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Aus der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie

des Instituts für Hygiene und Mikribiologie der Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität-Bochum

Leiter: Prof. Dr. med. Sören G. Gatermann

Vergleich von fünf phänotypischen Methoden zur Detektion einer Penicillinase in

Staphylococcus aureus

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität-Bochum

vorgelegt von

Sarah Magdalena Lenga

aus Herne

2010

II

Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla

Referent: Prof. Dr. med. S. G. Gatermann

Co-Referent: PD Dr. med. W. Cullmann

Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2012

III

Für meine Eltern

und

Oma Dodo

IV

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .................................................................................................................. 1

1.1 Staphylococcus aureus als Spezies der Gattung Staphylococcus ..................... 1

1.2 Die Rolle als Krankheitserreger ........................................................................ 2

1.2.1 Durch S. aureus hervorgerufene Erkrankungen ....................................... 3

1.2.2 Die Bedeutung von S. aureus bei nosokomialen Infektionen ................... 4

1.3 Resistenz gegen Beta-Laktam-Antibiotika ....................................................... 4

1.3.1 Beschreibung der Wirkungsweise der Beta-Laktam-Antibiotika ............. 4

1.3.2 Zwei Resistenzmechanismen gegen Beta-Laktam-Antibiotika ................ 6

1.3.3 Eigenschaften von Beta-Laktamasen ........................................................ 7

1.3.4 Die Therapie der Infektionen mit S. aureus ............................................ 11

1.4 Ausbildung der Beta-Laktam-Resistenz ......................................................... 11

1.4.1 Regulation der Expression von Penicillinasen ........................................ 11

1.4.2 Zusammenspiel der Regulation von mecA und blaZ .............................. 12

1.5 Ziel dieser Doktorarbeit .................................................................................. 13

2 Material und Methoden ........................................................................................... 16

2.1 Material ........................................................................................................... 16

2.1.1 Chemikalien ............................................................................................ 16

2.1.2 Medien und Agar .................................................................................... 16

2.1.3 Puffer und Lösungen ............................................................................... 18

2.1.4 Antibiotika .............................................................................................. 19

2.1.5 Bakterienstämme .................................................................................... 20

2.1.6 Geräte ...................................................................................................... 20

2.2 Methoden ........................................................................................................ 21

2.2.1 Anzucht der Bakterien ............................................................................ 21

2.2.2 Identifikation von S. aureus .................................................................... 21

2.2.3 Überprüfung der Spezies als S. aureus ................................................... 22

2.2.4 Agardiffusions-Test ................................................................................ 23

V

2.2.5 Cloverleaf-Test ....................................................................................... 25

2.2.6 Nitrocefin-Test ........................................................................................ 26

2.2.7 Jod-Stärke-Test ....................................................................................... 26

2.2.8 Präparation der genomischen DNA ........................................................ 27

2.2.9 Präparation der genomischen DNA mit dem QiAmp-Kit ...................... 27

2.2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ......................................................... 27

2.2.11 Gel-Elektrophorese ................................................................................. 29

2.2.12 Fehlerquellen .......................................................................................... 29

3 Ergebnisse ............................................................................................................... 30

3.1 Auswertung der phänotypischen Tests ........................................................... 30

3.1.1 Phänotypische Tests zur Speziesüberprüfung ......................................... 30

3.1.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchung ........................................................ 30

3.1.3 Ergebnisse der phänotypischen Methoden zur Penicillinase-Detektion 31

3.1.4 Ergebnisse des Agardiffusions-Tests ...................................................... 32

3.1.5 Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ 34

4 Diskussion ............................................................................................................... 36

5 Zusammenfassung .................................................................................................. 41

VI

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Aufbau von Antibiotika ....................................................................................... 5

Abb. 2: Methicillin (Quelle: Wikipedia) ........................................................................... 7

Abb. 3: Regulation der Expression von Penicillinasen ................................................... 12

Abb. 4: scharf demarkierter Hemmhofrand .................................................................... 24

Abb. 5: unscharf demarkierter Hemmhofrand ................................................................ 24

Abb. 6: Positiver Cloverleaf-Test ................................................................................... 25

Abb. 7: blaZ PCR und SA 442 PCR positiv ................................................................... 31

Abb. 8: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Penicillin ........ 33

Abb. 9: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Mecillinam ..... 34

VII

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Wichtige toxinbedingte Erkrankungen ................................................................. 2

Tab. 2: Klassifikation der Beta-Laktamasen nach Bush ................................................... 8

Tab. 3: Einteilung der Penicillinasen von Staphylokokken ............................................ 10

Tab. 4: Primer der blaZ und SA 442-PCR ...................................................................... 28

Tab. 5: Sensitivität der phänotypischen Tests ................................................................ 32

Tab. 6: Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ ........... 35

VIII

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

bidest. bidestilliert

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

CNS Koagulasenegative Staphylokokken

DNA Desoyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

g Gramm

h Stunde

HIV Humanes Immundefizienz Virus

kDA Kilodalton

LB Luria-Bertani

M Molar

mg Milligramm

min Minute

MHK minimale Hemmkonzentration

ml Milliliter

mM Millimolar

mRNA messenger RNA

MRSA methicillinresistenter Staphylococcus aureus

PBP2a Penicillin-Bindungsprotein 2a

PCR Polymerasekettenreaktion

PVL Panton-Valentine

RNA Ribonukleinsäure

IX

rpm Umdrehung pro Minute

s Sekunde

SCV small colony variants

Tab. Tabelle

TMA Trehalose-Mannitol-Agar

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Units

z.B. zum Beispiel

1

1 Einleitung

1.1 Staphylococcus aureus als Spezies der Gattung Staphylococcus

Staphylokokken sind grampositive Kugelbakterien und wurden früher zur Familie der

Micrococceae gezählt. Heute wird S.aureus in der gängigen Systematik wie folgt

eingeordnet: Abteilung-Firmicutes, Klasse-Bacilli, Ordnung-Bacillales, Familie-

Staphylococcaceae, Gattung-Staphylococcus, Art-Staphylococcus aureus [29]. Sie

ordnen sich in Haufen bzw. Trauben an und ihre Größe beträgt ca. 0,5-1,5 µm im

Durchmesser. Staphylokkoken sind unbeweglich, bilden keine Sporen und können

unbekapselt sein. Die Bakterien besitzen die Fähigkeit, Katalase zu bilden und sie

vermehren sich fakultativ anaerob.

Zu der Gattung Staphylococcus gehören mehr als 32 Spezies, von denen 16 Subspezies

in nennenswerter Häufigkeit in humanen mikrobiellen Proben gefunden wurden.

Aufgrund der Bildung freier Koagulase kann S. aureus von den übrigen,

koagulasenegativen Staphylokokken (KNS) differenziert werden und gilt als

wesentlicher humanpathogener Erreger unter den Staphylokokken. Seine Kolonien

weisen eine goldgelbe Farbe auf Blutagar und häufig einen hämolytischen Saum auf

[29].

Die Hauptvertreter der koagulasenegativen Staphylokokken sind S. epidermidis, S.

haemolyticus, S. hominis subsp. hominis, S.lugdunensis und S. saprophyticus. Letzterer

ist der zweithäufigste Erreger von Harnwegsinfektionen der jungen Frau [29]. S.

epidermidis, der zur physiologischen Hautflora gehört, kann ebenso wie S. haemolyticus

und S. hominis subsp. hominis Infektionen von Plastikmaterialien (Endoplastitis)

hervorrufen.

2

1.2 Die Rolle als Krankheitserreger

Die durch S. aureus hervorgerufenen Krankheitsbilder lassen sich grob in zwei

Kategorien einteilen: Infektionen, bei denen sich der Erreger am Infektionsort befindet

(oberflächlich-eitrig oder tief-invasiv verlaufend), und toxinbedingte Syndrome, bei

denen das sezernierte S. aureus-Toxin für das infektiologische Geschehen

verantwortlich ist [29].

S. aureus besitzt eine Reihe von zellwandgebundenen Virulenzfaktoren, extrazellulären

Enzymen und Toxinen, die neben der Anwesenheit des Erregers für die Symptomatik

bei Infektionen verantwortlich sind.

Bei den toxinbedingten Erkrankungen (siehe Tabelle 2) treten die Erreger selbst meist

nicht am Ort der Symptomatik auf. Eine häufige Erkrankung stellt die staphylogene

Nahrungsmittelvergiftung durch die Enterotoxine A-E dar. Diese Enterotoxine werden

typischerweise von S. aureus gebildet, während sich die Bakterien in kontaminierten

Nahrungsmitteln vermehren. Da die Toxine hitzestabil sind, bleiben sie auch nach

Wiedererhitzen intakt. Nur die Toxine befinden sich in der aufgenommenen Nahrung,

nicht die Bakterien selber, weshalb die Dauer der Symptome wie Übelkeit, Erbrechen

und Diarrhoe durch die Ausscheidung der Toxine limitiert ist [29]. Weitere

toxinvermittelte, jedoch seltenere Krankheitsbilder sind das Staphylococcal scalded skin

syndrom (SSSS) und das Toxische-Schock-Syndrom (siehe Tabelle 1).

Tab. 1: Wichtige toxinbedingte Erkrankungen

Toxin Erkrankung

Enterotoxine A-E Lebensmittelintoxikation

Exfoliative Toxine A und B Exfoliative Dermatitis

Toxisches-Shock-Syndrom-Toxin (TSST) Toxisches Schock-Syndrom

3

Häufige lokalisierte Manifestationen einer Infektion mit Staphylokokken im ambulanten

Bereich sind umschriebene Abszesse, unter anderem in Form von Furunkeln und

Karbunkeln, aber auch Tonsillarabszesse. Seltener sind im ambulanten Bereich

diagnostizierte Pneumonien, die durch S. aureus hervorgerufen werden.

1.2.1 Durch S. aureus hervorgerufene Erkrankungen

Das Spektrum der durch S. aureus hervorgerufenen Erkrankungen reicht von

superfiziellen Haut- und Weichteilinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen

Erkrankungen wie Pneumonien, endovaskulären Infektionen, Sepsis und tiefen

Gewebe- und Knocheninfektionen.

Einige Patientengruppen haben ein höheres Risiko sich mit S. aureus zu infizieren, z.B.

immungeschwächte Patienten (HIV-Infektionen), Diabetiker, Drogen- und

Alkoholabhängige und Patienten, die eine Hämo- oder Peritonealdialyse benötigen. Der

wichtigste Risikofaktor für eine Infektion mit S. aureus ist jedoch die chronische

Besiedlung der Haut.

Die Erkrankungen, für die S. aureus verantwortlich ist, kann man u.a. in lokalisierte

(z.B. Follikulitis, Erysipel, postoperative Wundinfektionen) und generalisierte (z.B.

Sepsis, Endokarditis) Erkrankungen einteilen [29].

