Aus der Kinder- und Jugendklinik der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Wolfgang Rascher

Intrauterine Wachstumsrestriktion der Ratte: Charakterisierung hormoneller Einflüsse am Modell der duktalen Morphogenese

der pubertären Brustdrüse

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von Nina Fährmann aus München

2012

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Wolfgang Rascher Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Andrea Hartner Tag der mündlichen Prüfung: 29. April 2013

Inhaltsverzeichnis

1 ZUSAMMENFASSUNG .................................... ................................................1

1.1 ZUSAMMENFASSUNG IN DEUTSCHER SPRACHE .....................................................1 1.2 ABSTRACT ..........................................................................................................3

2 EINLEITUNG.....................................................................................................5

2.1 DIE WEIBLICHE BRUSTDRÜSE ..............................................................................5 2.1.1 ANATOMIE...........................................................................................................5 2.1.2 MORPHOGENESE DER BRUSTDRÜSE DER RATTE ...................................................6 2.1.3 HORMONELLE EINFLÜSSE AUF DIE ENTWICKLUNG DER BRUSTDRÜSE .....................7 2.1.3.1 Zentrale Einflüsse auf die Entwicklung der Brustdrüse ......................................8 2.1.3.2 Lokale Einflüsse auf die Entwicklung der Brustdrüse.........................................9 2.2 FETALE PROGRAMMIERUNG BEI INTRAUTERINER WACHSTUMSRESTRIKTION [IUGR]

UND IHRE WIRKUNG AUF PUBERTÄT BZW . BRUSTDRÜSENENTWICKLUNG ..............11 2.2.1 DEFINITION VON FETALER PROGRAMMIERUNG.....................................................11 2.2.2 DEFINITION VON IUGR UND IHRE FOLGEN IM ALLGEMEINEN .................................13 2.2.3 AUSWIRKUNGEN VON FETALER PROGRAMMIERUNG BEI IUGR AUF PUBERTÄT BZW.

BRUSTDRÜSENENTWICKLUNG IM SPEZIELLEN......................................................14 2.2.3.1 Einflüsse von IUGR auf Pubertät bzw. Brustdrüsenentwicklung im Tiermodell 15 2.2.3.1.1 Nutritive Einflüsse auf Pubertät bzw. Brustdrüsenentwicklung im Tiermodell

16 2.2.3.1.2 Durch Ligatur der Arteria uterina bedingte Einflüsse auf Pubertät bzw.

Brustdrüsenentwicklung im Tiermodell ............................................................18 2.2.3.2 Einflüsse von IUGR auf Pubertät bzw. Brustdrüsenentwicklung beim Menschen

........................................................................................................................19 2.2.4 KLINISCHE RELEVANZ VON IUGR BEZÜGLICH PUBERTÄT BZW.

BRUSTDRÜSENENTWICKLUNG UND AUSBLICK AUF FEHLREGULATION DER BRUSTDRÜSENENTWICKLUNG DES MENSCHEN IM HINBLICK AUF EINE PRÄDISPOSITION FÜR BRUSTKREBS....................................................................21

3 FRAGESTELLUNG...................................... ...................................................24

4 METHODEN....................................................................................................25

4.1 ÜBERBLICK .......................................................................................................25 4.2 TIERMODELL .....................................................................................................26 4.3 WHOLE-MOUNT ANALYSE .................................................................................28 4.4 PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN-FÄRBUNG [PCNA] ............................30 4.5 REVERSE TRANSKRIPTASE -POLYMERASE-KETTENREAKTION [RT-PCR]..............35 4.5.1 RNA-ISOLATION ................................................................................................35 4.5.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ......................................................................37 4.5.3 PHOTOMETRIE ..................................................................................................38 4.5.4 REVERSE TRANSKRIPTION .................................................................................39 4.5.5 TAQMAN-REAL-TIME POLYMERASE-KETTENREAKTION ........................................40 4.6 ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY [ELISA]............................................ 44 4.7 LIQUID CHROMATOGRAPHY TANDEM MASSENSPEKTROMETRIE [LC-TANDEM-MS]

........................................................................................................................46 4.8 GENE-ARRAY ...................................................................................................50 4.9 STATISTISCHE DATENAUSWERTUNG ...................................................................53

5 ERGEBNISSE................................................................................................. 54

5.1 AUXIOLOGISCHE DATEN DER TIERE ................................................................... 54 5.2 WHOLE-MOUNT ANALYSE ................................................................................. 55 5.2.1 PROZENTUALER ANTEIL DUKTO-ALVEOLÄRER STRUKTUREN AM MAMMÄREN

FETTKÖRPER DER LUMBALEN GESAMTBRUSTDRÜSE ........................................... 56 5.2.2 AUSDEHNUNG DUKTO-ALVEOLÄRER STRUKTUREN IM FETTGEWEBSKÖRPER ......... 57 5.3 PROLIFERATIONSRATE ÜBER IMMUNHISTOCHEMISCHE FÄRBUNG MITTELS PCNA-

ANTIKÖRPER .................................................................................................... 58 5.4 HEPATISCHE MRNA-EXPRESSIONSRATE VON IGF-1 UND IGFBP-1 MITTELS RT-

PCR ................................................................................................................ 59 5.5 PROTEINEXPRESSIONSRATE VON IGF-1 IM SERUM MITTELS ELISA ..................... 61 5.6 STEROIDHORMON-PROFIL MITTELS TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE ................ 61 5.6.1 MINERALO- UND GLUCOCORTICOIDE .................................................................. 63 5.6.1.1 Corticosteron / Dehydrocorticosteron .............................................................. 63 5.6.1.2 Deoxycorticosteron.......................................................................................... 64 5.6.2 SEXUALHORMONE ............................................................................................. 64 5.6.2.1 Progesteron..................................................................................................... 64 5.6.2.2 Dehydroepiandrosteron / Dehydroepiandrosteron-Sulfat ................................. 65 5.7 ANALYSE VERÄNDERTER GENEXPRESSIONSRATEN DER MAMMA MITTELS GENE-

ARRAY ............................................................................................................. 66

6 DISKUSSION.................................................................................................. 69

6.1 AUXIOLOGISCHE DATEN .................................................................................... 69 6.2 HISTOLOGISCHE ANALYSEN DER MAMMA ........................................................... 71 6.3 ANALYSE SYSTEMISCHER HORMONVERÄNDERUNGEN ......................................... 77 6.3.1 GH-IGF-1-ACHSE............................................................................................. 77 6.3.1.1 Hepatische mRNA-Expressionsrate von IGF-1 und IGFBP-1 .......................... 80 6.3.1.2 Proteinexpressionsrate von IGF-1 im Serum ................................................... 81 6.3.2 STEROIDHORMON-PROFIL IM SERUM.................................................................. 82 6.3.2.1 Mineralo- und Glucocorticoide ......................................................................... 84 6.3.2.1.1 Corticosteron und Dehydrocorticosteron ................................................... 84 6.3.2.1.2 Deoxycorticosteron ................................................................................... 85 6.3.2.2 Sexualhormone ............................................................................................... 85 6.3.2.2.1 Progesteron .............................................................................................. 85 6.3.2.2.2 DHEA und DHEAS.................................................................................... 87 6.4 ANALYSE DES MAMMÄREN EXPRESSIONSPROFILS MITTELS GENE-ARRAY ............ 89 6.5 AUSBLICK ........................................................................................................ 92

7 LITERATURVERZEICHNIS ............................... ............................................. 93

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................. ....................................... 105

1

1 Zusammenfassung

1.1 Zusammenfassung in deutscher Sprache

Hintergrund und Ziele

Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung von Veränderungen im Ablauf der pubertä-

ren Brustdrüsenentwicklung der weiblichen Ratte nach intrauteriner Wachstumsrestrik-

tion [IUGR]. Neben einer unmittelbaren Erhöhung des perinatalen Risikos, trägt IUGR

auch zu gesundheitlichen Spätfolgen (z.B. Pubertas praecox, Adipositas, Diabetes melli-

tus Typ 2) im Jugend- und Erwachsenenalter bei. Neben diesen klassischen Folgen der

IUGR finden sich Hinweise auf eine gestörte Entwicklung der weiblichen Brustdrüse

mit konsekutiv erhöhter Suszeptibilität gegenüber Karzinogenen. Eine gesteigerte Proli-

ferationsrate epithelialer Strukturen in der Pubertät wird dabei als ursächlich diskutiert.

Die dieser Störung zugrunde liegenden endokrinen Mechanismen sind bislang nur in

Ansätzen geklärt.

Material und Methoden

In der vorliegenden Arbeit wurde ein bereits etabliertes Proteinmangelmodell [low pro-

tein diet = LP] zur Induktion einer IUGR in der Ratte genutzt. Nach definierter intraute-

riner Mangelernährung erfolgte eine Wurfreduktion auf sechs weibliche Tiere, welche

postpartal wie die Kontrollgruppe [normal protein diet = NP] ernährt wurden. Organ-

und Blutentnahmen erfolgten zu Beginn (d 21) und Ende (d 28) der duktalen Morpho-

genese der Mamma. Auxiologische Daten der Tiere wurden kontinuierlich bestimmt.

Die Proliferation duktaler Strukturen der Mamma wurde morphometrisch in Quetsch-

präparaten und mittels PCNA-Färbung in Gewebsschnitten ermittelt. Die Expression

von insulin-like growth factor 1 [IGF-1] und seinem Bindeprotein [IGFBP-1] wurde

mittels real-time PCR in der Leber untersucht. Der Proteinnachweis von Serum-IGF-1

erfolgte im ELISA. Das Serum-Steroidhormon-Profil wurde via LC-Tandem-MS analy-

siert. Lokale mRNA-Expressionsmuster der Mamma wurden mit einem kommerziellen

Gene-Array und einer funktionellen pathway-Analyse in silico erfasst.

Ergebnisse und Beobachtungen

Weibliche LP-Tiere zeigten eine signifikante Wachstumsrestriktion, sowie Veränderun-

gen im Serum-Steroidhormon-Profil an d 28. Die lumbale Brustdrüse entwickelte sich

strukturell regelhaft, jedoch signifikant größenreduziert. Im Einzelnen wurden folgende

Ergebnisse erzielt:

2

1. Auxiologisch zeigte die LP-Gruppe ein signifikant reduziertes Gewicht bis d 28, die

Körperlänge fand sich nur bis d 21 signifikant reduziert.

2. Im Vergleich zu NP-Tieren zeigte sich in der LP-Gruppe an d 21 und d 28 eine un-

veränderte Dichte duktaler Strukturen, bei gleichzeitig reduzierter Gesamtfläche des

von drüsigen Anteilen eingenommenen mammären Fettkörpers.

3. In den LP-Tieren war die Proliferationsrate duktaler Elemente der Mamma, in Ana-

logie zu deren Ausdehnungsrate, an d 21 und d 28 signifikant erniedrigt.

4. Die Analyse des hepatischen IGF-1/IGFBP-1 Quotienten (mRNA), sowie von IGF-1

im Serum (Protein) ergab keine Gruppenunterschiede.

5. Das Serum-Steroidhormon-Profil an d 28 ergab in der LP-Gruppe erhöhte Progeste-

ron- und Deoxycorticosteron-Spiegel, sowie einen signifikant erhöhten Corticoste-

ron/Dehydrocorticosteron-Quotienten. LP-Tiere zeigten einen signifikanten Anstieg

der Corticosteron-Parameter von d 21 auf d 28, in der NP-Gruppe blieb dieser aus.

6. Die Gene-Array-Analyse lokaler Expressionsmuster identifizierte differentiell regu-

lierte Gene mit Assoziation zu Signalproteinen des MAP-Kinase-Signalwegs.

Praktische Schlussfolgerungen

In unserem IUGR-Modell zeigte sich an d 21 und an d 28 eine reduzierte Proliferations-

rate duktaler Strukturen der Brustdrüse. Dieser Befund ist divergent zu einem ähnlichen,

in der Literatur beschriebenen Modell (Mangelernährung intrauterin und bis d 21

postpartal), bei dem sich an d 28 eine gesteigerte Proliferationsrate mit Aufholwachs-

tum des mammären Drüsenkörpers zeigte. Über den Einfluss intrauteriner Mangelernäh-

rung hinaus lassen diese diskrepanten Proliferationsraten beider Modelle einen additi-

ven und ggf. unabhängigen Effekt postnataler, präpubertärer Alimentation auf die Sus-

zeptibilität der unreifen Brustdrüsenanlage gegenüber Kanzerogenen vermuten. Die

Erhöhung des Progesteron-Spiegels im Serum der LP-Tiere könnte hinweisend auf eine

Pubertas praecox sein. Ein verfrühter Eintritt in die Pubertät erhöht das Brustkrebsrisiko

beim Menschen. Progesteron wird in geringen Mengen in der Nebenniere, in höheren

Mengen jedoch erst ab d 38 in den Corpora lutea der Ratte gebildet. In weiteren Unter-

suchungen gilt es daher zu klären, ob LP-Tiere tatsächlich eine verfrühte Gonarche zei-

gen oder ob diese Veränderungen durch Dysregulationen der hypothalamisch-

hypophysär-adrenalen Achse bedingt werden. Erhöhte Progesteron-Spiegel könnten

ursächlich für die beobachteten Veränderungen im MAP-Kinase-Signalweg sein. Ein

gesteigerter enzymatischer Umsatz des erhöhten Progesterons in Glucocorticoide könnte

die Brustdrüsenentwicklung in der LP-Gruppe hemmen.

3

1.2 Abstract

Objective

The objective of this study is the characterisation of the developmental processes of

pubertal mammary development in female rats following intrauterine growth restriction

[IUGR]. Besides increasing the perinatal risk of neonates, IUGR leads to long-term

health consequences in adolescents and adults (e.g. precocious onset of puberty, obesity,

diabetes mellitus type 2). Beyond these classic sequelae of IUGR there is a growing

body of evidence linking IUGR to a disruption of pubertal female mammary gland de-

velopment with a subsequent increase of the organ’s susceptibility to carcinogens.

Etiopathogenetically, an increase in the proliferation rate of epithelial structures during

puberty is discussed. So far, the exact causative endocrine mechanisms remain greatly

elusive.

Materials and Methods

Our study utilised the well-established rat model of IUGR induced via intrauterine pro-

tein restriction [low protein diet = LP]. Following intrauterine malnutrition, litter size

was reduced at birth to six female rats which were fed the diet of the control group

[normal protein diet = NP] after birth. Organ and blood samples were taken at the start

(d 21) and at the end (d 28) of mammary ductal morphogenesis. Auxiologic data of the

animals were recorded continuously. The proliferation of ductal structures in the mam-

mary fat pad was studied morphometrically in whole mount preparations and via stain-

ing for PCNA in histological sections. The expression of insulin-like growth factor 1

[IGF-1] and its binding protein IGFBP-1 was analyzed by real-time PCR in the liver.

IGF-1 serum protein levels were measured using ELISA. Serum steroid profiling was

conducted via LC-tandem-MS. To identify local mRNA expression profiles at the dif-

ferent time points, mammary glands were subjected to a commercial gene-array analysis

followed by a functional pathway analysis in silico.

Results

Along with a significant growth restriction, female LP-rats showed an altered serum

steroid profile at d 28. The lumbar mammary gland developed regularly, however, it

showed a significant reduction in size. In detail, the following results were obtained:

1. Auxiologically, the LP-group showed a sustained reduction in weight until d 28,

length was significantly reduced up to d 21 only.

4

2. When compared to NP-rats, ductal structures in LP-mammary glands were of the

same density, the percentage of mammary fat pad that was occupied by these ductal

structures, however, was significantly reduced.

3. In analogy to the rate of ductal expansion, the proliferation rate of ductal elements

within the mammary gland of LP-rats was significantly reduced on d 21 and d 28.

4. No differences were observed in the hepatic IGF-1/IGFBP-1 ratio (mRNA) and in

serum IGF-1 (protein) in both experimental groups.

5. Profiling of serum steroids in the LP-group showed a significant increase of proges-

terone and deoxycorticosterone levels at d 28, as well as an increased corticoster-

one/dehydrocorticosterone ratio. While the latter parameters significantly increased

from d 21 to d 28 in LP-rats, respective changes were not observed in the NP-group.

6. Analysis of mammary gland expression profiles by gene-array analysis revealed dif-

ferentially expressed genes with association to signal proteins of the MAP-kinase-

pathway.

Conclusion

In our IUGR animal model a reduced proliferation of mammary ductal structures at d 21

and d 28 was demonstrated. This finding is divergent to observations from a similar

animal model (intrauterine malnutrition continued to d 21 of life) from the literature,

where an increase of mammary gland development (organ catch-up growth) at d 28 was

found. Beyond the impact of intrauterine malnutrition, the discrepant proliferation rates

of those models point to an additive and most likely independent effect of postnatal,

prepubertal alimentation on the susceptibility of the immature mammary gland to car-

cinogens. The increase in serum progesterone levels in the LP-group could be indicative

of a precocious puberty. Early onset of puberty has been linked to an increased breast

cancer risk in females. Progesterone production is found in the adrenal glands in minor

amounts. Physiologically, the corpora lutea produce progesterone at higher rates, how-

ever only starting at d 38. Hence, further studies are needed to clarify whether LP-rats

show an early gonarche, or if these changes rather represent a dysregulation of the hy-

pothalamic-pituitary-adrenal axis. Increased serum progesterone levels could contribute

to the changes in MAP-kinase signaling. An increased enzymatic turnover of progester-

one to corticosteroids could inhibit or delay mammary gland development in the LP-

group.

5

2 Einleitung

2.1 Die weibliche Brustdrüse

2.1.1 Anatomie Die weibliche Brustdrüse des Menschen wird in der Embryonalphase hormon-

unabhängig (124) in Form kleiner Drüsenbaum-Knospen angelegt (143). Diese befinden

sich zwischen der Geburt und dem Beginn der Pubertät im Alter von 8 bis 14 Jahren

(92) in einer Ruhephase (124). Die Pubertät ist nach van Weissenbruch et al. (140) defi-

niert als Beginn der Interaktionen zwischen Hypothalamus, Hypophyse und Gonaden.

Als Marker für die Pubertät gelten neben der zumeist als erstes auftretenden Brustent-

wicklung auch Menarche, Pubarche und Körperwachstum. Durch vermehrte Sekretion

des hypothalamischen Gonadotropin-Releasing-Hormons [GnRH] zu Beginn der Puber-

tät steigt die Östrogenproduktion der Ovarien, was die Entwicklung der Brustdrüse aus-

löst. Trigger für den Beginn der Pubertät dürften sich sowohl auf genetischer als auch

auf Ebene der Umwelteinflüsse finden, sind wissenschaftlich allerdings noch nicht voll-

ständig geklärt (10,33,92). Der Zeitraum, in dem sich über hormonelle Veränderungen

die Brustdrüse entwickelt, wird als Thelarche bezeichnet und nach Tanner in fünf Sta-

dien B 1 - B 5 eingeteilt (120): Stadium B 1 beschreibt kindliche Verhältnisse, Stadium

B 2 zeigt eine vergrößerte Brustdrüse sowie Vorwölbung und Vergrößerung der Areola.

In Stadium B 3 übersteigt das Volumen des Drüsenkörpers den Durchmesser der Areo-

la. Stadium B 4 zeichnet sich durch eine zweite Vorwölbung bestehend aus Mamille

und Areola aus. Stadium B 5 beschreibt die voll entwickelte Brust.

Histologisch besteht eine reife Brustdrüse aus 15 - 20 tubulo-alveolären Drüsenein-

heiten. Die Drüsenendstücke, Azini, besitzen ein ein- bis zweischichtiges Epithel und

sind von Myoepithelzellen umgeben. Kommt es zu einer Schwangerschaft, erweitern

sich die Azini zu alveolären Endstücken mit einschichtigem Epithel. Sie münden in die

mit zweischichtigem Epithel ausgekleideten Milchgänge, Ductus lactiferi. Nach ihrem

Zusammenfluss in einen Ductus lactifer colligens erreichen sie die Brustwarze. Durch

das die Gangstrukturen umgebende Binde- und Fettgewebe wird die Brustdrüse in Drü-

senlappen und -läppchen unterteilt (117).

Der histologische Aufbau der präpubertären Brustdrüse des Menschen gleicht dem der

Ratte. Beide bestehen aus dukto-alveolären Einheiten und unterscheiden sich stark vom

rein duktalen Aufbau der Brustdrüse der Maus (59).

6

Auch die Karzinogenese des Menschen weist nach Russo et al. (111,113) große Pa-

rallelen zu derjenigen der Ratte auf.

Unter diesen Voraussetzungen erscheint es zur Klärung der hier untersuchten Frage-

stellung (vgl. Kapitel 3) zielführend, die Brustdrüse der Ratte zu untersuchen, um daraus

Rückschlüsse auf die Pathophysiologie des Menschen ziehen zu können.

2.1.2 Morphogenese der Brustdrüse der Ratte

Abbildung 2.1 Schematische Darstellung eines „terminal end bud“ mit seinen relevanten Strukturen (modifiziert nach (123)).

Durch die pubertären Hormonveränderungen initiiert (vgl. Kapitel 2.1.3), wachsen aus

den embryonal angelegten Drüsenknospen die sogenannten „terminal end buds“ [TEB]

aus (Abbildung 2.1). Diese bilden die leitenden Strukturen zur Entstehung der Drüsen-

gänge und bestehen aus einer mehrschichtigen Endauftreibung mit „body cells“ im In-

neren und einer äußeren Schicht „cap cells“. Zwischen den Drüsenepithelzellen und der

Basalmembran befinden sich die myoepithelialen Zellen. Außerhalb der Basalmembran

sind die TEB seitlich von Fibroblasten, Adipozyten, Makrophagen und Kollagen umge-

ben. Die weitgehend lumenlosen TEB wachsen immer weiter ins Fettgewebe ein, bis sie

dieses schließlich völlig ausfüllen. An dem der Mamille zugewandten Ende der TEB

bilden sich nach Apoptose (83) der body cells die duktalen Lumina (64,124).

7

Abbildung 2.2 Schematische Darstellung des Brustdrüsenbaums der Ratte in seinen zeitlich versetzt auftretenden Stadien: „terminal end buds“, „alveolar buds“, „terminal ducts“ und primitive Lobuli (modifiziert nach (114)).

Nachdem die Anzahl der TEB ihren Höchststand erreicht hat, spalten sich diese unter

dem zyklischen Einfluss der Östrogene in kleinere sogenannte „alveolar buds“ [AB]

und primitive Lobuli (Abbildung 2.2). Mit zunehmendem Alter der jungfräulichen Ratte

verlieren die TEB an Durchmesser und werden dann als „terminal duct“ [TD] bezeich-

net. Kommt es zu einer Schwangerschaft, führen die veränderten hormonellen Verhält-

nisse zu aktiver Zellproliferation. Die TEB entwickeln sich verstärkt zu AB und weiter

zu Lobuli. Nach dem Abstillen kollabieren die sekretorischen alveolären Strukturen und

werden von Makrophagen beseitigt. Die Morphologie nach der Schwangerschaft ähnelt

somit wieder derjenigen vor der Schwangerschaft, wobei die TEB aber durch AB und

Lobuli ersetzt sind (112,111).

2.1.3 Hormonelle Einflüsse auf die Entwicklung der Brustdrüse Vorab zu erwähnen ist, dass die genauen Mechanismen des hormonell ausgelösten

Wachstums der Brustdrüse noch nicht vollständig geklärt sind (123).

Die hormonelle Steuerung des pubertären Brustdrüsenwachstums erfolgt sowohl

zentral über die Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Achse [HPO-Achse] sowie den hy-

pothalamo-hypophysären Regelkreis des Wachstumshormons [GH], als auch über loka-

le Einflüsse und über deren Quervernetzungen.

8

2.1.3.1 Zentrale Einflüsse auf die Entwicklung der Brustdrüse

GnRH stimuliert die Sekretion von Follikel stimulierendem Hormon [FSH] und luteini-

sierendem Hormon [LH] aus der Hypophyse (Abbildung 2.3). FSH und LH bewirken

die Ausschüttung der Effektorhormone Östrogen und Progesteron aus dem Ovar. FSH

lässt dazu den Follikel reifen, der seinerseits Östrogene, vor allem Estradiol produziert.

LH löst die Ovulation aus und dient dem Erhalt des Corpus luteum, welches aus dem

Follikel entsteht und Progesteron produziert (33).

Abbildung 2.3 Stark vereinfachte schematische Darstellung zentraler Einflüsse auf die Brustdrüsenentwicklung: Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Achse und hypothalamo-hypophysärer Regelkreis des Wachstumshormons. GnRH = Gonadotropin-Releasing-Hormon, GHRH = Growth-Hormon-Releasing-Hormon, FSH = Follikel stimulier-endes Hormon, LH = Luteinisierendes Hormon, GH = Wachstumshormon, IGF-1 = insulin-like growth factor 1.

Während Östrogen vorwiegend in die Entstehung der TEB während der Pubertät, das

sogenannte primäre „branching“, und deren Verzweigung in AB, das sogenannte sekun-

däre branching, involviert ist, ist Progesteron zusammen mit dem durch Östrogen stimu-

lierten Prolaktin und anderen Wachstumsfaktoren (111) hauptsächlich an der Verzwei-

gung der Drüsengänge in der adulten Brustdrüse, dem sogenannten tertiären „side-

branching“ beteiligt (47,123,124,143).

Der andere bekannte zentrale Regulationsmechanismus steuert über die Freisetzung von

Growth-Hormon-Releasing-Hormon [GHRH] aus dem Hypothalamus die Sekretion von

9

hypophysärem GH. Dieses wirkt einerseits direkt positiv auf Körperwachstum, Lipolyse

und Blutzucker; andererseits stimuliert es die Sekretion der insulin-like growth factors

[IGF] aus der Leber ins Blut. Neben dieser systemischen Wirkung führt GH in vielen

Organen zusätzlich auch zu lokaler IGF-Ausschüttung mit para- oder autokriner Wir-

kung (vgl. Kapitel 2.1.3.2) (33). IGF sind Wachstumsfaktoren, die sowohl für Kno-

chen-, als auch für Organ- und Gewebewachstum verantwortlich sind. Während IGF-2

vor allem in der fetalen Entwicklung agiert, ist IGF-1 für postnatales Wachstum zustän-

dig (126).

2.1.3.2 Lokale Einflüsse auf die Entwicklung der Br ustdrüse

Die oben erläuterte, zentral gesteuerte Regulation der Entwicklung der Brustdrüse durch

hormonelle Einflüsse ist essentiell. Allerdings kommt der lokalen hormonellen Regula-

tion nach aktuellem Stand der Wissenschaft ebenfalls große Bedeutung zu. Abbildung

2.4 versucht, diese komplexen Einflüsse zu verdeutlichen.

Abbildung 2.4 Stark vereinfachte schematische Darstellung lokaler Einflüsse auf die Brustdrüsenentwicklung. GH = Wachstumshormon, GH-R = Wachstumshormon-Rezeptor, ER = Östrogen-Rezeptor, IGF-1 = insulin-like growth factor 1, IGF-1-R = insulin-like growth factor 1-Rezeptor (modifiziert nach (123,124)).

Östrogen, GH und IGF-1 wirken synergetisch in der Entwicklung der Brustdrüse. Ihr

genaues Zusammenspiel ist aber noch nicht vollständig geklärt (25).

Ein bedeutender Wirkmechanismus von Östrogen besteht in der Wirkverstärkung von

GH und IGF-1, wobei noch unklar bleibt, ob Östrogen für die GH- und/oder für die

IGF-1-Aktion nötig ist (105).

10

Während eine Stimulation ausschließlich mit Östrogen keinerlei Effekt auf die Brust-

drüsenentwicklung hat (107), sind sowohl GH als auch IGF-1 zumindest in der Lage,

die Entstehung einer kleinen Anzahl an TEB zu induzieren. Für eine normale Brustdrü-

senentwicklung wird jedoch zusätzlich Östrogen benötigt (62,105).

Zudem induziert Östrogen die Progesteron-Rezeptoren [PR] in Epithel und Stroma

(123). Auch Progesteron verstärkt – in der Pubertät auf nicht essentielle Weise – die

stimulative Wirkung von IGF-1 auf die duktale Morphogenese; im adulten tertiären

branching und in der Entwicklung zur milchgebenden Brustdrüse in der Schwanger-

schaft dürfte Progesteron nach Stand der Wissenschaft hingegen von essentieller Bedeu-

tung sein (64,124). Allerdings ist seine Rolle in Brustdrüsen- und Tumorentwicklung

noch nicht zur Gänze geklärt (112).

Östrogen-Rezeptoren [ER] sind sowohl im Stroma, als auch in epithelialen Zellen der

Brustdrüse zu finden (42). Durch GH wird aber vor allem im Stroma eine erhöhte Ex-

pression von ER-mRNA [= messenger-Ribonukleinsäure] stimuliert, während IGF-1

dazu nicht in der Lage ist (25,107).

Der GH-Rezeptor findet sich ebenso wie der ER in Stroma und Epithel. Höchste

Konzentrationen von GH wurden in der Phase vor der Schwangerschaft während der

TEB-Bildung festgestellt (51). Auf direktem Weg wirkt GH über die Bindung an den

epithelialen Rezeptor. Seine Hauptwirkung besteht jedoch in der Bindung an den stro-

malen Rezeptor, über den es die Expression von IGF-1 steigert und so eine erhöhte

Konzentration von lokalem IGF-1 bewirkt. In Abwesenheit von IGF-1 hat GH keine

Wirkung auf die Brustdrüsenentwicklung (107). Dies scheint der Beweis dafür zu sein,

dass IGF-1 über parakrine Wirkmechanismen das für die TEB-Bildung verantwortliche

Effektorhormon ist (63,138). Als essentieller Faktor in der pubertären Entwicklung der

Brustdrüse (107) ist es in der Lage, die Wirkung von GH in hypophys- und ovar-

ektomierten Ratten vollständig zu imitieren (109). Richert et al. (103) kritisieren jedoch,

dass die Annahme eines rein parakrinen Wirkmechanismus dem komplexen Mikroenvi-

ronment der Mamma nicht gerecht werde: IGF-1-mRNA ist nicht nur im Stroma, son-

dern auch in den TEB selbst zu finden; da seine Rezeptoren jedoch ausschließlich in

epithelialen Zellen, nicht aber im Stroma nachgewiesen wurden, wird vermutet, dass die

Epithelzellen also auch unter direktem, bzw. autokrinem Einfluss von IGF-1 stehen

(62).

Jenseits des Einflusses auf die pubertäre TEB-Bildung wurde im Mausmodell gezeigt,

dass IGF-1 – neben dem oben erwähnten Progesteron – zudem für die postpubertäre

duktale Morphogenese verantwortlich ist. Hierbei führt es zu Elongation und Verdi-

11

ckung der Gänge, sowie zum Auftreten von buds an bereits bestehenden Gängen, was

ein Hinweis auf beginnendes tertiäres side-branching ist (107).

