Biochemisches Praktikum 1 – Grundpraktikum · 2020. 1. 23. · Praktikum 1 Protein-Analytik...

Biochemisches

Praktikum 1

Protein-Analytik

Praktischer Teil

Version Februar 2020

Inhaltsverzeichnis Seite

Sicherheitshinweise Protein-Analytik 1

Arbeitshinweise Protein-Analytik 2

Ionenaustauschchromatographie 3

Ionenaustauschchromatographie - Materialien 4

Ionenaustauschchromatographie - Beeinflussbare Parameter bei der

Ionenaustauschchromatographie 5

Ionenaustauschchromatographie – Umpuffern und Verdünnen 6

Ionenaustauschchromatographie – Ablauf Säulenchromatographie 7

Ionenaustauschchromatographie – Planen & Testen von Reinigungsbedingungen 9

Ionenaustauschchromatographie – Arbeitsblätter Testläufe - Beispiel 11

Ionenaustauschchromatographie – Arbeitsblätter Testläufe – Testlauf 1 14

Ionenaustauschchromatographie – Arbeitsblätter Testläufe – Testlauf 2 15

Ionenaustauschchromatographie – Aufreinigung von GFP 17

Ionenaustauschchromatographie – Bradford-Assay 20

Ionenaustauschchromatographie – Arbeitsblätter - Quantitative Reinigung 22

Ionenaustauschchromatographie – Auswertung GFP - Reinigung 25

Taq-Polymerase Reinigung 26

Taq-Reinigung – Zellaufschluss, AS - Fällung 29

Taq-Reinigung – AS-Fällung, Affinitätsreinigung 31

Taq-Reinigung – Dialyse 33

SDS-Gelelektrophorese 34

Taq-Reinigung – SDS-Gel 35

Induzierte Genexpression 38

Induzierte Genexpression – Durchführung 40

Induzierte Genexpression – SDS-Gelelektrophorese 42

Proteingrößenstandard 46

Anzusetzende Puffer 47

Vorhandene Puffer 48

Protokoll zum Grundpraktikum 49

Sicherheitshinweise Protein-Analytik

1

Sicherheitshinweise: - Taq-Reinigung

o -Mercaptoethanol ist gesundheitsschädlich und riecht “schlecht“; Arbeiten mit -Mercap-

toethanol immer im Abzug durchführen; Abfälle, die -Mercaptoethanol enthalten, in Son-

dermüllbehältern sammeln (wässrige Abfälle)! Spitzen/Plastikgefäße, die mit -Mercapto-

ethanol kontaminiert sind, im Abzug in Abfallbehältern sammeln und vor der Entsorgung

mindestens 24 h abdampfen lassen!

o Für Arbeiten mit DTT gelten die gleichen Vorsichts- und Entsorgungsmaßnamen wie für

-Mercaptoethanol

o Viele Puffer der Taq-Reinigung enthalten -Mercaptoethanol oder DDT!

o Bakterienabfall immer im Autoklavierabfall entsorgen;

Induzierte Genexpression

o Der 1 x SDS Puffer enthält DTT - Sicherheitshinweise (siehe oben) beachten!

o Bakterienabfall immer im Autoklavierabfall entsorgen;

o Nicht benötigte Bakterienkulturen in Autoklavierkiste stellen

o Mit Bakterien verunreinigte Glasgefäße zum Autoklavieren stellen

SDS –Gelelektrophorese:

o Der 1 x SDS Puffer enthält DTT – Sicherheitshinweise beachten!

o Eluierte Proben können -Mercaptoethanol enthalten – Sicherheitshinweise beachten!

o Acrylamid ist toxisch (Nervengift) und möglicherweise kanzerogen; Hautkontakt vermeiden;

beim Arbeiten mit Acrylamid-Lösungen IMMER Handschuhe tragen und im Abzug arbeiten,

da Acrylamid auch in Lösung einen hohen Dampfdruck hat und in die Raumluft gelangt.

o Acrylamidgele im Abzug gießen, Gellösung im Abzug pipettieren; Acrylamidgele im Abzug

polymerisieren; die fertigen Gele werden am Platz gefahren;

o vertropfte Acrylamid-Lösung sofort mit einem Papiertuch aufnehmen, NICHT eintrocknen

lassen; Papiertuch in blauer Tonne für Feststoffabfall entsorgen;

o Festes SDS ist - wenn es nicht zu Pellets gepresst ist - sehr feinpulverig; SDS Staub schädigt

die Lunge; Staubbildung unbedingt vermeiden, unter dem Abzug abwiegen und in Lösung

bringen; SDS-Kristalle sofort mit feuchtem Tuch aufnehmen;

Bradford Assay

o Bradford-Reagenz enthält Phosphorsäure, Hautkontakt vermeiden; bei Kontakt mit Haut oder

Augen sofort abwaschen (Augendusche!)

o Abfall gesondert sammeln, entsorgen im Sonderabfall (wässrige Abfälle)

Arbeitshinweise Protein-Analytik

2

Allgemeine Arbeitshinweise:

o während der Arbeit Handschuhe tragen

o für jeden Pipettierschritt frische Spitze verwenden

o Entsorgungsanweisungen für -Mercaptoethanol und DTT beachten

o Eppis eindeutig beschriften (Edding)

o Arbeitsanweisungen für Acrylamid beachten

o Plastikröhrchen eindeutig beschriften (Edding) – Gruppennummer, Bakterienstamm,

induziert (+/-)

Ionenaustauschchromatographie

3

Während der Praktikumswoche „Protein-Analytik“ sollen Sie eine einfache Reinigungs-

strategie für das Grün-fluoreszierende Protein GFP, mit Hilfe der Ionenaustauschchroma-

tographie entwickeln. Dazu führen Sie vorher Testreinigungsläufe aus um anschließend

unter optimalen Bedingungen das GFP aufzureinigen.

GFP-Reinigung - Beeinflussbare Parameter bei der Ionenaustauschchromatographie

4

Für die Entwicklung der Reinigungsstrategie erhalten Sie von uns folgende Materialien:

(GFP auf Eis – Puffer und Säulen stehen im Abzug)

- 1 ml bakterieller GFP-Rohextrakt (Proteinextrakt)

o Proteinextrakt aus GFP exprimierenden BL21 Bakterien

o Proteinextrakt gelöst in 10 mM Tris, pH 7,5 / 150 mM NaCl

GFP (238 aa, 26,9 kDa) ist ein Protein aus der Qualle Aequorea victoria, das bei Anregung mit blauem oder ultraviolettem Licht grün fluoresziert.

- 1-2 Chromatographiesäulen mit ≈ 600 µl Q-Sepharose Material

o starker Anionenaustauscher

o Matrix Sepharose

o funktionelle Gruppe: quartäres Ammonium, -O-CH2N+(CH3)3

- 1-2 Chromatographiesäulen mit ≈ 600 µl SP-Sepharose Material

o starker Kationenaustauscher

o Matrix Sepharose

o funktionelle Gruppe: Sulfopropyl, -O-CH2CHOHCH2OCH2CH2CH2SO3-

- Pufferkomponenten:

1 M Tris pH 7,0; 1M Tris pH 7,5 ; 1 M Tris pH 8,0; 1 M Tris pH 8,5; 1 M MES pH 6,5; 1 M MES pH 5,5;

- 5 M NaCl

GFP-Reinigung - Beeinflussbare Parameter bei der Ionenaustauschchromatographie

5

Wichtig: Im GFP-Rohextrakt, der Ihnen zur Verfügung gestellt wird, sind die Proteine in 10 mM Tris

pH 7,5 und 150 mM NaCl gelöst.

Unter diesen Bedingungen bindet das GFP Protein weder an die SP-Sepharose noch an die

Q-Sepharose optimal.

Damit das GFP während der Chromatographie an die Säulenmaterialen binden kann

müssen pH-Wert und/oder Salzkonzentration geändert werden. Siehe dazu Seiten 5 und 6.

Der genaue Ablauf einer Säulenchromatographie wird auf den

n 7 und 8 beschrieben

Beeinflussbare Parameter bei der Ionenaustauschchromatographie

Ob ein Protein an einen Ionenaustauscher bindet hängt hauptsächlich von zwei Faktoren ab: - der Eigenladung des Proteins - der Ionenstärke des Puffers, in dem das Protein gelöst ist

Beide Faktoren können bis zu einem gewissen Grad beeinflusst werden. Die Eigenladung eines Proteins hängt neben seiner Aminosäurezusammensetzung vom pH-Wert

des Puffers ab. Ein Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 7,0 ist bei pH 7,0 insgesamt nach

außen ungeladen. Senkt man den pH-Wert, werden Seitenketten protoniert (z.B. His, Asp, Glu)

und das Protein erhält eine positive Nettoladung. Erhöht man stattdessen den pH-Wert, werden

Seitenketten deprotoniert (z.B. His, Lys) und das Protein ist in der Summe negativ geladen.

Mit Hilfe des pH-Werts des Puffers, in dem ein Protein gelöst ist, kann deshalb zu einem gewissen

Grad beeinflusst werden, ob oder wie stark ein Protein an einen Ionenaustauscher bindet.

Allerdings sind die meisten Proteine bei einem zu niedrigen oder zu hohem pH-Wert nicht stabil. In

der Regel werden Puffer daher nur im pH-Bereich von 5,5 – 8,5 verwendet.

Die Ionenstärke des Puffers hängt von der Konzentration der gelösten Salze ab. Diese Konzentration

ist durch Verdünnen oder Zufügen von Salz leicht zu beeinflussen. Im Praktikum steht Ihnen NaCl

als Salzkomponente für Ihre Reinigungspuffer zu Verfügung.

Damit das GFP an eines der Säulenmaterialen binden kann, muss also der pH-Wert und/oder die

Salzkonzentration geändert werden. Probieren Sie aus, was funktioniert.

Ionenaustauschchromatographie Umpuffern und Verdünnen

6

Umpuffern einer Proteinlösung und Verdünnen der Salzkonzentration:

Den pH-Wert einer Proteinlösung kann man am schnellsten ändern, indem man die Proteinlösung

mit Puffer des gewünschten pH-Werts mischt. Dabei sollte die Konzentration der

Pufferkomponente im Puffer des Ziel pH-Werts deutlich höher sein, als in der Ausgangslösung.

Als Pufferkomponente stehen Ihnen jeweils 1 M Stocklösungen von MES pH 5,5, MES pH 6,5, Tris

pH 7,5, Tris pH 8,0 und Tris pH 8,5 zur Verfügung.

Stellen Sie Ihre Puffer jeweils auf 50 mM der Pufferkomponente ein. Bei dieser Konzentration

können Sie sicher sein, dass die 10 mM Tris pH 7,5 im GFP-Rohextrakt austritiert werden - auch

wenn Sie den Rohextrakt nur 1 : 2 (= 1 + 1) mit dem gewünschten Puffer mischen. Die

Konzentration der Pufferkomponente in Ihrem umgepufferten Rohextrakt wird niedriger sein als

50 mM (abhängig davon wie stark Sie verdünnen). Die Konzentration des Salzes (NaCl) ist in der

Regel deutlich höher; daher kann man die Pufferkomponente vernachlässigen, solange die Tris-

oder MES-Konzentration 50 mM nicht übersteigt. Auf eine exakte Einstellung der Tris- oder MES

Konzentration im verdünnten Rohextrakt kann also verzichtet werden.

