Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren in Cyanobakterien · Eingereicht bei European Journal of...

I

Biogenese von

Eisen-Schwefel-Zentren in Cyanobakterien

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am

Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen

vorgelegt von

Markus Wollenberg

aus

Essen

Bochum

2003

I

Nicht durch unsere Entdeckungen, sondern durch unsere Ahnungslosigkeit bewegen wir uns sicher durch das Leben.

Jean Giraudoux (1882 - 1944), französischer Diplomat, Erzähler, Dramatiker, Bühnen- und Romanautor

I

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht: Wollenberg, M., Berndt, C., Bill, E., Schwenn, J.D. und Seidler, A. : A dimer of the

FeS cluster biosynthesis protein IscA from cyanobacteria binds a [2Fe2S] cluster in

between two protomers and transfers it to [2Fe2S] and [4Fe4S] apo proteins.

Eingereicht bei European Journal of Biochemistry, Oktober 2002

Seidler, A., Jaschkowitz, K. und Wollenberg, M. (2001): Incorporation of iron-

sulphur clusters in membrane-bound proteins. Biochem. Soc. Trans. 29: 418-421.

Inhalt

I

Inhalt

INHALT........................................................................................................... I

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................... V

1 EINLEITUNG .............................................................................................. 1

1.1 Aufbau und Funktion von Eisen-Schwefel-Zentren ..................................................... 1

1.2 Die Assemblierung von Eisen-Schwefel-Zentren – ein enzymatischer Prozess ?....... 3

1.3 Biogenese von Eisen-Schwefel-Proteinen in Cyanobakterien und Chloroplasten ..... 8

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit............................................................................................... 14

2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 16

2.1 Material........................................................................................................................... 16 2.1.1 Geräte ....................................................................................................................... 16 2.1.2 Chemikalien.............................................................................................................. 16 2.1.3 Enzyme ................................................................................................................. 17 2.1.4 Längen- und Größenstandards.................................................................................. 18 2.1.5 Antibiotika ................................................................................................................ 18 2.1.6 Verwendete Computerprogramme............................................................................ 18 2.1.7 Verwendete Datenbanken......................................................................................... 19

2.2 Mikrobiologische Methoden.......................................................................................... 19 2.2.1 Organismen............................................................................................................... 19

2.2.1.1 Bakterienstämme............................................................................................... 19 2.2.1.1.1 E. coli ......................................................................................................... 19 2.2.1.1.2 Synechocystis PCC 6803............................................................................ 20

2.2.1.2 Hefestämme....................................................................................................... 20 2.2.2 Sterilisation............................................................................................................... 20 2.2.3 Medien, Anzucht und Lagerung ............................................................................... 21

2.2.3.1 E. coli ................................................................................................................ 21 2.2.3.2 Synechocystis PCC 6803 ................................................................................... 21 2.2.3.3 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................. 22

2.2.4 Transformation ......................................................................................................... 23 2.2.4.1 E. coli ................................................................................................................ 23

2.2.4.1.1 Herstellung kompetenter Zellen................................................................. 23 2.2.4.1.2 Transformation........................................................................................... 24 2.2.4.1.3 Hitzeschocktransformation ........................................................................ 24

2.2.4.2 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................. 24 2.2.4.3 Synechocystis PCC6803 .................................................................................... 25

2.2.5 Hefe „Two-Hybrid“ Interaktionstest ........................................................................ 26 2.2.6 Heterologe Überexpression von Proteinen ............................................................... 27

2.2.6.2 Vorkultur ........................................................................................................... 27 2.2.6.1 Vorversuche für die Überexpression eines Proteins.......................................... 28 2.2.6.3 Expression von Proteinen im präparativen Maßstab ......................................... 28

2.2.6.3.1 IscA1.......................................................................................................... 28 2.2.6.3.2 IscA2.......................................................................................................... 28 2.2.6.3.3 SynIscU ...................................................................................................... 28

Inhalt

II

2.2.6.3.4 IscS............................................................................................................. 29 2.2.6 Zellaufbruch und Fraktionierung von Zellhomogenisaten ....................................... 29

2.2.6.1 E. coli ................................................................................................................ 29 2.2.6.1.1 analytischer Maßstab ................................................................................. 29 2.2.6.1.2 präparativer Maßstab ................................................................................. 29

2.2.6.1.2.1 Präparation der löslichen Proteinfraktion ........................................... 29 2.2.6.1.2.1 Präparation der unlöslichen Proteinaggregate .................................... 30

2.2.6.2 Synechocystis PCC 6803 ................................................................................... 30

2.3 Molekularbiologische Methoden .................................................................................. 31 2.3.1 Oligonukleotide ........................................................................................................ 31 2.3.2 Plasmide.................................................................................................................... 32 2.3.3 Plasmidschnellisolierung .......................................................................................... 34 2.3.4 Plasmidisolierung im präparativen Maßstab............................................................. 35 2.3.5 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA ................... 35 2.3.6 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA-Fragmenten...................... 35 2.3.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen .......................................................................... 36 2.3.8 Spaltung mit Restriktionsendonukleasen.................................................................. 36 2.3.9 Dephosphorylierung von DNA................................................................................. 36 2.3.10 Ligation................................................................................................................... 37 2.3.11 Phenol / Chloroform (P/C) Extraktion und DNA-Fällung...................................... 37 2.3.12 Präparation genomischer DNA aus Synechocystis ................................................. 37 2.3.13 Polymerase-Kettenreaktion..................................................................................... 38 2.3.14 Ortsgerichtete Mutagenese ..................................................................................... 38

2.3.14.1 Amplifikation des Helferphagen ..................................................................... 39 2.3.14.2 Gewinnung der Einzelstrang-DNA ................................................................. 40 2.3.14.3 Phosphorylierung von Oligonukleotiden......................................................... 40 2.3.14.4 Anlagerungs- und Synthese-Reaktion ............................................................. 41

2.3.15 Multiple ortsgerichtete Mutagenese ....................................................................... 41 2.3.16 Sequenzierung von DNA........................................................................................ 42

2.4 Biochemische Methoden................................................................................................ 42 2.4.1 Reinigung von Proteinen .......................................................................................... 42

2.4.1.1 Streptomycinsulfatfällung ................................................................................. 42 2.4.1.2 Ammoniumsulfatfällung ................................................................................... 42 2.4.1.3 Reinigung durch HPLC/FPLC .......................................................................... 43

2.4.1.3.1 IscA1.......................................................................................................... 43 2.4.1.3.2 SynIscU ...................................................................................................... 44 2.4.1.3.3 IscS............................................................................................................. 45

2.4.2 Rückfaltung von IscA2............................................................................................. 45 2.4.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen............................................................... 46

2.4.3.1 Proteinbestimmung............................................................................................ 46 2.2.3.2 Konzentrationsbestimmung von Ferredoxin ..................................................... 46

2.4.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) .............................................................. 46 2.4.4.1 SDS-PAGE........................................................................................................ 46 2.4.4.2 nicht-denaturierende PAGE .............................................................................. 47 2.4.4.3 Coomassie Gelfärbung ...................................................................................... 47 2.4.4.4 Färbung von Gelen mit Stains All..................................................................... 48

2.4.5 Immundetektion von Proteinen................................................................................. 48 2.4.5.1 Elektrotransfer von Proteinen............................................................................ 48 2.4.5.2 Immunnachweis ................................................................................................ 48

2.4.6 Sulfidbestimmung..................................................................................................... 49 2.4.6.1 IscS Aktivitätstest.............................................................................................. 49

2.4.7 Eisenbestimmung...................................................................................................... 50 2.4.8 analytische Gelfiltrationschromatographie ............................................................... 50 2.4.9 Rekonstitution von FeS Zentren ............................................................................... 51

Inhalt

III

2.4.9.1 IscA1 und IscA2................................................................................................ 51 2.4.9.2 SynIscU ............................................................................................................. 51 2.4.9.3 Rekonstitutionen für die Mössbauer-Spektroskopie ......................................... 51

2.4.10 Untersuchungen zur Stabilität der FeS Zentren...................................................... 52 2.4.11 Experimente zur Übertragung des FeS Zentrums von IscA und SynIscU auf Apo-FeS-Proteine ...................................................................................................................... 52

2.4.11.1 Übertragung des FeS Zentrums auf Apoferredoxin ........................................ 52 2.4.11.1.1 Herstellung von Apoferredoxin ............................................................... 52 2.4.11.1.2 Übertragung der FeS Zentren von IscA/SynIscU auf Ferredoxin ............ 52 2.4.11.1.3 Kinetische Untersuchungen ..................................................................... 53

2.4.11.2 Übertragung des FeS Zentrums auf die Catharantus roseus APS- Reduktase und die Bacillus subtilis PAPS-Reduktase.................................................................... 53

2.4.11.2.1 Herstellung der Apo-Proteine .................................................................. 53 2.4.11.2.2 Übertragung der FeS Zentren................................................................... 53 2.4.11.2.3 Aktivitätstest ............................................................................................ 54

2.4.11.2.3.1 APS-Reduktase-Aktivitätstest .......................................................... 54 2.4.11.2.3.2 PAPS-Reduktase-Aktivitätstest ........................................................ 54 2.4.11.2.3.3 Bestimmung des 35SO3

2- ................................................................... 54 2.4.12 Analyse der Reaktion von IscS mit reduziertem SynIscU ...................................... 55 2.4.13 Chlorophyllbestimmung ......................................................................................... 55 2.4.14 Aconitasetest........................................................................................................... 56

2.5 Biophysikalische Methoden........................................................................................... 56 2.5.1 UV/Vis-Spektroskopie.............................................................................................. 56 2.5.2 Tieftemperatur-Fluoreszenz-Spektroskopie.............................................................. 56 2.5.3 EPR-Spektroskopie................................................................................................... 56 2.5.4 Mössbauer-Spektroskopie ........................................................................................ 57 2.5.5 Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) ............................................................... 58

3 ERGEBNISSE............................................................................................. 59

3.1 IscA1................................................................................................................................ 59 3.1.1 Expression und Reinigung von IscA1 ...................................................................... 59 3.1.2 Charakterisierung von Apo-IscA1............................................................................ 60

3.1.2.1 UV/Vis-Spektroskopie ...................................................................................... 60 3.1.2.2 MALDI-TOF Massenspektrometrie.................................................................. 60 3.1.2.3 Untersuchung der Oligomerisierung durch analytische Gelfiltration................ 61

3.1.3 Charakterisierung des FeS-Zentrums von IscA1 ...................................................... 62 3.1.3.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA1.................................................... 62 3.1.3.2 Spektroskopische Untersuchung von Holo-IscA1............................................. 63 3.1.3.3 Untersuchung der Oligomerisierung von Holo-IscA1 durch analytische Gelfiltration ................................................................................................................... 64 3.1.3.4 Charakterisierung der Varianten von IscA1...................................................... 65 3.1.3.4 Untersuchungen zur Stabilität von IscA1 und den Varianten ........................... 69 3.1.3.5 Untersuchungen zur Bildung des FeS Zentrums von IscA1 ............................. 70

3.1.4 Übertragungsexperimente mit IscA1........................................................................ 72 3.1.4.1 Übertragung auf [2Fe2S] Apoproteine.............................................................. 72 3.1.4.2 Übertragung auf [4Fe4S]-Proteine .................................................................... 74 3.1.4.3 Übertragungsaktivität der Varianten von IscA1................................................ 76

3.2 IscA2................................................................................................................................ 77 3.2.1 Expression, Reinigung und Rückfaltung von IscA2................................................. 78 3.2.2 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA2 ........................................................... 78 3.2.3 Übertragung des FeS-Zentrums auf Apoferredoxin ................................................. 79

Inhalt

IV

3.3 SynIscU ........................................................................................................................... 80 3.3.1 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als Überträger des Schwefels.................... 80

3.3.1.1 Biochemische Untersuchungen mit IscS und SynIscU...................................... 80 3.3.1.2 Untersuchungen zur Interaktion von SynIscU mit den NifS-homologen Proteinen aus Synechocystis mit dem Hefe 2-Hybrid-System ...................................... 83

3.3.2 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als potentielle FeS-Assemblierungsplattform........................................................................................................................................... 85

3.3.2.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von SynIscU................................................ 85 3.3.2.2 Charakterisierung des FeS-Zentrums an SynIscU ............................................ 86 3.3.2.3 Versuche zur Übertragung des FeS-Zentrums .................................................. 87

3.4 Charakterisierung der Biogenese von FeS-Zentren in vivo -Erzeugung von Deletionsstämmen ................................................................................................................ 89

3.4.1 iscA1 ......................................................................................................................... 89 3.4.1.1 Erzeugung einer Insertionsmutante ................................................................... 89 3.4.1.2 Expression von IscA1 im Synechocystis-WT.................................................... 90

3.4.2 iscA2......................................................................................................................... 90 3.4.2.1 Erzeugung einer Deletionsmutante ................................................................... 90 3.4.2.2 Wachstum des Stamms iscA2::Sm .................................................................... 92 3.4.2.3 Verhältnis der Photosysteme............................................................................. 93 3.4.2.4 Untersuchungen zur Expression und Aktivität von FeS-Proteinen in iscA2::Sm....................................................................................................................................... 94 3.4.2.5 Einfluss der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt .................................... 95

3.4.3 syniscU ..................................................................................................................... 97

4 DISKUSSION............................................................................................ 98

4.1 Charakterisierung von IscA1 (Slr1417) - IscA1, die Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis ?........................................................................................... 98

4.1.1 Expression, Reinigung und Charakterisierung von Apo-IscA1................................ 98 4.1.2 Das FeS-Zentrum von IscA1 .................................................................................... 99 4.1.3 Übertragung des FeS-Zentrums.............................................................................. 103

4.2 Charakterisierung von IscA2 (Slr1565) ..................................................................... 108

4.3 Charakterisierung von SynIscU (Ssl2667) –Sulfidmobilisierung oder Assemblierungsplattform? ................................................................................................ 108

4.4 Die Rolle von IscA1, IscA2 und SynIscU in vivo........................................................ 112

4.5 Ausblick ........................................................................................................................ 117

5 ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................... 119

6 LITERATUR............................................................................................ 121

Abkürzungsverzeichnis

V

Abkürzungsverzeichnis µ mikro A Ampere A. bidest Wasser mit sehr niedriger Ionenstärke (Leitfähigkeit < 0,05 µS/cm) A. dest. Wasser mit niedriger Ionenstärke (Leitfähigkeit < 0,3 µs/cm) Abb. Abbildung Amp Ampicillin APS Adenosin-5'-Phosphosulfat ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin C Celsius Cm Chloramphenicol cm Zentimeter CTAB Hexadecyltrimethylammoniumbromid Da Dalton DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleotide DO Drop-Out DTT 1,4-Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Fa. Firma Fd Ferredoxin FeS- Eisen-Schwefel- g gramm, Erdbeschleunigung Gm Gentamycin h Stunde HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure I-ADEANS 5-((2-jodacetamido)ethyl)-1-amiononaphtalen-sulfonsäure IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid k Kilo K Kelvin Km Kanamycin l Liter m milli, meter M molar min Minute n nano OD optische Dichte p pico PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PAPS Phosphoadenosin-5'-Phosphosulfat PCC Pasteur Culture Collection PCR Polymerase-Kettenreaktion PEG Polyethylenglykol PLP Pyridoxalphosphat PMSF Phenylmethansulfonsäurefluorid R Resistenzkassette RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur, 25°C s Sekunde

Abkürzungsverzeichnis

VI

SDS Natriumdodecylsulfat Sm Spectinomycin Tab. Tabelle TEMED N, N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin Tris Tris-(hydroymethyl)-aminomethan Triton X100 Polyoxyethylen-(9,10)p-t-octylphenol U Unit ü.N. über Nacht Upm Umdreheungen pro Minute V Volt v/v Volumen pro Volumen Vol Volumen w/v Gewicht pro Volumen X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid

1 Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Aufbau und Funktion von Eisen-Schwefel-Zentren

Anorganische Oberflächen bestehend aus Eisen, Nickel und Sulfid gehören zu den

ältesten Katalysatoren auf diesem Planeten und könnten entscheidende Reaktionen

bei der Entstehung des Lebens ermöglicht haben. Frühe Reaktionen der Entstehung

des Lebens, wie Kohlenstofffixierung und Bildung von Peptiden konnten mit diesen

Katalysatoren unter Urzeitbedingungen realisiert werden (HUBER &

WÄCHTERSHÄUSER, 1997, 1998).

Trotz der geänderten Bedingungen auf diesem Planeten gehören Eisen und Schwefel

in der Form von proteingebunden Eisen-Schwefel-Zentren auch heute noch zu den

wichtigen Kofaktoren in der belebten Welt.

Das einfachste der FeS-Zentren ist ein tetrahedrisch von vier Sulfhydrylgruppen der

Aminosäure Cystein koordiniertes Eisen-Atom. Weitere Formen sind das planare

[2Fe2S]-, das kubane [4Fe4S]- und [3Fe4S]-Zentrum (Abb. 1.1 a-d). Diese FeS-

Zentren werden zumeist vom Schwefel der Aminosäure Cystein gebunden. Höher

molekulare Zentren bestehen meist aus Kombinationen dieser Grundtypen (BEINERT,

2000).

Abb. 1.1: a: 1 Fe, Rubredoxin - Clostridium pasteurianum FREY ET AL., 1987 b: [2Fe2S]-Zentrum, Ferredoxin- Chlorella fusca BES ET AL., 1999 c: [4Fe-4S]-Zentrum, Ferredoxin - Bacillus thermoproteoliticus FUKUYAMA ET AL., 2002 d: [3Fe-4S]-Zentrum, Ferredoxin -Desulfovibrio gigas KISSINGER ET AL., 1989

1 Einleitung

2

Die Funktion der FeS-Zentren liegt, aufgrund der Redoxeigenschaften des Eisens

und des Schwefels, in der Elektronenübertragung. Schwefel kann formale Valenzen

von -2 bis +6 annehmen, liegt in FeS-Zentren allerdings immer als S-2 vor, Eisen

liegt als Eisen 2+ und 3+, sehr selten als Eisen 4+ vor. Diese chemische

Vielseitigkeit spiegelt sich in der Vielzahl der verschiedenen FeS-Verbindungen und

dadurch auch in der Bandbreite der Redoxpotentiale der FeS-Zentren von Proteinen

wider. Die Redoxpotentiale proteingebundener FeS-Zentren können einen Bereich

von ca. 1 V umspannen (Übersicht: BEINERT, 2000). Dieser Bereich liegt zwischen

ca. – 650 mV für die 4Fe-Zentren in [7Fe8S]-Ferredoxinen bis ca. + 450 mV für die

[4Fe4S]-Zentren der sogenannten „High-Potential-Iron-Proteins“ (HiPIP). Diese

Varianz im Redoxpotential wird durch die verschiedenen Typen der FeS-Zentren

gewährleistet, die z.T. erhebliche Varianz im Redoxpotential eines Typs durch die

Proteinumgebung des FeS-Zentrums.

Daher sind Eisen-Schwefel-Proteine an nahezu allen wichtigen Redoxprozessen der

belebten Welt beteiligt. Sie fungieren dabei sowohl als kleine lösliche Elektronen-

Übertragungsproteine (Ferredoxine) als auch als Untereinheiten großer z.T.

membrangebundener Proteinkomplexe.

Im der photosynthetischen Elektronentransportkette ist das Photosystem I mit drei

gebundenen [4Fe4S]-Zentren (FX, FA, FB) an der Elektronenübertragung beteiligt

(GOLBECK & BRYANT, 1991). Die Elektronenübertragung vom PS I zur Ferredoxin-

NADP+-Oxidoreduktase wird dann durch ein [2Fe2S]-Ferredoxin übernommen.

Im Cytochrom-b6f-Komplex ist das Rieske-Protein mit einem gebundenem [2Fe2S]-

Zentrum der Elektronenüberträger vom Plastohydrochinon auf Cytochrom f. Die

Koordination des [2Fe2S]-Zentrums durch zwei Cystein- und zwei Histidinliganden

bedingt das hohe Redoxpotential des FeS-Zentrums von ca. + 300 mV (BRITT ET AL.,

1991, FEE ET AL., 1984).

In der mitochondriellen Atmungskette sind FeS-Zentren des Cytochrom bc1-

Komplexes, der Succinat-Dehydrogenase (ALBRACHT ET AL., 1972) und der NADH-

Dehydrogenase, mit 3 [4Fe4S]- und 5-6 [2Fe2S]-Zentren (HAN ET AL., 1989) der

größte bekannte FeS-Protein-Komplex, am Elektronentransport beteiligt.

Ein weiterer zentraler Stoffwechselprozess mit Beteiligung von FeS-Zentren ist die

Stickstofffixierung. Das Molybdän-Eisen-Protein der Nitrogenase bindet neben

einem [8Fe7S]-Zentrum ein [Mo7Fe9S]-Zentrum (CHAN ET AL., 1993).

1 Einleitung

3

Neben den beschriebenen wichtigen Stoffwechselprozessen sind FeS-Proteine an

sehr vielen Reaktionen beteiligt, deren Aufzählung immer unvollständig bleiben

müsste.

Neben der beschriebenen Beteiligung von FeS-Proteinen als Elektronenüberträger

können FeS-Proteine auch regulatorische Funktionen in einer Zelle übernehmen

(Übersicht: BEINERT, 2000). Dabei soll der eukaryontische zelluläre Eisensensor, das

IRP (Iron Regulatory Protein), das SoxR/SoxS-System, ein FeS-Protein als Sensor

gegenüber O2--Radikalen, und der Sauerstoffsensor Fumarat-Nitrat-Reduktase aus E.

coli erwähnt werden.

Ein FeS-Protein, das aufgrund seines Reaktionsmechanismus in den letzen Jahren

Gegenstand intensiver Forschungen gewesen ist, ist die Biotin-Synthase aus

Escherichia coli. Dieses Enzym katalysiert die Insertion des Schwefels zwischen

dem C6- und dem C9-Atom von Desthiobiotin mit einer sehr geringen Umsatzrate.

Ein von diesem Enzym koordiniertes [4Fe4S]-Zentrum bindet S-Adenosyl-

Methionin und katalysiert dessen Reduktion zu einem 5’-Adenosyl-Radikal und

Methionin (COSPER ET AL., 2002). Dies ist eine weitere weit verbreitete Reaktion von

FeS-Zentren um Radikale über das 5’-Adenosyl-Radikal auf Substrate oder aktive

Zentren anderer Proteinuntereinheiten zu übertragen (OLLAGNIER ET AL., 1997;

KULZER ET AL., 1998).

Ein zweites [2Fe2S]-Zentrum der Biotin-Synthase wird bei dieser Reaktion zerstört.

Vieles deutet darauf hin, dass durch die Zerstörung des [2Fe2S]-Zentrums ein

Schwefel aus diesem Zentrum in Biotin eingebaut wird (UGULAVA ET AL., 2001,

2002). Die Funktion eines [2Fe2S]-Zentrums als Schwefeldonor für diese Reaktion

ist eine neue sehr spezialisierte Aufgabe für ein FeS-Zentrum.

1.2 Die Assemblierung von Eisen-Schwefel-Zentren – ein

enzymatischer Prozess ?

Die Synthese verschiedenster FeS-Zentren ist in Anwesenheit von Sulfid, Eisen und

geeigneten Liganden RS- ein spontaner Prozess. Diese Liganden können sowohl von

anorganischen Thiolverbindungen (BEINERT ET AL., 1997) als auch von Proteinen

gestellt werden. Interessante Ansätze zur Erforschung dieser Ligandenstruktur

konnten durch Arbeiten an synthetischen Peptiden erzielt werden, an denen FeS-

Zentren assembliert werden konnten (GIBNEY ET AL., 1996). So konnte an einem

1 Einleitung

4

Peptid aus nur 7 Aminosäuren (CIACGAC) noch ein reduzierbares [4Fe4S]2+/+-

Zentrum chemisch assembliert werden (MULHOLLAND ET AL., 1999).

Neben diesen Untersuchungen an synthetische Liganden für das FeS-Zentrum, ist die

Assemblierung von FeS-Zentren an Proteinen schon lange Gegenstand der

Forschung. Erste Versuche zur chemischen Rekonstitution von FeS-Zentren in

Ferredoxinen aus Clostridium pasterianum und Spinat (MALKIN & RABINOWITZ,

1966; BAYER ET AL., 1967) mit Sulfid und Eisen konnten durch Zugabe eines

Reduktionsmittels zum Rekonstitutionsansatz weiter optimiert werden (MEYER ET

AL., 1986).

Obwohl die chemische Rekonstitution von FeS-Zentren in Proteinen mit hoher

Effizienz möglich ist, ist ein solcher Mechanismus in vivo unwahrscheinlich.

Dagegen spricht die Toxizität der für die chemischen Rekonstitutionen eingesetzten

Konzentration von Sulfid und Eisen, wodurch die Konzentration dieser Stoffe in vivo

gering ist. Diese sind nach FLINT (1996) zu gering um den Bedarf der Zelle an FeS-

Proteinen durch chemische Rekonstitution zu decken. Zudem laufen chemische

Prozesse oft unspezifisch ab und können nicht reguliert werden. Daher ist ein

enzymatischer Prozess zur Assemblierung von FeS-Zentren wahrscheinlich.

Erste Hinweise auf die Beteiligung spezifischer Enzyme an der Biogenese von FeS-

Zentren konnten durch Arbeiten an der Nitrogenase von Azotobacter vinelandii

gewonnen werden. Deletion von Genen des orf6-nifUSVWZM-Operons ergaben

Stämme, die nur sehr schlecht in der Lage waren diazotroph zu wachsen (JACOBSON

ET AL., 1989). Dabei konnte bei Stämmen, in denen die Gene nifS und nifU deletiert

wurden, eine sehr geringe Aktivität des Eisen-Proteins der Nitrogenase bei normaler

Synthese des Apoproteins festgestellt werden.

nifS wurde kloniert und das Genprodukt in E. coli heterolog überexprimiert. NifS, ein

Pyridoxalphosphat-abhängiges Enzym, katalysiert unter anaeroben Bedingungen die

Umwandlung von Cystein in Alanin und elementaren Schwefel (1) (ZHENG ET AL.,

1993). Wird dem Reaktionsansatz ein Reduktionsmittel zugesetzt, entsteht neben

Alanin als weiteres Reaktionsprodukt Sulfid (2).

NifS, O2-Ausschluß

(1) L-Cystein L-Alanin + S0

NifS, O2-Ausschluß, DTT

(2) L-Cystein L-Alanin + S2-

1 Einleitung

5

Untersuchungen des Mechanismus von NifS ergaben, dass es im Verlauf der

Reaktion zur Bildung einer Schiff-Base zwischen der Aminogruppe des Cysteins und

dem Kofaktor PLP kommt. Zudem konnte gezeigt werden, dass der aus Cystein

mobilisierte Schwefel vor der Freisetzung an einen aktiven Cysteinrest (C325)

intermediär als Persulfid gebunden wird (ZHENG ET AL., 1994a). Durch die Aktivität

von NifS konnten in vitro die FeS-Zentren des Fe-Proteins der Nitrogenase

rekonstituiert werden (ZHENG & DEAN, 1994 b).

Um die Funktion von NifU zu ermitteln wurde das Protein ebenfalls heterolog

exprimiert. Das gereinigte Protein konnte als ein Homodimer mit einem gebundenen

[2Fe2S]2+/+-Zentrum pro Untereinheit identifiziert werden (FU ET AL., 1994).

NifU ist ein modular aufgebautes Protein mit insgesamt 9 Cysteinen. Analyse der

Funktion der Cysteine ergab, dass die 7 N-terminalen Cysteine für die Funktion von

NifU in vivo essentiell sind, die in einem CxxC-Motiv angeordneten Cysteine der C-

terminalen Domäne konnten ohne einen Phänotyp gegen Alanin ausgetauscht werden

(AGAR ET AL. 2000a). Das [2Fe2S]2+/+-Zentrum von NifU wird durch die mittleren

Domäne von NifU durch 4 Cysteine koordiniert. Die Cysteine der N-terminalen

Domäne waren in vitro in der Lage Eisen zu binden (AGAR ET AL., 2000a). Durch

Inkubation von NifU mit Eisen, Cystein und NifS unter reduzierenden und anaeroben

Bedingungen konnte an der N-terminalen Domäne ein labiles [2Fe2S]-Zentrum

assembliert werden (YUVANIYAMA ET AL., 2000).

Hinweise auf eine generellere Funktion dieser Proteine außerhalb der Funktion bei

der Aktivierung des Fe-Proteins der Nitrogenase gab die Identifikation von Genen in

A. vinelandii und E. coli (Abb. 1-2), die homolog zu nifS, nifU und orf6 waren und

orf6 nifU nifS

iscS iscU iscA hscAhscB fdx

iscS iscU iscA hscAhscB fdx

A. vinelandii

nif-Operon

isc-Operon

isc-OperonE. coli

Abb. 1-2: Das nif- und isc-Operon aus A. vinelandii und E. coli

1 Einleitung

6

mit weiteren anderen Genen in einem Operon angeordnet waren (BLATTNER ET AL.,

1997; ZHENG ET AL., 1998). Analog zur angenommenen generellen Funktion bei der

Biogenese von FeS-Zentren wurde das nifS-homologe Gen als iscS (iron sulfur

cluster), das nifU-homologe Gen als iscU und das orf6 homologe Gen als iscA

bezeichnet. IscS aus E. coli und A. vinelandii besaßen die für NifS ermittelte

Cystein-Desulfurase-Aktivität (FLINT, 1996; ZHENG ET AL., 1998).

Neben diesen Genen sind im isc-Operon ein Ferredoxin (Fdx) und die beiden DnaJ-

und DnaK- homologen Chaperone HscA und HscB kodiert. Versuche der Deletion

von iscS und hscA in A. vinelandii zeigten, dass diese Gene essentiell sind (ZHENG

ET AL., 1998). Deletion von iscS, iscU, hscB, hscA und fdx in E. coli führten zu einer

stark verminderten Aktivität von FeS-Enzymen und zu einer starken Verlangsamung

des Wachstums (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001). Die Deletion von iscA hatte einen

nicht so stark ausgeprägten Phänotyp zur Folge. Die Regulation der Transkription

des isc-Operons in E. coli erfolgt durch den unmittelbar im isc-Operon

stromaufwärts von iscS kodierten Transkriptionsregulator IscR, der ein [2Fe2S]-

Zentrum bindet (SCHWARTZ ET AL., 2001) und mit gebundenem Zentrum die

Transkription des isc-Operons negativ reguliert.

Analyse der Funktion von A. vinelandii IscU in vitro, das homolog zur N-terminalen

Domäne von NifU ist, ergab die sequentielle Assemblierung von einem, später zwei

[2Fe2S]-Zentren pro Proteindimer, die dann zu einem [4Fe4S]-Zentrum

umgewandelt werden (AGAR, 2000b) und damit eine funktionelle Ähnlichkeit als

FeS-Assemblierungsplattform zu NifU. Assemblierung eines [2Fe2S]-Zentrums

konnte auch für IscU aus Thermatoga maritima gezeigt werden, dass von IscU auch

auf ein menschliches Apo-[2Fe2S]-Ferredoxin transferiert werden konnte (MANSY ET

AL., 2002).

Die Rolle von IscU als primäre Assemblierungsplattform wird durch direkte

Übertragung des Persulfids, das am aktiven Cysteinrest von IscS gebunden ist, auf

IscU bestätigt (SMITH ET AL., 2001; URBINA ET AL., 2001; NUTH ET AL., 2002).

IscU konnte auch als Interaktionspartner des HscA/HscB-Chaperone-Systems

identifiziert werden (HOFF ET AL., 2000; SILBERG ET AL., 2001; HOFF ET AL., 2002).

Neben NifU/IscU als Assemblierungsplattform für FeS-Zentren wird für IscA-

Proteine eine Rolle als alternative Assemblierungsplattform diskutiert. So konnte für

A. vinelandii NifIscA (Orf6) die sequentielle Assemblierung eines [2Fe2S]- und eines

[4Fe4S]-Zentrums gezeigt werden (KREBS ET AL., 2001). IscA aus E. coli ist ebenfalls

1 Einleitung

7

in der Lage ein FeS-Zentrum zu binden und dieses auf Apo-Fdx zu übertragen

(OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001).

Neben den nif- und isc-System zur Biogenese von FeS-Zentren konnte in E. coli ein

drittes System mit ähnlicher Funktion identifiziert werden. Überexpression des

sufABCDES-Operons konnte den starken Phänotyp der isc-Operon-Deletionsmutante

revertieren (TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002). SufS ist dabei homolog zu IscS, SufA

homolog zu IscA. Die SufBCD-Proteine könnten ein Transporter vom ABC-Typ

bilden. Die Transkription von sufS und sufD ist eisenabhängig durch das Fur-System

von E. coli reguliert (PATZER & HANDTKE, 1999).

In Eukaryonten kommt den Mitochondrien eine essentielle Rolle bei der Biogenese

von FeS-Zentren sowohl mitochondrialer als auch cytosolischer FeS-Proteine zu

(MÜHLENHOFF & LILL, 2000), obwohl auch eine Zellkern-Lokalisation von Nfs1p in

Hefe (NAKAI ET AL., 2001) und im humanen System eine Lokalisation von IscS und

IscU1 im Cytosol diskutiert wird (TONG & ROUAULT, 2000).

So konnte für das NifS-homologe Nfs1p (KISPAL ET AL. 1999; LI ET AL. 1999) , für die

IscU-homologen Isu1p und Isu2p (GARLAND ET AL., 1999; SCHILKE ET AL., 1999), für

das zur C-terminalen NifU-Domäne homologe Nfu1p (SCHILKE ET AL., 1999), für die

IscA-homologen Proteine Isa1p und Isa2p (JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT ET AL.,

2000; PELZER ET AL., 2000), für das Fdx-homologe Yah1p (LANGE ET AL., 1999) und

für die Chaperone Ssq1p (HscA) und Jaq1p (HscB) (KNIGHT ET AL., 1998; STRAIN ET

AL., 1998; KIM ET AL., 2001) eine Beteiligung an der Biogenese von FeS-Zentren in S.

cerevisiae und die Lokalisation in Mitochondrien nachgewiesen werden.

Im Gegensatz zur Deletion von iscA in E. coli (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001) ist

der Phänotyp der Deletion von isa1 und isa2 in S. cerevisiae stark (KAUT ET AL.,

2000; PELZER ET AL., 2000), da es zum Verlust der mitochondriellen DNA kommt.

Wird das Expressionsniveau eines dieser Gene herabreguliert, ist die Aktivität

zahlreicher zellulärer FeS-Proteine stark herabgesetzt.

FeS-Biogenese-Proteine aus S. cerevisiae ohne prokaryotische Homologe sind der

mitochondrielle ABC-Transporter Atm1p (KISPAL ET AL., 1999) und die im

Intermembranraum lokalisierte Sulfhydryloxidase Erv1p (LANGE ET AL., 2001), deren

Reprimierung nur die Aktivität cytosolischer FeS-Proteine herabsetzt. Bei diesen

Proteinen wird eine Rolle beim Export von FeS-Zentren oder von Vorstufen der FeS-

1 Einleitung

8

Zentren aus den Mitochondrien in das Cytosol diskutiert. Für die Biogenese

cytosolischer FeS-Proteine in S. cerevisiae konnte auch die Beteiligung von

Glutathion nachgewiesen werden (SIPOS ET AL., 2002). Auch die Beteiligung des

Glutaredoxins Grx5 (RODRIGUEZ-MANZANEQUE ET AL., 2002) an der Biogenese von

FeS-Proteinen in Hefe wird diskutiert.

Ein weiteres eukaryotisches Protein, bei dem eine Verbindung zur Biogenese von

FeS-Proteinen besteht, ist Yfh1p (CHEN ET AL., 2002; MÜHLENHOFF ET AL., 2002) aus

S. cerevisiae. Yfh1p besitzt starke Ähnlichkeit mit Frataxin, ein Protein aus dem

Menschen. Defekte im Frataxin führen beim Menschen zur sogenannten Friedreichs

Ataxia, einem neurodenegerativen und kardialen Krankheitsbild (CAMPUZANO ET

AL., 1996). Deletion von yfh1 in Hefe führt zu einer Deregulation des

mitochondriellen Eisenhaushalts (BABCOCK ET AL., 1997) und so zu einem starken

Anstieg der mitochondriellen Eisenkonzentration, einem Phänotyp der auch für die

Deletion einiger FeS-Biogenese-Proteine in Hefe festzustellen ist.

1.3 Biogenese von Eisen-Schwefel-Proteinen in Cyanobakterien und Chloroplasten

Im Genom des komplett sequenzierten Cyanobakteriums Synechocystis PCC 6803

(KANEKO ET AL., 1996) können eine Reihe von Genen identifiziert werden, die für

Proteine kodieren, aufgrund deren Sequenzähnlichkeit mit Proteinen aus anderen

Abb. 1-3: Übersicht über die offenen Leserahmen aus Synechocystis PCC 6803, deren Genprodukte Ähnlichkeit mit Proteinen aus anderen Organismen aufweisen, die an der Biogenese von FeS-Zentren beteiligt sind

A. vinelandii nifUS iscSUA

E. coli iscSUA

SynechocystisPCC 6803

orf6 nifU nifSiscS iscU iscA

iscS iscU iscA

iscSslr0387sll0704slr0077

syniscU/ssl2667

iscA2iscA1slr1417

slr1565

sufS

1 Einleitung

9

Organismen eine Funktion an der Biogenese von FeS-Zentren angenommen werden

kann. Abb. 1-3 gibt eine Übersicht der Situation in Synechocystis. Die gezeigten

Gene sind nicht wie in den meisten anderen Prokaryonten zusammen in Operons

angeordnet, sondern über das gesamte Genom verteilt, was für die Genorganisation

in Synechocystis charakteristisch ist.

Im Genom von Synechocystis PCC 6803 können drei Gene identifiziert werden, die

für Proteine mit Sequenzähnlichkeit zu NifS/IscS kodieren. Biochemische

Untersuchungen am heterolog in E. coli exprimierten IscS (Slr0387) haben eine

Cystein-Desulfurase-Aktivität für das PLP-abhängige Enzym nachgewiesen

(JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000). In vitro konnte durch IscS in Anwesenheit von

Cystein, Eisen und eines Reduktionsmittels der Einbau von FeS-Zentren in

Apoferredoxin und das Apo-Rieske Protein aus Synechocystis katalysiert werden

(JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000; SCHNEIDER ET AL., 2000).

Sll0704, das zweite NifS-homologe Protein aus Synechocystis ist ebenfalls eine

funktionelle Cystein-Desulfurase, die in der Lage ist die in vitro-Rekonstitution des

FeS-Zentrums von Apoferredoxin zu katalysieren (KATO ET AL., 2000).

