Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer ...

BIOLOGISCHE FUNKTIONSANALYSE UND IDENTIFIZIERUNG NEUER SUBSTRATE

DER METHYLTRANSFERASE DNMT2

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

im Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften

der Universität Kassel

Vorgelegt von

Sara Müller

Kassel, Oktober 2011

1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Nellen 2. Gutachter: Prof. Dr. Albert Jeltsch

Datum der Disputation: 23.12.2011

Beim Erforschen und Versuchen hört man auch die Frömmsten fluchen.

(Prof. Dr. Hans-Jürgen Quadbeck-Seeger, Chemiker Quelle : »Der Wechsel allein ist das Beständige«, 2002)

1. Zusammenfassung

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1. Zusammenfassung

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten

verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor

unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte,

wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der

“Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et

al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später

robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde

zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum

5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse

Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2

(Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011).

Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-

Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung

durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC)

MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-

Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem

Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-

Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen.

Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-

Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten

interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und

tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese

Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen,

ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-

Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu

den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC)

vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und

intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro

Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat

der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden.

Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein

System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-

Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt

als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem

1. Zusammenfassung

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Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung

dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und

(GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in

beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht

erhöhte Translationseffizienz der Reportergene.

Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte

Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer

dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich

reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war.

Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben

keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription

des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche

sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des

Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden.

In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus

E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben

vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des

Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise

fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen

vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind.

Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als

konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-

Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA

Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige

zelluläre Dnmt2-Funktionen.

2. Summary

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2. Summary

The highly conserved DNA methyltransferase 2 (Dnmt2) is the most widely distributed

eukaryotic DNA methyltransferase; however, its biological function is still enigmatic. Although

weak m5C-DNA methylation on retroelements has been reported for “Dnmt2-only” organisms

like D. discoideum, D. melanogaster and E. histolytica, its role is still controversially discussed

(Kunert et al. 2003; Banerjee et al. 2005; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009; Schaefer et

al.). Recent data have shown methyltransferase activity on tRNAAsp for different Dnmt2

homologues and, thus, suggested a dual activity (Goll et al. 2006; Jeltsch et al. 2006).

My work focused on identification of new RNA substrates and the biological function of tRNA

methylation by Dnmt2. Methylation analysis of the Dictyostelium Dnmt2-homologue, DnmA, has

also revealed a tRNA methylation activity for tRNAAsp in vitro and in vivo. Additionally,

tRNAGlu(UUC) was identified as substrate in vitro. For the Dnmt2-Homologue of S. pombe (Pmt1)

tRNAAsp methylation activity was also experimentally verified.

To identify further RNA substrates, a crosslink-RNA-immunoprecipitation (RNA-CLIP) of GFP-

tagged DnmA was combined with Next-Generation-Sequencing of associated RNAs. This

approach revealed interaction of DnmA with tRNA fragments covering the part from the

anticodon loop to the T-loop of a tRNA. In addition to fragments of tRNAAsp(GUC) and

tRNAGlu(UUC/CUC) enrichment of tRNAGly(GCC) was observed. However, the origin of these fragments

as well as the biological function are still unknown. Interestingly, for some tRNA we detected

antisense fragments with a low number of reads. These fragments show complementarities to

the sense fragments but are a few nucleotides smaller. Moreover, a separate RNA-CLIP

experiment reveals several additional RNA candidate substrates. In further validation

experiments rnu2 (U2 snRNA) but not sno7 (snoRNA 7) and two previously not annotated

intergenic transcripts could be methylated to a low extend in vitro by DnmA and Dnmt2.

In D. discoideum the aspartate codon GAC is used at least ten times less in comparison to GAU.

But only tRNAAsp complementary to the rare GAC codon is annotated in Dictybase. The question

arises if a putative tRNAAsp methylation caused by DnmA has an influence on codon recognition

and “wobbling”. A GFP-reporter system with either a (GAU)5- or a (GAC)5-leader has been

established to approach differences in translation efficiency between wildtype cells and dnmAKO

mutants. Contradicting the hypothesis the (GAC)5-GFP construct was translated slightly more

efficiently than the (GAU)5-leader. Overall, the translation efficiency was elevated in dnmAKO

mutants.

Approaching the uptake of external DNA by dnmAKO mutants and wildtype cells I observed

significantly reduced transformation efficiency with an integrating plasmid for one but not a

2. Summary

6

second dnmAKO strain. However, the uptake of an extrachromsomal plasmid was impaired in this

second strain in comparison to wildtype.

Investigating the role of DnmA in regulation of the skipper retrotransposon no realationship

between the generation of small skipper RNA and enhanced transcription in dnmAKO cells was

detected. Furthermore, experiments with a second mutant as well as rescue experiments failed

to link the skipper mobilisation to DnmA function.

In a further project the binding of the m5C-binding protein of E. histolytica (EhMLBP) to LINE

DNA (long interspersed nuclear element) was imaged using atomic force microscopy. Despite

many end binding events a preferential binding site could be defined. Possibly this site

correspond to one out of two A/T-rich sequences which are anticipated to be involved in

EhMLBP target recognition.

In summary, my results confirm tRNAAsp methylation as conserved Dnmt2 function. Moreover,

they indicate that DnmA has additional tRNA substrates and for the first time a putative non-

tRNA substrate is presented. In addition, several new phenotypes hint at extended roles of

Dnmt2 in cellular function.

3. Danksagung

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3. Danksagung

Ich möchte mich bedanken…

…bei Wolfgang Nellen für ein Stück Laborbank, drei Pipetten, Enzyme, Nukleotide uvm.

Kurzum: für die Möglichkeit in seiner Abteilung eine Doktorarbeit anzufertigen und die

hervorragende Betreuung.

…bei Albert Jeltsch (Jacobs University Bremen), der sich als Zweitkorrektor für diese Arbeit zur

Verfügung gestellt hat.

…bei Tomasz Jurkowski (Abt. Jeltsch, Jacobs University Bremen) für die Vermittlung von

technischem Know-how und die Bereitstellung des hDnmt2-Plasmids.

…bei Cynthia Sharma und Jörg Vogel (Julius-Maximilians-Universität Würzburg), deren

Abteilung die RNA-Sequenzierungen durchgeführt hat. Außerdem danke ich Carsten Seehafer

(Abt. Hammann, TU Darmstadt) für die Hilfestellung bei der Datenauswertung.

…bei Oliver Bertinetti (Abt. Herberg, Universität Kassel) für die Massenspektrometrie.

…bei Markus Maniak (Universität Kassel) für die Bereitstellung des Fluoreszenzspektrometers.

…bei den gesamten Arbeitsgruppen Genetik und Zellbiologie für die angenehme und

kooperative Arbeitsatmosphäre. Insbesondere danke ich Indra Windhof für produktive Dnmt2-

Diskussionen und Sonja Fuhrmann für die Unterstützung bei der Klonierung der U2-snRNA

Vektoren. Ebenfalls soll an dieser Stelle die enge Zusammenarbeit mit den ehemaligen

Mitarbeitern Susanne Junk und Vladimir Maximov nicht unerwähnt bleiben.

…bei meinen Großpraktikanten Robin Lorenz, Katrin Thüne, Sebastian Regett und Nadja

Arens, die das Dnmt2-Projekt während ihrer Praktika tatkräftig unterstützt haben. Zusätzlicher

Dank geht an Robin für die Bereitstellung der Daten zur RNA Bisulfitsequenzierung, die er im

Rahmen einer Kooperation mit Matthias Schäfer (Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg) erhoben hat.

…bei allen Mitgliedern der der DFG FOR1082 für hilfreiche Diskussionen auf den Forscher-

gruppentreffen und darüber hinaus bei Malte Bussiek (Abt. Nellen, Universität Kassel), Serge

Ankri (Technion, Haifa, Israel), Maria Becker (Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-

Essen) und Olaf Nickel (Abt. Reuter, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) für

Kooperationen bei Teilprojekten...

…bei der Studienstiftung des deutschen Volkes für knapp drei Jahre Promotionsförderung.

…und zu guter Letzt bei Kim Tobias und meinen Eltern, die auch das Fluchen geduldig

ertragen haben.

4. Inhaltsverzeichnis

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1. ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................................................................3

2. SUMMARY.....................................................................................................................................................5

3. DANKSAGUNG ..............................................................................................................................................7

4. INHALTSVERZEICHNIS ...............................................................................................................................8

5. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS....................................................................................................................11

6. EINLEITUNG ...............................................................................................................................................14

6.1. KATALYTISCHE BASENMODIFIKATIONEN IN NUKLEINSÄUREN.................................................................14 6.1.1. DNA Modifikationen in Eukaryoten..........................................................................................14 6.1.2. Modifizierte Nukleotide in eukaryotischer RNA .....................................................................16 6.1.3. DNA versus RNA 5mC-Methyltransferasen ..............................................................................20

6.2. DIE EUKARYOTISCHEN DNA 5MC-METHYLTRANSFERASEN.....................................................................22 6.2.1. Dnmt1-RID-CMT Methyltransferasen ......................................................................................23 6.2.2. Die Dnmt3 Familie ......................................................................................................................24 6.2.3. Dnmt2 – eine bifunktionelle DNA/RNA Methyltransferase?.................................................27

6.3. EPIGENETISCHE GENREGULATION..........................................................................................................31 6.3.1. Dynamik zwischen DNA Methylierung und Histoncode ........................................................31 6.3.2. Methyl-CpG-bindende Proteine .................................................................................................33 6.3.3. Erkrankungen durch aberrante DNA und RNA Modifikationen ..........................................34

6.4. DICTYOSTELIUM ALS MODELLORGANISMUS IN DER EPIGENETISCHEN FORSCHUNG....................................35

7. ZIELSETZUNG ............................................................................................................................................37

8. MATERIALIEN............................................................................................................................................38

8.1. GERÄTE................................................................................................................................................38 8.2. VERBRAUCHSMATERIALIEN...................................................................................................................39 8.3. CHEMIKALIEN .......................................................................................................................................40 8.4. AFFINITÄTSMATRICES FÜR CHROMATOGRAPHIE UND IMMUNPRÄZIPITATIONEN .....................................42 8.5. PUFFER UND LÖSUNGEN........................................................................................................................42 8.6. KITS.....................................................................................................................................................48 8.7. ENZYME UND ENZYMPUFFER .................................................................................................................48 8.8. GRÖßENSTANDARDS .............................................................................................................................49 8.9. NUKLEOTIDE ........................................................................................................................................49 8.10. ANTIKÖRPER ........................................................................................................................................50 8.11. NÄHRMEDIEN .......................................................................................................................................50 8.12. ANTIBIOTIKA........................................................................................................................................51 8.13. BAKTERIENSTÄMME .............................................................................................................................51 8.14. STÄMME DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM...................................................................................................51 8.15. STAMM DROSOPHILA MELANOGASTER ....................................................................................................52 8.16. OLIGONUKLEOTIDE/PRIMER.................................................................................................................52 8.17. PLASMIDE ............................................................................................................................................56 8.18. KLONIERUNGSSTRATEGIEN ...................................................................................................................58 8.19. SEQUENZEN/GENE................................................................................................................................61

9. METHODEN ................................................................................................................................................62

9.1. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN ..............................................................................................................62 9.1.1. Anzucht von Escherichia coli .....................................................................................................62 9.1.2. Herstellung kompetenter Escherichia coli Zellen ..................................................................62 9.1.3. Transformation von Escherichia coli .......................................................................................62 9.1.4. Anzucht von Dictyostelium discoideum ...................................................................................62 9.1.5. Transformation von Dictyostelium discoideum .....................................................................63 9.1.6. Subklonierung von Dictyostelium discoideum .......................................................................63 9.1.7. Ernten von Sporen.......................................................................................................................64 9.1.8. Hitzeschock-Behandlung von Dictyostelium Zellen ...............................................................64 9.1.9. Hungerexperimente mit Dictyostelium Zellen in Schüttelkultur.........................................64 9.1.10. Fluoreszenzmikroskopie .......................................................................................................64 9.1.11. Fluoreszenzspektrometrie ....................................................................................................65


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9.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ..................................................................................................66 9.2.1. Präparation genomischer DNA aus Dictyostelium discoideum ...........................................66 9.2.2. Präparation von Gesamt-RNA aus Dictyostelium discoideum .............................................66 9.2.3. Anreicherung kleiner RNA aus Gesamt-RNA...........................................................................67 9.2.4. Trennung von Kern und cytoplasmatischer RNA ...................................................................67 9.2.5. Phenol/Chloroform Extraktion .................................................................................................67 9.2.6. Fällung von Nukleinsäuren .......................................................................................................68 9.2.7. Plasmidpräparationen aus E. coli ............................................................................................68 9.2.8. Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen ........................................................................68 9.2.9. Dephosphorylierung von Nukleinsäuren ................................................................................69 9.2.10. Phosphorylieren von Oligonukleotiden ..............................................................................69 9.2.11. Ligation von DNA Fragmenten .............................................................................................69 9.2.12. Hybridisieren komplentärer Oligonukleotide ...................................................................70 9.2.13. Polymerasekettenreaktion (PCR) ........................................................................................70 9.2.14. Rekursive PCR .........................................................................................................................71 9.2.15. Quantitative Real time-PCR ..................................................................................................71 9.2.16. PCR zur Herstellung methylierter PCR-Fragmente...........................................................72 9.2.17. Elektrophoretische Trennverfahren ...................................................................................73 9.2.18. Gelelution ................................................................................................................................74 9.2.19. Elektroelution .........................................................................................................................75 9.2.20. RNA Bisulfitsequenzierung ...................................................................................................75 9.2.21. Northern-Blot (Kapillarblot) ................................................................................................75 9.2.22. Northern-Blot für kleine RNAs (Semidry-Blot) ..................................................................76 9.2.23. Stripping von Northern Blots ...............................................................................................76 9.2.24. In vitro Transkription............................................................................................................76 9.2.25. Gelfiltration.............................................................................................................................78 9.2.26. Radioaktive Endmarkierung von Nukleinsäuren..............................................................78 9.2.27. Random primed oligo-labeling ............................................................................................78 9.2.28. Primer extension ....................................................................................................................79

9.3. BIOCHEMISCHE METHODEN ..................................................................................................................79 9.3.1. Überexpression rekombinanter Proteine in Escherichia coli ..............................................79 9.3.2. Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine aus E. coli.......................................................80 9.3.3. Affinitätsreinigung getaggter Proteine aus Dictyostelium ..................................................82 9.3.4. Co-Immunopräzipitationen von RNA .......................................................................................83 9.3.5. RNA Sequenzierung (Next-Generation-Sequenzierung) .......................................................85 9.3.6. Präparation von Gesamtprotein aus Dictyostelium discoideum.........................................85 9.3.7. Fällung von Proteinen ................................................................................................................85 9.3.8. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................................................85 9.3.9. Coomassie Färbung ....................................................................................................................86 9.3.10. Coomassie Schnelltest............................................................................................................86 9.3.11. Massenspektrometrie (nanoLC-ESI-MS/MS Analyse) .......................................................86 9.3.12. Western Blot............................................................................................................................86 9.3.13. Proteinmengenbestimmung nach Bradford ......................................................................87 9.3.14. 3H-in vitro Methylierungsassay ...........................................................................................87 9.3.15. 3H-in vitro Shift-Assay............................................................................................................88 9.3.16. 3H-in vitro Blockierungs-Assay ............................................................................................88

9.4. BIOPHYSIKALISCHE METHODEN ............................................................................................................89 9.4.1. Probenvorbereitung für Atomic Force Microscopy................................................................89 9.4.2. AFM Imaging................................................................................................................................89

10. ERGEBNISSE ..........................................................................................................................................90

10.1. IN VITRO METHYLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN AUS DICTYOSTELIUM DURCH DNMT2- HOMOLOGE ........90 10.1.1. Heterologe Expression und Reinigung von Dnmt2-Homologen aus E. coli ..................90 10.1.2. Das Dictyostelium Dnmt2-Homolog DnmA methyliert tRNA in vitro .............................91 10.1.3. Identifizierung von potentiellen tRNA-Substraten aus Dictyostelium ...........................96 10.1.4. tRNAAsp und tRNAGlu sind in vitro Substrate von Dnmt2-Homologen ..............................97 10.1.5. RNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen ............................101 10.1.6. Der in vivo Methylierungsstatus ausgewählter tRNAs in Dictyostelium .....................103 10.1.7. Das Dnmt2-Homolog Pmt1 aus S. pombe ist eine aktive tRNA Methyltransferase ....105


10

10.2. IDENTIFIZIERUNG NEUER DNMA SUBSTRATE .......................................................................................106 10.2.1. Etablierung eines RNA-CLIP Systems zur Analyse von DnmA-RNA Interaktionen .....106 10.2.2. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit FA-crosslinking und

454-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten RNAs..................................................107 10.2.3. Dictyostelium U2-snRNA kann in vitro von Dnmt2-Homologen methyliert werden .110 10.2.4. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit UV- crosslinking und

Illumina®-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten RNAs .......................................112 10.3. EINFLUSS DER TRNAASP-METHYLIERUNG DURCH DNMA AUF DIE TRANSLATIONSEFFIZIENZ..................118

10.3.1. Aspartat-Codon usage in verschiedenen Organismen ...................................................118 10.3.2. Das „Asp-leader“-Reportersystem .....................................................................................119 10.3.3. DnmAKO-Mutanten zeigen leicht erhöhte Translationseffizienz ...................................120 10.3.4. DnmA ist nicht an der Transkriptionskontrolle des GFP-Reportergens beteiligt .....121

10.4. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON DNMA AUF DIE AUFNAHME UND INTEGRATION VON ........................... FREMD-DNA .....................................................................................................................................122 10.5. VERTIEFENDE ANALYSE ZUR FUNKTION VON DNMA BEI DER REGULATION DES RETROTRANSPOSONS ......... SKIPPER..............................................................................................................................................124

10.5.1. Untersuchung kleiner RNAs des Retrotransposons skipper ..........................................124 10.5.2. Analyse der skipper Transkription in DnmA-Mutanten .................................................125 10.5.3. Relative Bestimmung der skipper Kopienzahl in DnmA-Mutanten..............................127 10.5.4. In vitro Methylierung von DIRS-1 LTR und skipper RT Fragmenten ............................127

10.6. UNTERSUCHUNG VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN..................................................................128 10.7. ANALYSE SPEZIESÜBERGREIFENDER DNMT2 FUNKTIONEN ...................................................................132

10.7.1. Heterologe Expression humaner Dnmt2 in Dictyostelium.............................................132 10.7.2. Klonierung von DnmA in einen Drosophila Expressionsvector.....................................132

10.8. EINZELMOLEKÜLUNTERSUCHUNGEN DES 5MC-BINDENDEN PROTEINS EHMLBP AUS E. HISTOLYTICA .....133

11. DISKUSSION ........................................................................................................................................136

11.1. TRNA METHYLIERUNG ALS KONSERVIERTE DNMT2 FUNKTION............................................................136 11.1.1. DnmA und Pmt1 sind aktive tRNA Methyltransferasen .................................................136 11.1.2. tRNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen ...........................138 11.1.3. Endogene Dnmt2-Aktivität unterliegt vermutlich Umwelteinflüssen..........................138

11.2. DNMT2 ALS MULTISUBSTRAT-(T)RNA-METHYLTRANSFERASE ...........................................................139 11.2.1. Ist die RNA Methylierung durch Dnmt2 sequenzspezifisch?..........................................139 11.2.2. Methylierung vs. Bindung - dynamische Substraterkennung durch Dnmt2 ...............142

11.3. IDENTIFIZIERUNG VON NEUEN PUTATIVEN RNA-SUBSTRATEN MITTELS RNA-CLIP .............................144 11.3.1. U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA Substrat der Dnmt2 ..........................................146 11.3.2. DnmA ist mit tRNA-Fragmenten assoziiert ......................................................................147

11.4. BIOLOGISCHE FUNKTIONSANALYSE VON DNMT2..................................................................................150 11.4.1. Einfluss der tRNAAsp Methylierung auf die Translationseffizienz .................................150 11.4.2. Protein-Protein-Interaktionen ...........................................................................................152 11.4.3. Beeinflusst DnmA die Aufnahme von Fremd-DNA? .........................................................153 11.4.4. DnmA - ein Regulator des Retrotransposons skipper? ...................................................154

11.5. DAS BINDEVERHALTEN DES METHYLATED-LINE-BINDING-PROTEINS AUS E. HISTOLYTICA ....................155

12. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................................156

13. ERKLÄRUNG ........................................................................................................................................167

5. Abkürzungsverzeichnis

11


A Adenin

Amp Ampicillin

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosäure

asRNA antisense RNA

ATP Adenosintriphosphat

BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat

bp Basenpaare

BS Blasticidin

C Cytosin

CAM Chloramphenicol

cDNA copy/complemtary DNA

ChIP Chromatin-Immunopräzipitation

CTP Cytidintriphosphat

DAPI 4’,6-Diamidin-2’-phenylindol

DEPC Diethylpyrocarbonat

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)

DnmA DNA Methyltransferase A (Dnmt2-Homolog)

Dnmt DNA-Methyltransferase

DTBP Dimethyl-3,3´-dithiobispropionimidate

dNTP Desoxyribonukleotide

DMF Dimethylformamid

dsRNA doppelsträngige RNA

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EhMLBP E. histolytica methylated LINE binding protein

EMSA electrophoretic mobility shift assay

ESC embryonale Stammzelle (embryonic stem cell)

EtOH Ethanol

F Farad

FA Formamid

G Guanin

G418 Geniticin

gDNA genomische DNA


12

GFP grün fluoreszierendes Protein

GSH Glutathion (γ-L-Glutamyl-L-Cysteinglycin)

GST Glutathion-S-Transferase

GTC Guanidiniumthiocyanat

GTP Guanosintriphosphat

gus β-Glucuronidase

h Stunde

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

5hmC 5-Hydroxymethylcytosin

IMAC immobilized metal chelat affinity chromatography

IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid

KA Klebsiella aerogenes (Klebsiella mobilis)

KAN Kanamycin

kb Kilobasenpaare

kD Kilodalton

L Liter

LINE Long Interspersed Nuclear Element

LTR Long terminal repeat

M Molar (mol/L)

mA Milliampere

MBD methyl-CpG-binding domain protein

5mC 5-Methylcytosin

MeOH Methanol

min Minuten

miRNA micro RNA

MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure

MTase Methyltransferase

MW molecular weight (Molekulargewicht)

ncRNA nicht-kodierende RNA

nt Nukleotide

NiNTA Nickel-Nitrilotriessigsäure

OD optische Dichte

Pi ortho-Phosphat

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

piRNA piwi-interacting RNA


13

PNK Polynukleotid Kinase

Pmt1 Pombe Methyltransferase 1 (Dnmt2-Homolog)

PSTVd potato spindle tuber viroid

qPCR quantitative PCR

rcf relative centrifuge force

RNA Ribonukleinsäure (ribonuecleic acid)

RNA-CLIP Crosslink-RNA-Immunopräzipitation

RNAi RNA Interferenz

RKM Rasterkraftmikroskopie

rNTP Ribonukleotide

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RT Reverse Transkriptase

s Sekunde

SAH (AdoHcy) S-Adenosylhomocystein

SAM (Adomet) S-Adenosylmethionin

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulphate)

siRNA small interfering RNA

snRNA small nuclear RNA

snoRNA small nucleolar RNA

SSC Standard saline citrate

SSPE Standard saline phosphate with EDTA

ssDNA singlestranded DNA

Su(var) Suppressor of variegation

T Thymin

TAP Tandem affinity purification

TBE Tris-Borat-EDTA

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

TRD Target recognition domain

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

tRNA transfer RNA

TTP Thymidintriphosphat

U Uracil

u unit (Enzymeinheit)

üN über Nacht (~ ca. 16h)

UTP Uridintriphosphat

UV Ultraviolett

V Volt

6. Einleitung

14

6. Einleitung

Der Großteil des genetischen Materials einer eukaryotischen Zelle ist als Chromatin, einem

Komplex aus DNA und Proteinen (überwiegend Histonen), organisiert. Dabei wird die

Erbinformation nicht wie lange Zeit angenommen statisch allein durch die Abfolge der vier

Desoxyribonukleotide definiert, sondern das Genom unterliegt einer dynamischen Regulation.

Diese prägt sich beispielsweise in entwicklungs- oder gewebespezifischen Transkriptomen

sowie Veränderungen in der Genexpression als Reaktion auf Umweltbedingungen aus.

Varianzen im Genexpressionsmuster einer Zelle gehen dabei auf Änderungen in der

Chromatinstruktur zurück, an der neben post-translationaler Modifikationen der Histone vor

allem auch chemische Modifikationen der DNA beteiligt sind. Auch die Funktion vieler nicht

kodierender RNAs (ncRNAs) hängt oft von kovalenten Nukleotidmodifikationen ab.

6.1. Katalytische Basenmodifikationen in Nukleinsäuren

Katalytische Basenmodifikationen von Nukleinsäuren kommen in allen drei Reichen des Lebens

und zusätzlich in einigen Viren vor. Modifizierte DNA-Nukleotide sind dabei im Vergleich zu RNA

Modifikationen deutlich weniger divergent, da modifizierte Basen anfälliger für Mutationen sind

und die Erhaltung des Doppelstranges für das Überleben vermutlich essentiell ist

(zusammengefasst in Iyer et al. 2011). 1948 wurde erstmalig über das Auftreten nicht-

kanonischer Nukleotide in DNA berichtet (Hotchkiss 1948). Zwei Jahre später wurde 5-

Methylcytosin als fünfte Base der DNA (Wyatt 1950) und Mitte der fünfziger Jahre Pseudouridin

in RNA identifiziert (Davis et al. 1957; Cohn 1960). Seitdem sind mehr als 100 RNA

Modifikationen sowie einige weitere DNA Modifikationen entdeckt worden. Funktionell wurden

DNA Modifikationen als erstes in Bakterien als Bestandteil der Restriktions-Modifikations-

Systeme beschrieben. Dazu gehören die Methylierung des C5 von Cytosinen sowie die

Modifikationen N4-Methylcytosin und N6-Methyladenin (Ehrlich et al. 1987).

6.1.1. DNA Modifikationen in Eukaryoten

Mit Ausnahme der exozyklisch modifizierten Base N6-Methyladenin in niederen Eukaryoten wie

z. B. Tetrahymena (Hattman 2005) galt in höheren Eukaryoten 5-Methylcytosin (5mC) lange als

einzige Basenmodifikation. Mittlerweile ist mit 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) eine sechste

Base bekannt (Kriaucionis et al. 2009; Tahiliani et al. 2009), der ebenfalls eine Bedeutung

hinsichtlich epigenetischer Genregulation zugeschrieben wird (Abbildung 1). Neueste Studien

mittels single molecule real time-Sequenzierung deuten daraufhin, dass in eukaryotischer DNA

möglicherweise noch weitere Nukleotidmodifikationen vorhanden sind (Flusberg et al. 2010).

6. Einleitung

15

Desoxyribose

5-Methylcytosin

Desoxyribose

Cytosin

Desoxyribose

5-Hydroxymethylcytosin

MethylierungDnmt1, Dnmt3a/b, (Dnmt2)

(?) HydroxylierungTet 1-3

Demethylierung

N

NO H

NH2

N

NO H

CH3

NH2

N

NO H

NH2

OH

5-Methylcytosin

In Vertebraten, einigen Insekten (z. B. A. mellifera) und Deuterostomia (z. B. E. esculentus)

kommt 5mC überwiegend in symmetrischen CpG-Dinukleotiden vor (zusammengefasst in Suzuki

et al. 2008). In Säugetieren sind 60-90% aller Cytosine in CpG-Dinukleotiden methyliert (globale

Methylierung), das einem Anteil von 3-8% aller Cytosine entspricht (zusammengefasst in Jeltsch

2002). Ausnahmen bilden CpG-reiche Regionen (CpG islands), die nahe transkriptioneller

Startstellen (TSS) euchromatischer Gene vorkommen und weitestgehend unmethyliert bleiben.

In Pflanzen, Pilzen und vielen Invertebraten kommt DNA Methylierung meist in mosaikartigen

Strukturen vor. Neben CpG-Methylierung besitzen Pflanzen zusätzlich Methylierung von

Cytosinen in symmetrischen CpNpG (N = C, A, G, T) Kontexten und wie Pilze und viele

Invertebraten asymmetrische DNA Methylierung in CpNpN Abfolgen (Suzuki et al. 2008). Auch

in humanen embryonalen Stammzellen (ESC) wurde mittlerweile Nicht-CpG-Methylierung

beobachtet. Die Methylierung tritt hier überwiegend im gene body von Genen auf, die in RNA

Prozessierung, RNA Spleißen und RNA Stoffwechsel involviert sind, und ist mit aktiven Genen

assoziiert (Lister et al. 2009). Diese asymmetrische Methylierung verliert sich während der

Differenzierung und ihre biologische Funktion ist bisher unklar.

1975 wurde DNA Methylierung erstmals mit transkriptioneller Aktivität in Verbindung gebracht

und als „zelluläres Gedächtnis“ vorgeschlagen (Holliday et al. 1975; Riggs 1975). Heute ist

bekannt, dass in Eukaryoten vor allem heterochromatische Regionen wie perizentrische und

subtelomerische Bereiche durch DNA Methylierung transkriptionell inaktiviert werden.

Außerdem ist 5-Methylcytosin an der Stilllegung von Retroelementen (Walsh et al. 1998) sowie

einigen single copy Genen (z. B. X-linked Rhox cluster in Mäusen) beteiligt (Oda et al. 2006) und

für die Erhaltung der X-Chromosom-Inaktivierung sowie der Differenzierung embryonaler

Abbildung 1: Die Base Cytosin kann endozyklisch an der Position C5 des Pyrimidinrings durch DNA Methyl-transferasen (Dnmts) zu 5-Methylcytosin methyliert werden (Kapitel 6.2). Ein Mechanismus zur Demethylierung verläuft möglicherweise über die Hydroxylierung von m5C zu 5-Hydroxy-methylcytosin durch Tet-Proteine.

6. Einleitung

16

Stammzellen (ESCs) essentiell (Li et al. 1993a; Panning et al. 1996). Im Gegensatz zu ESCs büßen

adulte hämatopoetische Stammzellen bei Verlust der DNA Methylierung sogar schon die

Fähigkeit zur Selbsterneuerung ein (Trowbridge et al. 2009). DNA Methylierung ist ebenfalls ein

wesentlicher Bestandteil gesunder Embryonalentwicklung. Genomweite De- und

Remethylierung finden sowohl in der Zygote als auch in Primordialen Keimzellen statt, bei

denen auch neue Imprints gesetzt werden (zusammengefasst in Reik et al. 2001).

Base J und 5-Hydroxymethylcytosin

In Euglenoozoa wie Trypanosoma und Leishmania wird Base J (β-D-glucosyl-hydroxy-

methyluracil) mit der Assemblierung von Heterochromatin assoziiert und entsteht durch

Hydroxylierung und nachfolgende Glykosylierung der Base Thymin (zusammengefasst in Borst

et al. 2008). An diesem Prozess sind JBP-Hydroxylasen beteiligt, die zur Familie der 2-

Oxoglutarat- und Fe2+-abhängigen Dioxygenasen gehören. Derselben Familie werden die Tet

(Ten eleven Translocation)-Onkogene in Metazoen (Tet1-3) zugeordnet, deren Produkte

strukturelle Ähnlichkeiten zur DNA Methyltransferase Dnmt1 aufweisen und die Umwandlung

von 5-Methylcytosin zu 5-Hydroxymethylcytosin katalysieren. Mit Überexpression von murinem

Tet1 und Tet2, aber nicht Tet3, in U2OS and HEK293T Zellen korreliert das Auftreten von 5-

Hydroymethylcytosin mit der Abnahme von 5-Methylcytosin (Ito et al.). Außerdem spielt 5hmC

für die Selbsterhaltung von ESC durch Einfluss auf das Markergen Nanog sowie die Erhaltung

der inneren Zellmasse (ICM) eine essentielle Rolle (Ito et al.). Da bei hohem pH-Wert unter

Abspaltung von Formaldehyd eine spontane Umwandlung von 5-Hydroxylmethylcytosin zu

Cytosin stattfinden kann, besteht die Möglichkeit, dass 5hmC als Intermediat eines direkten

Demethylierungsprozesses dient (Privat et al. 1996) (Abbildung 1). Allerdings gibt es mehrere

Hinweise, dass 5hmC eine eher indirekte Funktion hat. Dazu gehört beispielsweise, dass eine

spezifische 5hmC Glykosylaseaktivität in Extrakten aus Kalbsthymus entdeckt worden ist

(Cannon et al. 1988).

6.1.2. Modifizierte Nukleotide in eukaryotischer RNA

Mehr als zwei Drittel der ca. 100 beschriebenen RNA Modifikationen beinhalten das Übertragen

einer Methylgruppe und finden mit wenigen Ausnahmen posttranskriptionell statt

(zusammengefasst in Motorin et al. 2011). RNA Methylierung kommt an allen vier

Hauptnukleotiden sowie Inosin und Pseudouridin vor (Abbildung 2) und hat oft mehrere

Funktionen. Aufgrund milder Phänotypen der zugehörigen Knockout-Mutanten sind RNA

Methylierungen häufig schwer zu untersuchen.

6. Einleitung

17

Guanosin Adenosin

UridinCytidin

Inosin

Pseudouridin

N N

NNH

O

NH2

O

OH

O

PO

OO

5´

3´

2´

1

23

7

Gm, m1G, m2G, m7G, m22G, imG,

m2,7G, m2,2,7G, yW, o2yW, OHyW,

OHyW*

Am, m1A, m6A, ms2m6A, m62A,

m62Am, m1Am, m6Am, i6A, io6A

m1I, Im

Cm, m3C, m5C, m5Cm, hm5C, m4C, f5Cm, m4C, ac4C

Um, m5U, m5Um, m3U, m3Um,m5D, mcm5U, s2U, ho5U, tm5U

mY,m1Y,m1acp3Y

5´

3´

2´

NHNH

O

O

OH

O

PO

OO

O

1

3´

N N

N

C

N

NH2

O

OH

O

PO

OO

5´

2´

12

6

5´

3´

2´

N

N

O

C

NH2

O

OH

O

PO

OO

3

4

5

5´

3´

2´

N

NH

O

C

O

O

OH

O

PO

OO

3

5

2

5´

3´

2´

N N

NNH

O

O

OH

O

PO

OO

1

Abbildung 2: Beispiele methylierter Nukleotide in eukaryotischer RNA. Methylierungen treten an den meisten Stickstoffatomen auf. Ausnahmen sind Stickstoffatome der glykosidischen Bindung sowie N3 und N7 von Adenosin. Zusätzlich treten RNA Methylierungen als 2´-O-Methylierung, 5-Methylpyrimidin sowie des Kohlenstoffatoms C2 und C8 am Adenosin auf. Ebenfalls sind Derivate von Wybutosin (yW) dargestellt. m: methyl, imG: Wyosine, o2: peroxy, OH: hydroxy, i: isopentyl, io: hydroxyisopentenyl, hm: hydroxy-methyl, f: formyl, ac: acetyl, D: Dihydrouridin, mcm: methoxycarbonylmethyl, s: thio, ho: hydroxy, t: taurin, Y = Ψ: Pseudouridine, acp: 3-amino-3-carboxylpropyl. (RNA Modifikationen entnommen aus http://rna-mdb.cas.albany.edu/RNAmods)

tRNA

tRNAs gehören zu den am besten untersuchten und am stärksten modifizierten RNAs

(Abbildung 3), wobei ihre Modifikationen zwischen einzelnen Spezies variieren können. tRNA

Modifikationen lassen sich nach ihrer Funktion in zwei große Gruppen einteilen: strukturelle

und metabolische Stabilität sowie Dekodierung von mRNA (zusammengefasst in Motorin et al.

