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1 Mikrobiologisches Praktikum Stoob/ Tautschnig CH11 VTBC FS13

Studiengang Chemie VT BC Gruppe Nr. : 5

Mikrobiologisches Praktikum Projekt Nr. : 8

Bestimmung eines unbekannten

Enterobakteriums und eines Klärschlammisolates

Start : 19.02.2013

Ende : 03.04.2013

Berichtabgabe : 23.04.2013

Verfasser: L. Stoob/ M. Tautschnig

Zusammenfassung

Dieser Bericht umfasst die Bestimmung eines Enterobakteriums und eines Klärschlammisolats

innerhalb des mikrobiologischen Praktikums der SBCH11 VTBC. Im Rahmen dieser Arbeit wurden

zwei Isolate mittels bunter Reihe, API-Test und MALDI-TOF als Escherichia coli identifiziert. Eine

genauere Bestimmung des Subtyps konnte mit diesen Resultaten nicht durchgeführt werden.

Korrektor: Dr. Walter Krebs


Inhalt

1. Einleitung ......................................................................................................................................... 3

2. Probennahme .................................................................................................................................. 4

3. Grobdifferenzierung ........................................................................................................................ 4

4. Differenzierung (Bunte Reihe) ......................................................................................................... 5

Indoltest .............................................................................................................................................. 5

H2S-Test .............................................................................................................................................. 5

Ureasetest ........................................................................................................................................... 5

Beweglichkeit ...................................................................................................................................... 6

5. API-Test............................................................................................................................................ 7

6. Eigene Konzeption ........................................................................................................................... 9

Bestimmung der Isolate mittels eigenem Konzept ........................................................................... 10

7. MALDI-TOF .................................................................................................................................... 12

Unbekanntes Enterobakterium ......................................................................................................... 12

Klärschlammisolat ............................................................................................................................. 13

8. Diskussion ...................................................................................................................................... 14

9. Literaturverzeichnis ....................................................................................................................... 15

10. Anhang....................................................................................................................................... 16

Abbildungsverzeichnis ....................................................................................................................... 16

Tabellenverzeichnis ........................................................................................................................... 16


1. Einleitung

Im Rahmen des Mikrobiologiepraktikums wurde jeder Gruppe ein unbekanntes Enterobakterium zugeteilt. Dieses wird durch diverse Tests auf ihre Eigenschaften geprüft. Beispielsweise wird die Mobilität in einem Lichtmikroskop untersucht, aber auch Stoffwechseleigenschaften wie die Bildung oder Verwertung von Stoffen wird geprüft. Meist äussert sich dies durch den Farbumschlag eines Indikators, es kann aber auch Gas entstehen, welches zu einem Testresultat führt. Diese Tests werden zusammengefasst die Bunte Reihe genannt. Der Api-Test beinhaltet viele dieser Tests auf kleinstem Raum, die Indikatoren und Substrate sind bereits vorgelegt, es wird lediglich das suspendierte Bakterium aufgetragen. Anhand der Ergebnisse wird ein Code erstellt, womit die Identität des Bakteriums bestimmt werden kann. Als weitere Methode wird das Bakterium mit dem Maldi-Tof analysiert und über eine Datenbank identifiziert.


2. Probennahme Das unbekannte Bakterium wurde in Reinkultur auf einer Nähragarplatte zur Verfügung gestellt. Das Klärschlammisolat wurde selber aufbereitet. Dabei wurde flüssiger Klärschlamm auf einem MacConkey Agar ausgestrichen und auf diesem eine säurebildende Kultur entnommen und zweimal weiter auf Nähragar ausgestrichen, um eine Reinkultur zu erhalten.