Bezüglich der hormonellen Einflüsse auf die pubertäre Brustdrüse lässt sich nach der-

zeitigem Stand der Wissenschaft festhalten, dass der parakrine und autokrine Austausch

zwischen epithelialen und stromalen Zellen, darunter besonders das Hormon IGF-1,

sowohl für primäres als auch für sekundäres und tertiäres branching wesentlich ist. Ös-

trogen wirkt dabei permissiv auf primäres und sekundäres branching. Progesteron (bzw.

in der Schwangerschaft Prolaktin) hingegen wirkt permissiv auf tertiäres branching

(123).

2.2 Fetale Programmierung bei intrauteriner Wachstu ms-restriktion [IUGR] und ihre Wirkung auf Pubertät bz w. Brustdrüsenentwicklung

2.2.1 Definition von fetaler Programmierung Die fetale Programmierung bezeichnet ein hypothetisches Konzept, welches sich vor

allem auf epigenetischer Ebene abspielt (35): durch Methylierung der Promotorregion

und Veränderungen der Histon-Proteine wird die Ableserate der DNA modifiziert, ohne

dass dabei eine Veränderung der eigentlichen Gensequenz erfolgt. Nach derzeitigem

Stand der Wissenschaft, geht man davon aus, dass der Organismus während der Ent-

wicklung sensible Phasen mit hoher epigenetischer Plastizität durchläuft (35). Im Ver-

lauf dieser Entwicklung kann er stark auf äußere Einflüsse reagieren (Abbildung 2.5).

Entsprechend diesem Konzept könnte während der sensiblen Phasen eine fetale Pro-

grammierung erfolgen, wobei Stoffwechsel und Organe möglicherweise durch bleiben-

de Veränderungen auf epigenetischer Ebene „metabolische Programme“ erstellen und

versuchen, sich an die zukünftig erwarteten Umweltbedingungen anzupassen.

Die Theorie geht davon aus, dass bei Nicht-Übereinstimmen der Vorhersage mit der

Wirklichkeit, wie es beispielsweise bei intrauteriner Mangel- und späterer Überernäh-

rung in gut entwickelten Ländern der Fall sein kann, ein von Godfrey et al. (35) als

„mismatch“ bezeichneter Zustand mit erhöhtem Krankheitsrisiko resultiert (Abbildung

2.5).

12

Abbildung 2.5 Darstellung des hypothetischen Konzepts der „mismatch theory“, nach dem mit zunehmendem Alter die Plastizität sinkt, während die Umweltexposition gleichzeitig zunimmt. Die zur Zeit der Entwicklungsphase herr-schenden Umweltbedingungen bewirken aufgrund der hohen Plastizität epigenetische Veränderungen, die zu einem individuellen Phänotyp führen. Passen diese epigenetischen Veränderungen zum späteren Umfeld („match“), resul-tiert daraus ein gut adaptierter Organismus mit niedrigem Krankheitsrisiko während seiner Interaktionen mit der Umwelt. Werden intrauterine epigenetische Veränderungen hingegen diskrepant zum postpartalen Umfeld angelegt („mismatch“), besteht ein erhöhtes Krankheitsrisiko des maladaptierten Organismus gegenüber Umwelteinflüssen (modifiziert nach (35)).

Auch Barker et al. (7) und Hales et al. (39) stellten ein Modell auf, welches sie als

„thrifty phenotype hypothesis“ bezeichneten. Nach diesem Modell durchlaufen Gewebe

und Organe des Fetus sogenannte „kritische“ Phasen. Eine Adaptation des Fetus unter

Mangelernährung oder Sauerstoffmangel führt zur Reduktion des Zellwachstums, be-

sonders der Gewebe, die sich zu diesem Zeitpunkt in einer kritischen Phase befinden.

Eine besondere Rolle scheinen in dieser Theorie Insulin sowie GH zu spielen. Selbst

kurze Zeiträume von Mangelernährung oder Sauerstoffmangel könnten sich durch eine

dauerhaft verminderte Zellzahl – beispielsweise der β-Zellen des Pankreas – in perma-

nenten Veränderungen von Stoffwechselwegen zeigen. Außerdem geht das Modell da-

von aus, dass Mangelernährung nicht nur zu Veränderungen der metabolischen Aktivi-

tät und der hormonellen feed-back-Systeme führt, sondern auch Veränderungen der

Organstruktur und der Verteilung der Zelltypen bedingen kann. Barker et al. (8) formu-

lierten die These, dass die in der Fetalperiode aufgestellten Programme determinierend

für Krankheiten im späteren Leben sind: Fetale Mangelernährung kann demnach zu

Veränderungen metabolischer Programme, beispielsweise zu Insulin- oder GH-

Resistenz führen. Im Verlauf des Lebens, besonders auch in Zusammenhang mit adulter

Adipositas und Inaktivität, können daraus Diabetes mellitus Typ 2, Hypercholesterinä-

mie und Bluthochdruck, sowie Veränderungen der Blutgerinnung resultieren. Dies wie-

13

derum könnte die Entstehung von coronarer Herzerkrankung und Schlaganfällen be-

günstigen.

2.2.2 Definition von IUGR und ihre Folgen im Allgem einen Neugeborene mit einem Gewicht unterhalb der 10. Perzentile gelten als „small for

gestational age“ [SGA]. Zu unterscheiden ist hierbei der physiologische Kleinwuchs,

der beispielsweise bei Kindern kleiner Eltern im Sinne einer verringerten, genetisch

determinierten Zielgröße vorkommt, vom pathologischen Kleinwuchs. Letzterer wird

auch als intrauterine Wachstumsrestriktion [IUGR = intrauterine growth restriction]

bezeichnet. Bei physiologischem Kleinwuchs folgt die Wachstumskurve konstant dem

Verlauf der Perzentilen, bei IUGR hingegen kommt es zum dynamischen Kreuzen der

Perzentilen mit verringerter Endgröße durch akuten Wachstumsstillstand (Abbildung

2.6) (76).

Abbildung 2.6 Intrauterine Perzentilenkurven von (a) einem SGA-Fetus mit einem Wachstumsverlauf entlang der Perzentilen, jedoch unterhalb der 10. Perzentile und (b) einem IUGR-Fetus, dessen Gewichtsverlauf zunächst inner-halb der Perzentilen liegt, diese jedoch ab der 35. Schwangerschaftswoche unter Stagnation des Gewichts kreuzt. Das Geburtsgewicht von etwa 2700 g liegt unterhalb der 10. Perzentile. LGA = large for gestational age, AGA = appropriate for gestational age, SGA = small for gestational age (modifiziert nach (137)).

Ursachen der IUGR sind fetaler oder plazentarer, bzw. maternaler Natur: Als fetale Ur-

sachen sind im Wesentlichen intrauterine Infektionen wie Toxoplasmose, Röteln, CMV

oder Herpes, fetale Stoffwechselerkrankungen und Chromosomenanomalien anzusehen,

die die Pathogenese einer IUGR ebenso begünstigen wie plazentare Insuffizienz bei-

spielsweise aufgrund mütterlicher Mangelernährung, Hypoxie oder Toxin-Exposition

(insbesondere Nikotin) (127). Ebenso sind mögliche Ursachen einer IUGR in weiteren

14

potentiell schädlichen Umwelt-Einflüssen zu finden (vgl. Kapitel 2.2.3.2). Im Folgen-

den beschränken sich die Ausführungen auf die Auswirkungen plazentarer Insuffizienz,

da diese als Auslöser fetaler Mangelversorgung gegenüber anderen IUGR-

begünstigenden Faktoren klar zu definieren und somit essentieller Bestandteil der For-

schung am Konzept der fetalen Programmierung ist.

In der sensiblen Phase der Entwicklung (vgl. Kapitel 2.2.1) kommt es bei IUGR – mög-

licherweise im Rahmen der fetalen Programmierung – nicht nur zu einer bleibenden

Beeinflussung des Wachstums, sondern auch zu Veränderungen des Stoffwechsels und

der Gefäße. Es kommt zu strukturellen Veränderungen der Organe und deren Funktion.

Besonders von den adaptiven Vorgängen betroffen sind Pankreas, Leber, Muskel- und

Fettgewebe, Nieren, Blutdruckregulation und die HPO-Achse (vgl. Kapitel 2.1.3.1)

(39). In bisherigen Forschungen wurde herausgefunden, dass nach IUGR das Risiko für

Insulinresistenz, Diabetes mellitus Typ 2 (30), frühkindliche Adipositas (86), Hyperto-

nie (142) und renale Erkrankungen (45,67,96), koronare Herzkrankheit (23) und Klein-

wüchsigkeit (16) steigt. Beim Gehirn sind strukturelle Veränderungen seltener (39);

allerdings gibt es auch Hinweise auf eine – meist jedoch subtile – Unterentwicklung des

Gehirns und ein reduziertes Gehirnvolumen nach IUGR (9). Auch vorzeitige Pubarche

als ein Merkmal beginnender Pubertät wurde post-IUGR beobachtet und über die Ent-

wicklung einer Insulinresistenz mit oben erwähnten Krankheiten in Verbindung ge-

bracht (49,50,139).

2.2.3 Auswirkungen von fetaler Programmierung bei I UGR auf Pubertät bzw. Brustdrüsenentwicklung im Speziellen

Die Pubertätsentwicklung nach IUGR steht in den letzten Jahren zunehmend im Fokus.

Zur Thelarche, die als wichtiger Marker der Pubertätsentwicklung gilt und hormonel-

len Einflüssen unterliegt, liegen bisher nur wenige Daten vor. Da die Thelarche als

Spiegel systemischer endokriner Dysfunktionen Rückschlüsse auf Hormonachsen und

mögliche fetale Programmierung zulässt, soll diese im Folgenden näher untersucht wer-

den. Im Detail wird auf Einflüsse und klinische Relevanz von IUGR auf die Pubertäts-

entwicklung des Menschen in Kapitel 2.2.3.2 und 2.2.4 eingegangen.

15

2.2.3.1 Einflüsse von IUGR auf Pubertät bzw. Brustd rüsenentwick-lung im Tiermodell

Im Tiermodell liegen bereits Untersuchungen zu fetaler Wachstumsrestriktion und feta-

len Programmierungsvorgängen unserer und anderer Arbeitsgruppen vor, die im Fol-

genden kurz dargestellt werden. Die Minderversorgung des Fetus wurde dabei entweder

durch Proteinrestriktion des Muttertieres (93) oder durch Ligatur der Arteria uterina

(80,82) herbeigeführt.

Nüsken et al. (81) untersuchten am Modell der Ratte Unterschiede bezüglich fetaler

Programmierung bei IUGR durch Malnutrition versus plazentare Minderdurchblutung

durch Ligatur. Bei ihren Untersuchungen richtete sich der Fokus auf die Untersuchung

von Plazenta und fetaler Leber bei männlichen wie weiblichen Feten am Tag der Ge-

burt. Sie kamen hierbei zu dem Ergebnis, dass IUGR die plazentare wie auch die fetale

Genexpression von Hormonen, Hormon-Rezeptoren und vasoregulierenden Faktoren

beeinflussen kann:

So war nach Malnutrition beispielsweise die plazentare Genexpression von IGF-1 er-

höht, die von IGFBP-1 [= IGF-Bindeprotein-1] vermindert, wohingegen nach Ligatur in

der Plazenta eine verminderte Genexpression von IGF-1 und eine erhöhte von IGFBP-1

vorlag. In der fetalen Leber zeigte sich in der LP-Gruppe lediglich eine erhöhte Expres-

sion des Insulin-Rezeptors, sowie des IGF-1- und IGF-2-Rezeptors; IGF-1, IGF-2 und

IGFBP-1 zeigten keine Veränderungen. Im Ligaturmodell war eine verminderte Expres-

sion von IGF-1 und vermehrte Expression des IGF-2-Rezeptors zu beobachten; IGF-2,

IGFBP-1, Insulin-Rezeptor und IGF-1-Rezeptor zeigten keine veränderte Regulation.

Nüsken et al. stellten fest, dass die Expressionsmuster weitgehend unabhängig von

Geschlecht und Geburtsgewicht sind. Hingegen fanden sie heraus, dass die Auswirkun-

gen von IUGR auf die Programmierung der Genexpression bedingt sind durch die dem

niedrigen Geburtsgewicht zugrunde liegende Ursache. Die Morbidität nach IUGR sollte

daher in Zusammenhang mit der jeweiligen Ursache analysiert werden.

In der Literatur finden sich jedoch auch einige Hinweise darauf, dass Veränderungen

der Genexpression durch fetale Programmierung möglicherweise geschlechtsspezi-

fisch sind:

So führten van Abeelen et al. (1) humane Studien im Zusammenhang mit der hollän-

dischen Hungersnot der Jahre 1943-47 durch und untersuchten hierbei im Rahmen einer

retrospektiven Studie den Zusammenhang zwischen der Größe der Plazenta und späterer

Hypertonie. Ein solcher fand sich ausschließlich bei Männern. Sie kamen zu dem Er-

16

gebnis, dass bei Männern, die sich während der Hungersnot in utero befanden, ein Zu-

sammenhang zwischen großer Plazenta und späterer Hypertension bestand, was auf ein

kompensatorisches Plazenta-Wachstum bei Unterernährung zurückzuführen sein könn-

te; bei Männern, die sich nicht während der Hungersnot in utero befanden, wurde Hy-

pertonie hingegen mit einer kleinen Plazenta in Zusammenhang gebracht, was als Mani-

festation einer ungenügenden Implantation des Embryos gedeutet werden könnte (1).

Während sich bei Männern also die Entwicklung eines zu hohen Blutdrucks – mögli-

cherweise über eine fetale Programmierung – durch mütterliche Diät manipulierbar

zeigte, konnte bei Frauen diesbezüglich kein Zusammenhang hergestellt werden; hier

war Hypertonie – unabhängig von mütterlichem Hungern – mit niedrigem Geburtsge-

wicht assoziiert.

Pankevich et al. (90) fanden durch pränatalen Stress ausgelöste, geschlechtsspezifi-

sche Auswirkungen – möglicherweise über eine fetale Programmierung – auf die Gen-

expression der 11-Beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 2 im Modell der Maus, wobei

diese beim Männchen bei pränataler Stressexposition steigende Tendenz zeigte, beim

Weibchen hingegen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erniedrigt war.

Ebenfalls geschlechtsspezifisch unterschiedlich dürfte die fetale Programmierung der

HPO-Achse sein, wie Kapoor et al. (58) in einem Review über die Auswirkung einer

Verabreichung synthetischer Glucocorticoide während der Schwangerschaft im Tierver-

such zusammenstellten.

Bisherige Forschungen deuten darauf hin, dass IUGR einen Einfluss auf das Hormon-

system hat. Dabei wurden geschlechtsspezifische Unterschiede beobachtet. Die Unter-

suchungen bezogen sich bisher hauptsächlich auf männliche Lebewesen. Die Experi-

mente dieser Arbeit sollen sich hingegen auf die weibliche Entwicklung nach IUGR

fokussieren und dabei besonders deren Auswirkungen auf die hormonell gesteuerte Pu-

bertäts-, bzw. Brustdrüsenentwicklung beleuchten.

2.2.3.1.1 Nutritive Einflüsse auf Pubertät bzw. Bru stdrüsenentwicklung im Tiermodell

Sloboda et al. (122) untersuchten prä- und postnatale nutritive Einflüsse auf die repro-

duktive Reife und auf die Ovarfunktion.

Sie konnten zeigen, dass die maternale Ernährungshistorie während der intrauterinen

Phase, während des Stillens und nach dem Abstillen unterschiedlich stark den Zeitpunkt

des Pubertätsbeginns der weiblichen Ratte beeinflusst. Weibliche Ratten kamen sowohl

17

nach Mangelernährung [LP = low protein diet] als auch Überernährung [HF = high fat

diet] der Mutter während Schwangerschaft oder Laktation früher in die Pubertät als

nach mütterlicher Normaldiät [NP = normal protein diet]. Das Pubertätsalter ist nach

Sloboda et al. (122) also über die Ernährung der Mutter beeinflussbar, nicht aber abhän-

gig von einem „kritischen“ Körpergewicht des Jungtieres bei Eintritt in die Pubertät.

(Frisch et al. (31) gingen in ihrer im Jahre 1970 durchgeführten Längsschnittstudie an

Mädchen im Alter von etwa 11 bis 18 Jahren hingegen noch davon aus, dass der Zeit-

punkt der Menarche direkt mit dem Körpergewicht zu diesem Zeitpunkt korreliert.) Ei-

ne Ernährung mit hohem Fettanteil nach dem Abstillen führte in beiden Gruppen (NP

und LP) zu einem beschleunigten Pubertätsverlauf, wobei dieser Effekt in der LP-

Gruppe im Vergleich zum Einfluss der pränatalen Mangelernährung nur eine relativ

kleine Rolle spielte (122).

Der Darstellung der Ovarfunktion dienten Messungen der Progesteron-Spiegel. Die

ovarielle Funktion der Ratte setzt nach Kennedy et al. (60) um d 38

[d x = Tag x postpartal] ein. Höhere Progesteron-Konzentrationen sind mit höheren

Ovulationsraten verbunden. Messungen lassen somit Rückschlüsse auf die Ovarfunktion

zu (135). Bei adulten LP-Tieren (Messungen an d 150) stellten Sloboda et al. (122) er-

niedrigte, bei adulten NP-Tieren hingegen vergleichsweise höhere Werte fest, was auf

persistierende Veränderungen der ovariellen Funktion durch Mangelernährung schlie-

ßen lässt.

Die Ursache ihrer Beobachtungen sehen Sloboda et al. (122) durch die „life-history

theory“ (14) begründet: Dieses hypothetische Konzept geht davon aus, dass intrauterin

mangelernährte Organismen postpartal globale Aspekte der organismalen Reife der Er-

langung der Reproduktionsreife unterordnen, um sich aufgrund der durch Nahrungs-

mangel bedingten verringerten Lebenserwartung schnellstmöglich zum Erhalt der eige-

nen Art fortpflanzen zu können. Diese Theorie wird unter anderem durch Forschungser-

gebnisse zur Menopause in der Folge von IUGR unterstützt: post-IUGR zeigte sich der

Verlust der Ovarfunktion, gekennzeichnet durch eine niedrigere Progesteron-

Konzentration der adulten Ratte, zu einem früheren Zeitpunkt als nach NP-Diät (122).

Fernandez-Twinn et al. (26) untersuchten die Auswirkungen von Proteinrestriktion des

Muttertiers während der Schwangerschaft und der postnatalen Laktation auf das Brust-

krebs-Risiko der neugeborenen weiblichen Ratte.

Das Körpergewicht der Tiere der LP-Gruppe blieb zu allen Untersuchungs-

Zeitpunkten der Studie (3, 4, 5, 7 Wochen) unter dem der NP-Gruppe, wobei während

18

der postnatalen Laktationsphase die mütterliche Diät zunächst weiterhin der in der

Schwangerschaft angebotenen entsprach, nach dem Abstillen an d 21 aber die jungen

Ratten beider Gruppen Normaldiät ad libitum erhielten. Postnatal präsentierten die neu-

geborenen Ratten der LP-Gruppe eine retardierte Brustdrüsenentwicklung im Vergleich

zur NP-Gruppe. Bei Umstellung auf Normaldiät nach der Laktation wurde in der LP-

Gruppe interessanter Weise eine Induktion von Wachstumsfaktoren und Hormonsig-

nalwegen mit konsekutivem Aufholwachstum der Brustdrüse beobachtet. Gleichzeitig

war in Woche 5 in den Epithelzellen die Proteinexpression der Insulin-, IGF-1-, Östro-

gen- und Erb2-Rezeptoren trotz niedrigerem Körpergewicht im Vergleich zur NP-

Gruppe erhöht. Auch Nüsken et al. (81) konnten für den IGF-1-Rezeptor im hepatischen

Gewebe bei LP-Tieren erhöhte Werte bei Geburt zeigen. Die IGF-1-Expression der feta-

len Leber nach Malnutrition unterschied sich nicht von der in Kontroll-Tieren. Bezüg-

lich Östrogen-, Progesteron- und FSH-Plasma-Konzentrationen wurden bei Fernandez-

Twinn et al. (26) in ihrer nicht gewichtsnormalisierten Auswertung keine Unterschiede

zwischen LP- und NP-Tieren festgestellt. Die leichteren LP-Tiere zeigten jedoch einen

Trend zu höheren Werten. Tumor-Induktion durch das Kanzerogen Nitrosomethylurea

[NMU] verdoppelte in der Studie von Fernandez-Twinn et al. (26) die Inzidenz der so-

genannten „early onset“ Tumoren (Woche 0 - 16 nach Injektion) in der LP-Gruppe im

Vergleich zur NP-Gruppe.

Die Ursache der erhöhten Suszeptibilität vermuten Fernandez-Twinn et al. (26) mit-

unter in erhöhten Östrogen-Spiegeln. Dies entspräche der Feststellung von Palmer et al.

(89), die erhöhte Östrogen-Exposition in utero mit erhöhtem Brustkrebs-Risiko in Ver-

bindung gebracht haben, wobei beispielsweise dadurch bedingte anormale Methylie-

rungsmuster der DNA das Tumor-Risiko erhöhen könnten (21). Als weitere Ursache

vermuten Fernandez-Twinn et al. (26) das schnelle Aufholwachstum besonders der Epi-

thelzellen der Brustdrüse nach Einführen der NP-Diät. Schnelles Wachstum begünstigt

allgemein die Expansion von mutierten Zellen und so auch die Entstehung von Tumo-

ren (3). Verbesserte Kenntnisse über die Mechanismen der induzierten Systeme nach

IUGR könnten Grundlagen für mögliche therapeutische Angriffspunkte darstellen.

2.2.3.1.2 Durch Ligatur der Arteria uterina bedingt e Einflüsse auf Pubertät bzw. Brustdrüsenentwicklung im Tiermodell

Zum Einfluss von durch Ligatur verursachter IUGR auf Pubertät bzw. Brustdrüsenent-

wicklung finden sich Aussagen betreffend Zeitpunkt der Pubertät sowie Untersuchun-

gen zu GH und IGF-1.

19

Im Modell der Ratte ist nach beidseitiger Ligatur der Arteria uterina an Tag 17 der

Schwangerschaft (= Spätgestation) und folglich IUGR durch plazentare Minderdurch-

blutung der Eintritt in die Pubertät gegenüber der Kontrollgruppe verzögert. Zu Beginn

der Pubertät wurde von van Weissenbruch et al. (139,140) und Delemarre-van de Waal

et al. (19) ein geringeres Körpergewicht der Nachkommen beobachtet. Dies lässt darauf

schließen, dass der Eintritt in die Pubertät nicht abhängig von einem „kritischen“ Kör-

pergewicht (vgl. Kapitel 2.2.3.1.1), sondern vom Grad der intrauterinen Minderversor-

gung ist (22).

Des Weiteren stellten sie (19,140) im Ligaturmodell eine geringere Anzahl von Folli-

keln fest. Dies könnte über ein somit späteres Erreichen eines für den Eintritt in die Pu-

bertät nötigen Östrogen-Spiegels eine Verzögerung der Pubertät bedingen.

Auch Houdijk et al. (44) zeigten im Ligaturmodell bei der adulten weiblichen Ratte

ein inkomplettes Aufholwachstum – Schwanz- und Körperlänge glichen sich der Kon-

trollgruppe an, nicht aber das Körpergewicht: GH- und IGF-1-Sekretion lagen an

Tag 100 postnatal im physiologischen Bereich. Um die Geburt herum jedoch ist IGF-1

in Serum und Lebergewebe nach IUGR noch erniedrigt (134). Auch Nüsken et al. (81)

konnten zeigen, dass die IGF-1-Expression der fetalen Leber im Ligaturmodell am Tag

der Geburt gegenüber Schein-Operation und Kontrollgruppe signifikant erniedrigt war,

während die Expression des IGF-1-Rezeptors unverändert blieb. Obwohl demnach

postnatal also ein relativer Anstieg von IGF-1 beobachtet wurde, führte dieser bei Hou-

dijk et al. (44) bezüglich des Körpergewichts zu keinem vollständigen Aufholwachs-

tum. Dies lässt eine verminderte Gewebe-Responsabilität in der IUGR-Gruppe – sowohl

für das Ligaturmodell als auch für das Modell der Malnutrition, bei dem ein vollständi-

ges Aufholwachstum ebenso ausbleibt – vermuten.

Fu et al. (32) analysierten am Modell der Ratte nach beidseitiger Ligatur der Arteria

uterina an Tag 19 der Schwangerschaft die epigenetischen Veränderungen im IGF-1-

Gen der Nachkommen. Sie konnten verminderte IGF-1-Konzentrationen sowohl hepa-

tisch als auch im Serum messen. Außerdem führte IUGR geschlechtsspezifisch zu epi-

genetischen Veränderungen vor allem des Histoncodes.

2.2.3.2 Einflüsse von IUGR auf Pubertät bzw. Brustd rüsenentwick-lung beim Menschen

Die Pubertät des Menschen steht unter dem Einfluss eines komplexen Zusammenspiels

unterschiedlicher prä- und postnataler Faktoren (101). Welche Mechanismen schließlich

die HPO-Achse aktivieren und so die Pubertät initiieren, ist noch weitgehend ungeklärt.

20

Zu postnatalen Einflüssen liegen bereits diverse Studien vor. Demnach ließen Hygiene

und gute Ernährung der Kinder das Pubertätsalter sinken (34). Umgekehrt ist in der Li-

teratur häufig eine Assoziation zwischen schlechter Ernährung in der Kindheit und spä-

tem Pubertätseintritt beschrieben (34,91). Nicht außer Acht lassen sollte man auch die

Erkenntnis, dass sogenannte endokrine Disruptoren – chemisch hergestellte, aber endo-

krin wirksame Chemikalien wie Weichmacher in Kunststoffen, das Insektizid Dichlor-

diphenyltrichlorethan [DDT] oder Bisphenol A – durch ihre östrogene Wirkung das

menschliche endokrine System stören und sich negativ auf die Reproduktionsfähigkeit

des Menschen auswirken können (91).

Darüber hinaus dürfte die hier untersuchte pränatale Alimentation als weiterer Faktor

eine bedeutende Rolle in der Pubertätsentwicklung spielen. Mehrere Studien beschäf-

tigten sich bereits mit Auswirkungen von fetaler Programmierung bei IUGR auf die

Pubertät.

Einige IUGR-Kinder bleiben zeitlebens kleiner; bei den meisten jedoch wird ein

postnatales Aufholwachstum beobachtet. Folglich scheint das Hormonsystem meist

nicht nachhaltig gestört zu sein (19). Allerdings prädisponiert besonders ein schnelles

Aufholwachstum für Folgeschäden wie frühkindliche Adipositas (86) und deren Folgen

für das adulte Leben. Cooper et al. (15) und Sloboda et al. (121) fanden einen Zusam-

menhang zwischen niedrigem Geburtsgewicht, schnellem Gewichtszuwachs in der

Kindheit und früher Menarche. Ebenso zeigten Adoptionsstudien, in denen Mädchen

aus Entwicklungsländern in entwickelte Länder migrierten, einen frühen Eintritt in die

Pubertät, zusätzlich begünstigt durch den Gewichtszuwachs in der Kindheit (128,129).

Auch Delemarre-van de Waal et al. (19) beschrieben einen frühen Pubertätsbeginn und

frühe Menarche bei Mädchen mit niedrigem Geburtsgewicht.

Argumentiert man im Rahmen der life-history theory (14), so könnten also ungünsti-

ge Umstände in der fetalen Phase möglicherweise über fetale Programmierung eine frü-

he Reproduktionsreife bedingen, um den Erhalt der Spezies zu gewährleisten. Spärliche

postnatale Ernährung hingegen würde die Geschlechtsreife im Sinne des Arterhaltungs-

triebs eher verzögern (34) und auf günstigere Umweltbedingungen verschieben.

21

2.2.4 Klinische Relevanz von IUGR bezüglich Pubertä t bzw. Brustdrüsenentwicklung und Ausblick auf Fehlregulat ion der Brustdrüsenentwicklung des Menschen im Hinblick auf eine Prädisposition für Brustkrebs

Nach den Daten der holländischen Hungersnot 1944-1945, die in einem kleinen Kollek-

tiv einen Zusammenhang zwischen Hungern zum Zeitpunkt der Konzeption und einer

erhöhten Inzidenz von Brustkrebs beschreiben (88), stellt sich die Frage, ob eine über

fetale Programmierung in utero angelegte Störung des hormonell gesteuerten Ablaufs

der pubertären Mamma-Entwicklung und eine durch IUGR induzierte Pubertas praecox

den Ausgangspunkt einer Präkanzerose bilden.

Die Risikofaktoren für eine maligne Entartung der Mamma sind vielfältig und bleiben

bisher mechanistisch weitgehend ungeklärt (110).

Nach einer Meta-Analyse von Ruder et al. (110) korreliert das Brustkrebs-Risiko,

wenngleich nicht konsistent in allen Studien bestätigt, einerseits positiv mit Geburtsge-

wicht, Geburtsgröße und Körpergröße in der Adoleszenz, andererseits negativ mit

Gestationsalter und Body-Mass-Index in der Kindheit. Die Mehrzahl der existierenden

Studien zur Korrelation von Geburtsgewicht und Brustkrebs-Risiko thematisiert hohes

Geburtsgewicht als ursächlichen Faktor (110,146). Dies ist nicht zuletzt mit der ver-

schiedenen statistischen Wichtung von niedrigem und hohen Geburtsgewicht begründet:

Mehrere Studien zeigen einen ein J-förmigen Zusammenhang (Abbildung 2.7) zwischen

Geburtsgewicht und der Inzidenz von Brustkrebs, wobei hohes Geburtsgewicht den

deutlich signifikanteren Einfluss hat, niedriges Geburtsgewicht aber besonders mit

early-onset Mamma-Tumoren assoziiert sein dürfte (53,73,115). Bei einem Geburtsge-

wicht über 4000g gelten erhöhte Östrogen-Konzentrationen als möglicherweise begüns-

tigender Faktor (73,118), bei einem Geburtsgewicht unter 2500g sind die Zusammen-

hänge im humanen Kollektiv noch unklar (73). Interessanterweise fanden Fernandez-

Twinn et al. (28) im Modell der Ratte jedoch auch bei LP-Muttertieren erhöhte Östro-

genwerte in der letzten Schwangerschaftswoche. Niedriges Geburtsgewicht ist zudem

häufig assoziiert mit der Entwicklung von Insulinresistenz, Diabetes mellitus Typ 2, und

dem metabolischen Syndrom – Faktoren, die wiederum unabhängig das Brustkrebs-

Risiko erhöhen (145,147).