2011).

6. Einleitung

18

Abbildung 3: Übersicht über tRNA Methylierungen in höheren Eukaryoten (modifiziert nach Motorin et al. 2011). Identische Modifikationen sind gleichfarbig gekennzeichnet. Positionen, die verschiedene Modifikationen tragen können, sind braun. Abkürzungen sind in der Legende von Abbildung 2 erklärt.

Beispielsweise begünstigen 2´-O-

Methylierungen an Pyrimidinen die C3´-endo-

Konformation des Zuckers und erhöhen so

die Schmelztemperatur der tRNA (Kawai et

al. 1992). In S. cerevisia gibt es mindestens

zwei Wege zum Abbau hypomodifizierter

und damit vermutlich fehl gefalteter tRNA.

Der TRAMP pathway (Cid14/Trf4-Air1-Mtr4

polyadenylation complex) wurde in

Trm6/Trm61 Mutanten entdeckt, denen

m1A58 in der tRNAiMet fehlt. Die tRNA wird

zunächst polyadenyliert und anschließend

durch das Exosom abgebaut (Kadaba et al.

2004). Rapid tRNA decay (RTD) ist erstmals

in TRM8 und TRM4 Doppelmutanten

beschrieben worden, in denen tRNAVal(AAC)

aufgrund fehlender im m7G und m5C

variablen Loop verstärkt durch die 5´-3´-

Exonukleasen Rat1 und Xrn1 degradiert wird (Alexandrov et al. 2006; Chernyakov et al. 2008).

Beschleunigter Abbau hypomodifizierter tRNA erfolgt in der Hefe auch als Antwort auf

oxidativen Stress (Chan et al. 2010). Auch das Fehlen von m5C38 in Drosophila Dnmt2-Knockout-

Mutanten vermindert die Stabilität verschiedener tRNAs nach Hitze- und oxidativem Stress

(Schaefer et al. 2010b). Neueste Erkenntnisse zeigen, dass Abbauprodukte von tRNAs häufig

definierte Fragmentlängen besitzen, z. B. 19mere des 5´-Endes oder „half-tRNAs“ (Schopman et

al.; Cole et al. 2009; Hsieh et al.). Inwiefern diese Produkte biologische Funktionen ausüben,

bleibt momentan Spekulation: Möglicherweise spielen Abbauprodukte von tRNAs eine Rolle bei

der Translationsinhibition oder können miRNA/siRNA ähnliche Funtionen ausüben

(zusammengefasst in Thompson et al. 2009).

Modifizierte Nukleotide des Anticodonloops einer tRNA spielen eine wesentliche Rolle bei der

Erhaltung des Leserasters während der Translation, wobei die bisher gewonnen Erkenntnisse

überwiegend auf prokaryotischen Translationssystemen beruhen. An Frameshifting Ereignissen

in Richtung +1 und -1 sind beispielsweise modifizierte Nukleotide an den Positionen 34 (u. a.

mnm5s2U34, Q34) und 37 (u. a. ms2io6A37, m1G37) beteiligt. An den genannten Positionen

mutierte tRNAs erhöhen das Auftreten eines Frameshifting Ereignisses um den Faktor 1,5 – 9,0

(Urbonavicius et al. 2001). Modifikationen an der Position 37 können beispielsweise eine vierte

Basenpaarung zwischen tRNA und mRNA verhindern. Durch Inkorporation von s2U34 in

6. Einleitung

19

unmodifizierte Transkripte der tRNALys(UUU) konnte gezeigt werden, dass diese Modifikation für

das „Wobbling“ dieser tRNA auf den Codons AAA und AAG verantworlich ist, aber gleichzeitig

falsches „Wobbling“ auf den Asparagin-Codons AAU und AAC verhindert (Ashraf et al. 1999).

Die Methylierung des G37 zu m1G37 in tRNAAsp aus Hefe schützt vor aberranter Aminoacylierung

der tRNA durch Argininyl-tRNA-Synthetase (Putz et al. 1994). Für tRNA Modifikationen im

Anticodonloop ist zusätzlich eine Bedeutung beim tRNA Priming der reversen Transkription von

Retroviren (HIV-1) vorgeschlagen worden, wobei die ursprünglichen Ergebnisse später nicht

reproduziert werden konnten (Barat et al. 1989; Thrall et al. 1996).

TRM9 aus S. cerevisiae ist neben ca. 25 weiteren Proteinen an der Modifikation von U34 beteiligt

(zusammengefasst in Motorin et al.) und bringt tRNA Modifikationen mit einer Reihe weiterer

zellulärer Prozesse in Verbindung: So ist TRM9 Teil des Elongator-Komplexes (Huang et al.

2005) und koppelt tRNA Modifikationen mit Histonacetylierung (Wittschieben et al. 1999) und

Exozytose (Rahl et al. 2005). Weiterhin verbinden TRM9 Modifikationen die Translation mit

DNA damage respsonse (Begley et al. 2007) und erzeugen Erkennungsmuster für Ribotoxine wie

Zymocin (Jablonowski et al. 2006). Zusätzlich wurde eine Auswirkung von TRM9 und Dnmt2

katalysierten tRNA Modifikationen auf die Regulation der Lebensspanne vorgeschlagen

(Fabrizio et al. 2010; Schaefer et al. 2010b).

rRNA

rRNA aller lebender Organismen enthalten sowohl Methylierungen von Basen als auch 2´-O-

Methylierungen der Ribosen. Funktionell ist Basenmethylierung von rRNA wichtig für den Erhalt

der Sekundärstruktur. In Hefe ist das Ausschalten von Dim1, einer konservierten m62A m62A

Dimethylase der 18S rRNA, sogar letal (Lafontaine et al. 1994). Generell führen hypomodifizierte

rRNAs zu geringerer Translationseffizienz (zusammengefasst in Motorin et al. 2011).

mRNA

Soweit bisher bekannt, beschränken sich Modifikationen in eukaryotischer mRNA im

Wesentlichen auf das kotranskriptionelle Capping (m7G) sowie die Editierung von C zu U und A

zu I. Fehler bei der A zu I Editierung werden mit amyotropher Lateralsklerose, Epilepsie,

Schizophrenie und Krebs in Verbindung gebracht (Dominissini et al.; Maas et al. 2006).

Abgesehen von wenigen m5C ist über m6A (1-3 pro RNA) in Exons und Introns berichtet worden

(zusammengefasst in Motorin et al. 2011).

6. Einleitung

20

snRNA und snoRNA

Während des Reifungsvorgangs erhalten eukaryotische U-snRNAs/snoRNAs im Kern ein m3G-

Cap, das als Signal für den Export aus dem Kern dient (Mouaikel et al. 2002). Zusätzlich ist über

Pseudouridine, 2´-O-Methylierungen der Ribosen und Basenmethylierung (z.B. m6A, m6Am und

m2G) in snRNA/snoRNAs berichtet worden (zusammengefasst in Massenet et al. 1998).

Kleine regulatorische RNAs

2´-O-Methylierung durch die MTase Hen1 ist ebenfalls von siRNA und miRNAs in Pflanzen

bekannt und schützt das 3´-Ende der Nukleinsäuren vor Uridylierung (Li et al. 2005; Yu et al.

2005; Yang et al. 2006). In Drosophila bilden keimbahnspezifische piRNAs sowie einzelsträngige

siRNAs Substrate für Hen1 (Horwich et al. 2007).

6.1.3. DNA versus RNA 5mC-Methyltransferasen

Bis auf sehr wenige Ausnahmen einiger folatabhängiger Methyltransferasen in Bakterien (Delk

et al. 1975; Urbonavicius et al. 2005) nutzen alle MTasen (S,S)-S-Adenosylmethionin (SAM oder

AdoMet) als Methylgruppendonor. Der Großteil der RNA MTasen sowie fast alle DNA MTasen

gehören zur Rossmannfold-MTase Familie, die sich durch ihr ubiquitär vorkommendes

Strukturmotiv zur Bindung Adenosin beinhaltender Kofaktoren auszeichnet (zusammengefasst

in Motorin et al. 2011). Obwohl SAM einen starken Methylgruppendonor darstellt und in vitro

schwache spontane Alkylierungen von Nukleinsäuren nachgewiesen werden konnten (Barrows

et al. 1982; Rydberg et al. 1982), läuft die Methylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin unter

physiologischen Bedingungen spontan nicht ab. In vivo werden Methylierungsreaktionen durch

5mC-Methyltransferasen, nach dem Reaktionsprinzip der Michael-Addition, katalytisch

begünstigt.

Kennzeichnend für DNA MTasen sind zehn Motive, die an der Methylierungsreaktion beteiligt

sind. Die Motive I – VI, VIII und X bilden die große, Motiv IX und die Target recognition domain

(TRD), zwischen Motiv VIII und IX, die kleine Domäne (Abbildung 5 und Abbildung 8). Dabei

sind die Motive I – III und X an der Bindung des Kofaktors beteiligt (zusammengefasst in Jeltsch

2002). RNA MTasen beinhalten generell die gleichen zehn Motive, jedoch meist weniger

konserviert und in anderer Reihenfolge.

Sowohl bei RNA als auch DNA Methyltransferasen ist die Reaktion durch das Auftreten eines

kovalenten Intermediats zwischen Enzym und Nukleinsäure gekennzeichnet, das zwischen einer

cysteinischen Thiolgruppe des Enzyms und dem Pyrimidinring des Cytosins ausgebildet wird

(Wu et al. 1987; Chen et al. 1991). RNA und DNA 5mC-Methyltransferasen beinhalten beide ein

6. Einleitung

21

konserviertes PC Motiv im Motiv IV (Abbildung 4). In den DNA MTasen erfolgt die Methylierung

durch einen nukleophilen Angriff dieses Cysteins auf das C6 der Base. Daraus resultiert ein

kovalentes Intermediat mit Carbanioncharakter an Position C5 des Cystosins, das ausreichend

nukleophil ist um die Methylgruppe des SAM zu akzeptieren (Wu et al. 1987). Ein konservierter

Glutamatrest im Motiv VI stabilisiert das Enamin-Intermediat (O'Gara et al. 1996). Nach

Auflösen des Enzym-Nukleinsäure-Komplex wird das freigesetzte S-Adenosylhomocystein (SAH)

enzymatisch zu Adenosin und Homocystein hydrolysiert (Chiang et al. 1996).

Interessanterweise unterstützt das genannte Cytosin die Methylierungsreaktion in RNA

Methyltransferasen ebenfalls, spielt jedoch keine katalytische Rolle. Der nukleophile Angriff der

Thiolgruppe erfolgt hier durch das Cystein eines TC Motivs im Motiv VI, das ausschließlich in

RNA Methyltransferasen konserviert ist (Liu et al. 2000). Für die Methylierung von tRNA durch

die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) konnte durch Mutagenesestudien gezeigt werden, dass

Dnmt2 den DNA Katalysemechanismus nutzt (Jurkowski et al. 2008).

Abbildung 4: Unterschiede im Reaktionsmechanismus von 5mC-DNA und 5mC-RNA Methyltransferasen (entnommen aus Schaefer et al. 2009b).

Die Kristallstruktur der bakteriellen DNA Metyltransferase M.HhaI (Abbildung 8 in Kapitel 6.2.3)

zeigte mit dem base flipping eine weitere mechanistische Gemeinsamkeit der 5mC-

Methyltransferasen (Cheng et al. 2001). Das Zielnukleotid wird durch eine Rotation um die

flankierenden Zucker-Phosphatreste um 180° aus der Doppelhelix herausgeklappt und so für

das katalytische Zentrum der MTase zugänglich gemacht.

6. Einleitung

22

6.2. Die eukaryotischen DNA 5mC-Methyltransferasen

Nach ihrer Abstammung lassen sich die eukaryotischen 5mC-Methyltransferasen in drei große

Gruppen einteilen: Dnmt1-CMT-RID-Methyltransferasen, die Dnmt3- und die Dnmt2-Familie

(Abbildung 5). Davon sind Dnmts der Säugetiere am besten untersucht.

Abbildung 5: Schematische Übersicht über die Struktur eukaryotischer DNA Methyltransferasen. NLS: Kernlokalisationssignal, BAH: bromo-adjacent homology, UBA: Ubiquitin assoziierte Domäne. (Modifiziert nach Goll et al. 2005).

6. Einleitung

23

6.2.1. Dnmt1-RID-CMT Methyltransferasen

Dnmt1 war die erste intensiv erforschte eukaryotische Methyltransferase (Bestor et al. 1988)

und kommt in fast allen Organismen vor, in denen m5C-DNA Methylierung gefunden wurde. Da

murine Dnmt1 in ersten Experimenten Präferenz für hemimethylierte CpG-Substrate zeigte

(Stein et al. 1982; Pradhan et al. 1999) und verstärkt während der S-Phase des Zellzyklus

exprimiert wird (Szyf et al. 1991; Robertson et al. 2000), wird nach wie vor ihre Hauptfunktion

in der Erhaltung von Methylierung nach der Replikation gesehen (maintenance Methylierung).

Bis heute ist jedoch unklar, inwiefern diese MTase in vivo als maintenance und/oder de novo-

Methyltransferase aktiv ist, da die Präferenz für hemimethylierte DNA durch Anwesenheit

methylierter Oligonukleotide als allosterische Regulatoren fast vollständig aufgehoben werden

kann (Goyal et al. 2006). Die resultierende de novo Methyltransferaseaktivität kann bis zu

zehnmal stärker als die von Dnmt3-MTasen sein (zusammengefasst in Svedruzic 2011).

Deletionen des dnmt1-Gens reduzieren DNA Methylierung in ESCs um ca. zwei Drittel.

Undifferenzierte ESCs ohne Dnmt1 zeigen normales Wachstum, aber induzierte Differenzierung

führt zu Apoptose in vitro und zu embryonaler Letalität in vivo (Li et al. 1992). Dnmt1 wird mit

der Stilllegung von Retrotransposons z. B. intracisternal A particle class LTR-retrotransposons in

Mäusen (Gaudet et al. 2004) sowie X-Chromosom-Inaktivierung, durch Methylierung und

Repression von Xist des aktiven X-Chromosoms, in Verbindung gebracht (Panning et al. 1996).

Homozygote loss-of-fuction-Mutationen von dnmt1 in Embryonen resultieren außerdem in

biallelischer Expression oder Repression geprägter Gene (z. B. H19 und Igf2) (Li et al. 1993b).

Bei der Reprogrammierung in frühen Embryonen erfolgt passive Demethylierung durch

Replikation unter Ausschluss von Dnmt1 aus dem Kern (Mertineit et al. 1998; Howell et al.

2001). Die Erhaltung der Methylierung in geprägten Genen wurde zunächst ausschließlich der

spezifisch in Oozyten und präimplantierten Embryonen exprimierten Isoform Dnmt1o

zugesprochen, die zwischen dem 8-16 Zellstadium kurzfristig kernlokalisiert ist (Ratnam et al.

2002). Mittlerweile ist jedoch gezeigt, dass das Dnmt1 Volllängeprotein sowohl als maternales

Restprotein als auch als neu synthetisiertes Protein ebenfalls im frühen Embryo nachzuweisen

ist (Cirio et al. 2008; Hirasawa et al. 2008).

In Pflanzen führt der Verlust des Dnmt1-Orthologs Met1 zu partieller Sterilität und

homöotischen Transformationen während der Blütenentwicklung (Finnegan et al. 1996).

Pflanzen besitzen mit der Gruppe der Chromomethylasen (CMTs) eine weitere Gruppe Dnmt1

verwandter Proteine. CMTs methylieren Cytosine im CpNpG und CpNpN Kontext und spielen

eine essentielle Rolle bei RNA vermittelter DNA Methylierung (Bartee et al. 2001; Lindroth et al.

2001). In Pilzen bildet DIM-2 aus N. crassa den Prototypen Dnmt1-ähnlicher Proteine. Sowohl

maintenance als auch de novo Methylierungsprozesse lassen sich in diesem Organismus auf

DIM-2 (defective in methylation) zurückführen (Kouzminova et al. 2001). Ascomyzeten

6. Einleitung

24

beinhalten mit RID (repeat induced point mutation defective) noch eine weitere

Methyltransferase, die Ähnlichkeiten zu Dnmt1 zeigt. RID methyliert repetitive DNA Sequenzen

und führt zu einer Punktmutation durch Deaminierung des methylierten Cytosins.

Strukturell ähnelt die MTase-Domäne der Dnmt1 eher den bakteriellen MTasen der

Restriktions-Modifikationssysteme als den C-terminalen Domänen von Dnmt2 und Dnmt3.

Dabei ist der „katalytische“ C-Terminus (nach GK-Wiederholungen) allein nicht aktiv, sondern

zur Methylierung wird ein großer Teil des N-Terminus benötigt. Das Fehlen der ersten 672 AS

führt zum Aktivitätsverlust (Pradhan et al. 2008). Der N-Terminus erfüllt im Wesentlichen drei

Funktionen:

a) Allosterische Regulation der katalytischen Aktivität. Dabei erfolgt Aktivierung durch

vollständig methylierte DNA und Inhibierung durch unmethylierte DNA sowie Poly(ADP)ribose.

RNA vermittelte DNA Methylierung wird durch methylierte und unmethylierte ncRNAs

beeinflusst (zusammengefasst in Svedruzic 2008).

b) Der N-Terminus beinhaltet Phosphorylierungs- und Methylierungsstellen, die die Aktivität

von Dnmt1 regulieren.

c) Interaktionen zwischen Dnmt1 und anderen Molekülen, die die DNA Methylierung

beeinflussen, erfolgen mit der Ausnahme des Kochaperons p23 durch den N-Terminus.

Mittlerweile sind über dreißig physikalische und funktionelle Interaktionspartner aus drei

Bereichen bekannt, die die vielfältigen Funktionen von Dnmt1 widerspiegeln. Beispielsweise

interagieren mit Dnmt1 Komponenten des Core chromatin remodeling complex wie Dnmt3a/B,

PCNA, Uhrf1, HP1β, HDAC1/2, MBD2/MBD3, LSH, NoRC (Kapitel 6.3.1). Nachgewiesene

Interaktionen mit PARP-1, p53 und Rb/E2F1 unterstützen die Annahme, dass Dnmt1 in

Prozesse wie DNA Reparatur, der Zellzyklusregulation und Apoptose involviert ist. Außerdem

beeinflussen RNA-Pol II und das m5C-bindende Protein MeCP2 Dnmt1 im Rahmen der RNA

vermittelte DNA Methylierung (zusammengefasst in Svedruzic 2011).

6.2.2. Die Dnmt3 Familie

Die Beobachtung, dass murine ESC ohne Dnmt1 weiterhin detektierbare Methylierung zeigen

und retrovirale Konstrukte de novo methylieren können (Lei et al. 1996), führte zur Entdeckung

der de novo Methyltransferasen Dnmt3a und Dnmt3b (Okano et al. 1998). Dnmt3 Homologe

kommen in Vertebraten, einigen Insekten, Knidarien und Tunikaten vor. In Pflanzen wird de

novo Methylierung überwiegend von DRM Methyltransferasen ausgeführt (Cao et al. 2002).

In vitro methylieren rekombinant exprimierte Dnmt3a und Dnmt3b unmethylierte und

hemimethylierte DNA gleichermaßen (Okano et al. 1998). Dabei ist im Gegensatz zu Dnmt1 der

6. Einleitung

25

C-Terminus allein katalytisch aktiv (Gowher et al. 2002). Die N-Termini von Dnmt3a und

Dnmt3b aus Säugetieren beinhalten eine PWWP-Damäne (Pro-Trp-Trp-Pro), die ein putatives

Histonbindemodul darstellt sowie eine zwischen Dnmt3a und Dnmt3b hochkonservierte ADD-

Domäne (AtrX-Dnmt3-Dnmt3L), die eine cysteinreiche Zinkfingerdomäne darstellt und ebenfalls

in Histonbindung involviert ist (zusammengefasst in Chedin 2011) (Abbildung 5). Im Gegensatz

zu Dnmt1 zeigen die Dnmt3 Homologe keine so stark ausgeprägte CpG Spezifität. Dnmt3a

methyliert in vitro auch CpA, aber nicht CpC und CpT, Dnmt3b hingegen CpA und CpT (Suetake

et al. 2003). Dnmt3-Homologe spielen wahrscheinlich jedoch ebenfalls eine Rolle bei

maintenance Methylierung, da Dnmt3a über den ganzen Zellzyklus hinweg gleichmäßig und

Dnmt3b verstärkt während der S-Phase exprimiert wird (Robertson et al. 2000).

In der Zelle führt Dnmt3a/b Methylierungsaktivität vermutlich zu hemimethylierter DNA (Lin et

al. 2002), so dass vollständige Methylierung symmetrischer CpG Stellen durch maintenance

Methylierung etabliert werden muss. Ist maintenance Methylierung ausschließlich an die

Replikation gekoppelt, tragen die Nachkommen variable Methylierungsmuster (RAMM -

replication associated maintenance methylation, Abbildung 6) (Chedin 2011).

Abbildung 6: Modell zur replikationsassoziierten maintenance Methylierung und replikationsunabhängigen maintenance Methylierung (übersetzt und modifiziert nach Chedin 2011). Weiße Kreise repräsentieren unmethylierte Nukleotide. Graufärbung symbolisiert de novo und schwarz maintenance Methylierung.

6. Einleitung

26

Neuere Erkenntnisse zeigen jedoch, dass Dnmt1 vermutlich auch unabhängig von der S-Phase an

das Chromatin assoziieren kann (Easwaran et al. 2004), um uniforme Methylierungsmuster zu

etablieren (RIMM – replication independent maintenance methylation; Abbildung 6). Das

Bindeglied zur Rekrutierung von Dnmt1 außerhalb der Replikation könnte Uhrf1 (ubiquitin-like,

containing PHD and RING finger domains 1) sein, das hemimethylierte DNA erkennt und dessen

Verlust in Säugetierzellen zu großräumiger Reduktion von DNA Methylierung führt (Bostick et

al. 2007; Sharif et al. 2007). Außerdem kann Uhrf1 auch mit Dnmt3a/b interagieren (Meilinger

et al. 2009).

Funktionell sind Dnmt3 Homologe in vivo in die Reproduktion und Entwicklung sowie Erhaltung

mentaler Gesundheit involviert. Knockout-Mutanten von Dnmt3a und Dnmt3b in Mäusen führen

zum Verlust von de novo Methylierung in präimplantierten Embryonen, wohingegen die

Methylierung geprägter Gene jedoch erhalten bleibt (Okano et al. 1999). Spätere Experimente

mit konditionalen Deletionen von Dnmt3a und Dnmt3b in der Keimbahn zeigten einen Einfluss

von Dnmt3a bei maternalem und paternalem Imprinting (Kaneda et al. 2004). Verlust von

Dnmt3b ist embryonal letal in Mäusen, Dnmt3a-Knockout-Mutanten leben bis zu vier Wochen

(Okano et al. 1999). Dnmt3a/b werden in der Blastocyste und während der Keimzellentwicklung

stark, nach Tag E10,5 nur noch in der Milz, Thymus und Gehirn exprimiert, wobei abhängig von

der Entwicklungsstufe von beiden Dnmt3 Homologen verschiedene Isoformen exprimiert

werden. Insgesamt zeigen differenzierte Zellen nur sehr wenig de novo Methylierung. Dnmt3a/b

sind außerdem verantwortlich für die Langzeiterhaltung der DNA Methylierung in ESCs, da

langzeitkultivierte Doppelmutanten fortschreitenden und globalen Verlust an DNA Methylierung

zeigen (Chen et al. 2003).

Neben den überlappenden Funktionen haben Dnmt3a und Dnmt3b unterschiedliche

Präferenzen hinsichtlich der Substrate. Beispielsweise ist die globale Methylierung sowie die

Methylierung geprägter Regionen überwiegend von Dnmt3a abhängig, Dnmt3b methyliert

dagegen bevorzugt minor satellite repeats (Okano et al. 1999). Gegenüber nackter DNA zeigt

Dnmt3a eine höhere Methylierungsaktivität in vivo, Dnmt3b modifiziert auch nucleosomale

DNA, wenn auch mit schwacher Aktivität. Eine dem rDNA Promotor komplementäre DNA (pRNA

– promotor associated RNA) kann im Rahmen RNA vermittelter Genregulation mit der

Erkennungsstelle des Transkriptionsfaktors TTF-I eine DNA:RNA Triple-Helix ausbilden, die

spezifisch von Dnmt3b erkannt wird (Schmitz et al.).

Dem Regulatorprotein Dnmt3L fehlt aufgrund der unvollständigen katalytischen Domäne die

Fähigkeit den Kofaktor SAM zu binden. Es hat außerdem nur geringe Affinität zu DNA und zeigt

folglich keine Methyltransferaseaktivität. Dnmt3L wird in ESCs sowie den Phasen der

Keimzellentwicklung exprimert, die mit de novo Methylierung einhergehen (Bourc'his et al.

2001; Huntriss et al. 2004). Somatische Zellen exprimieren hingegen kaum Dnmt3L. Knockout

6. Einleitung

27

Mutanten in Mäusen sind lebensfähig und asymptomatisch. Knockout Männchen sind jedoch

steril (Bourc'his et al. 2004) und den Eizellen von Knockout Weibchen fehlt DNA Methylierung

an geprägten Genen, was biallelische oder keine Expression zur Folge hat (Bourc'his et al. 2001).

Nachkommen aus einer Kreuzung von diesen Weibchen mit Wildtyp-Männchen sterben

während der Entwicklung.

Immunopräzipitationen zeigten physikalische Interaktion der pseudokatalytischen Domäne von

Dnmt3L mit den katalytischen Domänen von Dnmt3a und Dnmt3b (Hata et al. 2002). In

weiteren Experimenten kristallisierte sich eine regulatorische Funktion für Dnmt3L heraus, bei

denen Dnmt3L die Aktivität der Isoform Dnmt3A2 bis zu Faktor 20 stimuliert (Kareta et al.

2006). In Lösung können Dnmt3a und Dnmt3b unabhängig von Dnmt3L heterogene Komplexe

bilden, in vivo liegen Dnmt3a/b vermutlich als Homooligomere oder gemischte Heterooligomere

vor (zusammengefasst in Chedin 2011). Inwiefern diese Oligomerisierung eine spezielle

Funktion hat, ist nach wie vor unklar. Dnmt3a Oligomere scheinen aber eine reduzierte Aktivität

zu haben (Purdy et al. 2010). Dnmt3L hingegen liegt überwiegend als Homodimer vor und hat

die Fähigkeit heterogene Dnmt3a Komplexe zu heterotrameren Dnmt3a:Dnmt3L (2:2)

Komplexen zu reorganisieren (Abbildung 7) und so regulatorischen Einfluss auszuüben (Jia et al.

2007; Jurkowska et al. 2008).

Abbildung 7: Modell zur regulatorischen Funktion von Dnmt3L. SAM: S-Adenosylmethionin. (übersetzt und modifiziert nach Chedin 2011).

6.2.3. Dnmt2 – eine bifunktionelle DNA/RNA Methyltransferase?

Die Dnmt2 Familie nimmt unter den eukaryotischen DNA Methyltransferasen eine Sonderrolle

ein. Obwohl Dnmt2-Homologe alle zehn charakteristischen MTase Motive in typischer

Reihenfolge enthalten (Abbildung 5, Kapitel 6.2), konnte lange Zeit keine DNA

Methylierungsaktivität nachgewiesen werden. Dabei ist Dnmt2 die am weitesten verbreitete

DNA MTAse und ihre Homologe in verschiedenen Organismen weisen hohe Konservierung (30 –

50% Identität) auf (Goll et al. 2005). Abgesehen von C. elegans und S. cerevisiae existiert Dnmt2

auch in niederen eukaryotischen Modellorganismen wie D. discoideum, D. melanogaster, S.

6. Einleitung

28

pombe und E. histolytica, deren Genom für keine weiteren DNA MTAsen kodiert („Dnmt2-only“-

Organismen). In Säugetieren und Drosophila werden verschiedene Isoformen in allen Geweben

exprimiert, wobei die höchste Expression in Ovarien und Hoden nachgewiesen werden konnte

(Yoder et al. 1998; Schaefer et al.).

Die zunächst nicht nachzuweisende DNA Methylierungsaktivität von Dnmt2 wurde zum einen

auf den fehlenden N-Terminus zurückgeführt, der anderen MTasen zur Rekrutierung an die Ziel-

DNA dient (Abbildung 5, Kapitel 6.2). Zum anderen gibt die Kristallstruktur humaner Dnmt2

einen weiteren Anhaltspunkt zur Erklärung reduzierter DNA Methylierungsaktivität: Die TRD

von Dnmt2-Homologen enthält ein einzigartiges CFT-Motiv (CFTXXYXXY), bei dem das zweite

Tyrosin möglicherweise zu einer sterischen Hinderung bei der Bindung doppelsträngiger DNA

führt (Abbildung 8). Die Struktur der bakteriellen MTase M.HhaI besitzt an der genannten Stelle

ein für die Funktion essentielles Glycin (Dong et al. 2001). Allerdings konnten mit Dnmt2 und

dsDNA SDS-stabile kovalente Komplexbildung nachgewiesen werden (Dong et al. 2001).

Im Jahr 2003 wurde erstmals schwache DNA Methylierungsaktivität der humanen Dnmt2 in

vitro detektiert (Hermann et al. 2003). In den folgenden Jahren konnte in den „Dnmt2-only“-

Organismen E. histolytica, D. discoideum und D. melanogaster eine schwache Dnmt2-abhängige

5mC-DNA Methylierung in vivo nachgewiesen werden (Lyko et al. 2000; Kunert et al. 2003;

Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005), die überwiegend asymmetrisch und mit

Retroelementen assoziiert ist (Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Dem „Dnmt2-only“

Organismus S. pombe scheint DNA Methylierung zu fehlen, was ursprünglich auf eine Mutation

Abbildung 8: Überlagerung der Kristallstrukturen von M.HhaI (hellblau, PDB: 10MH) und hDnmt2 (dunkelblau, PDB: 1G55). Rot: Mit M.HhaI kokristallisierte DNA, magenta: Targetnukleotid, welches während des Methylierungsprozesses aus der DNA heraugeklappt wird, grün: Methylgruppendonor SAM (der M.HhaI), das mit hdnmt2 kokristallisierte SAM ist nicht dargestellt. türkis: zweites Tyrosin des CFT-Motivs der hDnmt2, beige: äquivalente Position (Glycin) zum zweiten Tyrosin des CFT-Motivs der hDnmt2. (DeLano 2002)

180°C

6. Einleitung

29

im katalytischen PCG Motiv des Dnmt2-Homologs Pmt1 zurückgeführt wurde (Wilkinson et al.

1995). Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit der Daten zur DNA

Methylierung durch Dnmt2 bleibt das Ausmaß der DNA Methylierungsaktivität von Dnmt2 nach

wie vor unklar (Schaefer et al.; Krauss et al. 2011).

In vitro Experimente der Arbeitsgruppe Bestor resultierten in der Entdeckung der RNA

Methylierungsaktivität von Dnmt2. Die MTase methyliert tRNAAsp an der Postion C38 mit

deutlich stärkerer Effizienz (Goll et al. 2005). Hochkonservierte Nukleotide der tRNAAsp

verschiedener Organismen mit Dnmt2 lassen eine Koevolution zwischen dem Anticodonloop

dieser tRNA und Dnmt2 vermuten (Goll et al. 2006). Organismen ohne Dnmt2 zeigen im

Anticoconloop der tRNAAsp Sequenz eine größere Variabilität. Grundsätzlich besteht die

Vermutung, dass es sich bei Dnmt2 um eine Ableitung bakterieller DNA-MTasen handelt, die ihr

Hauptsubstrat von DNA zu RNA verändert hat (Jeltsch et al. 2006). Mittlerweile konnte in

D. melanogaster neben der tRNAAsp(GUC) auch Dnmt2 abhängige Methylierung tRNAGly(GCC) und

tRNAVal(AAC) nachgewiesen werden (Schaefer et al.). Die Behandlung von humanen Krebszellen

mit dem DNA MTase Inhibitor 5-Azacytidin resultierte in einer Reduktion der Dnmt2-

abhängigen tRNA Methylierung (Schaefer et al. 2009a). Die tRNA Methylierungsaktivität von

Ehmeth, dem Dnmt2-Homolog aus E. histolytica, scheint durch Interaktion mit dem

glykolytischen Enzym Enolase inhibiert zu werden (Tovy et al.).

Funktionell geben Experimente mit Dnmt2-Knockout-Mutanten weitere Hinweise auf die

biologische Bedeutung der Methyltransferase (Abbildung 9). Nachdem zunächst keine

offensichtlichen Phänotypen in verschiedenen Organismen detektiert wurden (Wilkinson et al.

1995; Kunert et al. 2003; Goll et al. 2005), zeigten Dnmt2 Knockout Mutanten in Drosophila und

Dictyostelium Auswirkungen auf die Genomstabilität. In Dictyostelium führt eine Deletion des

dnmA-Gens zur Mobilisierung des Retroelements skipper (Kuhlmann et al. 2005), in Drosophila

geht das Ausschalten des dnmt2-Gens mit Verlust von H4K20me3 Methylierung sowie Verlust

subtelomerischer Invader-Cluster einher (Phalke et al. 2009). In Entamoeba ist das Dnmt2-

Homolog Ehmeth vermutlich essentiell (Fisher et al. 2006). Interessanterweise können virulente

Entamoeba durch die Gabe von 5-Azacytidin in eine nicht-virulente Form überführt werden

(Fisher et al. 2004). Zusätzlich konnte in Dictyostelium AX4 Stämmen das Ausschalten des dnmt2

Gens mit morphologischen Defekten in der späten Entwicklung in Verbindung gebracht werden

(Katoh et al. 2006). Über Dnmt2 Knockout Mutanten des Zebrafisches wurden Defizite in der

Organentwicklung berichtet (Rai et al. 2007).

6. Einleitung

30

Abbildung 9: Morphologische und molekulare Phänotypen durch Deletion oder Überexpression (OE) von Dnmt2 in verschiedenen Organismen.