Kürzlich konnte für das dritte NifS-homologe Protein (Slr0077) aus Synechocystis

eine Cystein-Desulfurase-Aktivität nachgewiesen werden. Neben Cystein kann durch

das Enzym auch Cystin als Substrat für die Reaktion verwendet werden (D. Kessler,

persönliche Mitteilung). Unabhängig vom verwendeten Substrat ist die spezifische

Aktivität von Slr0077 verglichen mit der Aktivität von IscS sehr niedrig.

Das Gen für Slr0077 ist mit Genen für ein SufB- (Slr0074), SufC- (Slr0075) und

SufD-homologes Protein (Slr0076) in einem putativen Operon angeordnet, dessen

Transkription durch ein unmittelbar stromaufwärts kodiertes Protein (SufR) reguliert

wird, das ein FeS-Zentrum bindet (J. Golbeck, persönliche Mitteilung). Deletion des

entsprechenden Gens in Synechococcus PCC 7002 führte zu einem verbesserten

Wachstum unter Eisen-limitierten Bedingungen.

Von den drei NifS-homologen Proteinen in Synechocystis ist einzig Slr0077 (SufS)

essentiell. Die anderen beiden entsprechenden Gene können einzeln oder in

Kombination deletiert werden (SEIDLER ET AL., 2001). Die Untersuchung des

Phänotyps der iscS- und sll0704-Deletionsmutante ergab für beide Stämme einen

Wachstumsdefekt und leicht herabgesetzte Aktivität einiger untersuchter FeS-

Enzyme (VOLLMER, 2002).

1 Einleitung

10

Das Genom von Arabidopsis thaliana enthält zwei offene Leserahmen, die für NifS-

homologe Proteine kodieren. Für ein zu 70 % zu IscS/Slr0387 homologes Protein

(AtNFS1) wurde eine Lokalisation in den Mitochondrien gezeigt (KUSHNIR ET AL.,

2001). Das zweite NifS-homologe Protein aus A. thaliana ist zu 75 % homolog zu

SufS/Slr0077 aus Synechocystis. Durch Lokalisationsvorhersage durch das

Programm TargetP (EMANUELSSON ET AL., 2000) und eine GFP-Fusion konnte

AtNFS2 als chloroplastidäres Protein identifiziert werden. Biochemische

Untersuchungen des Enzyms haben eine Cystein-Desulfurase-Aktivität für AtNFS2

nachgewiesen (LEON ET AL., 2002).

Ein weiteres Protein, das aus löslichen Extrakten des Cyanobakteriums Synechocystis

PCC 6714 aufgrund seiner Fähigkeit aufgereinigt wurde, das FeS-Zentrum von

Apoferredoxin zu rekonstituieren ist die Cystein/Cystin C-S-Lyase. Dieses ebenfalls

PLP-bindende Enzym ist wie NifS in Lage aus Cystein in Anwesenheit eines

Reduktionsmittels Sulfid zu mobilisieren, mit höherer Spezifität wird von dem

Enzym Cystin als Substrat bevorzugt. Als weiteres Reaktionsprodukt entsteht nicht

wie bei NifS-homologen Enzymen Alanin, sondern Pyruvat und Ammonium

(LEIBRECHT & KESSLER, 1997). Die Untersuchung des entsprechenden Enzyms aus

Synechocystis PCC 6803 (Slr2143) ergab einen Reaktionsmechanismus, bei dem ein

im Gegensatz zu NifS exogenes Cystein als Akzeptor des mobilisierten Schwefels

fungiert und so ein Cysteinpersulfid entsteht, das über nicht-kovalente Bindungen

mit dem Protein assoziiert ist. (LANG & KESSLER, 1999). Dieses ungewöhnliche

Reaktionsprodukt konnte durch eine Röntgenkristallstruktur bestätigt werden

(CLAUSEN ET AL., 2000).

Neben den beschriebenen NifS/IscS-homologen Proteinen konnten im Genom von

Synechocystis offene Leserahmen für zwei IscA-Proteine (Slr1417 und Slr1565) und

ein offener Leserahmen für ein Protein mit Sequenzähnlichkeit zur C-terminalen

Domäne von A. vinelandii NifU (Ssl2667) identifiziert werden. Ein offener

Leserahmen mit Sequenzähnlichkeit zur N-terminalen NifU-Domäne/IscU konnte

nicht identifiziert werden (Übersicht Abb. 1-3), obwohl diese Domäne außer in

einigen Archea und nicht stickstofffixierenden Cyanobakterien in nahezu allen

Organismen konserviert ist (HWANG ET AL., 1996). Auch NifU-Proteine, die im nif-

Operon einiger stickstofffixierender Bakterien (z.B. Rhodobacter capsulatus) kodiert

1 Einleitung

11

sind, besitzen nur Sequenzähnlichkeit zur C-terminalen NifU-Domäne aus A.

vinelandii (MASEPOHL ET AL., 1993).

Abb. 1-4: Sequenzvergleich von IscA1(Slr1417) und IscA2(Slr1565) aus Synechocystis mit IscA1(AC007067.4), IscA2 (AC005825.3), IscA3 (AC006921.5) aus A. thaliana, IscA aus Porphyra purpurea (NP_053827), IscA (T44283) und Orf6 (Q44540) aus A. vinelandii,

die streng konservierten Cysteine sind gelb, die chloroplastidären Cysteine rot hinterlegt.

1 Einleitung

12

Abb. 1-4 zeigt einen Sequenzvergleich der IscA-Proteine aus Synechocystis PCC

6803 mit IscA-Proteinen aus anderen Organismen. Die Sequenz beider IscA-Proteine

(Slr1417-IscA1 / Slr1565-IscA2) weist drei in allen IscA-Proteinen konservierte

Cysteine auf. Im Fall von IscA1/Slr1417 sind zwei dieser Cysteine in einem

konservierten C-terminalen CGCG-Motiv lokalisiert. In der Sequenz von

IscA2/Slr1565 ist dieses CGCG-Motiv durch ein CSCS-Motiv ersetzt.

Neben diesen drei Cysteinen sind in der Sequenz von IscA1 zwei weitere Cysteine zu

finden. Diese Cysteine (C34 und C75) kommen auch in weiteren IscA-Sequenzen

aus Organismen mit oxygener Photosynthese vor. AtIscA1 aus A. thaliana ist nach

Analyse durch das Programm TargetP im Chloroplasten lokalisiert, das IscA-Protein

aus der Rotalge Porphyra purpurea ist im Chloroplastengenom dieses Organismus’

kodiert.

SynIscU (Ssl2667) aus Synechocystis besitzt Sequenzähnlichkeit zur C-terminalen

Domäne von NifU aus A. vinelandii. Das entsprechende Gen ist für Synechocystis

essentiell (SEIDLER ET AL., 2001). Die Sequenz von SynIscU weist zwei Cysteine auf.

Biochemische Untersuchungen am heterolog exprimierten und gereinigten Protein

ergaben eine Lokalisation dieser Cysteine an der Oberfläche des Proteins

(WOLLENBERG, 2000). Aufgrund des CxxC-Motivs in der Sequenz von SynIscU und

biochemischer Untersuchungen wurde eine Rolle von SynIscU als Reduktionsmittel

bei der Mobilisierung von Sulfid aus Cystein durch IscS/SynIscU vorgeschlagen

(WOLLENBERG, 2000). Alternativ wird eine Rolle von SynIscU als

Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis diskutiert (NISHIO &

NAKAI, 2000).

Im Genom von A. thaliana können mindestens 3 Proteine mit Homologie zu SynIscU

identifiziert werden, all diese Proteine sind nach dem Programm TargetP im

Chloroplasten lokalisiert. Die Sequenz der drei Proteine aus A. thaliana besitzt zwei

zu SynIscU homologe Bereiche. Abb. 1-5 zeigt einen Sequenzvergleich von Nfu1,

Nfu2 und Nfu3 aus A. thaliana mit der verdoppelten Sequenz von SynIscU. Das N-

terminale Methionin der Wiederholung der Sequenz von SynIscU ist rot hinterlegt.

Die Sequenzähnlichkeit zwischen der ersten Wiederholung der SynIscU-Sequenz und

den Nfu-Sequenzen aus A. thaliana ist höher als die der zweiten Wiederholung.

Zudem sind in der zweiten Wiederholung der SynIscU-Sequenz die Aminosäuren des

CxxC-Motivs durch andere ersetzt oder deletiert. Die Rolle der Nfu-Proteine aus A.

1 Einleitung

13

thaliana und der Sinn dieser Domänenverdopplung des SynIscU-Proteins aus

Synechocystis sind noch völlig offen.

Durch die z.T. gezeigte, z.T. vorhergesagte Lokalisation der FeS-Biogenese-Enzyme

AtNfs2, AtIscA1 und Nfu1-3 im Chloroplasten konnte bestätigt werden, dass der

Chloroplast neben den Mitochondrien in der Pflanze ein eigenständiges System zur

Biogenese von FeS-Proteinen besitzt. Arbeiten an isolierten Chloroplasten hatten

Cystein als Schwefelquelle für diesen Prozess identifiziert und zudem eine

Abhängigkeit von Licht oder NADPH und ATP im Dunkeln gezeigt (TAKAHASHI ET

AL., 1986, TAKAHASHI ET AL., 1991a; TAKAHASHI ET AL. 1991b).

Abb. 1-5: Sequenzvergleich von Nfu1 (NP_194321), Nfu2 (AF370353_1) und Nfu3 (AAK62607) aus A. thaliana mit der verdoppelten Sequenz von SynIscU (Ssl2667) aus SynechocystisPCC 6803. Das N-terminale Methionin der zweiten Wiederholung von SynIscU ist rot, die Cysteine des CxxC-Motivs aus SynIscU und die entsprechenden Cysteine in den Proteinen aus A. thaliana sind gelb hinterlegt.

1 Einleitung

14

1.4 Zielsetzung dieser Arbeit

In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion verschiedener Proteine bei der

Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis PCC 6803 durch in vitro und in vivo

Versuche ermittelt werden. IscA1 und IscA2 aus Synechocystis PCC 6803 sollten

heterolog in E. coli exprimiert, gereinigt und untersucht werden. Die Proteine sollten

auf ihre Fähigkeit Eisen oder Sulfid zu binden untersucht werden und ob sie in der

Lage sind ein FeS-Zentrum zu assemblieren. Dazu sollte versucht werden die

Proteine entweder mit gebundenem FeS-Zentrum aus E. coli zu isolieren oder ein

System zu etablieren, das die Assemblierung eines FeS-Zentrums an IscA1 und

IscA2 in vitro erlaubt. Zudem sollte die Funktion der zusätzlichen

pflanzenspezifischen Cysteine in IscA1 untersucht werden.

Für SynIscU sollte der Mechanismus der Bildung von Sulfid mit IscS, reduziertem

SynIscU und Cystein aufgeklärt werden. Dabei sollte gezeigt werden, ob es zu einer

direkten Übertragung des von IscS aus Cystein mobilisierten Schwefels auf SynIscU

kommt und dieser eventuell zur Assemblierung eines FeS-Zentrums an SynIscU

genutzt werden kann. Um unabhängig von der Fragestellung der

Schwefelübertragung die von NISHIO & NAKAI (2000) vorgeschlagene die Rolle von

SynIscU als Assemblierungsplattform für FeS-Zentren zu untersuchen, sollte ein

System etabliert werden, das die Assemblierung eines FeS-Zentrums an SynIscU in

vitro erlaubt und so die genaue Untersuchung des gebundenen FeS-Zentrums

ermöglicht.

Neben der Fragestellung der Assemblierung und der Art eines FeS-Zentrums an

IscA/SynIscU sollte der Transfer assemblierter FeS-Zentren auf Apo-FeS-Proteine

untersucht werden. Dabei sollte versucht werden neben Ferredoxin andere Apo-FeS-

Proteine, vor allem solche mit einem [4Fe4S]-Zentrum, als Empfänger eines FeS-

Zentrums zu etablieren.

Neben den beschriebenen in vitro-Untersuchungen soll die Rolle von IscA1 und

IscA2 in vivo ermittelt werden. Dazu sollten Deletionsmutanten von Synechocystis

PCC 6803 hergestellt werden und der Phänotyp dieser Stämme untersucht werden.

1 Einleitung

15

Aufgrund ähnlicher Enzymausstattung und des Modellcharakters von Synechocystis

für den Chloroplasten könnten diese Beobachtungen auch Licht auf die

entsprechenden Vorgänge in den Chloroplasten werfen.

2 Material und Methoden

16


2.1 Material

2.1.1 Geräte Hier sind nur häufig verwendete Standard-Laborgeräte aufgelistet. Wurden über diese Auflistung hinaus spezielle Geräte verwendet, so ist dies in den einzelnen Methodenbeschreibungen vermerkt. Autoklav Dampfsterilisator, Typ 300/400/500 EP-Z, Varioklav Brutschrank Heraeus Sniders Scientific, beleuchtet Elektrophorese Elektrophoresis Power Supply, LifeTechnologies Biorad Mini Protean 3 Agarosegelkammer, Eigenbau Entsalzungsanlage Selpapur Pro 90 CN Gefrierschrank, -70°C REVCO Geldokumentation MWG Inkubationsschüttler Model G25, New Brunswick Scientific CO. Inc. Immunoblotaparatur Biometra Konzentratoren Centricon, Centriprep, Amincon Kugelmühle Biospec Products Magnetrührer Heidolph MR 1000 Mikropipetten (-Spitzen) Glison (Sarstedt) pH-Meßgerät HANNA Instruments PVDF-Membran Qurzküvetten Hellma Reaktionsgefäße Sarstedt (1,5 ml & 12 ml), Corning (50 ml) Rotoren Beckmann Ti 50 Beckmann 100.5 Du Pont Sorvall GSA Du Pont Sorvall GS3 Du Pont Sorvall SS34 Spektralphotometer Beckman DU 7400 Sterilbank Thermocycler MWG Primus Ultrafiltrationszelle Amicon Ultraschallstab Sonic Dismembreator, Fisher Vortex Heidolph REAX 2000 Wasserbad Köttermann Zentrifugen Beckman Avanti J-25 Du Pont Sorvall RC-5B Ultrazentrifuge, Beckman Optima TL Ultrazentrifuge, Beckman L8-00 M Tischzentrifuge, Heraeus Biofuge Pico Speedvac, Savant

2.1.2 Chemikalien 1,4-Dithiothreitol (DTT), Fa. Sigma Magnesiumsulfat, Fa. J.T. Baker

Methanol, Fa. J.T. Baker N,N-Dimethyl-p-phenylendiaminsulfat

5-((2-jodacetamido)ethyl)-1-amiononaphtalen-sulfonsäure (1,5-I-ADEANS), Fa. Sigma Natriumacetat, Fa. J.T. Baker Acetonitril, Fa. J.T. Baker Natriumcarbonat, Fa. J.T. Baker Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8), Fa. Appli Chem

Natriumchlorid, Fa. J.T. Baker

Natriumdodecylsulfat (SDS), Fa. Biomol Agarose zur Gelelektrophorese, Fa. Gibco Natriumhydrogenphospat, Fa. J.T. Baker


17

Aminosäuren (diverse), Fa. Sigma Natriumnitrat, Fa. J.T. Baker Ammoniumacetat, Fa. J.T. Baker Saccharose, Fa. J.T. Baker Ammoniumeisen(II)-sulfat-6-hydrat, Fa. Riedel-de Haen

Salzsäure, Fa. J.T. Baker

Schwefelsäure, Fa. J.T. Baker Ammoniumsulfat, Fa. J.T. Baker Sinapinsäure, Fa. Sigma Argon (Druckgas), Fa. Messer Griesheim Streptomycinsulfat, Fa. Sigma Ascorbinsäure, Fa. J.T. Baker TAPS, Fa. Sigma Bacto Agar, Fa. Difco Laboratories Trifluoressigsäure, Fa. Arcos Organics β-Mercaptoethanol, Fa. Sigma Tris "ultrapure", Fa. Biomol Bradford- Reagenz, Fa. Biorad Trypton, Fa. Difco BSA, Fa. Biomol Butylsepharose, Fa. Pharmacia

X-GAL, Fa. Sigma Yeast Nitrogene Base, Fa. Difco

Chloroform, Fa. Riedel- de Haen Zinksulfat, Fa. J.T. Baker Coomassie Brilliant Blue R 250, Fa. Sigma

CTAB, Fa. Sigma D(+)-Glukose-1-hydrat, z.A., Fa. J.T. Baker

DMSO, Fa. Sigma DNase, Fa. Boehringer Eisen-(III)-chlorid-6-hydrat, Fa. Riedel- de Haen

Essigsäure, Fa. J.T. Baker Ethanol, absolut, z.A., Fa. J.T. Baker Ethidiumbromid, Fa. Pharmacia Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Fa. Merck

Galactose, Fa. Sigma Glycerin, Fa. Riedel-de Haen Glycin, Fa. Biomol Hefeextrakt, Fa. Difco HEPES, Fa. Biomol IPTG, Fa. Appli Chem Isoamylalkohol, Fa. J.T. Baker Kaliumchlorid, Fa. J.T. Baker Kaliumhydrogenphospat, Fa. J.T. Baker Kaliumhydroxid, Fa. J.T. Baker Kaliumpermanganat, Fa. J.T. Baker Kasein, Fa. Difco Kupfersulfat, Fa. J.T. Baker L-Cystein, Hydrochlorid Fa. Sigma Lysozym aus Hühnereiweiß, Fa. Serva Magnesiumchlorid, Fa. J.T. Baker

2.1.3 Enzyme Restriktionsenzyme mit den zugehörigen Puffern wurden von Takara, Gibco oder

New England Biolabs bezogen. RNaseA zum RNA-Abbau stammte von Boehringer

Mannheim, DNase von Pharmacia Biotech, Benzonase von Merck. Es wurde

Lysozym von Sigma verwendet. Weitere DNA-modifizierenden Enzyme wie CIAP,

T4-Ligase und Taq-Polymerase stammten von Gibco. Klenow-Polymerase wurde


18

von MBI bezogen, T4 DNA Polymerase von Takara, Pfu-Polymerase und PNK von

Stratagene und S1-Nuklease von Pharmacia.

2.1.4 Längen- und Größenstandards

Für die Elektrophorese von Agarose- und SDS-Gelen wurden folgende

Größenstandards verwendet. Tab. 2-1: Größenstandards

DNA bp λ (EcoRI, HindIII) 125, 564, 831, 947, 1375, 1584, 2027, 3530, 4268, 4973,

5148 und 21226 Low Range DNA (MBI) 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031 Protein kDa Prestained Protein Ladder (Invitrogen)

9,1; 16,8; 21,7; 28,4; 40; 52,5; 68,8; 85,9; 121,3; 184,5

10 kDa Protein Ladder (Invitrogen)

10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 110; 120, 200

Protein Ladder Low Range (Gibco)

3: 6,2; 14,3; 18,4; 29; 43

Prestained Protein Ladder Low Range (Gibco)

2,9; 5,7; 14,8; 20,2; 29,3; 44,7

2.1.5 Antibiotika Ampicillin, Chloramphenicol (Biomol), Tetracyclin, Kanamycin, Gentamycin,

Spectinomycin (Sigma)

2.1.6 Verwendete Computerprogramme Tab. 2-2: Liste der verwendeten Computerprogramme

Programm Hersteller Anwendung

Netscape Communicator Netscape Internetbrowser

Word XP Microsoft Textverarbeitung

Photoshop 6.0 Adobe Grafikprogramm

Acrobat Reader 4.0 Adobe Erstellen und Lesen von pdf-Dateien

DNA-Strider 1.3 Christian Mark DNA-Sequenzanalyse

Excel XP Microsoft Datenauswertung

Origin 6.0 Microal Darstellung von Grafen

BioEdit Hall, 1999 Sequenzvergleiche Die gezeigten Gele, Blots und Spektren wurden digital bearbeitet, aber inhaltlich

nicht verändert.


19

2.1.7 Verwendete Datenbanken Tab. 2-3: Liste der verwendeten Computerdatenbanken Datenbank/Programm Beschreibung,

Verwendung URL

Cyanobase Synechocystis-Sequenzen http://www.kazusa.or.jp/cyano Cyanomutants Liste der Synechocystis-

Mutanten http://www.kazusa.or.jp/cyano/mutants

National Center for Biotechnology Information

Datenbank von Fachliteratur, Gensequenzen, Proteinsequenzen

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Expasy Datenbanken Programme etc. zur Analyse von DNA- und Proteinsequenzen

http://www.expasy.ch

Expasy Proteomics tools

Programme zur Analyse von Proteinsequenzen

http://www.expasy.ch/tools

TargetP Programm zur Importvorhersage in Eukaryonten

http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP

2.2 Mikrobiologische Methoden

2.2.1 Organismen

2.2.1.1 Bakterienstämme

2.2.1.1.1 E. coli Tab. 2-4 Liste der verwendeten Bakterienstämme

Genotypen und verwendete Abkürzungen stammen aus (SAMBROOK ET AL.,

1989)

Stamm Genotyp Referenz E. coli DH5α supE44∆lacU169 (Φ80lacZ∆M15)

hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 HANAHAN, 1983

E. coli Bl21 (DE3) hsdS gal(λcIts857 ind 1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1)

STUDIER & MOFFATT, 1986

E. coli XL-10 Gold® tetR,(mcrA)183, ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA, supE44, lac Hte [F` proAB laclqZ∆M15, Tn10(TetR Amy CamR)

Stratagene

E. coli CJ236i

dut1 ung1 thi-1 relA1 / F' [proAB+ lacIq

lacZ ∆M15 Tn10 (TetR)] KUNKEL ET AL., 1987 verändert von Skerra, unveröffentlicht

E. coli WK6 (lac-proAB) galE, strA / F' lacIq

lacZ.M15 proA+B+ ZELL & FRITZ, 1987

E. coli WK6/VCSM13 WK6 mit dem Phagen VCSM13 infiziert


20

Die verwendeten E. coli-Stämme sind in Tabelle 2-4 aufgeführt.

Der Stamm DH5α und wurde zur Transformation von Ligationsansätzen verwendet.

Der E. coli-Stamm BL21(DE3) wurde zur heterologen Überexpression von

Proteinen aus Synechocystis PCC 6803 verwendet. Dazu trägt er, in das Chromosom

integriert, das Gen für die RNA-Polymerase aus dem Phagen T7, das unter der

Kontrolle des lacUV5-Promotors steht. Molekularbiologische Arbeiten wurden in der

Regel mit dem Stamm DH5α durchgeführt. Der Stamm E. coli CJ236i diente der

Isolierung Uracil-haltiger einzelsrängiger DNA, der Stamm WK6 zur Vermehrung

des Phagen VCSM13. Der Stamm E. coli XL-10 Gold® wurde zur Transformation

nach multipler ortsgerichteter Mutagenese verwendet.

2.2.1.1.2 Synechocystis PCC 6803 Tab. 2-5: Liste der verwendeten Synechocystis-Stämme Stamm Beschreibung Referenz Synechocystis PCC 6803 Wildtyp, Glukose-tolerant Geschenk von Prof.

Pakrasi, Washington University, USA

Synechocystis iscA1::Gm Insertion einer GmR in slr1417 (iscA1), nicht segregiert

diese Arbeit

Synechocystis iscA2::Sm Insertion einer SmR in slr1565 (iscA2), Deletion eines Teils des Gens

diese Arbeit

2.2.1.2 Hefestämme

Als Hefestamm wurde der Stamm EGY48 (MATα, ura3, his3, trp1, LexAop(x6)-

LEU2; ESTOJAK ET AL., 1995) verwendet.

2.2.2 Sterilisation

Alle Medien wurden bei 121°C für 20 min autoklaviert. Die Zugabe der Antibiotika

erfolgte nach dem Autoklavieren und dem Abkühlen auf ca. 50°C. Zusätze, die nicht

autoklaviert werden konnten, wurden steril filtriert (Sterilfilter Schleicher & Schüll,

0,45 µm) und nach dem Abkühlen des Mediums zugesetzt.


21

2.2.3 Medien, Anzucht und Lagerung

2.2.3.1 E. coli

E. coli wurde, wenn nicht anders vermerkt, in LB-Medium angezogen, dem je nach

Bedarf Antibiotika aus Stammlösungen zugesetzt wurde. Für die Kultivierung von E.

coli in Flüssigkultur wurden die Zellen, wenn nicht anders vermerkt, bei 37°C auf

einem Schüttler mit 200 Upm ü.N. angezogen.

Für die Herstellung von Agarplatten wurde dem LB-Medium 1,5 % (w/v) Agar und 1

% (w/v) sterilfiltrierte Glukose aus einer 20 %igen Stammlösung zugesetzt.

zugesetzt. Die Inkubation von Agarplatten erfolgte für maximal 18 h in einem

Brutschrank bei 37°C.

Die Platten wurden in Petrischalen (Fa. Sarstedt) gegossen und für wenige Wochen

bei 4°C gelagert. Bakterienkolonien auf Agarplatten wurden maximal für 4 Wochen

bei 4°C im Kühlschrank gelagert. Tab. 2-6 Zusammensetzung der E. coli-Medien Medium Zusammensetzung LB 1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 86 mM NaCl TP 2 % (w/v) Trypton, 1,5 % (w/v) Hefeextrakt, 137 mM NaCl,

20 mM KH2PO4/Na2HPO4 NZY + Broth 1 % (w/v) Kasein (hydrolysiert), 0,5 % (w/v) Hefeextrakt,

86 mM NaCl 12,5 mM MgCl2, 12,5 mM MgSO4, 20 mM Glukose, pH 7,5

TSB 10 % (w/v) PEG 4000, 5 % DMSO, 0,02 M MgCl2, 1% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % NaCl (sterilfiltriert, Lagerung bei 4°C)

2.2.3.2 Synechocystis PCC 6803

Tab. 2-7 Zusammensetzung des Synechocystis-Mediums Medium Zusammensetzung Referenz BG11

5 mM (für Festmedium 10 mM) HEPES/NaOH pH 8,2, 57 µM Ammoniumeisen(III)-citrat, 189 µM NaCO3, 175 µM K2HPO4, 17,6 µM NaNO3, 304 µM MgSO4, 245 µM CaCl2, 31,4 µM Citronensäure, 2,8 µM EDTA, 46,3 µM H3BO3, 9,1 µM MnCl2, 0,77 µM ZnSO4, 1,6 µM Na2MoO4, 0,32 µM CuSO4, 0,17 µM Co(NO3)2,

das Festmedium enthielt zusätzlich 19 mM Na2S2O3, 1,5 % (w/v) Agar

RIPPKA ET AL., 1979


22

Den Medien wurden je nach Bedarf Antibiotika aus sterilfiltrierten Stammlösungen

zugesetzt. BG11-Agarplatten enthielten standardmäßig 5 mM Glukose. Es wurden

auch Kulturen ohne 57 µM Ammoniumeisen(III)-citrat verwendet. Die Zellen

wurden vor Inokulation des eisenfreien Mediums einmal mit diesem gewaschen.

Für Synechocystis wurden verschiedene Anzuchtsbedingungen gewählt. Die

Lichtintensität betrug entweder 5 µmol Photonen / (m2 . s) (Schwachlicht, SL) bzw.

45 µmol Photonen / (m2 . s) (Hochlicht, HL). Die Temperatur betrug 30°C. Die

Dauerkultivierung von Synechocystis erfolge auf Festmedium im Schwachlicht für

maximal 4 Wochen. Vor der Inokulation von Flüssigmedium wurden die Kulturen

neu ausgestrichen und für höchstens 5 Tage im SL oder 3 Tage im HL kultiviert.

Flüssigkulturen wurden in maximal zu 50% gefüllten Erlenmeyerkolben angezogen.

Für die Durchführung von Wachstumskurven wurden 25 ml BG11 Medium von

Platte inokuliert und bis zum Erreichen einer OD730 von ca. 2 mit Glukose und

Antibiotika angezogen. Daraufhin wurden die Kulturen auf eine OD730 von 0,1 – 0,2

verdünnt und nochmals für einen Tag kultiviert. Daraus wurden beim Beginn der

Wachstumskurve die Kulturen auf eine OD730 von 0,05 inokuliert.

Für die Herstellung von Dauerkulturen wurden die Cyanobakterien in einem 100 ml

Erlenmeyerkolben unter HL-Bedingungen in ca. 30 ml des entsprechenden Mediums

angezogen. In der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase (OD730 ≈ 2,5) wurden

die Zellen in einem sterilen Röhrchen durch Zentrifugation bei 5000 g und RT für 6

Minuten sedimentiert. Anschließend wurden sie in 2 - 3 ml frischem Medium mit

15 % (v/v) Glycerin resuspendiert und in 500 µl Aliquots in Schraubdeckelröhrchen

überführt. Die Kulturen wurden 1 - 3 Stunden bei 0 °C gelagert, bei -20 °C

eingefroren und ü.N. inkubiert. Die Dauerkulturen wurden dann bei -70 °C gelagert.

2.2.3.3 Saccharomyces cerevisiae Dropout-Medium ist ein synthetisches Medium, das alle für das Wachstum

erforderlichen Nährstoffe enthält. Zur Selektion auf Stoffwechselmutanten wurden

Komponenten des DO-Mediums weggelassen. Für Drop-Out-Agarplatten (Tab. 2.8)

wurde 20 g/l Agar dem Medium zugesetzt und der pH-Wert mit NaOH eingestellt.

Die Platten wurden bis zur Benutzung bei 4°C gelagert.

Die Anzucht auf Agarplatten erfolgte bei 30°C über 2-4 Tage. Danach wurden die

Platten bei 4°C gelagert.


23

Für die Anzucht in Flüssigmedium wurden die Kulturen in maximal zu 1/5 gefüllten

Erlenmeyerkolben oder schräg gestellten Reagenzgläsern bei 30°C auf einem

Schüttler mit 250 Upm durchgeführt, um eine ausreichende Belüftung der Kultur zu

gewährleisten. Zur Induktion der Proteinexpression der unter der Kontrolle des

Galaktose-Promotors stehenden Fusionsproteine wurde spezielles glukosefreies DO-

Medium benötigt, das 2 % (w/v) Galaktose und 1 % (w/v) Raffinose enthielt. Wurde

X-Gal in den Platten benötigt, so wurde es nach dem Autoklavieren in einer

Konzentration von 80 mg/l dem Medium zugesetzt. Tab. 2-8: Zusammensetzung des Hefe-Drop-Out-Mediums Medium Zusammensetzung Drop-Out (DO)

0,67 % (w/v) YNB (Yeast Nitrogene Base, ohne Aminosäuren), 0,2 % (w/v) DO-Pulver, 2 % (w/v) Glukose

Tab. 2.9: Zusammensetzung des DO-Pulvers: Nährstoff Einwaage

in g Konzen-tration im

Medium[mg/l]

Nährstoff Einwaage in g

Konzen-tration im

Medium[mg/l]

Adeninhemisulfat 2,5 40 L-Phenylalanin 3,0 50 L-Arginin 1,2 20 L-Serin 22,5 375 L-Aspartat 6,0 100 L-Threonin 12,0 200 L-Glutamat 6,0 100 L-Tryptophan 2,4 40 L-Histidin 1,2 20 L-Tryptophan 2,4 40 L-Isoleucin 1,8 30 L-Tyrosin 1,8 30 L-Leucin 3,6 60 L-Valin 9,0 150 L-Lysin 1,8 30 Uracil 1,2 20 L-Methionin 1,2 20

2.2.4 Transformation

2.2.4.1 E. coli

E. coli DH5α, BL21(DE3) / pLysS, und CJ236i und wurden nach einer

Beschreibung von (CHUNG ET AL., 1989) transformiert. E. coli XL-10Gold wurde

durch Hitzeschock transformiert (2.2.4.1.3).

2.2.4.1.1 Herstellung kompetenter Zellen

Zur Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen (CHUNG ET AL., 1989) wurden 50 ml

LB-Medium (evtl. mit Antibiotikazugabe) aus einer ü.N.-Kultur des entsprechenden

Stammes 1 %ig inokuliert und bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Bei Erreichen


24

der exponentiellen Phase (OD600 ≈ 0,5) wurde die Kultur bei 3000g, 4°C für 10 min

zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde in 5 ml eiskaltem

TSB-Medium resuspendiert und die Zellen mindestens 10 min auf Eis inkubiert. Die

kompetenten Zellen wurden schockgefroren und bei -70°C gelagert.

2.2.4.1.2 Transformation

50 µl Ligationsansatz oder 1 µl Plasmid-DNA (0,5-1 µg/µl) wurden zu 200 µl

kompetenten Zellen gegeben und mindestens 5 min auf Eis inkubiert. Darauf wurden

zu dem Ansatz 730 µl TSB-Medium und 20 µl 20 % (w/v) sterilfiltrierte Glukose

gegeben und der Ansatz 1 h bei 37° inkubiert.

Nach 1 h wurden 100 µl des Ansatzes auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden

Antibiotikum verteilt, der Rest bei 8000 Upm 2 min in der Tischzentrifuge

zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Sediment im Rest des Mediums

resuspendiert und auf einer zweiten Selektivagarplatte verteilt.

2.2.4.1.3 Hitzeschocktransformation

Hitzeschock-kompetente XL10-Gold-Zellen wurden von der Fa. Stratagene bezogen

und für die Transformation nach Multi-Site-QuiKChange Mutagenese verwendet.

Dazu wurden 45 µl Zellen in ein eisgekühltes Reaktionsgefäß gegeben und mit 2 µl

β-Mercaptoethanol versetzt und 10 min unter gelegentlichem Schütteln auf Eis

inkubiert. 1,5 µl Mutageneseansatz wurden zu den Zellen gegeben und weitere 30

min auf Eis inkubiert. Darauf wurden die Zellen für 30 s in einem Wasserbad auf

42 °C erhitzt und 0,5 ml NZY + Broth (42°C) hinzugegeben. Das Röhrchen wurde

für 1 h bei 37°C in einem Schüttler inkubiert und dann 1, 10 und 100 µl der

Zellsuspension auf Selektivagarplatten mit 80 µg/ml X-Gal und 20 mM IPTG

ausplattiert.

2.2.4.2 Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae wurde nach Li-Acetat-Methode transformiert (GIETZ ET

AL., 1992). Dazu wurden der Ausgangstamm H6 (EGY48/pSH18-34) auf Drop-Out-

Medium ohne Uracil (DO-Ura) mit Glukose ausgestrichen und 2-3 Tage bei 30°C

inkubiert. Von dieser Platte wurden 20 ml DO-Ura +Glukose inokuliert und für 8h

bei 250 Upm auf einem Schüttler inkubiert. Mit 5 ml dieser Kultur wurden wiederum

50 ml DO-Ura+Glukose inokuliert und diese für 16-18 h bei 250 Upm und 30°C

angezogen. Mit dieser stationären Kultur (OD600≥1) wurden 300 ml DO-


25

Ura+Glukose inokuliert und diese für weitere 3 h bei 30°C auf einem Schüttler

inkubiert bis eine OD600 von ca. 0,5 erreicht war. Die Kultur wurde durch eine

Zentrifugation (1000g, 5 min, RT) geerntet und das Sediment in 50 ml sterilem A.

bidest. gewaschen. Die Zellsuspension wurde erneut sedimentiert und in 1,5 ml

steriler Li-Acetat-Lösung (0,1 M Li-Acetat, 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5)

resuspendiert.

Zur Transformation wurde zunächst Heringssperma-DNA durch Erhitzen auf 100°C

für 20 min denaturiert. 0,1 µg des oder der zu transformierenden Plasmide wurden

mit 100 µg einzelsträngiger Heringssperm-DNA zu 100 µl der Zellsuspension

gegeben und gemischt. Zu den Ansätzen wurden 600 µl PEG-Li-Acetat-Lösung

gegeben (40% PEG4000, 0,1M Li-Acetat, 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5)

und die Ansätze für 30 min bei 30°C auf einem Schüttler inkubiert. Nach einer

Zugabe von 70 µl DMSO wurden die Ansätze für 15 min bei 42°C im Wasserbad

erhitzt, danach auf Eis gekühlt und für 5s, 13000 Upm zentrifugiert. Das Sediment

wurde in 500 µl TE-Puffer resuspendiert.

Von dieser Suspension wurden 100 µl, wenn zwei Plasmide gleichzeitig

transformiert wurden 250 µl, auf DO-Ura+Glukose Platten ausplattiert, denen zudem

noch die Aminosäure(n) fehlte(n), deren Auxotrophie durch das (die)

transformierte(n) Plasmid(e) vermittelt wurde(n). Die Platten wurden für 2-4 Tage

bei 30°C kultiviert bis Einzelkolonien sichtbar wurden.

2.2.4.3 Synechocystis PCC6803

Synechocystis PCC6803 ist ein natürlich kompetenter Bakterienstamm.

Synechocystis-Zellen sind in der Lage DNA aus dem Medium aufzunehmen und in

das Genom zu integrieren, wenn auf dem aufgenommenen DNA-Fragment zur

Genomsequenz homologe Bereiche existieren. Liegen zwei homologen Bereiche vor,

wird das DNA-Fragment in eine Genomkopie über ein Doppel-Crossover integriert.

Zur Transformation von Synechocystis wurde der zu transformierende Stamm von

einer frischen Agarplatte in 50 ml BG11 mit 5 mM Glukose inokuliert und diese

Kultur bis zum Beginn der exponentiellen Wachstumsphase (OD730 ≈ 0,2-0,5) unter

HL Bedingungen angezogen. Die Kultur wurde geerntet (3000g, 10 min, RT) und die

Zellen in BG11 mit 5 mM Glukose resuspendiert, so dass eine OD730 von 2,5 erreicht

wurde. 400 µl der Zellsuspension wurden in einem Reagenzglas mit ca. 2 µg

Plasmid-DNA versetzt und für mind. 12 h im Brutraum auf einem Schüttler

inkubiert. Anschließend wurden 200 µl der Zellsuspension auf einer BG11-


26

Agarplatte mit 5 µg/ml des entsprechenden Antibiotikums ausplattiert und diese für

mehrere Tage im Brutraum inkubiert. Die restlichen 200 µl der Zellsuspension

wurden mit 1 ml BG11 mit 5 mM Glukose versetzt einen weiteren Tag auf dem

Schüttler inkubiert und von den Zellen ein Glycerinkultur angelegt (2.3.3.2).

Von der ersten Agarplatte wurde nach mehreren Tagen Inkubation Zellen auf eine

Agarplatte mit höherer Antibiotika-Konzentration ausgestrichen. Dieser Vorgang

wurde solange wiederholt bis eine Konzentration von 50 µg/ml für Spectinomycin

und von 70 µg/ml für Gentamycin erreicht wurde. Dann wurde die Segregation durch

PCR (2.3.13) überprüft.