Beachten Sie aber, dass bei hohen Konzentrationen der Pufferkomponente (> 100 mM) die

Bindung des GFP doch durch die Pufferkomponente beeinflusst wird.

Die Salzkonzentration im GFP-Rohextrakt können Sie durch einfaches Verdünnen senken.

Beachten Sie bitte, dass Sie niemals mit reinem Wasser verdünnen, sondern immer mindestens

mit 50 mM Ihrer gewählten Pufferkomponente (pH-Wert muss eingestellt bzw. stabilisiert werden).

Beispiele für die Puffergestaltung

Beispiel 1: Ziel: Reinigung über Q-Sepharosesäule bei pH 8,0 und NaCl 50mM

Um das zu erreichen, verdünnen Sie den GFP-Rohextrakt (pH 7,5 ; 150 mM NaCl) 1 : 3 (ein Teil

Rohextrakt + 2 Teile Puffer) mit 50 mM Tris pH 8,0 ohne NaCl.

Ihre Q-Sepharose equilibrieren Sie mit einem Puffer, der 50 mM Tris pH 8,0 und 50 mM NaCl enthält

(gleiche Bedingungen wie im verdünnten Rohextrakt) und als Waschpuffer verwenden Sie ebenfalls

den Puffer pH 8,0, 50 mM NaCl. Für die Elution würden Sie dann Puffer mit 50 mM Tris pH 8,0 und

steigenden NaCl Konzentrationen verwenden.

Beispiel 2: Sie wollen testen, ob allein die Erhöhung des pH-Wertes auf pH 8,0 ausreicht, um GFP

effizient an die Q-Sepharose zu binden. D.h. Reinigung bei pH 8,0 und NaCl 150mM

Um das zu erreichen, verdünnen Sie Ihren Rohextrakt 1 : 2 (ein Teil Rohextrakt und ein Teil Puffer)

mit 50 mM Tris pH 8,0 /150 mM NaCl. Salzgehalt bleibt unverändert, während der pH-Wert durch

das 50 mM Tris auf pH 8,0 eingestellt wird.

Ihre Q-Sepharose equilibrieren Sie in diesem Beispiel mit 50 mM Tris pH 8,0 und 150 mM NaCl

(gleiche Bedingungen wie im verdünnten Rohextrakt) und als Waschpuffer verwenden Sie ebenfalls

50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl. Für die Elution würden Sie dann Puffer mit 50 mM Tris pH 8,0

und steigenden NaCl Konzentrationen (> 150 mM NaCl) verwenden.

(Achtung: Dies sind Beispiele, um die Vorgehensweise zu erklären. Wir wollen damit nicht

behaupten, dass GFP unter diesen Bedingungen an eines der beiden Säulenmaterialien bindet!)

Ionenaustauschchromatographie Ablauf Säulenchromatographie

7

Allgemeine Hinweise zum Umgang mit Chromatographiesäulen

- Das Säulenmaterial wurde als Suspension in 20 % Ethanol (verhindert Wachstum von

Mikroorganismen) in die Säulen gefüllt. VOR der ersten Benutzung muss das Material daher

mit Auftragspuffer equilibriert werden. Dazu werden mindestens 5 Säulenvolumen des

Puffers durch die Säule gespült!

- Vor jedem neuen „Lauf“ muss die Säule mit 5 Säulenvolumen des jeweiligen

Auftragspuffers neu equilibriert werden.

- Nach jedem Lauf muss die Säule mit mindestens 5 Säulenvolumen Puffer, der 1 M NaCl

enthält gewaschen werden, um fest bindende Proteine zu entfernen.

- Sie arbeiten im Praktikum mit sogenanntem Gravity flow, d.h. die Flüssigkeit fließt auf Grund

der Schwerkraft durch das Säulenmaterial. Dies verhindert ein vollständiges Trockenlaufen

des Säulenmaterials. Trotzdem muss die Säule bei „längerer“ (> 1h) Nichtbenutzung muss

die Säule an beiden Enden verschlossen werden. Bitte heben Sie also die Kappen und

Stopfen auf! Die Säulen werden in zukünftigen Kursen wiederverwendet.

Allgemeiner Ablauf eines Säulenlaufs

Der Ablauf einer Trennung lässt sich in verschiedene Schritte aufteilen:

Nachdem die Säule mit dem Laufpuffer equilibriert ist, wird die Proteinlösung aufgetragen.

Entsprechend ihrer physikalischen Eigenschaften werden manche Proteine zurückgehalten, andere

nicht. Der Durchlauf mit den nicht gebundenen Proteinen wird aufgefangen.

Anschließend wird die Säule mit mindestens 5 Säulenvolumen Laufpuffer gewaschen, um alle nicht

bindenden Proteine auszuwaschen. Die Waschlösung wird in Fraktionen von jeweils ca. 1

Säulenvolumen aufgefangen.

Anschließend können die gebundenen Proteine durch Erhöhung des Salzgehalts im Elutionspuffer

schrittweise eluiert werden. Im Grundpraktikum erfolgt die Elution durch einen einfachen

„Stufengradienten“: Die Säule wird mit jeweils 2 Volumen Puffer mit höherem Salzgehalt gespült, die

Elution fraktioniert aufgefangen. Dann wird die Säule erneut mit Puffer mit noch höherem Salzgehalt

gespült, die Elution wieder fraktioniert aufgefangen usw.

- Säule mit dem gewählten Auftragspuffer equilibrieren (5 Säulenvolumen)

- Proteinextrakt auf den gewünschten pH-Wert und Salzkonzentration einstellen (siehe oben)

- Proteinextrakt auftragen und Durchlauf (D) in einem Eppi auffangen

- Zum Waschen 1 Säulenvolumen Laufpuffer auftragen und Durchlauf auffangen (W1)

- Waschschritt 4 mal wiederholen (W2 – W5)

- 1 Säulenvolumen der ersten Gradientenstufe auftragen und Eluat auffangen (E11)

- Schritt wiederholen (E12)

- 1 Säulenvolumen der zweiten Gradientenstufe auftragen und Eluat auffangen (E21)

- Schritt wiederholen (E22)

- ….

Ionenaustauschchromatographie Ablauf Säulenchromatographie

8

- Gradienten mit NaCl werden in der Regel bis 1 M NaCl gefahren; da Sie die Elution des GFP

optisch verfolgen können, wissen Sie bei welchem Salzgehalt das GFP vollständig von der

Säule entfernt ist und können den Stufengradienten an dieser Stelle stoppen.

- Um alle restlichen Proteine von der Säule zu entfernen, 5 Säulenvolumen Puffer mit 1 M

NaCl auftragen. Wenn Sie sehen konnten, dass das GFP bereits vorher komplett eluiert

wurde, müssen Sie diese Fraktionen nicht mehr sammeln.

Ionenaustauschchromatographie Planen & Testen von Reinigungsbedingungen, Tag 1 & 2

9

Entwicklung einer Reinigungsstrategie für das GFP Protein durch Ionenaustausch-chromatographie Ihre Aufgabe im Praktikum ist es Bedingungen zu finden, unter denen das GFP an die SP-Sepharose

oder an die Q-Sepharose bindet und dann einen Teil Ihres GFP-Rohextrakts unter diesen

Bedingungen über die Säule zu reinigen.

Die Testbedingungen werden pro Saal festgelegt, die Ergebnisse der verschiedenen Test-

bedingungen werden zusammengetragen und dann kann jede Gruppe die Bedingungen für eine

„quantitative“ Reinigung festlegen.

Durchführung:

1. Die Gruppen eines Saales entscheiden gemeinsam welche Bedingungen (Säulenmaterial,

Salzgehalt, pH-Wert) getestet werden sollen. Pro Saal sollte sich dabei eine in etwa

systematische Erprobung bestimmter Parameter ergeben.

In jedem Fall muss jede Gruppe zwei verschiedene Bedingungen testen!

Die Aufteilung der verschiedenen Bedingungen pro Saal wird auf je einer (fahrbaren)

Tafel tabellarisch dokumentiert. In diese Tabelle werden im Laufe der Woche die

Ergebnisse der qualitativen Testläufe und die Verteilung der Bedingungen der

quantitativen Reinigung eingetragen. (Am Ende der Woche Foto machen (lassen); wir

stellen das Bild dann für jeden abrufbar auf die online-Plattform.)

2. Anschließend legt jede Gruppe für sich fest, mit welchen Puffern und mit welchen Volumina

Sie den GFP-Rohextrakt umpuffern bzw. verdünnen. Mit welchen Puffern wollen Sie die

Säulen jeweils equilibrieren, womit waschen Sie nach dem Auftrag, mit welchen Puffern

eluieren Sie? Wie viel der Puffer müssen Sie ansetzen, wie setzen Sie die Puffer an usw.

Es ist sinnvoll wenn Sie die Puffer heute schon ansetzen!

3. Verwenden Sie zum Testen Ihrer Reinigungsbedingungen jeweils 100 µl des ausgegebenen

Rohextrakts. Zur Auswertung der Tests bestimmen Sie die Fluoreszenz aller Fraktionen

unter der UV-Lampe. Notieren Sie die Ergebnisse Ihrer Testläufe in der Tabelle an der

Tafel.

Während der Testläufe notieren sie bitte folgende Informationen / Werte und tragen

Sie diese in die Arbeitsblätter (Vorlagen: Seiten 13 - 16) ein (Betreuer zeichnen ab!):

- Säulenmaterial

- pH-Wert des Testlaufs

- Salzkonzentration des Auftrags/Waschpuffers

- Verdünnung des Rohextrakts (Wie viel Rohextrakt mit wie viel von welchem Puffer)

- Salzkonzentration und Volumen der Elutionen

- Fluoreszenz (unter UV-Lampe) von

+ Durchlauf

+ Waschfraktion 1 – 5

+ Elutionsfraktionen

(Wertung mit keine, wenig, mittel ,stark oder -, +, ++, +++)

Ionenaustauschchromatographie Planen & Testen von Reinigungsbedingungen, Tag 1 & 2

10

Detektion des GFP in den Säulenfraktionen:

Die optische Detektion des GFP ist einfach. Unter optimalen Bedingungen (Bindung an die

Säule, scharfe Elution) sehen Sie die grün-gelbe Fluoreszenz des Proteins auch bei

Tageslicht. Noch einfacher ist es, die Eppendorftubes mit den verschiedenen Fraktionen an

der UV-Lampe (366 - 395 nm) zu betrachten (Achtung! Schutz von Haut und Augen). Unter

diesen Bedingungen leuchtet GFP sehr stark.

Die Detektion per Auge bei Tageslicht oder an der UV-Lampe erlaubt nur eine qualitative,

keine quantitative Aussage über die GFP Konzentration in den Fraktionen. Quantitativ

kann die Reinigung nur über Photometermessungen ausgewertet werden.

Für die Testläufe reicht die Detektion des GFP über das bloße Auge und das anstrahlen

der Fraktionen mit der UV-Lampe aus.

