Aus dem Institut für Transfusionsmedizin der Universität Ulm

(Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Hubert Schrezenmeier)

Auswirkungen von Minor

Histokompatibilitätsantigen Mismatchen auf

die unverwandte, allogene hämatopoetische

Stammzelltransplantation

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

der medizinischen Fakultät Ulm

der

Universität Ulm

vorgelegt von

Kirsten Recker

geboren in Eupen

2012

Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Hubert Schrezenmeier

2. Berichterstatter: Prof. Dr. Donald Bunjes

Tag der Promotion: 11. Januar 2013

I

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................. I

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................... III

1. EINLEITUNG .................................................................................................................. 1

1.1 Das HLA-System ........................................................................................................... 1

1.2 Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ........................... 5

1.3 Minor Histokompatibilitätsantigene .......................................................................... 15

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit ............................................................................................ 31

2. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................. 32

2.1 Material ........................................................................................................................ 32

2.2 Methoden ...................................................................................................................... 38

3. RESULTATE ................................................................................................................. 53

3.1 Validierung des Testkits .............................................................................................. 53

3.2 Allel- und Genotypverteilung der untersuchten mHag ........................................... 54

3.3 Verteilung der HLA-Merkmale in der untersuchten Kohorte ................................ 59

3.4 Bestimmung der Einflussfaktoren und Zielgrößen für die Subgruppenanalyse ... 60

3.5 Quantitative Ergebnisse des Gesamtkollektivs ......................................................... 62

3.6 Statistische Auswertung der Einflussfaktoren .......................................................... 63

3.7 Statistische Auswertung der mHag ............................................................................ 68

4. DISKUSSION ................................................................................................................ 90

II

4.1 Validierung des Testverfahrens ................................................................................. 91

4.2 Etablierte Risikofaktoren einer Stammzelltransplantation und deren

Auswirkungen auf die klinischen Endpunkte nach allogener, unverwandter HSCT . 92

4.3 Einfluss der untersuchten mHag auf die klinischen Endpunkte nach allogener,

unverwandter HSCT ......................................................................................................... 99

4.4 Statistische Auswertung und Interpretation der Ergebnisse ................................ 107

4.5 Auswirkungen von mHag-Mismatchen auf die allogene HSCT: Stand der

Forschung und Ausblick ................................................................................................. 109

5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 115

6. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................... 117

Danksagung ...................................................................................................................... 137

Lebenslauf ........................................................................................................................ 138

III

Abkürzungsverzeichnis

AGIHO Arbeitsgemeinschaft Infektionen in der Hämatologie und Onkologie

aGvHD akute Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (engl.: acute Graft-versus-

host-disease)

ALL akute lymphatische Leukämie

Allo-HSCT allogene hämatopoetische Stamzelltransplantation (engl.: allogeneic

hematopoietic stem cell transplantation)

AML akute myeloische Leukämie

AP akzelerierte Phase (engl.: accelerated phase); Stadium einer chronischen

Leukämie

APC Antigenpräsentierende Zelle (engl.: antigenpresenting cell)

Aqua dest. destilliertes Wasser

AS Aminosäure

ATG Antithymozytenglobulin

B-ALL akute lymphoblastische Leukämie, ausgelöst durch B-Zellen

BC Blastenkrise (engl.: blast crisis); Stadium einer chronischen Leukämie

BCL2A1-Gen Gen, welches für das B-Cell Lymphoma 2 related protein A1 kodiert

B-CLL chronisch lymphatische Leukämie, ausglöst durch B-Zellen

BEAM BiCNU (Carmustine), Etoposid, Arabinosid (Cytarabin), Melphalan;

Hochdosischemotherapieschema

BMDW weltweites Register für Stammzellspender (engl: Bone Marrow Donors

Worldwide)

bp Basenpaare (engl.: base pairs)

C Cystein (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

C2, C4a und b Komplementfaktoren 2, 4a und 4b

CD immunphänotypische Oberflächenmerkmale von Zellen, meistens

Glykoproteine, die eine Einteilung von Zellen in bestimmte Gruppen

zulassen (engl.: Cluster of differentiation); die Merkmale werden je nach

Gruppe nummeriert, z.B. CD3, CD4, CD8, CD22, CD34

CDL Ligand für Zelloberflächenmoleküle vom CD-Typ, z.B. CD40L, CD62L

CD19+-B-Zelle B-Zelle, auf deren Oberfläche CD19 exprimiert wird

CD8+-T-Zelle T-Zelle, die auf ihrer Oberfläche den Marker CD8 exprimiert

IV

Cen Zentromer (engl.: Centromer)

cGvHD chronische Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (engl.: chronic graft-

versus-host disease)

cGy CentiGray; Einheit für pro Masse absorbierte Strahlungsenergie

CI Konfidenzintervall; 95%CI: geschätzter Bereich in dem 95% aller

möglichen Werte des untersuchten Parameters liegen

CIBMTR internationale Forschungseinrichtung für Stammzell- und

Knochenmarktransplantation (engl: Center for International Blood and

Marrow Transplant Research)

CLL chronisch lymphatische Leukämie

CML chronisch myeloische Leukämie

CMV Zytomegalievirus (engl.: cytomegalovirus)

CP chronische Phase (engl.: chronic phase); Stadium einer chronischen

Leukämie; 1CP: erste chronische Phase, 2CP: zweite chronische Phase

usw.

CR komplette Remission (engl.: complete remission); 1CR: erste komplette

Remission, 2CR: zweite komplette Remission usw.

CRP C-reaktives Protein

CsA Cyclosporin A

CTL zytotoxische T-Lymphozyten (engl.: cytotoxic T- lymphocytes)

CTS gemeinsame Transplantationsstudie (engl.: Collaborative Transplant

Study); Internationale Studie im Bereich Transplantation

Cy Cyclophosphamid

D Asparaginsäure (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

dbSNP Datenbank für Punktmutationen (siehe auch: SNP), engl.: database SNP;

allgemeinzugängliche Datenbank, in der jede einfache genetische

Mutation gesammelt und mit einer charakteristischen Bezeichnung

versehen wird

Df Freiheitsgrad (engl.: degree of freedom), Zahl der frei wählbaren,

voneinander unabhängigen Parameter eines Systems beim statistischen

Test

DFS krankheitsfreies Überleben (engl.: disease free survival)

dl Deziliter

DLI Donorlymphozyteninfusionen

V

DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic acid)

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

DRST Deutsches Register für Stammzelltransplantationen

EBMT europäische Gesellschaft für Blut- und Knochenmarktransplantation

(engl.: European Group for Blood and Marrow Transplantation)

EBV Eppstein-Barr-Virus

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (engl.: ethylenediaminetetraacetic acid)

ER endoplasmatisches Retikulum

evtl. eventuell

F Phenylalanin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

Flu/Melph Fludarabin und Melphalan

Flu/Cy Fludarabin undCyclophosphamid

G Glycin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

GIT Gastrointestinaltrakt

GlyCAM-1 glykosilierungsabhängiges Zelladhäsionsmolekül 1(engl.: glycosylation-

dependent cell adhesion molecule 1), Ligand für CD62L/LECAM-

1/SELL

GNU project GNU’s Not Unix projekt, Projekt zur Entwicklung eines vollständig

freien Betriebssystems (GNU)

GvH Transplantat-gegen-Wirt (engl.: graft-versus-host)

GvHD Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (engl.: graft-versus-host-disease)

GvL Transplantat-gegen-Leukämie (engl.: graft-versus-Leukemia)

GvT Transplantat-gegen-Tumor (engl.: graft-versus-Tumor)

H Histidin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

HHV-6 humanes Herpesvirus 6

HL Hodgkin-Lymphom

HLA humanes Leukozytenantigen

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: high performance

liquid chromatography)

HR Risikoquotient (engl.: hazard ratio); gibt das Verhältnis der jeweiligen

Risiko des Auftretens eines Ereignisses zwischen zwei betrachteten

Gruppen

HSC hämatopoetische Stammzelle (engl.: hematopoietic stem cell)

VI

HSCT hämatopoetische Stammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stem

cell transplantation)

HSP-70 Hitzeschockprotein 70

HSV Herpes simplex Virus

HvG Wirt-gegen-Transplantat (engl.: host-versus-graft)

HWE Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (engl.: Hardy-Weinberg-Equilibrium)

IFN-γ Interferon gamma

iPN idiopathische Pneumonie

ITIM inhibitorische, immunrezeptorähnliche tyrosinbasierte Motive (engl.:

immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs)

IUB internationale Union der Biochemie (engl.: International Union of

Biochemistry)

IUPAC internationale Union der reinen und angewandten Chemie (engl.:

International Union of Pure and Applied Chemistry)

KIR Killerzell-Immunoglobulinähnlicher Rezeptor (engl.: killer cell

immunoglobuline-like receptor); immunglobulinähnlicher Rezeptor, der

auf natürlichen Killerzellen exprimiert wird

KM Knochenmark

KMT Knochenmarktransplantation

KOF Körperoberfläche

l Liter

L Leucin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

Lbc Oncogen lymphoides Blastenkrisenonkogen (engl.: lymphoid blast crisis oncogen)

LECAM-1 Leukozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (engl.: leucocyte

endothelial cell adhesion molecule 1); Membranglykoprotein, welches

als Zelladhäsionsmolekül dient (syn.: CD62L, L-Selectin oder SELL)

LMP1 und 2 latentes Membranprotein 1 und 2 (engl.: latent membrane proteine 1 and

2); zytoplasmatische Peptidpumpe

M Methionin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

MAC myeloablative Konditionierung (engl.: myeloablative conditioning

regimen)

MadCAM-1 mukosales vaskuläres Addressin Zelladhäsionsmolekül-1 (engl.: mucosal

vascular addressin cell adhesion molecule-1); Ligand für

CD62L/LECAM-1/SELL

VII

MAGE-3 Melanomassoziiertes Antigen-3 (engl.: melanoma-associated antigen 3)

MDA multiple Dislokationsamplifizierung (engl.: Multiple displacement

amplification); Art der ganzgenomischen Vervielfältigung

MDS myelodysplastisches Syndrom

MESNA 2-Mercaptoethansulfonat-Natrium

mg Milligramm

mHag Minor Histokompatibilitätsantigen (engl.: minor histocompatibility

antigen)

MHC Majorhistokompatibilitätskomplex (engl.: major histocompatibility

complex)

min Minuten

ml Milliliter

l Mikroliter

MM Mismatch

MMF Mycophenolatmofetil

MTX Methotrexat

MUD Fremdspender (engl.: matched unrelated donor)

MYO1G Myosin 1 Gen; Gen für das unkonventionelle Myosin der Klasse I

N Asparagin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

ng Nanogramm

NHL Non-Hodgkin-Lymphom

NK-Zellen natürliche Killerzellen

NRM Tod, der nicht durch einen Krankheitsrückfall / -progress verursacht

wurde (engl.: Non relapse mortality), ist in dieser Arbeit TRM

gleichgesetzt

OS Gesamtüberleben (engl.: overall survival)

P Prolin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

P antigenes Peptid (Kapitel 1.1.3, Abbildung 3)

PANE 1 Proliferationsassoziiertes nukleares Element 1 (engl.: proliferation

associated nuclear element 1); auch Bezeichnung für das gleichnamige

mHag

PASW Predictive Analysis Software; zwischenzeitliche Bezeichnung für SPSS

zwischen 2009 und 2010 (siehe auch SPSS)

Pat. Patient(en)

VIII

PBSZ periphere Blutstammzellen

PCR Polymerasekettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction)

PCR-SSP Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern

PCR-SSO Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Oligonukleotiden

PECAM-1 Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (engl.: platelet

endothelial cell adhesion molecule 1); Membranglykoprotein, welches

als Zelladhäsionsmolekül dient (syn.: CD31)

Pers. Person

Phi29 (φ29) Phage phi29 des Bacillus subtilis

Pos Position

Post-tx nach Transplantation

p-Wert Signifikanzwert (engl.: p für probability); Kennzahl zur Auswertung

statistischer Tests

R Arginin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

Rel Krankheitsrückfall (engl.: relapse), rel1: erster relapse, >1rel:

nächstfolgender relapse

RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (engl.: restriction fragment

length polymorphism); Genotypisierungsverfahren mit allelspezifischen

Restriktionsendonukleasen

RIC reduzierte Konditionierung (engl.: reduced intensity conditioning

regimen)

RSCA Referenzstrangkonformationsanalyse (engl.: reference strand

conformational analysis); Genotypisierungsverfahren mit Hilfe natürlich

vorkommender Bezugsallele

S Serin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

SAA schwere aplastische Anämie

SCID angeborener schwerer kombinierter Immundefekt (engl.: severe

combined immunodeficiency); charakterisiert durch Mangel oder

Fehlfunktion von T-Zellen

sec Sekunde

SELL Selectin L (engl.: selectin L); siehe LECAM-1

SNP Punktmutation (engl.: single nucleotid polymorphism); einzelner

Basenaustausch auf DNA-Ebene

IX

SPSS Statistical Package for the Social Sciences, Statistikanalysesoftware von

IBM

T Threonin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

TAP1 und 2 Transporter der Antigenprozessierung 1 und 2 (engl.: transporter of

antigen processing); zytoplasmatische Peptidpumpe

Taq Thermus aquaticus

TBI Ganzkörperbestrahlung (engl.: total body irradiation), low dose TBI:

niedrigdosierte Ganzkörperbestrahlung

TBI/Cy Ganzkörperbestrahlung (engl.: total body irradiation) und

Cyclophosphamid

TCR T-Zell-Rezeptor (engl.: T-cell receptor)

Tel Telomer

TH1 T-Helferzellen Subpopulation 1

TNF- α und –β Tumornekrosefaktor-α und Tumornekrosefaktor–β

TRM Tod durch transplantationsbedingte Komplikationen (engl.: Transplant

related mortality), ist in dieser Arbeit NRM gleichgesetzt

Tx Transplantation

UGT2B17 Uridindiphosphat-Glycosyltransferase-Gen 2B17 (auch Bezeichnung für

das gleichnamige mHag)

US Vereinigte Staaten von Amerika (engl.: United States of America)

UV ultraviolett

V Valin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

VOD Venookklusive Lebererkrankung (engl.: veno-occlusive disease of liver)

VZV Varizella-Zoster-Virus

χ2 Prüfgröße des Chi-Quadrat-Anpassungstests zur Prüfung der Verteilung

von Daten

Y Tyrosin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)

ZAP 70 Zetakette-assoziierte Proteinkinase 70 (engl. Zeta-chain-associated

protein kinase 70); zum T-Zell-Rezeptor zugehöriges Protein, welches

eine Rolle bei der Signalübertragung spielt

1

1. Einleitung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist für maligne

Erkrankungen des hämatopoetischen Systems die meist einzig kurative Therapie. Für die

heutzutage über 50.000 transplantierten Patienten jährlich (Gratwohl et al, 2010) stehen

weltweit über 18 Millionen Fremdspender in Spenderregistern (BMDW, 03. April 2012)

zur Verfügung. Der Erfolg einer HSCT ist jedoch durch eine hohe Komplikationsrate

limitiert (siehe hierzu Kapitel 1.2, Abschnitt 3). Trotz großer Fortschritte durch

Entwicklung neuer, individueller Behandlungsschemata, Verbesserung der

Konditionierungsregimes, Entwicklung neuer, besser verträglicherer Immunsuppressiva

und Antibiotikaprophylaxen sterben immer noch zwischen 30% und 40% der allogen

transplantierten Patienten innerhalb des ersten Jahres nach ihrer Transplantation (Pasquini

and Wang, 2011). Hauptsächlich sind hierfür ein früher Rückfall der Grunderkrankung und

transplantationsbedingte Komplikationen verantwortlich. Eine weitere große Rolle spielen

immunogen vermittelte Reaktionen wie die Graft-versus-Host (GvH)-Reaktion, bei der

immunkompetente Spender-T-Zellen gesundes Gewebe des Patienten angreifen. Die

Hauptursache der GvH liegt in Gewebsantigendifferenzen zwischen Patient und Spender.

Das hierfür verantwortliche Gensystem, für das man schon vor über 70 Jahren Hinweise

gefunden hat (Gorer, 1936) und das heutzutage bei allen untersuchten Säugetieren

gefunden wurde (Götze, 1977), bezeichnet man generell als

„Haupthistokompatibilitätskomplex“ (engl: major histocompatibility complex, MHC) und

speziell bei Menschen als „HLA-System“ (humanes Leukozytenantigensystem).

1.1 Das HLA-System

1.1.1 Entdeckung, Rolle und Genetik des HLA-Systems

Die Entdeckung des HLA-Systems durch Professor Dausset im Jahre 1958 (Dausset, 1958)

resultierte aus Untersuchungen zur Gewebetransplantation. Transplantiert man Gewebe

von einem Individuum auf ein genetisch nicht identisches Individuum derselben Spezies,

wird das Transplantat als immunologisch fremd erkannt und zerstört. Die Ausprägung

2

dieser immunologischen Abstoßungsreaktion hängt im Wesentlichen davon ab, inwieweit

sich Spender und Empfänger in ihren Transplantationsantigenen unterscheiden. So wird

dem HLA-System eine zentrale Rolle in der „Selbst“- und „Fremd“-Erkennung

zugesprochen, und dies sowohl bei der Prägung des Immunsystems als auch im Rahmen

der spezifischen zellulären Immunantwort als Antigen-präsentierendes Molekül, das nach

intrazellulärer Prozessierung fremde (allogene) wie auch körpereigene (autologe)

Proteinantigene exprimiert. Darauf gründet sich nun die zentrale Bedeutung des HLA-

Systems für die Übertragung von Zellen, Geweben und Organen.

Die Gene des HLA-Komplexes sind auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert

(6p21.1-6p21.3) und umfassen in etwa den Bereich von 3500 Kilobasenpaaren. Innerhalb

dieses Bereiches werden drei verschiedene Regionen unterschieden: Auf der telomernahen

Seite des Komplexes liegt die Region der HLA-Klasse I-Gene (HLA-A bis F), daran

schließt sich zentromerwärts die historisch als Klasse III bezeichnete Region an. In diesen

Bereich gehören außer z. B. den Komplementfaktoren C2, Faktor B, C4a und b unter

anderem auch die Gene für den Tumornekrosefaktor (TNF-α und β) und das

Hitzeschockprotein (HSP-70). Somit stellt Klasse III einen heterogenen Bereich dar, der

Gene enthält, die weder HLA-Klasse I noch Klasse II zugerechnet werden können.

Auf der dem Zentromer zugewandten Seite des Komplexes liegt der HLA-Klasse II-Genort

(HLA-DP bis DR), der zusätzlich auch Gene für die intrazelluläre Antigenprozessierung

und den Transport prozessierter Antigene (TAP1/TAP2 und LMP1/LMP2) enthält (siehe

hierzu Abbildung 1).

Abbildung 1: Genetische Organisation des HLA-Systems; Tel: Telomer, Cen: Zentromer

(Quelle: Mehra and Kaur, 2003)

3

1.1.2 Struktur und Funktion der HLA-Antigene

HLA-Klasse I- und II-Moleküle unterscheiden sich durch ihren unterschiedlichen

molekularen Aufbau, ihre Expression in unterschiedlichen Geweben sowie

unterschiedlichen Antigenpräsentationswegen und den damit verbundenen

unterschiedlichen Funktionen voneinander (siehe hierzu Abbildung 2).

Abbildung 2: Struktur der HLA-Klasse I- und II-Moleküle, CD: cluster of differentiation

(Membranproteine), N: aminoterminales Ende, α1 bis α3: α-Kette, β2m: β2-Mikroglobulin,

β1 und β2: β-Kette (Quelle:Waßmuth, 2005a)

HLA-Klasse I-Moleküle bestehen aus einer schweren, membranverankerten α-Kette mit

drei Domänen (α1 bis α3), die mit einer leichten β-Kette (β2-Mikroglobulin) nicht kovalent

verknüpft ist (Nakamuro et al, 1973; siehe hierzu auch Abbildung 2). Das β2-

Mikroglobulin-Molekül kartiert auf Chromosom 15q22 und weist keine Polymorphismen

auf (Cunningham and Berggård, 1974). HLA-Klasse I-Moleküle werden auf fast allen

kernhaltigen Zellen exprimiert.

Dagegen werden HLA-Klasse II-Moleküle bevorzugt auf antigenpräsentierenden Zellen,

wie B-Lymphozyten, aktivierten T-Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten oder

dendritischen Zellen exprimiert (Shackelford et al, 1982). Sie setzen sich aus einer

schweren α- und einer leichten β-Kette mit den Domänen α1 und α2 bzw. β1 und β2

zusammen (siehe hierzu Abbildung 2). Beide nicht kovalent miteinander verbundenen

Ketten sind membranverankert (Snary et al, 1977).

4

Die hochpolymorphe Antigenbindungsstelle, die beim HLA-Klasse I-Molekül durch die

α1- und α2-Domänen gebildet wird, stellt hierbei den funktionell wichtigsten Teil des HLA-

Moleküls dar. Kristallographische Analysen haben gezeigt, dass HLA-Moleküle an dieser

dem T-Zell-Rezeptor (TCR) zugewandten Seite eine Vertiefung ausbilden, die sogenannte

Antigenbindungsfurche (Bjorkman et al, 1987a und 1987b), die es vermag, Peptide bis zu

einer Länge von 11 Aminosäuren (AS) aufzunehmen. Außerdem existieren im Bereich der

Antigenbindungsstelle sogenannte Taschen, welche die Seitenketten der AS der antigenen

Peptide aufnehmen können. Typischerweise besitzt ein HLA-Klasse I-Molekül sechs mit A

bis F bezeichnete Taschen. Wenn die Aminosäureseitenketten mit den jeweiligen Taschen

zusammenpassen, wird die Antigenbindung stabilisiert. Die Bindungsmöglichkeit der

Peptide ist daher durch eine HLA-abhängige Aminosäurebevorzugung, besonders an den

Positionen P2 und P9, limitiert. Diese Positionen werden daher auch als Ankerpositionen

bezeichnet.

Anhand dieser durch die Ankerpositionen gegebenen Peptid-Bindungsspezifitäten kann

man einen Großteil aller humanen HLA-A und –B- Moleküle in HLA-Supertypen einteilen

(Sidney et al, 1996): den HLA-A3-Supertyp mit A*03:01, A*11:01, A*31:01, A*33:01,

A*34:01, A*66:01, A*68:01 und A*74:01, den HLA-B7-Supertyp mit B*07:02-05,

B*35:01-03, B*51:01-05, B*53:01, B*54:01, B*55:01-02, B*56:01, B*67:01 und B*78:01

sowie schließlich den HLA-B44-Supertyp mit den Allelen B*37, B*40(60), B*40(61),

B*41, B*44, B*45, B*47, B*49 und B*50.

1.1.3 Die HLA-abhängige Antigenpräsentation

Die eigentliche Antigenerkennung erfolgt durch den Komplex aus HLA-Molekül,

prozessiertem Antigen, welches an das HLA-Molekül gebunden ist, und dem T-Zell-

Rezeptor (TCR).

Der auf die Antigenerkennung spezialisierte TCR kann das ihm dargebotene antigene

Peptid nur im Zusammenhang mit einem HLA-Molekül erkennen, was als MHC (oder

HLA) –Restriktion bezeichnet wird (Zinkernagel and Doherty, 1974). Gleichzeitig können

T-Lymphozyten durch den TCR nicht nur das präsentierte Antigen, sondern auch zwischen

„eigenen“ oder „fremden“ HLA-Molekülen unterscheiden (Garcia et al, 1998). Der HLA-

TCR-Komplex wird ergänzt durch auf den T-Lymphozyten liegende Glykoproteine und

die Oberflächenmarker CD4 bzw. CD8: CD4-positive Lymphozyten (z. B. die klassichen

TH1-Helferzellen) erkennen gebundene Peptide im Komplex mit HLA-Klasse II–

5

Molekülen. CD8-positive, zytotoxische Lymphozyten (CTL’s) hingegen erkennen die

antigenen Peptide nur im Zusammenhang mit HLA-Klasse I–Molekülen (Allison and

Lanier, 1987), siehe hierzu Abbildung 3.

Abbildung 3: Interaktion von HLA-Klasse I-und II-Molekülen mit dem TCR (HLA-TCR-

Komplex), P: antigenes Peptid ; TCR: T-Zell-Rezeptor, α1 bis α3: α-Ketten, β2-m: β-

Mikroglobulin,β1 und β2: β-Kette, CD4-CD8: Oberflächenmarker der T-Zellen (Quelle:

Waßmuth, 2005b)

Peptide, die von HLA-Klasse I-Molekülen präsentiert werden, entstammen größtenteils

von intrazellulären, zumeist zytoplasmatischen oder nukleären Proteinen, die innerhalb der

Zelle synthetisiert wurden. HLA-Klasse II-Moleküle dagegen präsentieren Peptide, die

durch Degradation im Phagolysosom entstanden sind; diese können sowohl exogener wie

auch endogener Herkunft sein.

1.2 Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT)

Die erste Transplantation allogener hämatopoetischer Stammzellen nach Hochdosis-

Chemotherapie bei einem Patienten mit maligner hämatologischer Erkrankung wurde 1957

6

durch (Thomas et al, 1957) durchgeführt. Mit der Entdeckung des HLA-Komplexes ein

Jahr später wurde eine geeignete Auswahl von Spendern, die in ihren HLA-Antigenen

weitgehend mit den HLA-Antigenen des Empfängers übereinstimmen („Matching“),

möglich. Die Anzahl Transplantierter steigt bis zur heutigen Zeit durch Verbesserung der

medizinischen Bedingungen an.

1.2.1 Indikationen für eine allogene HSCT

Eine HSCT ist bei vielen malignen hämotologischen Erkrankungen sowie auch bei einigen

gutartigen Störungen der Hämatopoese angezeigt.

Etablierte Indikationen für eine HSCT unter den malignen Erkrankungen sind akute

Leukämien (akute myeloische Leukämie - AML - und akute lymphatische Leukämie -

ALL). Bei einer akuten Hochrisikoleukämie ist eine allogene HSCT sogar schon in der

ersten kompletten Remission (1CR) indiziert, da eine Transplantation in fortgeschrittenen

Krankheitsstadien zusätzlich zum Risiko des Krankheitsrückfalls (Relapse) auch das

Risiko für transplantationsbedingte Komplikationen (Aschan, 2006) erhöht.

Auch für die chronisch myeloische Leukämie (CML) ist eine HSCT trotz der Einführung

der Tyrosinkinaseinhibitoren wie Imatinib (Glivec) bis heute die einzig kurative Therapie.

Meistens werden jedoch jüngere Patienten mit niedrigerer vorhersagbarer

transplantationsbedingter Mortalität (TRM/NRM) oder Patienten nach Versagen der First-

Line-Therapie mit Imatinib transplantiert. Besonders letzteres Kriterium verschiebt die

Patienten, die für eine Transplantation in Frage kommen, in die Gruppe derer mit

fortgeschrittener, resistenter oder genetisch komplexer Erkrankung.

Die einzige Therapie mit kurativem Potential bleibt die HSCT auch für das

myelodysplastische Syndrom (MDS). Abhängig vom Krankheitsstatus vor HSCT können

zwischen 30% und 70% der Patienten auf lange Dauer geheilt werden (Bartenstein and

Deeg, 2010). Dabei sind die Transplantationserfolge bei Patienten in weniger

fortgeschrittenen Stadien, jüngeren Patienten, sowie früh Transplantierten höher als bei

Patienten mit weit fortgeschrittenen Stadien (Appelbaum, 2003).

Auch bei jüngeren, ausgewählten Patienten mit multiplem Myelom/Plasmozytom ist eine

allogene Stammzelltransplantation möglich (Costa et al, 2009), sollte aber nur im Rahmen

von klinischen Studien angewendet werden, da sie nicht unbedingt Vorteile zur autologen

HSCT - dem bisherigen Gold-Standard - bietet (Kuruvilla et al, 2007).

7

Der Großteil (85%) der Patienten mit Hodgkin-Lymphomen (HL) und 40-50% der

Patienten mit hochmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) können nach klassischer

Chemotherapie lange Zeit überleben (Hart and Peggs, 2007). Eine allogene Transplantation

ist Patienten vorbehalten, die nach autologer HSCT (Gold-Standard für primär refraktäre

oder zurückkehrende Lymphome) einen erneuten Rückfall erleiden.

Bei den bisher unheilbaren niedrigmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen verspricht eine

Transplantation nach reduzierter Konditionierungstherapie (RIC) durch eine niedrige

TRM/NRM (11% in 3 Jahren), gutes progressionsfreies Überleben und gutes Ansprechen

auf Donorlymphozyteninfusionen (DLI) bisher sehr viel, Ergebnisse zu

Langzeitergebnissen stehen aber noch aus (Morris et al, 2004). So werden Patienten mit

chronisch lymphatischer Leukämie (CLL), die zu den niedrigmalignen B-Zell-NHL gehört,

nur bei vorhandenen Hochrisiko-Indikatoren wie Chemotherapeutikaresistenz (besonders

Purinanaloga), ZAP 70 Expression oder Deletionen (17p13 oder 11q23) transplantiert.

Zu den durch HSCT heilbaren, nicht malignen Erkrankungen des hämatopoetischen

Systems zählen neben der schweren, aplastischen Anämie (SAA) auch verschiedene

Hämoglobinopathien (z. B. homozygote Form der β-Thalassämie) sowie angeborene

Immundefekte (z. B. SCID, Osteopetrose).

1.2.2 Vorbereitungen zur allogenen HSCT

1.2.2.1 Spenderauswahlkriterien

Die wichtigste Rolle für eine erfolgreiche Stammzelltransplantation spielt die

immunologische Gewebekompatibilität zwischen dem Patienten und seinem Spender.

Der immunologisch ideale Spender ist somit ein eineiiger Zwilling. Eine Allo-HSCT

zwischen eineiigen Zwillingen (syngene Transplantation) ist jedoch mit einer erhöhten

Rückfallrate verbunden (Horowitz et al, 1990), was die Vermutung, dass ein genetisch

komplett identer Spender auch der beste wäre, fraglich erscheinen lässt. Eine angestrebte

Transplantation ist die mit einem komplett HLA-identen Geschwister, da bei einer solchen

Konstellation mit hoher Wahrscheinlichkeit neben den HLA-Merkmalen auch andere

(bisher nicht regelmäßig untersuchte) Gewebsmerkmale, die auf dem gleichen Chromosom

vererbt werden, identisch wären. Bisher werden für ca. 30% aller Patienten HLA-idente

Geschwisterspender gefunden, da jedoch in vielen Ländern der westlichen Welt die

Geburtenrate zurück geht, sinkt diese Wahrscheinlichkeit. Dies und auch die Tatsache,

8

dass spezifische HLA-Kombinationen nur in bestimmten ethnischen Gruppen vorkommen,

unterstreicht die Wichtigkeit von Fremdspenderregistern, die weltweit versuchen,

möglichst viele Spender zu typisieren und aufzunehmen.

Wünschenswert ist ein sogenanntes 10/10 Match, d. h. ein in beiden Allelen eines jeden

HLA-Locus (HLA-A, B, C, DR und DQ) übereinstimmender Spender. Mit der Anzahl der

HLA-Mismatche steigt das Risiko für Abstoßung und GvHD (Petersdorf and Malkki,

2005). Dank der heutzutage existierenden genaueren, molekulargenetischen

Gewebetypisierungsmethoden und folglich besserem Matchinggrad sind die Ergebnisse

nach unverwandter HSCT mittlerweile fast genauso gut, wie nach HSCT mit HLA-identen

Familienspendern (Ringdén et al, 2004). Sind mehrere in den HLA-Merkmalen komplett

mit dem Patienten übereinstimmende Spender vorhanden, gibt es zusätzliche Kriterien zur

Auswahl.

Da bei einer Transplantation mit weiblichen Stammzellen ein erhöhtes GvHD-Risiko

besteht, sollte für einen männlichen Patienten möglichst kein weiblicher Spender gewählt

werden (Ottinger et al, 2005). Auch das Spenderalter zeigt Effekte auf das

Gesamtüberleben nach HSCT: Somit überleben Patienten mit jüngeren Spendern (18-30

Jahre) signifikant besser und haben eine niedrigere GvHD-Inzidenz (Kollman et al, 2001).

Genauso wie für die HLA-Merkmale wird für den CMV(Zytomegalievirus)-Status ein

Matching angestrebt um Neu- oder Reinfektionen im Stadium der Neutropenie zu

verhindern. CMV-seronegative Patienten sollten möglichst mit CMV-seronegativen

Spendern transplantiert werden, CMV-seropositive Patienten mit CMV-seropositiven

Spendern (Ljungmann et al, 2003; Boeckh et al, 2004). Eine Blutgruppenübereinstimmung

zwischen Spender und Patient ist zwar nicht so wichtig wie in der Organtransplantation,

eine Nichtübereinstimmung kann jedoch zu einem verzögerten Engraftment führen (Eapen

and Rocha, 2008).

1.2.2.2 Stammzellquelle

Vom Zeitpunkt der ersten HSCT bis weit in die 1990er Jahre war Knochenmark (KM) die

einzig nennenswerte Quelle für hämatopoetische Stammzellen. Seitdem aber haben

periphere Blutstammzellen (PBSZ) das Knochenmark als Hauptstammzellquelle besonders

bei erwachsenen Patienten immer mehr verdrängt: Zwischen 2000 und 2004 betrug der

Anteil von KM an Transplantaten noch über 35%, zwischen 2005 und 2009 nur noch unter

20% (Pasquini and Wang, 2011).

9

Die Gründe hierfür sind vielfältig. Neben der weitaus einfacheren Entnahme enthalten

PBSZ eine höhere Anzahl kernhaltiger Zellen, darunter CD34- und CD3-positive Zellen

genauso wie NK-Zellen, was zu einer schnelleren Neutrophilen- und

Thrombozytenrekonstitution führt. Trotz der höheren Zellzahl (besonders von

Immunzellen) ist die Inzidenz für aGvHD nicht höher als bei einer HSCT mit KM (Oehler

et al, 2005; Körbling and Anderlini, 2001). Besonders Patienten mit fortgeschrittener

Leukämie scheinen durchaus von PBSZ zu profitieren (Bensinger and Storb, 2001). Ein

Nachteil von PBSZ ist jedoch die deutlich höhere Inzidenz von chronischer GvHD

(cGvHD) als bei Nutzung von KM, weswegen bei Patienten mit gutartigen Erkrankungen,

die folglich auch nicht von einem parallel zur cGvHD auftretenden GvL-Effekt profitieren,

PBSZ meistens nicht eingesetzt werden (Bensinger and Storb, 2001).

Eine weitere, relativ neue Stammzellquelle stellt das Nabelschnurblut dar, welches in

speziellen Nabelschnurblutbanken gelagert wird. Es bietet eine Reihe von Vorteilen, wie

u.a. bessere Verträglichkeit und schnelle Verfügbarkeit durch Kryokonservierung, wird

jedoch häufig wegen der begrenzten Menge eher für Transplantationen im Kindesalter

verwendet.

1.2.2.3 Konditionierung

Die myeloablative Konditionierung (MAC) ist darauf ausgelegt, die maligne Erkrankung

maximal zu beseitigen und das Immunsystem des Patienten komplett zu zerstören, um das

Risiko einer Transplantatabstoßung zu minimieren und gleichzeitig Platz für das neue

Immunsystem des Spenders zu schaffen. Durch die schweren, beeinträchtigenden

Nebenwirkungen als Folge der Toxizität der Substanzen ist die Anwendung einer

myeloablativen Konditionierung auf jüngere Patienten beschränkt, die sich üblicherweise

in einem besseren Allgemeinzustand befinden und keine weiteren Begleiterkrankungen

haben.