Zu den generalisierten von S. aureus hervorgerufenen Erkrankungen gehört die

Staphylokokken-Sepsis. Eine der schwersten Komplikationen ist die infektiöse

Endokarditis einer nativen oder künstlichen Herzklappe [29]. Sie kann zur

Klappendestruktion, peripheren septischen Embolie, Myokarditis und Schock trotz

adäquater antibiotischer Therapie führen. Zudem kann S. aureus Pneumonien

verursachen. Für zehn Prozent der ambulant erworbenen Pneumonien und für 20-30%

der nosokomialen Pneumonien ist S. aureus verantwortlich [18].

Eine weitere Erkrankung, bei der S. aureus der Haupterreger ist, ist die Osteomyelitis.

In 50-70% der Fälle wird sie durch S. aureus hervorgerufen [2, 3, 27, 42]. Seit

Einführung einer effizienten antibiotischen Therapie ist ihre Inzidenz gesunken und die

Letalität liegt beinahe bei null Prozent.

4

1.2.2 Die Bedeutung von S. aureus bei nosokomialen Infektionen

Nosokomiale Infektionen sind solche, die bei hospitalisierten Patienten auftreten.

Innerhalb eines Krankenhauses treten solche Infektionen häufiger auf Intensivstationen

als auf peripheren Stationen auf. S. aureus ist neben koagulasenegativen

Staphylokokken der häufigste Erreger von nosokomial erworbenen Bakteriämien, der

häufigste Erreger von chirurgischen Wundinfektionen (28%) [11] und nosokomialen

Pneumonien (28%) [18]. Die Letalität von invasiven S. aureus Infektionen liegt

zwischen 19% und 34% [25, 26, 31, 32]. Die 30-Tages-Sterblichkeit ist insbesondere

bei Infektionen des unteren Respirationstraktes, bei Diabetes mellitus, Alter über 65

Jahre, einem nicht eradizierten Fokus, einem septischen Schock oder einer nicht

ausreichende Gabe eines penicillinasefesten Penicillins erhöht [31].

Ein wichtiger Risikofaktor ist die chronische Besiedlung der Haut mit S. aureus. Die

S. aureus-Trägerrate variiert in der gesunden Bevölkerung von zehn bis zu 40% [2, 8,

25], wobei die Nasenvorhöfe das primäre Reservoir darstellen. Aber auch an anderen

Körperstellen wie in der Axilla, der Leistenregion und im Rachen kann sich eine

Keimbesiedlung befinden. Oft ist das nasale Erregerreservoir die wichtigste

Infektionsquelle; in bis zu 80% ist der Stamm aus den Nasenvorhöfen für eine

Bakteriämie verantwortlich [9].

1.3 Resistenz gegen Beta-Laktam-Antibiotika

1.3.1 Beschreibung der Wirkungsweise der Beta-Laktam-Antibiotika

Zu den Beta-Laktam-Antibiotika zählen die Penicilline und Penicillinderivate, die

Cephalosporine, Monobactame und Carbapeneme.

Die Beta-Laktam-Antibiotika zeichnen sich alle durch einen Beta-Laktamring aus, der

ein Strukturanalogon zur D-Alanyl-D-Alanin Endgruppe des Peptidoglykans ist

(Abb.1). Sie hemmen die Zellwandsynthese der Bakterien, indem sie die

Quervernetzung von Peptidoglykan, einem Bestandteil der Zellwand grampositiver

Bakterien, verhindern. Der Beta-Laktamring der Beta-Laktame wird von dem

bakteriellen Enzym D-Alanin-Transpeptidase gebunden, so dass dieses nicht mehr für

den bakteriellen Zellwandaufbau zur Verfügung steht. Somit wirkt Penicillin bakterizid

5

auf proliferierende Keime, da Fehler in der Zellwandsynthese auftreten, die zu Lyse und

Tod der Bakterienzelle führen.

Abb. 1: Aufbau von Antibiotika

von oben nach unten: a) Beta-Laktamring, b) Penicillin, c) Cephalonsporin [47]

Penicillin G war das erste Penicillin, das therapeutisch zur Anwendung kam. Es hat

auch heute noch eine gute Wirksamkeit gegen viele Streptokokken, C. diphtheriae,

Clostridium perfringens, Treponema pallidum und Meningokokken. Die meisten

Staphylokokkenstämme sind mittlerweile aufgrund der Bildung von Beta-Laktamasen

oder veränderten Penicillinbindungsproteinen resistent.

Penicilline mit einem breiteren Wirkungsspektrum sind die Aminopenicilline

(Ampicillin, Amoxicillin) und Acylaminopenicilline (Piperacillin, Mezlocillin), die

prinzipiell auch gegen gramnegative Bakterien (H. influenza, E. coli, Salmonellen)

wirken können. Aminopenicilline und Acylaminopenicilline werden oft als fixe

Kombination mit Beta-Laktamase-Inhibitoren gegeben (Clavulansäure, Sulbactam,

Tazobactam), die die Beta-Laktamasen der Staphylokokken, und die einiger anderer

Bakterien, hemmen und selbst keine ausreichende antibakterielle Wirkung besitzen.

Ein weiteres Penicillinderivat ist Mecillinam, das ein Penicillingrundgerüst besitzt,

jedoch kein Acylierungsprodukt der 6-Aminopenicillinsäure ist. Es wirkt vor allem

gegen gramnegative Bakterien und wurde in der Vergangenheit v.a. bei

Harnwegsinfektionen eingesetzt [43]. Aufgrund der begrenzten Wirksamkeit (oft nur in

6

Kombination mit Ampicillin verwendet) und der Instabilität gegenüber Beta-

Laktamasen erreichte Mecillinam keine große Bedeutung in der klinischen Therapie

von Infektionserkrankungen.

Da die bisher genannten Penicillinderivate nicht bei Staphylokokken mit einer Beta-

Laktamase wirken, wurden Beta-Laktamase-resistente Penicilline wie Oxacillin,

Dicloxacillin oder Flucloxacillin entwickelt. Sonst gibt es keine anderen Vorteile

gegenüber Penicillin G, da sie weniger wirksam gegenüber anderen Bakterien sind.

Cephalosporine besitzen ebenfalls einen Beta-Laktamring, wirken wie die Penicilline,

und sind stabil gegenüber Penicillinasen von Staphylokokken. Die Einteilung erfolgt

nach Generationen gemäß der zeitlichen Markteinführung. Gleichzeitig spiegelt sie eine

zunehmende Spektrumserweiterung gegen gramnegative Stäbchenbakterien wieder.

Zu der ersten Generation, die gut gegen grampositive Bakterien wirksam ist, aber

Lücken im gramnegativen Bereich aufweist, gehört u.a. Cefazolin.

Cefuroxim ist ein 2. Generations-Cephalosporin mit einem erweiterten Spektrum gegen

gramnegative Stäbchen.

Breitspektrumscephalosporine gehören der dritten Generation an (Ceftriaxon,

Cefotaxim), die auch gegen Enterobakterien wirksam sind und eine Beta-

Laktamasestabilität aufweisen.

Die Carbapeneme (Imipenem) haben das breiteste Wirkungsspektrum aller Antibiotika

(fast alle grampositiven und –negativen Bakterien) und sind gegen sehr viele Beta-

Laktamasen stabil.

1.3.2 Zwei Resistenzmechanismen gegen Beta-Laktam-Antibiotika

Ein Mechanismus, über den die Penicillinresistenz vermittelt wird, ist die Produktion

einer Penicillinase. Penicillinasen von Staphylokokken sind sezernierte Enzyme, die

Penicillin G, Aminopenicilline und Acylaminopenicilline, nicht jedoch

Isoxazolylpenicilline wie Flucloxacillin und Cephalosporine inaktivieren, indem sie den

Beta-Laktam-Ring hydrolisieren. Schon kurz nach der Einführung des Penicillins als

Therapeutikum in der Mitte der 1940er Jahre tauchten die ersten Penicillinase

produzierenden S. aureus auf.

Der zweite Resistenzmechanismus basiert auf der Bildung eines zusätzlichen Penicillin-

Bindungs-Proteins, dem PBP2a bzw. PBP2´. Das PBP2a besitzt eine reduzierte Affinität

zu den Beta-Laktam-Antibiotika, so dass diese bei therapeutischer Dosis nicht mehr

7

binden. Es ist für eine breite Resistenz gegen alle derzeit zugelassenen Beta-Laktame

verantwortlich. Dieser Mechanismus liegt bei MRSA (= methicillin resistant

staphylococcus aureus) Stämmen vor. Namensgebend war dabei die Resistenz gegen

das heute nicht mehr eingesetzte penicillinasefeste Methicillin.

Abb. 2: Methicillin [48]

1.3.3 Eigenschaften von Beta-Laktamasen

Die Penicillinasen von S. aureus gehören zu den Beta-Laktamasen. Es gibt mittlerweile

hunderte von unterschiedlichen Beta-Laktamasen, die nach zwei Klassifikationen

eingeteilt werden.

Die erste Klassifikation beruht auf Bush et al. und unterscheidet nach dem bevorzugten

Substrat der Betalaktamasen und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Beta-Laktamase-

Inhibitoren (Tabelle 2) [28]. Das Problem bei dieser Einteilung ist, dass durch

Punktmutationen die Substratspezifität und die Empfindlichkeit gegenüber Beta-

Laktamase-Inhibitoren verändert werden kann und dadurch die Gruppenzugehörigkeit

nicht stabil ist.

Die zweite Möglichkeit beruht auf einer sequenzbasierten Einteilung nach Ambler [28].

Diese beinhaltet die Beta-Laktamaseklassen A bis D. Die vier Penicillinasen (A, B, C,

D) von S. aureus gehören der Klasse A nach Ambler an [49] und der Klasse 2 a nach

Bush [28].

Klasse A nach der Klassifikation von Ambler sind Serin-Beta-Laktamasen, die aus

mehreren Untergruppen nach der Klassifikation nach Bush bestehen (2a, 2b, 2be, 2br,

2c, 2e, 2f) und verschiedene Eigenschaften besitzen können. Das bevorzugte Substrat ist

Penicillin, verschiedene Untergruppen können aber auch zusätzlich eine gleiche oder

8

höhere Affinität zu anderen Substraten haben (z.B. 2be und 2e zu Cefotaxim).

Clavulansäure als Beta-Laktamase-Inhibitor inhibiert die Penicillinasen der Gruppe A,

wobei es auch Ausnahmen gibt (2br wird nicht inhibiert, 2c nur schwach).

Die Klasse B Betalaktamasen nach Ambler heißen auch Metallo-Beta-Laktamasen. In

der Klassifikation nach Bush gehört sie der Gruppe drei an und gute Substrate sind

Penicillin, Oxacillin, Carbonylpenicillin, Cefotaxim, Cephaloridin und Imipenem.

Clavulansäure inhibiert nicht.

Die Beta-Laktamasen der Klasse C gehören nach der Einteilung nach Bush der Gruppe

eins an und haben Cephaloridin als bevorzugtes Substrat. Diese Beta-Laktamasen

können durch Cloxacillin inhibiert werden.

