This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

über die Biosynthese des Cumarins II V o n F R I E D R I C H W E Y G A N D , H E L M U T S I M O N , H E I N Z - G Ü N T E R F L O S S u n d U T E M O T H E S

Aus dem Organisch-chemischen Institut der Technischen Hochschule München ( Z . N a t u r f o r s c h g . 15 b , 7 6 5 — 7 6 8 [ 1 9 6 0 ] ; e i n g e g a n g e n am 20. O k t o b e r 1960)

Herrn Professor K U H T M O T H E S in Verehrung zum 60. Geburtstage gewidmet

Durch Versuche mit Wurzelkulturen von Melilotus off. wurde festgestellt, daß Umbelliferon-[2-14C] nicht in Cumarin übergeht. Damit wird ein von HAWORTH vorgeschlagener Mechanismus der biogenen Lactonringbildung äußerst unwahrscheinlich.

Im Zusammenhang mit den Arbeiten über die Bildung der Phenylpropan-Derivate in der Natur ist in jüngster Zeit über eine Reihe von Untersu-chungen berichtet worden, die sich mit der Biogenese von Cumarinen befassen.

W E Y G A N D und W E N D T 1 fanden in Wurzelkulturen von Melilotus off. Einbau von L-Phenylalanin-[uni-form- 1 4 C] in Cumarin und konnten durch Abbau zeigen, daß dabei das Kohlenstoffgerüst intakt bleibt. Glucose - [1 - 1 4 C] wurde ebenfalls verwertet und lieferte ein Cumarin, das eine ähnliche Radio-aktivitäts-Verteilung besaß, wie sie D A V I S 2 in der aus E. coli nach Verabfolgung von Glucose - [1 - 1 4 C] isolierten Shikimisäure fand. Hierdurch wurde erst-mals der Beweis geliefert, daß auch in Pflanzen das von D A V I S aufgestellte und an Mikroorganismen er-mittelte Entstehungsschema für aromatische Verbin-dungen aus Zuckern gilt. K O S U G E und C O N N 3 zeig-ten, daß in Melilotus alb. die Verwertung von Glu-cose, Phenylalanin und Zimtsäure für die Cumarin-biosynthese in der angegebenen Reihenfolge zu-nimmt. Bei Hierochloe odorata fanden B R O W N und Mitarb. 4 den Einbau von L-Phenylalanin, Zimtsäure und o-Cumarsäure sowie o-Cumarsäure-glucosid in Cumarin. Für Acetat wurde von allen Autoren über-einstimmend ein vernachlässigbar geringer Einbau in Cumarin gefunden.

Versuche über die Biogenese substituierter Cuma-rine bestätigen diese Ergebnisse. R E Z N I K und U R B A N 5

fanden, daß Ferulasäure in Scopoletin von Weizen-, Mais- und Sonnenblumenblättern eingebaut wird

1 F . W E Y G A N D U . H . W E N D T , Z . N a t u r f o r s c h g . 1 4 b , 4 2 1 [1959],

2 B. D. DAVIS, Advances in Enzymology 16, 247 [1955]; Arch. Biochem. Biophysics 78, 497 [1958]; vgl. audi A. C. NEISH, Ann. Rev. Plant Physiol. 11, 55 [I960],

3 T . KOSUGE U . E . E . C O N N , J . b i o l . C h e m i s t r y 2 3 4 , 2 1 3 3 [1959].

und R E I D 6 beobachtete, daß von Nicotiana tabacum L-Phenylalanin besser zur Scopoletin-Synthese ver-wertet wird als C 0 2 , Essigsäure oder Phenylessig-säure. Schließlich berichteten K E N N E R und Mitarb. 7

kürzlich darüber, daß das Kohlenstoffgerüst des L-Tyrosins unverändert in den Cumarinring des Novobiocins übergeht.