Um auch älteren Patienten (z. B. MDS-Patienten), Patienten mit ernsthaften

Begleiterkrankungen sowie Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen den Zugang zu

einer HSCT zu öffnen, wurde eine Konditionierung mit reduzierter Intensität (RIC)

entwickelt. Durch die niedrigere Dosierung von Chemo- und Bestrahlungstherapie weist

die RIC eine verminderte Behandlungssterblichkeit (Transplant related mortality – TRM

oder non relapse mortality – NRM) auf. Die RIC macht durch ihre vorwiegende

Ausrichtung auf Immunsuppression die Koexistenz von hämatopoetischen Stammzellen

10

(HSC) des Spenders und des Empfängers möglich (mixed chimerism). In der Mehrzahl der

Fälle eliminieren die Spenderabwehrzellen die Resthämatopoese und damit auch die

verbleibenden Tumorzellen des Patienten. Dieser sogenannte graft-versus-tumor (GvT)

oder graft-versus-leukemia (GvL)-Effekt führt zu einem vollen Spenderchimärismus. Ein

Eckpfeiler der RIC ist die weiterführende Immunsupression nach HSCT um das

Engraftment nicht zu gefährden. 1998 repräsentierte die RIC noch 1% aller

Konditionierungen vor allogener Transplantation, 2003/2004 war ihr Anteil schon auf 31%

angestiegen (Gratwohl et al, 2006). Dazu beigetragen hat vor allem die Beschreibung des

GvT-Effektes (Kolb et al, 1995; Feinstein and Storb, 2001). Doch hat auch die RIC

negative Effekte zur Folge, wie eine erhöhte Gefahr des Transplantatversagens und ein auf

lange Sicht erhöhtes Rückfallrisiko. Diese treten besonders bei schnell fortschreitenden

Erkrankungen mit geringem Ansprechen auf GvT-Maßnahmen (ALL, AML, hochmalignes

NHL) auf, so dass hier oft auf myeloablative Konditionierung zurückgegriffen wird (Alyea

et al, 2006). Gerade auch Patienten, die nicht in Remission transplantiert werden, können

durch RIC seltener geheilt werden (Shimoni et al, 2006); siehe hierzu auch Abbildung 4.

Abbildung 4: Die Balance zwischen der Konditionierungsintensität und

transplantationsbedingten Nebenwirkungen (TRM/NRM); TBI/Cy: Ganzkörperbestrahlung

und Cyclophosphamid, BEAM: Carmustin, Etoposid, Cytarabin und Melphalan,

Flu/Melph: Fludarabin und Melphalan, Flu/Cy: Fludarabin und Cyclophosphamid, low

dose TBI: niedrigdosierte Ganzkörperbestrahlung, DLI: Donorlymphozyteninfusion, ATG:

Antithymozytenglobulin (Quelle: Hart and Peggs, 2007)

11

1.2.3 Komplikationen nach allogener HSCT

1.2.3.1 Transplantationsbedingte Komplikationen (Transplant related mortality -

TRM/ Non relapse mortality - NRM)

a) Toxizität der Konditionierung

Die Toxizität der Konditionierungsbehandlung ist substanz- und dosisabhängig. Übelkeit

und Erbrechen sowie milde Hautausschläge sind unmittelbare Folgen jeder

Chemoradiotherapie. Eine orale Mukositis entwickelt sich meistens innerhalb des 5. bis 7.

Tages post-tx. Nach zwei Wochen haben die meisten Patienten eine komplette Alopezie

entwickelt und sind panzytopen. Selten entwickeln Patienten auch schwerwiegende

substanzabhängige Nebenwirkungen, die entweder durch eine spezielle Prophylaxe

verhindert werden können (z. B. akute hämorrhagische Zystitis – Gabe von MESNA,

venooklusive Erkrankunge der Leber – Ursodeoxycholsäure (Bearman, 1995)) oder für die

es bisher noch keine Therapie gibt (z. B. idiopathische interstitielle Pneumonie) (Crawford

et al, 1993); siehe auch hierzu Abbildung 5.

Die Konditionierungsbehandlung hinterlässt auch Spätnebenwirkungen; so sind

Wachstumsverzögerungen bei Kindern, Azoospermie bei Männern und Ovarialinsuffizienz

bei Frauen sowie generelle endokrinologische Störungen nicht selten gesehen.

b) Graftversagen

Nach Konditionierung und erfolgter allogener HSCT kommt es innerhalb von 12 bis 16

Tagen zu einem Engraftment, d. h. zu einem stabilen Wert der neutrophilen Granulozyten

von > 1,0 x 109/l. Bei Non-Engraftment unterscheidet man primäres Graftversagen, d. h. es

erfolgt gar kein initialer Anstieg der Granulozyten, von sekundärem Graftversagen, bei

dem nach bereits erfolgtem Engraftment die Granulozyten wieder auf Werte < 0,5 x 109/l

abfallen. Insgesamt ist das Graftversagen eine seltene Komplikation (<5% aller HSCT),

wobei HLA-Inkompatibilitäten zwischen Patient und Spender, ein T-Zell depletiertes

Transplantat, zu niedrig dosierte Konditionierungsbehandlung, zu hohe Immunsuppression

oder therapierefraktäre Erkrankung zum Zeitpunkt der HSCT die wichtigsten Ursachen

darstellen.

12

c) Infektionen

Infektionen stellen den Hauptteil der TRM/NRM dar, weshalb wir auf dieses Thema hier

detaillierter eingehen werden (siehe auch hierzu Abbildung 5). Nach HSCT bestimmt das

Stadium der Grunderkrankung, die Form der Vorbehandlung (MAC – RIC) und vor allem

die gewählte Transplantationsmodalität (allogen – autolog, Grad der Übereinstimmung in

den HLA-Merkmalen, T-Zell-Depletion) das Infektionsrisiko (Einsele et al, 2001).

Abbildung 5: Häufigste Komplikationen einer HSCT (y-Achse) und deren typische

Auftretenszeitpunkte in Tagen nach HSCT (x-Achse),

VOD: Venoocclusive disease of liver; HSV: Herpes simplex virus; CMV:

Cytomegalovirus; VZV: Varizella Zoster Virus, GvHD: graft-versus-host-disease (Quelle:

Appelbaum, 2003)

Fast alle Patienten entwickeln innerhalb der ersten drei Wochen nach HSCT eine

fieberhafte Neutropenie, welche hauptsächlich für die Empfindlichkeit gegenüber

Infektionen in dieser frühen Posttransplantationsphase verantwortlich ist. Da bakterielle

13

und Pilzinfektionen in der neutropenen Phase häufig lebensbedrohlich verlaufen, werden

diese Patienten in den meisten Tx-Zentren routinemäßig mit einer Antibiotika- und

Antimykotikaprophylaxe abgedeckt, so dass das Risiko, an einer Infektion zu versterben,

in der frühen neutropenen Phase auf etwa 5% gesunken ist. Nach dem Engraftment bleibt

ein schwerer kombinierter quantitativer und funktioneller B-und T-Zell-Defekt bestehen,

der bei HLA-Inkompatibilitäten zwischen Spender und Empfänger deutlich protrahiert

verläuft. Daraus resultiert eine Störung der T-Helferzellfunktion sowohl für die Synthese

von Immunglobulinen als auch für die Differenzierung und Proliferation zytotoxischer T-

Effektorzellen. Neben seltener werdenden, aber mit gleicher Mortalität behafteten

Bakteriämien (bei 14% aller Patienten nach Engraftment), werden die Infektionen in der

mittleren Posttransplantationsphase (Engraftment bis Tag 100 post-tx) meist durch Viren

(Adenoviren, VZV, EBV, HHV-6 usw.) verursacht. Die bedrohlichste, da eine der

Hauptursachen für infektionsassoziierte Mortalität nach HSCT, ist die CMV-Infektion. Die

häufigsten Gründe hierfür sind Virusreaktivierungen bei seropositiven Patienten oder die

Transmission von einem seropositiven Donor auf einen seronegativen Patienten.

Infektionen in der späten Posttransplantationsphase werden vor allem durch die

Anwesenheit einer cGvHD begünstigt. Dabei sind auch hier insgesamt die Infektionsraten

besonders bei Patienten mit einem unverwandten oder nicht 10/10 HLA-gematchten

Spender erhöht (Einsele et al, 2001).

1.2.3.2 Graft-versus-host-disease

Eine GvHD tritt auf, wenn immunkompetente, allogene T-Zellen, die entweder mit dem

Transplantat übertragen werden oder neu aus den transplantierten Spender-HSC’s

entstehen, Gewebe oder Organe des Patienten angreifen (Ferrara and Deeg, 1991). Die

Graft-versus-host-disease ist als eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität nach

HSCT eine ernst zu nehmende Komplikation (Nash et al, 1992; Horowitz et al, 1990) und

wird grundsätzlich nach Erscheinungszeitpunkt in zwei Formen eingeteilt: die akute Form

(aGvHD) tritt innerhalb der ersten drei Monate (90 Tage) nach Tx auf; die chronische

Form (cGvHD) tritt später auf, kann jedoch auch aus einer aGvHD entstehen. Die beiden

Formen unterscheiden sich, zusätzlich zu ihrem unterschiedlichen zeitlichen Auftreten,

auch durch verschiedene klinische Manifestationsformen und pathophysiologische

Vorgänge (Via and Finkelman, 1993). Die Stärke der aGvHD wird nach der Glucksberg-

14

Skala in die Schweregrade 0 – IV eingeteilt, wobei Grad II bis IV als klinisch relevante

GvHD bezeichnet werden (Glucksberg et al, 1974; siehe hierzu auch Tabelle 1).

Tabelle 1: Glucksberg-Kriterien zur klinischen Einteilung der akuten GvHD bei

Erwachsenen; KOF: Körperoberfläche

Grad der aGvHD Ausmaß der Organbeteiligung

Haut Leber Darm

I

Makulopapulöses

Erythem der Haut,

<50% der KOF

Keine Beteiligung Keine Beteiligung

II Generalisierte

Erythrodermie Bilirubin 2-3mg/dl

Durchfall 500-1000ml/Tag

oder anhaltende Übelkeit

mit oder ohne Erbrechen

III Generalisierte

Erythrodermie

Bilirubin >3mg/dl

<15mg/dl

Durchfall >1000ml/Tag

(blutig) oder Krämpfe oder

Ileus

IV

Generalisierte

Erythrodermie mit

Blasenbildung und

Schuppung

Bilirubin >15mg/dl

Gleichzeitiges Auftreten

zweier Symptome aus dem

dritten Stadium

Abhängig von Stammzellquelle, Transplantationsart und HLA-Kompatibilität zwischen

Spender und Empfänger zeigt die Inzidenz moderater bis schwerer (Grad II bis IV) aGvHD

eine große Schwankungsbreite (Nash et al, 1992). Genauso schwankt auch die Mortalität

der aGvHD, je nach Schweregrad, zwischen 10% und 75% (siehe hierzu Tabelle 2).

Tabelle 2: Inzidenz von aGvHD und relative Überlebenshäufigkeit bei 5809 Erwachsenen

nach allogener, verwandter HSCT bis 1995 (Quelle: Kondakci M, 2005)

Ungefähr 40-60% aller Patienten, welche die ersten sechs Monate nach HSCT überlebt

haben, entwickeln eine chronische Graft-versus-Host-Disease (cGvHD) (Atkinson et al,

15

1990). Häufig ist es jedoch nicht möglich, mit Hilfe der klinischen Symptomatik und der

Laborbefunde zwischen einer GvHD und einer Infektion zu unterscheiden und es müssen

im Einzelfall zur Sicherung der Diagnose Gewebeproben des betroffenen Organs (wie

Haut, Bindehaut oder Darm) untersucht werden. Somit ist die Diagnose cGvHD sehr

schwer zu stellen und wird auch folglich in klinischen Daten nicht zuverlässig erfasst,

weshalb die cGvHD auch in dieser Studie nicht berücksichtigt wurde.

1.2.3.3 Krankheitsrückfall

Die Rückkehr der Grunderkrankung (engl. Relapse) ist heutzutage der häufigste Grund für

Therapieversagen und Sterblichkeit nach einer HSCT. Das Relapserisiko hängt von der

Grunderkrankung, dem Krankheitsstadium bei HSCT und der Art der GvHD-Prophylaxe

ab (Aschan, 2006). Patienten, die in erster Remission einer akuten Leukämie oder einer

ersten chronischen Phase einer CML transplantiert werden, haben ein Relapserisiko von

20-30%, das schon auf 40-60% ansteigt, wenn die Transplantation erst in späterer

Remission oder der zweiten chronischen Phase stattfindet. Patienten, die nicht in

Remission oder mit primär refraktärer Erkrankung transplantiert werden, haben ein

70%iges Relapserisiko. Eine intensive GvH-Prophylaxe senkt durch die

Immunsuppression die Inzidenz einer GvHD, erhöht jedoch dadurch das Relapserisiko.

Eine längerdauernde, niedrigdosierte GvH-Prophylaxe senkt jedoch dieses Risiko wieder

(Carlens et al, 1999). Um die bestmögliche Behandlung zu gewährleisten, ist es wichtig,

ein Relapse so früh wie möglich zu erkennen. Jedoch bestehen bisher für alle

Erkrankungen außer der CML (erneuter Nachweis des bcr/abl-Gens) keine eindeutigen

molekulargenetischen Marker zur Frühdiagnostik. Als Alternative zur kostspieligen und

zeitaufwendigen Entwicklung krankheitsspezifischer Marker gibt es noch die Möglichkeit,

ein Relapse anhand des Wiederauftretens der patienteneigenen Hämatopoese früh zu

entdecken.

1.3 Minor Histokompatibilitätsantigene

Die erste Beschreibung von Minor Histokompatibilitätsantigenen (mHag) in Mäusen

datiert schon von vor über 60 Jahren. Damals konnten außerhalb des MHC gelegene Gene

mit der Abstoßung allogener Hauttransplantate zwischen MHC-identen Mäusen in

Verbindung gebracht werden (Snell, 1948; Barth et al, 1956). Jahrzehnte später zeigten

16

klinische und experimentelle Daten, dass bei Patienten nach allogener HSCT trotz

kompletter HLA-Übereinstimmung mit dem Spender in 20-40% der Fälle eine GvH-

Reaktion auftreten kann (Beatty und Hervé, 1990; Bortin et al, 1991). Außerdem wurde im

Vergleich zur autologen HSCT nach HLA-kompatibler allogener HSCT eine niedrigere

Rückfallrate gefunden (Zittoun et al, 1995; Ljungmann et al, 1993). Die Entfernung von T-

Zellen aus dem Transplantat hing dagegen in mehreren Studien mit niedrigerem GvH-

Risiko und deutlich höherem Rückfallrisiko zusammen (Apperley et al, 1986; Hale et al,

1988; Sullivan et al, 1989). Offensichtlich sind also alloreaktive T-Zellen aus dem

Transplantat für eine erhöhte Inzidenz von sowohl GvH- als auch GvL-Reaktion

verantwortlich. Man vermutet, dass die Alloreaktivität der T-Zellen gegen verbleibende

Variationen in der Aminosäuresequenz der in den HLA-Molekülen präsentierten Peptiden

gerichtet ist, weshalb diese auch als Minor Histokompatibilitätsantigene (mHag)

bezeichnet werden.

1.3.1 Genetik, Entstehung, Lokalisation und Nachweis von mHag

1.3.1.1 Genetik und Entstehung

Im menschlichen Genom gibt es unzählige Punktmutationen (Single Nucleotid

Polymorphisms - SNP), d.h. Austausche einzelner DNA-Basen durch andere Basen.

Liegen diese Basenveränderungen im kodierenden Bereich eines Gens, können sie zu

einem Aminosäureaustausch in Proteinen führen. Werden diese Proteine als Peptide

prozessiert und diese in der Bindungsfurche von HLA-Molekülen an der Zelloberfläche

exprimiert, so sind sie in der Lage, eine alloreaktive T-Zell-Reaktion bei einem fremden

Individuum auszulösen und werden daher als mHag bezeichnet (Simpson et al, 2002).

MHag werden analog zu anderen Selbst-Peptiden aus intrazellulären Proteinen gebildet

und in der Antigenbindungsfurche eines passenden HLA-Moleküls (MHC-Restriktion)

gebunden (siehe hierzu Kapitel 1.1, Abschnitt 3, Abbildung 3 und Kapitel 1.3, Abschnitt

1.1, Abbildung 6). Durch die Aminosäure-Varianz in den zytosolischen Proteinen kann es

nun zwischen einzelnen Individuen zu einer qualitativ und quantitativ unterschiedlichen

Expression eines mHag kommen. Im HSCT-Setting bedingt dies eine entweder uni- oder

bidirektional gerichtete T-Zell-Antwort. So können Spender-T-Zellen das vom Empfänger

gebildete antigene Peptid als fremd erkennen, umgekehrt können auch Patienten-T-Zellen

gegen das vom Spender gebildete mHag reagieren (unidirektional); in seltenen Fällen

17

können auch beide Peptide antigene Reaktionen hervorrufen (bidirektional) (Falkenburg et

al, 2003).

Jedes mHag ist das Produkt eines einzigen Gens und folgt dem Mendelschen Erbgang. Die

Loci der einzelnen mHag sind nicht mit dem HLA-Genkomplex verbunden, so dass bei

einer HLA-identen Situation nicht automatisch auch die mHag übereinstimmen; jedoch ist

bei HLA-identen Geschwistern auch wahrscheinlich, dass sie für manche mHag identisch

sind (Schreuder et al, 1993).

Abbildung 6: Zytosolische Proteine werden im Proteasom in kurze Peptidfragmente

degradiert. Diese werden wiederum durch Aminopeptidasen N-terminal gekürzt und

daraufhin durch den TAP (Transporter in antigen processing) ins ER (Endoplasmatisches

Reticulum) geschleust. Die HLA-Klasse I Moleküle werden solange im ER zurück

gehalten, bis ein Peptid erfolgreich gebunden ist. Diese Peptid/HLA Komplexe werden nun

über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert (Quelle: Falkenburg et al, 2003)

1.3.1.2 Lokalisation und molekularbiologischer Nachweis

Mehrere mHag, darunter die auf dem Y-Chromosom kodierten oder auch die autosomalen

mHag HA-3 und HA-8 werden ubiquitär exprimiert (Brickner et al, 2001; de Bueger et al,

1992). Dagegen ist die Expression anderer mHag auf bestimmte Zell- oder Gewebetypen

beschränkt (siehe hierzu auch Tabelle 3): HA-1 und HA-2 werden nur auf

hämatopoetischen Zellen (de Bueger at al, 1992), HB-1 nur auf Vorläufer B-Zellen

(Dolstra et al, 1997) und CD31 sowohl auf Immunzellen (T-Lymphozyten, NK-Zellen,

Granulozyten, Monozyten) als auch auf Endothelzellen und Thrombozyten exprimiert

18

(Behar et al, 1996). Der Grund für die spezifische Expression kann die je nach Zelltyp

variierende Art von Proteasomen sein. Für Immunoproteasome, einer Untergruppe von

Proteasomen, die in vielen hämatopoetischen Zellen und besonders APC’s vorkommt,

wurde im Gegensatz zu gewöhnlichen Proteasomen ein spezielles Muster nachgewiesen,

nach dem diese Proteine zerteilen. So ist die Präsenz von z. B. MAGE-3, einem melanom-

spezifischen Protein, an Immunoproteasomen gebunden (Schultz et al, 2002).

Tabelle 3: Gewebsverteilung der von uns untersuchten mHag; B-ALL: akute lymphatische

Leukämie der B-Zellen, B-CLL: chronisch lymphatische Leukämie der B-Zellen, EBV:

Eppstein-Barr-Virus, APC: antigenpräsentierende Zelle, NK-Zelle: Natürliche Killerzelle,

GIT: Gastrointestinaltrakt

mHag HA-1 HA-2 HA-3 HA-8 HB-1

Vorkommen Hämatopoetische

Zellen ubiquitär

Vorläufer B-Zellen, B-ALL, EBV

transformierte

B-Zelllinie

mHag ACC-1 ACC-2 CD31 CD62L PANE-1 UGT2B17

Vorkommen

Hämatopoetische

Zellen (inclusive

Leukämiezellen)

unter

inflammatorischen

Bedingungen auch

ubiquitär

Immunzellen,

Thrombozyten,

Endothelzellen

APC’s,

NK-Zellen,

neutrophile

Granulozyten

B-Lymphozyten

(B-CLL)

GIT, Prostata,

APC’s

Manche Proteine und die daraus gebildeten mHag werden unter normalen Bedingungen

nicht überall im Körper exprimiert, sondern z. B. nur bei Zellaktivierung im Rahmen von

Inflammationsprozessen (z. B. durch Konditionierung vor HSCT) im geschädigten

Gewebe (siehe hierzu Tabelle 3, ACC-1 und -2).

1976 wurden erstmals spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL’s) gegen das auf

dem Y-Chromosom lokalisierte mHag H-Y in Patienten nach HLA-identer allogener KMT

nachgewiesen. (Goulmy et al, 1976). Seitdem konnten bis zum heutigen Zeitpunkt auch

viele autosomal lokalisierte mHags zuerst mit Hilfe von CTL-Klonen aus spezifischen T-

Zellen von Patienten, die nach HLA-gematchter allogener HSCT eine GvHD entwickelt

hatten, bestimmt werden (Marijt et al, 1993). Zusätzlich ist es für viele mHag auch

gelungen, mittels biochemischer Isolationsverfahren (Säureelution der gebundenen Peptide

aus aufgereinigten HLA-Molekülen gefolgt von Trennung der Peptide durch HPLC und

19

darauffolgender Analyse der TCR-Bindung) deren Aminosäuresequenz und darauffolgend

auch die Nukleotidsequenz zu entschlüsseln, so dass nun die Möglichkeit besteht, diese

mHag mittels PCR-basierten Verfahren, wie PCR-SSP und Multiplex-PCR-SSO,

nachzuweisen (Wilke et al, 1998; Wilke et al, 2002; Pietz et al, 2005).

1.3.2 Die Rolle von mHag bei der allogenen HSCT

1.3.2.1 akute Graft-versus-Host-Disease (aGvHD)

MHag werden mit für die Entwicklung einer aGvHD nach allogener, HLA-identer HSCT

verantwortlich gemacht. Welche mHag eine Rolle bei der Entstehung einer aGvHD spielen

und ob die Gewebeverteilung hier eine Rolle spielt, ist bis heute nicht eindeutig geklärt.

Außerdem konnte gezeigt werden, dass manche unter normalen Bedingungen nur auf

hämatopoetischen Zellen exprimierte mHag durch Anwesenheit entzündlicher Zytokine

auch auf Zellen anderer Gewebsarten gebildet werden können (Kloosterboer et al, 2005).

Somit ist die Gewebsverteilung von mHag nicht immer eindeutig. Allerdings besteht

Konsens über die Bedingung, dass das eine aGvHD auslösende mHag auf

antigenpräsentierenden Zellen (APC) präsentiert werden muss, um die erforderliche CD8+-

T-Zell-Antwort auslösen zu können (Shlomchik et al, 1999).

Einerseits wird eine Reaktion gegen ubiquitär exprimierte mHag als Auslöser einer

klinisch manifesten aGvHD vermutet. Ein in situ Versuch mit Tetramer-gebundenen mHag

zeigte bei gleichzeitigem Ausbleiben des T-Zell-Anstiegs gegen hämatopoesespezifische

mHag einen deutlichen Anstieg von zytotoxischen T-Zellen gegen ubiquitär exprimierte

mHag; gleichzeitig wurden Anzeichen einer schweren aGvH-Reaktion beobachtet

(Dickinson et al, 2002). Gegen eine Reaktion auf ubiquitär exprimierte mHag spricht die

explizite Beteiligung von Haut, Leber, GIT und Lunge an einer aGvHD, wohingegen

andere Gewebe nicht betroffen sind (Glucksberg et al, 1974).

Andererseits konnte auch gezeigt werden, dass hämatopoesespezifische mHag an der

Entwicklung einer aGvHD beteiligt sind (Goulmy et al, 1996b). Ein Versuch in

Mausmodellen zeigte, dass T-Zell-Antworten gegen hämatopesespezifische mHag

signifikanten „Kollateralschaden“ auslösen und auch in Abwesenheit von T-Zell-

Reaktionen gegen ubiquitär exprimierte mHag eine aGvHD auslösen können (Teshima et

al, 2002a). Diese Theorie besagt, dass die aGvHD und deren Klinik durch eine

Zytokinausschüttung verursacht wird und wie folgt abläuft: Die T-Zell-Reaktion gegen die

20

in dendritischen (oder anderen hämatopoetischen) Zellen exprimierte mHag findet in den

bei aGvHD involvierten Organen statt, führt zu einer lokalen Inflammationsreaktion und

darauffolgend zu einer zytokin-vermittelten Zerstörung der umliegenden

nichthämatopoetischen Gewebe (Teshima and Ferrara, 2002b). Alternativ dazu kann man

behaupten, dass die T-Zell-Reaktion gegen hämatopoesespezifische mHag zusammen mit

der lokalen Inflammation zu einer Vermehrung der reaktiven T-Zellen führt und diese T-

Zellvermehrung nun für den Gewebsschaden verantwortlich ist (Mutis et al, 1999).

1.3.2.2 Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekt

Neben einer aGvHD können allogene T-Zellen auch für den Graft-versus-leukemia (GvL)-

Effekt verantwortlich gemacht werden, da dieser bisher weder bei der autologen HSCT

noch nach einer HSCT mit T-Zell depletiertem Transplantat beobachtet wurde (Gale et al,

1994). Es wird nun vermutet, dass mHag, die auf malignen Zellen exprimiert werden, als

Targetstrukturen für den durch alloreaktive T-Zellen vermittelten GvL-Effekt dienen. In-

vitro und in Mausmodellen konnte bislang nachgewiesen werden, dass viele der bis jetzt

beschriebenen mHag, darunter HA-1 bis HA-8 und HB-1 in klonalen

Leukämievorläuferzellen exprimiert und von allogenen T-Zellen erkannt werden können

(Pierce et al, 2001; Dolstra et al, 1997; Falkenburg et al, 1991; Bonnet et al, 1999). Gerade

bei malignen hämatologischen Erkrankungen könnten hämatopoese-spezifische mHag als

Targets funktionieren: so würden Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI) von mHag-

negativen Spendern zur Eliminierung der restlichen malignen Zellen des mHag-positiven

Patienten führen, ohne dabei die neue donorinduzierte Hämatopoese zu stören. Erste

Studien konnten dies für die hämatopoesespezifischen mHag HA-1 und HA-2 bestätigen

(Falkenburg et al, 1991; Bonnet et al, 1999). Für besondere Spender-Empfänger-Paare, in

denen der jeweilige Spender negativ und der Empfänger positiv für diese HA-1/HA-2 war,

konnte nach DLI gleichzeitig mit dem Verschwinden der Grunderkrankung und dem

vollen Spenderchimärismus das Auftreten von HA-1/HA-2-spezifischen T-Zellen

nachgewiesen werden (Marijt et al, 2003). Zurzeit wird in klinischen Phase I- und II-

Impfstudien getestet, ob hämatopoese- sowie tumorspezifische mHags einen GvL- bzw.

GvT-Effekt verstärken können (Goulmy, 2006).

21

1.3.2.3 Transplantatversagen

Im Gegensatz zur Transplantation von soliden Organen, die auch mit eingeschränkter

Immunsuppression und einer größeren Zahl an HLA-Differenzen zwischen Spender und

Empfänger toleriert wird, verursachen hämatopoetische Stammzellen beim Patienten schon

bei kleinsten Differenzen der HLA-Merkmale oder einer zu schwachen Konditionierung

eine starke T-Zell-Aktivierung bis hin zum Transplantatversagen. Hierfür werden bei

HLA-Identität zwischen Spender und Empfänger unter anderem mHag-Differenzen

verantwortlich gemacht. Eine akute Abstoßung des Stammzelltransplantats macht sich

anfänglich durch einen schnellen Anstieg der patienteneigenen CD8+-T-Zellen kurz nach

Graftinfusion bemerkbar. Durch Klonieren dieser CD8+-T-Zellen konnte eine Reaktivität

gegen geschlechtsspezifische und autosomale mHags nachgewiesen werden (Goulmy et al,

1977; Voogt et al, 1990; Marijt et al, 1995). Da wir in unserer Studie das

Transplantatversagen nicht untersucht haben, wird dies nur der Vollständigkeit halber

erwähnt.

1.3.2.4 Relapse und Transplant related / Non relapse mortality (TRM/NRM)

Ein Einfluss auf einen Krankheitsrückfall konnte bisher für die mHag CD31, CD62L und

HY gezeigt werden (El-Chennawi et al, 2006; Katagiri et al, 2006; Markiewicz et al,

2009). Der Einfluss von mHag auf TRM/NRM nach allogener, unverwandter HSCT wurde

bisher nur in drei Studien untersucht; zwei davon konnten bei den untersuchten mHag

keinen Effekt auf TRM/NRM feststellen (Lin et al, 2001; Pérez-García et al, 2005).

Dagegen scheint ein Mismatch in UGT2B17 zwischen Spender und Empfänger eine

erhöhte Inzidenz von TRM/NRM zu zeigen (Terakura et al, 2005).

Da bisher nur vereinzelte Studien den Effekt von mHag auf Relapse und NRM/TRM

untersucht haben (siehe Tabelle 28), wurde dies nun systematisch in unserer Studie

gemacht.

1.3.3 Untersuchte autosomale Minor Histokompatibilitätsantigene

1.3.3.1 HA-1

Bei HA-1 handelt es sich um ein diallelisches Nonapeptid, das durch zwei Exons des

KIAA0223-Gens auf Chromosom 19 kodiert wird (Wilke et al, 1998) und einen

22

Aminosäureaustausch von Arginin zu Histidin aufweist (den Haan et al, 1998). Das

komplette KIAA0223-Gen kodiert ursprünglich für ein Protein zur intrazellulären

Signalweiterleitung. Das HA-1H Peptid (VLHDDLLEA), kodiert durch das HA-1

H-Allel,

wird von spezifischen zytotoxischen T-Zellen im Zusammenhang mit HLA-A*02 erkannt,

im Gegensatz zum VLRDDLLEA-Peptid (kodiert durch das HA-1R-Allel), welches nur

sehr wenig durch HLA-A*02 gebunden und auf der Zelloberfläche exprimiert wird sowie

ein funktionelles Null-Allel darstellt (den Haan et al, 1998). HA-1H weist bei weißen US-

Amerikanern eine durchschnittliche Allelfrequenz von 35,9% und HA-1R eine Frequenz

von 64,1% auf (Spierings et al, 2007), und wird ausschließlich auf Zellen

hämatopoetischen Ursprungs exprimiert (de Bueger et al, 1992). Zum

molekulargenetischen Nachweis von HA-1 existieren verschiedene Methoden (Tseng et al,

1998; Wilke et al, 1998; Aróstegui et al, 2000). HA-1 gehört als eins der ältesten

bekannten mHag zu den in Studien am besten untersuchten mHag. Neuerdings gibt es

Hinweise auf weitere immunogene Peptide, die von HA-1 kodiert werden, sowie weitere

HLA-Moleküle, in denen das HA-1H-Peptid exprimiert werden kann, z. B. HLA-B60,

HLA-A*02:06 (Mommaas et al, 2002; Torikai et al, 2007).

Bisherige Studienergebnisse zum Einfluss von HA-1-Mismatchen auf die HSCT behandeln

hauptsächlich das Thema aGvHD und sind genauso zahlreich wie widersprüchlich. Ältere

Studien zeigen einen signifikanten Zusammenhang zwischen HA-1-Mismatchen und

erhöhter aGvHD-Inzidenz (Goulmy et al, 1996b; Tseng et al, 1999; Gallardo et al, 2001;

Socié et al, 2001), neuere Studien widersprechen dem und zeigen zudem auch einen

fehlenden Einfluss auf Gesamtüberleben, Relapse und TRM/NRM (Lin et al, 2001;

Heinemann et al, 2004; Spellman et al, 2009; Markiewicz et al, 2009).

1.3.3.2 HA-2

Auch HA-2 wird ausschließlich auf hämatopoetischen Zellen und in HLA-A*02 exprimiert

(de Bueger et al, 1992). Erstmals wurde die zum mHag HA-2 gehörende

Aminosäuresequenz YIGEVLVSV durch den Haan et al im Jahr 1995

massenspektrometrisch dargestellt und beschrieben (den Haan et al, 1995). 2001 gelang es

Pierce et al, das HA-2 kodierende Gen als ein bisher unbekanntes Gen der Klasse-I-

Myosine (unkonventionelles Myosin 1G –MYO1G) auf dem kurzen Arm von Chromosom

7 zu bestimmen. Des Weiteren konnten zwei allelische Varianten, die sich durch einen

Aminosäureaustausch von Valin (MYO1GV) zu Methionin (MYO1G

M) unterscheiden,

23

nachgewiesen werden. Die erste Variante (MYO1GV) kodiert für das als antigene Peptid

bekannte HA-2V (YIGEVLVSV), wohingegen das von der zweiten allelischen Variante

(MYO1GM

) kodierte Peptid HA-2M

(YIGEVLVSM) nicht an der Oberfläche von

MYO1GM

enthaltenden Zellen exprimiert werden kann, obwohl der Aminosäureaustausch

weder HLA-Bindung noch T-Zell-Erkennung behindert (Pierce et al, 2001). 2002

entwickelten Wilke et al einen molekulargenetischen Nachweis für HA-2 mittels PCR-SSP

(Wilke et al, 2002). HA-2V weist bei weißen US-Amerikanern eine Allelfrequenz von

75,6% und HA-2M

eine Frequenz von 24,4% auf (Spierings et al, 2007).

Für HA-2 konnte bisher kein Einfluss auf die von uns untersuchten Outcomes nach HSCT

festgestellt werden (Goulmy et al, 1996b).

1.3.3.3 HA-3

Erstmals wurden HA-3 spezifische T-Zellen aus dem Blut eines AML- Patienten isoliert,

der nach HLA-identer HSCT an aGvHD Grad II erkrankt war (Goulmy, 1988). Das später

entdeckte antigene Peptid von HA-3, HA-3T (VTEPGTAQY), welches in HLA-A*01

gebunden präsentiert wird, wird durch das lymphoid blast crisis Lbc-Onkogen auf

Chromosom 15q24-q25 kodiert und ist ubiquitär exprimiert (de Bueger, 1992). Somit ist

HA-3 das erste entdeckte mHag, das durch ein Onkogen kodiert wird. Ein

Aminosäureaustausch von Threonin zu Methionin führt zum Verdau des HA-3M

Peptids

(VMEPGTAQY) im Proteasom, so dass dieses nicht an der Zelloberfläche exprimiert

werden kann. Beim Vergleich der beiden Allele fiel auf, dass diese sich zusätzlich noch in

sechs weiteren nicht synonymen SNP’s unterscheiden, die möglicherweise für weitere

mHag kodieren könnten, deren Bedeutung bis jetzt jedoch noch ungeklärt ist (Spierings et

al, 2003). Spierings et al zeigen in dieser Veröffentlichung auch eine SSP basierte

Nachweismethode für beide Allele von HA-3. HA-3T weist bei weißen Amerikanern eine

Allelfrequenz von 65,2% und HA-3M

eine Frequenz von 34,8% auf (Spierings et al, 2007).