22

Abbildung 2.7 Die J-förmige Kurve stellt die Tumorinzidenz in Abhängigkeit vom Geburtsgewicht dar. Bei norma-lem Geburtsgewicht ist die Inzidenz am geringsten, während sie sowohl bei zu niedrigem, als auch bei zu hohem Geburtsgewicht ansteigt. Dabei zeigt ein zu hohes Geburtsgewicht einen deutlich größeren Einfluss als ein zu gerin-ges Geburtsgewicht.

Zwischen niedrigem Geburtsgewicht und früh einsetzender Pubertät bei post-IUGR-

Mädchen besteht Kohärenz (vgl. Kapitel 2.2.3.2) und frühe Pubertät wird daher als prä-

disponierender Faktor für die Entstehung von Tumoren der Mamma diskutiert

(46,112,125). In einer Fall-Kontroll-Studie stellten Hsieh et al. (46) ein um 11 % erhöh-

tes Brustkrebs-Risiko bei einem um 2 Jahre verfrühten Pubertätsbeginn fest. Allerdings

konnten Painter et al. (88) in ihrem Kollektiv in der Gruppe mit erhöhter Brustkrebs-

Inzidenz, die der Hungersnot in Holland zum Zeitpunkt der Konzeption ausgesetzt war,

weder ein erniedrigtes Geburtsgewicht, noch einen früheren Eintritt der Menarche fest-

stellen. Hungern zu späteren Zeitpunkten der Schwangerschaft bewirkte hingegen ein

geringfügig erniedrigtes Geburtsgewicht. Der Eintritt der Menarche erwies sich als nicht

signifikant beeinflussbar durch den Zeitraum des Hungerns während der Schwanger-

schaft. Dass jedoch ein Zusammenhang zwischen erhöhtem Brustkrebs-Risiko und

Hungern zum Zeitpunkt der Konzeption bestand, könnte darauf hinweisen, dass Hun-

gern in der Schwangerschaft möglicherweise über eine fetale Programmierung in sen-

siblen Phasen einen direkten Einfluss auf die Entwicklung und so auch Entartung der

Mamma hat und somit einen vom Geburtsgewicht, bzw. von einem möglichen konseku-

tiven postnatalen schnellen Aufholwachstum unabhängigen Risikofaktor darstellt.

Weiterhin könnte neben genetischer Prädisposition die kumulative Exposition gegen-

über Östrogenen im Verlauf des Lebens in der Pathogenese des Mamma-Karzinoms

eine Rolle spielen (112). In diesem Zusammenhang werden eine frühe Menarche (ähn-

lich post-IUGR), eine späte Menopause, eine Hormontherapie sowie postmenopausale

Adipositas als ursächlich diskutiert. Die Mechanismen bleiben derzeit noch ungeklärt.

23

Über die verstärkende Wirkung von Östradiol auf IGF-1 (vgl. Kapitel 2.1.3.2) dürfte

auch eine Verbindung zur GH-IGF-1-Achse bestehen. Erhöhte IGF-1-Plasma-

Konzentrationen bedingen nach Hankinson et al. (40) beim Menschen ein erhöhtes

Brustkrebs-Risiko prämenopausal. Ray et al. (100) zeigten durch fehlenden hormonel-

len Einfluss von GH/IGF-1 bei hypophysektomierten Patientinnen eine Regression von

metastasierten Mamma-Karzinomen.

Zudem dürfte schnelles Wachstum in der Kindheit, welches sich sekundär zu erhöh-

ten GH-Werten zeigt und häufig post-IUGR zu beobachten ist, über den Mechanismus

der beschleunigten Pubertät ein begünstigender Faktor sein (46,112).

24

3 Fragestellung Zentrale Hypothese des vorliegenden Projektes ist, dass die intrauterine Wachstumsre-

striktion [IUGR] der weiblichen Ratte via Proteinmangelernährung zu Veränderungen

an der pubertären Entwicklung der Mamma führt. In diesem Zusammenhang soll in der

hier vorgestellten Arbeit geklärt werden, welche Veränderungen sich in der Phase der

duktalen Morphogenese der Mamma auf histo-morphologischer Ebene zeigen und ob

solche Veränderungen sekundäre Folge hormoneller Veränderungen sind.

Über die Identifikation mammärer Prozesse hinaus ist es Ziel, aus den Ergebnissen

der mammären Organentwicklung Rückschlüsse auf zentrale Hormonachsen und ihre

Regulation durch intrauterine und postnatale Alimentation zu gewinnen. Das Verständ-

nis solcher Vorgänge in der Ratte soll Ansätze zur Prävention von post-IUGR-

Morbidität beim Menschen liefern.

25

4 Methoden

4.1 Überblick

Um mögliche Störungen der Pubertätsentwicklung der weiblichen Ratte nach IUGR zu

erkunden, wurde das Augenmerk einerseits auf die pubertäre Entwicklung mammärer

Strukturen auf histo-morphologischer Ebene, andererseits auf die Funktion relevanter

endokriner Strukturen gerichtet. Die Ergebnisse sind jeweils zu einer Kontrollgruppe

mit Normaldiät in Bezug gesetzt. Die Experimente fanden an d 21 und an d 28 postnatal

statt, da diese Zeitpunkte den Anfang und das Ende der duktalen Morphogenese der

Mamma via TEB-Proliferation kennzeichnen. Anschließend tritt die Brustdrüse in das

alveoläre Stadium ein (vgl. Kapitel 2.1.2) (111,119).

Die Methode der Whole-Mount Analyse diente der Prüfung von Unterschieden im Ent-

wicklungsgrad über eine Analyse der Dichte der dukto-alveolären Strukturen sowie über

die Gesamtfläche des Drüsenkörpers. Untersucht wurden zu einem Brustdrüsenkörper

verschmolzene apikale und distale lumbale Brustdrüsen. Die Whole-Mount Analyse

wurde nach der von Ruan et al. (106,107,108) etablierten Methode durchgeführt.

Die von Plank et al. (96) etablierte Proliferating Cell Nuclear Antigen Färbung

[PCNA] zeigte den Anteil an proliferierenden Zellen innerhalb der TEB und erweiterte

somit die durch die Whole-Mount Analyse getroffene Aussage über die momentane

Dichte des Drüsenbaums um die Darstellung der proliferativen Aktivität. Die Auszäh-

lung der PCNA-positiven Zellen nach Ruan et al. (106,107,108) und Kleinberg et al.

(62) ermöglichte die Feststellung von Proliferationsunterschieden zu Beginn und Ende

der duktalen Morphogenese zwischen den verglichenen Gruppen. Gefärbt wurde das

peri-areoläre Brustdrüsengewebe.

Mit der Reversen-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion [RT-PCR] wurde nach

Vorbild von Nüsken et al. (81) die Transkriptionsrate von IGF-1 und IGFBP-1 in der

Leber untersucht.

Eine IGF1-Messung im Serum erfolgte zudem über einen enzyme-linked immuno-

sorbent assay [ELISA].

Für mögliche Hinweise auf fetale Programmierung aufgrund von IUGR, die zu Un-

terschieden in der Glucocorticoid- oder Sexualhormon-Synthese führen, wurde mittels

liquid chromatography Tandem-Massenspektrometrie [LC-Tandem-MS] ein Steroid-

26

hormon-Profil im Serum erstellt (98,99). Dieses diente der Untersuchung systemischer

endokriner Veränderungen.

Außerdem wurde ein Gene-Array zur Darstellung von durch intrauterine Mangeler-

nährung veränderten mammären Genexpressionsraten durchgeführt, an den sich eine

in silico-Analyse zur Klärung von Zugehörigkeiten zu Signalwegen und biologischen

Strukturen anschloss (144).

4.2 Tiermodell

Das Versuchsvorhaben wurde durch die Regierung von Mittelfranken mit dem Akten-

zeichen 54-2532.1-31/09 gemäß § 8 Abs.7 des Tierschutzgesetzes genehmigt.

Das Tiermodell der intrauterin mangelernährten Wistar Ratte ist in unserem Labor

etabliert (93) (Abbildung 4.1). Verglichen wurden ausschließlich Weibchen einer LP-

Gruppe mit Weibchen einer NP-Gruppe. Die Ratten wurden im Franz-Penzoldt-

Zentrum der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg in einem 12h

Tag/Nacht-Rhythmus bei 22°C und Leitungswasser ad libitum gehalten.

Abbildung 4.1 Versuchsaufbau mit zeitlichem Ablauf. NP = normal protein diet, LP = low protein diet; jeweils 25g/d. HF = Haltungsfutter ad libitum.

Während die Muttertiere der LP-Gruppe postkonzeptionell für 23 Tage auf eine Diät

von täglich 25 g Futter mit 8,5 % Casein gesetzt wurden, bestand die Diät der NP-

Gruppe aus 25 g mit 17 % Casein. Der Gehalt an Natrium (0,02 %), Vitaminen, Mine-

ralstoffen, Fett (NP: 5 %; LP: 6,1 %), Disacchariden (11 %), Speisestärke (NP: 47 %;

LP: 48 %), Energiegehalt (NP: 3500 kcal/kg; LP: 3262 kcal/kg), Methionin (NP:

10 mg/kg; LP: 8,7 g/kg), Folsäure (10 mg/kg) und der Anteil anderer Aminosäuren wa-

ren in beiden Gruppen ähnlich (81). Postpartal erhielten die Muttertiere beider Gruppen

nach Wurfreduktion auf sechs Weibchen Haltungsfutter [HF] ad libitum (19 % Soja,

27

Energiegehalt 2844 kcal/kg). Nach dem Abstillen und gleichzeitigen Opfern der Mutter-

tiere an d 21 erhielten die jungen Ratten weiterhin HF ad libitum.

Nach Isofluran-Narkose erfolgte die Euthanasierung durch Herzpunktion unter sterilen

Bedingungen an d 21 und d 28 postpartal (Beginn und Ende der akzelerierten duktalen

Morphogenese der Brustdrüse) (119). Von jeweils drei der sechs Weibchen wurden

nach unten beschriebener Operationstechnik folgende Organe entnommen (Abbildung

4.2): lumbales Brustdrüsengewebe in toto für die Gesamtpräparation mit anschließender

Fixation in Paraformaldehyd 4 % (38), bzw. zirkulär die Areola umgebendes Gewebe

für RNA- und Protein-Extraktion, sowie für die immunhistochemische Aufbereitung

nach Fixation in Methylcarnoy (96). Weiterhin wurden Leber und Ovarien entnommen,

in flüssigem Stickstoff schock-gefroren und anschließend bis zu ihrer Verwendung bei

-80°C in Cryo-Röhrchen gelagert. Das Blut wurde über Nacht bei 4°C gehalten, an-

schließend für 15 min bei 8.000 U/m und 4°C abzentrifugiert, aliquotiert und bis zur

Analyse bei -80°C in Cryo-Röhrchen gelagert.

Abbildung 4.2 Schematische Darstellung der Organentnahme an der Ratte. Grün: Lumbales Brustdrüsenpaar. Hell-blau: Peri-areoläres, lumbales Brustdrüsengewebe. Rot: Herz. Mittelblau: Leber. Orange: Ovarien (modifiziert nach (54)).

Die Operations-Technik erfolgte nach Ip et al. (54): Nach der Euthanasierung unter Nar-

kose mittels Herzpunktion nach Thorakotomie (Blutextraktion) wurden die Ratten mit

der Ventralseite nach oben an den Extremitäten fixiert. Es folgte eine Y-förmige Inzisi-

on der Haut, lateral zwischen apikalem und distalem lumbalen Brustdrüsenpaar begin-

nend in Richtung Thorax. Die Haut mit den daran attachierten Brustdrüsen wurde vom

Peritoneum separiert und zur Seite geklappt, die Brustdrüsen wurden abpräpariert. Als

Orientierung diente eine Vene, welche die apikale lumbale Brustdrüse durchzieht, sowie

der sich anatomisch lateral der Brustdrüse befindliche Lymphknoten. Entnommen wur-

den in der Folge ein Teil der Leber, ebenso wie die Ovarien nach Abpräparieren von

Tuben und umgebendem Fettgewebe.

28

Mit sieben Muttertieren pro Gruppe und einer Wurfreduktion auf sechs Weibchen zum

Zeitpunkt der Geburt [d 1] (Abbildung 4.1) ergab sich eine Gruppenstärke von insge-

samt 98 Tieren, wodurch für die Untersuchungen an d 21 und d 28 jeweils Material von

21 Jungtieren pro Gruppe zur Verfügung stand. Die auxiologischen Daten der Tiere

wurden kontinuierlich erhoben.

Tabelle 4.1 Materialien für Blut- und Organentnahme. BD Microlance 0,9x40 mm Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Cryo-Röhrchen SARSTEDT, Nümbrecht, Deutschland EBA 12R Zentrifuge Hettich Lab Technologie, Tuttlingen, Deutschland Histologie-Kassette Termo Fischer Scientific Germany Ltd. & Co. KG,

Braunschweig, Deutschland Isofluran 100 % (V/V) Abbott, Wiesbaden, Deutschland Monovette SARSTEDT, Nümbrecht, Deutschland Multi-Adapter SARSTEDT, Nümbrecht, Deutschland

4.3 Whole-Mount Analyse

Um sich einen Überblick über Größe und Dichte des mammären Drüsenkörpers zu ver-

schaffen, wurden sogenannte Whole-Mount-Präparate angefertigt (106,107,108). Dazu

wurden von allen Tieren die kompletten zum lumbalen Brustdrüsenkörper verschmol-

zenen apikalen (vierten) und distalen (fünften) lumbalen Brustdrüsen wie unten be-

schrieben gefärbt. Anschließend wurden die Drüsen zwischen zwei Objektträgern kon-

stantem Druck ausgesetzt und photographiert. Es erfolgte die Vermessung des prozen-

tualen Anteils dukto-alveolären Gewebes am mammären Fettgewebskörper, sowie des

von dukto-alveolärem Gewebe eingenommenen Areals jeweils im apikalen und im

distalen Drüsenanteil (Abbildung 4.3).

Abbildung 4.3 Repräsentativer lumbaler Drüsenanteil (a) Rohbild, (b) Auswertung mit Flächendefinition des von dukto-alveolärem Gewebe eingenommenen Areals und Markierung des dukto-alveolären Gewebes.

29

Nach Rosen et al. (104) wurde das mammäre Gewebe nach Entnahme für 2 h auf Eis in

4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend bis zur weiteren Färbung in

70 % Ethanol bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Um eine Färbung zu ermöglichen war zunächst die Entfettung des Gewebes nötig, die

durch dreimal 30minütiges Einlegen in einen mit Aceton befüllten Glasmessbecher er-

folgte, wobei das Gewebe zunächst in den Histologie-Kassetten belassen wurde. An-

schließend wurde eine Rehydratisierung durch Einlegen für 30 min in 100 % und in der

Folge für 30 min in 95 % Ethanol vorgenommen. Bevor die Objekte für 1 h in Hämato-

xylin gelegt wurden, wurde dieses gefiltert, um punktuelle Überfärbung des Gewebes zu

vermeiden. Nach der Färbung wurden die Farbüberreste unter laufendem Leitungswas-

ser ausgewaschen, bis das Wasser im Glasmessbecher klar war. Zur Reduktion der Hin-

tergrundfärbung lagen die Objekte für dreimal 35 min in einer Lösung aus 150 ml

100 % Ethanol, 150 ml Aqua destillata und 7,5 ml HCl 1N. Anschließend erfolgte eine

Dehydrierung über zweimal 30 min in 70 % Ethanol, zweimal 30 min in 95 % Ethanol

und zweimal 30 min in 100 % Ethanol. Schließlich wurden die Histologie-Kassetten

entfernt und das gefärbte Gewebe über Nacht in Xylol gelegt. Tags darauf erfolgte die

Prüfung der Färbequalität durch Beurteilung des Gewebes unter konstantem Druck. Bis

zum Abphotographieren wurden die fertigen Whole-Mount-Präparate in Methylsalicylat

in wiederverschließbaren Szintillations-Glasbehältern lichtgeschützt aufbewahrt.

Zur digitalen Aufnahme der Whole-Mount-Präparate wurde die Durchlichteinheit ei-

nes Mikroskops als Lichtquelle verwendet. Ein Einsatz aus Milchglas diente der

gleichmäßigen Ausleuchtung des gesamten Präparats. Die Präparate wurden mit einer

Pinzette aus der Methylsalicylat-Lösung entnommen, zwischen zwei Objektträger ge-

legt, mit vier Klemmen zwischen diesen unter konstantem Druck fixiert und auf die

Milchglasplatte gelegt. Zügiges Arbeiten verhinderte ein Austrocknen der Präparate.

Photographiert wurde aus einer Entfernung von 60 cm mit der auf einem Stativ befestig-

ten Kamera NIKON D200. Um gleichen Abstand und gleiche Lichtverhältnisse zu ge-

währleisten, wurde das Photographieren aller Präparate in direkter Folge aufeinander

abgehandelt.

Zur Auswertung diente die MetaVue Software (41). Nach dem Öffnen eines Photos in

MetaVue, wurde der Zoom zunächst auf 100 % eingestellt. In dieser Vergrößerung wur-

de zuerst der Drüsenanteil der apikalen Brustdrüse manuell selektiert. Anschließend

wurde die Vergrößerung auf 280 % gestellt. Nun wurden mittels Schwellwertoperation,

ausgehend von den hellsten zu markierenden Strukturen, die ast-artigen Verzweigungen

des Brustdrüsengewebes markiert. Vorkommende Lymphknoten blieben dabei stets

30

ausgeschlossen. Schließlich berechnete das Programm die Größe des umfahrenen Areals

und den Anteil der markierten Fläche innerhalb des umfahrenen Areals in Pixel. Im An-

schluss wurde dieselbe Berechnung mit dem zweiten, distalen Drüsenanteil durchge-

führt. Schließlich erfolgte mit Hilfe eines normierten Glasmaßstabs, welcher bei glei-

cher Objektiv-Brennweite und gleichem Objektabstand analog zur Aufnahme der Who-

le-Mount-Präparate digital aufgenommen wurde, mittels ImageJ (97) die Umrechnung

von Pixel in µm, bzw. µm². Daraus ergab sich eine Pixelgröße von

11,125 µm x 11,125 µm, was einer Pixelfläche von 123,766 µm² entspricht.

Tabelle 4.2 Materialien Whole-Mount Analyse Aceton Merck, Darmstadt, Deutschland Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen, Deutschland Ethanol (100 %) Merck, Darmstadt, Deutschland Ethanol (70 %) Merck, Darmstadt, Deutschland Ethanol (95 %) Merck, Darmstadt, Deutschland Hämatoxylin Merck, Darmstadt, Deutschland HCl 1N Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutsch-

land Histologie-Kassette Termo Fischer Scientific Germany Ltd. & Co. KG,

Braunschweig, Deutschland Kamera NIKON D200 Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland Klemmen Haas Bürobedarf, Erlangen, Deutschland MetaVue Software Visitron Systems, Puchheim, Germany Methylsalicylat Merck, Darmstadt, Deutschland Objektträger Superfrost Menzel, Braunschweig, Deutschland Paraformaldehyd (4 % ) Honeywell Riedel-de Haen, Seelze, Deutschland Szintilations- Glasbehälter Gerresheimer AG, Düsseldorf, Deutschland Xylol (98 %) Roth, Karlsruhe, Deutschland

4.4 Proliferating Cell Nuclear Antigen-Färbung [PCN A]

Zur Darstellung proliferierender Zellen wurde die von Plank et al. (96) etablierte im-

munhistologische Färbung des Proliferating Cell Nuclear Antigen [PCNA] verwendet,

welche proliferierende Zellen braun hervorhebt. Zur Auswertung war die Anzahl proli-

ferierender Zellen pro TEB-Fläche zu berechnen (Abbildung 4.4). Untersucht wurden

die Brustdrüsen von jeweils zwei Tieren an d 21 und d 28 pro Wurf, sodass insgesamt

60 Drüsen gefärbt wurden.

PCNA ist ein Protein, welches während der Elongationsphase der DNA-Replikation die

DNA ringförmig umgibt, sowie die DNA-Polymerase δ bindet. So wird eine Dissoziati-

on der Polymerase vom DNA-Strang verhindert und eine schnelle und lückenlose

Replikation gewährleistet (65).

31

Abbildung 4.4 Repräsentativer TEB (a) mit ◊ = Adipozyten, □ = Body Cells, ○ = Cap Cells, ∆ = Drüsenepithelzellen und (b) Markierung der PCNA-positiven Zellen pro TEB-Areal.

Zur Färbung wurden nach dem Deparaffinieren und Hydratisieren der Schnittpräpara-

te die endogenen Peroxidasen durch Wasserstoffperoxid geblockt. Unspezifische Anti-

gene wurden durch fetales Kälberserum [FCS] blockiert, um eine Hintergrund-, bzw.

unspezifische Färbung zu minimieren. Während der Färbung wurde wiederholt mit

TBS-Puffer gewaschen, um den pH-Wert zu optimieren. Auf die oben genannten Blo-

ckierungen folgte zunächst die Inkubation mit dem primären PCNA-Antikörper

(Abbildung 4.5), anschließend mit dem biotinylierten sekundären Antikörper. Zur Sig-

nalverstärkung wurde auf die ABC-Methode [=Avidin-Biotin-Complex] zurückgegrif-

fen, bei der an das Antigen ein Komplex aus einem unbeladenen primären Antikörper,

einem biotinylierten sekundären Antikörper sowie einem vorgefertigten Komplex aus

Avidin und biotinylierter Peroxidase bindet. Entsprechend dieser Methode wurde nach

dem Sekundärantikörper Avidin zugegeben. Das Makromolekül Avidin verfügt über

vier Bindungsstellen für Biotin. Die Affinität für das deutlich kleinere Biotin ist äußerst

stark und führte somit zu quasi irreversiblen Bindungen. Sowohl der biotinylierte se-

kundäre Antikörper als auch die in der Lösung enthaltene biotinylierte Peroxidase gin-

gen eine Bindung mit Avidin ein. Durch enzymatische Umwandlung des im Folgenden

zugegebenen Substrats DAB [=3,3’-Diaminobenzidin] wurden die Stellen, an denen der

spezifische PCNA-Antikörper gebunden hat, über Avidin und seine Bindungsstellen

dreifach verstärkt. Die über Biotin an das Avidin gebundene Peroxidase oxidierte das

DAB-Substrat. Das oxidierte Produkt polymerisierte zu einer braunen, im Lichtmikro-

skop sichtbaren Struktur. Die Gegenfärbung der übrigen Zellen erfolgte mit Hämatoxy-

lin. Schließlich durchliefen die Objekte eine aufsteigende Alkoholreihe, bevor sie zum

Schutz mit Deckgläsern versehen wurden.

32

Abbildung 4.5 Skizze zur PCNA-Färbung: Anfärben der PCNA-positiven Zellen über einen Komplex aus primärem und biotinyliertem sekundärem Antikörper, Avidin, biotinylierte Peroxidase und DAB.

Direkt nach der Entnahme wurde das Gewebe durch 4 h Inkubation bei 4°C in Methyl-

carnoy (60 % Methanol, 30 % Chloroform, 10 % Eisessig) fixiert und über Nacht in

Paraformaldehyd (pH 7,2-7,4) gelegt. Anschließend wurden die Präparate bei Raum-

temperatur für jeweils 40min in 70 %, 80 %, zweimal 95 % und zweimal

100 % Methanol sowie über Nacht in 100 % Isopropanol gelagert. Tags darauf wurden

sie bei jeweils 58°C für 40 min in 100 % Isopropanol, für 1 h in einer 1:1 Lösung

Isopropanol/Paraffin und für zweimal 2 h und zuletzt über Nacht in jeweils frisches Pa-

raffin gelegt. Am nächsten Tag erfolgte das Einbetten in Metallgussformen durch Über-

gießen der fixierten Gewebe mit warmem Paraffin. Die Aushärtung erfolgte auf Eis,

bedeckt mit Histologie-Kassetten, die später beim Anfertigen der Schnittpräparate als

Halterung dienten.

Das nun in Paraffinblöcke eingebettete Brustdrüsengewebe wurde mit dem MICROM

COOL-CUT HM 335 E seriell in 3 µm dicke Scheiben geschnitten. Pro Brustdrüse

wurden circa 60-70 Serienschnitte angefertigt. Um das mikroskopische Untersuchen

sechs verschiedener Ebenen innerhalb einer Brustdrüse sicherzustellen, wurde nur jeder

zehnte Schnitt weiterverarbeitet. Die Schnitte wurden in ein Wasserbad mit einer Tem-

peratur von 45°C abgelegt und von dort auf einen gläsernen Objektträger aufgezogen.

Anschließend wurden sie für circa 30 min im Wärmeschrank bei 60°C getrocknet und

bis zu ihrer Verwendung bei Raumtemperatur in Objektträgerboxen lichtgeschützt auf-

bewahrt.

Die auf Objektträger aufgebrachten Schnitte wurden dreimal 5 min in Xylol deparaf-

finiert und in einer absteigenden Alkoholreihe zunächst für dreimal 3 min in

100 % Ethanol, dann für zweimal 2 min in 95 % Ethanol hydratisiert. Die Blockierung

der endogenen Peroxidase erfolgte zur Minimierung unspezifischer Hintergrundfärbung

33

durch die im Verlauf der Färbung eingesetzte exogene Peroxidase. Hierzu befanden sich

die Schnitte für 20 min bei Raumtemperatur in einer mit 3 % Wasserstoffperoxid in

Aqua destillata angefüllten Kunststoffküvette. Nach dem Blocken der endogenen Pero-

xidase wurden die Objekte zunächst dreimal für jeweils 3 min in einfachem TBS gewa-

schen (im Folgenden wurde TBS immer in einfacher Verdünnung verwendet; zum Wa-

schen wurden die Objektträger in eine Kunststoffküvette gestellt). Vor dem Aufbringen

von jeweils 50 µl 100 % FCS zum Blockieren unspezifischer Antigene wurden die Ob-

jektträger um den Gewebeschnitt herum manuell abgetrocknet und das Gewebe mit ei-

nem Fettstift umfahren. Um ein Austrocknen während der Inkubationszeiten zu verhin-

dern, waren die Objektträger von nun an in einer feuchten Dunkelkammer aufzubewah-

ren. Nach 30 min bei 37°C wurden nach Abklopfen des FCS jeweils 50 µl des primären

Antikörpers aufgetragen. Der aus der Maus stammende monoklonale PCNA-Antikörper

wurde zuvor im Verhältnis 1:50 in 1 % TBS/Albumin verdünnt. Es folgte eine Inkuba-

tion über Nacht bei 4°C in der Dunkelkammer. Tags darauf folgte nach erneutem drei-

mal dreiminütigen Waschen in TBS das Auftragen des ebenfalls aus der Maus stam-

menden sekundären, biotinylierten Antikörpers, von dem im Verhältnis 1:500 in

1 % TBS/Albumin wieder jeweils 50 µl pro Schnitt pipettiert wurden. Die Inkubation

erfolgte für 30 min in der Dunkelkammer bei Raumtemperatur. Zur Herstellung einer

aktiven Avidin-D-Lösung, wurden direkt nach Auftragen des sekundären Antikörpers

auf die Objekte gemäß der Anleitung des Vectastain ABC-Kit in einen Cup mit

2,5 ml TBS je ein Tropfen der Lösung A und der Lösung B nach Anleitung des Herstel-

lers gegeben und bis zur Verwendung 30 min bei 4°C aufbewahrt. Nach erneutem drei-

mal dreiminütigen Waschen in TBS wurden je 50 µl des Peroxidase-gekoppelten Avi-

din D auf die Objekte pipettiert und für 30 min in der Dunkelkammer bei Raumtempe-

ratur inkubiert. Zur Farbentwicklung kam das DAB-KIT zum Einsatz. Zunächst wurden

die Objekte erneut dreimal 3 min in TBS gewaschen. Um schließlich durch einen brau-

nen Farbumschlag die Zellen mikroskopisch sichtbar zu machen, an die der spezifische

PCNA-Antikörper zuvor gebunden hatte, wurden je 100 µl der nach Anleitung des

DAB-KIT hergestellten Lösung auf die Objekte pipettiert. Die Lösung bestand aus

2,5 ml Aqua destillata, einem Tropfen Hydrogen-Peroxidase, zwei Tropfen DAB und

einem Tropfen Puffer und konnte wegen ihrer Instabilität erst direkt vor Gebrauch her-

gestellt werden. Sie wurde etwa 8 min auf dem Gewebe belassen, während derer das

enthaltene Substrat mit der Peroxidase reagierte und so zur Braunfärbung führte. Da-

nach wurde sie mit einer Pipette abgenommen und sachgerecht entsorgt. Die Objekte

wurden, um eine störende Weiterreaktion zu verhindern, sofort für 5 min in Aqua destil-

34

lata gestellt. Zur Gegenfärbung der übrigen Zellen wurden die Objektträger nun für

15 sec in eine mit Hämatoxylin befüllte Kunststoffküvette getaucht, bevor unter laufen-

dem Leitungswasser die überschüssige Farbe etwa 10 min lang ausgewaschen wurde.

Zur Stabilisierung der entstandenen Färbung erfolgte eine aufsteigende Alkoholreihe,

bei der die gefärbten Gewebeschnitte zunächst zweimal kurz in 95 % Ethanol, darauf

dreimal 3 min in 100 % Ethanol und schließlich dreimal 5 min in Xylol gestellt wurden.

Zum Schutz wurden alle Objekte mit Entellan und Deckgläsern eingedeckelt. Die Auf-

bewahrung erfolgte bei Raumtemperatur lichtgeschützt in Objektträgerboxen.

Die mit der PCNA-Methode gefärbten Schnitte konnten anschließend unter dem Mik-

roskop in der 10-, bzw. 20fachen Vergrößerung auf das Vorkommen von TEB unter-

sucht werden. Kriterien für einen TEB waren hierbei der Längsschnitt und in der End-

auftreibung das Verfügen über mindestens drei Zelllagen. Ausgewertet wurden TEB,

bei denen der abgehende Drüsengang über ein möglichst langes Stück erkennbar war,

um eindeutig zu gewährleisten, dass es sich um einen längs angeschnittenen TEB, nicht

um den Querschnitt eines Drüsenganges handelt. Alle gefundenen TEB wurden bei

konstanten Beleuchtungsparametern für alle Proben in 40facher Vergrößerung fokus-

siert, bevor ein digitales Bild erstellt und gespeichert wurde. Ausgewertet wurden die

Photos über das Programm ImageJ (97). Hierzu wurde zunächst das mehrschichtige

Epithel der Endauftreibung des TEB ab einer Dicke von drei Zelllagen unter Ausschluss

der äußeren Fibroblasten-Zellschicht manuell selektiert. Es erfolgte die Berechnung der

Größe der umfahrenen Fläche in Pixel mit anschließender Umrechnung von Pixel in

µm, bzw. µm². Dazu wurde ein standardisierter Glasmaßstab zur Hilfe genommen, von

dem bei gleichem Objektiv und gleicher Nachvergrößerung analog zur Aufnahme der

TEB ein digitales Bild erstellt wurde. Es ergab sich eine Pixelgröße von

0,243 µm x 0,243 µm, was einer Pixelfläche von 0,059 µm² entspricht.