Nach all diesen Befunden steht fest, daß das Ring-system des Cumarins aus Glucose über Shikimi-säure, Phenylalanin und Zimtsäure gebildet wird. Ungeklärt ist dagegen bisher, wie der Lactonring entsteht. Nach H A W O R T H 8 könnte er nach einer primär erfolgenden p-Hydroxylierung über eine chinoide Zwischenstufe entstehen, wobei im Falle des Cumarins selbst die Hydroxylgruppe aus der p-Stellung entfernt werden muß. Diese Hypothese sollte das häufige Vorkommen von 7-Hydroxy-cuma-rinen erklären. Eine zweite Möglichkeit ist eine pri-märe Hydroxylierung in o-Stellung zur Seitenkette und ein normaler Lactonringschluß unter Wasser-abspaltung 1 . Dieser W e g steht im Einklang mit dem Einbau von o-Cumarsäure und seinem Glucosid, ob-wohl hier zu bedenken ist, daß o-Cumarsäure auch spontan in Cumarin übergehen kann. K E N N E R und Mitarb. 7 ziehen noch eine dritte Möglichkeit in Be-tracht, nämlich die direkte Cyclisierung durch intra-molekularen Angriff eines Carboxylradikals oder eines potentiellen Carboxylkations.

In der vorliegenden Untersuchung haben wir durch Verwendung von 1 4C-markiertem Umbelli-feron zu klären versucht, ob dem Lactonringschluß

4 S . A . B R O W N , G . H . N . T O W E R S U . D . W R I G H T , C a n a d . J . B i o -chem. Physiol. 38, 143 [I960].

5 H . REZNIK U. R . URBAN, Naturwissenschaften 4 4 , 1 3 [ 1 9 5 7 ] . 6 W . W . REID, Chem. and Ind. 1 9 5 8 , 1439. 7 K . CHAMBERS, G . W . K E N N E R , E . J . T . ROBINSON U . R . B .

WEBSTER, Proc. chem. Soc. [London] 1960, 291. 8 R . D. HAWORTH, J. chem. Soc. [London] 1942 , 448.

eine para-Hydroxylierung vorangeht. W ä r e dies der Fall, so müßte Umbelliferon unmittelbarer Vorläu-fer des Cumarins sein.

Sterile Wurzelkulturen von Melilotus off. wurden mit Umbel l i feron- [2 - 1 4 C] ( 0 , 3 9 m C / m M o l , 4 5 m g / / Nährlösung) inkubiert. Die Wurzeln wurden nach 4, 8 und 1 4 Tagen geerntet, worauf das Cumarin nach Zusatz einer definierten Menge nichtradioaktiven Cumarins isoliert und seine spez. Aktivität bestimmt wurde. Der Zusatz von Trägersubstanz erwies sich als notwendig, da sich sonst das Cumarin aus der geringen Menge Wurzelmaterial nicht in reinem Zu-stand isolieren ließ.

In der Lit. 4 wird der Cumaringehalt von Meli-lotus off. zu ca. 2 % des Trockengewichtes angegeben. Durch Chromatographie 9 von Wurzelextrakten und Vergleich der Fleckengröße wurde die gleiche Grö-ßenordnung für den Cumaringehalt der Wurzeln gefunden. Damit läßt sich aus der zugesetzten Cu-marinmenge, der spez. Aktivität und dem Trocken-gewicht der verarbeiteten Wurzeln die spez. Aktivi-tät des pflanzeneigenen Cumarins abschätzen (vgl. die T a b . ) .

Das angebotene Umbelliferon wurde von den Wur-zeln in starkem M a ß e aufgenommen. Die Aktivität der Nährlösung war nach 1 4 Tagen auf ca. */3 der Ausgangsaktivität zurückgegangen. Aus den Wurzeln konnte Umbelliferon isoliert werden, das dieselbe spez. Aktivität hatte wie eingesetztes Umbelliferon. Ein wässeriger Extrakt aus den Wurzeln wurde nach Entfernung des frei vorliegenden Umbelliferons mit-tels Äther mit Emulsin behandelt. Danach ließ sich erneut Umbelliferon nachweisen. Dies zeigt, daß Umbelliferon in den Wurzeln teilweise in ein Gly-kosid verwandelt worden ist.