2.2.5 Hefe „Two-Hybrid“ Interaktionstest

Das Hefe 2-Hybrid System ist ein System zum Nachweis von Protein-Protein

Interaktionen in vivo. Das hier benutzte System (GYURIS ET AL., 1993) nutzt dabei

aus, dass die Expression vom E. coli LexA-Operators nur dann erfolgen kann, wenn

dieser durch den Kontakt der LexA-DNA-Bindedomäne mit einer

Aktivierungsdomäne (hier eine synthetische Aktivierungsdomäne, B42) aktiviert

wird. Dies wird zum Nachweis von Protein-Protein Interaktionen genutzt, indem die

Gene für die zu untersuchenden Proteine in den Leserahmen der LexA-DNA-

Bindedomäne (pEG202-Derivate) bzw. der B42-Aktivatordomäne (pJG4-5-Derivate)

kloniert werden. Dadurch werden in Saccharomyces cerevisiae Fusionsproteine

exprimiert, mit der LexA-DNA-Bindedomäne bzw. der B42-Aktivatordomäne als N-

terminalen und den zu untersuchenden Proteinen als C-terminalen Teil des Proteins.

Interagieren nun die C-terminalen Fusionsproteine kommt die Aktivierungsdomäne

in räuliche Nähe der LexA-DNA-Bindedomäne und somit zur Aktivierung der

Transkription vom LexA-Promotor.

Als Reportersysteme dienen in dem Stamm H6 (EGY48/pSH18-34) zum einen das

plasmidkodierte lacZ-Gen, dessen Expression durch 8 LexA-Operatoren reprimiert

wird und der ins Hefechromosom integrierte Leucinreporter leu2, der unter der

Kontrolle von 6 LexA-Operatoren steht und dem Stamm bei Expression des Gens

Leucin-Aututrophie verleiht.

Zum Test auf eine Interaktion wurden die zu untersuchenden pEG202- und pJG4-5-

Derivate (2.3.2) in EGY48/pSH18-34 transformiert (2.2.4.2). Mit einer Einzelkolonie

wurden dann 5 ml Drop-Out-Medium ohne Uracil, Histidin und Tryptophan mit

Glukose (DO-Ura-His-Trp+Glukose) inokuliert und ü.N. im Schüttler bei 30°C


27

inkubiert. 1,5 ml dieser Kultur wurden in der Tischzentrifuge 2 min bei 13000 Upm

zentrifugiert und in 1 ml DO-Ura-His-Trp+Galaktose/Raffinose gewaschen. Nach

einer weiteren Zentrifugation wurde das Sediment in 0,5 – 1 ml DO-Ura-His-

Trp+Galaktose/Raffinose resuspendiert und mit 0,5 ml dieser Zellsuspension 4,5 ml

DO-Ura-His-Trp+Galaktose/Raffinose inokuliert. Diese Kultur wurde für mindestens

6 h bei 30°C auf einem Schüttler inkubiert. Diese Schritte dienen dazu die von der

Zelle gespeicherte Glukose abzubauen, so dass es zur Transkription der Gene

kommen kann, die in den pJG4-5-Derivaten unter der Kontrolle des Gal4-Promotors

stehen. Die OD600 dieser Kulturen wurde auf 0,6 eingestellt und 20 µl dieser Kultur

wurden auf folgenden Platten ausgestrichen: DO-Ura-His-Trp+Glukose, DO-Ura-

His-Trp-Leu+Glukose, DO-Ura-His-Trp-Leu+Galaktose/Raffinose, DO-Ura-His-

Trp+X-Gal+Glukose und DO-Ura-His-Trp+X-Gal +Galaktose/Raffinose. Die Platten

wurden für 2-4 Tage bei 30°C inkubiert und dann ausgewertet.

Als Positivkontrolle für eine Interaktion wurde der Stamm EGY48/pSH1834/

pCDC28 /pCDI1 (GYURIS ET AL., 1993) verwendet, als Negativkontrolle die pEG202-

bzw. pJG4-5-Derivate gegen den jeweiligen Ausgangsvektor pJG4-5 bzw. pEG202.

2.2.6 Heterologe Überexpression von Proteinen

Zur heterologen Überexpression von Proteinen wurden die entsprechenden Gene in

Plasmide (2.3.2) kloniert, in denen ihre Transkription durch den starken Φ10-

Promoter des Phagen T7 kontrolliert ist. Die Expression erfolgte in dem lysogenen E.

coli Stamm BL21(DE3), in dessen Chromosom das Gen für die T7-RNA-Polymerase

unter der Kontrolle des lacUV5-Promotoers integriert ist. Dazu wurden die

Expressionsplasmide in BL21(DE3)/pLysS transformiert. Das Plasmid pLysS trägt

das Gen für das Lysozym des Phagen T7. Dies ermöglicht als Inhibitor der T7-RNA-

Polymerase eine stringentere Kontrolle der Expression vor der Induktion und einen

besseren Zellaufschluss.

2.2.6.2 Vorkultur

3 - 50 ml LB-Medium (mit Antibiotika) wurden mit einer Einzelkolonie des

Expressionsstamms inokuliert. Die Kultur wurde für 6-8 h bei 37°C in einem

Schüttler inkubiert und die Zellen anschließend bei 5000 g für 10 min bei 4° C

sedimentiert. Die Zellen wurden in 3 - 50 ml frischem Ausgangsmedium

resuspendiert und ü.N. bei 4°C gelagert.


28

2.2.6.1 Vorversuche für die Überexpression eines Proteins

Zur Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen wurden je 50 ml Medium

(LB/TP mit jeweiligen Antibiotika) mit 1 ml der Vorkulturen vom Vortag inokuliert

und bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase (OD600 ≈ 0,6) bei 37°C

im Schüttler inkubiert. Wurden andere Expressionstemperaturen gewählt, wurden

diese bei einer OD600 von ca. 0,3 eingestellt. Bei Erreichen einer OD600 von 0,6

wurden die Kulturen geteilt und 25 ml mit IPTG (Endkonzentration 0,5 mM)

induziert. Die andere Hälfte diente als Kontrolle ohne Induktion der Expression.

Jeweils nach 1, 2, 3, und 4 Stunden wurde die OD der Kultur bei 600 nm bestimmt

und 1 ml zur Analyse des Proteingehaltes entnommen. Die Zellen der entnommenen

Probe wurden bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge (RT) sedimentiert, der

Überstand abdekandiert und das Zellsediment in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Danach wurden die Proben bis zur Präparation und Analyse der löslichen

Zellproteine bei - 70°C gelagert.

2.2.6.3 Expression von Proteinen im präparativen Maßstab

Die Expression von Proteinen im präparativen Maßstab erfolgte in 2 l

Erlenmeyerkolben, die mit 500 ml Medium befüllt wurden. Die Zellernte erfolgte

durch Zentrifugation bei 5000 g und 4°C für 10 min. Der Überstand wurde

verworfen.

2.2.6.3.1 IscA1

Die heterologe Expression von IscA1 erfolgte im Stamm BL21 (DE3)/ pLysS /

pISCA1 bei 25°C in LB-Medium. Bei einer OD600 ≈ 0,6 wurde die Kultur mit

0,5 mM IPTG induziert und bis zur Zellernte 6 h inkubiert.

2.2.6.3.2 IscA2

Die heterologe Expression von IscA1 erfolgte im Stamm BL21 (DE3)/ pLysS /

pISCA2 bei 37°C in LB-Medium. Bei einer OD600 ≈ 0,6 wurde die Kultur mit

0,5 mM IPTG induziert und bis zur Zellernte 4 h inkubiert

2.2.6.3.3 SynIscU

Die heterologe Expression von SynIscU (WOLLENBERG, 2000) erfolgte im Stamm

BL21 (DE3)/ pLysS / pISCU bei 25°C in LB-Medium. Bei einer OD600 ≈ 0,6 wurde

die Kultur mit 0,5 mM IPTG induziert und bis zur Zellernte 4 h inkubiert.


29

2.2.6.3.4 IscS

Die heterologe Expression von IscS (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) erfolgte durch

den Stamm BL21 (DE3)/ pLysS / pISCS bei 25°C in TP-Medium mit 10 mM

Pyridoxalphosphat. Die Kultur wurde nicht induziert und 18 h nach Inokulation

geerntet.

2.2.6 Zellaufbruch und Fraktionierung von Zellhomogenisaten

2.2.6.1 E. coli

2.2.6.1.1 analytischer Maßstab

Um die löslichen Proteine aus E. coli zu isolieren, wurden die bei -70° C gelagerten

Zellsedimente aufgetaut. Das aufgetaute Sediment wurde in 100 µl 50 mM

HEPES/NaOH, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,5 resuspendiert.

Zum Zerkleinern der DNA wurde zu den aufgebrochenen Zellen 2,5 µl 1 M MgCl2

und 5 µl DNaseI (10 mg/ml) gegeben und die Ansätze 15 min bei RT inkubiert. Es

folgte eine Zentrifugation bei 13000 Upm bei RT in der Tischzentrifuge. Das

Sediment, das unlösliche Aggregate, einen Teil der Membranen sowie

Zellwandbestandteile enthielt, wurde mit 100 µl Wasser und 25 µl 5x SDS

Probenpuffer versetzt. Der Überstand wurde, um Membranen zu entfernen, bei

100000g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Sediment wurde verworfen und der

Überstand, der die löslichen cytoplasmatischen und periplasmatischen Proteine

enthielt, mittels einer SDS-PAGE (2.4.5.1) analysiert.

2.2.6.1.2 präparativer Maßstab

2.2.6.1.2.1 Präparation der löslichen Proteinfraktion Das Zellsediment in 10 ml Puffer pro Liter Expressionskultur (50 mM

HEPES/NaOH, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen

wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei

-70°C gelagert.

Um die löslichen Zellproteine aus den Zellen zu isolieren wurden die Zellen wieder

aufgetaut. Dieser Vorgang aus Frieren und Tauen wurde zweimal wiederholt. Die

aufgeschlossenen Zellen wurden zum Zerkleinern der Nukleinsäuren mit MgCl2

(Endkonzentration: 15 mM) und 125U Benzonase pro 10 ml Puffer versetzt und 1 h

auf Eis inkubiert. Danach wurde der Ansatz zentrifugiert (15000g, 30 min, 4°C) und


30

der Überstand abgenommen. Das Sediment wurde mit 5 ml Puffer gewaschen und

erneut zentrifugiert. Der abgenommene Überstand wurde mit dem zuvor

abgenommen Überstand vereinigt und in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (100000 g,

1h, 4°C). Der Überstand enthielt dann die lösliche Proteinfraktion.

2.2.6.1.2.1 Präparation der unlöslichen Proteinaggregate

Das Zellsediment in 10 ml Puffer pro Liter Expressionskultur (50 mM

HEPES/NaOH, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen

wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei

-70°C gelagert. Der Zellaufbruch erfolgte durch 6-8 Zyklen Beschallung mit einem

Ultraschallstab für 30s bei 0°C. Die unlöslichen Aggregate wurden durch

Zentrifugation (20000g, 15 min) sedimentiert, dreimal in 50 mM HEPES/NaOH, pH

7,5, 1 % Triton X-100, dreimal in 50 mM HEPES/NaOH, pH 7,5 gewaschen, in A.

bidest. resuspendiert und bis zu ihrer weiteren Verarbeitung und bei – 70°C gelagert.

2.2.6.2 Synechocystis PCC 6803

50-250 ml Synechocystis-Kultur (OD730 ≈ 1,5-2,5) wurden für 10 min bei 5000g

sedimentiert und 1 ml pro 25 ml Kultur Thylakoidpuffer (50mM HEPES/NaOH,

pH 7,0, 5 mM MgCl2, 15 mM CaCl2 15 % Glycerin, 0,5 % DMSO) gewaschen und

erneut zentrifugiert. Das Sediment wurde in 0,5 – 1,3 ml Thylakoidpuffer

resuspendiert und in ein 2 ml Schraubgefäß überführt, das zu 1/3 mit Glaskugeln

(Biospec, Ø = 0,1 mm) gefüllt war. Der Ansatz wurde 10 min auf Eis inkubiert. Der

Zellaufbruch erfolgte durch 5-8 Zyklen in einer Schwingmühle für 30s bei 5000

Upm. Zwischen den Zyklen wurde der Ansatz für mind. 1 min auf Eis inkubiert.

Nach dem Zellaufbruch wurde der Ansatz 10 min ruhig auf Eis gelagert und das

Zellhomogenat in ein neues Gefäß überführt. Danach erfolgte eine Zentrifugation in

der Tischzentrifuge für 1 min bei 13000 Upm, wodurch nicht aufgeschlossene Zellen

abgetrennt wurden. Der Überstand wurde für 15 min und 100000 g bei 4°C

zentrifugiert. Im Überstand befanden sich die löslichen Proteine im Sediment die

Membranen. Diese wurden in einem geeigneten Volumen Thylakoidpuffer

resuspendiert.


31

2.3 Molekularbiologische Methoden

2.3.1 Oligonukleotide

Die Oligonukleotide wurden von der Fa. MWG Biotech synthetisiert und bezogen.

Tab. 2-10 Sequenz und Funktion der in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide. Die Basen,

die bei Mutagenese-Oligonukleotiden im Vergleich zur Gensequenz verändert wurden sind

klein geschrieben, eingeführte Schnittstellen unterstrichen

Oligonukleotid Sequenz Funktion MOslr1417-1 5'-CCCCCACCCGTAgcgctAGATCTT

TGCCCTG Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys34 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer Eco47III Schnittstelle

MOslr1417-2 5'- GTAGGACATGCCAGAggcGCCC CCTTGACG

Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys44 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer KasI-Schnittstelle

MOslr1417-3 5'- GAGATATAGCAAACTTTTCCG aTCGgcGATAATCTGAAAACCTTC

Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys75 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer PvuI Schnittstelle

MOslr1417-4 5'-CCCCAAAGGATTTACCACAACC AgctGTTTGATTAGCATTAGG

Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys110 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer PvuII Schnittstelle

MOslr1417-5 5'- GCTTAAACCCCAAAGGATTTAC CggcgCCACAGGTTTGATTAGC

Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys112 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer KasI- Schnittstelle

MOslr1417-4+5 5'-CCCCAAAGGATTTACCAgcACC AgctGTTTGATTAGCATTAGG

Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys110 und 112 in slr1417 gegen je ein Alaninkodon, Einführung einer PvuII Schnittstelle

PRiscA11

5'-GGAATTCCATATGAGCCAAGC CACCGCTACC

5'-Primer zur Amplifikation von slr1417 (iscA1), Einführung einer NdeI-Schnittstelle

PRiscA12 5'-GATCTAAGCTTAAACCCCAAA GGATTTACC

3' -Primer zur Amplifikation von slr1417 (iscA1), Einführung einer HindIII-Schnittstelle

PRiscA2+3 5'-GGTAGTATGGCAAATGGAGC 5'-primer zur Amplifikation von iscA2 (slr1565) mit 65 bp 5'-Bereich

PRiscA2+4 5'-AACTGGGCAAACTTTGACCC 3'-Primer zur Amplifikation von iscA2 (slr1565) mit 200 bp 3'-Bereich

PRslr0387-3 5'-GTTATGAATTCATGGAACGGCC TCTTTACTTCG

5'-Primer zur Amplifikation von slr0387 (iscS), Einführung einer EcoRI Schnittstelle

PRsll0704-4 5'-GATTAGAATTCATGAAAATTTA CCTCGATTACAG

5'-Primer zur Amplifikation von sll0704, Einführung einer EcoRI Schnittstelle

PRslr0077-3

5'-GTTATGAATTCATGGTTGCTCT CCAAATTCCC

5'-Primer zur Amplifikation von slr0077 (sufS), Einführung einer EcoRI Schnittstelle

PRT7TERM

5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 3'-Primer zur Amplifikation von Genen, die in Plasmide mit T7-Terminator kloniert sind


32

2.3.2 Plasmide

Die Plasmide, auf denen die in dieser Arbeit benutzten und konstruierten Plasmide

(Tab. 2-12) beruhen sind in Tab. 2-11 aufgeführt. Tabelle 2-11: Ausgangsplasmide für die in dieser Arbeit benutzten und konstruierten Plasmide Plasmid Beschreibung Referenz pRSET5a Expressionsplasmid für das T7-Expressionssystem,

AmpR, SCHÖPFER, 1993

pRSET6a Expressionsplasmid für das T7-Expressionssystem, AmpR,

SCHÖPFER, 1993

pEG202 Plasmid für 2-Hybrid System, AmpR, His-Marker zur Selektion in Hefe, Replikationsursprung für E. coli (ori) und Hefe (2µm) "bait" = Gen für DNA-Bindedomäne (LexA) unter Kontrolle des konstituiven ADH-Promoters und Polylinker

GYURIS ET AL., 1993

pJG4-5 Plasmid für das 2-Hybridsystem, AmpR, Trp- Marker für Selektion in Hefe, Replikationsursprung für E. coli (ori) und Hefe (2µm), "prey" = B42 Aktivatordomäne unter Kontrolle des induzierbaren Gal4-Promotors und Polylinker

GYURIS ET AL., 1993

pKS+ Plasmid mit lac-Promotor, Multipler Klonierungsstelle und AmpR

SAMBROOK ET AL., 1989

pLysS Plasmid zur konstitutiven Expression des T7-Lysozyms als Inhibitor der T7-RNA Polymerase in E.coli

STUDIER & MOFFATT, 1986

Tab. 2-12: während dieser Arbeit erzeugte und benutzte Plasmide Plasmid Ausgangs-

plasmid Beschreibung Referenz

pISCA1 pRSET5a Plasmid zur Expression von IscA1(Slr1417) aus Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und HindIII

Seidler, A., unver-öffentlicht

pISCA1C34A pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA1C44A

pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 44 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA1C75A


diese Arbeit

pISCA1C110A


diese Arbeit

pISCA1C112A


diese Arbeit


33

pISCA1C34/75A

pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34 und 75 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA1C34/44/75A

pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34,44 und 75 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA1C110/112A

pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 110 und 112 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA1C34/75/110A pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34, 75 und 110 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA1C34/75/112A pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34, 75 und 112 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA1C34/75/110/112A

pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34, 75, 110 und 112 gegen Ala ausgetauscht

diese Arbeit

pISCA2 pRSET5a Plasmid zur Expression von IscA2 (Slr1565) aus Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und HindIII


pISCU

pRSET6a Plasmid zur Expression von SynIscU (Ssl2667) aus Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und PstI


pISCS1 pRSET6a Plasmid zur Expression von IscS (Slr0387) von Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und PstI

(JASCH-KOWITZ & SEIDLER, 2000)

pISCA1+::Gm pKS+ Plasmid zur Erzeugung einer Insertionsmutante in iscA1 (slr1417), slr1417 mit flankierenden Sequenzen (ApaI/EcoRI) mit GmR in BglII,


pISCA2+::Sm pKS+ Plasmid zur Erzeugung einer Deletionsmutante von slr1565 (iscA2), slr1565 mit flankierenden Sequenzen PstI/XbaI) und SmR in BstEII


pEG-ISCS

pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscS (slr0387) von Synechocystis, iscS kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen

diese Arbeit

pEG-Sll0704

pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit sll0704 von Synechocystis, sll0704 kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen

diese Arbeit


34

pEG-Slr0077

pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit slr0077 von Synechocystis, slr0077 kloniert über EcoRI und XhoI

diese Arbeit

pEG-ISCU pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscU (ssl2267) von Synechocystis, iscU kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen

diese Arbeit

pJG-ISCS

pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscS (slr0387) von Synechocystis, iscS kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen

diese Arbeit

pJG-Sll0704

pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit sll0704 von Synechocystis, sll0704 kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen

diese Arbeit

pJG-Slr0077

pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit slr0077 von Synechocystis, slr0077 kloniert über EcoRI und XhoI

diese Arbeit

pJG-ISCU pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscU (ssl2267) von Synechocystis, iscU kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen

diese Arbeit

pSH18-34 pUC

Reporter-Plasmid für das Hefe Two-Hybrid System., lacZ unter der Kontrolle des GAL1- Promotors (UASG gegen LexA op(x8) ausgetauscht), URA3

ESTOJAK ET AL., 1995

pCDC28 pEG202 Positivkontrolle für das Hefe Two-Hybrid System

GYURIS ET AL., 1993

pCDI1 pJG4-5 Positivkontrolle für das Hefe Two-Hybrid System

GYURIS ET AL., 1993

2.3.3 Plasmidschnellisolierung (HOLMES & QUIGLEY, 1989)

STET-Puffer: 8 % Saccharose, 0,1 % Triton X 100, 50 mM EDTA

50 mM Tris/HCl, pH 8,0

TE-Puffer: 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA

1,5 ml Übernachtkultur wurden in einem Eppendorfgefäß in der Tischzentrifuge

sedimentiert (2 min, 13000 Upm) und der Überstand komplett abgenommen. Das


35

Sediment wurde in 200 µl STET resuspendiert, 10 µl Lysozym (20 mg/ml)

hinzugegeben und der Ansatz 5 min bei RT inkubiert. Der Ansatz wurde 45 s

gekocht und kurz im Eisbad abgekühlt. Zelltrümmer, chromosomale DNA und nicht

aufgeschlossene Zellen wurden 30 min in der Tischzentrifuge sedimentiert (13000

Upm) und das Sediment mit einem sterilen Zahnstocher entfernt. Zu dem Überstand

wurden 6 µl 5% CTAB in 700 mM NaCl gegeben. Der Ansatz wurde gemischt und 5

min abzentrifugiert (13000 Upm). Der Überstand wurde verworfen und das Sediment

in 300 µl 1,2 M NaCl resuspendiert. Zu dem Ansatz wurden 750 µl Ethanol gegeben

und der Ansatz zentrifugiert (13000 Upm, 10 min). Die DNA wurde mit 500 µl 70%

Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Sediment wurde getrocknet und in

50 µl TE mit 10 µg/ml RNase gelöst.

2.3.4 Plasmidisolierung im präparativen Maßstab

Die Plasmidisolierung im präparativen Maßstab erfolgte mit dem Machery & Nagel

AX 100 Kit. Die Plasmidisolierung erfolgte nach der Anleitung und mit dem

Material des Herstellers. Ein Aliquot der erhaltenen DNA-Lösung wurde

abgenommen und die DNA-Konzentration im Photometer (siehe 2.3.5) bestimmt.

Bei einem Verhältnis OD260/OD280 von weniger als 1,75 wurde zur Entfernung der

kontaminierenden Proteine eine P/C-Extraktion mit anschließender Ethanolfällung

durchgeführt (siehe 2.3.11)

2.3.5 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung

von DNA

Die Extinktion einer Verdünnung der präparierten DNA wurde im Photometer bei

260 nm und 280 nm bestimmt. Eine OD260 von 1 entspricht einer DNA-

Konzentration von 0,05 µg/µl (MÜLLER ET AL., 1993). Über das Verhältnis der

Absorption bei 260 nm zu 280 nm ließ sich die Reinheit der DNA-Präparation

abschätzen. Wenig verunreinigte Lösungen weisen ein Verhältnis von ca. 1,8 auf. Je

stärker Lösungen verunreinigt sind, desto niedriger ist dieses Verhältnis.

2.3.6 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA-

Fragmenten

1x TBE-Puffer: 0,09 M Tris, 0,09 M Borsäure, 0,002 M EDTA, pH 8,0


36

Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden Agarosegele eingesetzt mit 0,5 x

TBE als Puffersystem. Die Agarosekonzentration im Gel wurde entsprechend den zu

trennenden Fragmentgrößen gewählt und das Gel vor dem Gießen wurde mit etwa 1

µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die zu analysierende DNA-Lösung wurde mit etwa

1/10 Vol 10 x Ladepuffer (Takara) versetzt und in die Taschen des Gels aufgetragen.

Zur Auftrennung wurde für 20-40 min eine konstante Spannung von ca. 7 V/cm

angelegt. Zur Abschätzung der Fragmentgrößen wurde auf das Gel ein

Längenstandard mit aufgetragen.

2.3.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen

Die DNA-Bande wurde durch Vergleich mit dem Größenstandard auf dem UV-Tisch

im Agarosegel identifiziert und mit einem Skalpell aus diesem ausgeschnitten. Die

Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit einem Kit der Firma

Pharmacia nach Anleitung des Herstellers. Dazu wurden die mitgelieferten Säulen

und Lösungen verwendet. Nach der Extraktion wurde das eluierte Fragment in 20-50

µl 1/10 TE-Puffer aufgenommen.

2.3.8 Spaltung mit Restriktionsendonukleasen

Die Restriktionsenzyme wurden in den von den Herstellern mitgelieferten Puffern

angewendet und unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen inkubiert.

Für die Gewinnung von DNA-Fragmenten zur Ligation wurden 3-5 µg DNA mit

1/10 Vol 10x Reaktionspuffer und 10 U Restriktionsenzym in einem geeignetem

Volumen (40-80 µl) für 1,5-2,5 h inkubiert.

Für Testrestriktionen nach der Plasmidschnellisolierung wurden 2-5 µl DNA mit 1 µl

10-fach Reaktionspuffer und 2 U Restriktionsenzym in 10 µl Gesamtvolumen 1 h

inkubiert.

2.3.9 Dephosphorylierung von DNA

Um eine Religation eines Plasmids zu verhindern, das nur mit einem

Restriktionsenzym gespalten worden war, wurde das gespaltene Plasmid vor der

Ligation dephosphoryliert. Das Volumen der Lösung, die den linearisierten Vektor

enthielt wurde mit H2O auf 75 µl aufgefüllt. Zu dem Ansatz wurden 10 µl 10x

Dephosphorylierungspuffer und 0,2 µl in 15 µl Verdünnungspuffer verdünnte CIAP

(Gibco) gegeben. Der Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert und danach einer P/C

Extraktion (2.3.11) unterzogen.


37

2.3.10 Ligation

Die DNA-Konzentration der zu ligierenden DNA-Fragmente wurde über ein

Agarosegel abgeschätzt. Für die Ligation wurde ein DNA-Verhältnis Fragment zu

Vektor von 3:1 gewählt. Die Ligation erfolgte in 20 µl Gesamtvolumen in

Ligasepuffer und 0,2 µl T4-DNA-Ligase (Gibco 5U/µl). Die Inkubation erfolgt bei

4°C ü.N. oder bei RT für 1 h. Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne Fragment wie

oben beschrieben behandelt.

2.3.11 Phenol / Chloroform (P/C) Extraktion und DNA-Fällung

Um Proteine aus DNA-Lösungen zu entfernen, wurde die Phenol / Chloroform

Extraktion mit anschließender DNA-Fällung durchgeführt. Dazu wurde das Volumen

der Lösung auf mindestens 100 µl eingestellt. 1 Vol wassergesättigtes Phenol /

Chloroform / Isoamylalkohol (25:24:1) wurde zu dem Ansatz gegeben und der

Ansatz durchmischt. Der Ansatz wurde 2 min bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge

zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Der Überstand wurde

mit dem gleichen Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24:1) versetzt, gemischt

und 1 min zentrifugiert (13000 Upm). Der Überstand wurde wiederum in ein neues

Gefäß überführt, mit 1/10 Vol 3 M Natriumacetat und 2,5 Vol Ethanol versetzt,

gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde 15 min bei 13000 Upm

abzentrifugiert, das Sediment mit 500 µl 70 % Ethanol gewaschen und getrocknet.

Das DNA-Sediment wurde in einem geeigneten Volumen TE-Puffer gelöst.

2.3.12 Präparation genomischer DNA aus Synechocystis

10 ml einer Synechocystis-Kultur (OD730 ≥ 2) wurden bei 5000g für 10 min

zentrifugiert und das Sediment zweimal in 1 ml TES-Puffer (5 mM Tris/HCl, pH 8,5,

50 mM NaCl, 5 mM EDTA) gewaschen. Das Sediment wurde dann in 450 µl TES-

Puffer resuspendiert und 50 µl Lysozymlösung (20 mg/ml) hinzugegeben. Der

Ansatz wurde 15 min bei RT inkubiert und 100 µl einer 10% Sarkosyllösung

hinzugegeben. Dann wurde der Ansatz mit 600 µl Phenol/Chloroform/

Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt und 15 min auf einem Taumelschüttler inkubiert.

Nach einer Zentrifugation (10 min/13000 Upm/RT) wurde die wässrige obere Phase

abgenommen und in neues Gefäß überführt. Nach Zugabe von 100 µl 5 M NaCl,

100 µl CTAB (10 % w/v in 0,7M NaCl) und 600 µl Chloroform/Isoamylalkohol

(24:1) wurde der Ansatz erneut auf einem Schüttler 15 min inkubiert und


38

anschließend zentrifugiert (13000 Upm, 10 min, RT). Die wässrige Phase wurde

erneut abgenommen und in ein neues Gefäß überführt, mit 600 µl Isopropanol

versetzt und wiederum zentrifugiert. Das resultierende DNA-Sediment wurde mit

70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 50-100µl TE-Puffer resuspendiert.

Die Konzentration und Reinheit der DNA wurde nach 2.3.5 bestimmt.

2.3.13 Polymerase-Kettenreaktion

Mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, MULLIS & FALOONA, 1987) können DNA-

Fragmente von einer Vorlage-DNA gezielt amplifiziert werden. Dazu wird die

Vorlage-DNA denaturiert. An die einzelsträngige DNA können Oligonukleotide

(Primer) angelagert werden, die vom 3’-Ende aus durch eine thermostabile DNA-

Polymerase Taq-Polymerase verlängert werden können. In weiteren Zyklen, die aus

einem Denaturierungs-, Anlagerungs- und Verlängerungsschritt bestehen dienen die

neu synthetisierten DNA-Stränge wiederum als Vorlage-DNA, so dass DNA-

Fragmente mit definierter Größe entstehen.

Alle PCR-Ansätze enthielten 1x PCR-Puffer, 25 pmol der jeweiligen Oligo-

nukleotide (2.3.1), 2,5 mM MgCl2 und 0,2 mM dNTP. Das Reaktionsvolumen betrug

i.d.R. 100 µl.

Bei Verwendung chromosomaler DNA als Vorlage betrug die DNA-Konzentration

2-20 µg/ml. Den PCR-Ansätzen wurde dann 5% (v/v) DMSO zugesetzt. Es wurden

30 Zyklen aus Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung durchgeführt.

Bei Verwendung von Plasmid-DNA als Vorlage betrug die DNA-Konzentration 50

ng/ml. Es wurden dann 25 Zyklen durchgeführt.

Zu Beginn einer PCR-Reaktion wurde die DNA für 3 min denaturiert. Dann wurden

25 U/ml Taq-Polymerase zugegeben. Die Zyklen bestanden aus je 30s

Denaturierung bei 94°C, einer Anlagerungsphase von 1 min bei 50-60°C und einer

Verlängerungsphase bei 72°C (1 min pro zu amplifizerendes kb). Den Zyklen folgte

eine 10-minütige Verlängerungsphase. Danach wurden die Ansätze auf 4°C

abgekühlt. Der Erfolg einer PCR wurde dann durch eine Agarosegelelektrophorese

kontrolliert (2.3.6).

2.3.14 Ortsgerichtete Mutagenese

Die Mutagenese nach Kunkel et al. (1987) beruht auf dem Prinzip der Anlagerung

eines Mutagenese-Oligonukleotids an einzelsträngige Uracil–haltige DNA mit


39

nachfolgender Synthese des Komplementationsstrangs und Selektion gegen den

eingesetzten Parentalstrang.

Dazu wird ein Plasmid mit einem Replikationsursprung des Phagens M13 in E. coli

CJ236i transformiert. Dieser Stamm besitzt keine aktive dUTPase und Uracil-N-

Glycosylase, so dass statt Thymin gelegentlich Uracil in die DNA eingebaut wird.

Dieser Stamm wird über Sexpili mit dem Phagen VCSM13 infiziert. Im

Replikationszyklus des Phagens wird nun statt der Phagen-DNA zu einem großen

Anteil einzelsträngige Plasmid-DNA in den Phagen verpackt. Diese kann nach der

Lyse der Zellen und der Freisetzung der Phagen aus diesen isoliert werden und wird

dann als Vorlage für eine enzymatische Verlängerung eingesetzt. Zur Mutagenese

wird ein Oligonukleotid, das die gewünschte Mutation trägt, an die Einzelstrang-

DNA angelagert. Ausgehend vom 3’-Ende des Oligonukleotids wird der

Komplementationsstrang durch die T4-DNA-Polymerase synthetisiert mit dem 5’-

Ende des Oligonukleotids durch die Ligase ligiert. Die DNA wird dann in einen

Stamm transformiert, der eine aktive Uracil-N-Glycosylase besitzt, wodurch der

Uracil-haltige, nicht mutagenisierte Strang abgebaut wird. Dadurch wird mit einer

höheren Wahrscheinlichkeit der mutagenisierte Strang repliziert. Die DNA kann

dann isoliert werden und durch Restriktion und Sequenzierung die erfolgreiche

Mutagenese verifiziert werden.

2.3.14.1 Amplifikation des Helferphagen

Der Stamm WK6/VCSM13 wurde in 3 ml LB mit 25 µg/ml Km ü.N. angezogen. 1,5

ml der Kultur wurden für 5 min bei RT und 13000 Upm sedimentiert. Der die

Phagen enthaltene Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und bei

4 °C gelagert.

Zur Bestimmung des Phagentiters wurde in 1 ml LB-Medium eine Verdünnungsreihe

der Phagensuspension angesetzt. In Reagenzgläsern wurden je 3 ml flüssiger H-

Topagar (0,1 % (w/v) Trypton, 0,08 % (w/v) NaCl, 0,8 % (w/v) Agar) bei 37 °C

vorgelegt. Dazu wurden je 100 µl ü.N.-Kultur von WK6 und der Phagenverdünnung

(10-8 bis 10 -10) gegeben. Der Ansatz wurde auf vorgewärmte LB-Agarplatten

gleichmäßig verteilt. Nach dem Erstarren wurden die Platten ü.N. bei 37°C inkubiert.

Der Phagentiter konnte durch Auszählen der Plaques bestimmt werden.


40

2.3.14.2 Gewinnung der Einzelstrang-DNA

Das Plasmid mit der zu mutagenisierenden DNA-Sequenz wurde in CJ236i

transformiert. Mit 0,4 ml einer ü.N.-Kultur dieses Stamms wurden 20 ml LB-

Medium mit 10 µg/ml Tetracyclin und 50 µg/ml Ampicillin inokuliert und auf einem

Schüttler bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3 (≈ 3 x 108 Zellen/ml) angezogen. Die

Zellen wurden mit einem 20-fachen Überschuss des Phagen infiziert und nach einer

Stunde zur Selektion auf die vom Phagen infizierten Zellen Kanamycin bis zu einer

Konzentration von 50 µg/ml zugegeben. Die Zellen wurden ü.N. unter Schütteln bei

25°C inkubiert.

Zweimal 8 ml der Kultur wurden bei 10000 g für 15 min zentrifugiert und der

Überstand, der die aus den lysierten E. coli-Zellen freigesetzten Phagen enthielt,

abgenommen, mit 10 µl RNase (10 mg/ml) versetzt und für 30 min bei RT inkubiert.

Zu den Ansätzen wurden 2 ml PEG 6000 in 2,5 M NaCl zugegeben und 30 min auf

Eis inkubiert. Die Ansätze wurde bei 10000 g für 10 min zentrifugiert, der Überstand

abgenommen, erneut 1 min zentrifugiert und der Überstand erneut vollständig mit

einer Pasteurpipette entfernt. Das die Phagen enthaltende Sediment wurde in 100 µl

STE-Puffer (100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA) resuspendiert,

wodurch es zur Freisetzung der DNA kam, und die Ansätze vereinigt. Der Ansatz

wurde bei 13000 Upm für 2 min zentrifugiert und der Überstand abgenommen.

Danach schloss sich eine zweimalige Extraktion mit Phenol/Chloroform mit

anschließender DNA-Fällung an (2.3.11). Das die gereinigte Einzelstrang-DNA

enthaltende Sediment wurde in 20 µl TE-Puffer resuspendiert und die DNA über ein

Agarosegel (2.3.6) und eine DNA-Konzentrationsbestimmung (2.3.5) quantitativ und

qualitativ überprüft.

2.3.14.3 Phosphorylierung von Oligonukleotiden

Zur Einführung von Phosphatgruppen an 5’-Enden von Oligonukleotiden wurden

200 pmol eines Oligonukleotids in 30 µl Polynukleotidkinasepuffer mit 5 U

Polynukleotidkinase (Stratagene) 45 min bei 37°C inkubiert. Die

Polynukleotidkinase wurde anschließend durch Inkubation für 10 min bei 65°C

inaktiviert.


41

2.3.14.4 Anlagerungs- und Synthese-Reaktion

Zur Anlagerung des Oligonukleotids wurden 250 ng Uracil-haltige Einzelstrang-

DNA in 10 µl 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl mit 0,5 µl

phosphoryliertem Oligonukleotid (6,6 pmol/µl) versetzt und auf 80°C erhitzt. Der

Ansatz wurde dann in 5-minütigen Schritten von 5°C bis auf RT abgekühlt und dann

10 min auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 1 µl Synthesepuffer (5 mM dNTPs,

10 mM ATP, 100 mM Tris/HCl, pH 7,9, 50 mM MgCl2, 20 mM DTT), 1 U T4-

DNA-Polymerase und 3 U T4-DNA-Ligase wurde der Ansatz bei 37°C für 90 min

inkubiert. 10 µl wurden dann für die Transformation von E. coli (2.2.4.1) eingesetzt.

Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne Oligonukleotid identisch behandelt.

2.3.15 Multiple ortsgerichtete Mutagenese

Gleichzeitige Mutagenese mehrerer Stellen in einem Plasmid wurde durch das

QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit der Fa. Stratagene durchgeführt.

Diese Reaktion beruht auf dem Prinzip der Anlagerung von Mutagense-

Oligonukleotiden an durch Hitze denaturierte einzelsträngige DNA. Durch die

Reaktion der Pfu-Polymerase werden ausgehend vom 3’-Ende der Oligonukleotide

der zur Vorlage komplementäre Strang synthetisiert und dann durch die Reaktion der

Ligase mit den 5’-Enden der Oligonukleotide verknüpft. Bei dieser Reaktion

entstehen vor allem einzelsträngige mutagenisierte DNA-Stränge. Diese sind nicht

methyliert. Die anderen DNA-Arten, die entstehen können, sind die doppelsträngige

Vorlage-DNA und doppelsträngige DNA, bei der ein Strang von der Vorlage-DNA

stammt und der andere neu synthetisiert wurde. Diese Formen sind an einem oder

beiden DNA-Strängen methyliert, da die Vorlage-DNA aus E. coli isoliert wurde.