Daraufhin wurden alle dunkelbraunen Zellen innerhalb der umfahrenen Fläche mar-

kiert und gezählt. Die Grenze zwischen hell- und dunkelbraun wurde hierbei in jedem

Photo manuell festgelegt, da sie wegen der etwas unterschiedlich ausgefallenen Anfär-

bung der Strukturen bei jedem TEB unterschiedliche Helligkeitsgrade aufwies. Sowohl

die Größe der Fläche als auch die Anzahl der dunkelbraunen Zellen wurden in eine Ta-

belle übertragen. Aus den beiden Werten konnte schließlich der Quotient aus dunkel-

braunen Zellen pro Fläche berechnet und somit eine Aussage über das Ausmaß der ak-

tuellen Proliferationsrate duktaler Strukturen der Brustdrüse erhalten werden.

35

Tabelle 4.3 Materialien PCNA-Färbung Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L) Rat Adsorbed Affinity Purifierd Made in Horse

LINARIS Biologische Produkte GmbH, Dossen-heim, Deutschland

Entellan Merck, Darmstadt, Deutschland Ethanol (100 %) Merck, Darmstadt, Deutschland Ethanol (95 %) Merck, Darmstadt, Deutschland FCS (100 %) PAA Laboratories, Linz, Österreich Fettstift Dako Pen Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland Hämatoxylin Merck, Darmstadt, Deutschland Horseradish Peroxidase Avidin D LINARIS Biologische Produkte GmbH, Dossen-

heim, Deutschland Isopropanol (100 %) Roth, Karlsruhe, Deutschland Kamera NIKON Digital Sight DS-U1 Nikon GmbH, Düsseldorf, Deutschland Methanol (100 %) Merck, Darmstadt, Deutschland Methanol (70 %) Merck, Darmstadt, Deutschland Methanol (80 %) Merck, Darmstadt, Deutschland Methanol (95 %) Merck, Darmstadt, Deutschland MICROM COOL-CUT HM 335 E Microm, Walldorf, Deutschland Mikroskop LEICA DMR 211185 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland Monoclonal Mouse Anti Proliferating Cell Nuclear Antigen Clone PC10

Dako Deutschland GmbH, Stresemannstraβe 161, Hamburg, Deutschland

Objektträger SuperFrost Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutsch-land

Paraffin Merck, Darmstadt, Deutschland Paraformaldehyd (4 %) Honeywell Riedel-de Haen, Seelze, Deutschland Peroxidase Substrate kit DAB LINARIS Biologische Produkte GmbH, Dossen-

heim, Deutschland Wasserstoffperoxid (3 %) Roth, Karlsruhe, Deutschland Xylol (98 %) Roth, Karlsruhe, Deutschland Für 1 L 10fach TBS: 60,55 g Tris(hydroxymethylaminomethan) Merck, Darmstadt, Deutschland 85,20 g NaCl Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen, Deutsch-

land 48,1 ml HCl 25 % Th. Geyer GmbH & Co. KG, Renningen, Deutsch-

land Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen, Deutschland

4.5 Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion [RT-PCR]

Um mittels RT-PCR die Transkriptionsrate eines Gens (hepatisches IGF-1 und

IGFBP-1) untersuchen zu können wurde RNA aus Gewebe extrahiert. Da in der PCR

nur DNA-Fragmente amplifiziert werden können, musste die RNA dazu über eine Re-

verse Transkriptase in einzelsträngige, komplementäre DNA [cDNA] umgeschrieben

werden, bevor sie in der PCR nachweisbar waren. Es wurde eine Doppelbestimmung

durchgeführt, wobei für beide Gruppen (NP, LP) Proben von jeweils zwei Tieren eines

Wurfs pro Zeitpunkt vorlagen.

4.5.1 RNA-Isolation Die Ribonukleinsäuren wurden mit Hilfe von TRIzol® Reagent [= Guanidin-

Isothiocyanat-Acid-Phenol] nach den Angaben des Herstellers aus dem Lebergewebe

extrahiert. Diese vierphasige Methode umfasst Homogenisierung, Extraktion, Präzipita-

36

tion und Waschen. TRIzol® Reagent hat die Eigenschaft, während der Homogenisierung

Zellmembranen in Folge von Protein-Denaturierung zu zerstören und die Bildung von

RNA-Komplexen mit Guanidin und Wasser zu fördern. Dies verhindert eine Lösung der

enthaltenen DNA-Fragmente und Proteine in der zu untersuchenden wässrigen Phase.

Durch die Zugabe von Chloroform und anschließendes Zentrifugieren wurde die Lö-

sung aus TRIzol® und Probenmaterial in drei Phasen getrennt – eine untere rötliche Phe-

nol-Chloroform-Phase, die die Protein- und Lipid-Bestandteile enthielt, eine DNA-

haltige Interphase und die RNA-haltige farblose wässrige obere Phase. Diese obere Pha-

se wurde mit einer Pipettenspitze abgenommen und in ein neues Cup pipettiert.

Nach Zugabe von Isopropanol und erneutem Zentrifugieren bildete sich das RNA-

haltige Pellet, das mit Ethanol gewaschen und schließlich in RNAse-freiem DEPC-

Wasser gelöst wurde.

Nach photometrischer Konzentrationsbestimmung und gelelektrophoretischer Auf-

trennung der Ribonukleinsäurefragmente wurden die Proben bis zur weiteren Verwen-

dung bei -80°C gelagert.

Um eine Kontamination mit RNAsen zu verhindern, wurde für die RNA-Isolation mit

Handschuhen unter dem Abzug gearbeitet. Dabei kamen nur Geräte zur Anwendung,

die ausschließlich zur RNA-Isolation bestimmt sind.

Von dem nach Entnahme bei -80°C in Cryo-Röhrchen aufbewahrten Lebergewebe wur-

den nach dem Mörsern jeweils zwischen 0,04 g und 0,09 g zur RNA-Isolierung ver-

wendet. Dazu wurden die Proben in flüssigen Stickstoff, bzw. zum Zerkleinern auf Tro-

ckeneis gelegt, um ein Auftauen und damit die Zerstörung der RNA zu verhindern. Die

Lagerung bis zur weiteren Verwendung erfolgte bei -80°C.

Abhängig von seinem Gewicht wurde das Gewebestück, aus dem die RNA extrahiert

wurde, in ein Cup gegeben und mit 0,5 ml (bei Gewebemasse ≤ 0,06 g) oder

1 ml TRIzol® (bei Gewebemasse > 0,06 g) versetzt. In der Gewebemühle erfolgte über

2 min bei 30 Hertz die Homogenisierung des Gewebes mit anschließender Inkubation

für 5 min bei Raumtemperatur. Nach Zugabe von 100 µl / 200 µl Chloroform (Gewe-

bemasse ≤ 0,06 g / > 0,06 g) wurden die Proben etwa 15 sec mittels Vortexer gemischt,

was zu einer milchig-rötlichen Verfärbung des Zelllysates führte. Nach 2-3 min Inkuba-

tion bei Raumtemperatur wurde das Cup für 15 min bei 12.000 U/m und 4°C zentrifu-

giert. Anschließend wurde der wässrige Überstand in einen neues Cup pipettiert, in das

bereits 250 µl / 500 µl Isopropanol vorgelegt waren, kurz gemischt und das Cup für

20 min auf Eis gestellt. Um das RNA-haltige Pellet zu gewinnen, wurde die Lösung

37

15 min bei 14.000 U/m und 4°C zentrifugiert und anschließend das überstehende

Isopropanol mit einer Saugpipette abgesaugt. Mit 0,5 ml / 1,0 ml 75 % Ethanol wurde

das Pellet zweimal gewaschen, je 5 min bei 14.000 U/m und 4°C zentrifugiert und an-

schließend der Alkohol abgesaugt. Bevor das Pellet in 50 µl DEPC gelöst wurde, trock-

nete es etwa 2-3 min, um eine vollständige Verdunstung des Alkohols zu gewährleisten.

Nach Vermessung von Konzentration und Qualität der extrahierten RNA wurde diese

bei - 80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

4.5.2 Agarose-Gelelektrophorese Die gelelektrophoretische Auftrennung im Agarosegel erlaubte eine Abschätzung der

Qualität der extrahierten RNA.

Nukleinsäuren tragen bei neutralem pH-Wert in wässriger Lösung durch Dissoziation

eines Protons vom Phosphorsäurerest des Moleküls negative Ladungen. Dies führt bei

Anlegen einer Spannung zum Wandern der Moleküle durch die Poren des Gels Rich-

tung Anode. Dabei trennen sich die Bestandteile entsprechend ihrer molekularen Größe

auf, wobei die kleinsten am schnellsten in Richtung Anode laufen. Bei intakter RNA

werden zwei Banden sichtbar, die die 18S- [S = Svedberg-Einheit], sowie die 28S-

Untereinheit der ribosomalen RNA darstellen.

Der Einsatz des Fluoreszenzfarbstoffs Ethidiumbromid erlaubte bei Durchleuchtung

des Gels mit UV-Licht das Sichtbarmachen dieser RNA-Banden. Einzelne Ethidi-

umbromid-Moleküle lagern sich zwischen die Basen der RNA. Dabei verändert sich das

Anregungsspektrum des Farbstoffs und führt bei Anregung mit UV-Licht zu erhöhter

Fluoreszenz an den Stellen, an denen sich ein Molekül eingelagert hat.

Zur Herstellung eines 1,5 % Gels wurden 0,45 g Agarose durch kurzes Aufkochen in

30 ml einmal-TAE Puffer gelöst. Das so entstandene flüssige Gel wurde mit

3 µl Ethidiumbromid versetzt und in eine dichte Kammer gegossen, in die zum späteren

Auftragen der Proben nahe der Kathode ein Kamm eingelegt wurde. Nach Aushärtung

des Gels nach etwa 20 min wurde der Kamm entfernt und die Kammer mit 1x-TAE

Puffer aufgefüllt, bis das Gel vollständig bedeckt war. Nun wurden je 2 µl Probe, gelöst

in 3 µl HPLC-Wasser und 1,3 µl 5x-TAE Puffer, der zum Erleichtern des Pipettierens

mit Bromphenolblau gefärbt war, in die im Gel entstandenen Taschen pipettiert. Die

Auftrennung der RNA in ihre Banden erfolgte durch das Anlegen einer Spannung von

90 Volt für 15 min. Anschließend wurde die Qualität der RNA-Fragmente unter Be-

strahlung mit ultraviolettem Licht der Wellenlänge 254 nm beurteilt, wobei durch Anla-

38

gerung von Ethidiumbromid die RNA-Fragmente als fluoreszierende Banden sichtbar

wurden (Abbildung 4.6).

Abbildung 4.6 Für die RNA-Qualität dieser Arbeit repräsentatives Gelelektrophorese-Bild. Es zeigen sich die für RNA typischen Banden der ribosomalen 18S- und 28S-Untereinheiten.

4.5.3 Photometrie Die Photometrie der RNA diente der Konzentrationsbestimmung der extrahierten RNA

und war für eine exakte Berechnung der einzusetzenden Menge an RNA bei der folgen-

den reversen Transkription nötig. Nukleinsäuren absorbieren ultraviolettes Licht der

Wellenlänge 260 nm in Abhängigkeit von ihrer Konzentration. Bei einer Absorption

von 1,0 bei 260 nm liegt RNA oder einzelsträngige DNA in einer Konzentration von

40 µg/ml, doppelsträngige DNA in einer Konzentration von 50 µg/ml vor. Proteine ha-

ben ihr Absorptionsspektrum bei 280 nm, Aromaten, Phenole und Salze bei 230 nm.

Um eine Kontamination herauszufiltern, wurde der Quotient aus der Extinktion bei

260 nm und 280 nm, bzw. bei 260 nm und 230 nm berechnet. Für reine RNA-Proben

sollte der Wert optimaler Weise zwischen 1,8 und 2,2 liegen.

Die Proben wurden auf Eis aufgetaut und gevortext. Nach Erstellung des Leerwerts mit

DEPC-Wasser erfolgte zur Konzentrationsbestimmung der in den Proben enthaltenen

RNA deren photometrische Messung. Je nach Ergebnis wurden die Proben mit DEPC-

Wasser verdünnt, um rechnerisch auf eine Konzentration von 200 ng/µl zu kommen.

Entsprechend des gemessenen Wertes wurde die RNA in der entsprechenden Verdün-

nung mit DEPC-Wasser in der anschließenden RT eingesetzt, um 1 µg RNA jeder Pro-

be zu messen.

Tabelle 4.4 Materialien RNA-Isolation Agarose (Biozym LE) Biozym Scientific GmbH, Hess, Oldendorf,

Deutschland Aqua ad iniectabilia DeltaSelect GmbH, Pfullingen, Deutschland Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen, Deutschland BioPhotometer Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg,

Deutschland Bromphenolblau Merck, Darmstadt, Deutschland Chloroform Amresco inc, Cochran, OH, USA Cryo-Röhrchen SARSTEDT, Nümbrecht, Deutschland

39

DEPC Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutsch-land

Eppendorf-Cup Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Ethanol (75 %) Merck KG, Darmstadt, Deutschland Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutsch-

land HPLC-Wasser Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutsch-

land Isopropanol Merck, Darmstadt, Deutschland TAE-Puffer Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutsch-

land TRIzol®Reagent Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Zentrifuge Rotanta A96R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland Zentrifuge Universal 16R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland

4.5.4 Reverse Transkription Die Reverse Transkription dient dem Umschreiben der RNA in cDNA.

Um falsch positive Ergebnisse, die durch Verunreinigung der RNA-Lösung durch ge-

nomische DNA entstehen, zu verhindern, wurde vor der reversen Transkription ein

DNAse-Verdau durchgeführt. Dieser spaltete möglicherweise vorhandene genomische

DNA-Reste durch eine RNAse-freie DNAse I in Oligo-Desoxyribonukleotide.

Es folgte die eigentliche reverse Transkription der RNA in cDNA. Die verwendete

reverse Transkriptase [RT] ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase mit 5’-3’-

Aktivität, die aus dem Retrovirus Molony Murine Leukosis Virus [M-MLV] gewonnen

wurde. Zur Initiation sind DNA-Primer nötig, die an die RNA binden. An deren 3’-

Ende bindet die DNA-Polymerase und es entsteht unter Zugabe von Desoxy-

Nucleosidtriphosphaten [dNTP] ein RNA-DNA-Hybrid. Der entstandene cDNA-

Einzelstrang kann dann über die PCR nachgewiesen werden.

Die Proben wurden auf Eis aufgetaut, auf dem Vortexer gemischt und kurz zentrifugiert.

Ebenso wurden die übrigen Materialien vorbereitet, wobei bei den Enzymen auf Vorte-

xen verzichtet wurde, um deren Zerstörung zu verhindern. Pro Probe wurde ein Fünf-

fachansatz erstellt. Die folgenden Mengenangaben beziehen sich jeweils auf einen Ein-

fachansatz. Eingesetzt wurde 1 µg der in DEPC gelösten RNA. Um auf eine Konzentra-

tion von 1 µg RNA/12 µl Probe zu kommen, wurden die Proben abhängig vom vorher

photometrisch bestimmten RNA-Gehalt mit DEPC verdünnt. Für den DNAse-Verdau

wurden 1µl 10x DNAse I-Puffer und 1 µl RNAse freier DNAse I hinzugefügt und

15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Gestoppt wurde der DNA-Verdau durch Zugabe

von 1 µl einer 25 mM EDTA-Stop-Solution und Erhitzen im Thermoblock für 15 min

bei 65°C. Im Anschluss wurde jeder Cup mit 1 µl des Mastermix A (Tabelle 4.5) ver-

setzt und für 5 min bei 70°C inkubiert sowie 1 min auf Eis gelagert, um die Bindung der

Primer zu gewährleisten. Nach Zugabe von 10 µl des Mastermix B (Tabelle 4.5) fand

40

während der einstündigen Inkubation bei 37°C die reverse Transkription statt. Durch

einminütiges Abkühlen auf Eis wurde die Reaktion beendet und die Proben bis zu ihrer

weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

Tabelle 4.5 Materialien reverse Transkription DNAse-Vedau: 1 µg RNA 1 µl 10mal DNAse I-Puffer Promega Madison, WI, USA 1 µl RNAse freie DNAse I Promega Madison, WI, USA STOP-solution: 1 µl 25 mM EDTA-Stop-Solution Promega Madison, WI, USA Mastermix A: 0,6 µl Random Primer 1:4 DEPC (0,5 µg/µl) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutsch-

land 0,4 µl Oligo dt-Primer 1:9 DEPC (0,5 µg/µl) MWG-Biotech AG, Ebersberg, Deutschland Mastermix B: 5 µl 5x MMLV-Buffer Promega Madison, WI, USA 1,3 µl dNTP-Mix (10 mM je 500 µl) Finnzymes, Espoo, Finnland 0,5 µl Rnase-Inhibitor 40 U/µl Promega Madison, WI, USA 1 µl MMLV Reverse Transkriptase 200 U/µl Promega Madison, WI, USA 2,3 µl DEPC Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München,

Deutschland Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen, Deutschland Zentrifuge Universal 16R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland Zentrifuge Rotanta A96R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland

4.5.5 TaqMan-Real-Time Polymerase-Kettenreaktion Die TaqMan-Real-Time Polymerase-Kettenreaktion [RT-PCR] wurde zur Vervielfälti-

gung und Quantifizierung der bekannten Sequenzen des hepatischen IGF-1- und

IGFBP-1-Gens innerhalb der zuvor hergestellten cDNA verwendet. Der Versuch wurde

nach Angaben des Herstellers (4) durchgeführt.

Die TaqMan-RT-PCR kombiniert die Methode der PCR, die 1983 von Kary Mullis zur

Amplifizierung definierter Gen-Abschnitte entwickelt wurde (77), mit der simultanen

Quantifizierung des PCR-Produkts über fluoreszierende Sonden und macht eine Detek-

tion sehr kleiner DNA-Mengen mit hoher Genauigkeit möglich.

Die PCR besteht aus drei Teilen: Denaturierung, Primer-Hybridisierung und Elongation.

Durch deren zyklische Wiederholung verdoppelt sich bei optimalen Versuchsbedingun-

gen das PCR-Produkt in jedem Zyklus, was zu einer annähernd exponentiellen Verviel-

fältigung der Zielsequenz führt.

Die Komponenten der Reaktion sind ein template [= zu amplifizierende DNA], ein

forward und ein reverse Primer [= Startpunkte für die Synthese eines zur RNA-Matrize

identischen, bzw. komplementären DNA-Strangs], die aus dem Bakterium Thermus

aquaticus stammende hitzestabile Taq-DNA-Polymerase, sowie dNTP.

41

Durch Inkubation für 2 min bei 50°C mit der AmpErase® Uracil-N-Glycosylase

[UNG] vor dem Start der Reaktion wurde eine Verschleppung von DNA-Fragmenten

aus vorausgegangenen Amplifikationen in den neuen Reaktionsansatz verhindert, die zu

sogenannten carry-over-PCR-Produkten führen würden. Zu diesem Zweck muss Thy-

min im PCR-Ansatz durch die natürlich nur in RNA vorkommende Base Uracil ersetzt

werden, damit die entstehenden Produkte empfindlich gegenüber einer Behandlung mit

UNG werden. Vor dem Start der Reaktion können dann alle Uracil-haltigen DNA-

Fragmente vorausgegangener Amplifikationen denaturiert werden, wobei die native,

Thymin-haltige DNA des neuen Ansatzes unberührt bleibt. Durch Hitzedenaturierung

(10 min bei 95°C) wurde die Reaktion der UNG vor Beginn der PCR beendet.

Die nun folgenden Amplifikations-Schritte wurden 40 Mal wiederholt.

Im ersten Schritt der PCR, der Denaturierung, wird die doppelsträngige DNA durch

Erhitzen auf 95°C für 15 sec zu Einzelsträngen denaturiert, wobei die Wasserstoffbrü-

ckenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren zerstört werden. Im zwei-

ten Schritt, der Primer-Hybridisierung, binden die zu den 3’-Enden der beiden DNA-

Einzelstränge komplementären Primer unter Abkühlung für 1 min auf 60°C an ihre

spezifischen Sequenzen. Im dritten Schritt schließlich, der Elongation, synthetisiert die

hitzestabile Taq-DNA-Polymerase ausgehend vom 3’-Ende des Primers bei 72°C den

komplementären DNA-Strang in 3’-5’-Richtung des Ursprungsstrangs. Das Magne-

siumchlorid dient der Taq-DNA-Polymerase als Cofaktor und stabilisiert die Bindung

der Sonde.

Zur Quantifizierung der gesuchten Gene diente der sogenannte Fluorescence resonance

energy transfer [FRET] (Abbildung 4.7). Dazu wurde eine fluoreszierende Sonde einge-

setzt. Diese sogenannte TaqMan-Sonde besteht aus einem Oligonukleotid, welches zwi-

schen den beiden Primern bindet. Sie enthielt FAM [6-Carboxy-Fluorescein] als Repor-

ter (= Donor-Fluorochrom) am 5’-Ende und TAMRA [6-Carboxy-tetramethyl-

rhodamin] als Quencher (= Akzeptor-Fluorochrom) am 3’-Ende. Bei intakter Sonde

wurde der Reporter durch Licht der Wellenlänge 488 nm angeregt und gab einen Teil

seiner Energie an den Quencher ab, der die Fluoreszenz des Reporters durch die räumli-

che Nähe unterdrückte. Die 5’-3’-Exonuklease-Aktivität der eingesetzten AmpliTaq

Gold® DNA-Polymerase führte zu Verdrängung und hydrolytischer Spaltung der Sonde

während der DNA-Synthese. Unter zunehmendem Abstand des Reporters vom Quen-

cher, der durch die Hydrolyse entstand, nahm das Fluoreszenzsignal des Reporters zu,

während das des Quenchers abnahm. Die Akkumulation von PCR-Produkten konnte

42

über die Zunahme der Fluoreszenz des Reporters am Ende der Elongationsphase in je-

dem Zyklus gemessen werden. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals ist dabei direkt pro-

portional zur Menge des PCR-Produkts. Da die 5’-3’-Exonuklease nur aktiv wird, wenn

sowohl die Sonde stabil an die Zielsequenz gebunden hat, als auch die DNA-

Polymerase korrekt ihre Zielsequenz vervielfältigt, ist dieses Verfahren sehr spezifisch.

Abbildung 4.7 Schematische Darstellung der Quantifizierung der replizierten DNA mittels FRET (modifiziert nach (4)).

Zur Auswertung der Ergebnisse kam das Programm 7500 Real Time PCR System in

Verbindung mit der 7500 System Software zum Einsatz. Die Amplifikationskurve hat

drei Segmente (Abbildung 4.8). In der ersten Phase befindet sich der gesuchte Gen-

Abschnitt unter der Nachweisgrenze. Das Signal des PCR-Produkts ist kleiner als das

background-Signal des PCR-Systems. Die exponentielle Phase beginnt, wenn das Sig-

nal des PCR-Produkts das Hintergrundsignal übersteigt. Die Kurve endet in der Pla-

teauphase.

Um Fluoreszenzunterschiede aufgrund von Konzentrations- oder Volumenschwankun-

gen zu eliminieren, wurde das Reporter-Signal auf einen Referenzfarbstoff [ROX =

6-Carboxy-X-rhodamin], der seine Fluoreszenz während des Versuchs nicht veränderte,

normalisiert. Rn ist dabei der Quotient aus dem Reporter-Signal und dem ROX-Signal

(Abbildung 4.8).

43

Abbildung 4.8 Amplifikationskurve (modifiziert nach (4)).

Ab einem Schwellenzyklus CT [Threshold-cycle] ist zwischen dem bereits vor Beginn

der Amplifikation messbaren Hintergrundsignal Rn- des Reporters und dem in einem

späteren Zyklus gemessenen Wert Rn+ ein deutlicher Fluoreszenzanstieg ∆Rn messbar.

Der CT –Wert liegt also am Beginn der exponentiellen Phase. Mit Hilfe der 7500 Sys-

tem Software konnte nun über die Intensitätsmessung der Fluoreszenz für jede Probe

die Menge der ursprünglich eingesetzten DNA errechnet werden (4).

Zum Ausgleich von Ergebnisschwankungen, die durch Unterschiede in der eingesetzten

RNA-, bzw. cDNA-Menge entstanden, wurden alle Ergebnisse zu den house-keeping-

Genen HPRT [Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase] und r18S [ribosomale 18S-

RNA], die in unseren Voruntersuchungen konstant in der Brustdrüse exprimiert wurden,

in Bezug gesetzt. Um geräteabhängige Messungenauigkeiten bestmöglich zu eliminie-

ren, wurde täglich vor Messbeginn eine Background-Messung durchgeführt.

Folgende Reagenzien (Tabelle 4.6) wurden nach Angaben des Herstellers für die Durch-

führung der PCR verwendet (Mengenangaben pro Well):

Tabelle 4.6 Reagenzien PCR IGF-1 IGFBP-1 HPRT r18S 10x Taq-Puffer II (1:50 in HPLC-Wasser)

2.50 µl 2.50 µl 2.50 µl 2.50 µl

ROX Passive (1:50 in HPLC-Wasser)

1,75 µl 1,75 µl 1,75 µl 1,75 µl

dNTP-Mix (UTP) 1,00 µl (5 mM) 1,00 µl (5 mM) 1,00 µl (5 mM) 1,00 µl (2,5 mM) 50 mM MgCl2 2,00 µl (4,0 mM) 1,50 µl (3,0 mM) 2,00 µl (4,0 mM) 1,75 µl (3,5 mM) AmpliTaq gold 0,13 µl 0,13 µl 0,13 µl 0,13 µl AmpEraseUNG 0,25 µl 0,25 µl 0,25 µl 0,25 µl HPLC-Wasser 7,37 µl 7,87 µl 7,37 µl 7,62 µl Sonde taq 2,50 µl (2 µM) 2,50 µl (2 µM) 2,50 µl (2 µM) 2,50 µ l(2 µM) Primer for 2,50 µl (3 µM) 2,50 µl (3 µM) 2,50 µl (9 µM) 2,50 µl (6 µM) Primer rev 2,50 µl (9 µM) 2,50 µl (3 µM) 2,50 µl (9 µM) 2,50 µl (6 µM) Template 2,50 µl 2,50 µl 2,50 µl 2,50 µl

Σ: 25,00 µl 25,00 µl 25,00 µl 25,00 µl

44

Reagenzien und Proben wurden auf Eis aufgetaut, im Vortexer gemischt (außer Enzy-

me) und abzentrifugiert. Aus den Reagenzien wurde ein Mix erstellt, von dem in jedes

Well der MicroAmp-Platte 22,5 µl pipettiert wurden. Dazu wurden jeweils 2,5 µl der

Probe gegeben. Als Kontrolle dienten das verwendete HPLC-Wasser sowie das in der

RT verwendete DEPC-Wasser. Nach erneutem Zentrifugieren für 2 min bei 1200 U/m

wurde die Messung im 7500 Real Time PCR System gestartet.

Tabelle 4.7 Verwendete Primer-Sequenzen (5’ – 3’) (74,81). IGF-1 Sonde taq CCTTTACCAGCTCGGCCACAGCC Primer for CTACCTGGCACTCTGCTTGCT Primer rev TGGTCCACACACGAACTGAAG IGFBP-1 Sonde taq AGCCCTGCCAACGGGAACTCTATAAAGTG Primer for AGATCACTGACCTCAAGAAATGGA Primer rev TGAGCGGCAGCTAATCTCTCTA HPRT Sonde taq TGCAAGCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTC Primer for GCAGTACAGCCCCAAAATGG Primer rev TCATTATAGTCAAGGGCATATCCAAC r18S Sonde taq CGCCCGTCGCTACTACCGATTGG Primer for TTGATTAAGTCCCTGCCCTTTGT Primer rev CGATCCGAGGGCCTCACTA

Tabelle 4.8 Materialien PCR 2,5µl 10x Taq-Buffer II Eurogentec, Seraing, Belgien 1µl dNTP-Mix (Uridintriphosphat), 5mM Eurogentec, Seraing, Belgien MgCl, 50mM Eurogentec, Seraing, Belgien 0,13µl AmpliTaq Gold DNA-Polymerase Eurogentec, Seraing, Belgien 0,25µl AmpERase UNG Eurogentec, Seraing, Belgien 1,75µl ROX Passive reference RT-PARE-03 Eurogentec, Seraing, Belgien Primer und Sonde 2,5µl forward Primer (3 oder 6 µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg, Deutschland 2,5µl reverse Primer (3 oder 6 µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg, Deutschland 2,5µl TaqMan-Sonde (2µM) MWG-Biotech AG, Ebersberg, Deutschland 7500 Real Time PCR System Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland 7500 System Software Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen, Deutschland DEPC Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutsch-

land HPLC-Wasser Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, Deutsch-

land Micro-Amp-Platte Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland Zentrifuge Rotanta A96R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland Zentrifuge Universal 16R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland

4.6 Enzyme-linked Immunosorbent Assay [ELISA]

Der ELISA ist ein immunologisches Verfahren, bei dem mittels Bindung spezifischer

Antikörper einzelne Proteine nachgewiesen werden können. In der vorliegenden Arbeit

diente er der Messung von IGF-1 im Serum. Es erfolgte eine Doppelbestimmung von

fünf Würfen à fünf Jungtiere der LP-Gruppe und von sechs Würfen à sechs Jungtiere

der NP-Gruppe. Dabei wurde nach den Angaben des Herstellers vorgegangen (72).

45

Spezifische Antikörper binden bekanntermaßen an ihr Antigen und führen zur enzyma-

tischen Umwandlung eines Substrates, was als Nachweis für das Vorkommen des Anti-

gens gilt und über photometrische Messung quantifiziert werden kann.

Im hier durchgeführten Assay ist die Messung von IGF-1 durch die Interferenz mit

dem IGFBP-1 erschwert, zu dem IGF-1 eine hohe Affinität aufweist. Daher wurde zu-

nächst durch saures Milieu die Dissoziation von IGF-1 und IGFBP-1 herbeigeführt und

im Anschluss IGFBP-1 durch IGF-2 blockiert. Dazu wurden die Proben mit einem sau-

ren Puffer (pH < 3,1) verdünnt, anschließend wurde der pH-Wert neutralisiert (pH 7).

Durch Zugabe von IGF-2 im Überschuss wurden die Bindungsstellen der IGFBP-1 be-

setzt. Der im Verlauf zugegebene IGF-1-Antikörper weist eine extrem niedrige Kreuz-

reaktivität mit IGF-2 auf, sodass der Überschuss von IGF-2 unproblematisch für die

Messung war. Der Nachweis von IGF-1 geschah unter Verwendung eines Streptavidin-

Peroxidase-Komplexes. Dieser bewirkt im Substrat (stabilisiertes H2O2 -

Tetramethylbenzidin) einen Farbumschlag durch Oxidation. Die entstandene blaue Far-

be wird dann durch Zugeben der Stopplösung (Schwefelsäure) gelb und im Anschluss

photometrisch quantitativ nachgewiesen.