Entscheiden Sie auf Grund der Testreinigungen des Saales, welches die besten

Reinigungsbedingungen sind. Verteilen Sie optimale aber auch nicht-optimale

Bedingungen unter den Gruppen eines Saales.

Ionenaustauschchromatographie Arbeitsblätter Testläufe- Beispiel

11

Schematische Darstellung

1. Festlegung der Versuchsbedingungen: Säule: SP-Sepharose Auftragsbedingungen: pH 7, 0; 100 mM NaCl

2. Herzustellende Puffer:

Verdünnungspuffer (Einstellen von pH-Wert und Salzgehalt im Rohextrakt)

50 mM Tris pH 7,0 / 50 mM NaCl / 1 ml

Pufferkomponente Salz Wasser (H2Obidest)

Stock 1 M Tris pH 7,0 5 M NaCl

eingesetzt 50 µl 10 µl 940 µl

Laufpuffer (äquilibrieren der Säule, Waschen der Säule nach Auftrag Rohextrakt)




eingesetzt 500 µl 200 µl 9,3 ml

Elutionspuffer 1

50 mM Tris pH 7,0 / 200 mM NaCl / 1,5 ml




Elutionspuffer 2





Elutionspuffer 3





Elutionspuffer 4





Säulenreinigungspuffer




eingesetzt 250 µl 1000 µl 3,75 ml

Ionenaustauschchromatographie Arbeitsblätter Testläufe- Beispiel

12

3. Säulen-Äquilibrierung:

Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen; 3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen); durchtropfen lassen

4. GFP-Rohextrakt verdünnen GFP Rohextrakt ist: 10 mM Tris pH 7,5 / 150 mM NaCl GFP soll: 50 mM Tris pH 7,0 / 100 mM NaCl Verdünnung 1 : 2 (= 1 + 1): 100 µl GFP-Rohextrakt + 100 µl Verdünnungspuffer mischen

5. Verdünnten GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren); Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi = D (Durchlauf)

Volumen D: ≈ 200 µl Fluoreszenz D: -

6. Säule Waschen mit 5 x 1 Volumen Laufpuffer 5 x 600 µl Laufpuffer vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren, jeweils in 1,5 ml Eppis sammeln = W1, W2, W3, W4, W5 ( W = Waschen)

Volumen W1: ≈ 600 µl Fluoreszenz W1: -

Volumen W2: ≈ 600 µl Fluoreszenz W2: +




7. Elution 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E22 analog mit Elutionspuffer 3 - 5

Volumen E11: ≈ 600 µl Fluoreszenz E11: -


Volumen E21: ≈ 600 µl Fluoreszenz E21: ++

Volumen E22: ≈ 600 µl Fluoreszenz E22: ++++

Volumen E31: ≈ 600 µl Fluoreszenz E31: ++

Volumen E32: ≈ 600 µl Fluoreszenz E32: +





8. Fluoreszenz an der UV-Lampe bestimmen, in Tabellen eintragen;

9. Säule waschen mit 3 ml Säulenreinigungspuffer

Ionenaustauschchromatographie Arbeitsblätter Testläufe – Testlauf 1

13

Arbeitsblatt Testlauf 1 – Ausfüllen und von Betreuer abzeichnen lassen!

1. Festlegung der Versuchsbedingungen: Säule: Auftragsbedingungen:




Stock

eingesetzt



Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 1


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 2


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 3


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 4


Stock

eingesetzt



Stock

eingesetzt


14


Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen; 3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen); durchtropfen lassen

4. GFP-Rohextrakt verdünnen GFP Rohextrakt ist: 10 mM Tris pH 7,5 / 150 mM NaCl GFP soll: Verdünnung:

5. Verdünnter GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren);

Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi= D

Volumen D: Fluoreszenz D:

6. Säule Waschen mit 5 x 1 Volumen Laufpuffer 5 x 600 µl Laufpuffer auf vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren, jeweils in 1,5 ml Eppis sammeln = W1, W2, W3, W4, W5

Volumen W1: Fluoreszenz W1:





7. Elution 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E22 analog mit Elutionspuffer 3 – 4

Volumen E11: Fluoreszenz E11:













15

Arbeitsblatt Testlauf 2 – Ausfüllen und von Betreuer abzeichnen lassen!





Stock

eingesetzt



Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 1


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 2


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 3


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 4


Stock

eingesetzt



Stock

eingesetzt


16


Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen;

3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen);

durchtropfen lassen


5. Verdünnter GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren); Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi= D

Volumen D: Fluoreszenz D:







7. Elution

1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E22 analog mit Elutionspuffer 3 – 4













Ionenaustauschchromatographie Aufreinigung von GFP, Tag 3 & 4

17


18

Reinigung von GFP Protein durch Ionenaustauschchromatographie

Im Folgenden wird GFP gereinigt und der Erfolg der Reinigung wird quantitativ bestimmt.

Durch Absorption bei 395nm kann GFP direkt detektiert und somit quantifiziert werden. Die

einzelnen Fraktionen enthalten jedoch weitere Proteine, die noch nicht vom GFP

abgetrennt wurden. Diese können durch eine Gesamtproteinbestimmung gemessen

werden. Wir bestimmen die Gesamtproteinmenge der einzelnen Fraktionen mittels

Bradford Assay (Seiten 20-21 und 24 Arbeitsblatt).

GFP (Absorption bei OD395nm) + Verunreinigung = Gesamtproteingehalt (Bradford Assay)

1. Jede Gruppe reinigt 700 µl Rohextrakt unter den zugeteilten Bedingungen.

Sammeln Sie alle Fraktionen der quantitativen Reinigung. Heben Sie den übrigen

Rohextrakt auf!

2. Messen Sie für ALLE Fraktionen und für den Rohextrakt, (pH/Salz eingestellter Rohextrakt)

die Absorption bei 395nm um die Konzentration an reinem GFP zu ermitteln. Die

Messungen bei 395nm sollten zwischen 0,1 und 0,8 liegen (linearer Bereich Photometer).

Bitte entsprechend verdünnen, z.Bsp. 400µl Fraktion + 400µl Puffer für schwach

fluoreszierende Proben und 100µl Probe + 700µl Fraktion für stärker fluoreszierende

Proben.

3. Bestimmen Sie auch die Gesamtproteinkonzentrationen ALLER Fraktionen mittels

Bradford-Assay (Seiten 20, 21 und 24 Arbeitsblatt).

4. Bestimmen Sie die spezifische (Seite.25) und Gesamtmenge an GFP in Ihrem Auftrags und

Ihren Elutionsfraktionen und vergleichen Sie diese.

5. Analysieren Sie Ihre GFP-Reinigung auf einem SDS-Gel. Tragen Sie folgende Proben auf

ein 12 % Gel mit 15er Kamm auf:

1: Marker 10 µL 6. Waschen 3 10 µl 11. Elution 22 5 µl

2: Auftrag 3 µl 7. Waschen 4 10 µl 12. Elution 31 5 µl

3. Durchlauf 3 µl 8. Elution 11 10µl 13. Elution 32 5 µl

4: Waschen 1 10 µl 9. Elution 12 5 µl 14. Elution 41 5 µl

5. Waschen 2 10 µl, 10. Elution 21 5 µl 15. Elution 42 5 µl

Proben vor dem Auftrag aufs Gel mit entsprechender Menge 5xSDS-Auftragspuffer

versetzen, 5 min auf 95°C im Heizblock erhitzen. Gesamtvolumen (Probe+Puffer) soll

15µl betragen, davon werden 10µl auf das Gel aufgetragen.

Nach dem Entfärben das Gel am Gel-Imager fotografieren und das Bild mit der

Gruppennummer speichern. Tragen Sie Ihre Auftragsreihenfolge inklusive

Reinigungsbedingungen und Salzkonzentration in den Elutionsfraktionen in Moodle ein.

Fotos und Auftragsschemata werden für die Auswertung im Protokoll online gestellt.


19

Für die quantitative Reinigung notieren Sie bitte folgende Informationen/Werte:

- Säulenmaterial

- pH-Wert

- Salzkonzentration des Auftrags/Waschpuffers

- Verdünnung des Rohextrakts (Wie viel Rohextrakt mit wie viel von welchem Puffer)

- Auftragsvolumen

- Volumen der Waschfraktionen

- Salzkonzentration der Elutionen

- Volumen der Elutionen

- Absorption bei 395 nm für alle Fraktionen

- Proteinkonzentration für alle Fraktionen

Siehe Arbeitsblätter „Quantitative Reinigung“ Seiten (22- 24)

Achtung:

- Bitte denken Sie daran von ALLEN Fraktionen einer Reinigung genug Probe sowohl für die Bestimmung der Absorption und der Proteinkonzentration, als auch zur Elektrophorese auf zu bewahren!!

- Das GFP Protein ist relativ unempfindlich und kann längere Zeit bei Raumtemperatur bearbeitet werden. Es ist aber sinnvoll, die Proben tagsüber auf Eis zu lagern und nachts bei -20 °C einzufrieren

Ionenaustauschchromatographie Bradford-Assay, Tag 4

20

Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen – Bradford-Assay:

Zur quantitativen Proteinbestimmung wird unter anderen der sogenannte Bradford-Assay

verwendet. Die Methode nutzt die Verschiebung des Absorptionsmaximums von Coomassie

Brilliant-Blau in Gegenwart von Proteinen im sauren Milieu von 465 nm zu 595 nm. Daher

beobachtet man beim Mischen einer Coomassie-Lösung in Ethanol und Phosphorsäure mit einer

Proteinlösung eine Farbverschiebung von rot-braun nach blau. Die Intensität der Blaufärbung kann

photometrisch bestimmt werden und korreliert in einem bestimmten Konzentrationsbereich mit der

Gesamtproteinkonzentration.

Um die Konzentration einer unbekannten Lösung bestimmen zu können, muss zunächst eine

Eichgerade erstellt werden. Dazu werden steigende Mengen einer Proteinlösung mit bekannter

Konzentration mit dem Bradford Reagenz gemischt und nach einer definierten Zeit im Photometer

gemessen. Trägt man die Absorption gegen die Proteinkonzentration auf, ergibt sich ein linearer

Anstieg der Absorption mit zunehmender Konzentration. Diese Eichgerade kann genutzt werden,

um die Konzentration einer unbekannten Probe zu bestimmen.

Materialien:

- BSA-Stocklösung 1 mg/ml

- H2Obidest

- Bradford-Reagenz (5x)

- Küvetten

- Photometer

- Pipetten

- Pipettenspitzen (weiß, gelb, blau)

- sterile Eppendorf Cups 1,5 ml

Versuchsdurchführung:

- H2O in beschrifteten Küvetten vorlegen

- BSA zugeben, Küvette mit Parafilm verschließen, mischen

- wenn alle Küvetten fertig und das Photometer frei ist:

Bradford-Reagenz zugeben, mischen, 5 min. inkubieren, mischen

- messen am Photometer bei 595 nm

Referenz = Spalte 1 in Tabelle Nullwert einstellen

(Messwert Spalte 2 vermutlich < 0,1 und Messwert Spalte 10 vermutlich > 1,0 eventuell

nicht mehr im linearen Messbereich des Photometers; beim Erstellen der Eichgerade

beachten)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

H2O (µl) 800 799 798 797 796 795 793 790 785 780

BSA-Lsg. (1mg/ml) (µl) 0 1 2 3 4 5 7 10 15 20

5xBradford-Lsg. (µl) 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

Messwert: 0

Ionenaustauschchromatographie Bradford-Assay, Tag 4

21

Proben der Reinigung messen (Gesamtproteinbestimmung):

Der gemessene Wert sollte größer 0,1 und kleiner 0,9 sein (Linearität des Photometers);

Vergessen Sie nicht bei der Berechnung der Gesamtproteinkonzentration das gemessene

Probenvolumen mit einzurechnen!