Neuere Ergebnisse deuten daraufhin, dass Dnmt2 in die zelluläre Stressantwort sowie den RNA

Stoffwechsel involviert ist. Schäfer et al. zeigten eine Reduktion der Lebensspanne von

Drosophila Dnmt2-Knockout-Mutanten unter oxidativem Stress wie Paraquat oder Wasserstoff-

peroxid. Gleichzeitig wird bei oxidativem oder Hitzestress die tRNA Stabilität beeinflusst. In

Drosophila dnmt2-/- steigt die Anzahl an tRNA Fragmenten der tRNAs, die im Wildtyp von Dnmt2

methyliert werden (Schaefer et al.). In Drosophila sowie Entamoeba wurde über einen

Zusammenhang von Überexpression der Dnmt2-Homologe und Hochregulation von Hitze-

schockproteinen berichtet (Lin et al. 2005; Fisher et al. 2006).

Mittels Immunopräzipitationen aus HeLa-Zellen wurden Proteine, die in den RNA

Prozessierungsmechanismus involviert sind, als Interaktionspartner von Dnmt2 identifiziert

(Thiagarajan et al.). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch in humanen Zellen endogene

Dnmt2 kernlokalisiert ist und unter Stress in P-bodies (processing bodies) und Stressgranula

relokalisiert. In Dictyostelium lokalisiert auch überexprimierte DnmA überwiegend nukleär

(Kuhlmann et al. 2006), in Drosophila ist eine Assoziation mit der Kernmatrix (Schaefer et al.

2008) und für Ehmeth, das Dnmt2-Homolog aus Entamoeba, mit scaffold/matrix attachment

region vorgeschlagen worden (Banerjee et al. 2005).

6. Einleitung

31

6.3. Epigenetische Genregulation

Der Begriff Epigenetik (griech. epi - „über“) wurde erstmals durch Conrad Waddington in den

1940er Jahren geprägt, um zu erklären, inwiefern es Wechselwirkungen zwischen Umwelt und

Genen geben kann, die sich phänotypisch niederschlagen (Waddington 1942). Heute wird

Epigenetik allgemein als vererbbare Änderung in der Genexpression definiert, die nicht auf

Änderungen in der DNA Sequenz zurückgehen. Dabei spielen strukturelle Änderungen des

Chromatins die Hauptrolle, die auf Interaktionen zwischen fünf Phänomenen beruhen: kovalente

Modifikationen der DNA sowie der Histone, chromatin remodeling complexes, Einbau von

Histonvarianten sowie der Einfluss nicht-kodierender RNAs (Abbildung 10).

Abbildung 10: Übersicht über die verschiedenen Mechanismen epigenetischer Genregulation. Ac: Histonacetylierung, Me: Histonmethylierung, P: Phosphorylierung (modifiziert nach Cheng et al. 2011).

6.3.1. Dynamik zwischen DNA Methylierung und Histoncode

Da Dnmt1 und Dnmt3a/b abgesehen von der CpG Spezifität keine Sequenzspezifität aufweisen

(Yoder et al. 1997), spielt die Struktur des Chromatins eine entscheidende Rolle bei der

Regulation von DNA Methylierung. Ein erster Hinweis, dass Histonmethylierung DNA

Methylierung beeinflussen kann, kam von Experimenten mit N. crassa, in denen gezeigt werden

konnte, dass globale DNA Methylierung von H3K9 Trimethylierung durch DIM-5 abhängt

(Tamaru et al. 2001). H3K9me3 wird durch die Chromodomäne von HP1 (Heterochromatin

Protein 1) erkannt und rekrutiert die DNA MTase DIM-2 (Honda et al. 2008). Mittlerweile wird

die Kontrolle von DNA Methylierung durch H3K9 Methylierung als konservierte Funktion

angesehen: In A. thaliana führen Mutationen des KYP-Gens (KRYPTONITE), das eine H3K9

Methyltransferase kodiert, zum Verlust CMT3 vermittelter DNA Methylierung an CpNpG-

Nukleotidabfolgen und zur Aktivierung endogener Retroelemente (Jackson et al. 2002). Das

HP1-Ortholog LHP1 aus Arabidopsis scheint für DNA Methylierung jedoch nicht benötigt zu

werden (Malagnac et al. 2002). Dafür kann die Chromodomäne von CMT3 (Abbildung 5) direkt

6. Einleitung

32

mit Histon H3 interagieren, wenn K9 und K27 gleichzeitig methyliert sind (Lindroth et al. 2004).

Doppelmutanten der mit Heterochromatin assoziierten H3K9 Methyltransferasen Suv39h1 und

Suv39h2 in murinen ESCs ziehen den spezifischen Verlust von DNA Methylierung an den

perizentrischen major satellite repeats, aber nicht an anderen zentromerischen Sequenzen, nach

sich (Lehnertz et al. 2003).

Demethylierung von H3K4 spielt bei der Etablierung maternaler Imprints eine entscheidende

Rolle. Deletion der murinen H3K4 Demethylase KDM1B/LSD2 führt zu erhöhter H3K4

Methylierung und verhindert die Etablierung von DNA Methylierung an vier von sieben

untersuchten geprägten Genen in Oozyten. Embryonen aus diesen Eizellen zeigen bialleische

Expression oder Inaktivierung dieser Gene und sterben im Embryonalstadium (Ciccone et al.

2009). Mittels Immunopräzipitationen und Bindungsstudien konnte eine direkte Interaktion der

ADD Domäne von Dnmt3L mit dem N-Terminus des Histon H3 nachgewiesen werden. Der

Lysinrest K4 wird durch zwei Aspartatreste von Dnmt3L erkannt, die aufgrund sterischer

Hinderungen nur Bindung an unmethylierte Lysine erlauben (Ooi et al. 2007). Vermutlich bindet

Dnmt3L unmodifiziertes H3K4 und rekrutiert die keimbahnspezifische Isoform der de novo

Methyltransferase Dnmt3A2 zu unmethylierten H3K4 (Ooi et al. 2007). Aufgrund der hohen

Konservierung der ADD Dömanen zwischen Dnmt3L und Dnmt3a/b ist eine direkte Interaktion

von Dnmt3a/B mit unmethyliertem H3K4 wahrscheinlich und konnte für Dnmt3a in vitro auch

bestätigt werden (Otani et al. 2009). Erst kürzlich wurde außerdem entdeckt, dass die PWWP

Domäne von Dnmt3a, aber nicht von Dnmt3b, in vitro mit H3K36me3 interagiert (Dhayalan et

al.). Beide Interaktionen erhöhten die Aktivität von Dnmt3a auf nukleosomaler DNA. H3K36me3

ist häufig an gene bodies aktiver Gene zu finden und korreliert mit dem Auftreten von DNA

Methylierung an diesen Stellen (Hodges et al. 2009).

In neueren Experimenten wurde gezeigt, dass die Histondemethylase LSD1 auch weitere

Proteine demethylieren kann und Dnmt1 wurde als neues Substrat für LSD1 identifiziert.

Deletion von LSD1 in murinen ESCs resultierte in einem fortschreitenden Verlust von DNA

Methylierung (Wang et al. 2009). In weiteren Experimenten wurde verminderte Stabilität des

Dnmt1 Proteins durch Methylierung des Lys-142 durch die Protein Methyltransferase Set7/9

nachgewiesen (Esteve et al. 2009).

Die Arbeitsgruppe von G. Reuter schlug erstmals eine Verbindung zwischen Dnmt2 und

Histonmodifikationen vor. Deletion von Dnmt2 in Drosophila ist mit einem Verlust von

H4K20me3 Methylierung sowie Aktivierung von Retrotransposons assoziiert (Phalke et al.

2009). Inwiefern die Beobachtungen ein direkter Effekt von DNA Methylierung durch Dnmt2

sind, steht im Focus der aktuellen Forschung.

6. Einleitung

33

6.3.2. Methyl-CpG-bindende Proteine

Biologische Effekte von DNA Methylierung werden u. a. von Methyl-CpG-bindenden Proteinen

vermittelt, die - soweit bis heute bekannt – alle in die Etablierung und Erhaltung von

Heterochromatin involviert sind. Die bisher identifizierten Methyl-CpG-bindenden Proteine

lassen sich in drei große Familien gliedern: die MBD Familie, die Kaiso und Kaiso-like Familie

sowie die SRA Domänen Proteine. Ein Beispiel für die letztgenannte Familie ist Uhrf1, dessen

Verlust in Säugetierzellen zu großräumiger Reduktion von DNA Methylierung führt (Bostick et

al. 2007; Sharif et al. 2007). Da Uhrf1 hemimethylierte DNA mit hoher Affinität bindet und eine

physikalische Interaktion mit Dnmt1 nachgewiesen wurde, ist wahrscheinlich, dass Uhrf1

Dnmt1 an hemimethylierte DNA Regionen rekrutiert. Uhrf1 ist außerdem in die Etablierung von

Heterochromatin involviert, da ESCs ohne Uhrf1 keine exogenen Reportergene stilllegen können

(Meilinger et al. 2009). Methyl-CpG-bindende Proteine spielen auch eine Rolle bei der X-

Chromosom-Inaktivierung, da beispielsweise MBD2 an der Repression des Xist-Gens des aktiven

X-Chromosoms beteiligt ist (Barr et al. 2007). MeCP2 der MBD Familie spielt eine wichtige Rolle

bei der Stilllegung des L1 Retrotransposons in Säugetieren (Yu et al. 2001).

Interessanterweise binden einige MBDs (u. a. MBD2) auch verschiedene Arten an RNA

Molekülen (mRNA und siRNA). Wenn MDBs jedoch eine RNA gebunden haben, können sie nicht

mehr mit methylierter DNA interagieren (Jeffery et al. 2004). Vermutlich koordinieren RNA

Moleküle so den Zugang zu methylierter DNA zwischen Dnmts und MBDs, da die

Bindungsstellen jeweils nur von einem der großen Proteine gebunden werden können.

In „Dnmt2 only“-Organismen sind Moleküle, die 5-Methylcytosin „lesen“ können, kaum vertreten.

Das Genom von Drosophila kodiert für ein Ortholog der MBD2 aus Säugetieren (MBD2/3), wobei

Daten zur selektiven Bindung von methyliertem CpA/T (Marhold et al. 2004) oder CpG (Roder et

al. 2000) nicht reproduziert werden konnten. Vermutlich kann dieses Protein aufgrund von

Mutationen kein 5mC detektieren (Krauss et al. 2011). Die H3K9 Methyltransferase SETDB1 aus

Drosophila erkennt 5mC in einem CpA Kontext in vitro, wobei noch nicht nachgewiesen wurde,

dass dSETDB1 in vivo als MBD fungiert. Durch ChIP-Experimente wurde bisher gezeigt, dass

H3K9me3 durch dSETDB1 vermutlich dDnmt2 und das HP1-Ortholog Su(var)205 an Zielgene

von dSETDB1 rekrutiert (Gou et al. 2005). In E. histolytica wurde vor einigen Jahren das Protein

EhMLBP entdeckt, welches bevorzugt methylierte DNA in interspersed nuclear elements und

rDNA bindet, aber keine Homologien zu den „klassischen“ MBDs aus Säugetieren aufweist (Lavi

et al. 2006; Lavi et al. 2008; Lavi et al. 2009).

6. Einleitung

34

6.3.3. Erkrankungen durch aberrante DNA und RNA Modifikationen

Aberrante DNA Methylierung ist mit vielen Krebsarten, Imprintingerkrankungen, verschiedenen

Autoimmunerkrankungen sowie neuronalen Defekten assoziiert. Tumore sind häufig durch

Hypomethylierung von Onkogenen und repetitiven Elementen wie SINEs und LINEs (short and

long interspered repeat elements) sowie spezifischer Hypermethylierung der Promotoren von

Tumorsuppressorgenen gekennzeichnet (Feinberg et al. 2004). Die abweichenden

Methylierungsmuster werden oft mit erhöhter Expression der Dnmts in Verbindung gebracht,

wobei die Fehlregulation der MTasen auf verschiedenen Ebenen stattfinden kann.

Beispielsweise können Mutationen in Tumorsuppressorgenen wie z. B. p53 oder Rb, die an der

transkriptionellen Regulation von Dnmt1 beteiligt sind, die Expressionsrate der MTase

verändern (zusammengefasst in Kinney et al. 2011). In der Brustkrebszelllinie MCF-7 wurde bei

gleich bleibender mRNA Menge eine erhöhte Stabilität des Dnmt1 Proteins nachgewiesen. Auch

wenn der genaue Mechanismus noch ungeklärt ist, wurde gezeigt, dass die ersten 118 AS das

Dnmt1 Protein stabilisieren (Agoston et al. 2005). Die Expression der Dnmts wird außerdem

durch miRNAs reguliert. In Lungenkrebzellen konnte die Menge an Dnmt3a und Dnmt3b durch

verstärkte Expression der miR29s reduziert werden (Fabbri et al. 2007). Ein weiteres Beispiel

bildet die Regulation der dnmt1 mRNA durch Interleukin 6 regulierte miRNAs (Braconi et al.).

Deren Expression ist in Cholangiokarzinomen reduziert, was die Repression von

methylierungssensitiven Turmorsuppressorgenen nach sich zieht. Es konnte gezeigt werden,

dass mir148a und mir152 direkt mit dem 3´UTR der dnmt1 mRNA interagieren und das Dnmt1

Level reduzieren können. Folglich erhöhte sich die Expression der Tumorsuppressorgene.

Auch die „sechste“ Base 5-Hydroxymethlycytosin (Kapitel 6.1.1) scheint in Krankheitsprozesse

involviert zu sein. Erst kürzlich ist über eine Verbindung zwischen geringem 5hmC-Level und

Mutationen des Tet2-Proteins in Patienten mit myeloiden Erkrankungen berichtet worden

(Ko et al.).

Neben Defekten in der DNA Methylierung sind tRNA Modifikationen in die Entstehung von

Krebserkrankungen involviert. tRNAs aus Morrin-Hepatomzellen wiesen einen deutlichen

Rückgang an m5U, m3C und m5C im Vergleich zu tRNAs aus Hepatozyten auf (Randerath et al.

1974). In einigen humanen Lymphomen und Leukämiezellen ist die Base Queosin in tRNAs

unterrepräsentiert (Emmerich et al. 1985).

Mutationen der katalytischen Domäne von Dnmt3b werden in Verbindung mit dem autosomal

rezessiven ICF-Syndrom (Immundefefekt, Zentromerinstabilität und faciale Anomalien)

gebracht (Xu et al. 1999). ICF-Patienten leiden unter schwerwiegende DNA Hypomethylierung in

satellite tandem repeats der Chromosomen 1, 9 und 16 (Jeanpierre et al. 1993).

Autoimmunerkrankungen wie z.B. Atopische Dermatitis (Neurodermitis) oder Systemischer

6. Einleitung

35

Lupus erythematodes (SLE), einer chronischen Bindegewebserkrankung, sind ebenfalls durch

weitreichende DNA Hypomethylierung gekennzeichnet, zeigen dabei aber keine locus-

spezifische Hypermethylierung wie sie bei Krebserkrankungen beschrieben wird. Schizophrenie

ist hingegen mit genspezifischer Hypermethylierung assoziiert, die die Expression neuronaler

Proteine reprimiert (zusammengefasst in Kinney et al. 2011).

Das Auftreten uniparentaler Disomien (Engel et al. 1991) oder Fehler beim Imprinting führen zu

bialleischer Expression oder Stilllegung geprägter Gene. Imprintingfehler liegen beispielsweise

bei ca. 4% der Patienten mit Angelman-Syndrom sowie ca. 1% der Patienten mit Prader–Willi-

Syndrom (PWS) vor. Bei 25-30% der PWS-Erkrankten fehlt die väterliche Genexpression

aufgrund einer maternalen uniparentalen Disomie 15 (zusammengefasst in Horsthemke 2008).

Beim Silver-Russel- und Beckwith–Wiedemann-Syndrom spielt reziproke Hypo- und

Hypermethylierung des maternalen und paternalen Allels von imprinting control regions (ICR) -

insbesondere ICR1 auf Chromosom 11 - eine entscheidende Rolle (Eggermann et al. 2008).

6.4. Dictyostelium als Modellorganismus in der epigenetischen Forschung

Dictyostelium discoideum bietet aufgrund mehrerer Eigenschaften ein gutes Modell zur

Untersuchung epigenetischer Genregulation. Die soziale Amöbe wird phylogenetisch den

Amoebozoa zugeordnet, die sich nach der Verzweigung von Pflanzen und Tieren, aber vor der

Divergenz von Pflanzen und Pilzen abgeteilt haben (Eichinger et al. 2005). Außerdem wachsen

Dictyostelium Zellen einerseits einzellig, andererseits entwickeln sie sich bei Hungerphasen zu

einem differenzierten Fruchtkörper (zusammengefasst in Kessin 2001). Dictyostelium bildet

damit ein Bindeglied zwischen der Komplexität höheren Eukaryoten und der Einfachheit von

beispielsweise Hefen.

Das haploide Genom (34 Mbp) ist sehr A/T reich (78%) und in sechs Chromosomen,

mitochondrialer DNA sowie einem extrachromosomalen rDNA Palindrom mit ca. 100 Kopien

pro Zelle organisiert (Eichinger et al. 2005). Die ca. 12 500 Gene kodieren u. a. für RNAi

Komponenten wie Dicer, RdRPs und Argonauten (Martens et al. 2002; Kuhlmann et al. 2005),

Histonvarianten (z.B. CenH3) (Dubin et al. 2010a) und Histon modifizierende Enzyme wie HMTs

(z. B. Set1 (H3K4 MTase)) (Chubb et al. 2006) und SuvA (H3K9 MTase) (Kaller et al. 2006b)

sowie HP1-Homologe (HcpA, HcpB, HcpC) (Kaller et al. 2006a). Wie in Kapitel 6.2.3 beschrieben

konnte schwache DNA Methylierung durch das Dnmt2-Homolog DnmA im LTR des

Retrotransposon DIRS-1 sowie im RT des Retrotransposons skipper nachgewiesen werden

(Kuhlmann et al. 2005). Insgesamt 10 % des Dictyostelium entfallen auf Retroelemente, davon ist

6. Einleitung

36

das LTR Retrotransposon DIRS-1 mit 240 kompletten und inkompletten Kopien, das am

häufigsten vorkommende Retrotransposon in der Amöbe (ca. 3% des Genoms) (Glockner et al.

2001). Interessanterweise kodiert der ORF3 von DIRS-1 für eine N6A-Methyltransferase, die

jedoch aufgrund einer unvollständigen SAM-Bindestelle inaktiv ist (Goodwin et al. 2004). In

einigen Grünalgen wie Volvox ist jedoch mindestens ein DIRS-1-Elemente mit aktiver N6A-MTase

bekannt (zusammengefasst in Iyer et al. 2011).

Der Großteil aller bekannten kleinen regulatorischen RNAs aus Dictyostelium sind zu DIRS-1

komplementär (Kuhlmann et al. 2005; Hinas et al. 2007). Für das zweithäufigste im Genom

vorkommende Retrotransposon skipper (~1 % des Genoms) wurden mittlerweile acht miRNA

ähnliche ncRNAs nachgewiesen (Hinas et al. 2007). Zusätzlich sind zwei miRNA Kandidaten in

Dictyostelium beschrieben (Hinas et al. 2007). Neben den klassischen ncRNAs wie tRNAs, snRNA

und snoRNAs, kommen im Dictyosteliumgenom zwei weitere Klassen kleiner RNAs vor, class I

und class II RNAs, die vermutlich Dictyostelium spezifisch sind (Hinas et al. 2007).

7. Zielsetzung

37

7. Zielsetzung

Im Gegensatz zu den DNA Methyltransferasen Dnmt1 und Dnmt3a/b ist über die am weitesten

verbreitete Methyltransferase Dnmt2 relativ wenig bekannt. Die in einigen „Dnmt2 only“-

Organismen veröffentlichte schwache DNA Methyltransferaseaktivität wird kontrovers

diskutiert (Schaefer et al.; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009).

Zusätzlich wurde vor einigen Jahren entdeckt, dass Dnmt2 nach dem Mechanismus einer DNA-

MTase auch die tRNAAsp an der Position C38 methylieren kann (Goll et al. 2006; Jurkowski et al.

2008). Zu Beginn dieser Arbeit war tRNAAsp-Methylierungsaktivität der Dnmt2-Homologe aus D.

melanogaster und H. sapiens nachgewiesen. Weiterhin zeigen trotz hoher evolutionärer

Konservierung der Dnmt2 Proteine Knockout-Mutanten verschiedener Organismen nur milde

Phänotypen. Um Antworten auf die Frage zu finden, welche biologische – möglicherweise

bifunktionelle - Aktivität die evolutionäre Erhaltung des Proteins bewirkt hat, sind die

Identifikation des Substratspektrums sowie die Analyse von Dnmt2-Funktionen in vivo von

besonderem wissenschaftlichem Interesse.

Das Hauptziel dieser Dissertation bildete die biologische und biochemische Charakterisierung

der RNA Methyltransferaseaktivität des Dnmt2-Homolgs DnmA aus Dictyostelium. Dazu

gehörten der Nachweis der tRNA Methylierung in vitro und in vivo. Im Vordergrund standen die

Identifizierung neuer RNA-Substrate sowie die Untersuchung eines eventuellen Einflusses der

tRNA-Methylierung auf die Translation.

Basierend auf den Daten zur Mobilisierung des Retrotransposons skipper (Kuhlmann et al. 2005)

wurde zusätzlich der regulatorische Einfluss von DnmA auf das Retrotransposon unter dem

Aspekt RNA vermittelter Genregulation vertiefend charakterisiert.

Im Rahmen der Dnmt2-Forschergruppe FOR1082 war außerdem eine Beteiligung an der

Analyse speziesübergreifender Dnmt2-Funktionen sowie der Abbildung der Bindeeigenschaften

des Methylcytosin bindenden Proteins EhMLBP aus Entamoeba histolytica mittels AFM

vorgesehen.

8 Materialien

38

8. Materialien

8.1. Geräte

Binokular Zeiss, Jena

Blottingapparatur Biometra, Göttingen

Brutschrank Adolf Kühner, Birsfelden, Schweiz

Cantilever Tap 300AL-G Nano and more, Wetzlar

Elektrophorese-Kammern Agarosegele, V-Kammer Metallwerkstatt, Universität Kassel PAA-Gele (groß) Metallwerkstatt, Universität Kassel Mini-PROTEAN® Tetra Cell Biorad, München

Elektroporator (Gene PulserII®) Biorad, München

Feinwaage (BP 210 S) Sartorius, Göttingen

Fluoreszenzmikroskop Leica DM IRB Leica, Wetzlar

Fluoreszenzspektrometer Hitachi, VWR-Vertriebszentrum Hannover (Hitachi F2700)

Fotometer Novaspec™ III Visible Spectro- photometer GE Healthcare, München Pharmacia Gene quant RNA/DNA calc. Pharmacia, Stockholm, Schweden

Geldokumentation Intas, Göttingen

Geltrockner Drystar Bachofer, Reutlingen

Glimmer Plano, Wetzlar

Kulturschüttler Schütt, Göttingen

Mikroliter-Pipetten (20 μl, 200 μl, 1000 μl) Gilson, Langenfeld

Mikroliter-Pipette (10 μl) Eppendorf, Hamburg

Multimode AFM mit Nanoscope 3a Controller Bruker (Digital Instruments), Karlsruhe

PCR-Thermocycler Mastercycler personal Eppendorf, Hamburg Mastercycler ep gradient S Eppendorf, Hamburg

Realplex2 Mastercycler ep gradient S Eppendorf, Hamburg

Phosphoimager (Fujifilm FLA-7000) Fujifilm, Düsseldorf

Sterilbänke Galaire, Italien; Nunc, Wiesbaden

Ultraschallprozessor (UP 200S) Dr. Hielscher, Hamburg

UV-Stratalinker 2400 Stratagene, Amsterdam, Niederlande

UV-Tisch Bachofer, Reutlingen

Vakuum-Zentrifuge Bachofer, Reutlingen

8 Materialien

39

Zellzähler (Z2 Coulter® Particle Count & Beckman Coulter®, Hialeah, Florida Size Analyzer) Zentrifugen

Avanti®30 Beckmann, München Centrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5804R Eppendorf, Hamburg Rotina 48R Hettich, Tuttlingen

8.2. Verbrauchsmaterialien

Chromatographiesäulen (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) Biorad, München

Cryoröhrchen Nunc, Wiesbaden

Deckgläser Menzel-Gläser, Braunschweig

Einmalskalpell Bayha, Tuttlingen

Einmalküvetten Sarstedt, Nümbrecht

Einwegspritzen (Ominfix-F 1 mL) B. Braun, Melsungen

EP-Küvetten (Gene Pulser® 0,4 cm) Biorad, München

Falconröhrchen (15 ml, 50 ml) Sarstedt, Nürnbrecht

Filterpapiere (3mm Chr) Whatman, Dassel

Glasflaschen, Bechergläser Schott, Mainz

Glaspipetten Hirschmann, Eberstadt

Klebefolie (95.1994) Sarstedt, Nürnbrecht

Nitrozellulosemembran Macherey-Nagel, Düren (porablot™ NCP)

Nylonmembran Amersham, GE, München (Hybond-NX)

Objektträger Menzel-Gläser, Braunschweig

PCR-Reaktionsgefäße Sarstedt, Nürnbrecht

Petrischalen Sarstedt, Nürnbrecht

Pipettenspitzen Sarstedt, Nürnbrecht

Real time PCR Platten (Twin.tec 96) Eppendorf, Hamburg

Reaktionsgefäße (1,5 mL; 2 mL) Sarstedt, Nürnbrecht

Röntgenfilme Raymed Imaging AG, Krauchthal (Contatyp CX-BL+ Medical X-ray film)

Sterilfilter Sarstedt, Nürnbrecht

Zentrifugalfilter (Amicon® Ultra-4, 4mL) Millipore, Schwalbach

8 Materialien

40

8.3. Chemikalien

Acrylamid/Bisacrylamid (30%, 40%) Roth, Karlsruhe

Agarose Sigma, Taufkirchen

Agar-Agar Euler, Frankfurt am Main

Aluminiumsulfat Roth, Karlsruhe

Ammoniumacetat Merck, Darmstadt

Ammoniumthiocyanat Roth, Karlsruhe

Amplify-Solution Amersham, GE, München

APS Merck, Darmstadt

BCIP-T Fermentas, St. Leon-Rot

Borsäure Roth, Karlsruhe

Bromphenolblau Fluka, Deisenhofen

BugBuster® Protein Extraction Reagent Merck, Darmstadt

Calciumchlorid Roth, Karlsruhe

Complete-mini (Protease Inhibitor Tabletten) Roche, Mannheim

Coomassie Brillant Blue G-250 Serva, Heidelberg

DABCO Roth, Karslruhe

DEPC Roth, Karslruhe

Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt

DMF Merck, Darmstadt

DMSO Sigma, Taufkirchen

DTT Roth, Karlsruhe

DTBP Sigma, Taufkirchen

EDC Sigma, Taufkirchen

EDTA Roth, Karlsruhe

Essigsäure 100 % Roth, Karlsruhe

Ethanol >99.8% Roth, Karlsruhe

Ethidiumbromid Fluka, Deisenhofen

Galactose Roth, Karlsruhe

Glucose Roth, Karlsruhe

Glycerin 86 %, >99% Roth, Karlsruhe

GTC Roth, Karlsruhe

Harnstoff Roth, Karlsruhe

HEPES Roth, Karlsruhe

Hexanukleotid Random-Primer-Mix Roth, Karlsruhe

8 Materialien

41

Imidazol Roth, Karlsruhe

IPTG Roth, Karlsruhe

Isopropanol Roth, Karlsruhe

Kaliumchlorid Roth, Karlsruhe

Kaliumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe

Magermilchpulver Rossmann, Kassel

Magnesiumchlorid Roth, Karlsruhe

Magnesiumsulfat Roth, Karlsruhe

Mercaptoethanol (-β) Fluka, Deisenhofen

MOPS Roth, Karlsruhe

Natriumacetat Merck, Darmstadt

Natriumchlorid Roth, Karlsruhe

Natriumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe

Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid Roth, Karlsruhe

NP40 Fluka, Deisenhofen

Paraformaldehyd Roth, Karlsruhe

PEG8000 Promega, Mannheim

Phenol Roth, Karlsruhe

Phenol/Chloroform Roth, Karlsruhe

Phosphorsäure Fluka, Deisenhofen

Saccharose Roth, Karlsruhe

S-Adenosyl-L-methioninchlorid Sigma, Taufkirchen

Salzsäure 37% Merck, Darmstadt

SDS Roth, Karlsruhe

Sepharose (Sephadex® G-50-150) Fluka, Deisenhofen

SYBR-Green Jena Bioscience, Jena (EvaGreen® Fluorescent DNA stain)

TEMED Roth, Karlsruhe

Tris Roth, Karlsruhe

TritonX-100 Roth, Karlsruhe

Xylencyanol Fluka, Deisenhofen

8 Materialien

42

8.4. Affinitätsmatrices für Chromatographie und Immunpräzipitationen

IgG-Agarose rabbit Sigma, Taufkirchen

GSH-Agarose Sigma, Taufkirchen

GFP-trapA (Nanotrap, GBP) Chromotek, Planegg-Martiensried

NiNTA-Sepharose™ Qiagen, Hilden

Strep-Tactin® Superflow® IBA, Göttingen

8.5. Puffer und Lösungen

AP-Puffer 100 mM Tris/HCl pH 9,5 (Western-Blot) 100 mM NaCl

20 mM MgCl2 BCIP-Lösung 50 mg/ml BCIP-T in DMF Bindepuffer (1x) 10mM Tris–HCl, pH 7,5 (für SFM) 50mM NaCl 6mM EDTA

4% (v/v) Glycerin Blockierlösung 2% Magermilchpulver in 1x NCP Church-Puffer 0,25 M NaPi, pH 7,0 (Northern-Blot) 1 mM EDTA (0,5 M) 1% BSA 7% SDS Coomassie-Färbelösung, kollodial 0,1% Coomassie Brilliant Blue G250

(SDS-PAGE) 2% (w/v) Phosphorsäure 5% (w/v) Aluminumsulfat

Coomasie-Färbelösung 0,1% Coomassie Brilliant Blue G250 (Schnelltest) 10% Essigsäure Crosslinking solution 127 mM Methylimidazol

(Northern-Blot) 0,16 M EDC in DEPC-H2O pH 8,0 einstellen (HCl)

Crosslink-Reversal-Buffer 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 300 mM NaCl 0,5% NP40 0,5% Natriumdeoxycholat 5 mM EDTA 0,5 % SDS Denhardt Lösung (100x) 2% Ficoll 400 (Northern-, Southern-Blot) 2% Polyvinylpyrrolidone

2% BSA

8 Materialien

43

DEPC-Wasser 0,1% DEPC in dest. Wasser (üN stehen lassen, dann 2x

autoklavieren) Dialysepuffer I 30 mM KPi, pH 7,0 (IMAC) 200 mM KCl

20% (v/v) Glycerin 0,1 mM EDTA 1 mM DTT

Dialysepuffer II 30 mM KPi, pH 7,0 (IMAC) 100 mM KCl

50% (v/v) Glycerin 0,1 mM EDTA

1 mM DTT Dialysepuffer I 30 mM KPi, pH 7,5 (GST-Affinitätschromatographie) 150 mM NaCl 20% (v/v) Glycerin

0,5 mM EDTA 0,1 mM DTT Dialysepuffer II 30 mM KPi, pH 7,5 (GST-Affinitätschromatographie) 150 mM NaCl 50% (v/v) Glycerin

0,5 mM EDTA 0,1 mM DTT

Dilution Buffer 20 mM Tris/HCl, pH 7,0 (modifiziert im Original ohne Mg2+) 150 mM NaCl (GFP-Nanotrap) 3 mM MgCl2

DNA-Auftragspuffer (6x) 10 mM Tri/HCl, pH7,6 60% (v/v) Glycerin 60 mM EDTA 0,03% Xylencyanol und/oder 0,03% Bromphenolblau

Elutionspuffer 30 mM KPi, pH 7,0 (IMAC) 300 mM KCl

10% (v/v) Glycerin 200 mM Imidazol

0,1 mM DTT Elutionspuffer 50 mM Tris/HCl, pH 9,6 (GST-Affinitätschromatographie) 150 mM NaCl 20 mM GSH EP-Puffer (für Elektroporation) 10 mM Na2HPO4

50 mM Saccharose, sterilfiltrieren

8 Materialien

44

Ethidiumbromid-Lösung 1 mg/mL Ethidiumbromid in dest. H2O Fixierlösung (für denat. PAA-Gele) 10% MeOH

10% HAc Formamid-RNA-Ladepuffer (2x) 95% Formamid (FA-Puffer) 5 mM ETDA, pH 7,4

0,03% Xylencyanol und/oder 0,03% Bromphenolblau

Hybridisierungslösung nach Denhardt 5x Denhardt Lösung (Northern-, Southern-Blot) 5x SSC

50% Formamid 1% SDS 120 mM Phosphatpuffer, pH 6,7

Inactivation Buffer 100 mM Tris/HCl, pH 8,0 (nach DTBP crosslinking für Affinitätschr.) 150 mM NaCl IPP 150 (mit 0,1% NP40) 300 mM Galaktose

(TAP) 10 mM Tri/HCl, pH 8,0 150 mM NaCl

0,1% NP40 Lämmli-Puffer (Probenpuffer 5 x) 31 mL 1M Tris, pH 6,8 (SDS-PAGE) 10 g SDS 50 mL Glycerin (zum Lösen etwas erwärmen) 1,8 mg Bromphenolblau Ad 100 mL H2O

10% (v/v) β-Mercaptoethanol Lösung I 25 mM Tris/HCl, pH 7,4 (Plasmidpräp.) 10 mM EDTA

15% Saccharose Lösung II 200 mM NaOH (Plasmidpräp.) 1% SDS Lösung III 3 M Natriumacetat pH 4,7 (Plasmidpräp.)

