Universität Duisburg–Essen

Solche Affinitätstechnologien basieren auf derspezifischen und umkehrbaren Bindung einesMoleküls an einen Rezeptor, welcher sinnvoller-weise an der Oberf läche eines festen Trägers fi-xiert ist. Auf diese Weise können in komplexenGemischen ganz bestimmte Moleküle dadurcherkannt werden, dass nur sie an der Trägerober-f läche haften bleiben. Dieses Verfahren lässt sichfür den analytischen Nachweis oder für die prä-parative Reinigung nutzen (Abb. 1). Ei-ne sehr attraktive Alternative zu biolo-gischen Rezeptoren sind die in denletzten Jahren entwickelten funktionel-len nanoskaligen Kavitäten, so genann-te molekulare Abdrücke in molekulargeprägten Polymeren (MIPs) – alsoKunststoffverbindungen. Die Synthesevon MIPs aus synthetischen Bausteinen(Monomeren oder Polymeren) mitfunktionellen Haftgruppen erfolgt inGegenwart eines Templates, einer Artmolekularer Schablone, und führt zueinem Polymernetzwerk oder Festkörpermit spezifischen Bindungsstellen fürdas Templat. Diese stabilen syntheti-schen Materialien funktionieren ähn-lich wie Antikörper (Plastic Antibodies)oder Enzyme (Plastic Enzymes).

Proteine spielen im Zusammenhang mit bio-inerten, bioaktiven oder affinen Oberf lächeneine Schlüsselrolle. Proteine lagern sich an nahe-zu allen Oberf lächen an und ändern dabei ihredreidimensionale Struktur. Daraus ergibt sichmeist eine verringerte biologische Aktivität. Bei

der Isolierung und Identifizierung oder derbiotechnologischen Herstellung und Reinigungkommen Proteine zwangsläufig mit Oberflächenin Kontakt. Dies kann durch die oben beschrie-benen Eigenschaften zu ungewollten Verände-rungen oder Verlusten wertvoller Substanzenführen. Eine weitere unerwünschte Konsequenzvon Proteinadsorptionsprozessen ist das so ge-nannte Proteinfouling, also die Verunreinigung

von Oberflächen. Solche Ablagerungen könnenim Extremfall zur Folge haben, dass Trenn- oderAnalyseverfahren ab einem bestimmten Gradder Verschmutzung nicht mehr funktionieren.Die Entwicklung von wirksamen bioinertenOberf lächen ist deshalb nach wie vor äußerst

assgenaue AttraktivitätChemisch maßgeschneiderte

Grenzschichten steuern Prozesse Ob wir uns zu einem anderen Menschen hingezogen fühlen oder von ihm abgestoßenwerden, entscheidet sich oft aufgrund des ersten visuellen Eindrucks. Das Gesicht, derKörper, Gestik und Mimik fesseln oder langweilen uns. Oberflächliche Eindrücke. Nichtanders ist das in der Materialwissenschaft. Auch hier entscheiden Oberflächen über dieArt und die Stärke ihrer Wechselwirkungen mit der Umgebung. Bei vielen Anwendungenim Bereich der Lebenswissenschaften müssen solche Wechselwirkungen minimiert werden.Das Ziel sind hier Oberflächen, die nicht zu Verunreinigungen führen und biologischinaktiv sind. Diese Eigenschaften werden auch als non-fouling und bioinert bezeichnet.Für Biomaterialien, die im Kontakt mit Zellen oder Geweben angewendet werden, benötigtman dagegen biokompatible oder bioaktive Oberflächen, welche bestimmte Substanzenbinden, andere jedoch abweisen. Auch Wege zur gesteuerten und starken Bindung vonSubstanzen, zum Beispiel Biomolekülen, an der Oberfläche von Materialien sind von größ-tem Interesse. Hier wird das Ziel verfolgt, affine, für bestimmte Verbindungen geeigneteOberflächen herzustellen, wobei Art und Stärke der Wechselwirkungen gezielt eingestelltwerden sollen.

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Abbildung 1: Affinitätstrennung (hier substanz-spezifische Festphasenextraktion) mitporösen Membranadsorbern.