Beta-Laktamasen der Klasse D haben als bevorzugtes Substrat Oxacillin, können aber

auch andere Beta-Laktame hydrolysieren. Sie gehören unterschiedlichen funktionellen

Gruppen nach Bush an und werden durch Clavulansäure kaum inhibiert.

Tab. 2: Klassifikation der Beta-Laktamasen nach Bush

Bush-

Jacoby-

Medeiros

Gruppe

Molekulare

Klasse

Bevorzugte

Substrate

Inhibiert durch:

Clavulansäure/EDTA

Beispiele für

Enzyme

1 C Cephalosporine - + AmpC Beta-

Laktamase

2a A Penicillin - + Penicillinasen

grampos.

Bakterien

2b A Penicillin,

Cephalosporine

+ - TEM-1, TEM-

2, SHV-1

2be A Penicillin,

Cephalosporine,

Monobaktame

+ - TEM-3 bis

TEM-26, SHV-

2 bis SHV-6

2br A Penicilline +/- - TEM-30 bis

TEM-36, TCR-

1

9

2c A Penicilline,

Carbenicillin

+ - PSE-1, PSE-3,

PSE-4

2d D Penicilline,

Cloxacillin

+/- - OXA-1 bis

OXA-11, PSE-2

2e A Cephalosporine + - Cephalosporina-

sen P. vulgaris

2f A Penicilline,

Cephalosporine

Carbapeneme

+ - NMC-A, Sme-1

3 B meisten Beta-

Laktame, inkl.

Carbapeneme

- + L1, CcrA

4 NDb Penicillin - ? Penicillinase P.

cepacia

Übernommen von K. Bush, G.A. Jacoby und A.A. Medeiros (1995). Antimicrob. Agents Chemother. 39:

1211-1233

Die Penicillinasen von Staphylokokken werden in die Typen A, B, C und D eingeteilt.

Diese Terminologie kann verwirrend sein, denn sie alle gehören zu den Beta-

Laktamasen des Klasse A nach Ambler und werden dementsprechend durch

Clavulansäure gehemmt.

Diese Einteilung der Penicillinasen basiert auf der unterschiedlichen Fähigkeit der vier

Typen zur Hydrolyse verschiedener Antibiotika (Tab. 3), sowie unterschiedlichen

kinetischen Eigenschaften. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die

Penicillinasen zu typisieren. Richmond klassifizierte die Typen A-D immunologisch

mittels Antiseren gegen die extrazelluläre Penicillinase [39]. Die Bestimmung des

isoelektrischen Punktes ist bei Staphylokokken unbefriedigend, da sie um den

isoelektrischen Punkt wenig löslich sind [49]. Eine aktuelle Klassifikation beruht auf

Unterschieden in der Kinetik und Unterschieden in der Fähigkeit zur Hydrolyse von

Penicillin und Cephalosporinen [24 ,49].

10

Die Staphylokokken-Penicillinasen vom Typ A und C kommen in den USA und Europa

vor, während man Typ B hauptsächlich in Isolaten aus Skandinavien und den USA

findet. Typ D ist überall selten vorzufinden [28].

Tab. 3: Einteilung der Penicillinasen von Staphylokokken

Fähigkeit zur

Hydrolyse

Antibiotikum Penicillinase

Typ A

Penicillinase

Typ B

Penicillinase

Typ C

Penicillinase

Typ D

Cephaloridine - + + -

Cefazolin + - - (+)

Cephapirin + - + -

Cephalotin - (-) (-) -

Cefamandole - + + -

Cefuroxime - / / /

Nitrocefin + - - +

Ampicillin - + + -

Penicillin G (+) + + -

+ gutes Substrat; (+) Hydrolyse möglich; (-) kaum Hydrolyse möglich; - stabil

In Anlehnung an "Km-Werte (Michaelis-Konstante) für ß-Laktam-Antibiotika von gereinigten

Penicillinasen von S. aureus“ aus Zygmunt DJ, Stratton CW, Kernodle DS (1992). Antmicrob Agents

Chemother 36, 440-445

Bei S. aureus sind die Penicillinasen sind ca. 30 kDa groß und bestehen aus 257

Aminosäuren, wobei die Aminosäuren 128 und 216 die entscheidenden für das

kinetische Profil einer Penicillinase sind. Zum Beispiel kommt es durch die Substitution

von Asparagin für Serin an der Position 216 in der Typ A Penicillinase zu einer nicht

von Typ C zu unterscheidenden Kinetik [45]. Die Penicillinasen sind im Allgemeinen

durch Beta-Laktamase-Inhibitoren hemmbar.

11

Alle vier Penicillinasetypen sind gegen Benzyl-, Amino- und Carboxylpenicilline aktiv,

während Isoxazolylpenicilline, Nafcillin und Methicillin stabil sind. Es gibt aber auch

Unterschiede in der Aktivität gegenüber verschiedenen Antibiotika zwischen den

Pencillinasetypen. So ist die Hydrolyse von Cefazolin typisch für die Typ A-Beta-

Laktamase, d.h. Produzenten dieser Beta-Laktamase sind resistenter gegenüber

Cefazolin, während Typ C nicht gut durch Tazobactam hemmbar ist [28].

1.3.4 Die Therapie der Infektionen mit S. aureus

S. aureus ist primär empfindlich gegenüber Beta-Laktam-Antibiotika (Penicillin,

Cephalosporine, Carbapeneme). Wenn eine Penicillinasebildung sicher ausgeschlossen

werden kann, sollte Penicillin bevorzugt werden, da es die höchste Aktivität und somit

Wirksamkeit gegen Staphylokokken aufweist. Die Wirkungsunterschiede zwischen den

einzelnen Penicillinen beruhen u.a. auf einer verschiedenen Affinität zu den Penicillin-

Bindungsproteinen (PBP) der Bakterien, die auch eine Rolle in der Ausbildung der

Methicillinresistenz spielen (PBP2a) [16, 33]. Inzwischen bilden allerdings bis zu 80%

der Bakterienstämme eine Beta-Laktamase, die das Penicillin hydrolisiert und

unwirksam macht [13, 32].

Deshalb ist eine sichere Unterscheidung zwischen penicillinsensiblen und

penicillinresistenten S. aureus Stämmen von großer klinischer Bedeutung, da sie

therapeutische Konsequenzen nach sich zieht. Ist ein Stamm penicillinsensibel, wird

Penicillin G als Antibiotikum der ersten Wahl verabreicht.

Bei MRSA-Stämmen ist keines der derzeit zugelassenen Betalaktam-Antiobiotika

wirksam und es muss auf andere Antibiotikaklassen ausgewichen werden. Meistens

erfolgt eine Therapie von MRSA-Infektionen mittels Vancomycin oder Linezolid.

1.4 Ausbildung der Beta-Laktam-Resistenz

1.4.1 Regulation der Expression von Penicillinasen

Die Gene für Penicillinasen bei S. aureus liegen auf Plasmiden. Die Expression ist

induzierbar [5, 21]. Verantwortlich für die Synthese ist das Bla-Operon. Es besteht aus

blaZ, dem Gen, das für die Penicillinase kodiert, und zwei regulatorischen Genen,

12

blaR1-blaI, die aufwärts nebeneinander lokalisiert sind und in der entgegengesetzten

Richtung zu blaZ transkribiert werden. Dabei kodiert blaR1 für die Funktion eines

transmembranösen Signalüberträgers mit Anti-Repressor-Aktivität und blaI kodiert für

den Repressor der Penicillinase-Synthese [6].

In Anwesenheit von Beta-Laktam-Antibiotika wird die Expression der Penicillinase

induziert, indem das Beta-Laktam an den extrazellulären Teil von BlaR1 bindet.

Dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung, die die intrazelluläre

proteolytische Aktivität von BlaR1 aktiviert. Der Repressor BlaI wird von der BlaR1-

Protease gespalten, so dass er nicht länger an den Bla-Operator binden kann. Somit

kann blaZ-mRNA abgelesen und Penicillinase produziert werden [6, 17].

Beta-Laktam-Antibiotika können über diese Kaskade die Bildung einer Penicillinase

induzieren.

Abb. 3: Regulation der Expression von Penicillinasen

1.4.2 Zusammenspiel der Regulation von mecA und blaZ

Das verantwortliche Gen für die Methicillin-Resistenz in S. aureus (MRSA) ist mecA.

Es kodiert für ein zusätzliches Penicillin-Bindungsprotein mit reduzierter Affinität für

alle Beta-Laktame, PBP2a, und liegt auf einem mobilen staphylococcal cassette

chromosome (SCCmec), das horizontal unter Staphylokokken übertragbar ist. Das Mec-

Operon ist ähnlich organisiert wie das Bla-Operon. Der Repressor MecI bindet an das

Mec-operon und verhindert so eine Transkription von mecA. Durch die Anwesenheit

von Beta-Lakam-Antibiotika wird MecR1, das wie BlaR1 ein transmembranöser

Signalübermittler mit Anti-Repressor-Aktivität ist, induziert [5, 17].

13

Der blaR1-blaI-Komplex weist eine signifikante Homologie der Aminosäuren zum

mecR1-mecI-Komplex auf [6, 23]. Daher können MecI und BlaI an dieselbe MecA-

MecR1-Promoter-Operator-Sequenz binden. Zusätzlich zur Transkription von blaZ

kann BlaI auch die Transkription von mecA reprimieren, es wirkt allerdings als

Repressor weniger stark als MecI [23, 30].

Es besteht somit eine Koregulation von mecA durch MecI und BlaI [40].

Das Ziel dieser Koregulation ist entweder PBP2a oder Penicillinase, da beide auch ohne

Induktion in großen Mengen produziert werden können. Die Überproduktion von

mecR1, was zu einer erhöhten Synthese von PBP2a in Abwesenheit von Beta-Laktamen

führt, verlangsamt das Zellwachstum und bringt so einen Selektionsnachteil für die

Zelle mit sich [40]. Die regulatorischen Gene für die Penicillinase scheinen eine Lösung

für den Bedarf an Kontrolle über die PBP2a-Produktion zu sein, da sie zu einer

Minimierung der Energie für die Aufrechterhaltung von mecA beitragen und

gleichzeitig fähig sind PBP2a in Anwesenheit von Antibiotika zu exprimieren.

Deshalb spielen Penicillinase-Plasmide, die in MRSA vorkommen, eine wichtige Rolle

in der Stabilität der phänotypischen Expression des mecA Gens [17, 23].