Setzen Sie Ihre Proteinbestimmung wie folgt an:

x µl Proteinlösung

800 – x µl H2O

200 µl Bradford-Lösung

Vorgehen wie bei der Erstellung der Eichgerade:

H2O vorlegen, Proteinlösung zugeben, mischen, Bradford-Lösung zugeben, mischen, 5

min. inkubieren, messen;

Fraktion µl Bemerkung

Auftrag 1 – 5 pH/Salz eingestellter

Rohextrakt

Durchlauf 1 – 10 -

Waschfraktionen 5 – 50

die erste Waschfraktion sollte ähnlich viel Protein enthalten wie der Durchlauf, die letzte

Waschfraktion sollte (fast) kein Protein enthalten

Elutionsfraktionen 5 – 50 alle aufgefangenen Fraktionen

messen

Ionenaustauschchromatographie Arbeitblätter - Quantitative Reinigung

22

Arbeitsblatt Quantitative Reinigung – Ausfüllen und von Betreuer abzeichnen lassen!





Stock

eingesetzt



Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 1


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 2


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 3


Stock

eingesetzt

Elutionspuffer 4


Stock

eingesetzt



Stock

eingesetzt


23

3. Säulen-Äquilibrierung: Säule öffnen, Flüssigkeit (30 % Ethanol) austropfen lassen; 3 ml Laufpuffer auftragen (600 µl Säulenvolumen => 3 ml = 5 x 600 µl = 5 Säulenvolumen); durchtropfen lassen


5. Verdünnter GFP-Rohextrakt auftragen (vorsichtig auf Säulenoberfläche pipettieren); Durchlauf auffangen in 1,5 ml Eppi= D

Volumen D:


Volumen W1:

Volumen W2:

Volumen W3:

Volumen W4:

Volumen W5:

7. Elution 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E11 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 1 auftragen, sammeln = E12 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 1 Säulenvolumen = 600 µl Elutionspuffer 2 auftragen, sammeln = E21 analog mit Elutionspuffer 3 - 4

Volumen E11: Volumen E31:




8. Absorbtion aller Proben messen bei 395 nm, in Tabellen eintragen;

Sie benötigen vermutlich unterschiedliche Volumina, um vernünftige Werte für E zu

bestimmen. Notieren Sie daher bei den einzelnen Fraktionen auch die für die E Bestimmung verwendeten Volumina. Als Referenz zum Nullen des Photometers verwenden Sie die jeweiligen Puffer. Achtung: Mindestens 800 µl Volumen für die Messung in die Küvette geben, da sonst die Flüssigkeit nicht im Strahlengang des Photometers ist.

Volumen verwend.

OD Volumen verwend.

OD

E(395) D (Rohextrakt) E(395) E12 (Elution 12)

E(395) D (Durchlauf) E(395) E21

E(395) W1 (Waschen 1) E(395) E22

E(395) W2 E(395) E31

E(395) W3 E(395) E32

E(395) W4 E(395) E41

E(395) W5 E(395) E42


24

9. Proteinkonzentration bestimmen für alle Fraktionen: Sie benötigen unterschiedliche Volumina, um vernünftige Werte für die Protein-konzentrationen zu bestimmen. Beachten Sie, dass die Absorption im Bereich zwischen 0,1 und 0,8 liegen muss, da das Photometer im Bereich < 0,1 und > 0,8 nicht linear misst. Vorschläge, wie viel µl Sie bei der Proteinbestimmung für die einzelnen Fraktionen testen könnten, finden Sie auf Seite 21. Abhängig von Ihrem Versuchsverlauf müssen Sie aber eventuell andere Werte einsetzen. Notieren Sie daher bei den einzelnen Fraktionen auch die für die für die Proteinkonzentrations-Bestimmung verwendeten Volumina.

Volumen verwend.

OD Volumen verwend.

OD

E(595) D (Rohextrakt) E(595) E12 (Elution 12)

E(595) D (Durchlauf) E(595) E21

E(595) W1 (Waschen 1) E(595) E22

E(595) W2 E(595) E31

E(595) W3 E(595) E32

E(595) W4 E(595) E41

E(595) W5 E(595) E42


Ionenaustauschchromatographie Auswertung GFP - Reinigung

25

Auswertung der Reinigung: Ziel einer Proteinreinigung ist es, das Protein möglichst rein, in guter Ausbeute und in hoher

Konzentration zu erhalten. Die spezifische Menge des Zielproteins (mg GFP pro mg

Gesamtprotein) und die Gesamtmenge des Zielproteins (GFP) sind zwei Parameter, mit denen

eine Reinigung beurteilt werden kann.

Die spezifische Menge gibt Auskunft darüber wie rein das Protein ist.

Die spezifische Menge MS(GFP) = Menge GFP pro mg Gesamtprotein P(gesamt) [mg/mg].

Dieser Wert ist angelehnt an die spezifische Aktivität von Enzym-Präparationen, die in Units/mg

angegeben wird (je größer, umso reiner ist das Enzym). Im Gegensatz zur spezifischen Aktivität ist

die spezifische Menge eine reine Zahl ohne Einheit. Sie gibt das Verhältnis von GFP zu noch

vorhandenen Verunreinigungen an. Zu Beginn der Reinigung ist MS(GFP) deutlich kleiner 1. Im

Verlauf der Reinigung wird MS(GFP) größer bis im Idealfall bei einer homogenen (= reinen) GFP

Fraktion die Zahl 1 erreicht wird. (MS(GFP) kann niemals größer 1 sein! Warum?)

Zur Berechnung von MS(GFP) benötigen Sie die Menge GFP pro Volumeneinheit und die

Gesamtmenge Protein pro Volumeneinheit.

GFP wird photometrisch durch Messung der Absorption bei 395 nm bestimmt. Mit dem

spezifischen Extinktionskoefizienten von GFP ε397nm= 30000 cm-1M-1 kann mit Hilfe des Lambert-

Beerschen Gesetzes die molare Konzentration und daraus die Menge an GFP (MW = 28500g/mol)

berechnet werden. Das Gesamtprotein Ihrer Fraktionen erhalten Sie aus der quantitativen

Proteinbestimmung mit dem Bradford-Assay.

Die Gesamtmenge (GFP) gibt Auskunft darüber, wieviel des Zielproteins man gereinigt hat.

Die Konzentration und damit die Menge an GFP ergibt sich aus den photometrischen Messungen

und Berechnung nach dem Lambert-Beerschen Gesetz (siehe unten). Wichtig bei der

Berechnung der Gesamtmenge an Zielprotein (GFP) ist es, die unterschiedlichen Volumina

der verschiedenen Reinigungsstufen mit ein zu beziehen. Die Gesamtmenge an Zielprotein

wird während einer Reinigung kleiner, da bei jedem Reinigungsschritt auch Zielprotein verloren

geht.

Bei der Entwicklung einer Reinigungsstrategie ist es immer von Bedeutung beide Faktoren,

spezifische Menge und Gesamtmenge des Zielproteins, zu berücksichtigen. Wenn viel Protein

benötigt wird, macht es wenig Sinn eine Säule zu verwenden, die die spezifische Menge zwar

stark erhöht , aber auf der sehr viel Zielprotein verloren geht (= hohe Reinigung bei geringer

Ausbeute).

Wird dagegen hochreines Protein in relativ geringer Menge benötigt, kann es sinnvoll sein, einen

Reinigungsschritt mit geringer Ausbeute (weniger als 50% „recovery“) aber hoher Reinigungs-

Effizienz zu verwenden. Ausbeute und Reinigungseffizienz müssen sich aber nicht unbedingt wie

entgegengesetzte Ziele verhalten. In der Labor-Praxis wird daher viel Zeit dafür verwendet,

Reinigungsbedingungen mit guter Effizienz UND guter Ausbeute zu finden.

Lambert Beer´sches Gesetz: A()= ε() .c . d

A() - Absorption bei Wellenlänge

ε() - molarer Absorptionskoeffizent bei der Wellenlänge λ (L mol-1cm-1) c - Konzentration (mol L-1) d - Schichtdicke der Küvette in cm

Taq-Polymerase Reinigung

26


27

Die Konzentration vieler Proteine in Ihren natürlichen Quellen ist sehr gering. Dies macht Ihre Reinigung direkt aus der natürlichen Quelle arbeits- und zeitaufwendig, mitunter sogar kostenintensiv. Viele Proteine lassen sich aber durch Verwendung geeigneter Expressionssysteme (siehe auch induzierte Genexpression) in (relativ) großen Mengen in Bakterien, Hefen oder speziellen Zellkulturen herstellen. Man verwendet sogenannte Expressionsplasmide, die neben dem origin of replication für den Zielorganismus und einem Markergen auch alle DNA-Sequenzen enthalten, die für die Transkription des Gens im jeweiligen Wirtsorganismus notwendig sind. Im Wesentlichen sind das ein Wirts-spezifischer Promotor, an den die RNA-Polymerase bindet und mit der Trankription startet sowie ein Terminator, der das Ende der zu transkribierenden Sequenz signalisiert. Durch die Auswahl geeigneter Promotoren kann man erreichen, dass z.B. in Bakterien das heterolog exprimierte Fremdprotein bis zu 1 % der Zellmasse ausmacht.