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wichtig. Andererseits kann man eine Fixierungvon Proteinen an Oberf lächen auch gezielt etwa für die Proteintrennung bei der Herstel-lung von rekombinanten Proteinen für thera-peutische Anwendungen oder bei der Protein-analytik (vor allem für die Proteomforschung)nutzen. Gegenwärtig gibt es in der Proteomanaly-tik eine besonders dynamische Entwicklung.Sie reicht von konventionellen manuellen Ana-lyseverfahren über parallelisierte und zum Teilbereits automatisierte Verfahren im so genann-ten Mikrotiterplattenformat zu noch wesent-lich höher integrierten und damit kleineren Mi-kroarrays, zum Beispiel so genannten BioChips

oder Lab-on-a-Chip-Systemen. Dabei führt dieMiniaturisierung in Kombination mit einer ef-fektiven Signalerzeugung und -erfassung zu einerdrastischen Verringerung des Probenbedarfs so-wie des Analyseaufwands. Solche Mikroarrayssind geeignet für vielfältigste Anwendungen wiedie Identifizierung von Protein-Protein-Wech-selwirkungen, das Screening von Wirkstoffenals potenzielle Arzneimittel sowie diverse diag-nostische Anwendungen. Die Entwicklung vonVerfahren zur Fixierung von Proteinen, Anti-

körpern oder Enzymen auf festen Trägern unterErhalt ihrer biologischen Aktivität ist dabeivon grundsätzlicher Bedeutung. Hierbei wirdeine optimale Balance zwischen bioinerten undaffinen Eigenschaften der Oberf lächen ange-strebt.

Letztlich werden die Wechselwirkungen lebenderZellen oder Gewebe mit so genannten Biomate-rialien ebenfalls entscheidend durch die Art,Menge und biologische Aktivität von an derOberf läche gebundenen Proteinen beeinf lusst.Solche Proteine (zum Beispiel Adhäsionsprotei-ne) können entweder bereits im Kulturmediumvorhanden sein oder aber von den Zellen sekre-tiert werden. Eine rationale Entwicklung vonbiokompatiblen Materialien muss die Strukturvon Proteinen im Kontakt mit Oberf lächendurch eine maßgeschneiderte Grenzflächenstruk-tur berücksichtigen.

Steuerbare WechselwirkungenEine Arbeitsgruppe der Universität Duisburg-Essen um Mathias Ulbricht beschäftigt sich mit

der Herstellung, Beschreibung undpotenziellen Anwendungen von dün-nen funktionalen Polymerschichtenauf diversen Trägermaterialien. ImMittelpunkt stehen die gezielte Ein-stellung der chemischen Zusammen-setzung sowie der molekularen Ar-chitektur in Kombination mit für dasBasismaterial zerstörungsfreien Reak-tionsbedingungen. Letzteres ist insbe-sondere für den Einsatz von porö-sen Trägermaterialien wie zumBeispiel Trennmembranen wesentlich(Abb. 1). Spezielle Entwicklungenführen zu neuartigen Reaktorkon-zepten (Abb. 2). Die Funktiona-lisierungen beruhen meist auf licht-

Abbildung 2: Poröse Enzymmembranenals katalytische Mikroreaktoren.

Abbildung 3: Synthese vonDünnschicht-MIPs durchphotoinitiierte Oberf lächen-funktionalisierung.

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gesteuerten Reaktionen an der Oberf läche derpolymeren oder organisch modifizierten Trä-germaterialien. Dabei besitzen alle funktionalenPolymerschichten typischerweise Dicken imunteren Nanometerbereich.

Besonders spezialisiert sind die Essener Chemikerauf molekular geprägte dünne Schichten (Dünn-

schicht-MIPs), die im Vergleich zu konventionellenMIPs eine Reihe von Vorteilen aufweisen (Abb. 3). Die von der Arbeitsgruppe Ulbrichtentwickelte Synthese von Dünnschicht-MIPsdurch kontrollierte photoinitiierte Oberflächen-funktionalisierung stellt eine bedeutende Erwei-terung der MIP-Technologie dar. Die wichtigsteSchlussfolgerung der bisherigen Arbeiten ist, dassder Träger genutzt werden kann, um die MIP-Synthese zu steuern (Vorordnung) und um dieerhaltenen Dünnschicht-MIP-Rezeptoren zu-sätzlich zu stabilisieren (Fixierung).

Die Charakterisierung der funktionalen Schich-ten erfolgt durch Kombination von speziellenMethoden zur Oberflächenanalytik wie zum Bei-spiel Rasterkraftmikroskopie, Kontaktwinkel- undStrömungspotenzialmessungen sowie Infrarot-und Fluoreszenzspektroskopie. Darüber hinausliefern Immunoassays und die Oberflächenplas-monenresonanz Aussagen darüber, ob das ver-wendete Material zur Fixierung bzw. Erkennungvon Protein geeignet ist. In Kooperation mit an-deren Arbeitsgruppen werden zusätzlich Expe-rimente zum Verhalten der Materialien in Zell-und Gewebekulturen durchgeführt.

Auf der Basis dieser Erkenntnisse kann mit maß-geschneiderten Grenzschichten die Wechselwir-kung der Materialien mit Biomolekülen und

Zellen kontrolliert werden. Je nach Erforderniskann zwischen einer vollständigen Abschirmung(non-fouling / bioinert) und der selektiven Bindungeines Moleküls (affin) oder aber einer optimalenKonditionierung unter Zellkulturbedingungen(biokompatibel / bioaktiv) gewählt werden. Hierzuverfolgt die Arbeitsgruppe derzeit unterschied-liche Strategien (Abb. 4).