1.5 Ziel dieser Doktorarbeit

Über 80% der klinisch isolierten Stämme von S. aureus weisen heutzutage eine

Resistenz gegenüber Penicillin G auf [13, 32], die typischerweise durch Penicillinasen

verursacht wird. Dabei gilt S. aureus zusammen mit den koagulasenegativen

Staphylokokken als einer der Hauptverursacher von nosokomialen Bakteriämien und

ambulant erworbenen Infektionen [10, 36, 46]. Die zuverlässige Identifizierung einer

Penicillinaseproduktion ist wichtig, da Penicillin nach wie vor aufgrund seiner Affinität

zu den Bindungsproteinen von S. aureus als Mittel der Wahl bei penicillinase-negativen

penicillin-sensiblen S. aureus-Stämmen gilt [38]. Eine falsch sensible Meldung in der

Testung auf die Empfindlichkeit gegenüber Penicillin kann in einer inadäquaten

Therapie und damit in einer potentiell lebensgefährlichen Situation für den Patienten

resultieren. Andererseits führen falsch resistente Meldungen dazu, dass dem Patienten

die wirksamste Therapie vorenthalten wird. Eine MHK von ≤ 0,12 mg/l gilt formal als

sensibel, aber das CLSI empfiehlt zusätzliche Testungen [7] zur Detektion von

Penicillinasen, z.B. molekulare Methoden wie die PCR, oder phänotypische Tests.

14

Das Ziel dieser Studie war es fünf phänotypische Methoden zur Erkennung einer

Penicillinase in S. aureus miteinander zu vergleichen. Getestet wurden der

Agardiffusionstest, der Hemmhofrandcharakter, der Cloverleaf-Test, der Nitrocefin-

Test und der Jod-Stärke-Test. Als Referenzmethode wurde die blaZ PCR gewählt. Es

wurden nur Isolate getestet, die laut VITEK 2 eine MHK im sensiblen Bereich

aufwiesen (MHK ≤ 0,12 mg/l).

Nachfolgend sollen kurz die Prinzipien dieser fünf phänotypischen Methoden erläutert

werden. Dem Prinzip des Agardiffusionstests und der Hemmhofcharakterisierung liegt

eine Diffusion des Antibiotikums (hier: Mecillinam und Penicillin) in den mit dem zu

testenden Stamm beimpften Agar zugrunde. Ist der Stamm penicillinsensibel, ist der

Hemmhof größer und die Koloniegröße nimmt graduell ab, was einer unscharfen

Hemmhofrandbegrenzung entspricht. Bildet der Teststamm jedoch eine Penicillinase

aus, ergibt sich eine scharfe Begrenzung des Hemmhofrandes um das Antibiotika-

Testblättchen herum mit einer kleineren Hemmhofgröße [12, 34].

Bei der Durchführung des Cloverleaf-Tests kommt es zu einem Wachstum des

penicillinsensiblen S. aureus ATCC 25923 im Bereich des Impfstrichs des zu testenden

Stammes in den Hemmhof hinein, da bei Penicillinasebildung des Teststammes das

Enzym in den Agar hineindiffundiert und so das Wachstum des S. aureus ATCC 25923

ermöglicht [19, 34].

Nitrocefin ist ein empfindliches Cephalosporin, dessen Beta-Laktamring in

Anwesenheit einer Beta-Laktamase gespalten wird. Dabei werden chromophore

Gruppen frei, so dass das Produkt bei der Produktion einer Penicillinase farbig erscheint

[19, 34, 37].

Das Prinzip des Jod-Stärke-Tests ist, dass Jod und Stärke zusammen einen

purpurfarbenen Komplex bilden. Wird von einem Stamm Penicillinase produziert,

wandelt sich Penicillin zu Penicillinsäure um und Jod wird in Jodid umgewandelt. Jodid

kann mit Stärke keinen purpurfarbenen Komplex mehr bilden, deshalb entfärbt sich der

Agar um penicillinasepositive Stämme herum und wird weiß [19, 33, 34, 35].

Die für diese Studie verwendeten S. aureus-Isolate stammen aus dem Institut für

Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum, das sein Untersuchungsmaterial aus den

Universitätskliniken und Akademischen Lehrkrankenhäusern der Umgebung erhält. Es

wurden nur Stämme mit in die Studie eingeschlossen, die im VITEK 2 eine MHK von

≤ 0,12 mg/l besaßen, da ab dieser MHK laut CLSI die Stämme formal als

penicillinsensibel gelten [7]. Das heißt, dass diese Stämme keine Penicillinase ausbilden

und somit Penicillin als Antibiotikum klinisch wirksam ist. Dieses gilt für Penicillin G

15

und seine Derivate ebenso wie für Ampicillin, Mezlocillin und Piperacillin. Aufgrund

der ähnlichen Struktur sind die zuvor genannten Antibiotika bei Ausbildung einer

Penicillinresistenz ebenso klinisch unwirksam und man muss bei der Therapie von

Infektionserkrankungen auf Alternativen zurückgreifen oder eine Kombination mit

einem Beta-Laktamase-Inhibitor anstreben. Daher ist die zuverlässige Identifikation

einer Penicillinaseproduktion für die Therapie von Infektionskrankheiten sehr wichtig.

Ein weiteres Penicillinderivat ist Mecillinam. Aufgrund seiner begrenzten Wirksamkeit

und Instabilität gegenüber Beta-Laktamasen erreichte Mecillinam keine große

Bedeutung in der klinischen Therapie von Infektionserkrankungen und gewann

vielmehr an wissenschaftlicher Bedeutung [44]. Es bewirkt die Ausbildung großer (50-

100 faches Volumen), kugelförmiger Zellen, die in Medien mit niedriger Osmolarität

nicht lysieren. Verschiedene Elektrolytkonzentrationen in den Medien können im

gleichen Organismus verschiedene MHK oder Hemmhofrandgrößen hervorrufen [43],

so dass Mecillinam oft in wissenschaftlichen Arbeiten, wie auch hier, verwendet wurde.

16

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien

di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Jod Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Kaliumjodid (KI) Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

NaCl Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

1 M HCL Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Ethanol Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland

Alle Chemikalien stammten, wenn nicht anders angegeben, von Merck KgaA,

Darmstadt, Deutschland und sind in der Qualität hochrein.

2.1.2 Medien und Agar

Agar Agar Otto Norwald GmbH, Hamburg, Deutschland

Columbia Blutagar Oxoid, Wesel, Deutsachland

31,2 g Columbia Agar

ad 800 ml Aqua bidest

32 ml defibriniertes Schafsblut

DNase-Agar Oxoid, Wesel, Deutsachland

9,75 g DNase-Agar


Jod-Stärke-Agar eigene Herstellung

17

LB-Bouillon Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Mueller-Hinton Agar Merck, Darmstadt, Deutschland

34 g Mueller-Hinton-Agar


Nutrient-Agar Oxoid, Wesel, Deutsachland

Nutrient Broth

TMA(Trehalose-Mannitol)–Agar Difco über Otto Norwald GmbH, Hamburg,

Deutschland

15,5 g Purple-Agar-Base (DIFCO 222810)


4,5 g Trehalose (Merck 1.08216) und 5,0 g

Mannitol (Merck 1.05982)

0,05 g Phenophthalein-diphosphat


Einfriermedium 30% Glycerin

0,2% kalt lösliche Stärke Applichem, Darmstadt, Deutschland

Jod-Stärke-Agar 6,5 g Nutrient-Broth

1 g wasserlösliche Stärke

7,5 g Agar Agar


0,1 mg Oxacillin

Nitrocefin-Teststäbchen Oxoid, Wesel ,Deutschland

Nutrient-Agar-Platten Oxoid, Wesel, Deutschland

0,2% kalt löslicher Stärke und 0,2 mg/l Oxacillin

Penicillin-Jod-Lösung: 2 Stammlösungen ansetzen

1M K2HPO4: 87,09 g K2HPO4 (di-Kaliumhydrogenphosphat)

ad 500 ml destilliertes Wasser

18

1M KH2PO4: 68,05 g KH2PO4 (Kalium-dihydrogenphosphat)

ad 500 ml destilliertes Wasser

2,78 ml 1 M K2HPO4 und 7,22 ml 1 M KH2PO4

verrühren


0,3 g I2 und 1,5 g Kaliumjodid (KI) und über 16 –

18 Stunden lösen. PH 6,4 mit Hilfe der

Stammlösungen oder mit sterilem Aqua bidest

einstellen.

Penicillin frisch vor der Testung hinzugeben

2 ml Lösung, 100 mg Penicillin.

2.1.3 Puffer und Lösungen

Jod-Lösung : 50 g/l Benzylpenicillin, 3 g/l Jod,

15 g/l KI in 0,1 M Phosphat-Puffer pH 6,4

2.1.3.1 Präparation der DNA

10 mM Tris pH 8,0

Lysostaphin für S. aureus / S. epidermidis Sigma, Taufkirchen, Deutschland

RNase Sigma, Taufkirchen, Deutschland

2.1.3.2 Verwendete Kits

QiAmp-Kit QiAmp Mini Kit oder DNeasy Mini

Kit Qiagen, Hilden, Deutschland

- ATL-Staph: 1ml 1 M Tris pH 8,0

600 µl Triton X-100

Ad 50 ml aqua bidest, sterifiltriert

- AW 1 Puffer

19

- AL Puffer

- AE Puffer

- Proteinkinase K

- Ethanol

- QiAmp spin Säule

2.1.3.3 PCR

dNTP´s GE Healthcare

Taq-Polymerase und PCR-Puffer GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont,

England

2.1.3.4 Elektrophorese

Stop-Mix (1:5 verdünnt in Puffer)

TAE-Puffer

Agarose Biozym DNA Agarose Biozym, Hessisch

Oldendorf, Deutschland

2.1.4 Antibiotika

Lösliches Benzylpenicillin Applichem, Darmstadt, Deutschland

Oxacillin Sigma, Taufkirchen, Deutschland

2.1.4.1 Antiobiotika-Testblättchen

Die Antibiotika-Testblättchen wurden von Oxoid (Wesel, Deutschland) bezogen und

waren mit folgenden Antibiotikakonzentrationen beschickt:

Mecillinam 10 µg/Plättchen

Penicillin 10 µg/Plättchen

20

2.1.5 Bakterienstämme

Von April 2005 bis Januar 2006 wurden 197 S. aureus Isolate gesammelt. Sie

stammten aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum, das sein

Untersuchungsmaterial aus den Schwerpunktkrankenhäusern der Umgebung erhält. Es

handelt sich zumeist um Universitätskliniken oder Akademische Lehrkrankenhäuser der

Ruhr-Universität Bochum. Dadurch sind ein hohes Patientenaufkommen und ein breites

Spektrum an Grunderkrankungen gegeben.

Alle Isolate waren im Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum durch

den Agglutinationstest mit Slidex Staph Plus (bioMérieux, Marcy l´Etoile, Frankreich)

als S. aureus identifiziert worden. Gesammelt und zur Abteilung Medizinische

Mikrobiologie der Ruhr-Universität-Bochum verschickt wurden sie, sofern im Vitek 2

eine MHK für Penicillin ≤ 0,12 mg/l gemessen wurde.

Die Isolate wurden an der Ruhr-Universität-Bochum in einem 30%ig Glycerin

enthaltendem Einfriermedium bei -70°C asserviert.