Lysepuffer 1x PBS (GST-Affinitätschromatographie) 100 mM KCl 1% Triton-X 100

1 mM DTT Lysis Buffer 20 mM Tris/HCl, pH 7,0

(modifiziert im Original ohne Mg2+) 150 mM NaCl (GFP-Nanotrap) 3 mM MgCl2

0,5% NP40

8 Materialien

45

Methylierungspuffer (10x) 500 mM Tris, pH 7,0 50 mM MgCl2 10 mM DTT 500 mM NaCl MOPS-Laufpuffer für PAA-Gele 20 mM MOPS, pH 7,0 NCP-Puffer (10 x) 12,1 g Tris/HCl, pH 8,0

87 g NaCl 5 g Tween®20 ad 1 L ddH2O

OLB-Mix (5x) 100 µL 1M Tris/HCl, pH 7,5

12,5 µL 1M MgCl2 1,7 µL β-Mercaptoethanol 2,5 µL 50mM dCTP 2,5 µL 50mM dGTP 2,5 µL 50mM dTTP 250 µL 2M Hepes, pH 6,6 150 µL 90 A260 Units/mL Oligonukleotide (PL) pd(N)6

Paraformaldehydlösung 4% Paraformaldehyd (Fixierung von Zellen) 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,7 PBS (10 x) 80,6 g NaCl/HCl pH 7,3

7,65 g Na2HPO4 x 2 H2O 2,01 g KCl 1,91 g KH2PO4 ad 1 L H2O

Proteinase K storage buffer 20 mM Tri/HCl, pH 7,4

1 mM CaCl2 50% Glycerol

Proteingel-Laufpuffer (5 x) 15,1 g Tris 72 g Glycin 5 g SDS ad 1 L H2O

Protein-Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8

14 mM SDS Protein-Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl, pH 8,8

14 mM SDS RIPA-Buffer (modifiziert) 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 150 mM NaCl 0,5% NP40 0,5% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA

8 Materialien

46

RIPA-Equilibration-Buffer 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 300 mM NaCl 0,5% NP40 0,5% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA 0,1 % SDS Rivetti-Puffer 10 mM Hepes, pH 9,0 (AFM) 10 mM NaCl

2 mM MgCl2 RNA-Auftragspuffer (nativ) 0,1x TBE 70% (v/v) Glycerin SDS/TE 0,3% SDS in 1 x TE-Puffer, pH 7,5 Semidry Blotpuffer 5,8 g Tris

2,92 g Glycin 0,38 g SDS 200 mL Ethanol ad 1 L H2O

Soerensen-Phosphatpuffer 2 mM Na2HPO4

(Malchow et al. 1972) 15 mM KH2PO4 auf pH 6,0 mit H3PO4 einstellen

Sonifizierungspuffer/Waschpuffer 30 mM KPi (pH 7,0)

(IMAC) 300 mM KCl 10% (v/v) Glycerin 10 mM Imidazol

0,1 mM DTT

SSC (20x) 3 M NaCl 0,3 M Natriumzitrat, pH 7,0

SSPE (20x) 3,6 M NaCl 200 mM NaH2PO4 20 mM EDTA, pH 7,4 mit NaOH STE-Puffer 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 (Hybridisieren von Oligonukleotiden) 50 mM NaCl 1 mM EDTA StrepII-Lysepuffer 30 mM KPi, pH 7,5 150 mM KCl 1 mM EDTA 1% Triton-X100 1 mM DTT 5% (v/v) Glycerin StrepII-Waschpuffer 30 mM KPi, pH 7,5 150 mM KCl 1 mM EDTA 0,1% Triton-X100 1 mM DTT 5% (v/v) Glycerin

8 Materialien

47

StrepII-Elutionspuffer 30 mM KPi, pH 7,5 150 mM KCl 1 mM EDTA 0,1% Triton-X100 1 mM DTT 5% (v/v) Glycerin 2,5 mM Desthiobiotin StrepII-Dialysepuffer 30 mM KPi, pH 7,5 100 mM KCl 1 mM EDTA 1 mM DTT 50% (v/v) Glycerin

Stringency RIPA-Buffer A 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 1 M NaCl 1% NP40 1% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA 0,1% SDS 1 M Urea

Stringency RIPA-Buffer A 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 1 M NaCl 1% NP40 1% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA 0,1% SDS 2 M Urea

Stripping Buffer 0,1x SSC (Northern-Blot) 1% SDS TBE-Puffer (5x) 445 mM Tris

445 mM Borsäure 10 mM EDTA pH 8,0

TE-Puffer (1x) 10 mM Tris (pH 7,5 oder pH 8,0) 1 mM EDTA TEV cleavage buffer 10 mM Tri/HCl, pH 7,0

(TAP) 150 mM NaCl 0,1% NP40 0,5 mM EDTA 1 mM DTT

Transkriptionspuffer (10x) 400 mM Tris/HCl, pH 8,0 (nach Doudna) 200 mM MgCl2 20 mM Spermidin 0,1% Triton X-100 Waschlösung I oder A 2 x SSC (Northern- und Southern-Blot) 0,1% SDS

8 Materialien

48

Waschlösung B 1x SSC (Northern-Blot) 0,1% SDS Waschlösung C 0,5x SSC (Northern-Blot) 0,1%SDS Waschlösung II 0,2 x SSC (Northern- und Southern-Blot) 0,1% SDS

Waschpuffer A 1xPBS (GST-Affinitätschromatographie) 100 mM KCl

1% Triton X-100 Waschpuffer B 1xPBS (GST-Affinitätschromatographie) 100 mM KCl Zelllysepuffer 50 mM HEPES pH 7,5 (Dictyostelium für gDNA) 40 mM MgCl2 20 mM KCl 5% (w/v) Saccharose

8.6. Kits

NucleoSpin® ExtractII Macherey-Nagel, Düren

NucleoBond® PC 100 Macherey-Nagel, Düren

CloneJETTM PCR-Cloning Kit Fermentas, St. Leon-Rot

Gene JetTM PCR-Cloning Kit Fermentas, St. Leon-Rot

SensiFAST SYBR No-ROX One-Step Kit Bioline, Luckenwalde

8.7. Enzyme und Enzympuffer

AcTEVTM Protease Invitrogen, Karlsruhe

Apa I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

BamH I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

BSA (10mg/mL) New England Biolabs, Frankfurt am Main

CIAP 1 u/μL (+ 10x CIAP-Puffer) Fermentas, St. Leon-Rot

DNase I (1 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

McRBC (10.000 U/mL) New England Biolabs, Frankfurt am Main

M-MuLV Reverse Transcriptase (20 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

Nco I (10 u/µL)

Pfu Polymerase Universität Kassel

Proteinase K Roth, Karlsruhe

Pst I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

8 Materialien

49

Pvu II (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

RNase A (1 mg/mL) Merck Biosciences, Bad Soden

T4 DNA Ligase (1 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

T4 Polynukleotid-Kinase (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

T7 RNA Polymerase Universität Kassel

Taq DNA Polymerase Universität Kassel

Xba I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot

Xho I (10u/µL) Fermentas, St. Leon-Rot

10 x B+, O+, R+, Y+/Tango Puffer Fermentas, St. Leon-Rot

10 x Pfu Puffer (+MgSO4) Fermentas, St. Leon-Rot

10 x T4 Ligase-Puffer (+DTT) Fermentas, St. Leon-Rot

10 x T4 PNK Buffer A Fermentas, St. Leon-Rot

10 x Taq-Puffer (+ KCl, +MgCl2) Fermentas, St. Leon-Rot

DMSO (100%) Fermentas, St. Leon-Rot

Glycogen (RNA grade, 20 mg/mL) Fermentas, St. Leon-Rot

8.8. Größenstandards

GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder Fermentas, St. Leon-Rot

GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder Plus Fermentas, St. Leon-Rot

GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus Fermentas, St. Leon-Rot

RiboRuler™ Low Range RNA Ladder Fermentas, St. Leon-Rot

Low Range ssRNA Ladder New England Biolabs, Frankfurt am Main

PageRulerTM Plus Prest. Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot

PageRulerTM Unstained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot

microRNA Marker New England Biolabs, Frankfurt am Main

DecadeTM marker Ambion, Austin, Texas

8.9. Nukleotide

[γ-32P] ATP (110 TBq/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig

[α-32P] UTP (110 TBq/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig

[3H]-SAM (2,22 TBq/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig

Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Fermentas, St. Leon-Rot

Ribonukleotide (ATP, CTP, GTP, UTP) Dianova, Hamburg

8 Materialien

50

dm5CTP New England Biolabs, Frankfurt am Main

8.10. Antikörper

Kaninchen-anti-TAP OPEN Biosystem, Huntsville

Maus-anti-His (MRGSHHHH) Universität Kassel, Kassel

AP-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen Dianova, Hamburg

AP-gekoppelter Ziege-anti-Maus Dianova, Hamburg

Maus-anti-GFP Universität Kassel, Kassel

GST (Z-5):sc-459 Santa Cruz Biotech, Heidelberg

8.11. Nährmedien

Medien für Dictyostelium discoideum

HL5-Medium FormediumTM, Norfolk HL5+-Medium HL5-Medium + 50 μg/mL Ampicillin + 0,25 μg/mL Amphotericin + 10 μg/mL Penicillin + 10 μg/mL Streptomycin

BS10-Medium HL5+-Medium + 10 μg/mL Blasticidin G10-Medium HL5+-Medium + 10 μg/mL Geniticin (G418) G10/BS10-Medium HL5+-Medium + 10 μg/mL Geniticin (G418) + 10 μg/mL Blasticidin Phosphatagar Soerensen-Phosphatpuffer + 13 g/L Agar-Agar

Medien für Escherichia coli

LB-Medium, pH 7,0 10 g Bacto-Trypton 5 g Hefeextract 5 g NaCl ad 1 L H2O LB-Amp-Medium LB-Medium + 50 μg/mL Ampicillin

8 Materialien

51

LB-Amp-CAM-Medium LB-Amp-Medium + 34 µg/µL Chloramphenicol LB-KAN-CAM-Medium LB-Medium + 10 µg/µL Kanamycin + 34 µg/µL Chloramphenicol LB-Agar LB-Medium + 13 g/L Agar-Agar

Medium für Klebsiella aerogenes (Enterobacter mobilis)

SM-Agar 15 g Bacto-Agar 10 g Pepton 10 g Glucose 1 g Hefeextrakt 1 g MgSO4

2,2 g KH2PO4

8.12. Antibiotika

Amphotericin (0,25 mg/mL) PAA, Cölbe

Ampicillin (50 mg/mL) Roth, Karlsruhe

Blasticidin (5 mg/mL) MP Biomedicals, Eschwege

Chloramphenicol (34 mg/mL) Merck, Darmstadt

Geniticin G418 (100 mg/mL) PAA, Cölbe

Kanamycin solution (10mg/mL) Sigma, Taufkirchen

Penicillin/Streptomycin (100x) PAA, Cölbe

8.13. Bakterienstämme

Escherichia coli-DH5αTM Invitrogen, Karlsruhe

Escherichia coli One Shot® TOP10 Invitrogen, Karlsruhe

Escherichia coli-(DE3) Rosetta2 pLysS Invitrogen, Karlsruhe

Klebsiella aerogenes Universität Kassel

8.14. Stämme Dictyostelium discoideum

AX2 (wt) (Watts et al. 1970b)

AX2 DnmAKO (Kuhlmann et al. 2005)

8 Materialien

52

AX2 DnmAKO “rox” (C. Joppich, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_DnmA-CTAP/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_DnmA-NTAP/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_ DnmA-StrepII/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_DnmA-GFP/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_DnmA-GFP/wt

AX2 pDneo2a_GFP (Dubin et al. 2010b)

AX2 pDbsrXP gfp (I. Windhof, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_hDnmt2-GFP/wt

AX2 pDneo2a_hDnmt2-GFP/dnmAKO (H. Ziegler, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_hDnmt2-NLS-GFP/wt (H. Ziegler, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_hDnmt2-NLS-GFP/dnmAKO (H. Ziegler, unveröffentlicht)

AX2 pDneo2a_GFP(GAC)5/wt

AX2 pDneo2a_GFP(GAC)5/DnmAKO

AX2 pDneo2a_GFP(GAU)5/wt

AX2 pDneo2a_GFP(GAU)5/DnmAKO

8.15. Stamm Drosophila melanogaster

Vermillion-Rosy v1/Y; +/+; ry506/ry506

8.16. Oligonukleotide/Primer

tRNA Oligonukleotide

SM3_tRNAAsp_5A (tRNAAsp Oligo 1) TTGTAATACGACTCACTATAGCGTCCTTGTTGGTCTAGTGGTGAGG

SM4_tRNAAsp_3´+BamHI (tRNAAsp Oligo 3) CGCGAAAGGCCCGGGTTCAATTCCCGGACAGGGAG GATCC

SM5_tRNAAsp_mid (tRNAAsp Oligo 2) CCCGGGCCTTTCGCGTGACAGGCGAAAATCCTCACCACTAGACCAACAAG

SM6_tRNAAsp_3´_rev (tRNAAsp Oligo 4) GGATCCTCCCTGTCCGG

SM7_tRNAGlu_C38A_5´ (tRNAGlu C38A Oligo 1) TTGTAATACGACTCACTATAGGGTCCTCATTGGTGTAGTCGGTAAC

SM8_tRNAGlu_C38A_3´ (tRNAGlu C38A Oligo 3) TTTCAAACTGGTACCTCGGGTTCGATTCCCGAATGGGGAGGATCC

SM9_tRNAGlu_C38A_mid (tRNAGlu C38A Oligo 2) CCCGAGGTACCAGTTTGAAAGACTAGAGTGTTACCGACTACACCAATGAG

8 Materialien

53

SM10_tRNAGlu_C38A_3´_rev (tRNAGlu C38A Oligo 4) GGATCCTCCCCATTCGG

SM11_tRNALeu-AAG8_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGCGTAAGCTTGCCCGAGCTGGTTTAAGGG

SM12_tRNALeu-AAG8_Oligo2 AACCCTTGTATCAATGATATTGCAGCCTTAATGCAACCCCTTAAACCAGCTCGG

SM13_tRNALeu-AAG8_Oligo3 GCAATATCATTGATACAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTTACAGCTG

SM14_tRNALeu-AAG8_Oligo4 CAGCTGTAAGCTAAGGGAT

SM15_tRNALeu-UAG1_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCGAGTGGTTAAGACAATAG

SM16_tRNALeu-UAG1_Oligo2 CGCGACCCCGGAGGATAGAGCCTAAATCTATTGTCTTAACCACTCGACCAA

SM17_tRNALeu-UAG1_Oligo3 CCTCCGGGGTCGCGGGTTCGAACCCCGCATCTCTCAGCTG

SM18_tRNALeu-UAG1_Oligo4 CAGCTGAGAGATGCGGG

SM19_tRNAVal-CAC1_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGGGAAAGTAGTGTAGTGGTTATCAC

SM20_tRNAVal-CAC1_Oligo2 CCACGACCTAACCCGTGTGAAGGGCTCGTGATAACCACTACACTACTTTC

SM21_tRNAVal-CAC1_Oligo3 CACGGGTTAGGTCGTGGGTTCGATCCCCATCTATCTCAGCTG

SM22_tRNAVal-CAC1_Oligo4

CAGCTGAGATAGATGGGG

SM24_tRNAAsp_mid_C38A (tRNAAsp C38A Oligo2) AGCGAAAGGCCCGGGTTCAATTCCCGGACAGGGAGGATCC

SM25_tRNAAsp_3´_C38A (tRNAAsp C38A Oligo3) CCCGGGCCTTTCGCTTGACAGGCGAAAATCCTCACCACTAGACCAACAAG

SM 38_Asp_primer-ext CTGTCCGGGAATTGAAC

SM 78_anti-as-Glu(UUC)-Fragment CACACTGGTACCTCGGG

Oligonukleotide für U-snRNA, snoRNA und intergenische Sequenzen

SM39_sno7_primer-ext TCAGATTTGTGCGAACAC

SM40_intergenicR69_primer-ext TCAGGAAAGAATAATGCATAG

SM41_Sno14as_primer-ext TCAGACGTCTTCTAAAGAAG

SM45_sno7_5-end TTGTAATACGACTCACTATAGCGTTGAATGATGATTGGTTGCAC

8 Materialien

54

SM46_sno7_3-End+BamHI GGATCCTGGTCAGATTTGTGC

SM47_intR24_sno14as_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGCG TAGATGATGAACCAAAATAC

SM48_intR24_sno14as_Oligo2 CACTATGGGTTCTAAAGTATAGGATAATACGTATTTTGGTTCATCATCTAC

SM49_intR24_sno14as_Oligo3 CTTTAGAACCCATAGTGAAATGATTTTACAACCTTCTTTAG

SM50_intR24_sno14as_Oligo4 GGATCCTCAGACGTCTTCTAAAGAAGGTTGTAAAATC

SM51_intR69_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGCGCTTGGTGATGATTAACAGCTAAAG

SM52_intR69_Oligo2 GTCTCAGCAATAGTTTTTACAGAAACTCTAGTCTTTAGCTGTTAATCATCACC

SM53_intR69_Oligo3 GTAAAAACTATTGCTGAGACTATGCATTATTCTTTCCTGA GGATCC

SM54_intR69_Oligo4 GGATCCTCAGGAAAGAATAATG

SM55_rnu2ab-5-End TTGTAATACGACTCACTATAGCGACCTTCTTGAAGCGTCTC

SM56_rnu2ab-3-End+BamHI GGATCCGTGAGGCGCAC

SM60_DDU2 (Hinas) GCACATCAACGTGTGATGGC

SM61_T7_PROMOTOR+GCG TTGTAATACGACTCACTATAGCG

SM62_Rnu2a/b_C73A_fw CTGCCATCAAACGTTGATGTG

SM63_Rnu2a/b_C73A_rev CACATCAACGTTTGATGGCAG

SM64_Rnu2a/b_C155A_fw CGACCTCTAAGCATTCGCTC

SM65_Rnu2a/b_C155A_rev GAGCGAATGCTTAGAGGTCG

SM66_rnu4a_5-end TTGTAATACGACTCACTATAGCGATCTTTACGCTGGGAC

SM67_rnu4a_3-end + NcoI CCATGGATAGTGACAAAAATTGC

SM72_hU2-fw+T7 TTGTAATACGACTCACTATAGCGATCGCTTCTCGGCCTTTTG

SM73_hU2-rev+BamHI GGATCCGGGTGCACCGTTCCTG

8 Materialien

55

DnmA und hDnmt2 Oligonukleotide (inkl. NLS-Oligonukleotide)

SM1_DnmA_Dm_forw GGGCCCATGGAACAATTGCGCGTGCTGGAATTTTATAG

SM2_DnmA_Dm_rev GGCTTTGTTAGCAGCGGGCCCCGTATTTTTTTCCTTC

SM30_DnmA-Nterm-NdeI CAGCCATATGGAACAATTGAGAGTATTAG

SM31_DnmA-Cterm-XhoI CTCGAGTTATTTTTTTCCTTCTTTTTCCTTTTG

SM34_hDnmt2_for_pDneo2a_fw CTGCAGAAATGGAACCACTTCGTGTTCTTGAACTATACAGC

SM35_hDnmt2_for_pDneo2a_rev GGATCCTTCATATAAGATTTTGATTAGTTTAGCTACTAC

SM43_NLS_BamHI_fw GATCCCCAAAAAAGAAA CGTAAAGTTG

SM44_NLS_BamHI_rev GATCCAACTTTACGTTTCTTTTTTGGG

Translationssystem

SM26_Asp(GAC)-Oligo I P-GAAATGGCTAAAACTGACGACGACGACGACG

SM27_Asp(GAC)-Oligo II P-GATCCGTCGTCGTCGTCGTCAGTTTTAGCCATTTCTGCA

SM28_Asp(GAU)-Oligo I P-GAAATGGCTAAAACTGATGATGATGATGATG

SM29_Asp(GAU)-Oligo II P-GATCCATCATCATCATCATCAGTTTTAGCCATTTCTGCA

qPCR Oligonukleotide

SM57_ GFP-qPCR-fw GAAAACTACCTGTTCCATGGC

SM58_ GFP-qPCR-rev GGCATGGCACTCTTGAAAAAG

SM70_skipper_RT_fw_qPCR GTAGGTTATCCAAAGAAACACAATG

SM71_skipper_RT_rev_qPCR ACTTCTCTGATCCATTCAGGTTC

SM74_skipper-gag-fw-qPCR CTACTCCTTCAAAGAAAGCCATC

SM75_skipper-gag-rev-qPCR TTCGACGTCGGATACATCAG

Coronin_qPCR_fw AAATATCGTCATGTTTTTGCAGCACAAC

8 Materialien

56

Coronin_qPCR_rev AATAATGGAACTGATGTGGTTTTACCTGAA

cinD_Forw GCCAGAAATGCTTTGAAAATGACAC

CinD_Rev GAGTGGTTTGCCAATTTCTTTTCCT

Weitere Oligonukleotide

SP6-GEM-PCR ATTTAGGTGACACTATAGAATAC

T7-GEM-PCR TGTAATACGACTCACTATAGGG

28nt T-Oligo TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

BB007_5.8S_consensus_N CATAAACGGTGAATACCTCGACTCC

BB008_5.8S_consensus_C AAAGGACCGATGTCATCATGTGCGT

8.17. Plasmide

Klonierungsstrategien der in dieser Arbeit entstandenen Plasmide sind im folgenden Kapitel

separat aufgeführt.

Plasmide für heterologe Proteinexpression in E. coli

pET 15b-DnmA rc rescue (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)

pET28a(+) hDnmt2 (Jurkowski et al. 2008)

pET15b pmt1 (M. Becker, Essen, unveröffentlicht)

pGEX-4T-1 EhMLBP full length (Lavi et al. 2006)

pGEX-4T-1 EhMLBP-ter (Lavi et al. 2006)

pET 28a(+) DnmA (N-term) (Klon 2)

über pJET1.2 DnmA NdeI/XhoI (N-term)

Plasmide für in vitro Transkription

pGEM T-Easy Glu5 (T. Winckler, Jena)

pGEM T-Easy suppresssor Glu (T. Winckler, Jena)

pJET1Glu5 (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)

pJET1Glu5rev (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)

pJET1Glusup (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)

8 Materialien

57

pJET1Glu5suprev (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)

pJET1 tRNA Phe (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)

pJET1 tRNA Asp (T7, BamHI)

pJET1 tRNA Glu C38A (T7, BamHI)

pJET1 tRNA LeuAAG (in Kooperation mit S. Junk)

pJET1 tRNA Leu UAG (in Kooperation mit S. Junk)

pJET1 tRNA Val CAC (2nd) (in Kooperation mit S. Junk)

pJET1 tRNA Asp C38A (in Kooperation mit S. Junk)

pJET1 rnu2a/b

pJET1 sno7

pJET intergenic R24 (sno14as)

pJET intergenic R69

pJET1 rnu2a/b C73A (in Kooperation mit S. Fuhrmann)

pJET1 rnu2a/b C155A (in Kooperation mit S. Fuhrmann)

pJET1 rnu4a (in Kooperation mit S. Fuhrmann)

pJET1 rnu2-1 (human)

Plasmide für Proteinexpression in Dictyostelium

pDneo2a_GFP (Dubin et al. 2010b)

pDneo2a_Asp(GAC)5_GFP

pDneo2a_Asp(GAU)5_GFP

pDneo2a_hDnmt2-GFP

pDneo2a_NLS-hDnmt2-GFP (in Kooperation mit H. Ziegler)

Plasmide für Proteinexpression in Drosophila

pGS UAS V5 (Schotta et al. 2000)

pJET DnmA f. D.m. (Klon 3)

pGS UAS DnmA V5 (Klon 3/8)

Sonstige Plasmide

pJET1.2 5.8s consensus (K13) (B. Boesler, Kassel, unveröffentlicht)

pGEM T-Easy RT LINE (Lavi et al. 2006)

Dnmt2 KO vector (ohne loxP sites) (Kuhlmann et al. 2005)

pGEM T-Easy Skipper RT (Kuhlmann et al. 2005)

pGEM T-Easy DIRS rLTR (Kuhlmann et al. 2005)

8 Materialien

58

8.18. Klonierungsstrategien

Plasmid für heterologe Proteinexpression in E. coli

pET 28a(+) DnmA (N-term): Das dnmA-Gen

wurde aus dem Plasmid pET 15b DnmA

amplifiziert, dabei unter Verwendung der Primer

SM30 und SM31 mit einer NdeI sowie einer XhoI

Schnittstelle versehen und in den pJet 1.2 Vektor

zwischenkloniert (pJET1.2 DnmA NdeI/XhoI (N-

term)). Der Zwischenvektor wurde mit den

genannten Restriktionsenzymen verdaut und das

Fragment gerichtet in den durch NdeI und XhoI

linearisierten Zielvektor ligiert.

Plasmide für in vitro Transkription

pJET1 tRNA-Plasmide, pJET1 int. R24 und R69 und pJET1 sno7: Die Gene der tRNAs (Kapitel

8.19), sno7 sowie die intergenischen Sequenzen (R24 und R69) wurden mittels rekursiver PCR

hergestellt (Kapitel 9.2.14) und ungerichtet in den Vektor pJET1 ligiert. Klone mit dem Gen in

der gewünschten Orientierung wurden mittels analytischer PCR identifiziert. Die vewendeten

Oligonukleotide für die Klonierung sind in Kapitel 8.16 unter Oligonukleotide für tRNA-Plasmide

und Oligonukleotide für U-snRNA, snoRNA und intergenische Sequenzen aufgeführt.

Oligonukleotide wurden so generiert, dass sich direkt vor jedem Gen ein T7-Promotor befindet

und das Transkript mit einem GCG oder GGG beginnt. Direkt an das 3´-Ende des Gens wurde eine

Restriktionsschnittstelle (5´-Überhang oder Blunt) kloniert: Plasmide der tRNAAsp(GUC),

tRNAAsp(GUC) C38A, tRNAGlu(UUC) C38A, der intergenischen Sequenzen und sno7 wurden mit einer

BamHI Schnittstelle versehen. Die tRNA-Plasmide von Leucin und Valin lassen sich mittels PvuII

linearisieren (Junk 2010). Die Punkmutationen C38A in die tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC) wurden

unter Verwendung der entsprechend mutagenisierten Oligonukleotide eingefügt.

Transkriptionsstart GCG/GGG und Restriktionsschnittstelle wurden so gewählt, dass die Faltung

möglichst wenig beeinflusst wird (Mfold, Zuker 2003). Beispiele der Vektorkarten:

pJET1 tRNA Asp (T7)

3228 bp

tRNA Asp

GCG

T7 promotor

BamHI (593)

BamHI (1124)

pJET1 tRNA Val-CAC (T7)

3225 bp

tRNA Val

GGG

T7 Promotor

PvuII (591)

PvuII (628)

PvuII (1170)

pET28a(+)DnmA N-term

6433 bp

DnmA cDNA

His-tag

KanR

Start ATG

T7-Promotor

NdeI (5130)

XhoI (6272)

8 Materialien

59

pJET1 rnu2a/b, pJET2 rnu2-1 und pJET rnu4: Die Gene der U2-snRNA rnu2a/b sowie der

rnu4a wurden von genomischer DNA aus Dictyostelium und das Gen rnu2-1 von humaner gDNA

mittels PCR amplifiziert. Analog zur Konstruktion der tRNA Plasmide wurde ein T7-Promotor

und GCG als Transkriptionsstart sowie BamHI bzw. NcoI als Schnittstelle zur Linearisierung des

Plasmids hinzugefügt.

pJET1 rnu4a

3279 bp

rnu4a

GCG

T7 Promotor

NcoI (644)

NcoI (686)

pJET1 rnu2-1 (human)

3345 bp

rnu2-1

GCG

T7 Promotor

BamHI (710)

BamHI (1241)

pJET1 rnu2a/b C73A, pJET rnu2a/b C155A: Die Herstellung der mutierten rnu2a/b Vektoren

erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Die U2-snRNA wurde jeweils in zwei Teilen aus

gDNA amplifiziert, wobei jeweils die internen Primer, die die Mutationsstelle überdeckten,

entsprechend punktmutiert waren. Für die C73A Mutation wurden die Primerpaare SM56/SM63

und SM62/SM56 und für die Mutation C155A die Primerpaare SM55/SM65 und SM64/SM56

vewendet. Die beiden Einzelfragmente wurden zusammen in einer weiteren PCR unter

ausschließlicher Verwendung der randständigen Primer SM61/SM56 amplifiziert und in den

pJET1 Vektor kloniert.

Plasmide für Proteinexpression in Dictyostelium

pDneo2a_Asp(GAC)5_GFP, pDneo2a_Asp(GAU)5_GFP:

Das Plasmid pDneo2a_GFP wurde mittels PstI und

BamHI verdaut und CIAP behandelt. Die Oligo-

nukleotide SM26/SM27 und SM28/SM29 wurden

hybridisert und jeweils gerichtet in das vorbereitete

pDneo2a_GFP-Plasmid ligiert.

pDneo2a Asp-leader-GFP

6844 bp

Amp(r)

T 4903 res 1029-2254

Asp-lead er

GFP

Act6pro

Act15-P

Act8-T

Act 15-T

BamHI (37)

Pst I (6)

8 Materialien

60

pDneo2a_hDnmt2-GFP: Die Amplifikation von

humaner dnmt2 erfolgte aus dem Vektor pET28a(+)

hDnmt2 mit Hilfe der Primer SM34 und SM35. Die

Primer wurden so designt, dass am 5´-Ende eine PstI

und am 3´-Ende eine BamHI Schnittstelle angefügt

wurde. Zudem erfolgte eine zielgerichtete

Mutagenese der ersten Codons am 5´-Ende der

kodierenden Sequenz um diese hinsichtlich der

Codon usage in Dictyostelium zu optimieren. Das Amplicon wurde in den pJET1.2 Vektor

zwischenkloniert. Aufgrund mehrerer endogener PstI Schnittstellen in dem dnmt2 Gen wurde

der Zwischenvektor zunächst mittels BamHI geschnitten und im Anchluss 15 min mit PstI

teilverdaut. Die Bande gewünschter Größe wurde geleluiert und in den BamHI und PstI

verdauten und dephosphorylierten Vektor pDneo2a_GFP ligiert.

pDneo2a_hDnmt2-NLS-GFP: Die Oligonukleotide

SM43/SM44 wurden hybridisiert, phosphoryliert

und ungerichtet in das durch BamHI linearisierte

und CIAP dephosphorylierte Plasmid

pDneo2a_hDnmt2-GFP ligiert. Inserts in

gewünschter Orientierung wurden mittels

analytischer PCR identifiziert.

Plasmid für Proteinexpression in Drosophila

pP{GS[v+,UASDnmAV5]} (Klon 3/8): Das dnmA

Gen wurde aus dem Vektor pET15b dnmA mit Hilfe

der Primer SM1 und SM2 amplifiziert und an das

Ende des Gens jeweils eine ApaI Schnittstelle

angefügt. Dabei wurden ebenfalls die ersten

Codons des dnmA Gens zielgerichtet mutiert um

diese hinsichtlich der Codon usage in Drosophila zu

optimieren. Das Gen wurde in den Zwischenvektor

pJET1.2 kloniert, dieser mittels ApaI verdaut und das dnmA Fragment ungerichtet in den

linearisierten Zielvektor pP{GS[vermillion+,UASV5]} ligiert.

pGS v+UAS+DnmA+V5

7458 bp

DnmA

V5-Tag

Vermillion

pBluescript II KS+

UAS

ApaI (924)

ApaI (2071)

pDneo2a hDnmt2-GFP

7990 bp

hDn mt2

Amp(r)

T 4903 res 1029-2254

Act6pro

Act15-P

Act8-T

Act 15-T

G FP

BamHI (1178)

Pst I (1)

Pst I (709)

Pst I (937)

pDneo2a hDnmt2-NLS-GFP

8017 bp

hDnmt2

NLS

Amp(r)

T 4903 res 1029-2254

Act6p ro

Act15-P

Act8-T

Act 15-T

GF P

BamHI (1178)

BamHI (1205)

Pst I (1)

Pst I (709)

Pst I (937)

8 Materialien

61

8.19. Sequenzen/Gene

Dictyostelium discoideum (Dictybase)

dnmA DDB_G0288047

tRNAAsp(GUC-1) DDB_G0294707

tRNAGlu(UUC-2) DDB_G0294709

tRNAVal(AAC-1) DDB_0234789

tRNALeu(UAG-1) DDB_0234827

tRNALeu(AAG-8) DDB_0235066

sno7 (DdR7, r7) DDB_G0295615

rnu2a/b (U2A, DdR19A) DDB_G0295491

rnu4a (U4A, DdR38A) DDB_G0295559

intergenische Sequenz R24 Chromosom 3, 385-469 von DB_G0280923 klonierte Sequenz: tagatgatgaaccaaaatacgtattatcctatactttagaacccatagtgaaatgattttacaaccttctttagaagacgtctga

intergenische Sequenz R69 Chromosom 5, 5394-5469 von gefQ

(DDB0191356|DDB_G0289665) klonierte Sequenz: cttggtgatgattaacagctaaagactagagtttctgtaaaaactattgctgagactatgcattattctttcctga

Homo sapiens (NCBI)

dnmt2 NM_004412.5, GI:297591820

rnu2-1 NR_002716.3, GI:225735587

9. Methoden

62

9. Methoden

9.1. Zellbiologische Methoden

9.1.1. Anzucht von Escherichia coli

E. coli wurde entweder als Schüttelkultur (240 rpm) in LB-Medium (ggf. mit entsprechendem

Antibiotikum) im Brutschrank (37°C) angezogen oder zur Selektion nach Transformationen auf

LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikum kultiviert.

9.1.2. Herstellung kompetenter Escherichia coli Zellen

Eine 5 mL-Vorkultur wurde bei 37°C auf dem Schüttler über Nacht inkubiert. Am Folgetag

wurden 2 mL der Vorkultur in 100 mL Schüttelkultur mit LB-Medium überimpft. Bei einer

Zelldichte von OD550 = 0,4-0,5 wurde die Kultur in zwei sterilen 50 mL-Reaktionsgefäßen für

5 min bei 1700 rcf abzentrifugiert und in 50 mL 50 mM CaCl2-Lösung resuspendiert. Die

Zellsuspension wurde für 30 min auf Eis gestellt und im Anschluss erneut zentrifugiert. Der

Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet in 15% Glycerinlösung (1,5 mL Glycerin 60%,

2,5 mL 100 mM CaCl2, 2 mL Millipore-H20) resuspendiert und in 100 µL Aliquots bei -80°C

eingefroren.

9.1.3. Transformation von Escherichia coli

Transformationen von Plasmiden in E. coli erfolgten mit der Hitzeschock-Methode. Dazu wurde

Plasmid-DNA (0,1 µg für Trafos in DH5α oder 1 µg für BL21/Rosetta2) oder ein kompletter

Ligationsansatzes mit 100 – 400 µL kompetenter Zellen gemischt. Nach einer 20 minütigen

Inkubation auf Eis wurden die Zellen für 90 s im Heizblock auf 42 °C erhitzt und danach sofort

wieder auf Eis gebracht. Der Ansatz wurde mit 1 mL LB-Medium versetzt, für 30 min bei 37 °C

im Brutschrank inkubiert und anschließend 3 min bei 1700 rcf zentrifugiert. Nach Dekantieren

des Überstandes wurden die Zellen im verbliebenen Restmedium resuspendiert, auf LB-Agar mit

dem entsprechenden Antibiotikum (Amp, Kan, Cam) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C

inkubiert.

