-Lösung in dH2O

dH2O

4× Probenpuffer für Sequenzgele 500 µl

100 µl

50 mg/ml

deionisiertes Formamid

25 mM EDTA, pH 8,0

Dextranblau

RNA-Farbpuffer 50 %

1 mM

0,25 %

0,25 %

Glycerol

EDTA

Bromphenolblau

Xylencyanol

RNA-Waschpuffer 0,1 %

0,1x

SDS

SSC

SDS-PAGE-Sammelgelpuffer 2,52 ml

0,1 ml

0,5 M Tris/HCl, pH 6,8

10 % SDS

SDS-PAGE-Trenngelpuffer 2,5 ml

0,1 ml

2,5 M Tris/HCl, pH 8,8

10 % SDS

Sequenzier-Probenpuffer 1 %

5 mM

80 %

Dextranblau

EDTA, pH 8,0

Formamid

2 Material 23

50× TAE, pH 8,0 242 g

57,1 g

100 ml

ad 1 l

Tris-Base

Essigsäure

0,5 M EDTA, pH 8,0

dH2O

10× TBE, pH 8,0 108 g

55 g

40 ml

ad 1 l

Tris-Base

Borsäure

0,5 M EDTA, pH 8,0

dH2O

Transferpuffer, alkalisch 3 M

8 mM

NaCl

NaOH

Tris/KCl-Puffer 10 mM

150 mM

0,1 %

3 %

Tris/HCl, pH 8,0

KCl

NP40

BSA

Western Blot-Antikörper-

Verdünnungspuffer

1 %

0,1 %

in

Magermilchpulver

Tween 20

PBSdef

Western Blot-Anodenpuffer I 36,34 g

200 ml

ad 1 l

Tris-Base

Ethanol

dH2O

Western Blot-Anodenpuffer II 3,04 g

200 ml

ad 1 l

Tris-Base

Ethanol

dH2O

Western Blot-Kathodenpuffer 5,25 g

3,03 g

200 ml

ad 1 l

6-Amino-N-Capronsäure

Tris-Base

Ethanol

dH2O

2 Material 24

2.5.2 Lösungen

Ampicillin-Stammlösung 100 mg

ad 1 ml

Ampicillin

dH2O

50x Denhardts Lösung 2,5 %

2,5 %

2,5 %

Ficoll Typ 400

Polyvinylpyrolidon PVP360

BSA

Fixierer/Entfärber für Proteingele 300 ml

100 ml

600 ml

Ethanol

Essigsäure

dH2O

Hybridisierungslösung nach

Collins

30 ml

10 ml

1 ml

20x SSC

50x Denhardts Lösung

10 % SDS

100 mM PMSF

360 mg

ad 21 ml

PMSF

Isopropanol

10 % SDS

100 g

ad 1 l

SDS

H2O

20x SSC (pH 7,0)

3 M

0,3 M

NaCl

Na3Citrat-Dihydrat

2.6 Wachstumsmedien

2.6.1 Wachstumsmedien für Bakterien

LB-Agar (1,5 %) 3,75 g

ad 250 ml

Bacto-Agar

LB-Medium

LB-Medium 10 g

5 g

10 g

ad 1 l

NaCl

Hefeextrakt

Pepton

dH20

2 Material 25

SOB-Medium 20 g

5 g

0,58 g

0,19 g

10 ml

10 ml

ad 1 l

Pepton

Hefeextract

NaCl

KCl

1 M MgCl2

1 M MgSO4

dH20

2.6.2 Wachstumsmedien für Säugerzellen

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco BRL, Karlsruhe

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)

ohne Methionin und Cystein

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Fetales Kälberserum (FCS) Gibco BRL, Karlsruhe

Trypsin/EDTA Gibco BRL, Karlsruhe

DMEM(+++) 500 ml

50 ml

5 ml

5 ml

DMEM

FCS (Fetales Kälberserum)

L-Glutamin 200 mM (100x)

Penicillin/Streptomycin 5000 IU/ml

DMEM(++) 500 ml

5 ml

5 ml

DMEM


Penicillin/Streptomycin 5000 IU/ml

DMEM(+Q) 500 ml

5 ml

DMEM


2.7 Nukleinsäuren und Nukleotide

2.7.1 Nukleinsäuren

DNA Größenmarker III (λ-DNA EcoRI, HindIII verdaut) Roche, Mannheim

1 kB DNA Ladder, 500 – 1002 bp New England Biolabs, Frankfurt

100 bp DNA Ladder, 100 – 1517 bp New England Biolabs, Frankfurt

MassRuler™ DNA-ladder High range MBI-Fermentas, St. Leon-Rot

Herring Sperm DNA, Sonicated

Promega, Mannheim

2 Material 26

2.7.2 Nukleotide

dATP 2’-Desoxyadenosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

dCTP 2’-Desoxycytidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

dGTP 2’-Desoxyguanosin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

dTTP 2’-Desoxythymidin 5’-Triphosphat 10 mM Eurogentec, Köln

2.7.3 DNA-Oligonukleotide

MARV-spezifische Vorwärtsprimer

Nr. Name Sequenz

787 FlagFVP35 CTA GTA TGG ACT ACA AGG ACG ACG ATG ACA AGG

797 FlagEcoFVP35

AAT TCA TGG ACT ACA AGG ACG ACG ATG ACA AGC CC

814 VP35Flag246EcoF AAT TCA TGG ACT ACA AGG ACG ACG ATG ACA AGC C

917 M.35f220

GAG GGA TCC ACA ATG CAT CTA CCC GCC AAC AAC ACT

919 M.35f120

GAC GGA TTC ACA ATG ATT TCC AAG GGG ATG TCA GAA

921 M.35f220d99 CAT CTA CCC GGC AAC AAC ACT

923 M.35f120d49

ATT TCC AAG GGG ATG TCA GAA

1118 M35fEcoRI CGG GAT CCA CCA TGG ACT ACA AGG ACG ACG ATG ACA

AGG CAG AAT TAT CAA CGC GTT AC

1120 E30fBamHIdATG

CGG GAT CCA CCA TGG CTT ACC CTT ACC CTT ATG ATG

TGC CGG ATT ATG CCG CAG AAT TAT CAA CGC GTT AC

1227 M35faa70EcoRI

CGG GAT CCA CCA TGG AAC AAA AAC TCA TCT CAG AAG

AGG ATC TGG CAG AAT TAT CAA GCC GTT AC

1248 M35L90Af CAT TCA AAG CAC TGC AAG CGA AGT AAC AAC

1250 M35L104Af GAG CGG CAA GCA CAT GAG ATT ACC CC

MARV-spezifische Rückwärtsprimer

788 FlagRVP35 GAT CCC TTG TCA TCG TCG TCC TTG TAG TCC ATA

798 FlagEcoRVP35 CGG GGG CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC CAT G

815 VP35Flag246EcR CCG GGG CTT GTC ACT GTC GTC CTT GTA GTC CAT G

918 M.35r329 TGA CTC GAG TTA GAT TTT AAG GGC CCG TGT TTC

920 M.35r220 TGA CTC GAG TTA ATG GGT AAA CAA TAA AAG GGC

922 M.35r120d99 AAT TGC TTC CAG TGT CCT TCC

924 M.35r70d49 TCT CTT CAC GAT CAG TTG GTC

1119 M35-150rBamHI CGG GAT CCG GCA TCA AAG GCA GCA GCT GG

1232 FusM35aa120r AAT TGC TTC CAG TGT CCT TCC

1242 FusM35aa109r TGG GGT AAT CTC ATG TAA TTG CCG

2 Material 27

1249 M35L90Ar GTT GTT ACT TCG CTT GCA GTG CTT TGA ATG

1251 M35L104Ar GGG GTA ATC TCA TGT GCT TGC CGC TC

1407 M35r122 TGA CTC GAG TTA CTT GGA AAT TGC TTC CAG TGT

EBOV-spezifische Vorwärtsprimer

1231 FusE30f GAA GCT TGA TAT GAG AGA GGA

EBOV-spezifische Rückwärtsprimer

409 EBO 30 flag C term.

rev.

AGA CTC GAG TTA CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC

AGG GGT ACC CTC ATC AGA CCA TG

434 EBO 30 C term +

Xho I rev

AGA CTC GAG TTA AGG GGT ACC CTC ATC AGA CC

Vektorspezifische Primer

125 pTM1-F ATT GTA TGG GAT CTG ATC TGG

174 pTM1-R GCC AAC TCA GCT TCC TTT CGG

2.8 Vektoren und rekombinante Plasmide

pTM1

B. Moss, NIH, Bethesda (USA)

pTM1-VP35 Institut für Virologie, Marburg

pTM1-VP351-278 Institut für Virologie, Marburg



pTM1-VP35152-329Flag Institut für Virologie, Marburg

pTM1-NP Institut für Virologie, Marburg

pTM1-NP∆C1 Institut für Virologie, Marburg

pTM1-L Institut für Virologie, Marburg

pTM1-L1-530Flag (pTM1-LFlag) Institut für Virologie, Marburg

Minigenom 3M5M Institut für Virologie, Marburg

pTM1-EVP302LA Institut für Virologie, Marburg

pCAGGS-T7 Y. Kawaoka, Wisconsin (USA)

Tabelle 2: Eingesetzte DNA-Oligonukleotide. Die Schnittstellen von Restriktions-endonukleasen sind unterstrichen und Nukleotidaustausche durch Fett-Druck hervor-gehoben. Die Primer #125, #174, #409 und #434 wurden von Dr. M. Krause am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung in Marburg synthetisiert. Die übrigen Primer wurden von der Firma MWG Biotech in München hergestellt.

2 Material 28

kloniertes Plasmid Matrizen-DNA Oligonukleotide Klonierungs-strategie

pTM1-VP35Flag pTM1-VP35 #797/#798 PA + RL

pTM1-VP351-278Flag pTM1-VP35 #787/#788 PA + RL



pTM1-VP3570-329 pTM1-VP35 #1227/#918 PCR + RL



pTM1-VP35∆71-119 pTM1-VP35 #923/#924 IPCR + RL

pTM1-VP35∆71-119Flag pTM1-VP35Flag #923/#924 IPCR + RL

pTM1-VP35∆121-219 pTM1-VP35 #921/#922 IPCR + RL

pTM1-VP35∆121-219Flag pTM1-VP35Flag #921/#922 IPCR + RL

pTM1-VP35L90A pTM1-VP35 #1248/#1249 OM + RL

pTM1-VP35L90AFlag pTM1-VP35Flag #1248/#1249 OM + RL

pTM1-VP35L104A pTM1-VP35 #1250/#1251 OM + RL

pTM1-VP35L104AFlag pTM1-VP35Flag #1250/#1251 OM + RL

pTM1-VP35L90/104A pTM1-VP35L90A #1250/#1251 OM + RL

pTM1VP35L90/104AFlag pTM1-VP35L90AFlag #1250/#1251 OM + RL

pTM1-VP351-122mut pTM1-VP35L90/104A #1118/#1407 PCR + RL

pTM1-VP351-122mutFlag pTM1-VP35L90/104AFlag #1118/#1407 PCR + RL

pTM1-VP35-1-150rep pTM1-VP35

pTM1-EVP302LA

#1118/#1119

#1120/#434

PCR + RL

pTM1-VP35-1-150repFlag pTM1-VP35

pTM1-EVP302LAFlag

#1118/#1119

#1120/#409

PCR + RL

pTM1-VP35-70-150rep pTM1-VP35-1-150rep #1227/#434 PCR + RL

pTM1-VP35-70-150repFlag pTM1-VP35-1-150repFlag #1227/#409 PCR + RL





pTM1-VP35-

70-110mutrep

pTM1-VP35-70-110rep #1231/#1242 PCR + RL

pTM1-VP35-

70-110mutrepFlag

pTM1-VP35-70-110repFlag #1248/#1249

#1250/#1251

OM + RL

2 Material 29

2.9 Proteine

2.9.1 Enzyme

Alkalische Phosphatase,

Calf Intestinal Phosphatase (CIP) (10 U/µl)

New England Biolabs, Frankfurt

PfuTurboTM DNA-Polymerase (2.5 U/µl) Stratagene, Heidelberg

Mikrokokken-Nuklease (100 – 300 U/µl) MBI-Fermentas, St. Leon-Rot

SAWADY PWO DNA-Polymerase (1U/µl) Peqlab Biotechnologie, Erlangen

Restriktionsendonukleasen New England Biolabs, Frankfurt

RNase A Qiagen, Hilden

T4 DNA Ligase (4 U / µl) New England Biolabs, Frankfurt

Thermo Sequenase™ II DNA Polymerase Amersham Pharmacia Biotech,

Freiburg

2.9.2 Antikörper und Peptide

α-Flag® M2 monoklonaler AK Sigma-Aldrich, Deisenhofen

α-Flag® polyklonaler AK vom Kaninchen Sigma-Aldrich, Deisenhofen

α MARV-NC, Kaninchen (1 M NaCl, 11.06.1996) Institut für Virologie, Marburg

α MARV-NP 2B10, Maus, monoklonal Institut für Virologie, Marburg

α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) Institut für Virologie, Marburg

α EBOV-VP30 Antiserum, rabbit 52/1 3. BE Institut für Virologie, Marburg

α Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente Roche, Mannheim

Ziege α Maus FITC-gekoppelt Dianova, Hamburg

Ziege α Kaninchen, Rhodamin-gekoppelt Dianova, Hamburg

Ziege α Maus, POD DAKO-Diagnositka, Hamburg

Ziege α Meerschweinchen, POD DAKO-Diagnositka, Hamburg

Flag® Peptide Sigma-Aldrich, Deisenhofen

2.9.3 Proteinmarker

RainbowTM Protein Molecular Weight Marker

14,3 - 200 kDa

Amersham Pharmacia Biotech,

Freiburg

Tabelle 3: Für Klonierungen verwendete DNA-Matrizen und Oligonukleotide. Die Bezeichnung der Oligonukleotide erfolgte mit der internen Labornummer (#), deren genaue Bezeichnung und Sequenzen unter 2.7.3 verzeichnet sind. PA: Primer Annealing (3.1.3), PCR: Polymerase-Ketten-Reaktion (3.1.1), RL: Restriktionsverdau (3.1.6.1) mit anschließender Ligation (3.1.9); OM: Ortsgerichtete Mutagenese (3.1.2).

2 Material 30

2.10 Radioaktiv markierte Substanzen

[14C] RainbowTM Protein Molecular Weight Marker

14,3 - 200 kDa

Amersham Pharmacia Biotech,

Freiburg

[14C]-Chloramphenicol (25 µCi)

[35S]PromixTM Cell Labelling Mix (7,5 mCi)

2.11 Zellen und Viren

2.11.1 Prokaryotische Zellen

E. coli Stamm XL1-Blue Stratagene, Heidelberg

Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F‘ proAB laclqZ∆M15 Tn10

(Tetr)]

2.11.2 Eukaryotische Zellen

Huh7-Zellen humane Hepatomazelllinie

Huh-T7-Zellen humane Hepatomazelllinie mit konstitutiver

Expression der T7-RNA-Polymerase

(V. Gauss-Müller, Lübeck)

Vero-Zellen Nierenzellen der afrikanischen Meerkatze

2.11.3 Viren

Marburg-Virus (MARV-Musoke) Institut für Virologie, Marburg

3 Methoden 31

3 Methoden

3.1 Molekularbiologische Methoden

3.1.1 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen durch Polymerase-Ketten-Reaktion

Mittels einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) können spezifische DNA-Sequenzen

in vitro vervielfältigt werden. Für jede Reaktion verwendet man zwei verschiedene

Primer, die an jeweils einen DNA-Strang binden und die Zielsequenz einrahmen. Der

Vorwärts-Primer und der Rückwärts-Primer bestehen aus 15 bis 25 Nukleotiden, die

das 5’- und das 3’-Ende des zu amplifizierenden DNA-Fragments definieren.

Entsprechend der Klonierungsstrategie können die Primer im 5’-Bereich zusätzliche

Sequenzen für Schnittstellen von Restriktionsenzymen enthalten (Abb. 4).

Ein Reaktionszyklus besteht aus drei verschiedenen Temperaturstufen. Zuerst wird die

doppelsträngige DNA-Matrize durch Erhitzen in ihre EinzeIstränge (Denaturierung)

überführt. Anschließend wird der Reaktionsansatz auf eine durch die Basensequenz

der Primer festgelegte Temperatur abgekühlt, damit diese an die komplementären

Sequenzabschnitte der einzelsträngigen DNA-Matrize (Annealing) binden können.

Nach Hybridisierung der Primer erfolgt ausgehend vom 3’-Ende des jeweiligen Primers

die Synthese des Doppelstranges (Extension). Hierzu wird die Temperatur auf das

Aktivitätsoptimum der hitzestabilen Pwo DNA Polymerase erhöht, die neben ihrer 5’-3’-

Polymeraseaktivität über eine Korrekturlesefunktion (3’-5’-Exonukleaseaktivität)

verfügt. Der Reaktionszyklus wird mehrfach wiederholt, wobei die zu amplifizierende

DNA im Reaktionsgemisch exponentiell angereichert wird. Im Anschluss an die PCR

werden 10 µl des Reaktionsansatzes auf einem analytischen DNA-Agarosegel (3.1.4.1)

überprüft. Die amplifizierten DNA-Fragmente werden über ein präparatives DNA-

Agarosegel (3.1.4.2) aufgetrennt und durch Gelextraktion (3.1.5.1) gereinigt.

dsDNA

Rückwärts-Primer

Vorwärts-Primer

5’3’

5’ 3’

3’

5’

3’

5’

Abbildung 4: Prinzip einer PCR. Der vergrößerte DNA-Abschnitt soll mittels PCR amplifiziert werden. Nach Denaturierung der doppelsträngigen DNA und Hybridisierung der Primer an die Zielsequenz erfolgt die Synthese des gewünschten DNA-Fragments in 5’-3’-Richtung.

3 Methoden 32

Reaktionsansatz: 10 ng DNA

300 nM Vorwärts-Primer

300 nM Rückwärts-Primer

je 1 µl 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

10 µl 10x PCR Puffer (20 mM MgSO4)

ad 99,5 µl dH2O

0,5 µl Pwo DNA Polymerase (1 U/µl)

Programm: Zyklen Temperatur Zeit

Denaturierung 1 95 °C 2 min


Annealing 50 – 60 °C 1 min

Synthese 72 °C 1 min + 5 sec

pro Zyklus

Ende der Synthese 1 4 °C ∞

Die Einführung von verschieden großen Deletionen in das Zielgen erfolgt mittels PCR

und anschließendem DpnI-Verdau (Imai et al., 1991). Die Primer bestehen aus 21

Nukleotiden komplemtär zu ihrer Zielsequenz. Nach Denaturierung der DNA-Matrize

und Hybridisierung der Primer lesen diese in entgegengesetzter Richtung aus dem

Gen hinaus (Abb. 5). Mittels der PfuTurbo® DNA Polymerase wird neben dem

gewünschten DNA-Fragment das gesamte Rückgrat

des Vektors in 16 Zyklen amplifiziert. Im Anschluss an

die PCR wird der Ansatz für eine Stunde bei 37 °C mit

1 µl DpnI verdaut (3.1.6.1). Die in vitro entstandene

mutierte DNA ist im Gegensatz zur bakteriell

replizierten DNA nicht methyliert. Die Restriktions-

endonuklease DpnI besitzt die Fähigkeit, ausschließ-

lich methylierte DNA zu schneiden und zerstört somit

die ursprünglich eingesetzte Plasmid-DNA. Die DNA

wird über ein präparatives DNA-Agarosegel (3.1.4.2)

aufgetrennt und mittels Gelextraktion (3.1.5.1)

gereinigt. Die resultierende deletierte DNA wird nach

Religation (3.1.9) in Z-kompetente E.coli XL1-Blue-

Zellen transformiert (3.1.10).

Plasmid-DNA

Primer

Deletion

5’5’

3’3’

Plasmid-DNA

Primer

Deletion

5’5’

3’3’

Plasmid-DNA

Primer

Deletion

5’5’

3’3’

Abbildung 5: Einführung von Deletionen mittels PCR. Die PCR-vermittelte Deletion bestimmter DNA-Sequenzen erfolgt mit Primern, die von der Polymerase in entgegen-gesetzter Richtung verlängert werden.

3 Methoden 33





5 µl 10x PCR Puffer

ad 49 µl dH2O

1 µl PfuTurbo® DNA Polymerase (2.5 U/µ)


Denaturierung 1 95 °C 30 sec


Annealing 55 °C 1 min

Synthese 68 °C 2 min/kb

Plasmidlänge


3.1.2 Ortsgerichtete Mutagenese von Plasmid-DNA

Punktmutationen, Deletionen und Insertionen können mittels in vitro Mutagenese in

Plasmid-DNA eingebracht werden. Diese Methode basiert auf einer PCR mit

spezifischen, zueinander komplementären Primern, die die gewünschte Mutation

enthalten. Die Amplifikation erfolgt mit Hilfe der rekombinanten PfuTurbo® DNA

Polymerase. Anschließend wird der Ansatz mit 1 µl der Restriktionsendonuklease DpnI

versetzt und für drei Stunden bei 37 °C inkubiert (3.1.7.1). Die methylierte Ausgangs-

DNA wird somit verdaut und die neu synthetisierten, nicht methylierten Amplifikate, die

die Mutation tragen, bleiben intakt. 10 µl dieses Ansatzes werden direkt in Z-

kompetente XL1-Blue-Zellen transformiert (3.1.6).





10 µl 10x PCR Puffer (20 mM MgSO4)

ad 99,5 µl dH2O

1 µl

PfuTurbo® DNA Polymerase (2.5 U/µl)

3 Methoden 34




Annealing 55 °C 1 min

Synthese 68 °C 2 min/kb

Plasmidlänge


Zur Kontrolle werden 10 µl des PCR-Ansatzes über ein analytisches Agarosegel

(3.1.4.1) analysiert.

3.1.3 Anlagerung komplementärer Oligonukleotide

Zwei zueinander komplementäre Oligonukleotide werden zu kurzen doppelsträngigen

DNA-Fragmenten hybridisiert (Primer Annealing). Mittels flankierender Restriktions-

schnittstellen werden die annealten Primer in einen zuvor entsprechend verdauten

Vektor einligiert (3.1.6.1, 3.1.9).

Reaktionsansatz: 22 µl 30 µM Oligonukleotid (+)-Orientierung

22 µl 30 µM Oligonukleotid (-)-Orientierung

8 µl Annealing-Puffer

4 µl dH2O

Der Reaktionsansatz wird zunächst für eine Minute bei 95 °C inkubiert. Die Oligo-

nukleotidanlagerung findet für 20 Minuten bei einer Temperatur von 37 °C statt. Nach

einer anschließenden 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur (RT) werden die

hybridisierten doppelsträngigen DNA-Fragmente mittels Ethanolfällung (3.1.8.2)

aufgereinigt.

3.1.4 Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren

Nukleinsäuren können aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen ent-

sprechend ihrer Molekülgröße im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt werden.

Unter Verwendung des interkalierenden Farbstoffes Ethidiumbromid und von UV-Licht

werden die Nukleinsäurefragmente sichtbar gemacht. Zur Größenbestimmung von

DNA-Fragmenten nach einer PCR oder nach enzymatischen Reaktionen werden

analytische DNA-Agarosegele verwendet, wogegen präparative DNA-Agarosegele zur

Reinigung von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Sie unterscheiden sich im

Reinheitsgrad der Agarose, dem Laufpuffer und dem einzusetzenden Probenvolumen.

3 Methoden 35

Um RNA-Fragmente verschiedener Größe für eine Northern Blot-Analyse (3.3.4)

aufzutrennen, werden denaturierende Formaldehyd-RNA-Agarosegele benutzt.

3.1.4.1 Analytische DNA-Agarosegele

Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose, ultrarein in 1x TBE-Puffer gelöst

Laufpuffer: 1x TBE-Puffer, pH 8,0

Die Agarose wird durch Erhitzen in TBE-Puffer gelöst und anschließend in eine

entsprechende Gelkammer gegossen. Zur Charakterisierung der Größe der zu

analysierenden DNA werden je 1 µl DNA-Längenstandard (2.7.1) mit den zu unter-

suchenden Proben auf dem Agarosegel aufgetrennt. Die DNA und die Marker werden

vor dem Auftragen mit 6x DNA-Probenpuffer versetzt. Dieser Auftragspuffer erhöht die

Dichte der DNA-Probe und erleichtert somit das Beladen der Geltaschen. Der

enthaltene Farbstoff Bromphenolblau liefert einen Anhaltspunkt für die Wanderung der

DNA. Die Elektrophorese erfolgt bei 40 bis 80 mA. Anschließend wird das Gel für 20

bis 30 Minuten in wässriger Ethidiumbromidlösung (1 µg/ml) inkubiert. Mit Hilfe eines

Geldokumentationssystems GelDoc2000 und UV-Beleuchtung mit Wellenlängen von

302 nm werden die DNA-Banden visualisiert.

3.1.4.2 Präparative DNA-Agarosegele

Agarosegel: 1 % (w/v) Agarose NA in 1x TAE-Puffer gelöst

Laufpuffer: 1x TAE-Puffer, pH 8,0

Die Aufbau- und Elektrophoresebedingungen entsprechen denen analytischer DNA-

Agarosegele (3.1.4.1). Nach Anfärbung der DNA in Ethidiumbromidlösung werden die

gewünschten DNA-Banden mit einem Skalpell auf einem UV-Schirm ausgeschnitten.

Die DNA wird anschließend mit dem QIAquickTM Gel Extraction Kit aus dem Gel isoliert

(3.1.5.1).

3.1.4.3 Formaldehyd-RNA-Agarosegele

Agarosegel: 1,5 % (w/v) Agarose, ultrarein

23 ml dH2O

6 ml 5x FA-Laufpuffer

1 ml 37 % Formaldehyd

Laufpuffer: 1x FA-Laufpuffer

Die Agarose wird zunächst mit dH2O und 5x Formaldehyd(FA)-Puffer versetzt und

aufgekocht. Das Formaldehyd wird erst nach Abkühlen der Lösung auf 60 °C unter

3 Methoden 36

dem Abzug zugegeben. Die Elektrophorese wird zu Beginn bei einer Spannung von

50 V durchgeführt und im weiteren Verlauf auf 90 V erhöht, bis die Bromphenolblau-

bande einen Zentimeter vor dem Gelende angekommen ist.