Die spez. Einbaurate des Umbelliferons ergibt sich zu 0 , 0 2 - 0 , 0 6 % (vgl. die T a b . ) . W ä r e Umbelli-feron ein direkter Vorläufer des Cumarins, so hätte das isolierte Cumarin um zwei Größenordnungen aktiver sein müssen und ferner hätte, da Umbelli-f e r o n - [ 2 - 1 4 C ] im Überschuß angeboten wurde, die Aktivität mit steigender Versuchsdauer zunehmen

9 Dünnschichtchromatographie mit Benzol als mobiler Phase nach Dr. G. BILLEK, Org.-chem. Inst. d. Universität Wien; Privatmitteilung.

10 Privatmitteilung von S. A. BROWN, Prairie Regional Labo-ratory, Saskatoon, Saskatchewan, Canada. Vgl. Z. Natur-forschg. 15b, 768 [I960].

* Die Radioaktivitäts-Messungen wurden, falls nichts ande-res angegeben ist, durch Oxydation der Substanzen mit Kaliumperchlorat zu Kohlendioxyd und Messung der

müssen. Dies ist jedoch nicht der Fall. Schließlich hat das zugesetzte Umbelliferon in den Wurzeln keine Verdünnung erfahren, was der Fall sein sollte, wenn es ein Zwischenprodukt bei der Biosynthese des Cumarins wäre.

Es ergibt sich daher, daß der Lactonring des Cumarins nicht nach der Vorstellung von H A W O R T H gebildet wird.

In Übereinstimmung mit diesen Resultaten stehen Versuche von B R O W N 1 0 , bei denen p-Cumarsäure mit Zimtsäure und Tyrosin mit Phenylalanin als Vorläufer für Cumarin bei Hierochloe verglichen wurden. In beiden Fällen wurde die p-Hydroxy-verbindung viel schlechter verwertet.

Es bleibt somit zu klären, ob der Ringschluß über eine o-Hydroxylierung oder durch direkten Angriff des Carboxyls auf den aromatischen Ring erfolgt.

Beschreibung der Versuche *

U m b e l l i f e r o n - [2-1 4C]

Die Darstellung erfolgte analog bekannten Verfah-ren 11 ~ 1 3 . 200 mg Malonsäure- [1.3-1 4C] (ca. 0,8 mC/ mMol) und 266 mg 2.4-Dihydroxy-benzaldehyd wurden in einem Reagenzglas mit Schliff in 0,6 ml trocknem Pyridin gelöst. Nach Zusatz von 0,1 ml Anilin wurde das Glas verschlossen 86 Stdn. im Trockenschrank auf 4 0 ° erwärmt. Nach dem Ansäuern mit verd. Salzsäure wurde die Umbelliferon-3-carbonsäure abzentrifugiert, einmal mit Wasser gewaschen und im Hochvakuum ge-trocknet. Durch 1-stdg. Erhitzen auf 2 6 0 ° wurde sie decarboxyliert, wobei das freiwerdende 1 4 C 0 2 mit Stickstoff in Natronlauge überführt und als Barium-carbonat gefällt wurde (304 mg, 80% d. Th.) . Das De-carboxylierungs-Produkt wurde 4-mal mit je 8 ml Me-thanol ausgekocht, und die nach Zentrifugieren erhal-tenen Lösungen wurden eingeengt und in einem Sub-limationsrohr durch Aufblasen von Stickstoff zur Trockne gebracht. Das Umbelliferon wurde sodann unter 14 Torr bei 1 8 0 - 2 0 0 ° sublimiert. Ausb. 80,6 mg, 0,39 mC/ mMol, Schmp. 225 — 2 2 7 ° . Durch mehrtägige Sublima-tion des Rückstandes bei etwas höherer Temperatur konnten noch 27,0 mg weniger reines Umbelliferon und schließlich nach Zugabe von inaktivem Träger noch wei-tere 8,7 mg in verdünnter Form isoliert werden. Gesamt-ausbeute, bezogen auf Malonsäure, 35,6%, radioaktive

Aktivität in Gaszählrohren im Proportionalbereich aus-geführt ; Zählausb. 67 ,5 Prozent. H. SIMON, H . DANIEL U. J. F. KLEBE, Angew. Chem. 71, 303 [1959].