HA-3 scheint laut neuester Studienergebnisse einen Einfluss auf die Inzidenz einer klinisch

relevanten aGvHD zu haben (Markiewicz et al, 2009).

1.3.3.4 HA-8

Das Nonapeptid RTLDKVLEV, welches in HLA-A*02 präsentiert und vom KIAA0020

Gen auf Chromosom 9 kodiert wird, wurde von Brickner et al 2001 entdeckt und analog

24

der bestehenden Nomenklatur als mHag HA-8R bezeichnet (Goulmy, 1996a; Brickner et al,

2001). Eine Punktmutation im KIAA0020-Gen führt zum Austausch der an erster Position

stehenden Aminosäure Arginin durch Prolin. Das dadurch entstehende Peptid

PTLDKVLEV (HA-8P) und seine Precursor-Proteine werden nur unzureichend durch den

transporter of antigen processing (TAP) transportiert, so dass es nicht an der Zelloberfläche

exprimiert werden kann. HA-8 wird ubiquitär exprimiert und ist das erste beschriebene

mHag, dessen Entstehung durch verschiedene Antigenprozessierung bedingt ist (Brickner

et al, 2001). HA-8R weist bei weißen Amerikanern eine Allelfrequenz von 45% und HA-8

P

eine Frequenz von 55% auf (Spierings et al, 2007).

Bislang bestehen Hinweise darauf, dass HA-8-Mismatche in Verbindung mit einer

erhöhten Inzidenz von klinisch relevanter aGvHD (Akatsuka et al, 2003b), sowie

verkürztem Gesamtüberleben bzw. krankheitsfreiem Überleben stehen (Pérez-García et al,

2005).

1.3.3.5 HB-1

Dolstra et al haben HB-1 erstmals 1999 aus einem HLA-B*44 restringierten CTL-Klon

eines an B-ALL erkrankten und daraufhin transplantierten Patienten isoliert (Dolstra et al,

1999). Als antigenes Peptid wurde das Decapeptid EEKRGSLHVW (Allel: HB-1H)

identifiziert, welches ausschließlich in HLA-B*44 gebunden wird. Ein Polymorphismus an

Position 153 im HB-1 kodierenden Gen auf Chromosom 5q32, dessen Funktion bisher

unbekannt ist, führt zum Ersatz der Aminosäure Histidin an Position 8 durch Tyrosin und

zur Bildung des EEKRGSLYVW-Peptids (Allel: HB-1Y). Die Expression von HB-1

konnte in weiteren Versuchen nur in leukämischen B-Lymphozyten (B-ALL und EBV

transformierten B-Zellen) nachgewiesen werden. Zwar wurde auch in normalen Zellen

eine kleine Anzahl an Gentranskripten festgestellt, jedoch reichte dies nicht zur Erkennung

durch den TCR aus. Somit ist HB-1 das erste entdeckte leukämieassoziierte mHag (Dolstra

et al, 1999). 2002 entwickelten Dolstra et al einen RFLP-Assay zum molekulargenetischen

Nachweis von HB-1 und bestimmen die Allelfrequenz von HB-1H und HB-1

Y mit 79%

bzw. 21%. 2010 wurde von Park et al ein verbesserter PCR-SSP Test entwickelt, der auch

das bisher schwer nachweisbare HB-1Y Allel gut erfasste (Park et al, 2010). Beide Allele

von HB-1 binden gleich stark an HLA-B*44 und werden durch jeweils spezifische CTL’s

erkannt, so dass HB-1 auch das bisher einzige mHag ist, dass eine bidirektionale allogene

T-Zell-Antwort auslösen kann (Dolstra et al, 2002). De Rijke et al haben 2003 Hinweise

25

auf zwei weitere in HLA-DR präsentierte von HB-1 kodierte Epitope gefunden (de Rijke et

al, 2003).

Bisherige Studien, die einen Einfluss von HB-1-Mismatchen auf die im Rahmen dieser

Arbeit untersuchten klinischen Outcomes nach HSCT untersucht haben, konnten keine

signifikanten Zusammenhänge nachweisen (Spellman et al, 2009; Markiewicz et al, 2009).

1.3.3.6 ACC-1 und ACC-2

Durch zwei nicht synonyme SNP’s an Position 56 und 245 des auf Chromosom 15q24-25

liegenden BCL2A1-Gens, das ursprünglich für ein antiapoptotisches Protein kodiert

(BCL2-related protein A1), entstehen aus einem Gen zwei neue mHag ACC-1 und ACC-2.

Der Austausch von Guanin zu Adenin an Position 56 führt durch den

Aminosäureaustausch von Cystein (C) zu Tyrosin (Y) zu einem durch den TCR in

Verbindung mit HLA-A*24 erkannten Nonapeptid DYLQYVLQI (ACC-1Y). Das durch

ACC-1C Allel kodierte Peptid DYLQCVLQI (ACC-1

C)wird zwar in HLA-A*24 gebunden,

jedoch nicht durch CTL’s erkannt. Das zweite neue mHag, das in HLA-B*44 gebundene

Decapeptid KEFEDDIINW (ACC-2D), ensteht aus einem AS-Austausch von Glycin (G) zu

Asparaginsäure (D). Entsprechend ACC-1 kann auch das ACC-2G Peptid KEFEDGIINW

nicht vom TCR erkannt, jedoch im HLA-Molekül gebunden werden. ACC-1 und ACC-2

sind die bisher einzigen mHag, die aus zwei verschiedenen SNP eines gleichen

autosomalen Gens entspringen (Akatsuka et al, 2003a). Es wurde zuerst angenommen, dass

die beiden mHag ausschließlich auf Zellen hämatopoetischen Ursprungs exprimiert werden

(Akatsuka et al, 2003a). Vorausgehende Studien zeigten jedoch, dass die Expression des

BCL2A1-Gens durch inflammatorische Zytokine wie TNF-α oder IL- 1β auch in

Endothelzellen induziert werden kann (Karsan et al, 1996). So vermutet man, dass unter

normalen Bedingungen ACC-2-spezifische T-Zellen sich gezielt gegen hämatopoetische

Zellen richten und einen GvL-Effekt bedingen können, diese Reaktivität sich allerdings in

Gegenwart inflammatorischer Wirts-Zellen und darauffolgender Hochregulierung

inflammatorischer Zytokine auch gegen andere Gewebe richten kann, so dass sie auch eine

Rolle in der Entstehung von GvHD spielen könnten (Kloosterboer et al, 2005).

Bisher konnten weder für ACC-1 noch für ACC-2 signifikante Auswirkungen auf klinische

Outcomes nach HSCT beobachtet werden (Nishida et al, 2004; Markiewicz et al, 2009).

26

1.3.3.7 PANE 1

Ein zusätzliches Exon eines alternativen Transkripts des PANE-1 (proliferation associated

nuclear element 1)-Gens auf Chromosom 22q13 ist für die Entstehung des in HLA-A*03

gebundenen mHag PANE-1 (Proteinsequenz: RVWDLPGVLK) verantwortlich. Ein

Basenaustausch in diesem zusätzlichen, kodierenden Exon führt anstelle des Einbaus von

Arginin an erster Stelle im Protein zur Bildung eines Stopcodons, so dass das PANE-1-

Protein in manchen Individuen erst gar nicht gebildet wird. Das alternative PANE-1-

Transkript, welches für das mHag kodiert, ist in großen Mengen in ruhenden CD19+-B-

Zellen und B-CLL-Zellen vorhanden. Bei Aktivierung der B-Zellen durch Stimulation mit

CD40L nimmt das alternative zugunsten des nicht-mHag-kodierenden Transkriptes ab

(Brickner et al, 2006). Die Allelfrequenzen einer weißen amerikanischen Population liegen

bei 69,9% PANE-1-positiven und 38,8% PANE-1-negativen Individuen (Spierings et al,

2007).

Bisher gibt es noch keine Studien zur Relevanz von PANE-1-Mismatchen zwischen

Spender-Empfänger-Paaren bei HSCT.

1.3.3.8 UGT2B17

2003 haben Murata et al mit dem durch das UGT2B17-Gen kodierten Peptid

AELLNIPFLY das erste mHag entdeckt, dessen Immunogenität zwischen Spender und

Empfänger durch eine homozygote Gendeletion in den Spenderzellen (bei rund 11% der

weißen Gesamtbevölkerung) zustande kommt. Das neu entdeckte Peptid wird in HLA-

A*29 gebunden und neben Leber, Hypophyse und GIT auch in APC’s exprimiert, so dass

eine Rolle bei GvHD und/oder GvL in UGT2B17-positiven Empfängern mit

Transplantaten von negativen Spendern nicht ausgeschlossen werden kann (Murata et al,

2003).

UGT2B17 selbst kartiert auf Chromosom 4 und gehört zur Familie der UDP-

Glycosyltransferasen, welche für die Elimination von u. a. Steroidhormonen, Bilirubin und

potentiell toxischen exogenen Stoffen (Medikamenten) verantwortlich ist (Tukey and

Strassburg, 2000). Da es schon mindestens 7 Gene in der UGT2-Unterfamilie gibt, die sehr

ähnliche Substratspezifitäten aufweisen, fällt der Ausfall der durch UGT2B17 kodierten

Glycosyltransferase jedoch klinisch nicht auf. Für UGT2B7, eine andere zur UGT2-

Familie gehörende Glycosyltransferase, konnte gezeigt werden, dass sie am Abbau von

27

Cyclosporin A und Tacrolimus beteiligt ist (Strassburg et al, 2001), so dass auch

UGT2B17, das in 88% der AS-Abfolge identisch zu UGT2B7 ist, daran beteiligt sein kann.

Somit kann UGT2B17 entweder als mHag oder auch durch Modifikation des

Arzneimittelmetabolismus das klinische Outcome nach HSCT beeinflussen. UGT2B17 ist

auch das mHag mit der größten Variation zwischen verschiedenen Populationen: Bei

96,5% der Weißen ist der immunogene Phänotyp vorhanden, bei Asiaten und Schwarzen

(70,9%) und Mexikanern (62,4%) ist er signifikant seltener (p<0,001), am seltensten ist er

bei Mulatten zu finden (22,0%, p<0,01) (Spierings et al, 2007).

Es konnte gezeigt werden, dass ein UGT2B17 positiver Spender einen unabhängigen

Risikofaktor für erhöhte Inzidenz für TRM/NRM und ein vermindertes Gesamtüberleben

nach HSCT darstellt (Terakura et al, 2005). Später wurde außerdem gezeigt, dass ein

UGT2B17-Mismatch zwischen Patient und Spender für eine erhöhte Inzidenz von aGvHD

verantwortlich ist, dies jedoch nicht auf einen bestimmten UGT2B17-Genotyp bei Spender

oder Empfänger zurückzuführen war (McCaroll et al, 2009).

1.3.3.9 CD31

CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1) ist ein auf Chromosom

17q23 kartierendes Membranglykoprotein (Gumina et al, 1996), das hauptsächlich auf

Endothelzellen, Thrombozyten, Monozyten, Blutstammzellen sowie auf zirkulierenden

Leukozyten exprimiert wird (DeLisser et al, 1994; Newman et al, 1990). Es gehört zur

Familie der Ig-ITIMs (Proteine der Ig-Superfamilie, welche ITIMs - immunoreceptor

tyrosine-based inhibitory motifs - enthalten) wie auch KIR und CD22.

CD31 spielt eine Rolle in der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion, Leukozytenmigration,

T-Zell-Aktivierung und Angiogenese (DeLisser et al, 1994; Zehnder et al, 1995). Erste

Hinweise auf seine mögliche Rolle als mHag gab ein Polymorphismus in Codon 125 (CTG

-> GTG, AS-Austausch von Leucin zu Valin), welcher bei Nichtkompatibilität zwischen

Spender und Empfänger ein Risikofaktor für die Inzidenz der aGvHD sein soll (Behar et

al, 1996). Zusätzlich dazu wurden 1998 noch drei weitere SNP`s identifiziert: der erste

befindet sich auch in Exon 3, Codon 80 und führt zum Austausch von Valin zu Methionin;

er wurde jedoch nur in einem Individuum gefunden, so dass man nicht auf einen

regelmäßigen SNP schließen kann. Die anderen liegen in Exon 8, Codon 563 (Asparagin

zu Serin) und Exon 12, Codon 670 (Glycin zu Arginin) (Maruya et al, 1998). Die beiden

letzten verbindet ein starkes Kopplungsungleichgewicht: Bei Serin (bzw. Asparagin) in

28

Codon 563 befindet sich in Codon 670 fast immer Arginin (bzw. Glycin). Valin in Codon

125 zeigt eine starke Kopplung mit Asparagin in Codon 563. Ein durch die CD31-

Polymorphismen kodiertes mHag könnte möglicherweise in HLA-Molekülen, die zur

HLA-B44-Superfamilie oder zur HLA-B7-Superfamilie gehören, exprimiert werden

(Maruya et al, 1998, Cavanagh et al, 2005).

In vitro zeigen Monozyten mit heterozygotem Genotyp (Codon 125 L/V, Codon 563 S/N,

Codon 670 R/G) eine erhöhte Adhäsion an Endothelzellen im Vergleich mit den beiden

homozygoten Genotypen (Goodman et al, 2008). Dies ist der erste Hinweis auf eine

Beeinträchtigung der Funktionalität von CD31 durch die SNP’s.

Auch für die Auswirkung von CD31-Mismatchen auf HSCT besteht bisher Uneinigkeit in

den Studienergebnissen: Hinweise gibt es auf eine erhöhte Inzidenz von aGvHD (Behar et

al, 1996; Maruya et al, 1998), sowie ein verkürztes krankheitsfreies Überleben bzw.

Gesamtüberleben (Grumet et al, 2001) oder eine erhöhte Relapseinzidenz (El-Chennawi et

al, 2006) bei Mismatchen zwischen Spender und Patient in den oben genannten Codons.

Außerdem wurde bei Patienten eine erhöhte aGvHD-Inzidenz bei der

Aminosäurenkonstellation Valin/Asparagin/Glycin des Spenders festgestellt (Cavanagh et

al, 2005).

1.3.3.10 CD62L

CD62L (leucocyte-endothelial cell adhesion molecule 1 – LECAM-1, SELL oder L-

Selectin), kodierend auf Chromosom 1, gehört zur Selektinfamilie der Adhäsionsmoleküle,

die für das initiale Anbinden und Rollen der Leukozyten an Venenendothelien vor der

Diapedese verantwortlich sind. Die Selektinfamilie setzt sich aus drei Subtypen zusammen,

wobei L-Selektin auschließlich auf Leukozyten, P-Selektin ausschließlich auf

Thrombozyten und E- und P-Selektin auf vaskulären Endothelzellen exprimiert wird. L-

Selektin besteht aus mehreren Domänen: einer extrazellulären aminoterminalen

Lektindomäne, einer dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnlichen Domäne und Short

repeat Units, die denen an C3/C4-komplementbindenden Proteinen ähneln (Tedder et al,

1995). L-Selektin interagiert mit vielen verschiedenen Liganden, u. a. GlyCAM-1

(glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1), MadCAM-1 (mucosal addressin cell

adhesion molecule-1) und CD34, welche alle auf hochendothelialen Venen des

lymphatischen Gewebes exprimiert werden (Ley et al, 1993; Kansas et al, 1996). 1998

wurde der erste Polymorphismus in CD62L beschrieben, welcher in Codon 213 zu einem

29

AS-Austauch von Prolin zu Serin führt, und zwischen inkompatiblen Spender- und

Empfänger-Paaren eine erhöhte aGvHD-Inzidenz bei Patienten verursacht (Maruya et al,

1998). Zudem wurde 2010 ein weiterer Polymorphismus in Codon 206 beschrieben, der

zum Austausch von Phenylalanin durch Leucin führt (Heinold et al, 2010). Ein durch die

CD62L-Polymorphismen kodiertes mHag könnte möglicherweise in HLA-Molekülen, die

zur HLA-A3-Superfamilie oder zur HLA-B44-Superfamilie gehören, exprimiert werden

(Maruya et al, 1998).

Katagiri und seine Mitarbeiter haben 2006 eine verminderte Relapseinzidenz nach HSCT

für CD62L gemismatchte Patienten feststellen können (Katagiri et al, 2006).

1.3.4 Y-chromosomal kodierte mHag

Obwohl nahezu 98% der auf dem X- und Y-Chromosom kodierten Peptide in ihrer

Aminosäureabfolge identisch sind, bleiben noch die restlichen 2% als Y-Chromosom-

spezifische Peptide übrig, die u. a. für spezifische Y-chromosomale mHag kodieren

können (Millrain et al, 2005; Vogt et al, 2000; Warren et al, 2000; Müller, 1996; Meadows

et al, 1997). Y-chromosomal kodierte mHag spielen besonders bei einer HSCT mit

weiblichem Donor und männlichem Empfänger eine Rolle, da die weiblichen Spender-T-

Zellen die auf den Empfängerzellen exprimierten mHag als fremd erkennen und somit eine

GvHD auslösen können. Die Bedeutung Y-chromosomaler mHags auf die Entwicklung

einer GvHD/GvL nach HSCT ist genauso widersprüchlich, wie die autosomaler mHags

(Stern et al, 2006; Randolph et al, 2004; Goulmy et al, 1996b; Spellman et al, 2009). Da

wir die einzelnen geschlechtsspezifischen mHag in unserer Studie nicht

molekulargenetisch untersucht haben, haben wir den Einfluss von Y-chromosomalen

mHag durch Einführung der Kovariaten „Geschlechtsmismatch“ berücksichtigt, welche bei

weiblichem Spender/männlichem Patienten als positiv und in allen anderen Fällen negativ

gewertet wird.

30

1.3.5 Tabellarische Übersicht über die untersuchten Minor Histokompatibilitätsantigene (mHag)

Tabelle 4: Übersicht der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten mHag HA-1 bis UGT2B17; mHag: Minor Histokompatibilitätsantigen, Lbc: Lymphoid blast crisis

oncogen, BCL-2: B-cell lymphoma 2, PECAM-1: platelet endothelial cell adhesion molecule 1, LECAM-1: leucocyte endothelial cell adhesion molecule 1, PANE-1:

proliferation associated nuclear element 1, UDP: Uridindiphosphat, CD: cluster of differentiationm, dbSNP: database of SNP’s

mHag Gen (Chromosom) Protein; Funktion Aminosäurepolymorphismen antigenes Peptid dbSNP HLA-Restriktion Referenz

HA-1 KIAA0223/HMHA1

(19p13.3) unbekannt; intrazelluläre Signalweiterleitung

Histidin (H) VLHDDLLEA von HA-1

H rs1801284 HLA-A*02

den Haan et al, 1998 Arginin (R)

HA-2 MYO1G

(7p13-p11.2) Klasse I Myosin; intrazellulärer Transport

Valin (V) YIGEVLVSV von HA-2

V rs61739531 HLA-A*02

Pierce et al, 1995;

den Haan et al, 1995 Methionin (M)

HA-3 Lbc/AKAP13

(15q24-q25) Lbc; Onkogen

Threonin (T) VTEPGTAQY von HA-3

T rs7162168 HLA-A*01

Spierings et al,

2003 Methionin (M)

HA-8 KIAA0020

(9p24.2) unbekannt

Arginin (R) RTLDKVLEV von HA-8

R rs2173904 HLA-A*02

Brickner et al, 2001 Prolin (P)

HB-1 HMHB1

(5q31.3) unbekannt

Histidin (H) EEKRGSLHVW von HB-1H

und EEKRGSLYVW von HB-1Y

rs161557 HLA-B*44 Dolstra et al, 1999

und 2002 Tyrosin (Y)

ACC-1 BCL2A1 (15q24.3)

BCL2 related protein A1; antiapoptotisch

Tyrosin (Y) DYLQYVLQI von ACC-1

Y rs1138357 HLA-A*24 Akatsuka et al,

2003a

Cystein ( C)

ACC-2 Asparaginsäure (D)

KEFEDDIINW von ACC-2D

rs3826007 HLA-B*44 Glycin (G)

CD 31 (Cd 125)

CD31

(17q23.3)

CD31 (PECAM-1); Adhäsion, Migration,

Angiogenese

Leucin (L)

unbekannt

rs668

HLA-B7- oder

B44- Superfamilie (vermutet)

Behar et al, 1996; ,

Maruya et al, 1998

Valin (V)

CD 31

(Cd 563)

Asparagin (N) rs12953

Serin (S)

CD 31 (Cd 670)

Arginin (R) rs1131012

Glycin (G)

CD62L

(Cd 206) CD62L

(1q23-q25)

CD62L (LECAM-1); Adhäsion und

Aggregation von Leukozyten

Phenylalanin (F)

unbekannt

rs1131498 HLA-A3- oder

HLA-B44-

Superfamilie (vermutet)

Maruya et al, 1998 Leucin (L)

CD62L (Cd 213)

Prolin (P) rs2229569

Serin (S)

PANE-1 PANE-1

(22q13.2) PANE-1; unbekannt

Arginin (R) RVWDLPGVLK rs5758511 HLA-A*03

Brickner et al,

2006 stoppcodon

UGT2B17 UGT2B17

(4q13)

UDP-Glykosyltransferase-Familie; Katabolismus von

Hormonen,Toxinen,Bilirubin

pos./neg. AELFNIPFLY -- HLA-A*29 Murata et al, 2003

31

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit

Zielsetzung dieser Arbeit ist es, den Einfluss von mHag-Disparitäten zwischen Patienten

und Spendern in Bezug zum Therapieerfolg einer HSCT zu analysieren. Hierfür ist es

zunächst erforderlich, ein bereits existierendes kommerzielles Testkit zur Analyse von

mHag-Polymorphismen in unserem Labor zu etablieren und zu validieren. Mit einer

einheitlichen Methodik soll eine größtmögliche Anzahl an mHag-Polymorphismen an

einer möglichst großen Patienten-und-Spender-Kohorte nach unverwandter, allogener

HSCT untersucht werden. Der untersuchte Einfluss wird an Hand der Messgrößen

Gesamtüberleben, Inzidenz eines Relapses, Transplant related mortality / Non relapse

mortality und Inzidenz einer aGvHD Grad II bis IV abgeschätzt. Außer den mHag-

Disparitäten soll in die statistischen Modelle auch der Einfluss anderer, patienten-,

spender- sowie therapiebezogener Risikofaktoren einfließen.

Die widersprüchlichen Ergebnisse bisheriger Studien zum Einfluss von mHag-Mismatchen

auf den Erfolg einer HSCT, verursacht u. a. durch verschiedene Studienpopulationen,

verschiedene Größe der Studienpopulationen und verschiedene statistische

Analysemethoden, zeigen uns, dass es in diesem Bereich noch weiterer Klärung bedarf, zu

der wir mit unserer Studie beitragen möchten. Im Gegensatz zur gut untersuchten aGvHD-

Inzidenz wurde der Einfluss von mHag auf andere Endpunkte, wie TRM/NRM,

Relapseinzidenz oder Gesamtüberleben, bisher in vielen Studien nicht berücksichtigt.

Für diesen Zweck wird eine Kohorte von 320 erwachsenen Patienten mit verschiedenen

malignen hämatologischen Erkrankungen in verschiedenen Stadien, welche zwischen 1997

und 2002 in 10 verschiedenen Tx-Zentren deutschlandweit mit unverwandten Spendern

transplantiert worden sind, und deren Spender genetisch getestet. Die Patienten-Spender-

Paare werden danach anhand der HLA-Restriktion der jeweiligen mHag in verschiedene

Subgruppen unterteilt, in denen in einem multivariaten Risikomodell der Einfluss von

mHag-Mismatchen unter Berücksichtigung der vorher identifizierten Risikofaktoren

analysiert wird.

Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit soll der Einfluss von mHag-Differenzen und weiteren

klinischen Risikofaktoren im Rahmen des aktuellen wissenschaftlichen Forschungsstands

neu evaluiert und eventuell resultierende neue therapeutische Konsequenzen diskutiert

werden.

32

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Probenmaterial

In der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Studie wird die DNA von 320 Patienten

und deren HLA-A, -B, -C, -DRB1 und DQB1 kompatiblen Fremdspendern (MUD) auf die

Genotypen der mHag HA-1, -2, -3, -8, HB-1, ACC-1 und -2, CD31 - (PECAM-1) - Codon

125, 563 und 670, CD62L - (LECAM-1) - Codon 206 und 213, PANE-1 und UGT2B17

untersucht. Es liegen schon zu Beginn der Studie DNA-Asservate aller Spender und

Patienten vor, sodass keine erneute Probenentnahme durchgeführt werden muss. Die

Konzentration der DNA-Asservate wird photometrisch bestimmt und liegt bei allen Proben

über einem Mindestwert von 10ng/µl.

Im Rahmen einer Vorgängerstudie zum Einfluss der HLA-Kompatibilität auf den

klinischen Ausgang einer HSCT wurden alle Proben HLA-A, -B, -C, -DRB1 und -DQB1

typisiert, anonymisiert und mit einer laboreigenen, spezifischen Identifikationsnummer

versehen. Der Kompatibilitätsgrad zwischen Spender und Patient entspricht den im

Zweiten Deutschen Konsensus zur immungenetischen Spenderauswahl für die allogene

Stammzelltransplantation festgelegten Kriterien zur Übereinstimmung in den HLA-

Merkmalen (Ottinger et al, 2001).

Zusätzlich zu den von uns typisierten DNA-Proben werden acht Referenzproben aus

Heidelberg typisiert (Abteilung Transplantationsimmunologie, Universitätsklinikum

Heidelberg).

Das Projekt wurde von der Ethikkommission der Universität Ulm beurteilt; ein positives

Votum liegt vor (Antrag-Nr. 263/09).

Einen Überblick über den HLA-Matchinggrad der untersuchten Kohorte gibt Tabelle 5.

Tabelle 5: Kompatibilitätsgrad zwischen Patienten und deren Spendern (n=320)

kein HLA-Mismatch >0 HLA-Mismatche

119 Paare (37,2%) 201 Paare (62,8 %)

33

2.1.2 Studiendesign und Patientencharakteristika

Die Patientenkohorte wird nach folgenden Kriterien ausgewählt:

Transplantation ausschließlich durch Fremdspender (MUD), keine Familienspender

Patienten älter als 18 Jahre

Patienten mit HLA-Merkmalen, die der HLA-Restriktion von mindestens einem

mHag entsprechen (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 5, Tabelle 4, HLA-Restriktion)

Vorhandensein von DNA und klinischen Follow-Up-Daten von Spender und

Patient

Die Transplantationen wurden zwischen 1997 und 2002 in 10 verschiedenen deutschen

Transplantationszentren (Berlin, Erlangen, Hannover, Heidelberg, Jena, Mainz, München,

Regensburg, Ulm und Wiesbaden) durchgeführt. Die Patienten (190 männlich, 130

weiblich) sind an akuter myeloischer (98 Pat.) oder akuter lymphatischer Leukämie (58

Pat.), chronisch myeloischer Leukämie (88 Pat.), myelodysplastischem Syndrom (27 Pat.)

oder sonstigen hämatologischen Erkrankungen (49 Pat.) erkrankt. Unter dem Begriff

„sonstige“ werden diejenigen Erkrankungen zusammen gefasst, deren jeweiliger Anteil

unter 5% der Gesamterkrankungen liegt. Er setzt sich aus nicht näher spezifizierten

Lymphomen (17 Pat.), Non-Hodgkin-Lymphomen (8 Pat.), Hodgkin-Lymphomen (4 Pat.),

Multiplem Myelom/Plasmozytom (13 Pat.), schwerer aplastischer Anämie (2 Pat.),

chronisch lymphatischer Leukämie (4 Pat.) und nicht weiter spezifizierter sekundärer

akuter Leukämie (1 Pat.) zusammen.

Für die Erkrankungen AML, ALL, CML und MDS bestanden schon in den Rohdaten des

Deutschen Registers für Stammzelltransplantation (DRST) Stadieneinteilungen nach

Schwere der Grunderkrankung. Die verschiedenen Krankheitsstadien sind wie folgt

definiert:

Frühes Krankheitsstadium (Stadium 1) – 124 Patienten:

AML und ALL in erster kompletter Remission (1CR)

CML in erster chronischer Phase (1CP)

MDS in Niedrigrisikogruppe (geringe Blasteninfiltration des KM, langsam

fortschreitende Erkrankung)

34

Mittleres Krankheitsstadium (Stadium 2) – 100 Patienten:

AML und ALL in zweiter kompletter Remission (2CR) oder erstem Relapse (rel1)

CML in zweiter chronischer Phase (2CP) oder akzelerierter Phase (AP)

MDS in mittlerer Risikogruppe (fortschreitende Blasteninfiltration des KM)

Fortgeschrittenes Krankheitsstadium (Stadium 3) – 49 Patienten:

AML und ALL in zweitem oder höherem Relapse (>rel1) oder primär refraktärer

Erkrankung

CML in Blastenkrise (BC)

MDS in Hochrisikogruppe (breite Blasteninfiltration des KM, schnell

fortschreitende Erkrankung)

Bei 47 Patienten fehlen die Daten zum Krankheitsstadium.

Vor Transplantation erhalten die Patienten entweder eine myeloablative oder eine

reduzierte Konditionierungstherapie. Die myeloablative Konditionierung (MAC) besteht

aus einer Ganzkörperbestrahlung (TBI) mit einer Dosis von >500cGy einmalig oder

>800cGy in fraktionierten Dosen (mit oder ohne Cyclophosphamid (Cy) >4mg/kg KG)

oder aus einer Hochdosischemotherapie mit Cy > 4mg/kg KG (mit oder ohne Busulfan,

Purin-Analoga oder Antikörpern) (Gonçalves et al, 2009). Die reduzierte Konditionierung

(RIC) besteht aus entweder einer alleinigen Ganzkörperbestrahlung (TBI) mit einer Dosis

≤ 500cGy einmalig oder ≤ 800cGy fraktioniert oder einer Kombination dieser mit einer

Niedrigdosischemotherapie (Cy ≤4mg/kg KG, Busulfan ≤9mg/kg KG, Melphalan

≤140mg/m2, Thiotepa ≤10 mg/kg KG, Purin-Analoga in niedriger Dosierung) (Giralt,

2005; Aoudhjane et al, 2005).

Nach Transplantation erfolgt bei den meisten Patienten eine GvHD-Prophylaxe durch eine

Kombination von Cyclosporin A und Methotrexat (CsA+MTX) oder durch CsA und

anderen Therapeutika (Mycophenolatmofetil - MMF -, Steroide, monoklonale Antikörper).

Bei 14 Patienten erfolgte eine andere nicht näher bezeichnete GvHD-Prophylaxe.

Detaillierte patientendemographische Daten sind in Tabelle 6 aufgeführt.

35

Tabelle 6: Patientendemographie; N: Anzahl, Tx: Transplantation, AML: akute myeloische Leukämie, ALL:

akute lymphoblastische Leukämie, CML: chronisch myeloische Leukämie, MDS: myelodyplastisches

Syndrom, MTX: Methotrexat, KM: Knochenmark, PBSZ: periphere Blutstammzellen, GvHD: Graft-versus-

host-disease, TRM: Transplant related mortality, NRM: Non relapse mortality, HLA: humanes

Leukozytenantigen, Erkr.: Erkrankung

N evaluiert N(%)

Anzahl Patienten 320

Anzahl Tx-Zentren 10

Patientenalter bei Tx 320

11-20 Jahre 16 (5,0%)

21-30 Jahre 63 (19,7%)

31-40 Jahre 96 (30,0%)

41-50 Jahre 90 (28,1%)

51-60 Jahre 51 (15,9%)

>60 Jahre 4 (1,3%)

Geschlecht 320

männlich 190 (59,4%)

weiblich 130 (40,6%)

medianes Patientenalter (Bereich) Jahre

320 39 (18-67)

medianes Spenderalter

(Bereich) Jahre 306 36 (19-59)

Geschlechtsmatch 319

Männlich/Männlich 134 (42,0%)

Männlich/Weiblich 56 (17,6%)

Weiblich/Männlich 75 (23,5%)

Weiblich/Weiblich 54 (16,9%)

Diagnose 320

AML 98 (30,6%)

ALL 58 (18,1%)

CML 88 (27,6%)

MDS 27 (8,4%)

sonstige 49 (15,3%)

Krankheitsstadium 320

Stadium 1 124 (38,8%)

Stadium 2 100 (31,3%)

Stadium 3 49 (15,3%)

unbekannt 47 (14,7%)

Stammzellquelle 320

KM 158 (49,4%)

PBSZ 162 (50,6%)

Konditionierung 315

myeloablativ 273 (86,7%)

reduced intensity 42 (13,3%)

GvHD-Prophylaxe 318

Cyclosporin + MTX

(± andere) 259 (81,5%)

Cyclosporin ± andere 43 (13,5%)

andere 16 (5%)

T-Zell Depletion 320

keine 311 (97,2%)

vorhanden 6 (1,9%)

unbekannt 3 (0,9%)

36

Todesursache 204

Relapse / Fortschreiten

der Erkr. 57 (27,9%)

sekundäre maligne Erkr. 2 (1%)

TRM/NRM 132 (64,7%)

andere 2 (1%)

unbekannt 11 (5,4%)

HLA-Match 320

Match 119 (37,2%)

Mismatch 201 (62,8%)

Medianes Follow-up 116 334,5 Tage (11,1 Monate)

2.1.3 Laborgeräte und -materialien

96-well Reaktionsplatte mit Barcode Part.No. 4306737, Applied Biosystems GmbH,

Foster City, USA

Abzugshaube, mc6 Elektromodul, Waldner Holding GmbH und Co. KG, Wangen,

Deutschland

Digital Graphic Printer UP-D897, Sony, bezogen durch Biozym Scientific GmbH,

Hessisch Oldendorf, Deutschland

Domed Cap Strips, Cat.# SP-0216, Thermo Scientific, ABgene, Epsom, UK

Druckerpapier für Thermodrucker UPP-110S, Sony, Deutschland

Erlenmayer-Kolben 500ml: Duran Retrace Code 00788967, Schott AG, Mainz,

Deutschland

Gefrierschrank: Sanyo VIP MDF-U53V, Sanyo House, Watford/Herts, UK

Gel-Elektrophoresekammer, Prod.No 501, Universitätsklinikum Heidelberg, Institut für

Immunologie, Heidelberg, Deutschland

Klebefolie für 96-well Platten, Cat.# AB-0558, Adhesive PCR Film, Thermo

Scientific, ABgene, Epsom, UK

Kühl- und Gefrierschränke Modelle Premium, Comfort und Profi-Line, Firma Liebherr

Hausgeräte Ochsenhausen GmbH, Ochsenhausen, Deutschland

Mikrowelle, Marke Exquisit, Firma GGV Handelsgesellschaft mbH & Co. KG, Kaarst,

Deutschland

Multipette® plus, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

PCR-Thermocycler:

PTC-200, MJ Research Ltd., Watertown, Massachusetts, USA

GeneAmp PCR Systems 9700, Applied Biosystems GmbH, Foster City,

USA

37

peqSTAR, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland

Pipetten:

Modell Eppendorf Research® (variabel) 0,5-10µl, 10-100µl, 100-1000µl

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Modell Eppendorf Reference® (variabel) 0,5-10µl, 10-100µl, 100-1000µl

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Pipettenspitzen:

0,5-10µl Plastibrand® Filter Tips, Brand GmbH+Co KG, Wertheim,

Deutschland

10µl Safe Seal Tips® premium, Biozym Scientific GmbH, Hessisch

Oldendorf, Deutschland

100µl Safe Seal Tips® premium, Biozym Scientific GmbH, Hessisch

Oldendorf, Deutschland

1000µl Safe Seal Tips® premium, Biozym Scientific GmbH, Hessisch

Oldendorf, Deutschland

Präzisionswaage, Scout Pro 2000g, Ohaus Waagen Vertriebs GmbH, Giessen,

Deutschland

Reaktionsgefäße, 1,5ml, Prod. No. 0030125.150, Eppendorf AG, Hamburg,

Deutschland

Skalpell, Disposable Scalpel, Feather Safety Razor Co. Ltd., Osaka, Japan

Spannungsversorger Pharmacia Biotech EPS 300 für Gel-Elektrophoresekammern,

Pharmacia Biotech AG, Uppsala, Schweden

Spektralphotometer, NanoDrop 1000, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen,

Deutschland

Thermometer, Standard Glasthermometer E737.1, Carl Roth GmbH und Co. KG,

Karlsruhe, Deutschland

Tischzentrifuge für 1,5ml Eppendorf-Tubes, Centrifuge 5415D, Eppendorf AG,

Hamburg, Deutschland

Transilluminator (Fluoreszenz-Imager + PC ), AlphaImager EP, AlphaImmotech,

Biozym scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland

Vortex-Genie 2, Scientific Industries Inc., Bohemia, New York, USA

Zentrifuge: Multifuge 3 S-R, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland

38

2.1.4 Chemikalien, Reagenzien, Enzyme

Agarose Biozym LE, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland

Ethidiumbromid 0,07%, Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg, Deutschland

LiChrosolv® Wasser (Aqua dest.), Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Taq DNA Polymerase, 5units/µl, Mat.Nr.1005476, Qiagen, Hilden, Deutschland

Borsäure 900nM, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

EDTA 25nM, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Titriplex III, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

Tris(hydroxymethyl)aminoethan 900nM, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland

2.1.5 Verwendete kommerziell erhältliche Komplettsysteme (Testkits)

Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit® , Prod.Code 25-6600-30/31/32, GE

Healthcare Europe GmbH, Freiburg/München, Deutschland

mHA CTS-PCR-SSP MINITRAY KIT, Prod.No.229, Universitätsklinikum

Heidelberg, Heidelberg, Deutschland

2.2 Methoden

2.2.1 Herstellung von Reagenzien und Lösungen

Die nachfolgend genannten Reagenzien werden zur Durchführung der

Agarosegelelektrophorese benötigt:

2.2.1.1 Agarose Gel 2%ig

In einem Erlenmayerkolben (Volumen: 500ml) werden auf 6g Agarose 300ml

1xBoratpuffer aufgefüllt. Das Gemisch wird in der Mikrowelle aufgekocht und

zwischendurch geschwenkt, bis die Agarose vollständig aufgelöst und die Lösung somit

klar ist. Anschließend wird der Behälter unter fließendem kaltem Wasser bis auf 60° C

abgekühlt (Gelthermometer) und unter den Abzug gestellt. Für die folgenden Schritte ist

39

das Tragen von geeigneter Schutzkleidung (u.a. Nitrilhandschuhe, Schutzkittel)

erforderlich, da mit potentiell mutagener Substanz umgegangen wird.