3.1.5 Isolierung von Nukleinsäuren

3.1.5.1 Isolierung von DNA aus Agarosegelen

Die Extraktion von DNA aus präparativen DNA-Agarosegelen erfolgt mit Hilfe des

QIAquick® Gel Extraction Kits entsprechend der beiliegenden Arbeitsanleitung. Die

DNA wird nach Reinigung über eine Säulenmatrix in 30 µl dH2O eluiert. Ein Zehntel

des Eluats wird zur Kontrolle der Präparation auf einem analytischen Agarosegel

aufgetrennt (3.1.4.1).

3.1.5.2 Isolierung replizierter RNA aus transfizierten Huh-T7-Zellen

Die Isolierung von replizierter RNA aus Huh-T7-Zellen zur Durchführung einer Northern

Blot-Analyse (3.3.4) erfolgt 40 Stunden nach Transfektion (3.2.3). Die Huh-T7-Zellen

werden zunächst zweimal mit kaltem PBSdef gewaschen, in einem Volumen von 500 µl

PBSdef abgekratzt und in 1,5 ml-Schraubröhrchen überführt. Nach einer sechs-

minütigen Zentrifugation bei 8000 Upm bei 4 °C werden die pelletierten Zellen in 200 µl

Mikrokokken-Nuklease(MCN)-Puffer aufgenommen und achtmal mit Hilfe einer 1 ml-

Spritze und einer violetten Kanüle (24 GA1 0.55 x 25 mm) geschert. Die anschließende

Beschallung der Huh-T7-Zellen erfolgt mit 40 der längsten Impulse im Branson Sonifier

450 bei 4 °C. Zelltrümmer und nicht lysierte Zellen werden mittels einer fünfminütigen

Zentrifugation bei 2500 Upm entfernt. Die Überstände werden einem MCN-Verdau

(3.1.6.2) unterzogen. Im Anschluss erfolgt die Fällung und Reinigung (3.1.8.3) der

replizierten RNA.

3.1.6 Verdau von Nukleinsäuren

3.1.6.1 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Doppelsträngige DNA-Moleküle können mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen an

spezifischen Erkennungsstellen gespalten werden. Sie werden sowohl für die

Herstellung von zur Klonierung verwendeten DNA-Fragmenten als auch zur

Identifizierung entstandener Klonierungsprodukte eingesetzt. Die zu analysierende

DNA wird mit dem gewünschten Enzym unter definierten Pufferbedingungen inkubiert.

Der Restriktionsansatz wird, je nach verwendetem Enzym, mit BSA (100 µg/ml)

komplementiert und beim jeweiligen Temperaturoptimum für zwei bis 16 Stunden

inkubiert.

3 Methoden 37

Ansatz für analytischen Verdau: 0,1 – 0,5 µg DNA

1 µl 10x Puffer nach Herstellerangaben

(1 µl 10 % BSA, falls notwendig)

0,3 µl Restriktionsendonuklease

(bei Doppelverdau je 0,15 µl)

ad 10 µl dH2O

Ansatz für präparativen Verdau: 3 – 5 µg DNA

5 µl 10x Puffer nach Herstellerangaben

(5 µl 10 % BSA, falls notwendig)

3 µl Restriktionsendonuklease

(bei Doppelverdau je 1,5 µl)

ad 50 µl dH2O

Die DNA kann gleichzeitig mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten werden, sofern

diese hinsichtlich der Temperatur- und Reaktionsbedingungen kompatibel sind.

Andernfalls wird die DNA nacheinander mit den gewünschten Enzymen verdaut. Um

für weitere Reaktionen störende Enzym- und Pufferrückstände sowie Fragmente vom

5’- und 3’-Ende zu entfernen, wird der Restriktionsansatz mit dem QIAquick® PCR

Purification Kit gereinigt (3.1.8.1). Die entstandenen Restriktionsfragmente haben

aufgrund der Lage der Spaltstellen eine definierte Länge und können mit einem

analytischen DNA-Agarosegel (3.1.4.1) überprüft werden. Für eine weitere

Verwendung muss die DNA nach dem Verdau entweder mit Hilfe des QIAquick® PCR

Purification Kits (3.1.8.1) oder über ein präparatives Agarosegel (3.1.4.2) mit

anschließender Gelextraktion (3.1.5.1) aufgereinigt werden.

3.1.6.2 Verdau von RNA mit Mikrokokken-Nuklease

Replizierte MARV-Minigenom-spezifische RNA ist durch die Enkapsidierung mit dem

NP resistent gegen Nukleasebehandlung und kann durch einen Verdau mit MCN von

anderen nicht geschützten RNAs getrennt werden. Nach Zugabe von 15 Units MCN

werden die Überstände der Huh-T7-Zellen (3.2.3) 70 Minuten bei 30 °C inkubiert. Im

Anschluss erfolgt die Reinigung und Fällung (3.1.8.3) der zu analysierenden RNA.

3.1.7 Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA

Um die Religation geschnittener Vektoren zu verhindern, werden die 5’-Phosphat-

gruppen der verdauten Plasmide durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase

(calf intestinal phosphatase, CIP) entfernt. Die CIP ist in den meisten 10x

Restriktionspuffern aktiv und kann, sofern die Inkubationstemperatur bei 37 °C liegt,

3 Methoden 38

einfach zum präparativen Restriktionsansatz hinzu gegeben und eine Stunde bei 37 °C

inkubiert werden. Die Inaktivierung der CIP erfolgt für zehn Minuten bei 72 °C durch

Zugabe von 0,5 µl einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0). Um für die Ligation störende

Substanzen zu entfernen, wird die DNA anschließend mit dem QIAquick® PCR

Purification Kit (3.1.8.1) gereinigt.

3.1.8 Reinigung von Nukleinsäuren

Saubere Nukleinsäurepräparationen bilden die Voraussetzung für molekularbiologische

Experimente. Verunreinigungen wie Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, Salze

Detergenzien oder Proteine haben einen negativen Einfluss auf nachfolgende

biochemische Reaktionen und müssen demzufolge entfernt werden.

3.1.8.1 Reinigung von DNA-Fragmenten

PCR-Ansätze enthalten nach der Amplifikation von DNA-Fragmenten (3.1.1) noch

Primer und Nukleotide. Ebenso befinden sich nach dem Verdau von DNA (3.1.6.1)

Fragmente vom 5’- und 3’-Ende sowie störende Salze im Restriktionsansatz. Diese

Bestandteile werden mit Hilfe des QIAquick® PCR Purification Kits entsprechend dem

beiliegenden Handbuch entfernt. Die DNA adsorbiert an eine Säulenmatrix, wird durch

Waschen von Verunreinigungen befreit und schließlich in einer entsprechenden Menge

dH2O (30 bis 50 µl) eluiert.

3.1.8.2 Ethanolfällung von DNA-Fragmenten

Mittels Ethanolpräzipitation können Nukleinsäuren gereinigt und konzentriert werden.

Die DNA bildet in Gegenwart von Natriumacetat in 100 %igem Ethanol einen

unlöslichen Niederschlag, der durch eine 30-minütige Zentrifugation bei 14.000 UpM

pelletiert wird. Dem Fällungsansatz kann optional der Carrier Glykogen zugesetzt

werden. Dieses Trägermaterial wird ebenfalls durch Ethanol präzipitiert und fällt so

sehr geringe DNA-Mengen mit aus. Zur Entfernung mitgefällter Salze wird das Pellet

mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Im Anschluss an eine 15-minütige Zentrifugation bei

14.000 UpM wird das DNA-Pellet bei RT getrocknet und in einer adäquaten Menge

dH2O gelöst.

Ansatz: x µl DNA-Lösung

(1 µl Glykogen, 20 mg/ml)

x/10 µl 3 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,2

ad 2,5fache des Ausgangvolumens 100 % Ethanol

3 Methoden 39

3.1.8.3 Reinigung und Fällung von RNA-Fragmenten

RNA aus den mit MCN verdauten Zelllysaten von Huh-T7-Zellen (3.1.6.2) wird mit Hilfe

des RNeasy® Mini Kits entsprechend dem beiliegenden Handbuch aufgereinigt und in

200 µl dH2O eluiert. Die Fällung der RNA wird wie folgt über Nacht bei –20 °C

durchgeführt.

Ansatz: 200 µl RNA-Lösung

1 µl Glykogen, 20 mg/ml

20 µl 3 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,2

ad 2,5fache des Ausgangvolumens 100 % Ethanol

Im Anschluss wird die präzipitierte RNA mittels einer 30-minütigen Zentrifugation (4 °C)

bei 14.000 UpM pelletiert und mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Im Anschluss an eine

15-minütige Zentrifugation bei 14.000 UpM wird das RNA-Pellet bei RT getrocknet und

zur Analyse auf einem Formaldehyd-RNA-Agarosegel (3.1.4.3) in 10 µl Formaldehyd-

Auftragspuffer aufgenommen, 15 Minuten bei 65 °C denaturiert und nach weiteren fünf

Minuten auf Eis mit 2 µl RNA-Farbpuffer versetzt.

3.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten in linearisierte Vektoren

Mit Hilfe einer DNA Ligase, die die Bildung von Phosphodiesterbrücken zwischen

freien 5’-Phosphatgruppen eines DNA-Stranges mit den freien 3’-OH-Gruppen eines

anderen Stranges katalysiert, können verschiedene DNA-Moleküle miteinander

verknüpft werden. Mittels PCR synthetisierte und mit Restriktionsenzymen verdaute

DNA-Fragmente (3.1.1, 3.1.6.1) oder hybridisierte Primer (3.1.3) werden so in zuvor

entsprechend geschnittene Vektoren einligiert (3.1.6.1).

Ansatz: 20 – 200 ng verdaute, gereinigte Insert-DNA

25 – 50 ng linearisierte, gereinigte Vektor-DNA

1 µl 10x Ligationspuffer mit rATP

0,5 µl T4 DNA Ligase (4 U/µl)

ad 15 µl dH2O

Zur Abschätzung des Verhältnisses von religierten Plasmiden zu Plasmiden mit

Insertionen wird eine Religationskontrolle mitgeführt, in der das zu klonierende DNA-

Fragment durch dH2O ersetzt wird. Als Ligationskontrolle wird ein nur mit einem

Restriktionsenzym linearisiertes, nicht dephosphoryliertes Plasmid eingesetzt. Die

3 Methoden 40

Ligationsansätze werden für eine Stunde bei RT inkubiert und im Anschluss vollständig

in Z-kompetente XL1-Blue-Zellen transformiert (3.1.10).

3.1.10 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterienzellen

Rekombinante Plasmide werden zur Vermehrung in Bakterienzellen eingeführt. Zur

Aufnahme fremder Plasmid-DNA müssen die Zellen zunächst kompetent gemacht

werden. Die Bakterien der Wahl werden mit dem Z-Competent E.coli Transformation

KitTM and Buffer Set entsprechend dem beiliegenden Protokoll behandelt, aliquotiert

und bei –80 °C gelagert. Vor einer Transformation werden die Z-kompetenten E.coli-

Zellen aufgetaut und transformiert, indem 100 µl Zellsuspension mit der DNA-Lösung

(15 µl Ligationsansatz, 10 bis 20 ng Plasmid-DNA) vermischt und für eine Stunde auf

Eis inkubiert werden.

3.1.11 Anzucht und Selektion rekombinanter Bakterien

Plasmid-DNA kann in Bakterien durch Antibiotika-Selektion vermehrt werden. Die

transformierten Bakterienzellen (20 bis 100 µl) werden auf ampicillinhaltige (100 µg/ml)

Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die gewünschten

Plasmide, die ein Ampicillinresistenzgen tragen, befähigen die Bakterien, auf dem

Selektionsmedium zu wachsen.

3.1.12 Plasmidpräparationen kleinen Maßstabes

Mit dem E.Z.N.A.® Plasmid Miniprep Kit I werden Plasmidpräparationen in kleinem

Maßstab nach dem beiliegenden Protokoll hergestellt. Zur Isolierung von Plasmid-DNA

werden einzeln gewachsene Bakterienkolonien gepickt und jeweils in 3 ml LB-Medium

mit Ampicillin (100 µg/ml) über Nacht auf einem Schüttler bei 37 °C angezogen. 1,5 ml

der Bakteriensuspension werden pelletiert, lysiert und auf eine HiBind®-Miniprep-Säule

geladen. Die Plasmid-DNA bindet an die in der Säule enthaltene Silikamembran, wird

durch Waschen von Verunreinigen befreit und nach Trocknen der Säule in 50 µl dH2O

eluiert. Zur Überprüfung, ob die Bakterien das gewünschte Plasmid aufgenommen

haben und ob die Insertion in richtiger Orientierung vorhanden ist, werden 2 bis 5 µl

des gewonnenen Eluats mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut (3.1.6.1)

und auf einem analytischen DNA-Agarosegel aufgetrennt (3.1.4.1).

3.1.13 Plasmidpräparationen großen Maßstabes

Auf der Basis eines positiven Bakterienklons wird unter Verwendung des QIAfilter®

Plasmid Maxi bzw. des HiSpeed Plasmid Maxi Kits eine Plasmidpräparation großen

Maßstabes angefertigt. Zur Anzucht werden 100 ml ampicillinhaltiges (100 µg/ml) LB-

Medium mit 100 µl einer Bakterienkultur des gewünschten Klons inokuliert und bei

3 Methoden 41

37 °C über Nacht auf einem Schüttler inkubiert. Die Anwendungen basieren auf einer

alkalischen Lyse von Bakterienzellen (Sambrook et al., 1989) mit anschließender

Adsorption der Plasmid-DNA an eine Anionenaustauscher-Matrix. Nach mehrmaligem

Waschen wird die DNA in 500 µl dH2O aufgenommen. Mit Hilfe eines Photometers wird

die Konzentration der Plasmidpräparation auf 1 µg/µl eingestellt.

3.1.14 Konzentrations- und Reinheitsbestimmungen von Nukleinsäuren

Nukleinsäurekonzentrationen werden durch UV-Messung in einer Quarzküvette bei

einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Die Optische Dichte der Lösung bei 260 nm

(OD260) ist direkt proportional zu ihrem Nukleinsäuregehalt. Um die Extinktionen im

linearen Bereich (0,1 bis 0,8) zu erhalten, werden die Proben 1:100 in dH2O verdünnt.

Für doppelsträngige Plasmid-DNA entspricht eine Absorption von eins einer

Konzentration von 50 µg/ml. Die Reinheit einer Nukleinsäurelösung lässt sich durch die

Bestimmung des Verhältnisses der Absorption bei 260 nm und bei 280 nm abschätzen.

Reine Lösungen besitzen einen OD260/OD280-Wert von 1,8. Durch Kontaminationen wie

Proteine ergeben sich wesentlich kleinerer Werte, wobei Verunreinigungen durch

Phenol oder RNA in einem deutlich höheren Quotienten resultieren.

3.1.15 Sequenzanalyse mit dem Kapillarsequenzer MegaBASETM 500

Das Prinzip dieser Sequenzierung beruht auf der Kettenabbruchmethode nach Sanger

und Coulson (Sanger and Coulson, 1975). Bei der hier verwendeten Modifikation der

Methode wird die zu sequenzierende DNA mittels PCR synthetisiert.

Reaktionsansatz: 1 µl DNA (100 – 200 ng/µl)

1 µl Primer (10 pmol)

4 µl Ter-Mix

ad 20 µl dH2O




Annealing 50 °C 15 sec

Synthese 60 °C 2 min


Neben den Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs) dATP, dCTP, dGTP und dTTP

werden unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs)

3 Methoden 42

ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP eingesetzt, die nach Einbau den Abbruch der

Elongation verursachen. Der Ter-Mix enthält neben einem Gemisch aus markierten

Nukleotiden (DYEnamic™ ET dye terminators) eine sequenzspezifische Polymerase

(Thermo Sequenase™ II DNA Polymerase). Die Proben werden im Anschluss an die

PCR mit Hilfe von Sephadex®G-50 Superfine in 96-well Multiscreen-Platten über

mehrere Zentrifugations- und Waschschritte aufgereinigt. Die Sequenzierung erfolgt

mit dem Kapillarsequenzer MegaBACETM 500, der fluoreszenzmarkierte DNA

automatisch analysiert und mittels einer speziellen Software auswertet.

3.2 Zellbiologische Methoden

3.2.1 Kultivierung von Vero-, Huh7- und Huh-T7-Zellen

Huh7- und Huh-T7-Zellen sind humane Hepatomazelllinien, wobei die letztere die T7-

RNA-Polymerase konstitutiv exprimiert. Bei Vero-Zellen handelt es sich um Nieren-

zellen der afrikanischen Meerkatze. Diese permanenten Zelllinien werden in 75 cm2

Zellkulturflaschen im Brutschrank bei 37 °C und unter 5 % CO2-Begasung kultiviert. Als

Wachstumsmedium wird DMEM(+++) verwendet. Für die Huh-T7-Zellen ist die Zugabe

von Geniticin (1 mg/ml) nötig. Die Passage der Zellen erfolgt unter einer Sicherheits-

werkbank im Abstand von drei bis vier Tagen. Der konfluente Zellrasen wird zweimal

mit 10 ml PBSdef gewaschen und anschließend zum Ablösen der Zellen vom Boden der

Kulturflasche mit 2 ml Trypsin/ EDTA für etwa eine Minute bei 37 °C inkubiert. Durch

Zugabe von 9 ml DMEM(+++) wird die Trypsin-Reaktion abgestoppt. Die abgelösten

Zellen werden durch mehr-maliges Pipettieren resuspendiert und in der gewünschten

Verdünnung in neue Zellkulturflaschen oder -platten ausgesät.

3.2.2 Transfektion von Huh7-Zellen mit Lipofectamine PlusTM

Um DNA in Zellen einzubringen, wird deren negative Ladung durch Komplexbildung

mit kationischen Lipiden maskiert. In dieser Form können sich die DNA-Lipidkomplexe

an die Zellmembran anlagern und diese passieren. Die Huh7-Zellen werden einen Tag

vor Transfektion in 6 well-Zellkulturplatten umgesetzt, so dass sie zum Transfektions-

zeitpunkt eine Dichte von 70 Prozent aufweisen. Für Immunfluoreszenzanalysen

werden die Huh7-Zellen auf runden Deckgläschen (12 mm) in 6 well-Zellkulturplatten

ausgesät. Die DNA-Transfektion der Zellen wird unter Verwendung von Lipofectamine

PlusTM durchgeführt, welches mit der DNA spontan Lipid-DNA-Komplexe bildet. Im

artifiziellen Replikations- und Transkriptionssystem ist ein Verhältnis von 1:5 der für die

Nukleokapsidproteine kodierenden Plasmide pTM1-NP und pTM1-VP35 essentiell

(Mühlberger et al., 1998). Die transfizierten Plasmidmengen betragen dement-

sprechend für das pTM1-NP 100 ng und für das pTM1-VP35 500 ng. NP- bzw. VP35-

3 Methoden 43

Mutanten werden in äquivalenten Mengen eingesetzt. Bei Einzelexpressionen wird die

Gesamtplasmidmenge durch die Zugabe von Leervektor pTM1 komplementiert. Die zu

exprimierenden Gene stehen in pTM1-Vektoren unter der Kontrolle eines T7-

Promotors. Die Bereitstellung der T7-RNA-Polymerase in Huh7-Zellen, die unter der

Kontrolle des eukaryotischen β-chicken-fibroblast-Promotors (Niwa et al., 1991)

exprimiert wird, erfolgt durch die Kotransfektion von je 500 ng des Plasmides

pCAGGS-T7 (Neumann et al., 2002). Vorbereitend werden zwei verschiedene Ansätze

(A und B) in Dnase- und Rnase-freien Polystyrolröhrchen entsprechend den

Empfehlungen des Herstellers pipettiert.

Pro well einer 6-well Zellkulturplatte:

A: 4 µl Lipofectamine PlusTM B: 1,1 – 1,5 µg DNA

100 µl DMEM(+Q) 100 µl DMEM(+Q)

6 µl Plus-ReagenzTM

Nach einer 15-minütigen Inkubation der Ansätze A und B bei RT werden diese vereint,

30 Sekunden gemischt und nochmals für 15 Minuten bei RT inkubiert. Währenddessen

wird das FCS-haltige Wachstumsmedium von den Huh7-Zellen abgenommen, und die

zu transfizierenden Zellen werden einmal mit vorgewärmtem DMEM(+Q) gewaschen.

Anschließend werden pro well einer 6 well-Zellkulturplatte 800 µl DMEM(+Q) vorgelegt.

Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Transfektionsgemische zugesetzt, so dass

das Transfektionsvolumen 1 ml beträgt. Die Transfektion erfolgt über Nacht, wobei

nach einer Inkubationszeit von drei Stunden bei 37 °C (5 % CO2) im Brutschrank 1ml

DMEM(+++) pro well hinzu gegeben wird. Zur Durchführung einer Immunpräzipitations-

analyse werden die transfizierten Huh7-Zellen radioaktiv mit [35S]Promix Cell-labelling

Mix markiert und lysiert (3.3.1) oder direkt für eine Immunfluoreszenzanalyse (3.3.6)

verwendet.

3.2.3 MARV-spezifisches Replikations- und Transkriptionssystem

In der Arbeitsgruppe wurde ein artifizielles MARV-spezifisches Replikations- und

Transkriptionssystem entwickelt (Mühlberger et al., 1998). Dieses reverse Genetik-

System basiert auf dem Plasmid 3M5M, welches für ein MARV-spezifisches RNA-

Minigenom unter der Kontrolle eines T7-Promotors kodiert. Es besteht aus einem

Reportergen (Chloramphenicol-Acetyltransferase, CAT), das in negativer Orientierung

vorliegt und von den 3’- und 5’-Enden des MARV-Genoms flankiert ist. Diese Regionen

enthalten alle für die Transkription und Replikation notwendigen cis-aktiven Signale.

Dieses Konstrukt wird gleichzeitig mit Plasmiden transfiziert, die unter der Kontrolle des

3 Methoden 44

T7-Promotors stehen und für die MARV-Nukleokapsidproteine NP, VP35 und L

kodieren. Die Expression der Nukleokapsidproteine in Huh-T7-Zellen führt zur

Transkription und Replikation des Minigenoms, wobei ein CAT-Transkript entsteht,

welches durch die zelluläre Translationsmaschinerie synthetisiert wird. Die CAT-

Aktivität (3.3.3) repräsentiert in diesem System die MARV-spezifische Transkription,

wobei der Nachweis von replizierter RNA mit Hilfe einer Northern Blot-Analyse (3.3.4)

erfolgt.

Huh-T7-Zellen werden einen Tag vor Transfektion in 6 well-Zellkulturplatten ausgesät,

so dass diese zum Transfektionszeitpunkt eine Konfluenz von 70 Prozent aufweisen.

Eine Stunde vor Beginn der Transfektion werden die zu transfizierenden Huh-T7-Zellen

zweimal mit DMEM(+Q) gewaschen. Anschließend werden pro 6 well 1 ml DMEM(+Q)

zugegeben, worauf eine einstündige Inkubation bei 37 °C (5 % CO2) im Brutschrank

erfolgt. In diesem Zeitraum werden die Transfektionsansätze (A und B) in Dnase- und

Rnase-freien Polystyrolröhrchen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers

vorbereitet.

Pro well einer 6 well-Zellkulturplatte:

A: 3 – 7 µl DNA B: 9 – 21 µl FuGENE 6

200 µl DMEM(+Q) 800 µl DMEM(+Q)

Die Standardkomponenten des MARV-Replikations- und Transkriptionsystems setzen

sich aus folgenden Plasmiden zusammen:

100 ng pTM1-NP

500 ng pTM1-VP35

1 µg pTM1-L

1 µg 3M5M

500 ng pCAGGS-T7

Die Mengen an pTM1-VP35 werden gegebenenfalls variiert oder durch ein Plasmid für

eine VP35-Mutante ersetzt. Die T7-RNA-Polymerase wird zum einen durch

Verwendung von konstitutiv exprimierenden Huh-T7-Zellen sowie durch die Kotrans-

fektion des Plasmides pCAGGS-T7 bereitgestellt (Enterlein, 2005). Die Transfektions-

ansätze werden vereint, für 20 Minuten bei RT inkubiert und anschließend auf die Huh-

T7-Zellen gegeben. 15 Stunden nach Transfektion wird das Transfektionsmedium

abgenommen, und die Zellen werden nach zweimaligem Waschen mit 2 ml

3 Methoden 45

DMEM(+++) versehen. Nach einer Gesamtinkubationszeit von 40 Stunden werden die

Zellen geerntet und für einen CAT-Reportergenassay (3.3.3) oder eine Northern Blot-

Analyse (3.3.4) verwendet.

3.2.4 Anzucht und Vermehrung von MARV

Kultivierte und zu 80 Prozent konfluente Vero-Zellen werden in 175 cm2 Zellkul-

turflaschen mit MARV-Musoke und einer multiplicity of infection (moi) von 0,01 infiziert.

Die Zellen werden mit 10 ml einer entsprechenden Virusverdünnung inokuliert und für

eine Stunde bei 37 °C (5 % CO2) im Brutschrank inkubiert. Im Anschluss werden 30 ml

DMEM(++) und FCS mit einer Endkonzentration von 2 % zugegeben und bis zum

Auftreten eines zytopathischen Effekts bei 37 °C (5 % CO2) im Brutschrank

aufbewahrt. Sieben bis acht Tage nach Infektion werden die Überstände geerntet. Die

Viren werden, wie bei Funke et al. (1995) beschrieben, aufgereinigt. Um außerhalb

eines Labors der Sicherheitsstufe 4 mit MARV-Präparationen arbeiten zu können,

werden diese mittels γ-Bestrahlung oder durch die Zugabe von SDS mit einer (Endkon-

zentration: 1 %) und zehnminütiges Kochen inaktiviert.

3.3 Biochemische und immunologische Methoden

3.3.1 Radioaktive Markierung und Lyse von Huh7-Zellen

Mit Hilfe des [35S]Promix Cell-labelling Mix werden transfizierte Huh7-Zellen (3.2.2)

radioaktiv markiert. 12 Stunden nach der Transfektion wird das Medium abgenommen.