Die Taq-Polymerase, die Sie reinigen werden, wurde im Bakterium BL21 unter Kontrolle des T7 Promotors nach Induktion mit IPTG exprimiert. Am Ende der codierenden Sequenz der Taq-Polymerase wurde (vor das Stop-Codon) die Sequenz für sechs Histidine eingefügt. Dies macht eine Affinitätsreinigung durch Bindung an Ni2+-Agarose möglich. Sie erhalten ein Zellpellet von Bakterien, in denen die Taq-Polymerase überexprimiert wurde. Der erste Schritt der Reinigung ist der Aufschluss der Bakterienzellen. Da die Taq-Polymerase ein sehr hitzestabiles Protein ist (stammt aus einem thermophilen Bakterium), können die Zellen durch eine Kombination aus enzymatischer Behandlung mit Lysozym und Inkubation bei 75°C lysiert werden. Lysozym ist ein Enzym, das Bakterienzellwände abbaut. Die anschließende Inkubation bei 75°C denaturiert die meisten E.coli Proteine. Dadurch wird die Zellmembran vollständig zerstört und der Zellinhalt in den Extraktions-im Puffer freigesetzt. Nicht nur die Zellmembranproteine werden durch die Hitze denaturiert (entfaltet), auch die meisten cytosolischen E. coli Proteine. Solange kein Detergenz die denaturierten Proteine in Lösung hält, werden entfaltete Proteine sehr schnell unlöslich und fallen aus. Daher können die meisten nicht gewünschten Proteine (E. coli Proteine, Lysozym) nach dem Hitzeschritt zusammen mit den Zelltrümmern abzentrifugiert werden. Nach der Zentrifugation befindet sich die Taq-Polymerase im wässrigen Überstand. Ammoniumsulfat ist ein antichaotropes Salz, mit dem Proteine gefällt werden können ohne sie zu denaturieren. Mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung wird der Überstand nach der Hitze-Denaturierung auf 45% (NH4)2SO4 eingestellt (die gesättigte Lösung entspricht hier 100%). Der Ansatz wird über Nacht im Kühlschrank gelagert. Die niedrige Temperatur unterstützt die Fällung, so dass die Taq-Polymerase durch Zentrifugation abgetrennt werden kann. Dieser Schritt dient vor allem der Konzentrierung der Taq-Polymerase, verunreinigende Proteine werden kaum abgetrennt. Das Protein-Pellet wird anschließend im Bindungspuffer für die Affinitäts-Reinigung gelöst. Bei der Affinitätschromatographie wird die starke und spezifische Bindung eines Proteins an einen Liganden für die Reinigung genutzt. Der Ligand wird an einer Säulenmatrix immobilisiert. Das Zielprotein bindet den Liganden, während andere Proteine in der wässrigen Lösung bleiben durch die Säule gespült werden. Im sog. „batch-Verfahren“ wird die Affinitäts-Matrix nicht in eine Säule gefüllt, sondern direkt im mit der Protein-Lösung inkubiert und durch leichte Zentrifugation vom Überstand abgetrennt bzw. gewaschen. Im Praktikum verwenden wir die Nickel-Affinitätschromatographie. Die Aminosäure Histidin kann mit dem Imidazol-Ring der Seitenkette als Ligand für Ni2+-Ionen dienen. Durch Anfügen von sechs aufeinanderfolgenden Histidinresten an die Aminosäuresequenz (=“His-Tag“) wird eine spezifische Bindung des Zielproteins, in unserem Fall die Taq-Polymerase, an Ni2+-NTA-Agarose erreicht. Auf dieser Matrix sind Ni2+-Ionen immobilisiert, sie haben aber noch eine freie Koordinations-Stelle für das His-Tag am Zielprotein. Verunreinigungen werden durch Waschen entfernt. Die Elution der Taq-Polymerase von der Ni2+-NTA-Agarose erfolgt durch Zugabe von Imidazol. Durch die hohe Imidazolkonzentration im Elutions-Puffer wird das His-Tag an der Taq-Polymerase von den Ni2+-NTA-Agarose-Beads verdrängt und sie befindet sich dann im Überstand.


28

Durch Dialyse gegen Lagerungspuffer werden das Imidazol und andere Salze aus der Taq-Lösung entfernt und die Lösung auf die für die Lagerung optimalen Bedingungen (pH, Salz und Glycerin-Konzentrationen) eingestellt.

Taq-Reinigung – Zellaufschluss, AS-Fällung, Tag 1

29

Materialien:

- Bakterienpellet (induziert)

- Lysozym-Lösung 20 mg/ml

- Lysozym-Aufschlusspuffer

- -Mercaptoethanol

- 10% SDS-Stock-Lösung

- 5 x SDS-Probenpuffer

- Pipetten

- Pipettenspitzen (gelb, blau)

- gesättigte Ammoniumsulfatlösung

- H2Obidest

- Eppendorf-Kühlzentrifugen

- sterile Eppendorf Tubes 2,0 ml

- Eisbad

- Thermomixer 75 °C


Thermomixer vorheizen auf 75 °C

Während der Reinigung entnehmen Sie auf verschiedenen Stufen Proben, die zur späteren

Auswertung der Reinigung verwendet werden. Diese Proben werden mit P1, P2, P3, ...

benannt und beschriftet. Sie werden wie angegeben behandelt und dann bis zur Analyse

eingefroren. Die Reinigungsschritte selbst erfolgen mit der Hauptmenge des Aufschlusses.

Bakterienpellet in 1,5 ml Lysozym-Aufschlusspuffer resuspendieren und in 2,0 ml Eppi

überführen (1000 µl Pipette, blaue Spitzen), auf Eis stellen;

20 µl Probe abnehmen und auf Eis stellen = P1

100 µl Lysozym-Lösung zur ca. 1,5 ml Bakteriensuspension zugeben, schnell mischen, 30 min

auf Eis inkubieren, hin und wieder mischen; (100 µl Pipette, gelbe Spitzen)

Aufschluss im Thermomixer bei 75 °C für 30 min inkubieren, hin und wieder mischen (was

beobachten Sie?)

Zentrifugieren: 30 min / maximale rpm / 4 °C, Eppendorf-Kühlzentrifuge

Überstand abnehmen und in frisches Eppi überführen;

16 µl Probe nehmen und auf Eis stellen = P2

Volumen der Hauptmenge des Überstands aus der Hitzedenaturierung abschätzen,

gleichmäßig auf zwei Eppis 1,5 ml verteilen

(1000 µl Pipette, blaue Spitzen)

Taq-Reinigung – Zellaufschluss, AS-Fällung, Tag 1

30

Lösung mit gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung auf 45 % Sättigung einstellen

Berechnung: (45 % x Volumen) geteilt durch (100 % - 45 %)

Bei 1,2 ml: 45 x 1,2 = 54

54 / 55 = 0,982 982 µl gesättigte AS-Lösung auf Gesamt-Überstand bzw.

491 µl pro Eppi

Erklärung: Die Menge Ammoniumsulfat ist in der verdünnten Lösung und der eingesetzten

gesättigten Lösung gleich. Damit gilt für unser Beispiel:

(1,2 ml + x ml) * 45% = x ml * 100%

Ausmultiplizieren und Umformen ergibt

1,2 ml * 45% = x ml * (100% - 45%)

woraus sich direkt die obige Formel ergibt.

mischen und über Nacht im Kühlschrank inkubieren

Behandlung der Proben P1, P2:

P1 zu 20 µl Probe 60 µl H2O geben, 20 µl 5 x SDS-Probenpuffer zugeben,

einfrieren auf – 20°C

P2 4 µl 5 x SDS-Probenpuffer zugeben, einfrieren auf – 20 °C

Taq-Reinigung – AS-Fällung, Affinitätsreinigung, Tag 2

31

Materialien:

- Ammoniumsulfatfällung

- Ni2+-NTA-Agarose, equilibriert in Bindungspuffer Ni2+-NTA

- Bindungspuffer Ni2+-NTA

- Pipetten



- Überkopf-Mischer



Ammoniumsulfatfällung zentrifugieren 30 min / 16.400 rpm / 4 °C, Eppendorf-Kühlzentrifuge

Überstand abnehmen und verwerfen

Protein-Pellets in je 100 µl Bindungspuffer Ni2+-NTA lösen, Schaumbildung vermeiden!,

vereinigen (in ein 1,5 ml Eppi überführen),

100 µl Ni2+-NTA-Agarosebead-Suspension zugeben;

Vor dem Pipettieren der Ni2+-NTA-Agarose:

- von einer gelben Spitze ca. 3 mm abschneiden und diese Spitze zum Pipettieren der Suspension

verwenden (die beads würden sonst die kleine Öffnung der Spitze verstopfen)

- vor dem Pipettieren die Suspension gut mischen (aber nicht vortexen!), da sich die Agarose-

beads schnell absetzen (Ni2+-NTA-Agarose ist resuspendiert in 1 Volumen Bindungspuffer

100 µl Ni2+-NTA-Agarose-Suspension entsprechen 50 µl Bead-Volumen)

Am Überkopf-Mischer über Nacht oder mindestens 3 Stunden bei RT inkubieren

Taq-Reinigung – Affinitätsreinigung, Tag 3

32

Materialien:

- Bindungsreaktion Ni2+-NTA-Agarose mit gelöster AS-Fällung

- Waschpuffer Ni2+-NTA

- Bindungspuffer Ni2+-NTA

- Elutionspuffer Ni2+-NTA

- Pipetten


- Eisbad




Bindungsreaktion der Ni2+-NTA-Agarose mit gelöster AS-Fällung zentrifugieren 2 min, 2000

rpm

vor Start der Zentrifuge Orientierung des Eppis merken Position des Pellets

Überstand abnehmen mit 100 µl Pipette, gelbe Spitze

Überstand langsam abpipettieren, Spitze von oben mit dem sinkenden Flüssigkeitsspiegel

mitführen; Spitze NICHT bis zum Eppi-Boden eintauchen um ein Aufwirbeln bzw.

Mitpipettieren der Beads zu vermeiden

Agarosebead-Pellet ist sehr schlecht zu sehen – lieber ca. 20 µl Überstand “stehen lassen“ als

die Beads einzusaugen;

Agarose-beads waschen: 2 x mit je 1 ml Bindungspuffer Ni2+-NTA

2 x mit je 1 ml Waschpuffer Ni2+-NTA

1 x mit je 1 ml Bindungspuffer Ni2+-NTA

(Welche unspezifischen Bindungen werden durch Waschen mit Hochsalz-Puffer einerseits

und mit Detergenz andererseits zerstört?)

nach jedem Waschschritt zentrifugieren 2 min, 2000 rpm

wieder gilt: Überstand sehr vorsichtig abnehmen, jeweils Orientierung des Eppis in der

Zentrifuge merken (siehe oben); NICHT die kompletten 1000 µl mit blauer Spitze

abpipettieren, sondern zunächst ca. 600 µl mit blauer Spitze von oben nach unten vorsichtig

abnehmen, dann mit gelber Spitze den Rest in 100 µl Schritten abpipettieren, eventuell 20 –

50 µl “stehen lassen“ um Verlust von Ni2+-NTA-Agarose zu vermeiden;

nach dem letzen Waschschritt Puffer sehr vorsichtig möglichst vollständig entfernen;

Eluieren der Taq-Polymerase von der Ni2+-NTA-Agarose

100 µl Elutionspuffer Ni2+-NTA zu den Agarose-beads geben, mischen, für 2 min. auf Eis

inkubieren; zentrifugieren und pipettieren wie oben

Überstand in frisches Eppi, keine beads mitschleppen! = Eluat 1 (E1)

Elution 2 x wiederholen (E2 – E3)

Je 5 µl von jeder Elutionsfraktion abnehmen, mit E1-S - E3-S beschriften und für spätere SDS-

Gelelektrophorese bei –20°C einfrieren

Taq-Reinigung – Dialyse, Tag 3

33

Materialien:

- Elutionsfraktionen E1-E3

- Lagerungspuffer

- Pipetten


- Dialysemembran mit Gummiringen

- Eisbad




Lagerungspuffer ansetzen (2 x 1 L für alle Gruppen) und in 1 L Flaschen auf Eis vorkühlen;

vor Dialyse in 1 L Becherglas überführen und Rührfisch reingeben; Becherglas in runde

Eisbox (ohne Eis) stellen, Becherglas mit Alufolie oder Parafilm verschließen, Eis um das

Becherglas herum auffüllen

Hauptmenge der Eluate E1 – E3 in einem Eppi ohne Deckel vereinigen, Schaumbildung

vermeiden!