S. aureus N315 (penicillinresistent) und ATCC 25923 (penicillinsensibel) wurden als

Kontrollstämme benutzt.

Von D. Kernodle, Vanderbilt University, Nashville, USA wurden folgende S. aureus

Stämme mit charakterisierten Penicillinasen zur Verfügung gestellt. PC1, NCTC 9789

(Typ A Penicillinase); -22260 (Typ B Penicillinase);- 3804 (pII 3804); RN9 (pII147);-

V 137 (Typ C Penicillinase) und FAR 10 (Typ D Penicillinase)

2.1.6 Geräte

Elektrophorese-Kammern Pharmacia (LKB GPS 200/400)

Heizblock Bioblock scientific

Magnetrührer Omnilab IIKA-COMBIM1G RCO

PCR-Gerät Mastercycler personal, Eppendorf

Schüttelwasserbad GFL 1083

Tischzentrifuge Biofuge pico, Haereus instruments

Ultraschallbad Branson 2510

VITEK 2 bioMérieux, Durham, NC, USA

21

Waagen 1. Mettler AE 100

2. Sartorius

Zentrifuge Biofuge stratos, Haereus instruments

2.2 Methoden

2.2.1 Anzucht der Bakterien

Die zu testenden S. aureus Stämme wurden aus dem Einfriermedium auf Columbia

Blutagarplatten über 16–18 Stunden bei 37°C angezüchtet. Nach sorgfältiger

Betrachtung der Agarplatten zum Ausschluss einer Verunreinigung wurden von der

Reinkultur einige Kolonien zur Herstellung einer Bakteriensuspension in

physiologischer Kochsalzlösung mit einer Dichte von McFarland 0,5 verwendet. Aus

dieser Suspension wurden sowohl alle Platten zur phänotypischen Testung, als auch die

Bouillon zur DNA-Präparation beimpft, so dass nur eine einmalige Passage der

Teststämme stattfand.

Für den Agardiffusions-Test und den Cloverleaf-Test wurden frische Mueller-Hinton-

Agarplatten verwendet.

2.2.2 Identifikation von S. aureus

Um S. aureus zu identifizieren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Zum Einen kann

man S. aureus an seiner oben beschriebenen typischen Morphologie erkennen. Die

klassische Methode zur Abgrenzung von S. aureus von anderen Staphylokokkenspezies

(KNS) ist die Testung auf Koagulase, einem Enzym, das zusammen mit Prothrombin

einen proteolytischen Komplex bildet und so als Virulenzfaktor an der Bildung der

charakteristischen Fibrinkapsel beteiligt ist. Die derzeit am meisten in der

Routinediagnostik genutzte Möglichkeit zur Identifizierung von S. aureus ist die

Anwendung eines schnellen Agglutinationstests, z.B. Slidex Staph Plus (bioMérieux).

Dieser weist den Clumping factor zum Einen durch Latexpartikel nach, die mit

humanem Fibrinogen sensitiviert wurden, zum Anderen kann er auch Protein A und

häufige Kapselantigene von S. aureus nachweisen. Er gilt als positiv, wenn es zu einer

sichtbaren Agglutination der Latexpartikel kommt [15].

22

Eine weitere Methode ist die Verwendung eines DNAse-Testagars zum Nachweis des

Enzyms Desoxyribonuclease, das bei S. aureus vorkommt. Der Agar enthält Tryptose,

Desoxyribinucleinsäure und Natriumchlorid. Durch Zugabe von 1 M Salzsäure auf den

bebrüteten Agar bilden sich im positiven Fall klare Randsäume um die Kolonien. Dieses

geschieht durch Präzipitation der polymerisierten DNA.

Als molekularbiologische Methode zur Speziesidentifizierung bei S. aureus sind PCR-

Untersuchungen auf speziesspezifische Gene, wie SA 442 zu erwähnen [41].

Zudem gibt es halbautomatisierte Verfahren, die Hefen und Bakterien unter Nutzung

der physiologischen Eigenschaften des Isolates identifizieren können, sowie eine

Resistenzbestimmung durchführen können, z.B. der VITEK 2.

2.2.3 Überprüfung der Spezies als S. aureus

Um Verwechslung oder Kontamination der bereits als S. aureus im Institut für

Medizinische Mikrobiologie identifizierten Stämme auszuschließen, wurden die

Stämme phänotypisch durch Testung auf DNase überprüft. S. epidermidis als mögliche

Kontamination wurde durch Testung auf TMA-Testagar ausgeschlossen.

Alle Isolate waren bereits durch den VITEK 2, ein halbautomatisiertes Verfahren zur

Identifikation und Resistenzbestimmung, charakterisiert.

2.2.3.1 TMA-Testagar

Mit einer 10-µl-Öse wurden Teststämme strichförmig auf TMA-Agar beimpft. Bis zu

vier Stämme wurden auf eine Platte beimpft. Die Platte wurde 16-18 h bei 37°C

bebrütet.

Eine Gelbverfärbung wurde als positiv gewertet, d.h. Trehalose oder Mannitol werden

verstoffwechselt. Blieb der Agar violett wurde das Ergebnis als negativ gewertet, d.h.

weder Trehalose noch Mannitol wurden verstoffwechselt. Letztere Konstellation ist

typisch für S. epidermidis.

23

2.2.3.2 DNase-Testagar

Mit einer 10-µl-Öse wurden Teststämme strichförmig auf DNase-Agar beimpft. Bis zu

vier Stämme wurden auf eine Platte beimpft. Die Platte wurde 16-18 h bei 37°C

bebrütet.

Der Test wurde als DNase positiv protokolliert, wenn sich nach Überschichtung mit

HCl 1 M um den Teststamm herum keine Trübung des Agars zeigte. Eine positive

Reaktion ist charakteristisch für S. aureus.

2.2.4 Agardiffusions-Test

Der Agardiffusions-Test wurde gemäß den Vorgaben des Clinical and Laboratory

Standards Institut (CLSI) durchgeführt [7].

Ein steriler Wattetupfer wurde in die oben beschriebene, auf eine optische Dichte von

McFarland 0,5 eingestellt, Zellsuspension getaucht und am Rand des Reagenzröhrchens

ausgedrückt. Die gesamte Oberfläche von Mueller-Hinton Agarplatten wurde in drei

Schritten beimpft, wobei die Agarplatte jeweils um 60 Grad gedreht wurde.

Anschließend wurden Penicillin- und Mecillinam-Testblättchen mit einer Beschickung

von je 10 µg aufgelegt. Die Bebrütung erfolgte über 16–18 Stunden bei 35 +/- 2°C.

Danach wurde der Hemmhofdurchmesser gemessen.

Zudem wurde protokolliert, ob der Penicillin-Hemmhofrand scharf demarkiert war,

oder, ob die Begrenzung des Hemmhofrandes unscharf war. Ein scharfer Rand mit

normaler Koloniegröße direkt am Hemmhof wurde als positiv gewertet, eine unscharfe

Begrenzung mit graduell abnehmender Koloniegröße als negativ [12].

24

Abb. 4: scharf demarkierter Hemmhofrand [12]

Abb. 5: unscharf demarkierter Hemmhofrand [12]

25

2.2.5 Cloverleaf-Test

Eine Mueller-Hinton Agarplatte wurde mit S. aureus ATCC 25923 als Indikatorstamm

beimpft, indem man einen zuvor in auf 0,5 McFarland eingestellte Indikatorlösung

getauchten Wattetupfer auf der Platte ausgestrichen hat. Mittig wurde ein Blättchen

Penicillin aufgelegt und der zu testende Stamm aus der oben beschriebenen

Bakteriensuspension mit der Dichte McFarland 0,5 mit einer Öse strichförmig vom

Testblättchen zum Plattenrand aufgetragen; es wurden jeweils drei Stämme pro Platte

aufgetragen. Anschließend erfolgte eine Bebrütung der Platten über 16–18 Stunden bei

37°C.

Der Test wurde als positiv bewertet, wenn im Bereich des Impfstrichs des zu testenden

Stammes der penicillinsensible S. aureus ATCC 25923 in den Hemmhof hineinwuchs

(siehe Abbildung 6).

Abb. 6: Positiver Cloverleaf-Test

26

2.2.6 Nitrocefin-Test

Der Nitrocefin-Test wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Mit einem

Nitrocefin-Teststäbchen wurden vom Penicillin-Hemmhofrand einige Kolonien

abgenommen, das Stäbchen in einem Tropfen sterilem Aqua bidest kurz angefeuchtet,

und bis zu einer Stunde in einer zur Erhaltung des feuchten Milieus geschlossenen

Petrischale inkubiert. Ein Farbumschlag des Stäbchens von gelb nach rot wurde als

positiv gewertet und nach 5, 15, und 60 Minuten abgelesen.

2.2.7 Jod-Stärke-Test

Mit einer 10-µl-Öse wurden Teststämme strichförmig auf Jod-Stärke-Agar beimpft. Bis

zu vier Stämme wurden auf eine Platte beimpft. Die Platte wurde 16-18 h bei 37°C

bebrütet.

Am nächsten Tag wurden 2 ml der frisch zubereiteten Penicillin-Jod-Lösung auf die

Jod-Stärke Testplatte gegeben und durch Schwenken der Agarplatte gleichmäßig auf

dieser verteilt.

Der Test wurde als positiv abgelesen, wenn sich der unmittelbar nach der Zugabe der

Penicillin-Jod-Lösung blau verfärbte Agar um den Teststamm herum innerhalb von 2

Minuten weiß verfärbte. Er wurde ebenfalls als positiv abgelesen, wenn sich die Platte

unter dem Impfstrich weiß verfärbte. Dieses wurde überprüft, indem mit einer Öse

vorsichtig ein Teil des Impfstrichs entfernt wurde.

2.2.7.1 Kontrollplatten

Die Kontrollplatten wurden mit derselben auf 0,5 McFarland eingestellten

Bakteriensuspension beimpft, die schon für die phänotypischen Tests verwendet wurde.

Pro zu testendem Stamm wurde je eine halben Platte Blutagar verwendet und mittels 3-

Ösen-Ausstrich beimpft. Dann wurde sie über 16–18 Stunden bei 37°C bebrütet, um sie

am nächsten Tag nochmals auf ihre Reinheit zu überprüfen.

27

2.2.8 Präparation der genomischen DNA

Mit einer 1-µl-Öse wurde direkt aus dergleichen Suspension, die schon für die

phänotypischen Test verwendet wurde (0,5 McFarland Dichte), eine 4 ml LB-Bouillon

beimpft, die über 16–18 Stunden bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert wurde.