Nach Entnahme wurde das Blut bei 4°C über Nacht gelagert, anschließend bei

3500 U/m für 15 min abzentrifugiert, abgesert und bei -80°C aufbewahrt. Die Notwen-

digkeit zur Verdünnung wurde in einem Vorlauf mit Standardkurve ermittelt, indem die

Messwerte sich oberhalb der mittleren Norm bewegt haben (Abbildung 4.9).

Abbildung 4.9 Repräsentative IGF-1-ELISA Standardkurve aus unseren Versuchsreihen. Standardkonzentrationen 0,5 – 2,5 – 6 – 12 – 18 ng/ml, analytische Sensitivität 0,029 ng/ml.

Die Proben wurden mit dem Probenpuffer verdünnt (d 21: Verdünnung 1:50; d 28: Ver-

dünnung 1:200). Die Standards A-E, welche rekombinantes IGF-1 in bekannten Men-

gen (0,5; 2,5; 6; 12; 18 ng/ml) enthielten, wurden zur Rekonstitution der lyophilisierten

Komponenten in je 1 ml Probenpuffer gelöst. Die lyophilisierten Kontrollseren KS1 und

46

KS2 wurden in 500 µl Probenpuffer gelöst. Der Waschpuffer wurde im Verhältnis 1:20

mit destilliertem Wasser verdünnt. Vor der Durchführung wurden alle Komponenten

auf Raumtemperatur gebracht.

Um die Messungen vergleichbar zu machen wurden alle Komponenten innerhalb von

15 min in die Vertiefungen der Testplatte pipettiert. Dabei wurden zunächst

50 µl Antikörperkonjugat pro Well pipettiert. Zur Erstellung des Leerwerts wurden in

die ersten Vertiefungen 50 µl Probenpuffer, im Anschluss daran jeweils 50 µl der Stan-

dardlösungen, der Kontrollseren, sowie der Proben pipettiert und mit Klebefolie dicht

abgedeckt. Nach Inkubation unter Schütteln > 350 U/m für 1 h bei Raumtemperatur

wurden die Lösungen abgesaugt und die Platte fünfmal mit 250 µl Waschpuffer pro

Vertiefung gewaschen. Der Waschpuffer verblieb dabei jeweils für mindestens 15 sec in

den Vertiefungen. Nach dem letzten Waschschritt wurden je 100 µl Enzymkonjugat

zugegeben, die Platte wiederum mit Klebefolie dicht abgedeckt und 30 min unter Schüt-

teln > 350 U/m bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem fünfmaligen Waschen

wie oben beschrieben wurden in die Vertiefungen je 100 µl der Substratlösung pipettiert

und die Platte für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Zuletzt wurden in

jede Vertiefung 100 µl der Stopplösung pipettiert. Die Ausmessung der Farbreaktion

erfolgte innerhalb von 30 min bei einer Wellenlänge von 450 nm. Die Auswertung der

Ergebnisse wurde mit Hilfe der Ascent Software for Multiscan vorgenommen.

Tabelle 4.9 Materialien ELISA Aqua destillata B.Braun AG, Melsungen, Deutschland Ascent Software for Multiscan Vers. 2.6., ©1996-2002 Thermo Labsystems Oy KIT Mediagnost, Reutlingen, Deutschland Photometer Multiscan Termo Fischer Scientific Germany Ltd. & Co. KG,

Braunschweig, Deutschland Zentrifuge Rotanta A96R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland Zentrifuge Universal 16R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland

4.7 Liquid Chromatography Tandem Massenspektrometri e [LC-Tandem-MS]

Die LC-Tandem-MS ist eine schnelle, reproduzierbare, sehr sensitive und spezifische

Methode zur Bestimmung der Konzentration von kleinen Molekülen. Sie ermöglicht

den simultanen Nachweis bestimmter Moleküle in einer Probe. In der vorliegenden Ar-

beit diente sie der Erstellung eines Steroidhormon-Profils mit Hilfe einer in unserem

Labor etablierten Methode (98,99). Die Bestimmung der Steroide erfolgte in den Seren

aller Tiere beider Gruppen.

47

Zur Probenaufbereitung geht der Massenspektrometrie [MS] eine Flüssigkeitschroma-

tographie [LC] voraus. Dabei wird die Probe durch unterschiedliche Adsorption der

einzelnen Komponenten des Stoffgemischs an definierte Oberflächen in Einzelfraktio-

nen aufgetrennt. Anschließend wird das zu untersuchende Substrat in die Gasform über-

führt und mittels APCI [= atmospheric pressure chemical ionization] ionisiert. Im Mas-

senanalysator werden die Ionen in elektromagnetischen Feldern nach ihrem Verhältnis

von Masse zu Ladung [m/z] getrennt und schließlich die Teilchenzahl einzelner Ionen

bestimmt. Bei der hier verwendeten Tandem-MS läuft die Detektion über zwei Analysa-

toren. Aus einem Ionenstrom erfolgt zunächst mithilfe eines Quadrupol-Massenfilters

die Selektion eines definierten Ions. Ein Quadrupol-Massenfilter ist eine Parallelanord-

nung von vier Metallstäben; bei definierter Frequenz können nur Ionen einer bestimm-

ten Masse durch diese Stäbe passieren, während Ionen anderer Masse seitlich emittiert

werden. In die zwischengeschaltete Kollisionszelle strömt Argon ein; Kollision der io-

nisierten Moleküle mit diesem Inertgas bewirkt Bindungsbrüche oder Umlagerungen; es

entstehen spezifische leichtere Ionen, die in einem zweiten Quadrupol-Massenfilter er-

neut separiert werden. Durch die Kopplung der drei beschriebenen Schritte wird ein

spezifischer Nachweis auch von Molekülen gleichen Molekulargewichts möglich. Für

jedes detektierte Molekül entsteht im Ionendetektor ein spezifischer Peak (136).

Nach Entnahme mittels Herzpunktion in Anästhesie wurde das Blut bei 4°C über Nacht

gelagert, anschließend bei 3500 U/m für 15 min abzentrifugiert, abgesert und bei -80°C

bis zur weiteren Analyse aufbewahrt. Die einzelnen Arbeitsschritte der LC-Tandem-MS

erfolgten wie bereits andernorts beschrieben (98,99):

Als Standards zur Kalibrierung dienten isotonische Salzlösungen versetzt mit Steroid-

Stammlösungen von 10 mg/l, welche Steroide in definierten Konzentrationen enthielten

(50 – 25 – 12,5 – 6,25 – 3,13 – 1,56 – 0,156 µg/l). Zusätzlich wurden ein Null-Standard,

Seronorm 1 und Seronorm 2 mit jeweils definierten Steroid-Konzentrationen als Kon-

trollen sowie Vergleichsproben von zwei Muttertieren als Positivkontrollen mitgeführt.

Als Internstandards dienten Cortisol d4, DHEAS-d5, Corticosteron-d8, 17-OH-

Progesteron d8 und Progesteron d9. Die Internstandard-Lösung bestand aus 2 mM Am-

monium-Acetat und Methanol im Verhältnis 1:1 bei einer Konzentration von 150 µg/l.

Die Substrate wurden bis zu ihrer Verwendung bei 4°C gelagert.

Zunächst wurden je 100 µl der Serumpoben, der Positivkontrollen oder der Standards

in Cups pipettiert. Im Anschluss wurden je 20 µl der Internstandards 1-4 in alle Cups

hinzugefügt. Nach kurzem Mischen im Vortexer wurden die Proben für 30 min bei

48

Raumtemperatur inkubiert, bevor im nächsten Schritt die Zugabe von je 200 µl Fäl-

lungsreagenz erfolgte. Dieses bestand aus einer 1:1 Mischung, zusammengesetzt aus

Methanol und einer 50 g/l ZnSO4 in H2O-Lösung. Nach erneutem Vortexen und

15minütiger Inkubation bei 4°C wurden die fertiggestellten Proben für 10 min bei 18°C

und 15.000 U/min zentrifugiert.

Von den Proben wurden nun je 250 µl in ein Well einer Mikrotiter-Platte pipettiert,

die Platte mit Folie beklebt und zur Messung in das Massenspektrometer bei 15°C ge-

stellt.

In Vorversuchen fanden sich Pregnenolon, 17OH-Pregnenolon, 17OH-Progesteron,

21OH-Progesteron, Cortisol, Cortison, Androstendion und Testosteron und Estradiol

unter der Nachweisgrenze. Gemessen wurden Progesteron, Deoxycorticosteron, Corti-

costeron, Dehydrocorticosteron, DHEA, DHEAS.

Das LC-System besteht aus einer binären Pumpe und einem 12-Port Ventil. 80 µl der

deproteinisierten Proben wurden unter Verwendung eines HTC PAL Autosamplers ein-

gespeist, welcher zwischen dem Valco-Ventil und der Extraktions-Säule (Oasis HLB

2.1* 20 mm, 15µm) mit einer 100 µl Probenschleife ausgestattet ist. Diese wurde an-

schließend für 1 min bei einer Flussrate von 3 ml/min mit Wasser/Methanol im Verhält-

nis 95:5 gewaschen. Anschließend wurde das Ventil geschalten und das gebundene Ma-

terial im Rückspülmodus mit 2 mM Ammonium-Acetat-Methanol im Verhältnis 30:70

bei einer Flussrate von 1 ml/min von der Extraktions- auf die Analyse-Säule übertragen.

Nach 2 min wurde erneut die Ventilposition verändert, um die Extraktions-Säule mit

Wasser/Methanol im Verhältnis 95:5 bei einer Flussrate von 3 ml/min zu re-

equilibrieren. Die Analysenzeit betrug 6 min. Es kam eine monolithische Säule (Chro-

molith RP-18e, 100* 4.6mm) zum Einsatz. Die Temperatur der Extraktions-Säule wur-

de mit Hilfe eines Agilent Säulen Ofens konstant bei 30°C gehalten. Die Flussrate be-

trug 1 ml/min.

Zur Detektion kam das API 4000TM Tandem-Massenspektrometer zum Einsatz, wel-

ches mit einer APCI-Quelle ausgestattet ist. Die Temperatur der APCI-Quelle lag bei

600°C, der Nadelstrom bei 5 µA. Die detailierten Methodenparameter finden sich in

Tabelle 4.10.

Zur Quantifizierung wurde eine Standardkurve der sieben Kalibrierungsstandards er-

stellt. Die Berechnung der Kalibrierungskurven erfolgte mittels linearer Regression

nach der Gleichung y = a + bx, wobei y das Verhältnis aus der Höhe des Peaks der Sub-

stanz zu der des Internstandards ist und x die Konzentration des Analyten der Kalibrie-

49

rungs-Probe. Die 1 / x – Gewichtung wurde zur Gewährleistung maximaler Präzision

bei geringen Konzentrationen verwendet. Es wurde die Höhe des Peaks verwendet, um

an der Detektionsgrenze den Einfluss des Hintergrundsignals und der Form des Peaks

zu minimieren.

Abbildung 4.10 zeigt die Darstellung der Intensität in Abhängigkeit von der Zeit

zweier repräsentativer, massenspektrometrisch analysierter Steroide.

0 2 4 6 8 10

0,0

4,0x103

8,0x103

1,2x104

1,6x104CorticosteroneMRM: 347/121RT: 4.33 min

Inte

ns

ity [

cp

s]

0 2 4 6 8 10

0,0

2,5x104

5,0x104

7,5x104

1,0x105

1,3x105

1,5x105

ProgesteroneMRM: 315/97RT: 7.08 min

Inte

nsi

ty [

cps

]

Abbildung 4.10 Repräsentative Kurven der Intensität von Corticosteron und Progesteron in Abhängigkeit von der Zeit [min]. cps = counts per second als Maßeinheit für die Signalintensität, MRM = multiples Reaktions Monitoring, RT = Retentionszeit. Tabelle 4.10 Methodenparameter Steroid MW Ion CAS-Nummer MRM MRM-Q IS Corticosteron 346.2 [M+H]+ 50-22-6 347/121 347/97 355/125 Dehydrocorticosteron 344.2 [M-H]+ 345/121 345/ 355/125 Deoxycorticosteron 330.2 [M+H]+ 64-85-7 331/109 331/97 339/113 Progesteron 314.2 [M+H]+ 57-83-0 315/97 315/109 339/113 DHEA 288.2 [M-H2O+H]+ 53-43-0 271/213 271/197 339/113 DHEAS 368.2 [M-SO4-H2O+H]+ 651-48-9 271/213 271/197 273/213 Tabelle 4.11 Materialien Tandem-MS 12-Port Ventil VICI Valco Instruments, Houston, USA Analyse software (Version 1.4) Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland Binäre Pumpe Agilent 1100 Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland Chromolith -Säule RP-18e, 100 mm×4.6 mm Merck, Darmstadt, Deutschland Eppendorf-Cups Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Extraktionssäule Oasis HLB 2.1 mm×20 mm, 15 µm Waters, Milford, USA HTC PAL Autosampler CTC Analytics, Zwingen, Schweiz Massenspektrometer Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland Methanol Merck, Darmstadt, Deutschland Micro-Amp-Platte Greiner BIO-ONE, Frickenhausen, Deutschland Tandem-Massenspektrometer API 4000TM Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland Zentrifuge Rotanta A96R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland Zentrifuge Universal 16R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Deutschland Zinksulfat Merck, Darmstadt, Deutschland

50

4.8 Gene-Array

Um auf lokaler Ebene Hinweise auf eine fetale Programmierung im mammären Expres-

sionsprofil zu finden, welche gegebenenfalls eine spätere prokanzerogene Entwicklung

der Mamma begünstigen könnte, wurde ein Gene-Array durchgeführt. Die mit TRIzol®

isolierten RNA-Proben (vgl. Kapitel 4.5.1) wurden zur kommerziellen Durchführung

des sogenannten Agilent SurePrint G3 Rat GE 8x60K Microarrays an die Firma Milte-

nyi Biotec (Bergisch Gladbach, Deutschland) auf Trockeneis versandt.

Pro Zeitpunkt (d 21, d 28) und Gruppe (LP, NP) wurde jeweils die RNA dreier Brust-

drüsen von Ratten unterschiedlicher Würfe verglichen. Die Gesamtanzahl der Proben

belief sich auf 12 Stück. Vor Durchführung des Arrays wurden die RNA-Proben einer

Qualitätskontrolle durch den Agilent RNA 6000 Nano Kit der Agilent 2100 Bioanalyzer

Platform und der zugehörigen Software unterzogen (Abbildung 4.11).

Zusätzlich zur visuellen Kontrolle erfolgte mit Hilfe des Agilent RNA 6000 Nano die

Erstellung von sogenannten RNA-Integrity-Nummern [RIN] zur Beurteilung der Integ-

rität und Qualität der RNA Proben. Der RIN-Wert wird über einen Software-internen

Algorithmus berechnet, welcher mehrere Qualitätsparameter einbezieht, wie beispiels-

weise das Verhältnis der Fläche unter den Spitzenausschlägen im Elektropherogramm

von 28S-RNA zu 18S-RNA, sowie unerwartete Spitzen in der 5S-RNA-Region. Ein

RIN-Wert von 10 zeigt höchste RNA-Qualität an, eine RIN-Wert von 1 ist mit geringer

Qualität gleichzusetzen. Nach den Standards der Firma Miltenyi und der gängigen Lite-

raturmeinung liefert eine RNA mit einem RIN-Wert von > 6 suffiziente Ergebnisse bei

der Genexpressionsanalyse (29). Alle verwendeten RNA Proben unseres Experiments

zeigten mit RIN-Werten zwischen 9,2 und 9,7 sehr gute Qualität. Quantifiziert wurde

die RNA über das ND-1000 Spectrophotometer.

Das “sample labeling” wurde nach dem One-Color Microarray-Based Gene Expressi-

on Analysis protocol (version 6.5, part number G4140-90040) durchgeführt.

Im Anschluss erfolgte ein linearer, auf Anwendung der T7-RNA-Polymerase basie-

render Amplifikationsschritt von 100 ng RNA pro Probe. Zur Herstellung von mit dem

Fluoreszenzfarbstoff Cy3 markierter cRNA wurden die Proben mit dem Agilent Low

Input Quick Amp Labeling Kit nach Herstellerangaben amplifiziert und markiert, wobei

die Effizienz mit Hilfe des ND-1000 Spectrophotometers kontrolliert wurde.

51

Abbildung 4.11 Qualitätskontrolle der für den Gene-Array verwendeten RNA. (a) Gelbild und (b) Elektrophe-rogramm der Gesamt-RNA-Proben. Erste Bahn im Gelbild: Referenz-Skala, RNA-Molekulargewichte in Nukleoti-den; grüne Bande: Internstandard.. Die beiden prominenten Ausschläge im Elektropherogramm repräsentieren ribo-somale RNA links der 18S-RNA, rechts der 28S-RNA. Die Ausrichtung der Y-Achse ist nach dem stärksten Signal automatisiert.

Die Hybridisierung erfolgte mittels Agilent Gene Expression Hybridization Kit:

600 ng Cy3-markierte, fragmentierte cRNA in Hybridisationspuffer wurden über Nacht

(17 h, 65 °C) mit Agilent Whole Rat Genome Oligo Microarrays 8x60K hybridisiert,

wobei Miltenyi Biotec die von Agilent empfohlene Hybridisierungskammer sowie

Hybridisierungsofen verwendeten.

Die Analyse der Daten erfolgte mittels Agilent’s Microarray Scanner System mit der

Agilent Feature Extraction Software. Diese bestimmt mit Hilfe der Hintergrundsubtrak-

tion die Einzelintensitäten, verwirft dabei Ausreißer und berechnet statistische Konfi-

denzintervalle. Die Gruppen wurden in diesem Rahmen einem gruppeninternen Konsis-

tenzabgleich unterzogen und daraufhin vor weiteren Analysen gefiltert. Zur Bestim-

52

mung der differentiellen Genexpression zwischen den beiden Gruppen LP und NP zu

den Zeitpunkten d 21 und d 28 wurde das Rosetta Resolver® gene expression data ana-

lysis system verwendet.

Die detaillierten Daten des Gene-Array finden sich unter NCBI Gene Expression

Omnibus (70) und sind ab 05.12.2012 öffentlich einzusehen über die GEO Series Zu-

gangsnummer GSE34136 (20).

Zur Analyse funktioneller Signalwege anhand von Expressionsunterschieden biologi-

scher und molekularer Signalwege der Brustdrüse nach intrauteriner Mangelernährung

zu den Zeitpunkten d 21 und d 28 wurde die online-Platform IPA benutzt, kürzlich de-

tailliert beschrieben von Wognum et al. (144). Die IPA-Software ordnet im Gene-Array

analysierte Gene nach ihrer funktionellen Bedeutung, nach Krankheiten und nach be-

kannten molekularen Interaktionen relevanten Signalpfaden und bestimmten molekula-

ren Netzwerken zu. Diese sind in der sogenannten IPKB [Ingenuity Pathways Know-

ledge Base] gespeichert, werden laufend aktualisiert und basieren auf durch unabhängi-

ge Gutachter beurteilten wissenschaftlichen Publikationen (Peer-Reviews) (11,68,71).

Im vorliegenden Experiment wurde für die signifikante Zuordnung zu Netzwerken der

Anteil der gefundenen Gene an der Gesamtanzahl der in diesem Signalweg vorkom-

menden Gene berechnet. Es wurden ausschließlich Gene berücksichtigt, welche einen

p-Wert < 0,05 und eine 2-fache Induktion oder Reduktion ihrer Expressionsrate zeigten

(68). Dabei fand zur statistischen Analyse der exakte Chi-Quadrat-Test Anwendung, um

die Zusammenhänge bestimmter Gene mit Netzwerken herauszufiltern, die in signifi-

kantem Zusammenhang stehen (144).

Tabelle 4.12 Materialien Gene-Array Agilent 2100 Bioanalyzer Platform, Agilent RNA 6000 Nano

Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland

Agilent Feature Extraction Software Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland Agilent Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland Agilent Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland Agilent SurePrint G3 Rat GE 8x60K Microarrays Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland Agilent’s Microarray Scanner System, Agilent Fea-ture Extraction Software (FES) 10.7.3.1

Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland

IPA Ingenuity Systems Redwood City, CA, USA, www.ingenuity.com ND-1000 Spectrophotometers NanoDrop Technologies, PEQLAB Biotechnologie

GmbH, Erlangen, Deutschland Rosetta Resolver® gene expression data analysis system

Rosetta Biosoftware, Cambridge, USA

53

4.9 Statistische Datenauswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mittels non-parametrischem Mann-Whitney-U-

Tests (PRISM 4.0/5.0, Graph PAD Software, San Diego, USA). Alle Werte wurden als

Mittelwert ± SEM [= Standarderror of the mean] dargestellt. Das Signifikanzniveau

wurde auf p < 0,05 festgelegt (p < 0,05 = *, p < 0,01 = **, p < 0.0001 = ***). Die Signi-

fikanzberechnung der funktionellen Signalweg-Analyse der Gene-Arrays via IPA Plat-

form basiert auf dem Chi-Quadrat-Test.

54

5 Ergebnisse

5.1 Auxiologische Daten der Tiere

Im hier vorliegenden Modell wurden Körpergewicht [Gewicht], Körperlänge [Länge]

und Schwanzlänge zwischen der Gruppe der LP-Tiere und der Gruppe der NP-Tiere

verglichen (Tabelle 5.1, Abbildung 5.1).

Für alle drei Parameter zeigte sich zwischen den beiden Gruppen an d 1 ein signifi-

kanter Unterschied (p < 0,0001), wobei die Werte der LP-Tiere immer unter denen der

NP-Tiere lagen. Die Längen der Tiere aus der LP- und NP-Gruppe glichen sich im zeit-

lichen Verlauf von d 21 (p = 0,001) bis d 28 (ns) [= nicht signifikant] an; bei Gewicht

und Schwanzlänge blieben an d 21 (jeweils p < 0,0001) und an d 28 (Gewicht:

p = 0,0011; Schwanzlänge: p = 0,0215) signifikante Unterschiede zwischen LP- und

NP-Tieren bestehen.

Der Zuwachs der Werte der drei dargestellten Parameter stellte sich in beiden Grup-

pen sowohl von d 1 auf d 21, wie auch von d 21 auf d 28 als signifikant (p < 0,0001)

heraus.

Tabelle 5.1 Auxiologische Daten d 1, d 21, d 28. LP NP P-Wert

d 1 4,9 ± 0,07 (n = 42) 6,2 ± 0,10 (n = 41) p < 0,0001 d 21 46,9 ± 0,95 (n = 40) 56,5 ± 0,64 (n = 43) p < 0,0001

Körpergewicht [g]

d 28 73,3 ± 2,33 (n = 20) 85,2 ± 2,28 (n = 24) p = 0,001 d 1 4,5 ± 0,05 (n = 42) 5,0 ± 0,05 (n = 40) p < 0,0001 d 21 11,4 ± 0,18 (n = 20) 12,5 ± 0,39 (n = 26) p = 0,001

Körperlänge [cm]

d 28 13,9 ± 0,21 (n = 20) 14,1 ± 0,11 (n = 24) ns d 1 1,5 ± 0,03 (n = 42) 1,7 ± 0,04 (n = 40) p < 0,0001 d 21 6,4 ± 0,14 (n = 20) 7,3 ± 0,08 (n = 26) p < 0,0001

Schwanzlänge [cm]

d 28 8,8 ± 0,20 (n = 20) 9,4 ± 0,14 (n = 24) p = 0,02

55

Abbildung 5.1 Körpergewicht [Gewicht], Körperlänge [Länge] und Schwanzlänge der LP- und NP-Gruppe im Ver-lauf, sowie an d 1, d 21 und d 28.

5.2 Whole-Mount Analyse

Die Whole-Mount Analyse (Abbildung 5.2) des aus verschmolzener apikaler (vierter)

und distaler (fünfter) Brustdrüse bestehenden lumbalen Brustdrüsenkörpers bezog den

von dukto-alveolärem Drüsengewebe eingenommenen Flächenanteil am gesamten lum-

balen Fettkörper sowie die Gesamtfläche des Drüsenkörpers ein, wobei sowohl Einzel-

analysen der apikalen und distalen lumbalen Brustdrüse, als auch Daten des gesamten

lumbalen Fettkörpers analysiert wurden.

56

Abbildung 5.2 Repräsentative Whole-Mount Analysen der Brustdrüse der NP- und LP-Gruppe an d 21 und d 28.

5.2.1 Prozentualer Anteil dukto-alveolärer Struktur en am mam-mären Fettkörper der lumbalen Gesamtbrustdrüse

Die Bestimmung des prozentualen Anteils des Drüsengewebes am Fettgewebskörper

der lumbalen Brustdrüse [in der Folge als Flächenanteil bezeichnet] (Tabelle 5.2,

Abbildung 5.3), welcher am Anfang und am Ende der pubertären Brustdrüsenentwick-

lung (d 21, d 28) von dukto-alveolären Strukturen durchzogen wird, ergab keine signifi-

kanten Gruppenunterschiede zwischen der LP- und der NP-Gruppe. Zu Beginn der The-

larche waren etwa 57,5% der lumbalen Gesamtbrustdrüse von dukto-alveolären Struktu-

ren durchzogen. Dieser prozentuale Flächenanteil nahm bis d 28 signifikant zu, sodass

dann bereits etwa 71,5% des mammären Fettkörpers von Drüsengewebe ausgekleidet

waren. Der Flächenanteil in der apikalen und distalen Brustdrüse zeigte hierbei keinen

Unterschied zum verschmolzenen Gesamtorgan. Auch nach einer Normalisierung des

Flächenanteils über das Körpergewicht der Ratten zu den beiden Zeitpunkten wurden

keine Gruppenunterschiede deutlich.

Tabelle 5.2 Prozentualer Anteil dukto-alveolärer Strukturen am Fettkörper der lumbalen Brustdrüse; d 21, d 28. LP NP P-Wert

d 21 57,44 ± 2,64 (n = 13) 57,80 ± 2,07 (n = 18) ns Gesamtdrüse [%] d 28 71,45 ± 2,06 (n = 12) 71,67 ± 1,51 (n = 10) ns

d 21 55,48 ± 3,31 (n = 14) 56,31 ± 3,08 (n = 19) ns Apikaler Anteil [%] d 28 71,34 ± 2,75 (n = 13) 70,36 ± 1,96 (n = 11) ns

d 21 60,28 ± 2,66 (n = 13) 59,60 ± 1,83 (n = 18) ns Distaler Anteil [%] d 28 71,13 ± 2,32 (n = 12) 72,03 ± 2,24 (n = 14) ns

57

5.2.2 Ausdehnung dukto-alveolärer Strukturen im Fet tgewebs-körper

Bezüglich der Drüsen-Gesamtfläche (Tabelle 5.3, Abbildung 5.3) zeigte sich an d 21 für

die lumbale Gesamtdrüse kein signifikanter Unterschied zwischen den LP- und den

NP-Tieren; an d 28 hingegen lag die Gesamtfläche der LP-Gruppe signifikant unter der

NP-Gruppe (p = 0,02). Die apikale lumbale Brustdrüse bot einen signifikanten Unter-

schied der Gesamtfläche an d 21 und einen nur marginal signifikanten Unterschied mit

p = 0,06 an d 28. Für die distale lumbale Brustdrüse bestanden weder an d 21, noch an

d 28 signifikante Unterschiede in der Gesamtfläche.

Auch nach Gewichtsnormalisierung (hier nicht dargestellt) ergab sich für die lumbale

Gesamtdrüse nur ein signifikanter Unterschied zwischen den LP- und den NP-Tieren an

d 28, für die apikale Brustdrüse an d 21 und d 28 und für die distale Brustdrüse an d 21.

Die Werte der NP-Gruppe lagen bei den Auswertungen der lumbalen Gesamtdrüse

und der apikalen Brustdrüse an d 21 und d 28, sowie der distalen an d 28 sowohl vor als

auch nach Normalisierung auf das Körpergewicht jeweils über den Werten der

LP-Gruppe; lediglich an d 21 lagen für die distale Brustdrüse die LP-Werte über

NP-Werten.

Der Vergleich der Zunahme der Gesamtfläche des Drüsenkörpers der LP- und der

NP-Gruppe zwischen d 21 und d 28 ergab in keiner der drei Auswertungen signifikante

Unterschiede, wobei entsprechend der größeren Zielgröße der Zuwachs der NP-Gruppe

größer als derjenige der LP-Gruppe war.

Tabelle 5.3 Flächige Ausdehnung dukto-alveolärer Strukturen in der lumbalen Brustdrüse; d 21, d 28. LP NP P-Wert

d 21 22,32 ± 1,82 (n = 27) 26,98 ± 1,79 (n = 39) ns Gesamtdrüse [mm²] d 28 32,43 ± 2,65 (n = 25) 50,71 ± 5,72 (n = 25) p = 0,02

d 21 19,62 ± 2,27 (n = 14) 34,49 ± 2,57 (n = 19) p = 0,0007 Apikaler Anteil [mm²] d 28 29,29 ± 3,54 (n = 13) 50,36 ± 8,55 (n = 11) ns (p = 0,06)

d 21 25,23 ± 2,76 (n = 13) 20,35 ± 1,03 (n = 18) ns Distaler Anteil [mm²] d 28 35,84 ± 3,88 (n = 12) 50,99 ± 7,98 (n = 14) ns

58

Abbildung 5.3 Prozentualer Anteil dukto-alveolärer Strukturen und flächige Ausdehnung dukto-alveolärer Struktu-ren in der lumbalen Brustdrüse an d 21 und d 28; jeweils Gesamtbrustdrüse, apikale lumbale Brustdrüse, distale lumbale Brustdrüse.

5.3 Proliferationsrate über immunhistochemische Fär bung mittels PCNA-Antikörper

Zur Untersuchung der proliferativen Aktivität erfolgte die Auszählung der PCNA-

positiven Zellen innerhalb eines TEB. Dazu wurden die PCNA-positiven Zellen pro

umfahrener TEB-Fläche in µm² berechnet. Hierbei fand sich sowohl an d 21, als auch

an d 28 ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen, wobei die

59

NP-Tiere jeweils eine höhere proliferative Aktivität zeigten und deren Werte an d 21

um etwa 50%, an d 28 um etwa 96% über denen der LP-Tiere lagen (Abbildung 5.4,

Tabelle 5.4).

Abbildung 5.4 PCNA-positive Zellen pro TEB-Fläche (a) ohne Unterscheidung zwischen apikalem und distalem Anteil, (b) des apikalen Anteils und (c) des distalen Anteils jeweils an d 21 und d 28.