Unter dem Abzug werden nun 6-8 Tropfen 0,07%iges Ethidiumbromid in die

Agaroselösung gegeben und das fertige Gemisch geschwenkt, damit sich das

Ethidiumbromid verteilt. Die Lösung wird nun gleichmäßig in einen schon vorbereiteten

Gelschlitten mit Gelkämmen gegossen und zum erstarren 20 Minuten unter die

Abzugshaube gestellt. Daraufhin werden die Gelkämme entfernt und der Agarosegel in

eine mit 1xBoratpuffer gefüllte Gelkammer platziert.

2.2.1.2 10x Boratpuffer

Zuerst werden 544,6g Tris(hydroxymethyl)aminoethan, 278,0g Borsäure und 46,52g

EDTA jeweils einzeln abgewogen und zusammen geschüttet. Danach werden die drei

Substanzen ad 5000ml mit Aqua dest. aufgefüllt. Die Lösung wird umgerührt bis die

Substanzen vollständig gelöst und die Lösung somit klar ist. 10x Boratpuffer ist die

konzentrierte Aufbewahrungsform des zur Analyse benötigten 1x Boratpuffers.

2.2.1.3 1x Boratpuffer

200ml des 10xBoratpuffers werden auf insgesamt 2000ml mit destilliertem Wasser

aufgefüllt. Somit ist die notwendige Pufferkonzentration zur Gelelektrophorese erreicht.

2.2.2 Konzentrationsbestimmung der DNA

Zur Amplifikation mit dem GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit® muss die DNA in

einer Konzentration von mindestens 10ng/µl vorliegen, da ansonsten keine ausreichende

Qualität des Produktes garantiert werden kann. Deswegen messen wir die Konzentration

von 1µl Ausgangs-DNA mit Hilfe des NanoDrop Spektralphotometers bei einer

Wellenlänge von 260 bzw. 280nm. Dabei absorbiert DNA Licht der Wellenlänge 260nm,

die Messung bei 280nm dient der Reinheitsgradkontrolle (Absorptionsmaximum von

Proteinen). Bei reiner DNA sollte der 260/280-Quotient zwischen 1,8 und 2,2 liegen, jeder

Wert unter 1,8 zeigt eine Verunreinigung mit Proteinen.

40

2.2.3 Multiple Displacement Amplification (MDA) mit GenomiPhi V2 DNA

Amplification Kit®

2.2.3.1 Methodik

Die MDA ist eine enzymatische Methode zur Vermehrung langer DNA-Abschnitte aus

geringen Mengen an Ausgangs-DNA bei gleichbleibender Temperatur (Dean et al, 2001;

Dean et al, 2002). Es werden sogenannte Random Primer benutzt, die im Gegensatz zu

PCR-Primern das ganze Genom ohne Bevorzugung bestimmter Abschnitte vervielfältigen.

Aufgrund ihrer hohen Prozessivität und starken Fähigkeit, den neu gebildeten

Komplementärstrang von der Matrize zu verdrängen, wird bei der MDA die φ29-DNA-

Polymerase verwendet (Lasken, 2009). Dies erlaubt ein mehrmaliges Abschreiben des

gleichen Matrizenstranges: Nach erneuter Primerbindung bindet die φ29-DNA-Polymerase

an die Matrize und spaltet währenddessen einen kurz vorher gebildeten

Komplementärstrang ab (siehe Abbildung 7 und 8).

Dank der 3’-5’-Exonukleaseaktivität der φ29-DNA-Polymerase ist die Fehlerrate beim

Einbau von Nukleotiden auf 1 von 3x106 Basen reduziert (zum Vergleich: konventionelle

PCR: 1 falsch eingebaute auf 2x103 Basen). Die Random Primer sind an ihrem 3’-Ende

mittels Bindung an Phosphorothioat gegen die Exonukleaseaktivität geschützt.

Abbildung 7: MDA (Multiple Displacement Amplification)-Reaktion; DNA:

Desoxyribonukleinsäure (Quelle: Lasken, 2009)

2.2.3.2 Durchführung

Da die in unserer Studie benötigten DNA-Proben schon als Asservate vorliegen, erfolgt

keine erneute DNA-Isolierung. Wegen der geringen vorhandenen Menge an DNA wird

jedoch eine Vermehrung mit Hilfe der MDA-Methode mit einem GenomiPhi V2 DNA

41

Amplification Kit® durchgeführt. Dies haben wir gemäß den Herstelleranweisungen wie

folgt eingesetzt:

Zuerst werden von jeder Probe 1µl DNA (Mindestkonzentration: 10ng/µl) in die 96-well

Reaktionsplatten vorgelegt. Nachdem wir zu jeder Probe 9µl Samplepuffer hinzugegeben

haben, wird die Platte für 3min bei 95° C denaturiert und dann auf 4° C abgekühlt. Die

folgenden Schritte werden auf einem Kühlrack pipettiert. Zuerst werden für jede Reaktion

1µl Enzymmix (φ29-DNA-Polymerase) und 9µl Reaktionspuffer (bestehend aus Random

Primern, dNTP’s, Salz und Puffer) zusammengefügt, dann wird von diesem Mix jeweils

10µl auf jede Probe in der Barcodeplatte pipettiert. Danach erfolgt die Amplification im

Thermocycler für 1,5 Stunden bei 30° C. Am Schluss erhöhen wir zur Hitzeinaktivierung

der φ29-DNA-Polymerase für 10min die Temperatur auf 65° C.

Abbildung 8: Ablauf einer DNA-Amplifikation mittels MDA (Multiple Displacement

Amplification), DNA: Desoxyribonukleinsäure, dNTPs: Desoxyribonukleosid-

triphosphate, Phi29: Phage des Bacillus subtilis (Quelle: GE Healthcare, illustra

GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit, Product web protocol, user manual, 2012)

Die vervielfältigte DNA ist nun das Ausgangsmaterial für unsere PCR-SSP-Testungen.

Die mit dem GemomiPhi V2 DNA Amplification Kit ® gewonnene DNA hat eine

Konzentration von 4-7µg in 20µl Reaktionsvolumen (ca. 280 ng/µl), bei einer

42

Mindestausgangskonzentration von 10ng/µl, muss bei -20° C gelagert werden und ist

genauso lange haltbar wie genomische DNA (mehrere Jahre).

2.2.4 PCR-SSP (Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern)

mit Hilfe des mHA CTS-PCR-SSP Minitray Kit

2.2.4.1 Methodik: Polymerasekettenreaktion (PCR) und PCR-SSP

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine enzymatische Methode zur Vervielfältigung

spezifischer DNA-Abschnitte und somit das Kernstück der molekulargenetischen

Gewebetypisierung. Mit Hilfe einer zyklisch durchgeführten DNA-Strangseparation (94-

96° C) mit anschließender Primeranlagerung an beiden Enden des zu amplifizierenden

Teils (ca. 65° C) und darauffolgender Neusynthese des jeweils komplementären Strangs

durch den Einsatz einer thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) und dNTPs

(ca. 72° C) erfolgt die exponentielle Vervielfältigung ausgewählter DNA-Zielsequenzen.

Diese Zielsequenzen treten in quantitativer Hinsicht deutlich gegenüber anderen DNA-

Abschnitten in den Vordergrund und können somit durch nachfolgende Verfahren

(Gelelektrophorese, Färbung) deutlich sichtbar gemacht werden.

Der Erfolg einer PCR hängt maßgeblich von der Primerauswahl (Spezifität), der Qualität

und Quantität der eingesetzten DNA, der Magnesiumkonzentration, und dem

Temperaturprofil der Amplifikationsreaktion im Thermocycler ab.

Durch den Einsatz allel- bzw. gruppenspezifischer Primerkombinationen in einer PCR-

Reaktion erlaubt das PCR-SSP Verfahren die Differenzierung von Allelen bzw.

Allelgruppen. Gemäß den bestehenden Sequenzinformationen werden

Primerkombinationen gewählt, die nur bei Anwesenheit eines bestimmten Allels oder einer

Allelgruppe zur Bildung eines PCR-Produktes führen. Durch Positionierung des 3’-

Terminus eines Primers an eine polymorphe Basenposition der Ausgangs-DNA wird im

Falle einer Fehlpaarung (mismatch) die Primerelongation durch die Taq-Polymerase

verhindert, da diese keine 3’-5’ Exonuklease-Aktivität besitzt. Findet sich eine passende

Kombination (match), wird ein spezifisches Produkt gebildet. So erlaubt die PCR-SSP-

Methode den direkten Nachweis von Punktmutationen (SNP’s) durch eine einfache PCR-

Reaktion. Außerdem können in einem diallelischen System alle drei möglichen Genotypen

mit Hilfe von nur zwei sequenzspezifischen PCR-Reaktionen bestimmt werden.

43

Zur Kontrolle der PCR-Amplifikation wird zu jedem Primerpaar ein Kontrollprimerpaar

hinzugefügt, das ein in jeder DNA-Probe vorhandenes Gen amplifiziert und folglich immer

zu einer sichtbaren Bande führen soll (interne Positivkontrolle).

Der Nachweis der Amplifikate erfolgt anschließend mittels Agarose-Gelelektrophorese.

Die Interpretation des erhaltenen Amplifikatmusters zur Genotypbestimmung erfolgt

anhand des erwarteten Amplifikationsverhaltens der spezifischen Primerpaare für die

jeweiligen Allele, wobei auf Fehlklassifikationen der Amplifikationsreaktionen (falsch-

positive, falsch-negative) zu achten ist (siehe hierzu Abbildung 9, Abbildung 11 und

Tabelle 9).

2.2.4.2 Durchführung

Zur mHag-Genotypisierung der 320 Patienten-Spender-Paare benutzen wir das PCR-SSP

Kit der Abteilung Transplantationsimmunologie des Universitätsklinikums Heidelberg

(mHA CTS-PCR-SSP Minitray Kit).

In einem Kit sind folgende Komponenten enthalten:

32-well-Minitrays mit je 27 vorpipettierten, lyophilisierten allelspezifischen PCR-

Primermixen und einem Negativkontrollmix an Position 28 (12 Stück)

1,3ml 5% Mastermix (Ammoniumsulfat, Tris Puffer, Magnesiumchlorid, Glycerin,

dNTP’s und Cresol-Red Markerfarbstoff)

Minitray-Caps

Die PCR wird gemäß den Vorgaben des Kitherstellers wie folgt angesetzt:

Zuerst werden 92µl Mastermix in einem Eppendorf-Tube vorgelegt und mit 219,3µl Aqua

dest. und 1,93µl Taq Polymerase zusammen pipettiert; der Mix sollte gut gemischt werden.

Hiervon werden 10µl in das Negativkontroll-Well abgegeben. Danach fügen wir 33µl

DNA (Mindestkonzentration: 100 – 150ng/µl) hinzu, mischen gut und sorgfältig, und

verteilen 10µl vom Mix in jedes der 27 wells des Trays. Jetzt wird die PCR-Reaktion mit

dem in Tabelle 7 angegebenen Thermocyclerprofil gestartet.

44

Abbildung 9: PCR-SSP (Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern),

PCR: Polymerasekettenreaktion (Quelle: Waßmuth, 2005c)

Tabelle 7: Thermocyclerprofil; min: Minute, sec: Sekunde, ° C: Grad Celsius

Initiale Denaturierung 94° C, 2min

Denaturierung 94° C, 15sec

Annealing und Elongation 65° C, 1min

10 Zyklen

Denaturierung 94° C, 15sec

Annealing 61°C, 50sec

Elongation 72° C, 30sec

20 Zyklen

Kühlen 4° C, 15min

45

Jeder Primermix enthält zusätzlich zu den sequenzspezifischen Primern noch ein

Kontrollprimerpaar, welches ein Teil des CRP-Gens (440bp Länge) vervielfältigt, als

interne Positivkontrolle.

Eine genaue Übersicht über die Primerspezifitäten und die Größe des allelspezifischen

Amplifikats gibt Abbildung 10 (Lokalisation der SNP’s, siehe hierzu Kapitel 1.3.,

Abschnitt 5, Tabelle 4):

Abbildung 10: Primermixe (durchnummeriert), Primerspezifitäten (Minor

Histokompatibilitätsantigen), detektiertes Allel (Angabe des Einbuchstaben-

Aminosäurecode nach IUPAC-IUB Vereinbarung von 1969), Größe des spezifischen

Amplifikates und der internen Positivkontrolle; PECAM-1 entspricht CD31 (Quelle: Tran

TH, Human Minor Histocompatibility Antigen (mHA) CTS-PCR-SSP Minitray Kit,

Working instruction, Locus- and Lot-specific manual No:29, CTS Heidelberg, 2008)

46

2.2.5 Agarosegelelektrophorese

2.2.5.1 Methodik

Zum Nachweis der PCR-Amplifikate kann eine Agarose-Gelelektrophorese, eine Methode

zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe und darauffolgende

Sichtbarmachung durch Färbung, durchgeführt werden.

Aufgrund der negativen Ladung ihrer Phosphodiesterbrücken wandert die DNA in einem

Gleichspannungsstromfeld von der negativen zur positiven Elektrode. Da diese Wanderung

durch den Widerstand einer Agarosegelmatrix erfolgt, trennen sich die verschiedenen

DNA-Fragmente voneinander und von den Primern wegen ihrer größenbedingten

unterschiedlichen Laufgeschwindigkeiten in der Matrix auf. Durch die Zugabe von

Ethidiumbromid, einem Fluoreszenzfarbstoff, der zwischen die Basenpaare der DNA

interkaliert, werden die DNA-Fragmente als Banden unter UV-Licht (302nm) auf einem

Transilluminator sichtbar gemacht.

2.2.5.2 Durchführung und Auswertung

Zur Herstellung des 2%igen Agarosegels und des Boratpuffers siehe Kapitel 2.2.,

Abschnitt 1.

Da das PCR-Produkt schon durch den Mastermix mit Cresolrot gefärbt ist, kann auf eine

weitere Zugabe eines Gel-Ladepuffers verzichtet werden. 10µl des PCR-Produkts werden

nun in die Geltaschen des verfestigten Gels aufgetragen, nachdem das Gel in eine mit 1x

Boratpuffer gefüllte Laufkammer platziert wurde. Die Laufbedingungen der

Gelelektrophorese sind in Tabelle 8 beschrieben.

Nach Beendigung der Gelelektrophorese können die spezifischen Banden im Fluoreszenz-

Imager durch Beleuchten mit UV-Licht (302nm) sichtbar gemacht, anschließend

fotografiert und ausgedruckt werden (siehe hierzu Abbildung 11).

Tabelle 8: Laufbedingungen der Gelelektrophorese, bp: base pairs, V: Volt, mA:

Milliampere, min: Minuten

Konzentration

der Agarose

Auftrennbare

Fragmente (bp)

Spannung (V) Stromstärke

(mA)

Laufzeit (min)

2% 100 – 1000 180 400 15-20

47

Abbildung 11: Beispiel eines Agarosegelelektrophoresebildes (links) mit dazugehörigem

Typisierungsergebnis (rechts), Pos = Position

Anhand der Größe und dem Vorhandensein der Amplifikate werden die Reaktionen als

positiv oder negativ ausgewertet (siehe hierzu Abbildung 11). In jeder Reaktion wird zur

spezifischen Bande zusätzlich noch ein 440bp großes Stück des CRP-Gens als interne

Positivkontrolle vervielfältigt, somit müssen bei jeder positiven Reaktion 2 Banden

vorhanden sein. Anhand Abbildung 10 wird dieses Ergebnis in die zutreffende

Allelkombination übersetzt (siehe hierzu Tabelle 9). Position 28 stellt die Negativkontrolle

dar.

Tabelle 9: Beispiel einer Auswertung einer Gelelektrophorese an Hand Abbildung 11

mHag HA-1 HA-2 HA-3 HA-8 HB-1 ACC-1 ACC-2

Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Allele H R V M T M R P H Y Y C D G

Reaktion + + + - + + + + - + - + - +

Ergebnis H/R V/V T/M R/P Y/Y C/C G/G

mHag CD31 CD31 CD31 CD62L CD62L PANE-1 UGT2B17

Position 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Allele L V N S R G F L P S R Stop +

Reaktion + + + + + + + - + + + - +

Ergebnis L/V N/S R/G F/F P/S R vorhanden

Pos 1: + Pos 9: - Pos 17:+ Pos 25:+

Pos 2: + Pos 10:+ Pos 18:+ Pos 26:-

Pos 3: + Pos 11:- Pos 19:+ Pos 27:+

Pos 4: - Pos 12:+ Pos 20:+ Pos 28:-

Pos 5: + Pos 13:- Pos 21:+

Pos 6: + Pos 14:+ Pos 22:-

Pos 7: + Pos 15:+ Pos 23:+

Pos 8: + Pos 16:+ Pos 24:+

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

48

2.2.6 statistische Methoden

2.2.6.1 Allgemeine statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der in dieser Arbeit gewonnenen Daten erfolgt mit Hilfe der

Computerprogramme PASW Statistics 18 und SPSS 19 für Windows® (beides IBM, New

York, USA) und R (freie Statistiksoftware; GNU operating system, 2012). Unter anderem

werden auch die patientendemographischen Daten mit der PASW/SPSS-Software

analysiert.

Nachdem die Typisierungsergebnisse aller 320 Patienten-Spender-Paare vorliegen, werden

Allel- und Genotypfrequenzen für alle untersuchten mHag berechnet und deren Verteilung

zwischen verschiedenen Gruppen (Patienten, Spendern und einer gesunden

Vergleichskohorte) verglichen. Außerdem werden die erhaltenen Allelfrequenzen mit der

Allelverteilung im Hardy-Weinberg-Equilibrium (HWE) verglichen. Das HWE beschreibt

die Verteilung von Allelen in einer idealen Population, die groß genug ist, damit von einer

Panmixie ausgegangen werden kann, wobei jedoch die Allele keiner Selektion unterliegen.

Bei zwei kodominant exprimierten Allelen im HWE folgt die Verteilung der Allele der

Binominalfunktion p2 + 2pq + q

2, wobei p und q den jeweiligen Allelfrequenzen entspricht.

Um nun den Einfluss von mHag-Mismatchen auf die allogene HSCT zu untersuchen,

müssen zuerst die statistischen Endpunkte, die den Erfolg einer allogenen HSCT

determinieren, festgelegt werden. Dazu wählen wir als primären Endpunkt das

Gesamtüberleben (engl.: Overall Survival - OS), welches als Zeit zwischen Transfusion

der Stammzellen (Tag 0) bis zum Todeszeitpunkt (Tod jeglicher Ursache) definiert wird.

Als sekundäre, miteinander konkurrierende Endpunkte werden anhand der EBMT-

Empfehlungen (Labopin et al, 2009) folgende Parameter ausgewählt:

Inzidenz einer klinischen aGvHD (Grad II-IV) eingeteilt nach der Glucksberg-

Skala (Glucksberg et al, 1974)

Inzidenz eines Krankheitsrückfalls (Relapseinzidenz)

Inzidenz von transplantationsassoziierter Mortalität (Transplant related mortality -

TRM) bzw. Non relapse mortality (NRM), definiert als Tod durch

transplantationsbedingte Komplikationen bzw. Tod, der nicht durch einen

Krankheitsrückfall/-progress bedingt ist

49

Zusätzlich zu den statistischen Endpunkten haben wir Störgrößen identifiziert, die

ihrerseits möglicherweise einen Effekt auf die von uns gewählten Endpunkte haben und

deswegen in der Lebenszeitanalyse zusätzlich zu den mHag-Mismatchen berücksichtigt

werden müssen.

Folgende Risikofaktoren werden untersucht und, je nach Einfluss, in der multivariaten

Analyse als Kovariate berücksichtigt:

Patientenabhängige Faktoren:

Patientenalter bei HSCT (18-67Jahre)

Patientengeschlecht (männlich/weiblich)

Krankheitsstadium bei HSCT (Stadium 1 bis 3)

Diagnose (AML, ALL, CML, MDS, sonstige)

Spenderabhängige Faktoren:

Geschlechtsmismatch (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 4)

Stammzellquelle (KM/PBSZ)

HLA-Kompatibilität (match/mismatch)

Spenderalter und -geschlecht

Therapiebezogene Faktoren:

GvHD-Prophylaxe (CsA+MTX, CsA+andere, andere)

Konditionierung (MAC/RIC)

Zur Evaluation des Einflusses der einzelnen mHag-Mismatche auf die gewählten

Endpunkte in Überlebenszeit- und kompetitiver Risikoanalyse wird unsere Kohorte in

mehrere Subgruppen je nach HLA-Restriktionen der jeweiligen mHags eingeteilt (siehe

hierzu Kapitel 3.3, Tabelle 14). Jedes mHag wird somit in einer Subgruppe mit der zu ihm

passenden HLA-Restriktion in Bezug auf die oben genannten Endpunkte analysiert. In den

Subgruppen werden die Einflüsse der verschiedenen mHag-Mismatche auf die Endpunkte

wie folgt analysiert: Für jedes mHag werden zuerst die möglichen Richtungen eines

Mismatchs festgelegt, dann werden für jede Richtung jeweils die Inzidenz- bzw.

Überlebenskurven einer Mismatchsituation den Inzidenz- bzw. Überlebenskurven einer

Matchsituation gegenübergestellt.

Mögliche Mismatchrichtungen entstehen wie folgt:

Ein Mismatch in GvH-Richtung entsteht dadurch, dass das antigene Peptid des jeweiligen

mHag beim Patienten exprimiert wird und folglich von Spender-T-Zellen als fremd

erkannt wird, da der Spender nur das nicht für ein Antigen kodierende Allel besitzt. Genau

50

umgekehrt entsteht ein Mismatch in HvG-Richtung: Übrig gebliebene Patienten-T-Zellen

erkennen ein von Spender-Zellen exprimiertes mHag als fremd, da sie wegen Fehlens des

antigenen Peptids auf Patientenzellen bisher keinen Kontakt damit hatten. Exprimieren nun

Patienten- und Spenderzellen beide das antigene Peptid (oder beide nur das nicht-antigene

Peptid) entsteht eine Matchsituation. Zusätzlich dazu haben wir ein Mismatch als solches

(GvHoderHvG-Richtung) der Matchsituation gegenüber gestellt.

Bei mHag, dessen antigene Peptide bisher unbekannt sind (gilt nur für CD31 und CD62L)

sowie HB-1, das bekannterweise für zwei verschiedene antigene Peptide kodiert, wird

zusätzlich noch die Situation GvHundHvG-Mismatch (d. h. Mismatch in beiden

Richtungen) der Matchsituation gegenübergestellt.

2.2.6.2 Überlebenszeitanalysen

Im Rahmen der Überlebenszeitanalyse vergleichen wir die Überlebenskurven je nach

mHag-Status (match/mismatch) mittels Cox-Regressionsanalyse (uni- und multivariat).

Sowohl uni- als auch multivariate Analysen werden mit dem proportionalen Hazard-

Modell (Cox-Modell) durchgeführt. Dieses Modell, die populärste Regressionsmethode zur

Analyse von Überlebensdaten, kann verwendet werden, wenn gleichzeitig der Effekt von

mehreren Einflussgrößen auf eine Zielvariable untersucht werden soll, kann jedoch auch

für die Analyse einzelner Einflussgrößen verwendet werden. Bei der Zielvariablen handelt

es sich hier um zensierte Überlebenszeiten. Die Grundidee der Cox-Regressionsanalyse ist

es, den Effekt der Therapie (hier: der Stammzelltransplantation) auf die Überlebenszeit zu

schätzen, adjustiert für alle anderen Einflussgrößen (stetig oder kategorial) des

Regressionsmodells. Es erlaubt, die Hazard Ratio (das unmittelbare Risiko) für einen

Patienten im Hinblick auf das interessierende Ereignis (hier: Tod: ja/nein) zu schätzen

(Ziegler et al, 2007).

Folgende Bedingung muss für die Cox-Regressionsanalyse erfüllt sein: die Verfügbarkeit

von Werten für alle Einflussfaktoren von allen untersuchten Individuen (bei Nicht-

Vorhandensein: Zensierung). Ein zeitlich konstanter Einfluss der verschiedenen Variablen

auf das Überleben wird außerdem angenommen. Für die Überlebenszeit wird keine

bestimmte Verteilung benötigt; auch der Beobachtungszeitraum muss nicht für alle

Individuen gleich lang sein. Somit kommt der Hazard-Funktion der zentrale Begriff zur

Interpretation der Ergebnisse zu. Mit der Hazard-Funktion wird die Wahrscheinlichkeit pro

Zeiteinheit bezeichnet, dass ein Patient innerhalb eines kleinen Zeitintervalls das

51

Zielereignis (hier: Tod) erfährt, wenn er den Beginn des Zeitintervalls erreicht hat. Durch

die Annahme der Proportionalität (Gleichheit des Hazards über die Zeit hinweg), kommt

man zur Definition einer von der Zeit unabhängigen Hazard Ratio (HR). Das zugehörige

95%-Konfidenzintervall (95%CI) gibt an, dass das tatsächliche HR mit 95%iger Sicherheit

zwischen den durch die obere und untere Konfidenzintervallgrenze gegebenen Werten liegt

(Ziegler et al, 2007).

In der univariaten Analyse wird nur der mHag-Matching-Status (match/mismatch) in

Bezug zum Gesamtüberleben gesetzt. MHag, die sich in der univariaten Analyse als

signifikant erwiesen (p<0,05) bzw. deren Einfluss geringfügig eine Signifikanz verfehlte

(0,1>p>0,05), sowie oben genannte Risikofaktoren (je nach Signifikanz ihres Einflusses)

werden in die multivariate Analyse miteinbezogen (siehe hierzu Kapitel 3.7, Abschnitt

1.1).

2.2.6.3 Analysen der Inzidenzen von aGvHD, Relapse und TRM/NRM

Da die sekundären Endpunkte in ihrem Auftreten nach HSCT miteinander konkurrieren

und auch parallel oder nacheinander auftreten können, gibt uns die Cox-

Regressionsanalyse durch falsche Zensuren falsche Auftretenswahrscheinlichkeiten eines

jeden Endpunktes. Um dem zu entgehen, berechnen wir die kumulativen Inzidenzen von

aGvHD, TRM/NRM, Relapse je nach mHag-Status (match/mismatch) und stellen sie den

kumulativen Inzidenzen ihres jeweiligen kompetitiven Risikos (auch je mHAg-Status)

gegenüber. Die Inzidenzen einer cGvHD untersuchen wir aufgrund mangelnder

Datenverfügbarkeit nicht.

Tabelle 10 zeigt die sekundären Endpunkte und deren kompetitive Risiken.

Tabelle 10: Sekundäre Endpunkte und deren kompetitive Risiken; TRM: Transplant related

mortality, NRM: Non relapse mortality, aGvHD: akute Graft-versus-Host Erkrankung, Tod

anderer Ursache: unbekannte Todesursache oder Tod durch andere Erkrankung

(Sekundärmalignom, Herzinfarkt, etc.)

Endpunkte Kompetitives Risiko

TRM/NRM Relapse + Tod anderer Ursache

aGvHD Relapse + TRM/NRM + Tod anderer

Ursache

Relapse TRM/NRM + Tod anderer Ursache

52

Die kumulative Inzidenz (engl. cumulative incidence rate) ist ein personenbezogenes

Risikomaß und drückt die Wahrscheinlichkeit aus, dass eine Person in einem Zeitraum

erkrankt bzw. von dem betrachteten Problem betroffen wird (hier: an TRM verstirbt, ein

Relapse/aGvHD erleidet). Sie wird vor allem in Längsschnittstudien verwendet und wird

als Quotient aus der Anzahl der (im betrachteten Zeitraum) erkrankten Personen und dem

Anfangsbestand (gesunder) Personen errechnet.

Wir analysieren die kumulativen Inzidenzen der sekundären Endpunkte und ihrer

jeweiligen kompetitiven Risiken mittels kompetitiver Risikoanalyse. Die kompetitive

Risikoanalyse ist darauf ausgelegt, Auftretenswahrscheinlichkeiten eines bestimmten

Endpunktparameters unter Berücksichtigung der konkurrierenden Risiken in

unterschiedlichen Gruppen zu berechnen (Kim, 2007). Auch hier werden signifikante

mHag und Risikofaktoren in der univariaten Analyse (p<0,05) im multivariaten Modell

berücksichtigt. Durch schrittweisen Ausschluss von Kovariaten mit zu geringer Signifikanz

(p>0,1) wird die Wahl des besten Modells möglich (backward stepwise exclusion) (siehe

hierzu Kapitel 3.7, Abschnitt 2.2).

53

3. Resultate

3.1 Validierung des Testkits

Durch die PCR-SSP-Methodik wurde es uns ermöglicht, die Polymorphismen von 11

verschiedenen mHag eines Individuums gleichzeitig durch sequenzspezifische

Amplifizierung bestimmter Genabschnitte zu bestimmen.

Zunächst wurde der eingesetzte Testkit (CTS-PCR-SSP MINITRAY KIT, Prod. No. 229,

Universitätsklinikum Heidelberg, Heidelberg, Deutschland) anhand von 8 Referenz-DNA-

Proben in unserem Labor validiert (siehe hierzu Tabelle 11, Abbildungen 12 und 13).

Tabelle 11: Ergebnisse der Testung der acht Referenz-DNAs und Grad der

Übereinstimmung mit den Vorergebnissen aus Heidelberg, Cd: Codon, Pers: Person

Gen HA-

1

HA-

2

HA-

3

HA-

8

HB-

1

ACC-

1

ACC-

2 UGT2B17

CD31

Cd 125

CD31

Cd 563

CD31

Cd 670

Übereinstim-

mung mit

Vortestung DNA

Pers1 H/R V/M T/T R/P H/H Y/C D/G Positiv L/V N/S R/G 100%

Pers2 H/H M/M T/T R/P H/Y Y/C D/G Positiv V/V N/N G/G 100%

Pers3 R/R V/M T/M P/P Y/Y Y/Y G/G Positiv L/V N/S R/G 100%

Pers4 R/R V/M T/M P/P H/Y Y/C D/G Positiv L/L S/S R/R 100%

Pers5 H/H V/V T/T R/R H/H C/C G/G Positiv V/V N/N G/G 100%

Pers6 R/R V/M M/M R/R H/Y C/C G/G Positiv L/L S/S R/R 100%

Pers7 R/R V/V T/T R/R H/H C/C G/G Positiv L/V N/S R/G 100%

Pers8 R/R V/M T/M P/P H/Y Y/C D/G Negativ V/V N/N G/G 100%

Beispielgelbilder:

Abbildung 12: Gelelektrophorese Pers2 Abbildung 13: Gelelektrophorese Pers3

54

Nach erfolgreicher Validierung wurden mithilfe dieses Testkits die 320 Patienten-Spender-

Paare auf die mHag HA-1, HA-2, HA-3, HA-8, HB-1, ACC-1, ACC-2, CD31 (Codon 125,

563 und 670), CD62L (Codon 206 und 213), PANE-1 und UGT2B17 getestet.

3.2 Allel- und Genotypverteilung der untersuchten mHag

3.2.1 Allel- und Genotyphäufigkeiten der mHag und Vergleich mit dem Hardy-

Weinberg-Gleichgewicht

Tabelle 12 zeigt die relativen Allelhäufigkeiten und die absoluten, sowie relativen

Genotyphäufigkeiten der in dieser Arbeit untersuchten mHag in den Gruppen der

Patienten, Spender und einer von uns gewählten Gruppe von Vergleichspersonen (aus

Spierings et al, 2007); dazu den p-Wert und die χ2-Statistik des Vergleichs der

Allelfrequenzen in den jeweiligen Gruppen mit der Verteilung im Hardy-Weinberg-

Gleichgewicht (HWE). Das HWE beschreibt die Verteilung zweier Allele in einer idealen

Population (große Anzahl Individuen, keine Selektion, Panmixie) nach der

Binomialfunktion p2 + 2pq + q

2=1, wobei p und q die jeweiligen Allelfrequenzen

darstellen.