Zur Selektion gegen die ursprünglichen, nicht die Mutation tragenden Stränge, wird

der Mutageneseansatz mit DpnI restringiert. DpnI schneidet spezifisch nur

methylierte oder hemimethylierte DNA. Die nicht geschnittene zirkuläre

mutagenisierte DNA wird dann in E. coli transformiert und dadurch repliziert.

Ein Mutagenese-Ansatz enthielt 1x Mutagenesepuffer, 50 ng Vorlage-Plasmid-DNA,

100 ng jedes (bis zu 3) phosphorylierten (2.3.14.3.) Oligonukleotids und 0,2 mM

dNTP und 1 µl Multi-Enzyme-Blend (Pfu-Polymerase und Ligase).

Der Ansatz wurde bei 95°C für 3 min in einem Thermocycler denaturiert. Darauf

folgten 30 Zyklen mit jeweils 1 min Denaturierung bei 95°C, 1 min Anlagerung bei


42

55°C und 2 min/kb Plasmidlänge Verlängerung bei 65°C. Zu den Ansätzen wurde

nach der Reaktion 1 µl DpnI gegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Die DNA

wurde durch Hitzeschock-Transformation in E. coli XL10-Gold-Zellen transformiert

(2.2.4.1.3).

2.3.16 Sequenzierung von DNA

Sequenzierungen wurden von der Firma MWG-Biotech durchgeführt. Dazu wurde

etwa 1 µg aufgereinigte Plasmid-DNA benötigt.

2.4 Biochemische Methoden

2.4.1 Reinigung von Proteinen

Die Reinigung von Proteinen (IscA1, IscU, IscS) aus der löslichen Fraktion nach

Überexpression in E. coli umfasste verschiedene Fällungsschritte und die

Aufreinigung durch Säulenchromatographie. Alle Methoden wurden zunächst im

analytischen Maßstab etabliert, hier beschrieben sind die präparativen

Reinigungsschritte. Wenn nötig, wurden die Proteine zum Pufferaustausch zweimal

gegen das mindestens 100-fache Volumen des entsprechenden Puffers dialysiert

(Dialyseschläuche Fa. Sigma) und aufkonzentriert (Amicon-Ultrafiltrationszelle, YM

10 bzw. 30-Membranen)

2.4.1.1 Streptomycinsulfatfällung

Zur Entfernung von Kontaminationen durch Nukleinsäuren wurde der Rohextrakt

unter Rühren tropfenweise mit 1/10 Vol Streptomycinsulfatlösung (100 mM

Streptomycinsulfat in 20 mM HEPES/NaOH, pH 7,5) versetzt und 1 h auf Eis unter

Rühren inkubiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (20000 g, 20 min, 4°C)

von der Lösung getrennt und der Überstand für die Ammoniumsulfatfällung

verwendet

2.4.1.2 Ammoniumsulfatfällung

Zur Fällung wurde gemörsertes Ammoniumsulfat langsam auf Eis und unter Rühren

zum Rohextrakt zugegeben bis die erste gewünschte Konzentration erreicht war. Die

Lösung wurde mindestens für 1h auf Eis inkubiert und das Präzipitat durch

Zentrifugation (20000 g, 20 min, 4°C) von der Lösung getrennt. Der Vorgang wurde

wiederholt und das Sediment nach der zweiten Fällung in 20 mM HEPES/NaOH,


43

pH 8,0, 1 mM DTT (IscA1), 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 1 mM DTT

(SynIscU) oder 20 mM TAPS, pH 9,0 (IscS) resuspendiert und dialysiert.

Tab. 2-13 Für die Fällung der verschiedenen

Proteine verwendeten Ammonuimsulfatkonzentrationen

Protein 1. Fällung [M] 2. Fällung [M] IscA1 1,23 2,05

SynIscU 1,64 2,87 IscS 1,03 1,64

2.4.1.3 Reinigung durch HPLC/FPLC HPLC-Anlage: FLPC-Anlage: Bio-CAD 700 E (PerSeptive) Fraktionssammler Modell FC 203 B (Gilson) Kyrostat Thermomix B und Frigomix (B. Braun) Säulenofen, Sonderanfertigung 60 cm (Jasco)

GradiFrac System (Pharmacia): Pumpe: Peristaltic Pump P-1 GradiFrac System Rack UV-Detektor: UV-1 Schreiber: REC 102 im Kühlraum 8°C

Alle Chromatographieschritte wurden zunächst an der HPLC-Anlage etabliert und

dann bei weiteren Wiederholungen z.T. an der FPLC-Anlage im Kühlraum

durchgeführt.

2.4.1.3.1 IscA1

Die Aufreinigung von IscA1 erfolgte über zwei Säulenchromatographieschritte. Als

erstes wurde ein hydrophobe Interaktionschromatographie und als zweites eine

Hydroxylapatitchromatographie durchgeführt. Die Detektion von IscA1 im Eluat

erfolgte spektroskopisch bei 280 nm.

Zur hydrophoben Interaktionschromatographie wurde eine Säule (Pharmacia XK26,

2,6 x 15 cm) gefüllt mit Butylsepharose (Pharmacia) mit etwa 200 ml 20 mM

HEPES/NaOH, pH 8,0, 760 mM Ammoniumsulfat, 1 mM DTT und einer Flussrate

von 5 ml/min äquilibriert. 80 mg Extrakt nach Ammoniumsulfatfällung wurden auf

eine Ammoniumsulfatkonzentration von 760 mM eingestellt, mit 2,5 mM DTT

versetzt und auf die Säule geladen. Diese wurde mit 140 ml 20 mM HEPES/NaOH,

pH 8,0, 760 mM Ammoniumsulfat, 1 mM DTT gewaschen. IscA1 wurde durch

einen Gradienten von 760 bis 0 mM Ammoniumsulfat in 20 mM HEPES/NaOH, pH

8,0, 1 mM DTT in 420 ml eluiert. Die Fraktionen wurden durch eine SDS-PAGE


44

(2.4.4) analysiert und die IscA1 enthaltenen Fraktionen vereinigt, aufkonzentriert

und gegen 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 1 mM DTT dialysiert.

Zur Hydroxylapatitchromatographie (1 ml/min) wurde eine Säule (Pharmacia HR5/5,

0,5 x 5 cm), gefüllt mit Hydroxylapatit (Typ 1, Biorad), mit 10 ml 20 mM

Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 1 mM DTT äquilibriert und mit 2 mg IscA1 nach

HIC beladen. Das reine IscA1 wurde mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5,

1 mM DTT von der Säule eluiert, während kontaminierende Proteine an der Säule

gebunden blieben. Die Fraktionen wurden mit einer SDS-PAGE überprüft,

verreinigt, aufkonzentriert und gegen 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0 dialysiert.

Die Reinigung der Varianten von IscA1 erfolgte entsprechend der Vorgehensweise

beim Wildtyp-Protein.

2.4.1.3.2 SynIscU

Die Aufreinigung von SynIscU (WOLLENBERG, 2000) erfolgte über eine hydrophobe

Interaktionschromatographie (5 ml/min) und einer anschließende Gelfiltration. Die

Detektion von SynIscU im Eluat erfolgte spektroskopisch bei 220 nm. Eine

Butylsepharose-Säule (Pharmacia, XR26, 2,6 x 15 cm, Flussrate 5 ml/min) wurde

mit 200 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 0,6 M Ammoniumsulfat, 1 mM

DTT äquilibriert und 80 mg Rohextrakt nach Ammoniumsulfatfällung in 20 mM

Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 0,6 M Ammoniumsulfat, 2,5 mM DTT auf die

Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 140 ml des Puffers gewaschen und SynIscU

durch einen Gradienten von 0,6 M auf 0 M Ammoniumsulfat in ca. 350 ml 20 mM

Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 1 mM DTT eluiert. Die SynIscU enthaltenen

Fraktionen wurden vereinigt und aufkonzentriert und gegen PBS (4 mM KH2PO4, 16

mM Na2HPO4, 115 mM NaCl), 1 mM DTT dialysiert.

Zur weiteren Aufreinigung von IscU wurde eine Gelfiltration durchgeführt. Als

Säule wurde eine Superose 12 HR 10/30-Säule (Pharmacia) verwendet und mit PBS,

1 mM DTT äquilibriert. Die Flussrate betrug 0,7 ml/min. Auf die Säule aufgetragen

wurden 2 mg SynIscU nach der HIC. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden

über eine SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, die IscU in möglichst reiner Form

enthielten, wurden vereinigt, eingeengt und gegen 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0

dialysiert.


45

2.4.1.3.3 IscS

Zur Aufreinigung von IscS (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) nach

Ammoniumsulfatfällung wurde eine Säule (Butylsepharose, XK26, Pharmacia, 2,6 x

15 cm, Flussrate 5 ml/min) mit 200 ml Hochsalzpuffer (20 mM TAPS, pH 9,0, 0,25

M Ammoniumsulfat äquilibriert und die Ammoniumsulfatkonzentration der

Proteinlösung ebenfalls auf 0,25 M eingestellt. Nach dem Beladen der Säule wurde

diese mit 140 ml Hochsalzpuffer gewaschen. Danach wurde IscS mit

Niedrigsalzpuffer (20 mM TAPS, pH 9,0) eluiert. Die Detektion der Proteine im

Eluat erfolgte spektroskopisch bei 280 nm. Die erhaltenen Fraktionen wurden über

eine SDS-PAGE analysiert und die Fraktionen, die IscS in möglichst reiner Form

enthielten, vereinigt und eingeengt. Zur Rekonstitution von IscS mit dem Kofaktor

Pyrydoxalphosphat wurde IscS mit 0,1 mM PLP versetzt und 2 h inkubiert. Durch

Dialyse (siehe 2.3.7.1) gegen 20 mM TAPS pH 9,0 wurde der Überschuss an PLP

wieder entfernt.

2.4.2 Rückfaltung von IscA2

Die Konzentration unlöslichen Aggregate (2.2.6.1.2.1) wurde durch einen Vergleich

der in einer SDS-PAGE (2.4.4.1) auftretenden Banden der unlöslichen Aggregate mit

Banden bekannter Mengen Lysozym abgeschätzt. Ein Aliquot der Suspension wurde

abzentrifugiert und in 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, 8 M Harnstoff, 10 mM DTT gelöst,

so dass eine Konzentration von 10 mg/ml erreicht wurde. Zum Lösen der Aggregate

wurde der Ansatz eine Stunde auf Eis inkubiert und die nicht gelösten Bestandteile

durch einen Ultrazentrifugationsschrtitt (100000g, 15 min) entfernt.

Zur Ermittlung der optimalen Rückfaltungsbedingungen wurden die gelösten

Aggregate durch langsame Zugabe in folgenden Puffer (2ml) schnell 100-fach

verdünnt. Generell wurden basische Pufferbedingungen gewählt und der Einfluss

von Arginin auf die Rückfaltung untersucht.

Puffer A: 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM DTT, Puffer B: 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, Puffer C: 100 mM Tris/HCl, pH 9,0, 1 mM DTT, Puffer D: 1 M Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, Puffer E: 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, 0,5 M Arginin Puffer F: 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, 1 M Arginin Die Rückfaltungsansätze wurden eine Stunde auf Eis unter Rühren inkubiert und das

nicht korrekt rückgefaltete, aggregierte Protein durch einen Ultrazentrifugations-


46

schrtitt entfernt. Die Protein-Konzentration des Rückfaltungsansatzes wurde

bestimmt (2.4.3.1) und die Homogenitität des rückgefalteten Proteins über eine

Anionenaustauschchromatographie bestimmt. Dazu wurde eine Säule (HR5/5, Q-

Sepharose, Pharmacia, 0,5 x 5 cm, Flussrate: 1 ml/min) mit 20 mM Tris/HCl, pH 8,0,

1 mM DTT äquilibriert und mit 1 ml des Überstands nach der Ultrazentrifugation

beladen. Das Protein wurde durch einen isokratischen Gradienten von 0 bis 1 M

NaCl eluiert. Die Detektion erfolgte bei 280 nm.

Für die präparative Rückfaltung von IscA2 wurden die Bedingungen der

analytischen Ansätze beibehalten. Die Rückfaltung erfolgte dann in 50 – 100 ml

Puffer C. Nach der Zentrifugation wurde das Protein aufkonzentriert und gegen 20

mM Tris/HCl, pH 8,0 dialysiert.

2.4.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen

2.4.3.1 Proteinbestimmung

Zur Proteinbestimmung (BRADFORD, 1976) wurden kleine Volumina (1-10 µl) der zu

testenden Proteinlösung mit Wasser auf 800 µl aufgefüllt. Zu dem Ansatz wurden

200 µl Bradford-Reagenz (Biorad) zugegeben, gemischt und die Probe für

mindestens 5 min (maximal 15 min) bei RT inkubiert. Die Absorption der Proben

wurde bei 595 nm bestimmt. Als Nullwert diente ein Wert ohne Proteinlösung. Zur

Quantifizierung der Proteinmenge wurden Eichansätze erstellt, die 0, 1, 2, 3, 4, 5,

7,5, 10 und 12,5 µg BSA enthielten

2.2.3.2 Konzentrationsbestimmung von Ferredoxin

Die Proteinkonzentration wurde für Holoferredoxin sowohl photometrisch bei 423

nm (ε423 = 6400 M-1 cm-1) als auch über einen Bradfordtest ermittelt. Aus den

unterschiedlichen Werten wurde ein Korrekturfaktor errechnet, mit dem das Ergebnis

der Proteinbestimmung nach Bradford des Apoferredoxins korrigiert wurde.

2.4.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

2.4.4.1 SDS-PAGE

Die SDS-PAGE wurde nach LAEMMLI (1970), modifiziert SEIDLER (1994) durchge-

führt. Der Quervernetzungsgrad, der dem Verhältnis der Konzentration von

Bisacrylamid zur Gesamtkonzentration an Acrylamid und Bisacrylamid entspricht,


47

betrug 2,6 %. Die Konzentration an Acrylamid im Trenngel wurde je nach

Proteinprobe variiert. Als Starter der radikalischen Polymerisation wurde

Ammoniumpersulfat, als Radikalüberträger TEMED verwendet. SDS bindet

unspezifisch an Proteine, so dass diese negativ geladen sind und bei der

Elektrophorese zur Anode laufen. Dabei ist die Laufstrecke normalerweise

umgekehrt proportional zum Logarithmus des Molekulargewichts.

Das Sammelgel hatte folgende Zusammensetzung: 125 mM Tris/HCl, pH 6,8, 0,2 %

(w/v) SDS, 5,15 % (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid, 0,13 % (v/v) TEMED und

0,07 % (w/v) Ammoniumpersulfat. Das Trenngel enthielt 750 mM Tris/HCl, pH 8,8,

0,1 % (w/v) SDS, 12,5 - 17,5 % (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid 0,08 % (v/v)

TEMED und 0,08 % (w/v) Ammoniumpersulfat. Es wurden Gele mit einer Höhe von

7 cm, einer Breite von 8,3 cm und einer Dicke von 0,75 mm verwendet. 4 Volumina

der Proteinprobe wurden mit 1 Volumen 5x Probenpuffer (160 mM Tris/HCl, pH

6,8, 5 % (w/v) SDS, 0,5 M DTT, 25% (w/v) Glycerin, 0,05 % (w/v)

Bromphenolblau) versetzt, für 1 min bei 100 °C denaturiert und nach kurzem

Abkühlen für 5 min bei 13000 U/min zentrifugiert. Es wurden 5 bis 25 µl

Proteinlösung auf das Gel aufgetragen. Für Anode und Kathode wurde 1x Laufpuffer

verwendet (192 mM Glycin, 50 mM Tris, 0,1 % SDS, pH 8,3). Die Elektrophorese

wurde bei 20 - 30 mA und maximal 220 V durchgeführt. Nachdem die Farbstofffront

das untere Ende des Gels erreicht hatte, wurde die Elektrophorese beendet und das

Gel gefärbt oder geblottet.

2.4.4.2 nicht-denaturierende PAGE

Für die Analyse von Ferrdoxin-haltigen Ansätzen wurde eine nicht-denaturierende

Gelelektrophorese durchgeführt. Dazu wurden 20%ige Polyacrylamidgele benutzt.

Die Zusammensetzung der Gele war dabei wie unter 2.4.4.1 beschrieben, allerdings

ohne SDS im Ladepuffer, Trenngel und Sammelgel und mit 375 mM Tris/HCl im

Trenngel. Die Spannung wurde auf maximal 200 V limitiert und die Elektrophorese

mit 13 mA Stromstärke durchgeführt.

2.4.4.3 Coomassie Gelfärbung

Lösungen : Färbelösung: 0,2 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R, 40 % (v/v) Methanol

7 % Essigsäure Entfärber: 40 % (v/v) Methanol, 7 % Essigsäure


48

Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue R bindet an die Proteine im Gel, die durch

Essigsäure im Gel fixiert wurden. Die SDS- und nicht-denaturierenden

Polyacrylamidgele wurden für mindestens 20 min in der Färbelösung geschwenkt.

Zum Entfernen der Hintergrundfärbung wurden die Gele danach für mindestens 6 h

mit Entfärber behandelt. Die Gele wurden zur Dokumentation fotografiert.

2.4.4.4 Färbung von Gelen mit Stains All

Zur Färbung von Ferredoxin-haltigen Gelen wurde, da Ferredoxine als sehr saure

Proteine wenig Coomassie binden, eine Färbung mit Stains-All durchgeführt. Dazu

wurde das Gel nach der Elektrophorese 15 min in 25 % (v/v) Isopropanol bei 60°C

und dann für mindestens 5 h im Dunkeln mit 0,1 mM Stains-All in 30 mM Tris/HCl,

pH 8,8, 10 % (v/v) Formamid und 25 % (v/v) Isopropanol inkubiert. Zum Entfärben

wurden die Gele mit Wasser gewaschen und für 1 – 2 min auf einem

Overheadprojektor belichtet. Im Anschluss daran wurden die Gele zur

Dokumentation fotografiert.

2.4.5 Immundetektion von Proteinen

2.4.5.1 Elektrotransfer von Proteinen

Zum Transfer von Proteinen auf Membranen wurde ein Semi-Dry-Western-Blot

durchgeführt. Dazu wurde zunächst eine PVDF-Membran für 1 min in Methanol

aktiviert und dann in Transferpuffer (20 mM CAPSO, pH 11,2, 20 % (v/v)

Methanol) überführt. Das Gel und Blotting-Papier (GB002, Gelblotting-Papier,

Schleicher & Schuell) wurden ebenfalls in Transferpuffer inkubiert. Der Transfer

vom Gel auf die Membran erfolgte zwischen je drei Lagen Blotting-Papier für 1 bis

1,5h bei 1,5 mA/cm².

2.4.5.2 Immunnachweis

Zur Absättigung der PVDF-Membran wurde die Membran nach dem Elektrotransfer

in 5 % (w/v) Trockenmilchpulver in TBST (10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl,

0,05% (v/v) Tween 20) inkubiert, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden.

Danach wurde die Membran zweimal 5 min mit 15 ml TBST gewaschen. Zur

Detektion der Proteine wurde die Membran mit dem primären Antikörper verdünnt

in 15 ml TBST für 1 h inkubiert. Die Antikörper und die verwendeten

Verdünnungen sind in Tab. 2-14 aufgeführt. Zur Entfernung der unspezifisch


49

gebundenen Antikörper wurde die Membran erneut zweimal 5 min mit 15 ml TBST

gewaschen. Dann wurde die Membran mit dem sekundären Antikörper (anti-

Kaninchen-Antikörper, gekoppelt an die alkalische Phosphatase, Sigma, 1:30000) in

15 ml TBST inkubiert, wieder zweimal mit TBST gewaschen und in den

Reaktionspuffer für die alkalische Phosphatase (100 mM Tris/HCl, pH 9,5, 100 mM

NaCl, 5mM MgCl2,) überführt. Dann wurde die Membran durch eine Farbreaktion

der alkalische Phosphatase gefärbt. Dazu wurde die Membran in 10 ml AP-Puffer

mit 0,0125 % (w/v) NBT und BCIP unter leichtem Schwenken inkubiert, bis die

Signale die gewünschte Intensität erreicht hatten.

Tab. 2-14: Verwendete Antikörper und Verdünnungen. Die Antikörper wurden von der Fa.

Biogenes gegen hochgereinigte Proteine in Kaninchen hergestellt.

Antikörper Verdünnung Referenz anti-IscA1 1:10000 diese Arbeit anti-IscA2 1:10000 diese Arbeit anti-IscU 1:8000 diese Arbeit anti-IscS 1:8000 A. Seidler, unveröffentlicht

2.4.6 Sulfidbestimmung

Zur Bestimmung des Sulfidgehaltes einer Lösung wurde der Sulfidnachweis nach

SIEGEL (1965) angewendet. Der Sulfidnachweis wurde unter anaeroben Bedingungen

(unter Argonbegasung) durchgeführt. Das Volumen der Ansätze betrug 0,5 oder 1

ml.

Zu der Lösung, deren Sulfidgehalt bestimmt werden sollte, wurde schnell

aufeinanderfolgend 0,1 ml 0,02 M N,N-dimethyl-p-phenylendiaminsulfat in 7,2 N

HCl und 0,1 ml 0,03 M FeCl3 in 1,2 M HCl zugegeben. Die Proben wurden gemischt

und für 30 min im Dunkeln inkubiert. Bei der Anwesenheit von Sulfid wird unter

diesen Bedingungen Methylenblau gebildet, das bei 650 nm absorbiert. Als Nullwert

diente ein Ansatz mit Puffer.

Die Quantifizierung des Sulfids erfolgte über eine Eichgerade mit 0, 10, 20, 30 und

40 nmol Na2S. Die Proben der Eichreihe wurden in der gleichen Weise wie die

Testansätze behandelt.

2.4.6.1 IscS Aktivitätstest

Für einen IscS-Aktivitätstest (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) enthielten die Ansätze

20 mM TAPS, pH 9,0, 1 mM DTT, 0,2 mM L-Cystein, 10 µM PLP. Die Reaktion


50

wurde durch die Zugabe von IscS (i.d.R. 6 µg) gestartet. Die Proben wurden für

i.d.R. 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch den

Sulfidnachweis gestoppt. Die spezifische Aktivität von IscS lag in etwa bei 7,5 µM /

min x mg.

2.4.7 Eisenbestimmung

Die Eisenbestimmung wurde nach der Methode von FISH (1988) durchgeführt. Alle

Angaben beziehen sich auf ein Reaktionsvolumen von 1 ml. Dazu wurde die

Proteinlösung, deren Eisengehalt bestimmt werden sollte, zur Freisetzung des Eisens

mit 0,5 ml 0,6 N HCl, 2,25 % (w/v) KMnO4 versetzt und 2 h bei 60°C inkubiert. Die

Ansätze wurden auf RT abgekühlt und zu den Ansätzen 100 µl reduzierende Eisen-

chelatierende Ferrozine Lösung (6,5 mM Ferrozin, 13, mM Neocuproin, 2 M

Ascorbinsäure, 5 M Ammoniumacetat) gegeben. Nach 15 min Inkubation (RT) und 5

min Zentrifugation (13000 Upm) wurde der magentafarbige Fe(II) [Ferrozin]32+

Komplex photometrisch bei 562 nm bestimmt.

Zur Quantifizierung des Eisengehaltes wurde eine Eichgerade mit 0, 1, 2, 3, 4, 5 und

6 µg Eisen (in A. bidest.) erstellt.

2.4.8 analytische Gelfiltrationschromatographie

HPLC-Anlage bestehend aus: HPLC-Pumpe Modell 515 (Waters), Photodioden

Array Detector (Waters), Säulenofen, Sonderanfertigung (Jasco)

Zur Bestimmung des Oligomerisierungszustandes von IscA1 wurde eine analytische

Gelfiltrationschromatographie durchgeführt. Dazu wurde eine Superose 12 HR

10/30-Säule (Pharmacia) verwendet und mit PBS, 1 mM DTT äquilibriert. Die

Flussrate betrug 0,7 ml/min. Die Probe wurde durch einen Injektionsschleife auf die

Säule aufgetragen. Das Volumen der Probe betrug 100 µl. Zur Eichung der

Molekulargewichte wurde ein Molekulargewichtsstandard (Biorad) bestehend aus

folgenden Substanzen aufgetragen: Tyroglobulin (Rind; 670 kDa), Gamma-Globulin

(Rind; 158 kDa), Ovalbumin (Huhn; 44 kDa), Myoglobin (Pferd; 17 kDa) und

Vitamin B12 (1350 Da).


51

2.4.9 Rekonstitution von FeS Zentren

2.4.9.1 IscA1 und IscA2

Zur Rekonstitution des FeS Zentrums an IscA1 und IscA2 wurde das Protein (50-200

µM) mit 5 molaren Äquivalenten L-Cystein, 2 molaren Äquivalenten

Fe(NH4)2(SO4)2 (auch Fe(III)ammoniumcitrat) pro Protein-Monomer unter

anaeroben Bedingungen (Argonbegasung) in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0

inkubiert. Als Reduktionsmittel enthielten die Ansätze 85 mM β-Mercaptoethanol,

wenn andere Reduktionsmittel (5 mM DTT) verwendet wurden ist dies vermerkt.

Die Reaktion wurde durch die Zugabe von katalytischen Mengen IscS gestartet.

Nach 2 h wurde der Ansatz über eine Sephadex-G25-Spin Column (0,7 x 6 cm),

äquilibriert mit 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, aufgereinigt.

Zur Optimierung der Rekonstitutionsreaktion wurden auch größere Mengen an

Cystein und Eisen, bis zu einem 10-fachen Überschuss, eingesetzt. Dies führte aber

nicht zu einem höheren Eisen- und Sulfidgehalt an IscA.

2.4.9.2 SynIscU

Das FeS Zentrums an SynIscU wurde mit der gleichen Methode wie bei IscA

rekonstituiert. Die Rekonstitution erfolgte in 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM

KCl, 125 mM NaCl, 85 mM β-Mercaptoethanol. Die Reinigung über eine

Gelfiltration erfolgte über Sephadex-G25-Spin-Column (0,7 x 6 cm), äquilibriert mit

dem gleichen Puffer ohne β-Mercaptoethanol.

2.4.9.3 Rekonstitutionen für die Mössbauer-Spektroskopie

Die Rekonstitution der FeS-Zentren für die Mössbauer-Spektroskopie erfolgte unter

den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Als Eisenquelle wurde

metallisches 57Fe in verdünnter Schwefelsäure gelöst und der pH der Lösung mit

Ammoniumhydroxid auf ca. pH 2 eingestellt. Um Schäden durch die Säure der 57Fe-

Lösung zu verhindern, wurde der Rekonstitutionsansatz mit 100 mM HEPES/NaOH,

pH 8,0 gepuffert. Der Ansatz wurde nach der Inkubation über eine PD10-Säule

(Pharmacia), äquilibriert mit entgastem und mit Argon gespültem 20 mM

HEPES/NaOH, pH 8,0 (IscA1) bzw. 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl,

125 mM NaCl (SynIscU) gereinigt und dann in einem Centriprep mit YM10-

Membran bei 3000 g in der Zentrifuge eingeengt. Von einem Aliquot der Probe

wurde die Konzentration durch einen Bradfordtest bestimmt (2.4.3.1), ein


52

Absorptionsspektrum aufgenommen und die Probe in einer Mössbauerküvette

eingefroren.

2.4.10 Untersuchungen zur Stabilität der FeS Zentren

Zur Untersuchung der Stabilität der FeS-Zentren an IscA1 und SynIscU wurden die

rekonstituierten Proteine in 20 mM HEPES/NaOH pH 8,0 (IscA1) bzw. 50 mM

HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl/ 10 % Glycerin (v/v) (SynIscU)

inkubiert. Die Versuche wurden in der Anwesenheit und Abwesenheit von Sauerstoff

ohne und mit Zusatz eines Reduktionsmittels (5 mM DTT, 85 mM β-

Mercaptoethanol) durchgeführt. Der Nachweis eines FeS-Zentrums an IscA1 und

SynIscU erfolgte über UV/Vis-Spektroskopie (2.5.1) nach 5, 10, 20, 30, 60, 120 min.

2.4.11 Experimente zur Übertragung des FeS Zentrums von IscA

und SynIscU auf Apo-FeS-Proteine

2.4.11.1 Übertragung des FeS Zentrums auf Apoferredoxin

Synechocystis Ferredoxin (Ssl0020) wurde in E. coli (BARTH ET AL., 2000) exprimiert

und gereinigt (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000).

2.4.11.1.1 Herstellung von Apoferredoxin

(nach MEYER ET AL., (1986), verändert)

1 ml Holoferredoxin aus Synechocystis PCC 6803 (ca. 2 mg/ml in 20 mM Tris-HCl,

pH 7,5, 10 mM DTT) wurde in ein mit Argon begastes, auf Eis gelagertes Greiner-

Röhrchen überführt. 10 M HCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M

zugegeben und der Ansatz für 45 min auf Eis unter ständigem Rühren und Argon-

Begasung inkubiert. Im Anschluss wurde die Suspension zentrifugiert (15000 g, 10

min, 4°C) und das weiße Sediment mit begastem A. bidest., 10 mM DTT gewaschen.

Das Sediment wurde in 100 - 300 µl mit Argon begastem 50 mM Tris/HCl, pH 8,5,

10 mM DTT resuspendiert.

2.4.11.1.2 Übertragung der FeS Zentren von IscA/SynIscU auf Ferredoxin

Für die Übertragungsreaktion wurden 2,5 nmol apo Ferredoxin mit 5 nmol IscA/IscU

in 100 µl Reaktionsvolumen unter Argonbegasung und mit 5 mM DTT für 1 h

inkubiert. Die Pufferbedingungen waren 20 mM HEPES/NaOH pH 8,0 (IscA) bzw.

50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin


53

(SynIscU). Die Analyse der Ansätze erfolgte über eine nicht denaturierende PAGE

(2.4.4.2)

2.4.11.1.3 Kinetische Untersuchungen

Zur Untersuchung der Kinetik der Übertragungsreaktion wurde diese in einem

Volumen von 300 µl mit den oben beschriebenen Konzentrationen durchgeführt.

Nach 2, 5, 10, 20, 30 und 60 min wurde ein Aliquot von 40 µl aus dem Ansatz

entnommen und mit 20 nmol Ferricyanid und 100 nmol EDTA versetzt. Dies führte

zur Zerstörung des FeS-Zentrums an IscA/SynIscU. Zudem wurden die Proben bis

zur Analyse in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

2.4.11.2 Übertragung des FeS Zentrums auf die Catharantus roseus APS-

Reduktase und die Bacillus subtilis PAPS-Reduktase

In E. coli heterolog exprimierte und gereinigte Catharantus roseus APS-Reduktase

und Bacillus subtilis PAPS-Reduktase sowie 35[S]-APS und 35[S]-PAPS wurden von

der Arbeitsgruppe Schwenn am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen an der Ruhr-

Universität Bochum für die Experimente zur Verfügung gestellt.

2.4.11.2.1 Herstellung der Apo-Proteine

Um den Transfer des FeS-Zentrums von IscA1 von Synechocystis auf die APS- bzw.

PAPS-Reduktase zu untersuchen, musste zunächst das [4Fe4S]-Zentrum der (P)APS-

Reduktase entfernt werden und so die Apo-(P)APS-Reduktase hergestellt werden.

Dazu wurde die (P)APS-Reduktase (15 µM) in 100 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, mit

0,3 mM K3Fe(CN)6 0,75 mM EDTA 10 min auf Eis inkubiert. Die Reinigung des

Proteins erfolgte durch eine PD10-Säule (Pharmacia) äquilibriert mit 100 mM

HEPES/NaOH, pH 8,0. Die Konzentration der Proteinlösung wurde bestimmt

(2.4.3.1) und die Lösung gegebenenfalls aufkonzentriert. Durch die Behandlung

verloren beide Enzyme die Aktivität.

2.4.11.2.2 Übertragung der FeS Zentren

Zum Transfer des FeS-Zentrums von IscA1 auf die Apo-APS- bzw. PAPS-

Reduktase wurden 200 pmol APS- bzw. PAPS-Reduktase in 300 µl 20 mM

HEPES/NaOH, 5 mM DTT mit 800 pmol rekonstituiertem IscA1 (2.4.8) inkubiert.

Alle Lösungen wurden zuvor im Argonstrom begast und der Ansatz für die Dauer

der Übertragung unter Argonatmosphäre gehalten. Nach einer bestimmten


54

Inkubationszeit wurden 100-200 ng APS-Reduktase bzw. 300 ng PAPS Reduktase

aus dem Ansatz entnommen und auf 30 µl mit 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 verdünnt.

2.4.11.2.3 Aktivitätstest

2.4.11.2.3.1 APS-Reduktase-Aktivitätstest

Der Aktivitätstest der APS-Reduktase (PRIOR ET AL., 1999) beruht auf der Umsetzung

von 35[S]-APS zu 35SO32-.

100 - 200 ng Catharantus roseus APS-Reduktase in 30 µl 10 mM Tris/HCl, pH 8,0

wurden mit 70 µl 100 mM Tris/HCl, pH 8.0, 100 mM Na2SO3, 500 mM Na2SO4, 60

µM 35[S]-APS, 10 mM reduziertem Glutathion versetzt und für 3 min bei 30°C

inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl Aceton gestoppt. Die

Menge des im Sauren flüchtigen Sulfits wurde wie unter 2.4.11.2.3.3 beschrieben

bestimmt.

2.4.11.2.3.2 PAPS-Reduktase-Aktivitätstest

Der Aktivitätstest der Bacillus subtilis PAPS-Reduktase (SCHWENN & SCHRIEK,

1987) beruht auf der Umsetzung von 35[S]-PAPS zu 35SO32-. 300 ng PAPS-Reduktase

in 30 µl 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 wurden mit 70 µl 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100

mM Na2SO3, 60 µM 35[S]-PAPS, 5-10 µM E. coli Thioredoxin A, 10 mM DTT

versetzt und 3 min bei 30°C inkubiert. Die weitere Behandlung erfolgte wie oben

beschrieben.

2.4.11.2.3.3 Bestimmung des 35SO32-

(SCHWENN & SCHRIEK, 1987)

Die Reaktionsgefäße mit dem mit Aceton versetzten Reaktionsgemisch wurden in

Szintllationsgefäße mit 500 µl Trioctylamin überführt. In das Reaktionsgefäß wurden

zu dem Reaktionsgemisch 300 µl 6 M H2SO4 gegeben. Das durch die Ansäuerung

freigesetzte SO2 wurde in einem geschlossenen Szintillationsgefäß während einer

Inkubation bei 65°C für 45 min oder bei RT ü.N durch das basische Trioctylamin

gebunden. Das Reaktionsgefäß wurde aus den Szintillationsgefäßen entfernt und 4

ml Szintillationsflüssigkeit zugegeben. Die gebundene Radioaktivität wurde in einem

Flüssigkeitsszintillationszähler (Liquid Szintillation Counter 12/9, Rackbeta,

Pharmacia-LBK) bestimmt. Aus den so erhaltenen Daten und der bekannten


55

spezifischen Radioaktivität des Substrates konnte der Umsatz des Enzyms berechnet

werden.

2.4.12 Analyse der Reaktion von IscS mit reduziertem SynIscU

Zur Analyse der von IscS und SynIscU katalysierten Reaktion wurden 10 nmol

SynIscU (auch die Varianten SynIscUC44A und C47A) in 200 µl 20 mM TAPS, pH

9,0, 1 mM DTT für 30 min reduziert und das Reduktionsmittel über eine Sephadex-

G25-Spin-Column (0,7 x 6 cm) äquilibriert mit 20 mM TAPS, pH 9,0 entfernt. Alle

Puffer wurden zuvor entgast und mit Argon gespült. Die Bestimmung der

Proteinkonzentration nach der Gelfiltration erfolgte durch einen Bradfordtest

(2.4.3.1). Zur Analyse der Reaktion wurden in einem Schraubdeckelgefäß, das mit

Argon gespült wurde, 6 nmol IscS und SynIscU mit 12 nmol Cystein in 600 µl 20

mM TAPS, pH 9,0, 10 µM PLP inkubiert. Die Inkubation erfolgte bei

Raumtemperatur.

Um die Reaktion zu stoppen, wurden nach verschiedenen Zeiten (siehe Ergebnisteil)

100 µl dieses Ansatzes mit 5 µl 10 mM I-ADEANS versetzt. Die alkylierende

Reagenz I-ADEANS bindet kovalent an Sulfhydrylgruppen und besitzt eine

fluoreszierende Gruppe, die durch ultraviolettes Licht zur Fluoreszenz angeregt

werden kann. Liegt SynIscU in reduzierter Form vor, wird dadurch eine weitere

Reaktion mit IscS verhindert, durch die Alkylierung des aktiven Cysteins von IscS

wird auch die Cystein-Desulfurase-Aktivität von IscS unterbunden. Ein eventuell

entstandenes IscS-SynIscU-Heterodimer kann durch die Alkylierung der zweiten

freien Sulfhydrylgruppe von SynIscU ebenfalls stabilisiert werden.

Die Analyse der Reaktionsprodukte erfolgte dann durch anschließende SDS-PAGE

und Westernblot mit dem Anti-IscS- und Anti-SynIscU-Antikörper (2.4.4/2.4.5).

Alternativ wurde mit 500 µl des Ansatzes eine Sulfidbestimmung (2.4.6)

durchgeführt.

2.4.13 Chlorophyllbestimmung

Synechocystis enthält nur Chlorophyll a. Für die Extraktion wurde Methanol

verwendet, das Chlorophyll aus ganzen Zellen extrahieren kann.

Zur Chlorophyllbestimmung wurde 0,5 - 1 ml Synechocystis-Kultur abzentrifugiert

und das Sediment mit 1 ml Methanol versetzt. Die Chlorophyllextraktion erfolgte

durch Inkubation der Ansätze für mindestens 30 min auf einem Taumelschüttler bei

RT.


56

Nach PORRA ET AL. (1989) gilt: cChl a = (0,01629 · E665,2 - 0,00854 · E652) mg/ml für

Methanol.

2.4.14 Aconitasetest

Die Bestimmung der Aktivität der Aconitase (KENNEDY ET AL., 1983) im löslichen

Proteinextrakt von Synechocystis erfolgte in 400 µl Tris/HCl, pH 8,0, 20 mM Iso-

Citrat mit 50 µg Proteinextrakt bei RT. Die Bildung von cis-Aconitat aus Iso-Citrat

wurde photometrisch über eine Zeit von 5 min bei 240 nm verfolgt. Der

Extinktionskoeffizient für cis-Aconitat beträgt 3,6 mM-1.