Tabelle 5.4 PCNA-positive Zellen pro TEB-Fläche ohne Unterscheidung zwischen apikalem und distalem Anteil, des apikalen Anteils und des distalen Anteils jeweils an d 21 und d 28.

LP NP P-Wert d 21 0,002929 ± 0,0004 (n = 23) 0,004392 ± 0,0003 (n = 27) p = 0,0008 PCNA Gesamt

[1/µm2] d 28 0,002718 ± 0,0002 (n = 70) 0,005340 ± 0,0004 (n = 47) p < 0,0001 d 21 0,002711 ± 0,0004 (n = 14) 0,004771 ± 0,0005 (n = 12) p = 0,008 PCNA apikal

[1/µm2] d 28 0,002941 ± 0,0003 (n = 29) 0,005120 ± 0,0005 (n = 28) p = 0,0003 d 21 0,003268 ± 0,0010 (n = 9) 0,004088 ± 0,0004 (n = 15) ns PCNA distal

[1/µm2] d 28 0,002561 ± 0,0003 (n = 41) 0,005663 ± 0,0006 (n = 19) p < 0,0001

5.4 Hepatische mRNA-Expressionsrate von IGF-1 und IGFBP-1 mittels RT-PCR

Durch die RT-PCR wurde die Expression von IGF-1 und IGFBP-1 in der Leber unter-

sucht (Abbildung 5.5, Tabelle 5.5). Als endogene Kontrolle dienten die house-keeping

Gene HPRT und r18S.

Die Auswertung erfolgte mittels ∆∆CT – Methode (61). Dabei werden die CT-Werte

der Zielgene auf diejenigen der house-keeping Gene normalisiert und anschließend die

Differenz zwischen der NP- und LP-Gruppe logarithmiert. Das Signifikanzniveau der

Gruppendifferenz bezieht sich auf die NP-Gruppe an d 21. Gewählt wurde die Darstel-

60

lung des Verhältnisses der Zielgene im Verhältnis zu r18S, zumal der Bezug der Ziel-

gene auf HPRT dem Verhältnis zu r18S entsprach.

Die gewichtsnormalisierten Daten sowohl von IGFBP-1 als auch von IGF-1 zeigten

signifikant erniedrigte Werte der LP-Gruppe gegenüber der NP-Gruppe an d 28.

Für IGFBP-1 lag die Expressionsrate in der Gruppe der LP-Tiere an d 28 um rund 3%

unter der NP-Gruppe. An d 21 zeigte sich kein signifikanter Unterschied.

Analog dazu war die Expressionsrate von IGF-1 in der LP-Gruppe an d 28 ebenso um

rund 3% gegenüber der NP-Gruppe erniedrigt, während an d 21 wiederum kein signifi-

kanter Unterschied zu beobachten war.

Das Verhältnis der Expressionsrate von IGF-1 zu IGFBP-1 zeigte mit p < 0,2 weder

in den Verlaufsdaten der Gruppen, noch im Gruppenvergleich signifikante Unterschie-

de.

Abbildung 5.5 Hepatische mRNA-Expression von (a) IGFBP-1, (b) IGF-1 und (c) dem Quotienten aus IGF-1 und IGFBP-1 an d 21 und d 28; Daten gewichtsnormalisiert; dargestellt ist die relative Induktion nach der ∆∆CT-Methode bezogen auf die NP-Gruppe an d 21; house-keeping Gen: r18S.

Tabelle 5.5 Über das Körpergewicht normalisierte hepatische mRNA-Expression von IGFBP-1 und IGF-1 an d 21 und d 28.

LP NP P-Wert d 21 0,99 ± 0,01 (n = 7) 1,0 ± 0,01 (n = 8) ns IGFBP-1 / KG

[relative Einheiten] d 28 0,97 ± 0,01 (n = 7) 1,0 ± 0,01 (n = 8) p = 0,03 d 21 0,98 ± 0,01 (n = 7) 1,0 ± 0,01 (n = 8) ns IGF-1 / KG

[relative Einheiten] d 28 0,97 ± 0,01 (n = 7) 1,0 ± 0,01 (n = 8) p = 0,009

61

5.5 Proteinexpressionsrate von IGF-1 im Serum mitte ls ELISA

Die Methode des ELISA diente der Untersuchung von Unterschieden zwischen der

LP- und der NP-Gruppe in den Konzentrationen des systemischen Gesamt-IGF-1 im

Serum an d 21 und d 28 (Abbildung 5.6, Tabelle 5.6).

Zunächst bestand an d 21 ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen

LP und NP. Auch im Verlauf von d 21 bis d 28 stiegen die Konzentrationen sowohl bei

den LP-Tieren (p < 0,0001), als auch bei den NP-Tieren (p < 0,0002) signifikant an. An

d 28 wiesen die Daten beider Gruppen LP und NP keinen signifikanten Unterschied auf.

Nach Normalisierung auf das Körpergewicht der Ratten jedoch stellten sich für beide

Gruppen zu beiden Zeitpunkten beinahe identische Serum-Spiegel heraus.

Abbildung 5.6 (a) Gesamt-IGF-1 im Serum an d 21 und d 28 und (b) auf das Körpergewicht normalisierte Daten.

Tabelle 5.6 Gesamt-IGF-1 im Serum und auf das Körpergewicht normalisiertes IGF-1 an d 21 und d 28. LP NP P-Wert

d 21 354,5 ± 14,39 (n = 15) 430,9 ± 23,99 (n = 17) p = 0,02 IGF-1 [ng/ml] d 28 579,5 ± 28,02 (n = 14) 686,4 ± 49,61 (n = 17) ns

d 21 7,6 ± 0,26 (n = 15) 7,7 ± 0,41 (n = 17) ns IGF-1 / KG [(ng/ml)/g] d 28 8,0 ± 0,28 (n = 14) 8,2 ± 0,42 (n = 17) ns

5.6 Steroidhormon-Profil mittels Tandem-Massenspektrometrie

Über die Methode der Tandem-MS wurde ein Steroidhormon-Profil aus dem Serum der

Ratten an d 21 und d 28 erstellt. Im messbaren Bereich lagen Progesteron, Corticoste-

ron [CS], Dehydrocorticosteron [DHCS], Deoxycorticosteron, Dehydroepiandro-

stendion-Sulfat [DHEAS] und Dehydroepiandrostendion [DHEA]. Unter der Nach-

weisgrenze lagen Estradiol, Testosteron, Androstendion und 17-OH-Progesteron.

Abbildung 5.7 zeigt eine Übersicht über die untersuchten Hormone. CS und DHCS der

62

Ratte entsprechen aktivem Cortisol (CS), bzw. inaktivem Cortison (DHCS) beim Men-

schen (Abbildung 5.8).

Abbildung 5.7 Schematische Darstellung der Steroidhormonsynthese in der Nebennierenrinde der Ratte. Rot um-rahmte Hormone wurden in vorliegender Studie untersucht.

Abbildung 5.8 Schematische Darstellung der Steroidhormonsynthese in der Nebennierenrinde des Menschen.

63

5.6.1 Mineralo- und Glucocorticoide

5.6.1.1 Corticosteron / Dehydrocorticosteron

Der Spiegel des aktiven CS der LP-Gruppe stieg von d 21 bis d 28 signifikant an

(p < 0,0001) (Abbildung 5.9, Tabelle 5.7). Auch bei der NP-Gruppe lag der Anstieg im

signifikanten Bereich (p = 0,0216). Zwischen der LP- und der NP-Gruppe bestanden

weder an d 21, noch an d 28 signifikante Unterschiede.

Analog zu den CS-Spiegeln stellten sich die Spiegel des inaktiven DHCS dar: Signi-

fikant erhöht waren sowohl die Spiegel der LP-Tiere (p = 0,0016) als auch die der

NP-Tiere (p < 0,0304) an d 28 im Vergleich zum Wert von d 21 derselben Gruppe.

Wiederum gab es jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Grup-

pen.

Bei der quantitativen Analyse des Verhältnisses von aktivem CS zu inaktivem DHCS

wiesen die LP-Tiere an d 28 einen signifikant erhöhten Anteil an CS im Vergleich zur

NP-Gruppe auf. Außerdem zeigte der Anteil an aktivem CS in der LP-Gruppe einen

signifikanten Anstieg von d 21 auf d 28 (p < 0,0001), was in der NP-Gruppe nicht beo-

bachtet werden konnte.

Abbildung 5.9 (a) Corticosteron, (b) Dehydrocorticosteron und (c) Verhältnis von Corticosteron zu Dehydrocorti-costeron im Serum an d 21 und d 28.

64

Tabelle 5.7 Corticosteron, Dehydrocorticosteron und Verhältnis von Corticosteron zu Dehydrocorticosteron im Serum an d 21 und d 28.

LP NP P-Wert d 21 169,4 ± 24,23 (n = 20) 189,0 ± 19,08 (n = 22) ns CS

[ng/ml] d 28 389,9 ± 26,99 (n = 19) 299,6 ± 32,45 (n = 24) ns d 21 11,7 ± 1,09 (n = 20) 11,2 ± 0,98 (n = 22) ns DHCS

[ng/ml] d 28 16,68 ± 0,89 (n = 19) 15,78 ± 1,53 (n = 24) ns d 21 13,27 ± 1,28 (n = 20) 16,90 ± 1,28 (n = 22) ns CS / DHCS d 28 23,99 ± 1,80 (n = 19) 18,25 ± 1,05 (n = 24) p = 0,01

5.6.1.2 Deoxycorticosteron

Deoxycorticosteron – ein Zwischenprodukt zwischen Progesteron und Corticosteron –

präsentierte an d 28 analog zu den Progesteron-Werten (vgl. Abbildung 5.11, Tabelle

5.9) ebenso signifikant höhere Spiegel bei den LP-Tieren als bei den NP-Tieren

(Abbildung 5.10, Tabelle 5.8). Außerdem zeigte sich hier in der LP-Gruppe ein signifi-

kanter Anstieg des Spiegels von d 21 auf d 28 (p = 0,0389). Der Spiegel in der

NP-Gruppe an d 28 lag um rund 16% unter dem NP-Wert von d 21.

Abbildung 5.10 Deoxycorticosteron im Serum an d 21 und d 28.

Tabelle 5.8 Deoxycorticosteron im Serum an d 21 und d 28. LP NP P-Wert

d 21 0,55 ± 0,14 (n = 20) 0,55 ± 0,11 (n = 22) ns Deoxycorticosteron [ng/ml] d 28 0,77 ± 0,09 (n = 19) 0,46 ± 0,07 (n = 24) p = 0,01

5.6.2 Sexualhormone

5.6.2.1 Progesteron

Die Progesteron-Messung zeigte weder in der LP-, noch in der NP-Gruppe einen signi-

fikanten Anstieg von d 21 auf d 28 (Abbildung 5.11, Tabelle 5.9). An d 28 jedoch war

der Progesteron-Spiegel der LP-Gruppe gegenüber der NP-Gruppe signifikant erhöht

(p = 0,0023). Körpergewicht und -länge hatten keinen Einfluss auf den Serum-

Progesteron-Spiegel (Daten nicht gezeigt).

65

Abbildung 5.11 Progesteron im Serum an d 21 und d 28.

Tabelle 5.9 Progesteron im Serum an d 21 und d 28. LP NP P-Wert

d 21 2,22 ± 0,68 (n = 20) 1,49 ± 0,22 (n = 22) ns Progesteron [ng/ml] d 28 2,45 ± 0,27 (n = 19) 1,33 ± 0,31 (n = 24) p = 0,002

5.6.2.2 Dehydroepiandrosteron / Dehydroepiandroster on-Sulfat

Die DHEA- und DHEAS-Spiegel lagen nur knapp über der Serum-Nachweisgrenze.

Die gemessenen Werte wiesen starke Schwankungen auf (DHEAmin: 0,001 ng/ml,

DHEAmax: 4,82 ng/ml; DHEASmin: 0,001 ng/ml, DHEASmax: 19,40 ng/ml).

Während für DHEA an d 21 kein signifikanter Unterschied zwischen der LP- und der

NP-Gruppe beobachtet werden konnte, lag der Spiegel der LP-Gruppe an d 28 signifi-

kant (p = 0,0295) über demjenigen der NP-Gruppe (Abbildung 5.12, Tabelle 5.10). Im

Verlauf von d 21 auf d 28 zeigte sich eine signifikante Abnahme sowohl in der

LP- (p = 0,0025), als auch in der NP-Gruppe (p = 0,0017).

Bei der Messung von DHEAS ergaben sich hingegen keinerlei signifikante Gruppen-

unterschiede.

Abbildung 5.12 (a) DHEA, (b) DHEAS im Serum an d 21 und d 28.

Tabelle 5.10 DHEA, DHEAS im Serum an d 21 und d 28. LP NP P-Wert

d 21 1,69 ± 0,17 (n = 20) 1,40 ± 0,24 (n = 22) ns DHEA [ng/ml] d 28 1,00 ± 0,21 (n = 19) 0,54 ± 0,11 (n = 24) p = 0,03

d 21 1,99 ± 0,48 (n = 20) 3,34 ± 1,27 (n = 22) ns DHEAS [ng/ml] d 28 1,29 ± 0,52 (n = 19) 1,31 ± 0,48 (n = 24) ns

66

5.7 Analyse veränderter Genexpressionsraten der Mam ma mittels Gene-Array

Mittels Agilent SurePrint G3 Rat GE 8x60K Microarray wurde das mammäre Expressi-

onsprofil der weiblichen Ratten dargestellt. Verglichen wurden hierbei drei Tiere der

LP-Gruppe mit drei Tieren der NP-Gruppe aus jeweils unterschiedlichen Würfen an

d 21 und d 28.

Der verwendete Gene-Array-Datensatz wurde von der IPA-Software den Datensätzen

der IPKB-Datenbank zugeordnet. Die vollständigen Ergebnisse des Gene-Array sind

unter der NCBI GEO Zugangsnummer GSE34136 zu finden (vgl. Kapitel 4.8).

Bei der Analyse der „functional pathways“ fand sich eine zentrale Rolle der MAP-

Kinase ERK [MAP = mitogen aktiviertes Protein, ERK = extrazellulär regulierte Kina-

se], IRS-1 [= Insulin-Rezeptor-Substrat-1], β-Estradiol und von ErbB2 [= epidermaler

Wachstumsfaktor-Rezeptor 2] (Abbildung 5.13, Abbildung 5.14).

Unter den Top 10 der regulierten Gene fanden sich an d 21 unter den induzierten Ge-

nen 60%, zu denen physiologische mammäre Prozesse in der Literatur beschrieben sind,

unter den Genen mit reduzierter Expressionsrate 20%. An d 28 war bei den induzierten

Genen für 30% eine funktionelle Assoziation mit Prozessen der Brustdrüse beschrieben

worden, bei den Genen mit reduzierter Expression für 50%.

67

Abbildung 5.13 LP d 21. (a) Signalnetzwerk 1: „Carbohydrate Metabolism, Drug Metabolism, Small Molecule Biochemistry“. (b) Signalnetzwerk 2: “Cancer, Reproductive System Disease, Cell-To-Cell Signaling and Interac-tion”. Legende: Rot: gegenüber NP induzierte Zielgene, Grün: gegenüber NP reduzierte Zielgene, --- indirekter Zu-sammenhang, ___ direkter Zusammenhang, * mehrfach im Gene-Array vertreten, ! hoch-signifikant reguliert.

68

Abbildung 5.14 LP d 28. (a) Signalnetzwerk 1: „Cell Cycle, Connective Tissue Development and Function, Skeletal and Muscular Disorders“. (b) Signalnetzwerk 2: „Cellular Function and Maintenance, Cell Signaling, Molecular Transport“. Legende: Rot: gegenüber NP induziert Zielgene, Grün: gegenüber NP reduziert Zielgene, --- indirekter Zusammenhang, ___ direkter Zusammenhang, * mehrfach im Gene-Array vertreten, ! hoch-signifikant reguliert.

69

6 Diskussion Die intrauterine Wachstumsrestriktion steht aktuell im Fokus perinataler Forschung, da

betroffene Kinder neben einer erhöhten perinatalen Morbidität außerdem ein erhöhtes

Risiko für die Entwicklung von Krankheiten im Laufe ihres Lebens aufweisen (vgl. Ka-

pitel 2.2.1, 2.2.2). Die Ätiologie der intrauterinen Wachstumsrestriktion ist ein multifak-

torielles Geschehen (maternale, plazentare, fetale und Umwelt-Einflüsse). Im humanen

Modell lassen sich zwei ursächliche Entitäten im Rahmen von Studien isoliert objekti-

vieren: Plazentare Minderperfusion und maternale Mangelernährung.

Die durch diese Einflussfaktoren herbeigeführte plazentare Insuffizienz lässt sich im

Tiermodell effektiv abbilden:

Für die plazentare Minderperfusion werden arterielle Ligaturmodelle (19,22,44,140)

verwendet, zur Herbeiführung diätetischer Effekte in der Schwangerschaft sind es Nah-

rungsreduktions-, bzw. gezielte Mangelernährungsmodelle, wie zum Beispiel das der

Proteinrestriktion (27,26,87).

6.1 Auxiologische Daten

Bereits mehrere Studien zu intrauteriner Wachstumsrestriktion sowohl durch plazentare

Minderperfusion, als auch durch Proteinmangelernährung am Modell der Ratte verdeut-

lichen, dass plazentare Insuffizienz während der Schwangerschaft Größe und Gewicht

der Nachkommen negativ beeinflusst.

In unserem Modell der intrauterinen Proteinmangelernährung der weiblichen Ratte

(vgl. Kapitel 4.2) zeigten sich für Körpergewicht, Körperlänge und Schwanzlänge der

LP-Tiere am Tag der Geburt signifikant verringerte Messwerte gegenüber der Kontroll-

gruppe (vgl. Kapitel 5.1).

Reduzierte auxiologische Daten nach intrauteriner Proteinrestriktion finden sich auch in

anderen Untersuchungen, beispielsweise bei Östreicher et al. (87) am Modell der männ-

lichen Ratte oder bei Fernandez-Twinn et al. (26) am Modell der weiblichen Ratte in

ähnlicher Weise: die Tiere kamen mit reduziertem Geburtsgewicht und reduzierter Kör-

perlänge im Vergleich zur Kontrollgruppe zur Welt. Bei Östreicher et al. (87) blieben

die IUGR-Tiere während der Laktation im Gewicht zurück, bis zu d 70 jedoch wurde

ein langsames Angleichen der beiden Gruppen festgestellt. Bei weiblichen Ratten blieb

70

laut Fernandez-Twinn et al. (26) die Differenz bezüglich des Körpergewichts hingegen

zu allen Messzeitpunkten bestehen.

Nüsken et al. (81) stellten sowohl nach einer durch Proteinmangelernährung, als auch

durch Ligatur der Arteria uterina bedingten IUGR ein vermindertes Gewicht am Tag der

Geburt bei männlichen wie weiblichen Ratten fest. Hier liegen allerdings keine Ver-

laufsdaten vor.

Im Ligatur-Modell (19,22,44,140) bleibt das Körpergewicht nach IUGR gegenüber

der Sham- und der Kontrollgruppe postnatal reduziert, wobei sich bei Houdijk et al. (44)

die Entwicklung der Körperlänge weiblicher Ratten bis d 57, die Schwanzlänge bereits

bis zum Abstillen an d 21 angleicht.

Mit Hilfe des Mangelernährungsmodells der Ratte konnten bereits wichtige kausale

Aspekte hinsichtlich der Entwicklung eines metabolischen Phänotyps post-IUGR ge-

klärt werden (26,81,93) (vgl. Kapitel 2.2.1). Unsere Studie entschied sich daher gezielt

für dieses Modell zur Erforschung des Einflusses von IUGR auf die duktale Morphoge-

nese der Brustdrüse der Ratte in der Pubertät – dies auch vor dem Hintergrund, dass

sich in humanen Kohorten intrauteriner Hypo-, bzw. Hyperalimentation postnatal eine

J-förmige Assoziation mit erhöhtem Brustkrebsrisiko gezeigt hat (58,76,88,118). Aller-

dings scheint nach Painter et al. (88) weniger das erniedrigte Geburtsgewicht, als viel-

mehr das Auftreten einer Mangelernährung während einer sensiblen Phase in utero aus-

schlaggebend zu sein für ein erhöhtes Brustkrebsrisiko.

Im Einklang mit den Daten aus oben genannten Studien lagen auch in unserem protein-

restriktiven Modell der weiblichen Ratte Körpergewicht, Körperlänge und Schwanzlän-

ge der LP-Tiere am Tag der Geburt deutlich unter den jeweiligen Werten der NP-Tiere.

Dabei erfolgte bei der Körperlänge bis zu d 28 ein langsames Angleichen, Gewicht und

Schwanzlänge der LP-Tiere hingegen blieben auch im Verlauf kontinuierlich unterhalb

der NP-Gruppe zurück.

In Zusammenschau mit den oben genannten Studien gehen wir daher von einer suffi-

zienten plazentaren Mangelversorgung in unserem IUGR-Modell aus.

Die Erhebung auxiologischer Langzeitdaten über die vierte Lebenswoche hinaus

bleibt Folgeexperimenten vorbehalten.

Im Weiteren wird wiederholt Bezug auf die ermittelten Folgen der Proteinrestriktion im

Modell der Ratte von Fernandez-Twinn et al. (27,26) genommen, weshalb an dieser

Stelle kurz die Unterschiede zwischen den beiden Modelle aufgezeigt werden sollen:

71

Während die Tiere bei Fernandez-Twinn et al. in Schwangerschaft und Laktation Fut-

ter ad libitum erhielten (proteinrestriktive Mangelernährung bis zum Ende der Laktation

an d 21), war die Proteinmangeldiät in unserem Modell in der Schwangerschaft auf

25 g/d limitiert und wurde direkt nach der Geburt auf eine Normaldiät ad libitum umge-

stellt. Fernandez-Twinn et al. führten außerdem eine Wurfreduktion auf 8 Tiere durch,

während in unserem Modell der Wurf auf 6 Jungtiere reduziert wurde. Erläuternd sei

außerdem hinzugefügt, dass die von Fernandez-Twinn et al. als inguinal bezeichneten

Brustdrüsen, die aus der vierten und fünften Brustdrüse bestehen, der von uns analysier-

ten apikalen (vierten) und distalen (fünften) lumbalen Brustdrüse entsprechen. Zweite

und dritte Brustdrüse werden als thorakal bezeichnet und liegen somit proximal der von

uns untersuchten Drüsen.

6.2 Histologische Analysen der Mamma

Wir entschieden uns in der hier vorliegenden Studie für die Analyse der Brustdrüse der

Spezies der Ratte, da diese aufgrund ihres dukto-alveolären Aufbaus ultrastrukturell der

humanen Brustdrüse ähnelt (59,111,113) (vgl. Kapitel 2.1.1). Der Aufbau der Brustdrü-

se der Maus hingegen ist rein duktal und somit weniger mit dem humanen vergleichbar.

Eine Analyse pathophysiologischer Veränderungen während der pubertären Morphoge-

nese der Brustdrüse der Ratte könnte daher Aufschluss über mögliche Dysregulationen

der humanen Brustdrüsenentwicklung nach IUGR geben. Außerdem konnten durch die

Untersuchungen an der Spezies der Ratte im Vergleich zur Maus in unserer Studie die

Anzahl partizipierender Tiere minimiert werden, da die Maus zu den untersuchten Zeit-

punkten deutlich kleiner als die Ratte ist und somit für die gewünschten Organentnah-

men und Gewebeuntersuchungen mehr Material und daher eine größere Anzahl an Tie-

ren nötig gewesen wäre.

Die Anatomie der Brustdrüse ist von besonderem Interesse, da ihre strukturelle Ent-

wicklung während der Pubertät direkt Rückschlüsse auf auto-, para-, und endokrine

Regelkreise geben kann (vgl. Kapitel 2.1.3), welche darüber hinaus auch in der Senolo-

gie von großer Bedeutung sind.

In unseren Untersuchungen zeigte sich zu keinem Zeitpunkt eine Differenz in der Dich-

te der dukto-alveolären Strukturen. Die Fläche der dukto-alveolären Strukturen war hin-

gegen in der LP-Gruppe an d 28 signifikant geringer als in der NP-Gruppe (vgl. Kapi-

tel 5.2). Die proliferative Aktivität lag in der LP-Gruppe zu beiden Zeitpunkten deutlich

unter der der NP-Gruppe (vgl. Kapitel 5.3).

72

Die Pubertät ist eine hoch proliferative Phase und stellt aufgrund der vorausgehenden

Ruhephase (124) zwischen Geburt und Eintritt in die Pubertät den ersten Zeitraum nach

der intrauterinen Phase dar, in dem sich Veränderungen im Gewebe der Brustdrüse ma-

nifestieren können. Möglicherweise kommen also, im Sinne einer multifaktoriellen Tu-

morgenese, ab der Pubertät das gesamte Organ betreffende Dysregulationen zum Aus-

druck – so beispielsweise eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber NMU (26) – , deren

Grundstein bereits präpubertär durch eine erste Veränderung gelegt wurde, die jedoch

mangels Proliferation vor dem Eintritt in die Pubertät keine Möglichkeit zur Manifesta-

tion hatten. Die Theorie der multifaktoriellen Tumorgenese wurde unter anderem 1953

von Nordling et al. (79) in Betracht gezogen und 1971 von Knudson et al. (66) ergänzt.

Sie geht davon aus, dass die Entstehung von Tumoren durch das Aufeinanderfolgen von

mehreren, das heißt mindestens zwei genetischen Veränderungen zustande kommt, wo-

bei durch eine erste Veränderung die Suszeptibilität gegenüber späteren Faktoren erhöht

werden kann. Auch in unserem Modell der intrauterinen Mangelernährung wurde be-

reits in früheren Untersuchungen Krankheitsentstehung, besonders auf renaler Ebene,

durch multifaktorielle Genese gezeigt (78,96).

In vorliegender Studie wurden unter Anderem mikroskopische Unterschiede zwi-

schen der LP- und der NP-Gruppe zu Beginn und Ende der Pubertät analysiert, die

Hinweise auf eine bereits in utero angelegte fetale Programmierung geben könnten,

welche sich aufgrund der präpubertären Ruhephase jedoch erst in der proliferativen

Phase der Pubertät manifestieren und möglicherweise eine spätere Tumorgenese be-

günstigen könnte.

Wir führten eine Whole-Mount Analyse, sowie eine immunhistochemische Analyse der

Proliferationsrate der Brustdrüse mittels PCNA durch, um mögliche Gruppenunter-

schiede im Entwicklungsgrad an d 21 und d 28 (119) zu identifizieren.

Dabei zeigte sich in der Whole-Mount Analyse zu beiden Zeitpunkten auch nach

Gewichtsnormalisierung kein Gruppenunterschied in der Dichte der dukto-alveolären

Strukturen. Dementsprechend ergab sich auch in der Zunahme der Dichte bis zu d 28

kein Gruppenunterschied.

Die von dukto-alveolären Strukturen eingenommene Fläche war hingegen in der

NP-Gruppe besonders an d 28 deutlich größer als in der LP-Gruppe. Die Differenz zur

LP-Gruppe zeigte sich im Wesentlichen in der apikalen lumbalen Drüse. Das Gewicht

der Tiere hatte dabei – wie auch bei der Dichte der dukto-alveolären Strukturen – keinen

Einfluss. An d 21 bestand bei der apikalen lumbalen Drüse eine deutliche Größendiffe-

73

renz zwischen den LP- und den NP-Tieren (LP < NP), während bei der distalen Drüse

die Fläche bei LP sogar etwas größer als bei NP war und keinen signifikanten Zuwachs

mehr bis d 28 zeigte.

Zusammenfassend war in der Gruppe der LP-Tiere somit die Entwicklung des apika-

len lumbalen Drüsenkörpers ausschlaggebend für den Flächenzuwachs der lumbalen

Gesamtdrüse, bei NP hingegen die Entwicklung des distalen Drüsenkörpers. Während

sich die Dichte der dukto-alveolären Strukturen in beiden Gruppen an d 21 und d 28

nicht signifikant unterschied, war die von diesen Strukturen eingenommene Fläche des

mammären Fettgewebskörpers in der LP-Gruppe an d 28 signifikant erniedrigt, wobei

sich in der apikalen Drüse ein relativ größerer, jedoch nur marginal signifikanter Unter-

schied zeigte, als in der distalen, in der an d 28 kein signifikanter Unterschied mehr zu

sehen war.

Die PCNA-Färbung veranschaulichte – die Ergebnisse der Whole-Mount Analyse bes-

tätigend – die signifikant gesteigerte proliferative Aktivität der NP-Gruppe (gegenüber

LP um die Hälfte erhöhte PCNA-Positivität an d 21, etwa doppelt erhöhte Positivität an

d 28). Dabei zeigte sich analog zur in der apikalen lumbalen Brustdrüse verminderten

Ausdehnung dukto-alveolärer Strukturen im Fettgewebskörper der LP-Tiere (vgl. Kapi-

tel 5.2.2) auch in der PCNA-Analyse der apikalen Brustdrüse zu beiden Zeitpunkten

eine signifikant verminderte Proliferationsrate pro TEB, während in der distalen Brust-

drüse zwar an d 28 ebenso ein signifikanter Unterschied bestand, an d 21 jedoch kein

Unterschied in der Proliferationsrate beobachtet werden konnte.

In einem eingangs erwähnten ähnlichen Modell intrauteriner Mangelernährung konnten

Fernandez-Twinn et al. (27,26) ein Aufholwachstum der Brustdrüse von d 21 bis d 28

beobachten, sodass im Alter von vier Wochen kein Unterschied mehr in der Whole-

Mount Analyse der jungen Ratten sichtbar war. Die Proliferationsrate der TEB wurde

von Fernandez-Twinn et al. nicht untersucht. Jedoch wiesen die LP-Tiere in den mam-

mären Epithelzellen eine erhöhte Proteinexpression des IGF-1-Rezeptors, des Insulin-

Rezeptors, sowie des Östrogen-Rezeptor-α, -β und des ErbB2-Rezeptors auf (26). Diese

Veränderung der lokalen Suszeptibilität gegenüber proliferativen Faktoren wurde in der

Studie von Fernandez-Twinn et al. als ursächlich für das Aufholwachstum des Brust-

drüsenkörpers und damit auch für das erhöhte Brustkrebsrisiko nach Behandlung mit

dem karzinogenen NMU diskutiert. Dass es bei Fernandez-Twinn et al. zu einem Auf-

holwachstum kam, während die beiden Gruppen sich in unserer Studie lediglich lang-

74

sam anglichen, könnte in den bestehenden Unterschieden im Ernährungsmodell begrün-

det liegen.