Tabelle 12: Genotyp- und Allelfrequenzen der untersuchten mHag-Polymorphismen nach

Testung von Patienten (n=320), deren gesunden, unverwandten Spendern (n=320) und

einem US-Referenzkollektiv (n=2011). HWE: Analyse der Übereinstimmung der

Allelverteilung mit dem HWE in den jeweiligen Gruppen mittels χ2

–Test

Patienten (n=320) Spender (n=320) US Referenzkollektiv

1

(white caucasien) (n=2011)

Genotyp Verteilung Frequenz Verteilung Frequenz Verteilung Frequenz

HA-1 H,H 41 0,13 40 0,13 261 0,13

HA-1, H,R 148 0,46 158 0,49 925 0,46

HA-1, R,R 131 0,41 122 0,38 825 0,41

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

Allelfrequenz HA-1 H 0,36

0,37

0,36

Allelfrequenz HA-1 R 0,64 0.63 0,64

Vergleich mit HWE P=0,94

χ2=0,006

P=0,31

χ2=1,04

P=0,95

χ2=0,005

55

Tabelle 12: Fortsetzung

HA-2 VV 210 0,66 192 0,60 1146 0,57

HA-2 VM 100 0,31 111 0,35 764 0,38

HA-2 MM 10 0,03 17 0,05 101 0,05

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

Allelfrequenz HA-2 V 0,81

0,77

0,76

Allelfrequenz HA-2 M 0,19 0,23 0,24

Vergleich mit HWE P=0,65

χ2=0,21

P=0,85

χ2=0,03

p=0,07

χ2=3,36

HA-3 TT 126 0,39 114 0,35 865 0,43

HA-3 TM 153 0,48 156 0,49 885 0,44

HA-3 MM 41 0,13 50 0,16 261 0,13

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

Allelfrequenz HA-3 T 0,63

0,60

0,65

Allelfrequenz HA-3 M 0,37 0,40 0,35

Vergleich mit HWE P=0,61

χ2=0,27

P=0,78

χ2=0,08

P=0,14

χ2=2,13

HA-8 RR 53 0,16 51 0,16 402 0,2

HA-8 RP 156 0,49 173 0,54 1006 0,5

HA-8 PP 111 0,35 96 0,30 603 0,3

Gesamt 320 1,00 320 1,0 2011 1,0

Allelfrequenz HA-8 R 0,41

0,43

0,45

Allelfrequenz HA-8 P 0,59 0,57 0,55

Vergleich mit HWE P=0,88

χ2=0,02

P=0,07

χ2=3,4

P=0,63

χ2=0,23

HB-1 HH 170 0,53 187 0,58 1086 0,54

HB-1 HY 139 0.44 115 0,36 825 0,41

HB-1 YY 11 0,03 18 0,06 100 0,05

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

Allelfrequenz HB-1 H 0,75

0,76

0,75

Allelfrequenz HB-1 Y 0,25 0,24 0,25

Vergleich mit HWE P=0,006

χ2=7,5

P=0,95

χ2=0,003

P=0,0003

χ2=12,9

56

Tabelle 12: Fortsetzung

ACC-1 Y,Y 12 0,04 26 0,08 141 0,07

ACC-1, Y,C 127 0,40 114 0,36 804 0,40

ACC-1, C,C 181 0,56 180 0,56 1066 0,53

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

Allelfrequenz ACC-1 Y 0,24

0,26

0,27

Allelfrequenz ACC-1 C 0,76 0,74 0,73

Vergleich mit HWE P=0,07

χ2=3,25

P=0,19

χ2=1,69

P=0,52

χ2=0,40

ACC-2 DD 12 0,04 24 0,08 121 0,06

ACC-2 DG 123 0,38 112 0,35 764 0,38

ACC-2 GG 185 0,58 184 0,57 1126 0,56

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

Allelfrequenz ACC-2 D 0,23

0,25

0,25

Allelfrequenz ACC-2 G 0,77 0,75 0,75

Vergleich mit HWE P=0,12

χ2=2,4

P=0,23

χ2=1,42

p=0,57

χ2=0,33

CD31-Cd125 LL 60 0,19 74 0,23 **

CD31-Cd125 LV 154 0,48 156 0,49

CD31-Cd125 VV 106 0,33 90 0,28

Gesamt 320 1,00 320 1,00

Allelfrequenz CD31-Cd125 L 0,43

0,48

Allelfrequenz CD31-Cd125 V 0,57 0,52

Vergleich mit HWE P=0,76

χ2=0,09

P=0,69

χ2=0,16

CD31 Cd563 NN 98 0,31 85 0,27 **

CD31 Cd563 NS 155 0,48 160 0,50

CD31 Cd563 SS 67 0,21 75 0,23

Gesamt 320 1,00 320 1,0

Allelfrequenz CD31 Cd563 N 0,55

0,52

Allelfrequenz CD31 Cd563 S 0,45 0,48

Vergleich mit HWE P=0,69

χ2=0,16

P=0,99

χ2=0,0003

57

Tabelle 12: Fortsetzung

CD31 Cd670 RR 67 0,21 77 0,24 **

CD31 Cd670 RG 154 0,48 157 0,49

CD31 Cd670 GG 99 0,31 86 0,27

Gesamt 320 1,00 320 1,00

Allelfrequenz CD31 Cd670 R 0,45

0,49

Allelfrequenz CD31 Cd670 G 0,55 0,51

Vergleich mit HWE P=0,62

χ2=0,25

P=0,75

χ2=0,10

CD62L Cd206 FF 171 0,53 172 0,54 **

CD62L Cd206 FL 129 0,4 132 0,41

CD62L Cd206 LL 20 0,06 16 0,05

Gesamt 320 1,00 320 1,00

Allelfrequenz CD62L Cd206 F 0,74

0,74

Allelfrequenz CD62L Cd206 L 0,26 0,26

Vergleich mit HWE P=0,51

χ2=0,44

P=0,14

χ2=2,16

CD62L-Cd213 PP 235 0,73 242 0,76 **

CD62L-Cd213 PS 80 0,25 69 0,22

CD62L-Cd213 SS 5 0,02 9 0,03

Gesamt 320 1,00 320 1,00

Allelfrequenz CD62L

Cd213 P 0,86

0,86

Allelfrequenz CD62L

Cd213 S 0,14 0,14

Vergleich mit HWE P=0,54

χ2=0,38

P=0,14

χ2=2,16

PANE-1 RR 154 0,48 169 0,53 945 0,47

PANE-1 R/stop 133 0,42 125 0,39 905 0,45

PANE-1 Stop/stop 33 0,1 26 0,08 161 0,08

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

Allelfrequenz PANE-1 R 0,69 0,72 0,69

Allelfrequenz PANE-1 Stop 0,31 0,28 0,31

58

Vergleich mit HWE P=0,59

χ2=0,29

P=0,67

χ2=0,18

P=0,006

χ2=7,57

* UGT2B17 pos 276 0,86 281 0,88 1931 0,96

UGT2B17 neg 44 0,14 39 0,12 80 0,04

Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00

1: Spierings et al, 2007, *: Mit der PCR-SSP-Testung wurde der heterozygote Genotyp nicht erfasst; das

mHag wurde nur auf vorhanden („positiv“ – hierin enthalten sind homozygote und heterozygote

Merkmalsträger) oder nicht vorhanden („negativ“) getestet; deswegen konnten die Allelfrequenzen nicht

berechnet und somit auch kein Vergleich mit dem HWE stattfinden, **: keine Angaben zu

Vergleichspersonen vorhanden

Bis auf HB-1 in der Patientengruppe befinden sich alle anderen von uns untersuchten

mHag-Allele in Übereinstimmung mit dem HWE. Bei unseren Patienten ist das

Gleichgewicht zugunsten von HB-1 HH (53%) und HB-1 HY (44%) verschoben, HB-1

YY ist mit nur 3% zu selten vorhanden. Um dies genauer zu charakterisieren, haben wir

die HB-1-Patientengruppe nach den einzelnen Krankheitsbildern aufgeteilt und die

Verteilung der Allel- bzw. Genotypfrequenzen in den einzelnen Subgruppen mit dem

HWE verglichen (siehe hierzu Tabelle 13). Hierbei lässt sich eine signifikante Abweichung

vom HWE in der Gruppe der CML-Patienten nachweisen (p=0,04). CML-Patienten weisen

HB-1 HH und HY vermehrt auf, im Gegensatz zur homozygoten HB-1YY Form. In der

Referenzgruppe der weißen US-Amerikaner wird unser Ergebnis für HB-1 bestätigt: auch

hier besteht eine Abweichung vom HWE (p=0,0003) mit nur 5% homozygoten HB-1 YY

Trägern. Zudem weicht in der Referenzgruppe auch PANE-1 vom HWE ab (p=0,006),

siehe hierzu Tabelle 12.

Tabelle 13: Genotyphäufigkeiten und Allelfrequenzen von HB-1 aufgeteilt nach

Krankheitsgruppen; p-Wert und χ2 –Statistik des Vergleichs mit dem HWE

HB-1 Genotyp ALL

(n=58)

AML

(n=98)

CML

(n=88)

MDS

(n=28)

Andere

(n=48)

HB-1 HH 32 (55,2%) 52 (53,1%) 45 (51,1%) 15 (53,5%) 26 (54,2%)

HB-1 HY 25 (43,1%) 40 (40,8%) 41 (46,6%) 12 (42,9%) 21 (43,7%)

HB-1 YY 1 (1,7%) 6 (6,1%) 2 (2,3%) 1 (3,6%) 1 (2,1%)

Vergleich mit

HWE

P=0,11

χ2=2,48

P=0,64

χ2=0,21

P=0,04

χ2=4,42

P=0,45

χ2=0,57

P=0,16

χ2=1,93

59

3.2.2 Vergleich der relativen mHag-Genotyphäufigkeiten zwischen den

einzelnen Gruppen

Darüber hinaus haben wir die Genotypverteilungen der mHag in den Gruppen Spender,

Patienten und US-Vergleichpersonen mittels χ2

–Test miteinander verglichen, um die

Eignung unserer Referenzgruppe zu bestätigen. Hierbei zeigte sich eine signifikante

Abweichung (p<0,0001) der Häufigkeit von UGT2B17 zwischen den von uns untersuchten

Spendern bzw. Patienten und dem Referenzkollektiv der weißen US-Amerikaner. Bei den

Vergleichspersonen (96%) ist UGT2B17 um 10% häufiger als bei unseren Patienten (86%)

und um 8% häufiger als bei unseren gesunden Spendern (88%). Dagegen zeigte sich beim

Vergleich zwischen unseren Patienten und Spendern keine signifikante Abweichung

(p=0,55). Es gab auch für keine anderen mHag signifikante Unterschiede zwischen den

Genotyphäufigkeiten von Spendern und Patienten.

3.3 Verteilung der HLA-Merkmale in der untersuchten Kohorte

Als Studieneinschlusskriterium für Patienten-Spender-Paare wurde festgelegt, dass

mindestens ein HLA-Merkmal vorhanden ist, in dem nachweislich mindestens eins der von

uns untersuchten mHag exprimiert wird (siehe Kapitel 2.1, Abschnitt 2). Für CD31 und

CD62L, bei denen bisher keine genaue MHC-Restriktion bekannt ist, werden HLA-

Superfamilien mit bestimmten Peptidbindungseigenschaften vermutet, die diese mHag

möglicherweise binden können (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 5, Tabelle 4). Neben der

Analyse in den dadurch gebildeten Subgruppen wurden CD31 und CD62L außerdem in der

Gruppe aller vorhandenen HLA-Merkmale untersucht. Patienten-Spender-Paare mit HLA-

Mismatchen wurden nur unter der Bedingung, dass die HLA-Mismatche außerhalb des

Restriktionsmoleküls für das jeweilige untersuchte mHag liegen in eine Subgruppe mit

eingeschlossen.

Eingeteilt nach HLA-Merkmalen ergaben sich die in Tabelle 14 dargestellten Subgruppen,

die somit auch für die spätere statistische Analyse relevant sind.

60

Tabelle 14: Subgruppen nach HLA-Merkmalen mit den jeweils in ihnen exprimierten

mHag und der Anzahl Paare (n) aus unserer Kohorte, die dieses HLA-Merkmal besitzen

HLA-

Merkmal HLA-A*01 HLA-A*02 HLA-A*03

HLA-A*03-

Superfamilie HLA-A*24 HLA-A*29

mHag HA-3 HA-1, HA-2,

HA-8 PANE-1 CD62L ACC-1 UGT2B17

Anzahl

Paare n=112 n=166 n=88 n=140 n=69 n=15

HLA-

Merkmal HLA-B*44

HLA-B*44-

Superfamilie

HLA-B*07-

Superfamilie Alle HLA

mHag HB-1

ACC-2

CD31,

CD62L CD31

CD31,

CD62L

Anzahl

Paare n=77 n=107 n=166 n=320

3.4 Bestimmung der Einflussfaktoren und Zielgrößen für die

Subgruppenanalyse

3.4.1 Zielgrößen

Um den Einfluss von mHag-Mismatchen auf die HSCT messbar zu machen, wurden, den

Empfehlungen der EBMT folgend, Zielgrößen (Endpunkte) definiert (Labopin et al, 2009).

Für alle diese Endpunkte wurden Patienten, die während der Beobachtungszeit verloren

gingen (loss to follow up) zensiert. Unsere primäre Zielgröße ist das Gesamtüberleben,

unsere sekundären, gegenseitig konkurrierenden Zielgrößen sind aGvHD-Inzidenz,

Relapseinzidenz und TRM/NRM (siehe hierzu Tabelle 15). Eine genauere Beschreibung

der Zielgrößen findet sich in Kapitel 2.2, Abschnitt 6.1.

61

3.4.2 Einflussfaktoren/Risikofaktoren

Die Heterogenität unserer Kohorte (siehe Kapitel 2.1.2 und Tabelle 6) erforderte die

Identifikation und Prüfung diverser Risikofaktoren, die bei der Analyse des Einflusses von

mHag auf die von uns festgelegten Zielgrößen als Störfaktoren auftreten können, da sie

möglicherweise ihrerseits diese Zielgrößen beeinflussen. Diese patienten–, spender-, und

therapieabhängigen Risikofaktoren wurden an Hand der gängigen Literatur (Appelbaum,

2003; Hart and Peggs, 2007; Aschan, 2006; Spellman et al, 2009) definiert und je nach

ihrer Signifikanz in die multivariaten Analysenmodelle mit oben genannten Endpunkten

mit einbezogen (siehe hierzu Tabelle 15). Eine genauere Beschreibung der Risikofaktoren

findet sich in Kapitel 2.2, Abschnitt 6.1.

Tabelle 15: Risikofaktoren und Zielgrößen; HLA: humanes Leukozyten Antigen, GvH:

Graft-versus-host, aGvHD: akute Graft-versus-host-disease, TRM: Transplant related

mortality, NRM: Non relapse mortality

Risikofaktoren (unabhängige Variablen) Zielgrößen (abhängige Variablen)

Diagnose Gesamtüberleben

Krankheitsstadium Inzidenz eines Relapses

Patientenalter Inzidenz einer aGvHD

Patientengeschlecht Inzidenz von TRM/NRM

Geschlechtsmatch

Stammzellquelle

HLA-Match

Konditionierung

GvH-Prophylaxe

Spenderalter und -geschlecht

62

3.5 Quantitative Ergebnisse des Gesamtkollektivs

3.5.1 Gesamtüberleben

Nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 334,5 Tagen (11,1 Monaten) lebten noch

161 (50,3%) von 320 Patienten. Die Drei-Jahres-Überlebensrate beträgt 38,1% (122 von

320 Patienten), die Fünf-Jahres-Überlebensrate 32,8% (105 von 320 Patienten).

3.5.2 Todesursache

Insgesamt sind 204 Patienten während der Nachbeobachtungszeit verstorben (63,8%).

Hiervon sind 57 (27,9%) an einem Krankheitsrückfall, 132 (64,7%) durch therapiebedingte

Nebenwirkungen (TRM/NRM), 2 (1%) durch Sekundärmalignome, 2 (1%) aufgrund

anderer Todesursachen und 11 (5,4%) durch unbekannte Ursachen verstorben.

3.5.3 Relapseinzidenz

Während des gesamten Beobachtungszeitraumes erlitten 91 Patienten (28,4%) einen

Rückfall ihrer Grunderkrankung.

3.5.4 NRM/TRM

Insgesamt sind 132 Patienten (41,3%) verstorben, ohne einen Krankheitsrückfall/ -progress

zu erleiden bzw. an transplantationsbedingten Komplikationen.

3.5.5 Inzidenz der akuten GvHD

Während des Nachbeobachtungszeitraumes entwickelten 140 Patienten (43,8%) eine akute

GvHD Grad II oder höher.

63

3.6 Statistische Auswertung der Einflussfaktoren

Folgende Risikofaktoren zeigen signifikant nachweisbare Einflüsse auf die von uns

untersuchten Endpunkte und werden deswegen in den multivariaten Analysemodellen

berücksichtigt:

3.6.1 Patientenalter

Das Alter eines Patienten spielt beim Gesamtüberleben eine entscheidende Rolle: So

nimmt die Überlebenswahrscheinlichkeit mit steigendem Alter zum Zeitpunkt einer HSCT

ab (p=0,02). Signifikant schlechter als die Referenzgruppe der 18-40jährigen Patienten

überleben zudem die 51-60jährigen (p=0,006, HR: 1,67, 95%CI: 1,16-2,41); bei den 41-

50jährigen und den über 60jährigen lässt sich eine Tendenz feststellen (p=0,17 bzw.

p=0,10), siehe hierzu Tabelle 16 und Abbildung 14.

Der Einfluss des Patientenalters auf die Relapseinzidenz verfehlt zwar knapp eine

Signifikanz (p=0,05); jedoch zeigen Patienten in höherem Alter tendenziell häufiger

Krankheitsrückfälle.

Tabelle 16: Patientenalter klassifiziert in Gruppen mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert) des

Einflusses auf das Gesamtüberleben in Tagen, HR und 95% Konfidenzintervall;

Referenzgruppe ist die Gruppe der 18-40jährigen; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad

df

Signifikanz

(p-Wert) HR

95,0% Konfidenzintervall für HR

Untere Grenze Obere Grenze

Patientenalter (gesamt) 3 0,023

Patientenalter (41-50 Jahre) 1 0,170 1,253 0,908 1,729

Patientenalter (51-60 Jahre) 1 0,006 1,670 1,160 2,405

Patientenalter (>60Jahre) 1 0,102 2,310 0,847 6,300

64

Abbildung 14: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom

Patientenalter in Jahren (kategorial: 18-40 Jahre, 41-50 Jahre, 51-60 Jahre, >60 Jahre)

3.6.2 Diagnose

Die Diagnose beeinflusst signifikant das Gesamtüberleben (p<0,001). Für das

Gesamtüberleben gilt dabei eine zunehmend ungünstige Beeinflussung in der Reihenfolge

CML - MDS – sonstige– ALL– AML, siehe hierzu Tabelle 17 und Abbildung 15.

Außerdem beeinflusst die Diagnose das Auftreten eines Relapses signifikant (p=0,03): die

Relapsewahrscheinlichkeit steigt in der Reihenfolge MDS – CML – ALL – AML –

sonstige.

Tabelle 17: Diagnosen klassifiziert in Gruppen mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert) des

Einflusses auf das Gesamtüberleben in Tagen, HR und 95% Konfidenzintervall,

Referenzgruppe ist die Gruppe der CML-Patienten; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad

df

Signifikanz

(p-Wert) HR

95,0% Konfidenzintervall für HR

Untere Grenze Obere Grenze

Diagnose (gesamt) 4 <0,001

Diagnose AML 1 <0,001 2,434 1,643 3,604

Diagnose ALL 1 <0,001 2,235 1,443 3,461

Diagnose sonstige 1 0,006 1,922 1,204 3,067

Diagnose MDS 1 0,312 1,361 0,749 2,475

65

Abbildung 15: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit der

verschiedenen Diagnosen (CML, MDS, sonstige, ALL, AML); „sonstige“ umfasst:

Lymphome, Multiples Myelom/Plamsozytom, aplastische Anämie und CLL

3.6.3 Krankheitsstadium

Auch das Krankheitsstadium beeinflusst signifikant das Gesamtüberleben. So überleben

Patienten, die im Krankheitsstadium 2 und 3 transplantiert werden signifikant schlechter,

als diejenigen, die im ersten Stadium ihrer Erkrankung transplantiert werden (p<0,001),

siehe hierzu Tabelle 18 und Abbildung 16.

Tabelle 18: Krankheitsstadium klassifiziert in Gruppen mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert)

des Einflusses auf das Gesamtüberleben in Tagen, HR und 95% Konfidenzintervall,

Referenzgruppe ist Krankheitsstadium 1; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, ges: gesamt

df

Signifikanz

(p-Wert) HR

95,0% Konfidenzintervall für HR

Untere Grenze Obere Grenze

Stadium (ges) 2 <0,001

Stadium 2 1 <0,001 1,919 1,367 2,694

Stadium 3 1 <0,001 2,552 1,717 3,793

66

Abbildung 16: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit der

verschiedenen Krankheitsstadien (Stadium 1-3)

Der Einfluss des Krankheitsstadiums auf die Inzidenz eines Krankheitsrückfalles verfehlt

nur knapp eine Signifikanz (p=0,09), weist aber auf eine Tendenz hin. Somit zeigen in

höheren Krankheitsstadien transplantierte Patienten tendenziell häufiger einen

Krankheitsrückfall.

3.6.4 Stammzellquelle

Periphere Blutstammzellen zeigen eine höhere Relapseinzidenz (p=0,005; HR: 2,09;

95%CI: 1,2-3,5) als Knochenmark. Zusätzlich zeigen PBSZ ein schlechteres

Gesamtüberleben mit schwacher Signifikanz (p=0,04). Außerdem zeigen PBSZ, auch hier

mit schwacher Signifikanz, eine geringere Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung einer

aGvHD (p=0,04) im Vergleich zu Knochenmark.

67

3.6.5 HLA-Match

Das HLA-Match hat zwar auf das Gesamtüberleben (p=0,46), die Inzidenz einer aGvHD

(p=0,6) oder eines Relapses (p=0,15) keinen Einfluss, spielt jedoch beim Tod durch

transplantationsassoziierte Ursachen (TRM/NRM) eine signifikante Rolle (p=0,009; HR:

1,8; 95%CI: 0,8-4,12), sodass Patienten mit HLA-Mismatch häufiger an

transplantationsbedingten bzw. non relapse bedingten Ursachen versterben, als deren

gematchte Gegenüber.

3.6.6 Geschlechtsmismatch

Bei Transplantationen mit weiblichen Spendern für männliche Patienten (positives

Geschlechtsmismatch) tritt häufiger ein Krankheitsrückfall auf. So haben Paare mit

Geschlechtsmismatch ein signifikant höheres Risiko ein Relapse zu erleiden (p=0,01; HR:

1,98; 95%CI: 1,15- 3,40).

3.6.7 Konditionierungsregime

Patienten mit reduziertem Konditionierungsregime (RIC) haben eine signifikant höhere

Relapseinzidenz (p<0,001; HR: 2,56; 95%CI: 1,5- 4,4) als Patienten, die eine

myeloablative Konditionierung (MAC) erhalten.

3.6.8 Nicht relevante Faktoren

Die Faktoren Patientengeschlecht, Spendergeschlecht und –alter, sowie Art der GvHD-

Prophylaxe nehmen keinen signifikanten Einfluss auf die von uns untersuchten Zielgrößen.

68

3.7 Statistische Auswertung der mHag

Um die Einflüsse der einzelnen mHag-Mismatche univariat oder zusammen mit den

jeweiligen Risikofaktoren (multivariat) auf die genannten Outcomes zu messen, werden

Subgruppen anhand der MHC-Restriktion der verschiedenen mHag eingeteilt (siehe

Kapitel 3.3).

3.7.1 Analyse des Gesamtüberlebens

Da der längste Nachbeobachtungszeitraum bei unseren Patienten acht Jahre beträgt, haben

wir die Überlebenszeitanalyse auf 3000 Tage nach HSCT begrenzt.

3.7.1.1 Univariate Analyse

Die univariate Überlebensanalyse wird mittels Cox-Regressionsanalyse durchgeführt

(siehe Kapitel 2.2, Abschnitt 6.2). Es wird nur der Einfluss von mHag-Match/-Mismatch

auf das Überleben berücksichtigt. Tabelle 19 zeigt die Signifikanzen, Hazard Ratios und

deren 95% Konfidenzintervalle der unterschiedlichen Überlebenskurven bei match und

mismatch für jedes mHAg in seinen möglichen Mismatchrichtungen:

Folgende signifikante Ergebnisse zeigen sich nach univariater Analyse:

a) In der Gesamtgruppe (alle HLA-Merkmale) zeigen Patienten, die mit ihrem

Spender ein CD31 Codon 563 Mismatch in HvG-Richtung aufweisen, ein

signifikant besseres Überleben als die gematchten Patienten (p=0,03; HR: 0,72;

95%CI: 0,54- 0,96).

b) In der HLA-B7-Superfamilie zeigen Patienten mit GvHoderHvG-Mismatches zu

ihren Spendern in sowohl CD31 Codon 563 als auch Codon 670 ein signifikant

besseres Überleben als die gematchten Patienten (jeweils p=0,04; HR: 0,66;

95%CI: 0,45- 0,97).

c) In der HLA-A3-Superfamilie zeigen Patienten mit einem CD62L Codon 206 GvH-

Mismatch zu ihrem jeweiligen Spender ein signifikant besseres Überleben als ihre

gematchten Gegenüber (p=0,04; HR: 0,58; 95%CI: 0,35-0,97). Dagegen überleben

Patienten mit einem CD62L Codon 213-Mismatch in GvH-Richtung signifikant

schlechter als die in diesem Codon gematchten Patienten (p=0,04; HR: 1,65;

69

95%CI: 1,02- 2,66). Dies lässt sich auch in den für Codon 213 in GvHoderHvG-

Richtung gemismatchten Paaren bestätigen: Auch hier ist das Überleben der

Mismatch-Patienten signifikant schlechter als das der gematchten (p=0,03; HR:

1,62; 95%CI: 1,06-2,50).

Einen nicht signifikanten, aber geringfügig eine Signifikanz verfehlenden Einfluss

(0,1≥p>0,05) auf das Gesamtüberleben zeigen: HB-1 Mismatch in HvG-Richtung

(p=0,07), ACC-2 Mismatch in GvH-Richtung (p=0,09), sowie, in der Gruppe aller HLA-

Merkmale, CD31 Codon 125 Mismatch in GvHundHvG-Richtung (p=0,08), Codon 563

sowohl in GvHoderHvG-Richtung (p=0,1) als auch in GvHundHvG-Richtung (p=0,08),

und Codon 670 in HvG-Richtung (p=0,05). Diese werden somit in eine multivariate

Analyse des Gesamtüberlebens miteinbezogen.

Keinen Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigen HA-1, HA-2, HA-3, ACC-1, CD31 in der

HLA-B44-Superfamilie-Gruppe, CD62L in der Gruppe aller HLA Merkmale, PANE-1 und

UGT2B17.

70

Tabelle 19: Signifikanzen (p-Wert), HR und 95% CI der Unterschiede der jeweiligen Überlebenskurven (mismatch vs. match) für alle mHag in ihren jeweiligen möglichen

Mismatch-Richtungen, GvH: graft-versus-host, HvG: Host-versus-graft, GvHoderHvG: Graft-versus-host oder Host-versus-graft, GvHundHvG: Graft-versus-host und

Host-versus-graft, HR: Hazard Ratio, CI: Konfindezintervall; sup: Superfamilie, Rote Werte: signifikant (p<0,05), blaue Werte:geringfügig nicht signifikant (0,05<p≤0,1).

Kein Wert: hier gab es in der Mismatch-Gruppe (GvHundHvG) keine Paare, sodass folglich kein Vergleich stattfinden konnte

Mismatch - Richtung

GvH HvG GvHoderHvG GvHundHvG

mHag (HLA-Restriktion)

n=Gruppengröße p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95% CI

HA-1 (HLA-A2) n=166 0,33 1,27 0,78-2,07 0,96 0,99 0,64- 1,52 0,39 0,85 0,58- 1,24 - - -

HA-2 (HLA-A2) n=166 0,12 0,4 0,13- 1,26 0,58 1,38 0,44- 4,36 0,25 0,62 0,27- 1,4 - - -

HA-3 (HLA-A1) n=112 0,72 0,88 0,42 -1,82 0,5 1,26 0,65- 2,47 0,81 1,07 0,62- 1,81 - - -

HA-8 (HLA-A2) n=166 0,32 0,79 0,49- 1,26 0,53 0,86 0,54- 1,37 0,16 0,76 0,52- 1,12 - - -

HB-1 (HLA-B44) n=77 0,23 0,66 0,34- 1,30 0,07 1,77 0,97- 3,24 0,66 1,14 0,64- 2,01 1,00 1,0 0,31- 3,23

ACC-1 (HLA-A24) n=69 0,82 0,91 0,41- 2,05 0,13 1,68 0,87- 3,25 0,29 1,38 0,76- 2,50 - - -

ACC-2 (HLA-B44) n=77 0,09 0,55 0,27- 1,10 0,11 1,73 0,88- 3,42 0,64 0,87 0,49- 1,55 - - -

CD31 Cd125 (alle HLA) n=320 0,35 0,87 0,65- 1,16 0,36 0,87 0,66- 1,16 0,55 1,09 0,83- 1,43 0,08 0,66 0,41- 1,05

CD31 Cd563 (alle HLA) n=320 0,25 0,84 0,63- 1,13 0,03 0,72 0,54- 0,96 0,1 0,79 0,60- 1,04 0,08 0,66 0,41- 1,05

CD31 Cd670 (alle HLA) n=320 0,36 0,87 0,66- 1,17 0,05 0,75 0,56- 1,00 0,11 0,8 0,60- 1,05 kein

Wert

kein

Wert kein Wert

CD31 Cd125 (HLA-B44sup) n=107 0,39 0,80 0,49- 1,32 0,62 0,89 0,55- 1,42 0,4 1,22 0,77- 1,95 0,19 0,64 0,32- 1,24

CD31 Cd563 (HLA-B44sup) n=107 0,55 0,86 0,53- 1,41 0,11 0,68 0,42- 1,09 0,22 0,74 0,46- 1,19 0,56 0,83 0,45- 1,55

CD31 Cd670 (HLA-B44sup) n=107 0,69 0,90 0,56- 1,47 0,18 0,72 0,45- 1,17 0,25 0,75 0,47- 1,21 kein

Wert

kein

Wert kein Wert

CD31 Cd125 (HLA-B7sup) n=166 0,68 0,92 0,62- 1,37 0,74 0,93 0,63- 1,39 0,49 0,87 0,60- 1,28 0,97 0,99 0,54- 1,81

CD31 Cd563 (HLA-B7sup) n=166 0,29 0,80 0,53- 1,21 0,52 0,88 0,59- 1,31 0,04 0,66 0,45- 0,97 0,7 1,12 0,62-2,06

CD31 Cd670 (HLA-B7sup) n=166 0,29 0,80 0,53- 1,21 0,52 0,88 0,59- 1,31 0,04 0,66 0,45- 0,97 kein

Wert

kein

Wert kein Wert

CD62L Cd206 (alle HLA) n=320 0,63 0,93 0,68- 1,26 0,87 0,97 0,72- 1,33 0,83 1,03 0,78- 1,36 0,41 0,77 0,41- 1,45

CD62L Cd213 (alle HLA) n=320 0,54 1,10 0,80- 1,52 0,9 0,98 0,69- 1,40 0,5 1,10 0,83- 1,46 0,74 0,86 0,35- 2,08

CD62L Cd206 (HLA-A3sup) n=140 0,04 0,58 0,35- 0,97 0,94 1,02 0,64- 1,62 0,32 0,80 0,52- 1,23 0,37 0,63 0,23- 1,73

CD62L CD213 (HLA-A3sup)

n=140 0,04 1,65 1,02- 2,66 0,53 1,18 0,70- 1,99 0,03 1,62 1,06- 2,50 1,00 1,00 0,25- 4,1

PANE-1 (HLA-A3) n=88 0,43 0,57 0,14- 2,34 0,45 1,36 0,61- 3,00 0,93 1,03 0,51- 2,11 - - -

UGT2B17 (HLA-A29) n=15 0,73 1,45 0,18- 11,88 0,28 2,14 0,54- 8,45 0,25 2,14 0,59- 7,69 - - -

71

3.7.1.2 Multivariate Analyse

Die multivariate Analyse wird auch mittels des Cox-Regressionsverfahrens durchgeführt.

In die multivariate Analyse werden nur mHag einbezogen, die signifikanten oder

geringfügig an einer Signifikanz vorbei gehenden Einfluss in der univariaten Analyse

aufweisen. Als Einschlussgrenze für die multivariate Analyse wählen wir p≤0,1.

Zudem werden in die multivariate Analyse die Risikofaktoren Patientenalter, Diagnose,

Krankheitsstadium und Stammzellquelle miteinbezogen, da diese einen signifikanten

Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigen. Auch hier werden die verschiedenen möglichen

Richtungen des Mismatches berücksichtigt (GvH, HvG, GvHoderHvG, evtl.

GvHundHvG). Folgende mHag zeigen nach multivariater Analyse einen Einfluss auf das

Gesamtüberleben in ihrer jeweiligen Subgruppe:

ACC-2

Wie in nachfolgender Abbildung 17 ersichtlich, haben Patienten mit einem ACC-2 GvH-

Match (blaue Kurve) eine niedrigere Überlebenswahrscheinlichkeit als Patienten, die für

ACC-2 einen Mismatch in GvH-Richtung mit ihrem Spender aufweisen (grüne Kurve)

(p=0,04; HR: 2,43; 95%CI: 1,06- 5,62). Weiteren Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigen

Krankheitsstadium (p=0,04) und Diagnose (p=0,02). Patientenalter (p=0,56),

Stammzellquelle (p=0,86) und HLA-Match (p=0,57) beeinflussen diese Analyse nicht

(siehe hierzu Tabelle 20 und Abbildung 17).

Tabelle 20: Variablen der multivariaten Analyse (ACC-2-Match vs. Mismatch in GvH-

Richtung sowie Kovariaten) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und 95%

Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, GvH: graft-versus-host,

Tx: Transplantation

df

Signifikanz

(p-Wert) HR

95% Konfidenzintervall für HR

Untere Grenze Obere Grenze

Patientenalter bei Tx 1 0,547 1,010 0,978 1,042

Stammzellquelle 1 0,864 1,060 0,544 2,065

Diagnose 1 0,018 0,688 0,505 0,939

Krankheitsstadium 1 0,039 1,540 1,021 2,321

ACC2_GvH 1 0,037 2,434 1,055 5,615

72

Abbildung 17: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom ACC-2-

Match in GvH(graft-versus-host)-Richtung, multivariate Analyse, Gruppe: HLA-B44

positive Paare, grüne Kurve: ACC-2-Mismatch in GvH n=17, blaue Kurve: ACC-2-Match

in GvH n=44

CD31

Bei der Analyse des Adhäsionsmoleküls CD31 haben wir drei verschiedene polymorphe

Codons (Codon 125, 563 und 670) untersucht. Bei multivariater Betrachtung von Codon

563 in der Gruppe aller HLA-Merkmale fällt auf, dass die in HvG-Richtung gematchten

Transplantationspaare mit einem signifikant schlechteren Patientenüberleben als die

gemismatchten assoziiert sind (p=0,03, HR: 1,42, 95%CI: 1,03-1,95), siehe hierzu

Abbildung 18 und Tabelle 21. Darüber hinaus sind Krankheitsstadium (p<0,001),

Diagnose (p=0,003), Stammzellquelle (p=0,049) und Patientenalter (p=0,02) signifikante

Einflussfaktoren.