2.5 Biophysikalische Methoden

2.5.1 UV/Vis-Spektroskopie

Absorptionsspektren wurden im Bereich von 210-800 nm an einem Beckman DU

7400 Diodenarray Spektrometer aufgenommen. Für die Aufnahme wurden

Quarzküvetten mit einer Dicke von 1 cm verwendet.

2.5.2 Tieftemperatur-Fluoreszenz-Spektroskopie

Mit der Tieftemperatur-Fluoreszenz-Spektroskopie kann bei 77 K das relative

Verhältnis von PS II zu PS I bestimmt werden.

Zur Messung wurden 0,5 – 1 ml einer Synechocystis-Kultur (OD730 ≈ 0,5 - 1) in

eine Glasküvette (Ø = 0,4 cm) in flüssigem Stickstoff eingefroren und entweder

sofort zur Messung verwendet oder bei -70°C bis zur Messung gelagert. Die

Messung erfolgte bei 77 K in flüssigem Stickstoff. Zur Anregung der Fluoreszenz

der Chlorophylle wurden entweder die Chlorophylle direkt bei 435 nm oder die

Chlorophylle über die Phykobillisomen bei 580 nm angeregt. Die an die

Photosysteme gebundenen Chlorophylle emittieren dabei die Anregungsenergie als

Fluoreszenz. Daher wurde ein Emissionsspektrum in einem Wellenlängenbereich

von 630 – 760 nm aufgenommen. I.d.R. wurden 3 Spektren gemittelt. Die

Monochromatoren waren au eine Bandbreite von 4 nm eingestellt.

2.5.3 EPR-Spektroskopie

Zur Untersuchung der FeS-Zentren in IscA1 wurde EPR-Spektroskopie verwendet.

Rekonstituiertes IscA1 wurde mit und ohne Reduktion bzw. Oxidation mit 10

molaren Äquivalenten Dithionit bzw. Ferricyanid vermessen.


57

Wird ein Elektron mit einem magnetischem Moment, ein Übergangsmetall oder ein

ungepaartes Elektronenpaar in ein magnetisches Feld gebracht, richtet sich das

magnetische Moment relativ zum angelegten magnetischen Feld aus. Dadurch

entstehen Zustände mit unterschiedlicher Energie. Durch Absorption von

elektromagnetischer Strahlung im Mikrowellenbereich können Übergänge zwischen

diesen Zuständen hervorgerufen werden.

X-Band-EPR-Spektroskopie wurde am Max-Planck-Institutut für Strahlenchemie in

Mülheim a.d. Ruhr in Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill durchgeführt. X-Band-

Spektren wurden an einem Bruker ESP300E Spektrometer ausgerüstet mit einem

Helium Kryostaten (Oxford Instruments ESR 910), einem NMR Gaussmeter und

einem Hewlett-Packard Frequenz-Zähler aufgenommen.

Die Probenkonzentration in der Probe betrug ca. 0,1 mM. Typische Messparameter

waren 1 mW Mikrowellenstärke, 20 G Modulationsamplitude, 9,46 GHz

Mikrowellenfrequenz, 10 K.

2.5.4 Mössbauer-Spektroskopie

Mössbauer-Spektroskopie beruht auf dem Mössbauereffekt, der 1956 von R.L.

Mössbauer entdeckt wurde. Er wies nach, dass Kerne Energie absorbieren und

emittieren können, ohne dass die Energie durch den Rückstoss verbreitert wird. Für

die Emission der Strahlung wird eine radioaktive Quelle eingesetzt, die über

angeregte Zwischenzustände in den Grundzustand zerfällt. Dabei wird γ-Strahlung

emittiert. Im Fall des für die Quelle eingesetzten Isotops ist die Energie der Strahlung

extrem genau definiert. Diese Energieschärfe gilt auch für die absorbierendenden

Isotope wie 57Fe. Diese Isotope nennt man Mössbauerisotope. Durch die extreme

Energieschärfe der Strahlung können sehr geringe Unterschiede zwischen der

Festkörperumgebung der Quelle und der des Absorbers untersucht werden. Ein

Absorber kann die Strahlung nur absorbieren, wenn die Energie der Quelle mit den

Energien der angeregten Zustände der Probe übereinstimmen. Um die Energie der

Quelle zu variieren wird die die Quelle bewegt. Die Veränderung der Energie beruht

auf dem Dopplereffekt. Die Festkörperumgebung der Probe wird beeinflusst durch

die Elektronendichte, den Gradienten des elektrischen Feldes, d.h. die

Ungleichverteilung der Elektronen in der Umgebung, und durch das magnetische

Feld der Probe. Die Mössbauerparameter, die durch diese Faktoren bestimmt werden,


58

sind die Isomerieverschiebung, die Quadrupol-Aufspaltung und die magnetische

Aufspaltung.

Die in dieser Arbeit angewendete Mössbauer-Spektroskopie wurde am Max-Planck-

Institut für Strahlenchemie in Mülheim a.d. Ruhr von Dr. E. Bill durchgeführt.

Die für die Mössbauer-Spektroskopie verwendeten Proben wurden wie unter 2.4.8.3

beschrieben mit 57Fe rekonstituiert und tiefgefroren.

Die Mössbauer-Spektren wurden mit einem Spektrometer mit wechselnder,

konstanter Beschleunigung aufgenommen. Die minimale experimentelle Linienbreite

war 0,24 mm/s (Signalbreite bei halber Signalhöhe). Die Temperatur wurde entweder

bei 80K oder 4,2 K durch ein Oxford Instrument Variox oder durch einen Oxford

Instruments Mössbauer-Spektromag Kryostaten konstant gehalten. Das magnetische

Feld wurde parallel zur γ-Strahlung angelegt. Als Strahlungsquelle wurde ein 57Co/Rh-Quelle (1,8 GBq) verwendet, angebracht bei RT in einer Nullfeldposition.

2.5.5 Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS)

MALDI-TOF–MS ist eine Methode zur Bestimmung des exakten

Molekulargewichtes von Proteinen. Die Probe wird dabei mit einer Matrix, die die

Laserenergie absorbiert und in Desorptions- und Ionisationsenergie umwandelt,

kristallisiert. Die aus der Matrix gelösten, ionisierten Proteine werden durch eine

Spannung beschleunigt und treffen nach einer bestimmten Flugzeit durch den

evakuierten Raum auf einen Detektor. Die Flugzeit ist dabei abhängig vom

Masse/Ladungsverhältnis (m/z) des Proteins.

Massenspektren wurden an einem Voyager System DEPRO 6061 (Perseptive

Biosystems) aufgenommen. Die Spektren wurden im linearen Modus aus 50 – 100

Einzelspektren gemittelt. Der Messbereich lag zwischen 2500 und 20000 Da, die

untere Ausschlussgrenze lag bei 2000 Da. Zur Beschleunigung der Ionen wurde eine

Spannung von 25000 V angelegt. Die Verzögerungszeit der Extraktion betrug 600

ns.

Als Matrix wurde eine gesättigte Lösung aus 0,1 % Trifluoressigsäure und 50 %

Acetonitril verwendet, die im Verhältnis 1:1 mit der Proteinlösung auf dem

Probenhalter gemischt wurde. Zur Kalibrierung der Masse wurde ein Standard

bestehend aus Insulin (Rind; 5730 Da) und Apo-Myoglobulin (Pferd; 16952 Da)

verwendet, die unter den identischen Bedingungen, wie beschrieben, gemessen

wurden.

3 Ergebnisse

59

Abb. 3-1: SDS-PAGE zu Expression und Reinigung von IscA1 M: Molekulargewichtstandard 1: lösliche Proteine der Expression 2: IscA1 nach Ammoniumsulfatfällung 3: IscA1 nach HIC 4: IscA1 nach HA-Chromatographie

3 Ergebnisse

3.1 IscA1

IscA1 sollte in E. coli exprimiert und gereinigt werden, um die Rolle des Proteins bei

der Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis zu untersuchen.

3.1.1 Expression und Reinigung von IscA1

Die Expression von IscA1 erfolgte in LB-Medium bei 25°C durch den Stamm E. coli

BL21(DE3)/pLysS/pISCA1 (2.2.6.3.1). Unter diesen Bedingungen konnte im SDS-

Gel eine zusätzliche Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 13 kDa

beobachtet werden, die nach 6 h Expression ihre maximale Intensität erreichte (Abb.

3-1).

Dies entspricht dem kalkulierten Molekulargewicht von IscA1. Dieses Protein

repräsentierte ca. 15 % der löslichen Proteinfraktion. Durch eine Kombination aus

Ammoniumsulfatfällung, hydrophober Interaktionschromatographie und

Hydroxylapatit-Chromatographie wurde IscA1 bis zur Homogenität gereinigt (Abb.

3-1). Die Ausbeute nach dem letzten Chromatographieschritt betrug 55 mg

gereinigtes IscA1 pro Liter E. coli-Kultur.

3 Ergebnisse

60

3.1.2 Charakterisierung von Apo-IscA1

3.1.2.1 UV/Vis-Spektroskopie

Das UV/Vis-Spektrum von Apo-IscA1 weist neben der für Proteine typischen

Absorption bei 278 nm eine Schulter bei 330 nm auf. Zunächst wurde vermutet, dass

es sich dabei um Protein gebundenes Eisen handelt. Durch eine Eisenbestimmung

von IscA1 (2.4.7) konnten keine signifikanten Mengen Eisen nachgewiesen werden.

Säurelabiles Sulfid (2.4.6), das neben Eisen auf ein gebundenes FeS-Zentrum deuten

würde, konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Um den Grund für die

Absorption festzustellen wurde IscA1 in 8 M Harnstoff denaturiert und gegen

Harnstoff dialysiert. Dies wurde auch in Anwesenheit von EDTA oder DTT

durchgeführt. Nach der Dialyse zeigte die Spektren noch immer die beschriebene

Schulter. Daher wurde angenommen, dass die absorbierende Spezies kovalent mit

IscA1 verknüpft sein muss. Um dies weiter zu untersuchen wurde MALDI-TOF

Massenspektroskopie (2.5.5) durchgeführt.

3.1.2.2 MALDI-TOF Massenspektrometrie

Das aufgrund der Aminosäuresequenz kalkulierte Molekulargewicht von IscA1

beträgt 12928,7 Da. Durch MALDI-TOF-MS konnte ein Molekulargewicht von

12797,7 Da bestimmt werden (Abb.: 3-3). Dies entspricht exakt dem berechneten

Molekulargewicht von IscA1 nach Abspaltung des N-terminalen Methionins nach

der Translation. Neben dieser Masse konnten noch weitere größere Massen detektiert

werden. Die prominenteste besitzt ein Molekulargewicht von 12892,5 Da und damit

einer Differenz von 94,8 Da.

Abb. 3-2: Absorptionsspektrum von Apo-IscA1 Die Proteinkonzentration betrug 40 µM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0.

250 300 350 400 450 5000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

3 Ergebnisse

61

3.1.2.3 Untersuchung der Oligomerisierung durch analytische

Gelfiltration

Zur Bestimmung des Oligomerisierungszustandes des gereinigten IscA1 wurde eine

Gelfiltrationschromatographie wie unter 2.4.8 beschrieben durchgeführt. IscA1

wurde vor dem Auftragen auf die Säule mit 5 mM DTT reduziert. IscA1 eluierte

nach 16,3, 17,5 und 18,3 min. Diese Elutionszeiten entsprechen nach der in Abb. 3-4

gezeigten Molekulargewichts-Eichgeraden Molekulargewichten von 52, 32 und

23 kDa. Jede dieser Formen besaß die für das Absorptionsspektrum von IscA1

typische Schulter bei 330 nm. Die hochmolekularen Formen können als Di- und

Abb. 3-4: links: analytische Gelfiltration von Apo-IscA1 in PBS + 1 mM DTT rechts: Eichgerade der Kalibrierung der analytischen Gelfiltrationschromatographie in PBS+ 1 mM DTT

Abb.: 3.3: MALDI-TOF Massenspektrum von gereinigtem IscA1

5000 8000 11000 14000 17000 20000Masse m/z

0

8155.0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100 %

Inte

nsitä

t

12797.67

12892.50

6396.15 6437.58 5403.16 9266.656830.35 17118.56

14 16 18 20 22 24 26

1000

10000

100000

Mol

ekul

arge

wic

ht [D

a]

Zeit [min]0 4 8 12 16 20 24 28

0,000,010,020,030,040,050,060,070,080,09

Abso

rptio

n 28

0 nm

Zeit [min]

3 Ergebnisse

62

Tetramer (26 bzw. 52 kDa) interpretiert werden. Die Differenz des hier bestimmten

Molekulargewichts für monomeres IscA1 von 23 kDa zum kalkulierten

Molekulargewicht von ca. 13 kDa ist recht groß. Der Grund dafür könnte in nicht

definierter Faltung des monomeren Proteins oder in der Exposition hydrophober

Bereiche im Monomer liegen.

3.1.3 Charakterisierung des FeS-Zentrums von IscA1

3.1.3.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA1

Zur Untersuchung der Fähigkeit von IscA1 ein FeS-Zentrum zu binden und somit als

Assemblierungsplattform für Eisen-Schwefel-Zentren zu dienen wurde, IscA1 wie

unter 2.4.9.1 beschrieben mit Cystein, Eisenammoniumsulfat und IscS (Slr0387) von

Synechocystis unter anaeroben und reduzierenden Bedingungen inkubiert. Das

anschließend über eine Gelfiltration gereinigte Protein besaß ein UV/Vis-Spektrum

(Abb. 3-5), das auf die Bindung eines FeS-Zentrums an IscA1 hindeutete. Das

Spektrum zeigt Absorptionsmaxima bei 278 nm, 330 nm, 420 nm (mit einer Schulter

bei 470 nm) und 580 nm. Diese Maxima sind typisch für ein oxidiertes [2Fe2S]2+-

Zentrum. Sulfid- und Eisenbestimmungen von IscA1 ergaben 0,9 Moleküle Sulfid

bzw. 1,2 Moleküle Eisen pro IscA1-Monomer. Durch Erhöhung der zur

Rekonstitution eingesetzten Cystein- bzw. Eisenkonzentration bis zu einem 10-

fachen Überschuss konnte keine weitere Steigerung der Maxima im Spektrum und

des Gehalts an Sulfid und Eisen erreicht werden.

Die Rekonstitution des mutmaßlichen FeS-Zentrums von IscA1 war unabhängig

davon möglich, ob Eisen(II) (Eisenammoniumsulfat) oder Eisen(III) (Eisen(III)-

ammoniumcitrat) als Eisenquelle eingesetzt wurden.

Abb. 3-5: Absorptionsspektrum des rekonstituierten IscA1 Die Proteinkonzentration in der Probe betrug 30 µM in 20 mM HEPES/ NaOH, pH 8,0. Das Spektrum wurde unter Argonatmosphäre aufgenommen.

300 400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

3 Ergebnisse

63

3.1.3.2 Spektroskopische Untersuchung von Holo-IscA1

Zur Bestätigung der Existenz eines FeS-Zentrums und zur genaueren Untersuchung

seiner Struktur wurden Elektronen-Spin-Resonanz- (EPR-) und Mössbauer-

Spektroskopie eingesetzt.

In der X- Band EPR-Spektroskopie (2.5.3) zeigte sich kein typisches EPR-Signal,

das auf ein FeS-Zentrum mit nicht ganzzahligem Spinzustand hindeutete. Nur ein

schwaches Signal von unspezifisch gebundenen Eisen(III)-Ionen bei g = 4,3 konnte

beobachtet werden. Die EPR-Ergebnisse deuteten in Übereinstimmung mit den

Ergebnissen der UV/Vis-Spektroskopie auf ein diamagnetisches Fe(III)-Fe(III)-

Zentrum von IscA1 mit einem Spin S = 0 hin. Versuche der Reduktion des FeS-

Zentrums mit äquimolaren Mengen an Dithionit konnten keinen EPR-detektierbaren

Zustand mit einem Spin S=½ einstellen. Höhere Konzentrationen an Dithionit (20

mM) führten zur Zerstörung des FeS-Zentrums. Versuche das FeS-Zentrum durch

Belichtung in Gegenwart von 0,1 mM Flavinmononukleotid und 0,5 mM EDTA zu

reduzieren (TOLLIN, 1995) führten ebenfalls zur Zerstörung des Zentrums.

Oxidation von Holo-IscA1 mit 10 molaren Äquivalenten Ferricyanid führte zum

Ausbleichen der Absorption im sichtbaren Bereich und zur Zerstörung des FeS-

Zentrums.

Um mehr Informationen über das FeS-Zentrum von IscA1 zu bekommen, wurde eine

Probe für die Mössbauer-Spektroskopie rekonstituiert (2.4.9.3). Zunächst wurde eine

Messung (2.5.4) bei 80 K ohne angelegtes externes magnetisches Feld durchgeführt.

Aus dem Nullfeld-Mössbauerspektrum (Abb. 3-6) von rekonstituiertem IscA1

konnten zwei bis drei übereinanderliegende Dupletts berechnet werden. Das mit

86 % Anteil am gemessenen Spektrum prominenteste Duplett besitzt eine

Isomerieverschiebung von δ= 0,27 mm/s und eine Quadrupol-Aufspaltung bei

∆EQ = 0,57 mm/s. Dieses Mössbauer-Duplett ist typisch für Fe(III)-Ionen, die

ausschließlich von Schwefelliganden umgeben sind, d.h. dass sich diese Fe-Ionen in

einem symmetrisch aufgebauten FeS-Zentrum befinden, welches von vier

Cysteinseitenketten ligiert ist. In weiteren Messungen konnte durch das Anlegen

eines magnetischen Feldes von bis zu 10 kG bei 80 K keine magnetische

Aufspaltung des Signals erreicht werden, was die diamagnetische Natur des [2Fe2S]-

Zentrums bestätigte. Diese Daten sprechen für ein [2Fe2S]2+-Zentrum, bei dem beide

Fe-Ionen identisch gebunden sind, da beide Ionen das gleiche Mössbauerspektrum

3 Ergebnisse

64

ergeben. Da alle bekannten [4Fe4S]-Zentren immer auch Fe(II)-Ionen enthalten,

kann ein solches Zentrum ausgeschlossen werden.

Ein weiteres Duplett repräsentiert ca. 12 % des gemessenen Signals. Dieses weist

eine Isomerie-Verschiebung von δ= 0,50 mm/s und eine Quadrupol-Aufspaltung bei

∆EQ = 0,77 mm/s auf. Dieses Signal wurde im magnetischen Feld in sechs Linien

aufgespalten (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass diese Spezies paramagnetisch ist.

Diese Eisenspezies kann begründet durch die hohe Isomerieverschiebung und durch

das magnetische Verhalten bei fehlendem X-Band EPR-Signal als nicht Protein-

gebundene super-paramagnetische Spezies interpretiert werden, die durch Eisen(III)-

Aggregate entstanden ist.

3.1.3.3 Untersuchung der Oligomerisierung von Holo-IscA1 durch

analytische Gelfiltration

Zur Untersuchung des Oligomerisierungszutands von Holo-IscA1 wurde eine

analytische Gelfiltrationschromatographie (2.4.8) durchgeführt.

Wie in Abb. 3-7 zu erkennen ist, eluierte Holo-IscA1 nach 15,9 und 17,5 min. Nach

der Eichgerade (Abb. 3-4) entspricht dies einem Molekulargewicht von 63 und 32

kDa. Demnach liegt Holo-IscA1 zu etwa 35 % als Tetramer und zu etwa 65 % als

Dimer vor. In keinem Experiment wurde monomeres Holo-IscA1 nachgewiesen.

Das Absorptionsspektrum des Holo-IscA1-Tetramers weist im Vergleich zum Dimer

weniger gut aufgelöste Absorptionsmaxima auf.

Abb. 3-6: Nullfeld – Mössbauerspektrum von IscA1 bei 80 K Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0. Die Punkte repräsentieren die Messpunkte, die Linien die berechnete Subspektren bzw. deren Addition. In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim.

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

0,980

0,985

0,990

0,995

1,000

Fe3+

[2Fe2S]2+

IscA1

Rel

ativ

e Tr

ansm

issi

on

Geschwindigkeit [mm/s]

3 Ergebnisse

65

3.1.3.4 Charakterisierung der Varianten von IscA1 Zur Ermittlung der Liganden des [2Fe2S]-Zentrums von IscA1 wurden Varianten

von IscA1 hergestellt, bei denen je eins der fünf Cysteine von IscA1 gegen Alanin

ausgetauscht wurde. Dazu wurde die Sequenz des Expressionsplasmids pISCA1

durch ortsgerichtete Mutagenese (2.3.14) verändert. Die Sequenz der erhaltenen

Plasmide pISCA1C34A, pISCA1C44A, pISCA1C75A, pISCA1C110A und

pISCA1C112A wurden durch Restriktionsanalysen und Sequenzierung verifiziert.

Die Expression und Reinigung (Abb. 3-8) der IscA1-Varianten erfolgte analog zum

Wildtyp-Protein.

Abb. 3-8: Reinigung der Varianten von IscA1 M: Molekulargewichtsstandard 1: IscA1 2: IscA1C34A 3: IscA1C44A 4: IscA1C75A 5: IscA1C110A 6: IscA1C112A

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

300 400 500

17,48

15,85

Wellenlänge

Abb. 3-7: links : Chromatogramm der analytischen Gelfiltrationschromatographie von Holo-IscA1 in PBS + 1 mM DTT rechts: Absorptionsspektrum der Elution bei 15,9 (unten) und 17,5 min (oben)

0 4 8 12 16 20 24 280,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10Ab

sorp

tion

280

nm

Zeit [min]

3 Ergebnisse

66

Da die initiale Rekonstitution des FeS-Zentrums der IscA1-Varianten mit 5 mM DTT

als Reduktionsmittel UV/Vis-Spektren ergaben, die auf die Anwesenheit eines FeS-

Zentrums an den Varianten hindeutete, wurden Varianten hergestellt, bei denen

mehrere Cysteine gegen Alanin ausgetauscht wurden. Die Mutagenese des

Expressionsplasmids (2.3.15) ergab die Plasmide pISCA1C34/75A,

pISCA1C34/44/75A, pISCA1C34/75/110A, pISCA1C34/75/112A und

pISCA1C34/75/110/112A. Nach Expression und Reinigung der entsprechenden

Proteinvarianten sollte untersucht werden, ob diese in der Lage waren ein FeS-

Zentrum zu binden. Dazu wurden sie analog zum WT-Protein mit 5 mM DTT als

Reduktionsmittel rekonstituiert. Auch diese Varianten wiesen nach der

Rekonstitution ein Absorptionsspektrum auf, das auf ein gebundenes FeS-Zentrum

hindeutete. Selbst die Variante IscA1C34/75/110/112A, deren Sequenz nur noch ein

Cystein enthält, zeigte dieses Spektrum (Abb. 3-9).

Eine weitere Optimierung der Rekonstitution durch den Einsatz von β-

Mercaptoethanol statt von DTT als Reduktionsmittel führte zu anderen Aussagen der

UV/Vis-Spektroskopie. Abb. 3-9 zeigt exemplarisch das UV/Vis-Spektrum der mit

DTT bzw. β-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel rekonstituierten Variante

IscA1C34/75/110/112A.

Nach der Optimierung der Rekonstitution wurden die Varianten mit einem Cystein-

Alanin-Austausch erneut untersucht. Die Rekonstitution dieser Varianten ergab, dass

der Austausch der C-terminalen Cysteine Cys110 oder Cys112 gegen Alanin dazu

führte, dass das entsprechende Protein kein FeS-Zentrum binden konnte (Abb.3-10).

Abb. 3-9: Rekonstitution der Variante IscA1C34/75/110/112A mit DTT bzw. β-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel

300 400 500 600 700 8000,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

β-Mercaptoethanol DTT

3 Ergebnisse

67

Damit konnten die Cysteine Cys110 und Cys112 von IscA1 als die Liganden des

FeS-Zentrums identifiziert werden. Je ein Monomer des dimeren Holo-IscA1 stellt

somit zwei Liganden für die Koordination des [2Fe2S]2+-Zentrums.

Die entsprechenden Apoproteine IscA1C110A und IscA1C112A zeigten auch nicht

die Absorption bei 330 nm (Abb. 3-10).

Die Spektren für die Varianten IscA1C44A und IscA1C75A zeigten weniger gut

aufgelöste Maxima bei 330 und 420 nm. Dies deutet auf einen geringeren Gehalt an

FeS-Zentren in der Population der Proteine hin. Die Variante C34A scheint hingegen

mehr FeS-Zentren als das WT-Protein zu binden.

Die Rekonstitution der Varianten mit mehreren Cystein-Alanin-Austauschen ergab,

dass alle Varianten mit einem Austausch von Cys110 oder 112 nicht mehr in der

Lage waren, ein FeS-Zentrum zu binden. Das Absorptionsspektrum der Variante

C34/75A, bei der die beiden pflanzenspezifischen Cysteinreste gegen Alanin

ausgetauscht wurden, ähnelte dem der Variante C34A, das Spektrum der Variante

C34/44/75A, die nur noch die beiden C-terminalen Cysteine 110 und 112 besitzt,

ähnelte dem der Variante C44A.

Abb. 3-10: Absorptionsspektren von Wildtyp-IscA1 und IscA1-Varianten mit einem Cystein-Alanin-Austausch

links: nach Rekonstitution des FeS-Zentrums mit β-Mercaptoethanol rechts: wie isoliert

300 400 5000,00,10,20,30,40,50,60,70,8

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

IscA1 IscA1C34A IscA1C44A IscA1C75A IscA1C110A IscA1C112A

300 400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

IscA1 IscA1C34A IscA1C44A IscA1C75A IscA1C110A IscA1C112A

3 Ergebnisse

68

Zur genaueren Untersuchung der Rolle des Cysteins 44, das zu den drei streng

konservierten Cysteinen in IscA-Proteinen gehört, wurde eine Mössbauerprobe der

Variante C44A erstellt und analysiert.

Tabelle 3-1: Vergleich der erhaltenen Mössbauer-Spektren für die IscA1, IscA1C44A und

IscA1C34/75A.

Fe-Spezies δ [mm s-1] ∆EQ [mm s-1]

% des Gesamtsignals

[2Fe2S]2+ 0,27 0,57 86,3 Fe(III) 0,50 0,77 12,1

IscA1

Fe(II) 1,30 3,10 1,6 [2Fe2S]2+ 0,27 0,57 39,4

Fe(III) 0,50 0,77 38,6 IscA1C44A

Fe(II) 1,30 3,10 22 [2Fe2S]2+ 0,27 0,57 95,5

Fe(III) 0,50 0,77 0 IscA1C34/75A

Fe(II) 1,30 3,10 4,5

Das erhaltene Spektrum (Abb. 3-11) konnte in drei Einzelspektren mit

Isomerieverschiebungen von δ = 0,27; 0,50; und 1,3 mm/s (siehe Tabelle 3-1) zerlegt

werden. Das Duplett mit δ=0,27 mm/s und einer Quadrupolaufspaltung von

∆EQ=0,57 mm/s, das 39,4 % des Gesamtspektrums ausmacht, ist das Signal der

Eisenionen im [2Fe2S]2+-Zentrum der Variante C44A. Auffällig ist das hohe Maß an

präzipitierten Eisen(III)-Aggregaten (δ=0,50 mm/s, ∆EQ=0,77 mm/s, 38,6 %). Die

dritte vorkommende Spezies mit einer Isomerieverschiebung δ= 1,3 mm/s und der

Quadrupol-Aufspaltung von ∆EQ=3,10 mm/s (22%) stammt von Eisen(II)-Ionen.

Abb. 3-11: Nullfeld-Mössbauerspektrum der Variante IscA1C44A bei 80 K. Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0 In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

0,980

0,985

0,990

0,995

1,000

Fe2+

Fe3+[2Fe2S]2+

IscA1C44A

Rel

ativ

e Tr

ansm

issi

on


3 Ergebnisse

69

Dieses Ergebnis spiegelt den in der UV/Vis-Spektroskopie geringeren Anteil an

rekonstituiertem Protein wieder.

Das Mössbauerspektrum der Variante C34/75A (Abb. 3-12), bei der die beiden

pflanzenspezifischen Cysteinreste gegen Alanin ausgetauscht sind, konnte ohne

einen Anteil an δ=0,50 mm/s-Isomerieverschiebung in die Einzelspektren zerlegt

werden. Den Hauptanteil des Spektrums (95 %) macht das Signal des [2Fe2S]2+-

Zentrums aus.

Untersuchungen der Varianten C44A und C34/75A durch analytische

Gelfiltrationschromatographie ergaben, dass die Varianten ebenfalls wie das

Wildtyp-Protein in einer dimeren und tetrameren Form vorliegen (Daten nicht

gezeigt).

3.1.3.4 Untersuchungen zur Stabilität von IscA1 und den Varianten

Die Stabilität des FeS-Zentrums von IscA1 wurde unter verschiedenen Bedingungen

untersucht (2.4.10). Unter aeroben Bedingungen war ein schneller Zerfall von IscA1

zu beobachten. Das Zentrum hatte bei Raumtemperatur nur eine Halbwertszeit von

10 min. Unter anaeroben Bedingungen betrug die Halbwertszeit 180 min. In

Anwesenheit von Reduktionsmitteln (5 mM DTT / 85 mM β-Mercaptoethanol) war

das FeS-Zentrum auch unter aeroben Bedingungen so stabil wie unter anaeroben

Bedingungen.

Abb. 3-12: Nullfeld-Mössbauerspektrum der Variante IscA1C34/75A bei 80 K Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 20 mM HEPES/ NaOH, pH 8,0 In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40,970

0,975

0,980

0,985

0,990

0,995

1,000

Fe2+

[2Fe2S]2+

IscA1C34/75A

Rel

ativ

e Tr

ansm

issi

on


3 Ergebnisse

70

Die Stabilität der Varianten von IscA1 wurde unter den gleichen Bedingungen

untersucht. Die Varianten zeigten einen ähnlich schnellen aeroben Zerfall wie das

WT-Protein. Der anaerobe Zerfall in Abwesenheit von Reduktionsmitteln der

Varianten C44A und C75A ist beschleunigt, die Varianten C34A und C34/75A

zeigten eine ähnliche Stabilität wie das Wildtyp-Protein. Eine Halbwertszeit t ½ ≈ 80

min für die Varianten C44A und C75A im Vergleich zu t ½ ≈ 180 min für das WT-

Protein konnte ermittelt werden. Unter reduzierenden Bedingungen (5 mM DTT/ 85

mM β-Mercaptoethanol) war das FeS-Zentrum der Varianten C44A und C75A wie

auch aller anderen Varianten ähnlich stabil wie das FeS-Zentrum von IscA1-WT.

3.1.3.5 Untersuchungen zur Bildung des FeS Zentrums von IscA1

Neben der Stabilität des FeS-Zentrums ist die Assemblierung des FeS-Zentrums ein

Faktor, der die geringere Rekonstitution der Variante C44A bedingen könnte. Daher

wurde untersucht durch welchen Mechanismus das FeS-Zentrum an IscA1

rekonstituiert werden kann. Zur Rekonstitution von IscA1 wurde als Schwefelquelle

Cystein eingesetzt. Cystein wird von IscS (Slr0387) von Synechocystis umgesetzt.

Dabei wird Alanin freigesetzt und der Schwefel an einem aktiven Cysteinrest

(Cys326) von IscS als Persulfid gebunden. In Anwesenheit von Reduktionsmitteln

kann dieser Schwefel als Sulfid freigesetzt werden.

Um zu untersuchen, ob der von IscS mobilisierte Schwefel als Sulfid von IscA1 in

das FeS-Zentrum inkorporiert wird, oder ob dazu eine direkte Übertragung vom

Persulfid an IscS auf IscA1 nötig ist, wurde die Kinetik der Bildung des FeS-

Zentrums von IscA1 mit Cystein und IscS bzw. Sulfid als Schwefelquelle verglichen.

Wie in Abb. 3-13 zu erkennen, ist die Kinetik der Bildung des FeS-Zentrums von

IscA1 mit Cystein und IscS bzw. mit Sulfid als Schwefelquelle in etwa zu

vergleichen. Nach 45 – 60 Minuten ist die Bildung des FeS-Zentrums in beiden

Fällen abgeschlossen. Daher ist ein direkter enzymatischer Weg nicht

auszuschließen, aber nicht Vorraussetzung für die Assemblierung des FeS-Zentrums.

Da durch den Austausch von C44 gegen Alanin unter denselben

Assemblierungsbedingungen ein geringerer Prozentsatz der Proteinmoleküle ein

FeS-Zentrum bindet, wurde auch die Assemblierung der Variante C44A untersucht

(Abb. 3-13).

3 Ergebnisse

71

Die Assemblierung von IscA1C44A durch IscS und Cystein ist nicht wie beim WT-

Protein nach 45 – 60 Minuten abgeschlossen. Die Absorption bei 420 nm steigt bis

zu einer Zeit von zwei Stunden kontinuierlich an. Demnach ist die Assemblierung

des FeS-Zentrums an der Variante verlangsamt.

Zur weiteren Untersuchung der Assemblierung des FeS-Zentrums von IscA1 sollten

Bedingungen untersucht werden, bei denen kein Sulfid durch die Reaktion von IscS

mit Cystein unter reduzierenden Bedingungen entstehen kann. Eine Assemblierung

eines FeS-Zentrums unter diesen Bedingungen würde wie bei NifIscA und NifS auf

einen enzymatischen Prozess bei der Assemblierung hinweisen. Dazu wurde

versucht das FeS-Zentrum von IscA1 unter den bei KREBS ET AL. (2001) für NifIscA

aus A. vinelandii verwendeten Rekonstitutionsbedingungen, mit 8 mM Cystein, 2

mM FeSO4, NifS und ohne Zusatz eines weiteren Reduktionsmittels, zu

Abb. 3-13: Kinetik der Bildung der FeS-Zentren von IscA1 mit Cystein und IscS (oben links) bzw. Sulfid als Schwefelquelle (oben rechts) und Kinetik der Bildung der FeS-Zentren der Variante C44A mit Cystein und IscS als Schwefelquelle Die Proben wurden aus einem Ansatz entnommen und über Gelfiltration gereinigt. Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford bestimmt und die Spektren demnach korrigiert.

300 400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5IscA1 + Cys+ IscS

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

0 min 15 min 30 min 45 min 60 min 90 min

300 400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6IscA1 Fe2+ S2-

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]


300 400 500 600 700 8000,000,050,100,150,200,250,300,350,40 IscA1C44A

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]


3 Ergebnisse

72

assemblieren. Dabei konnte keine Assemblierung eines FeS-Zentrums beobachtet

werden.

3.1.4 Übertragungsexperimente mit IscA1

Mit den folgenden Experimenten wurde untersucht, ob das an IscA1 assemblierte

FeS-Zentrum auf andere Apo-FeS-Proteine übertragen werden kann.

3.1.4.1 Übertragung auf [2Fe2S] Apoproteine

Als Modellprotein für die Übertragung von FeS-Zentren wurde zunächst das am

Elektronentransfer vom Photosystem I zu diversen Elektronenakzeptoren wie z.B.

die Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase beteiligte Ferredoxin (Ssl0020) von

Synechocystis gewählt. Dazu wurde aus dem gereinigten Holoprotein durch

Behandlung mit Salzsäure das FeS-Zentrum entfernt (2.4.11.1.1). Zur

Reinkorporation des FeS-Zentrums (2.4.11.1.2) wurde das so gewonnene

Apoferredoxin mit Holo-IscA1 im molaren Verhältnis von 1 : 2 (Apoferredoxin zu

IscA1-Monomer) unter reduzierenden und anaeroben Bedingungen gemischt und für

eine Stunde inkubiert. Unter diesen Bedingungen ist das FeS-Zentrum von IscA1

stabil (3.1.3.4). Die Analyse des Reaktionsansatzes erfolgte über eine nicht-

denaturierende Gelelektrophorese (2.4.4.2).

Wie in Abb. 3-14 zu erkennen ist, besitzt Holoferredoxin (Bahn 1) im Vergleich zu

Apoferredoxin und IscA1 (Bahn 2 bzw. 3) eine größere Mobilität in der nicht-

Abb. 3-14: Analyse des Übertragungsansatzes mit Holo-IscA1 und Apo- Ferredoxin über eine 20%ige nicht-denaturierende PAGE 1: Holo-Fd 2: Apo-Fd 3: IscA1 4: Übertragungsansatz gefärbt mit Stains All

3 Ergebnisse

73

denaturierenden PAGE. Im Übertragungsansatz (Bahn 4) ist zu erkennen, dass der

größte Teil (80%) des Ferredoxins in der Holo-Form vorliegt. Durch die

Anwesenheit von IscA1 mit assembliertem FeS-Zentrum wurde Apoferredoxin in

Holoferredoxin umgewandelt. Apo-IscA1 hatte keinen Effekt. IscA1 ist somit in der

Lage, das FeS-Zentrum auf Apoferredoxin zu übertragen.

Zur Untersuchung der Kinetik der Reaktion wurden zu bestimmten Zeiten aus dem

Ansatz Proben entnommen und die Reaktion gestoppt (2.4.11.1.3).

Wie in Abb. 3-15 zu erkennen ist, war nach 2 Minuten ein signifikanter Anteil des

Apoferredoxins in Holoferredoxin umgewandelt, ca. 50% der FeS-Zentren waren

nach 10 Minuten übertragen worden.

Während der Reaktion konnte eine Farbänderung des Reaktionsansatzes beobachtet

werden. Die Farbe des Ansatzes änderte sich von braun nach rot-braun. Um die

spektroskopischen Eigenschaften des Ferredoxins im Übertragungsansatz zu

überprüfen, wurde der Übertragungsansatz nach der Reaktion über eine Gelfiltration

gereinigt und eventuelle Reste an Holo-IscA1 durch Inkubation des Ansatzes an

Abb. 3-15: Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums von Holo-IscA1 auf Ferredoxin analysiert über eine nicht-denaturierende PAGE Gezeigt ist nur die Holoferredoxin-Bande, gefärbt mit Stains All

300 400 500 600 700 800

0,000,050,100,150,200,250,300,35

Differenzspektrum Fd wie isoliert

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

Abb. 3-16: Differenzspektrum aus dem Spektrum des Übertragungs-ansatzes abzüglich des Spektrums eines Ansatzes nur mit Holo-IscA1 ohne Apoferredoxin verglichen mit dem Spektrum des gereinigten Holoferredoxins. Vor der Aufnahme der Spektren wurden die Ansätze über eine Gelfiltration gereinigt und das FeS-Zentrum von Holo-IscA1 durch Luftsauerstoff zerstört.