9.1.4. Anzucht von Dictyostelium discoideum

D. discoideum wurde unter Dauerlicht entweder in Flüssigkultur (Sussman et al. 1967; Watts et

al. 1970a) oder auf einem Bakterienrasen (Klebsiella aerogenes) angezogen. Bei der Kultivierung

in Schüttelkultur (150 rpm), in Petrischalen oder Multiwell-Platten wurde axenisches HL5+-

Medium (ggf. mit entsprechendem Antibiotikum zur Selektion) verwendet. Schüttelkulturen

wurden bei entsprechender Zelldichte (höchstens 2 – 3 x 106 Zellen/mL) durch frisches Medium

9. Methoden

63

auf minimal 5 x 104 Zellen/mL verdünnt, bei Kulturen in Petrischalen und Multiwellplatten

wurde das Medium alle 2 – 3 Tage komplett gewechselt.

KA-Platten zur Kultivierung auf Bakterienrasen wurden durch Plattieren von ca. 500 µL

Bakteriensuspension auf eine SM-Agarplatte und einer Inkubation über Nacht bei 22 °C oder

30 °C hergestellt. Alternativ konnten vorhandene KA-Platten mit 2 mL Soerensen-

Phosphatpuffer abgewaschen und die Suspension auf mehrere SM-Agarplatten plattiert werden.

Die Dictyostelium Zellen wurden entweder mit einem Zahnstocher auf die mit Klebsiella

bewachsenen Platten angeimpft bzw. direkt zusammen mit den Bakterien ausplattiert.

9.1.5. Transformation von Dictyostelium discoideum

Für die Elektroporation von D. discoideum (Howard et al. 1988; Gaudet et al. 2007) wurden

2 x 107 Zellen im Medium für 10 min auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 5 min bei

390 rcf wurden die Zellen einmal mit Soerensen-Phosphatpuffer und zweimal mit jeweils 5 mL

EP-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden in 600 μL EP-Puffer aufgenommen, mit 10 μg Plasmid-

DNA gemischt und auf 800 μL mit EP-Puffer aufgefüllt. Die Suspension wurde in eine

vorgekühlte EP-Küvette überführt und 10 min auf Eis inkubiert. Die Elektroporation erfolgte bei

1 kV und 25 μF. Nach erneuter 10 minütiger Ruhepause auf Eis wurden die Zellen zu 8 μL

100 mM MgCl2 sowie 8 μL 100 mM CaCl2-Lösung in eine Petrischale gegeben 15 min dort

belassen. Anschließend wurde mit 10 mL HL5+-Medium aufgefüllt. Am nächsten Tag erfolgte der

Wechsel gegen das Selektionsmedium mit den entsprechenden Antibiotika. Hierbei wurden die

Zellen möglichst gleichmäßig auf der Petrischale verteilt. Nach erfolgreicher Transformation

wurden nach etwa einer Woche einzelne Kolonien sichtbar.

9.1.6. Subklonierung von Dictyostelium discoideum

Die Subklonierung (Vereinzelung) von Transformanten kann nach zwei verschiedenen

Methoden erfolgen. Sind eine Woche nach der Transformation nur wenige voneinander

abgegrenzte Kolonien sichtbar, können diese mit Hilfe einer Pipette direkt von der Petrischale

auf eine Multiwell-Platte übertragen werden. Dazu wurde 1 mL des jeweiligen Mediums in je ein

Loch der Multiwell-Platte gegeben und die Zellen darin angeimpft.

Waren nach der Transformation viele Kolonien vorhanden, wurde das Medium von der

Petrischale entfernt und die Zellen in einem geringeren Volumen (ca. 3 mL) des Mediums

resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und seriell in Phosphatpuffer verdünnt, so dass in 100

– 200 µL Suspension ca. 100 Zellen auf eine KA-Platte ausplattiert werden konnten. Nach drei bis

9. Methoden

64

fünf Tagen waren Einzelklone erkennbar. Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wurden vom

Fressrand der Einzelklone Zellen entnommen und in Multiwell-Platten herangezogen.

9.1.7. Ernten von Sporen

Um transformierte D. discoideum Zellen dauerhaft lagern zu können, werden deren Sporen in

flüssigem Stickstoff eingefroren. Dazu wurden ca. 2 x 108 Zellen aus dicht gewachsenen

Schüttelkulturen 5 min bei 390 rcf abzentrifugiert und mit Soerensen-Phosphatpuffer

gewaschen. Das Pellet wurde in 1 mL Soerensen-Phosphatpuffer resuspendiert und auf einer

Phosphatagar-Platte ausplattiert. Aufgrund des Nahrungsmangels treten dabei die Zellen in die

Entwicklung ein, an deren Ende sich einige Zellen zu Sporen ausdifferenzieren. Nach 3 Tagen

konnten die reifen Sporenköpfe durch Abspülen mit 1 mL Soerensen-Phosphatpuffer geerntet

und in 1,5 mL Cryoröhrchen eingefroren werden. Sporen wurden alternativ auch von

bewachsenen KA-Platten durch Abschlagen der Sporen in den Plattendeckel geerntet.

9.1.8. Hitzeschock-Behandlung von Dictyostelium Zellen

1,5 – 2x108 Dictyostelium Zellen wurden abzentrifugiert (390 rcf, 3 min) und in 100 mL bei 30°C

vorgewärmten Medium resuspendiert. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei 30°C auf dem

Schüttler.

9.1.9. Hungerexperimente mit Dictyostelium Zellen in Schüttelkultur

1x108 Dictyostelium Zellen wurden abzentrifugiert (390 rcf, 3 min), mit Phosphatpuffer

gewaschen und in 10 mL Phosphatpuffer resuspendiert. Es folgte eine vierstündige Inkubation

auf dem Schüttler.

9.1.10. Fluoreszenzmikroskopie

Für Fluoreszenzmikroskopie wurde ein Leica DM IRB Fluoreszenzmikroskop verwendet (Filter

GFP und DAPI). Bilder wurden bei einer 1000fachen Vergrößerung über die eingebaute

Digitalkamera aufgenommen und als Graustufenbilder exportiert. Die Bildbearbeitung erfolgte

mit CorelDrawX3 durch Verteilen der Graustufenbilder auf die entsprechenden Kanäle eines

RGB Bildes.

9. Methoden

65

Vorbereitung lebender Zellen

100 μL in Medium suspendierte Zellen einer mittelmäßig bewachsenen Kultur wurden auf ein

quadratisches Deckglas (5 cm2) pipettiert und für 15 min in einer feuchten Kammer absitzen

gelassen. Danach wurde das Medium abgezogen und durch 100 μL Phosphatpuffer ersetzt. Die

Zellen wurden für 45 min in der feuchten Kammer inkubiert, bevor der Phosphatpuffer erneut

gewechselt wurde.

Fixierung und DAPI-Färbung (modifiziert nach Dubin 2010)

100 μL in Medium suspendierte Zellen einer mittelmäßig bewachsenen Kultur wurden auf ein

Deckglas (2 cm2) pipettiert, absitzen gelassen und einmal mit Phosphatpuffer gewaschen. Der

Puffer wurde gegen eine 4%ige Paraformaldehydlösung (PFA in 20 mM Phosphatpuffer pH 6,7)

gewechselt und zehn Minuten bei 22°C inkubiert. Im Anschluss wurde die PFA-Lösung

abgenommen, der Objektträger für 10 min in MeOH getaucht und danach 20-60 min bei -20°C

inkubiert. Es folgten zwei Waschschritte mit 1xPBS und eine 15 minütige Inkubation mit 10 –

20 µL DAPI-Lösung (1:15000 in H2O). Zum Abschluss wurde das Deckglas mit Hilfe eines

Tropfens DABCO (Gelvatol) auf einem Objektträger fixiert.

9.1.11. Fluoreszenzspektrometrie

Zur Quantifizierung des Gehalts fluoreszierender Proteine (S65T-GFP, (Heim et al. 1996) Ex:

489nm, Em: 511 nm) in Dictyostelium wurde Fluoreszenzspektrometrie genutzt. Alle Messungen

wurden als Doppelbestimmung durchgeführt. Für eine fluoreszenzspektrometrische Messung

wurden 5x107 Zellen aus einer ca. 2x106 Zellen/mL entnommen, bei 390 rcf für 5 min

abzentrifugiert und einmal mit 10mL Soerensen-Phosphatpuffer gewaschen. Die Zellen wurden

dabei in ein 15mL-Gefäß überführt. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in 10 mL

Phosphatpuffer resuspendiert und für 1,5 - 2 Stunden auf einem Schüttler (150rpm) bei 22°C

inkubiert. Im Anschluss erfolgt ein weiterer Zentrifugationsschritt, von dem der Überstand

verworfen wurde. Die Zellen wurden in 2 mL Soerensen-Phosphatpuffer resuspendiert und

direkt hintereinander je 1 mL im Fluoreszenzspektrometer (Hitachi F2700) vermessen.

Proben für die erforderliche Proteinmengenbestimmung (dreimal 2x106 Zellen) wurden aus der

verbleibenden Kultur entnommen, 5 min bei 10.000 rcf abzentrifugiert, das Medium verworfen

und einmal mit 1 mL Soerensen-Phosphatpuffer gewaschen. Die Zellpellets konnten bis zur

Proteinmengenbestimmung (Kapitel 9.3.13) bei -20°C eingefroren werden.

9. Methoden

66

9.2. Molekularbiologische Methoden

9.2.1. Präparation genomischer DNA aus Dictyostelium discoideum

In kleinem Maßstab

Für Präparationen von genomischer DNA in kleinem Maßstab aus D. discoideum wurden jeweils

1 mL Kultur einer dicht bewachsenen Multiwell-Platte verwendet. Die Zellen wurden im Medium

resuspendiert und in ein 1,5 mL-Reaktionsgefäß überführt. Nach einer Zentrifugation bei 390 rcf

für 5 min wurde das Medium sorgfältig abgenommen. Die Zellen wurden in 200 µL 0,3% SDS/TE

lysiert. Das Lysat wurde mit 2 µL RNAse A (2mg/mL Stocklösung) versetzt und 15 min bei 37°C

inkubiert. Darauf folgte die Zugabe von 20 µL Proteinase K (2 mg/mL Stocklösung) und eine

weitere Inkubation für 1 h bei 45 °C. Anschließend wurde eine Phenol/Chloroform Extraktion

(Kapitel 9.2.5) durchgeführt, die DNA aus der wässrigen Phase gefällt (Kapitel 9.2.6) und das

getrocknete DNA Pellet in 50 µL UV-Wasser aufgenommen.

In großem Maßstab

2x108 Dictyostelium Zellen wurden durch eine dreimiütige Zentrifugation bei 390 rcf pelletiert

und einmal mit Phosphatpuffer gewaschen. Das Zellpellet wurde anschließend in 45 mL

Zelllysepuffer resuspendiert und tropfenweise (bis max. 1%) mit 10% NP40 versetzt, so dass die

Zell- aber nicht die Kernmembran lysiert wurde. Danach folgte eine Zentrifigation bei 3220 rcf

für 15 min (Ausschwingrotor) und die pelletierten Zellkerne wurden in 5 mL SDS/TE-Puffer

resuspendiert. Nach Zugabe von 125 µL Proteinase K (20 mg/mL Stocklösung) folgte eine

einstündige Inkubation bei 60°C im Hybridisierungsofen. Abschließend wurde das Kernlysat

Phenol/Chloroform extrahiert (Kapitel 9.2.5), die DNA aus der wässrigen Phase gefällt (Kapitel

9.2.6) und das getrocknete DNA Pellet in 100 µL UV-Wasser aufgenommen.

9.2.2. Präparation von Gesamt-RNA aus Dictyostelium discoideum

Die Präparation von RNA aus D. discoideum erfolgt aus 2x107 bis 1x108 Zellen mit der Trizol-

Methode (Chomczynski 1993). Dazu wurden die Zellen bei 390 rcf für 5 min abzentrifugiert und

der Überstand verworfen. Die Zellen wurden in 1 mL Trizol pro 2x 107 Zellen resuspendiert und

5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zehnminütiger Zentrifugation (10.000 rcf) wurde

der Überstand in ein neues Rekationsgefäß überführt. Es folgte eine Chloroform-Extraktion mit

fünfminütiger Inkubation auf einem Rollinkubator bei Raumtemperatur (200 µL Chloroform pro

mL Trizol). Die Phasentrennung erfolgte durch 10 min Zentrifugation (10.000 rcf). Der wässrige

Überstand wurde abgenommen und mit 0,8 Volumen Isopropanol bei -20 °C gefällt (2 h bis üN).

Im Anschluss erfolgte erneutes Zentrifugieren bei 10.000 rcf für 30 min bei 4°C. Der Überstand

9. Methoden

67

wurde dekantiert und das Pellet mit 1 mL 70% Ethanol gewaschen. Nach erneutem

Zentrifugieren und Trocknen wurde die RNA in 50-100 µL DEPC- oder UV-Wasser

aufgenommen.

9.2.3. Anreicherung kleiner RNA aus Gesamt-RNA

Der Anreicherung kleiner RNAs ging eine Präparation von Gesamt-RNA aus 1-5x108 Zellen

voraus (Kapitel 9.2.2). Wurde die Gesamt-RNA in verschiedenen Ansätzen präpariert, wurden

die einzelnen Fraktionen vereint und auf 2-3 mL Volumen aufgefüllt. Das Reaktionsgefäß wurde

auf Eis gebracht und mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus 1 M NaCl/10% PEG 8000

versetzt und vorsichtig gemischt. Es folgte eine Inkubation bei -20°C für genau 30 min. Nach

einer dreißigminütigen Zentrifugation (10.000 rcf, 4°C) wurde der Überstand in ein neues Gefäß

überführt und die RNA mit dem dreifachen Volumen 100%igem Ethanol über Nacht bei -20°C

gefällt. Im Anschluss wurde 30 min (10.000 rcf, 4°C) zentrifugiert und das RNA Pellet in der

Vakuumzentrifuge getrocknet. Die RNA wird in 50-100 µL DEPC- oder frischem UV-Wasser

aufgenommen.

9.2.4. Trennung von Kern und cytoplasmatischer RNA

5-6x108 Dictyostelium-Zellen wurden in drei 50 mL-Reaktionsgefäßen geerntet und zweimal mit

eiskaltem H2O (bidest) gewaschen. Das Zellpellet wurde in 45 mL eiskaltem Zelllysepuffer

resuspendiert und tropfenweise 10%ige NP40-Lösung bis zu einer max. Endkonzentration von

1% hinzugegeben. Die Zellkerne wurden bei 3220 rcf (Ausschwingrotor) für 15 min

abzentrifugiert.

RNA aus Cytoplasma: Der Überstand eines 50mL-Reaktionsgefäß würde in zwei neue Gefäße

überführt, von den anderen beiden der Überstand verworfen. Es erfolgte eine

Phenol/Chloroform Extraktion mit anschließender Fällung der RNA bei -20°C über Nacht. Die

getrocknete RNA wurde in 100 µL DEPC-Wasser aufgenommen.

RNA aus Zellkernen: Je ein Kernpellet wurde in 1 mL Trizol lysiert und alle drei Kernpellets in

ein Reaktionsgefäß überführt. Weiteres Vorgehen erfolgte wie in Kapitel 9.2.2 beschrieben mit

auf die 3 mL-Trizol angepassten Volumina.

9.2.5. Phenol/Chloroform Extraktion

Die Entfernung von Proteinen aus Nukleinsäurelösungen erfolgte durch Phenol/Chloroform-

Extraktion. Dabei wurde die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform versetzt, gut

invertiert und für 15 min bei 20000 rcf zentrifugiert. Anschließend konnte die wässrige,

9. Methoden

68

nukleinsäurehaltige Phase vorsichtig abgenommen werden. Um Reste der organischen

Lösungsmittel zu entfernen, wurde die Nukleinsäure anschließend einer Fällung unterzogen.

9.2.6. Fällung von Nukleinsäuren

Zur Fällung von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen, werden diese mit 1/10 Volumen 3 M

NaAc pH 4,7 und 0,8 Volumen Isopropanol oder 2,5 Volumen Ethanol versetzt und i. d. Regel

20 min bis über Nacht bei -20 °C inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 30 min bei 20000 rcf

wurde der Überstand dekantiert und das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen. Es folgte eine

weitere Zentrifugation für 15 min. Anschließend wurde der Überstand verworfen, das Pellet in

der Vakuumzentrifuge getrocknet und die Nukleinsäure in der gewünschten Menge UV-Wasser

aufgenommen.

9.2.7. Plasmidpräparationen aus E. coli

Für Plasmidminipräparationen aus E. coli (Birnboim 1983) wurden über Nacht angewachsene

1 mL-Schüttelkulturen für 5 min bei 1700 rcf abzentrifugiert und das Pellet in 100 μL Lösung I

resuspendiert. Nach Zugabe von 200 μL Lösung II und einer fünfminütigen Inkubation bei RT

wurde der Ansatz mit 150 μL vorgekühlter Lösung III versetzt. Es folgte ein weiterer

Inkubationsschritt von 10 min auf Eis sowie das Pelletieren der gefällten Proteine und

genomischer DNA durch Zentrifugieren für 15 min bei 20000 rcf. Der Überstand wurde

vorsichtig abgenommen, gefällt und die Plasmid-DNA in 25 μL UV-Wasser aufgenommen.

Midipräparationen von Plasmiden erfolgten aus über Nacht angewachsenen 100mL-

Schüttelkulturen. Dazu wurde das NucleoBond® PC 100 Kit nach Anleitung des Herstellers

verwendet.

9.2.8. Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen

Restriktionsverdaue wurden entweder analytisch (1 µg Plasmid-DNA in einem 20 µL Ansatz, 1h,

37°C) oder präparativ (15 – 20 µg in einem 75 µL Ansatz, 3h, 37°C) durchgeführt. Die Auswahl

des Enzympuffers erfolgte nach Vergleich der Aktivitäten der verwendeten Enzyme, wobei diese

mindestens 50% betragen sollte. Das Volumen der verwendeten Enzyme richtete sich nach der

Aktivität des Enzyms in u/µL. Die geschnittene DNA wurde danach entweder direkt

elektrophoretisch analysiert oder durch Phenol/Chloroform Extraktion weiter gereinigt.

9. Methoden

69

9.2.9. Dephosphorylierung von Nukleinsäuren

Dephosphorylierung von Plasmid-DNA

Dephosphorylierung von Plasmid-DNA erfolgte entweder durch Zugabe von 1 µL CIAP zum

Restriktionsverdau (Kapitel 9.2.8) oder erfolgte separat in einem 20 µL-Ansatz mit

entsprechendem CIAP-Puffer. Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Phenol/Chloroform-

Extraktion oder Hitzedenaturierung.

Dephosphorylierung von RNA

Zu dephosphorylierende RNA wurde in 44 µL DEPC-H2O aufgenommen, mit 5 µL CIAP-Puffer

und 1 µL CIAP versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Reaktionsansatz

mit DEPC-H2O auf 150 µL aufgefüllt um in Folge eine Phenol/chloroform-Extraktion mit

anschließender Fällung vornehmen zu können.

9.2.10. Phosphorylieren von Oligonukleotiden

Das Phosphorylieren von Oligonukleotiden erfolgte für 20 min bei 37°C nach dem

Reaktionsansatz aus Tabelle 1. Im Anschluss wurde das Enzym für 10 min bei 75°C inaktiviert.

Tabelle 1: Reaktionsansatz einer Phosphorylierungsreaktion.

Reaktionsansatz

50 pmol Oligo

2 µL 10x PNK Puffer A

2 µL dATP (10mM)

1 µL T4-PNK

ad 20 µL UV-H2O

9.2.11. Ligation von DNA Fragmenten

Bei Verwendung des CloneJETTM oder GeneJetTM PCR-Cloning Kit erfolgten die Liagtionen nach

Anleitung des Herstellers. Ligationen ohne Kit wurden nach dem Reaktionsansatz in Tabelle 2

angesetzt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der gesamte Ansatz

für eine Transformation eingesetzt.

9. Methoden

70

Tabelle 2: Reaktionsansatz einer Ligation.

Reaktionsansatz

Ca. 50 ng Plasmid

Ca. 150 ng Insert

2 µL T4 DNA Ligase Puffer

1 µL T4 Ligase

ad 20 µL UV-H2O

9.2.12. Hybridisieren komplentärer Oligonukleotide

Die Hybridierung komplentärer Oligonukleotide wurde für Klonierungen verwendet, wenn

kurze Inserts (bis ca. 40 bp) in Plasmide inseriert werden sollen. Dazu wurden je 1 µL

Oligonukleotid (10 µM Stock) mit 8 µL STE-Puffer in einem PCR-Reaktionsgefäß gemischt. Die

Hybrisierungsreaktion erfolgte in einem Thermocycler, der zunächst für 5 min auf 95°C

hochheizte, und dann in Minutenabständen die Temperatur jeweils um 5°C reduzierte bis

Raumtemperatur erreicht war.

Für eine nachfolgende Ligation wurden 0,4 µL hybridierte Oligonukleotide pro 50 ng Plasmid in

einem 20 µL Ligationsansatz verwendet. Da linearisierte Plasmide meist dephosphoryliert

wurden, wurden phosphorylierte Oligonukleotide verwendet oder die hybridisierten

Oligonukleotide wurden nachfolgend phosphoryliert (Kapitel 9.2.10).

9.2.13. Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (Mullis et al. 1986) wurde analytisch, präparativ oder als Colony-

PCR durchgeführt (Tabelle 3 und Tabelle 4). PCR-Fragmente für Klonierungen wurden mit

einem Taq/Pfu-Polymerase-Mix (2 µL/1µL) in präparativen Ansätzen hergestellt.

Tabelle 3: Reaktionsansatz verschiedener PCR-Reaktionen.

Reaktionsansatz

Präp. PCR Analyt. PCR/Colony-PCR

1 µL 1 µL/einige Bakterienzellen DNA-Probe/ Plasmid (10 ng/µL)

5 µL 2 µL 10 x PCR-Puffer (+MgCl2, + KCl)

5 μL 2 μL dNTPs (2,5 mM jedes dNTPs)

2 μL 1 μL 5’ Primer (5 mM, 5 pmol/µL)

2 μL 1 μL 3’ Primer (5 mM, 5 pmol/µL)

2 μL 1 μL Taq-Polymerase

ad 50 μL ad 20 μL UV-H2O

9. Methoden

71

Tabelle 4: Programmbeispiel einer Standard-PCR.

Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen

Erste Denaturierung 95 °C 3 – 5 min 1

Denaturierung 95 °C 30 s

Annealing 45 – 60 °C 30 s

Elongation 68 – 72 °C 1 kb/min bei 72°C

25 – 30

Finale Elongation 68 – 72 °C 3 – 5 min 1

9.2.14. Rekursive PCR

Kleinere Gene (< 150 bp) von tRNAs und snoRNAs wurden mittels rekursiver PCR amplifiziert.

Dazu wurden vier überlappende Oligonukleotide, die das gesamte Gen abdeckten, verwendet

(Abbildung 11). Die beiden inneren Oligonukleotide dienen als Template, die beiden äußeren als

Primer. Der PCR Ansatz erfolgte wie in Tabelle 3 beschrieben, mit den Ausnahmen, dass anstelle

des DNA-Templates die entsprechenden Oligonukleotide eingesetzt wurden und die Primer-

konzentration auf 20 pmol/Reaktion verdoppelt wurde.

Abbildung 11: Prinzip der rekursiven PCR (schematisch).

9.2.15. Quantitative Real time-PCR

Die Analyse von mRNA erfolgte mit Hilfe des One-Step-Kit (Bioline) nach Angaben des

Herstellers. Gesamt-RNA wurde mit Trizol (Kapitel 9.2.2) isoliert und 400 ng pro Reaktion

eingesetzt. Auf ein DNAseI Verdau wurde in der Regel verzichtet, da Kontroll-PCR-Reaktionen

DNA freie RNA bestätigten. Das relative Expressionslevel R wurde mit der ΔΔCt Methode

berechnet (Livak et al. 2001): R = 2 – [(CT target – CT housekeeping gene) – (CT calibrator – CT housekeeping gene)]

9. Methoden

72

Real time PCR auf genomische DNA wurde mit dem Ansatz aus Tabelle 5 durchgeführt.

Tabelle 5: Reaktionsansatz einer Real time-PCR auf gDNA.

Reaktionsansatz

4 µL DNA-Probe

2 µL 10 x PCR-Puffer (+MgCl2, + KCl)

2 μL dNTPs (2,5 mM jedes dNTP)

1,6 μL Primer-Mix (5 µM)

0,4 μL SYBR-Green

0,4 μL Taq-Polymerase

ad 20 μL UV-H2O

Alle Ansätze wurden als Triplikate in Twin.tec-96-well-Platten (Eppendorf) durchgeführt

(Tabelle 6). Als Housekeeping-Gene wurden cinD (bei RNA) und Coronin A (bei gDNA)

verwendet. In die Datenauswertung wurden ausschließlich Reaktionen einbezogen, deren Ct-

Werte der Triplikate weniger als 0,5 Einheiten voneinander abwichen.

Tabelle 6: Programm für Real-time PCR mit RNA oder DNA Template.

Schritt Temperatur Zeit (RNA) Zeit (DNA) Anzahl der Zyklen

cDNA- Synthese 45°C 10 min -- 1

Erste Denaturierung 95 °C 1,5 min 2 min 1

Denaturierung 95 °C 30 s 5 s

Annealing/Elongation 60 °C 1 min 20 s

35 – 40

9.2.16. PCR zur Herstellung methylierter PCR-Fragmente

Für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen wurden methylierte Amplicons eines DNA-

Fragments des Reversen Transkriptase-Gens eines LINES aus E. histolytica hergestellt (Tabelle 7

und Tabelle 8). Die PCR Produkte wurden im Anschluss gelelektrophoretisch aufgterennt und

elektroeluiert (Kapitel 9.2.19). Zur Kontrolle des Einbaus von d5mCTPs wurde die PCR Produkte

mit dem Enzym McrBC (5´…PumC(N40-3000)PumC…3´) verdaut.

9. Methoden

73

Tabelle 7: Reaktionsansatz für die Herstellung eines methylierten PCR-Produktes.

Reaktionsansatz

1 µL DNA-Probe (10 ng/µL)

5 µL 10 x PCR-Puffer (+MgCl2, + KCl)

5 μL dNTPs (2,5 mM je dATP, dTTP, dGTP)

5 μL d5mCTP (2,5 mM)

2 μL Primer-Mix (SP6, T7), (5 µM)

1,6 µL 100% DMSO

2 μL Taq-Polymerase

ad 50 μL UV-H2O

Tabelle 8: PCR-Programm zur Herstellung eines methylierten DNA-Fragments.

Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen

Erste Denaturierung 95 °C 3 min 1

Denaturierung 95 °C 30 s

Annealing 50 °C 15 s

Elongation 72 °C 40 s

30

Finale Elongation 72 °C 2 min 1

9.2.17. Elektrophoretische Trennverfahren

Agarosegelelektrophorese von DNA

Die Auftrennung von dsDNA erfolgte mit Hilfe nichtdenaturierender Agarosegele (0,8 bis 2,5 %

Agaroseanteil). Nukleinsäuren wurden mit Ethidiumbromid (0,01 %) gefärbt, welches dem Gel

nach Auflösen hinzugegeben wurde. Als Laufpuffer wurde 1xTBE verwendet und die Proben mit

mindestens 1/6 Volumen DNA-Auftragspuffer versetzt. Die Elektrophorese wurde im Anschluss

bei 6 - 10 V/cm durchgeführt.

GTC-Gelelektrophorese von RNA

Die Auftrennung von RNA erfolgte prinzipiell analog zur DNA Agarosegelelektrophorese.

Zusätzlich wurden die 1,8%igen Agarosegele nach dem Aufkochen auf 60 °C heruntergekühlt

und GTC (0,24 g/100 mL) hinzugegeben. Als Auftragspuffer für die Proben wurde FA-Puffer (2x)

verwendet, welcher zur Färbung der RNA zuvor mit entsprechender Menge

9. Methoden

74

Ethidiumbromidlösung versetzt wurde. Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel für

5 min auf 80 °C erhitzt und dann auf Eis gebracht.

Polyacrylamidgelelektrophorese

PAA-Gele wurden in den Größen 18x24 cm und 18x14 cm mit 1mm Tiefe verwendet. Die

Komponenten und Laufbedinungen für die verwendeten nativen und denaturierenden PAA-Gele

sind in Tabelle 9 aufgeführt. Zur Vorbereitung der Gele wurden die Komponenten gemischt,

TEMED und APS werden als letztes zugegeben, da APS als Radikalstarter für die

Polymerisationsreaktion dient. Die Proben wurden je nach Bedarf mit gleichen Volumen

nativem RNA-Auftragspuffer oder denaturierendem FA-Puffer versetzt. Letztere wurden

zusätzlich 5 min bei 80 °C erhitzt und sofort auf Eis gestellt um eine Renaturierung der RNA zu

vermeiden.

Tabelle 9: Zusammensetzung von Polyacrylamidgelen.

Komponente Denaturierend (TBE) Nativ (TBE) Denaturierend

(MOPS)

8% 10% 12% 6% 11 %

40% Acrylamid (29:1) 10 mL 12,5 mL 15 mL 4,5 mL 14 mL

Urea (7M) 21 g 21 g 21 g -- 21 g

5x TBE 10 mL 10 mL 10 mL 6 mL --

1 M MOPS pH7 -- -- -- -- 1 mL

Dest. H2O 15 mL 12,5 mL 10 mL 19,5 mL 21 mL

TEMED 100 µL 100 µL 100 µL 80 µL 100 µL

APS (20%) 100 µL 100 µL 100 µL 80 µL 100 µL

Σ 50 mL 50 mL 50 mL 30 mL 50 mL

Laufbedingungen 400 mM, 25 mA (30 min Vorlauf) 100 – 200V, 15 mA 150 V, 10 mA

9.2.18. Gelelution

Für die Gelelutionen aus Agarosegelen wurden die gewünschten DNA-Banden auf einem UV-

Tisch mittels Skalpell ausgeschnitten und in 1,5 mL Reaktionsgefäße überführt. Die

anschließende Elution erfolgt mit dem NucleoSpin® Extract II Kit nach Anleitung des Herstellers.

9. Methoden

75

9.2.19. Elektroelution

Die Elektroelutionskammer (V-Kammer) wurde mit 0,25x TBE-Puffer gleichmäßig befüllt. Zu

eluierende DNA Banden wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und so in die dafür

vorgesehene Vertiefung der V-Kammer gelegt, dass die Lauffront parallel zu den Elektroden

ausgerichtet ist (Abbildung 12). Nachdem jedes „V“ wird durch die vertikale Öffnung mit 140 µL

8M Ammoniumacetat befüllt wurde, erfolgte die Elektroelution für 45 min bei 180 V. Nach der

Elektroelution wurden die schräg horizontalen Öffnungen mit abgeschnittenen gelben Spitzen

verschlossen, der Pufferstand unter die obere Kante des „V“-Blocks abgesenkt. Durch die

vertikale Öffnung wurden ca. 200 µL Ammoniumacetat entnommen und die DNA mit 2,5x

Volumen 100% EtOH bei -20°C gefällt. Nach Waschen und Trocknen wurde die DNA in 40 µL

sterilfiltriertem Wasser (Sterilfilter 0,2 µm) aufgenommen.

Abbildung 12: Schematische Darstellung der Elektro-elutionskammer (Seitenansicht). Die Abbildung wurde freundlicherweise von N. Arens zur Verfügung gestellt.

9.2.20. RNA Bisulfitsequenzierung

Die RNA Bisulfitsequenzierung wurde von Robin Lorenz in Kooperation mit M. Schäfer (Abt.

Lyko, DKFZ, Heidelberg) nach einem etablierten Protokoll der Arbeitsgruppe durchgeführt

(Schaefer et al. 2009c).

9.2.21. Northern-Blot (Kapillarblot)

Für den Kapillarblot wurde die RNA zunächst mittels Agarosegelelektrophorese in einem GTC-

Gel aufgetrennt (Kapitel 9.2.17). Für den Blotaufbau wurde eine Glasplatte über eine Schüssel

mit 10 x SSPE Puffer gelegt. Auf die Glasplatte wurde ein Whatmanpapier in Größe des Gels

gelegt, welches jedoch rechts und links so lang war, dass es in das Pufferbad eintauchte. Auf

dieses Whatmanpapier folgte eine weitere Schicht Whatmanpapier in exakter Größe des Gels.

Nun folgten das Gel, die Nylonmembran und wieder zwei Schichten Whatmanpapier.

Whatmanpapier und Membran wurden zuvor in 1x SSPE getränkt. Auf die letzte Schicht

Whatmanpapier wurde ein Stapel Papiertücher gelegt und dieser mit Hilfe einer Glasplatte und

9. Methoden

76

eines Gewichtes (ca. 300 g) beschwert. Der Kapillarblot wurde über Nacht durchgeführt. Im

Anschluss wurde die Membran an der Luft getrocknet und durch UV-crosslinking bei 0,56 J/cm2

die RNA auf der Membran fixiert. Prähybridisierung mit Denhardt-Hybridisierungslösung

(Denhardt 1966) erfolgte für 60 min bei 42°C, Hybridisierung der radioaktiv markierten OLB-

Sonden erfolgte über Nacht. Nach der Hybridisierung wurde die Membran für 30 min mit der

Waschlösung I und im Anschluss mindestens 30 min mit der Waschlösung II gewaschen.

9.2.22. Northern-Blot für kleine RNAs (Semidry-Blot)

Northern Blot Analysen kleiner RNAs erfolgten in Anlehnung an das Protokoll von G. Pall (Pall et

al., 2007). 25 - 40 μg Gesamt-RNA wurden gelelektrophoretisch (denat. 11% PAA, 20 mM MOPS)

aufgetrennt (Kapitel 9.2.17) und anschließend mittels Elektroblot auf eine HybondTM-NX-

Membran (Amersham) übertragen. Diese wurde auf drei mit DEPC-H2O getränkte Whatman-

Papiere gelegt. Darauf folgten das PAA-Gel und drei weitere Lagen Whatman-Papier. Der

Elektroblot erfolgt bei 4 °C mit 20 V für 10-15 min.

Die Quervernetzung der RNA an die Membran erfolgte durch eine Carbodiimid-vermittelte

Methode. Dazu wird das Gel auf ein mit der Crosslinking-solution getränktes Whatmanpapier

platziert, eingeschweißt und zwei Stunden bei 55 °C im Hybridisierungsofen inkubiert. Bei

Bedarf wurde zusätzlich zuvor ein UV-crosslinking durchgeführt (Kapitel 0). Nach Abspülen der

Membran mit DEPC-H2O erfolgte die Prähybridisierung mit Church-Puffer für 30 min bei 42 °C.

Danach wurde die Membran über Nacht mit einem radioaktiv endmarkierten Oligonukleotid

hybridisiert (42 °C). Die Membran wurde zweimal 15 min mit Waschlösung A, zweimal 10 min

mit Waschlösung B und zweimal 5 min mit Waschlösung C bei 42 °C gewaschen. Die Exposition

zur Detektion kleiner RNAs erfolgte für 16 bis 72 Stunden.

9.2.23. Stripping von Northern Blots

Um Northern-Blots erneut mit einer Sonde hybridisieren zu können, wurden alte Sonden ggf.

durch dreimaliges Waschen mit Stripping-Buffer für 20 min bei 80 – 95°C im Hybridisierungs-

ofen entfernt.