Biokompatible GrenzschichtenDie Kontrolle der Grenzflächeneigenschaften vonPolymermaterialien ist von großer Bedeutungfür ihre Biokompatibilität, für ihre komplexenWechselwirkungen mit Proteinen, Zellen undGeweben. Hydrophobe, also wasserabweisendeOberf lächen, ziehen größere Mengen von Pro-teinen an. Die Proteine verändern sich dabeioft, verlieren ihre biologische Aktivität und inder Folge ihre Anziehungskraft auf Zellen imKontakt mit diesen Oberf lächen. Hydrophile,also wasseranziehende und flexible Oberflächen-schichten, können dagegen das Basismaterialsehr gut gegen den direkten Kontakt mit Protei-nen und Zellen abschirmen. Dies hat jedoch denNachteil, dass durch diese Abschirmung keineKontrolle oder Steuerung einer Zell- bzw. Ge-webekultur durch das Trägermaterial möglich ist.

Die Arbeitsgruppe um Mathias Ulbricht verfolgteinen alternativen Weg zur Optimierung derBiokompatibilität hydrophober Materialien: Mangestaltet mit Hilfe von so genannter Pfropfmo-difizierung gezielt molekular heterogene, alsoungleichmäßige Oberf lächen. Als Bausteinewerden hydrophile biokompatible Polymere wiezum Beispiel Polyethylenglykol (PEG) so verän-dert, dass sie eine hydrophobe und gegebenen-

a. Molekular heterogene Oberf lächen,synthetisiert durch kontrollierte Adsorpti-on und anschließende Fixierung amphi-philer (photo)reaktiver und hydrophilerMakromoleküle auf einem hydrophobenpolymeren Träger – Stabilisierung derKonformation adsorbierter Proteinedurch benachbarte hydrophile f lexibleMakromoleküle.

b. Pfropfcopolymerschichten mit mini-maler unspezifischer Proteinbindung,reaktiven Gruppen für die kovalenteFixierung von Proteinen sowie Matrixei-genschaften, welche die Proteinkonforma-tion stabilisieren.

c. Molekular geprägte Schichten für dieErkennung von Proteinen (Protein-Dünnschicht-MIPs) – Nachahmung derhochspezifischen molekularen Erkennungdurch biologische Rezeptoren (zumBeispiel Antikörper) mit Hilfe stabilersynthetischer Polymere.

Abbildung 4: Wege zu chemisch maßge-schneiderten Grenzschichten für die Erken-nung und Fixierung von Proteinen.

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falls auch photoreaktive, auf Licht ansprechendeEndgruppe besitzen. Man erhält also amphiphileMakromoleküle, die zur einen Seite hin hydro-phil, zur anderen hydrophob wirken. Diese kön-nen mit ihrer Kopfgruppe an der hydrophobenOberf läche andocken und bei Verwendung vonphotoreaktivem PEG dort auch reaktiv fixiertwerden. Der Grad der Heterogenität der Ober-f läche (Abb. 5) kann je nach Anforderung angepasst werden. Die hydrophoben Zwischen-räume zwischen den f lexiblen hydrophilen Makromolekülen mit Dimensionen im unte-ren Nanometerbereich bieten Raum für die Adsorption von Proteinmolekülen (Abb. 6),welche somit an der Oberf läche fixiert undgleichzeitig durch die benachbarten Makromo-leküle stabilisiert werden. Auf diese Weise wird

die biologische Aktivität der Proteine erhalten(Abb. 4a).

Für eine Reihe unterschiedlicher Zellartenkonnte bereits gezeigt werden, dass durch eineoptimale PEG-Dichte die Anheftung, die Aus-breitung, das Wachstum und die Vermehrungder Zellen im Vergleich zu hydrophoben odervollständig hydrophilen Oberflächen signifikantverbessert werden kann.

Grenzschichtstrukturen aus dem Baukasten

Mit einer so genannten kontrollierten photoiniti-

ierten Pfropfcopolymerisation kann man schwerfunktionalisierbare Polymere wie zum BeispielPolystyrol oder Polypropylen, die als Trägerma-terial dienen, kovalent modifizieren. Bei diesemVerfahren wird die Kettenstruktur des Polymerssehr gezielt aus unterschiedlichen Monomerenaufgebaut. Der entscheidende Vorteil dieser Be-schichtungstechnologie ist ihre Vielseitigkeitunter schonenden Bedingungen. Durch die Aus-wahl der Monomere (zum Beispiel funktionelleAcrylate oder Acrylamide) und der weiteren Re-aktionsparameter können nach einem Baukasten-

prinzip verschiedene Schichtzusammensetzungenbzw. -morphologien, funktionelle Gruppen undderen Konzentration, Hydrophilie, etc. sowiePfropfkettenlänge und -dichte eingestellt werden.Diese Beschichtungen können dann auch aufkommerzielle Basismaterialien wie zum BeispielMikrotiterplatten übertragen werden (Abb. 7).