1 ml der beimpften LB-Bouillon wurde in eine Eppendorf Pipette gegeben und 1 min

bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das übriggebliebene

Pellet in 1 ml sterilem Aqua bidest durch Vortexen resuspendiert. Dieser Vorgang

wurde zweimal wiederholt. Beim dritten Mal wurde das Pellet in 100 µl 10 mM Tris pH

8,0 resuspendiert und 10 min bei 95°C im Heizblock erhitzt. Nach Abkühlung auf

Raumtemperatur wurde die Suspension 15 min im Ultraschallbad beschallt. Danach

erfolgte eine Zentrifugation bei 15000 rpm und 4°C für 10 min. Der Überstand wurde

vorsichtig in eine frische Eppendorf Pipette pipettiert.

Diese DNA-Präparation wurde bei -20 °C eingefroren und maximal zweimal wieder

aufgetaut.

2.2.9 Präparation der genomischen DNA mit dem QiAmp-Kit

Eine beimpfte LB-Bouillon wurde 16-18 h als Schüttelkultur inkubiert. Danach erfolgte

eine einminütige Zentrifugation mit Verwerfung des Überstandes. Das so entstandene

Pellet wurde in 180 µl ATL-Staph suspendiert. Nach der Zugabe von 20 µl Lysostaphin

für S. aureus, wurde 30 min bei 37ºC inkubiert. Nun gab man 25 µl Proteinkinase K und

200 µl AL hinzu, mischte alles gut und inkubierte 30 min bei 56ºC. Es erfolgte die

Zugabe von 20 µl RNase und eine erneute Inkubation für 2 min bei Raumtemperatur

und für 10 min bei 70ºC. Nach Zugabe von 200 µl Ethanol wurde alles kurz gemischt

und vorsichtig auf QiaAmp spin Säulen gegeben. Nach 1 min Zentrifugation wurden

200 µl AE zum eluieren der DNA hinzugegeben, alles 1 min bei Raumtemperatur

stehengelassen und dann 1 min zentrifugiert. Zum erneuten Eluieren der DNA wurde

dieser Schritt wiederholt. Das Eluat wurde gepoolt und bei -20ºC eingefroren.

5 µl des Eluats wurden auf ein Agarose-Gel zur Kontrolle gegeben.

2.2.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR wurde als Duplex-PCR in einem Eppendorf Thermocycler durchgeführt. In

einem PCR-Tube wurden 5 µl PCR-Puffer, 8 µl dNTP´s (1,25 mM), 2,5 µl blaZ seq

28

Primer (10 pmol/µl), 2,5 µl blaZ rev Primer (10 pmol/µl), 22 µl Aqua bidest und 0,25 µl

Taq-Polymerase (5 U/µl) eingesetzt. Als Ziel-DNA wurden 5 µl der genomischen DNA

1:10 in aqua bidest verdünnt hinzugefügt.

Es wurde gleichzeitig die SA 442-PCR durch Zugabe von 0,625 µl SA 442 seq Primer

(10 pmol/µl) und 0,625 µl SA 442 rev Primer (10 pmol/µl) zur genomischen DNA

durchgeführt.

Begonnen wurde die PCR mit einer Denaturierungszeit von 5 min bei 94°C, es folgte

eine weitere Denaturierung bei 94°C für 30 s. Das Annealing erfolgte in 30 s bei 55°C,

die Elongation fand bei einer Temperatur von 72°C für 30 s statt. Beendet wurde die

PCR mit einem letzten Elongationsschritt (7 min bei 72°C), dazwischen lagen 30-35

Amplifikationszyklen. Alle Primer sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tab. 4: Primer der blaZ und SA 442-PCR

Bezeichnung Primersequenz Annealingtemperatur Amplifikatgröße

blaZ-fwd 5´-caa aga tga tat agt

tgc tta ttc tcc-3´

58,9°C 421 bp

blaZ-rev 5´-tgc ttg acc act ttt

atc agc-3´

55,9°C

SA 442 fwd 5´-gtc ggg tac acg

ata ttc ttc acg-3´

62,7°C 182 bp

SA 442 rev 5´-ctc tcg tat gac cag

ctt cgg tac-3´

64,4°C

Die Primer blaZ-fwd und blaZ-rev wurden anhand veröffentlichter Sequenzen der vier

bekannten Penicillinasen A-D (Genbank Accession NC_005127, M25254, U58139,

NC_005951 und AF086644) ausgewählt und binden in einem konservierten Bereich des

blaZ-Gens [41].

Die Primer SA 442 fwd und SA 442 rev binden spezifisch bei S. aureus [41].

Das blaZ-Gen ist 741 Basenpaare groß, darin liegt blaZ-fwd zwischen den Basen 267-

294 und blaZ-rev zwischen 667-682, bezogen auf Accession Nr. U58139.

29

Die Primer der S. aureus-spezifischen PCR sind SA 442 seq und rev [41].

2.2.11 Gel-Elektrophorese

Die PCR-Produkte wurden durch Gel-Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel

nachgewiesen. Als Größenmarker wurde eine 1kb-Ladder verwendet.

Im positiven Fall, d.h. bei Vorliegen einer Beta-Laktamase, amplifizieren beide Primer

einen 421 bp-großen Bereich der Beta-Laktamase.

Die SA 442-PCR sollte immer positiv sein. Sie bildet im positiven Fall ein 156 bp

großes PCR-Produkt [41].

2.2.12 Fehlerquellen

Mögliche Fehlerquellen bei der Durchführung und Auswertung der Versuche wurden

vorher identifiziert. Das Plasmid, das für die Beta-Laktam-Resistenz kodiert, kann

verloren gehen, was zu diskrepanten Ergebnissen in phänotypischen und genotypischen

Tests führt. Um dieses Problem zu umgehen, wurde die DNA aus dem Ansatz

präpariert, der auch für die phänotypischen Tests verwendet wurde.

Als interne Positivkontrolle zur Kontrolle der Qualität der DNA-Präparation und

nebenbei zur Speziesbestätigung erfolgte immer gleichzeitig eine SA 442-PCR, die

immer positiv ausfiel.

30

3 Ergebnisse

3.1 Auswertung der phänotypischen Tests

3.1.1 Phänotypische Tests zur Speziesüberprüfung

Die Testung mit DNase-Testagar zur S. aureus Speziesüberprüfung durch Nachweis des

Enzyms Desoxyribonuklease fiel immer positiv aus.

Der TMA-Agar zeigte immer einen Farbumschlag nach gelb an. Damit erfolgte die

Bestätigung der Speziesdiagnose, die zuvor durch Slidex Staph Plus im Institut für

Medizinische Mikrobiologie gestellt worden war, und es konnte eine Kontamination

durch die häufigste koagulasenegative Staphylokokkenspezies S. epidermidis

ausgeschlossen werden.

3.1.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchung

Von den 197 getesteten Stämmen ließ sich in 28 Stämmen (14,2%) mit der blaZ PCR

das für eine Penicillinase kodierende Gen blaZ nachweisen. Bei 169 Stämmen konnte

kein solches PCR-Produkt nachgewiesen werden.

Diese molekularbiologische Methode wurde als Referenzmethode gewählt, gegen den

die phänoptypischen Methoden verglichen wurden (siehe Abbildung 7).

31

Abb. 7: blaZ PCR und SA 442 PCR positiv

N315: Positivkontrolle, Negativkontrolle: ATCC 25923, Stamm 1: positiv, Stamm 2: negativ,

Stamm 3: negativ

3.1.3 Ergebnisse der phänotypischen Methoden zur Penicillinase-Detektion

Bei der Differenzierung des Hemmhofrandcharakters wurden von 28 PCR-positiven

Stämmen wurden 20 als positiv erkannt, das entspricht einer Sensitivität von 71,4%.

Der Cloverleaf-Test detektierte 19 von 28 penicillinasepositiven Stämmen, was einer

Sensitivität von 67,8% entspricht. Der Jod-Stärke-Test erkannte 12 von 28 positiven

Stämmen, seine Sensitivität beträgt 42,9%. Die Detektion des Nitrocefin-Tests stellt

sich wie folgt dar: Nach 5 Minuten Beobachtungszeit wurden 7 Stämme als positiv

detektiert (Sensitivität von 25%), nach 15 Min 10 Stämme (35,7% Sensitivität) und

32

nach 60 Minuten 11 Stämme (39,3% Sensitivität). Die Festlegung eines Grenzwertes

von ≤ 28 mm im Agardiffusions-Test, wie es vom CLSI empfohlen wird, um einen

Stamm als penicillinresistent einzustufen [7], resultierte in 16 als richtig positiv

erkannten Stämmen, was einer Sensitivität von 57,1% für diesen Test entspricht.

In keinem dieser 5 phänotypischen Tests (Cloverleaf-Test, Agardiffusions-Test,

Hemmhofrandcharakter, Jod-Stärke-Test, Nitrocefin-Test) traten falsch positive

Ergebnisse auf, d.h. bei jedem positiven Ergebnis der 5 phänotypischen Methoden war

auch die blaZ-PCR positiv.

Tab. 5: Sensitivität der phänotypischen Tests

Phänotypischer Test Sensitivität Richtig Positive N= 28

Hemmhofrandcharakter 71,4% 20

Cloverleaf-Test 67,8% 19

Nitrocefin-Test 5 min 25,0% 7



Jod-Stärke-Test 42,9% 12

Agardiffusions-Test 57,1% 16

3.1.4 Ergebnisse des Agardiffusions-Tests

16 Stämme wiesen für Penicillin einen Hemmhofdurchmesser von ≤ 28 mm auf. Dies

gilt als Grenze zur Unterscheidung zwischen resistent und sensibel, also demnach

zwischen Penicillinaseproduzenten und -nichtproduzenten nach CLSI [7]. 181 Stämme

besaßen einen Hemmhof, der größer als 28 mm war. Unter diesen Stämmen befinden

sich 12, die in der PCR als penicillinasepositiv getestet worden waren. Unter den 16

Stämmen, die einen Hemmhofdurchmesser von ≤ 28 mm aufwiesen, befinden sich 2

Stämme, die in der PCR als penicillinasenegativ getestet wurden. Diese Verteilung ist in

Abbildung 8 dargestellt.

33

Abb. 8: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Penicillin

Die Verteilung von Penicillinaseproduzenten und -nichtproduzenten überlappen sich; bei

Anwendung des von CLSI empfohlenen Grenzwertes von 28 mm zeigen sich demzufolge 12 falsch

sensible Ergebnisse

Die Durchschnittswerte für penicillinasepositive und –negative Stämme betragen 27,9

mm bzw. 36,9 mm. Anhand des Diagrammes kann man erkennen, dass sich kein

eindeutiger Grenzwert zur Unterscheidung zwischen Penicillinaseproduzenten und

Nichtproduzenten aufgrund der Größe des Hemmhofdurchmessers festlegen lässt. Die

Verteilungen überlappen sich.

Die durchschnittlichen Hemmhofdurchmesser des Agar-Diffusionstests für 10 µg

Mecillinam lagen für penicillinasepositive Stämme bei 10,0 mm und für negative

Stämme bei 14,4 mm. Für Mecillinam konnte ebenfalls kein Grenzwert festgelegt

werden, der deutlich zwischen positiven und negativen Stämmen unterscheidet.