3 Ergebnisse

74

Luftsauerstoff zerstört. Zur Ermittlung des IscA-Anteils am Spektrum wurde ein

Ansatz ohne Apoferredoxin gleich behandelt und ein Differenzspektrum aus den

beiden Absorptionsspektren gebildet. Abb. 3-16 zeigt das Differenzspektrum

verglichen mit dem Absorptionsspektrum von gereinigtem Ferredoxin. Wie in Abb.

3-16 zu erkennen ist, sind die spektroskopischen Eigenschaften des während der

Übertragung entstandenen Holoferredoxins ähnlich dem Absorptionsspektrum des

isolierten Ferredoxins.

Um einen Komplex aus Ferredoxin und IscA1 während der Übertragung

nachzuweisen wurde eine analytische Gelfiltration durchgeführt. Diese konnte keine

stabile Bildung eines Komplexes aus Ferredoxin und IscA1 während der Reaktion

nachweisen.

3.1.4.2 Übertragung auf [4Fe4S]-Proteine

Weiterhin sollte überprüft werden, ob IscA1 in der Lage ist neben [2Fe2S]-Zentren

auch [4Fe4S]-Zentren zu assemblieren. Dazu wurde die APS-Reduktase aus

Catharantus roseus gewählt. Dieses Protein besitzt ein [4Fe4S]-Zentrum, das

essentiell für die Aktivität des Enzyms ist. Das FeS-Zentrum wurde durch

Behandlung mit EDTA und Ferricyanid entfernt und das Apoprotein gereinigt

(2.4.11.3.1). Das so erhaltene Apoprotein wurde mit 4 Äquivalenten Holo-IscA1

(d.h. 2 [2Fe2S]-Zentren an IscA1 pro APS-Reduktasemolekül) unter anaeroben und

reduzierenden Bedingungen inkubiert (2.4.11.3.2) und nach bestimmten Zeiten eine

Probe entnommen. Die APS-Reduktaseaktivität dieser Probe wurde bestimmt

(2.4.11.3.3).

Wie in Abb. 3-17 gezeigt, führte die Inkubation von Apo-C. roseus APS-Reduktase

mit Holo-IscA1 zur Reaktivierung des Enzyms. Nach einer Stunde Inkubation bei

0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

Rea

ktiv

ieru

ng [%

]

Zeit [min]

holo IscA1 Fe2+, S2-

apo IscA1

Abb. 3-17: Reaktivierung der Apo-APS-Reduktase aus Catharantus roseus mit Holo-IscA1. Ausgangswert ist die Aktivität des Enzyms vor Entfernung des FeS-Zentrums. In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum

3 Ergebnisse

75

Raumtemperatur sind 40 % der ursprünglichen Aktivität vor der Entfernung des FeS-

Zentrums wieder hergestellt. Bereits nach 20 min beträgt die Reaktivierung über

20 %. Inkubation mit Apo-IscA1 oder entsprechenden Mengen an Sulfid und

Eisen(II) hatten keinen Effekt auf die Reaktivierung des Enzyms.

Ein dreifacher Überschuss an Holo-IscA1-Dimer führte zu einer schnelleren

Reaktivierung und zu höheren Reaktivierungsraten nach einer Stunde. Eine

Verlängerung der Inkubationszeit über eine Stunde hinaus, ergab keine weitere

Steigerung der Aktivität, sondern eine geringere Reaktivierung als nach einer Stunde.

Apo- und Holo-IscA1 alleine zeigten keine Aktivität im Testsystem. Dies

demonstriert, dass die Assemblierung von [4Fe4S]-Zentren aus zwei [2Fe2S]-

Vorstufen gebunden an Holo-IscA1 möglich ist.

Als ein weiteres Modellprotein für die Assemblierung von [4Fe4S]-Zentren wurde

die PAPS-Reduktase aus Bacillus subtilis gewählt. Dazu wurde das für die Aktivität

essentielle [4Fe4S]-Zentrum des Enzyms analog zum C. roseus Enzym entfernt und

die Apo-PAPS-Reduktase mit vier Äquivalenten Holo-IscA1 unter anaeroben und

reduzierenden Bedingungen inkubiert.

Apo-B. subtilis-PAPS-Reduktase wird durch Inkubation mit Holo-IscA1 aus

Synechocystis aktiviert (Abb. 3-17). Die gemessene spezifische Aktivität liegt höher

als die Aktivität vor Entfernung des FeS-Zentrums, da ein Teil des Enzyms wohl

schon als Apoprotein vorlag. Neben der hier gezeigten PAPS-Reduktase-Aktivität

besitzt das Protein auch eine APS-Reduktase-Aktivität. Diese steigt in gleichem

Maße wie die PAPS-Reduktase-Aktivität durch Inkubation mit Holo-IscA1 an. Die

spezifische Aktivität mit APS als Substrat ist mit der Aktivität mit PAPS zu

Abb. 3-17: Reaktivierung der Apo-PAPS-Reduktase aus Bacillus subtilis mit Holo-IscA1 Aufgetragen ist hier die spezifische Enzymaktivität mit 35S-PAPS als Substrat. In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum

0 10 20 30 40 50 600,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Aktiv

ität [

µmol

/ mg

x m

in]

Zeit [min]

holo IscA1 Fe2+, S2-

apo IscA1

3 Ergebnisse

76

vergleichen. Apo-IscA1 und freies Eisen und Sulfid hatten wiederum keinen Effekt.

IscA1 zeigte keine PAPS-Reduktase-Aktivität.

3.1.4.3 Übertragungsaktivität der Varianten von IscA1

Neben dem Wildtyp-Holo-IscA1 wurden auch die Varianten C44A und C34/75A

daraufhin untersucht, ob die nicht an der Bindung des [2Fe2S]-Zentrums beteiligten

Cysteinseitenketten von IscA1 eine Rolle bei der Übertragung des FeS-Zentrums

spielen. Dazu wurden die rekonstituierten Varianten C44A und C34/75A als Donor

für die Übertragung des FeS-Zentrums auf Ferredoxin eingesetzt. Abb. 3-18 zeigt

den Vergleich der Übertragungskinetik des FeS-Zentrums.

Wie in Abbildung 3-18 zu erkennen, sind die Varianten C44A und C34/75A in der

Lage, das assemblierte [2Fe2S]-Zentrum auf Apoferredoxin zu übertragen. Weder

der Austausch des strikt konservierten Cysteins 44, noch der der beiden

pflanzenspezifischen Cysteine 34 und 75 unterbinden die Übertragung des FeS-

Zentrums auf Ferredoxin. Die Kinetik des Prozesses ist bei den Varianten ähnlich der

Reaktionskinetik des WT-Proteins.

Um zu überprüfen, welchen Einfluss der Austausch der Cysteine gegen Alanin auf

die Übertragungsreaktion auf [4Fe4S]-Proteine hat, wurden die Varianten C44A und

Abb. 3-18: Vergleich der Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums auf Apoferredoxin von Holo-IscA1, C44A und C34/75A Gezeigt ist nur die Holoferredoxin –Bande gefärbt mit Stains All

0 10 20 30 40 50 600

20

40

Aktiv

ieru

ng [%

]

Zeit [min]

IscA1 IscA1C44A

Abb. 3-19: Aktivierung der C. roseus-APS-Reduktase durch Holo-WT-IscA1 und IscA1C44AIn Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum

3 Ergebnisse

77

C34/75A in der Übertragungsreaktion auf die C. roseus-APS-Reduktase und B.

subtilis-PAPS-Reduktase getestet.

Dazu wurden die Varianten und das WT-Protein rekonstituiert und mit Apo-APS-

Reduktase inkubiert. Wie in Abb. 3-19 zu erkennen ist die Aktivierung der APS-

Reduktase durch die Variante C44A wesentlich geringer als die durch das WT-

Protein. Sie betrug nach 60 min nur 18,7 % der Aktivierung durch den IscA1-

Wildtyp. Die Aktivierung der APS-Reduktase durch die Variante C34/75A war in

allen Versuchen ähnlich der Aktivierung durch das WT-Protein oder sogar besser.

Zur Bestätigung dieser Ergebnisse wurden die Versuche auch mit PAPS-Reduktase

aus B. subtilis durchgeführt. Nach einer Stunde Inkubation von Apo-B. subtilis-

PAPS-Reduktase mit Holo-IscA1-WT und -C44A erfolgte die Bestimmung der

Aktivität der PAPS-Reduktase.

Die Reaktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase durch Holo-IscA1C44A liegt nur

bei etwa 10 % der Reaktivierung durch IscA1 (Abb. 3-20). Durch den Einsatz der

dreifachen Menge an C44A konnte in etwa das Niveau der Reaktivierung durch

IscA1-WT erreicht werden.

3.2 IscA2 Das zweite IscA-Protein aus Synechocystis (Slr1565/IscA2) wurde ebenfalls in E.

coli exprimiert, gereinigt und untersucht.

100,0

10,2

96,4

0

20

40

60

80

100

120

IscA1 C44A 3 x C44A

% d

er R

eakt

ivie

rung

du

rch

Hol

o-Is

cA1

Abb. 3-20: Aktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase durch Holo-WT-IscA1 und IscA1C44A nach 60 min mit 35S-PAPS als Substrat In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum

3 Ergebnisse

78

3.2.1 Expression, Reinigung und Rückfaltung von IscA2

IscA2 wurde als unlösliches Aggregat im Stamm BL21(DE3)/pLysS/pISCA2

exprimiert. Vorversuche zur Expression hatten keine Bedingung ergeben, unter der

eine signifikante Menge an IscA2 löslich angereichert werden konnte.

IscA2 wurde in LB-Medium bei 37°C exprimiert. In einer Analyse des

Gesamtzellproteins durch eine SDS-PAGE konnte nach dem Zellaufschluss eine

starke Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 12 kDa beobachtet

werden. Dieses Protein entsprach ca. 40 % des Gesamtzellproteins (Abb. 3-21, Bahn

1). Durch wiederholte Waschungen mit Puffer und 1 % (v/v) Triton X100 konnten

diese Aggregate bis zu einer Reinheit von ca. 90% (Abb. 3-21, Bahn 2) aufgereinigt

werden (2.2.6.1.2.1). Die Ausbeute betrug ca. 200 mg gereinigte IscA2-Aggregate

pro Liter E. coli-Kultur.

Die Rückfaltung von IscA2 erfolgte nach der Methode der schnellen Verdünnung

nach Auflösen der Aggregate in Harnstoff (2.4.2). Nach Optimierung der

Rückfaltungsbedingungen konnte IscA2 mit einer Ausbeute von 40 – 50 % aus den

unlöslichen Aggregaten in 100 mM Tris, pH 9,0, 1 mM DTT zurückgefaltet werden.

Das Protein war nach der Rückfaltung rein (Abb. 3-21, Bahn 3). Die Homogenität

des rückgefalteten Proteins wurde durch Anionenaustauschchromatographie

überprüft. IscA2 eluierte in einem distinkten Bereich des NaCl-Gradienten von 0 -

1 M NaCl von der Säule (Daten nicht gezeigt).

3.2.2 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA2

IscA2 wurde wie IscA1 mit Cystein, Fe(NH4)2(SO4)2 und IscS rekonstituiert. Nach

der Reinigung des Ansatzes durch eine Gelfiltration wurde ein Absorptionsspektrum

Abb. 3-21: SDS-PAGE zu Expression, Reinigung und Rückfaltung von IscA2 1: aufgebrochene Zellen 2: isolierte und gereinigte Aggregate 3: rückgefaltetes Protein

3 Ergebnisse

79

aufgenommen. Das Spektrum (Abb. 3-22) ähnelt dem Spektrum von rekonstituiertem

IscA1. Es zeigt Absorptionsmaxima bei 330 und 420 nm (mit einer Schulter bei 470

nm) und 580 nm. Dies demonstriert, dass IscA2 wie IscA1 in der Lage ist ein FeS-

Zentrum zu binden. Das Absorptionsspektrum deutet wieder auf ein [2Fe2S]2+-

Zentrum hin. Das Apoprotein absorbiert bei 278 nm. Eine kleine Schulter bei 330 nm

ist ebenfalls zu erkennen.

3.2.3 Übertragung des FeS-Zentrums auf Apoferredoxin

Analog zu IscA1 sollte untersucht werden, ob IscA2 ebenfalls in der Lage ist, das

assemblierte FeS-Zentrum auf Ferredoxin zu übertragen. Dazu wurde Holo-IscA2

wie unter 2.4.11.1 beschrieben mit Apoferredoxin inkubiert und der Ansatz danach

über eine nicht-denaturierende Gelelektrophorese (2.4.4.2) untersucht. Wie in Abb.

3-23 zu erkennen, ist auch IscA2 in der Lage das FeS-Zentrum auf Apoferredoxin zu

Abb. 3-23: Analyse des Übertragungsansatzes mit Holo-IscA2 und Apoferredoxin über eine 20%ige nicht denaturierende PAGE 1: Holo-Fd 2: Apo-Fd 3: IscA2 4: Übertragungsansatz gefärbt mit Stains All

Abb. 3-22: Absorptionsspektrum von Apo- und Holo-IscA2 Die Proteinkonzentration in der Probe betrug 25 µM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0. Die Spektren wurden unter Argonatmosphäre aufgenommen

300 400 500 600 700 8000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

holo IscA2 apo IscA2

3 Ergebnisse

80

übertragen. Der Umsatz von Apo- zu Holoferredoxin war allerdings in allen

Versuchen verglichen mit IscA1 geringer.

3.3 SynIscU

Der Untersuchung von SynIscU wurden zwei verschiedene Arbeitshypothesen zu

Grunde gelegt. Zunächst sollte die Rolle von SynIscU als potentieller Überträger des

von IscS oder anderen NifS-homologen Proteinen mobilisierten Schwefels

untersucht werden. In einem zweiten Teil sollte wie von NISHIO & NAKAI (2000)

vorgeschlagen, die Rolle von SynIscU als Assemblierungsplattform für FeS-Zentren

untersucht werden.

3.3.1 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als Überträger des

Schwefels

Für SynIscU wurde in meiner Diplomarbeit (2000) aufgrund des Thioredoxin-artigen

CXXC-Motivs eine Funktion als Reduktionsmittel bei der Mobilisierung des

Schwefels aus Cystein vorgeschlagen. Diese Hypothese beruhte auf Experimenten,

bei denen katalytische Mengen IscS mit reduziertem SynIscU und Cystein inkubiert

wurden. Nach der Reaktion konnten pro Mol Cystein und reduziertem SynIscU ein

Mol Sulfid nachgewiesen werden. SynIscU lag nach der Reaktion oxidiert vor. Der

Nachweis des Redoxzustandes von SynIscU erfolgte durch Alkylierung der

Sulfhydrylgruppen des Ansatzes durch den Fluoreszenzmarker I-ADEANS. Dieser

bindet schnell und kovalent an reduzierte Sulfhydrylgruppen. Bindung von I-

ADEANS führte zu einer höheren Mobilität des alkylierten Proteins in der nicht-

denaturierenden PAGE. Dadurch konnten die oxidierte und die reduzierte, alkylierte

Form getrennt werden.

Der Mechanismus der Reaktion von IscS mit SynIscU und Cystein sollte aufgeklärt

werden. Zudem sollte die Interaktion von IscS mit SynIscU nachgewiesen werden.

3.3.1.1 Biochemische Untersuchungen mit IscS und SynIscU

Zum Nachweis des Reaktionsmechanismus wurden neben dem WT-Protein

Varianten von SynIscU eingesetzt, bei denen ein Cystein gegen Alanin ausgetauscht

worden war. Wenn der von IscS mobilisierte Schwefel direkt als Persulfid vom

aktiven Cystein 326 von IscS auf eines der Cysteinreste von SynIscU übertragen

wird, sollte es an den Varianten von SynIscU mit nur einem Cysteinrest stabilisiert

sein. Das Persulfid könnte dann durch I-ADEANS markiert und durch Zusatz eines

3 Ergebnisse

81

Reduktionsmittels abgespalten werden. Dieser Nachweis konnte in der Diplomarbeit

nicht erbracht werden.

Ein weiterer möglicher Reaktionsmechanismus ist der nukleophile Angriff einer

reduzierten Sulfhydrylgruppe von SynIscU auf den Schwefel des aktiven Cysteinrests

326 von IscS, der das von IscS gebildete Persulfid gebunden hat. Dadurch käme es

unter Ausbildung einer intermolekularen Disulfidbrücke intermediär zu einem IscS-

SynIscU-Heterodimer. Der als Persulfid an IscS gebundene Schwefel würde dadurch

reduziert und als Sulfid freigesetzt. Durch den nukleophilen Angriff der zweiten

Sulfhydrylgruppe von SynIscU auf die Disulfidbrücke könnte durch Bildung einer

intramolekularen Disulfidbrücke die intermolekulare Disulfidbrücke gespalten

werden und das Heterodimer getrennt werden. Eine genauere Besprechung der

Reaktionswege erfolgt in der Diskussion (siehe 4.3).

Um das zweite beschriebene Modell zu bestätigen oder zu widerlegen, wurden

„Single-Turnover“ Experimente mit IscS, SynIscU (bzw. den Varianten

SynIscUC44A bzw. SynIscUC47A) und Cystein durchgeführt.

Abb. 3-24: Analyse der Reaktion von IscS mit SynIscU und Cystein. Die Analyse erfolgte über eine 12,5% SDS-PAGE mit anschließendem Westernblot mit Anti-IscS- und Anti-IscU-Antikörpern. Die Proben wurden nach der angegebenen Zeit aus dem Reaktionsansatz entnommen und mit I-ADEANS versetzt. Die Auftragung auf das 12,5%ige SDS-Gel erfolgte mit SDS-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel.

3 Ergebnisse

82

Dazu wurden, wie unter 2.4.12 beschrieben, ein molares Äquivalent IscS und

reduziertes SynIscU mit 2 Äquivalenten Cystein inkubiert. Nach bestimmten Zeiten

wurden Proben entnommen und die Reaktion durch die Zugabe von I-ADEANS

gestoppt. Die Analyse erfolgte durch eine SDS-PAGE mit anschließendem

Immunnachweis mit Antikörpern gegen SynIscU und IscS. Die Proben wurden ohne

Zugabe eines Reduktionsmittels auf das Gel aufgetragen.

Wie in Abb. 3-24 zu erkennen ist, kann im Laufe der Reaktion eine hochmolekulare

Bande nachgewiesen werden, die sowohl mit dem SynIscU- als auch mit dem IscS-

Antikörper reagiert. Diese Bande besitzt ein apparentes Molekulargewicht von ca.

57 kDa. Dies entspricht der Addition der apparenten Molekulargewichte von IscS

(48 kDa) und SynIscU (9 kDa). Nach 30 min ist diese Bande nur noch schwach zu

erkennen. Zu jedem analysierten Zeitpunkt kann nur ein kleiner Anteil beider

Proteine im Heterodimer nachgewiesen werden. Das beschriebene Heterodimer

konnte durch die Zugabe eines Reduktionsmittels gespalten werden (nicht gezeigt).

Dies zeigt, dass es während der Reaktion von IscS mit SynIscU und Cystein zur

Bildung eines intermediären IscS-SynIscU-Heterodimers kommt, das über eine

Disulfidbrücke miteinander verknüpft ist.

Analog zum WT-Protein wurden die Reaktion der Varianten SynIscUC44A und

SynIscUC47A analysiert. Dazu wurden die Varianten wie unter 2.4.12 beschrieben

mit IscS und Cystein inkubiert und nach 30 min eine Probe mit I-ADEANS versetzt.

Die Analyse erfolgte wiederum über einen Immunnachweis.

Wie in Abb. 3-25 zu erkennen ist, kann durch den Anti-SynIscU-Antikörper nach 30

min Reaktionszeit nur mit der Variante C47A eine signifikante Menge IscS-SynIscU-

Heterodimer nachgewiesen werden. Die entsprechende Bande zeigte auch eine

Reaktion mit dem Anti-IscS-Antikörper (nicht gezeigt). Auch bei der Analyse

Abb. 3-25: Analyse der Reaktion von IscS, Cystein und SynIscU/C44A/C47A nach 30 min durch eine SDS-PAGE mit anschließendem Westernblot mit einem Antikörper gegen SynIscU Die Reaktion wurde durch Zugabe von I-ADEANS gestoppt. Der Auftrag auf das 12,5%ige SDS-Gel erfolgte in Probenpuffer ohne Reduktionsmittel.

3 Ergebnisse

83

früherer Reaktionszeitpunke konnte keine Bildung eines IscS-SynIscUC44A-

Heterodimers nachgewiesen werden.

Dies demonstriert, dass das IscS-SynIscU-Heterodimer durch den Austausch des

Cysteins 47 gegen Alanin stabilisiert werden kann. Demnach erfolgt durch Cystein

44 der Angriff auf den aktiven Cysteinrest 326 von IscS, Cystein 47 ermöglicht

durch Reduktion der intermolekularen Disulfidbrücke die Abspaltung von IscS und

die Dissoziation des Heterodimers.

Zum Nachweis des von SynIscU und den Varianten aus IscS und Cystein

mobilisierten Sulfids, wurden 5 nmol IscS, 5 nmol reduziertes SynIscU bzw.

-Variante mit 10 nmol Cystein inkubiert und nach 2 Stunden das gebildete Sulfid

bestimmt.

Für die Reaktion mit SynIscU konnten 3,9 nmol Sulfid, für die Reaktion mit C47A

0,7 nmol Sulfid nachgewiesen werden. Nach der Reaktion der Variante C44A konnte

kein Sulfid nachgewiesen werden.

3.3.1.2 Untersuchungen zur Interaktion von SynIscU mit den NifS-

homologen Proteinen aus Synechocystis mit dem Hefe 2-Hybrid-System

Da für eine Übertragung des Schwefels von einem NifS-homologen Enzym auf

SynIscU eine direkte Protein-Interaktion nötig wäre, wurde nach mehreren

biochemischen Untersuchungen (Diplomarbeit, 2000) das Hefe 2-Hybrid-System für

den Nachweis dieser Interaktion gewählt. Dafür wurden die Gene für die drei NifS-

homologen Proteine und das SynIscU-Protein aus Synechocystis mittels PCR

amplifiziert und über die EcoRI und die XhoI Restriktionsschnittstellen in die

Plasmide für das Hefe 2-Hybrid System pEG202 und pJG4-5 kloniert. Die so

erhaltenen Plasmide wurden nach Kontrollrestriktionen und Sequenzierung

paarweise in Hefe transformiert.

Das Hefe 2-Hybrid System ermöglicht den Nachweis einer direkten Protein-Protein-

Interaktion durch verschiedene Reportersysteme. Für die Aktivierung der LexA-

DNA-Bindedomäne ist eine Interaktion mit der azidischen Aktivierungsdomäne B42

nötig, die nur dann erfolgt, wenn die beiden an diese Domänen fusionierten Proteine

interagieren und so die DNA-Bindedomäne und die Aktivierungsdomäne in

räumliche Nähe gebracht werden. Bei den Reportergenen handelt es sich um das in

das Hefechromosom integrierte leu2-Gen und das episomal kodierte lacZ-Gen, die

beide unter der Kontrolle mehrerer LexA-Promotoren transkribiert werden. Bei

3 Ergebnisse

84

Transkription des leu2-Reportergens wird die Leucin-Auxotrophie des Stamms

EGY48 aufgehoben. Auf X-Gal-haltigem Medium kommt es durch die Expression

der β-Galactosidase zu einer Blaufärbung der Kolonien.

Tabelle 3-2 führt die in den Stamm EGY48/pSH18-34 transformierten

Plasmidkombinationen und die erhaltenen Reaktion auf Leucin-freiem Medium und

Medium mit X-Gal bei Wachstum im glukosefreien Raffinose/Galaktose-Medium

auf. Auf Medien, die Glukose als Kohlenstoffquelle enthielten, kam es zu keiner

Blaufärbung der Hefekolonien auf X-Gal-haltigen Platten und zu keinem Wachstum

auf Leucin-freien Platten, da die Transkription der Gene in den pJG4-5-Derivaten

durch den durch Glukose reprimierten GAL4-Promotor erfolgt.

Tabelle 3-2: Mit dem Hefe 2-Hybrid-System untersuchte Interaktionen mit

Raffinose/Galaktose-Medium

+: Wachstum auf Leucin-freiem Medium

+: Blaufärbung auf X-Gal enthaltenden Platten

n : nicht untersucht Interaktion Selbst-

aktivierung

pJG- ISCS

pJG-Sll0704

pJG-Slr0077

pJG- ISCU pJG4-5

pEG- ISCS + + n n n n - - - - pEG-

Sll0704 n n + + n n - - - - pEG-

Slr0077 n n n n - - - - - -

Interaktion

pEG- ISCU - - - - - - - - - -

Selbstaktivierung pEG202 - - - - - - - - n n

Keines der drei NifS-homologen Proteine (IscS, Sll0704 und Slr0077) interagiert im

Hefe 2-Hybrid Test mit SynIscU. Keines der Reportergene wurde aktiviert. Dies war

unabhängig vom Fusionspartner, da beide möglichen Interaktionsrichtungen

untersucht wurden (pEG-ISCS/Sll0704/Slr0077 mit pJG-ISCU und pEG-ISCU mit

pJG-IscS/Sll0704/Slr0077).

Positive Interaktionssignale konnten hingegen für die Interaktion von IscS und

Sll0704 mit sich selbst erhalten werden (pEG-ISCS mit pJG-ISCS, pEG-Sll0704 mit

pJG-Sll0704). Diese NifS-homologen Proteine liegen somit mindestens als Dimer

vor. Eine Selbstaktivierung der LexA-Bindedomäne durch das fusionierte Protein

3 Ergebnisse

85

ohne den Interaktionspartner konnte nicht beobachtet werden. Bei den

nachgewiesenen Interaktionen handelt es sich echte Protein-Protein-Interaktionen.

Eine Dimerisierung von Slr0077 (pEG-Slr0077 mit pJG-Slr0077) konnte hingegen

nicht nachgewiesen werden.

Auch Dimerisierung von SynIscU konnte nicht nachgewiesen werden (pEG-ISCU

mit pJG-ISCU).

3.3.2 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als potentielle FeS-

Assemblierungsplattform

3.3.2.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von SynIscU

Bei der Expression und Reinigung von SynIscU konnte unter allen untersuchten

Bedingungen kein SynIscU erhalten werden, das ein Absorptionsspektrum besaß,

welches auf ein gebundenes FeS-Zentrum hindeutete. Das isolierte Protein wies

lediglich die übliche Proteinabsorption auf (Abb. 3-26).

Daher wurde versucht, am gereinigten Protein analog zu IscA ein FeS-Zentrum zu

rekonstituieren. Nach Optimierung der Rekonstitutionsbedingungen konnte durch

Inkubation von SynIscU mit IscS, Cystein und Eisenammoniumsulfat nach

Reinigung durch Gelfiltration ein Protein erhalten werden, dessen

Absorptionsspektrum auf ein gebundenes FeS-Zentrum hindeutete (Abb. 3-27).

300 400 5000,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

Abb. 3-26: Absorptionsspektrum von gereinigtem SynIscU Die Proteinkonzentration betrug 50 µM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0.

3 Ergebnisse

86

Das Absorptionsspektrum des rekonstituierten SynIscU besitzt Absorptionsmaxima

bei 278, 325, 420 (mit einer Schulter bei 470) und 570 nm. Dies deutet auf ein

gebundenes [2Fe2S]-Zentrum hin.

3.3.2.2 Charakterisierung des FeS-Zentrums an SynIscU

Zur Untersuchung des FeS-Zentrums von SynIscU wurde eine Probe für die

Mössbauer-Spektroskopie rekonstituiert.

Das erhaltene Nullfeld-Mössbauerspektrum (Abb. 3-28) von SynIscU bei 80 K kann

in zwei Anteile zerlegt werden. Der Hauptanteil des Spektrums mit 61,1 % wird

durch ein Duplett mit einer Isomerieverschiebung von δ=0,28 mm/s und einer

Quadrupol-Aufspaltung von ∆EQ = 0,61 mm/s gebildet. Dieses Mössbauer-Duplett

ist wie das von IscA1 typisch für Fe(III)-Ionen, die ausschließlich von

Schwefelliganden umgeben sind, d.h. dass diese Fe-Ionen in einem symmetrisch

aufgebauten FeS-Zentrum befinden, das von vier Cysteinseitenketten ligiert ist.

Zusammengenommen mit dem Absorptionsspektrum zeigt dies ein [2Fe2S]2+-

Zentrum an SynIscU an.

Das zweite Subspektrum (38,9 %) mit einer Isomerieverschiebung δ=0,54 mm/s und

einer Quadrupol-Aufspaltung von ∆EQ = 0,75 mm/s wird wieder als präzipitierte

Eisen(III)-Aggregate interpretiert.

300 400 500 600 700 8000,0

0,2

0,4

0,6Ab

sorp

tion

Wellenlänge [nm]

Abb. 3-27: Absorptionsspektrum des rekonstituierten SynIscU Die Proteinkonzentration in der Probe betrug 50 µM in 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl, 10 % Glycerin. Die Spektren wurden unter Argonatmosphäre aufgenommen

3 Ergebnisse

87

Das von SynIscU assemblierte FeS-Zentrum ist aerob und anaerob instabil. In

Anwesenheit von Sauerstoff kommt es wie bei IscA1 zu einem schnellen Zerfall des

gebundenen FeS-Zentrums. Auch in Anwesenheit eines Reduktionsmittels konnte

das FeS-Zentrum von SynIscU unter anaeroben Bedingungen im Gegensatz zum

FeS-Zentrum von IscA1 nur partiell stabilisiert werden. Durch Zugabe von 10 %

(v/v) Glycerin, 50 mM KCl, 125 mM NaCl und 5 mM DTT in 50 mM

HEPES/NaOH, pH 8,0 wurde das Zentrum soweit stabilisiert, dass nach einer Stunde

bei Raumtemperatur als Maß für die Anwesenheit eines gebundenen FeS-Zentrums

ca. 80 % der Absorption bei 420 nm erhalten blieben.

3.3.2.3 Versuche zur Übertragung des FeS-Zentrums

Neben der Bindung eines FeS-Zentrums sollte überprüft werden, ob SynIscU in der

Lage ist das gebundene FeS-Zentrum auf andere Apo-FeS-Proteine zu übertragen.

Dazu wurde zunächst die Übertragung des FeS-Zentrums von SynIscU auf

Apoferredoxin untersucht. Dabei wurde ein molares Äquivalent Apoferredoxin mit

zwei molaren Äquivalenten rekonstituiertem SynIscU für eine Stunde unter

anaeroben und reduzierenden Bedingungen inkubiert. Die Pufferbedingungen (50

mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 (v/v)

Glycerin) entsprachen dabei den Bedingungen unter denen das FeS-Zentrum von

SynIscU stabilisiert werden konnte.

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

0,970

0,975

0,980

0,985

0,990

0,995

1,000

Fe3+

[2Fe2S]2+

SynIscU

Rel

ativ

e Tr

ansm

issi

on


Abb. 3-28: Nullfeld – Mössbauerspektrum von SynIscU bei 80 K Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl. In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim

3 Ergebnisse

88

Wie in Abb. 3-29 zu erkennen wurden in einer Stunde 80 – 90 % des eingesetzten

Apoferredoxins in Holoferredoxin umgewandelt. Dies ist ein weitaus größerer

Umsatz als der Anteil des spontanen Zerfalls von Holo-SynIscU unter den

beschriebenen Bedingungen. Daraus ist zu erkennen, dass SynIscU in der Lage ist

das gebundene [2Fe2S]-Zentrum auf Ferredoxin zu transferieren. Die Untersuchung

der Kinetik der Reaktion (Abb. 3-30) ergab, dass bereits nach 2 min ca. 10 % und

nach 10 min ca. 50 % des eingesetzten Ferredoxins in die Holo-Form umgewandelt

wurde. Nach einer Stunde war die Reaktion abgeschlossen.

Zur Untersuchung einer möglichen Reaktivierung der Apo-C. roseus-APS-Reduktase

durch Inkubation mit Holo-SynIscU wurden die Apo-C. roseus-APS-Reduktase und

Holo-SynIscU analog zu den Untersuchungen mit IscA1 inkubiert. Bei gleichzeitiger

Aktivierung durch Holo-IscA1 konnte keine signifikante Aktivierung durch Holo-

SynIscU nachgewiesen werden.

Abb. 3-30: Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums von Holo-SynIscU auf Apoferredoxin analysiert über eine nicht-denaturierende PAGE Gezeigt ist nur die Holoferredoxin-Bande, gefärbt mit Stains All

Abb. 3-29: Analyse des Übertragungsansatzes mit Holo-SynIscU und Apoferredoxin über eine 20%ige nicht-denaturierende PAGE 1: Holo-Fd 2: Apo-Fd 3: Übertragungsansatz gefärbt mit Stains All, SynIscU wird im mit Stains All gefärbten Gel nicht angefärbt.

3 Ergebnisse

89

Als weiteres Modellprotein für die Übertragung der FeS-Zentren von Holo-SynIscU

auf Apo-[4Fe4S]-Proteine wurde die Reaktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase

untersucht (Abb. 3-31). Die ereichte Reaktivierung lag bei 18,2 % der Reaktivierung

durch Holo-IscA1. Durch Zugabe eines dreifachen Überschusses an Holo-SynIscU –

Dimer lag die Aktivierung der PAPS-Reduktase bei 27,4 % der Reaktivierung durch

Holo-IscA1.

3.4 Charakterisierung der Biogenese von FeS-Zentren in vivo -

Erzeugung von Deletionsstämmen

3.4.1 iscA1

3.4.1.1 Erzeugung einer Insertionsmutante

Zur Erzeugung einer Insertionsmutante wurde das Plasmid pISCA1+::Gm in

Synechocystis PCC 6803 transformiert (2.2.4.3). Das mit 5’- und 3’- flankierenden

Bereichen in das Plasmid klonierte iscA1-Gen ist durch eine Gentamycin-

Resistenzkassette unterbrochen. Transformation von pISCA1+::Gm in Synechocystis

PCC 6803 Wildtyp führte zu Gentamycin-resistenten Transformanden. Durch

sukzessive Erhöhung der Gentamycinkonzentration bei jedem Zellausstrich sollte

erreicht werden, dass die eingeführte Gentamycin-Resistenzkassette in allen Kopien

des Genoms eingeführt wird.

Abb. 3-31: Aktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase durch Holo-WT-IscA1 und SynIscU In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum

100

18,227,4

0

20

40

60

80

100

120

IscA1 SynIscU 3 x SynIscU

% d

er R

eakt

ivie

rung

dur

ch

Hol

o-Is

cA1

3 Ergebnisse

90

Beim Erreichen der maximal tolerierten Gentamycinkonzentration von 70 µg/ml

wurde genomische DNA aus dem erzeugten Stamm isoliert (2.3.12) und die

Integration der Resistenzkassette mittels PCR (2.3.13) überprüft.

In mehreren Versuchen konnte keine vollständig segregierte iscA1-Insertionsmutante

erhalten werden.

3.4.1.2 Expression von IscA1 im Synechocystis-WT

Zur Überprüfung der Expression von IscA1 und zum Nachweis, wie stark IscA1

exprimiert wird, wurde IscA1 in löslichem Proteinextrakt durch Immundetektion

nachgewiesen und die Stärke des Signals über Standards mit gereinigtem IscA1

quantifiziert.

Abb. 3-32 zeigt einen Immunnachweis von IscA1 in der löslichen Fraktion des

Synechocystis-Extrakts (Bahn 4). IscA1 wird in Synechocystis exprimiert und

repräsentiert in etwa 0,025 % der löslichen Proteine.

3.4.2 iscA2

3.4.2.1 Erzeugung einer Deletionsmutante

Zur Deletion von iscA2 (slr1565) wurde das Plasmid pISCA2+Sm in Synechocystis

transformiert (2.2.4.3). Das Plasmid enthält einen Teil des iscA2-Gens mit

flankierenden 5’- und 3’- Bereichen. Ein großer Teil des Gens und ein Teil des 5’-

flankierenden Bereichs wurde (BstEII/HpaI) herausgeschnitten und durch eine

Spectinomycin-Resistenzkasette ersetzt.

Der transformierte Stamm wurde auf Medium mit Spectinomycin ausgestrichen und

die Spectinomycin-Konzentration bei jedem neuen Ausstrich erhöht. Beim Erreichen

von 50 µg/ml Spectinomycin im Medium wurde die genomische DNA aus dem

erzeugten Stamm isoliert (2.3.12) und die Deletion von iscA2 mit einer PCR (2.3.13)

überprüft. Als PCR-Primer wurden Oligonukleotide gewählt, deren komplementäre

Sequenzen im 5’- und 3’- flankierenden Bereich von iscA2 zu finden sind.

Abb. 3-33 zeigt die Analyse der Kontroll-PCR zur Segregation. Im Wildtyp (Bahn 2)

wurde ein ca. 600 bp großes Fragment amplifiziert. Dies entspricht der Größe des

Abb. 3-32: Westernblot (anti-IscA1-AK) mit gereingtem IscA1 und Synechocystis-Extrakt. 1: 7,5 ng gereinigtes IscA1 2: 15 ng gereinigtes IscA1 3: 30 ng gereinigtes IscA1 4: 60 µg löslicher Synechocystis Extrakt

3 Ergebnisse

91

iscA2-Gens inklusive flankierender Bereiche. In der Mutante wurde ausschließlich

ein Fragment mit einer Größe von ca. 2,3 kbp amplifiziert. Dies entspricht der

erwarteten Größe für das Fragment der im Gen inserierten Resistenzkassette

inklusive und flankierender 5’- und 3’-Bereiche.

In weiteren PCR-Kontrollen konnte mit der iscA2::Sm-DNA auch mit kurzer

Anlagerungszeit kein Fragment amplifiziert werden, das der Größe des WT-Gens

entsprach. 1/10 der in Ansatz 2 eingesetzten DNA-Menge konnte gemischt mit

iscA2::Sm-DNA nachgewiesen werden.

Zum Nachweis der Segregation der Mutante auch auf Proteinebene, wurden die

löslichen Proteine von Wildtyp und iscA2::Sm isoliert und IscA2 durch einen

Westernblot nachgewiesen.

Wie in Abb. 3-34 zu erkennen, kann IscA2 durch einen spezifischen Antikörper in

der löslichen Proteinfraktion des Deletionsstammes nicht mehr nachgewiesen

werden.