Die Huh7-Zellen werden einmal mit DMEM ohne Methionin und Cystein gewaschen,

mit 1 ml desselben Mediums versetzt und für eine Stunde bei 37 °C (5 % CO2)

inkubiert. Im Anschluss wird das Medium entfernt und durch 1 ml DMEM(+Q) mit 5 µl

[35S]Promix Cell-labelling Mix ersetzt. Nach einer zweistündigen Markierung bei 37 °C

wird der Überstand verworfen, und die Zellen werden zweimal mit kaltem PBSdef

gewaschen. Die markierten Huh7-Zellen werden in 500 µl KoIP-Puffer abgekratzt und

durch eine zweiminütige Beschallung mit den längsten Impulsen im Branson Sonifier

450 bei 4 °C aufgeschlossen. Zelltrümmer und nicht lysierte Zellen werden mittels einer

zehnminütigen Zentrifugation bei 10.000 UpM entfernt. Die Überstände werden in neue

Reaktionsgefäße überführt und für eine Immunpräzipitationsanalyse (3.3.8) verwendet.

3.3.2 Vernetzung von Proteinen

Die zu vernetzenden mit einem Flag-Epitop markierten Proteine werden mit Hilfe des

T7 Quick Coupled Transcription/Translation Systems in vitro translatiert (3.3.7) und mit

Hilfe einer speziellen Anti-Flag M2-Agarose in 1 ml Hepes-Puffer für drei Stunden auf

dem Überkopfrotierer (ÜKR) präzipitiert. Nach dreimaligem Waschen des Agarose-

3 Methoden 46

pellets mit je 800 µl Hepes-Puffer wird dieses in 200 µl Hepes-Puffer resuspendiert und

mit 20 µl eines Flag-Peptides in einer Endkonzentration von 300 µg/ml versetzt. Die

Elution der gekoppelten Flag-markierten Proteine erfolgt für drei Stunden bei 4 °C auf

dem ÜKR. Die Ansätze werden im Anschluss für zwei Minuten bei 5000 UpM

zentrifugiert und die Überstände in neue Reaktionsgefäße überführt. Je 20 µl der

Überstände werden mit verschieden Konzentrationen von Glutaraldehyd (0,5; 1; 5; 10;

20 mM in H2O) oder EGS (0,1; 0,5; 1; 2; 5 mM in DMSO) für 30 Minuten bei RT

vernetzt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2 µl 1 M Tris (pH 8,5) und einer

Inkubation von fünf Minuten abgestoppt. Die Proben werden mit 4x Probenpuffer

versetzt und mittels SDS-PAGE (3.3.9.1) aufgetrennt und mit dem Bio-Imager Analyzer

ausgewertet (3.3.9.2).

3.3.3 CAT-Reportergenassay

Zur Durchführung einer Reportergenanalyse werden Huh-T7-Zellen 40 Stunden nach

der Transfektion (3.2.3) zunächst zweimal mit eiskaltem PBSdef gewaschen und für

15 Minuten in 150 µl 1x Reporter-Lysis-Puffer auf dem Schüttler bei RT inkubiert. Zell-

debris und Zelllysate werden im Anschluss abgeschabt, in Reaktionsgefäße überführt

und für 30 Sekunden gemischt. Nach einer zweiminütigen Zentrifugation bei 10.000

UpM werden die Zelllysate für die Bestimmung der CAT-Aktivität oder eine Western

Blot-Analyse verwendet (3.3.5).

Im MARV-Transkriptionssystem (3.2.3) wird MARV-spezifische Transkription über die

gebildete CAT-Aktivität detektiert. Die CAT katalysiert die Übertragung von Acetyl-

Gruppen des Donors Acetyl-Coenzym A auf den Akzeptor Chloramphenicol. Es

entstehen die Produkte 1’-Acetylchloramphenicol, 3’-Acetylchloramphenicol und 1’,3’-

Acetylchloramphenicol, die in ihrem Laufverhalten in der Dünnschichtchromatographie

(DC) unterschieden werden können.

Ansatz: 0,2 – 4 µl Zelllysat

150 µl 250 mM Tris/HCl (pH 7,5)

1 µl Acetyl-Coenzym A (70 mg/ml)

2 µl [14C]-Chloramphenicol (25 µCi/ml)

Die Katalyse des Ansatzes bei 37 °C wird nach drei Stunden durch Zugabe von 750 µl

Ethylacetat gestoppt. Nach kräftigem Mischen und einer zweiminütigen Zentrifugation

bei 10.000 UpM wird die obere organische Phase in ein neues Reaktionsgefäß

überführt und im Vakuumverdampfer vollständig eingedampft. Das dabei entstehende

Pellet wird in 10 µl Ethylacetat aufgenommen und auf eine mit Kieselgel beschichtete

DC-Platte aufgetropft. Die Platte wird in eine abgeschlossene Kammer in DC-

3 Methoden 47

Laufpuffer gestellt bis die Lauffront den oberen Rand erreicht. Die Auswertung erfolgt

über die Exposition der DC-Platte mit einer Bio-Imagingplatte sowie dem Bio-Imager

Analyzer (3.3.9.2).

3.3.4 Elektrotransfer von RNA (Northern Blot)

Die MCN-resistente RNA wird mit Hilfe eines Formaldehyd-RNA-Agarosegels (3.1.4.3)

aufgetrennt und mit einem Vakuum-Blotter auf eine positiv geladene Nylonmembran

übertragen. Diese wird vorher kurz mit Methanol benetzt und anschließend in

alkalischem Transferpuffer äquilibriert. Der Transfer erfolgt für 90 Minuten bei 50 mbar.

Im Anschluss wird die Membran für zehn Minuten in 200 mM Phosphatpuffer

neutralisiert und für zwei Minuten auf einem UV-Schirm fixiert.

Prähybridisierung und Hybridisierung

Die Prähybridisierung dient zum Absättigen unspezifischer Bindungsstellen. 19 ml

einer vorgewärmten Hybridisierungslösung nach Collins (Grosfeld et al., 1995) werden

mit 1 ml Heringsspermien-DNA versetzt und zusammen mit der Blotmembran bei 65 °C

in einem Hybridisierungsofen unter Rotation inkubiert. Nach drei bis sechs Stunden

werden 16 ml der Hybridisierungslösung entnommen. Zu den verbleibenden 3 ml

werden 3-10 µl einer DIG-markierten Sonde (Enterlein, 2005) zugegeben, die zuvor

drei Minuten bei 95 °C denaturiert und für drei Minuten auf Eis inkubiert wird. Die

Hybridisierung wird für eine Inkubationszeit von mindestens 12 Stunden bei 65 °C

fortgesetzt.

Detektion

Nach der Hybridisierung wird die Membran für fünf Minuten bei RT in RNA-

Waschpuffer geschwenkt und anschließend für zwei Stunden in frischem RNA-

Waschpuffer bei 65 °C im Hybridisierungsofen gewaschen. Um Rückstände wie SDS

und SSC zu entfernen, wird die Blotmembran zunächst für fünf Minuten in

Chemolumineszenz-Puffer I geschwenkt und für eine Stunde in 60 ml Chemolumi-

neszenz-Puffer I mit 2 % RNA-Blockingreagenz auf dem Schüttler inkubiert.

Zur Detektion wird die Membran mit einem Anti-Digoxigenin-Antikörper in einer

Verdünnung von 1:20.000 für 30 Minuten bei RT auf dem Schüttler behandelt. Nicht

gebundene Antikörper werden durch dreimaliges Waschen für je fünf Minuten in

Chemolumineszenz-Puffer I mit 0,3 % Tween 20 entfernt. Die Blotmembran wird für

weitere fünf Minuten in Chemolumineszenz-Puffer II äquilibriert und fünf Minuten mit

einer CDP-Star-Lösung in einer Verdünnung von 1:200 in Chemolumineszenz-Puffer II

inkubiert. Nach Entfernung von überschüssigem Reagenz wird die Membran in eine

Folie eingeschweißt. Die Position der DIG-markierten RNA/Sonden-Hybride kann

3 Methoden 48

durch Exposition eines Röntgenfilms detektiert werden, dessen Entwicklung mit dem

Optimax 2010 erfolgt (3.3.9.2).

3.3.5 Elektrotransfer von Proteinen (Western Blot)

Der Western Blot ermöglicht den spezifischen Nachweis von Proteinen innerhalb eines

Proteingemisches. Dabei werden die Proteine irreversibel von einer SDS-PAGE auf

eine PVDF-Membran übertragen und anschließend mit Hilfe von Antikörpern

nachgewiesen. Zur Durchführung eines Semi-Dry-Blots (Kyhse-Andersen, 1984)

werden je drei Blatt Whatman-Papier (6 x 9 cm) mit Anodenpuffer I, Anodenpuffer II

oder Kathodenpuffer befeuchtet. Eine ebenso große PVDF-Membran wird zunächst

kurz mit Methanol benetzt, in dH2O getränkt und anschließend in Anodenpuffer II

äquilibriert. Der Western Blot in einer Fastblot-Apparatur (Biometra) zeigt folgenden

Aufbau:

Anode (⊕-Pol)

3x Whatman-Papier getränkt mit Anodenpuffer I

3x Whatman-Papier getränkt mit Anodenpuffer II

PVDF-Membran

SDS-PAGE-Gel

3x Whatman-Papier getränkt mit Kathodenpuffer

Kathode ( -Pol)

Luftblasen zwischen den einzelnen Schichten des Blots werden durch vorsichtiges

Überrollen mit einer Glaspipette entfernt. Die Übertragung der Proteine erfolgt für

90 Minuten bei 0,8 mA/cm2. Zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen

wird die Membran nach dem Elektrotransfer über Nacht bei 4 °C in Blockierungspuffer

inkubiert. Im Anschluss wird die Membran dreimal zehn Minuten in PBSdef/0,1 %

Tween 20 gewaschen und für eine Stunde mit einem spezifischen Erstantikörper bei

RT auf einem Schüttler inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten von je zehn

Minuten in PBSdef/0,1 % Tween 20 wird die Membran für eine Stunde mit einem POD-

gekoppelten Zweitantikörper behandelt und im Anschluss erneut zweimal je zehn

Minuten in PBSdef/0,1 % Tween 20 sowie viermal zehn Minuten mit PBSdef gewaschen.

Die Detektion des POD-gekoppelten Zweitantikörpers erfolgt durch Chemilumineszenz.

Die Membran wird auf eine Folie gelegt und mit einem Gemisch aus SuperSignal® und

Luminol/Enhancer-Lösung für fünf Minuten bei RT inkubiert. Nach Entfernung von

Luftblasen und überschüssigem Detektionsreagenz wird die Membran in Folie

eingeschweißt. Die anschließende Exposition auf einem Röntgenfilm sowie dessen

-

3 Methoden 49

Entwicklung erfolgt mit Hilfe des Optimax 2010 in der Dunkelkammer. Folgende

Antikörperverdünnungen werden in dieser Arbeit für Western Blot-Analysen verwendet:

α MARV-NP 2B10, Maus, monoklonal 1:1000

α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) 1:5000

Ziege α Maus, POD 1:40.000

Ziege α Meerschweinchen, POD 1:25.000

3.3.6 Indirekte Immunfluoreszenzanalyse

Mittels Immunfluoreszenzanalyse können virale Proteine intrazellulär lokalisiert

werden. Die Methode der indirekten Immunfluoreszenz wird auch als sogenannte

Sandwich-Technik bezeichnet, da die mit dem ersten Antikörper entstandenen Antigen-

Antikörper-Komplexe mit einem zweiten fluoreszenzmarkierten Antikörper nachge-

wiesen werden. Nach der Transfektion von Huh7-Zellen (3.2.2) werden diese zunächst

zweimal mit kaltem PBSdef gewaschen und mit 3 %igem Paraformaldehyd in PBSdef für

15 Minuten bei RT fixiert. Das Fixierungsmittel wird durch zweimaliges Waschen mit

PBSdef entfernt und durch eine zehnminütige Behandlung mit einer 0,1 M Glycin-

Lösung neutralisiert. Um das Zellinnere der Antikörperbehandlung zugänglich zu

machen, werden die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in PBSdef für zehn Minuten bei RT

permeabilisiert. Nach erneutem Waschen mit PBSdef werden die Zellen mit

Blockierungspuffer für mindestens zehn Minuten überschichtet. Die fixierten und

permeabilisierten Zellen werden mit dem ersten antigenspezifischen Antikörper für eine

Stunde in einer dunklen und feuchten Kammer inkubiert. 20 µl des verdünnten

Antikörpers werden auf Parafilm gegeben und das Deckglas mit der zellbewachsenen

Seite darauf gelegt. Sowohl die Verdünnungen der Primär- als auch der

Sekundärantikörper werden in Blockierungspuffer angesetzt. Um ungebundene

Primärantikörper zu entfernen, werden die Deckgläser dreimal mit PBSdef gewaschen

und anschließend mit einem Zweitantikörper für eine Stunde in einer dunklen und

feuchten Kammer behandelt. Der Zweitantikörper ist spezifisch gegen den ersten

Antikörper gerichtet und durch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert, der durch das UV-

Licht des Fluoreszenzmikroskopes angeregt wird. Die Deckgläser werden

anschließend dreimal mit PBSdef gewaschen, kurz in dH2O gespült und mit Fluoprep

auf einem Objektträger eingedeckt. Nach dem Trocknen der Eindeckflüssigkeit können

die gefärbten Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden.

3 Methoden 50

Verdünnungsverhältnisse der verwendeten Antikörper:

α-Flag® polyklonaler AK vom Kaninchen 1:200

α-MARV-NP monoklonaler AK 2B10 von der Maus 1:25

Ziege α Kaninchen, Rhodamin-gekoppelt 1:200

Ziege α Maus FITC-gekoppelt 1:200

DAPI 1:10.000

3.3.7 In vitro Translation

Unter Verwendung von Plasmid-DNA und des TNT® T7 Quick Coupled Transcription/

Translation Kits können [35S]-markierte Proteine im zellfreien System synthetisiert

werden. Sofern dem zu exprimierenden Gen ein T7-Promotor vorgeschaltet ist,

vermitteln das im TNT® T7 Quick Master Mix enthaltene Kaninchen-Retikulozytenlysat

sowie die T7-RNA-Polymerase sowohl die Transkription als auch die Translation.

Ansatz: 2 µg Plasmid-DNA mit T7-Promotor

40 µl TNT® T7 Quick Master Mix

2 µl [35S]Promix Cell-labelling Mix

ad 50 µl nukleasefreies dH2O

Um Interaktionsstudien viraler Proteine durchzuführen, werden je 1 µg Plasmid-DNA

zweier möglicher Bindungspartner in einem Ansatz kotranslatiert. Um die DNA-Mengen

gleich zu halten, wird bei Translation von nur einem Protein der Translationsansatz

durch 1 µg des Vektors pTM1 komplementiert. Die Reaktionsansätze werden auf Eis

pipettiert und für 60 bis 90 Minuten bei 30 °C inkubiert. Die radioaktiv markierten

Proteine werden mittels SDS-PAGE (3.3.9.1) aufgetrennt und mit dem Bio-Imager

(3.3.9.2) analysiert.

3.3.8 Immunpräzipitation

Mittels Immunpräzipitation oder Koimmunpräzipitation werden Proteine durch die

Kopplung von Antigen-Antikörper-Komplexen an Protein-A-Sepharose gefällt.

Äquilibrierung von Protein-A-Sepharose

250 mg Protein-A-Sepharose werden in 4 ml Tris/KCl- oder KoIP-Puffer aufgenommen,

gut gemischt und für eine Stunde bei RT inkubiert. Die gequollene Sepharose wird

anschließend eine Minute bei 5000 UpM pelletiert und dreimal mit je 1 ml Tris/KCl-

3 Methoden 51

oder KoIP-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wird die Protein-A-

Sepharose in einem Volumenteil (VT) Tris/KCl- bzw. KoIP-Puffer aufgenommen und

bei 4 °C gelagert.

Präadsorption

5 µl in vitro Translat (3.3.7) werden zunächst in 500 µl Tris/KCl-Puffer aufgenommen

und für 30 Minuten bei 4 °C und 14.000 UpM zentrifugiert. Um den Hintergrund an

unspezifischen Proteinen möglichst gering zu halten, werden die Überstände in neue

Reaktionsgefäße überführt und mit 20 µl Protein-A-Sepharose versetzt. Zur

Durchführung einer Immunpräzipitationsanalyse aus Huh7-Zellen werden die Zelllysate

(3.2.2, 3.3.1) ebenfalls mit 20 µl Protein-A-Sepharose versehen. Die Präinkubation

erfolgt bei 4 °C für eine Stunde auf dem ÜKR. Nach einer zweiminütigen Zentrifugation

bei 10.000 UpM werden die Überstände wiederum in neue Reaktionsgefäße überführt.

Spezifische Antigen-Antikörper-Reaktion

Die Überstände werden bei 4 °C für 1,5 Stunden mit dem/den spezifischen Anti-

körper(n) auf dem ÜKR inkubiert.

Verdünnungsverhältnisse der verwendeten Antikörper:

α-Flag® M2 monoklonaler AK 1:500

α MARV-VP35/2, Meerschweinchen (16.04.1998) 1:1000

α NC/1 M NaCl (11.09.96) 1:500

α EBOV-VP30 Antiserum, rabbit 52/1 3. BE 1:2500

Präzipitation der Antigen-Antikörper-Komplexe durch Kopplung an Protein-A-

Sepharose

Die Ansätze werden nach Zugabe von 20 µl Protein-A-Sepharose bei 4 °C für 1,5

Stunden auf dem ÜKR inkubiert. Die an Protein-A-Sepharose gebundenen Immun-

komplexe werden für zwei Minuten bei 3.000 UpM abzentrifugiert. Nach Absaugen der

Überstände werden die Sedimente viermal mit 800 µl Tris/KCl-Puffer gewaschen,

wobei für den letzten Waschschritt ein Tris/KCl-Puffer ohne BSA verwendet wird. Die

Immunpräzipitate aus Huh7-Zellen werden entsprechend mit KoIP-Puffer gewaschen.

Die verbleibenden Protein-A-Sepharose-Pellets werden mit 20 µl 4x Probenpuffer

versetzt und für fünf Minuten bei 95 °C aufgekocht. Die Analyse der Immunpräzipitate

erfolgt mittels SDS-PAGE (3.3.9.1) und dem Bio-Imager Analyzer (3.3.9.2).

3 Methoden 52

3.3.9 Elektrophoretische Auftrennung und Visualisierung von Proteinen

3.3.9.1 SDS-PAGE

SDS (Natriumdodecylsulfat) überdeckt die Eigenladung von Proteinen, so dass negativ

geladene SDS-Protein-Komplexe proportional zum Molekulargewicht entstehen. Durch

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) können Proteine über diese unter-

schiedlichen negativen Ladungen aufgetrennt werden. Das Gelsystem besteht aus

einem 4%igen Sammelgel und einem Trenngel, dessen Prozentigkeit von der Größe

der aufzutrennenden Proteine abhängt.

Sammelgel: Trenngel:

4 % 10 % 12 % 15 %

dH2O 1,4 ml 1,9 ml 1,6 ml 1,1 ml

30 % Polyacrylamid-Lösung

(rotiphorese® Gel 30)

0,33 ml 1,7 ml 2,0 ml 2,5 ml

PAGE-Sammelgelpuffer 0,27 ml - - -

PAGE-Trenngelpuffer - 1,35 ml 1,35 ml 1,35 ml

10 % APS 0,02 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml

TEMED 0,002 ml 0,002 ml 0,002 ml 0,002 ml

Die aufzutrennenden Proteingemische werden mit 4x Proteinprobenpuffer versetzt und

für fünf Minuten bei 95 °C denaturiert. Das aufzutragende Probenvolumen beträgt 20 µl

pro Geltasche. Durch das Mitführen von Proteinmarkern (2.9.3) lassen sich die

Molekulargewichte der Proteine ermitteln. Die Gelelektrophorese erfolgt in einer

Keutz®-Minigelkammer mit Proteingellaufpuffer bei 25 mA pro Gel. Im Anschluss

werden die SDS-Gele auf dem Schüttler in Fixierer/Entfärber-Lösung inkubiert, kurz in

Wasser gespült, für 30 Minuten auf Whatmann-Papier mit Hilfe eines Vakuum-

Geltrockners getrocknet und durch Autoradiographie oder mit dem Bio-Imager

analysiert (3.3.9.2).

3.3.9.2 Autoradiographie und Bio-Imager-Analyse

Radioaktiv markierte Proteine werden nach ihrer Auftrennung mittels SDS-PAGE

(3.3.9.1) durch Autoradiographie oder mit dem Bio-Imager Analyzer BAS-1000 sichtbar

gemacht. Die markierten Proteinbanden werden durch Exposition eines Röntgenfilms

bzw. durch Exposition einer Bio-Imagingplatte nachgewiesen. Die radioaktive

Strahlung der markierten Proteine versetzt Elektronen in der Bio-Imagingplatte in einen

3 Methoden 53

angeregten Zustand. Durch das Abtasten mit einem Helium-Neon-Laser werden die

Elektronen erneut angeregt, fallen dann in ihren ursprünglichen Energiezustand zurück

und emittieren dabei Licht. Die Daten werden für den Computer digitalisiert und über

das Computerprogramm TINA 2.0 analysiert. Auf dem Röntgenfilm erscheinen die

markierten Proteine nach dessen Entwicklung als dunkle Banden. Die Expositionszeit

variiert zwischen 30 Minuten und mehreren Tagen.

4 Ergebnisse 54

4 Ergebnisse

Zielstellung dieser Arbeit war es, die Homooligomerisierung des MARV VP35 zu

charakterisieren sowie deren Funktion hinsichtlich der viralen RNA-Synthese und der

Morphogenese des Nukleokapsidkomplexes zu untersuchen. Ferner sollte die

Stöchiometrie der VP35-Homooligomgere ermittelt werden.

4.1 Homooligomerisierung des Marburg-Virus VP35

Das MARV VP35 ist Bestandteil des Nukleokapsidkomplexes und in die Ausbildung

verschiedener Protein-Protein-Komplexe mit den Nukleokapsidproteinen NP und L

involviert (Becker et al., 1998). Außerdem konnte in einem in vitro System gezeigt

werden, dass das VP35 in der Lage ist, mit sich selbst zu interagieren (Möller, 2000).

4.1.1 Homooligomerisierung des VP35 in Huh7-Zellen

Im Folgenden sollte untersucht werden, ob auch intrazellulär eine Interaktion des VP35

mit sich selbst zu beobachten ist. Zur T7-gestützten Expression der Proteine VP35Flag

und VP35 wurden die Plasmide pTM1-VP35Flag und pTM1-VP35 entweder einzeln oder

gemeinsam in Huh7-Zellen transfiziert (3.2.2). 15 Stunden nach Transfektion wurden

die Zellen metabolisch mit [35S]Promix Cell-labelling Mix markiert, lysiert (3.3.1) und mit

Protein-A-Sepharose vorinkubiert. Zum Nachweis einer möglichen Interaktion wurden

die Ansätze mit einem gegen das Flag-Epitop gerichteten Antikörper (α-Flag M2 AK)

behandelt. Die Koimmunpräzipitate (3.3.8) wurden mittels SDS-PAGE (3.3.9.1) aufge-

trennt und die getrockneten Gele mit dem Bio-Imager sowie dem Computerprogramm

TINA 2.0 (3.3.9.2) ausgewertet.

Die Verwendung einer Flag-markierten Form des VP35 (VP35Flag) mit einem

Molekulargewicht von ca. 38 kDa ermöglichte die Unterscheidung zum Wildtyp-VP35

(36 kDa) und bildete somit die Voraussetzung für eine Koimmunpräzipitationsanalyse.

Abbildung 6 zeigt, dass das Flag-markierte VP35 (VP35Flag) sowohl mit Hilfe eines

kommerziell erhältlichen α-Flag M2 AK (Spur 3) als auch mit einem α-NC AK (Spur 4)

präzipitiert werden konnte. Das VP35 ließ sich nur mit dem α-NC AK präzipitieren

(Spur 5) und zeigte keine Kreuzreaktion mit dem ebenfalls verwendeten α-Flag M2 AK

(Spur 6). Wie in Spur 1 zu sehen ist, wurde nach Behandlung des Koexpressions-

ansatzes mit dem α-Flag M2 AK das VP35 durch das VP35Flag spezifisch mitgefällt.

Spur 2 zeigt zur Kontrolle die Präzipitation mit dem α-NC AK, welcher beide Proteine

detektierte. Das VP35 des MARV ist somit in der Lage, sowohl in vitro als auch in vivo,

mit sich selbst zu interagieren (Möller et al., 2005).

4 Ergebnisse 55

4.1.2 Lokalisation der Homooligomerisierungsdomäne des VP35

Durch eigene Vorarbeiten konnte die für die Homooligomerisierung des MARV VP35

verantwortliche Domäne näher eingegrenzt werden (Möller, 2002).

VP35

VP351-278

VP351-246

VP351-122

+

+

+

+VP35∆121-219 +

VP35∆71-119

VP35220-329

VP35120-220

VP35

VP351-278

VP351-246

VP351-122

+

+

+

+VP35∆121-219 +VP35∆121-219 +

VP35∆71-119

VP35220-329

VP35120-220

VP35∆71-119

VP35220-329

VP35120-220

30kD

46kD

αF αNC αF αNC αF αNC αF αNC

1 2 3 4 5 6 7 8

VP35Flag+VP35 VP35VP35Flag Mock

VP35Flag

VP3530kD

46kD


1 2 3 4 5 6 7 8

VP35Flag+VP35 VP35VP35Flag Mock

VP35Flag

VP35

Abbildung 6: Immunpräzipitationsanalyse von VP35Flag und VP35 nach Einzel- und Koexpression aus Huh7-Zellen. Zur Expression der Proteine VP35Flag und VP35 wurden die Plasmide pTM1-VP35Flag bzw. pTM1-VP35 in subkonfluente Huh7-Zellen einzeln oder kotransfiziert. Zusätzlich wurde zur Expression der T7-RNA-Polymerase das Plasmid pCAGGS-T7 kotransfiziert. 15 h nach Transfektion wurden die Zellen radioaktiv markiert und lysiert. Anschließend wurde unter Verwendung eines α-Flag M2 AK und eines α-NC Antiserums eine Koimmunpräzipitationsanalyse durchgeführt. Die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Bio-Imager ausgewertet. Die koexprimierten Proteine sind oberhalb und die zur Detektion verwendeten AK unterhalb der Abbildung gezeigt. Rechtsseitig sind die Positionen der untersuchten Proteine dargestellt. Bei den mit ( ) gekennzeichneten Banden handelt es sich um unspezifische zelluläre Proteine.