73

Abbildung 18: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom CD31

Codon 563-Match in HvG(host-versus-graft)-Richtung, multivariate Analyse, Gruppe: alle

HLA- Merkmale, grüne Kurve: Codon 563-Mismatch in HvG n=108, blaue Kurve: Codon

563-Match in HvG n=165

Tabelle 21: Variablen der multivariaten Analyse (CD31 Codon 563-Match vs. Mismatch in

HvG-Richtung und Kovariate) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und 95%

Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, HvG: host-versus-graft,

Tx: Transplantation

df

Signifikanz

(p-Wert) HR

95% Konfidenzintervall für HR

Untere Grenze Obere Grenze

Patientenalter bei Tx 1 0,021 1,017 1,003 1,031

Stamzellquelle 1 0,049 0,737 0,545 0,998

Diagnose 1 0,003 0,808 0,704 0,929

Krankheitsstadium 1 <0,001 1,676 1,380 2,034

CD31Cd563_HvG 1 0,030 1,418 1,034 1,945

74

Sowohl ein CD31 Codon 125-Match (p=0,03; HR: 1,75; 95%CI: 1,05-2,90) als auch ein

Codon 563-Match (p=0,04; HR: 1,61; 95%CI: 1,01- 2,58) in beiden Richtungen

(GvHundHvG) verschlechtern das Überleben nach unverwandter, allogener HSCT.

Interessanterweise können wir die in der univariaten Analyse errechneten Signifikanzen für

CD31 Codon 563 und 670 in der HLA-B7-Superfamilie multivariat nicht bestätigen.

CD62L

Bei der Analyse des Adhäsionsmoleküls CD62L haben wir zwei verschiedene polymorphe

Codons (Codon 206 und 213) in der HLA-A3-Superfamilie untersucht.

Für Codon 206 zeigt sich Folgendes:

Abbildung 19 zeigt die Überlebenskurve von Patienten, die mit ihren Spendern in Cd62L

Codon 206 in GvH-Richtung gematcht waren und die Überlebenskurve der gemismatchten

Patienten: Gematchte Patienten überleben hierbei deutlich schlechter (p=0,003; HR: 2,44;

95%CI: 1,35- 4,39). Außerdem spielten bei dieser multivariaten Analyse

Krankheitsstadium (p<0,001) und Diagnose (p=0,014) eine signifikante Rolle; zu

vernachlässigen sind Patientenalter (p=0,4) und Stammzellquelle (p=0,35), siehe Tabelle

22.

Tabelle 22: Variablen der multivariaten Analyse (CD62L Codon 206-Match vs. Mismatch

in GvH-Richtung und Kovariate) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und 95%

Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, GvH: Graft-versus-host,

Tx: Transplantation

df

Signifikanz

(p-Wert) HR

95,0% Konfidenzintervall für HR

Untere Grenze Obere Grenze

Patientenalter bei Tx 1 0,406 1,010 0,987 1,033

Stammzellquelle 1 0,350 0,797 0,495 1,283

Diagnose 1 0,014 0,761 0,611 0,947

Krankheitsstadium 1 <0,001 1,882 1,410 2,511

CD62LCd206_GvH 1 0,003 2,435 1,351 4,390

75

Abbildung 19: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom CD62L

Codon 206-Match in GvH(graft-versus-host)-Richtung, multivariate Analyse, Gruppe:

HLA-A3 positive Paare, grüne Kurve: Codon 206-Mismatch in GvH n=32, blaue Kurve:

Codon 206-Match in GvH n=87

Für Codon 213 zeigt sich Folgendes:

Bei CD62L Codon 213 lässt sich ein gegenteiliger Effekt beobachten: Ein Match in

GvHoderHvG-Richtung ist für ein besseres Überleben verantwortlich (p=0,03; HR: 0,59;

95%CI: 0,37- 0,95), zudem spielen Diagnose (p=0,016) und Krankheitsstadium (p<0,001)

signifikante Rollen, siehe hierzu Abbildung 20 und Tabelle 23.

Die in der univariaten Analyse festgestellte signifikante Verschlechterung der

Überlebenswahrscheinlichkeit durch ein CD62L Codon 213 Mismatch in GvH-Richtung

(p=0,04) lässt sich multivariat nicht bestätigen.

76

Abbildung 20: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom CD62L

Codon 213-Match in GvHoderHvG(graft-versus-host oder host-versus-graft)-Richtung,

multivariate Analyse, Gruppe: HLA-A3 positive Paare, grüne Kurve: Codon 213-

Mismatch in GvHoderHvG n=45, blaue Kurve: Codon 213-Match in GvHoderHvG n=74

Tabelle 23: Variablen der multivariaten Analyse (CD62L Codon 213-Match vs. Mismatch

in GvHoderHvG-Richtung und Kovariate) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und

95% Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, GvHoderHvG:

graft-versus-host oder host-versus-graft, Tx: Transplantation

df

Signifikanz

(p-Wert) HR

95,0% Konfidenzintervall für HR

Untere

Grenze

Obere

Grenze

Patientenalter bei Tx 1 0,381 1,011 0,987 1,035

Stammzellquelle 1 0,374 0,805 0,499 1,298

Diagnose 1 0,016 0,766 0,617 0,952

Krankheitsstadium 1 <0,001 1,692 1,273 2,250

CD62LCd213GvHoderHvG 1 0,031 0,593 0,369 0,954

77

3.7.2 Analyse der sekundären Outcomes

Der Einfluss von mHag-Mismatchen auf die sekundären Outcomeparameter (Inzidenz von

TRM/NRM, Relapse und aGvHD) wird in einer kompetitiven Risikoanalyse ermittelt

(siehe Kapitel 2.2, Abschnitt 6.3). Analog der Überlebenszeitanalyse werden in der

univariaten Analyse nur der mHag-Status, in der multivariaten Analyse zusätzlich auch

weitere Risikofaktoren berücksichtigt. Untersucht werden auch hier für jedes mHag

Mismatche in GvH, HvG, GvHoderHvG und für HB-1, CD31 und CD62L auch

GvHundHvG-Richtung.

Da eine akute GvHD per Definition nur bis Tag 100 nach HSCT auftritt und auch die

TRM/NRM-Inzidenz in den ersten 2 Jahren am höchsten ist, wird bei deren Analyse die

Zeitachse auf 500 Tage nach HSCT begrenzt. Dagegen wird die Relapseinzidenz bis zu

2000 Tage nach HSCT untersucht, um späte Rückfälle mit einschließen zu können.

3.7.2.1 Univariate Analyse

a) TRM/NRM

Einen signifikanten Einfluss auf die transplantationsassoziierte bzw. non relapse assoziierte

Mortalität (TRM/NRM) zeigen in unserer univariaten Analyse zwei mHag:

ACC-2

Patienten, die mit ihren Spendern für ACC-2 in GvH-Richtung gematcht sind, zeigen eine

signifikant höhere Wahrscheinlichkeit, an TRM/NRM zu versterben (durchgehende

schwarze Kurve) im Vergleich zu den gemismatchten (gestrichelte schwarze Kurve)

(p=0,04). Die roten Kurven zeigen die Auftretenswahrscheinlichkeiten des kompetitiven

Risikos (Relapse und Tod anderer Ursache) für gematchte (durchgehende Kurve) und

gemismatchte (gestrichelte Kurve) Paare, welche sich nicht signifikant unterscheiden (p=

0,73), siehe hierzu Abbildung 21.

78

Abbildung 21: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen für TRM/NRM und für

dessen kompetitives Risiko (Relapse und Tod anderer Ursache) innerhalb von 500 Tagen

nach HSCT; TRM/NRM: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;

durchgezogene schwarze Kurve: kumulative TRM/NRM-Inzidenzen bei ACC-2-Match in

GvH-Richtung (n=31), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative TRM/NRM-Inzidenzen

bei ACC-2-Mismatch in GvH-Richtung (n= 6)

CD62L

In der HLA-A3-Superfamilie zeigen die Patienten, die für CD62L Codon 206 in GvH-

Richtung mit ihrem Spender gematcht sind (durchgehende schwarze Kurve) eine

signifikant höhere TRM/NRM-Inzidenz (p=0,02) als ihre gemismatchen Gegenüber

(gestrichelte schwarze Kurve). Dahingegen lässt sich dieses Ergebnis nicht im

Gesamtkollektiv (alle HLA-Merkmale) bestätigen. Analog zu ACC-2 zeigen die roten

Kurven die Wahrscheinlichkeiten des kompetitiven Risikos (Relapse und Tod anderer

Ursache) an, welche sich nicht signifikant zwischen Match und Mismatchsituation

unterscheiden (p=0,44), siehe hierzu Abbildung 22.

ACC-2 match in GvH: TRM/NRM ACC-2 mismatch in GvH: TRM/NRM ACC-2 match in GvH: Relapse + Tod anderer Ursache ACC-2 mismatch in GvH: Relapse + Tod anderer Ursache

79

Abbildung 22: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen für TRM/NRM und für

dessen kompetitives Risiko (Relapse und Tod anderer Ursache) innerhalb von 500 Tagen

nach HSCT; TRM/NRM: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;

durchgezogene schwarze Kurve: kumulative TRM/NRM-Inzidenz bei Match für CD62L

Codon 206 in GvH-Richtung (n=44), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative

TRM/NRM-Inzidenz bei Mismatch für CD62L Codon 206 in GvH-Richtung (n= 9)

b) aGvHD Grad II oder höher

Das einzige mHag mit signifikanter Auswirkung auf die Entstehung einer aGvHD

innerhalb der ersten 500 Tage nach HSCT ist HA-8. Bei Patienten, die mit ihren Spendern

für HA-8 in HvG-Richtung (gestrichelte schwarze Kurve) gemismatcht sind, zeigt sich ein

erhöhtes Risiko eine aGvHD zu entwickeln, gegenüber dem Risiko bei gematchten

Patienten (durchgehende schwarze Kurve) (p=0,01). Die roten Kurven zeigen die

Inzidenzen des kompetitiven Risikos (Relapse, TRM/NRM und Tod anderer Ursache) für

gematchte (durchgehende Kurve) und gemismatchte (gestrichelte Kurve) Patienten, welche

sich nicht signifikant voneinander unterscheiden (p=0,24), siehe hierzu Abbildung 23.

CD62L Cd206 match in GvH: TRM/NRM CD62L Cd206 mismatch in GvH: TRM/NRM CD62L Cd206 match in GvH: Relapse+Tod anderer Ursache CD62L Cd206 mismatch in GvH: Relapse+Tod anderer Ursache

80

Abbildung 23: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen für aGvHD und für dessen

kompetitives Risiko (Relapse, TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 500

Tagen nach HSCT; aGvHD: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;

durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenz von aGvHD ≥Grad II bei Match für

HA-8 in HvG-Richtung (n=46), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenz von

aGvHD ≥Grad II bei Mismatch für HA-8 in HvG-Richtung (n= 24)

c) Relapse

Einen signifikanten Einfluss auf ein Relapse zeigen in unserer univariaten Analyse

folgende mHag:

ACC-1

Bei Patienten mit einem Mismatch in GvHoderHvG-Richtung erhöht sich signifikant die

Wahrscheinlichkeit eines Relapses gegenüber den für ACC-1 gematchten Patienten

(p=0,03); dahingegen unterscheiden sich die Inzidenzen für die kompetitiven Risiken

(TRM/NRM und Tod anderer Ursache) nicht (p=0,71) (ohne Abbildung).

HA-8 match in HvG: aGvHD HA-8 mismatch in HvG: aGvHD HA-8 match in HvG: Relapse,TRM/NRM, Tod anderer Urs. HA-8 mismatch in HvG: Relapse,TRM/NRM, Tod anderer Urs.

81

CD62L

Mismatche im Codon 206 des Adhäsionsmoleküls CD62L wirken sich in der

Gesamtkohorte (alle HLA-Merkmale) sowohl in GvH-Richtung als auch in HvG-Richtung

auf die Wahrscheinlichkeit eines Krankheitsrückfalls aus, siehe Abbildung 24 und 25.

Wie Abbildung 24 verdeutlicht, haben Patienten, die mit ihrem Spender ein Mismatch in

GvH-Richtung in Codon 206 aufweisen (schwarze gestrichelte Kurve) eine höhere

Wahrscheinlichkeit, einen Rückfall zu erleiden, als gematchte Patienten (schwarze

durchgezogen Kurve) (p=0,03).

Abbildung 24: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen eines Relapses und des

kompetitiven Risikos (TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 2000 Tagen

nach HSCT; Relapse: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;

durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenz eines Relapses bei Match für CD62L

Codon 206 in GvH-Richtung (n=55), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenz

eines Relapses bei Mismatch für CD62L Codon 206 in GvH-Richtung (n=30)

CD62L Cd206 match in GvH: Relapse CD62L Cd206 mismatch in GvH: Relapse CD62L Cd206 match: TRM/NRM + Tod anderer Ursache CD62L Cd206 mismatch: TRM/NRM + Tod anderer Ursache

82

Im Gegensatz zum Mismatch in GvH-Richtung zeigen, wie Abbildung 25 verdeutlicht, bei

einem Mismatch in HvG-Richtung die gematchten Patienten (schwarze durchgehende

Kurve) eine höhere Relapseinzidenz als die gemismatchten (schwarze gestrichelte Kurve)

(p=0,02).

Abbildung 25: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen eines Relapses und des

kompetitiven Risikos (TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 2000 Tagen

nach HSCT; Relapse: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;

durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenz eines Relapses bei Match für CD62L

Codon 206 in HvG-Richtung (n=70), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenz

eines Relapses bei Mismatch für CD62L Codon 206 in HvG-Richtung (n=15)

CD31

In der Gesamtkohorte (alle HLA-Merkmale) sinkt die Inzidenz eines Relapses bei

Patienten mit einem Mismatch für CD31 Codon 563 in GvHundHvG-Richtung im

Gegensatz zu gematchten Patienten (p=0,04) (ohne Abbildung).

CD62L Cd206 match in HvG: Relapse CD62L Cd206 mismatch in HvG: Relapse CD62L Cd206 match: TRM/NRM + Tod anderer Ursache CD62L Cd206 mismatch: TRM/NRM + Tod anderer Ursache

83

PANE-1

Auch die für PANE-1 mit ihren Spendern in HvG-Richtung gemismatchten Patienten

(gestrichelte schwarze Kurve) zeigen eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit, einen

Krankheitsrückfall zu erleiden als deren gematchte Gegenüber (durchgezogene schwarze

Kurve) (p=0,005), siehe hierzu Abbildung 26.

Abbildung 26: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen eines Relapses und des

kompetitiven Risikos (TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 2000 Tagen

nach HSCT; Relapse:schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;

durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenzen eines Relapse bei Match für

PANE-1 in HvG-Richtung (n=17), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenzen

eines Relapses bei Mismatch für PANE-1 in HvG-Richtung (n=6)

PANE-1 match in HvG: Relapse PANE-1 mismatch in HvG: Relapse PANE-1 match in HvG: TRM/NRM + Tod anderer Ursache PANE-1 mismatch in HvG: TRM/NRM + Tod anderer Ursache

84

3.7.2.2 Multivariate Analyse

Alle mHag-Mismatche, die sich in der univariaten Analyse als signifikant erwiesen haben,

werden außerdem in einem multivariaten Modell unter Berücksichtigung aller zusätzlichen

signifikanten Einflussfaktoren (siehe hierzu Kapitel 3.6) untersucht. Auch hier haben wir

eine kompetitive Risikoanalyse durchgeführt.

a) TRM/NRM

Auch unter Berücksichtigung der anderen Risikofaktoren konnte festgestellt werden, dass

die beiden mHag ACC-2 und CD62L Codon 206 (beide im Mismatch in GvH-Richtung)

einen signifikanten Einfluss auf TRM/NRM besitzen. Beide verringern mit einem

Mismatch in GvH-Richtung die Auftretenswahrscheinlichkeit für TRM/NRM (ACC-2:

p=0,02; HR: 0,34; 95%CI: 0,13-0,87; CD62L Codon206: p=0,03; HR: 0,45; 95%CI: 0,22-

0,91); siehe hierzu Tabelle 24.

Obwohl im kompetitiven Risikomodell aller Kovariaten nur das HLA-Matching als

unabhängiger Risikofaktor eine Auswirkung auf die Inzidenz der TRM/NRM hat (siehe

Kapitel 3.6, Abschnitt 5), spielen in den multivariaten Analysen auch andere Faktoren eine

Rolle:

Im ACC-2-Modell hat die Diagnose (p=0,02) einen signifikanten Einfluss. Zusätzlich zu

Codon 206 von CD62L beeinflussen Diagnose (p=0,04), Stadium der Erkrankung (p=0,04)

und HLA-Match (p=0,01) die Wahrscheinlichkeit einer TRM/NRM.

85

Tabelle 24: TRM/NRM, multivariate Analyse; p-Werte, HR und 95% CI

ACC-2 MM in GvH

CD62L Cd206 MM in GvH

(HLA-A3-Superfamilie)

N 77 140

Parameter Vergleich 1

p-Wert HR 95%CI p-

Wert HR 95% CI

mHag mismatch/match 0,02 0,34 0,13-0,87 0,03 0,45 0,22-0,91

Patientenalter 2

0,48 0,98 0,94-1,02 0,65 1,0 0,98-1,03

Diagnose 3

0,02 - - 0,04 - -

Geschlechtsmatch mismatch/match 0,42 0,51 0,09-2,62 0,56 0,76 0,29-1,92

Krankheitsstadium 3

0,31 - - 0,04 - -

Konditionierung RIC/MAC 0,28 1,75 0,63-4,82 0,7 1,29 0,36-4,65

Stammzellquelle PBSZ/KM 0,18 0,56 0,24-1,31 0,21 0,71 0,41-1,22

HLA-Match mismatch/match 0,12 2,17 0,82-5,7 0,01 2,25 1,18-4,3

N: Gruppengröße; MM: Mismatch; Parameter: untersuchter Risikofaktor, TRM/NRM:

Transplant related mortality / Non relapse mortality, GvH: graft-versus-host, RIC:

reduzierte Konditionierung, MAC: myeloablative Konditionierung, PBSZ: periphere

Blutstammzellen, KM: Knochenmark, HLA: Humanes Leukozytenantigen, HR: Hazard

ratio, CI: Konfidenzintervall

1: Als Baseline (Referenzgruppe) in dieser Spalte gilt immer die zweitgenannte Kategorie

in jedem Feld (z.B. match bei mismatch/match).

2: Patientenalter ist eine stetige Variable, p-Wert ist ein Mittelwert, HR und 95% CI

beziehen sich auf diesen Mittelwert.

3: Baseline sind AML (Diagnose) und Stadium 1 (Krankheitsstadium), beide p-Werte sind

durch den Wald-Test (Chi-Quadrat-Statistik) ermittelt.

86

b) aGvHD

Im multivariaten Modell zur Analyse der aGvHD-Inzidenz zeigt sich als einziges

signifikantes Kriterium ein Mismatch im mHag HA-8 in HvG-Richtung (p=0,01). Dieses

erhöht das Risiko der Entstehung einer aGvHD um das 1,8fache (p=0,01, HR: 1,85;

95%CI: 1,14-3,0); siehe hierzu Tabelle 25.

Tabelle 25: aGvHD, multivariate Analyse; p-Werte, HR und 95% CI

HA-8 MM in HvG

N 166

Parameter Vergleich1 p-Wert HR 95%CI

mHag mismatch/match 0,01 1,85 1,14-3,0

Patientenalter 2

0,12 1,01 0,99-1,04

Diagnose 3

0,46 - -

Geschlechtsmatch mismatch/match 0,41 1,32 0,68-2,53

Stadium 3

0,43 - -

Konditionierung RIC/MAC 0,19 0,58 0,26-1,31

Stammzellquelle PBSZ/KM 0,72 0,90 0,52-1,57

HLA-Match mismatch/match 0,74 1,10 0,62-1,95

N: Gruppengröße, MM: Mismatch, Parameter: untersuchter Risikofaktor, aGvHD: akute

Graft-versus-Host Erkrankung, HvG: host-versus-graft, RIC: reduzierte Konditionierung,

MAC: myeloablative Konditionierung, PBSZ: periphere Blutstammzellen, KM:

Knochenmark, HLA: Humanes Leukozytenantigen HR: Hazard ratio, CI:

Konfidenzintervall

1: Als Baseline (Referenzgruppe) in dieser Spalte gilt immer die zweitgenannte Kategorie

in jedem Feld (z.B. match bei mismatch/match).

2: Patientenalter ist eine stetige Variable, p-Wert ist ein Mittelwert, HR und 95% CI

beziehen sich auf diesen Mittelwert.

3: Baseline sind AML (Diagnose) und Stadium 1 (Krankheitsstadium), beide p-Werte sind

durch den Wald-Test (Chi-Quadrat-Statistik) ermittelt

87

Tabelle 26: Relapse, multivariate Analyse; p-Werte, HR und 95% CI

ACC-1 MM in GvHoderHvG

CD31 Cd563 MM

in GvHundHvG

(alle HLA-Merkmale)

CD62L Cd206 MM in GvH

(alle HLA-Merkmale)

CD62L Cd206 MM in HvG

(alle HLA-Merkmale) PANE-1 MM in HvG

N 68 308 308 308 83

Parameter Vergleich 1 p-Wert HR 95%CI p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95%CI p-Wert HR 95%CI p-Wert HR 95%CI

mHag mismatch/

match 0,01 3,36 1,28-8,81 0,08 0,44 0,18-1,12 0,01 1,83

1,14-

2,95 0,03 0,53

0,31-

0,92 0,001 8,26

2,30-

29,6

Pat.alter 2 0,05 1,05 1,0-1,11 0,10 1,01 0,99-1,0 0,19 1,01 0,99-

1,03 0,12 1,01

0,99-

1,03 0,72 0,99

0,94-

1,04

Diagnose 3 0,07 - - 0,05 - - 0,11 - - 0,06 - - 0,42 - -

Geschlechtsmatch mismatch/

match 0,09 4,86 0,78-30,3 0,02 1,98 1,14-3,43 0,007 2,11

1,23-

3,65 0,02 1,88

1,12-

3,19 0,16 1,92

0,77-

4,77

Stadium 3 0,29 - - 0,1 - - 0,03 - - 0,01 - - 0,09 - -

Konditionierung RIC/MA 0,13 1,56 1,56-3,4 0,001 2,46 1,43-4,24 <0,001 2,72 1,53-

4,83 <0,001 2,75

1,63-

4,64 <0,001 13,0

2,91-

58,7

Stammzellquelle PBSZ/KM 0,04 3,02 1,07-8,5 0,02 1,9 1,11-3,26 0,004 2,26 1,3-3,93 0,003 2,13 1,29-

3,51 0,16 2,19

0,74-

6,56

HLA-Match mismatch/

match 0,39 0,58 0,17-1,98 0,66 0,90 0,58-1,41 0,60 0,88

0,57-

1,38 0,35 0,80

0,51-

1,27 0,92 0,93

0,26-

3,41

N: Gruppengröße; MM: Mismatch; Parameter: untersuchter Risikofaktor, GvH: Graft-versus-host, HvG: Host-versus-graft, GvHoderHvG: Graft-versus-host oder Host-

versus-graft, GvHundHvG: Graft-versus-host und Host-versus-graft, Pat.alter: Patientenalter, RIC: reduzierte Konditionierung, MAC: myeloablative Konditionierung,

PBSZ: periphere Blutstammzellen, KM: Knochenmark, HLA: Humanes Leukozytenantigen, HR: Hazard Ratio, 95% CI: Konfidenzintervall

1: Als Baseline (Referenzgruppe) in dieser Spalte gilt immer die zweitgenannte Kategorie in jedem Feld (z.B. match bei mismatch/match).

2:

Patientenalter ist eine stetige Variable, p-Wert ist ein Mittelwert, HR und 95% CI beziehen sich auf diesen Mittelwert

3: Baseline sind AML (Diagnose) und Stadium 1 (Krankheitsstadium), beide p-Werte sind durch den Wald-Test (Chi-Quadrat) ermittelt

88

c) Relapse

Multivariat zeigen folgende mHag einen Einfluss auf einen Krankheitsrückfall (siehe

hierzu Tabelle 26):

Ein ACC-1-Mismatch in GvHoderHvG-Richtung vervielfacht das Risiko eines

Relapses durchschnittlich 3,4fach (p=0,01; 95%CI: 1,28-8,81), daneben wird die

Relapsewahrscheinlichkeit noch durch den Einsatz von peripheren

Blutstammzellen als Transplantat begünstigt (p=0,04; HR: 3,02; 95%CI: 1,07-8,5).

CD62L Codon 206: Ein Mismatch in GvH-Richtung begünstigt (p=0,01; HR: 1,83;

95%CI: 1,14-2,95), ein Mismatch in HvG-Richtung reduziert (p=0,03; HR:0,53;

95%CI: 0,31-0,92) die Wahrscheinlichkeit des Krankheitsrückfalls. Daneben

beeinflussen folgende Kovariate die Entstehung eines Relapses: ein

Geschlechtsmismatch zwischen Spender und Patient (p=0,007; HR: 2,11; 95%CI:

1,23-3,65 bzw. p=0,02; HR: 1,88, 95%CI: 1,12-3,19), ein höheres klinisches

Stadium bei HSCT (p=0,03 bzw. p=0,01), reduziertes Konditionierungsregime

(p<0,001; HR:2,72; 95%CI: 1,53-4,83 bzw. p<0,001; HR: 2,75; 95%CI: 1,63-4,64)

sowie PBSZ als Stammzellquelle (p=0,004; HR: 2,26; 95%CI: 1,3-3,93 bzw.

p=0,003; HR: 2,13; 95%CI: 1,29-3,51) begünstigen die Entstehung eines Relapses.

Ein PANE-1-Mismatch in HvG-Richtung erhöht die Wahrscheinlichkeit eines

Krankheitsrückfalls (p=0,001; HR: 8,26; 95%CI: 2,30-29,6), in diesem Modell

wirkt die reduzierte Konditionierung außerdem begünstigend auf ein Relapse

(p<0,001; HR: 13,0; 95%CI: 2,91-58,7).

Der signifikante Einfluss eines CD31 Codon 563-Mismatches in GvHundHvG-Richtung in

der univariaten Analyse auf die Relapsewahrscheinlichkeit konnte in der multivariaten

Analyse nicht bestätigt werden.

3.7.3 Tabellarische Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse

Aufgrund der Vielzahl und Komplexität der durchgeführten Analysen wurden die

wichtigsten Ergebnisse noch einmal in Tabelle 27 zusammengefasst.

89

Tabelle 27: Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse mit jeweiligen p-Werten, aGvHD: akute Graft-versus-host Erkankung, TRM: Transplant-related mortality,

NRM: Non relapse mortality, MM: Mismatch, : erhöht, : vermindert, GvH: Graft-versus-host, HvG: Host-versus-graft, GvHoderHvG: Graft-versus-host oder Host-

versus-graft, GvHundHvG: Graft-versus-host und Host-versus-graft

mHag Codon/

Subgruppe

Gesamtüberleben aGvHD TRM/NRM Relapse

Univariat Multivariat Univariat Multivariat Univariat Multivariat Univariat Multivariat

HA-8 HLA-A2 - -

durch MM

inHvG

(p=0,01)

durch MM

inHvG

(p=0,01)

- - - -

ACC-1 HLA-A24 - - - - - - durch MM in

GvHodHvG(p=0,03)

durch MM in

GvHodHvG(p=0,01)

ACC-2 HLA-B44 durch MM in GvH

(p=0,09)

durch MM in GvH

(p=0,04) - -

durch MM in

GvH (p=0,04)

durch MM in GvH

(p=0,02) - -

CD31

Cod 125 (alle

HLA)

durchMM in

GvHundHvG (p=0,08)

durch MM in

GvHundHvG (p=0,03) - - - - - -

Cod 563 (alle

HLA)

durch MM inHvG

(p=0,03); durch MM

inGvHundHvG (p=0,08)

durch MM inHvG

(p=0,03); durch MM

inGvHundHvG (p=0,04)

- - - -

durch MM in

GvHundHvG

(p=0,04)

durch MM in

GvHundHvG

(p=0,08)

Cod 563 und 670

(HLAB7Superfam)

durch MM in

GvHodHvG (p=0,04) - - - - - - -

CD62L

Cod 206 (alle

HLA) - - - - - -

durch MM in GvH

(p=0,03);

durch MM in HvG

(p=0,02)

durch MM inGvH

(p=0,01);

durch MM in HvG

(p=0,03)

Cod 206(HLA-A3

Superfam)

durch MM in GvH

(p=0,04)

durch MM in GvH

(p=0,003) - -

durch MM in

GvH (p=0,02)

durch MM in

GvH (p=0,03) - -

Cod 213(HLA-A3

Superfam)

durch MM in GvH

(p=0,04); durch MM

GvHodHvG (p=0,03)

durch MM in

GvHodHvG (p=0,03) - -

durch MM in

GvH (p=0,04)

durch MM in GvH

(p=0,08) - -

PANE-

1 HLA-A3 - - - - - -

durch MM inHvG

(p=0,005)

durch MM

inHvG(p=0,001)

90

4. Diskussion

Dass bis heute zahlreiche widersprüchliche Publikationen zu den verschiedenen mHag und

deren Einfluss auf den klinischen Verlauf einer allogenen HSCT veröffentlicht wurden,

lässt die Komplexität dieses Themas vermuten und zeigt den Bedarf nach dessen weiterer

Klärung (Behar et al, 1996; Goulmy et al, 1996b; Maruya et al, 1998; Tseng et al, 1999;

Gallardo et al, 2001; Grumet et al, 2001; Lin et al, 2001; Akatsuka et al, 2003b;

Heinemann et al, 2004; Nishida et al, 2004; Cavanagh et al, 2005; Terakura et al, 2005;

Pérez-García et al, 2005; Katagiri et al, 2006; Markiewicz et al, 2009; McCaroll et al,

2009; Spellman et al, 2009).

Um die Bedeutung von mHag in der HSCT zu untersuchen, wurde in dieser Studie die

Assoziation zwischen Kompatibilität der einzelnen mHag in Patienten-Spender-Paaren und

dem Erreichen definierter klinischer Endpunkte nach allogener, nicht verwandter HSCT

eruiert. Ziel war es, eine hohe Fallzahl an Patienten-Spender-Paaren zu gewinnen, um den

Einfluss möglichst vieler etablierter mHag an dieser Kohorte untersuchen zu können.

Durch die hohe Fallzahl wurde unsere Kohorte sehr heterogen, und in unseren Analysen

mussten mehrere bekannte patienten-, spender- und therapieabhängige Risikofaktoren

berücksichtigt werden, um danach den alleinigen Effekt der mHag-Disparitäten

herauszufiltern. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die in dieser Studie inkludierten

Transplantationen zwischen 1997 und 2002 durchgeführt wurden, eine Zeit, zu der weder

die reduzierte Konditionierung (RIC), noch die GvH-Prophylaxe, noch die intensiven

Nachbehandlungs- und infektionsprophylaktischen Methoden auf dem heutigen klinischen

Stand waren, so dass, mit heute verglichen, eine prozentuale Verschiebung in den

Todesursachen zu Gunsten des TRM/NRM und zu Ungunsten der Relapseinzidenz

festzustellen ist (siehe Kapitel 3.5, Abschnitt 2).

Ausführlich diskutiert wurden neben der Bedeutung der mHag für die HSCT auch die

verschiedenen Nachweismethoden für mHag, sowie die von uns verwendeten statistischen

Verfahren zur Datenauswertung.

91

4.1 Validierung des Testverfahrens

Zunächst galt es, ein zuverlässiges und praktikables Testverfahren zur parallelen Testung

möglichst vieler mHag-Polymorphismen zu validieren und in unserem Labor zu etablieren.

Dazu haben wir das PCR-SSP Kit der Universität Heidelberg erworben und an acht

bekannten, gesunden und in Heidelberg vortypisierten Probanden in unserem Labor

validiert. Die Typisierungsergebnisse stimmten zu 100% mit den Vorergebnissen überein,

so dass wir davon ausgehen können, dass die technischen Voraussetzungen für eine

korrekte Typisierung gegeben sind. Als Alternative zur SSP-Testung steht bis dato ein

Multiplex-SSO Verfahren zur Verfügung, welches z. B. Spellman et al 2009 benutzt

haben. Dieses beruht auf der Luminex-Technologie: Auf eine Multiplex-PCR folgt eine

allelspezifische PCR, das resultierende Produkt wird daraufhin mittels DNA-Sonden

hybridisiert, diese werden an durch UV-Farbstoff markierte Antikörper gebunden und

sichtbar gemacht. Dies ermöglicht die simultane Analyse mehrerer mHag in einer Probe.

Da diese Technologie jedoch weitaus kostenintensiver als die SSP-Testung ist, entschieden

wir uns für letztere. Bisher gibt es keine vergleichende Analyse zwischen beiden

Verfahren, jedoch werden in beiden die gleichen mHag erfasst.

Die Hardy-Weinberg-Analyse der Allelverteilung der von uns untersuchten Kohorte,

aufgeteilt in Patienten-, Spender- und Kontrollgruppe wurde als zusätzliche

Validitätsüberprüfung unserer Daten eingesetzt. Die Allelverteilung der mHag aller

gesunden Stammzellspender befand sich in Übereinstimmung mit dem HWE. Bis auf HB-

1 befanden sich auch alle mHag der Patientengruppe in Übereinstimmung mit dem HWE.

In dieser Gruppe war die Verteilung zugunsten von HB-1 HH und HB-1 HY verschoben.

Um die Ursache dafür genauer zu untersuchen, wurden die Allel- und Genotypfrequenzen

von HB-1 aus der Patientengruppe nach den einzelnen Krankheitsbildern getrennt und die

Allelverteilung in den einzelnen Subgruppen mit dem HWE verglichen. Dabei ließ sich ein

signifikanter Unterschied vom HWE in der Gruppe der CML-Patienten nachweisen

(p=0,04). Bei CML-Patienten sind HB-1 HH und HY vermehrt enthalten, zu ungunsten der

seltenen Homozygoten HB-1YY Form, was auf eine Überexpression des HB-1H Allels in

leukämischen CML-Zellen deuten könnte. Die Relevanz dieses molekulargenetischen

Befundes für eine Antigenexpression ist jedoch unklar, da in der Literatur bis heute die

HB-1 Expression nur auf leukämischen B-Zellen (B-ALL) beschrieben ist (Dolstra et al,

1999). Auch in der Kontrollgruppe der weißen US-Amerikaner wich die Allelverteilung

92

von HB-1 vom HWE (p=0,0003) ab und bestätigte das Ergebnis in unserer

Patientengruppe. In dieser Kontrollgruppe weicht auch PANE-1 vom HWE ab. Die

Ursache für diese Abweichungen bei HB-1 und PANE-1 ist unklar und könnte

möglicherweise an methodischen Problemen liegen. So wurde für HB-1 in dem unserem

SSP-Kit beiliegenden Manual über mögliche falsch-positive Reaktionen des Primers zum

Nachweis von HB-1 Y besonders beim gleichzeitigen positiven Nachweis von HB-1 H

berichtet (Tran TH, 2008; Park et al, 2010). Dies könnte, trotz erhöhter Aufmerksamkeit

und Nachtestungen im Zweifelsfall, zu einem erhöhten Anteil von HB-1 HY typisierten

Individuen führen. Auch Spierings et al haben die SSP-Methode, jedoch von einem

anderen Hersteller (invitrogen) verwendet (Spierings et al, 2007); es wäre zu vermuten,

dass auch dort solch unspezifische Reaktionen auftreten.