Abbildung 9 stellt die Verteilung der Hemmhofdurchmesser für Mecillinam dar.

34

Abb. 9: Verteilung der Hemmhofdurchmesser im Agardiffusions-Test Mecillinam

Die Verteilungen von Penicillinaseproduzenten und –nichtproduzenten überschneiden sich

vollständig

3.1.5 Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ

Bei einer minimalen Hemmkonzentration (MHK) von ≤ 0,03 mg/l war kein Stamm als

positiv getestet worden (0%). 6,2% der Stämme mit einer MHK von 0,06 mg/l

(insgesamt 81 Stämme, davon 5 penicillinasepositiv) produzierten eine Beta-Laktamase.

Von 99 Stämmen mit einer MHK von 0,12 mg/l waren 23 positiv. Die Rate der

penicillinasebildenden Stämme mit einer MHK von 0,12 mg/l lag bei 23,2% (Tab. 6)

35

Tab. 6: Korrelation von Penicillin-MHK im VITEK 2 und Nachweis von blaZ

MHK in mg/l N Anzahl blaZ positiver

Stämme /Anzahl

Stämme gesamt

Anzahl blaZ

positiver Stämme

≤ 0,03 17 0% 0

0,06 81 6,2% 5

0,12 99 23,2% 23

36

4 Diskussion

Fast 80% der klinisch isolierten Stämme von S. aureus weisen heutzutage eine

Resistenz gegenüber Penicillin G und seinen Derivaten auf [13, 32]. Verursacht wird

diese Resistenz durch Penicillinasen, also Beta-Laktamasen, die in der Lage sind, den

Beta-Laktamring der Antibiotika zu spalten und sie so unwirksam zu machen. S. aureus

gilt zusammen mit den koagulasenegativen Staphylokokken als einer der

Hauptverursacher von nosokomialen Bakteriämien und ambulant erworbenen

Infektionen [10, 36, 46]. Da Penicillin nach wie vor Mittel der Wahl bei S. aureus

Stämmen ist [16, 38], welche keine Penicillinase bilden, ist eine zuverlässige

Identifikation von Beta-Laktamaseproduzenten wichtig. Eine falsch sensible Messung

in der Testung auf die Empfindlichkeit gegenüber Penicillin kann in einer inadäquaten

Therapie und damit in einer potentiell lebensgefährlichen Situation für den Patienten

resultieren.

Verglichen mit unserer molekularbiologischen Referenzmethode stellten sich als relativ

sensitive und gut durchführbare phänotypische Methoden die Charakterisierung des

Hemmhofrandes mit einer Sensitivität von 71,4 % und der Cloverleaf-Test mit 67,8 %

heraus [22]. Beide Methoden sind leicht durchzuführen und mit etwas Übung sicher

abzulesen. Nachteil ist die Bebrütungsdauer von ca. 12 Stunden, bis ein

Bakterienwachstum stattgefunden hat.

Als Methoden mit geringer Sensitivität für die Erkennung einer Penicillinase in S.

aureus stellten sich der Nitrocefin-Test und der Jod-Stärke-Test heraus. Der Nitrocefin-

Test war einfach und schnell durchzuführen, jedoch war die Interpretation oft schwierig

und die höchste Sensitivität nach 60 min betrug 39,3 %. Der Jod-Stärke-Test war nicht

nur schwierig abzulesen, er war auch aufwändig durchzuführen, da die Reagenzien vor

dem Test frisch zusammengestellt werden mussten. Seine Sensitivität betrug 42,9 %

[22].

28 mm gelten nach CLSI [7] als Grenzwert zur Unterscheidung zwischen

penicillinsensiblen und penicillinresistenten, und damit zwischen penicillinasepositiven

und -negativen S. aureus-Stämmen. Stämme mit einem Hemmhofdurchmesser von

kleiner oder gleich 28 mm gelten als resistent gegen Penicillin. Stämme, die einen

größeren Hemmhofdurchmesser besitzen, gelten als sensibel gegenüber Penicillin.

Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass dieser Grenzwert keineswegs verlässlich ist. Von

den 16 Stämmen, die einen Hemmhofdurchmesser von ≤ 28 mm besaßen, wurden zwei

Stämme in der PCR als penicillinasenegativ getestet. Zwölf Stämme besaßen in der

Testung mit der PCR eine Penicillinase, obwohl ihr Hemmhofdurchmesser größer als

37

28 mm war. Die Verteilung der Hemmhofdurchmesser von penicillinasepositiven und

penicillinasenegativen Stämmen überschneidet sich. Damit ist die Festlegung eines

Grenzwertes nicht möglich und die nach CLSI festgelegten Grenzwerte sind nicht

sicher, d.h. auch wenn der Hemmhofdurchmesser mehr als 28 mm beträgt, kann eine

Penicillinase nicht ausgeschlossen werden.

Der Nitrocefin-Test besaß bei uns eine Sensitivität von 39,3% trotz Induktion mit

Penicillin und einer Inkubationszeit von 60 min. In anderen Studien erreichte er 82%

[1], 86,2% [4], 95,6% [19], 70,8-97,9%, abhängig von der Induktionsmethode und dem

verwendeten Agar [34], und 62,1-100%, abhängig vom Hersteller des Nitrocefin-Tests

[35]. Auch der Jod-Stärke-Test konnte in einer anderen Studie eine Sensitivität von

100% aufweisen [33]. In unseren Ergebnissen zeigte der Cloverleaf-Test eine

Sensitivität von 67,8%. In früheren Studien wurde über Sensitivitäten von 93,8% [19],

97,9% [34] und 96,6% [37] berichtet.

Oberhofer und Towle [33] zeigten, dass der Jod-Stärke-Test in Form des Penicillinase-

Paper-Strip-Tests verlässlich, schnell, einfach zu handhaben und billig war. Er wurde

mit azidometrischen und iodometrischen Methoden verglichen, wobei der

Agardiffusions-Test als Referenzmethode diente. In dieser Studie wies der Jod-Stärke-

Test eine hohe Korrelation mit den konventionellen Tests und der Referenzmethode auf;

es gab keine falsch positiven oder negativen Ergebnisse.

Auch bei Jarløv und Rosdahl [19] schnitt der Jod-Stärke-Test im Vergleich zum

Cloverleaf- und Nitrocefin-Test als bester Test ab. Kein phänotypischer Test erkannte

alle penicillinaseproduzierenden Stämme. Es wurden Stämme verwendet, die aus

vorherigen Studien als Penicillinaseproduzenten oder -nichtproduzenten bekannt waren.

Der Jod-Stärke-Test meldete als einziger Test keine falsch positiven Ergebnisse.

Petersson et al. [34] verglichen den Cloverleaf-Test, den Jod-Stärke-Test, den

Nitrocefin-Test und den Agardiffusions-Test mit der quantitativen macroiodometrischen

Methode nach Perret [35]. Hierbei stellte sich der Jod-Stärke-Test ebenfalls als

zuverlässig heraus, wenn man methicillin-induzierte Stämme verwendete. Allerdings

wurde bemängelt, dass der Test aufwändig durchzuführen sei, da die Reagenzien frisch

zusammengestellt werden müssen. Dieses deckt sich mit unseren Erfahrungen. Der

Agardiffusions-Test und der Cloverleaf-Test meldeten viele falsch positive und negative

Ergebnisse und wurden als nur begrenzt einsetzbar eingestuft. Diese zu unseren

widersprüchlichen Ergebnisse könnten auf die verschiedenen Referenzmethoden (bei

uns eine molekularbiologische Referenzmethode mit der PCR, sonst phänotypische wie

Agardiffusionstest) und unterschiedliche Versuchsdurchführungen zurückzuführen sein.

38

So wurden z.B. beim Cloverleaf-Test Blutagarplatten statt Mueller-Hinton-Platten

verwendet und als Indikator S. pneumoniae anstelle von ATCC 25923 benutzt.

In vielen Studien stellte sich der Jod-Stärke-Test als die beste und sicherste Methode

dar, auch wenn er aufwändig durchzuführen ist [19, 33, 34]. Ebenso schnitt der

Nitrocefin-Test oft gut ab, allerdings mit der Einschränkung, dass er oft schwierig zu

interpretieren sei [34]. In der von uns durchgeführten Studie wiesen diese beiden Tests

die niedrigsten Sensitivitäten für die Erkennung einer Penicillinase auf. Zudem waren

sie schwierig abzulesen und im Falle des Jod-Stärke-Tests aufwändig durchzuführen.

Der Cloverleaf-Test gilt bei Petersson et al. als unzuverlässig [34], während er bei uns

eine hohe Sensitivität aufweist. Der Grund für diesen Unterschied könnte in

Abweichungen in der Durchführungen liegen. Wir verwendeten Mueller-Hinton- und

nicht Kochblutagar, zudem wurden unterschiedliche Indikatorstämme verwendet.

Eine Übereinstimmung mit der Studie von Petersson et al. besteht darin, dass die Größe

des Penicillin-Hemmhofes für die Aussage, ob eine Penicillinase vorliegt oder nicht,

unzuverlässig ist [34].

Im Agardiffusions-Test wurde neben der Hemmhofgröße von Penicillin auch die

Hemmhofgröße von Mecillinam gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich kein

Grenzwert festlegen lässt, der eindeutig zwischen penicillinaseproduzierenden und –

nichtproduzierenden Stämmen unterscheidet [22].

Bruun und Gahrn-Hansen [4] verglichen 2001 die Hemmhofgröße von Mecillinam mit

der Größe und dem Charakter des Hemmhofes von Penicillin, dem Nitrocefin- und dem

Cloverleaf-Test in Bezug auf die Penicillinaseproduktion von S. aureus.

Penicillinsensible Stämme besaßen größere Hemmzonen um Mecillinam herum als

Stämme, die gegen Penicillin resistent waren. Alle Stämme wurden zwei Mal getestet.

Falls eine Diskrepanz in den Ergebnissen auftrat wurde die Testung ein drittes Mal

wiederholt und mit den Ergebnissen des Cloverleaf-Tests, Agardiffusions-Tests und

Cefisone-Tests (anstelle von Nitrocefin) verglichen. Die Autoren kamen zu dem

Ergebnis, dass bei einer Mecillinam-Hemmhofgröße von > 22 mm keine Penicillinase

produziert wird. Sie stuften die Messung der Hemmhofgröße von Mecillinam als gut

durchführbaren, verlässlichen Zusatztest ein, der sicherer sei als die Hemmgröße von

Penicillin.

Die Diskrepanzen der Ergebnisse unserer Studie und der von Bruun und Gahrn-Hansen

sind letztlich unklar. Im Gegensatz zu Bruun und Gahrn-Hansen verwendeten wir

jeweils eine Antibiotikabeschickung von 10 µg, während in der dänischen Studie die

Penicillinbeschickung bei 5 µg und die Mecillinambeschickung bei 33 µg lag. Zudem

39

führten wir den Agardiffusions-Test auf Mueller-Hinton-Agarplatten durch und nicht

auf Kochblutagar.