Abbildung 7: Schematische Darstellung des VP35 und der untersuchten VP35-Deletionsmutanten. VP35Flag wurde zusammen mit den entsprechenden VP35-Deletions-mutanten in vitro translatiert und anschließend mittels Koimmunpräzipitation analysiert. Für die mit (+) gekennzeichneten VP35-Deletionsmutanten konnte eine Interaktion mit VP35Flag detektiert werden. Die mit (-) gekennzeichneten VP35-Deletionsmutanten waren nicht in der Lage, mit VP35Flag zu interagieren.

4 Ergebnisse 56

Koimmunpräzipitationsanalysen der in Abbildung 7 dargestellten VP35-Deletions-

mutanten haben gezeigt, dass sich die Homooligomerisierungsdomäne des MARV

VP35 auf dem N-Terminus des Proteins befindet.

Nach Deletion der Aminosäuren 71 bis 119 (VP35∆71-119) konnte keine Kopräzipitation

mit dem VP35Flag nachgewiesen werden. Innerhalb dieses Bereiches befinden sich

Aminosäuresequenzen, die nach Computervorhersage Coiled-Coil-Strukturen aus-

bilden können und vermutlich für die Interaktion des MARV VP35 mit sich selbst

verantwortlich sind (Möller et al, 2005).

4.1.2.1 Einfluss des N-Terminus auf die Homooligomerisierung des VP35

Es sollte nun geklärt werden, ob neben der Coiled-Coil-Struktur ein intakter N-

Terminus für die Homooligomerisierung des MARV VP35 notwendig ist. Um diese

Fragestellung zu untersuchen, wurden die N-terminal an das Coiled-Coil-Motiv

grenzenden Aminosäuren 1 bis 69 deletiert. Die Expression der daraus resultierenden

VP35-Deletionsmutante VP3570-329 zusammen mit dem volle Länge Interaktionspartner

VP35Flag erfolgte in vitro unter Verwendung des TNT® T7 Quick Coupled Transcription/

Translation Kits (3.3.7). Die anschließend durchgeführte Koimmunpräzipitations-

analyse (3.3.8) ist in Abbildung 8 dargestellt. Alle im Rahmen dieser Arbeit

untersuchten VP35-Mutanten wurden nach Einzelexpression mit den eingesetzten

Antikörpern auf eventuell bestehende Kreuzreaktionen getestet und ergaben keine

Unspezifitäten (Daten nicht gezeigt).

Die VP35-Deletionsmutante VP3570-329 kosedimentierte bei Präzipitation des VP35Flag

mit dem α-Flag M2 AK (Spur 1). Zur Expressionskontrolle diente die Fällung des

Ansatzes mit einem α-VP35 AK, der sowohl das volle Länge VP35Flag als auch die

VP35-Deletionsmutante VP3570-329 erkannte (Spur 2). Dieses Ergebnis verstärkte die

Annahme, dass die, durch Computeranalyse identifizierte, Coiled-Coil-Struktur die

Homooligomerisierungsdomäne des MARV VP35 repräsentiert.

46kD

30kD

1 2

αFlag α35

VP35Flag

VP35Flag+VP3570-329

VP3570-329

46kD

30kD

1 2

αFlag α35

VP35Flag

VP35Flag+VP3570-329

VP3570-329

Abbildung 8: Koimmunpräzipitationsanalyse von VP35Flag und der VP35-Deletionsmutante VP3570-329. VP35Flag und die VP35-Deletionsmutante VP3570-329

wurden mit Hilfe des TNT® T7 Quick Coupled Trans-cription/Translation Systems in vitro koexprimiert. Zur Koimmunpräzipitationsanalyse wurden ein α-Flag M2 AK und ein α-VP35 AK verwendet. Die Analyse der Präzipitate erfolgte über SDS-PAGE und Bio-Imager. Die koexprimierten Proteine sind oberhalb und die zur Detektion verwendeten AK unterhalb der Abbildung gezeigt. Rechtsseitig sind die Positionen der unter-suchten Proteine dargestellt.

4 Ergebnisse 57

4.1.3 Charakterisierung der Homooligomerisierungsdomäne des VP35

Um die Rolle der Homooligomerisierung des VP35 im Vermehrungszyklus des MARV

untersuchen zu können, sollte zunächst die potentielle Coiled-Coil-Domäne im Bereich

der Aminosäuren 70 bis 120 näher charakterisiert werden.

4.1.3.1 In silico-Mutationsanalysen des Coiled-Coil-Motivs des VP35

Von Coiled-Coil-Strukturen ist bekannt, dass diese eine wichtige Rolle bei Protein-

Protein-Interaktionen spielen können. Charakteristisch für Coiled-Coil-Strukturen ist

eine sich wiederholende Abfolge von heptameren Motiven (heptad repeats) die an

Position 1 (a) und 4 (d) jeweils hydrophobe Aminosäuren enthalten. Durch die helikale

Anordnung der Coiled-Coil-Strukturen bilden diese hydrophoben Aminosäuren die

Interaktionsfläche innerhalb der gebildeten Oligomere. (Burkhardt et al., 2001). Die

Ergebnisse der Analyse der Aminosäuresequenz des MARV VP35 mit dem Computer-

programm COILS 2.2 (Lupas, 1996; Lupas et al., 1991) sind in Abbildung 9 graphisch

dargestellt.

RTLADLLIPINRQISDIQSTLSEVTTRVHEIERQLHEITPVLKMGRTLEAI70 120

d d da a ada d d da ada

90

A

104

A

VP35

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e

0 50 100 150Aminosäurebereich

L90A

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e


L104A

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e


L90/104A

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e


C

A

D

B

RTLADLLIPINRQISDIQSTLSEVTTRVHEIERQLHEITPVLKMGRTLEAI70 120

d d da a ada d d da ada

90

A

104

A

VP35

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e


L90A

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e


L104A

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e


L90/104A

00,20,40,60,81

Coi

led-

Coil

scor

e


C

A

D

B

4 Ergebnisse 58

Wie bereits beschrieben wurde, konnte für den Bereich der Aminosäuren 70 bis 120

des MARV VP35, dessen Sequenz mit der heptameren Periodizität exemplarisch

gezeigt ist, die Ausbildung einer Coiled-Coil-Struktur vorhergesagt werden (Abb. 9A).

Es wurden verschiedene Aminosäureaustausche gegen Alanin an den Positionen a

und d vorgenommen und mittels Computeranalyse geprüft. Nach Substitution der

Leucine an Position 90 (L90A) oder 104 (L104A) zu Alanin verminderte sich die

Wahrscheinlichkeit zur Anordnung einer Coiled-Coil-Struktur um etwa 50 Prozent (Abb.

9B und 9C). Der Austausch beider Leucine zu Alanin (L90/104A) erwies sich als

besonders kritisch und schien einen starken Einfluss auf die Ausbildung der Coiled-

Coil-Struktur zu haben (Abb. 9D).

4.1.3.2 Interaktionsstudien der VP35-Substitutionsmutanten

Die durch die Computer-gestützte Analyse gewonnen Daten (4.1.3.1) sollten im

Folgenden experimentell verifiziert werden. Mittels ortsgerichteter Mutagenese (3.1.2)

wurden die Aminosäuren Leucin 90 oder/und Leucin 104 durch Alanin ersetzt. Auf der

Grundlage der Konstrukte pTM1-VP35Flag und pTM1-VP35 wurden folgende Plasmid-

paare hergestellt: pTM1-VP35L90AFlag und pTM1-VP35L90A, pTM1-VP35L104AFlag

und pTM1-VP35L104A sowie pTM1-VP35L90/104AFlag und pTM1-VP35L90/104A.

Ausgehend von diesen Konstrukten wurden die VP35-Substitutionsmutanten

zusammen mit deren Flag-markierten Varianten in vitro translatiert und metabolisch mit

[35S]Promix Cell-labelling Mix markiert (3.3.1). Die anschließend durchgeführte

Koimmunpräzipitationsanalyse (3.3.7) ist in Abbildung 10 dargestellt. Die Laufunter-

schiede der VP35-Substitutionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp-VP35 sind

möglicherweise auf eine veränderte Bindung von SDS zurückzuführen. Wie in einigen

Spuren zu erkennen ist, traten neben den erwarteten Proteinen Abbaubanden

verschiedener Größen auf, die möglicherweise aus der Verwendung des TNT® T7

Quick Coupled Transcription/Translation Kits resultieren. Da die Ribosomen in diesem

in vitro System auch interne Translationsstarts erkennen, kommt es zusätzlich zur

Expression kleinerer Proteine. So entspricht das Molekulargewicht der auftretenden

Proteine der Größe, die zu erwarten wäre, wenn ein internes AUG als Startkodon

benutzt wird.

Abbildung 9: Graphische Darstellung der potentiellen Coiled-Coil-Domäne und der Computeranalyse der Aminosäuresequenzen des VP35 und der VP35-Substitutions-mutanten mit dem Programm COILS 2.2. Oben: Aminosäuresequenz des VP35 im Bereich 70 bis 120. Hydrophobe Aminosäuren in der Sequenz des VP35 an den Positionen a und d im Bereich der putativen Coiled-Coil-Domäne wurden unterstrichen und durch Fettdruck hervorgehoben. (A-D) Ergebnis der Coiled-Coil-Analyse. Die Wahrscheinlichkeiten für die Ausbildung einer Coiled-Coil-Struktur sind auf der X-Achse und die dafür entsprechenden Aminosäurebereiche auf der Y-Achse aufgetragen. (A) Analyse der Aminosäuresequenz des Wildtyp-VP35. (B) L90A. (C) L104A. (D) L90/104A.

4 Ergebnisse 59

Das Wildtyp-VP35 sowie die VP35-Substitutionsmutanten L90A und L104A kosedi-

mentierten bei Präzipitation des VP35Flag bzw. des L90AFlag oder L104AFlag mit dem α-

Flag M2 AK (Spur 1, 3 und 5). In den Spuren 2, 4 und 6 ist die Fällung der

entsprechenden Ansätze mit dem α-VP35 AK zu sehen. In Spur 7 ist die Koimmunprä-

zipitationsanalyse der VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag mit dem L90/104A

dargestellt, welches bei Fällung mit dem α-Flag M2 AK nicht mitgerissen wurde. Durch

die Expressionskontrolle konnte gezeigt werden, dass die nicht markierte Variante

L90/104A im Ansatz vorhanden war (Spur 8). Aus diesen Ergebnissen wurde

geschlossen, dass die Interaktion des MARV VP35 mit sich selbst über eine Coiled-

Coil-Struktur innerhalb des N-Terminus des Proteins vermittelt wird. Die Substitution

beider Leucine an Position 90 und 104 führte zu einer Destabilisierung dieser Struktur

und verhinderte somit die Homooligomerisierung des Proteins (Möller et al., 2005).

4.1.3.3 Übertragung der Coiled-Coil-Domäne des Marburg-Virus VP35 auf ein monomeres Reporterprotein

Es war nun von Interesse, ob die identifizierte Coiled-Coil-Domäne des MARV VP35

ausreicht, um dessen Homooligomerisierung zu vermitteln. Hierzu wurden verschieden

lange N-terminale Fragmente des MARV VP35, die die Coiled-Coil-Domäne

beinhalteten, an ein monomeres Reporterprotein (rep) bzw. an eine Flag-markierte

Variante (repFlag) fusioniert. Mittels Koimmunpräzipitation wurde untersucht, ob die

VP35-Fragmente die Interaktion des Reporterproteins vermitteln konnten. Als

Reporterprotein (rep) wurde eine Mutante des EBOV VP30 (VP30L100/102A) gewählt, die

VP35Flag+VP35

L90AFlag+L90A

L104AFlag+L104A

L90/104AFlag+L90/104A

α35 α35αFlag αFlag α35αFlag αFlag α3530kD

46kD1 2 3 4 5 6 7 8

VP35Flagbzw. VP35mut Flag

VP35 bzw.VP35mut

VP35Flag+VP35

L90AFlag+L90A

L104AFlag+L104A

L90/104AFlag+L90/104A

α35 α35αFlag αFlag α35αFlag αFlag α3530kD

46kD1 2 3 4 5 6 7 8

VP35Flagbzw. VP35mut Flag

VP35 bzw.VP35mut

Abbildung 10: Koimmunpräzipitationsanalyse von VP35 und den VP35-Substitutions-mutanten. Das VP35Flag und das VP35 sowie die VP35-Substitutionsmutanten L90AFlag und L90A, L104AFlag und L104A bzw. L90/104AFlag und L90/104A wurden zusammen mit dem TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation Kit synthetisiert. Anschließend wurden die Translationsansätze mit dem α- Flag M2 AK oder dem α-VP35 AK gefällt, über SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Bio-Imager ausgewertet. Die koexprimierten Proteine sind oberhalb und die zur Detektion verwendeten AK unterhalb der Abbildung gezeigt. Rechtsseitig sind die Positionen der untersuchten Proteine dargestellt. VP35mut steht zusammenfassend für die jeweiligen VP35-Substitutionsmutanten. Die mit ( ) gekennzeichneten Proteine resultieren aus der Verwendung des in vitro Expressionsystems.

4 Ergebnisse 60

nicht in der Lage war, Homooligomere auszubilden (Hartlieb et al., 2003). In Abbildung

11A sind die Fusionsmutanten, die ebenfalls in einer Flag-markierten Variante

hergestellt wurden, dargestellt. Die Konstrukte wurden in vitro translatiert und mittels

Koimmunpräzipitation (3.3.7, 3.3.8) analysiert. Durch die Fusion der N-terminalen

Aminosäuren 1 bis 150 des MARV VP35 konnte die Interaktion des monomeren

Reporterproteins vermittelt werden. Zur weiteren Charakterisierung wurden zwei

Fusionsmutanten, die über die Aminosäuren 70 bis 150 bzw. 70 bis 120 des MARV

VP35 verfügten, eingesetzt. Beide waren in der Lage, mit der entsprechenden Flag-

markierten Version nach Koexpression zu interagieren. Zur weiteren Eingrenzung

wurde die Coiled-Coil-Domäne gekürzt und eine Fusionsmutante, die die Aminosäuren

70 bis 110 (70-110-rep) enthielt, konstruiert und in vitro translatiert (3.3.7). Die im

Anschluss durchgeführte Koimmunpräzipitationsanalyse (3.3.8) ist in Abbildung 11B

dargestellt. In Spur 1 ist zur Kontrolle die Präzipitation des monomeren Reporter-

proteins repFlag mit dem α-Flag M2 AK gezeigt, wobei die nicht markierte Form (rep)

nicht mitgefällt werden konnte. Dass beide Varianten im Ansatz vorhanden waren,

wurde durch die Fällung mit einem α-VP30 Antiserum bestätigt, welches beide

Proteine spezifisch erkannte (Spur 2). Im Gegensatz dazu konnte durch das Anhängen

der Coiled-Coil-Domäne des MARV VP35 die Interaktion des Reporterproteins

vermittelt werden (Spur 3 und 4).

MARV VP35 EBOV VP30(L100/102A)

1-150-rep

70-150-rep

70-120-rep

70-110-rep

70-110mut-rep

+

+

+

+

70-110-repFlag70-110-rep

repFlag+rep

70-110mut-repFlag+70-110mut-rep

70-110-repFlag bzw. 70-110mut-repFlag

repFlag 70-110-rep bzw.70-110mut-rep

rep

30kD

46kD1 2 3 4 5 6

α30 α30αFlag αFlag α30αFlag

B

AMARV VP35 EBOV VP30(L100/102A)

1-150-rep

70-150-rep

70-120-rep

70-110-rep

70-110mut-rep

+

+

+

+

70-110-repFlag70-110-rep

repFlag+rep

70-110mut-repFlag+70-110mut-rep

70-110-repFlag bzw. 70-110mut-repFlag

repFlag 70-110-rep bzw.70-110mut-rep

rep

30kD

46kD1 2 3 4 5 6

α30 α30αFlag αFlag α30αFlag

B

A

4 Ergebnisse 61

Diese Daten zeigen, dass die Aminosäuren 70 bis 110 ausreichend waren, um die

Interaktion des Reporterproteins zu vermitteln (Möller et al., 2005). Unterstützt wurde

diese Beobachtung durch die Untersuchung einer Fusionsmutante 70-110mut-rep, in

der die für die Coiled-Coil-Struktur kritischen Leucine 90 und 104 zu Alanin

ausgetauscht wurden. Nach Koexpression mit dem Flag-markierten Interaktionspartner

(70-110mut-repFlag) und Fällung mit dem α-Flag M2 AK konnte keine Interaktion

nachgewiesen werden (Spur 5 und 6).

Abb. 11: Übertragung der MARV VP35 Coiled-Coil-Domäne auf ein monomeres Reporterprotein. (A) Schematische Darstellung der mittels Koimmunpräzipitationsanalyse untersuchten Fusionsmutanten und deren Fähigkeit zur Interaktion mit den entsprechenden Flag-markierten Interaktionspartnern. Für die mit (+) gekennzeichneten Fusionsmutanten konnte eine Interaktion nachgewiesen werden. Die mit (-)gekennzeichneten Fusionsmutanten waren nicht in der Lage, zu interagieren. (B) Die Fusionsmutanten 70-110-rep und 70-110mut-rep sowie das unveränderte Reporterprotein wurden zusammen mit ihren Flag-markierten Versionen in vitro synthetisiert und mittels Koimmunpräzipitationsanalyse untersucht. Die Präzipitate wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Bio-Imager ausgewertet. Die koexprimierten Proteine sind oberhalb und die zum Nachweis verwendeten AK unterhalb der Abbildung gezeigt. Linksseitig sind die Positionen des mitgeführten Größenmarkers sowie das Flag- bzw. das nicht markierte Reporterprotein angezeigt. Auf der rechten Seite sind die Positionen der untersuchten Fusionsmutanten dargestellt.

4 Ergebnisse 62

4.2 Funktionelle Charakterisierung der Homooligomerisierung des Marburg-Virus VP35

Im weiteren Verlauf sollte geklärt werden, ob die Homooligomerisierung des MARV

VP35 einen Einfluss auf die Replikation und Transkription der viralen RNA hat.

4.2.1 Funktionelle Untersuchungen der VP35-Substitutionsmutanten

Um diese Fragestellung zu untersuchen, sollten die unter 4.1.3.2 hergestellten volle

Länge VP35-Substitutionsmutanten in einem artifiziellen Transkriptions- und Replika-

tionssystem (Mühlberger et al., 1998; 1999) getestet werden. Dieses reverse Genetik-

System basiert auf der simultanen T7-gestützten Expression der Nukleokapsidproteine

(NP, VP35 und L) und eines MARV-spezifischen Minigenoms. Die T7-RNA-

Polymerase wird durch die Verwendung von konstitutiv exprimierenden Huh-T7-Zellen

sowie durch die Kotransfektion eines entsprechenden Plasmides (pCAGGS-T7)

bereitgestellt (Enterlein, 2005). Das künstliche Minigenom fungiert als Matrize für den

Replikations- bzw. Transkriptionskomplex und besteht aus einem Reportergen

(Chloramphenicol-Acetyltransferase; CAT), welches von den cis-aktiven Signalen des

MARV-Genoms flankiert ist. Die Transkription des Minigenoms erfolgt durch den sich

konstituierenden Nukleokapsidkomplex. Die virale mRNA wird vom zellulären

Proteinsyntheseapparat translatiert und führt zur Expression des Reporterproteins,

dessen Aktivität mit Hilfe eines CAT-Assays detektiert wird (3.3.3). Im Gegensatz zu

transkribierter RNA wird replizierte RNA während der Synthese durch das

Nukleoprotein NP verpackt und ist somit resistent gegenüber Nukleasen. Der

Nachweis neu synthetisierter und enkapsidierter RNA erfolgt über einen Nuklease-

Verdau mit anschließender Northern Blot-Analyse (3.3.4; Mühlberger et al, 1998).

4.2.1.1 Titration der VP35-Substitutionsmutanten

Um für die funktionelle Analyse äquivalente Bedingungen zu gewährleisten, sollten die

zu transfizierenden Plasmid-DNA-Mengen der VP35-Substitutionsmutanten zunächst

in einem Vorexperiment titriert werden. Huh-T7-Zellen wurden mit den Plasmiden, die

für die T7-RNA-Polymerase, das MARV-spezifische Minigenom und die Nukleo-

kapsidproteine NP und L kodieren, transfiziert (3.2.3). Für die Synthese des Wildtyp-

VP35 sowie der VP35-Substitutionsmutanten L90A und L104A wurden 0,25; 0,5; 0,75

und 1 µg Plasmid-DNA transfiziert. Auf Grund einer schlechteren Expression wurden

für die VP35-Substitutionsmutante VP35L90/104A Plasmid-DNA-Mengen von 0,5; 1;

1,5 und 2 µg eingesetzt (Abb. 13). 40 Stunden nach Transfektion wurden die Zelllysate

für eine CAT-Aktivitätsbestimmung verwendet (3.3.3), und die Überprüfung der

4 Ergebnisse 63

Expression des VP35 bzw. der VP35-Substitutionsmutanten erfolgte mittels Western

Blot-Analyse der Zelllysate (3.3.5).

Die Ergebnisse der Titration der jeweiligen VP35-Konstrukte sind in Abbildung 12E

graphisch dargestellt. Im Vergleich zum Wildtyp-VP35 (Abb. 12A) zeigten die VP35-

Substitutionsmutanten L90A (Abb. 12B) und L104A (Abb. 12C) eine leichte Reduktion

bezüglich der CAT-Aktivität, wogegen bei Einsatz der VP35-Substitutionsmutante

L90/104 keine Transkriptionsaktivität festgestellt werden konnte (Abb. 13D).

0

20

40

60

80

100

120

0,250,5 0,7

51 0,5 1 1,5 2 (µg DNA)

VP35 L90A L104A L90/104A0,2

50,5 0,7

51 0,2

50,5 0,7

51

E

L104A

L104A

0,25 0,5 0,75 1 (µg DNA)

C

ANeg

(-VP35)Mock VP35

VP35

0,25 0,5 0,75 1 (µg DNA)

L90/104A

0,5 1 1,5 2 (µg DNA)

L90/104A

D

L90A

BL90A

0,25 0,5 0,75 1 (µg DNA)

[%]

CAT-

Aktiv

ität

0

20

40

60

80

100

120

0,250,5 0,7

51 0,5 1 1,5 2 (µg DNA)

VP35 L90A L104A L90/104A0,2

50,5 0,7

51 0,2

50,5 0,7

51

E

L104A

L104A

0,25 0,5 0,75 1 (µg DNA)

C

ANeg

(-VP35)Mock VP35

VP35

0,25 0,5 0,75 1 (µg DNA)

L90/104A

0,5 1 1,5 2 (µg DNA)

L90/104A

D

L90A

BL90A

0,25 0,5 0,75 1 (µg DNA)

[%]

CAT-

Aktiv

ität

4 Ergebnisse 64

4.2.1.2 Analyse der Replikations- und Transkriptionsaktivität der VP35-Substitutionsmutanten

Im Folgenden sollten die unter 4.2.1.1 beschriebenen VP35-Substitutionsmutanten auf

ihre Fähigkeit, die virale Replikation zu unterstützen, analysiert werden. Subkonfluente

Huh-T7-Zellen wurden mit den MARV-spezifischen Expressionsplasmiden und dem

Minigenomvektor transfiziert (3.2.3). Zur Expression des Wildtyp-VP35 sowie der

VP35-Substitutionsmutanten L90A und L104A kamen je 0,25 µg und für die VP35-

Substitutionsmutante L90/104A 1,5 µg Plasmid-DNA zum Einsatz. 40 Stunden nach

Transfektion wurde das Zelllysat eines Ansatzes für die Durchführung des CAT-Assays

(3.3.3) sowie für eine Western Blot-Analyse (3.3.5) verwendet. Der zweite Ansatz

diente zur Untersuchung replizierter RNA mittels Northern Blot (3.3.4). Die Ergebnisse

der gewonnenen Daten sind in Abbildung 13 dargestellt. Analog zu den Beo-

bachtungen unter 4.2.1.1 zeigten die VP35-Substitutionsmutanten L90A oder L104A

einen leichten Rückgang in der Transkriptionsaktivität. Verglichen mit dem Wildtyp-

VP35 konnte für die VP35-Substitutionsmutante L90/104A keine CAT-Aktivität

nachgewiesen werden (Abb. 13A). Bei Analyse der replizierten RNA war ein ähnliches

Muster erkennbar (Abb. 13B). Während die VP35-Substitutionsmutanten L90A und

L104A die Replikationseffizienz leicht hemmten, konnte im Falle der VP35-

Substitutionsmutante L90/104A keine replizierte RNA nachgewiesen werden (Abb.

13B). Die Expression des Wildtyp-VP35 sowie der VP35-Substitutionsmutanten wurde

mittels Western Blot-Analyse (3.3.5) überprüft. Ferner konnte in allen Ansätzen die

gleiche Menge an NP detektiert werden (Abb. 13C). Die fehlende Transkriptions- und

Replikationsaktivität bei Einsatz der VP35-Substitutionsmutante L90/104A, die nicht

mehr in der Lage war, mit sich selbst zu interagieren, deutet darauf hin, dass die

Homooligomerisierung essentiell für die Funktion des MARV VP35 während der viralen

RNA-Synthese ist (Möller et al., 2005).

Abbildung 12: Titration von VP35 und der VP35-Substitutionsmutanten in dem MARV-spezifischen Minigenomsystem. Huh-T7-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die für das MARV-spezifische Minigenom, NP und L kodieren. Außerdem wurden verschiedene Mengen an Plasmiden kotransfiziert, die entweder für das Wildtyp-VP35 oder für eine der VP35-Substitutionsmutanten kodieren. 40 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und ein CAT-Reportergenassay durchgeführt. Die Proben wurden mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt und mit dem Bio-Imager ausgewertet. Die Western Blot-Analyse zur Kontrolle der Expression von VP35 sowie der VP35-Substitutionsmutanten wurde mit einem α-VP35 AK und einem sekundären POD-gekoppelten α-Meerschweinchen AK durchgeführt. Bei den mit ( ) gekennzeichneten Banden handelt es sich um unspezifische zelluläre Proteine. (A) Wildtyp-VP35. (B) L90A. (C) L104A. (D) L90/104A. (E) Graphische Zusammenfassung der Titrationen von VP35, L90A, L104A und L90/104A.