9.2.24. In vitro Transkription

In vitro Transkription von tRNAs

Für die Herstellung von Transkripten für den Methylierungsassay, wurden alle Komponeneten

zusammengegeben (Tabelle 10). Die Vektoren, von denen transkribiert wurde, mussten im

Vorfeld durch einen präparativen Restriktionsverdau linearisiert, Phenol/Chloroform extrahiert

9. Methoden

77

und gefällt werden. Die Transkription fand während einer zweistündigen Inkubation bei 37 °C

im Heizblock statt. Im Anschluss erfolgt ein fünfzehnminütiger DNAse I (RNAse frei) Verdau.

Wurden große Mengen benötigt, wurden zwei bis drei parallele Ansätze gemacht, anschließend

vereint und auf 150 µL mit DEPC-Wasser aufgefüllt. Der Ansatz wurde einer Phenol-Extraktion

unterzogen. Die wässrige Phase wurde zur Entfernung nicht eingebauter Nukleotide gelfiltriert

(Kapitel 9.2.25).

Tabelle 10: Reaktionsansatz einer in vitro-Transkription für tRNAs.

Reaktionsansatz

0,5 µg DNA template (linearisiertes Plasmid)

10 µL 5x Transkriptionspuffer (Fermentas)

10 µL NTP-Mix (5mM each)

2 µL T7 RNA-Polymerase (homemade)

1 µL RNAse Inhibitor (40u/µL)

ad 50 µL (DEPC- oder UV-H2O)

In vitro Transkription von snoRNAs und U-snRNAs

In vitro Transkriptionen von snoRNAs und U-snRNAs erfolgten prinzipiell analog zur in vitro

Transkription von tRNA. Abweichend wurde hier der Transkriptionspuffer nach Doudna (Ferre-

D'Amare et al. 1996) verwendet (Tabelle 11). Nach Phenol/Chloroform Extraktion der

Transkripte wurden diese einer Ethanolfällung unterzogen.

Tabelle 11: Reaktionsansatz einer in vitro Transkription für snoRNA und U-snRNAs.

Reaktionsansatz

0,5 µg DNA Template (linearisiertes Plasmid)

5 µL 10x Transkriptionspuffer (Doudna)

25 µL NTP-Mix (5mM each)

2 µL T7 RNA-Polymerase (homemade)

1 µL RNAse Inhibitor (40u/µL)

ad 50 µL (DEPC- oder UV-H2O)

9. Methoden

78

9.2.25. Gelfiltration

Für die Gelfiltrationschromatographie wurde der Boden einer 1 mL-Einmalspritze mit Glaswolle

ausgekleidet und die Spritze anschließend durch Zentrifugation mit 1 mL Sephadex®G50 befüllt.

Die Spritze wurde dann in ein 15 mL-Falconröhrchen gegeben, in dessen Spitze ein 1,5 mL

Reaktionsgefäß zum Sammeln des Durchflusses dient. In die so präparierte Spritze konnte nun

die zu gelfiltrierende Probe (Mindestvolumen 100 µL) gegeben werden. Nach einer fünf

minütigen Zentrifugation bei 200 rcf wurde das Reaktionsgefäß mit der darin befindlichen,

gereinigten Nukleinsäure wieder entfernt.

9.2.26. Radioaktive Endmarkierung von Nukleinsäuren

Die Herstellung radioaktiv endmarkierter Nukleinsäuren erfolgte durch Übertragung eines

radioaktiven Phosphats von [γ-32P]-ATP an das 5’-OH Ende der Nukleinsäure durch die

T4-Polynukleotid-Kinase. Nach Zugabe aller Komponenten (Tabelle 12) wurde das

Reaktionsgefäß für 30 min bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Überschüssige Nukleotide wurden

anschließend durch Gelfiltration (Kapitel 9.2.25) entfernt. In dieser Arbeit wurden radioaktiv

markierte Oligonukleotide als Sonden für Northern-Blot Analysen oder für Primerextension-

Assays genutzt. In Co-Immunopräzipitationen angereicherte RNA wurden ebenfalls für erste

Analyse endgelabelt.

Tabelle 12: Ansatz einer Endmarkierungsreaktion.

Reaktionsansatz

8 µL

X µL*

Oligonukleotid (1 pmol/µL)

oder

RNA

5 μL 10x T4 PNK Puffer A (for)

1 μL T4 Polynukleotid Kinase (10 µg/µL)

1 μL [γ-32P] ATP (110 TBq/mmol)

ad 50 μL DEPC-H2O

* Werte wurde den Bedürfnissen entsprechend angepasst.

9.2.27. Random primed oligo-labeling

Die Herstellung radioaktiv markierter DNA Sonden erfolgt ausgehend von einem geluierten PCR

Produkt oder eines Restriktionsfragments. Nach der Zugabe aller Komponenten (Tabelle 13)

9. Methoden

79

wurde für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte zum Abtrennen überschüssiger

Nukleotide eine Gelfiltration (Kapitel 9.2.25).

Tabelle 13: Reaktionsansatz einer Random priming-Reaktion.

Reaktionsansatz

500 ng DNA-Fragment

10 µL 5 x OLB-Mix

ad 41 µL H2O

3 min, 95°C

Danach ergänzen:

2 µL BSA (10 mg/mL)

5 µL (1,8 MBq) [α-32P] ATP (110 TBq/mmol)

2 µL Klenow-Fragment (2u/µL)

UV-H2O ad 50 μL

9.2.28. Primer extension

Für Primer extension wurden 0,1 µg in vitro Transkript oder 2 µg Gesamt-RNA mit 3 µL eines

radioaktiv endmarkierten Oligonukleotide (Konzentration nach Endmarkierung ~ 0,08

pmol/µL) (Kapitel 9.2.26) gemischt und auf 11,5 µL mit DEPC-H2O aufgefüllt. Nach fünf

minütiger Inkubation bei 80°C wurde der Ansatz auf Eis gebracht. Nach Zugabe von 4 µL 5x RT-

Reaktionspuffer, 2 µL 10 mM dNTPs und 0,5 µL Ribolock (x u/µL) folgte eine weitere Inkubation

bei 37°C für 5 min. Die reverse Transkription erfolgte durch Zugabe von 1 µL RT für 1 Stunde bei

37°C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von denaturierndem Auftragspuffer gestoppt und die

Probe auf einem denaturierenden 12%igem PAA-Gel aufgetrennt.

9.3. Biochemische Methoden

9.3.1. Überexpression rekombinanter Proteine in Escherichia coli

Um rekombinante Proteine für nachfolgende Experimente zu gewinnen, wurde eine Vorkultur

(LB-Flüssigmedium mit den entsprechenden Antibiotika) mit den gewünschten E. coli Klonen

inokuliert und über Nacht bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Bei den in dieser Arbeit

verwendeten E. coli Expressionsstämmen handelt es sich um BL21 pLysS (DE3) oder Rosetta2

pLysS. Durch das Lysozym kodierende zusätzliche Plasmid musste bei der Selektion dem

9. Methoden

80

Medium auch Chloramphenicol zugesetzt werden. Am nächsten Tag wurde eine Hauptkultur

(20 mL für Expressionschecks, 500 mL für präparative Zwecke) angesetzt, in die die

Starterkultur 1:50 verdünnt wurde. Die Zellen wurden bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert bis

ein OD600-Wert von ca. 0,6 erreicht ist. Nach Abnahme der Nullproben, konnte die Expression

der Proteine durch Zugabe von IPTG, wobei die Endkonzentration dem jeweilig zu

exprimierenden Enzym angepasst wurde (Tabelle 14), induziert werden. Die Kulturen wurden

weiterhin bei gewünschter Temperatur inkubiert (Tabelle 14). Nach einigen Stunden (Tabelle

14) wurden die Kulturen schließlich in Falconröhrchen für 10 min bei 1700 rcf gesammelt

(100mL Kultur pro Falcon). Die Zellpellets zur Lagerung bei -20°C oder -80 °C eingefroren

werden.

Tabelle 14: Übersicht der Expressionsbedingungen verwendeter rekombinanter Proteine in E. coli.

Protein Vektor Selektionsmedium C(IPTG) Temp. Dauer

His6-DnmA pET15b LBAmp+CAM 0,5 mM 22°C 3 h

pET28a(+) LBKAN+CAM 1 mM 22°C 3 h

His6-hDnmt2 pET28a(+) LBKAN+CAM 1 mM 37°C 3 h

His6-Pmt1 pET15b LBAmp+CAM 1 mM 37°C 2 h

GST-EhMLBP pGEX-4T-1 LBAmp+CAM 0,5 mM 30°C 4 h

GST-EhMLBP (C-ter) pGEX-4T-1 LBAmp+CAM 0,5 mM 30°C 4 h

9.3.2. Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine aus E. coli

Allen Zellaufschlusspuffern wurde je 10 mL Volumen eine Proteinaseinhibitortablette (complete

mini, Roche) zugesetzt.

9.3.2.1. Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC)

Die Reinigung rekombinanter His6-markierter Proteine erfolgt über immobilisierte Metallchelat-

Affinitätschromatographie (IMAC) mittels NiNTA-Sepharose™. Der Zellaufschluss erfolgte durch

Auftauen der Zellpellets und erneutem Einfrieren bei -20°C für ca. eine Stunde. Danach wurden

die Pellets (aus je 100 mL Kultur) erneut aufgetaut und in je 5 mL Sonifizierungspuffer mit

1mg/mL Lysozym resuspendiert. Es folgte eine ca. zwanzigminütige Inkubation auf Eis.

Nach Vortexen wurden alle Fraktionen vereint und ca. zehn Mal für 10 sec sonifiziert (Amplitude

50%, Zyklus 0,5). Zwischen jeder Ultraschallbehandlung wurde 30 sec Pause eingelegt. Es

folgten zwei Zentrifugationsschritte (10.000 rcf, 4°C, 10 min) um das unlösliche Zellmaterial zu

9. Methoden

81

pelletieren. Nach dem ersten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand in ein neues

Reaktionsgefäß überführt. Vom Lysat sowie nach jedem weiteren Schritt wurde eine Probe zur

Analyse auf einem SDS-Gel entnommen. Alle weiteren Schritte fanden bei 4°C statt. Zwei

10mL-Chromatographiesäulen (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) wurden hierzu mit je 500 μL NiNTA-

Sepharose™-Suspension befüllt und mit 5 mL Sonifizierungs-/Waschpuffer äquilibriert. Das

Zelllysat wurde auf die erste Chromatographiesäule gegeben und der Durchfluss direkt auf eine

zweite Säule geleitet. Nach dem Binden der His-getaggten Proteine an die NiNTA-Matrix wurden

beide Säulen separat weiterbearbeitet. Jede Säule wurde einmal mit 10 mL und im Anschluss

noch einmal mit 5mL Sonifizierungs-/Waschpuffer gewaschen. Die Elution erfolgte durch

Zugabe von je 500 µL Elutionspuffer pro Säule, gefolgt von einer zehnminütigen Inkubation. Im

Anschluss wurde die Elutionsfraktion aus der Säule entlassen und zwei weitere Elutionsschritte

ohne weitere Inkubation wiederholt. Die einzelnen Fraktionen wurden separat gesammelt.

Mittels Coomassie-Schnelltest wurde der Proteingehalt der einzelnen Elutionen semiquantitativ

bestimmt und die entsprechenden Fraktionen vereint. Die Dialyse erfolgte für zwei Stunden in

Dialysepuffer I gefolgt von einer Inkubation über Nacht in Dialysepuffer II.

9.3.2.2. GST-Affinitätschromatographie

Induzierte und eingefrorene Bakterienpellets wurden aufgetaut und ein weiteres Mal für ca. 30-

60 min eingefroren. Nach erneutem Auftauen wurden die Zellen in 15 ml Lysepuffer + 5 ml

Bugbuster resupsendiert und für 20 min auf Eis inkubiert. Der Zellaufschluss wurde durch ca.

zehnmaliges Sonifizieren (Amplitude 80 %, Cycle 0,8; 10 s, 20 s Pause) komplettiert. Die

Zellreste wurden durch Zentrifugieren für 15 min bei 10.000 rcf und 4°C entfernt. Vom

Überstand des Lysats sowie jedem weiteren Schritt wurden Proben zur Analyse auf einem SDS-

Gel entnommen.

Der Überstand wurde mit 500 μL äquilibrierter (10 mL 1xPBS) Gluthation-Sepharose versetzt

und für 2 h bei 4 °C auf dem Drehrad inkubiert. Im Anschluss wurde der Ansatz auf eine

Chromatographiesäule (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) gegeben, der Durchfluss verworfen und

jeweils dreimal mit 10 mL Waschpuffer A und Waschpuffer B gewaschen. Die GSH-Sepharose

wurde in 500 μL Elutionspuffer aufgenommen und in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß für 1 h bei

4 °C auf dem Drehrad inkubiert. Der Ansatz wurde erneut auf die Säule gegeben und die Elution

aufgefangen. Es folgte eine Nachelution ohne Inkubation mit 300-500 μL Elutionspuffer. Die

Eluate wurden mit Hilfe des Coomassie-Schnelltests überprüft, positive Eluate vereint und 3 h in

Dialysepuffer I und danach über Nacht in Dialysepuffer II dialysiert.

9. Methoden

82

9.3.3. Affinitätsreinigung getaggter Proteine aus Dictyostelium

Allen Zellaufschlusspuffern wurde je 10 mL Volumen eine Proteinaseinhibitortablette (complete

mini, Roche) zugesetzt.

9.3.3.1. Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)

Tandem Affinitätsreinigung (TAP, tandem affinity purification) wurde ähnlich wie in Puig et al.

beschrieben durchgeführt (Puig et al. 2001). 4-5 x 108 Dictyostelium Zellen (mit pDneo2a_N-TAP,

pDneo2a_N-TAP-DnmA oder pDneo2a_DnmA-C-TAP) wurden durch Zentrifugieren bei 390 rcf

für 5 min geerntet und einmal mit Phosphatpuffer gewaschen. Die Zellen wurden in 15 mL

IPP 150 resuspendiert und fünf- bis zehnmal für 10 s sonifiziert (Amplitude 25, Cycle 0,25). Es

folgte eine Zentrifugation für 20 min bei 4°C mit 10.000 rcf. Vom Überstand wurden zur Analyse

auf dem SDS-Gel 30 µL Probe entnommen und mit dem gleichen Volumen Lämmli-Puffer

versetzt. Von jedem weiteren Schritt wurden ebenfalls 30 µL Probe zur Analyse auf dem SDS-Gel

entnommen.

300 µL IgG-Agarose wurden mit 5 mL IPP150 äquilibriert und anschließend der Überstand für

zwei Stunden mit den Beads inkubiert. Die IgG-Agarose wurde mit Hilfe einer

Chromatographiesäule (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) herausfiltriert und dreimal mit 10 mL

IPP 150 gewaschen. Nachdem die IgG-Agarose beads mit 5 mL TEV cleavage buffer äquilibriert

wurden, erfolgte die Elution für 2 h bei 16°C in 1mL TEV cleavage buffer, der mit 100 u der

AcTEVTM Protease versetzt wurde. Nach der TEV Proteolyse wurden die IgG-Sepharose beads

erneut mit Hilfe der Chromatographiesäule vom Eluat getrennt und mit 200 µL des TEV cleavage

buffers nacheluiert. Der zweite Reinigungsschritt der Tandem Affinitätsreinigung wurde in

dieser Arbeit nicht verwendet. Für Aktivitätstests wurde das Eluat mit Hilfe eines

Zentrifugalfilters (Amicon® Ultra-4) durch Zentrifugieren auf ca. 100-200 µL ankonzentriert

und der Puffer mit 50% Glycerin angereichert.

9.3.3.2. StrepII-Affinitätsreinigung

Für die StrepII-Affinitätsreinigung wurden 5x108 DnmA-StrepII überexprimierende

Dictyostelium Zellen geerntet, mit Phosphatpuffer gewaschen und in 10 mL StrepII-Lysepuffer

resupsendiert. Nach fünfzehnminütiger Inkubation auf Eis wurden unlösliche Zellreste

abzentrifugiert (10.000 rcf, 30 min, 4°C). 200 µL Strep Tactin® SuperflowTM Agarose beads

wurden mit 5 mL StrepII-Lysepuffer äquilibriert und anschließend für 30 min bei 4°C mit dem

Überstand des Lysates auf einem Drehrad inkubiert. Im Anschluss wurde der Überstand

verworfen und die Beads je einmal mit 10 mL und 5 mL StrepII-Waschpuffer gewaschen. Die

9. Methoden

83

Elution erfolgte in fünf Schritten mit je 250 µL StrepII-Elutionspuffer. Die einzelnen Fraktionen

wurden im Coomassie-Schnelltest oder SDS-PAGE überprüft, positive Fraktionen vereint und

über Nacht gegen StrepII-Dialyspuffer dialysiert.

9.3.3.3. Affinitätsreinigung mit der GFP-Nanotrap

Die Reinigung von DnmA-GFP und GFP für den Aktivitätstest im Methylierungsassay erfolgte

prinzipiell analog zu der unter Kapitel 9.3.4.2 (mit Formaldehyd-crosslinking) beschriebenen

Methode. Es wurden 2x108 Zellen eingesetzt, kein Crosslinking durchgeführt und die mit dem

Protein beladenen beads wurden direkt im Methylierungsassay eingesetzt.

Zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (1,5x109 Zellen) wurde das Formaldehyd-

crosslinking durch Crosslinking mit DTBP ersetzt. Dazu wurden die Zellen in 1xPBS mit 5 mM

DTBP resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend folgte ein Waschschritt mit

20 mL Inactivation Buffer sowie ein weiterer Waschschritt mit 1xPBS. Alle weiteren Schritte

erfolgten analog zu Kapitel 2.3.4.2. Von jedem Schritt wurden je 30 µL Probe zur Analyse auf

einem SDS-Gel abgenommen.

9.3.4. Co-Immunopräzipitationen von RNA

9.3.4.1. RNA-IP mit Tandem-Affinitätschromatographie

RNA-Co-Immunopräzipitationen mit TAP-DnmA wurden analog zur Tandem-Affinitätsreinigung

überexprimierter DnmA aus Dictyostelium durchgeführt (Kapitel 9.3.3.1). Für die RNA Analysen

wurden vom Überstand und Durchfluss zusätzlich jeweils 100 µL Probe entnommen, von allen

weiteren Proben 1 mL bzw. der Elution 1,2 mL. Zur Gewinnung der RNA wurden diese Proben

mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt, radioaktiv endmarkiert und

auf einem denaturierenden PAA-Gel analysiert.

9.3.4.2. RNA-CLIP mit der GFP Nanotrap

Mit Formaldehyd-crosslinking

Für Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen wurden DnmA-GFP und GFP exprimierende

Dictyostelium-Zellen (5x107 - 2x109) (Kuhlmann et al. 2005) bei 390 rcf für 5 min abzentrifugiert,

mit Phosphatpuffer gewaschen und in 1-40 mL Phosphatpuffer (1 mL/5x107 Zellen) mit

1% Formaldehyd resuspendiert. Nach 15 min bei 22°C wurde die Crosslinking Reaktion durch

Zugabe von Glycin (125 mM Endkonz.) gestoppt. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 4°C

(10.000 rcf) wurden die Zellen in 1 - 40mL Lysis Buffer resuspendiert und dreimal sonifiziert

9. Methoden

84

(Amplitude 50, Cycle 0,5). Es folgten drei Zentrifugationsschritte bei 10.000 rcf, 15 min, 4°C. Der

Überstand wurde zwischen den Zentrifugationen jeweils in ein neues Gefäß überführt. 250-

300 µL SephadexTM G-50 Medium in 1x TE-Puffer wurden dreimal mit 1 mL Dilution Buffer

äquilibriert (Abzentrifugieren bei 510 rcf) und das Lysat für 15 min bei 4°C auf dem Drehrad mit

den Beads inkubiert. 20-100 µL GBP-NHS-Sepharose (Rothbauer et al. 2008) wurden ebenfalls

mit 1 – 1,5 mL Dilution Buffer äquilibriert (Abzentrifugieren bei 1000 rcf) und der Überstand für

30 min bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert. Es folgten vier Waschschritte mit 0,5 – 2,5 mL

Dilution buffer.

Zur Gewinnung der RNA wurden die Beads in 300 µL Dilution buffer resuspendiert, mit 1 mg/mL

Proteinase K versetzt und für 30 min bei 56°C inkubiert. Je 30 µL Probe des Inputs wurden mit

70 µL Dilution buffer vesetzt und ebenfalls mit Proteinase K und 56°C behandelt. Von den

Waschschritten wurde jeweils 1 mL analysiert. Im Anschluss erfolgte eine Phenol/Chloroform-

Extraktion, die RNA wurde mit Isopropanol gefällt (-20°C üN), mit 70% EtOH gewaschen und in

DEPC-H2O aufgenommen.

Mit UV-crosslinking

Für das RNA-CLIP-Experiment mit UV-crosslinking wurden je 2-4x108 Dictyostelium Zellen

verwendet. Die Zellen wurden geerntet, einmal mit Phosphatpuffer gewaschen und in 20-40 mL

1xPBS resuspendiert. Je 10 mL der Suspension wurden auf eine Petrischale (10 cm

Durchmesser) gegeben. Nach 15 minütiger Ruhe erfolgte das UV-crosslinking bei 250 mJ/cm2 bei

254 nm. Jede Petrischale wurde mit 4 mL RIPA-Puffer (modifiziert) abgewaschen und die Zellen

in ein 15 mL-Reaktionsgefäß überführt. Die Lyse wurde durch drei- bis fünfmaliges Sonifizieren

für je 10s (Amplitude 50, Cycle 0,5) unterstützt. Zentrifugation, Präinkubation mit Sephadex und

Inkubation mit der Nanotrap (60 µL) erfolgte wie oben beschrieben. Das Waschen erfolgte

zweimal mit 1,5 mL stringency RIPA Buffer A und dreimal mit 1,5 mL stringency RIPA Buffer B.

Die GBP-Sepharose wurde mit 1 mL RIPA Equilibration Buffer äqulibriert und die beads in 500-

800 µL Crosslink Reversal Buffer resuspendiert.

Für die Extraktion der RNA wurden vom Input je 30 µL Probe entnommen mit 70 µL Crosslink

Reversal Buffer versetzt und 4,8 µL EDTA (25 mM stock, pH 7,4) hinzugefügt. Die Waschschritte

wurden jeweils mit 4 mM EDTA versetzt und ebenso wie die in Crosslink Reversal Buffer

resuspendierten Beads vollständig weiterverarbeitet. Alle Proben wurden mit 1 mg/mL

Proteinase K versetzt und für 1 h bei 42°C und dann 5 h bei 65°C inkubiert. Phenol/Chloroform

Extraktion und Fällung der RNA erfolgte wie oben beschrieben. Allerdings wurde die Fällung

durch Zugabe von 20 µg Glykogen unterstützt.

9. Methoden

85

9.3.5. RNA Sequenzierung (Next-Generation-Sequenzierung)

Die Next-Generation-Sequenzierung der co-immunopräzipitierten RNA wurde von J. Vogel und

C. Sharma (Zentrum für Infektionsforschung, Universität Würzburg) nach einem etablierten

Protokoll der Abteilung durchgeführt (Sittka et al. 2008).

9.3.6. Präparation von Gesamtprotein aus Dictyostelium discoideum

Für Western-Blot Analysen zur Überprüfung der Expression von Proteinen wurde 1 mL einer

dicht gewachsenen Dictyostelium-Schüttelkultur für 3 min bei 390 rcf abzentrifugiert. Das

Zellpellet wurde in 50-100 μL 5 x Probenpuffer aufgenommen und durch zehnminütiges

Erhitzen auf 95 °C im Heizblock denaturiert.

9.3.7. Fällung von Proteinen

Um Proteine für eine Gelelektrophorese zu konzentrieren, kann eine Fällung mit

Trichloressigsäure erfolgen. Die proteinhaltigen Lösungen wurden je mit dem gleichen Volumen

20%iger TCA-Lösung versetzt und mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurde der

Ansatz mit 20.000 rcf für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das

Pellet mit Aceton gewaschen, getrocknet und in 5 x Probenpuffer aufgenommen (ggf. wurde der

pH-Wert durch Tris-Feststoff wieder eingestellt).

9.3.8. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Für die SDS-PAGE (Laemmli 1970) wurden die Proteinproben mit 1/5 Volumen

5 x Propenpuffer versetzt, für zehn Minuten bei 95 °C denaturiert und im Anschluss sofort auf

Eis gestellt. Die Auftrennung der dentaurierten Proteine erfolgte in 12%igen PAA-Gelen (Tabelle

15) mit 1x Proteingel-Laufpuffer (25 mA/Gel).

Tabelle 15: Komponenten für die SDS-PAGE (ausreichend für 2 Gele).

Komponente 12 % Trenngel Sammelgel

Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) 4,4 mL 450 μL

Protein-Trenngelpuffer 2,64 mL -

Protein-Sammelgelpuffer - 1 mL

H2O 3,4 mL 2,5 mL

250 mM EDTA 43,2 μL 16 μL

TEMED 5 μL 4 μL

APS (20 %) 120 µL 60 µL

9. Methoden

86

9.3.9. Coomassie Färbung

Um die aufgetrennten Proteine nach einer SDS-PAGE sichtbar zu machen, wurden die Gele

zunächst für 10 min mit kochendem destilliertem Wasser überschichtet um SDS aus dem Gel zu

entfernen. Die Inkubation in kollodialer Coomassie-Lösung erfolgte schwenkend über Nacht. Am

nächsten Tag konnte die Färbelösung gegen Wasser gewechselt werden.

9.3.10. Coomassie Schnelltest

Um Proteingehalt von Lösungen semiquantitativ zu bestimmen, wurden 5 µL Proteinhaltige

Lösung auf Whatmann-Papier getropft, 30 s in der Mikrowelle getrocknet und in Coomassie-

Lösung (0,1% CBB G250; 10% HAc) getaucht. Überschüssiges Coomassie wurde mit Wasser

abgespült.

9.3.11. Massenspektrometrie (nanoLC-ESI-MS/MS Analyse)

Die Probenvorbereitung und massenspektrometrische Analyse wurden von O. Bertinetti (Abt.

Herberg, Universität Kassel) durchgeführt. Der In-Gel-Verdau erfolgte nach einem etablierten

Protokoll der Abteilung (Bertinetti et al. 2009). Für die nanoLC-ESI-MS/MS Analyse wurde ein

nanoLC System (NANOLC 1D™ PLUS, eksigent) mit einem QTRAP Massenspektrometer (4000

QTRAP® LC/MS/MS System, AB Sciex) verwendet.

9.3.12. Western Blot

Für Western Blot-Analysen (Renart et al. 1979) wurde das zu blottende Gel auf eine

Nitrozellulosemembran (Towbin et al. 1979) gelegt und zwischen je zwei Lagen mit Semidry-

Blotting Buffer getränkte Filterpapiere eingebettet. Der Transfer wurde für 50 min bei 200 mA

durchgeführt. Im Anschluss wurde die Membran mind. 30 min mit Blockierlösung präinkubiert.

Nach Zugabe des 1. Antikörper (Verdünnung 1:3 bzw. 1:1000 bei kommerziellen AK) folgte eine

weitere Inkubation bei 4°C über Nacht. Anschließend wurde die Membran fünfmal 5 min mit

1 x NCP-Puffer gewaschen und 3h erneut mit dem 2. Antikörper (AP-gekoppelter Ziege-anti-

Maus oder AP-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen, je 1:5000) inkubiert. Nach erneutem Waschen

und Umpuffern in AP-Puffer folgte die Farbreaktion durch Inkubation der Membran in 35 μL

BCIP-Lösung/10 mL AP-Puffer im Dunkeln.

9. Methoden

87

9.3.13. Proteinmengenbestimmung nach Bradford

Die Proteinmengenbestimmung nach

Bradford basiert auf einer Anlagerung eines

Coomassiefarbstoffs an basische

Aminosäuren (Bradford 1976). Für den Test

wurde die Roti-Quant Lösung (Roth) sowie

das Fotometer (Novaspec III, Amersham)

verwendet. Die Eichgerade wurde von

Stephan Wiegand erstellt und diente zur

Quantifizierung der Proteinmenge

(Abbildung 13).

a) Die Bestimmung der Proteinkonzentration zur Referenzierung der fluoreszenz-

spektrometrischen Messungen (in Anlehnung an ein Protokoll der Abt. Zellbiologie,

Universität Kassel): Die Zellpellets aus je 2x106 Zellen wurden in je 300µL

Phosphatpuffer resuspendiert und dreimal in flüsssigem Stickstoff eingefroren und bei

37°C wieder aufgetaut. Die Zelllyse wurde durch mehrmaliges Vortexen unterstützt. Es

folgte eine einstündige Zentrifugation bei 10.000 rcf bei 4°C. Vom Überstand wurden

40 µL in eine 1 mL-Einwegküvette mit 760 µL dest. Wasser überführt und mit 200 µL

Roti-Quant Lösung gemischt. Nach 10 min Inkubation erfolgte die photometrische

Bestimmung bei OD595.

b) Für die Bestimmung der Proteinkonzentration isolierter rekombinanter Proteine

wurden je nach Bedarf zwischen 2-10 µL eingesetzt (790-798 mL dest. Wasser).

9.3.14. 3H-in vitro Methylierungsassay

Die Methylierung von RNA Substraten wurde mit wenigen Änderungen wie in Jurkowski et al.

beschrieben durchgeführt (Jurkowski et al. 2008). Der Reaktionsansatz (Tabelle 16) wurde bei

22°C von 1 min bis zu 3 h inkubiert. Bevor die RNA zum Reaktionsansatz hinzugefügt wurde,

erfolgte eine Präinkubation für 5 min, die der Beladung der MTasen mit radioaktiv markierten

Kofaktor diente. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 mM nicht-radioaktivem SAM (2 µL,

Stock: 10mM) und 1 mg/mL Proteinase K (2 µL, Stock: 20 mg/mL) für 30 min gestoppt. Im

Anschluss wurden die Proben mit dem gleichen Volumen FA-Puffer versetzt und auf 8-12%

denaturiereden PAA-Gelen aufgetrennt. Das Gel wurde mit EtBr gefärbt, zweimal 10-15 min

fixiert (10% MeOH, 10% HAc) und für 1h in Amplify-Solution inkubiert. Nach Trocknen des Gels

bei 60-70°C für 1-3 h erfolgte eine Exposition auf einen für 16h bis zu 4 Wochen.

Eichgerade für Bradford-Assay

0 5 10 15 200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

y = 0,04611x

R2 = 0,989

BSA [µg]

OD

59

5

Abbildung 13: Eichgerade (mit BSA) zur Bestimmung der Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.

9. Methoden

88

Tabelle 16: Reaktionsansatz eines Methylierungsassays.

9.3.15. 3H-in vitro Shift-Assay

Der 3H-in vitro Shift-Assay macht sich die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten von

einzelsträngigen und doppelstängigen Nukleinsäuren (in diesem Fall RNA/DNA Hybriden)

zunutze. Zunächst erfolgte ein Methylierungsassay wie in Kapitel 9.3.14 beschrieben. Nach

Stoppen der Reaktion wurde das gewünschte Oligonukleotid zum Reaktionsansatz pipettiert

(5 µL Oligonukleotid; Stock: 10 µM je Oligonukleotid in STE-Puffer). Der Reaktionsansatz wurde

in einem Thermocycler für 5´ bei 80°C erhitzt, dann für 3´ bei 78°C inkubiert. Darauf folgte eine

Temperaturabsenkung auf 75°C und je eine weitere Absenkung um 5°C nach jeder weiteren

Minute bis eine Temperatur von 20°C erreicht war. Die Proben wurden daraufhin mit nativem

RNA-Auftragspuffer versetzt und auf einem nativen PAA-Gel (6%) aufgetrennt.

9.3.16. 3H-in vitro Blockierungs-Assay

Der 3H-in vitro Blockierungs-Assay basiert auf der Annahme, dass Methylierung am

Zielnukleotid einer RNA nicht mehr erfolgen kann, wenn diese Stelle durch Hybridisierung mit

einem DNA Oligonukleotid „blockiert“ ist. Dazu wurde die gewünschte Menge RNA (500 ng

Transkript oder 10 µg kleine angereichte RNA) mit 5 µL Oligonukleotid (Stock: 10 µM je

Oligonukleotid in STE-Puffer) versetzt und wie in Kapitel 9.3.15 beschrieben hybridisiert. Dieser

Ansatz wird danach für einen Methylierungsassay (Kapitel 9.3.14) eingesetzt.

Reaktionsansatz

3 -6 µM

3 -12 µM

His6-hDnmt2 oder

His6-DnmA

2 µL 10x Methylierungspuffer

2µL [3H]-SAM (Endkonz.: 1,7 µM)

1 u/µL RiboLock™ RNase Inhibitor

5 min Präinkubation

500 ng

20 µg

10 µg

(t)RNA-Transkript oder

Gesamt-RNA oder

angereicherte kleine RNA aus Dictyostelium

ad 20 µL UV-H2O

9. Methoden

89

9.4. Biophysikalische Methoden

9.4.1. Probenvorbereitung für Atomic Force Microscopy

Für die Abbildung des Bindeverhaltens des EhMLBP-Proteins an methylierte DNA mittels Atomic

force microscopy (AFM) wurde affinitätsgereinigtes GST-EhMLBP C-ter verwendet. RT-LINE DNA

wurde unter Verwendung von dm5CTP amplifiziert (Kapitel 9.2.16) und anschließend

elektroeluiert (Kapitel 9.2.19). Der folgende Reaktionsansatz wurde in angebender Reihenfolge

pipettiert und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Tabelle 17: Reaktionsansatz für AFM Messungen.

Reaktionsansatz

1,8 µL 5x Bindepuffer

1 µL DTT (5mM)

15 pmol RT-LINE DNA

1,5 µL GST-EhMLBP C-ter (2,7 µM)

ad 10 µL ddH2O (filtriert 0,1 µm)

In der Zwischenzeit wurde die Glimmeroberfläche vorbereitet, indem mit einem Stück

Klebestreifen die oberste Glimmerschicht abgezogen wurde. Im Anschluss wurden 1 μL des

Ansatzes mit 30 μL Rivetti-Puffer verdünnt für 1 min auf dem Glimmer inkubiert. Nach

dreimaligem Waschen mit 1 mL sterilfiltriertem Wasser wurde die Oberfläche mit Stickstoff

getrocknet.

9.4.2. AFM Imaging

Die nach Kapitel 9.4.1 vorbereiteten Proben wurden mit einem AFM Multimode mit Nanoscope

3A Controller (Bruker) im Tapping mode (in Luft) analysiert. Dazu wurden Tap 300AL-G

Cantilever (Nanoandmore) verwendet. Die Messungen erfolgten mit einer Auflösung von

512x512 Pixel, einer Scanrate von 1,5 Hz sowie einer Scangröße von 3 µm. Die Auswertung der

Daten erfolgte mit Image J.