Beim Vergleich der Genotyp-Häufigkeiten zwischen den jeweiligen Gruppen (Patienten

mit Spendern, Patienten mit Vergleichspersonen, Spendern mit Vergleichspersonen) fiel

ein signifikanter Unterschied zwischen der UGT2B17-Positivität in einer gesunden

Normalbevölkerung US-amerikanischer Herkunft (96% positiv für UGT2B17) und unseren

gesunden Stammzellspendern (88%) sowie unseren Patienten (86%) (jeweils p<0,0001)

auf. Gleichzeitig ließ sich zwischen unseren Spendern und Patienten keine signifikante

Abweichung finden. Laut Spierings et al besteht beim positiven Nachweis von UGT2B17

ein West-Ost-Gefälle: bei einer weißen US-Bevölkerung exprimieren noch 96,5% aller

Individuen UGT2B17, bei der asiatisch-indischen Bevölkerung sind dies noch 58,7%, bei

einer südostasiatischen Population sind dies nur noch 33,3% (Spierings et al, 2007). Somit

ist der von uns gefundene Unterschied zwischen weißen US-Amerikanern und

Europäischen Kaukasiern eher auf ethnische denn auf krankheitsspezifische Ursachen

zurückzuführen.

4.2 Etablierte Risikofaktoren einer Stammzelltransplantation und deren

Auswirkungen auf die klinischen Endpunkte nach allogener,

unverwandter HSCT

Da die von uns untersuchten Patienten- und Spenderpaare außer der Volljährigkeit und

vorhandener vollständiger Daten im DRST (Deutsches Register für

Stammzelltransplantationen) keine patienten- oder spenderspezifischen besonderen

93

Einschlusskriterien erfüllen mussten, wurde unsere Studienpopulation sehr vielfältig. Die

verschiedenen, etablierten Faktoren (siehe Tabelle 15), die den klinischen Ausgang einer

HSCT beeinflussen können, wurden vor der Analyse der mHag-Mismatche auf ihren

Einfluss hin getestet, um je nach Relevanz später im multivariaten Modell berücksichtigt

zu werden (siehe Kapitel 3.6).

4.2.1 Donor- und patientenspezifische Risikofaktoren

4.2.1.1 Patientenalter und -geschlecht

Einen großen Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigt das Patientenalter: die

Überlebenswahrscheinlichkeit nimmt mit steigendem Patientenalter zum Zeitpunkt der

HSCT ab (p=0,02). Die höchste Überlebenswahrscheinlichkeit zeigen Patienten im Alter

von 18-40 Jahren. Dies ist kongruent zur bestehenden Literatur (Eapen and Rocha, 2008)

und klinisch erklärbar: ältere Patienten leiden häufiger an Komorbiditäten zu ihrer

malignen Erkrankung, und auch die Konditionierung wird im Alter aufgrund von

nachlassender Nieren- und Leberfunktion noch schlechter vertragen.

Die Haupttodesursache bei älteren Patienten in unserer Studie ist ein Rückfall der

Grunderkrankung. Auch wenn der Einfluss des Patientenalters auf die Relapseinzidenz

knapp eine Signifikanz (p=0,05) verfehlt, steigt die Häufigkeit eines Relapses mit dem

Alter: So ist ein Krankheitsrückfall bei 41-50jährigen noch mit 20,3% relativ selten, steigt

bei den 51-60jährigen schon auf 31,7% und bei den >60jährigen auf 75% Anteil an den

Todesursachen. Jedoch steigt der Anteil der in Stadium 2 und 3 Transplantierten auch mit

dem Alter der Patienten an: Von den 41-50jährigen sind dies 53,1%, von den 51-

60jährigen 61% und von den >60jährigen 100%. Da das Relapserisiko für einen Patienten

steigt, je höher das Krankheitsstadium ist, in welchem er transplantiert wird (Aschan,

2006), ist dies eine zusätzliche Erklärung zum Anstieg der Relapseinzidenz im Alter in

unserer Kohorte.

Ob ein Patient weiblich oder männlich ist, hat in unserer Studie keine Auswirkung auf

Gesamtüberleben, Inzidenz von aGvHD, Rückfall oder TRM/NRM. Bedeutender ist das

Geschlechtsmismatch zwischen Patient und Spender (siehe Abschnitt 1.3,

Geschlechtsmismatch).

94

4.2.1.2 Spenderalter und -geschlecht

Das Spendergeschlecht nahm in unserer Studie keinen signifikanten Einfluss auf die von

uns untersuchten Zielgrößen, wichtiger ist der Geschlechtsunterschied zwischen Patient

und Spender (siehe nächster Abschnitt). In der gängigen Literatur kann ein höheres

Spenderalter zu einem höheren Risiko der Entwicklung einer aGvHD, zu einer höheren

TRM/NRM oder einer erhöhten Gesamtsterblichkeit führen (Eapen and Rocha, 2008). Dies

konnten wir nicht bestätigen.

4.2.1.3 Geschlechtsmismatch

Die auf dem humanen Y-Chromosom kodierten spezifischen Peptide bilden die mit „H-Y“

bezeichneten geschlechtsspezifischen mHag, die durch unterschiedliche HLA-Moleküle

gebunden und in dieser Arbeit nicht speziell typisiert worden sind. Da weibliche T-Zellen

die y-chromosomal kodierten Peptide als fremd erkennen, spielen diese mHAg

hauptsächlich bei der Transplantation eines weiblichen Donors auf einen männlichen

Patienten eine entscheidende Rolle (positives Geschlechtsmismatch). Diesen Effekt haben

wir mit der Einführung der Variablen Geschlechtsmismatch berücksichtigt (siehe Kapitel

1.3.4). Dessen Bedeutung zur Induktion einer GvH- oder GvL-Reaktion ist, wie die

Bedeutung der autosomalen mHag, umstritten (Randolph et al, 2004, Spellman et al,

2009). Es wird zusammenfassend von einem möglicherweise erhöhten aGvHD-Risiko bei

positivem Geschlechtsmismatch gesprochen (Eapen and Rocha, 2008). Die bei uns mit

einem positiven Geschlechtsmismatch (Spender weiblich, Patient männlich)

transplantierten Patienten erlitten signifikant häufiger einen Rückfall ihrer

Grunderkrankung, was damit eher auf einen fehlenden GvH- bzw. GvL-Effekt

zurückzuführen ist, wiesen aber kein erhöhtes aGvHD-Risiko auf. Ein erhöhtes

Rückfallrisiko, wie bei uns beschrieben, wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben.

4.2.1.4 Stammzellquelle

Pilot- und klinische Phase-II-Studien zeigen, dass PBSZ nicht nur ein deutlich schnelleres

Engraftment vorweisen, sondern auch die aGvHD-Inzidenz nicht steigern (Bensinger et al,

1995; Bensinger and Storb, 2001). Dies konnten wir auch hier in unserer Analyse

bestätigen: Nur 39,6% der mit PBSZ Transplantierten entwickelten nach HSCT eine

95

klinisch relevante aGvHD, bei KM lag diese bei 51,3% (p=0,04). Somit war in unserer

Studie die aGvHD-Inzidenz bei PBSZ-Transplantaten sogar noch signifikant niedriger als

bei Transplantationen von KM. Bisherige Studienergebnisse zeigen außerdem, dass durch

die schnellere Immunrekonstitution nach PBSZ-Transplantationen und folglich niedrigerer

Relapseinzidenz das Gesamtüberleben und krankheitsfreie Überleben besonders bei

Hochrisikopatienten verlängert werden (Storek et al, 2001). Überraschenderweise zeigte

sich in unserer Studie ein gegenteiliger Effekt: Das Überleben nach Transplantation von

PBSZ war schlechter als das nach KM-Transplantation. Bei genauerer Betrachtung konnte

man jedoch folgendes feststellen: Da PBSZ gerade bei Hochrisikoleukämiepatienten und

Patienten in höheren Krankheitsstadien eine größere Chance auf Lebensverlängerung

versprachen (Bensinger and Storb, 2001), sorgte dies wahrscheinlich auch bei unserer

Kohorte für einen Trend in der Vorauswahl für PBSZ-Patienten. Während bei den

Erkrankungen mit guter Prognose (CML, MDS) in 42,4% KM als Stammzellquelle

gewählt wurde, erhielten bei den Krankheiten mit insgesamt schlechter Prognose (AML,

ALL und sonstige) 70,2% PBSZ (29,8% KM). Auch erhielten vorwiegend ältere Patienten

PBSZ: Bei den 41-50jährigen war das Verhältnis mit 54,4% KM und 45,6% PBSZ noch

ausgeglichen, bei den 51-60jährigen betrug es schon 26% KM zu 74% PBSZ.

Darüber hinaus zeigen in unserer Analyse periphere Blutstammzellen als

Transplantatquelle eine signifikant höhere Relapseinzidenz (p=0,005; HR: 2,09; 95%CI:

1,2-3,5) als Knochenmark. Während 39,4% aller Patienten, die mit PBSZ transplantiert

wurden, ein Relapse erleiden, sind dies bei der Transplantation von KM nur 17,9%. Auch

dies lässt auf eine Vorauswahl der PBSZ-Patienten auf Patienten in höheren

Krankheitsstadien schließen. Laut Aschan et al, korreliert das Risiko eines Relapses mit

Diagnose und Krankheitsstadium (Aschan, 2006).

4.2.1.5 HLA-Match

Die Kompatibilität der HLA-Merkmale auf allelischer Ebene zwischen Spender und

Patient ist im wissenschaftlichen Konsens der wichtigste prädiktive genetische Faktor für

ein verbessertes Outcome nach HSCT (Petersdorf and Malkki, 2005; Perez, 2011; Tait,

2011). In unserer Studie jedoch hat der HLA-Match-Status überraschenderweise weder auf

das Gesamtüberleben, die Inzidenz eines Relapses noch auf die Inzidenz einer aGvHD

einen signifikanten Einfluss. Jedoch ist er signifikant an der Entwicklung der

96

transplantationsassoziierten/Non Relapse Mortalität (TRM/NRM) beteiligt (p=0,009): Ein

HLA-Mismatch erhöht die TRM/NRM-Inzidenz bei Patienten.

TRM/NRM setzt sich zum größten Teil aus Graftversagen (primäres oder protrahiertes)

und Infektionen in der Posttransplantationsphase zusammen. HLA-Inkompatibilitäten

spielen nicht nur für das Graftversagen, wie man vermuten würde, eine Rolle, sondern

auch der nach dem Engraftment bestehende kombinierte funktionelle B- und T-Zell-Defekt

verläuft bei HLA-Inkompatibilitäten deutlich protrahiert (Einsele et al, 2001). Somit

werden Infektionen in der mittleren Posttransplantationsphase durch ein HLA-Mismatch

begünstigt (siehe auch Kapitel 1.2., Abschnitt 3.1c). Auch die in der späten

Posttransplantationsphase auftretenden viralen Infektionen, die durch den kombinierten

humoralen und zellulären Immundefekt bei cGvHD begünstigt werden, sind bei

unverwandten und nicht 10/10 HLA-gematchten Spendern erhöht (Einsele et al, 2001).

Da in unserer Studie die HLA-Mismatche wegen teilweise fehlender Informationen nicht

weiter klassifiziert wurden (Klasse I bzw. II, Antigen- oder Allelebene), kann dies auch

unser Ergebnis sowie die fehlende Signifikanz bei weiteren Endpunkten erklären.

4.2.2 Therapiebezogene (klinische) Risikofaktoren

4.2.2.1 Konditionierung

In unserer Kohorte weisen Patienten mit reduzierter Konditionierungsbehandlung (RIC)

eine signifikant höhere Relapseinzidenz auf (p<0,001; HR: 2,56; 95%CI: 1,5- 4,4) als

Patienten, die eine myeloablative Konditionierung (MAC) erhalten. Dies hat aber in

unserer Kohorte keine Auswirkungen auf das Gesamtüberleben (p=0,6). Da in unserem

Patientenkollektiv die MAC, deren vergleichsweise hohe Toxizität zu hoher TRM/NRM

führen kann (Clift et al, 1990, 163), mit 86,7% stark gegenüber der RIC mit 13,3 %

überwiegt, lässt sich der fehlende Einfluss des erhöhten Relapses auf das Gesamtüberleben

erklären. Außerdem wäre der hohe Anteil an myeloablativ konditionierten Patienten eine

Erklärung für die hohe TRM/NRM-Inzidenz in unserem Kollektiv (64,7% aller Todesfälle)

im Gegensatz zu den Todesfällen durch Relapse (27,9%).

Das Ziel der RIC ist es, auch älteren und komorbiden Patienten, bei denen eine MAC

kontraindiziert gewesen wäre, einen Zugang zur HSCT zu ermöglichen. Deswegen kann

für die Zeit unserer Studie (1997-2002) eine Vorselektion nicht ausgeschlossen werden: In

97

dieser Zeitspanne war die RIC noch in Entwicklung, so dass eine Präselektion der

Patienten für die RIC nicht ausgeschlossen werden kann, die aufgrund ihres Alters oder des

Fortschritts ihrer Grunderkrankung eher zu einem Relapse neigten. Außerdem bestand zu

dieser Zeit noch nicht die Kenntnis, dass vor allem langsam fortschreitende Erkrankungen

(CML, CLL, NHL) gute Ergebnisse nach RIC zeigen, da sie auch am besten auf die

nachfolgenden DLI’s ansprechen, und hochaggressive Leukämien (AML, ALL) besser auf

MAC ansprechen. Eine Studie von 2005 zum Vergleich von MAC und RIC bei CLL-

Patienten fand außer einer niedrigeren TRM/NRM auch eine signifikant höhere

Relapseinzidenz bei den durch RIC vortherapierten Patienten (Dreger et al, 2005), welche

damit auch unser Ergebnis bestätigt. Weitere aussagekräftige Studienergebnisse zur

Langzeit-Relapseinzidenz nach RIC stehen noch aus.

4.2.2.2 GvH-Prophylaxe

In unserer Analyse spielt die Art der GvH-Prophylaxe, die wir in drei frei gewählte

Gruppen: „Cyclosporin und Methotrexat (MTX)“, „Cyclosporin und andere“ und „andere“

eingeteilt haben, keine Rolle auf die von uns gewählten Endpunkte aGvHD-Inzidenz,

Relapseinzidenz, TRM/NRM und Gesamtüberleben. Cyclosporin und MTX ist die

heutzutage am häufigsten gebräuchliche Immunsuppression nach HSCT; MTX wird auch

häufig durch andere Immunsuppressiva (wie z. B. Prednisolon) ausgetauscht. Eine erhöhte

Relapseinzidenz durch eine stärkere Immunsuppression (z. B. durch Kombination von CsA

und MTX), wie in der Literatur beschrieben (Aschan, 2006), können wir nicht beobachten.

4.2.2.3 Diagnose

Die Diagnose beeinflusst das Gesamtüberleben (p<0,001) sowie das Auftreten eines

Krankheitsrückfalls (p=0,03) signifikant. Für das Gesamtüberleben gilt dabei ein

zunehmend schlechteres Überleben in der Reihenfolge: CML - MDS – sonstige – ALL–

AML. Die Wahrscheinlichkeit für ein Rezidiv steigt außerdem in der Reihenfolge MDS –

CML – ALL – AML – sonstige, so dass das schlechtere Gesamtüberleben durchaus durch

die höhere Wahrscheinlichkeit eines Krankheitsrückfalls erklärt werden kann. Da wenige

Studien ein in den Diagnosen so heterogenes Kollektiv aufweisen, konnte oben genannte

Reihenfolge nicht mit Literatur untermauert werden.

98

Die CML hat aufgrund der vielfältigen Therapiemöglichkeiten (Chemotherapie, HSCT,

Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren, siehe Druker et al, 2006), dem guten Ansprechen

auf DLI nach einem Relapse (Mackinnon et al, 1995) und aufgrund ihres generell

langsameren Verlaufs eine günstigere Prognose unter den Leukämien. Das meist langsam

verlaufende myelodysplastische Syndrom hat ebenso eine sehr gute Prognose. Dahingegen

ist man zur Therapie einer akuten Leukämie (AML, ALL) durch das geringfügige

Ansprechen auf DLI und die hochakute, aggressive Verlaufsform auf eine myeloablative

Konditionierung angewiesen, um das Risiko eines frühen Krankheitsrückfalls nach HSCT

zu minimieren (Oran and Lima, 2011). Mehrere Studien weisen auf die Wichtigkeit der

Dosis bei der Konditionierungstherapie einer akuten Leukämie hin (Alyea et al, 2006),

welche durch ihre Toxizität zusätzlich zum aggressiven Verlauf der Erkrankung zur

schlechten Prognose der akuten Leukämien im Erwachsenenalter beiträgt. Auch haben

akute Leukämien eine höhere Relapseinzidenz als chronische, und das MDS hat so gut wie

keine Rückfälle zu verzeichnen.

Die Untergruppe „sonstige“ fasst Erkrankungen zusammen, welche alleine nicht 5% des

Kollektivs ausmachen und ist aus rein statistischer Notwendigkeit entstanden. Somit

werden darin sowohl die langsam verlaufende CLL als auch das hochaggressive NHL

zusammengefasst. Dadurch ist diese Gruppe in ihrer Prognose sehr heterogen. Durch diese

Heterogenität entsteht wohl auch die verschiedenartige Einordnung in die Reihenfolge der

Relapsewahrscheinlichkeit (erster Platz, somit höchste Wahrscheinlichkeit) und des

Gesamtüberlebens (mittlerer Platz zwischen chronischen und akuten Leukämien).

4.2.2.4 Krankheitsstadium bei Tx

Ein weiterer Faktor mit signifikantem Auswirken auf das Gesamtüberleben in unserer

Studie ist das Krankheitsstadium, in welchem der Patient transplantiert wird. Patienten, die

in späteren Krankheitsstadien transplantiert werden, überleben signifikant seltener als

diejenigen im frühen Stadium. Dies ist auch in der gängigen Literatur beschrieben (Eapen

and Rocha, 2008). Das schlechtere Gesamtüberleben ist wesentlich durch den Tod an

einem Krankheitsrückfall bedingt: So erleiden Patienten, die in erster kompletter

Remission (akute Leukämie), erster chronischer Phase (chronische Leukämie) oder

Niedrigrisiko-MDS transplantiert werden, nur in 20% der Fälle einen Rückfall. Von den

Patienten, die in zweiter kompletter Remission oder höherem Stadium (akute Leukämien),

zweiter chronischer Phase oder höherem Stadium (chronische Leukämien) oder Mittel- bis

99

Hochrisiko-MDS transplantiert werden, erleiden über 33% ein Relapse. Auch wenn wir

nur eine Tendenz hin zu höherer Relapseinzidenz bei höheren Krankheitsstadien feststellen

konnten, stimmt dies mit dem aktuellen wissenschaftlichen Konsens überein, laut dem das

Rückfallrisiko streng mit Diagnose und Krankheitsstadium korreliert: So haben z. B. in

der Literatur Patienten, die an CML erkrankt sind, wenn sie in erster chronischer Phase

transplantiert werden, ein Rückfallrisiko von 20-30%, während das Risiko bei denjenigen,

die später transplantiert werden, bei 40-60% liegt; bei Patienten, die in

Chemotherapierefraktion transplantiert werden, sogar bei 70% (Aschan, 2006). In der

ersten kompletten Remission transplantierte AML Patienten haben sogar eine 50-70%ige

Wahrscheinlichkeit, in den ersten 3 Jahren nach HSCT einen Krankheitsrückfall zu

erleiden, 20-40% erreichen sogar keine Remission durch Konditionierung (Robak and

Wierzbowska, 2009).

4.3 Einfluss der untersuchten mHag auf die klinischen Endpunkte nach

allogener, unverwandter HSCT

Durch eine multivariate statistische Auswertung der in der vorliegenden Arbeit

gewonnenen Daten konnten, neben den bekannten Risikofaktoren (siehe hierzu Kapitel

4.2), mehrere mHag-Inkompatibilitäten als weitere Risikofaktoren auf die von uns

gewählten klinischen Endpunkte nach unverwandter, allogener HSCT detektiert werden.

4.3.1 Einfluss auf die aGvHD-Inzidenz

Keiner der bekannten Risikofaktoren wie z. B. Art der GvHD-Prophylaxe, HLA-Match

oder Spenderalter (Eapen and Rocha, 2008) zeigte in unserer Analyse einen signikanten

Einfluss auf die Inzidenz einer aGvHD. Als einziges mHag mit Auswirkungen auf die

Entwicklung einer aGvHD zeigte sich HA-8, mit einem erhöhten Risiko einer aGvHD bei

Mismatch in HvG-Richtung in univariater und multivariater Analyse (jeweils p=0,01).

Akatsuka et al konnten in einer Studie mit 577 verwandten Transplantationen Folgendes

zeigen: Bei 72 Patienten, für die ein Mismatch in HA-8 bestand, wurde nach Korrektur für

andere, bekannte Risikofaktoren eine erhöhte Inzidenz für aGvHD Grad II bis IV im

Gegensatz zur gematchten Kohorte festgestellt; Auswirkungen auf die anderen Outcomes

100

(Relapse, Gesamtüberleben, cGvHD) konnten nicht festgestellt werden (Akatsuka et al,

2003b). Auch Perez-García et al konnten 2005 in einer Studie mit 146 Erwachsenen nach

verwandter HSCT im multivariaten Analysemodell zeigen, dass HA-8-Mismatche mit

einem erhöhten Risiko schwerer aGvHD (Grad III-IV) assoziiert sind und damit unsere

und die Ergebnisse Akatsukas et al von 2003 bestätigen. In der gleichen Studie wurde

festgestellt, dass HA-8-Mismatche das Gesamtüberleben sowie das krankheitsfreie

Überleben signifikant senken (Perez-García et al, 2005). Somit gibt es eindeutige Hinweise

auf eine wichtige Rolle von HA-8 bei der Inzidenz einer klinisch relevanten aGvHD.

Allerdings handelt es sich in unserer Analyse um HA-8-Mismatche in HvG-Richtung,

welche eine erhöhte Inzidenz einer aGvHD nicht wirklich logisch erklären. Im Gegensatz

dazu sind in den oben genannten Studien Mismatche in GvH-Richtung beschrieben, die

eine erhöhte Inzidenz einer aGvHD weitaus besser erklären.

Die mehrfach in vorhergegangenen Studien beschriebene erhöhte aGvHD-Inzidenz durch

HA-1-Mismatche in GvH-Richtung (Goulmy et al, 1996b; Tseng et al, 1999, Gallardo et

al, 2001) konnten wir nicht bestätigen. Unsere Ergebnisse stimmen mit denen von Lin et al

aus dem Jahr 2001 überein: Diese haben bei 613 verwandten Patienten-Spender-Paaren

HA-1-Inkompatibilitäten und deren Auswirkungen auf klinische Endpunkte nach HSCT

untersucht und haben zwischen HA-1-gematchten und -gemismatchten Paaren keinen

Unterschied in Bezug auf Gesamtüberleben, Inzidenz einer aGvHD Grad II bis IV, eines

Rückfalls oder der TRM/NRM gefunden (Lin et al, 2001). Auch Heinemann et al konnten

HA-1-Mismatche nicht als Risikofaktor für eine aGvHD-Inzidenz im multivariaten Modell

identifizieren (Heinemann et al, 2004).

4.3.2 Einfluss auf die Inzidenz eines Krankheitsrückfalls

Für das Auftreten eines Krankheitsrückfalls spielen verschiedene Risikofaktoren eine

wichtige Rolle: Neben der Art der Diagnose (p=0,03), dem Geschlechtsmismatch (p=0,01),

der Art der Konditionierung (p<0,001) und der Stammzellquelle (p=0,005) mit eindeutiger

Signifikanz zeigen auch Patientenalter und Krankheitsstadium Tendenzen, einen

Krankheitsrückfall zu beeinflussen. Der Einfluss von Diagnose, Krankheitsstadium, Art

der Konditionierung sowie Patientenalter wurde auch in aktueller Literatur beschrieben

(Aschan, 2006; Burnett et al, 2011).

101

Wir konnten zeigen, dass sich bei einem ACC-1-Mismatch in GvHoderHvG-Richtung

signifikant (multivariat:p=0,01) die Wahrscheinlichkeit eines Relapses gegenüber den für

ACC-1 gematchten Transplantationen erhöht. Die erhöhte Wahrscheinlichkeit eines

Krankheitsrückfalls wirkte sich aber weder auf das Gesamtüberleben aus (p=0,64), noch ist

dies mit der Theorie zum GvL-Effekt zu erklären: Hiernach begünstigt ein Mismatch in

GvH-Richtung eine Abtötung der nach Chemotherapie übrig gebliebenen Resttumorzellen

durch Spender-T-Zellen und führt somit zum besseren Überleben sowie einer niedrigeren

Krankheitsrückfallrate. Wir haben ein genau gegenteiliges Ergebnis geliefert. Auch steht

dies teilweise im Widerspruch mit den von Nishida et al veröffentlichten Daten von 2004;

hier konnte kein Einfluss von ACC-1 mit den Outcomes nach nicht-verwandter HSCT

festgestellt werden (Nishida et al, 2004), andererseits konnten die von Nishida et al

festgestellten fehlenden Auswirkungen auf aGvHD und Gesamtüberleben bestätigt werden.

Weiterhin haben wir herausgefunden, dass der von Heinold et al beschriebene

Polymorphismus im Codon 206 des Adhäsionsmoleküls CD62L (Heinold et al, 2010) eine

Rolle für einen Krankheitsrückfall spielt: Ein Mismatch in GvH-Richtung in Codon 206

erhöht (multivariat: p=0,01), ein Mismatch in HvG-Richtung mindert (multivariat: p=0,03)

die Wahrscheinlichkeit eines Krankheitsrückfalls, wenn man den Polymorphimus in der

Gesamtkohorte untersucht (alle HLA Merkmale). Auf das Gesamtüberleben hat die

erhöhte bzw. verminderte Relapseinzidenz in der Gesamtkohorte jedoch keine

Auswirkungen (p=0,32 bzw. 0,39). Auch hier steht das Resultat im Widerspruch mit einem

GvL-Effekt. Ein weiterer Polymorphismus von CD62L in Codon 213 ist von Maruya et al

schon 1998 beschrieben worden (Maruya et al, 1998). Durch die räumliche Nähe der

beiden Polymorphismen und durch die Tatsache, dass durch den Codon 213-

Polymorphimus möglicherweise ein antigenes Peptid, welches in der HLA-A3-

Superfamilie gebunden werden kann, gebildet wird, haben wir unsere Untersuchungen des

Codon 206-Polymorphismus auf die Subgruppe der der HLA-A3-Superfamilie

zugehörigen HLA-Merkmale erweitert. Hier konnten wir die Auswirkungen auf einen

Krankheitsrückfall jedoch nicht bestätigen. Bisherige Studienergebnisse zum Codon 206-

Polymorphismus gibt es nur von Heinold et al zur Nierentransplantation: Hier spielt dieser

SNP keine Rolle auf die Dauer des Transplantatüberlebens (Heinold et al, 2010), was

passend zu unseren Ergebnissen - kein Einfluss auf das Gesamtüberleben - im HSCT-

Setting ist.

Ein drittes mHag mit relevantem Einfluss auf die Entstehung eines Relapses ist PANE-1.

Ein Mismatch in HvG-Richtung erhöht die Inzidenz eines Rückfalls der Grunderkrankung

102

signifikant (p=0,001). Da das alternative PANE-1-Transkript, welches für das mHag

kodiert, nur auf ruhenden B-Zellen und B-CLL Zellen exprimiert wird und bei Aktivierung

dieser abnimmt (Brickner et al, 2006), ist fraglich, ob ein Mismatch für die erhöhte

Relapseinzidenz verantwortlich ist. Eher würde bei einem Relapse das Transkript des

mHag in den proliferierenden, leukämischen B-Zellen abnehmen und so ein Mismatch in

GvH-Richtung entstehen. Bisher liegen keine weiteren Studienergebnisse zu Mismatchen

im durch PANE-1 kodierten mHag in Verbindung mit HSCT vor.

Ein interessantes Ergebnis haben de Rijke et al 2003 bei Untersuchungen zu HB-1

gefunden: Da HB-1 selektiv auf u.a. B-ALL-Zellen exprimiert wird und außerdem jedes

der beiden Allele (HB-1H und

Y) durch die jeweils kodierten Peptide eine allogene T-Zell-

Antwort auslöst, haben sie vermutet, dass es sich besonders gut zur Induktion einer GvL-

Reaktion nach allogener HLA-identer HSCT eignen würde. So haben sie erstmals durch

mit antigenem HB-1H Peptid beladene dendritische Zellen spezifische zytotoxische CD-8

+-

T-Zellen in vivo generiert. Von einem generierten CTL-Klon wurde bei Stimulation mit B-

ALL-Zellen IFN- γ sezerniert. Interessanterweise wurde durch Stimulation mit HB-1H-

Antigen gleichzeitig eine CD8+- und eine CD4

+-T-Zell-Antwort induziert. Dies stand in

Übereinstimmung mit bisherigen, präklinischen Studien, die besagten, dass zur effektiven

Antitumorantwort sowohl zytotoxische CD8+-T-Zellen wie auch CD4

+-T-Helferzellen

unabdingbar sind (Pardoll and Topalian, 1998; Ossendorp et al, 1998; Toes et al, 1999;

Wang and Rosenberg, 1999). Somit hat HB-1 die notwendigen Eigenschaften als Target

einer T-Zell-vermittelten B-ALL-Antitumortherapie (de Rijke et al, 2003). Die von de

Rijke et al vorausgesagte Targetfunktion von HB-1 zur Induktion eines GvL-Effektes,

konnten wir insofern nicht bestätigen, als dass ein Mismatch von HB-1 die Inzidenz eines

Relapses nicht wesentlich beeinflusst hat. Andererseits haben wir die Relapseinzidenz

aufgrund der geringen Gruppengröße von HLA-B44 positiven Patienten-Spender-Paaren

(n=77) nur im Gesamtkollektiv und nicht in einer speziellen ALL-Gruppe untersucht.

Der in der univariaten Analyse als signifikant aufgefallene Einfluss eines CD31 Codon

563-Mismatch in GvHundHvG-Richtung (senkt das Relapserisiko univariat in der Gruppe

„alle HLA-Merkmale“, p=0,04) konnte multivariat nicht bestätigt werden.

103

4.3.3 Einfluss auf die Inzidenz von TRM/NRM

Transplant related mortality (TRM) wird definiert als Tod durch transplantationsbedingte

Nebenwirkungen und wird in den neueren Studien eher als Non relapse mortality (NRM),

d. h. Tod, der nicht durch Krankheitsrückfall bzw. -fortschreiten bedingt ist, bezeichnet. In

der von uns durchgeführten Studie beeinflussen neben dem HLA-Match als unabhängigem

Risikofaktor noch zwei weitere mHag das Auftreten von TRM/NRM.

Das erste ist ACC-2, welches bei einem Mismatch in GvH-Richtung die TRM/NRM-

Inzidenz reduziert (p=0,02). Gleichzeitig hat dieses Mismatch einen positiven Effekt auf

das Gesamtüberleben (p=0,04). Eigentlich würde man bei einer Verbesserung des

Gesamtüberlebens durch einen Mismatch in GvH-Richtung eher eine Senkung der

Relapseinzidenz erwarten, dies spräche für einen durch das Mismatch ausgelösten GvL-

Effekt. Dies konnten wir jedoch nicht beobachten: Es bestand kein signifikanter

Zusammenhang zwischen Relapseinzidenz und einem ACC-2 Mismatch in GvH-Richtung

(p=0,31). Andererseits wurden von Einsele et al sowie von Hansen et al auch HLA-

Inkompatibilitäten als wichtiger Faktor für die Entwicklung von TRM/NRM beschrieben,

da diese die hämatopoetische Rekonstitution verlangsamen und somit das Risiko für

Infektionen und tranplantationsassoziierte Organtoxizität erhöhen können (Einsele et al,

2001; Hansen et al, 2008). Dies könnte neben den HLA-Merkmalen auch für

Inkompatibilitäten von mHag, in diesem Falle ACC-2, zutreffen. In der bestehenden

Literatur wurden bislang für ACC-2 noch keine Auswirkungen auf klinische Endpunkte

einer HSCT beschrieben.

Die gleiche Wirkung auf TRM/NRM-Inzidenz und Gesamtüberleben zeigt ein Mismatch in

GvH-Richtung in Codon 206 des Adhäsionsmoleküls CD62L in der Subgruppe der HLA-

A3-Superfamilie. Für ein Mismatch in Codon 213 des gleichen Adhäsionsmoleküls wurde

von Katagiri et al ein verbessertes Gesamtüberleben durch Reduktion der Relapseinzidenz

beschrieben, jedoch wurde die Auswirkung auf die Inzidenz von TRM/NRM in dieser

Studie nicht untersucht (Katagiri et al, 2006). Eine andere interessante Interpretation

unserer Ergebnisse wird durch die Rolle von CD62L als Adhäsionsmolekül, welches nur

auf Leukozyten exprimiert wird und eine wichtige Rolle für Anbinden und Rollen dieser

am Endothel spielt, gegeben. Somit könnte CD62L nicht als mHag, sondern der

Polymorphismus in Codon 206 als solcher im Adhäsionsmolekül ausschlaggebend für eine

verbesserte Infektabwehr durch eine bessere Leukozytenfunktion sein, und dadurch zu

104

einer verminderten TRM/NRM-Inzidenz und einem verbesserten Gesamtüberleben führen.

Erste Hinweise auf eine Rolle von CD62L bei Auftreten und Persistenz bzw. Ausheilen

von Infektionen geben uns Rafiei et al mit dem Zusammenhang des Codon 206

Polymorphimus und Infektionen mit Brucellose (Rafiei et al, 2006).

In der multivariaten kompetitiven Risikoanalyse von ACC-2- und CD62L Codon 206-

Mismatchen fielen, neben dem bekannten Einfluss vom HLA-Match, zusätzliche

Signifikanzen der Risikofaktoren Diagnose und Krankheitsstadium (siehe Kapitel 3.7,

Abschnitt 2.2a)) auf. Da wir dies jedoch in der kompetitiven Risikoanalyse zur

Risikofaktorenanalyse (Modell mit allen bekannten Risikofaktoren ohne mHag) nicht

bestätigen konnten, sind dies vermutlich falsch-positive Ergebnisse (siehe hierzu Kapitel

4.4).

Die von Terakura et al 2005 beschriebene erhöhte Sterblichkeit durch erhöhte TRN/NRM

durch einen für UGT2B17 positiven Donor konnten wir nicht bestätigen, obwohl die Zahl

der UGT2B17 positiven Spender mit 88% deutlich höher ist als in der japanischen

Bevölkerung mit 15% (Terakura et al, 2005). Auch in der von McCaroll et al im Jahre

2009 durchgeführten Studie konnte kein Einfluss von UGT2B17 auf TRM/NRM,

Gesamtüberleben und Krankheitsrückfall gezeigt werden, allerdings stieg bei den 1345

untersuchten Patienten-Spender-Paaren die Inzidenz einer aGvHD bei einem UGT2B17-

Mismatch in GvH-Richtung (McCaroll et al, 2009). Dies konnten wir wiederum in unserer

Kohorte nicht bestätigen.

4.3.4 Einfluss auf das Gesamtüberleben

Neben ACC-2 und Codon 206 von CD62L in der Subgruppe der HLA-A3-Superfamilie,

die beide schon in Kapitel 4.3., Abschnitt 3 diskutiert wurden, haben CD31 (in

Gesamtgruppe aller HLA-Merkmale) und Codon 213 von CD62L (in der HLA-A3-

Superfamilie) einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben nach allogener, nicht-

verwandter HSCT.