Aktuell stehen die speziellen Anforderungen ansolche dünnen Polymerschichten für die Fixie-rung empfindlicher Proteine im Zentrum der

Abbildung 5: Molekular heterogene Modifizierung der Oberf läche von Polystyrol mit einem photoreaktiven Polyethylen-glykol (ABMPEG, ca. 5000 g/mol): Dynamische Kontaktwinkelmessungen zeigen die Heterogenität der Oberf läche(Hysterese = Differenz zwischen Fortschreit- und Rückzugswinkel) in Abhängigkeit von der Wahl der ABMPEG-Konzen-tration in Lösung.

Abbildung 6: Molekular heterogene Modifizierung der Oberf läche vonPolystyrol mit einem photoreaktiven Polyethylenglykol (ABMPEG, ca. 5000g/mol): Messungen der Oberf lächenplasmonenresonanz zeigen die systema-tische Abnahme der adsorbierten Proteinmenge (Rinderserumalbumin, BSA,pH = 7) in Abhängigkeit von der Wahl der ABMPEG-Konzentration inLösung.

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Forschungsarbeiten in Essen. Ziel ist eine drei-dimensionale Schichtstruktur mit Größen imunteren Nanometerbereich, welche eine hoheFlexibilität, geringe unspezifische Wechselwir-kungen, aber auch die Fähigkeit zur Stabilisierungfixierter Proteine aufweisen soll. Diese besonde-ren Eigenschaften werden durch eine Kombinati-on von synthetischen Monomer- und Polymer-bausteinen mit natürlichen oder Biopolymerenwie zum Beispiel Dextran, Zellulose oder Agaro-se erreicht. Die reaktiven Gruppen in den funk-tionalen Polymerschichten bieten vielfältige Mög-lichkeiten zur Immobilisierung von Proteinen(Enzymen, Antikörpern) über variable kova-lente Methoden (Amino-, Thio-, Carboxy- oderAldehydgruppen; Abb. 8 und Abb. 4b).

Vorläufige Ergebnisse zeigen weiterhin, dass nacheinem Verfahren zur Synthese von Dünnschicht-MIPs analog zu Abbildung 3 mit einem Modell-protein (Lysozym) als Templat auch MIP-Rezep-toren für Proteine erhalten werden können. DieseProtein-Dünnschicht-MIPs haben eine höhereProteinaffinität als das Basismaterial und Kon-trollmaterialien, welche ohne Protein präpariertwurden, sowie eine deutlich größere Affinität fürdas Templat im Vergleich zu anderen Proteinen,das heißt sie können ähnlich wie ein Antikörperdas Zielprotein molekular erkennen (Abb. 4c).

Abbildung 7: Pfropfpolyacrylsäure-funktionalisierte 96-Well Mikrotiterplatte aus Polypropylen: Die Färbungmit einem carboxyl-reaktivem Farbstoff zeigt die hoheund sehr gleichmäßige Bindungskapazität der Oberf lä-che in jedem Well (ELIPSA GmbH, Berlin).

Ko n t a k tProf. Dr. Mathias UlbrichtDipl.-Chem. Melvy G. Chuquimia-BeltranDipl.-Chem.-Ing. Dimitrios Lazos

Institut für Technische Chemie II

Tel. 02 01/1 83-31 51 oder -31 44 (Sekretariat)

Fax: 02 01/1 83-31 47

mathias.ulbricht@uni-essen.dehttp://www.uni-essen.de/tech2chem/

Abbildung 8: Biofunktionalisierung derOberf läche von Polystyrol:

Durch Variation der Monomerkonzentra-tion (hier Acrylsäure) können Funktional-gruppenmenge und Morphologie derfunktionalisierten Schicht gezielt maßge-schneidert werden, wobei wahlweise eineTentakel- oder Bürsten-Struktur erhaltenwird.

Dadurch wird die Bindungskapazität fürdie kovalente Fixierung von Protein (hierRinderserumalbumin, BSA, pH = 7)gezielt angepasst.

Anschließende Untersuchungen mitELISA (Enzym-Linked ImmunoadsorbentAssay) zeigen die Zugänglichkeit desimmobilisierten Proteins für primäre undsekundäre Antikörper: Sie ist wesentlichbesser für die offene, f lexible Tentakel- imVergleich zur kompakten Bürsten-Struktur.