11 F. VORSATZ, J. prakt. Chem. [2] 145, 265 [1936]. 1 2 K . C. PANDYA U. T . S. SODHI, Proc. Ind. Acad. Sei. 7 A , 3 8 1

[1938]; C. A.32, 7435 [1938]. 1 3 H . v. PECHMANN U. E. GRAEBER, Ber. dtsch. chem. Ges. 3 4 ,

378 [1901].

Tab.l. Einbau von Umbelliferon-[2-14C] (5,8• 108 ipm/mMol, 45 mg/Z Nährlösung) in Cumarin in Wurzelkulturen von Melilotus off. * Unter der Annahme von 2% Cumarin in den

Wurzeln.

Verunreinigungen unter 1% (nach papierchromatogra-phischer Reinheitsprüfung).

K u l t u r d e r W u r z e l n Es wurden Wurzelkulturen von Melilotus off. (MEL

9/57, Sortiment Gatersleben) verwendet. Die Kultur er-folgte in der bereits beschriebenen Weise wobei die folgende Nährlösung nach B O N N E R 14 verwendet wurde (in g pro l aqua bidest.).

Versuchsdauer (Tage) 4 . 8 14

Frischgewicht der Wurzeln (mg)

1394 1525 1669

Trockengewicht in % des Frischgewichtes 10 13,3 14,4 Auf Cumarin auf-gearbeitete Wurzel-menge (mg Frischgewicht) 693 829 762

Zugesetztes nicht-radioaktives Cumarin (mg) 20,0 20,1 22,6

Spez. Aktivität des isolierten Cumarins (ipm/mMol) 2320 2558 1220 Spez. Aktivität des pflanzeneigenen Cumarins (ipm/mMol)* 3,4 • 105 2,4 • 105 1,3-105

Spez. Einbaurate in %

0,06 0,04 0,02

Spez. Aktivität des wiederisolierten Umbelliferons (ipm/mMol)

5,78 • 108 5,64 • 108 5,92 • 108

Ca(N03 )2 -4H20 0,240 MgS04 • 7 H20 0,040 KNOs 0,085 KCl 0,060 KH2P04 0,020

Fe-III-citrat 0,0015 Vitamin Bx • HCl 0,0002 Vitamin B6 -HCl 0,0002 Nicotinsäureamid 0,0003 Saccharose 20,0

Je 16 Wurzeln wurden im Alter von 7 Tagen unter sterilen Bedingungen in einen F e r n b a c h - Kolben mit 4,5 mg Umbelliferon-[2-14C] (0,39 mC/mMol, ent-sprechend 5,8 • 108 ipm/mMol) in 100 cm3 Nährlösung gebracht. Insgesamt wurden 12 Kolben angesetzt. Je 4 Kolben wurden am 4., 8. und 14. Tag geerntet. Die Wurzeln wurden abfiltriert, gewogen und aufgeteilt. Etwa die Hälfte wurde für die Isolierung des Cumarins verwendet, ein Viertel wurde bei 55° getrocknet und nach Bestimmung des Trockengewichts auf Umbelliferon

14 J. SEELIGER, Flora [Jena] 144,47 [1956/57].

aufgearbeitet, der Rest wurde zum Nachweis des Um-belliferon-glykosids verwendet.

I s o l i e r u n g d e s C u m a r i n s Die frischen Wurzeln wurden mit Sand zerrieben

und mit 30 ml Wasser in einen Kolben gebracht. Nach Zusatz von nichtradioaktivem Cumarin (Mengen s. Ta-belle) wurde bei 45 — 50 Torr wasserdampfdestilliert. Die ca. 400 ml Destillat wurden 6-mal mit Äther aus-geschüttelt, worauf die ätherische Lösung einmal mit einer Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet wurde. Nach dem Ab-dampfen des Äthers wurde der Rückstand im Vakuum sublimiert und sodann nochmals in einem liegenden Rohr mit Temperaturgefälle sublimiert. Es wurden zwi-schen 8,7 und 15,5 mg Cumarin isoliert, dessen Radio-aktivität bestimmt wurde (s. Tabelle).