In der löslichen Proteinfraktion des Wildtyps kann IscA2 nachgewiesen werden. Eine

Quantifizierung ergab, dass IscA2 ca. 0,02 % der löslichen Proteine von

Synechocystis entsprach.

Abb. 3-33: Analyse der Kontroll-PCR zur Segregation der Mutante iscA2::Sm über ein Agarosegel (1%) M: λ EcoRI/HindIII-Standard 1: Kontrolle ohne genomische DNA 2: PCR mit WT-DNA 3: PCR mit iscA2::Sm-DNA Primer: PRiscA2+3, PRiscA2+4 30 Zyklen aus 94°C , 30’’ Denaturierung 58°C, 60’’ Anlagerung 72°C, 2,5’ Verlängerung

Abb. 3-34: Westernblot (anti-IscA2-AK) mit löslichem Synechocystis-Extrakt. 1: 30 µg löslicher WT-Extrakt 2: 30 µg löslicher iscA2::Sm-Extrakt

3 Ergebnisse

92

3.4.2.2 Wachstum des Stamms iscA2::Sm

Das erste Kriterium zur Untersuchung der Auswirkung der Deletion ist der Vergleich

des Wachstums von Synechocystis-WT und dem Stamm iscA2::Sm. Dazu wurde die

Wachstumsphase der Stämme wie unter 2.2.3.2 beschrieben synchronisiert und nach

den angegebenen Zeitpunkten Proben entnommen und die OD730 bestimmt. Es wurde

das Wachstum unter photoautotrophen Bedingungen im Hochlicht und unter

photomixotrophen Bedingungen im Niedrig- und Hochlicht untersucht. Das

Wachstum der Mutante iscA2::Sm ist wie in Abb. 3-35 gezeigt, unter allen getesteten

Bedingungen ähnlich dem Wachstum des Wildtyps. Unter photomixotrophen

Bedingungen erreicht die Mutante eine höhere Dichte als der Wildtyp. Unter

photoautotrophen Bedingungen im Schwachlicht wuchsen WT und iscA2::Sm nur

Abb. 3-35: Vergleich des Wachstums von WT und iscA2::Sm bei 30°C

PM-HL: BG11 + 5 mM Glukose, 50 µE Licht PA-HL: BG11, 50 µE Licht PM-NL: BG11 + 5 mM Glukose, 5µE Licht

0 20 40 60 80 1000

1

2

3

4

5

6

PM-HL

OD

730

Zeit [h]

WT iscA2::Sm

0 20 40 60 80 100 120 140

0

1 PA-HL

OD 73

0

Zeit [h]

WT iscA2::Sm

0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

PM-NL

OD 73

0

Zeit [h]

WT iscA2::Sm

3 Ergebnisse

93

sehr langsam. Nach 200 – 300 h kam es bei beiden Kulturen zum Absterben der

Zellen. Die Deletion des iscA2-Gens führt unter den getesteten Bedingungen zu

keinem gravierenden Wachstumsdefekt.

3.4.2.3 Verhältnis der Photosysteme

Da Photosystem I mit drei gebundenen [4Fe4S]-Zentren eines der wichtigsten FeS-

Proteine in Synechocystis darstellt, sollte untersucht werden, ob die Deletion von

iscA2 einen Einfluss auf das Verhältnis von Photosystem II zu Photosystem I hat.

Das Verhältnis von PS II zu PS I kann durch die Tieftemperatur-Fluoreszenz-

Spektroskopie (2.5.3) bestimmt werden. Zur direkten Anregung der Chlorophylle

wird Licht mit einer Wellenlänge von 435 nm verwendet, die Anregung der

Phycobillisomen erfolgt bei 580 nm. Die gemessenen Spektren von WT und

640 660 680 700 720 740 760

1

2

3

4

5

6 A

rel.

Fluo

resz

enz

Wellenlänge [nm]

WT iscA2::Sm

640 660 680 700 720 740 7600

1

2

3

4

5

6 B

rel.

Fluo

resz

enz

Wellenlänge [nm]

WT iscA2::Sm

640 660 680 700 720 740 760

1

2

3

4

5

6C

rel.

Fluo

resz

enz

Wellenlänge [nm]

WT iscA2::Sm

640 660 680 700 720 740 7600

1

2

3

4

5

6 Dre

l. Fl

uore

szen

z

Wellenlänge [nm]

WT iscA2::Sm

Abb. 3-36: 77K-Fluoreszenzemissionsspektren von WT und iscA2::Sm A: Anzucht photomixotroph im Hochlicht; Anregung bei 435 nm (Chlorophyll), Normierung 725 nm B: Anzucht photomixotroph im Hochlicht; Anregung bei 580 nm (Phykobillisomen), Normierung 665 nm C: Anzucht photomixotroph im Schwachlicht; Anregung bei 435 nm (Chlorophyll), Normierung 725 nm D: Anzucht photomixotroph im Schwachlicht; Anregung bei 580 nm (Phykobillisomen), Normierung 665 nm

3 Ergebnisse

94

iscA2::Sm sind in Abb. 3-36 dargestellt. Die Anzucht der Zellen erfolgte unter

photomixotrophen Bedingungen im Hochlicht und Schwachlicht. Die

Fluoreszenzemissionen bei 650 nm und 665 nm stammen von den Pigmenten der

Phycobillisomen, die Emission bei einer Wellenlänge von 685 nm von dem

terminalen phycobillisomalen Emitter Allophycocyanin B und der äußeren Antenne

von PS II. Die Emission bei 695 nm lässt sich den von PS2 gebundenen

Chlorophyllen zuordnen, die Emission bei 725 nm den mit PS I assoziierten

Chlorophyllen (MEUNIER ET AL., 1997).

Bei den gemessenen Fluoreszenzemissionsspektren lässt sich bei Anregung bei

435 nm beim Stamm iscA2::Sm eine leichte Reduktion des PS II –Gehalts relativ zur

Menge an PS I feststellen. Dieser Effekt tritt sowohl bei Anzucht im Hochlicht als

auch bei Anzucht im Schwachlicht auf. Von einer Verringerung des PS I-Gehaltes

kann, da Wildtyp und iscA2::Sm in etwa den gleichen Chlorophyllgehalt aufweisen,

daher nicht ausgegangen werden.

Die bei Anregung bei 580 nm ermittelte Verteilung der Phycobillisomen ist bei

Wildtyp und iscA2::Sm nahezu identisch. Sie liegen als freie, nicht mit einem

Photosystem assoziierte Phycobillisomen (650 und 665 nm), an PS II assoziiert (685-

95 nm) und in geringerem Maße an PS I assoziiert vor.

3.4.2.4 Untersuchungen zur Expression und Aktivität von FeS-Proteinen

in iscA2::Sm

Abb. 3-37: Vergleich des Holo-Ferrdoxingehalts von WT und iscA2::Sm Analyse über eine 20 %ige nicht-denaturierende PAGE, Aufgetragen sind 150 µg der löslichen Proteinfraktion von WT (Bahn1) und iscA2::Sm (Bahn 2), Photomixoptrophe Anzucht der Zellen im HL

3 Ergebnisse

95

Die Auswirkung der Deletion von iscA2 auf weitere FeS-Proteine der Zelle sollte

untersucht werden.

Um den Gehalt von Ferredoxin im Wildtyp und in der Mutante zu vergleichen

wurden 150 µg löslicher Synechocystis-Proteinextrakt auf ein nicht denaturierendes

Gel aufgetragen und die Stärke der Holoferredoxin-Banden verglichen. Wie in Abb.

3-37 zu erkennen, ist der Holoferredoxinanteil in Wildtyp und Mutante etwa gleich.

Die [4Fe4S]-Aconitase katalysiert die Bildung von cis-Aconitat aus Isocitrat. Zum

Vergleich der Aconitaseaktivität wurde die Reaktion im löslichen Synechocystis-

Proteinextrakt wie unter 2.4.14 beschrieben gemessen.

Tabelle 3-3: Vergleich der Aconitaseaktivität im Rohextrakt (Anzucht photomixotroph, HL)

Wildtyp iscA2::Sm Steigung OD240 / min 0,026 0,02

Aktivität [nmol / min x mg] 57 44 Aktivität [%] 100 77

Die Mutante weist nur 77 % der Aconitaseaktivität des Wildtyps auf (Tab. 3-3).

Ausgehend von diesen Ergebnissen ist kein signifikanter Einfluss der Deletion von

iscA2 auf die Expression und Aktivität von FeS-Proteinen festzustellen.

3.4.2.5 Einfluss der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt

IscA-homologe Proteine sind häufig im bakteriellen suf-Operon kodiert, das unter

Eisenmangel verstärkt exprimiert wird (PATZER & HANDTKE, 1999). Daher sollte die

Auswirkungen der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt der Zelle untersucht

werden.

Unter Eisenmangel kommt es bei Cyanobakterien zu einer Ausbildung einer Antenne

um das Photosystem I. Diese besteht aus 18 IsiA-Untereinheiten, die jeweils 180

Chlorophylle binden (BIBBY ET AL., 2001, BOEKEMA ET AL., 2001). Dies führt zu einer

Blauverschiebung des Absorptionsspektrums der Zelle und zu einer Änderung der

Fluoreszenzemission bei 77K.

Um Effekte der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt zu untersuchen, wurden

die Zellen unter Eisenmangel photoautotroph im Hochlicht angezogen und die

Reaktion der Zelle durch UV/Vis- und Tieftemperaturfluoreszenz-Spektroskopie

untersucht.

3 Ergebnisse

96

In der UV/Vis-Spektroskopie (Abb. 3-38) konnte bei Anzucht unter Eisenmangel-

bedingungen eine Blauverschiebung der Chlorophyll-Absorption beobachtet werden.

Das Absorptionsmaximum verschob sich bei unter Eisenmangel angezogenen Zellen

von 683 nm auf 677 nm.

Im Vergleich von WT und iscA2::Sm ist allerdings kein signifikanter Unterschied in

der Absorption zu erkennen. Zur weiteren Untersuchung wurden

Fluoreszenzemissionsspektren aufgenommen. Unter Eisenmangel ist beim Wildtyp

und bei der Mutante eine Erhöhung der Fluoreszenz bei 685 nm zu beobachten. Dies

ist auf die Bildung der IsiA-Antenne um das PS I zurückzuführen. Beim Stamm

iscA2::Sm ist diese Reaktion gegenüber dem Wildtyp verstärkt. Dies demonstriert,

dass die Mutante eher eine stärkere Eisenmangelreaktion zeigt als der Wildtyp.

Das Wachstum der Mutante ist bei Anzucht unter Eisenmangel unter

photoautotrophen Bedingungen nicht verlangsamt. Auch ist kein Unterschied in der

maximal erreichten Zelldichte festzustellen.

Abb. 3-38: links: Absorptionsspektren von Synechocystis WT und iscA2::Sm-Zellen in BG11 +/- Fe. rechts: 77K-Fluoreszenzspektren von Synechocystis WT und iscA2::Sm in BG11 +/- Fe. Die Anzucht erfolgte in BG11 +/– Fe unter photoautotrophen Bedingungen im Hochlicht bis zu einer OD730 von ca. 0,9. Die Proben für die Absorptionsspektren wurden 1:2 mit BG11-Medium verdünnt. Die Fluoreszenz-Spektren sind auf die Fluoreszenz bei 725 nm normiert.

600 700 8000,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Abso

rptio

n

Wellenlänge [nm]

WT - Fe iscA2::Sm - Fe WT + Fe iscA2::Sm + Fe

640 660 680 700 720 740 760

1

2

3

4

5

6

7

rel.

Fluo

resz

enz

Wellenlänge [nm]

WT - Fe iscA2::Sm - Fe WT + Fe iscA2::Sm + Fe

3 Ergebnisse

97

3.4.3 syniscU

Zur Bestimmung des Expressionsniveaus von SynIscU in Synechocystis, wurden

30 µg löslicher Synechocystis-Extrakt und bestimmte Mengen gereinigtes SynIscU

über ein SDS-Gel aufgetrennt und SynIscU mit einem spezifischen Antikörper

nachgewiesen.

Wie in Abb. 3-39 gezeigt, kann SynIscU in Synechocystis-Extakt immunologisch

nachgewiesen werden. 30 µg Synechocystis-Extrakt enthalten 5 –10 ng SynIscU,

damit repräsentiert SynIscU ca. 0,015 - 0,03 % der löslichen Proteine von

Synechocystis.

Versuche syniscU (sll2667) zu deletieren, hatten nie vollständig segregierte

Mutanten ergeben (SEIDLER ET AL., 2001).

Abb. 3-39: Westernblot (anti-SynIscU-AK) mit gereingtem SynIscU und Synechocystis-Extrakt. 1: 5 ng gereinigtes SynIscU 2: 10 ng gereinigtes SynIscU 3: 20 ng gereinigtes SynIscU 4: 30 µg löslicher Synechocystis Extrakt

4 Diskussion

98

4 Diskussion

4.1 Charakterisierung von IscA1 (Slr1417) - IscA1, die

Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis ?

IscA-homologe Proteine sind in vielen eukaryotischen und prokaryotischen

Organismen verbreitet. Die entsprechenden Gene sind dabei im nif-, isc- und suf-

Operon lokalisiert (TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002)

In Synechocystis PCC 6803 ist die Rolle von IscA-homologen Proteinen besonders

interessant, da ein Gen für Protein mit Ähnlichkeit zu IscU fehlt, obwohl diese

Domäne in nahezu allen Organismen verbreitet ist (HWANG ET AL., 1996).

4.1.1 Expression, Reinigung und Charakterisierung von Apo-IscA1

IscA1 (Slr1417) von Synechocystis konnte mit Hilfe des T7-Expressionsystems als

lösliches Protein in E. coli exprimiert und durch Fällungs- und zwei Säulenchromato-

graphieschritte bis zur Homogenität gereinigt werden.

Isoliertes IscA1 bindet kein FeS-Zentrum und auch kein Eisen, wie durch Eisen- und

Sulfidbestimmung des Proteins gezeigt wurde. Eine Eisenbindung von IscA1

(Slr1417) war aufgrund der Absorption des isolierten Proteins bei 330 nm vermutet

worden. Untersuchungen an A. vinelandii NifIscA (KREBS ET AL., 2001) ergaben, dass

IscA zwar in der Lage ist Eisen zu binden, dies aber mit geringer Affinität. Die

Modifikation von IscA1, wodurch im Absorptionsspektrum eine Absorption bei 330

nm auftritt, ist kovalent mit dem Protein verknüpft.

Da die Varianten C110A und C112A, die in vitro nicht in der Lage sind ein FeS-

Zentrum zu binden, diese Absorption nicht aufweisen, könnte eine mögliche Ursache

für die Absorption bei 330 nm die Bindung eines FeS-Zentrums in E. coli sein, das

während der Reinigung verloren geht und dabei das Protein oxidativ modifiziert. Für

diese Hypothese spricht das Auftreten einer zusätzlichen Masse von + 95 Da in der

Massenspektrometrie, was dem ungefähren Gewicht von 6 Sauerstoffatomen und

damit der Massendifferenz von zwei zur Cysteinsäure oxidierten Cysteinseitenketten

entspricht. Das Absorptionsspektrum von Cysteinsäure zeigt allerdings keine

Absorption bei 330 nm. Daher ist durch diese vermutete Oxidation die Schulter bei

330 nm nicht zu erklären. Die Frage nach Art der eventuell auftretenden

Oxidationsprodukte, die die Absorption bei 330 nm bedingen, ist daher noch offen.

4 Diskussion

99

4.1.2 Das FeS-Zentrum von IscA1

Durch Inkubation von IscA1 mit Eisen, Cystein und IscS (Slr0387) von

Synechocystis konnte unter reduzierenden und anaeroben Bedingungen ein FeS-

Zentrum an IscA1 assembliert werden. Die Bindung eines FeS-Zentrums von IscA-

Proteinen konnte bisher für IscA aus E. coli, NifIscA (Orf6) aus A. vinelandii und für

Isa1 aus Schizosaccharomyces pombe beobachtet werden (KREBS ET AL., 2001;

OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001; WU ET AL., 2002a).

Untersuchungen des gebundenen FeS-Zentrums durch EPR- und Mössbauer-

Spektroskopie ergaben, dass IscA1 von Synechocystis ein [2Fe2S]2+-Zentrum bindet,

das wahrscheinlich durch vier Cystein-Liganden koordiniert wird. Dieser

diamagnetische Zustand ist der einzig stabile Zustand des Zentrums. Alle Versuche

das Zentrum zu reduzieren oder zu oxidieren waren erfolglos.

Im Gegensatz zu den Untersuchungen von KREBS ET AL. (2001) an A. vinelandii NifIscA konnte keine Assemblierung eines [4Fe4S]-Zentrums an IscA1 von

Synechocystis beobachtet werden. Ob dieser Unterschied ein Unterschied genereller

Natur zwischen den IscA-Proteinen aus den beiden Organismen ist oder ein

Unterschied der experimentellen Bedingungen darstellt, ist unklar. Unter den für die

Rekonstitution des FeS-Zentrums von NifIscA aus A. vinelandii verwendeten

Bedingungen durch NifS (8 mM Cystein, kein Reduktionsmittel), war im Fall von

Synechocystis IscA1 mit IscS (Slr0387) nur sehr geringe Rekonstitution des FeS-

Zentrums zu beobachten. Dies kann dadurch bedingt sein, dass es sich bei der

Reaktion von NifS und NifIscA von A. vinelandii um eine enzymatische

Rekonstitution handelt, bei der zwei Enzyme interagieren. Die entsprechenden Gene

sind in einem Operon lokalisiert und werden kotranskribiert (JACOBSON ET AL.,

1989).

Ob es sich bei der Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA1 von Synechocystis

mit IscS und Cystein um eine solche enzymatische Rekonstitution handelt, konnte

nicht endgültig geklärt werden. Eine chemische Rekonstitution von IscA1 mit Sulfid

und Eisen war ebenfalls möglich und kinetisch ähnlich. Daher kann es sein, dass das

von IscS aus Cystein unter reduzierenden Bedingungen mobilisierte Sulfid in dieser

Form in das FeS-Zentrum inkorporiert wird, ohne dass es zu einer direkten Protein-

Protein-Interaktion kommt. Zudem ist es aufgrund meist fehlender Operonstrukturen

in Synechocystis, die einen Hinweis auf die Reaktionspartner eines

Biogenesesystems geben könnten, unklar, ob es sich bei IscA1 und IscS um

4 Diskussion

100

Reaktionspartner in vivo handelt oder ob ein anderes der insgesamt drei NifS-

homologen Proteine aus Synechocystis diesen Reaktionspartner darstellt.

Holo-IscA1 liegt in verschiedenen Oligomerisationsformen vor. Neben einer dimeren

Form, konnte auch eine tetramere Form beobachtet werden. Monomeres Holo-IscA1

hingegen konnte nie beobachtet werden. Die Absorptionsspektren des Dimers und

des Tetramers von Holo-IscA1 unterscheiden sich leicht in der Ausprägung der

Absorptionsmaxima. Diese Unterschiede deuten auf eine durch die unterschiedliche

Oligomerisierung veränderte Mikroumgebung des FeS-Zentrums hin. NifIscA aus A.

vinelandii ist ein Homodimer (KREBS ET AL., 2001), WU ET AL. (2002) beobachteten

für Holo-Isa1 aus S. pombe ebenfalls hochmolekulare Formen. Apo-IscA1 aus

Synechocystis liegt hauptsächlich als Monomer vor. Allerdings ist die Abweichung

des bestimmten Molekulargewichts für das Monomer zum berechneten Gewicht

recht groß. Dieses Laufverhalten könnte darauf hindeuten, dass es sich beim

Monomer um eine Form handelt, die große hydrophobe Oberflächen exponiert hat.

Ob Apo-IscA1 in vivo auch als Monomer vorliegt oder dies durch die

experimentellen Bedingungen, wie die starke Reduktion des Proteins vor dem

Auftragen auf die Säule, bedingt wird, muss noch genauer untersucht werden.

Um die Liganden des [2Fe2S]-Zentrums zu ermitteln, wurde mit Hilfe ortsgerichteter

Mutagenese Varianten von IscA1 hergestellt. Alle Cystein-Alanin-Austausche der

Cysteine 34, 44 und 75, einzeln oder in Kombination, verhinderten nicht die Bindung

eines FeS-Zentrums.

Bei der Variante C44A, bei der das dritte hoch konservierte Cystein gegen Alanin

ausgetauscht wurde, war das Maß der Rekonstitution geringer als beim Wildtyp-

Protein. In Saccharomyces cerevisiae ist die entsprechende Aminosäure für die

Funktion von ISA1 essentiell (JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT ET AL., 2000).

Untersuchung der rekonstituierten Variante C44A mit Hilfe der Mössbauer-

Spektroskopie zeigte klar die Bindung eines [2Fe2S]2+-Zentrums. Allerdings war der

Anteil an Fe(III)-Aggregaten (δ = 0,50 mm/s) bei dieser Variante wesentlich größer

als der beim Wildtyp-Protein. Der Grund dafür scheint in der Kinetik der

Assemblierung des FeS-Zentums der Variante C44A zu liegen. Diese erscheint im

Vergleich zum Wildtyp-Protein verlangsamt. KREBS ET AL. (2001) hatten vermutet,

dass eines der drei konservierten Cysteine eine Rolle bei der Assemblierung spielt

4 Diskussion

101

und dieses ein am aktiven Cysteinrest von NifS gebildete Persulfid reduziert. Da

aber, wie oben diskutiert, der Mechanismus der Assemblierung des FeS-Zentrums an

IscA1 offen ist, kann eine Beteiligung des Cysteins 44 daran nicht endgültig

bewiesen werden. Zudem bietet das Modell von KREBS ET AL. nur im Bezug auf die

Biogenese von [2Fe2S]-Zentren eine Erklärungsmöglichkeit für die Biogenese eines

FeS-Zentrums ohne exogenes Reduktionsmittel. Die beobachtete Bildung von

[4Fe4S]-Zentren an NifIscA erklärt das Modell nicht.

Neben der beobachteten verlangsamten Assemblierung des FeS-Zentrums an der

Variante C44A, konnte eine Beteiligung dieser Aminosäure beim Transfer des FeS-

Zentrums auf Apo-[4Fe4S]-Zentren gezeigt werden, was später diskutiert werden

soll.

Die Variante C75A assembliert verglichen mit dem IscA1-Wildtyp ebenfalls weniger

FeS-Zentren. Interessanterweise erscheint die Variante C34/75A im Vergleich zum

Wildtypprotein leicht besser rekonstituiert. Das Mössbauerspektrum der Variante

C34/75A zeigt auch keinen Anteil an Eisen(III)-Aggregaten, was die verbesserte

Bindung der FeS-Zentren nochmals untermauert. Da die verminderte Rekonstitution

der Variante C75A durch die Einführung einer weiteren Mutation reversibel ist,

scheint eine direkte Beteiligung des Cysteins 75 an der Stabilisierung oder

Assemblierung des FeS-Zentrums unwahrscheinlich. Möglicherweise bilden C34

und C75 einen Mechanismus, der die Assemblierung oder die Übertragung des FeS-

Zentrums bei IscA1 reguliert. Daher könnte C34 die Assemblierung des FeS-

Zentrums inhibieren oder dessen Bindung schwächen. Dem Cystein C75 käme dabei

eine Rolle als Antagonist der Funktion von C34 zu. Weitere Experimente sind nötig

um diesen Mechanismus aufzuklären

Bei diesen pflanzenspezifischen Cysteinresten könnte auch ein Ansatzpunkt für eine

Regulation im Chloroplasten/Cyanobakterium durch das Thioredoxin-System liegen

und so eine Verknüpfung der Biogenese von FeS-Zentren mit dem Redoxzustand der

Zelle erfolgen.

Die Varianten mit einem Austausch eines der C-terminalen hochkonservierten

Cysteine C110 oder C112 waren klar nicht mehr in der Lage ein FeS-Zentrum zu

binden.

Die Ergebnisse der Charakterisierung der IscA1-Varianten, die Ergebnisse der

Mössbauer-Spektroskopie, die komplette Cystein-Ligation des FeS-Zentrums

4 Diskussion

102

indizieren, und die Ergebnisse der Gelfiltration implizieren ein Modell für Holo-

IscA1 mit einem [2Fe2S]2+-Zentrum pro Protein-Dimer. Dabei stellt ein Protomer

mit den Cysteinresten C110 und C112 je zwei Liganden (Abb. 4-1)

Diese Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen von KREBS ET AL. (2001) für die

[2Fe2S]2+-Form von NifIscA, wo auch ein Zentrum pro Protein-Dimer nachgewiesen

werden konnte.

Arbeiten am S. pombe Isa1 widersprechen diesem Modell. Dort resultierte der

einzelne Austausch aller drei hochkonservierten Cysteine gegen Alanin in Varianten,

die nach Rekonstitution in der Lage waren ein [2Fe2S]2+-Zentrum zu binden (WU ET

AL., 2002a). Die Rekonstitution erfolgte bei diesem Protein bei der Rückfaltung aus

unlöslichen Aggregaten mit hohen Konzentrationen DTT als Reduktionsmittel. Die

Verwendung von DTT als Reduktionsmittel hatte auch bei dem hier untersuchten

IscA1 aus Synechocystis zu Problemen bei der Charakterisierung der Varianten

geführt. Die IscA1-Variante mit nur einem Cysteinrest (C34/75/110/112A) zeigte

nach Rekonstitution mit DTT als Reduktionsmittel ein Absorptionsspektrum, das auf

ein FeS-Zentrum hindeutete. Der Wechsel vom „dithiolen“ DTT zum „monothiolen“

β-Mercaptoethanpol bei der Rekonstitution ermöglichte dann klarere Aussagen.

Offenbar ist DTT in der Lage Eisen zu komplexieren. Dieser Eisen-DTT-Komplex

scheint zudem an Proteine fest binden zu können.

Das [2Fe2S]-Zentrum von IscA1 von Synechocystis ist relativ instabil. In

Anwesenheit von Sauerstoff kommt es zu einem schnellen Zerfall des Zentrums.

Abb. 4-1: Modell der Bindung des [2Fe2S]-Zentrums durch IscA1

4 Diskussion

103

Unter anaeroben Bedingungen besitzt das FeS-Zentrum mit einer Halbwertszeit von

180 min eine größere Stabilität. In Anwesenheit von Reduktionsmitteln war das FeS-

Zentrum von IscA1 in Anwesenheit von Luftsauerstoff ähnlich stabil wie unter

anaeroben Bedingungen. Wahrscheinlich schützt das Reduktionsmittel das FeS-

Zentrum vor Schädigung durch Oxidation /Reduktion. In Anwesenheit von Eisen(III)

kommt es in Anwesenheit von Sauerstoff zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies,

die in der Lage sind FeS-Zentren zu oxidieren oder zu reduzieren. Beides führt, wie

in dieser Arbeit gezeigt zur Zerstörung des FeS-Zentrums an IscA1. Das zugesetzte

Reduktionsmittel scheint der Bildung der reaktiven Sauerstoffspezies oder der

Schädigung der FeS-Zentren an IscA1 durch diese entgegen zu wirken.

Das [2Fe2S]-Zentrum von IscA aus E. coli und A. vinelandii ist aerob ebenfalls

instabil und anaerob stabil (KREBS ET AL., 2001, OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL.,

2001).

4.1.3 Übertragung des FeS-Zentrums

Neben der Assemblierung eines FeS-Zentrums müssen potentielle

Assemblierungsplattformen für eine Beteiligung an der Biogenese von FeS-Zentren

auch in der Lage sein, das assemblierte Zentrum auf Apo-FeS-Proteine zu

übertragen.

Eine Übertragung von FeS-Zentren ist bereits für IscU von Thermatoga maritima

(MANSY ET AL., 2002) und Isu1 von S. pombe (WU ET AL., 2002b) gezeigt worden. Als

Apoproteine wurden dabei verschiedene Apo-[2Fe2S]-Ferredoxine verwendet. Für E.

coli konnte die Übertragung des FeS-Zentrums von Holo-IscA auf das im isc-Operon

kodierte Ferredoxin Fdx gezeigt werden (OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001).

Synechocystis IscA1 überträgt das gebundene [2Fe2S]-Zentrum auf Apoferredoxin

aus Synechocystis. In vitro war dafür nur die Anwesenheit eines Reduktionsmittels

nötig. Die Geschwindigkeit der Reaktion war hoch. Nach 10 Minuten waren 50 %

der FeS-Zentren übertragen.

Da eine chemische Rekonstitution von Apoferredoxin mit stöchiometrischen Mengen

Sulfid und Eisen unter diesen Bedingungen möglich und ebenfalls schnell ist,

musste, um einen Transfer des FeS-Zentrums zu beweisen, das FeS-Zentrum unter

diesen Bedingungen für die Dauer des Experiments stabil sein. Durch die

Anwesenheit eines Reduktionsmittels und anaerobe Bedingungen wurde dies

gewährleistet.

4 Diskussion

104

Die spektralen Eigenschaften des entstandenen Holoferredoxins stimmen mit denen

des isolierten Proteins überein. Dies und die veränderte Migration im nicht-

denaturierenden Acrylamidgel demonstriert die korrekte Insertion des FeS-Zentrums

durch Holo-IscA1.

Die Cystein-Alanin-Austausche des strikt konservierten Cysteins 44 und der

pflanzenspezifischen Cysteine 34 und 75 hatten keinen Einfluss auf die Übertragung

des FeS-Zentrums auf Ferredoxin.

Die C. roseus APS-Reduktase gehört zur Gruppe der pflanzlichen APS-Reduktasen.

Diese binden, wie die B. subtilis PAPS-Reduktase (Berndt, C., Bill, E., Schwenn, J.-

D., unveröffentlicht), ein [4Fe4S]-Zentrum (KOPRIVA ET AL., 2001). Nach Entfernung

des FeS-Zentrums sind beide Enzyme inaktiv und konnten durch Inkubation mit

Holo-IscA1 aus Synechocystis wieder reaktiviert werden. Da Apo-IscA1 sowie

freies Sulfid und Eisen keinen Effekt hatten, kann daraus geschlossen werden, dass

die FeS-Zentren von Holo-IscA1 auf die Apoproteine übertragen wurden. Damit ist

die hier beschriebene Reaktivierung der beiden Reduktasen die erste bekannte

Rekonstitution eines [4Fe4S]-Zentrums durch IscA/IscU.

Über den Mechanismus der Transferreaktion auf Apo-[2Fe2S]- und Apo-[4Fe4S]-

Proteine kann nur spekuliert werden. Wie die Aktivierung der APS-Reduktase aus C.

roseus und der PAPS-Reduktase aus B. subtilis zeigt, ist der Transfer von FeS-

Zentren auf verschiedene Apo-FeS-Proteine aus verschiedenen Organismen durch

Holo-IscA1 aus Synechocystis möglich. Demnach ist das Vorkommen eines

spezifischen Erkennungssignals oder einer Anlagerungsstelle für IscA1

unwahrscheinlich. Dagegen spricht auch die Vielzahl verschiedener FeS-Proteine

eine Zelle. Vielmehr scheint es die Geometrie der präsentierten Liganden des

Apoproteins für das FeS-Zentrum sein, die den Transfer ermöglicht. Vorstellbar ist

ein Mechanismus, bei dem der Transfer schrittweise erfolgt. In einem ersten Schritt

werden die Liganden eines IscA-Protomers durch zwei Liganden des Apoproteins

ersetzt, in einem weiteren erfolgt dann der Austausch der Liganden des zweiten

Protomers.

Die Liganden des FeS-Zentrums von IscA liegen in einem konservierten CGCG-

Motiv. Dies ist eine sehr ungewöhnliche Ligandenanordnung für ein FeS-Zentrum

(GIBNEY ET AL., 1996). Durch diesen ungewöhnlichen Abstand der Liganden,

4 Diskussion

105

getrennt nur durch die kleinste Aminosäure, könnte eine geringere Affinität von IscA

zum [2Fe2S]-Zentrum bedingt sein, wodurch ein Austausch von Liganden, die in

einer bevorzugteren Geometrie angeordnet sind, thermodynamisch begünstigt würde.

Bei der Aktivierung der Apo-[4Fe4S]-Enzyme durch Holo-IscA1 stellt sich zudem

die Frage, wie Holo-IscA1, das ein [2Fe2S]-Zentrum bindet, ein [4Fe4S]-Zentrum in

diesen Proteinen assemblieren kann. Prinzipiell sind dafür zwei Denkmodelle

vorstellbar.

Zum einen könnte ein gleichzeitiger Transfer von zwei [2Fe2S]-Zentren ein [4Fe4S]-

Zentrum bilden. Der gleichzeitige Transfer zweier Zentren ist allerdings kinetisch

unwahrscheinlich. Zum anderen könnte zunächst ein [2Fe2S]-Zentrum auf das

Apoprotein übertragen werden und dann das zweite. Dabei würde es zur transienten

Bindung eines [2Fe2S]-Zentrums in der Bindenische der [4Fe4S]-(P)APS-Reduktase

kommen. Bisher ist Bindung eines [2Fe2S]- und [4Fe4S]-Zentrums in der gleichen

oder zumindest überlappenden Bindenische nur für A. vinelandii IscU (AGAR ET AL.,

2000b), NifIscA (KREBS ET AL., 2001) und E. coli FNR (KOROSHILOVA ET AL., 1997)

gezeigt worden.

Hier könnte eine weitere Rolle für das hoch konservierte Cystein 44 von IscA1

liegen, das in Saccharomyces cerevisiae essentiell für die Funktion von ISA1 ist

(JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT ET AL., 2000). Die im Vergleich zum IscA1-

Wildtyp-Protein verminderte Fähigkeit zur Reaktivierung der Apo-APS- bzw. PAPS-

Reduktase deutet auf eine Beteiligung dieser Aminosäure an der Biogenese der

[4Fe4S]-Zentren hin, wohingegen die Übertragung auf Apoferredoxin nicht

beeinträchtigt ist. Obwohl die Variante C44A bei ihrer Rekonstitution weniger FeS-

Zentren assembliert, ist diese Verminderung der Reaktivierung der APS/PAPS-

Reduktasen mit 80 – 90 % größer als die verminderte Beladung der Variante C44A.

Nach den Absorptionsspektren betrug die Beladung von IscA1C44A verglichen mit

dem IscA1-WT ca. 50 %.

Allerdings konnte durch die dreifache Menge IscA1C44A dieser Effekt wieder

aufgehoben werden. Es ist daher noch nicht endgültig geklärt, ob der Effekt

geringerer Aktivierung der APS- bzw. PAPS-Reduktase durch die Variante C44A

nur an geringerer Beladung der Variante C44A liegt oder eine mechanistische

Ursache hat. Die Rolle von C44 könnte in einer Stabilisierung eines von der APS-

bzw. PAPS-Reduktase intermediär gebundenen [2Fe2S]-Zentrums liegen. Auch dann

4 Diskussion

106

hätte eine größere Menge an Holo-IscA1C44A eine Steigerung der Reaktivierung zur

Folge, da durch die größere Menge an Holo-IscA1C44A der Zeitraum einer

intermediären Bindung eines [2Fe2S]-Zentrums bis zur Insertion eines zweiten

Zentrums verkürzt wäre. Der überproportionale Anstieg der Reaktivierung um einen

Faktor 10 durch die Zugabe einer dreifachen Menge C44A spricht für diesen

kinetischen Effekt. Weitere Experimente sind nötig, um die Rolle dieser Aminosäure

bei der Biogenese von [4Fe4S]-Zentren aufzuklären. Die hier vorgestellten

Experimente bieten einen guten Ansatz dafür.

Wie die Aktivierung der APS-Reduktase aus C. roseus durch die Variante C34/75A

demonstriert sind diese zusätzlichen pflanzenspezifischen Cysteinreste für den

Prozess der Biogenese von [4Fe4S]-Zentren nicht essentiell.

Neben den oben diskutierten mechanistischen Aspekten der Assemblierung von

[4Fe4S]-Zentren aus [2Fe2S]-Vorstufen, muss ein Redoxprozess beachtetet werden.

Liegen die für die Assemblierung eines [4Fe4S]-Zentrums benötigten vier

Eisenatome im [2Fe2S]2+-Zentrum als Fe3+ vor, so haben sie im [4Fe4S]2+-Zentrum

die formale Ladung Fe+2,5. Daher werden zur Bildung eines [4Fe4S]-Zentrums aus

zwei [2Fe2S]-Zentren zwei Elektronen benötigt.

Im untersuchten in vitro Rekonstitutionsansatz können diese durch das

Reduktionsmittel bereitgestellt worden sein. Als potentieller Elektronendonor in vivo

könnte das im isc-Operon kodierte Ferredoxin Fdx dienen. Ein Komplex gebildet

ausschließlich von Holo-IscA und Holo-Fdx konnte für die Enzyme aus E. coli

nachgewiesen werden (OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001).

Im Genom von Synechocystis PCC 6803 kann ein zu Fdx homologes Protein

(Slr0148) identifiziert werden. Abb. 4-2 zeigt einen Sequenzvergleich von Slr0148

verschiedenen Ferredoxinen und mit Fdx aus E. coli und A. vinelandii. Neben einem

N-terminalen Teil mit Ähnlichkeit zu Fdx besitzt Slr0148 eine C-terminale

Verlängerung, deren Funktion nicht bekannt ist. Die Cysteine, die bei Fdx aus E. coli

das [2Fe2S]2+/+-Zentrum koordinieren (KAKUTA ET AL., 2001), sind in der Sequenz

von Slr0148 konserviert. Biochemische Untersuchungen und Versuche das

entsprechende Gen zu deletieren müssen eine Funktion von Slr0148 an der

Biogenese von FeS-Zentren nachweisen.

4 Diskussion

107

In S. cerevisiae konnte ein zu Fdx homologes Ferredoxin Yah1p identifiziert werden,

das essentiell für die Lebensfähigkeit der Zelle ist (LANGE ET AL., 1999). Zellen, die

ein niedrigeres Expressionsniveau von Yah1p aufweisen, zeigen den in Hefe

typischen Phänotyp für einen Defekt in der Biogenese von FeS-Zentren, wie

herabgesetzte Aktivität der FeS-Enzyme und hoher mitochondrieller Eisenspiegel.

Arbeiten von (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001) in E. coli deuteten auch auf eine

Beteiligung von Fdx an der Biogenese von FeS-Zentren in E. coli hin.

Abb. 4-2: Sequenzvergleich von Slr0148 aus Synechocystis PCC 6803 mit Tlr2302 aus Themosynechococcus elongatus BP-1, Fdx aus A. vinelandii (T44286) und E. coli(NP_289082) und Ferredoxinen aus Pseudomonas aeroginosa (NP_252498) und Haemophilus influenza (NP_438533). Die das FeS-Zentrum von E. coli-Fdx koordinierenden Cysteine sind gelb hinterlegt.