3. Grobdifferenzierung Das erhaltene Unbekannte Enterobakterium ist stäbchenförmig, beweglich und gemäss Färbung gramnegativ. Auf Nähragar bildet es leicht gelbliche, leicht trübe, schleimige, kreisförmige Kulturen. Für das Klärschlammisolat KS1 wurden dieselben Befunde vermerkt. Zusätzlich wurden die folgenden Tests durchgeführt: Tabelle 1: Gramtests

Test Unbekannt Isolat KS1

Katalase + +

Oxidase - -

KOH + (gramnegativ) + (gramnegativ)

Aminopeptidase - -

Diese Resultate bestätigen die Gramfärbung und erlauben den späteren Gebrauch eines API E 20 Tests zur Bestimmung eines Enterobakteriums.

Abbildung 1: unbekanntes Bakterium


4. Differenzierung (Bunte Reihe) Aufgrund der Vorgaben können wir die möglichen Enterobakterien auf folgende 11 beschränken: Citrobacter freundii Cronobacter sakazakii Enterobacter cloacae Escherichia coli Morganella morganii Proteus mirabilis Proteus vulgaris Raoulltella terrigena Salmonella enteriditis Serratia rubidae Shigella flexneri Für das unbekannte Enterobakterium und das Klärschlammisolat KS1 wurden die folgenden Tests mit entsprechenden Resultaten durchgeführt: Tabelle 2: Bunte Reihe

O/F:O O/F:F Urease Indol H2S Glucose Suc/Lac Gas

Unbekannter + + - + - + +/- -

KS1 + + - + - + - -

Mit den vorhandenen Ergebnissen wurde nun per Ausschlussverfahren ein mögliches Enterobakterium ermittelt: (In Klammern jeweils die prozentualen Anteile der positiven Tests)

Indoltest

Citrobacter freundii (5 %) Cronobacter sakazakii (11 %) Enterobacter cloacae (0 %)

Escherichia coli (98 %) Morganella morganii (98 %) Proteus mirabilis (2 %)

Proteus vulgaris (98 %) Raoulltella terrigena (0 %) Salmonella enteriditis (1 %)

Serratia rubidae (0 %) Shigella flexneri (50 %)

H2S-Test

Escherichia coli (1 %) Morganella morganii (5 %)

Proteus vulgaris (95 %)

Shigella flexneri (0 %)

Ureasetest

Escherichia coli (1 %) Morganella morganii (98 %)



Beweglichkeit

Escherichia coli (95 %)


Da sowohl beim Klärschlammisolat, als auch beim unbekannten Enterobakterium die gleichen

Resultate vorliegen können beide als Escherichia coli identifiziert werden. (J.J. Farmer III, 1985)


5. API-Test Api 20E ist ein Teststreifen der für Enterobakterien konzipiert ist, um diese zu unterscheiden und identifizieren. Der Test wird mit Bakteriensuspension beimpft und für 24 Stunden bei 36°C inkubiert. Bei einigen

Testbehältern müssen noch zusätzliche Chemikalien zugefügt werden, um Reaktionen zur

Identifikation der Spezies hervorzurufen. Je nach Bakterium werden Substanzen verwertet oder auch

nicht. Dabei ist meist ein Indikator anwesend, der einen Farbumschlag verursacht falls das Resultat

positiv ausfällt. Der Api 20E kann durch weitere Indizien erweitert werden um die

Trefferwahrscheinlichkeit zu erhöhen.

Abbildung 2 ApiTest 20E

Nach dem Auswerten des ApiTest, wird die Kombination der bakteriellen Fähigkeiten mit einer

Datenbank verglichen. Die Datenbank ist über das Internet oder einen Katalog erreichbar, womit das

Ergebnis abgerufen werden kann.

Folgende Resultate fanden wir bei unseren Enterobakterien.

Tabelle 3: API-Test

Name Signifikante Taxa Identifikation ohne Zusatz Identifikation mit Zusatz

Unbekannt Escherichia coli 1 51.0 % 93.8 %

Isolat Escherichia coli 1 96.3 % 97.4 %


Abbildung 3: API-Tests


6. Eigene Konzeption Im Vorfeld zur Differenzierung wurde ein eigenes Konzept erstellt, welches eine Einteilung der elf Enterobakterien ermöglicht. Die Bestimmung gilt wieder für beide Isolate. (J.J. Farmer III, 1985)

Abbildung 4: Konzept Übersicht


Bestimmung der Isolate mittels eigenem Konzept

Wenn wir dieses Konzept zur Bestimmung der Enterobakterien verwenden würden, stellt sich zuerst die Frage: Lactosefermentierung Ja oder Nein?