I s o l i e r u n g von U m b e l l i f e r o n a u s d e n W u r z e l n

Die getrockneten Wurzeln wurden in einem S o x -1 e t h - Apparat mit trocknem Aceton extrahiert. Der Extrakt wurde auf 2 ml eingeengt. Durch Dünnschicht-chromatographie mit Benzol als Laufmittel9 würde zu-erst Cumarin abgetrennt (Rf 0,25). Das Umbelliferon blieb am Start liegen, wurde mit Aceton eluiert und erneut auf eine Dünnschichtplatte aufgetragen. Nach Entwicklung mit Chloroform-Äther (9 : 1 vol.) wurde der Umbelliferonfleck (Rf 0,3) eluiert und auf Papier (Schleicher & Schüll Nr. 2043 bm, gewaschen mit Was-ser und Isopropanol) mit Wasser rechromatographiert. Das Umbelliferon wurde sodann mit Isopropanol in einem 5-ml-Meßkolben eluiert und seine Konzentration bei 327 m/u an Hand einer Eichkurve und in 1 ml davon die Radioaktivität bestimmt. Aus beiden Werten ergab sich die spez. Aktivität (s. Tabelle).

P r ü f u n g d e r V o l l s t ä n d i g k e i t d e r T r e n -n u n g v o n C u m a r i n u n d U m b e l l i f e r o n Um festzustellen, inwieweit das isolierte Cumarin

mit Spuren des hochradioaktiven Umbelliferons bei der oben angegebenen Isolierung verunreinigt sein kann, wurde folgender Blindversuch ausgeführt.

In nichtradioaktiver Nährlösung gewachsene Wur-zeln wurden in gleicher Weise wie bei den aktiven Ver-suchen auf Cumarin aufgearbeitet, jedoch wurden vor der Wasserdampfdestillation zur Lösung 0,2 mg Um-belliferon-[2-14C] (5,8-IO8 ipm/mMol) gegeben. Das isolierte Cumarin hatte nur eine Aktivität von 89 ipm/ mMol.

N a c h w e i s e i n e s Um b e l l i f e r o n - g l y k o s i d s 1,19 g frische Wurzeln (aus allen drei Versuchen)

wurden im S o x l e t h - Apparat im Wasserstrahlpum-pen-Vakuum mit Wasser extrahiert. Der wässerige Ex-trakt wurde 3-mal ausgeäthert (Ätherlösung a), erneut ausgeäthert (Ätherlösung b) und sodann nach Ver-kochen des gelösten Äthers mit 0,2 mg Emulsin versetzt. Nach Stehen über Nacht wurde erneut ausgeäthert (Ätherlösung c). Das Volumen der Ätherlösungen

wurde gemessen, dann wurde je 1 ml auf einem Proben-sehälchen eingedampft und die Radioaktivität des Rück-standes mit einem dünnwandigen Fensterzählrohr (Zähl-ausbeute ca. 1%) bestimmt. Die Aktivität betrug für die gesamte Ätherlösung a 1,88-IO5 ipm, für Lösung b 2,5-IO3 ipm und für Lösung c 8,56-IO4 ipm. In Lö-sung c war sie also ca. 34-mal höher als in Lösung b. — Die Lösungen a und c wurden eingedampft, aus den Rückständen wurde Umbelliferon isoliert, und die Radioaktivität wurde nach Verbrennung zu C02 im

Gaszählrohr bestimmt. Sie betrug 5,54-108 bzw. 5,95 • 108 ipm/Mol. Bei der Chromatographie konnte außer Umbelliferon keine weitere radioaktive Verbin-dung entdeckt werden.

Wir danken der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s -g e m e i n s c h a f t bestens für eine Sachspende und ebenso dem B u n d e s m i n i s t e r i u m f ü r A t o m -k e r n e n e r g i e u n d W a s s e r w i r t s c h a f t für Bereitstellung von Mitteln.