4 Ergebnisse 65

[%]

CAT-

Aktiv

ität

0

20

40

60

80100

120

1 2 3 4 5 6

VP35(-L)

L90A L104AVP35 L90/104A

Mock

VP35 bzw. VP35mut

NP

1 2 3 4 5 6

VP35(-L)

L90A L104AVP35 L90/104A

Mock

C

1 2 3 4 5 6

VP35(-L)

L90A L104AVP35 L90/104A

Mock0

20

40

60

80100

120

[%]

Repl

ikat

ions

aktiv

ität

B

A

[%]

CAT-

Aktiv

ität

0

20

40

60

80100

120

1 2 3 4 5 6

VP35(-L)

L90A L104AVP35 L90/104A

Mock

VP35 bzw. VP35mut

NP

1 2 3 4 5 6

VP35(-L)

L90A L104AVP35 L90/104A

Mock

C

1 2 3 4 5 6

VP35(-L)

L90A L104AVP35 L90/104A

Mock0

20

40

60

80100

120

[%]

Repl

ikat

ions

aktiv

ität

B

A

Abbildung 13: Analyse der Transkriptions- und Replikationsaktivität des VP35 sowie der VP35-Substitutionsmutanten. (A) CAT-Assay: Huh-T7-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die für das MARV-spezifische Minigenom, NP, L, VP35 oder die VP35-Substitutionsmutanten kodieren. Im Anschluss an die Transfektion wurden die Zellen lysiert und ein CAT-Reportergenassay durchgeführt. Die Proben wurden mittels Dünn-schichtchromatographie aufgetrennt und mit dem Bio-Imager ausgewertet. Die CAT-Aktivität wurde mit der Software TINA 2.0 quantifiziert und graphisch dargestellt. Gezeigt sind die Werte die mit der VP35-Substitutionsmutanten im Vergleich zum VP35.

4 Ergebnisse 66

4.3 Interaktion der Marburg-Virus Nukleokapsidproteine VP35 und L

Der Proteinkomplex aus den Nukleokapsidproteinen VP35 und L repräsentiert die

virale RNA-abhängige RNA-Polymerase des MARV. Das L-Protein stellt den

katalytischen Teil dar, und das VP35 fungiert als Kofaktor, wobei dessen Funktion

unter anderem darin besteht, das L-Protein an das Nukleokapsid heran zu führen

(Mühlberger et al., 1992; 1998).

4.3.1 Lokalisation der L-Interaktionsdomäne auf dem VP35

Es konnte bereits gezeigt werden, dass sich die Bindungsdomäne für das VP35

innerhalb der ersten 530 N-terminalen Aminosäuren des L-Proteins befindet (Becker et

al., 1998). Zur Identifikation der Bindungsstelle des L-Proteins auf dem VP35 wurde

daher anstelle des volle Länge L-Proteins eine C-terminal verkürzte Deletionsmutante

verwendet, die für die 530 N-terminalen Aminosäuren des L-Proteins kodiert und mit

einem Flag-Epitop (LFlag) versehen ist. Mit Hilfe von Koimmunpräzipitationsanalysen

der in Abbildung 14 dargestellten VP35-Deletionsmutanten konnte, durch eigene

Vorarbeiten, die L-Bindungsstelle auf den C-Terminus des VP35 eingegrenzt werden

(Möller, 2002).

VP35

VP351-278

VP351-246

VP351-122

+

+

+

VP35220-329

VP35120-220

VP35∆121-219

VP35∆71-119

VP35

VP351-278

VP351-246

VP351-122

+

+

+

VP35220-329

VP35120-220

VP35∆121-219

VP35∆71-119VP35∆71-119

(B) Northern Blot: Nach Transfektion von Huh-T7-Zellen, wie unter (A) beschrieben, wurden die Zelllysate einem Nuklease-Verdau unterzogen und anschließend mittels Northern Blot analysiert. Die Menge an replizierter RNA wurde mit Hilfe der Software TINA 2.0 bestimmt und graphisch dargestellt. (C) Western Blot: Das NP wurde durch einen monoklonalen α-NP AK und einen sekundären POD-gekoppelten α-Maus AK detektiert. Die Expression des Wildtyp-VP35 sowie der VP35-Substitutionsmutanten wurde durch einen α-VP35 AK und einen sekundären POD-gekoppelten α-Meerschweinchen AK nachgewiesen.

Abbildung 14: Schematische Darstellung der Interaktion von LFlag und VP35 und der untersuchten VP35-Deletionsmutanten. LFlag wurde zusammen mit den entsprechenden VP35-Deletionsmutanten in vitro translatiert und anschließend mittels Koimmunpräzipitation analysiert. Für die mit (+) gekennzeichneten VP35-Deletionsmutanten konnte eine Interaktion mit dem LFlag detektiert werden. Die mit (-) gekennzeichneten VP35-Deletionsmutanten waren nicht in der Lage, mit dem LFlag zu interagieren.

4 Ergebnisse 67

Ferner schien die Homooligomerisierung des MARV VP35 für die Bindung des L-

Proteins erforderlich zu sein (Möller et al., 2005).

4.3.1.1 Einfluss des N-Terminus des VP35 auf die Interaktion mit dem L-Protein

Die bisherige Untersuchung der VP35-Deletionsmutanten (4.3.1) lieferte keine

Hinweise inwieweit der N-Terminus des MARV VP35 einen Einfluss auf die Interaktion

mit dem L-Protein hat. Zur Klärung dieser Fragestellung wurde die VP35-Deletions-

mutante VP3570-329, die ein intaktes Coiled-Coil-Motiv besitzt, zusammen mit dem LFlag

in vitro koexprimiert (3.3.7) und mittels Koimmunpräzipitationsanalyse untersucht

(3.3.8; Abb. 15).

Die VP35-Deletionsmutante VP3570-329 kosedimentierte bei Präzipitation des LFlag mit

dem α-Flag M2 AK (Spur 1). In umgekehrter Weise konnte das LFlag durch die Fällung

der VP35-Deletionsmutante VP3570-329 mit einem α-VP35 AK kopräzipitiert werden

(Spur 2). Zur Kontrolle wurde zusätzlich mit dem α-Flag M2 AK und dem α-VP35 AK

gefällt (Spur 3). Dieses Ergebnis legt nahe, dass der N-Terminus außerhalb der Coiled-

Coil-Domäne des MARV VP35 keinen Einfluss auf die Interaktion mit dem L-Protein

hat (Möller et al., 2005).

4.3.2 Einfluss der Homooligomerisierung des VP35 auf die Komplexbildung mit dem L-Protein

Im weiteren Verlauf sollte durch die Verwendung der volle Länge VP35-Substitutions-

mutanten untersucht werden, ob die Homooligomerisierung des MARV VP35 für die

Interaktion mit dem L-Protein notwendig ist. Die nicht markierten VP35-Substitutions-

mutanten (L90A, L104A bzw. L90/104A) wurden zusammen mit dem LFlag in vitro

translatiert und radioaktiv markiert (3.3.7). Die im Anschluss durchgeführte Koimmun-

präzipitationsanalyse (3.3.8) ist in Abbildung 16 dargestellt.

αFlag α35

LFlag

VP3570-329

1 2

LFlag + VP3570-329

66kD

46kD

30kD

3

αFlag+α35

αFlag α35

LFlag

VP3570-329

1 2

LFlag + VP3570-329

66kD

46kD

30kD

66kD

46kD

30kD

3

αFlag+α35

Abbildung 15: Koimmunpräzipitations-analyse von LFlag und der VP35-Deletions-mutante VP3570-329. LFlag sowie die VP35-Deletionsmutante VP3570-329 wurden mit Hilfe des TNT® T7 Quick Coupled Transcription/ Translation Systems in vitro koexprimiert. Zur Koimmunpräzipitationsanalyse wurden ein α-Flag M2 AK und/oder ein α-VP35 AK ver-wendet. Die Analyse der Präzipitate erfolgte über SDS-PAGE und Bio-Imager. Die koexprimierten Proteine sind oberhalb und die zur Detektion verwendeten AK unterhalb der Abbildung gezeigt. Rechtsseitig sind die Positionen der untersuchten Proteine dargestellt.

4 Ergebnisse 68

Die Spuren 1 bis 3 zeigen die Koimmunpräzipitationsanalyse des LFlag mit dem Wildtyp-

VP35. Nach Fällung mit dem α-Flag M2 AK wurde das VP35 mit dem LFlag mitgerissen

(Spur 1). Wie in Spur 2 zu sehen ist, war es ebenfalls möglich, die Interaktion zwischen

dem VP35 und dem LFlag über die Verwendung des α-VP35 AK nachzuweisen. Zur

Kontrolle der Expression wurde mit dem α-Flag M2 AK und dem α-VP35 AK gefällt

(Spur 3). In den Spuren 4 und 7 ist gezeigt, dass die VP35-Substitutionsmutanen L90A

bzw. L104A ebenfalls mit Hilfe des α-Flag M2 AK kopräzipitiert wurden. Ferner konnte

das LFlag auf umgekehrte Weise durch Präzipitation der VP35-Substitutionsmutanten

L90A bzw. L104A mit dem α-VP35 AK mitgerissen werden (Spur 5 und 8). Im

Gegensatz dazu konnte zwischen dem LFlag und der VP35-Substitutionsmutante

L90/104A, die keine Homooligomere ausbildet, keine Interaktion nachgewiesen werden

(Spuren 10 und 11). Die Expression beider Proteine wurde durch die Präzipitation mit

dem α-Flag M2 AK und dem α-VP35 AK überprüft (Spur 12). Diese Untersuchungen

weisen darauf hin, dass die Homooligomerisierung des MARV VP35 die

Voraussetzung für die Interaktion mit dem L-Protein bildet (Möller et al., 2005).

LFlag +

VP35 L90A L104A L90/104A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12LFlag

VP35 bzw.VP35mut

α35αFlag αFlag+α35




46kD

LFlag +

VP35 L90A L104A L90/104A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12LFlag

VP35 bzw.VP35mut





46kD

VP35 L90A L104A L90/104A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12LFlag

VP35 bzw.VP35mut





46kD









46kD46kD46kD

Abbildung 16: Koimmunpräzipitationsanalyse von LFlag mit VP35 bzw. der VP35-Substitutionsmutanten. Das LFlag und das VP35 sowie die VP35-Substitutions-mutanten L90A, L104A bzw. L90/104A wurden zusammen mit dem TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation Kit synthetisiert. Anschließend erfolgte die Fällung der Translationsansätze mit dem α-Flag M2 AK oder/und dem α-VP35 AK. Die Präzipitate wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Bio-Imager analysiert. Die koexpri-mierten Proteine sind oberhalb und die zur Detektion verwendeten AK unterhalb der Abbildung gezeigt. Rechtsseitig sind die Positionen der untersuchten Proteine dargestellt. VP35mut steht zusammenfassend für die jeweiligen VP35-Substitutions-mutanten. Die mit ( ) gekennzeichneten Proteine resultieren aus der Verwendung des in vitro Expressionsystems.

4 Ergebnisse 69

4.4 Hemmung der Marburg-Virus-Transkription durch gemischte VP35-Oligomere

Aus den bisherigen Untersuchungen ergab sich die folgende Hypothese: Zum einen ist

die Homooligomerisierung des MARV VP35 für die Interaktion mit dem L-Protein und

somit für die Funktionalität des Polymerasekomplexes essentiell. Andererseits befindet

sich die eigentliche L-Bindungsstelle auf dem C-Terminus des MARV VP35. Um diese

Ergebnisse zu bestätigen, wurde der in Abbildung 17A dargestellte experimentelle

Ansatz gewählt.

aktiv inaktiv aktiv

N

C

VP35 wt +122mut

VP35 wt VP35 wt + 122

N

C C

+

N

B

N1

C70 120

329

70 120

1 122N C

STLSEVTTRVHEIERQLHE VP35 wt bzw. 122

STASEVTTRVHEIERQAHE 122mut

70 120

1 122N C

A

aktiv inaktiv aktiv

N

C

VP35 wt +122mut

VP35 wt VP35 wt + 122

N

C C

+

N

B

N1

C70 120

329

70 120

1 122N C

STLSEVTTRVHEIERQLHE VP35 wt bzw. 122

STASEVTTRVHEIERQAHE 122mut

70 120

1 122N C

A

4 Ergebnisse 70

Zur Herstellung gemischter VP35-Oligomere sollte neben dem Wildtyp-VP35 eine

Deletionsmutante VP351-122 eingesetzt werden. Diese kodiert für den N-Terminus des

Proteins, der die Homooligomerisierungsdomäne beinhaltet und somit in der Lage ist,

mit dem Wildtyp-VP35 zu interagieren. Sollte die Homooligomerisierung des MARV

VP35 und demzufolge eine entsprechende Anzahl intakter C-Termini entscheidend für

die Interaktion mit dem L-Protein sein, müsste ein gemischtes VP35-Oligomer, welches

keine korrekt oligomerisierten C-Termini enthält, in der Komplexbildung mit dem L-

Protein eingeschränkt sein. Darauf aufbauend müsste die Rekrutierung des L-Proteins

an die enkapsidierte RNA gehemmt und die Aktivität der Polymerase herunter reguliert

sein. Zur Kontrolle sollte eine VP35-Deletionsmutante VP351-122mut dienen, die auf

Grund der Substitution der Leucine 90 und 104 zu Alanin, nicht mehr in der Lage ist, zu

oligomerisieren. Die Ausbildung gemischter VP35-Oligomere wäre in diesem Falle

nicht möglich, und die Transkriptionsaktivierung im Minigenomsystem sollte

vergleichbar mit dem Wildtyp-VP35 sein.

Zur Überprüfung dieser Theorie wurden subkonfluente Huh-T7-Zellen mit den

Plasmiden, die für die T7-RNA-Polymerase, das MARV-spezifische Minigenom sowie

die Nukleokapsidproteine NP, VP35 und L kodieren, transfiziert (3.2.3). Des Weiteren

wurden die Plasmide, die für die VP35-Deletionsmutanten VP351-122 bzw. VP351-122mut

kodieren in steigenden Konzentrationen kotransfiziert. 40 Stunden nach Transfektion

erfolgte die Lyse der transfizierten Huh-T7-Zellen (3.2.3) und die Durchführung einer

CAT-Aktivitätsbestimmung (3.3.3). Die Expression der Nukleokapsidproteine wurde

mittels Western Blot-Analyse der Zelllysate überprüft (3.3.5). In Spur 3 der Abbildung

18A ist die Reportergenanalyse der Probe dargestellt, die den Wildtyp-VP35 exprimiert.

Im Vergleich dazu war bei Austausch des Wildtyp-VP35 durch die VP35-Substitutions-

mutanten VP351-122 (Spur 4) bzw. VP351-122mut (Spur 5) keine CAT-Aktivität messbar.

Die Spuren 6 bis 8 zeigen den Einfluss von steigenden Konzentrationen der VP35-

Deletionsmutante VP351-122 auf die Reportergenaktivität. Wie aus der quantitativen

Darstellung (Abb. 18B) ersichtlich ist, nahm die Transkriptionsaktivität in Gegenwart

der höchsten Menge der VP35-Deletionsmutante VP351-122 auf fünf Prozent ab. Die

funktionell inaktive, aber zur Oligomerisierung fähige VP35-Deletionsmutane VP351-122

verursachte somit einen dominant-negativen Effekt. Hingegen blieb die Transkriptions-

aktivität durch Zugabe der VP35-Deletionsmutante VP351-122mut (Abb. 18A, Spur 9-11)

vergleichbar mit dem Wildtyp-Level. Western Blot-Analysen der Zelllysate bestätigten,

dass die Menge an NP und Wildtyp-VP35 in allen Ansätzen konstant war (Abb. 18C).

Abbildung 17: Schematische Darstellung des experimentellen Ansatzes zur Hemmung der MARV-Transkription durch gemischte VP35-Oligomere. (A) Darstellung des Wildtyp-VP35 und der eingesetzten VP35-Deletionsmutanten VP351-122 sowie VP351-122mut. (B) Experimenteller Ansatz bezüglich der Funktionalität der ausgebildeten gemischten VP35-Oligomere.

4 Ergebnisse 71

Entsprechend der steigenden Konzentrationen an Plasmid-DNA zur Expression der

VP35-Deletionsmutanten VP351-122 und VP351-122mut konnte eine zunehmende Menge

an beiden Mutanten nachgewiesen werden. Diese Beobachtungen bestätigen die

Annahme, dass die Homooligomerisierung des MARV des VP35 essentiell für seine

Funktion im MARV-Polymerasekomplex ist (Möller et al., 2005).

[%]

CAT-

Aktiv

ität

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120

VP35 +

VP35VP351-122 VP351-122mut

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Neg

(–L)

Pos

(VP

35)

Moc

k

VP3

5 1-1

22

VP35

1-12

2mut

VP351-122

VP35 +

VP351-122mut

C

B

A

1 2 3 4 5 6

NP

VP35

VP351-122 VP351-122mut

VP35 +

VP35122/122mut

[%]

CAT-

Aktiv

ität

1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

120

VP35 +

VP35VP351-122 VP351-122mut

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Neg

(–L)

Pos

(VP

35)

Moc

k

VP3

5 1-1

22

VP35

1-12

2mut

VP351-122

VP35 +

VP351-122mut

C

B

A

1 2 3 4 5 6

NP

VP35

VP351-122 VP351-122mut

VP35 +

VP35122/122mut

4 Ergebnisse 72

4.5 Interaktion der Marburg-Virus Nukleokapsidproteine VP35 und NP

Eine zentrale Rolle bei den Interaktionen der Nukleokapsidproteine spielt das mit sich

selbst interagierende NP, das Hauptnukleokapsidprotein, welches bei Einzelexpression

in der Lage ist, Nukleokapsid-ähnliche helikale Strukturen auszubilden (Kolesnikova et

al., 2000, Mavrakis et al., 2002). Es wird davon ausgegangen, dass die Bildung dieser

helikalen Strukturen den ersten Schritt im Zusammenbau des Nukleokapsidkomplexes

darstellt. Da das VP35 an das NP bindet (Becker et al., 1998) und wesentlich an der

Bildung des Nukleokapsidkomplexes und somit an der Morphogenese neuer Viren

beteiligt ist, war es von Interesse, diese Interaktion näher zu charakterisieren.

4.5.1 Einfluss der Homooligomerisierung des VP35 auf die Interaktion mit dem NP

Die Homooligomerisierung des MARV VP35 ist essentiell für die Interaktion mit dem L-

Protein und somit für die Replikation und Transkription der viralen RNA (Möller et al.,

2005). Darauf aufbauend sollte untersucht werden, ob die Homooligomerisierung des

MARV VP35 für die Komplexbildung mit dem NP von Bedeutung ist.

4.5.1.1 Immunfluoreszenzanalyse der Flag-markierten VP35-Substitutions- mutanten nach Einzel- und Koexpression mit dem NP

Im Folgenden sollte die intrazelluläre Verteilung der mit einem Flag-Epitop versehenen

VP35-Substitutionsmutanten nach Einzelexpression sowie nach Koexpression mit dem

NP durch eine Immunfluoreszenzanalyse betrachtet werden. Für die Einzelexpression

wurden subkonfluente Huh7-Zellen mit den Plasmiden pTM1-NP, pTM1-VP35Flag,

pTM1-VP35L90AFlag, pTM1-VP35L104AFlag sowie pTM1-VP35L90/104AFlag transfiziert

(3.2.2). Für die Interaktionsstudien wurden diese Plasmide gemeinsam mit dem für das

NP kodierende Plasmid pTM1-NP transfiziert. Die T7-RNA-Polymerase wurde durch

Kotransfektion des Konstruktes pCAGGS-T7 bereitgestellt. 12 Stunden nach Trans-

Abbildung 18: Analyse der Hemmung der MARV-spezifischen Transkriptionsaktivität durch Ausbildung gemischter VP35-Oligomere. (A) CAT-Assay: Huh-T7-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die für das MARV-spezifische Minigenom, NP, L, VP35 oder die VP35-Deletionsmutanten VP351-122 oder VP351-122mut kodieren. Des Weiteren wurden neben gleich bleibenden Mengen an Wildtyp-VP35 die VP35-Deletionsmutanten VP351-122 oder VP351-122mut

in steigenden Konzentrationen kotransfiziert. Im Anschluss an die Transfektion erfolgte die Lyse der Zellen und die Durchführung des CAT-Reportergenassay. Die Proben wurden mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt und mit dem Bio-Imager ausgewertet. (B) Die CAT-Aktivität wurde mit der Software TINA 2.0 quantifiziert und graphisch dargestellt (% der durch das VP35 unterstützten Transkriptionsaktivität). (C) Western Blot: Die Detektion des NP erfolgte mit einem monoklonalen α-NP AK und einem sekundären POD-gekoppelten α-Maus AK. Die Expression des Wildtyp-VP35 sowie der VP35-Deletionsmutanten wurde durch einen α-VP35 AK und einen sekundären POD-gekoppelten α-Meerschweinchen AK nachgewiesen.

4 Ergebnisse 73

fektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit den entsprechenden Anti-

körpern gefärbt (3.3.6). In Abbildung 19 ist die Darstellung des NP mit einem

monoklonalen α-NP AK und einem FITC-gekoppelten α-Maus AK gezeigt. Das NP

besitzt die Fähigkeit zur Selbstaggregation, was intrazellulär zur Ausbildung von

typischen Einschlusskörperchen führte.

In Abbildung 20 ist die Expression des VP35Flag sowie der Flag-markierten VP35-

Substitutionsmutanten nach Einzelexpression dargestellt. Die Anfärbung erfolgte mit

Hilfe eines gegen das Flag-Epitop gerichteten polyklonalen α-Flag-AK und eines

Rhodamin-gekoppelten α-Kaninchen AK. Da für alle folgenden Immunfluoreszenz-

analysen die gleichen Antikörper zum Einsatz kamen, ist die Behandlung der Mock-

Zellen in der Abbildung 20 exemplarisch unter E1 und E2 dargestellt. Im Gegensatz zur

Verteilung des NP, zeigten das VP35Flag (A1) sowie die VP35-Substitutionsmutanten

(B1-D1) ein homogenes Erscheinungsbild. Zur Analyse der koexprimierten Proteine

wurden die Huh7-Zellen gleichzeitig mit einem monoklonalen α-NP AK und einem

polyklonalen α-Flag AK behandelt. Als sekundäre Antikörper wurden dementsprechend

ein FITC-gekoppelter α-Maus und ein Rhodamin-gekoppelter α-Kaninchen AK

verwendet. Die Koexpression von NP und VP35Flag führte zu einer Relokalisation des

VP35Flag in die vom NP gebildeten Einschlusskörper (A2 und A3). Diese Kolokalisation

war vor allem in der Überlagerung beider Signale sichtbar (A4). Ebenso zeigten die

VP35-Substitutionsmutanten L90AFlag (B2-B4), L104AFlag (C2-C4) und L90/104AFlag

(D2-D4) in Gegenwart von NP keine homogene Verteilung, sondern waren nun in den

NP-induzierten Einschlusskörpern zu finden. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass

das MARV VP35 sowohl als Monomer als auch als Homooligomer in der Lage ist, mit

dem NP zu interagieren (Möller et al., 2005).

αNP αNP

NP MockA B

αNP αNP

NP MockA B

Abbildung 19: Immunfluoreszenzanalyse der Einzelexpression von NP. Zur Expression des NP wurden subkonfluente Huh7-Zellen mit dem Plasmid pTM1-NP transfiziert. 12h nach Transfektion wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit einem monoklonalen α-NP AK und einem FITC-gekoppelten α-Maus AK gefärbt. (A) NP-exprimierende Huh7-Zellen. (B) Mock.

4 Ergebnisse 74

1 2 3 4

αFlag αNP ÜberlagerungαFlag

A

B

C

D

VP35Flag NP+VP35Flag NP+VP35Flag NP+VP35Flag

L90AFlag NP+L90AFlag NP+L90AFlag NP+L90AFlag


L90/104AFlag NP+L90/104AFlag NP+L90/104AFlag NP+L90/104AFlag

E

Mock Mock

1 2 3 4

αFlag αNP ÜberlagerungαFlag

A

B

C

D

VP35Flag NP+VP35Flag NP+VP35Flag NP+VP35Flag



L90/104AFlag NP+L90/104AFlag NP+L90/104AFlag NP+L90/104AFlag

E

Mock Mock

Abbildung 20: Immunfluoreszenzanalyse des VP35Flag und der Flag-markierten VP35- Substitutionsmutanten nach Einzel- und Koexpression mit NP. Subkonfluente Huh7-Zellen wurden mit den Plasmiden pTM1-VP35Flag, pTM1-VP35L90AFlag, pTM1-VP35L104AFlag, bzw. pTM1-VP35L90/104AFlag entweder einzeln oder zusammen mit dem NP-exprimierenden Plasmid pTM1-NP transfiziert. 12h nach Infektion wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. (A1-D1) Einzelexpression von VP35Flag, L90AFlag, L104AFlag und L90/104AFlag; Färbung mit einem polyklonalen α-Flag AK und einem Rhodamin-gekoppelten α-Kaninchen AK. (A2-A4) Koexpression von NP und VP35Flag. (B2-B4) Koexpression von NP und L90AFlag. (C2-C4) Koexpression von NP und L104AFlag. (D2-D4) Koexpression von NP und L90/104AFlag. (E) Mock; Färbung mit einem monoklonalen α-NP AK und einem polyklonalen α-Flag AK sowie einem FITC-gekoppelten α-Maus und einem Rhodamin-gekoppelten α-Kaninchen AK.

4 Ergebnisse 75

4.5.1.2 Immunpräzipitationsanalyse des VP35Flag und der Flag-markierten VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag nach Koexpression mit dem NP

Bei dem unter 4.5.1.1 beschriebenen Experiment diente die Relokalisation des nach

Einzelexpression homogen verteilten VP35Flag in die vom NP-induzierten Einschluss-

körper als Indikator für eine Interaktion der beiden Proteine. Um diese Beobachtungen

zu verifizieren, sollte die Bindung des VP35Flag mit dem NP nach Aufschluss der Zellen

mittels Detergenzien und anschließender Koimmunpräzipitationsanalyse untersucht

werden. Des Weiteren sollte mit Hilfe dieses experimentellen Ansatzes bestätigt

werden, dass die Flag-markierte VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag, die nicht

mehr in der Lage ist, Homooligomere zu bilden, mit dem NP interagiert. Die Konstrukte

pTM1-VP35Flag oder pTM1-VP35L90/104AFlag wurden gemeinsam mit dem für das NP

kodierende Plasmid pTM1-NP transfiziert (3.2.2). Die Synthese der T7-RNA-

Polymerase wurde durch die Kotransfektion des Plasmides pCAGGS-T7 sichergestellt.