Im Folgenden soll die Whole-Mount Analyse unserer Studie noch einmal detailliert der

Studie von Fernandez-Twinn et al. (26) gegenübergestellt werden:

Nach unseren Ergebnissen der Whole-Mount Analyse zeigte in der LP-Gruppe die

apikale Drüse zwar den größeren Flächenzuwachs von d 21 zu d 28; dennoch blieb sie

an d 28 ausschlaggebend für den Rückstand gegenüber der NP-Gruppe bezüglich der

Größe der von Brustdrüsengewebe eingenommenen Fläche. Dieser Rückstand bestand

bei uns im Gegensatz zur Studie von Fernandez-Twinn et al. bis zu d 28 fort. Da der

größere Flächenzuwachs in der apikalen Drüse festgestellt wurde, wären unsere Ergeb-

nisse allerdings weiter zu verifizieren; zu beweisen wäre dabei, dass trotz des größeren

Zuwachses von d 21 bis d 28 in der apikalen Drüse der an d 28 bestehende signifikante

Unterschied in der von dukto-alveolärem Gewebe eingenommenen Fläche vorrangig

durch die kleiner bleibende apikale Drüse bedingt ist. Um dieser Hypothese gerecht zu

werden, müsste man wiederum voraussetzen, dass die apikale Brustdrüse bereits bei

Geburt deutlich kleiner angelegt ist und somit im Verlauf trotz stärkeren Zuwachses

dennoch kleiner als distaler gelegene Drüsen bleibt. Des Weiteren wäre zu erörtern,

durch welche lokalen oder systemischen Vorgänge das proximal verstärkte Wachstum

innerhalb der LP-Gruppe bedingt ist. Wir konnten bisher nur aufzeigen, dass die über

die PCNA-Färbung dargestellte proliferative Aktivität in der LP-Gruppe insgesamt klei-

ner als in der NP-Gruppe war.

In Analogie zu unseren Ergebnissen beschreiben auch Fernandez-Twinn et al. (26),

dass die proximal gelegenen Drüsen an d 21 wie an d 28 ausschlaggebend für den Flä-

chenunterschied sind, während bei den distaler gelegenen Drüsen an d 21 noch ein sig-

nifikanter Unterschied zu sehen war, der jedoch bis d 28 verschwand. Ab dem Alter von

fünf Wochen war kein Unterschied mehr zwischen den Gruppen ersichtlich.

Anhand dieser beiden Untersuchungen könnte man also in der LP-Gruppe einen

Trend hinsichtlich der Fläche des Brustdrüsengewebes beobachten: Je weiter proximal

die Lage der Drüsen, umso mehr Flächendifferenz bleibt mit zunehmendem Alter im

Vergleich zur NP-Gruppe bestehen. Bei den distaler gelegenen Drüsen hingegen scheint

von Anfang an ein geringer ausgeprägter Unterschied zu bestehen. Somit könnte man in

der Zusammenschau der Ergebnisse von Fernandez-Twinn et al. (26) und unserer Er-

gebnisse vermuten, dass sich eine fetale Programmierung in höherem Maße auf die pro-

ximal gelegenen Brustdrüsenabschnitte auswirkt, als auf die distalen. In der distalen

75

Brustdrüse war weder der Zuwachs von d 21 bis d 28 in der LP-Gruppe signifikant,

noch konnte – zu keinem der beiden Zeitpunkte – ein signifikanter Gruppenunterschied

beobachtet werden; hingegen zeigte sich in beiden Studien die proximale Drüse als aus-

schlaggebend.

Möglicherweise wären also weiter proximal gelegene, als die von uns untersuchte

vierte und fünfte Brustdrüse zukünftig geeigneter, um Auswirkungen von IUGR auf die

Entwicklung der Mamma zu erforschen. Um diese Hypothese zu erhärten bedarf es al-

lerdings zunächst weiterer detaillierter Untersuchungen. Nachdem sich bei Fernandez-

Twinn et al. zwar bei der Whole-Mount Analyse die Gruppenunterschiede deutlicher in

der thorakalen Brustdrüse zeigten, auf Proteinebene jedoch auch Unterschiede in der

inguinalen (entspricht der von uns untersuchten apikalen und distalen lumbalen Brust-

drüse) zu finden waren (im Alter von fünf Wochen in der LP-Gruppe Überexpression

des IGF-1-Rezeptors, Insulin-Rezeptors, Östrogen-Rezeptor-α, -β sowie ErbB2-

Rezeptors (26)), scheint unsere Analyse der apikalen und distalen lumbalen Brustdrüse

durchaus berechtigt.

Die Ursache für das beobachtete ausbleibende Aufholwachstum des Brustdrüsengewe-

bes in unserem Modell im Vergleich zur Studie von Fernandez-Twinn et al. (26) scheint

im unterschiedlichen Versuchsaufbau des Tiermodells begründet zu sein:

Während wir unsere Ratten nur einem intrauterinen Proteinmangel unterzogen, weite-

ten Fernandez-Twinn et al. diese Hypoalimentation postpartal bis zum Abstillen an d 21

aus. Die bisherige Lehrmeinung geht davon aus, dass die Brustdrüsenanlage intrauterin

entsteht und bis zur Pubertät, beginnend an d 21, in einem Ruhestadium verweilt (124).

Die Tatsache, dass sich das Ernährungsregime unseres Modells lediglich durch den

Zeitraum der postnatalen präpubertären Phase von dem bei Fernandez-Twinn et al.

durchgeführten Modell unterscheidet und unsere Brustdrüsenanalytik im Gegensatz zur

Studie von Fernandez-Twinn et al. kein Aufholwachstum ab d 21 zeigt, lässt vermuten,

dass der postnatalen präpubertären Phase mehr Bedeutung für den Ablauf der pubertä-

ren Brustdrüsenentwicklung zukommt, als bislang angenommen. Außerdem könnte der

postnatale präpubertäre Effekt der Hypoalimentation bei Fernandez-Twinn et al. (26)

verstärkt ins Gewicht fallen, da diese ihre Würfe postpartal auf 8 Tiere, wir hingegen

auf 6 reduzierten.

Interessanter Weise konnten Sloboda et al (122) in einem 50 % Mangelernährungs-

modell (kein reiner Proteinmangel) der weiblichen Ratte zeigen, dass das Timing der

Pubertät fast ausschließlich vom Ernährungsstatus in utero und während der Laktations-

76

phase abhängt. Eine konsekutive hyperkalorische Diät ab dem Zeitpunkt des Abstillens

an d 21 beschleunigte zwar den Pubertätseintritt, jedoch in viel geringerem Maße als die

Hypoalimentation in utero. Da die duktale Morphogenese der Brustdrüse durch Sloboda

et al. (122) nicht im Einzelnen untersucht wurde, lässt sich der postpartale Einfluss einer

persistierenden Mangelernährung auf das Timing der Brustdrüsenentwicklung nur ver-

muten.

In unserem Modell der weiblichen Ratte wurde gezielt auf eine Fortsetzung der

postpartalen Mangelernährung verzichtet, um dem humanen Modell näher zu kommen,

da bei post-IUGR Kindern üblicherweise eine ausreichende Gewichtsentwicklung durch

normo- bis hochkalorische Kost angestrebt wird. Es wurden in anderen Untersuchungen

an unserem Mangelernährungsmodell auch bereits zufriedenstellende Daten, besonders

bezüglich der Entstehung renaler Erkrankungen, erhoben (96,95), was den Aufbau unse-

res Modells rechtfertigt und dessen Effektivität bestätigt.

Zur weiteren Ermittlung postpartaler Einflüsse auf die Brustdrüsenentwicklung erwei-

terten Fernandez-Twinn et al. ihr Modell um eine Gruppe mit hochkalorischer Diät (27):

Hierbei blieb die Mangelernährung bis zum Abstillen für alle Tiere bestehen; ab dem

Alter von sieben Wochen, also postpubertär, bis zum Ende der Studie (Alter von

16 Wochen) erhielten jedoch die Hälfte der LP-, sowie die Hälfte der Kontrollgruppe

eine hochkalorische Diät. Das Ergebnis zeigte unabhängig von der Zugehörigkeit zu

LP- oder Kontrollgruppe einen vermehrten Gewichtszuwachs durch die hochkalorische

Diät. Die ehemals der LP-Gruppe zugehörigen Tiere blieben trotz des vermehrten post-

pubertären Wachstums unter hochkalorischer Diät bezogen auf das Körpergewicht hin-

ter der Kontrollgruppe zurück. In beiden Gruppen waren auch die Nüchtern-Serum-

Spiegel von Glucose, sowie von Insulin als Folge der hochkalorischen Diät erhöht. Da

Hyperinsulinämie ein Faktor ist, der das Brustkrebsrisiko erhöhen kann (27), könnte

sich die hochkalorische Diät besonders auf die ehemalige LP-Gruppe auswirken, da

diese zusätzlich zu erhöhtem Serum-Insulin noch eine erhöhte Expression des Insulin-

Rezeptors aufwies (26). Dies konnte bestätigt werden, da die höchste Brustkrebsinzi-

denz nach Induktion mit NMU bei der LP-Gruppe nach einer zusätzlichen postpubertä-

ren hochkalorischen Diät lag. Auch in der NP-Gruppe wurde nach postpubertärer hoch-

kalorischer Diät im Vergleich zu postpubertärer Normaldiät vermehrt Brustkrebs beo-

bachtet, das Risiko war jedoch signifikant niedriger als in der LP-Gruppe. Insgesamt

vermuten Fernandez-Twinn et al. somit einen von der intrauterinen Ernährung zwar

77

unabhängigen, jedoch additiven Effekt dieser postpubertären Diät auf das Brustkrebsri-

siko (27).

Da nach den obigen Untersuchungen von Fernandez-Twinn et al. (27) eine postpuber-

täre hyperkalorische Diät additiv, jedoch von den intrauterinen Gegebenheiten unab-

hängig das Brustkrebsrisiko steigern konnte, wäre in Folgestudien auch in unserem Mo-

dell eine Langzeitbeobachtung der Ratten postpubertär anzudenken.

Die Whole-Mount Analyse gibt indirekt Aufschluss über an der pubertären Entwicklung

beteiligte Hormonsysteme, welche in der Folge beschrieben werden. Auch das Ausmaß

des tertiären side-branching (vgl. Kapitel 2.1.3.1) wird gerne verwendet, um auf hormo-

nelle Einflüsse rückzuschließen. Es kann beispielsweise Hinweise auf die Progesteron-

Konzentration geben. Progesteron verstärkt die Wirkung von IGF-1 auf die pubertäre

Brustdrüsenentwicklung und gilt als ein Hormon, welches in der adulten Brustdrüse

essentiell benötigt wird für tertiäres side-branching und für die Entwicklung zur laktie-

renden Mamma (123). Eine Untersuchung des branching ist Bestandteil von Folge-

Analysen.

6.3 Analyse systemischer Hormonveränderungen

Die HPO-Achse stellt einen wichtigen Teil der an der somatischen Entwicklung wäh-

rend der Pubertät beteiligten hormonellen Einflussfaktoren (Östrogen, Progesteron) dar.

Aufgrund der zentralen Rolle der GH-IGF-1-Achse für die pubertäre Entwicklung

(vgl. Kapitel 2.1.3) liegt es zudem nahe, dass besonders Veränderungen auch dieser

Achse ursächlich an pathologisch veränderter Brustdrüsenentwicklung beteiligt sein und

möglicherweise sogar eine Entartung des Gewebes begünstigen könnten. In vorliegen-

der Studie wurden daher relevante Hormone beider Achsen anhand verschiedener Mess-

methoden in der Leber (RT-PCR: IGF-1, IGFBP-1) und im Serum (ELISA: IGF-1; Tan-

dem-MS: Steroidhormon-Profil) analysiert und die Ergebnisse beider Gruppen einander

gegenübergestellt.

6.3.1 GH-IGF-1-Achse In unserer Studie wurden Untersuchungen an einem wachstumsrestriktiven Mangeler-

nährungsmodell der Ratte durchgeführt. Dabei erfolgte als Teil der Charakterisierung

der somatischen Entwicklung der Ratten einerseits die Darstellung der hepatischen

mRNA-Expressionsrate von IGF-1 und IGFBP-1 in der Leber der Ratten, wozu über die

78

Methode der RT-PCR Messungen an d 21 und d 28 durchgeführt wurden (vgl. Kapi-

tel 6.3.1.1). Andererseits betrachteten wir mittels ELISA die Menge an systemisch zir-

kulierendem IGF-1-Protein im Serum (vgl. Kapitel 6.3.1.2).

Bezogen auf das Körpergewicht zeigten sich weder im Verhältnis der mRNA-

Expression von IGF-1 und IGFBP-1 (vgl. Kapitel 5.4), noch für die Proteinexpression

von IGF-1 Unterschiede zwischen der LP- und der NP-Gruppe (vgl. Kapitel 5.5).

Es ist bekannt, dass die GH-IGF-1-Achse in der normalen fetalen und postnatalen Ent-

wicklung als essentieller hormoneller Regelkreis gilt und IGF-1 als Proliferationsfaktor

somit eine wichtige Determinante von somatischem Wachstum ist (18). So ist auch das

Gewebe der Brustdrüse nicht nur suszeptibel gegenüber IGF-1, sondern IGF-1 stellte

sich vielmehr als essentielles Hormon in der normalen Entwicklung der Mamma heraus

(62,107) (vgl. Kapitel 2.1.3).

Als wichtiger Wachstumsfaktor wird IGF-1 in zahlreichen Geweben synthetisiert,

bedingt besonders Knochen- und Organwachstum und unterliegt der Regulation des

hypophysären GH. Im Blut zirkulierendes IGF-1 stammt aus der Leber. Der IGF-1-

Serum-Spiegel dürfte, den Ergebnissen mehrerer Studien nach, positiv mit dem Körper-

gewicht korrelieren (12,24). Veränderungen an dieser Hormonachse können zahlreiche

Störungen in der Entwicklung bedingen (33).

Im Plasma liegt IGF-1 an Proteine gebunden vor, den sogenannten IGFBP. Sie fungie-

ren als Transportproteine, modulieren die Funktion des IGF, erhöhen seine Halbwert-

zeit, können aber auch direkte Effekte entfalten (48), wie beispielsweise – gegenteilig

zu IGF selbst – einen Wachstumsarrest von Tumorzellen der Brust (84,85). Nachdem

die IGFBP als Faktoren gelten, welche die IGF-Funktion modulieren, hat das Verhältnis

von IGF-1 zu IGFBP-1 Auswirkungen auf die Entwicklung. Über die Messung der

IGFBP können demnach Rückschlüsse auf die Bioverfügbarkeit von IGF-1 gezogen

werden.

Seine Wirkung entfaltet IGF-1 über Bindung an den transmembranen IGF-1-Rezeptor

[IGF-1-R]. Eine Bindung führt zu Proliferation, sowie zur Protektion der Zellen vor

Apoptose. Starke Überexpression des IGF-1-R in Zellkulturen begünstigt maligne Zell-

transformationen; umgekehrt können maligne transformierte Zellen durch eine vermin-

derte IGF-1-R-Dichte in den programmierten Zelltod übergehen (2). Bei mehreren Tu-

mortypen – darunter auch Brustkrebs – wurde ein erhöhter IGF-1-R-Status beobachtet:

Fernandez-Twinn et al. (26) fanden in ihrem Modell (Proteinmangelernährung bis d 21)

79

in Einklang mit dieser Vermutung im Brustdrüsengewebe über die Methode des Wes-

tern Blot eine erhöhte IGF-1-R-Dichte in der LP-Gruppe (im Alter von vier Wochen in

der thorakalen Drüse, im Alter von fünf Wochen in der inguinalen) und interpretierten

die dadurch veränderte Suszeptibilität als mögliche Ätiologie für die verdoppelte Brust-

krebs-Inzidenz gegenüber der NP-Gruppe nach Behandlung mit NMU. Nüsken et al.

(81) konnten in ihrem Tiermodell, das in Analogie zu unserem Modell steht, am Tag der

Geburt über die Methode der RT-PCR in der Leber eine für die LP-Gruppe induzierte

Expression der mRNA für IGF-1-R, IGF-2-R, sowie für Insulin-Rezeptoren nachwei-

sen. Bei Nüsken et al. wurden männliche, sowie weibliche Ratten untersucht, wobei

sich kein geschlechtsspezifischer Unterschied zeigte. In unserer Studie wurden keine

IGF-Rezeptoren untersucht. Die Gene-Array-Analyse (vgl. Kapitel 5.7, 6.4) zeigte keine

signifikanten Veränderungen hinsichtlich dieser Rezeptoren, jedoch war IRS-1 zentraler

Achsenpunkt der Signalwege signifikant differentiell regulierter Gene. Dies lässt ver-

muten, dass an anderer Stelle im Signalweg zwischen IGF-1/Insulin und deren Effekt

zwischengeschaltete Stationen verändert sind. Eine detaillierte Analyse bleibt Folge-

untersuchungen vorbehalten.

Zusätzlich zum hepatischen, systemisch zirkulierenden IGF-1 synthetisieren fast alle

Gewebe lokales IGF-1, welches sich durch para- oder autokrine Wirkungsweise aus-

zeichnet (18). Mehreren Studien zur Folge scheint für die Entwicklung der Brustdrüse

insbesondere die lokale IGF-1-Synthese entscheidend zu sein. So konnten Richards et

al. (102) in einer Studie an der Spezies der Maus zeigen, dass eine leberspezifische De-

letion des IGF-1-Gens über das Cre/loxP-System, welche das Serum-IGF-1 um etwa

75 % senkt, ohne dabei die Synthese in non-hepatischen Geweben zu beeinflussen,

nicht zu quantitativen Unterschieden der Verzweigungen der Brustdrüse führt. Zu er-

wähnen sei hierbei außerdem, dass die mutierten Mäuse trotz kompensatorisch erhöhten

GH-Werten keine erhöhte Transkriptionsrate von non-hepatischem IGF-1 aufwiesen.

Bei einer IGF-1-Mutante der Maus hingegen, bei der ausschließlich die Synthese von

Wildtyp-IGF-1 möglich ist, also sytemisches und lokales IGF-1 erniedrigt sind, zeigte

sich eine bezüglich der Anzahl der Verzweigungen der Drüsengänge um etwa 50 %

reduzierte Entwicklung der Brustdrüse (102). Houdijk et al. (44) beobachteten in einem

Ligaturmodell der Ratte ein trotz physiologischen GH- und IGF-1-Konzentrationen in-

komplettes Aufholwachstum der Brustdrüse post-IUGR, welches sie auf eine veränderte

lokale Responsibilität der Gewebe zurückführten. Ebenso fanden Ruan et al. (105) Hin-

weise, dass zirkulierende Wachstumsfaktoren weniger bedeutend sein könnten, als loka-

80

le, da auch nach Hypophysektomie mit konsekutivem Fehlen von systemischem IGF-1

unter lokaler IGF-1-Applikation eine normale Brustdrüsenentwicklung beobachtet wer-

den konnte.

6.3.1.1 Hepatische mRNA-Expressionsrate von IGF-1 u nd IGFBP-1

Unsere Ergebnisse zeigten nach Gewichtsnormalisierung für beide Gene (IGF-1 und

IGFBP-1) an d 28 unterschiedlich regulierte Expressionen mit jeweils reduzierten Wer-

ten in der LP-Gruppe gegenüber der NP-Gruppe (vgl. Kapitel 5.4). Dieses Resultat har-

moniert sowohl mit den von uns erhobenen Ergebnissen der auxiologischen Daten (vgl.

Kapitel 5.1), nach denen die LP-Gruppe kein überschießendes Aufholwachstum zeigt,

sondern sich lediglich langsam angleicht, als auch mit den Ergebnissen der Whole-

Mount Analyse (vgl. Kapitel 5.2) und der PCNA-Analyse (vgl. Kapitel 5.3), nach denen

die Fläche der Brustdrüsen der LP-Gruppe reduziert gegenüber der NP-Gruppe bleibt

und – dies bestätigend – auch die proliferative Aktivität der LP-Gruppe geringer ist.

Da jedoch die Expression von IGF-1 und IGFBP-1 in der LP-Gruppe zu beiden Zeit-

punkten in gleicher Weise gegenüber der NP-Gruppe erniedrigt war, also im Verhältnis

aus IGF-1 und IGFBP-1 zu beiden Zeitpunkten kein signifikanter Gruppenunterschied

vorlag, ist dementsprechend davon auszugehen, dass keine signifikanten Gruppenunter-

schiede im aktiven, systemisch frei verfügbaren IGF-1 bestehen.

Daher bestätigt sich für die Ätiologie der morphologischen Unterschiede die bereits

bestehende Annahme, dass die Brustdrüsenentwicklung vornehmlich vom lokalen

IGF-1-System abhängt (vgl. Kapitel 6.3.1).

Denkbar wäre jedoch auch, dass die bestehende morphologische Unterentwicklung in

der LP-Gruppe nicht durch einen Mangel an proliferativen, sondern durch vermehrte

inhibierende Faktoren auf lokaler und/oder systemischer Ebene bedingt ist. Diese Theo-

rie könnte unterstützt werden durch die Tatsache, dass im IGF-1 System kein Unter-

schied gemessen wurde, jedoch in der NP-Gruppe die über die PCNA-Färbung gemes-

sene proliferative Aktivität dennoch höher war als in der LP-Gruppe. Nachdem bisher

vorrangig die aktivierende Seite Gegenstand von Studien war, wären in zukünftigen

Analysen ebenso die hemmenden Faktoren zu untersuchen, um ein umfassendes Bild

der komplexen Einflüsse auf die Entwicklung der Brustdrüse zu erstellen.

Nüsken et al. (81), deren Tiermodell bezüglich der Proteinmangeldiät dem unsrigen

entspricht, führten Messungen am Tag der Geburt durch. Sie untersuchten dabei Männ-

chen und Weibchen, konnten aber keinen signifikanten Unterschied zwischen beiden

81

Gruppen NP und LP feststellen. Über die Methode der RT-PCR fanden sie nach intra-

uteriner Mangelernährung in der Leber der jungen Ratten keine Veränderungen im Ver-

gleich zur Kontrollgruppe bezüglich der Expressionsrate der mRNA von IGF-1, IGF-2,

oder von IGFBP-1. Die Daten wurden bei Nüsken et al. nicht in Bezug zum Körperge-

wicht gesetzt. Nachdem aber die LP-Tiere post-IUGR bei gleichem IGF-1 ein geringe-

res Geburtsgewicht hatten, entsprächen die Ergebnisse für IGF-1 und IGFBP-1 bei

Nüsken et al. pro Körpergewicht höheren Werten in der Gruppe der LP-Tiere im Ver-

gleich zur NP-Gruppe. Auch wurde hier keine Aussage über das Verhältnis von IGF-1

zu IGFBP-1 getroffen.

In Zusammenschau mit den von Nüsken et al. an einem identischen Ernährungsmodell

erhobenen Werten scheinen in der LP-Gruppe sowohl die mRNA-Expression von

IGF-1, als auch von IGFBP-1 bezogen auf das Körpergewicht der Ratten zunächst nicht

signifikant oder nur marginal verschieden von der Expressionsrate der NP-Gruppe zu

sein, mit zunehmendem Alter aber vom Tag der Geburt bis d 28 abzunehmen. Die Ursa-

che für diese Veränderungen im zeitlichen Verlauf dürfte in der Proteinmangelernäh-

rung begründet sein. Dass allerdings im Verhältnis der mRNA von IGF-1 und IGFBP-1,

welches Rückschlüsse auf die Bioverfügbarkeit von systemisch zirkulierendem IGF-1

erlaubt, keine signifikanten Unterschiede konstatiert werden konnten, bestätigt die

Hypothese, dass die Ätiologie der histo-morphologisch festgestellten Unterschiede in

der Entwicklung der Brustdrüse im lokalen Milieu begründet liegt.

Die lokalen endokrinen Verhältnisse der Brustdrüse an d 21 und d 28 waren zum

Zeitpunkt der Fertigstellung dieser Arbeit noch nicht untersucht und sind daher Gegen-

stand weiterer, derzeit noch nicht abgeschlossener Studien.

6.3.1.2 Proteinexpressionsrate von IGF-1 im Serum

Bei der Messung des systemisch zirkulierenden Gesamt-IGF-1 im Serum ergaben sich

über die Methode des ELISA aus unseren gewichtsnormalisierten Daten weder an d 21,

noch an d 28 signifikante Gruppenunterschiede bezüglich des IGF-1-Spiegels (vgl. Ka-

pitel 5.5). Dies wiederum bestätigt unser Ergebnis der PCR, in der sich, dem Verhältnis

von IGF-1 und IGFBP-1 entsprechend, keinerlei signifikanter Unterschied im frei ver-

fügbaren IGF-1 zeigte. Vor einer Normalisierung auf das Körpergewicht waren bei den

LP-Tieren zu beiden Zeitpunkten erniedrigte Serum-IGF-1-Spiegel sichtbar, was mit

oben genannter Aussage übereinstimmt, nach der der Serum-IGF-1-Spiegel positiv mit

dem Körpergewicht korreliert (vgl. Kapitel 6.3.1). Die Tatsache allerdings, dass sich

82

bezogen auf das Körpergewicht keine Unterschiede in der IGF-1-Konzentration fanden,

erhärtet wiederum die Hypothese, dass systemisch zirkulierendem IGF-1 eine weniger

bedeutende Rolle in der Entwicklung der Brustdrüse, als lokal produziertem zukommt

und die beobachteten Unterschiede bezüglich der proliferativen Aktivität des Brustdrü-

sengewebes zwischen der LP- und der NP-Gruppe möglicherweise in einer unterschied-

lichen Gewebe-Suszeptibilität gegenüber IGF-1 begründet liegen.

Die Proteinexpression von zirkulierendem oder lokalem IGFBP-1 war zum Zeitpunkt

der Fertigstellung dieser Arbeit noch nicht gemessen. Folglich bleibt – zur Erweiterung

oben getroffener Aussage über das Verhältnis der mRNA-Expressionsrate von IGF-1 zu

IGFBP-1 – das Verhältnis der Proteinexpressionsrate von IGF-1 zu IGFBP-1 noch un-

geklärt.

Zusammenfassend festgehalten liegen in unserer Studie in der Pubertätsphase zwischen

d 21 und d 28 bezüglich der hepatischen mRNA-Expression von IGF-1, sowie des zir-

kulierenden IGF-1, also in den systemischen IGF-1-Verhältnissen keine signifikanten

Gruppenunterschiede vor. Aufgrund dessen liegt die Vermutung nahe, dass die Ursache

für die beobachtete mikroskopisch veränderte Brustdüsenentwicklung der LP-Gruppe in

lokalen Veränderungen begründet liegt. Zur weiteren Untersuchung des lokalen Milieus

stehen Analysen der lokalen Verhältnisse von IGF-1 und IGFBP-1, sowie des IGF-1-R-

Status aus. Zudem könnten nach d 28 fortgeführte Langzeitstudien mögliche Spätfolgen

einer IUGR auf diese hormonellen Regelkreise ergründen.

6.3.2 Steroidhormon-Profil im Serum Es ist bekannt, dass eine postpartale Mangelernährung über die Ausschüttung adrenaler

Corticoide hemmenden Einfluss auf die Proliferation von Brustdrüsengewebe hat

(13,56,131,148,149). (Viele der diesbezüglichen Untersuchungen stammen aus dem

Bereich der Senologie an postpubertären Brustdrüsenzellen oder in vitro-Analysen.)

Daher wurde dieser potentielle Zusammenhang in der vorliegenden Studie auch für die

pubertäre Brustdrüsenentwicklung nach intrauteriner Mangelernährung in vivo im Sinne

einer fetalen Programmierung untersucht.

Mittels Tandem-MS wurde ein Steroidhormon-Profil im Serum erstellt. Die Methode

der Tandem-MS wurde gewählt, da diese sehr sensitiv ist und Mess-Variationen auf-

grund der Möglichkeit, das komplette Steroidhormon-Profil in einer einzigen Messung

zu analysieren, ausbleiben.

83

In der Messung unserer Serumproben lagen Progesteron, Deoxycorticosteron, Corti-

costeron und Dehydrocorticosteron, DHEA und DHEAS im messbaren Bereich (vgl.

Abbildung 5.7). Unterschiede zeigten sich vor allem an d 28, wobei die Konzentrationen

in der LP-Gruppe für Progesteron, Deoxycorticosteron, für den Corticosteron-

Dehydrocorticosteron-Quotienten, sowie für DHEA gegenüber der NP-Gruppe erhöht

waren (vgl. Kapitel 5.6).

Die normale Brustdrüsenentwicklung wird von Glucocorticoiden (52,132) über die

Kontrolle von Zellzyklus, Proliferation und Apoptose (133) beeinflusst, wobei diese

einen Teil ihrer Funktion wahrscheinlich über die Regulation des Zellzyklus via Modi-

fikation cyclin-abhängiger Kinasen ausüben (37,149).

Postnatale Nahrungsrestriktion aktiviert als Stressantwort unter anderem die Sezer-

nierung von Nebennierenrinden-Steroiden (55).

Bei der mammären Karzinogenese finden sich in der Literatur zunehmend Hinweise

auf eine inhibierende Wirkung von Nebennierenrinden-Steroiden (13,56,131,148,149).

Dabei interagieren Corticosteroide wahrscheinlich mit mehreren noch unbekannten Me-

diatoren, die die Inhibition von Brust-Tumoren nach Proteinrestriktion verstärken

(150,151). Adrenalektomie kann die mammäre Karzinogenese beschleunigen (5), wäh-

rend die Injektion kortikaler Steroide diese hemmen kann (6).

Nach Hoijman et al. (43) führen Glucocorticoide in undifferenzierten Zellen der

Mamma zu einer Reduktion der Zellproliferation, in differenzierten Zellen hingegen zu

einer Reduktion der Apoptose. Dies könnte zu zwei entgegengesetzten Hypothesen füh-

ren: Einerseits könnten erhöhte Glucocorticoid-Konzentrationen während der mammä-

ren Entwicklung über reduzierte Zellproliferation dem Risiko einer Entartung im Sinne

von early-onset-Tumoren entgegenwirken, erhöhte Werte nach der Pubertät hingegen

karzinogen wirken; andererseits könnte es durch eine frühzeitige Ausdifferenzierung bei

erhöhten Glucocorticoid-Spiegeln in der Pubertät zu Mutationen kommen, die in der

Folge eine Karzinogenese begünstigen.

Dennoch scheinen nach Jiang et al. (57) erhöhte Glucocorticoid-Konzentrationen we-

niger bedeutend für die Inhibition von Mamma-Tumoren zu sein, als verringerte IGF-1-

Spiegel.