Uber die Lactonringbildung des Cumarins * V o n S T E W A R T A . B R O W N

Aus dem Prairie Regional Laboratory, National Research Council, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada (Z. Naturforschg. 15 b , 768—769 [1960] ; e ingegangen am 7. November 1960)

Tracer experiments with 14C have shown that p-coumaric acid is over 70 times less efficient than cinnamic acid as a precursor of coumarin in Hierochloe odorata, and that tyrosine is over 60 times less efficient than phenylalanine. The results show that in this species the reaction sequence postu-lated by HAWORTH, in which coumarins are formed from p-coumaric acid, is not significantly involved in the biosynthesis of coumarin itself. It is suggested that, in higher plants, cinnamic acid (or an "activated" form of it) is a common precursor of all coumarins, and that ortho- or para-hydroxylation of this compound leads subsequently to the formation of coumarin and the 7-hydroxycoumarins, respectively. Different enzyme systems may be required for the formation of the lactone ring of coumarin and the 7-hydroxycoumarins.

Die Biogenese des Cumarins in höheren Pflanzen wurde kürzlich in mehreren Laboratorien unter-sucht 1 _ 3 . Die Befunde haben die Theorie unter-stützt, daß Cumarin aus o-Cumarinsäure und ihrem Glucosid, welche die Pflanze aus einfachen Kohlen-hydraten über Shikimisäure und Phenylalanin bil-det, entsteht.

Der Mechanismus der Bildung des Lactonringes ist jedoch noch Gegenstand von Spekulationen. Vor fast 20 Jahren schlug H A W O R T H 4 einen Mechanismus vor, der die Tatsache in Betracht zieht, daß alle Cumarine außer Cumarin selbst in der 7-Stellung, d. h. para-ständig zur Seitenkette hydroxyliert sind. Nach diesem Schema betrachtet man p-Hydroxy-zimtsäure (p-Cumarsäure) als Vorläufer, und der Sauerstoff des Lactonringes soll von der Carboxyl-gruppe stammen. Die allgemeine Anwendung die-ser Theorie würde die nachträgliche Entfernung der 7-ständigen Hydroxylgruppe nach der Cyclisierung nur in dem einzigen außergewöhnlichen Fall des Cumarins erfordern.

* N.R.C. Nr. 6083. 1 S . A . BROWN , G . H . N . TOWERS U. D . WRIGHT , C a n . J. B i o -

chem. Physiol. 38, 143 [I960]. 2 T . KOSUGE U. E. E . CONN, J. biol. Chemistry 234, 2133

[1959]. 3 F . WEYGAND U. H. WENDT, Z . Naturforschg. 14 b, 421

ri959].

Die Leichtigkeit, mit der sich o-Cumarsäure und ihr Glucosid in Cumarin in Hierochloe odorata um-wandeln, beweist, daß, zumindest in dieser Species, der Lactonring durch eine klassische Reaktion, näm-lich über cts-o-Hydroxyzimtsäure gebildet werden kann. Da jedoch neben Cumarin auch p-Cumarsäure vorkommt1 und da ferner diese Säure noch nicht als Cumarinvorläufer getestet wurde, bleibt die mög-liche Bedeutung des alternativen Weges unbestimmt. Wegen des erneuten Interesses an den Vorstellun-gen von H A W O R T H 3 ' 5 ' 6 soll über das Ergebnis eines Versuches berichtet werden, bei dem p-Cumarsäure und Tyrosin mit ihren nichthydroxylierten Analo-gen, der Zimtsäure und dem Phenylalanin, als Vor-läufer des Cumarins und des o-Cumaryl-glucosids in H. odorata verglichen wurden.

Methodik

Die Synthese der markierten Verbindungen, ihr Ein-bringen in die Pflanzen, die Isolierung und die 14C-Ana-lyse des Cumarins wurden bereits beschrieben 7. Die

4 R. D. HAWORTH, J. chem. Soc. [London] 1942, 448. 5 K . CHAMBERS, G . W . KENNER, M . J . TAMPLE ROBINSON U. B .

R. WEBSTER, Proc. chem. Soc. [London] 1960, 291. 6 T . GEISSMAN, in: W . RUHLAND, Handbuch der Pflanzen-

physiologie, Bd. 1 0 , S. 5 4 3 [ 1 9 5 8 ] . 7 S. A. BROWN U. A. C. NEISH , Can. J. Biochem. Physiol. 34,

7 6 9 [ 1 9 5 6 ] .