Dialyse-Membran über Eppis mit Gummiring fixieren und durch Ziehen an Enden glätten;

Oberfläche muss wie bei einer Trommel gespannt und völlig faltenfrei sein!

mit Dialyse-Membran verschlossene Eppis in Schwimmer bis “auf Anschlag“ einsetzen und mit

der Membran nach unten in Lagerungspuffer platzieren (schräg einsetzen um Fangen von

Luftblasen unter Dialysemembran zu verhindern); sicherstellen, dass Proteinlösung

quantitativ aus der Eppi-Spitze nach unten auf die Dialysemembran gelaufen ist!

Deckel auf Eisbox, über Nacht unter Rühren dialysieren;

Dialysierte Taq-Polymerase-Lösung in frisches Eppi (1,5 ml) überführen und für die 3. Woche

(DNA-Analytik) bei -20 °C einfrieren. Merken Sie sich bitte, wo Ihre Taq-Polymerase gelagert

wird!

SDS-Gelelektrophorese

34

Native Protein können in einer Gelmatrix (für Proteine in der Regel aus Polyacrylamid (PAA)) nicht

der Größe nach getrennt werden. Die Ladung eines Proteins hängt von seiner

Aminosäuresequenz ab, Diese bestimmt auch die Faltung und damit die räumliche Struktur eines

Proteins. Proteine mit der gleichen Anzahl an Aminosäuren können völlig unterschiedliche

Ladungen aufweisen und von kompakter bis zu linearer Struktur unterschiedlich viel Raum

einnehmen.

Um Proteine der Größe nach aufzutrennen müssen sie zunächst denaturiert werden. Erhitzen auf

100°C und Zugabe eines starken Detergenzes (Natrium-Dodecylsulfat, SDS) führt dazu, dass

Proteine vollständig entfaltet werden und alle als lineare Aminosäurekette vorliegen. Durch Zugabe

eines Reduktionsmittels werden die Disulfid-Brücken innerhalb bzw. zwischen Aminosäureketten

aufgebrochen. Dodecylsulfat lagert sich gleichmäßig an diese Aminosäureketten an. Die

resultierenden Dodecylsulfat-Polypeptid-Komplexe weisen eine konstante Ladungsdichte auf

(Verhältnis Ladung pro Masseeinheit ist konstant) und haben eine annähernd lineare Form. Auf

diese Weise können Proteine in einer Matrix im elektrischen Feld nach ihrer Größe aufgetrennt

werden.

Die Porengröße eines PAA-Gels und damit die Auftrennung der Proteine wird hauptsächlich durch

die Konzentration an Acrylamid (8 – 20 %) und den Grad der Vernetzung bestimmt.

Im Praktikum verwenden wir die diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese. Dazu wird ein

niedrigprozentiges Sammelgel über ein hochprozentiges Trenngel gegossen. Der pH von 6,8 im

Sammelgel führt zusammen mit der Aminosäure Glycin im Puffer zu einer Fokusierung der

Proteinbanden. Im Trenngel werden die Proteine dann bei pH 8,8 der Größe nach aufgetrennt.

(Bitte Theorieteil zur diskontinuierlichen Gelelktrophorese lesen!)

Der blaue Farbstoff im Auftragspuffer (Bromphenolblau) zeigt die Lauffront während der

Elektophorese und dient NICHT zur Färbung der Proteine!

Die Färbung der Proteine erfolgt im Gel mit Coomassie-Brilliant-Blau. Dieser

Triphenylmethanfarbstoff bildet im sauren Milieu eine unprotonierte, anionische Sulfonatform aus,

die mit Proteinen Komplexe bildet. Der Farbstoff interagiert dabei mit den kationischen und den

nichtpolaren, hydrophoben Seitenketten. Je nach Aminosäurezusammensetzung können damit

100 ng – 1 µg Protein noch deutlich nachgewiesen werden. Für die Färbung wird das PAA-Gel in

einer Coomassie-Lösung in Essigsäure geschwenkt und nach ca. einer Stunde das überschüssige

Coomassie-Brilliant-Blau mit reiner 10 % Essigsäure wieder ausgewaschen. Die PAA-Matrix wird

klar und nur die Proteinbanden bleiben gefärbt.

Taq-Reinigung – SDS-Gel, Tag 3

35

Materialien:

- Proben P1, P2, E1, E2, E3

- nichtinduzierte Bakterienprobe = P0

- Proteinmarker Biorad

- Rotiphorese Gel 30 (= Acrylamid + Bisacrylamid-Lösung 30 + 0,8)

- Ammoniumperoxidisulfat-Lösung, 10 %

- SDS-Stocklösung, 10 %

- TEMED

- 1 M Tris, HCl pH 6,8

- 1 M Tris HCl, pH 8,8

- H2Obidest

- Isopropanol

- Coomassie-Lösung

- 10 % Essigsäure

- 70 % Ethanol, techn.

- Mini Protean 3 Kammer mit Gießstand, Glasplatten, Kämme

- sterile 50 ml Falcon-Röhrchen

- sterile 15 ml Plastik-Röhrchen

- Pipetten


- Sterile Glaspipetten

- Pipettierhilfe

- Eisbad

- Tisch-Zentrifugen


- Thermomixer, 95oC

- Glasschale

- Geldokumentationssystem


SDS-Gel gießen:

siehe Vesuchsbeschreibung S. 43 ff

Trenngel-Lösung ansetzen (unmittelbar vor dem Gießen, im Abzug!):

Substanz Konzentration im

Gel Stammlösung Pro 10 ml

Acrylamid-Lösung 30+0,8

10 % 30 %

Tris HCl pH 8,8 0,38 mol/l 1 mol/l

dd H2O - -

APS 0,1 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %

Taq-Reinigung – SDS-Gel, Tag 3 und 4

36

Acrylamid-Lösung, Tris HCl pH 8,8, dd H2O und SDS zusammen pipettieren und mischen (nicht

vortexen); APS und TEMED zugeben, mischen, sofort gießen; nach dem Gießen sofort mit ca.

1 ml Isopropanol vorsichtig überschichten (beseitigt Luftblasen von der Gelkante und stellt

ebene Gelkante sicher);

nach erfolgter Polymerisation (mind. 30 min) Isopropanol möglichst vollständig ablaufen

lassen, Sammelgel gießen.

Sammelgellösung ansetzen (unmittelbar vor dem Gießen, im Abzug!):



Acrylamid-Lösung 30 + 0,8

5 % 30 %


dd H2O - -

APS 0,13 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %

Acrylamid-Lösung, Tris HCl pH 6,8, dd H2O und SDS zusammen pipettieren und mischen; APS

und TEMED zugeben, mischen, sofort gießen; nach dem Gießen Kamm (10er Kamm)

einsetzen; Polymerisation mind. 30 min. Gel in nassem Fließpapier packen und in einer kleinen

Tüte oder Frischhaltefolie im Kühlschrank lagern.

Tag 4: Nach der vollständigen Polymerisation des Gels, die Gel-Kassette in die

Elektrophoreseeinheit einsetzen; Kammer mit Puffer füllen

Thermomixer auf 95°C vorheizen

Auftragsschema:

Spur Probe OD-Einheiten Volumen 5 x SDS-

Probenpuffer H2O

1 Marker - 10 µl - -

2 BL21DE3 nicht

induziert = P0, wird fertig gestellt

0,04 OD ? - -

3 BL21DE3 induziert =

P1 (schon fertig)

0,04 OD ? - -

4 P2 (schon fertig) 16 µl 4 µl -

5 E1-S 5 µl 2 µl 3 µl

6 E2-S 5 µl 2 µl 3 µl

7 E3-S 5 µl 2 µl 3 µl

8 BSA (1 mg/ml) 1 µl 2 µl 7 µl

9 BSA (1 mg/ml) 3 µl 2 µl 5 µl

Taq-Reinigung – SDS-Gel, Tag 3 und 4

37

Proben entsprechend der oben stehenden Tabelle vorbereiten;

Wie viel müssen Sie von den Proben P0 und P1 auftragen? (Zur Erleichterung der

Berechnung hier ein Beispiel: Sie starten mit 500 ml einer Bakterienkultur der OD 3,0; diese

zentrifugieren Sie ab und lysieren sie in 60 ml Puffer. Ihre imaginäre OD in diesem Lysat

beträgt dann (500x3)/60 = 25. Um 0,04 OD aufzutragen, bräuchten Sie also 0.04/25 = 0,0016

ml oder 1,6 µl.)

Ihr Bakterienpellet für die Reinigung entsprach bei 10 ml Kultur OD600 = 6,3 oder

entsprechend 63, wenn das Pellet in 1ml aufgenommen wird (OD600 63/ml) - da der Wert

Batch-abhängig ist, bitte nochmal vom Kursleiter bestätigen lassen.

Proben 5 min auf 95°C erhitzen, (Warum? Welche Funktion erfüllen die Zusätze -

Mercaptoethanol, Glycerin und SDS im Probenpuffer?), Proben P0 und P1 vortexen (2 min)

(Warum?), alle Proben kurz zentrifugieren;

Proben auftragen, falls nötig Auftragshilfe verwenden, Deckel schließen, Kammer an

Spannungsgerät anschließen, Elektrophorese bei 200 V bis Blaumarker (Bromphenolblau) die

untere Kante der Glasplatten erreicht hat; Blaumarker darf etwas rauslaufen!!

Gelkassette ausbauen, kleine Glasplatte vorsichtig mit einem dünnen Spatel aufhebeln und

abnehmen;

Gel in Glasschale mit ca. 50 – 100 ml Coomassie-Lösung überführen (nur mit feuchten

Handschuhen anfassen, sonst klebt es gerne mal fest und reißt)

1 h oder über Nacht färben

Coomassie-Lösung zurückschütten – Vorsichtig!!! Das Coomassie färbt auch die Proteine in

Ihrer Haut und Kleidung sehr gut.

Gel in der Glasschale vorsichtig spülen / schwenken mit H20, 10 % Essigsäure zugeben,

schwenken;

(Zugeben von einem (!) zusammengeknäultem Papiertuch hilft beim Entfärben, da es

Coomassie bindet; nicht aufs Gel legen, sondern daneben; auch Austauschen des Entfärbers

gegen frische 10 % Essigsäure beschleunigt natürlich das Entfärben.

Gel am Dokumentationssystem fotografieren, sobald der Gelhintergrund klar ist.


38

Unter der Expression eines Genes (= Genexpression) versteht man die Summe der Prozesse, die

in einer Zelle von der DNA-Sequenzinformation zum fertigen, funktionellen Protein führen. Im

Wesentlichen sind dazu zwei grundlegende zelluläre Prozesse notwendig:

- die Transkription der DNA-Sequenz in mRNA

- und die Translation der mRNA in eine Polypeptidkette.

Beide Prozesse sind vor allem in Prokaryonten und einzelligen Eukaryonten wie der Bäckerhefe

sehr genau untersucht.

Um eine DNA-Sequenz in mRNA zu transkribieren, müssen vor dem Startcodon und nach dem

Stopcodon bestimmte Signale vorhanden sein:

Der Promotor ist die DNA Sequenz vor Beginn des kodierenden Bereichs, der von der RNA-

Polymerase erkannt und gebunden wird und von dem aus die Transkription beginnt.