10. Ergebnisse

90

10. Ergebnisse

Alle Bilder der Methylierungsassays sind mit Corel Draw Graphics Suite X3 in das Bitmap-Format

(Graustufen, 8bit, 300 dpi) konvertiert. Um den dabei entstehenden Kontrastverlust auszugleichen sind

die Bilder zusätzlich mit der Funktion „automatische Kontrastanpassung“ bearbeitet.

10.1. In vitro Methylierung von Nukleinsäuren aus Dictyostelium durch Dnmt2-

Homologe

In vitro-Methylierungsstudien mit humaner Dnmt2 (hDnmt2) zeigten, dass Gesamt-RNA aus

Dictyostelium discoideum im Bereich der tRNA-Fraktion methyliert werden kann (Jurkowski et

al. 2008). Dieses Kapitel der vorliegenden Arbeit adressiert die Frage, inwiefern das Dnmt2-

Homolog aus Dictyostelium (DnmA) ebenfalls als tRNA Methyltransferase aktiv ist und welche

(t)RNAs aus Dictyostelium als Substrate dienen können. Dabei wurden die in vitro

Methylierungsstudien mit DnmA überwiegend vergleichend zur hDnmt2 durchgeführt.

10.1.1. Heterologe Expression und Reinigung von Dnmt2-Homologen aus E. coli

Für die Methylierungs- und Bindungsstudien in vitro wurden die Dnmt2-Homologe hDnmt2

(H. sapiens), DnmA (D. discoideum) und Pmt1 (S. pombe) rekombinant in E. coli exprimiert und

mittels immobilisierter Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt (Kapitel

9.3.2.1). Im Verlauf der Arbeit stellte sich heraus, dass rekombinante His6-DnmA deutlich

schwächere Methylierungsaktivitäten zeigte als das humane Homolog. Eine Umklonierung von

DnmA aus dem Vektor pET15b in den Vektor pET28a(+) konnte die Aktivität des rekombinanten

Enzyms erhöhen (Abbildung 14 und Daten nicht gezeigt).

Abbildung 14 zeigt SDS-PAGEs mittels IMAC gereinigter und anschließend durch Dialyse

konzentrierter Dnmt2-Homologe (mit His6-tag). hDnmt2 (berechnetes MW: 46,7 kD) und Pmt1

(berechnetes MW: 40,5 kD) entsprechen in ihrem Laufverhalten dem kalkulierten

Molekulargewicht. DnmA zeigt mit einer Bande bei ca. 50 kD eine Abweichung, da die

berechneten Molekulargewichte 46,2 kD (im pET15b Vektor) und 44,1 kD (im pET28a(+)

Vektor) betragen.

10. Ergebnisse

91

Abbildung 14: SDS-PAGE (12%) der Dnmt2-Homologe mit His6-tag nach IMAC. Gezeigt sind mittels pET15b Vektor exprimierte His6-DnmA (240 pmol) im Vergleich zu His6-hDnmt2 (60 pmol) (A) und mittels pET28a(+) exprimierte His6-DnmA (60 pmol) im Vergleich zu His6-hDnmt2 und His6-Pmt1 (je 60 pmol) (B). Die eingesetzten Mengen entsprechen der Masse an Protein, die pro Methylierungsassay verwendet wurde. Marker: PageRuler™ Unstained Protein Ladder (Fermentas)

10.1.2. Das Dictyostelium Dnmt2-Homolog DnmA methyliert tRNA in vitro

Um rekombinant exprimierte His6-DnmA auf ihre RNA Methylierungsaktivität zu untersuchen,

wurden 3H-in vitro Methylierungsstudien (Kapitel 9.3.14) durchgeführt. Als Substrat wurde

Gesamt-RNA oder aus Gesamt-RNA angereicherte kleine RNA aus verschiedenen Dictyostelium

Stämmen verwendet.

DnmA ist eine aktive tRNA Methyltransferase

Erste Experimente zeigten, dass rekombinante DnmA in vitro als tRNA Methyltransferase aktiv

ist. Die Reaktionstemperatur musste jedoch im Vergleich zur hDnmt2 auf 22°C, der optimalen

Wachstumstemperatur für Dictyostelium-Zellen, gesenkt werden, da DnmA bei 37°C keine

Methylierungsaktivität zeigte (Abbildung 15A). Alle weiteren Experimente wurden bei 22°C

durchgeführt, da die hDnmt2 in einem Vergleichsexperiment keine verminderte Aktivität bei

dieser Temperatur zeigte (Daten nicht gezeigt).

Ein Timecourse mit rekombinanter DnmA über einen Zeitraum von 180 min ergab, dass nach ca.

80-100 min keine weitere Inkorporation von Radioaktivität in die RNA mehr stattfindet

(Abbildung 15B). Dies entspricht dem Reaktionsverlauf hDnmt2 (Jurkowski et al. 2008).

Allerdings trifft diese Beobachtung nur auf die obere Bande der im Methylierungsassay zu

sehenden Signale zu. Die untere Bande erscheint erst nach 40-60 min und erreicht zwischen

A B

10. Ergebnisse

92

100-120 min ihr Maximum. Dieses Ergebnis weist daraufhin, dass vermutlich mehr als eine

tRNA durch DnmA methyliert werden kann (siehe auch Kapitel 10.1.5). Allerdings kann ebenfalls

nicht ausgeschlossen werden, dass die untere Bande ein Degradationsprodukt darstellt.

Abbildung 15: Das Dnmt2-Homolog DnmA aus Dictyostelium ist eine aktive tRNA Methyltransferase in vitro. Gezeigt sind zwei 3H-Methylierungsassays mit rekombinanter His6-DnmA aus E. coli und angereicherten kleinen RNAs aus Dictyostelium. Im Gegensatz zur hDnmt2 (nicht gezeigt) ist DnmA temperatursensitiver und nur bei 22°C, der optimalen Wachstumstemperatur von Dictyostelium, methylierungsaktiv (A). Timecourse der Methylierung von angereicherter kleiner RNA durch His6-DnmA (B). Exposition: 16 h

Die Methylierbarkeit von tRNA aus Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO-Zellen

Durch vergleichende in vitro Methylierungsstudien von RNA aus Dictyostelium Wildtyp- und

dnmAKO-Zellen wurde indirekt der in vivo-Methylierungstatus der tRNAs untersucht: Eine aktive

DnmA in vivo führt zu einer verminderten Inkorporation von radioaktiven Methylgruppen in die

RNA in vitro. Dieses Experiment wurde vielfach wiederholt und führte zu verschiedenen

Ergebnissen. Abhängig von der RNA-Präparation traten starke bis keine Unterschiede in der in

vitro-Methylierbarkeit der RNA aus Wildtyp- und dnmAKO-Zellen auf (Abbildung 16). Die

wechselnde Methylierbarkeit der RNA aus Wildtyp- und dnmAKO-Zellen steht im Einklang mit

Ergebnissen einer Bestimmung des Methylierungsstatus der tRNAAsp aus Drosophila, die eine

Varianz der C38 Methylierung von 40-70% zeigen (pers. Mitteilung M. Schäfer, DKFZ Heidelberg,

siehe auch Kapitel 11.1.2 der Diskussion).

A B

10. Ergebnisse

93

Ein in vitro Methylierungsassay mit angereicherter kleiner RNA aus Cytoplasma im Vergleich zu

RNA aus angereicherten Zellkernen, gibt einen Hinweis auf eine verstärkte in vivo Methylierung

von tRNA im Zellkern (Abbildung 17). Dies würde eine nukleäre Funktion der überwiegend im

Zellkern lokalisierten DnmA stützen.

Da sich die Expression vieler Gene sowie die Aktivität einiger Proteine in Dictyostelium mit

Eintritt in die Entwicklung verändert, sollte dieser Einfluss auch bezüglich der Methylierbarkeit

der tRNA durch DnmA untersucht werden. Zusätzlich ist bezüglich der DnmA abhängigen

Regulation des Retrotransposons skipper ein Effekt bei der Langzeitkultivierung von Zellen

gezeigt worden (Kuhlmann et al. 2005), so dass ebenfalls ein Langzeiteffekt auf die tRNA

Methylierung überprüft werden sollte. In weiteren Experimenten wurde daher RNA aus

Wildtyp- und dnmAKO-Zellen, die vier Stunden in Phosphatpuffer kultiviert und damit die ersten

vier Stunden der Entwicklung durchlaufen haben, sowie über 28 Monate in Schüttelkultur

gewachsene Zellen getestet. Die zugehörigen in vitro Methylierungsassays gaben keinen

Abbildung 16: In vitro Methylierung angereicherter kleiner RNA aus Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO Stämmen mit His6-hDnmt2 und His6-DnmA aus E. coli. Je nach RNA Präparation wird die tRNA Fraktion aus Wildtyp- (1) und dnmAKO-Zellen (2) mit unterschiedlicher Effizienz methyliert.

Abbildung 17: In vitro Methylierungsassay mit His6-DnmA und kleiner angereicherter RNA aus Dictyostelium Wildtyp- (1) und dnmAKO–Zellen (2). Dem Experiment ging eine Zellfraktionierung in Kern und Cytoplasma voraus.

10. Ergebnisse

94

weiteren Hinweis darauf, dass einer dieser Einflüsse zu verstärkter tRNA Methylierung durch

DnmA in vivo führt (Daten nicht gezeigt).

In vitro Methylierungsanalysen mit Dictyostelium DnmA-Überexpressions-Stämmen

Aus Dictyostelium gereinigte TAP-getaggte DnmA ist ebenfalls methylierungsaktiv (Abbildung

16B), aber auch bei diesem Enzym variierten die Methylierungseffizienzen in Abhängigkeit von

der RNA Präparation (Abbildung 18A und vgl. Abbildung 16). Grundsätzlich ist anzumerken,

dass die Methylierungssignale der TAP-getaggten DnmA durch auf einem SDS-Gel fast nicht

sichtbare Menge an Protein generiert wurden (Abbildung 18B).

Abbildung 18: In vitro Methylierung mit TAP-getaggter DnmA aus Dictyostelium. Aus Dictyostelium isolierte TAP-getaggte DnmA ist unabhängig von der Position des Tags methylierungsaktiv. Zum Aktivitätsvergleich ist eine Methylierungsreaktion mit His6-DnmA aus E. coli dargestellt (A). Für den Assay aus (A) wurde angereicherte kleine RNA aus Wildtypzellen (1) und angereicherte kleine RNA aus dnmAKO-Zellen (2) verwendet. SDS-PAGE zum Vergleich der im Methylierungsassay eingesetzten Konzentrationen an DnmA-C-TAP und His6-getaggten Enzym (60 pmol) und Western-Blot zum Nachweis von DnmA-C-TAP (* Volllänge-Protein) (B). Gereinigte DnmA-C-TAP wurde freundlicherweise von V. Maximov zur Verfügung gestellt.

Für isolierte DnmA aus DnmA-GFP und DnmA-StrepII Überexpressionsstämmen (mit dnmAKO-

Hintergrund) konnte ebenfalls Methylierungsaktivität in vitro nachgewiesen werden (Abbildung

19). Massenspektrometrische Analysen von DnmA-StrepII ergaben zwei putative

posttranslationale Phophorylierungsstellen (Maximov 2010). Ein Einfluss auf die Aktivität durch

eine mögliche Phosphorylierung erscheint nach einem ersten Aktivitätstest mit CIAP

behandelter DnmA-StrepII als unwahrscheinlich (Abbildung 19B).

A B

10. Ergebnisse

95

In weiteren Experimenten wurde die Methylierbarkeit von tRNAs aus den genannten

Überexpressionsstämmen mit His6-DnmA und His6-hDnmt2 aus E. coli untersucht. Gesamt-RNA

aus DnmA-GFP überexprimierenden Zellen wurde reproduzierbar durch rekombinante His6-

DnmA kaum in vitro methyliert (Abbildung 20A). RNA aus dem DnmA-Überexprimierer mit

StrepII-tag wurde ebenfalls wie RNA aus Wildtyp Zellen manchmal stark und manchmal nur

sehr schwach methyliert. Eine Northern-Blot Analyse zur Bestimmung der dnmA mRNA-Menge

in den beiden Überexprimierern, um damit indirekt auf den Proteingehalt und die damit

verbundene Aktivität schließen zu können, zeigte keine gravierende Unterschiede der

Expression (Abbildung 20B).

Abbildung 20: In vitro Methylierung von RNA aus DnmA-GFP (2) und DnmA-StrepII (1) Überexpressionsstämmen (A). Northern-Blot zum Nachweis von DnmA in verschiedenen Dictyostelium Stämmen (B). Die Expression von DnmA im Wildtyp ist so gering, dass sie unter der Detektionsgrenze des Northern Blots liegt.

Abbildung 19: In vitro Methylierung mit isolierter DnmA-GFP und DnmA-StrepII aus Überexpressionsstämmen. DnmA-GFP wurde mit Hilfe der GFP-Nanotrap angereichert und an die Beads gekoppelt in den Methylierungs-assay eingesetzt. Trotz Immobilisierung ist das Enzym ebenfalls methylierungsaktiv (A). Methylierungsassay von DnmA-StrepII mit und ohne vorherige Behandlung des Proteins mit CIAP (B). Für die Assays wurde aus Gesamt RNA angereicherte kleine RNA aus dnmAKO-Zellen verwendet. .

A B

A B

10. Ergebnisse

96

Auffällig ist jedoch, dass His6-hDnmt2 die RNA aus beiden DnmA-Überexprimierern

reproduzierbar methyliert (Abbildung 20A). Wie später gezeigt werden konnte, ist die Präferenz

für in vitro Methylierung von tRNAAsp von DnmA stärker ausgeprägt als bei hDnmt2. Vermutlich

kommt bei hDnmt2 die grundsätzlich stärkere Methylierungsaktivität auf anderen Substraten

(wie z.B. tRNAGlu) bei der Methylierung der RNA aus DnmA-Überexprimieren zum Tragen.

Aus den erhobenen Daten lässt sich schlussfolgern, dass DnmA Aktivität in vivo von

möglicherweise schwer kontrollierbaren Umwelt- oder Wachstumsbedingungen, die bisher

nicht identifiziert werden konnten, abhängig ist (siehe auch Kapitel 11.1.3 der Diskussion).

10.1.3. Identifizierung von potentiellen tRNA-Substraten aus Dictyostelium

Aus den bisher vorgestellten Experimenten ergibt sich die Frage, welche tRNAs aus

Dictyostelium von Dnmt2-Homologen methyliert werden. Einer Hypothese zu Folge modifiziert

hDnmt2 die Position C38 einer tRNA, wenn an den Positionen 32, 37 und 40 die Nukleotide

Cytosin, Adenosin und wieder Cytosin zu finden sind (unveröffentlichte Daten, M. Helm,

Johannes-Gutenberg-Universität Mainz) (Abbildung 21).

Zur Identifizierung potentieller tRNA-Substrate aus Dictyostelium wurden die in der Dictybase

(http://dictybase.org/) annotierten tRNAs auf das vorgeschlagene Sequenzmuster untersucht

(Abbildung 22). Neben der tRNAAsp zeigt nur die tRNAGlu das vollständige Erkennungsmuster.

Auffällig hierbei ist das ausschließliche Vorkommen von 22 identischen tRNAAsp(GUC) Genen,

obwohl Aspartat auch durch die tRNAAsp(AUC) translatiert werden kann (Dieses Phänomen wird in

Kapitel 10.3.1 näher betrachtet). Bei der tRNAGlu zeigen alle 19 chromosomal kodierten

tRNAGlu(UUC) das Muster sowie eine der drei tRNAGlu(CUC).

Abbildung 21: Vorgeschlagenes Sequenz-muster zur Erkennung von Substrat-tRNA durch Dnmt2- Homologe. Die Methylierung findet an der Position C38 statt, wenn die tRNA die Nukleotide C32, A37 und C40 enthält.

10. Ergebnisse

97

Abbildung 22: Ausgewählte tRNAs aus Dictyostelium, die das vorgeschlagende Sequenzmuster zur Substraterkennung durch Dnmt2 vollständig oder teilweise enthalten. Dargestellt sind der Sequenzbereich des Anticodonloops sowie einige Nukleotide up- und downstream davon. Nukleotide des Sequenzmusters sind in Magenta, das Zielnukleotid C38 in Rot hervorgehoben. Das Anticodon ist durch Fettdruck markiert. Alle schwarz gedruckten tRNAs wurden in Methylierungsassays getestet.

10.1.4. tRNAAsp und tRNAGlu sind in vitro Substrate von Dnmt2-Homologen

Zur Überprüfung der Hypothese zur Substraterkennung aufgrund des postulierten

Sequenzmusters wurden die Gene der in Abbildung 22 aufgeführten tRNAs mittels rekursiver

PCR generiert, kloniert, in vitro transkribiert und auf eine Funktion als in vitro Substrat getestet.

Aufgrund identischer Sequenzen up- und downstream des Anticodons der beiden tRNAGlu wurde

ausschließlich die tRNAGlu(UUC) für Experimente verwendet.

tRNAAsp und tRNAGlu werden mit unterschiedlicher Effizienz methyliert

In vitro transkribierte tRNAAsp aus Dictyostelium dient ebenfalls als Substrat für DnmA und

hDnmt2 (Abbildung 23). Als optimale Magnesiumkonzentration für die Methylierung konnten

5 mM ermittelt werden. Eine Konzentration von 10 mM Mg2+-Ionen führen im Zeitraum von

60 min nahezu zu einem kompletten Verlust des radioaktiven Signals. Bei optimaler

Magnesiumkonzentration zeigen hDnmt2 und DnmA eine sehr ähnliche Kinetik hinsichtlich der

Methylierung der tRNAAsp. Die Umsetzung ist nach ca. 30 min abgeschlossen (Abbildung 23B und

Daten nicht gezeigt).

10. Ergebnisse

98

Abbildung 23: Timecourse der Methylierung von tRNAAsp. Die Methylierung ist sensitiv gegenüber der Magnesiumkonzentration (A). Methyliertes Produkt akkumuliert über einen Zeitraum von ca. 30 min, wobei DnmA und hDnmt2 ähnliche Kinetiken zeigen (A, B).

tRNAGlu(UUC) wird ebenfalls von beiden Dnmt2-Homologen modifiziert jedoch mit deutlich

geringerer Effizienz als tRNAAsp(GUC) (Abbildung 24A). Durch gerichtete Mutation des potentiellen

Zielnukleotids C38 zu A konnte dieses Cytosin als Target identifiziert werden. Ein antisense

Transkript der tRNAGlu(UUC) diente als zusätzliche Negativkontrolle (Abbildung 24B).

A B

Abbildung 24: In vitro Methylierung von Dictyostelium tRNAAsp(GUC), tRNAGlu(UUC) und suppressor tRNAGlu(CUA) durch DnmA und hDnmt2. Die Methylierungsreaktion wurde mit rekombinanten Dnmt2-Homologen sowie in vitro transkribierter tRNA durchgeführt. Das Zielnukleotid für die Methyltransferasen ist das C38 im Anticodonloop (A). Antisense (as) trans-kribierte tRNAGlu dient nicht als Substrat für DnmA und hDnmt2 (B).

A

B

10. Ergebnisse

99

Um den Einfluss des Anticodons auf die Substraterkennung durch Dnmt2 zu untersuchen, wurde

zusätzlich die synthetisch hergestellte suppressor tRNAGlu(CUA) verwendet (Dingermann et al.

1990). Abbildung 24A (links) lässt eine unterschiedliche Präferenz von hDnmt2 und DnmA

bezüglich der Methylierung von tRNAGlu und suppressor tRNAGlu vermuten, was in

Folgeexperimenten jedoch nicht bestätigt werden konnte (rechts). Möglicherweise spielt hierbei

jedoch auch die größere Instabilität der tRNAGlu(UUC)-Transkripte eine Rolle (siehe EtBr-Färbung

Abbildung 24 rechts).

Ein Timecourse mit der suppressor tRNAGlu(CUA) zeigt, dass das methylierte Produkt mindestens

über einen Zeitraum von zwei Stunden akkumuliert und damit deutlich langsamer abläuft als

mit der tRNAAsp (Abbildung 25A). Auch hier konnte die optimale Magnesiumkonzentration von

5mM bestätigt werden (Abbildung 25B).

Abbildung 25: In vitro Methylierung der suppressor tRNAGlu(CUA) mit DnmA und hDnmt2. Radioaktives Produkt akkumuliert über einen Zeitraum von mindestens zwei Stunden (A). Ebenso wie für die tRNAAsp liegt die optimale Mg2+-Konzentration bei 5 mM (90 min Inkubationszeit) (B).

Alle getesteten tRNAs ohne vollständiges Erkennungsmuster sind keine DnmA-Substrate

Alle getesteten tRNAs, die zwar ein C38, aber das vorgeschlagene Erkennungsmuster im

Gegensatz zur tRNAAsp und tRNAGlu nicht oder nur unvollständig enthalten, konnten weder durch

DnmA noch durch hDnmt2 effizient methyliert werden (Abbildung 26).

A B

10. Ergebnisse

100

Abbildung 26: In vitro Methylierungsassay mit Dictyostelium tRNAs, die C38, aber das vorgeschlagene Sequenzmuster für die Substraterkennung durch Dnmt2 nicht oder nur unvollständig zeigen. Bei keiner dieser tRNAs konnte - auch nach langer Expositionszeit (Daten nicht gezeigt) – Inkorporation von Radioaktivität nachgewiesen werden. Die Mehylierungsreaktion wurde mit rekombinanten Dnmt2-Homologen sowie in vitro transkribierter tRNA durchgeführt. Positivkontrolle: tRNAAsp(GUC), Negativkontrolle: tRNAPhe(GAA).

Dnmt2 vermittelte Methylierung benötigt keine prozessierten Enden der tRNAs

Alle in dieser Arbeit getesteten in vitro transkribierten tRNAs zeichnen sich durch ein GGG oder

GCG am 5´ Ende als Startpunkt für T7 Polymerase aus und sind am 3´ Ende aufgrund der

klonierten Restriktionsschnittstellen zur Linearisierung der Plasmide um zwei bis fünf

Nukleotide länger. Weder das Tragen einer Aminosäure noch das Vorhandensein des CCA-

Trinukleotids scheinen für die Substraterkennung durch DnmA essentiell. Wie aus vorherigen

Experimenten bekannt, sind ebenso andere Modifikationen keine Voraussetzung für C38

Methylierung (Jurkowski et al. 2008). Für rasterkraftmikroskopische Bindungsstudien wurden

die tRNA Substrate in ein gus-PSTVd Konstrukt kloniert, in dem die tRNA in ein langes, teilweise

doppelsträngiges Transkript eingebettet ist (Bonin et al. 2001; Schöne 2009) (Abbildung 27A).

Methylierungsstudien mit diesen Transkripten zeigten, dass die tRNAs auch in diesem Kontext

methyliert werden können. Eine Dnmt2 vermittelte Methylierung von tRNA Präkursoren wäre

damit vorstellbar.

A B

Abbildung 27: In vitro Methylierung der GUS-PSTVd tRNAGlu(CUA) mit His6-DnmA und His6-hDnmt2. Schematische Zeichnung der gefalteten gus-PSTVd RNA (gus (β-Glucuronidase) blau, PSTVd (potato spindle tuber

viroid), grün) mit integrierter tRNA (rot) (A) (Entnommen aus Anspach 2009). Nur gus-PSTVd mit in sense Orientierung integrierter tRNA dient als in vitro Substrat der Methyltransferasen (B). 1: gus-PSTVd RNA, 2: gus-PSTVd tRNAGlu(CUA) sense, 3: gus-PSTVd tRNAGlu(CUA) antisense. Die Transkripte wurden von A. Schöne zur Verfügung gestellt.

10. Ergebnisse

101

10.1.5. RNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen

Nachdem in vitro transkribierte tRNAAsp und tRNAGlu als Substrate für DnmA und hDnmt2

identifiziert wurden, stellt sich die Frage, ob auch beide tRNAs in Gesamt-RNA methyliert

werden.

Um dies zu untersuchen wurde ein Experiment entwickelt, bei dem die RNA nach der in vitro

Methylierungsreaktion mit einem anti-tRNAAsp-Oligonukleotid hybridisiert und in einem nativen

Polyacrylamidgel aufgetrennt wurde (Abbildung 28). Das Oligonukleotid wurde im Überschuss

eingesetzt, so dass alle tRNAAsp Moleküle als RNA-DNA-Hybrid vorliegen und im Gel verminderte

Mobilität zeigen sollten.

Abbildung 28: Prinzip des 3H-Shift-Assays. Blau und gün: verschiedene tRNAs, rot: anti-tRNA-Oligonukleotid, gelb: radioaktive CH3-Gruppe.

Dieses Gelretardierungsexperiment führte zum vollständigen Shift des radioaktiven Signals in

den Spuren, bei denen die RNA zuvor durch DnmA methyliert wurde (Abbildung 29). In der Spur

des Methylierungsassays mit hDnmt2 verblieb jedoch ein deutliches Signal mit höherer

Mobilität. Nach zweiwöchiger Expositionszeit konnte in den Spuren mit DnmA ebenfalls ein

verbleibendes Signal mit erhöhter Mobilität detektiert werden (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 29: Fluorogramm eines in vitro Shift-Assays mit angereicherter kleiner RNA aus dnmAKO-Zellen und rekombinanter DnmA und hDnmt2. Die RNA wurde nach der 3H-Methylierungsreaktion mit einem anti-tRNAAsp Oligonukleotid hybridisert. Exposition: 16h

10. Ergebnisse

102

Um herauszufinden, ob das verbleibende Signal von einer Methylierung der tRNAGlu verursacht

wurde, wurde ein weiteres Experiment entwickelt. Dazu wurde angereicherte kleine RNA

einmal zuerst mit einem anti-tRNAAsp-Oligonukleotid und ein zweites Mal zusätzlich mit einem

anti-tRNAGlu-Oligonukleotid hybridisiert. Die Oligonukleotide überdeckten den gesamten

Bereich des Anticodonstem- und loops und sollten damit die tRNA für Dnmt2 unzugänglich

machen (Abbildung 30). Ziel war es, auf diese Weise schwache Methylierung potentieller

weiterer Substrate sichtbar zu machen.

Abbildung 30: Prinzip des 3H-Blocking-Assays. Blau und grün: verschiedene tRNAs, rot: anti-tRNA-Oligo-ukleotid, gelb: radioaktive CH3-Gruppe.

Die Methylierung in vitro transkribierter tRNAAsp wurde durch vorherige Hybridisierung mit

einem anti-tRNAAsp-Oligonukleotid, welches das Zielnukleotid überdeckt, vollständig blockiert

(Abbildung 31A).

Abbildung 31: In vitro 3H-Blockierungsassay mit His6-DnmA und His6-hDnmt2. Durch vorherige Hybridisierung mit einem anti-tRNAAsp Oligonukleotid kann die 3H-Methylierung eines in vitro Transkriptes der tRNAAsp vollständig blockiert werden (A). Blockierung von angereicherter kleiner RNA mit einem anti-tRNAAsp oder einem anti-tRNAAsp und anti-RNAGlu Oligonukleotid führt nicht zum vollständigen Verlust der Methylierungssignals (B).

A B

10. Ergebnisse

103

Im Gegensatz dazu konnte die in vitro Methylierung der tRNA-Fraktion angereicherter kleiner

RNA aus Dictyostelium durch Zugabe des anti-tRNAAsp-Oligonukleotids nicht vollständig

blockiert werden. Von den verbleibenden zwei Banden konnte jedoch die untere durch

vorherige zusätzliche Hybridisierung mit einem anti-tRNAGlu-Oligonukleotid eliminiert werden

(Abbildung 31B). Interessanterweise verblieb eine weitere radioaktive Bande, welche einen

Hinweis darauf lieferte, dass Dnmt2 möglicherweise noch weitere Substrate methyliert. Bei der

verbleibenden Bande kann es sich nicht um die zweite tRNAGlu mit CUC-Anticodon handeln, da

sich die verschiedenen tRNAGlu kaum voneinander unterscheiden und die wenigen

Fehlpaarungen die Hybridisierung des Oligonukleotids nicht beeinträchtigen sollten (Abbildung

32).

Abbildung 32: Alignments der tRNAGlu(UUC) und tRNAGlu(CUC) aus Dictyostelium. Identische Nukleotide in allen drei tRNAs sind in Rot, identische Nukloetide in zwei tRNAs blau und abweichende Nukleotide in Grün dargestellt. Das Anticodon ist schwarz.

10.1.6. Der in vivo Methylierungsstatus ausgewählter tRNAs in Dictyostelium

Mittels RNA-Bisulfitsequenzierung (Schaefer et al. 2009c) wurde in Kooperation mit Robin

Lorenz und Matthias Schäfer (Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg) der in vivo Methylierungsstatus der

tRNAAsp(GUC), tRNAGlu(UUC/CUC) und tRNAVal(AAC) aus Dictyostelium Wildtyp-, verschiedenen dnmAKO-

und DnmA-Überexpressionsstämmen bestimmt. 30% der tRNAAsp Sequenzen aus Wildtypzellen

zeigten eine Methylierung der Position 38, die in den beiden analysierten dnmA-Knockout-

Mutanten nicht detektierbar war (Abbildung 33). Alle tRNAs waren unabhängig von DnmA an

der Position C48 methyliert. Aus S. cerevisae ist bekannt, dass diese Position von TRM4

methyliert wird (Motorin et al. 1999). Eine Hitzeschockbehandlung der Dictyostelium Zellen bei

30°C über einen Zeitraum von zwei Stunden scheint keinen Einfluss auf DnmA abhängige C38

Methylierung zu haben (Abbildung 33).

10. Ergebnisse

104

Abbildung 33: In vivo Methylierungsstatus der Cytosine in tRNAAsp(GUC) aus verschiedenen Dictyostelium Stämmen. Ergebnisse der RNA-Bisulfitsequenzierung (454-Seqeuencing) sind in Prozent für die einzelnen Cytosin-Positionen angegeben. Die Zahl der Sequenzierungen ist in Klammern in der jeweiligen Überschrift des Diagramms angegeben. Die Daten wurden freundlicherweise von Robin Lorenz zur Verfügung gestellt.

10. Ergebnisse

105

Überexpression von DnmA-GFP im dnmAKO-Hintergrund führt zu einer 100%igen Methylierung

des C38 in der tRNAAsp. Allerdings ist die Methylierung aller Cytosine in dieser tRNA erhöht.

Überexpression humaner Dnmt2 in Dictyostelium Wildtyp-Zellen führt einem Anstieg der C38

Methylierung auf ca. 50%. Möglicherweise liegt dies an der unterschiedlichen Lokalisation von

DnmA-GFP und hDnmt2-GFP begründet (siehe Kapitel 10.7.1). Eine unvollständige Konversion

der Cytidine zu Uridinen bei der Bisulfitbehandlung der RNA aus dem DnmA-

GFP/dnmAKO-Stamm kann jedoch ebenfalls nicht ausgeschlossen werden. Die Zunahme der

Methylierung in dem hDnmt2-Überexpressionsstamm gibt jedoch erstmals einen Hinweis auf

speziesübergreifende Dnmt2 Aktivität. In tRNAGlu und tRNAVal konnte keine DnmA abhängige

Cytosinmethylierung detektiert werden. tRNAGlu zeigte lediglich 100% Methylierung der Position

C49 und 10-50% Methylierung der Position 60 (Daten nicht gezeigt). Da die verwendete

Methode möglicherweise auf unmodifizierte tRNAs selektiert, kann dies nicht als eindeutiger

Hinweis für Nicht-Methylierung der tRNAGlu in vivo gedeutet werden.

10.1.7. Das Dnmt2-Homolog Pmt1 aus S. pombe ist eine aktive tRNA Methyltransferase

S. pombe gehört wie D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica zu den „Dnmt2-only“-

Organismen. Das Dnmt2-Homolog von S. pombe Pmt1 beinhaltet im Gegensatz zu anderen

Dnmt2-Homologen jedoch in dem konservierten katalytischen Motiv IV eine Mutation, bei der

ein Prolin gegen ein Serin ausgetauscht ist (PPCQ zu PSCQ). Bisher wurde davon ausgegangen,

dass Methyltransferasen durch diese Mutation inaktiviert werden. Diese Vermutung steht im

Einklang mit der fehlenden DNA Methylierung in S. pombe (Wilkinson et al. 1995) sowie der

Beobachtung, dass durch Deletion des Serincodons DNA Methylierungsaktivität in vitro (wieder)

hergestellt werden kann (Pinarbasi et al. 1996). In Zusammenarbeit mit M. Becker (Abt.

Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen) konnte erstmals gezeigt werden, dass Pmt1

trotz der Mutation im Motiv IV als tRNA Methyltransferase aktiv ist und die tRNAAsp aus

Dictyostelium an der Position C38 methylieren kann (Abbildung 34).

Abbildung 34: In vitro Methylierung von in vitro transkribierter tRNAAsp(GUC) aus Dictyostelium durch rekombinante Pmt1, DnmA und hDnmt2. Wie DnmA und hDnmt2 methyliert Pmt1 die tRNAAsp an der Position C38. Exposition: 16h

10. Ergebnisse

106

10.2. Identifizierung neuer DnmA Substrate

Bei den 3H-Blockierungsexperimenten konnten neben einer Bande in der Größe einer tRNA nach

langer Expositionszeit auch schwache Banden, die einem höheren Molekulargewicht

entsprachen, detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Aufgrund dieser Ergebnisse sowie später

hinzugekommenen Hinweisen aus anderen Arbeitsgruppen (Schaefer et al. 2010b), dass DnmA

vermutlich eine multisubstrat RNA Methyltransferase ist, wurde ein RNA-CLIP (Crosslink-RNA-

Immunopräzipitation) System etabliert um DnmA-RNA Interaktionen in vivo zu untersuchen

und neue RNA Substrate zu identifizieren (Abbildung 35). Die mit DnmA co-

immunopräzipitierte RNA wurde einer RNA Sequenzierung unterzogen um so potentielle neue

RNA Substrate der DnmA zu identifizieren. Geeignete Kandidaten wurden im Anschluss durch in

vitro Methylierung validiert.

Abbildung 35: Schematische Darstellung der Arbeitsabläufe zur Identifizierung neuer Dnmt2-Substrate mittels RNA-CLIP auf Basis der GFP-Nanotrap® und nachfolgender Next-Generation-Sequenzierung. Aufgrund der kurzen Barcode Sequenzen können in der abschließenden Analyse die Sequenzen aus den Fraktionen mit DnmA-GFP und der GFP-Kontrolle voneinander getrennt werden. Dem Experiment geht ein in vivo crosslinking (mit Formaldehyd oder durch UV-Strahlung) voraus (nicht dargestellt).