4 Diskussion

108

4.2 Charakterisierung von IscA2 (Slr1565)

IscA2 konnte durch das T7-Expressionssystem in E. coli nur als unlösliches

Aggregat exprimiert werden. MORIMOTO ET AL. (2002) konnten IscA2 als lösliches

Protein mit gebundenem FeS-Zentrum in E. coli exprimeren, jedoch mit einer

geringen Ausbeute. Das sehr hohe Expressionsniveau von IscA2 als unlösliches

Aggregat (200 mg pro Liter E. coli-Kultur) ermöglichte eine effiziente Aufreinigung

des Proteins aus dem Rohextrakt. Durch Rückfaltung nach der Methode der

schnellen Verdünnung nach Auflösen der Aggregate in Harnstoff konnte mit einer

Ausbeute von 40 – 50 % ein bis zur Homogenität aufgereinigtes lösliches Protein

erhalten werden.

IscA2 konnte analog zu IscA1 rekonstituiert werden. Dies demonstriert, dass IscA2

trotz des für IscA-Proteine ungewöhnlichen C-terminalen CSCS-Motivs anstelle des

konservierten CGCG-Motivs in der Lage ist ein FeS-Zentrum zu assemblieren.

IscA2 ist wie IscA1 in der Lage das assemblierte FeS-Zentrum auf Ferredoxin zu

übertragen, die Effizienz dieser Reaktion scheint gegenüber IscA1 vermindert. Ob

dies ein Unterschied genereller Natur zwischen IscA1 und IscA2 ist, oder ob dies

durch die experimentellen Bedingungen hervorgerufen wird, ist unklar. Die von

MORIMOTO ET AL. (2002) diskutierte Rolle von IscA2 abseits der Biogenese von FeS-

Proteinen, kann hier insofern nicht bestätigt werden, als dass IscA2 wie IscA1 in der

Lage ist ein FeS-Zentrum zu assemblieren und dieses auf Apo-FeS-Proteine zu

übertragen.

4.3 Charakterisierung von SynIscU (Ssl2667) –

Sulfidmobilisierung oder Assemblierungsplattform?

NifU von A. vinelandii ist ein modular aufgebautes Protein bestehend aus drei

Domänen (OUZOUNIS ET AL., 1992; AGAR ET AL., 2000a). Die N-terminale Domäne ist

in der Lage Eisen zu binden und durch Inkubation mit NifS und Cystein ein

transientes [2Fe2S]-Zentrum zu assemblieren (YUVANIYAMA ET AL., 2000). Weitere

Inkubation mit NifS, Cystein und Eisen führt zur Assemblierung eines [4Fe4S]-

Zentrums pro NifU-Monomer (Smith, A., Johnson, M.K., persönliche Mitteilung).

IscU-Proteine aus verschieden Organismen besitzen Ähnlichkeit zu dieser N-

terminalen Domäne des NifU-Proteins.

Die mittlere Domäne des NifU-Proteins bindet ein Ferredoxin-ähnliches

reduzierbares [2Fe2S]2+/+-Zentrum (FU ET AL., 1994). Die C-terminale Domäne des

4 Diskussion

109

NifU-Proteins aus A. vinelandii besitzt zwei konservierte in einem CXXC-Motiv

lokalisierte Cysteinreste, die für die Funktion des NifU-Proteins in vivo nicht

essentiell sind (AGAR ET AL., 2000a). SynIscU besitzt Homologie zu dieser C-

terminalen Domäne. Die Funktion von SynIscU sollte untersucht werden.

Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zur Rolle von SynIscU als

Reduktionsmittel zur Mobilisierung von Sulfid aus Cystein beruhten auf den

Experimenten aus meiner Diplomarbeit, bei denen pro Mol reduziertem SynIscU

nach Inkubation mit Cystein und IscS (Slr0387) ein Mol Sulfid und oxidiertes

SynIscU nachgewiesen werden konnte. Arbeiten von TAKAHASHI ET AL. (1991a) an

isolierten Chloroplasten zeigten zudem sowohl für die Mobilisierung von Sulfid aus

Cystein als auch für die Biogenese des FeS-Zentrums von Ferredoxin die

Notwendigkeit von Redoxäquivalenten (NADPH) bei diesen Reaktionen. Daher

stellte SynIscU einen potentiellen Kandidat für die Übertragung dieser

Redoxäquivalente auf den von IscS aus Cystein mobilisierten Schwefel dar.

Der durch die Experimente dieser Arbeit gezeigte Mechanismus der Reaktion von

reduziertem SynIscU mit IscS und Cystein, widerlegt die Hypothese der Übertragung

des Persulfidschwefels von IscS auf eine Cysteinseitenkette von SynIscU mit

nachfolgender Oxidation von SynIscU unter Abspaltung von Sulfid (Abb. 4-3,

Reaktion A). Vielmehr konnte ein instabiles IscS-SynIscU-Heterodimer

Abb. 4-3: Mögliche Reaktionsmechanismen von IscS mit reduziertem SynIscU und Cystein, die zur Bildung von Sulfid und zur Oxidation von SynIscU führen

4 Diskussion

110

nachgewiesen werden, dass im Verlauf der Reaktion dissoziierte. Das nachgewiesene

Heterodimer war durch eine intermolekulare Disulfidbrücke kovalent miteinander

verknüpft. Es konnte durch Austausch des Cysteins 47 gegen Alanin stabilisiert

werden. Diese Beobachtung deuten auf einen Reaktionsmechanismus hin, bei dem

der Schwefel des Cysteins 44 von SynIscU den Schwefel des Cysteins 326 von IscS

angreift, wobei der als Persulfid gebundene Schwefel am Cystein 326 von IscS

abgespalten und als Sulfid freigesetzt wird und ein IscS-SynIscU-Heterodimer

entsteht (Abb. 4-3, Reaktion B). In einem zweiten Schritt kommt es dann zu einem

nukleophilen Angriff des Schwefels des Cysteins 47 von SynIscU auf den des

Cysteins 44, wobei intermolekulare die Disulfidbrücke gespalten wird und so eine

intramolekulare Disulfidbrücke der Cysteine 44 und 47 von SynIscU gebildet wird.

Dieser vorgeschlagene Reaktionsmechanismus für Synechocystis IscS, Cystein und

reduziertem SynIscU erklärt die in meiner Diplomarbeit untersuchte Reaktion. Dieser

Reaktionsmechanismus benötigt nicht ein Persulfid an SynIscU. Dieses konnte auch

an den Varianten C44A und C47A nicht nachgewiesen werden, obwohl es durch den

Cystein-Alanin-Austausch stabilisiert worden wäre.

Ob diese in vitro beobachtete Reaktion in vivo relevant ist, ist unklar. Eine direkte

Übertragung des Persulfids von IscS auf SynIscU würde einen Transport des

Schwefels ohne Freisetzung des Zellgifts Sulfid ermöglichen (Reaktion A). Dieser

Schwefel hätte dann zur Assemblierung eines FeS-Zentrums an SynIscU, das von

NISHIO & NAKAI (2000) mit gebundenem FeS-Zentrum nach Überexpression aus E.

coli isoliert werden konnte, oder an einem anderen Protein genutzt werden können.

Der nachgewiesene Reaktionsmechanismus (Reaktion B) setzt aber direkt Sulfid frei

und ist damit wahrscheinlich nicht physiologisch.

Arbeiten an E. coli und A. vinelandii IscS und IscU, die keine Ähnlichkeit zu

SynIscU besitzen, konnten den direkten Transfer eines Persulfids, im Falle von A.

vinelandii mehrerer Persulfide, von IscS auf IscU nachweisen (URBINA ET AL., 2001;

SMITH ET AL., 2001). Bei dieser Reaktion kommt es auch zur Bildung eines IscS-

IscU-Heterodimers, das über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft ist (KATO ET

AL., 2002). Im Falle von E. coli IscS und IscU konnte der übertragene Schwefel zur

Assemblierung eines FeS-Zentrums an IscU genutzt werden (URBINA ET AL., 2001).

Der Reaktionsmechanismus dieser Reaktion ist auch noch nicht endgültig aufgeklärt.

4 Diskussion

111

Die Untersuchung der Interaktion von SynIscU mit den drei NifS-homologen

Proteinen aus Synechocystis durch das Hefe 2-Hybrid-System ergab zudem keine

Interaktion zwischen diesen Proteinen. Dieses Ergebnis bestätigt die biochemischen

Experimente der Diplomarbeit. Durch das Hefe 2-Hybrid System konnte die dimere

Natur von IscS (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) und Sll0704 (KATO ET AL., 2000)

bestätigt werden, was ein Charakteristikum der Cysteindesulfurasen ist (KAISER ET

AL., 2000; MIHARA ET AL., 1999). Warum das dritte NifS-homologe Enzym (Slr0077)

keine Dimerisierung im 2-Hybrid-Test anzeigt, ist unklar. Um die genaue Ursache

dafür herauszufinden, wären weitere Experimente nötig. So müsste die Expression

des Fusionsproteins in Hefe überprüft werden. Möglicherweise wird das

Fusionsprotein in Hefe nicht löslich exprimiert oder nicht in den Kern transportiert.

Zusammengefasst erscheint eine Rolle für IscS und SynIscU als Enzympaar für die

Mobilisierung und Übertragung des Schwefels in Synechocystis als

unwahrscheinlich. Ob dies, wie oben für IscA1 und IscS diskutiert, wiederum daran

liegt, dass mit IscS (Slr0387) nur eine von drei Cysteindesulfurasen von

Synechocystis für die biochemischen Untersuchungen eingesetzt werden konnte, ist

unklar. Genetische Untersuchungen haben gezeigt, dass von den drei NifS-

homologen Proteinen einzig Slr0077 (SufS) für Synechocystis essentiell ist (SEIDLER

ET AL., 2001). Dieses Protein konnte nur als unlösliches Aggregat heterolog in E. coli

exprimiert werden. Eine Rückfaltung zu einem aktiven Enzym war nicht möglich (A.

Seidler, pers. Mitteilung). Kürzlich konnte für Slr0077 sowohl eine Cystein-

desulfurase-Aktivität, als auch eine Cystin-Lyase-Aktivität gezeigt werden. (D.

Kessler, pers. Mitteilung). Diese Aktivität war verglichen mit der Aktivität von IscS

(Slr0387) allerdings sehr gering. Versuche mit Slr0077 könnten die hier diskutierten

Fragen zur Übertragung des Schwefels vielleicht klären.

Um die Funktion von SynIscU als FeS-Assemblierungsplattform unabhängig von der

Frage der Übertragung des Schwefels von IscS zu untersuchen, wurde zunächst

analog zu NISHIO & NAKAI (2000) versucht SynIscU mit gebundenem FeS-Zentrum

nach Überexpression in E. coli zu isolieren. Es konnte aber in Gegensatz zu NISHIO

& NAKAI keine Bedingung gefunden werden, SynIscU mit gebundenem FeS-

Zentrum aus E. coli zu isolieren.

4 Diskussion

112

Durch die für IscA verwendete Methode konnte in vitro ein FeS-Zentrum an SynIscU

assembliert werden. Die Untersuchung des FeS-Zentrums durch Mössbauer-

Spektroskopie ergab, dass SynIscU ein [2Fe2S]2+-Zentrum bindet. Dies war auch von

NISHIO & NAKAI (2000) vermutet worden. Die Mössbauer-Spektroskopie deutete auf

eine komplette Cystein-Ligation des FeS-Zentrums. Da die Sequenz von SynIscU nur

zwei Cysteine aufweist, kann dadurch gezeigt werden, dass analog zu IscA1 ein

[2Fe2S]-Zentrum von einem SynIscU-Dimer gebunden wird.

Das rekonstituierte Holo-SynIscU war wie das mit FeS-Zentrum aus E. coli isolierte

Protein in der Lage das gebundene FeS-Zentrum auf Apoferredoxin zu übertragen.

Obwohl das FeS-Zentrum von SynIscU nicht vollständig stabilisiert werden konnte,

kann eine aktive Übertragung postuliert werden, da der Umsatz dieses Prozesses

größer und die Kinetik der Übertragung schneller ist als der spontane Zerfall des

FeS-Zentrums von SynIscU.

Im Gegensatz zu NISHIO & NAKAI (2000) war für diese Übertragung die Zugabe

eines Reduktionsmittels nötig. Ohne Reduktionsmittel konnte nur ein minimaler

Umsatz erreicht werden. Der Grund dafür liegt eventuell in der unterschiedlichen

Herstellung von Apoferredoxin. NISHIO & NAKAI benutzen dafür eine extrem hohe

Konzentration an DTT, die durch Gelfiltration wahrscheinlich nicht vollständig

entfernt wurde.

Der Vergleich der Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums von IscA1 und

SynIscU auf Apoferredoxin zeigt, dass unter den verwendeten Bedingungen der

Prozess in etwa gleich schnell abläuft.

Die Reaktivierung der Apo-[4Fe4S]-Proteine APS-Reduktase aus C. roseus und

PAPS-Reduktase aus B. subtilis war verglichen mit der Reaktivierung durch IscA1

wesentlich niedriger. Sie betrug nur ca. 20 % der Reaktivierung durch Holo-IscA1.

Auch durch Zugabe eines Überschusses an Holo-SynIscU konnte keine weitere

signifikante Steigerung erreicht werden. Die Relevanz dieser Beobachtung für die

Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis und die Rollen von IscA1, IscA2 und

SynIscU bei diesem Prozess sollen im nächsten Abschnitt weiter diskutiert und

voneinander abgegrenzt werden.

4.4 Die Rolle von IscA1, IscA2 und SynIscU in vivo

Neben der biochemischen Charakterisierung in vitro wurden auch Versuche

durchgeführt, die entsprechenden Gene, die die untersuchten Proteine kodieren, zu

4 Diskussion

113

deletieren, um so Informationen darüber zu erhalten, ob das Gen essentiell für den

Organismus ist oder nicht. Die Untersuchung des Phänotyps einer Mutante kann

dann Aufschluss über die Funktion des Proteins in der Zelle geben.

IscA1 wird von Synechocystis PCC 6803 exprimiert. Alle Versuche iscA1 (slr1417)

durch Insertion einer Gentamycin-Resistenzkassette in das Gen zu inaktivieren,

führten zwar zu einer Gentamycin-Resistenz des transformierten Stammes, aber nicht

zu einer homozygoten Insertionsmutante. Dieses Ergebnis spricht für eine essentielle

Funktion von IscA1 für Synechocystis. Nach Analyse der Genomsequenz von

Synechocystis PCC 6803 befindet sich kein weiterer offener Leserahmen

stromabwärts in der Transkriptionsrichtung von iscA1. Daher können polare Effekte,

die durch die Insertion einer Resistenzkassette mit einem Terminator entstehen

können, ausgeschlossen werden.

Die Deletion des zweiten Gens für ein IscA-Protein in Synechocystis war möglich.

Obwohl im Synechocystis-Wildtyp IscA2 in ähnlichem Maß wie IscA1 exprimiert

wird, konnte das iscA2-Gen (slr1565) homozygot durch eine Spectinomycin-

Resistenzkassette ersetzt werden. Die Deletion des iscA2-Gens hatte auf

Synechocystis keine signifikante Auswirkung. Verglichen mit dem Synechocystis-

Wildtyp zeigte die Deletionsmutante unter den getesteten Bedingungen ein ähnliches

Wachstum, ein ähnliches Verhältnis der Photosysteme und ähnliche Aktivität und

Expression der untersuchten FeS-Proteine.

Ob die von dem iscA2-Deletionsstamm unter Eisenmangel gezeigte stärkere

Expression der IsiA-Antenne (BIBBY ET AL., 2001; BOEKEMA ET AL., 2001) signifikant

ist, muss noch genauer untersucht werden. Das ähnliche Wachstum von Wildtyp und

Deletionsstamm unter Eisenmangel zeigt allerdings, dass der Phänotyp der Mutante

durch die erhöhte Stressreaktion, die verstärkte Expression der IsiA-Antenne,

kompensiert werden kann.

Das Gen für SynIscU (ssl2667) ist essentiell (SEIDLER ET AL., 2001). Es konnte

gezeigt werden, dass das Protein in ähnlichem Maße wie IscA1 und IscA2 in

Synechocystis exprimiert wird.

4 Diskussion

114

Zusammengenommen mit den Untersuchungen der Proteinfunktion in vitro

ermöglichen die unternommen Versuche zur Deletion der Gene in Synechocystis

folgende Aussagen und Interpretationsmöglichkeiten.

Trotz ähnlicher Eigenschaften in den in vitro durchgeführten Versuchen, kann die

Funktion von IscA1, da iscA1 essentiell ist, in vivo nicht durch die Funktion IscA2

ersetzt werden. Dies weist auf unterschiedliche zelluläre Rollen für die beiden

Proteine hin. Dies war schon vorher vermutet worden, da für IscA2 und nicht für

IscA1 aus Synechocystis ein spezifischer Komplex mit einem „heat-repeat-protein“

(Slr1098) nachgewiesen werden konnte (MORIMOTO ET AL., 2002). Über die Funktion

dieses IscA2-Slr1098-Komplexes und auch über die Funktion der heat-repeat

Proteine ist nichts weiter bekannt. MORIMOTO ET AL. spekulieren, dass eine spezielle

Funktion von IscA2 von den frühen Cyanobakterien zusammen mit Slr1098

entwickelt worden war. Ob der sehr milde Phänotyp der iscA2-Deletionsmutante

dadurch entsteht, dass diese Funktion für die Zelle unter den verwendeten

Anzuchtsbedingungen nicht essentiell ist oder ob IscA1 die Funktion von IscA2 in

vivo übernehmen kann, muss noch geklärt werden.

Die Abgrenzung der zellulären Funktionen von IscA1 und SynIscU ist hingegen

schwieriger. In vitro konnte für beide Proteine die Bindung eines [2Fe2S]-Zentrums

gezeigt werden, das von beiden Proteinen auf Ferredoxin übertragen werden kann.

Ein Unterschied besteht, wie schon oben diskutiert bei der Reaktivierung der Apo-

[4Fe4S]-Proteine. Beide Gene sind für Synechocystis essentiell und die

entsprechenden Proteine werden exprimiert.

Diese essentielle Funktion für ein IscA-Protein ist neu. Deletion des entsprechenden

Gens im nif-Operon von A. vinelandii (orf6) führt nicht, wie für nifS und nifU

beschrieben, zur sehr starken Verlangsamung des diazotrophen Wachstums

(JACOBSON ET AL., 1989). Deletion von iscA im isc-Operon von E. coli führte zu einer

verminderten Aktivität von FeS-Enzymen, deren Verminderung aber nicht so stark

war, wie bei Deletion von iscS oder iscU (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001). Auch

bei Ko-Überexpression des isc-Operons in E. coli, führt die Deletion von iscA zwar

zu einer verminderten Bildung der Holo-Form der als Reporter überexprimierten

Ferredoxine, aber trotzdem nicht zu einem totalen Verlust der de novo Synthese von

FeS-Zentren (TAKAHASHI & NAKAMURA, 1999). Deletion der iscA-Gene in S.

4 Diskussion

115

cerevisiae führt zwar zu einem starken Phänotyp (JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT

ET AL., 2000; PELZER ET AL., 2000), aber selbst eine Doppelmutation beider iscA-Gene

ist nicht letal (JENSEN & CULOTTA, 2000).

Das gleiche gilt auch für Proteine oder Proteindomänen mit Homologie zu SynIscU.

Die Cysteine der C-terminalen Domäne des NifU-Proteins aus A. vinelandii sind für

die Funktion des gesamten Proteins nicht essentiell (AGAR ET AL., 2000A). Auch in S.

cerevisiae ist das entsprechende nfu1-Gen nicht essentiell (GARLAND ET AL., 1999;

SCHILKE ET AL., 1999).

Der Grund für diese außergewöhnliche Essentialität dieser beiden Gene in

Synechocystis liegt wahrscheinlich in der Tatsache, dass ein Gen für ein IscU-

homologes Protein oder für ein Protein homolog zur N-terminalen NifU-Domäne in

Synechocystis fehlt, obwohl dieses Protein bzw. diese Domäne evolutionär extrem

konserviert ist (HWANG ET AL., 1996).

Aber warum benötigt Synechocystis zwei essentielle Gene oder Proteine mit

zumindest in vitro teilweise redundanter Funktion?

Eine Hypothese, die diese Beobachtung beantworten würde, ist das Vorkommen

zweier verschiedener Systeme zur Assemblierung von FeS-Zentren in Synechocystis,

wobei IscA1 und SynIscU die jeweilige FeS-Assemblierungsplattform in diesen

Systemen darstellen würden. Das Vorkommen zweier FeS-Assemblierungssysteme

ist bereits in zwei Prokaryonten, A. vinelandii und E. coli, untersucht worden.

In E. coli konnte der Phänotyp einer isc-Operon-Deletionsmutante durch eine

spontane Mutation im Promotorbereich des suf-Operons revertiert werden

(TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002). Die Überexpression des suf-Operons konnte den

Phänotyp der isc-Operon-Mutante aufheben. Im suf-Operon sind neben einem

hypothetischen ABC-Trasporter (sufBCD) auch ein IscS- und IscA-homologes

Protein (sufS/sufA) kodiert.

Ein anderes Bild zeichnet die Situation in A. vinelandii. Neben den im nif-Operon

kodierten Proteinen NifS, NifU und NifIscA (JACOBSON ET AL., 1989), existiert in A.

vinelandii noch ein klassisches isc-Operon (iscSUA-hscBA-fdx; ZHENG ET AL., 1998).

Hier konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von iscS nicht möglich ist, auch

wenn NifS unter Bedingungen, die Stickstofffixierung ermöglichen, exprimiert wird.

Andererseits zeigt ein nifS-Deletionsstamm noch sehr schwaches diazotrophes

Wachstum, was dafür spricht, dass die Funktion von NifS von IscS übernommen

4 Diskussion

116

werden kann. ZHENG ET AL. (1998) interpretieren NifS als spezialisierte Cystein-

Desulfurase für die Biogenese der FeS-Zentren der Nitrogenase und IscS als das eher

generelle Enzym für die Biogenese aller FeS-Zentren der Zelle. Im Vergleich zum

E. coli isc/suf-System liegt hier eine Spezifität in zumindest eine Richtung vor.

Wenn aber zwei essentielle Systeme zur Biogenese von FeS-Zentren in

Synechocystis existieren, worin liegt dann die Spezifität dieser Systeme?

Spezifität könnte dadurch entstehen, dass FeS-Zentren in verschiedenen Apo-FeS-

Proteinen nur von dem einen oder dem anderen Protein assembliert werden können.

Da, wie oben diskutiert, nicht angenommen werden kann, dass es eine spezifische

Anlagerungsstelle für Proteine gibt, die FeS-Zentren übertragen, muss diese

Spezifität ebenfalls wieder in der Geometrie der vom Apo-FeS-Protein präsentierten

Liganden liegen. Hier ist vorstellbar, dass eine Anordnung die Übertragung des FeS-

Zentrums durch das eine Protein bevorzugt, eine andere Anordnung die Übertragung

durch das andere Protein.

Eine weitere Möglichkeit der Spezialisierung ist es, dass in vivo ein Protein nur die

Assemblierung der [2Fe2S]-Zentren, das andere die Assemblierung der [4Fe4S]-

Zentren katalysiert. Die Ergebnisse der nur sehr schwachen Reaktivierung der Apo-

[4Fe4S]-Enzyme durch SynIscU in vitro legen den Verdacht nahe, dass Holo-

SynIscU in vivo das gebundene FeS-Zentrum nur auf Apo-[2Fe2S]-Proteine

übertragen kann, wobei IscA1 die Assemblierung der [4Fe4S]-Zentren katalysiert

oder zumindest dafür spezialisiert ist.

Ein weiterer Faktor, der diese Spezifitäten bedingen könnte, ist die Interaktion von

IscA und SynIscU mit verschiedenen anderen Proteinen in vivo. Diese könnten bei

der Übertragung des FeS-Zentrums von IscA1 oder SynIscU auf Apo-FeS-Proteine

benötigt werden. Wenn für diesen Prozess ein anderes Protein benötigt wird und

dieses mit IscA und nicht mit SynIscU interagiert, oder umgekehrt, wäre dadurch

eine Spezialisierung gegeben.

Potentielle Kandidaten für die Interaktion mit IscA1 und SynIscU sind Chaperone,

die in E. coli und A. vinelandii im isc-Operon kodiert sind. So konnte für E. coli IscU

und Hsc66 (HscA) und Hsc20 (HscB) gezeigt werden, dass IscU die ATPase-

4 Diskussion

117

Aktivität des Hsp70-Chaperones HscA steigert (HOFF ET AL., 2000; SILBERG ET AL.,

2001; HOFF ET AL., 2002; TOKUMOTO ET AL., 2002). Deletion von hscA und hscB in E.

coli führen zu einer stark herabgesetzten Aktivität verschiedener FeS-Enzyme

(TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001), das gleiche konnte für die entsprechenden

Proteine in S. cerevisiae gezeigt werden (STRAIN ET AL., 1998).

Interaktion von HscA konnte auch mit IscA aus E. coli gezeigt werden (TOKUMOTO

ET AL., 2002). Ein weiterer potentieller Interaktionspartner ist Fdx, das ebenfalls in E.

coli mit IscA (OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001), aber auch mit IscS und HscA

(TOKUMOTO ET AL., 2002) interagiert.

Neben der Frage, wodurch Spezifität bei verschiedenen Systemen bedingt sein

könnte, ist die Frage von Interesse, bei welchem Schritt in der Biogenese von FeS-

Zentren die Spezifität der Systeme beginnt. Sind IscA1 und SynIscU wirklich Teile

zweier verschiedener Systeme oder zwei spezialisierte Komponenten eines Systems?

Die Tatsache, dass mit Slr0077 nur eine essentielle Cysteindesulfurase in

Synechocystis existiert, aber zwei essentielle potentielle Assemblierungsplattformen

vorkommen, spricht für eine spätere Verzweigung der Wege. Die Ermittlung der

Rolle der verschieden Proteine in vivo bleibt ein Ansatzpunkt weiterer

Untersuchungen, die zu einem noch besseren Verständnis der Biogenese von FeS-

Proteinen in Synechocystis führen können.

4.5 Ausblick

Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnte eine Funktion von IscA1 als eine

Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis ermittelt werden. IscA1

bindet ein [2Fe2S]-Zentrum, das auf Apo-[2Fe2S]- und [4Fe4S]-Proteine übertragen

werden kann. Der Mechanismus der Übertragung müsste noch genauer untersucht

werden. Vor allem die Übertragung auf die Apo-[4Fe4S]-Proteine bleibt ein

interessanter Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen im Hinblick auf ein eventuell

intermediär gebundenes [2Fe2S]-Zentrum als Zwischenprodukt der Reaktion. Die

Hinweise dieser Arbeit auf Beteiligung des dritten strikt konservierten Cysteins C44

in IscA1 an diesem Prozess müssten weiter untermauert werden. Die Ermittlung des

Elektronendonors für diese Reaktion in vivo bleibt eine weitere Aufgabe, wobei das

vorgeschlagene Ferredoxin (Slr0148) einen guten Kandidaten für diese Reaktion

darstellt. Das hier etablierte System bietet erstmalig die Möglichkeit die Übertragung

4 Diskussion

118

von FeS-Zentren sowohl auf Apo-[2Fe2S]-Proteine als auch auf Apo-[4Fe4S]-

Proteine zu studieren.

Auch für SynIscU bleibt der Mechanismus der Übertragung der FeS-Zentren weiter

aufzuklären. Ein mechanistischer Unterschied dabei könnte die Rollen von IscA1

und SynIscU weiter voneinander abgrenzen.

Neben der Frage der Übertragung der FeS-Zentren von IscA1 und SynIscU ist die

genauere Untersuchung der Assemblierung dieser Zentren ein offener Punkt. Dabei

wäre die Suche nach der „richtigen“ Cysteindesulfurase für diese Reaktion ein

Ansatzpunkt. Interessant wären auch Experimente der Übertragung des FeS-

Zentrums von SynIscU auf IscA1 oder umgekehrt. Diese Experimente könnten dann

eine primäre bzw. sekundäre Assemblierungsplattform ermitteln und so Auskunft

darüber geben, ob und an welchem Punkt der Assemblierungskette oder –ketten eine

Spezialisierung der Enzyme festzumachen ist.

Die Abgrenzung der Rollen von IscA1 und SynIscU in vivo würde zu einem

genaueren Verständnis der Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis führen.

Dabei könnte der Versuch der Deletion von iscA1 oder syniscU unter dem

Hintergrund der Überexpression des jeweilig anderen Proteins in Synechocystis

Auskunft darüber geben, ob hier wie beim Beispiel des E. coli isc- und suf-Operons

(TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002) ein Dosiseffekt die Übernahme der Funktion des

einen Proteins durch das andere Protein verhindert oder ob dieser Unterschied durch

eine wie auch immer geartete Spezifität bestehen bleibt.

Die molekulare Ursache für diese Spezifität wäre dann eine weitere Fragestellung der

zukünftigen Forschung auf diesem Gebiet.

5 Zusammenfassung

119

5 Zusammenfassung

Eisen-Schwefel-Proteine sind an nahezu allen elementaren Prozessen der belebten

Welt beteiligt. Obwohl die Bildung von Eisen-Schwefel-Komplexen in vitro spontan

ablaufen kann, haben alle Organismen Enzymsysteme entwickelt um FeS-Zentren zu

assemblieren. Ein Teil dieses Systems aus dem Cyanobakterium Synechocystis PCC

6803 wurde in dieser Arbeit untersucht und die Funktion der beteiligten Enzyme

Enzyme aufgeklärt.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde IscA1 (Slr1417) heterolog in E. coli

exprimiert und gereinigt. Es konnte ein System entwickelt werden, das die

Assemblierung eines labilen FeS-Zentrums an einem IscA1-Dimer erlaubte. Durch

biochemische und spektroskopische Methoden wurde das FeS-Zentrum als ein

diamagnetisches [2Fe2S]2+-Zentrum identifiziert, das ausschließlich durch

Cysteinseitenketten an das Protein gebunden wird. Ortsgerichtete Mutagenese ergab,

dass von den drei konservierten Cysteinen lediglich die beiden C-terminal in einem

CGCG-Motiv lokalisierten Cysteine an der Bindung des FeS-Zentrums beteiligt sind.

Es wurde gefolgert, dass das [2Fe2S]-Zentrum zwischen den beiden Protomeren

gebunden ist und je ein Protomer des IscA1-Dimers zwei Cystein-Liganden für

dessen Bindung zur Verfügung stellt.

Das FeS-Zentrum von IscA1 konnte mit hoher Effizienz auf Apo-FeS-Proteine

übertragen werden. Neben dem Transfer des FeS-Zentrums auf ein Apo-[2Fe2S]-

Ferredoxin konnten die Apo-[4Fe4S]-Enzyme APS-Reduktase aus Catharantus

roseus und PAPS-Reduktase aus Bacillus subtilis durch Inkubation mit Holo-IscA1

reaktiviert werden. Damit konnte erstmals die enzymatische Synthese eines [4Fe4S]-

Zentrums in vitro durchgeführt werden. Überraschenderweise zeigte sich, dass es

möglich ist dies aus zwei [2Fe2S]-Vorstufen zu erhalten.

Versuche des Transfers des FeS-Zentrums mit der Variante IscA1C44A deuten auf

eine Beteiligung des hoch konservierten Cysteins 44 an der Reaktivierung der Apo-

[4Fe4S]-Proteine, nicht jedoch von Apo-[2Fe2S]-Proteinen.

Das zweite IscA-Protein aus Synechocystis (IscA2/Slr1565) wurde als unlösliches

Aggregat in E. coli exprimiert, aufgereinigt und zu einem homogenen, löslichen

Protein zurückgefaltet. Durch die für IscA1 etablierte Methode konnte ein FeS-

5 Zusammenfassung

120

Zentrum an IscA2 assembliert werden, das von Holo-IscA2 auf Apoferredoxin

transferiert werden konnte. Damit konnten ähnliche Funktionen für die zwei IscA-

Proteine aus Synechocystis in vitro nachgewiesen werden.

Für SynIscU, ein drittes Protein, das an der Biogenese von FeS-Zentren in

Synechocystis beteiligt sein könnte, wurde wie bei IscA die Bindung eines

diamagnetischen [2Fe2S]2+-Zentrums durch ein SynIscU-Dimer nachgewiesen.

Auch das von SynIscU gebundene FeS-Zentrum konnte auf Apoferredoxin

übertragen werden. Die Reaktivierung der Apo-APS- und PAPS-Reduktase von C.

roseus bzw. B. subtilis war im Vergleich zur Reaktivierung durch Holo-IscA1 so

gering, dass diese Reaktion höchstwahrscheinlich nicht von physiologischer

Bedeutung ist.

Neben den biochemischen Untersuchungen in vitro wurde auch die Funktion der

untersuchten Proteine in vivo ermittelt. Versuche zur Deletion von iscA1 haben

gezeigt, dass dieses Gen wie syniscU für Synechocystis essentiell ist. Die Deletion

von iscA2 war hingegen möglich. Untersuchungen des Phänotyps der erzeugten

Deletionsmutante ergaben in Bezug auf Wachstum, Verhältnis der Photosysteme und

Expression und Aktivität verschiedener FeS-Enzyme keinen signifikanten

Unterschied zum Synechocystis-Wildtyp. Dies demonstriert, dass IscA1 nicht durch

IscA2 funktionell ersetzt werden kann, möglicherweise aber IscA2 durch IscA1.

Trotz ähnlicher Eigenschaften in vitro haben beide Proteine offenbar

unterschiedliche Funktionen.

Zusammengenommen geben die Ergebnisse dieser Arbeit neue grundlegende

Erkenntnisse über die Funktion und den Mechanismus der untersuchten Proteine im

Allgemeinen sowie für die Rolle der Proteine bei der Biogenese von Eisen-Schwefel-

Proteinen in Synechocystis. Aufgrund ähnlicher Enzymausstattung und dem

Modellcharakter von Synechocystis für den Chloroplasten, werfen diese Ergebnisse

auch Licht auf den Mechanismus der Biogenese von FeS-Proteinen im

Chloroplasten.

Darüber hinaus konnten in dieser Arbeit Ansätze für die weitere Untersuchung der

Biogenese von FeS-Proteinen aufgewiesen und Methoden zur Arbeit daran etabliert

werden.

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Danke ! Bei einer Arbeit, die in der Zeit von August 2000 bis zum Januar 2003 entstanden ist, ist es nicht nur wichtig, dass sie enstanden ist, sondern auch wie sie entstanden ist. Daher ein herzliches „Danke Schön“ an die Menschen, die das Zustandekommen dieser Arbeit unterstützt haben.

Prof. Dr. Matthias Rögner für die Übernahme der Betreuung der Arbeit und für Möglichkeit diese Arbeit am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen anzufertigen.

Mein besonderer Dank gilt Dr. Andreas Seidler. Er war es, der mir dieses spannende Thema überlassen hat, mir den Raum und die Möglichkeit gegeben hat es frei auszufüllen und, nicht nur wenn dies mal ins Stocken geriet, mir mit Rat und Tat zur Seite stand. Dank für die vielen anregenden Gespräche, auch abseits zellulärer Biogeneseprozesse.

Prof. Dr. W. Hengstenberg danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferates.

Bei allen aktuellen und ehemaligen Kollegen der AG Seidler möchte ich mich für das gute Arbeitsklima, die Unterstützung und Aufmunterungen bedanken. Danke, Tatjana Reinholz, Martin Vollmer, Marc Novaczyk, Katharina Nünning und vor allem Ulrike Kokelj !!!

Danke an meinen alten Kindergarten- und Schulfreund Carsten Berndt. Unsere Lebensläufe sind durch die gemeinsamen Experimente noch ähnlicher geworden. Dank auch an Jens Dirk Schwenn.

Danke an Dr. E. Bill vom MPI in Mülheim, der mich in den Tiefen der Physik unterstützt hat und so manche Probe gemessen hat.

Dank auch allen anderen Mitarbeiten des Lehrstuhls Biochemie der Pflanzen. Thomas Volkmer, der trotz meiner Schwefelgerüche gute Laune im Gastlabor verbeitet hat, Tatjana Schwabe für ihre Tipps zum Proteine-Schießen, Melanie für die Mitfahrgelegenheiten nach Essen, Bernd und Dieter für die Unterstützung im Kampf gegen die „digitale Sau“, Stephan-Olav, Daniela, Wendy und allen anderen dafür, dass Arbeit auch Spaß macht.

Meinen Freunden danke ich vor allem dafür, dass ihr mich nie in meiner Freizeit über die Forschung habt erzählen lassen. Mit euch war es nie schwer die Arbeit zu verdrängen, Spaß zu haben und das Leben zu zelebrieren. Danke auch an meine große-kleine Schwester Andrea für Unterstützung und Aufmunterung.

Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich immer unterstützt haben, mich nie gedrängt und doch gefördert haben und bei denen ich immer Ich sein durfte.

Essen, im Januar 2003

Markus Wollenberg

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Lebenslauf

Zur Person:

Name: Markus Wollenberg

Geboren am: 27.01.1975 in Essen

Familienstand: ledig, keine Kinder

Schulbildung:

1981 – 1985 Besuch der St. Elisabeth-Grundschule, Essen

1985 – 1994 Besuch des Viktoria-Gymnasiums, Essen

Zivildienst:

1994 – 1995 Zivildienst im kath. Krankenhaus Phillipusstift, Essen

Studium:

1995 – 2000 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

September 1997 Vordiplom Biologie

Mai 1999 – Juni 2000 Anfertigung der Diplomarbeit am Lehrstuhl für

Biochemie der Pflanzen. Thema: Biogenese von Eisen-

Schwefel-Proteinen in Synechocystis PCC 6803:

Die Rolle von NifU-homologen Proteinen

Juni 2000 Abschluss des Studiums als Diplom-Biologe an der

Ruhr-Universität Bochum

seit August 2000 Anfertigung der Doktorarbeit am Lehrstuhl für

Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität, Bochum

Tätigkeiten an der Ruhr-Universität Bochum:

Mai/Juni 1998 Studentische Hilfskraft am Lehrstuhl für

Pflanzenphysiologie

August – Dezember 1999 Studentische Hilfskraft am Lehrstuhl für Biochemie

der Pflanzen

Seit August 2000 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Lehrstuhl für

Biochemie der Pflanzen

Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren in Cyanobakterien · Eingereicht bei European Journal of...

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