Die niedrigeren Sensitivitäten der phänotypischen Tests könnten durch die streng

selektierte Stamm-Auswahl der Isolate mit geringer MHK im VITEK 2 hervorgerufen

worden sein.

Im Gegensatz zu den meisten der zitierten Studien, wurde in unserer Studie ein

molekularer Goldstandard benutzt. Nur Pittkälä et al. verwendeten ebenfalls die PCR als

Goldstandard, mit dem Unterschied, dass nur bovine S. aureus-Stämme getestet wurde

[37].

S. aureus ist eine der Hauptursachen für ambulant erworbene Infektionen und für

nosokomiale Bakteriämien [10, 36, 46]. Die Letalität ist hoch, sie erreicht in

verschiedenen Studien zwischen 19% und 34% [20, 21, 26, 29]. Deshalb ist es wichtig

möglichst schnell mit einer gezielten Antibiotikatherapie zu beginnen. Als wirksames

Antibiotikum gegen S. aureus gilt nach wie vor Penicillin G, vorausgesetzt, der

krankheitsverursachende S. aureus Stamm besitzt keine Penicillinase und ist sensibel.

Jedoch sind S. aureus-Stämme ohne Penicillinase selten.

Um sicher zwischen penicillinsensiblen und –resistenten Stämmen zu unterscheiden,

muss es einen schnellen und einfach durchführbaren Test geben, damit die Therapie von

S. aureus Infektionen optimiert wird. Dabei sollte der Test eine hohe Sensitivität in der

Detektion von Penicillinasen aufweisen, denn eine falsch angegebene Empfindlichkeit

gegenüber Penicillin kann zu einer potenziell gefährlichen inadäquaten Therapie von S.

aureus Infektionen führen.

Labore, die den VITEK 2 benutzen, um die Empfindlichkeit von S. aureus zu testen,

haben das Problem, dass eine MHK von ≤ 0,12 mg/l laut CLSI formal bedeutet, dass

das Isolat penicillinsensibel ist [7]. Da aber Probleme in der Detektion von

Penicillinasen bei S. aureus bekannt sind, ist ein zusätzlicher Test für Penicillin nötig.

Limitation unserer Studie ist, dass die PCR als Goldstandard nur nachweisen kann, ob

ein Stamm das nötige Gen zur Produktion einer Penicillinase in seiner DNA besitzt. Das

Vorhandensein dieses Gens garantiert jedoch nicht die phänotypische Expression der

Penicillinase; der jeweilige Stamm muss also nicht tatsächlich gegen Penicillin resistent

sein. Durch Mutationen in der Promotorregion oder Nonsense-Mutationen, bei denen es

zu keiner Proteinbildung kommt, kann die Expression einer Penicillinase verhindert

werden.

40

Während wir in dieser Studie Diskrepanzen in den Ergebnissen bedingt durch einen

Plasmidverlust mittels einer geeigneten Planung der Experimente ausschließen konnten,

ist zu beachten, dass in der Routinediagnostik Isolate bei Mischkulturen ein bis zwei

Mal passagiert werden müssen. Dabei ist das Risiko für einen Plasmidverlust gegeben

und falsch negative Ergebnisse der Testung auf Penicillinase sind prinzipiell denkbar.

Die für die PCR verwendeten Primer wurden so gewählt, dass sie bei allen vier derzeit

bei Staphylokokken bekannten Penicillinase-Genen binden. Dennoch sind durch

Auftreten neuer Penicillinasen bei Staphylokokken oder Mutationen in den

Primerbindungsstellen falsch negative PCR-Ergebnisse möglich.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der Gebrauch des Nitrocefin- oder Jod-

Stärke-Tests als zusätzliche Methode zur Testung auf Penicillinasen für Isolate mit einer

MHK von 0,06 mg/l oder 0,12 mg/l im VITEK 2 nicht geeignet ist. Höhere

Sensitivitäten weisen die Charakterisierung des Hemmhofrandes und der Cloverleaf-

Test auf. Es könnte aber zu falsch-negativen Ergebnissen kommen. Wenn bei schweren

S. aureus-Infektionen eine sehr hohe diagnostische Sicherheit vor der Entscheidung zu

einer Penicillin-Therapie nötig ist, sollte das Vorliegen einer Penicillinase durch eine

blaZ PCR ausgeschlossen werden [22].

41

5 Zusammenfassung

Heute weisen über 80% der S. aureus Stämme eine Penicillinase auf [13, 32]. Diese

vermittelt die Resistenz gegenüber Penicillin, wobei das kodierende Gen für die

Penicillinase blaZ ist. Da Penicillin nach wie vor als Mittel der Wahl gegen

penicillinsensible S. aureus-Isolate ohne Penicillinasebildung gilt, sind zuverlässige

diagnostische Verfahren zum Ausschluß einer Penicillinase nötig. Gemäß CLSI [7]

sollen S. aureus-Isolate mit einer formal sensiblen MHK von ≤ 0,12 mg/l nachgetestet

werden.

In dieser Studie wurden fünf phänotypische Methoden (Cloverleaf-Test,

Charakterisierung des Hemmhofrandes, Agardiffusions-Test, Nitrocefin-Test, Jod-

Stärke-Test) mit einer blaZ PCR verglichen. Dazu wurden 197 S. aureus Stämme

getestet. Der Jod-Stärke-Test und der Nitrocefin-Test wiesen geringe Sensitivitäten von

42,9% und 35,7% auf. Zudem war die Durchführung des Jod-Stärke-Tests sehr

aufwendig, da die Reagenzien immer frisch zubereitet werden mussten. Der Cloverleaf-

Test und die Charakterisierung des Hemmhofrandes zeigten Sensitivitäten von 67,8%

und 71,4%. Diese Methoden könnten unter bestimmten Umständen routinemäßig

durchgeführt werden, sie waren jedoch nicht so sensitiv wie die Referenzmethode [22].

Der Agardiffusions-Test mit der Bestimmung der Hemmhofgröße erreichte nur eine

Sensitivität von 71,4% für die Penicillinase-Detektion und ist daher nicht zur sicheren

Unterscheidung zwischen penicillinsensiblen und –resistenten Stämmen geeignet.

Die besten phänotypischen Methoden zum Ausschluß einer Penicillinase sind demnach

der Cloverleaf-Test und die Charakterisierung des Penicillin-Hemmhofrandes. Ist bei

schweren S. aureus-Infektionen vor Entscheidung zur Penicillintherapie eine sehr hohe

diagnostische Sicherheit erforderlich, sollte eine Penicillinase mittels blaZ-PCR

ausgeschlossen werden [22].

42

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48

[47] Wikipedia – Die freie Enzyklopädie ( Zugriff vom 08.11.2009)

http://de.wikipedia.org/wiki/B-Lactam-Antibiotika

[48] Wikipedia – Die freie Enzyklopädie ( Zugriff vom 08.11.2009)

http://de.wikipedia.org/wiki/ Methicillin

[49] Zygmunt, D. J., Stratton, C. W., Kernodle, D. S. (1992). Characterization of four

beta-lactamases produced by Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents

Chemother 36, 440-445

49

Danksagungen

Mein besonderer Dank gilt:

Herrn Prof. Dr. med. Soeren G. Gatermann für die freundliche Überlassung des

Themas, sowie für die hervorragende Betreuung,

Herrn Dr. med. Martin Kaase für eine sehr gute Betreuung und die stete Bereitschaft

meine Fragen zu beantworten und mir bei der Erstellung der Dissertation zu helfen,

Allen Mitarbeitern der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität-

Bochum für die herzliche Aufnahme und stete Hilfsbereitschaft, insbesondere Susanne

Friedrich für die gute Organisation des praktischen Teils dieser Arbeit und für die gute

Beratung,

Frau Sabine Loose-Kuhlenberg dafür, dass sie immer als Ansprechpartnerin da war und

einen wesentlichen Teil dazu beigetragen hat, dass die Arbeit auch nach dem Umzug

nach Hamburg fertiggestellt werden konnte,

Tim für seine Hilfe bei der Formatierung und der Bearbeitung der Dissertation. Ohne

seine wiederholten Rettungen hätte es die Arbeit in dieser Form nicht gegeben.

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Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Sarah Magdalena Lenga

Geburtsdatum 11.01.1983

Geburtsort Herne

Familienstand Ledig

Berufliche Laufbahn

01/2009 bis 12/2009 Assistenzärztin in der Abteilung für Kardiologie,

Angiologie und Intensivmedizin

Marienhospital Gelsenkirchen

Chefarzt Prof. Dr. med. H. Blanke

Seit 01/2010 Assistenzärztin in der Abteilung für Innere Medizin

und geriatrische Frührehabilitation

Krankenhaus Groß Sand, Hamburg

Chefarzt Prof. Dr. med. R. Scola

51

Ausbildung und Studium

08/1989 bis 06/1992 Grundschule an der Vellwigstrasse, Herne

08/1992 bis 06/1993 Albert-Schweitzer Grundschule, Datteln

08/1993 bis 06/2002 Comenius Gymnasium, Datteln

Abschluss: Abitur

10/02 bis 11/08 Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum

08/2004 Ärztliche Vorprüfung

08/07 bis 07/08 Praktisches Jahr:

Innere Medizin: Prosper-Hospital Recklinghausen

Anästhesie: Prosper-Hospital Recklinghausen

Chirurgie: Prosper-Hospital Recklinghausen

10/2008 Abschluss des Medizinstudiums: Staatsexamen

Seit 06/2006 Promotion in der Abt. für Medizinische Mikro-

biologie der Ruhr-Universität Bochum über das

Thema: „Vergleich von fünf phänotypischen

Methoden zur Penicillinasedetektion bei S. aureus“

unter der Leitung von Prof. Dr. S. Gatermann

Famulaturen

02/2005 bis 03/2005 Praxis für Allgemeinmedizin Dr. M. Bergmann,

Recklinghausen

02/2006 bis 03/2006 Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil,

Klinikum der Ruhr-Universität Bochum

Abteilung für Kardiologie und Angiologie

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(Prof. Dr. A. Mügge)

07/2006 bis 08/2006 Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil,

Klinikum der Ruhr-Universität Bochum

Institut für Radiologie (Prof. Dr. V. Nicholas)

09/2006 bis 10/2006 Institut für Medizinische Mikrobiologie der Stadt Bochum

(Prof. Dr. S. Gatermann)

02/2007 bis 03/2007 St. Josef-Hospital, Klinikum der Ruhr-Universität

Bochum

Neurologische Klinik (Prof. Dr. R. Gold)

Kenntnisse und Fähigkeiten

Sprachen Englisch fliessend in Wort und Schrift

Italienisch gute Kenntnisse

Spanisch Grundkenntnisse

Französisch Grundkenntnisse

EDV Office, Outlook

Hamburg, den 08.07.2010

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