84

6.3.2.1 Mineralo- und Glucocorticoide

6.3.2.1.1 Corticosteron und Dehydrocorticosteron

Das aktive Corticosteron [CS] der Ratte, welches dem humanen Cortisol entspricht, ist

das primäre Glucocorticoid (130). Es wird über die 11β-Hydroxylase aus Deoxycorti-

costeron synthetisiert (vgl. Abbildung 5.7). In unseren Ergebnissen zeichnete es sich in

beiden Gruppen durch einen deutlichen Zuwachs von d 21 bis d 28 aus (vgl. Kapi-

tel 5.6.1.1). Gleiches galt für das inaktive, dem humanen Cortison entsprechenden De-

hydrocorticosteron [DHCS]. Interessanterweise zeigte sich bei der quantitativen Analy-

se des Verhältnisses von aktivem Corticosteron zu inaktivem Dehydrocorticosteron,

dass die LP-Tiere an d 28 einen signifikant höheren Spiegel an aktivem Corticosteron

aufwiesen, als die NP-Tiere.

Plank et al. (94) stellten in ihren Serum-Analysen mittels Tandem-MS weder im Mo-

dell der männlichen Ratte in einem unserer Studie identischen Proteinrestriktionsmo-

dell, noch in einer retrospektiven humanen Studie (Vergleich von SGA- und AGA-

Kindern) Gruppenunterschiede bezüglich CS / DHCS, bzw. Cortisol / Cortison fest. Als

Ursache für das von unserer Studie differierende Ergebnis bei Plank et al. könnten ei-

nerseits die Untersuchung männlicher Ratten, sowie die späteren Messzeitpunkte (Alter

von 6, 11 und 15 Wochen) angesehen werden.

Die bei uns konstatierten erhöhten Corticosteron-Spiegel können eine Antwort auf

durch Mangelernährung bedingten erhöhten Stress sein (55,56,148). In der Literatur

finden sich Theorien, dass erhöhte Corticosteron-Spiegel inhibierend auf das mammäre

Zellwachstum (56,149) oder die Tumorgenese wirken können (13,131,148), wobei in

den genannten Studien die Glucocorticoid-Applikation teils bei bereits bestehendem

Tumor erfolgte (13) und sich nicht streng auf die Phase der Pubertät beschränkte.

Unsere Studie zeigte an d 28 in der LP-Gruppe einen erhöhten CS/DHCS-Quotienten.

Diese erhöhte CS-Aktivität könnte möglicherweise eine Hemmung des Zellwachstums

und eine frühere Ausdifferenzierung bedingen. Dies würde mit den von uns erhobenen

Daten der PCNA-Färbung übereinstimmen, bei der sich die proliferative Aktivität an

d 28 für die Gruppe der LP-Tiere signifikant erniedrigt zeigte (vgl. Kapitel 5.3). Im

Rahmen der frühen Ausdifferenzierung könnte es allerdings auch zu Mutationen kom-

men, die wiederum eine Karzinogenese begünstigen würden.

Auch nach Hoijman et al. (43) könnten erhöhte CS-Spiegel eine Karzinogenese be-

günstigen. Dieser Theorie nach führen erhöhte CS-Spiegel zu einer reduzierten apopto-

tischen Aktivität der am Ende der Pubertät schon weitgehend differenzierten mammären

85

Zellen, wobei ein gewisser Prozentsatz dieser Zellen in der Folge anhaltend erhöhter

Glucocorticoid-Konzentrationen sogar bereits Mutationen aufweisen könnte.

6.3.2.1.2 Deoxycorticosteron

Ebenso zeigten sich für Deoxycorticosteron, das eine Zwischenstufe in der durch die

21α-Hydroxylase und die 11β-Hydroxylase katalysierten enzymatischen Umwandlung

von Progesteron in Corticosteron darstellt, für LP an d 28 deutlich erhöhte Werte. Zu-

dem war bei LP-Tieren ein deutlicher Anstieg von d 21 bis d 28 zu beobachten, wäh-

rend die Werte der NP-Tiere auf gleichem Niveau blieben (vgl. Kapitel 5.6.1.2).

Deoxycorticosteron wird über die 11β-Hydroxylase zu Corticosteron und weiter über

die Aldosteron-Synthase zum Mineralcorticoid Aldosteron katalysiert.

Das Ergebnis scheint einen Sekundäreffekt zu zeigen, welcher in den ebenso erhöht

gemessenen Progesteron-Werten (vgl. Kapitel 5.6.2.1) für die LP-Gruppe an d 28 be-

gründet zu sein scheint.

6.3.2.2 Sexualhormone

6.3.2.2.1 Progesteron

Die Progesteron-Konzentration zeigte in unserer Studie weder in der LP-, noch in der

NP-Gruppe einen deutlichen Zuwachs von d 21 bis d 28. Der Serum-Spiegel der LP-

Tiere lag dabei zu beiden Zeitpunkten über dem der NP-Tiere, wobei der Unterschied

nur an d 28 signifikant war (vgl. Kapitel 5.6.2.1).

Progesteron spielt in der duktalen Morphogenese der Mamma eine bedeutsame Rolle,

indem es die proliferative Wirkung von IGF-1 verstärkt (108) (vgl. Kapitel 2.1.3.2).

Allerdings ist auch eine mitogene Wirkung bei prämenopausalen Frauen beschrieben

(112). Während in der gesunden Brustdrüse die Mehrzahl der Zellen Progesteron-

Rezeptor-negativ sind, exprimieren bei Diagnosestellung etwa 70% der Mamma-

Tumoren diesen Rezeptor (69).

Nachdem Progesteron die Wirkung von IGF-1 auf die duktale Morphogenese ver-

stärkt, könnten die in unseren Untersuchungen am Ende dieser Phase (d 28) erhöht ge-

messenen Progesteron-Spiegel der LP-Tiere demnach eher für eine prolongierte Stimu-

lation der über IGF-1 vermittelten duktalen Proliferation und Extension (108) sprechen.

Da die physiologische ovarielle Progesteron-Synthese der Ratte jedoch erst an d 38 ein-

setzt (60), dürften die von uns an d 28 erhöht gemessenen Progesteron-Spiegel in der

LP-Gruppe entweder Syntheseprodukt der Nebennierenrinde sein oder Ausdruck einer

86

deutlich beschleunigten ovariellen Maturation. Letztere würde mit dem hypothetischen

Konzept der life-history theory (14) übereinstimmen, nach der in Einklang mit den üb-

rigen Ergebnissen unserer Untersuchung (verringerte proliferative Aktivität (vgl. Kapi-

tel 5.3), erhöhter Spiegel aktiven Corticosterons (vgl. Kapitel 5.6.1.1)) und anderer Stu-

dien mit Proteinmangelernährung (vgl. Kapitel 2.2.3.1.1) in der LP-Gruppe zum Ende

der duktalen Morphogenese bereits erhöhte Progesteron-Spiegel denkbar wären, welche

einer vorzeitigen Pubertät mit frühzeitiger ovarieller Maturation entsprächen. Seine

Wirkung könnte Progesteron dabei nach den Ergebnissen von Kariagina et al. (59) an

d 28 über den bereits zu diesem Zeitpunkt exprimierten PR-B entfalten; die volle lokale

Wirkung kann Progesteron nach genannter Studie allerdings erst ab der fünften Le-

benswoche ausüben, in der sowohl PR-A als auch PR-B im messbaren Bereich lagen.

Bei Messungen an d 150 fanden Sloboda et al. (122) nach intrauteriner Mangelernäh-

rung bei adulten Ratten mit post-IUGR vorzeitiger Pubertätsentwicklung und entspre-

chend früherem Verlust der Ovarfunktion erniedrigte Progesteron-Spiegel. Nach mater-

naler HF-Diät zeigten sich hingegen erhöhte Progesteron-Werte als möglicher Ausdruck

einer später einsetzenden Menopause. Bezogen auf den Menschen konnte durch Painter

et al. (88) als Auswirkung der holländischen Hungersnot bei den Frauen, die in der

Frühschwangerschaft hungerten, ein niedrigeres Alter bei der Geburt des ersten Kindes,

sowie frühere Menarche und Menopause im Vergleich zu Frauen, die keinem intrauteri-

nen Hunger ausgesetzt waren, beobachtet werden. Dies entspricht den Beobachtungen

frühen Eintritts in die Pubertät und frühen Verlusts der Ovarfunktion am Tiermodell

von Sloboda et al. (122). Bei Fernandez-Twinn et al. (27) zeigte sich im Modell der

Ratte bei LP-Diät bis d 21, anschließender Normaldiät und postpubertärer HF-Diät ab

der siebten Lebenswoche eine erhöhte Expression des Progesteron-Rezeptors (mRNA

und Protein) im Alter von vier Monaten; Progesteron-Spiegel im Serum wurden zu die-

sem Zeitpunkt nicht untersucht. In den Konzentrationen der systemisch gemessenen

Hormone Progesteron, Estradiol und FSH fanden sich bei Messungen im Alter von fünf

und sieben Wochen keine Gruppendifferenzen bei Fernandez-Twinn et al. (26).

Nachdem der Progesteron-Spiegel nach unseren Ergebnissen in der LP-Gruppe an

d 28 erhöht war, wobei duktale Proliferation und Extension an d 28 keinen Gruppenun-

terschied aufwiesen (vgl. Kapitel 5.2.1), bzw. in der LP-Gruppe sogar geringer ausge-

prägt waren (vgl. Kapitel 5.2.2), und zudem im Sinne der life-history theory erhöhte

Progesteron-Spiegel denkbar wären, wäre zur abschließenden Beurteilung und Verifika-

tion unserer Ergebnisse einerseits eine Langzeitbeobachtung sinnvoll, um eine mögli-

cherweise doch nach d 28 stattfindende Extension untersuchen zu können; andererseits

87

ist neben Messungen der Progesteron-Spiegel zur Darstellung der tatsächlichen Aktivi-

tät des Progesterons eine Analyse des Progesteron-Rezeptor-Status, darunter insbeson-

dere des PR-B, welcher bei Kariagina et al. (59) ab der dritten Lebenswoche nachweis-

bar war, vonnöten, welche Gegenstand derzeitiger Untersuchungen ist. Eine Aussage

über die Rolle der Nebennierenrinde hinsichtlich der Synthese von Progesteron zu dem

von uns untersuchten Zeitpunkt ist nach derzeitigem Kenntnisstand noch nicht möglich.

Schlussfolgernd kann man festhalten, dass die Progesteron-Konzentration offenbar

über intrauterine Ernährung moduliert werden kann. Dass Sloboda et al. in ihrem Mo-

dell (50% Mangelernährung, kein reiner Proteinmangel) bei Analysen an d 150 in der

LP-Gruppe erniedrigte, unsere Studie an d 28 erhöhte Progesteron-Werte präsentierten,

dürfte trotz bestehender Unterschiede im Ernährungsmodell Ausdruck einer durch

Mangelernährung ins frühere Lebensalter verschobenen reproduktiven Phase sein.

6.3.2.2.2 DHEA und DHEAS

DHEA und DHEAS lagen nur knapp über der Sensitivitätsgrenze der Tandem-MS (vgl.

Kapitel 5.6.2.2). Die Messwerte wiesen starke Schwankungen auf (DHEAmin:

0,001 ng/ml, DHEAmax: 4,82 ng/ml; DHEASmin: 0,001 ng/ml, DHEASmax: 19,40 ng/ml).

Die Zahl der Tiere, deren Messergebnis deutlich über der Nachweisgrenze

(> 0,001 ng/ml) lag, war für DHEA bei 93 %, für DHEAS allerdings nur bei 51 %, so-

dass die n-Zahl der zur Auswertung zur Verfügung stehenden Tiere zu gering war, um

verlässliche Aussagen über Gruppenunterschiede treffen zu können. Besonders bei der

Berechnung des Verhältnisses von DHEA zu DHEAS fallen Schwankungen vor allem

im Nenner stark ins Gewicht, sodass die Berechnung dieses Quotienten weiteren Analy-

sen vorbehalten bleibt. Bezüglich der Einzelwerte von DHEA und DHEAS soll dennoch

kurz eine mögliche Tendenz aufgezeigt werden:

DHEA zeigte in der Auswertung unserer Messergebnisse für beide Gruppen einen

signifikanten Abfall von d 21 bis d 28. An d 21 konnte kein Gruppenunterschied beo-

bachtet werden, an d 28 lagen die Messwerte der LP-Gruppe über den Werten der

NP-Gruppe; für DHEAS zeigte sich zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied.

Die Serum-DHEA-Konzentration sinkt mit zunehmendem Alter, während das Karzi-

nomrisiko gleichzeitig zunimmt (36). Niedrige DHEA-Spiegel werden daher mit erhöh-

tem Tumor-Risiko assoziiert. Die Verabreichung von DHEA wiederum verringert bei

Nagern das Karzinomrisiko, wobei die mitogenen Eigenschaften von verabreichten

Karzinogenen herabgesetzt und maligne Zelltransformationen somit verhindert wurden.

Außerdem konnte DHEA die Gewichtszunahme ohne Beeinträchtigung der Nahrungs-

88

aufnahme, sowie die Ausprägung von Diabetes und von Autoimmunprozessen unter-

drücken. Nachdem DHEA zudem als ein möglicher Inhibitor der Glucose-6-Phosphat-

Dehydrogenase gilt, könnte die antikarzinogene Wirkung von DHEA über diese inhibi-

torische Funktion vermittelt sein (36).

Das DHEA/DHEAS-System scheint nach unseren noch mit Vorsicht zu betrachten-

den Ergebnissen von einer Dysregulation durch IUGR weitgehend ausgenommen zu

sein, wobei jedoch Veränderungen – wie sie für DHEA an d 28 angedeutet sind – nicht

zuletzt aufgrund der Messung im niedrigen Sensitivitätsbereich nicht endgültig auszu-

schließen sind und in weiteren Untersuchungen verfolgt werden sollen.

Eine Analyse von Auswirkungen einer IUGR auf die Östrogen-Spiegel steht noch aus,

da Östrogen in durchgeführter Tandem-MS unter der Nachweisgrenze lag.

Zusammenfassend lässt sich bezüglich der Ergebnisse der Tandem-MS (vgl. Kapi-

tel 5.6) festhalten, dass Differenzen zwischen den beiden Gruppen vorliegen, die sich

erst an d 28 ausgeprägt haben. Sie weisen auf eine Beeinträchtigung der HPO-Achse,

sowie der HPA-Achse durch intrauterine Mangelernährung hin, die erst während der

Pubertät zur Ausprägung kommt. Dabei sind die erhöhten Deoxycorticosteron- und Cor-

ticosteron-Konzentrationen möglicherweise ein rein durch die erhöhten Konzentratio-

nen von Progesteron bedingter Sekundäreffekt. Progesteron geht im Syntheseweg der

Nebennierenrindenhormone den Hormonen Deoxycorticosteron und Corticosteron vor-

aus und kann in der Folge zu erhöhten Werten aller aus ihm entstehenden Hormone füh-

ren (vgl. Abbildung 5.7). Allerdings sollte man bei dieser Vermutung bedenken, dass

zumindest bei adulten weiblichen Lebewesen, deren ovarielle Funktion bereits einge-

setzt hat, ein Großteil des Progesterons außerhalb der Nebennierenrinde, nämlich im

Ovar von den Corpora lutea synthetisiert wird. Unter dieser Voraussetzung wäre eine

andere Ätiologie der erhöhten Deoxycorticosteron- und Corticosteron-Spiegel zu su-

chen. Unterschiede bezüglich DHEA und DHEAS sind aufgrund des Synthesewegs als

davon unabhängiger Effekt der Mangelernährung auf die pubertäre Hormonsynthese zu

sehen. Die systemische GH-IGF-1-Achse scheint dabei nicht verändert zu sein (vgl.

Kapitel 5.4, 5.5).

In Zusammenschau mit der aktuellen Literatur zeigen die von uns konstatierten Ver-

änderungen im Steroidhormon-Profil einerseits antiproliferative Elemente (gegenüber

NP erhöhter Corticosteron-Dehydrocorticosteron-Quotient (13,56,131,148,149) sowie

erhöhtes DHEA (36) in der LP-Gruppe), andererseits auch Elemente, die eine maligne

Transformation der Brustdrüse begünstigen könnten (gegenüber NP erhöhtes Progeste-

89

ron (108,112) sowie erhöhter Corticosteron-Dehydrocorticosteron-Quotient (43) in der

LP-Gruppe). Eine abschließende Beurteilung der veränderten adrenalen Funktion nach

IUGR bedürfte weiterer Analysen der lokalen Hormonkonstellationen sowie postpuber-

tärer Langzeituntersuchungen.

Abschließend ist noch zu erwähnen, dass sich ein Aufholwachstum der Brustdrüse nach

dem Ende der duktalen Morphogenese ab d 28 nicht gänzlich ausschließen lässt. In die-

sem Rahmen wäre ein verzögerter Pubertätseintritt denkbar, wie er auch schon im Liga-

turmodel von Engelbregt et al. (22) beobachtet werden konnte. Zur Klärung eines sol-

chen Effekts bedürfte es weiterer Langzeituntersuchungen in unserem Modell.

Schlussfolgernd wurden in mehreren Studien Hinweise darauf gefunden, dass die Er-

nährung einen Einfluss auf unterschiedliche Hormonsysteme (GH-IGF-1-Achse und

HPO-Achse) zeigt, wobei sowohl das somatische Wachstum, als auch die ovarielle

Achse involviert sein dürften. Dabei sei noch einmal darauf hingewiesen, dass ovarielle

Hormone mit dem GH-IGF-1-System interagieren (vgl. Kapitel 2.1.3.2): Östrogen, GH

und IGF-1 wirken synergistisch in der pubertären Entwicklung der Brustdrüse (25), wo-

bei Östrogen verstärkend auf die GH-IGF-1-Achse wirkt (62,105,123). Ebenso vermag

Progesteron, die Wirkung dieser Achse zu verstärken, spielt allerdings nach aktuellem

Stand der Wissenschaft erst im tertiären side-branching der adulten Brustdrüse eine

essentielle Rolle (64,124). In unseren Analysen zeigten sich auf systemischer Ebene

weder auf Transkriptions- noch auf Proteinebene Veränderungen der GH-IGF-1-Achse;

die lokalen Verhältnisse gilt es nach den Ergebnissen des Gene-Arrays zu bestätigen,

bevor genauere Aussagen über das lokale Milieu getroffen werden können. Progesteron

im Serum war in der LP-Gruppe besonders an d 28 gegenüber der NP-Gruppe erhöht;

Östrogen hingegen lag systemisch bisher nicht im messbaren Bereich. Für Folge-

Analysen der Sexualhormone stehen außerdem die asservierten Ovarien der Tiere zur

Verfügung. Gegenstand weiterer Untersuchungen wird die detaillierte Klärung der Zu-

sammenhänge zwischen den beobachteten histo-morphologischen Veränderungen und

den systemischen und lokalen hormonellen Verhältnissen sein.

6.4 Analyse des mammären Expressionsprofils mittels Gene-Array

Bisher waren vorwiegend systemische Regelkreise Gegenstand unserer Untersuchun-

gen. Dabei war jedoch keine Aussage über die lokale Hormonsituation oder die lokale

Sensitivität nach IUGR möglich, die Einflüsse intrauteriner Mangelernährung erkennen

90

lassen könnte. Daher stellten wir über einen Gene-Array das mammäre Genexpressi-

onsprofil dar und ordneten die veränderten Gene über die IPKB-Datenbank funktionel-

len Netzwerken zu. Ziel dabei war es, Kandidatengene zu identifizieren, welche Rele-

vanz in der Entwicklung der Brustdrüse haben oder eine spätere kanzerogene Entwick-

lung der Brustdrüse erkennen lassen können.

Im Zentrum der Top 2-Signalnetzwerke der LP-Gruppe an d 21 und d 28, die von der

IPA-Datenbank durch Zuordnung der Expressionsdaten des Gene-Arrays zu funktionell

relevanten Signalwegen erstellt wurden, fanden sich die MAP-Kinase ERK, das für den

Insulin- und IGF-1-Signalweg wichtige Signalmolekül IRS-1, der epidermale Wachs-

tumsfaktor-Rezeptor ErbB2 und das wichtigste vom Ovar sezernierte Estrogen

β-Estradiol (vgl. Kapitel 5.7).

Gegenstand und Ziel aktueller, noch nicht abgeschlossener Analysen ist es demnach,

eine Verifizierung der veränderten Regulation der genannten, von der IPA-Datenbank

als wichtig herausgestellten Gene per PCR und Western Blot durchzuführen, um so wei-

tere lokale Gene zu identifizieren, welche an für die Brustdrüsenentwicklung relevanten

Signalwegen beteiligt sind.

Die extrazelluläre Kinase ERK wird als wichtiger Bestandteil von Signalkaskaden

beschrieben, die unter anderem in der Mamma eine Rolle spielen (141). Bei 30 % der

Mamma-Tumoren werden Mutationen im ERK-Signalweg gefunden. Seine Aktivierung

geht über eine Signalkaskade mit sequentieller Aktivierung von Kinasen und wird über

Phosphorylierung reguliert. Als aktivierende Substrate von ERK gelten Transkriptions-

und Apoptoseregulatoren, sowie Steroidhormon-Rezeptoren, wie beispielsweise der

Progesteron-Rezeptor (141). Migliaccio et al. (75) konnten an Analysen humaner

Brustkrebs-Zelllinien nachweisen, dass sowohl Progesteron, welches in den Ergebnis-

sen unserer Studie in der LP-Gruppe an d 28 signifikant gegenüber der NP-Gruppe er-

höht war (vgl. Kapitel 5.6.2.1), über den Progesteron-Rezeptor als auch Estradiol die

MAP-Kinase ERK stimulieren. Die über ERK laufende Signalkaskade führt zu Prolife-

ration, Differenzierung, Anti-Apoptose, Angiogenese, Motilität und Zellinvasion (141).

IRS-1 ist ein intrazelluläres Signalprotein, welches von Hormonen und Wachstums-

faktoren aktiviert wird und ein Element innerhalb von Signalkaskaden ist (17). Von

besonderer Bedeutung ist es bei den intrazellulären Signalkaskaden, welche Signale

über den Insulin- und den IGF-1-Rezeptor übertragen. Es wird beschrieben, dass es eine

Rolle in der mammären Karzinogenese spielt (17). Nachdem IRS-1 auch Bestandteil

91

des ERK-Signalweges ist, verstärkt eine Überexpression von IRS-1, wie sie auch in

Tumoren zu finden ist, über Phosphorylierungsvorgänge die Aktivität von ERK (17).

ErbB2 induziert anti-apoptotische Proteine via ERK-Signalweg, schützt damit vor

Apoptose und zerstört die Zellorganisation des mammären Epithelzellverbands (141). In

mammären Tumoren findet sich häufig eine Überexprimierung von ErbB2, welche über

den ras-raf-MAP-Kinase-Signalweg zu verstärkter Proliferation führt (141).

β-Estradiol stimuliert die Zellproliferation über Mechanismen, an denen unter ande-

rem eine Aktivierung von ERK beteiligt ist (116).

Fernandez-Twinn et al. (26) konnten in ihren Analysen der mammären Epithelzellen der

Ratte in der LP-Gruppe mittels Western Blot auf Proteinebene an d 28 eine leicht indu-

zierte Expression für den IGF-1-R in der thorakalen Brustdrüse (entspricht zweiter und

dritter Brustdrüse) messen; erst an d 35 zeigte sich eine erhöhte Expressionsrate des

IGF-1-R in der inguinalen Brustdrüse (entspricht vierter und fünfter Brustdrüse). Eine

PCR wurde nicht durchgeführt. In einer weiteren Studie (27) konnten Fernandez-Twinn

et al. bei Messungen in der inguinalen Brustdrüse sowohl im Western Blot, als auch in

der PCR ebenso erst an d 35 eine induzierte Genexpression des IGF-1-R zeigen. Die

thorakale Brustdrüse wurde nicht analysiert. Für den Progesteron-Rezeptor waren bei

Messungen im Alter von vier Monaten sowohl Protein-, als auch mRNA-Expression

erhöht, für ErbB2 und für phosphorylierte ERK1/2 zeigte sich eine erhöhte Proteinex-

pression (27). Ebenso zeigte sich eine induzierte Proteinexpression des ErbB2-

Rezeptors, sowie des ER-α und -β (26).

Diesen Ergebnissen nach scheint für die Genregulation der Zeitpunkt eine entschei-

dende Rolle zu spielen.

Für ERK und ErbB2 wird in der Literatur eine Relevanz in der Brustdrüsenentwick-

lung beschrieben (141); sowohl in unseren, als auch in Analysen von Fernandez-Twinn

et al. ergaben sich Unterschiede zwischen der LP- und der NP-Gruppe. Daher ist die

Verifizierung unserer Ergebnisse per Western Blot und PCR Gegenstand aktueller Un-

tersuchungen. Ebenso werden in der Folge weitere Analysen bezüglich der in unserer

Studie an d 28 induzierten Genexpression von IRS-1 und β-Estradiol, sowie von ande-

ren für die Brustdrüsenentwicklung relevanten Genen durchgeführt.

Im Gegensatz zu den von Fernandez-Twinn et al. erhobenen Daten fanden sich in den

wichtigsten Signalnetzwerken unseres Gene-Arrays keine modifizierten Regulationen

von IGF-1-R und ER im Vergleich zur NP-Gruppe.

92

6.5 Ausblick

Unsere Studie untersuchte den Einfluss intrauteriner Mangelernährung auf die pubertäre

Entwicklung der Brustdrüse der weiblichen Ratte. Neben dem in vorliegender Studie

untersuchten Zeitraum zwischen Beginn und Ende der Pubertät sind Veränderungen zu

erwägen, welche sich erst in Langzeituntersuchungen manifestieren. Um weiterführend

über die gestörte pubertäre Brustdrüsenentwicklung hinaus auch eine Aussage über das

Risiko der Entstehung von Mamma-Tumoren in der Brustdrüse nach IUGR treffen zu

können, könnte unser Modell um eine medikamentöse Tumorinduktion erweitert wer-

den. Bei Bestätigung unserer Ergebnisse sind zusätzlich zu den von uns analysierten

pränatalen auch postnatale, präpubertäre, sowie auch postpubertäre Einflüsse auf die

Brustdrüsenentwicklung denkbar. Diese sind neben pränatalen Ursachen ebenso als

Ätiologie für eine gestörte Pubertäts-, bzw. Brustdrüsenentwicklung, wie für eine poten-

tielle Begünstigung mammärer Tumorgenese vorstellbar. Umgekehrt lässt sich die

Möglichkeit einer Reversibilität vermuten, welche entweder über die mütterliche oder

über die kindliche Seite von statten gehen kann. Über ein sogenanntes „cross-fostering“

könnten postnatale maternale Einflussfaktoren eruiert werden, die während der Lakta-

tion zu Modifikationen führen, welche sich wiederum auf die pubertäre Entwicklung der

Brustdrüse post-IUGR auswirken. Übertragen auf das humane Modell wären dement-

sprechend beispielsweise Hinweise auf eine spezielle Zusammensetzung der Ernährung

für post-IUGR-Kinder zu erwarten. Zur Untersuchung postnataler Modifikationen sei-

tens der Nachkommen wäre eine Transplantation der Brustdrüsenanlage zwischen den

Gruppen in Betracht zu ziehen. Aus der Analyse der histo-morphologischen Entwick-

lung der Brustdrüse und des endokrinen Milieus wären Rückschlüsse auf mögliche An-

wendung hormoneller Therapie vorstellbar, welche bei Kindern post-IUGR zum Ver-

hindern gestörter Pubertätsentwicklung und erhöhter Morbidität im weiteren Leben zum

Einsatz kommen könnten. Weitere Details bezüglich der pubertären Entwicklung post-

IUGR könnten in unserem Modell durch Forschungsergebnisse zu den entnommenen

und konservierten Ovarien ebenso wie durch die detaillierte Untersuchung lokaler Ver-

änderungen im Brustdrüsengewebe erreicht werden. Denkbar wäre zudem auch eine

Ausweitung unserer Analysen auf andere Spezies, wie beispielsweise das Schwein,

welches endokrin größere Ähnlichkeiten zum Menschen aufweist als die Spezies der

Ratte, oder auch Untersuchungen am Ligaturmodell, um weiteren Aufschluss über die

Pathophysiologie post-IUGR zu erhalten.

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8 Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer A Ampere AB alveolar bud ABC Avidin-Biotin-Complex AGA appropriate for gestational age APCI atmospheric pressure chemical ionization bzw. beziehungsweise cDNA komplementäre DNA cm Centimeter CMV Cytomegalie-Virus CS Corticosteron CT Threshold-cycle d 1 Tag 1 = Zeitpunkt der Geburt d 21 Tag 21 postpartal d 28 Tag 28 postpartal DAB 3,3’-Diaminobenzidin DDT Dichlordiphenyltrichlorethan DEPC Diethylpyrocarbonat DHCS Dehydrocorticosteron DHEA Dehydroepiandrosteron DHEAS Dehydroepiandrosteron-Sulfat DNA Desoxyribonucleinsäure DNAse Desoxyribonuclease dNTP Desoxy-Nucleosidtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ER Östrogen-Rezeptor ErbB2 epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 ERK extrazellulär regulierte Kinase FAM 6-Carboxy-Fluorescein FCS fetales Kälberserum FRET Fluorescence resonance energy transfer FSH Follikel stimulierendes Hormon g Gramm GH Wachstumshormon GHRH Growth-Hormon-Releasing-Hormon GnRH Gonadotropin-Releasing-Hormon h Stunde H2O Wasser H2O2 Wasserstoffperoxid HCl Salzsäure HF high fat diet / Haltungsfutter HPA-Achse Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse HPLC high-performance liquid chromatography HPO-Achse Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Achse HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase IGF insulin-like growth factor

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IGFBP IGF-Bindeprotein IPKB Ingenuity Pathways Knowledge Base IRS Insulinrezeptor-Substrat IUGR intrauterine Wachstumsrestriktion KS Kontrollserum LC-Tandem-MS Liquid Chromatography Tandem-Massenspektrometrie LGA large for gestational age LH luteinisierendes Hormon LP low protein diet MAP mitogen aktiviertes Protein max maximal MgCl2 Magnesiumchlorid min minimal/Minute ml Milliliter M-MLV Molony Murine Leukosis Virus mRNA messenger Ribonukleinsäure n Anzahl der Tiere pro Gruppe NaCl Natriumchlorid ng Nanogramm Nm Nanometer NMU Nitrosomethylurea NP normal protein diet ns nicht signifikant OH- Hydroxy- p P-Wert PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR Polymerase-Kettenreaktion PR Progesteron-Rezeptor r18S ribosomale 18S-RNA RIN RNA-Integrity-Nummern Rn normalized reporter RNA Ribunucleinsäure RNAse Ribunuclease ROX 6-Carboxy-X-rhodamin RT reverse Transkriptase RT-PCR Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion S Svedberg-Einheit Sec Sekunde SEM Standarderror of the mean SGA small for gestational age TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TAMRA 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin Taq Thermus aquaticus TBS Tris-Buffered Saline TD terminal duct TEB terminal end bud TRIzol® Reagent Guanidin-Isothiocyanat-Acid-Phenol U/m Umdrehungen/Minute UNG Uracil-N-Glycosylase UV ultraviolett ZnSO4 Zinksulfat