Der Terminator befindet sich nach dem Stopcodon und stellt sicher, dass die RNA-Polymerase die

Transkription am Ende des Gens einstellt.

Bakteriengene haben unterschiedliche Promotoren, die die Stärke der Transkription eines Gens

regulieren. Es gibt konstitutive Promotoren, die eine beständige (konstitutive) Transkription


39

sicherstellen. Andere Promotoren sind induzierbar, werden also erst angeschaltet, wenn ein

bestimmtes Signal zu ihrer Aktivierung führt. Diese induzierbaren Promotoren bewirken nach

Induktion meist eine schnelle und sehr starke Transkription.

Der Promotor des Lac-Operons, den Sie für die Induktion von GST-Fusionsproteinen (pGEX-

Plasmide) verwenden, ist so ein induzierbarer Promotor. Die Gene des Lac-Operons werden nicht

transkribiert, solange keine Lactose im Medium vorhanden ist. Die Zugabe von Lactose führt zur

Aktivierung des Lac-Promotors.

Im Praktikum wird für die Induktion an Stelle von Lactose das Analog IPTG verwendet, da dieses

nicht abgebaut werden kann und daher die Induktion lange aufrechterhält.

In Bakterien ist es auch möglich, Promotoren aus Phagen für die Transkription zu verwenden,

wenn man gleichzeitig im Bakterium die entsprechende Phagen RNA-Polymerase zur Verfügung

stellt.

Das zu exprimierende Gen steht in den pET-Vektoren unter der Kontrolle eines T7 Promotors

(spezifisch für den Phagen T7). Da die bakterielle RNA Polymerase diesen Promotor nicht erkennt,

können die Gene erst exprimiert werden, wenn die RNA-Polymerase des T7-Phagen vorhanden

ist. In einem der von Ihnen verwendeten Bakterienstämme ist das Gen für die Phagen T7-RNA-

Polymerase im bakteriellen Genom integriert. Dieses T7-RNA-Polymerase Gen steht wiederum

unter der Kontrolle des Lac-Promotors, so dass die Genexpression ebenfalls durch IPTG induziert

werden kann.

Solange keine Lactose (oder IPTG) im Medium vorhanden ist, wird keine T7-Polymerase gebildet

und Gene unter Kontrolle des T7 Promotors können nicht transkribiert werden. Zugabe von IPTG

führt zur Induktion der T7-Polymerase und das ACID Protein kann transkribiert werden.

Im Praktikum werden Sie Proteine in zwei verschiedenen Bakterienstämmen exprimieren und aus

den Induktionsergebnissen Rückschlüsse auf das verwendete Expressionssystem ziehen.

Die Auswertung der induzierten Expression erfolgt über die Analyse der Proteine in den

induzierten und nicht induzierten Bakterienkulturen. Die Proteinextrakte werden einfach durch

Aufkochen der Bakterien in SDS-Auftragspuffer hergestellt.

Um die verschiedenen Proben vergleichen zu können, müssen gleiche Mengen an Gesamt-Protein

aufgetragen werden.

Man kann davon ausgehen, dass Bakterien pro Zelle immer ungefähr die gleiche Menge an

Protein enthalten. Daher ist die Anzahl an Bakterien, die zum Herstellen der Proteinextrakte

verwendet wird auch ein Maß für die Proteinmenge, die darin enthalten ist. Gleiche Anzahl an

Bakterien bedeutet also in etwa gleiche Proteinkonzentration.

Die Anzahl an Bakterien in einer Kultur wird durch Messen der OD600 bestimmt. 1ml E. coli Kultur

mit einer OD600 von 1 enthält ungefähr 109 Bakterienzellen. Verwendet man gleiche „OD600

Äquivalente“ für die Herstellung der Proteinextrakte, werden immer in etwa die gleiche Anzahl an

Bakterien verwendet und damit die gleiche Proteinkonzentration für die Extrakte erhalten.

Der Unterschied zwischen den Proteinextrakten ist dann nur für das induzierte Protein zu sehen,

während alle anderen Protein-Banden die gleiche Intensität behalten.

Induzierte Genexpression – Duchführung, Tag 2

40

Materialien:

- LB-Medium

- Ampizillin-Stocklösung, 50 mg/ml

- Kanamycin-Stocklösung, 50 mg/ml

- Bakterienkulturen

- sterile 50 ml Falcon-Röhrchen

- sterile 15 ml Plastik-Röhrchen (= Spitzröhrchen)

- Pipetten


- Sterile Glaspipetten

- Pipettierhilfe

- IPTG Stocklösung 100 mM

- 70 % Ethanol, tech.

- 1 x SDS-Probenpuffer

- Plastikküvetten

- Photometer

- Schüttler, 37°C

- Eisbad

- Tisch-Zentrifugen

- Heizblock 100oC



Jede Gruppe erhält zwei Kulturen mit zwei verschiedenen Bakterienstämmen, die beide das

GLEICHE Plasmid enthalten. Untersucht wird die Induzierbarkeit der Expression in

Abhängigkeit vom Bakterienstamm!

Nachbargruppen an einer Arbeitsfläche sollen jeweils verschiedene Plasmide untersuchen.

z.B.:

Gruppe 1: Kultur BL21 mit pGEX und Kultur Top10F´ mit pGEX werden induziert;

Gruppe 2: Kultur BL21 mit pET-ACID und Kultur Top10 F´ mit pET-ACID werden induziert;

Gruppe 3: Kultur BL21 mit pGEX und Kultur Top10F´ mit pGEX werden induziert;

Gruppe 4: Kultur BL21 mit pET-ACID und Kultur Top10 F´ mit pET-ACID werden induziert;

.....

Arbeitsfläche desinfizieren mit 70 % EtOHtech

70 % Ethanol aufspritzen, mit Papiertuch verteilen, trocken wischen

LB-Medium mit Antibiotikum ansetzen

pro Kultur je 20 ml LB Medium mit entsprechendem Antibiotikum versetzen

(10 ml mehr als benötigt als back-up für mögliche Verdünnungsfehler)

Für pGEX-Kulturen: Ampizillin Stocklösung 50 mg/ml

Endkonzentration Ampizillin 50 µg/ml

Für pET-ACID-Kulturen: Kanamycin Stocklösung 50 mg/ml

Endkonzentration Kanamycin 30 µg/ml

Übernachtkultur im 50 ml Röhrchen aufschütteln (mischen) und 2 ml Kultur mit 1000 µl Pipette

in 15 ml Röhrchen überführen

Induzierte Genexpression – Duchführung, Tag 2

41

10 ml LB mit entsprechendem Antibiotikum zugeben (= verdünnen der Kultur 1 : 6),

Glaspipette verwenden

Gut mischen, 3 ml der Verdünnung entnehmen, in frisches Röhrchen überführen und auf Eis

stellen = nicht induzierte Probe

die verbleibenden 9 ml der verdünnten Bakteriensuspension mit IPTG induzieren;

Endkonzentration von 0,5 mM (Stocklösung IPTG: 100 mM)

induzierte Bakterienkultur in 37°C Schüttler stellen und schütteln (normalerweise würde man

das Kulturröhrchen nicht so hoch befüllen, um gute Durchmischung und Belüftung zu

gewährleisten)

Nach einer Stunde Inkubation im 37°C-Schüttler: gründlich mischen und 3 ml der induzierten

Kultur entnehmen, in frisches Röhrchen überführen und auf Eis stellen = Probe nach 1 h

Induktion

die verbleibenden 6 ml der Kultur im 37°C-Schüttler weiter inkubieren

nach 3 Stunden Inkubation (gerechnet vom Zeitpunkt der IPTG Zugabe) Bakterienkultur aus

dem Schüttler nehmen und auf Eis stellen = Probe nach 3 h Induktion

Von allen drei Proben (nicht induzierte Probe, Probe nach 1 h Induktion, Probe nach 3 h

Induktion) OD600 bestimmen:

1 ml LB in Plastikküvette pipettieren = Referenz; je 1 ml der Proben in Plastikküvetten

pipettieren, OD600 gegen Referenz bestimmen;

je 0,4 OD600 der Proben abzentrifugieren in Eppendorf-Tischzentrifuge (1 min bei 10.000 rpm);

Überstand abnehmen (Autoklavierabfall!), Bakterienpellet resuspendieren in 100 µl 1 x SDS-

Proben-Puffer (Achtung! DTT – im Abzug pipettieren);

Berechnung von 0,4 OD600:

Annahme: Sie bestimmen für Ihre Bakterienkultur eine optische Dichte

von 0,8 pro ml 0,5 ml entsprechen einer OD600 von 0,4 (= das würden Sie messen, wenn

die 0,5 ml mit LB auf 1 ml aufgefüllt würden) 0,5 ml abzentrifugieren

Proben beschriftet bei –20 °C einfrieren

Induzierte Genexpression–SDS-Gelelktrophorese,Tag 2

42

Materialien:

- nicht induzierte und induzierte Proben in 1 x SDS

- Proteinmarker Fermentas

- Rotiphorese Gel 30 (= Acrylamid + Bisacrylamid-Lösung 30 + 0,8)

- Ammoniumperoxidisulfat-Lösung, 10 %

- SDS-Stocklösung, 10 %

- TEMED

- 1 M Tris HCl pH 6,8

- 1 M Tris HCl, pH 8,8

- H2O

- Isopropanol

- Mini Protean 3 Kammer mit Gießstand, Glasplatten, Kämme

- 70% Ethanol, techn.

- sterile 50 ml Röhrchen

- sterile 15 ml Röhrchen

- Pipetten


- sterile Glaspipetten

- Pipettierhilfe

- Eisbad

- Tisch-Zentrifugen

- Thermomixer, 95oC


- Coomassie-Lösung

- 10 % Essigsäure

- Glasschale


Thermoschüttler auf 95°C vorheizen

Proben auftauen

Proben vortexen, 3 x 20 sec

Proben erhitzen auf 95°C, 5 min

Proben vortexen, 3 x 20 sec

bis zum Auftrag auf Eis lagern


43

SDS-Gel gießen:

Gelelektrophorese-System vorbereiten:

In der Abbildung sehen Sie alle Komponenten, die für den Lauf eines SDS-Gels mit dem Mini Protean 3 System benötigt werden. Zunächst alle Teile säubern (falls notwendig); Glasplatten mit Spülmittel und heißem Wasser reinigen, mit 70 % EtOHtech spülen und trocknen

.