15 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen metabolisch mit [35S]Promix Cell-

labelling Mix markiert, lysiert (3.3.1) und mit Protein-A-Sepharose vorinkubiert (3.3.8).

Zum Nachweis einer möglichen Interaktion wurden die Ansätze mit einem gegen das

Flag-Epitop gerichteten Antikörper (α-Flag M2 AK) behandelt. Zur Kontrolle der

Expression der beiden Nukleokapsidproteine wurde ein Antiserum (α-NC AK)

verwendet, welches sowohl das NP als auch das VP35Flag bzw. die VP35-

Substitutionsmutante L90/104AFlag erkannte. Die Koimmunpräzipitate wurden mittels

SDS-PAGE (3.3.9.1) aufgetrennt und mit dem Bio-Imager sowie dem

Computerprogramm TINA 2.0 (3.3.9.2) ausgewertet. Abbildung 21 zeigt, dass das NP

durch die Präzipitation des Flag-markierten VP35 (VP35Flag, Spur 1) mitgerissen

werden konnte.

NP+VP35Flag NP Mock

NP+L90/104AFlag

3 4 5 61 2 7 8

VP35Flag bzw.

46kD

66kD

97kD NP

VP35L90/104AFlag

30kD


NP+VP35Flag NP Mock

NP+L90/104AFlag

3 4 5 61 2 7 8

VP35Flag bzw.

46kD

66kD

97kD NP

VP35L90/104AFlag

30kD


NP+VP35Flag NP Mock

NP+L90/104AFlag

3 4 5 61 2 7 8

VP35Flag bzw.

46kD

66kD

97kD NP

VP35L90/104AFlag

30kD


4 Ergebnisse 76

In Spur 2 ist zur Kontrolle die Fällung des Ansatzes mit dem α-NC AK, der sowohl das

VP35Flag als auch das NP erkannte, dargestellt. Das NP zeigte nach Einzelexpression

keine Kreuzreaktion mit dem α-Flag M2 AK (Spur 3), konnte allerdings erwartungs-

gemäß mit dem α-NC AK nachgewiesen werden. Nach der Behandlung von Mock-

Zellen mit den zur Präzipitation verwendeten AK traten keine Unspezifitäten auf (Spur

5 und 6). Wie in Spur 7 zu sehen ist, wurde nach Fällung des Koexpressionsansatzes

mit dem α-Flag M2 AK das NP durch die VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag

kopräzipitiert. Beide Proteine konnten mit dem α-NC AK detektiert werden (Spur 8).

Diese Beobachtungen bestätigen die durch die Immunfluoreszenzanalyse gewonnenen

Daten, dass die Homooligomerisierung des MARV VP35, für die Interaktion mit dem

NP nicht notwendig zu sein scheint (Möller et al., 2005).

4.5.2 Lokalisation der NP-Interaktionsdomäne auf dem VP35

Durch die Analyse verschiedener Flag-markierter VP35-Deletionsmutanten (Möller,

2002) konnte die Bindungsstelle des NP auf dem VP35 weitest gehend eingegrenzt

werden. Abbildung 22 zeigt ein Set verschiedener mit einem Flag-Epitop versehener

VP35-Deletionsmutanten, die für den N- und/oder C-Terminus des Proteins kodieren.

Nach Koexpression mit dem NP wurden diese Mutanten mittels Koimmunfluoreszenz-

analyse (3.3.8) auf ihre Interaktionsfähigkeit hin untersucht (Daten nicht gezeigt).

VP35Flag

VP351-278Flag

VP351-246Flag

+

+

+

VP35∆121-219Flag

VP35∆71-119Flag

VP35152-329Flag

+

+

VP35Flag

VP351-278Flag

VP351-246Flag

+

+

+

VP35∆121-219Flag

VP35∆71-119Flag

VP35152-329Flag

+

+

Abbildung 21: Koimmunpräzipitationsanalyse von NP und VP35Flag sowie der VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag nach Kotransfektion aus Huh7-Zellen. Zur Koexpression der Proteine VP35Flag und L90/104AFlag wurden die Plasmide pTM1-VP35Flag bzw. pTM1-VP35L90/104AFlag zusammen mit dem NP-exprimierenden Plasmid pTM1-NP in subkonfluente Huh7-Zellen transfiziert. Zusätzlich wurde zur Expression der T7-RNA-Polymerase das Plasmid pCAGGS-T7 kontransfiziert. 15 h nach Transfektion wurden die Zellen radioaktiv markiert und lysiert. Anschließend erfolgte unter Verwendung eines α-Flag M2 AK und eines α-NC Antiserums die Durchführung einer Koimmunpräzipitationsanalyse. Die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Bio-Imager ausgewertet. Die koexprimierten Proteine sind oberhalb und die zur Detektion verwendeten AK unterhalb der Abbildung gezeigt. Rechtsseitig sind die Positionen der untersuchten Proteine dargestellt. Bei den mit ( ) gekennzeichneten Banden handelt es sich um unspezifische zelluläre Proteine.

4 Ergebnisse 77

Die C-terminal verkürzten VP35-Deletionsmutanten VP351-278Flag und VP351-246Flag

wurden nach Koexpression durch das NP in die intrazytoplasmatischen Einschluss-

körper rekrutiert. Auch die internen VP35-Deletionsmutanten VP35∆121-129Flag und

VP35∆71-119Flag erschienen nach Koexpression mit dem NP in den Einschlusskörper-

chen. Die N-terminal verkürzte VP35-Deletionsmutante VP35152-329Flag hingegen war

homogen verteilt und konnte nicht mit dem NP kolokalisieren. Diese Daten wiesen

darauf hin, dass sich auf dem N-Terminus des MARV VP35 eine potentielle Bindungs-

stelle für das NP befindet.

4.5.2.1 Einfluss des N-Terminus des VP35 auf die Struktur der vom NP-induzierten intrazytoplasmatischen Einschlusskörper

Voruntersuchungen haben gezeigt, dass die Interaktion von NP und VP35 eine

Veränderung der Struktur der vom NP gebildeten Helices bewirkt (Kolesnikova, mündl.

Mitteilung). Um die Rolle des N-Terminus des MARV VP35 auf die Interaktion mit dem

NP näher zu charakterisieren, sollte im weiteren Verlauf eine C-terminal verkürzte und

Flag-markierte VP35-Deletionsmutante (VP351-122Flag) in Gegenwart von NP untersucht

werden. Die Plasmide pTM1-NP und pTM1-VP351-122Flag wurden in subkonfluente

Huh7-Zellen kotransfiziert (3.3.6). Zur Synthese der T7-RNA-Polymerase wurde das

Konstrukt pCAGGS-T7 zugesetzt. 12 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen

fixiert und permeabilisiert. Die Anfärbung des NP erfolgte mit einem monoklonalen α-

NP AK, die der VP35-Deletionsmutante VP351-122Flag mit einem polyklonalen α-Flag AK.

Als sekundäre Antikörper wurden ein FITC-gekoppelter α-Maus bzw. ein Rhodamin-

gekoppelter α-Kaninchen AK verwendet (3.3.6).

Die durchgeführte Immunfluoreszenzanalyse ist in Abbildung 23 dargestellt. Die VP35-

Deletionsmutante VP351-122Flag blieb sowohl nach Einzelexpression als auch in

Anwesenheit des NP homogen im Zytoplasma verteilt (A und B). Diese Beobachtung

deutete zunächst darauf hin, dass diese Mutante nicht mehr mit dem NP interagierte.

Betrachtet man allerdings das NP, so war dieses ebenfalls homogen verteilt (C). Das

VP351-122Flag war somit vermutlich in der Lage, das NP zu binden, verhinderte jedoch

die Bildung der typischen intrazytoplasmatischen Einschlusskörperchen (D).

Dieses Ergebnis verstärkte zum einen die Annahme, dass der N-Terminus des MARV

VP35 eine wichtige Rolle für die Interaktion mit dem NP spielt. Zum anderen scheint

Abbildung 22: Schematische Darstellung der Interaktion von NP und VP35Flag und der untersuchten Flag-markierten VP35-Deletionsmutanten. NP wurde zusammen mit den entsprechenden VP35-Deletionsmutanten in Huh7-Zellen kotransfiziert und anschließend mittels Koimmunfluoreszenzanalyse untersucht. Für die mit (+) gekennzeichneten VP35-Deletionsmutanten konnte eine Interaktion mit dem NP detektiert werden. Die mit (-) gekennzeichneten VP35-Deletionsmutanten waren nicht in der Lage, mit dem NP zu interagieren.

4 Ergebnisse 78

das VP35 wesentlich an der Bildung des Nukleokapsids beteiligt zu sein, da der

isolierte N-Terminus des Proteins die Ausbildung der vom NP-induzierten

intrazellulären Einschlusskörper verhindern konnte.

Ferner lassen diese Daten eine weitere NP-Bindungsstelle auf dem C-Terminus des

VP35 vermuten. Da die interne VP35-Deletionsmutante VP35∆121-129Flag (4.5.2), die für

den N- und den C-Terminus des Proteins kodiert, mit dem NP kolokalisieren konnte,

scheint der C-Terminus des VP35 die Ausbildung der intrazytoplasmatischen Ein-

schlusskörper zu induzieren.

4.5.3 Einfluss der Coiled-Coil-Struktur des VP35 auf die Ausbildung der vom NP-induzierten intrazytoplasmatischen Einschlusskörper

Durch die Analyse der Aminosäuresequenz des MARV NP mit Hilfe des Computer-

programmes COILS 2.2 (Lupas, 1996; Lupas et al., 1991) konnten zwei potentielle

Coiled-Coil-Domänen in der Mitte Proteins vorhergesagt werden. Diese sind im Bereich

der Aminosäuren 320 bis 348 (NPC1) sowie zwischen den Aminosäuren 370 bis 400

(NPC2) lokalisiert. Mittels Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass das erste

Coiled-Coil-Motiv eine entscheidende Rolle für die Homooligomerisierung des NP spielt

(Di Carlo, 2004). Im Folgenden sollte geklärt werden, ob die Integrität der Coiled-Coil-

Motive des NP und des VP35 wichtig für deren Komplexbildung und somit für die

Ausbildung der vom NP-induzierten Einschlusskörper sowie für die Struktur des

Nukleokapsidkomplexes ist.

Abbildung 23: Koimmunfluoreszenzanalyse der VP35-Deletionsmutante VP351-122Flag nach Einzel- und Koexpression mit NP. Subkonfluente Huh7-Zellen wurden mit dem Plasmid pTM1-VP351-122Flag entweder einzeln oder zusammen mit dem NP-exprimierenden Plasmid pTM1-NP transfiziert. 12h nach Infektion wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. (A) Einzelexpression von VP351-122Flag; Färbung mit einem polyklonalen α-Flag AK und einem Rhodamin-gekoppelten α-Kaninchen AK. (B-D) Koexpression von NP und VP351-122Flag; Färbung mit einem monoklonalen α-NP AK und einem polyklonalen α-Flag AK sowie einem FITC-gekoppelten α-Maus und einem Rhodamin-gekoppelten α-Kaninchen AK.

VP351-122Flag

αFlag

NP+VP351-122Flag

αNP

NP+VP351-122Flag

Überlagerung

NP+VP351-122Flag

αFlag

A B C DVP351-122Flag

αFlag

NP+VP351-122Flag

αNP

NP+VP351-122Flag

Überlagerung

NP+VP351-122Flag

αFlag

A B C DVP351-122Flag

αFlag

VP351-122Flag

αFlag

NP+VP351-122Flag

αNP

NP+VP351-122Flag

αNP

NP+VP351-122Flag

Überlagerung

NP+VP351-122Flag

Überlagerung

NP+VP351-122Flag

αFlag

NP+VP351-122Flag

αFlag

A B C D

4 Ergebnisse 79

4.5.3.1 Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Mutante NP∆C1

nach Koexpression mit dem VP35Flag

Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden eine NP-Deletionsmutante NP∆C1, die

nicht mehr über das erste Coiled-Coil-Motiv von Aminosäure 320 bis 348 verfügte (Di

Carlo, 2004) und ein Flag-markiertes VP35 (VP35Flag) sowohl nach Einzel- als auch

nach Koexpression analysiert. Die entsprechenden Plasmide wurden zusammen mit

dem Konstrukt, welches für die T7-RNA-Polymerase kodiert, in subkonfluente Huh7-

Zellen transfiziert (3.2.2). 12 Stunden nach Transfektion erfolgte die Immunfluores-

zenzanalyse der fixierten und permeabilisierten Zellen (3.3.6).

Wie bereits unter 4.5.1.1 dargestellt wurde, zeigte das VP35Flag nach Einzelexpression

eine homogene Verteilung im Zytoplasma der Zelle (Abb. 24, A1). Über-

raschenderweise verlor die singulär exprimierte NP-Deletionsmutante NP∆C1 durch

die Deletion der ersten potentiellen Coiled-Coil-Domäne die Fähigkeit zur Induktion der

intrazytoplasmatischen Einschlusskörper (A2). Nach Koexpression beider Proteine

erschien das NP wieder in Form von Einschlusskörperchen (B2). Das VP35Flag

kolokalisierte mit der NP-Deletionsmutante NP∆C1 in den Einschlusskörpern (B1), was

durch die Überlagerung beider Signale deutlich zu sehen ist (B3). Diese Daten lassen

VP35Flag

αFlag αNP Überlagerung

NP∆C1+VP35Flag

1 2 3

B

A

NP∆C1+VP35Flag NP∆C1+VP35Flag

NP∆C1VP35Flag


NP∆C1+VP35Flag

1 2 3

B

A

NP∆C1+VP35Flag NP∆C1+VP35Flag

NP∆C1

Abbildung 24: Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Deletionsmutante NPDC1 sowie des VP35Flag nach Einzel- und Koexpression. Die Plasmide pTM1-NP∆C1 und pTM1-VP35Flag wurden entweder einzeln oder zusammen in subkonfluente Huh7-Zellen transfiziert. 12h nach Infektion wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Die Anfärbung der exprimierten Proteine erfolgte mit einem monoklonalen α-NP AK und einem polyklonalen α-Flag AK sowie einem FITC-gekoppelten α-Maus bzw. einem Rhodamin-gekoppelten α-Kaninchen AK. (A1 und B1) VP35Flag nach Einzel- und Koexpression mit NP∆C1. (A2 und B2) NP∆C1 nach Einzel- und Koexpression mit VP35Flag. (B3) Überlagerung von B1 und B2.

4 Ergebnisse 80

vermuten, dass das VP35 bestimmte Funktionen des NP bei der Morphogenese des

Nukleokapsidkomplexes ersetzen kann.

4.5.3.2 Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Mutante NP∆C1 nach Koexpression

mit der VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag

Es war nun von Interesse, ob die VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag, die keine

Homooligomere bildet, nach Koexpression mit der NP-Deletionsmutante NP∆C1 ein

ähnliches Phänomen verursacht. Analog zu 4.5.3.1 wurden subkonfluente Huh7-Zellen

mit den entsprechenden Plasmiden kotransfiziert und nach Fixierung sowie Perme-

abilisierung mittels Immunfluoreszenz analysiert (3.3.6). Wie in Abbildung 25 zu sehen

ist, konnte durch den Verlust der Coiled-Coil-Struktur des MARV VP35 die Ausbildung

der Einschlusskörper nicht induziert werden. Sowohl die NP-Deletionsmutante NP∆C1

als auch die VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag zeigten ein homogenes Erschei-

nungsbild (A1 bis A3).

Da die Kolokalisation der Proteine in den intrazellulären Einschlusskörpern als

Indikator für eine bestehende Bindung gewertet wird, blieb nach diesem Ergebnis

jedoch unklar, ob eine Interaktion zwischen beiden Proteinen besteht. Allerdings

konnte neben der homogenen Lokalisation der NP-Deletionsmutante NP∆C1 und der

VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag nach Koexpression ein weiterer Phänotyp

1 2 3

B

A


NP∆C1+L90/104AFlag NP∆C1+L90/104AFlag NP∆C1+L90/104AFlag


1 2 3

B

A




1 2 3

B

A




Abbildung 25: Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Deletionsmutante NP∆C1 nach Koexpression mit der Flag-markierten VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag. Die Plasmide pTM1-NP∆C1 und pTM1-VP35L90/104AFlag wurden zusammen in subkonfluente Huh7-Zellen transfiziert. 12h nach Transfektion erfolgte die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen. Zur Anfärbung der exprimierten Proteine wurden ein monoklonaler α-NP AK und ein polyklonaler α-Flag AK sowie ein FITC-gekoppelter α-Maus bzw. ein Rhodamin-gekoppelter α-Kaninchen AK verwendet. (A und B) Koexpression von NP∆C1 und L90/104AFlag.

4 Ergebnisse 81

beobachtet werden. Wie unter B1 und B2 zu erkennen ist, traten neben einer

homogenen Verteilung kleine über das gesamte Zytoplasma der Zelle verstreute

punktförmige Aggregate auf, in denen sich beide Fluoreszenzsignale überlagerten

(B3). Hinsichtlich der Morphologie unterscheiden sich die detektierten Aggregate

allerdings wesentlich von den eher perinukleär lokalisierten Einschlusskörpern, die

nach Expression des Wildtyp-NP auftreten. Aus diesen Daten wurde geschlossen,

dass intakte Coiled-Coil-Motive des NP und des VP35 eine wichtige Rolle für die

Struktur der Einschlusskörper und wahrscheinlich bei der Morphogenese des

Nukleokapsidkomplexes spielen.

4 Ergebnisse 82

4.6 Stöchiometrie der Marburg-Virus VP35-Homooligomere

Abschließend sollte die Stöchiometrie des VP35 sowohl im MARV-Partikel als auch

nach rekombinanter Expression des Proteins betrachtet werden.

4.6.1 Stöchiometrie des VP35 im Marburg-Virus-Partikel

Um die Stöchiometrie des VP35 zu charakterisieren, sollte zunächst eine durch γ-

Bestrahlung inaktivierte MARV-Probe unter nativen Bedingungen untersucht werden.

Ein Mikroliter der MARV-Präparation (3.2.4) wurde über Polyacrylamidgelelektro-

phorese (3.3.9.1) aufgetrennt und mittels Western Blot (3.3.5) analysiert. Wie in

Abbildung 26 zu sehen ist, traten neben dem monomeren VP35 (MGtheor.: 36 kD) auch

höher molekulare Formen auf, die andeuten, dass das VP35 im MARV-Partikel sowohl

als Monomer als auch als Multimer eingebaut ist.

Da es sich bei den höheren Formen allerdings um VP35 handeln könnte, welches mit

anderen viralen Proteinen interagiert, konnte keine eindeutige Aussage über die

Stöchiometrie des MARV VP35 gemacht werden. Auf diesem Grunde sollten die

folgenden Untersuchungen zur Stöchiometrie des VP35-Homooligomers nach

rekombinanter Expression des Proteins erfolgen.

4.6.2 Stöchiometrie des VP35 nach rekombinanter Expression

Zur genauen Analyse der Stöchiometrie des VP35-Homooligomers wurde die VP35-

Deletionsmutante VP351-122Flag verwendet, die das für die Homooligomerisierung

essentielle Coiled-Coil-Motiv enthielt. Als Negativkontrolle wurde die VP35-

Deletionsmutante VP351-122mutFlag untersucht, deren Coiled-Coil-Struktur auf Grund der

Substitution der Leucine 90 und 104 zerstört war. Beide VP35-Deletionsmutanten

wurden in vitro translatiert und metabolisch mit [35S]Promix Cell-labelling Mix markiert

66kD97kD

46kD

30kD

220kD

γ-MARV

36kD/Monomer

72kD/Dimer ? 108kD/Trimer ?144kD/Tetramer ?

66kD97kD

46kD

30kD

220kD

γ-MARV

36kD/Monomer

72kD/Dimer ? 108kD/Trimer ?144kD/Tetramer ?

Abbildung 26: Analyse des Oligomeri-sierungsgrades des VP35 im MARV-Partikel. Ein Mikroliter einer g-bestrahlten MARV-Präparation wurde über Polyacryl-amidgelelektrophorese aufgetrennt und mittels Western Blot analysiert. Zur Detektion des VP35 wurde ein α-VP35 AK und ein sekundärer POD-gekoppelter α-Meerschweinchen AK verwendet. Linksseitig sind die Positionen des mit geführten Größenmarkers dargestellt. Auf der rechten Seite sind die Positionen der möglichen Homooligomere aufgeführt.

4 Ergebnisse 83

(3.3.7). Die exprimierten VP35-Deletionsmutanten wurden über die Kopplung des Flag-

Epitops an eine spezielle Anti-Flag M2-Agarose aus dem Translationsansatz

präzipitiert. Die auf diese Weise selektionierten Flag-markierten VP35-Deletions-

mutanten wurden mit Hilfe eines Flag-Peptides von der Anti-Flag M2-Agarose eluiert.

Im Anschluss erfolgte die Behandlung mit den chemischen Quervernetzungs-

Reagenzien Glutaraldehyd und EGS, die durch die Ausbildung von kovalenten

Bindungen die einzelnen Monomere eines Oligomers kovalent verknüpfen können

(3.3.2). Die so stabilisierten Proteinkomplexe wurden mittels SDS-PAGE (3.3.9.1)

aufgetrennt und mit dem Bio-Imager sowie dem Computerprogramm TINA 2.0 (3.3.9.2)

ausgewertet. In Abbildung 27 ist die Vernetzung (3.3.2) der VP35-Deletionsmutante

VP351-122Flag mit Glutaraldehyd (A) und EGS (B) dargestellt.

66kD97kD

21kD14kD

46kD30kD

220kD

0 20 0 0,5 1 5 10 20mM Glutaraldehyd

Mock VP351-122Flag

3 4 5 61 2 7 8

15,5kD/Monomer

31kD/Dimer 46,5kD/Trimer 62kD/Tetramer

66kD97kD

21kD14kD

46kD30kD

220kD

0 5 0 0,1 0,5 1 2 5mM EGS

Mock VP351-122Flag

3 4 5 61 2 7 8

15,5kD/Monomer

31kD/Dimer 46,5kD/Trimer

62kD/Tetramer

B

A

66kD97kD

21kD14kD

46kD30kD

220kD

0 20 0 0,5 1 5 10 20mM Glutaraldehyd

Mock VP351-122Flag

3 4 5 61 2 7 8

15,5kD/Monomer

31kD/Dimer 46,5kD/Trimer 62kD/Tetramer

66kD97kD

21kD14kD

46kD30kD

220kD

0 5 0 0,1 0,5 1 2 5mM EGS

Mock VP351-122Flag

3 4 5 61 2 7 8

15,5kD/Monomer


62kD/Tetramer

B

66kD97kD

21kD14kD

46kD30kD

220kD

0 5 0 0,1 0,5 1 2 5mM EGS

Mock VP351-122Flag

3 4 5 61 2 7 8

15,5kD/Monomer


62kD/Tetramer

B

A

Abbildung 27: Analyse des Oligomerisierungsgrades der Flag-markierten VP35-Substitutionsmutante VP351-122Flag nach rekombinanter Expression und Querver-netzung. Die VP35-Substitutionsmutante VP351-122Flag wurde mit dem TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation Kit synthetisiert und anschließend mittels Anti-Flag M2-Agarose präzipitiert. Nach Elution mit Hilfe eines Flag-Peptides erfolgte die Inkubation mit den Cross-Linkern Glutaraldehyd und EGS. Die vernetzten Proteine wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Bio-Imager analysiert. Die verwendeten Konzentrationen der Cross-Linker sind unterhalb und die Positionen der Homooligomere rechtsseitig dargestellt.

4 Ergebnisse 84

Während in Abwesenheit der Vernetzungsreagenzien lediglich Monomere (MGtheor.:

15,5 kD; Abb. 22, A und B, Spur 3) detektiert wurden, konnten nach Zugabe der

quervernetzenden Agenzien zusätzliche Banden mit den erwarteten Molekular-

gewichten von Dimeren (MGtheor.: 31 kD), Trimeren (MGtheor.: 46,5 kD) und Tetrameren

(MGtheor.: 62 kD) beobachtet werden. In den Spuren 7 und 8 wurden weitere Banden

detektiert, wobei es sich möglicherweise um hochmolekulare Addukte handelt, die bei

hohen Konzentrationen der verwendeten Vernetzunsreagenzien entstehen können. Die

optimale Konzentration lag für Glutaraldehyd bei 5 mM und für EGS bei 1 mM (Abb.

27, A und B, Spur 6).

0 0,5 1 5 10 20 0 20mM Glutaraldehyd

15,5kD/Monomer

MockVP351-122mutFlag

3 4 5 61 2 7 8

A

66kD

21kD

97kD

14kD

46kD

30kD

220kD

Mock VP351-122mutFlag

3 4 5 61 2 7 8B

0 5 0 0,1 0,5 1 2 5mM EGS

66kD

21kD

97kD

14kD

46kD

30kD

220kD

15,5kD/Monomer

0 0,5 1 5 10 20 0 20mM Glutaraldehyd

15,5kD/Monomer

MockVP351-122mutFlag

3 4 5 61 2 7 8

A

66kD

21kD

97kD

14kD

46kD

30kD

220kD

Mock VP351-122mutFlag

3 4 5 61 2 7 8B

0 5 0 0,1 0,5 1 2 5mM EGS

66kD

21kD

97kD

14kD

46kD

30kD

220kD

15,5kD/Monomer

Abbildung 28: Analyse des Oligomerisierungsgrades der Flag-markierten VP35-Substitutionsmutante VP351-122mutFlag nach rekombinanter Expression und Querver-netzung. Die VP35-Substitutionsmutante VP351-122mutFlag wurde mit dem TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation Kit synthetisiert und anschließend mittels Anti-Flag M2-Agarose präzipitiert. Nach Elution mit Hilfe eines Flag-Peptides erfolgte die Inkubation mit den Cross-Linkern Glutaraldehyd und EGS. Die vernetzten Proteine wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Bio-Imager analysiert. Die verwendeten Konzentrationen der Cross-Linker sind unterhalb und die Position des Monomers rechtsseitig dargestellt.