CD31 (PECAM-1) gehört ebenso wie CD62L zur Familie der Adhäsionsmoleküle, wird

aber zusätzlich zu Leukozyten auch auf Endothelzellen, Thromobozyten und Monozyten

exprimiert und spielt eine Rolle in der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion,

Leukozytenmigration, T-Zell-Aktivierung und Angiogenese. Bis jetzt sind zwar drei

105

polymorphe Codons bekannt (Codon 125, 563 und 670), das durch diese Polymorphismen

gebildete möglicherweise antigene Peptid jedoch noch nicht. Maruya et al haben ein Peptid

vermutet, welches von der HLA-B7 oder HLA-B44-Superfamilie gebunden werden kann

(Maruya et al, 1998), zusätzlich hierzu haben wir die Auswirkung der Polymorphismen

auch in der gesamten Gruppe untersucht. In unserer Arbeit konnten wir beobachten, dass

ein Mismatch der Codons 125 und 563 in GvHundHvG-Richtung signifikant das

Gesamtüberleben verbesserte (multivariat: p=0,03 bzw. p=0,04). Patienten mit

GvHundHvG-gemismatchten Codons 125 und 563 zeigten auch eine Tendenz zur

niedrigeren Inzidenz eines Krankheitsrückfalls (multivariat beide: p=0,08), diese war

jedoch nicht signifikant. Diese Influenz auf Gesamtüberleben sowie Relapse würde durch

die Aussage von Katagiri et al in 2006 gestützt: Sie fanden heraus, dass ein Mismatch in

GvH-Richtung von CD31 Codon 125 und 563 (nur Tendenz) und CD62L Codon 213

(signifikant) das Gesamtüberleben nach HSCT verbessern, indem die Relapseinzidenz

gesenkt wird (Katagiri et al, 2006). Katagiris et al und unser Ergebnis würden für einen

möglichen GvL-Effekt durch die CD31-Mismatche sprechen.

Unser zweites signifikantes Ergebnis, ein CD31 Codon 563-Mismatch in HvG-Richtung

betreffend, welches zu einer höheren Überlebenswahrscheinlichkeit führt, konnte durch die

gängige Literatur nicht untermauert werden.

Ansonsten gibt es in der Literatur zu den CD31-Polymorphismen bisher gegensätzliche

Aussagen: Behar et al, die 1996 den Codon-125-Polymorphismus als Erste beschrieben,

konnten in der Gruppe aller HLA Merkmale eine erhöhte Inzidenz von aGvHD bei

Patienten feststellen, wenn ein Mismatch in GvH-Richtung oder ein Mismatch in

GvHundHvG-Richtung vorliegen (Behar et al, 1996). Nichols et al konnten im gleichen

Jahr diese Beobachtung in ihrer Multicenterstudie mit 301 Paaren nicht bestätigen (Nichols

et al, 1996). Weiterhin konnten Maruya et al 1998 zusätzlich zum SNP in Exon 3, Codon

125, noch drei weitere Aminosäureaustausche im CD31-Gen identifizieren: Der erste, sehr

seltene befindet sich auch in Exon 3, Codon 80, und führt zum Austausch von Valin zu

Methionin. Die anderen liegen in Exon 8, Codon 563 (Asparagin zu Serin) und Exon 12,

Codon 670 (Glycin zu Arginin). Maruya et al konnten in einer japanischen Kohorte von

118 Patienten und deren HLA-identen Geschwisterspendern zeigen, dass bei Codon-563-

und 670-Mismatch in GvH-Richtung die Inzidenz einer aGvHD bei Patienten der HLA-

B44-Superfamilie signifikant anstieg. Für Codon 125 war dies nicht der Fall (Maruya et al,

1998). Die erste Studie zum Einfluss von CD31 auf aGvHD, cGvHD, Relapse und

Gesamtüberleben nach HSCT mit einer US-amerikanischen Kohorte führten Grumet et al

106

2001 durch. Sie stellten fest, dass sowohl für Codon 125 wie auch für Codon 563 und 670

ein Mismatch in GvHundHvG-Richtung in der multivariaten Analyse in der Gruppe aller

HLA-Merkmale ein unabhängiger, signifikanter Risikofaktor für schwere (Grad III-IV)

akute GvHD und das Gesamtüberleben ist. Außerdem zeigte sich in der multivariaten

Analyse ein (nicht signifikanter) Trend für den Zusammenhang von CD31 Codon 125-,

563- und 670-Mismatchen und erhöhtem Relapse (Grumet et al, 2001). Cavanagh et al

zeigten 2005 in einer Regressionsanalyse der Outcomes aGvHD und Gesamtüberleben,

dass der CD31-Genotyp Valin/Asparagin/Glycin beim Patienten mit einer erhöhten

aGvHD assoziiert war (p=0,004) und Heterozygotie des Spenders in Codon 563 mit

schlechterem Gesamtüberleben (Cavanagh et al, 2005). Somit zeigten mehrere Studien

eine durch CD31-Mismatche erhöhte Inzidenz der aGvHD, manchmal sogar mit

Auswirkung auf das Gesamtüberleben, welche wir in unseren Ergebnissen nicht bestätigen

konnten. Weiterhin konnten wir in den Subgruppen der HLA-B44-Superfamilie sowie der

HLA-B7-Superfamilie keine multivariat signifikanten Ergebnisse finden.

Im Gegensatz zu einem GvH-Mismatch in Codon 206, welches das Gesamtüberleben nach

HSCT verbessert (p=0,003, siehe Kapitel 4.3.3), senkt ein Mismatch in GvHoderHvG-

Richtung in Codon 213 des Adhäsionsmoleküls CD62L das Gesamtüberleben der

Patienten zugehörig zur HLA-A3-Superfamilie signifikant. Auch die Inzidenz der

TRM/NRM, die durch ein Codon 206-Mismatch gesenkt wird, wird durch ein Codon 213-

Mismatch zwar nicht signifikant, aber tendenziell (p=0,09) gesteigert. Somit hat in unserer

Studie ein Codon 213-Mismatch genau den gegenteiligen Effekt zu einem Codon 206-

Mismatch. Maruya et al, die 1998 als erste den Codon 213-Polymorphismus beschrieben

haben, haben diesen in einer japanischen Kohorte, auch in der Gruppe der HLA-A3-

Superfamilie, bei einem Mismatch in GvH-Richtung mit einer erhöhten aGvHD-Inzidenz

in Verbindung gebracht (Maruya et al, 1998). Einen weiteren Effekt eines Codon 213-

Mismatches in GvH-Richtung konnten Katagiri et al in einer japanischen Kohorte von 106

HLA-identen Patienten-Spender-Paaren zeigen: Bei Mismatch für CD31 Codon 125 und

563 (tendenziell) und CD62L (signifikant) hatten die Patienten eine höhere 12-Jahres-

Überlebensrate als in einer Matchsituation. Dies wurde auf eine niedrigere Relapseinzidenz

zurückgeführt, was somit für einen GvL-Effekt sprach (Katagiri et al, 2006). Diese

Beobachtung entspricht zwar unseren Ergebnissen für CD31 (siehe oberer Abschnitt), für

Codon 213 von CD62L jedoch haben wir Gegenteiliges festgestellt. Auch hier könnten die

Ergebnisse möglicherweise, analog der Interpretation zu Codon 206, durch die Funktion

107

von CD62L als Adhäsionmolekül hervorgerufen werden: Der Polymorphismus in Codon

213 könnte an einer für die Funktion von CD62L wichtigen Stelle stehen und somit das

Anbinden und Rollen der Leukozyten behindern, womit Infektionen, ein Hauptgrund für

TRM/NRM, begünstigt wären (siehe Kapitel 4.3, Abschnitt 3).

Neben den erwähnten mHag hatten als unabhängige Risikofaktoren erwartungsgemäß das

Patientenalter, die Diagnose, das Krankheitsstadium und die Stammzellquelle einen

signifikanten Einfluss auf Gesamtüberleben in unserer Kohorte.

4.4 Statistische Auswertung und Interpretation der Ergebnisse

Die aktuelle wissenschaftliche Literatur zeigt, dass die Analysen zum Einfluss einzelner

mHag-Mismatche auf klinische Endpunkte nach hämatopoetischer

Stammzelltransplantation widersprüchliche Ergebnisse zeigen. Zum besseren Verständnis

haben wir die Ergebnisse der bisherigen Studien hier noch einmal übersichtlich zusammen-

gefasst (siehe hierzu Tabelle 28). Neben den verschiedenen Studienpopulationen

(Orientalisch/asiatische Kohorten z.B. bei Maruya et al, 1998; Tseng et al, 1999 gegenüber

Kaukasiern europäischer Abstammung bei Perez-García et al, 2005 oder Kaukasiern US-

amerikanischer Abstammung bei Grumet et al, 2001), der verschieden Kohortengröße und

verschiedenen Art der HSCT (verwandt vs. nicht-verwandt) wurden auch zur statistischen

Analyse der Ergebnisse verschiedene Methoden gewählt (siehe Tabelle 28). Wir haben uns

an die neuesten vom EBMT ausgesprochenen Empfehlungen zur Auswertung von Daten

aus Stammzelltransplantationen gehalten (Szydlo et al, 2008; Gooley et al, 1999, Labopin

et al, 2009) und Einflüsse auf das Gesamtüberleben mittels Cox-Regressionsmodell (uni–

und multivariat) ermittelt, charakterisiert durch Hazard Ratio und 95%CI der Hazard Ratio

(siehe hierzu Kapitel 2.2, Abschnitt 6.2). Die berechneten kumulativen Inzidenzen der

sekundären Outcomes (aGvHD, Relapse und TRM/NRM) haben wir in einer uni- und

multivariaten kompetitiven Risikoanalyse den kumulativen Inzidenzen ihrer jeweiligen

kompetitiven Risiken gegenübergestellt (siehe Kapitel 2.2, Abschnitt 6.3). In diesen

Analysen wird immer die zeitliche Entwicklung der Auftretenswahrscheinlichkeiten der

von uns gewählten Endpunkte mit berücksichtigt und das persönliche Risiko von

Merkmalsträgern gegenüber Nicht-Merkmalsträgern ermittelt. Gerade Daten aus älteren

Studien (z. B. aus Goulmy et al, 1996b; Behar et al, 1996) wurden jedoch entweder ohne

108

Berücksichtigung der Zeitachse in der statistischen Analyse durch Unabhängigkeitstest

(Chi-Quadrat-Test) oder unter Berücksichtigung der Zeitachse mit der Kaplan-Meier-

Methode ermittelt, welche Verhältnisse von Merkmalsträgern zu Nicht-Merkmalsträger zu

bestimmten Zeitpunkten (sog. Survival-Raten) berechnet. Somit sind die so ermittelten

Signifikanzen aufgrund verschiedener Aussagen teilweise gar nicht mit unseren

Signifikanzen zu vergleichen. Neuere Studien (z. B. Akatsuka et al, 2003b; Spellman et al,

2009) verwendeten ebenfalls den vom EBMT empfohlenen Standard, so dass hier der

Vergleich mit unseren Ergebnissen wieder möglich ist.

Einen weitereren Diskussionspunkt in diesem Abschnitt stellt das multiple Testen dar.

Dadurch, dass wir elf verschiedene mHag, dabei jedes mindestens in drei verschiedene

Mismatch-Richtungen (GvH, HvG, GvHoderHvG und evtl. GvHundHvG) und auf vier

verschiedene Endpunkte (OS, aGvHD, TRM/NRM, Relapse) in einer gleichen

Grundgesamtheit getestet haben, wurden insgesamt 132 Tests in der gleichen

Grundgesamtheit durchgeführt. Somit sind bei einem gewählten α-Niveau von 5%

(gewähltes Fehlerniveau, welches in 5% der Testungen falsch-positive Ergebnisse durch

eine falsche Ablehnung der Nullhypothese zulässt) statistisch gesehen 6,6 (5% von 132)

Signifikanzen falsch-positiv, d. h. zufällig signifikant. Um dem entgegenzuwirken, gibt es

die Möglichkeit statistischer Korrekturen, wie z. B. die Bonferroni-Korrektur, die eine

häufig in medizinischen Studien verwendete Methode ist (Bland and Altman, 1995). Bei

allen in Tabelle 28 zusammen gefassten Studien wurde jedoch keine Korrektur für

multiples Testen erwähnt. Bei Studien, die nur ein einzelnes mHag untersuchen, ist dies

durch die geringe Anzahl notwendiger Tests nachzuvollziehen, jedoch wurde dies auch bei

den beiden großen Studien (Spellman et al 2009, Markiewicz et al 2009) nicht

angesprochen, so dass wir uns entschieden haben, die Möglichkeit der statistischen

Korrektur hier zu thematisieren. Spellman et al (2009) haben allerdings die

Signifikanzgrenze auf p<0,01 heruntergesetzt, um multiplen Vergleichen eher gerecht zu

werden.

Zudem haben Spellman et al 2009 in ihrer 730 Patienten-Spender-Paare einschließenden

Studie die mangelnde statistische Teststärke (Power) ihrer Analyse kritisiert, welche u.a.

durch kleine Subgruppen für die Analyse einzelner mHag (gegeben durch die MHC-

Restriktion der mHag, siehe hierzu Kapitel 1.3, Abschnitt 1.1) und auch die relative

Seltenheit von mHag-Disparitäten bedingt ist. Die statistische Teststärke bezeichnet die

Aussagekraft eines statistischen Tests und somit dessen Fähigkeit, eine wahre Signifikanz

eines Unterschieds (Alternativhypothese) auch als solche statistisch zu erkennen und hängt

109

von Kohortengröße, Signifikanzniveau, Merkmalsstreuung und Häufigkeit der zu

detektierenden Unterschiede ab. Auch bei uns lagen kleine Subgruppen vor (z. B. HLA-

B44 Gruppe: n=77, HLA-A3: n=88), was die Aussagekraft (Power) unserer statistischen

Testergebnisse wahrscheinlich genauso einschränkte, jedoch nur durch eine größere

Gesamtkohorte und folglich großen Subgruppenzahlen zu umgehen wäre. Die relative

Seltenheit von mHag-Disparitäten ist genetisch bedingt. Dadurch, dass meist das für das

antigene Peptid kodierende Allel eines mHag seltener ist als sein Gegenspieler, werden

auch relevante Mismatche seltener. Ein Beispiel hierfür liefert ACC-2: Das für das

antigene Peptid kodierende ACC-2 D-Allel ist mit 25,5% Anteil deutlich seltener als sein

Gegenspieler, ACC-2 G mit 74,5%. Hierdurch sinkt die Wahrscheinlichkeit für ein

immunogen relevantes Mismatch von ACC-2. Dies kann man außerdem im Ergebnisteil

dieser Arbeit sehr gut an den Fallzahlen von gemismatchten Paaren gegenüber gematchten

Paaren sowohl bei der Überlebenszeitanalyse als auch bei der Analyse der sekundären

Outcomes beobachten. Auch dieser Faktor erschwert die Detektion von Unterschieden, die

durch mHag-Mismatche bedingt sind und ist leider nicht durch statistische Kalkulationen

auszuschließen.

Insgesamt darf man sowohl bei signifikanten wie auch bei nicht signifikanten Ergebnissen

unserer Studie die verschiedenen statistischen sowie genetischen Bedingungen nicht außer

Acht lassen. Da viele Ergebnisse eher unerwartet aufgefallen sind, ist auch eine

Bestätigung durch weitere Studien erforderlich, bevor endgültige Schlüsse gezogen werden

können.

4.5 Auswirkungen von mHag-Mismatchen auf die allogene HSCT: Stand

der Forschung und Ausblick

In bisherigen Studien zum Effekt einzelner mHag in der Stammzelltransplantation stößt

man oft auf widersprüchliche Ergebnisse (siehe hierzu Tabelle 28) und auch die

vorliegende Arbeit kam meist zu neuen Aussagen, die nicht durch die bestehende Literatur

zu untermauern waren. Die meisten bisherigen Studien jedoch haben entweder eine

überschaubare Anzahl von Transplantationspaaren oder haben nur den Einfluss eines

einzelnen mHag untersucht. Bisher gibt es nur drei Studien, die mit unserer entweder in

ihrer Populationsgröße oder in der Anzahl der untersuchten mHag oder in beidem

vergleichbar wären. Die erste große Studie wurde 1996 durch Goulmy et al durchgeführt.

110

Untersucht wurden die mHag-Mismatche von HA-1 bis HA-5 und deren Auswirkungen

auf die aGvHD in 148 verwandten Transplantationspaaren. Festgestellt wurde eine erhöhte

aGvHD-Inzidenz bei Patienten, die für HA-1 in GvH-Richtung gemismatcht waren

(Goulmy et al, 1996b). Dies konnte in folgenden Studien bestätigt (Tseng et al, 1999;

Gallardo et al, 2001) sowie auch widerlegt (Lin et al, 2001) werden; auch wir konnten

keinen signifikanten Einfluss von HA-1-Mismatchen auf die Inzidenz einer aGvHD finden.

Die weiteren beiden großen Studien zu mHag-Mismatchen und allogener HSCT wurden

im Jahre 2009 publiziert und sind damit noch recht aktuell: Markiewicz et al (2009)

untersuchten 93 nicht-verwandte Patienten-Spender-Paare auf die mHag HA-1, -2, -3, -8,

HB-1, ACC-1, -2, SP110, PANE-1, UGT2B17 und HY. Dabei beeinflusste neben HY nur

ein Mismatch in HvG-Richtung von HA-3 signifikant die Inzidenz einer aGvHD nach

HSCT; Gesamtüberleben und Relapseinzidenz wurden von autosomalen mHag nicht

beeinflusst (Markiewicz et al, 2009). Die Beeinflussung der aGvHD durch ein HA-3-

Mismatch in HvG-Richtung war, laut Markiewicz et al 2009, unerwartet und müsste

bestätigt werden. Dies würde auf ein Überleben von immunkompetenten Empfängerzellen

hinweisen, welche auf gemismatchte Spender-mHag reagieren und damit die Donor-T-

Zellen zur Abwehr und damit zur Entwicklung einer aGvHD anregen. Dies könnte auch für

viele von uns gefundene signifikante mHag-Mismatche in HvG-Richtung gelten, allerdings

konnten wir den von Markiewicz et al 2009 gefundenen Effekt von HA-3 nicht bestätigen,

und mangels statistischer Korrekturen können sowohl diese wie auch unsere Ergebnisse

durchaus aus Zufallssignifikanzen entspringen.

Eine weitere Studie stammt von Spellman et al 2009. Es wurden bei 730 unverwandten

Patienten-Spender-Paaren die Einflüsse von Mismatchen der mHag HA-1, -2, -3, -8, HB-1

und CD31 auf Gesamtüberleben, aGvHD Grad III-IV, TRM und cGvHD untersucht. In

Anbetracht der multiplen Tests wurden nur Ergebnisse mit p<0,01 als signifikant gezählt.

Bei der Analyse einzelner mHag-Mismatche fiel lediglich eine signifikant geringere

aGvHD-Inzidenz bei einem Mismatch von CD31 Codon 563 in HvG-Richtung in der

Gruppe der HLA-A2-positiven auf. Daneben wurden auch multiple mHag-Mismatche in

den bestehenden Subgruppen untersucht und dabei folgende Effekte beobachtet: Für

gemismatchte Paare in HvG-Richtung in der HLA-A2-Subgruppe (HA-1, -2, -8 und/oder

CD31) ergab sich eine verminderte aGvHD-Inzidenz bei >2 Mismatchen verglichen mit

gematchten Paaren. Bei Mismatchen in GvH-Richtung in derselben Gruppe kam es zu

einem verminderten Gesamtüberleben bei >2 Mismatchen im Vergleich zu Gematchten.

Tendenzen (p<0,02) zeigten sich in der Gruppe der HLA-A1 positiven Paare: Hier hatten

111

gemismatchte Paare für CD31 und HA-3 in GvH-Richtung ein vermindertes

Gesamtüberleben durch eine erhöhte Inzidenz von TRM (Spellman et al, 2009).

Dass bei der Analyse von multiplen mHag-Mismatchen deutlich häufiger Signifikanzen

gefunden wurden, spricht für einen additiven Effekt einzelner mHag-Mismatche. Es könnte

durch multiple mHag-Mismatche, die alleine keinen Effekt erzielen, zu einer Potenzierung

und somit einem signifikanten Effekt auf die HSCT kommen, wie Heinold es in seinem

Vortrag beschreibt (Heinold, 2011). Bis jetzt existieren dazu bis auf die Spellman-Studie

jedoch noch keine Studien zu multiplen mHag-Mismatchen. Dies ist daher von großem

Interesse für zukünftige Forschung.

Auch ein möglicher GvL-Effekt durch mHag-Mismatche (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 2.2)

ist von weiterem klinischem Interesse und derzeit Gegenstand der Forschung. So haben

DLI mit für HA-1 und HA-2 spezifischen Donor-T-Zellen schon nachweisbare Erfolge

gezeigt (Marijt et al, 2003) und eine gleichzeitige GvHD-Induktion durch

hämatopoesespezifische mHag für unwahrscheinlich befunden (Goulmy, 1997). Auch eine

weitaus einfacher durchzuführende Methode, die Impfung mit HA-1- und HA-2-Peptiden

zur Verstärkung der Spender-Immunzellen zwecks GvL-Erzielung und Gabe vor einer DLI

bei gemismatchtem Spender, ist auf dem Weg in die klinische Anwendung (Phase I und II

Studie) (Goulmy, 2004).

In der Nieren-Transplantation scheinen mHag-Mismatche keine Rolle zu spielen: In einer

multizentrischen Studie mit über 33785 Nierentransplantationspatienten spielte keins der

untersuchten mHag (HA-1, -2, -3, -8, HB-1, ACC-1 und UGT2B17) oder

Adhäsionsmoleküle (CD31, CD62L) eine Rolle für das 5-Jahres-Transplantatüberleben

(Heinold et al, 2008, 178; Heinold et al, 2010).

Eine Herausforderung für die Zukunft stellt sicherlich die Anzahl an möglichen mHag dar.

Die bisher bekannten mHag sind sicher nicht vollständig: Die im menschlichen Genom

bisher bekannten nicht-synonymen SNP’s übersteigen mittlerweile die Zahl von 50000,

daraus resultieren über 800000 mögliche antigene Peptide. Neue Methoden zur schnellen

Identifizierung neuer mHag wurden in den letzten Jahren entwickelt (Van Bergen et al,

2010; Spaapen et al, 2009). Von der Identifikation neuer möglicher mHag erhofft man sich

auch neue Kenntnisse zur Therapie von GvHD bei gleichzeitiger Nutzung eines GvL-

Effektes (Hinds et al, 2005).

112

Tabelle 28: Übersicht der Studienergebnisse zu mHag Einflüssen auf die verschiedenen

Outcomeparameter nach HSCT (aGvHD Grad II-IV, Relapse, TRM/NRM,

Gesamtüberleben); n.a.: keine Angabe vorhanden/nicht untersucht, mHag: Minor

Histokompatibilitätsantigen, aGvHD: akute Graft-versus-Host Disease, TRM/NRM:

Transplant related mortality bzw. Non relapse mortality, OS: Overall Survival, DFS:

Disease free survival, MM in GvH: Mismatch in GvH-Richtung, MM in HvG: Mismatch

in HvG-Richtung, MM in GvHoderHvG: Mismatch in GvH oder HvG-Richtung, MM in

GvHundHvG: Mismatch in GvH und HvG-Richtung, : erhöht, : vermindert

mHag Fall-

zahl

verwandt

/ nicht

verwandt

aGvHD (Grad

II-IV) Relapse

TRM/

NRM

Gesamt-

überleben Referenz

statistische

Analyse

HA-1, -2, -3,

-4, -5 148 verwandt

durch HA-

1-MM in GvHn.a. n.a. n.a.

Goulmy

et al,

1996b

univariat,

Chi-Quadrat

HA-1 237 verwandt

durch HA-

1-MM in GvH,

univariat

signifikant,

multivariat

Tendenz

(p=0,08)

n.a. n.a. n.a. Tseng et

al, 1999

uni- und

multivariate

Regression

HA-1 215 verwandt durch HA-

1-MM in GvHkein Einfluss n.a. kein Einfluss

Gallardo

et al,

2001

uni- und

multivariate

Regression

HA-1 613 verwandt

kein Einfluss

durch MM in

GvH

kein Einfluss kein

Einfluss kein Einfluss

Lin et al,

2001

uni- und

multivariate

Regression

HA-1, CD31

und CD49b 163

verwandt

und nicht

verwandt

kein Einfluss n.a. n.a. n.a.

Heine-

mann et

al, 2004

multivariate

Regression

HA-8 577 verwandt durch HA-

8-MM in GvHkein Einfluss n.a. kein Einfluss

Akatsu-

ka et al,

2003

uni-und

multivariate

Regression

für OS,

kompetitive

Risiken für

aGvHD und

Relapse

HA-8 146 verwandt

durch HA-

8-MM (in

GvH?) !Nur auf

aGvHD Grad

III-IV!

n.a. kein

Einfluss

durch HA-

8-MM (in

GvH?) plus

verkürztes DFS

Pérez-

Garcia

et al,

2005

multivariate

Regression

(Cox-

Modell)

ACC-1 320 nicht

verwandt kein Einfluss kein Einfluss n.a. kein Einfluss

Nishida

et al,

2004

n.a.

113

UGT2B17 435 nicht

verwandt kein Einfluss kein Einfluss

durch

UGT2-

B17-MM

in HvG

durch

UGT2B17 MM

in HvG, kein

Einfluss durch

MM in GvH

Terakura

et al,

2005

multivariate

Regression

(Cox-

Modell)

UGT2B17 1345 verwandt

durch

UGT2B17 MM

in GvH; kein

Einfluss durch

MM in HvG

n.a. n.a. n.a.

McCaroll

et al,

2009

Cochran-

Mantel-

Haenszel-

Test

(Variante

des Chi-

Quadrat-

Test)

CD31 Codon

125 46 verwandt

durch CD31

Codon125 MM

in

GvHoderHvG,

GvHundHvG

und GvH

(Gruppe: alle

HLA-Merkmale)

n.a. n.a. n.a. Behar et

al, 1996

Chi-

Quadrat-

Test

CD31 Codon

125 301 verwandt

kein Einfluss

(Gruppe: alle

HLA-Merkmale)

n.a. n.a. n.a.

Nichols

et al,

1996

Chi-

Quadrat-

Test

CD31 (Codon

80, 125,

563, 670),

CD49b,

CD62L

(Codon 213)

118 verwandt

durch CD31

Codon 563/670

MM in GvH

(Gruppe: HLA-

B44-Superfam)

durch

CD62L MM in

GvH (Gruppe:

HLA-A3-

Superfam)

n.a. n.a. n.a.

Maruya

et al,

1998

Chi-

Quadrat-

Test,

Korrektur

für multiples

Testen

CD31 (Codon

125, 563 und

670)

120 verwandt

durch CD31

MM in

GvHoderHvG

und

GvHundHvG

(für alle 3

Codons-

Gruppe: alle

HLA-Merkmale)

!Grad III-IV!

n.a. n.a.

durch

CD31 MM in

GvHoderHvG

und

GvHundHvG

(alle 3 Codons

– Gruppe: alle

HLA-

Merkmale),

zusätzl.

verkürzte DFS

Grumet

et al,

2001

multivariate

Regression

(Cox-

Modell)

CD31 (Codon

125, 563 und

670)

74 verwandt

bei

Val/Asn/Gly-

Haplotyp des

Donors

n.a. n.a.

bei CD31

Codon 563

Heterozygotie

des Donors

Cava-

nagh et

al, 2005

multivariate

Regression

(Cox-

Modell)

CD31 (Codon

125) 60 verwandt

durch CD31

Codon125 MM

in GvHoderHvG

und

GvHundHvG

durch

CD31

Codon125

MM in

GvHoderHvG

n.a. n.a.

El-

Chenna-

wi et al,

2006

Chi-

Quadrat-

Test

114

(Gruppe: alle

HLA-Merkmale)

und

GvHundHvG

(Gruppe:

alle HLA-

Merkmale)

HA-1, CD31,

CD49b,

CD62L

(Codon 213)

106 n.a. kein Einfluss

durch

CD62L MM

in GvH

n.a. n.a.

Katagiri

et al,

2006

multivariate

Regression

HA-1, -2, -3,

-8, HB-1,

CD31 (Codon

125 und

563)

730 nicht

verwandt

durch CD31

Codon 563 MM

in HvG

!Nur aGvHD

Grad III-IV!

(Gruppe: HLA-

A2)

durch

multiple mHag

MM

kein Einfluss n.a.

durch

multiple mHag

MM in GvH

Spell-

man et

al, 2009

OS:

multivariate

logistische

Regression;

aGvH,cGvH

und

Relapse:

kompetitive

Risiko-

analyse

HA-1, -2, -3,

-8, HB-1,

ACC-1 und -

2, SP110,

PANE-1,

UGT2B17,

HY

92 nicht

verwandt

durch HA-3

und HY (jeweils

MM in HvG)

durch HY

MM in GvHn.a. kein Einfluss

Markie-

wicz et

al, 2009

OS:

multivariate

logistische

Regression,

aGvH,cGvH

und

Relapse:

kompetitive

Risiko-

analyse

115

5. Zusammenfassung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist eine etablierte,

kurative Therapie für eine Vielzahl maligner, hämatologischer Erkrankungen. Jedoch ist es

bis heute noch nicht gelungen, ihre schwerwiegenden Nebenwirkungen, allen voran die

akute Graft-versus-Host-Erkrankung (aGvHD), stärker einzugrenzen. Auch bei einer

idealen, komplett für das humane Leukozytenantigen (HLA) gematchten Spender- und

Empfängersituation kommt es in 30-40% zu einer aGvHD. Diese klinischen Daten legen

die Existenz sogenannter Minor Histokompatibilitätsantigene (mHag) nahe, welche durch

Aminosäuredifferenzen zwischen Spender und Empfänger in vom Major

Histokompatibiltätskomplex (MHC) exprimierten Peptiden entstehen. Diese aus

intrazellulären Proteinen entstandenen Peptide sind in der Lage, in Anwesenheit von

fremden T-Zellen eine allogene Reaktion auszulösen und somit eine aGvHD zu

verursachen.

In der vorliegenden Studie werden mittels der PCR-SSP Methode (Polymerase-

kettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern) die allelischen Ausprägungen der mHag

HA-1, -2, -3, -8, HB-1, ACC-1 und -2, PANE-1 und UGT2B17 sowie die polymorphen

Zelladhäsionsmoleküle CD31 und CD62L in 320 unverwandten HLA-kompatiblen

Patienten-Spender-Paaren analysiert. Die Methodik wird durch die Testung von 8

bekannten Proben sowie dem nachfolgenden Vergleich der gefundenen Allelfrequenzen

mit einer Gruppe von Normalpersonen (n=2011) und einer Allelverteilung im Hardy-

Weinberg-Equilibrium (HWE) validiert.

Mismatche in den untersuchten mHag zwischen Spender und Patient werden multivariat,

zusammen mit den bekannten therapie-, spender- und patientenbezogenen Risikofaktoren,

statistisch auf die klinischen Endpunkte Gesamtüberleben, Inzidenz von aGvHD,

Krankheitsrückfall (Relapse) und Transplant related bzw. Non relapse mortality

(TRM/NRM) ausgewertet. Ein HA-8-Mismatch in HvG (Host-versus-Graft)-Richtung ist

das einzige mHag, welches die Inzidenz einer aGvHD erhöht. Das Auftreten eines

Krankheitsrückfalls wird signifikant durch ACC-1 (erhöhte Inzidenz bei einem Mismatch

in GvHoderHvG - graft-versus-host- oder host-versus-graft-Richtung), PANE-1 (erhöhte

Inzidenz bei einem Mismatch in HvG-Richtung) und Codon 206 von CD62L in der

116

Gruppe aller HLA-Merkmale (erhöhte Inzidenz bei einem Mismatch in GvH (graft-versus-

host)-Richtung; verminderte Inzidenz bei einem Mismatch in HvG-Richtung) beeinflusst.

ACC-2 und Codon 206 von CD62L, letzteres in der Subgruppe HLA-A3-Superfamilie,

(beide jeweils bei einem Mismatch in GvH-Richtung) senken die Inzidenz für TRM/NRM.

Das Gesamtüberleben wird positiv von ACC-2 (bei einem Mismatch in GvH-Richtung)

beeinflusst. Die beiden Adhäsionsmoleküle CD31 und CD62L beeinflussen das

Gesamtüberleben auf vielfältige Weise. In der Gruppe aller HLA-Merkmale verbessern

Mismatche in Codon 125 und 563 von CD31 signifikant das Gesamtüberleben (jeweils bei

einem Mismatch in GvHundHvG – graft-versus-host- und host-versus-graft-Richtung und

für Codon 563 auch bei einem Mismatch in HvG), teilweise erklärbar durch eine Tendenz

zur verminderten Relapseinzidenz (Codon 563). Die beiden Polymorphismen von CD62L

(Codon 206 und 213), analysiert in der HLA-A3-Superfamilie, haben gegenteilige

Auswirkungen auf das Gesamtüberleben: Ein Mismatch in GvH-Richtung in Codon 206

von CD62L verbessert die Überlebenswahrscheinlichkeit, erklärbar durch eine signifikant

niedrigere TRM/NRM-Inzidenz. Dagegen verschlechtert ein Codon 213-Mismatch in

GvHoderHvG-Richtung von CD62L das Überleben signifikant; hier zeigt sich eine

Tendenz zur einer höheren TRM/NRM-Inzidenz.

Unsere Resultate sind kritisch in Bezug auf die statistische Aussagekraft und

molekulargenetische Besonderheiten von mHag zu interpretieren und sollten aufgrund der

widersprüchlichen Ergebnisse bisheriger Studien zum Einfluss von mHag auf klinische

Outcomes nach allogener HSCT durch weitere Studien an großen Kohorten bestätigt

werden, um sichere Aussagen zur klinischen Relevanz treffen zu können.

117

6. Literaturverzeichnis

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Danksagung

Danken möchte ich meinem Doktorvater, Herrn Prof. Hubert Schrezenmeier, und meinem

Betreuer, Herrn PD Joannis Mytilineos, sowie meinem Kollegen Dr. Daniel Fürst, für die

Antworten auf meine vielen Fragen, die allzeitige Hilfe bei Problemen und die vielen

fachlichen Tips und Anregungen.

Dem Team der Abteilung Transplantationsimmunologie danke ich für die wunderbare

Arbeitsatmosphäre, die rege Unterstützung bei der labortechnischen Durchführung und die

moralische Unterstützung beim Schreiben und Verbessern. Eure Unterstützung war mir

eine große Hilfe!

Meinem Kommilitonen und guten Freund, Jens Putzbach, danke ich für die Einarbeitung

ins Labor und die vielen gemeinsamen Abende, die wir dort verbracht haben.

Allen voran möchte ich aber meiner Familie, meinen Freunden und meinem Freund für die

ausdauernde moralische Unterstützung beim Schreiben dieser Arbeit danken, sowie

besonders meinem Vater, Ludwig Recker, und meinem Freund, Jonas Rumpf, für das

unermüdliche und genaue Korrekturlesen! Soviele Fehler hätte ich nicht mehr gefunden :-)

Lebenslauf

Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt.

138