Glasplatten in Gießstand einsetzen:

- Plattenhalter auf eine ebene Fläche stellen, Andruck-Klammern offen

- eine kurze Glasplatte auf eine Spacerplatte legen

- beide Glasplatten in die Plattenhalter einsetzen, Markierung an der Spacerplatte nach

oben, kleine Glasplatte nach vorne

- beide Glasplatten müssen eben auf dem Untergrund anstehen

- beide Andruck-Klammern schließen

- kontrollieren Sie, dass beide Glasplatten unten parallel auf gleicher Höhe sind;

- Gel-Kassette in den Gießstand einsetzen und fixieren; die Glasplatten müssen eben

auf dem Gummi aufliegen, die Halterung presst die Glasplatten auf den Gummi und

dichtet das Gel unten ab;

Kamm zwischen die Platten stecken, kleine Platte markieren ca. 1 cm unter dem Kamm

Gießhöhe des Trenngels; Kamm wieder entfernen;


44

Trenngel-Lösung ansetzen (unmittelbar vor dem Gießen, im Abzug!):




15 % 30 %


dd H2O - -

APS 0,1 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %

Acrylamid-Lösung, Tris HCl pH 8,8, dd H2O und SDS zusammen pipettieren und mischen

(nicht vortexen); APS und TEMED zugeben, mischen, sofort gießen; nach dem Gießen sofort

mit ca. 1 ml Isopropanol vorsichtig überschichten (beseitigt Luftblasen von der Gelkante und

stellt ebene Gelkante sicher);

Nach erfolgter Polymerisation (mind. 30 min) Isopropanol möglichst vollständig ablaufen

lassen, Sammelgel gießen; Sammelgellösung ansetzen (unmittelbar vor dem Gießen, im

Abzug!):




5 % 30 %


dd H2O - -

APS 0,13 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %

Acrylamid-Lösung, Tris HCl pH 6,8, dd H2O und SDS zusammen pipettieren und mischen;

APS und TEMED zugeben, mischen, sofort gießen bis zum Rand; nach dem Gießen Kamm

einsetzen (für die induzierte Genexpression 10er), Einschluss von Luftblasen unter dem

Kamm vermeiden;

Polymerisation mind. 30 min.

Gel in mit feuchtem Papier abdecken und in Folie (oder frische Tischabfall-Tüte) eingepackt im

Kühlschrank lagern.


45

Nach der vollständigen Polymerisation des Gels, die Gel-Kassette aus dem Gießstand

nehmen und in die Elektrophoreseeinheit einsetzen; Orientierung der kleineren Glasplatte

nach innen;

die Elektrophoreseeinheit mit den Gel-Kassetten in die Halterung einsetzen; die

Elektrophoreseeinheit nach unten drücken und die Klammern schließen;

die Halterung in den Elektrophorese-Tank einsetzen

innere Kammer bis knapp unter den Rand der großen Glasplatte mit 1 x SDS-Laufpuffer füllen (ca. 125 ml); äußere Kammer mit mind. 200 ml 1 x SDS-Laufpuffer füllen;

die für 5 min. auf 95oC erhitzten und gevortexten Proben kurz anzentrifugieren – Eppendorf-Tischzentrifuge, quick run 10 sec;

Auftragsschema: Reihenfolge beachten und notieren!!

Slot Probe OD-

Einheiten Volumen

1 Marker 10 µl

2 Plasmid pGEX bzw. pET-ACID, TOP 10, vor Induktion 0,04

3 Plasmid pGEX bzw. pET-ACID, TOP 10, 1h Induktion 0,04

4 Plasmid pGEX bzw. pET-ACID, TOP 10, 3h Induktion 0,04

5 Plasmid pGEX bzw. pET-ACID, BL21DE3, vor Induktion 0,04

6 Plasmid pGEX bzw. pET-ACID, BL21DE3, 1h Induktion 0,04

7 Plasmid pGEX bzw. pET-ACID, BL21DE3, 3h Induktion 0,04

Proben auftragen, falls nötig Auftragshilfe verwenden, Deckel schließen, Kammer an Spannungsgerät anschließen, Elektrophorese bei 200 V bis Blaumarker die untere Kante der Glasplatten erreicht hat; Blaumarker soll NICHT auslaufen!!

Gelkassette ausbauen, kleine Glasplatte vorsichtig mit einem dünnen Spatel aufhebeln und abnehmen;

Gel in Glasschale mit ca. 50 – 100 ml Coomassie-Lösung überführen

1 h oder über Nacht färben

Coomassie-Lösung zurückschütten – Vorsichtig!!!

Gel in der Glasschale spülen mit H20, 10 % Essigsäure zugeben, auf Schüttler stellen;

Essigsäure alle 30 min. austauschen bis der Gelhintergrund klar ist

Gel am Dokumentationssystem fotografieren

Proteingrößenstandard

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Fermentas

Anzusetzende Puffer

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Protein-Analytik – Anzusetzende Puffer:

10 % Essigsäure: 500 ml, jede Gruppe

10 % (v/v) Essigsäure in H2Obidest

10 x SDS-Laufpuffer: 200 ml, jede Gruppe

1,92 M Glycin MW: 75,07 Feststoff einwiegen 250 mM Tris MW: 121,14 Feststoff einwiegen 1 % (w/v) SDS Feststoff einwiegen

Lysozym-Aufschluss-Puffer: 10 ml, jede Gruppe

50 mM Tris, pH 8,0 1 M Tris HCl, pH 8,0 150 mM NaCl 5 M NaCl

Bindungspuffer Ni2+-NTA: 20 ml, jede Gruppe

50 mM Tris pH 8,0 1 M Tris HCl, pH 8,0 500 mM NaCl 5 M NaCl

5 mM -Mercaptoethanol 100 % -Mercaptoethanol MW: 78,13g mol-1, D=1,1143 g cm-3 0,01 % (v/v) Triton 10 % Triton

Waschpuffer Ni2+-NTA: 10 ml, jede Gruppe 50 mM Tris pH 8,0 1 M Tris HCl, pH 8,0 100 mM NaCl 5 M NaCl

5 mM -Mercaptoethanol 100 % -Mercaptoethanol 1 % Triton 10 % Triton

Elutionspuffer Ni2+-NTA: 10 ml, jede Gruppe

50 mM Tris pH 8,0 1 M Tris HCl, pH 8,0 500 mM NaCl 5 M NaCl

5 mM -Mercaptoethanol 100 % -Mercaptoethanol 0,01 % (v/v) Triton 10 % Triton 200 mM Imidazol, pH 8,0 1 M Imidazol, pH 8,0

Lagerungspuffer: 1 L pro Box (pro 4 Gruppen) 50 mM Tris pH 8,0 1 M Tris HCl, pH 8,0 100 mM NaCl 5 M NaCl

5 mM -Mercaptoethanol 100 % -Mercaptoethanol 50 % Glycerin 100 % Glycerin

Vorhandene Puffer

48

Vorhandene Puffer und Stocklösungen:

1 M Tris HCl, pH 6,8






1 M MES, pH 6,5

1 M MES, pH 5,5

5 M NaCl

1 M Imidazol, pH 8,0

10 % Triton

Coomassie-Färbelösung: 200 ml, jede Gruppe 0,1 % (w/v) Coomassie Brillant BlauR Feststoff einwiegen 45 % (v/v) Ethanol 100 % Ethanol 10 % (v/v) Essigsäure 100 % Essigsäure Coomassie lösen, dann filtrieren durch Faltenfilter

LB-Medium: 1 % Bacto Trypton 0,5 % Hefe Extrakt 0,5 % NaCl

Ampizillin Stocklösung: 50 mg/ml Ampizillin gelöst in H2O

Kanamycin Stocklösung: 50 mg/ml Kanamycin gelöst in H2O

IPTG-Lösung 100 mM IPTG

10 % SDS: 10 % SDS, gelöst in H2O

Lysozym-Lösung: 20 mg/ml Lysozym 10 mM Tris HCl, pH 8,0

gesättigte AS-Lösung: 250 ml festes AS, auffüllen mit H2O auf 500 ml, rühren über Nacht, filtrieren durch Faltenfilter, titrieren mit NH3 auf pH 7,5

BSA-Lösung: 1mg/ml in H2O

5 x SDS-Probenpuffer: 50 ml 250 mM Tris HCl, pH 6,8 10 % (w/v) SDS 30 % (v/v) Glycerin 500 mM DTT 0,1 % (w/v) Bromphenolblau

10 % APS 10 % (w/v) APS (Ammoniumperoxidisulfat) gelöst in H2O

Protokoll zur Woche Protein-Analytik

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Protokoll zum Grundpraktikum

Protokoll von:

Name:

Vorname:

Matrikelnummer:

und

Name:

Vorname:

Matrikelnummer:

Thema: Protein-Analytik

Zeitraum:

Betreuer:


50

Protokoll zum Grundpraktikum Biochemie – Woche Protein -Analytik Bitte schreiben sie 1 1/2 zeilig mit Schriftgröße 11 – 12 Punkt!

Achtung: Alle (abgezeichneten) Original -Messdaten als Anhang zum Protokoll beilegen! Schreiben Sie zu folgenden Themen jeweils ca. 1 ½ Seiten „Einleitung“. Die Einleitung soll kurz auf die theoretischen Inhalte der Versuche eingehen und mit einer kurzen Zusammenfassung was Sie mit welcher Zielsetzung gemacht haben, enden. Schreiben Sie nicht wesentlich mehr als 1 ½ Seiten; nach 2 Seiten werden wir aufhören zu lesen und zu korrigieren Themen: 1. Induzierte Genexpression 2. Reinigung der Taq-Polymerase 3. Ionenaustauschchromatographie

1. Berechnungen Berechnung der Pufferherstellung:

500 ml 10 % Essigsäure:

10 % (v/v) Essigsäure

200 ml 10 x SDS-Laufpuffer:

1,92 M Glycin

250 mM Tris

1 % (w/v) SDS

10 ml Lysozym-Aufschluss-Puffer:

50 mM Tris, pH 8,0

150 mM NaCl

20 ml Bindungspuffer Ni2+-NTA:

50 mM Tris pH 8,0

500 mM NaCl

5 mM -Mercaptoethanol

0,01% (v/v) Triton

10 ml Waschpuffer Ni2+-NTA:

50 mM Tris pH 8,0

100 mM NaCl


1 % (v/v) Triton


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10 ml Elutionspuffer Ni2+-NTA:

50 mM Tris pH 8,0

500 mM NaCl


0,01% (v/v) Triton

200 mM Imidazol, pH 8,0

1 L Lagerungspuffer Ni2+-NTA:

50 mM Tris pH 8,0

100 mM NaCl


50 % (v/v) Glycerin

Berechnung der Gelherstellung: Trenngel 10 %:




10 % 30 %


dd H2O - -

APS 0,1 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %

Trenngel 15 %:




15 % 30 %


dd H2O - -

APS 0,1 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %


52

Trenngel 12 %:




12 % 30 %


dd H2O - -

APS 0,1 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %

Sammelgel:




5 % 30 %


dd H2O - -

APS 0,13 % 10 %

SDS 0,1 % 10 %

TEMED 0,1 % 100 %


53

2. Reinigung der Taq-Polymerase Gel-Dokumentation: Kleben Sie das Bild Ihres PAA-Gels hier ein und beschriften Sie das Bild EXAKT! (Nummerierung der Spuren, Kennzeichnung der Markerbanden in kDa, Kennzeichnung der Taq, Liste was

in welche Spur aufgetragen wurde)

Versuchsauswertung

1. Messen Sie die Laufstrecke der einzelnen Markerbanden aus und tragen Sie diese in eine

Tabelle mit d

Biochemisches Praktikum 1 – Grundpraktikum · 2020. 1. 23. · Praktikum 1 Protein-Analytik...

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