Abbildung 5: Konzeptausschnitt 1

Diese Frage können wir aufgrund des pink gefärbten MacConkey Agars mit Ja beantworten. Als nächstes folgt die Frage H2S-Bildner Ja oder Nein?


Aufgrund des nicht schwarz gefärbten TSI-Agars können wir diese Frage mit Nein beantworten. Die nächste Frage ist: Citrat als Substrat Ja oder Nein?



Diese Frage können wir aufgrund des API-Tests mit Nein beantworten. Dies ergibt als Resultat Escherichia coli.


7. MALDI-TOF

Unbekanntes Enterobakterium

Mittels MALDi-TOF konnte Escherichia coli bestätigt werden. Jedoch sind die Daten für die Bestimmung des Subtyps nicht genau genug um eine zuverlässige Aussage zu treffen.

Abbildung 8: MALDI-TOF: unbekanntes Enterobakterium


Klärschlammisolat

Wiederum konnte zwar Escherichia coli bestätigt werden, jedoch nicht dessen Subtyps da auch hier die Resultate zu ungenau sind.

Abbildung 9: MALDI-TOF: Klärschlammisolat


8. Diskussion Rückblickend auf das ganze Praktikum ist zu erwähnen, dass es wichtig ist den Überblick zu behalten und eine klare Struktur einzubringen. Ohne sauberes und steriles Arbeiten ist es nicht möglich, Bakterien in Reinkultur zu bringen und zu analysieren. Im Vorhinein wurde die Gramnegativität der beiden vermeintlichen Enterobakterien mittels verschiedener Test (S. 4) bestimmt. Und die Mobilität via Lichtmikroskop nachgewiesen. Durch verschiedene Verfahren haben wir die Identität des Isolats KS1 und des unbekannten Enterobakteriums bestimmt. Die Resultate aus der Bunten Reihe, Api-Test und Maldi-Tof stimmen überein. Obwohl beide Bakterien den Genus Escherichia coli aufweisen, haben nicht alle Tests die gleichen Resultate bezüglich Subtypen ergeben. Der Grund der unterschiedlichen Eigenschaften liegt deshalb in der Vielfalt und Variabilität der Bakterien. Wir versuchten nun durch Recherche die Subtypen zu bestimmen, mangels Informationen war dies jedoch nur stark eingeschränkt bis nicht möglich. Allerdings ist hierbei zu erwähnen, dass sehr viele Escherichia coli bereits identifiziert und in Datenbanken niedergelegt sind. Als weiteres Vorgehen würde sich der Vergleich mit weiteren Datenbanken lohnen. Das Konzept, welches im Prolog zur bunten Reihe angefertigt wurde, würde beide Isolate ebenfalls zu Escherichia coli führen.


9. Literaturverzeichnis

J.J. Farmer III, B. D.-B.-C. (January 1985). Biochemical Identification of New Species and Biogroups of

Enterobacteriaceae from Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology, S. 46-76.


10. Anhang

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: unbekanntes Bakterium ..................................................................................................... 4

Abbildung 2 ApiTest 20E.......................................................................................................................... 7

Abbildung 3: API-Tests............................................................................................................................. 8

Abbildung 4: Konzept Übersicht .............................................................................................................. 9

Abbildung 5: Konzeptausschnitt 1 ......................................................................................................... 10



Abbildung 8: MALDI-TOF: unbekanntes Enterobakterium.................................................................... 12

Abbildung 9: MALDI-TOF: Klärschlammisolat........................................................................................ 13

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Gramtests ............................................................................................................................... 4

Tabelle 2: Bunte Reihe............................................................................................................................. 5

Tabelle 3: API-Test ................................................................................................................................... 7

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