4 Ergebnisse 85

Wie in Abbildung 28 zu sehen ist, konnten nach Vernetzung der VP35-Deletions-

mutante VP351-122mutFlag erwartungsgemäß keine oligomeren Formen nachgewiesen

werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das VP35 des MARV in Form von

Mono-, Di-, Tri- und Tetrameren vorliegen kann. Ferner konnte durch diese Versuche

bestätigt werden, dass die Coiled-Coil-Struktur im N-terminalen Bereich des MARV

VP35 die Homooligomerisierung des Proteins vermittelt.

5 Diskussion 86

5 Diskussion

Mit Hilfe eines artifiziellen Replikations- und Transkriptionssystems (Mühlberger et al.,

1998) ist es in den vergangenen Jahren gelungen, grundsätzliche Aspekte der

Molekularbiologie des MARV aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass drei der vier

Nukleokapsidproteine (NP, VP35 und L) sowohl notwendig als auch ausreichend für

die Replikation und Transkription der viralen RNA des MARV sind (Mühlberger et al.,

1998). Das vierte Nukleokapsidprotein VP30 scheint zusätzlich einen Einfluss auf die

Replikation und Transkription der viralen RNA zu haben, da das Abschalten des VP30

mittels RNA Interferenz eine Reduktion der Proteinlevel aller anderen viralen Proteine

zur Folge hatte (Fowler et al., 2005). Die Nukleokapsidproteine sind jeweils in

unterschiedliche Proteinkomplexe involviert, deren Funktion bislang nicht bekannt ist.

Da diese Proteine zugleich strukturelle und funktionelle Aufgaben besitzen, wird

vermutet, dass die Ausbildung verschiedener Proteinkomplexe für die Regulation von

Replikation und Transkription sowie den Aufbau des Nukleokapsidkomplexes

notwendig ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Homooligomerisierung des MARV VP35

bezüglich seiner Funktion für die Synthese der viralen RNA und für die Morphogenese

des Nukleokapsidkomplexes zu untersuchen.

Homooligomerisierung des Marburg-Virus VP35

In der vorliegenden Arbeit konnte bestätigt werden, dass das VP35 des MARV in der

Lage war, Homooligomere auszubilden. Bedingung für die Homooligomerisierung des

VP35 war die Anwesenheit eines durch Computeranalyse vorhergesagten Coiled-Coil-

Motivs im N-terminalen Bereich des Proteins. Die Substitution der Leucinreste an

Position 90 und 104 zu Alanin führte zu einer Destabilisierung der Coiled-Coil-Struktur

und somit zum vollständigen Verlust der Homooligomerisierung des MARV VP35

(Möller, 2002; Möller et al., 2005). Für das VP35 des EBOV, dem zweiten Vertreter der

Familie der Filoviridae, konnte ebenfalls im N-terminalen Bereich des Proteins eine

Coiled-Coil-Domäne identifiziert werden. Äquivalent zum MARV VP35 wurde durch die

Substitution kritischer Aminosäuren im Bereich des Coiled-Coil-Motivs die Homo-

oligomerisierung des EBOV VP35 unterbunden (Reid et al., 2005; Schinkel, 2005).

Coiled-Coils sind hoch flexible Proteinstrukturen, die für eine Vielzahl von Protein-

Protein-Interaktionen verantwortlich sind (Burkhard et al., 2001; Mason and Arndt,

2004). Durch die Übertragung der Coiled-Coil-Struktur des MARV VP35 auf ein

monomeres Reporterprotein (Hartlieb et al., 2003) konnte dessen Interaktion vermittelt

werden (Möller et al., 2005). Diese Daten weisen darauf hin, dass eine Coiled-Coil-

Struktur innerhalb des N-Terminus des VP35 der Filoviren das entscheidende Element

für die Ausbildung der homooligomeren Formen darstellt.

5 Diskussion 87

Coiled-Coil-Strukturen als Module zur Vermittlung der Homooligomerisierung der Polymerasekofaktoren der Mononegavirales

Obwohl das VP35 der Filoviren vergleichsweise schwach phosphoryliert ist,

repräsentiert es das funktionelle Analogon zu den Phospho(P)-Proteinen der anderen

Viren der Ordnung der Mononegavirales (Becker and Mühlberger, 1999). Die meisten

der für die Homooligomerisierung der P-Proteine verantwortlichen Domänen beinhalten

ein Coiled-Coil-Motiv, das allerdings an unterschiedlichen Stellen der entsprechenden

P-Proteine lokalisiert ist (Curran et al., 1995a). Für die Vesikuloviren, die zur Familie

der Rhabdoviridae gehören, konnten die jeweiligen Oligomerisierungsdomänen auf die

N-Termini der P-Proteine eingegrenzt werden (Curran et al., 1995a; Raha et al., 2000).

Bezüglich der P-Proteine der Familie der Paramyxoviridae befinden sich die Coiled-

Coil-Strukturen vorwiegend im C-terminalen Bereich (Asenjo and Villanueva, 2000;

Choudhary et al., 2002; Curran et al., 1995a; De et al., 2000; Harty and Palese, 1995;

Khattar et al., 2001; Llorente et al., 2006; Nishio et al., 1997; Rahaman et al., 2004;

Shaji and Shaila, 1999; Tarbouriech et al., 2000a; b).

Die Bornaviridae bilden eine eigene Familie innerhalb der Ordnung der Mononega-

virales. Sie unterscheiden sich zum einen durch ihre Replikation im Kern der infizierten

Zelle und zum anderen durch die Nutzung des zellulären Splicing-Apparates von den

anderen Mitgliedern der Ordnung der Mononegavirales. Überdies konnte eine Homo-

oligomerisierung des Borna-Virus P-Proteins gezeigt werden, die allerdings nicht über

eine Coiled-Coil-Struktur vermittelt wird (Schneider et al., 2004; Schwemmle et al.,

1998).

Mit einigen Ausnahmen (Curran et al., 1995a; Raha et al., 2000; Schwemmle et al.,

1998) scheint die Homooligomerisierung der P-Proteine bzw. des VP35 über Coiled-

Coil-Strukturen, die vorwiegend im N-terminalen Bereich der analysierten Proteine zu

finden sind, aber auch C-terminal vorkommen, eine allgemeine Eigenschaft innerhalb

der Ordnung Mononegavirales zu sein. Interessanterweise ist die Sequenzhomologie

der P-Proteine und des VP35 relativ gering. Obwohl die Homooligomerisierung der P-

Proteine bzw. des VP35 für deren Funktion essentiell ist, scheint die Lokalisation der

für die Homooligomerisierung verantwortlichen Module keine Rolle zu spielen (Curran,

1996; 1998; Gao et al., 1996; Gigant et al., 2000).

Einfluss der Homooligomerisierung des VP35 auf die Replikation und Transkription der viralen RNA des Marburg-Virus

Die Komplexe aus VP35 und dem L-Protein der Familie der Filoviridae sowie aus den

P- und L-Proteinen der Rhabdo-, Paramyxo-, und Bornaviridae fungieren als RNA-

abhängige RNA-Polymerasen. Das L-Protein verkörpert hierbei die katalytische

5 Diskussion 88

Untereinheit, während das VP35 bzw. die P-Proteine die Polymerasekofaktoren

repräsentieren (Banerjee and Barik, 1992; Horikami et al., 1992; Mühlberger et al.,

1992; 1998; 1999; Parks, 1994; Walker et al., 2000). Nach Austausch der zwei

kritischen Leucinreste innerhalb der Coiled-Coil-Domäne des MARV VP35 konnten auf

Grund einer zerstörten Coiled-Coil-Struktur keine Homooligomere ausgebildet werden.

Das monomere VP35 konnte weder Replikation noch Transkription unterstützen.

(Möller et al., 2005). Bei vergleichbaren Untersuchungen zur Funktion der Homo-

oligmerisierung des EBOV VP35 wurde festgestellt, dass diese ebenfalls für die

Transkription der viralen RNA notwendig ist (Schinkel, 2005). Diese Ergebnisse lassen

sich dadurch erklären, dass ausschließlich homooligomeres VP35 in der Lage war, mit

dem L-Protein zu interagieren. Zusammenfassend bildet somit eine intakte Coiled-Coil-

Struktur im N-terminalen Bereich des VP35 der Filoviridae die Grundlage für die

Homooligomerisierung des Proteins, die wiederum ausschlaggebend für die Interaktion

mit dem L-Protein und somit für die Ausbildung eines funktionellen Polymerase-

komplexes ist.

Ähnliche Beobachtungen wurden bei der Funktionsanalyse des P-Proteins des

vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) aus der Familie der Rhabdoviridae gemacht. Wie im

Falle des VP35 der Filoviren konnte das VSV P-Protein lediglich in seiner homooligo-

meren Form mit der katalytischen Untereinheit des Polymerasekomplexes interagieren

und somit die Replikation und Transkription der viralen RNA vermitteln (Das et al.,

2005; Gao et al., 1996; Gupta et al, 2003). Eine andere Situation konnte für die P-

Proteine einiger Mitglieder der Familie der Paramyxoviridae beobachtet werden.

Sowohl das P-Protein des Rinderpest-Virus (RPV) als auch des humanen Para-

influenzavirus (hPIV) Typ 3 waren in der Lage, in ihrer monomeren Form mit dem L-

Protein zu interagieren. Entscheidend war jedoch, dass ausschließlich die homooligo-

meren P-Proteine im Komplex mit den L-Proteinen die Vermehrung der viralen RNA

bewerkstelligen konnten (Choudhary et al., 2002; Curran, 1996; 1998; Rahaman et al.,

2004).

Für die Vertreter der Bornaviridae, die vierte Familie innerhalb der Ordnung Mononega-

virales, konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Homooligomerisierung des P-

Proteins essentiell für dessen Funktion während der Synthese der viralen RNA ist,

obwohl auch hier das monomere P-Protein die Fähigkeit besaß, mit dem L-Protein zu

interagieren (Schneider et al., 2004). Diese Daten deuten darauf hin, dass die

Homooligomerisierung des VP35 sowie der P-Proteine der Viren der Ordnung Mono-

negavirales wichtig für die Funktionalität der entsprechenden Polymerasekomplexe im

Vermehrungsprozess der viralen RNA ist.

5 Diskussion 89

Eine Hypothese zur Notwendigkeit der homooligomeren Formen der Polymerase-

kofaktoren besagt, dass die funktionellen Polymerasekomplexe über die N(NP)/RNA-

Matrize hinweg rollen, wobei die einzelnen Untereinheiten der VP35- bzw. P-

Homooligomere nacheinander mit dem N(NP)/RNA-Template in Interaktion treten. Die

daraus resultierende Fortbewegung des Polymerasekomplexes an der N(NP)/RNA-

Matrize entlang ermöglicht das Ablesen des Templates, die mRNA-Synthese als auch

die Replikation der viralen RNA. In Anwesenheit des monomeren P-Proteins wäre

diese Bewegung nicht möglich (Curran, 1998; Kolakofsky et al., 2004; Mellon and

Emerson, 1978).

Neben der Homooligomerisierung des VP35 konnte des Weiteren gezeigt werden,

dass der C-Terminus des Proteins eine entscheidende Rolle bei der Interaktion mit

dem L-Protein spielt. Innerhalb dieses Bereiches ist die eigentliche Bindungsdomäne

für das L-Protein lokalisiert (Möller et al., 2005). Für die Vertreter der Familie der

Paramyxoviridae konnten die Interaktionsdomänen für die L-Proteine ebenfalls auf die

C-Termini der zugehörigen P-Proteine eingegrenzt werden (Bousse et al., 2001;

Curran et al., 1994; De et al., 2000; Khattar et al., 2001; Nishio et al., 2000; Smallwood

et al., 1994; Tuckis et al., 2002). Innerhalb der Familie der Rhabdoviridae befinden sich

die L-Bindungsstellen in den N-terminalen Bereichen der entsprechenden P-Proteine

(Chenik et al., 1998; Emerson and Schubert, 1987; Paul et al., 1988; Takacs et al.,

1995).

In den bisher untersuchten Fällen war eine räumliche Nähe der Homooligomeri-

sierungsdomänen und der L-Bindungsstellen auf dem VP35 bzw. den P-Proteinen

erkennbar, die jedoch nicht direkt überlappen. Diese Beobachtungen bildeten die

experimentelle Grundlage, um die Transkription der viralen RNA des MARV zu

unterbinden. Der Einsatz von dominant-negativen VP35-Deletionsmutanten, die noch

in der Lage waren, zu oligomerisieren, allerdings nicht über eine intakte C-terminale L-

Bindungsstelle verfügten, führte zur Blockade der viralen RNA-Synthese (Möller et al.,

2005). Ähnliche Untersuchungen wurden für das P-Protein des zur Familie der

Paramyxoviridae gehörenden RPV durchgeführt. Die Coiled-Coil-Struktur allein war

nicht in der Lage, mit dem L-Protein zu interagieren (Chattopadhyay and Shaila, 2004).

Allerdings verursachte im Minigenomsystem (Raha et al., 2004) die Ausbildung von

gemischten Oligomeren einen dominant-negativen Effekt auf die Transkription und

Replikation der viralen RNA (Rahaman et al., 2004). Diese Ergebnisse lassen

vermuten, dass ein intakter Polymerasekomplex aus homooligomeren funktionellen P-

bzw. VP35-Molekülen und dem L Protein bestehen muss. Darüber hinaus muss für die

Funktionalität der Polymerasekomplexe eine intakte Bindung über die C-Termini des

VP35 bzw. über die entsprechenden Domänen auf den P-Proteinen mit der

5 Diskussion 90

katalytischen Untereinheit gewährleistet sein. Auf Grund der Tatsache, dass Coiled-

Coils als strukturelle Komponenten in eine Reihe von wichtigen Protein-Protein-

Interaktionen involviert sind, scheint die Homooligomerisierung des VP35 ein

vielversprechendes Ziel für die Entwicklung eines Therapeutikums gegen eine MARV-

Infektion zu sein.

Einfluss der Homooligomerisierung des Marburg-Virus VP35 auf die Interaktion mit dem NP

Das Nukleoprotein N bzw. NP ist die Hauptkomponente der Nukleokapsidkomplexe

von den Viren der Ordnung Mononegavirales. Das mit sich selbst interagierende N

oder NP induziert die Ausbildung so genannter intrazytoplasmatischer Einschluss-

körper, die mikroskopisch deutlich erkennbar sind. Diese Einschlusskörper sind in

infizierten Zellen zu beobachten und werden als Bildungszentren neuer Nukleokapside

sowie Orte der Replikation betrachtet (Becker et al., 1998; Bhella et al., 2002; Buchholz

et al., 1993; Fooks et al., 1993; Iseni et al., 1998; Karlin et al., 2003; Spehner et al.,

1991). Das NP des MARV ist in der Lage nach rekombinanter Einzelexpression,

Nukleokapsid-ähnliche Strukturen auszubilden, die dem Grundgerüst der Nukleo-

kapside sehr ähnlich sind. Es wird davon ausgegangen, dass die Bildung dieser

helikalen Strukturen den ersten Schritt im Zusammenbau des Nukleokapsidkomplexes

darstellt (Kolesnikova et al., 2000, Mavrakis, 2002).

Das NP des MARV ist außerdem in der Lage, mit dem VP35 zu interagieren. Mittels

Immunfluoreszenzanalysen konnte beobachtet werden, dass das ansonsten homogen

verteilte VP35 nach Koexpression mit dem NP in die vom NP-induzierten

intrazytoplasmatischen Einschlusskörper rekrutiert wurde. Diese Interaktion könnte

über eine direkte Bindung an das NP, aber auch über eine weitere unbekannte

Komponente vermittelt werden. Da jedoch eine Interaktion zwischen dem NP und

VP35 mittels Koimmunpräzipitation nachgewiesen werden konnte, wird davon

ausgegangen, dass die Rekrutierung des VP35 in die Einschlusskörper durch eine

direkte Bindung an das NP zustande kam (Becker et al., 1998; Möller et al., 2005). Für

die Interaktion mit dem NP war die Homooligomerisierung des MARV VP35 nicht

notwendig. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass verschiedene stöchiometrische

Formen des VP35 die Funktion des Proteins innerhalb der Proteinkomplexe mit den

anderen Nukleokapsidproteinen regulieren könnte (Möller et al., 2005).

Vergleichbare Beobachtungen konnten für die P-Proteine der Viren der Familie der

Rhabdoviridae gemacht werden (Green et al., 2000; Mavrakis et al., 2004).

Kontroverse Daten ergaben sich für die P-Proteine der Familie der Paramyxoviridae.

Das P-Protein des hPIV Typ 3 scheint in seiner monomeren Form ebenfalls in der Lage

zu sein, mit dem Nukleoprotein zu interagieren (Choudhary et al., 2002). Für die P-

5 Diskussion 91

Proteine des RPV sowie des Sendai-Virus konnte jedoch gezeigt werden, dass deren

Homooligomerisierung wichtig für die Komplexbildung mit dem N bzw. NP zu sein

scheint (Shaji and Shaila, 1999; Tuckis et al., 2002). Eine mögliche Erklärung hierfür

könnte die unterschiedliche Lokalisation der Interaktionsdomänen auf den P-Proteinen

zwischen den Rhabdo- und Paramyxoviridae sein. Ferner variieren die P-Proteine

innerhalb der Ordnung der Mononegavirales von 250 bis 600 Aminosäuren erheblich in

ihrer Größe, was zum Teil zu Überlappungen und somit zu einer Abhängigkeit der

Interaktionsdomänen führen könnte.

Einfluss des VP35 auf die Ausbildung der Einschlusskörper und die Morphogenese des Nukleokapsidkomplexes des Marburg-Virus

Durch die Komplexbildung des VP35 mit dem NP scheint das VP35 wesentlich an der

Entstehung des Nukleokapsidkomplexes und somit an der Morphogenese neuer

Nachkommenviren beteiligt zu sein. Die für das NP verantwortlichen Bindungsstellen

befinden sich sowohl auf dem N- als auch auf dem C-Terminus des VP35 (Möller,

2002). Wie bei anderen Vertretern der Mononegavirales konnte auch hier die Existenz

von zwei verschiedenen Bindungsstellen nachgewiesen werden, die in den meisten

Fällen ebenfalls auf dem N- und dem C-Terminus lokalisiert sind (Chenik et al., 1994;

Fu et al., 1994; Garcia-Barreno et al., 1996; Green et al., 2000; Harty and Palese,

1995; Khattar et al., 2001; Liston et al., 1997; Mallipeddi et al., 1996; Nishio et al.,

1996; 1999; Ryan et al., 1991; Ryan and Portner, 1990; Takacs et al., 1993).

Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Interaktion von NP

und VP35 eine Veränderung der Struktur der vom NP gebildeten helikalen Strukturen

bewirkt (Kolesnikova, persönliche Mitteilung). Dafür spricht auch, dass eine VP35-

Deletionsmutante, die ausschließlich den N-Terminus des Proteins umfasste, die

Ausbildung der vom NP-induzierten Einschlusskörper verhinderte. Diese Ergebnisse

deuten darauf hin, dass der N-Terminus des VP35 ausreichend ist, um mit dem NP zu

interagieren. Andererseits scheint die C-terminale NP-Bindungsstelle des VP35 in

Anwesenheit beider Proteine eine wesentliche Rolle bei der Ausbildung der Struktur

der Einschlusskörper zu haben.

Das Nukleoprotein N bzw. NP der Viren der Mononegavirales tritt in zwei

verschiedenen Formen auf. Zum einen liegt das selbst aggregierte N bzw. NP, wie

bereits beschrieben, in der Gestalt von Nukleokapsidstrukturen in den Einschluss-

körpern vor. Ferner erscheint das N bzw. NP in einer löslichen Variante, die als N0 bzw.

NP0 bezeichnet wird (Curran et al 1995b). Für die P-Proteine der Vertreter der

Mononegavirales ist bekannt, dass diese in der Lage sind, sowohl mit dem löslichen N0

bzw. NP0 als auch mit dem Nukleokapsid-assozierten N bzw. NP interagieren zu

können. Das einzelsträngige RNA-Genom der Viren der Mononegavirales, welches

5 Diskussion 92

vollständig durch das Nukleoprotein verpackt ist, dient als Matrize für die virale RNA-

abhängige RNA-Polymerase. Es wird davon ausgegangen, dass das N0 bzw. NP0

durch die Interaktion mit dem entsprechenden P-Proteinen in Lösung gehalten wird

und so eine Bindung an unspezifische zelluläre RNA verhindert werden kann (Curran

et al, 1995b, Huber et al., 1991; Spehner et al., 1997). Des Weiteren dienen die N0-

bzw. NP0-P-Komplexe als Substrate für die Verpackung der genomischen RNA, indem

die P-Proteine abdissoziieren, sobald das NP an die nackte RNA gebunden hat (Cevik

et al., 2004). Möglicherweise hat der N-Terminus des MARV VP35 einen

entscheidenden Einfluss darauf, das NP in Lösung zu halten.

Ähnliche Beobachtungen konnten bereits für andere Vertreter der Mononegavirales

gemacht werden. So fungiert der N-Terminus des Sendai-Virus P-Proteins als

Chaperon für das NP, welches während der Replikation des Genoms zum Verpacken

der nackten RNA zur Verfügung gestellt wird (Curran et al., 1995b). Für das P-Protein

des Rabies-Virus, einem Vertreter der Familie der Rhabdoviridae, konnte gezeigt

werden, dass das Nukleoprotein und das P-Protein zum einen nach unabhängiger und

zum anderen nach simultaner Expression die Fähigkeit besitzen, miteinander zu

interagieren. Die dafür verantwortlichen N-Bindungsstellen befinden sich sowohl auf

dem N- als auch auf dem C-Terminus des P-Proteins. Allerdings war eine

Deletionsmutante, die nur den N-Terminus des P-Proteins umfasste, nur nach

Koexpression mit dem N-Protein in der Lage, mit diesem in Interaktion zu treten.

Möglicherweise simulieren diese Untersuchungen die Situation in vivo, wobei die neu

synthetisierten N-Termini des N- und des P-Proteins aneinander binden, und das N-

Protein somit zunächst in Lösung gehalten werden kann (Fu et al., 1994).

Wie für das MARV VP35 gezeigt werden konnte, scheint auch im Falle des hPIV Typ 2

die C-terminale N-Bindungsstelle des P-Proteins einen wesentlichen Einfluss auf die

Ausbildung der intrazytoplasmatischen Einschlusskörper zu haben (Nishio et al., 1996).

Die Vorstellungen gehen auch hier in die Richtung, dass in der frühen Phase des

Vermehrungszyklus die N-Termini der Nukleoproteine mit denen der P-Proteine

interagieren, um das N bzw. NP somit zunächst in Lösung zu halten. Während der

Replikation der genomischen RNA könnte diese mit der N-terminalen N- bzw. NP-

Bindungsstelle auf dem P-Protein konkurrieren, was eine Abdissoziation des P-

Proteins zur Folge hätte (Hudson et al., 1986).

Nach der Verpackung replizierter genomischer RNA, könnte das N bzw. NP mit dem C-

Terminus der P-Proteine bzw. des VP35 in Interaktion treten und so die Morphogenese

der Nukleokapsidkomplexe bzw. neuer Viren iniziieren (Fu et al., 1994; Hudson et al.,

1986): Diese Beobachtungen legen nahe, dass die verschiedenen N- bzw. NP-

Bindungsstellen der P-Proteine in unterschiedliche und zeitlich versetzte Interaktionen

5 Diskussion 93

involviert sein könnten. Würden die P-Proteine nicht über ihren C-Terminus mit dem

Nukleoprotein interagieren, so wäre eine Rekrutierung der P-Proteine in neue

Nukleokapsid-komplexe eher unwahrscheinlich (Fu et al., 1994).

Obwohl gezeigt werden konnte, dass die Homooligomerisierung des MARV VP35

keine Rolle bei der Komplexbildung mit dem NP spielt, scheinen die Coiled-Coil-

Strukturen beider Proteine, jedoch in einer gewissen Abhängigkeit zu stehen. Das NP

verfügt über zwei Coiled-Coil-Strukturen, wobei die erste ausschlaggebend für die

Homooligomerisierung des Proteins zu sein scheint, da nach Deletion dieser Domäne,

das NP nicht mehr in der Lage war, in den typischen Einschlusskörpern zu

assemblieren (Di Carlo, 2005). Überraschenderweise wurde durch die Koexpression

mit VP35 die NP-Mutante so moduliert, dass die Ausbildung der intrazyto-

plasmatischen Einschlusskörper rekonstituiert werden konnte. Im Gegensatz dazu

konnte eine VP35-Substitutionsmutante mit einem zerstörten Coiled-Coil-Motiv die

Morphologie der Einschlusskörper nicht wieder herstellen. Beide Proteine blieben

homogen verteilt, und es gab auf Grund des Verlustes der intrazytoplasmatischen

Einschlusskörper keine Indikation einer Interaktion. Da aber zusätzlich ein zweiter

Phänotyp auftrat, in denen beide Proteine in kleinen, über das gesamte Zytoplasma

verteilten Aggregaten kolokalisierten, wird davon ausgegangen, dass das NP und das

VP35 ebenfalls in ihren monomeren Formen miteinander interagieren. Diese

Untersuchungen in Bezug auf die Interaktion von NP und VP35 legen nahe, dass für

die Ausbildung der intrazytoplasmatischen Einschlusskörper, die die Reife- und

Morphogenesezentren neuer Nukleokapsidkomplexe repräsentieren, in beiden

Proteinen intakte Coiled-Coil-Strukturen vorhanden sein müssen. Ferner lassen diese

Ergebnisse vermuten, dass die niedermolekularen Formen beider Proteine miteinander

interagieren können und als intermediäre Komplexe zusätzlich andere, bislang

unbekannte Funktionen während der Replikation des MARV wahrnehmen können.

Stöchiometrie der Homooligomere des Marburg-Virus VP35

Über den exakten Oligomerisierungsstatus der P-Proteine der Viren der Ordnung der

Mononegavirales wird seit längerem kontrovers diskutiert. In einer Reihe von

Untersuchungen von den Vertretern der Familie der Rhabdoviridae bis hin zu den

Paramyxoviridae wurden die P-Proteine als Mono-, Di-, Tri- bzw. Tetramere

nachgewiesen (Chattopadhyay et al., 1997; Gao et al., 1996; Gao and Lenard, 1995;

Rahaman et al., 2004; Tabouriech et al., 2000a; b). Für das P-Protein des RPV wurde

ein tetramerer Oligomerisierungsstatus gezeigt (Rahaman et al., 2004). Obwohl in

früheren Arbeiten angedeutet wurde, dass das Sendai-Virus P-Protein als Trimer

vorliegt, konnte mit Hilfe neuerer kristallographischer Analysen ebenfalls ein Tetramer

identifiziert werden (Tabouriech et al., 2000a; b). Obgleich die P-Proteine der Familie

5 Diskussion 94

der Rhabdoviridae als Trimere nachgewiesen wurden, konnte eine Tetramerisierung

nicht ausgeschlossen werden (Gao et al., 1996; Gao and Lenard, 1995; Gigant et al.,

2000). Tetramere konnten in dieser Arbeit ebenfalls für das VP35 nachgewiesen

werden. Diese Daten lassen darauf schließen, dass sowohl die P-Proteine als auch

das VP35 als Tetramere vorkommen können.

Multifunktionalität des VP35 des Marburg-Virus

Zusammenfassend repräsentiert das VP35 eine zentrale Komponente im

Vermehrungszyklus des MARV, wobei es durch die Interaktion mit den anderen

Nukleokapsidproteinen des MARV verschiedene Funktionen ausüben kann. Zum einen

konnte gezeigt werden, dass das VP35 in der Lage ist, Homooligomere auszubilden.

Diese homooligomeren Formen des VP35 sind notwenig für die Interaktion mit dem L-

Protein, welches die katalytische Untereinheit des MARV-Polymerasekomplexes

verkörpert. Die Homooligomerisierung des VP35 ist somit essentiell für die Synthese

der viralen RNA. Zum anderen war die Homooligomerisierung des VP35 für die

Komplexbildung mit dem NP nicht notwendig (Möller et al., 2005).

Die Morphogenese von Nachkommenviren beginnt mit der Assemblierung neuer

Nukleokapsidkomplexe, die in zwei Schritten erfolgt. Zunächst wird die neu

synthetisierte genomische RNA durch das NP verpackt. Bis zu diesem Prozess wird

das NP wahrscheinlich durch die Ausbildung eines NP0-VP35-Komplexes in Lösung

gehalten, wobei dafür der N-Terminus des VP35 eine wesentliche Rolle zu spielen

scheint. Ob das VP35 innerhalb dieses Komplexes als Homooligomer vorliegt, muss in

weiteren Experimenten geklärt werden. Nach der Verpackung der viralen RNA wird die

Ausbildung reifer Nukleokapsidkomplexe durch die Anlagerung der Nukleokapsid-

proteine VP35, L, und VP30 vervollständigt. Die Interaktion des VP35 mit Nukleo-

kapsid-assoziertem NP wird dabei möglicherweise durch den C-Terminus des VP35

geregelt. Sowohl bei der Homooligomerisierung des NP als auch des VP35 spielen

vorhergesagte Coiled-Coil-Strukturen eine entscheidende Rolle.

Das VP35 ist nicht nur wichtig für die Vermehrung der viralen RNA und die Morpho-

genese neuer Nukleokapsidkomplexe, sondern fungiert im Rahmen einer MARV-

Infektion als Typ I Interferonantagonist und schwächt somit die unspezifischen

zellulären Abwehrmechanismen gegen eine Virusinfektion (Basler et al., 2000; 2003;

persönliche Mitteilung). Für das VP35 des EBOV konnte gezeigt werden, dass dieses

für die Inhibition der Interferonsignalkaskade als Homooligomer vorliegen muss (Reid

et al., 2005). Das MARV enthält mit 19,1 Kilobasen eine sehr beschränkte genetische

Information, die lediglich für sieben Proteine kodiert. Damit sich die Viren in der

infizierten Zelle erfolgreich vermehren können, muss diese genetische Information

optimal genutzt werden. Durch die Interaktion mit unterschiedlichen Partnern können

5 Diskussion 95

von den einzelnen viralen Proteinen möglicherweise mehrere Funktionen ausgeführt

werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das MARV VP35 in

verschiedenen homooligomeren Formen an der Ausbildung von diversen Protein-

Protein-Komplexen mit den anderen Nukleokapsidproteinen beteiligt ist und somit

verschiedene Funktionen im Vermehrungszyklus des MARV wahrnehmen kann.

6 Zusammenfassung 96

6 Zusammenfassung

Das Marburg-Virus verursacht eine fieberhafte hämorrhagische Erkrankung bei

menschlichen und nichtmenschlichen Primaten, die mit hohen Letalitätsraten einher-

geht. Taxonomisch bildet das Marburg-Virus (MARV) zusammen mit dem Ebola-Virus

(EBOV) die Familie der Filoviridae. Die Virionen sind aus einem Nukleokapsidkomplex,

der über eine Proteinmatrix mit der Virushülle verbunden ist, aufgebaut. Der Nukleo-

kapsidkomplex besteht aus der viralen RNA sowie den vier Nukleokapsidproteinen NP,

VP35, VP30 und L, die untereinander durch verschiedene Protein-Protein-Interaktionen

verbunden sind. Der Komplex aus VP35 und dem L-Protein fungiert als virale RNA-

abhängige RNA Polymerase, wobei L den katalytischen Teil des Enzyms darstellt. In

der vorliegenden Arbeit wurde die Homooligomerisierung des Polymerasekofaktors

VP35 des MARV hinsichtlich ihrer Funktion für die Synthese der viralen RNA und die

Morphogenese neuer Nukleokapsidkomplexe sowie die Interaktion des VP35 mit dem

NP untersucht.

Die Homooligomerisierung des MARV VP35 wird über eine Coiled-Coil-Struktur im N-

Terminus des Proteins vermittelt, die im Bereich der Aminosäuren 70 bis 120 lokalisiert

ist. Zwei Leucinreste an den Positionen 90 und 104 waren ausschlaggebend für die

Stabilität der Coiled-Coil-Struktur und somit für die Homooligomerisierung des VP35.

Ferner konnte gezeigt werden, dass das Coiled-Coil-Motiv des VP35 ausreichend war,

um die Protein-Protein-Interaktion zu vermitteln. Die Homooligomerisierung des VP35

bildete die Voraussetzung für die Interaktion mit dem L-Protein und die Ausbildung

eines funktionellen Polymerasekomplexes. Im Gegensatz dazu schien die Homooligo-

merisierung des VP35 für die Bindung an das NP, der strukturgebenden Komponente

des Nukleokapsidkomplexes, nicht notwendig zu sein. Über die Interaktion des NP mit

dem N-Terminus des VP35 könnte das NP durch das VP35 in Lösung gehalten und

während der Replikation der viralen RNA als Substrat für deren Verpackung zur

Verfügung gestellt werden. Eine weitere NP-Bindungsstelle auf dem C-Terminus des

VP35 scheint eine wichtige Rolle beim Zusammenbau neuer Nukleokapsidkomplexe zu

spielen. Die Integrität der Coiled-Coil-Strukturen des VP35 und des NP hatte einen

wesentlichen Einfluss auf die Ausbildung und die Struktur der intrazytoplasmatischen

Einschlusskörper, die die Reifezentren neuer Nukleokapsidkomplexe darstellen.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Homooligomerisierung des MARV

VP35 essentiell für dessen Interaktion mit dem L und für die virale Transkription und

Replikation ist. Für die direkte Interaktion von VP35 mit NP scheint die Homo-

oligomerisierung des VP35 keine Rolle zu spielen. Es zeichnet sich allerdings ab, dass

für die Entstehung von funktionellen Nukleokapsiden die Homooligomerisierung des

VP35 notwendig ist.


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8 Abbildung- und Tabellenverzeichnis 108

8 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildungen:

Abbildung 1 Taxonomie der Filoviren. 1

Abbildung 2 Struktur des Marburg-Virus. 7

Abbildung 3 Genomstruktur des Marburg-Virus. 8

Abbildung 4 Prinzip einer PCR. 31

Abbildung 5 Einführung von Deletionen mittels PCR. 32

Abbildung 6 Immunpräzipitationsanalyse des VP35Flag und VP35 nach

Einzel- und Koexpression aus Huh7-Zellen.

55

Abbildung 7 Schematische Darstellung des VP35 und der untersuchten

VP35-Deletionsmutanten.

55

Abbildung 8 Koimmunpräzipitationsanalyse von VP35Flag und der VP35-

Deletionsmutante VP3570-329.

56

Abbildung 9

Graphische Darstellung der potentiellen Coiled-Coil-Domäne

und der Computeranalyse der Aminosäuresequenzen des

VP35 und der VP35-Substitutionsmutanten

mit dem Programm COILS 2.2.

57

Abbildung 10 Koimmunpräzipitationsanalyse von VP35 und den

VP35-Substitutionsmutanten.

59

Abbildung 11 Übertragung der MARV VP35 Coiled-Coil-Domäne auf ein

monomeres Reporterprotein.

60

Abbildung 12 Titration von VP35 und der VP35-Substitutionsmutanten in

dem MARV-spezifischen Minigenomsystem.

63

Abbildung 13 Analyse der Transkriptions- und Replikationsaktivität des

VP35 sowie der VP35-Substitutionsmutanten.

65

Abbildung 14 Schematische Darstellung der Interaktion von LFlag und VP35

und der untersuchten VP35-Deletionsmutanten.

66

Abbildung 15 Koimmunpräzipitationsanalyse von LFlag und der VP35-

Deletionsmutante VP3570-329.

67


Abbildung 16 Koimmunpräzipitationsanalyse von LFlag mit VP35 bzw. der

VP35-Substitutionsmutanten.

68

Abbildung 17

Schematische Darstellung des experimentellen Ansatzes zur

Hemmung der MARV-Transkription durch gemischte VP35-

Oligomere.

69

Abbildung 18

Analyse der Hemmung der MARV-spezifischen

Transkriptionsaktivität durch Ausbildung gemischter VP35-

Oligomere.

71

Abbildung 19 Immunfluoreszenzanalyse der Einzelexpression von NP. 73

Abbildung 20

Immunfluoreszenzanalyse des VP35Flag und der Flag-

markierten VP35-Substitutionsmutanten nach Einzel- und

Koexpression mit NP.

74

Abbildung 21

Koimmunpräzipitationsanalyse von NP und VP35Flag sowie der

VP35-Substitutionsmutante L90/104AFlag nach Kotransfektion

aus Huh7-Zellen.

75

Abbildung 22

Schematische Darstellung der Interaktion von NP und

VP35Flag und der untersuchten Flag-markierten VP35-

Deletionsmutanten.

76

Abbildung 23 Koimmunfluoreszenzanalyse der VP35-Deletionsmutante

VP351-122Flag nach Einzel- und Koexpression mit NP.

78

Abbildung 24 Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Deletionsmutante

NP∆C1 sowie des VP35Flag nach Einzel- und Koexpression.

79

Abbildung 25

Koimmunfluoreszenzanalyse der NP-Deletionsmutante

NP∆C1 nach Koexpression mit der Flag-markierten VP35-

Substitutionsmutante L90/104AFlag.

80

Abbildung 26 Analyse des Oligomerisierungsgrades des VP35 im MARV-

Partikel.

82

Abbildung 27

Analyse des Oligomerisierungsgrades der Flag-markierten

VP35-Substitutionsmutante VP351-122Flag nach rekombinanter

Expression und Quervernetzung.

83

Abbildung 28

Analyse des Oligomerisierungsgrades der Flag-markierten

VP35-Substitutionsmutante VP351-122mutFlag nach

rekombinanter Expression und Quervernetzung.

84


Tabellen:

Tabelle 1 Ausbrüche von Filovirusinfektionen. 2

Tabelle 2 Eingesetzte DNA-Oligonukleotide. 26

Tabelle 3 Für Klonierungen verwendete Matrizen und Oligonukleotide. 28


9 Abkürzungsverzeichnis

Die Abkürzungen für SI-Einheiten, Aminosäuren und Nukleotide entsprechen den

international verbindlichen Normen. Die Abkürzungen der chemischen Substanzen

wurden im Materialteil aufgeführt.

α anti AK Antikörper AS Aminosäure ASGP-R Asialoglykoproteinrezeptor bp Basenpaare CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase CDC Centers for Disease Control (Atlanta/USA) CEBOV Ivory Coast Ebola-Virus C-Terminus Carboxyterminus d (bei dH2O) deionisiert ddNTP 2’3’ -Didesoxynukleosidtriphosphat def deficient DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP 2’ -Desoxynukleosidtriphosphat DC-SIGN “dendritic cell-specific intercellular adhesion

molecule-grabbing nonintegrin” DC-SIGNR “dendritic cell-specific intercellular adhesion

molecule-grabbing nonintegrin related protein” EBOV Ebola-Virus FCS fetales Kälberserum FR-alpha Folatreszeptor alpha FITC Fluorescein-Isothiocyanat Isomer 1 GP Glykoprotein h Stunden hMGL “human macrophage galactose- and N-

acetylgalactosamine-specific C-type lectin” hPIV humanes Parainfluenzavirus

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IFN Interferon ISRE “interferon-stimulated response element“ kb Kilobasen kDa Kilodalton KoIP Koimmunpräzipitation L-Protein Large-Protein (Polymerase) LSECtin “liver and lymph node sinusoidal endothelial cell C-

type lectin”


MARV Marburg-Virus min Minuten MG Molekulargewicht Mock Scheininfektion moi “multiplicity of infection“ MPS monozytäres phagozytisches System mRNA messenger RNA MVB “multi vesicular bodies“ = multivesikuläre StrukturenN/NP Nukleoprotein

N0/NP0 lösliches Nukleoprotein Nedd4 “neuronal precursor cell-expressed developmentally

down-regulated 4” N-Terminus Aminoterminus OD Optische Dichte ORF offener Leserahmen P Phosphoprotein

POD Peroxidase P/S Penicillin/Streptomycin PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCR Polymerase-Kettenreaktion Q L-Glutamin RNA Ribonukleinsäure rNAPc2 “recombinant nematode anticoagulant protein c2“ REBOV Reston Ebola-Virus

RSV respiratorisches Syncytialvirus

RT Raumtemperatur SEBOV Sudan Ebola-Virus sec Sekunden TGN Trans-Golgi-Netzwerk TNF α Tumor Nekrose Faktor α TSG101 “tumor susceptibilty gene101“ U “unit“ = Einheit ÜKR Überkopfrotierer UpM Umdrehungen pro Minute VLP “virus-like particles” = Virus-ähnliche Partikel VP Virusprotein vRNA virale RNA VSV vesikuläres Stomatitis-Virus VT Volumenteil WHO World Health Organisation w/v weight per volume ZEBOV Zaire Ebola-Virus


10 Veröffentlichungen, Vorträge und Posterpräsentationen

Veröffentlichungen

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurden folgende Publikationen erstellt:

Homo-Oligomerization of Marburgvirus VP35 is essential for its function in replication and transcription Möller, P., N. Pariente, H. D. Klenk, and S. Becker J Virol. 2005 Dec; 79(23): 14876-86

Weitere Publikationen während der Dissertation:

Effect of the zinc finger antiviral protein on filovirus replication Müller, S. a, P. Möller a, M. J. Bick, S. Becker, S. Günther, and B. M. Kümmerer ª both authors contributed equally to this work (in Vorbereitung) VP24 of Marburg virus influences the formation of infectious particles Bamberg, S., L. Kolesnikova, P. Möller, H. D. Klenk, and S. Becker J Virol. 2005 Nov; 79(21): 13421-33 LSECtin interacts with filovirus glycoproteins and the spike protein of SARS coronavirus Gramberg, S., H. Hofmann, P. Möller, P. F. Lalor, A. Marzi, M. Geier, M. Krumbiegel., T. Winkler, F. Kirchhoff., D. H. Adams,. S. Becker, J. Münch, and S. Pöhlmann Virology 2005 Sep; 43(2): 224-236 Inhibition of Marburgvirus Protein Expression and Viral Release by RNAi Fowler, T. ª, S. Bamberg ª, P. Möller, T. F. Meyer, S. Becker, and T. Rudel ª both authors contributed equally to this work J Gen Virol. 2005 Apr; 86(6): 1181-8 DC-SIGN and DC-SIGNR interact with the glycoprotein of Marburg virus and the S protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus Marzi, A. ª, Gramberg, T. ª, Simmons, G. ª, P. Möller, A. J. Rennekamp, M. Krumbiegel, M. Geier, J. Eisemann, N. Turza, B. Saunier, A. Steinkasserer, S. Becker, P. Bates, H. Hofmann, and S. Pöhlmann J Virol. 2004 Nov;78(21):12090-5 ª authors contributed equally to this work


Properties of replication-competent vesicular stomatitis virus vectors expressing glycoproteins of filoviruses and arenaviruses Garbutt, M., R. Liebscher, V. Wahl-Jensen, S. Jones, P. Möller, R. Wagner, V. Volchkov, H. D. Klenk, H. Feldmann, and U. Ströher J Virol. 2004 May;78(10):5458-65 Production of monoclonal antibodies and development of an antigen capture ELISA directed against the envelope glycoprotein of Ebola virus Lucht, A., R. Grunow, C. Otterbein, P. Möller, H. Feldmann, and S. Becker Med Microbiol Immunol (Berl). 2004 Nov;193(4):181-7 Development, characterization and use of monoclonal VP40 antibodies for the detection of Ebola virus Lucht, A., R. Grunow, P. Möller, H. Feldmann, and S. Becker J Virol Methods. 2003 Jul;111(1):21-8

Vorträge:

Marburg-Virus-Ausbruch in Angola, 2005 – Ein Erfahrungsbericht Möller P. b

Virologisch-Parasitologisches Seminar, Institut für Virologie Marburg, 2005 VP24 of Marburg Virus is essential for particle formation Bamberg S. , L. Kolesnikova, P. Möller, H. D. Klenk, and S. Becker b

International Union of Microbiological Sciences (IUMS), Virology Division, 2005 VP24 of Marburg Virus is essential for particle formation Bamberg S. b, L. Kolesnikova, P. Möller, H. D. Klenk, and S. Becker

Annual Meeting of the German Society of Virology, Hannover, Germany, 2005 LSECtin interacts with filovirus glycoproteins and the spike protein of SARS coronavirus Gramberg T. b, H. Hofmann, P. Möller, A. Marzi, M. Geier, M. Krumbiegel, T. Winkler, F. Kirchhoff, S. Becker, J. Münch, and S. Pöhlmann

Annual Meeting of the German Society of Virology, Hannover, Germany, 2005 Homo-Oligomerization of the polymerase cofactor VP35 is essential for transcription and replication of Marburg viral RNA Möller P., N. Pariente, and S. Becker b

Workshop on Replication and Cell Biology of Negative Strand Viruses, Evanston, USA, 2004


Homo-Oligomerization of the polymerase cofactor VP35 is essential for transcription and replication of Marburg viral RNA Möller P. b, N. Pariente, and S. Becker

Annual Meeting of the German Society of Virology, Tübingen, Germany, 2004 Inhibition of Marburg virus protein expression and viral release by RNAi Bamberg S. b, T. Fowler, S. Becker, P. Möller, T. F. Meyer, and T. Rudel

Annual Meeting of the German Society of Virology, Tübingen, Germany, 2004 Functional Characterization of the Interactions of Marburg virus nucleocapsid proteins Möller P. b, H. D. Klenk, and S. Becker

SFB 593 convention, Hirschegg, Austria, 2004 Characterization of interaction domains on the Marburg virus nucleocapsid protein VP35 Möller P., C. Rinne, U. Hofsäss, E. Mühlberger, and S. Becker b

Annual Meeting of the German Society of Virology, Erlangen, Germany, 2002 Filovirus-antibodies in autochtonous populations with and without contact to bats in the Republic of Guinea ter Meulen J., b K. Koulemou, L. Koivogu, H. Feldmann, P. Möller, and S. Becker

23rd African Health Sciences Congress, Makerere University, Kampala, Uganda, 2002

Development of an antigen capture Elisa for Ebola virus Lucht A. b, C. Bartling, P. Möller, H. Feldmann, S. Becker, and R. Grunow

ConVir – European Conference on Viral Diseases, Munich, Germany, 2002

Posterpräsentationen:

Homo-Oligomerization of the polymerase cofactor VP35 is essential for transcription and replication of Marburg viral RNA but not for interaction with the nucleoprotein

International Union of Microbiological Sciences (IUMS), virology Division, San Francisco, USA, 2005

SFB 593: International Symposium on Mechanisms of Cellular Compartmentalization, Marburg, Germany, 2005

Annual Meeting of the German Society of Virology, Hannover, Germany, 2005


Employment of RNAi to Reduce Marburg Virus Replication Fowler T., S. Bamberg, P. Möller, T. F. Meyer, S. Becker, and T. Rudel

ASM Biodefense Meeting, März 2004, Baltimore, USA Functional Characterization of the Oligomerization Domain of the Marburg virus nucleocapsid protein VP35 Möller P., N. Pariente, and S. Becker

Twelfth International Conference on Negative Strand Viruses, Pisa, Italy, 2003 Production of monoclonal antibodies to Ebola-Zaire virus Lucht A., C. Otterbein, P. Möller, H. Feldmann, S. Becker and R. Grunow

Symposium on Marburg and Ebola viruses, Marburg, Germany, 2000 a authors contributed equally to this work b presenting author

11 Curriculum Vitae 117

11 Curriculum Vitae

Persönliche Daten

Name: Peggy Möller

Anschrift: Am Kupfergraben 3, 35037 Marburg

Geburtsdatum: 27.01.1975

Geburtsort: Ilmenau

Schulausbildung

09/1981 – 08/1991 Polytechnische Oberschule Ilmenau

09/1991 – 08/1993 Staatliches Gymnasium „Am Lindenberg“ Ilmenau

Berufsausbildung

09/1993 – 06/1996 Medizinische Fachschule Erfurt, Ausbildung zur medizinisch-technischen Laboratoriumsassistentin

Berufstätigkeit

07/1996 – 09/1996 Pathologisches Institut am St. Johannisstift Paderborn, Anstellung als medizinisch-technische Laboratoriumsassistentin

Hochschulausbildung

10/1996 – 01/2002 Studium der Humanbiologie, Philipps-Universität Marburg Hauptfach: Virologie Nebenfächer: Molekularbiologie, Immunologie

10/1998 Vordiplom (Note: gut)

12/2000 Diplom-Prüfung (Note: sehr gut)

01/2001 – 01/2002 Diplomarbeit am Institut für Virologie,

Philipps-Universität Marburg Thema: „Charakterisierung von Interaktionsdomänen auf dem Marburg-Virus VP35“ (Note: sehr gut)

03/2002 – 12/2005 Promotion am Institut für Virologie,

Philipps-Universität Marburg Thema: „Die Rolle der Homooligomerisierung des Polymerasekofaktors VP35 im Vermehrungszyklus des Marburg-Virus“

Marburg, den 20.12.05

(Peggy Möller)

12 Verzeichnis der akademischen Lehrer 118

12 Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer an der Philipps-Universität Marburg waren die folgenden

Damen und Herren:

Arnold, Aumüller, Aurich, Becker, Besedovsky, Bestgen, Daut, Dobbelstein, Elsässer,

Feuser, Fruhstorfer, Garten, Grzeschik, Gudermann, Habermehl, Hartmann, Heeg,

Jungclas, Kaiser, Kern, Kirchner, Klenk, Koch, Körle, Koolman, Lammel, Lang, Lill,

Löffler, Lührmann, Maisner, Melsheimer, Mühlberger, Müller, Neumann, Niessing,

Radsak, Renkavitz-Pohl, Röhm, Schäfer, Schulz, Schwee, Seifart, Seitz, von Löw,

Tampe, Vedder, Voigt, Westermann.

13 Danksagung 119

13 Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. Hans-Dieter Klenk vom Institut für Virologie, dass er mir

dieses interessante und vielseitige Thema zur selbstständigen Bearbeitung überlassen

hat.

Für die hervorragende wissenschaftliche Betreuung bedanke ich mich besonders bei

Herrn PD. Dr. Stephan Becker, der mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite stand und

durch wertvolle Anregungen und Diskussionen einen erfolgreichen Abschluss dieser

Arbeit ermöglichte.

Außerdem danke ich dem Hessischen Ministerium für Wissenschaft und Kunst und der

Philipps-Universität Marburg für die Förderung meiner Arbeit durch ein Promotions-

stipendium für besonders qualifizierte wissenschaftliche Nachwuchskräfte.

Mein besonderer Dank gilt den Kollegen aus dem Labor G23: Dr. Sandra Bamberg,

Angelika Lander, Dr. Larissa Kolesnikova, Dr. Andrea Di Carlo, Daniel Voß, Bettina

Hartlieb, Thomas Hoenen, Eva Mittler, Jörg Wenigenrath, Stefanie Schinkel sowie allen

Praktikanten, die gemeinsam zu einer hervorragend kollegialen und fruchtbaren

Arbeitsatmosphäre beigetragen haben. Bei Dr. Nonia Pariente bedanke ich mich für die

erfolgreiche Mitarbeit an meinem Projekt.

Dr. Rüttger Ebendt, der leider verstorben ist, danke ich für seine unermüdliche Hilfe

und Unterstützung in Sachen Computer.

Allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des Institutes für Virologie, vor allem Frau PD

Dr. Elke Mühlberger, Michael Schümann und Constanze Möritz, danke ich für eine sehr

gute Zusammenarbeit und ein angenehmes Betriebsklima.

Mein größter Dank gilt meinen Eltern Georg und Luise Möller. Für ihre Liebe, ihr

Vertrauen und die großzügige materielle sowie ideelle Unterstützung während meines

gesamten Ausbildungsweges möchte ich mich an dieser Stelle von ganzem Herzen

bedanken. Sie haben mich fortwährend bestärkt und sind immer für mich da.

Insbesondere bedanke ich mich bei Mario Kühn, der mir in allen Situationen und

Entscheidungen den Rücken stärkt und mich stets in meinem Fortkommen unterstützt.

14 Ehrenwörtliche Erklärung 120

14 Ehrenwörtliche Erklärung

Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur

Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel:

„Die Rolle der Homooligomerisierung des Polymerasekofaktors VP35 im Vermehrungszyklus des Marburg-Virus“

im Medizinischen Zentrum für Hygiene und Infektionsbiologie unter Leitung von Prof.

Dr. Hans-Dieter Klenk mit Unterstützung durch PD Dr. Stephan Becker ohne sonstige

Hilfe selbst durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der

Dissertation angeführten Hilfsmittel benutzt habe.

Ich habe bisher an keinem in- und ausländischen Medizinischen Fachbereich ein

Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder eine

andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht (Kapitel 10).

Marburg, den 20.12.05

(Peggy Möller)

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