10.2.1. Etablierung eines RNA-CLIP Systems zur Analyse von DnmA-RNA

Interaktionen

Eine Tandem-Affinitätschromatographie mit N-TAP-DnmA, anschließender 32P-Endmarkierung

und denaturierender PAA-Gelelektrophorese der assoziierten RNAs zeigte keine Unterschiede

im Vergleich zur Negativkontrolle (nur N-TAP) (Daten nicht gezeigt). Eine deutlich kürzere und

sehr effiziente Methode für Immunopräzipitationen ist die GFP-Nanotrap (Rothbauer et al.

2008), bei der in vivo Crosslinking sowie Reinigung unter denaturierenden Bedingungen genutzt

werden kann. Zusätzliche Optimierung der radioaktiven Endmarkierungsreaktion durch CIAP

Behandlung sowie Hitzedenaturierung der RNA Enden vor der PNK-Reaktion ermöglichte auch

das radioaktive Markieren von tRNA, die aufgrund ihres phospohrylierten rezessiven 5´-Endes

nur schwer zugänglich für die Kinase ist (Daten nicht gezeigt).

10. Ergebnisse

107

Ein RNA-CLIP-Experiment mit DnmA-GFP ergab eine Anreicherung von RNAs mit einer Größe

zwischen etwa 60 nt - 150 nt mit DnmA-GFP im Vergleich zur GFP-Kontrolle (Abbildung 36).

Verstärkt traten angereicherte RNAs mit einer Größe von ca. 75 – 85 nts auf und entsprechen

damit der Größe von tRNAs.

10.2.2. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit

FA-crosslinking und 454-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten RNAs Für die Identifikation neuer RNA-Substrate und RNA-Interaktionspartner wurde zunächst ein

RNA-CLIP Pilotexperiment mit Formaldehyd-crosslinking (Kapitel 9.3.4.2) durchgeführt und die

präzipitierte RNA mittels 454-Sequenzierung analysiert.

Das Experiment erfolgte mit DnmA-GFP/dnmAKO Zellen vergleichend zu nur GFP

exprimierenden Zellen im Widtyp-Hintergrund. Pro Probe wurden 20.000 Sequenzen analysiert.

Davon entsprachen jeweils ~ 19.000 Sequenzen denen von rRNAs (extrachromosomales rRNA

Palindrom) (Daten nicht gezeigt) und nur ~ 700 Sequenzen passten zu Sequenzen genomischer

DNA aus Dictyostelium. In die Auswertung wurden ausschließlich Sequenzen einbezogen, die

entweder mit ≥2:0 oder mindestens dreifach in der DnmA-GFP-Probe oder der GFP-Kontrolle

angereichert waren (Abbildung 37). Sequenzen mit gleicher Anzahl in beiden Proben wurden

nicht berücksichtigt. Überraschenderweise waren kaum tRNAs in den Sequenzen der 454-

Abbildung 36: Autoradiogramm von 32P-endmarkierter RNA verschiedener Fraktionen eines RNA-CLIP Experiment mit DnmA-GFP und GFP als Kontrolle. IN: Input, W: letzter Waschschritt, IP: immuno-präzipitierte RNA. In der IP mit DnmA-GFP sind angereicherte RNAs mit einem roten Pfeil markiert. Die radioaktiven Signale mit einer Größe von 10nt sind nicht mit RNAseA verdaubar, so dass es sich hierbei möglicherweise nicht um RNA handelt. Decade marker (Ambion), Größen in nt. Exposition: 16h

10. Ergebnisse

108

Sequenzierung zu finden. Troubleshooting Experimente deuteten daraufhin, dass bei der cDNA

Synthese die Reverse Transkriptase die tRNAs entweder aufgrund der starken Faltung und

Modifikationen oder aufgrund unzureichenden Crosslink Reversal schlecht transkribiert (Daten

nicht gezeigt). Bei dem Folgeexperiment mit UV-crosslinking trat dieses Problem jedoch nicht auf

(Kapitel 10.2.4). Für die Anreicherung der tRNAGly in der GFP-Kontrolle gibt es bisher keine

Erklärung.

Abbildung 37: Ergebnisse der 454 Sequenzierung von mit DnmA-GFP angreicherter RNA. Dargestellt ist die absolute Anzahl an Sequenzen, die Treffer auf genomische DNA (nach http://dictybase.org/) ergeben haben und die entweder mit ≥2:0 oder mindestens dreifach in der DnmA-GFP Probe oder der GFP-Kontrolle angereichert waren. Die ncRNAs, die für nachfolgende in vitro Methylierungsexperimente eingesetzt wurden, sind mit einem schwarzen Pfeil markiert.

10. Ergebnisse

109

Mittels Northern-Blot konnte die Existenz der tRNAAsp in der Elutionsfraktion jedoch

nachgewiesen werden (Abbildung 38).

Interessanterweise wurden viele snoRNAs und U-snRNAs sowie intergenische Sequenzen als

angereicherte RNA-Spezies in der DnmA-GFP Probe identifiziert. Erste Validierungsexperimente

bestätigten die Expression ausgewählter ncRNA-Transkripte der intergenischen Bereiche in

vegetativen Dictyostelium Zellen (Abbildung 39).

Weitergehende bioinformatische Analyse der intergenischen Sequenzen zeigte, dass einige von

diesen die für snoRNAs charakteristischen 5´-CUGA-3´ Motive beinhalten. Möglicherweise

handelt es sich bei diesen Sequenzen um nicht annotierte snoRNAs oder soRNA-ähnliche RNAs.

Es ist jedoch anzumerken, dass DnmA-GFP nukleär lokalisiert und die mit diesem Protein

angereicherten RNAs (U-snRNAs, snoRNAs) überwiegend kernlokalisiert sind. Im Gegensatz

Abbildung 39: Primer extension zur Überprüfung der Existenz ausgewählter intergenischer Transkripte aus Abbildung 37. Die snoRNA sno7 wurde als Positivkontrolle verwendet.

Abbildung 38: Northern-Blot mit anti-tRNAAsp Sonde verschiedener Fraktionen des RNA-CLIP Experiment mit FA-crosslinking. Die verwendeten Bait-Proteine in der Co-IP waren DnmA-GFP und GFP als Kontrolle. IN: Input (0,03%), W: letzter Waschschritt (83%), IP: immunopräzipitierte RNA (83%). Die Kontrollhybridisierung mit einer anti-5.8S rRNA-Sonde gibt einen Hinweis auf möglicherweise unspezifische Anreicherung von RNA mit DnmA-GFP bei der verwendeten Methode.

10. Ergebnisse

110

dazu sind die scRNAs (small cytoplasmic RNA) und SRP-RNAs (signal recognition particle RNA),

die vor allem mit dem ubiquitär vorkommenden GFP assoziiert sind, cytoplasmatisch lokalisiert,

so dass die Anreicherung möglicherweise auch aufgrund der Lokalisation des Bait-Proteins

beruht. Bei dem Folgeexperiment mit UV-crosslinking (Kapitel 10.2.4) wurde dieses Phänomen

jedoch nicht beobachtet. Beispielsweise wurden SRP-RNAs bei diesem Experiment

gleichermaßen in der DnmA-GFP und GFP Probe gefunden (Daten nicht gezeigt).

Für weitere Analysen wurden die in Abbildung 37 mit einem Pfeil markierten RNAs ausgewählt

(Kapitel 10.2.3).

10.2.3. Dictyostelium U2-snRNA kann in vitro von Dnmt2-Homologen methyliert

werden Die ausgewählten RNAs (Abbildung 37) wurden kloniert, in vitro transkribiert und im

Methylierungsassay mit rekombinant hergestellter His6-DnmA und His6-hDnmt2 getestet. Da die

Gene rnu2a und rnu2b identische Transkripte ergeben und im Rahmen dieser Studie nicht

unterschieden werden können, wird im Folgenden die Bezeichnung rnu2a/b verwendet. Im

Gegensatz zu snoRNA 7 (sno7) und den intergenischen ncRNAs R69 und R24 kann die U2-

snRNA (rnu2a/b) von His6-DnmA und His6-hDnmt2 sehr schwach methyliert werden (Abbildung

40A).

Abbildung 40: In vitro Methylierungsassay zur Validierung der mittels RNA-CLIP identifizierten potentiellen DnmA Substrate. U2-snRNA (rnu-2a/b) wird im Gegensatz zu snoRNA 7 (sno7) und den intergenischen ncRNAs R69 und R24 von His6-DnmA und His6-hDnmt2 schwach methyliert (A). Mutationen der Cytosine an den Positionen 73 und 155 führen nicht zum Verlust des Methylierungssignals. U4-snRNA dient ebenfalls nicht als Dnmt2-Substrat (B).

Im Vergleich zu den genannten RNAs zeigt die U2-snRNA das für die Substraterkennung durch

Dnmt2-Homologe vorgeschlagene Sequenzmuster zweimal (Abbildung 41). Einzelmutationen

der beiden potentiellen Zielcytosine führten in weiteren Experimenten nicht zum Verlust des

Methylierungssignals (Abbildung 40B). Möglicherweise werden beide Cytosine parallel

A B

10. Ergebnisse

111

methyliert oder ein anderes Cytosin dient als Targetnukleotid. Sollte es sich um eine

Methylierung aufgrund einer Kontamination in den Proteinpräparationen (aus E. coli) handeln,

wäre diese spezifisch für die U2-snRNA aus Dictyostelium.

Abbildung 41: Sequenz- und Strukturdarstellung der U2-snRNA (rnu2a) aus Dictyostelium. Die bei tRNAs identifizierte Erkennungssequenz für Dnmt2-Substrate ist rot gekennzeichnet. Potentielle Zielcytosine sind mit einem Pfeil markiert (modifiziert nach Hinas et al. 2006).

Die ebenfalls im RNA-CLIP Experiment angereicherte U4-snRNA (rnu4a) zeigt ebenfalls einmal

das Erkennungsmuster (Abbildung 42), dient in vitro jedoch nicht als Substrat (Abbildung 40B).

In einem ersten Versuch konnte die humane U2-snRNA (rnu2-1) ebenfalls nicht in vitro

methyliert werden (Abbildung 42 und Daten nicht gezeigt).

Abbildung 42: Sequenzen der U4- und U2-snRNA aus D. discoideum sowie der U2-snRNA aus H. sapiens. Das potentielle Erkennungsmuster für Dnmt2-Substrate ist in Grün, das jeweilige potentielle Zielcytosin in Rot dargestellt.

Die Bestimmung des in vivo Methylierungsstatus der jeweiligen Regionen um die potentiellen

Zielnukleotide (C73 und C155) der U2-snRNA aus Dictyostelium ergab keine Methylierung der

untersuchten Cytosine (in Zusammenarbeit mit R. Lorenz, Daten nicht gezeigt). Zusätzliche

10. Ergebnisse

112

Northern-Blot Analysen mit Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zeigten keinen Einfluss auf die

Expression oder Stabilität der U2-snRNA (rnu2a/b) durch DnmA (Daten nicht gezeigt).

10.2.4. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit UV-

crosslinking und Illumina®-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten

RNAs

Für einen zweiten Deep Sequencing-Ansatz wurde die RNA-CLIP-Methode auf UV-crosslinking

umgestellt und die RNA Sequenzierung mittels der Illumina®-Technologie durchgeführt.

Insgesamt wurden pro Probe ca. 5,5 Mio. Sequenzen erhoben (DnmA-GFP: 5 674 433/GFP:

5 540 257), von denen bei der Probe DnmA-GFP 1 249 579 Sequenzen und bei der GFP-

Kontrolle 514 809 Sequenzen dem Dictyostelium-Genom zugeordnet werden konnten (Tabelle

18).

Tabelle 18: Verteilung der Sequenzen aus der Illumina®-RNA-Sequenzierung auf das Dictyostelium-Genom. Das Auftreten von Dezimalzahlen ergibt sich aus der Verteilung der Reads auf das Genom. Kommt eine Sequenz bspw. dreimal im Genom vor, wird diese bei der verwendeten Methode nur jeweils mit 1/3 berücksichtigt.

Genom DnmA-GFP GFP

Chromosom 1 234 812,528 188 940,19

Chromosom 2 335123,756 59532,592

Chromosom 3 1377559,425 73855,775

Chromosom 4 396655,465 126256,981

Chromosom 5 79813,519 371714,427

Chromosom 6 58719,625 23944,371

Mt-DNA 2,0 2,36

rDNA 6892,688 5093,298

∑Rohdaten 1 249 579 514 809

Für die Auswertung wurden die Rohdaten normalisiert (Kapitel 9.3.5 und Anhang) um die

Unterschiede in der Häufigkeit der Rohsequenzen zwischen DnmA-GFP und GFP auszugleichen

und jeweils die Sequenzen ausgewertet, die mit dem Bait-Protein DnmA-GFP angereichert

waren.

tRNA und tRNA-Fragmente

In den erhobenen Daten fallen tRNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 20 – 24 nt auf, die im

Bereich des Anticoconloops beginnen und bis in den T-loop der tRNA hineinreichen („mid“-

Fragment) (Abbildung 43A-D). Besonders hebt sich hier die tRNAAsp(GUC) hervor. Ebenfalls stark

10. Ergebnisse

113

angereichert in der DnmA-GFP Probe sind „mid“-Fragmente der tRNAGlu(UUC), tRNAGlu(CUC) und

tRNAGly(GCC) (Abbildung 43A). Bei der tRNAPro(UGG), tRNALys(UUU-3) und tRNAGln(UUG-2) ist dieser Effekt

weit weniger ausgeprägt (Abbildung 43B/C links). Interessanterweise wurden in der

Sequenzierung bei den genannten tRNAs (außer der tRNALys(UUU-3)) und zusätzlich bei der

tRNAVal(UAC) antisense tRNA-Fragemente (as-Fragmente) detektiert, die meist nur mit einer

Häufigkeit von ca. 15-20 Sequenzen in der DnmA-GFP Fraktion, aber nie in der GFP-Kontrolle

auftraten (Abbildung 43A/B). Eine Ausnahme bilden die as-Fragmente der tRNAGlu(UUC), die mit

einer Häufigkeit von ca. 250 Sequenzen beobachtet wurden. Die as-Fragmente sind ca. 17 – 18nt

groß und meist zu den „mid“-Fragmenten komplementär, jedoch an jedem Ende jeweils um

einige Nukleotide kürzer (Abbildung 43E und Tabelle 19). Die einheitliche Länge und Position

dieser Transkripte schließen ein Zufallsartefakt weitgehend aus.

Tabelle 19: Übersicht über Länge und Position der sense und antisense tRNA-Fragmente.

* Reale Längen der Fragmente können um wenige Nukleotide von den angegebenen Längen abweichen.

Von den tRNAs Cystein und Threonin (tRNACys(GCA), tRNAThr(UGU)) wurde in der Sequenzierung

eine leichte Anreicherung eines 17nt langen Fragments des 5´-Endes festgestellt. Auffällig ist

zusätzlich noch die tRNAAla(AGC), von der ein Fragment des 3´-Endes (20nt) mit DnmA-GFP

Fragmente

Sense Antisense

„mid“ 5´- Ende 3´- Ende „mid“ tRNA

Länge [nt]*

Position Länge [nt]*



Position

Asp(GUC) 20 36 – 55 - - - - 18 53 - 36

Glu(UUC) 24 32 – 55 - - - - 18 53 - 36

Glu(CUC) 21 36 -55 - - - - 18 53 - 36

Gly(GCC) 23 33 – 55 - - - - 21 53 - 33

Gly(GCC) - - - - 42 30 - 71 21 53 - 33

Pro(UGG-4) 24 28 – 50 - - - - 19 51 - 33

Pro(UGG-2) - - - - 42 30 - 71 18 53 - 36

Gln(UUG-2) 24 33 – 56 - - - - 18 53 – 36

Gln(UUG-8) - - - - 43 32-72 19 53 - 35

Lys(UUU-3) 22 34 – 55 - - - - - -

Ala(AGC) - - - - 20 54 - 73 - -

Cys(GCA) - - 17 1-17 - - - -

Thr(UGU) - - 17 1- 17 - - - -

Phe(GAA) - - - - 20 54-74 - -

Lys(UUU-8) - - - - 43 31-73 - -

10. Ergebnisse

114

assoziiert (Abbildung 43C). Dass tRNAs oder tRNA-Fragmente nicht grundsätzlich höhere

Affinität zu DnmA-GFP haben, zeigt die exemplarische Auswertung des +-Stranges von

Chromsom 1 auf Sequenzen, die in beiden Proben gleichmäßig vorkommen oder in der GFP-

Kontrolle angereichert sind (Abbildung 43D).

10. Ergebnisse

115

Abbildung 43: Ergebnisse des RNA-CLIP Experiment mit UV-crosslinking und anschließender Illumina®-Sequenzierung der RNA. Dargestellt sind tRNAs sowie sense und anstisense tRNA Fragmente, die spezifisch mit DnmA-GFP angereichert wurden (A-C), V/P – Volllänge tRNA oder Präkursor. „Mid“-Fragmente sind grün, 3´-Fragmente blau, 5´-Fragmente gelb und antisense Fragmente rot markiert. Zum Vergleich sind tRNAs dargestellt, die in beiden Proben gleich oder in GFP leicht angereichert vorkommen (D). Schematische Darstellung der „mid“-sense und antisense tRNA Fragmente (E).

10. Ergebnisse

116

Northern-Blot Analysen konnten die Existenz von tRNAAsp-Fragmenten in den

immunopräzipitierten RNA-Fraktionen bestätigen (Abbildung 44A). Jedoch fällt hier auf, dass

die Volllänge-tRNA deutlich stärker als z. B. die 20 nt Fragmente vertreten sind. Der Unterschied

zwischen Northern-Blot und Sequenzierung kann auf einer effizienteren reversen Transkription

der Fragmente beruhen. In einem ersten Experiment konnten außerdem as-Fragmente der

tRNAGlu in der DnmA-GFP-Fraktion nachgewiesen werden (Abbildung 44B).

snoRNA, U-snRNA, intergenische Sequenzen

Weitere RNAs oder RNA Fragmente wurden als angereichert betrachtet, wenn sie in der

DnmA-GFP Probe mindestens dreimal so häufig vorkamen wie in der GFP Kontrolle. Gezielte

Analyse der kleinen Kern-RNAs ergab, dass keine snoRNA dieses Kriterium erfüllte. Die U2-

snRNA kam im Gegensatz zum ersten Deep Sequencing-Ansatz in unregelmäßigen Fragmenten

vor und war ebenfalls nicht verstärkt mit DnmA assoziiert. Die U1-snRNA (rnu1b) zeigte jedoch

eine deutliche Anreicherung in der DnmA-GFP Probe im Vergleich zur GFP-Kontrolle (Abbildung

45).

Abbildung 44: Northern-Blot der mit DnmA-GFP und GFP immunopräzipitierten RNA. Mit einer anti-tRNAAsp Sonde, die sich von Position 3 – 48 nt der tRNA erstreckt, können die Volllänge-tRNA (72 nt) sowie vier Fragmente detektiert werden (A). Das bei 20 nt angereicherte Fragment könnte dem „mid“-Fragment aus der Sequenzierung entsprechen. Mit einem DNA-Oligonukleotid, welches extakt komplementär zum as-Fragment der tRNAGlu

ist, kann eine ca. 16nt große Bande detektiert werden (B). Aufgrund der starken Sequenzähnlichkeit zwischen tRNAGlu(UUC) und tRNAGlu(CUC) können Fragmente dieser tRNAs nicht differenziert werden. Mit Hilfe des ssRNA low range Markers wurde eine Eichgerade (y = 403,51e-0,3754x) erstellt, die zur Berechnung der Fragmentlängen herangezogen wurde.

A B

10. Ergebnisse

117

Abbildung 45: Ergebnisse der Illumina®-Sequenzierung für snoRNA und U-snRNA. Sequenzen, die in der DnmA-GFP Probe mindestens dreimal häufiger als in der GFP Kontrolle vorkamen, sind mit einem violetten Kreuz gekennzeichnet.

Weiterhin wurden noch einige intergenische Sequenzen detektiert, die das oben genannte

Kriterium erfüllen (Abbildung 46).

Abbildung 46: Ergebnisse der Illumina®-Sequenzierung für intergenische Sequenzen. Sequenzen, die in der DnmA-GFP Probe mindestens dreimal häufiger als in der GFP Kontrolle vorkamen, sind mit einem violetten Kreuz gekennzeichnet.

10. Ergebnisse

118

10.3. Einfluss der tRNAAsp-Methylierung durch DnmA auf die

Translationseffizienz

Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Erkennung der Codons und damit den

Translationsprozess beeinflussen können (Kapitel 6.1.2), wurde in dieser Arbeit ein System zur

Analyse der Translationseffizienz in Abhängigkeit des Dnmt2-Homologs DnmA aus Dictyostelium

entwickelt. Zunächst wurde dafür die Aspartat-Codon usage analysiert und im Anschluss ein auf

einem „Asp-leader“-Reportergen basierendes Translationssystem etabliert.

10.3.1. Aspartat-Codon usage in verschiedenen Organismen

Die Aminosäure Aspartat wird durch die Codons GAC und GAU kodiert. In Dictyostelium wird das

Codon GAC jedoch deutlich seltener benutzt (ca. Faktor 10) als das Codon GAU (Tabelle 20).

Allerdings ist nur eine tRNAAsp mit dem GUC Anticodon (komplementär zum GAC Codon) in der

Dictybase annotiert. Insgesamt gibt es 22 tRNAAsp(GUC)-Gene, die zu identischen Transkripten

führen.

Tabelle 20: tRNAAsp Codon usage in ausgewählten Organismen. Das häufiger genutzte Codon ist jeweils rot hervorgehoben.

tRNAAsp

Organismus Codon usage [%] GAC GAU

Anzahl der tRNAAsp-Gene GUC AUC

D. discoideum* 0.43 4.7 22 0

S. pombe 1.55 3.79 8 0

D. melanogaster 2.46 2.76 14 0

H. sapiens 2.51 2.18 19 0

M. musculus 2.6 2.1 16 0

D. rerio 2.78 2.48 150 1

B. taurus 2.82 2.05 48 6

A. thaliana 1.72 3.66 26 0

S. cerevisiae 2.03 3.81 16 0

C. elegans 1.71 3.58 27 0

Quelle: Genomic tRNA database (http://gtrnadb.ucsc.edu/GtRNAdb), *Codon bias table from

Dictybase (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=44689)

10. Ergebnisse

119

Die Codon usage der beiden „Dnmt2 only“-Organismen S. pombe und D. melanogaster sowie C.

elegans und S. cerevisiae, deren Genom für keine Dnmt kodiert, zeigt einen ähnlichen Trend, der

jedoch deutlich schwächer ausgeprägt ist. Eine untersuchte Auswahl an Organismen, die alle

drei DNA-Methyltransferasen beinhalten zeigen – mit Ausnahme von A. thaliana - hingegen eine

leichte Präferenz für das Codon GAU (Tabelle 20).

Mit wenigen Ausnahmen kodieren die Genome der untersuchten Spezies alle nur tRNAAsp-Gene

mit dem GUC Anticodon. Auch der Mensch kodiert nur für tRNAAsp mit GUC Anticodon, allerdings

gibt es hier zwei tRNAAsp Spezies. Der Großteil der Transkripte ist nahezu identisch, einige

wenige haben Punktmutationen im Akzeptorstamm. Sie zeigen jedoch alle das Nukleotidmuster

für die Substraterkennung durch Dnmt2. Zwei Transkripte fallen aus der Reihe, sie sind bis auf

wenige Punktmutationen im Akzeptorstamm identisch, aber beide haben die Punktmutation

C38U (Genomic tRNA database: http://gtrnadb.ucsc.edu/GtRNAdb).

C. elegans, C. briggsae und C. remanei haben etliche tRNAAsp(AUC) Pseudogene, für Bos taurus sind

sechs tRNAAsp(AUC) Gene annotiert. Vereinzelt findet man in wenigen Eukaryoten wie z. B. Pferd,

Hund, Katze, Reis, Zebrafisch tRNAAsp(AUC)-Gene. Interessanterweise zeigt keins der untersuchten

tRNAAsp(AUC)-Gene das vorgeschlagene Sequenzmuster für Methylierung durch Dnmt2,

wohingegen die meisten der tRNAAsp(GUC)-Gene die Nukleotidabfolge beinhalten. Goll et al. (2006)

beschrieben, dass Organismen mit Dnmt2 einen hochkonservierten Anticodonstamm und -loop

der tRNAAsp(GUC) zeigen, dem möglicherweise eine Koevolution zwischen Dnmt2 und der tRNAAsp

zu Grunde liegt. Ausnahmen bildeten S. cerevisiae und C. elegans, die keine Dnmt2 Homologe

haben.

Die Analyse der tRNA-Gene sowie der Codon usage wirft die Frage auf, inwiefern eine

Methylierung durch Dnmt2 für das „Wobbling“ der tRNAAsp(GUC) verantwortlich ist.

10.3.2. Das „Asp-leader“-Reportersystem

Um den Einfluss DnmA vermittelter tRNAAsp(GUC) Methylierung auf die Codonerkennung bei der

Translation zu untersuchen, wurde auf der Grundlage des Translationssystems von Nakamura et

al. (2007) ein „Asp-leader“-Reportersystem entwickelt (Abbildung 47).

Abbildung 47: Schematische Dar-stellung der Vektoren des „Asp-leader“-GFP-Reporter-systems.

10. Ergebnisse

120

Dazu wurde in den pDneo2a_GFP Vektor N-terminal ein „Asp-leader“ kloniert, der für die

Aminosäuresequenz MAKTDDDDDGS kodiert. Die vor der Asp-Sequenz vorgeschalteten vier AS

werden durch häufig genutzte Codons kodiert und sind für einen effizienten Start der

Translation notwendig. In Dictyostelium ist beispielsweise bekannt, dass die

Translationseffizienz zurückgeht, wenn überwiegend seltene Codons innerhalb der ersten zehn

AS verwendet werden (Vervoort et al. 2000). Für das System wurden zwei verschiedene Asp-

Leader verwendet, einmal ausschließlich mit dem Asp-Codon GAC und einmal mit GAU

(Abbildung 47), die beide jeweils mehrfach in Dictyostelium Wildtyp-Zellen und dnmAKO-

Mutanten transformiert wurden. Die Transformanten wurden nicht subkloniert, sondern als

Population verwendet. Eine Population wurde in die Analyse miteinbezogen, wenn nach der

Transformation mindestens zehn klonal gewachsene Transformanten auf der Petrischale zu

finden waren. Die Translationseffizienz wurde insgesamt definiert als:

Die Fluoreszenz lebender Zellen wurde dabei fluoreszenzspektrometrisch als

Doppelbestimmung erhoben und im Verhältnis zur Masse an Gesamtprotein einer Zelle

angegeben. Das Experessionlevel der gfp mRNA wurde mittels Real time-PCR und der ΔΔCt-

Methode relativ quantifiziert. Als Housekeeping-Gen diente das Gen cinD. Die

Translationseffizienz wird als dimensionslose Zahl angegeben.

10.3.3. DnmAKO-Mutanten zeigen leicht erhöhte Translationseffizienz

In Abbildung 48 sind die Translationseffizienzen (normalisiert auf die Population GFP/wt 1 = 1)

des „Asp-leader“-GFP-Reportergens in Wildtyp und dnmAKO-Zellen dargestellt. Durchschnittlich

ist die Translation des Reportergens in dnmAKO Zellen doppelt so effizient wie in Wildtyp-Zellen

unabhängig vom Asp-leader. Diese Beobachtung widerspricht der Hypothese, dass DnmA

abhängige tRNA Methylierung für effizientes Wobbling verantwortlich ist Der Asp(GAC)-Leader

wird hingegen gegenüber dem Asp(GAU)-Leader doppelt so gut translatiert. Aufgrund der Codon

usage in Dictyostelium wurde jedoch eine effizientere Translation des Asp(GAU)-leaders

erwartet.

Statistische Analyse mittels ungepaartem t-Test ergaben keine signifikanten Unterschiede

zwischen Wildtyp- und dnmAKO-Zellen sowie zwischen den beiden Asp-Leadern. Vergleicht man

nur die Populationen miteinander, die am gleichen Tag entstanden sind, ergibt sich ein P-value

10. Ergebnisse

121

von p= 0.0072 (**) (gepaarter t-Test). Zur besseren Übersicht wurden die gepaarten Daten

jeweils aus wt = 1 normalisiert (Abbildung 48 rechts).

Abbildung 48: Translationseffizienzen der „Asp-leader“-GFP-Reportergene in Wildtyp und dnmAKO Stämmen. Fehlerbalken: mean with range. n: unabhängige Populationen, #Zwei unabhängige Populationen und ein biologisches Replikat, gepaarter t-Test: p = 0.0072 (**).

10.3.4. DnmA ist nicht an der Transkriptionskontrolle des GFP-Reportergens

beteiligt

Bei detaillierter Analyse der für das Translationssystem erhobenen Daten fällt auf, dass die

Unterschiede zwischen den Wildtyp- und dnmAKO-Zellen in der Translationseffizienz vor allem

auf signifikant reduzierter Expression in den dnmAKO-Populationen beruht (Abbildung 49A

und B), d.h. trotz geringerer mRNA Mengen (Abbildung 49B) findet man etwa gleiche

Fluoreszenzintensität (Abbildung 49A).

Dieser starke Unterschied im Expressionslevel warf die Frage auf, inwiefern die deutlich

reduzierte Expression des Reportergens in dnmAKO-Zellen transkriptionsreguliert ist oder durch

eine geringere Anzahl an Integrationen des Transgens verursacht wird. Von sechs

Populationspaaren wurde mit qPCR auf gDNA die relative Anzahl der Integrationen bestimmt.

Abgesehen von einem Populationspaar spiegelt sich der Trend der Expressionsunterschiede in

der Anzahl der Integrationen wieder (Abbildung 49C), so dass eine Rolle von DnmA bei der

Transkriptionskontrolle des Transgens ausgeschlossen ist.

10. Ergebnisse

122

Abbildung 49: Vergleichende Darstellung der Fluoreszenz/Protein [µg] (A), der relativen Expression (B) und der relativen Anzahl an Integrationen (C) des „Asp-leader“-GFP-Reportergens. as relative Expressionslevel und die relative Anzahl an Integrationen sind einmal mit und einmal ohne die Population 1 dargestellt. Fehlerbalken: mean with range, n: unabhängige Populationen, gepaarter t-Test: p = 0.0028 bei n = 8 (**) und p = 0,0004 bei n = 7 (***) (B), (C) p = 0,002 bei n = 5 (**).

10.4. Untersuchung des Einflusses von DnmA auf die Aufnahme und Integration

von Fremd-DNA

Aus den Daten aus Kapitel 10.3.4 und der Durchführung vieler Transformationen von Plasmiden

in Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO-Zellen ergab sich die Vermutung, dass die Mutanten

möglicherweise weniger effizient transformierbar sind. Transformationen schlugen häufiger fehl

und die Entwicklung von Zellkolonien nahm meist mehr Zeit in Anspruch als bei Zellen mit

Wildtyp-Hintergrund. (Die Zahlen der Populationen des Translationssystems spiegeln diese

Vermutung nicht wieder, da hier mehrere Transformationen in Knockout-Zellen durchgeführt

wurden um sicherzustellen eine ausreichende Anzahl an Populationen zu erhalten.) Zusammen

mit der Beobachtung, dass die relative Anzahl der Integrationen eines GFP-Reportergens

(Kapitel 10.3.4) in dnmA-Knockouts geringer ist, ergibt die Frage, ob generell die DNA Aufnahme

in die dnmAKO-Zellen weniger effektiv ist oder ob ausschließlich die DNA Integration des

Transgens in das Genom inhibiert ist. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden ein

extrachromosomales (pDbsrXP_gfp) und ein integrierendes Plasmid (pDneo2a_gfp) mehrfach in

den Wildtyp, dnmAKO-Zellen und als Kontrolle in Knockout-Zellen des Argonaut-Proteins B

(AgnB) transformiert. Die Anzahl sich entwickelnder Kolonien wurde über einen Zeitraum von

einigen Tagen bis einigen Wochen verfolgt. Da Dictyostelium Knockout-Stämme eine Blasticidin-

A B C

10. Ergebnisse

123

Resistenz (BSR) tragen, können sie nicht mit dem extrachromosomalen Plasmid transformiert

werden, da hier ebenfalls eine BS-Selektion notwenig wäre. Daher wurden zusätzlich dnmAKO-

und agnBKO-Zellen verwendet, denen die BSR-Kassette entfernt wurde (KO „rox“). Ein Stopcodon

in der kodierenden Sequenz erhält den Knockout-Status.

Entsprechend den vorherigen Beobachtungen ließ sich der dnmAKO-Stamm schlechter mit dem

integrierenden Plasmid transformieren als die AgnB Mutanten und der Wildtyp. Der dnmAKO-

„rox“-Stamm hingegen zeigte eine dem Wildtyp vergleichbare Transformationseffizienz

(Abbildung 50A). Bei Transformationen mit dem extrachromosomalen Plasmid blieb die Anzahl

resistenter Klone des dnmAKO „rox“-Stammes signifikant hinter dem AngBKO „rox“- und dem

Wildtyp-Stamm zurück (Abbildung 50B).

Abbildung 50: Transformationseffizienz verschiedener Dictyostelium Stämme mit dem integrierenden Plasmid pDneo2a_gfp (A) und dem extrachromosomalen Plasmid pDbsrXP_gfp (B). Fehlerbalken: Mean with

SEM; ungepaarter t-Test: p = 0,0448 (*) (A), p = 0,0072 (**) (wt/DnmAKO “rox”) und p = 0,0002 (***) (AgnBKO „rox“/ DnmAKO “rox”). Die AgnBKO-Zellen wurden freundlicherweise von B. Boesler zur Verfügung gestellt.

Die Daten geben einen Hinweis darauf, dass DnmA die Aufnahme eines extrachromosomalen

Plasmids inhibiert. Das unterschiedliche Verhalten der beiden untersuchten dnmAKO–Stämme

bezüglich der Aufnahme eines integrierenden Plasmids kann momentan nicht erklärt werden

(siehe auch Kapitel 11.4.3 der Diskussion).

A B

10. Ergebnisse

124

Abbildung 51: miRNA ähnlicher Präkursor der kleinen skipper RNAs. Für die Northern-Analysen wurde eine dem rotem Bereich komplementäre Sonde verwendet (entnommen aus Hinas et al. 2007).

10.5. Vertiefende Analyse zur Funktion von DnmA bei der Regulation des

Retrotransposons skipper

Dictyostelium galt lange Zeit als Organismus ohne DNA-Methylierung (Smith et al. 1991).

Unabhängig voneinander wiesen vor wenigen Jahren zwei Arbeitsgruppen schwache

asymmetrische m5C-Methylierung in Dictyostelium durch DnmA nach (Kuhlmann et al. 2005;

Katoh et al. 2006). Die Methylcytosine wurden im LTR des Retrotransposons DIRS-1 und im RT

Bereich des Retrotransposons skipper (Abbildung 53) lokalisiert. Northern-Blot Analysen

ergaben eine verstärkte Expression des Retrotransposons skipper (Volllänge-Transkript) in

dnmAKO– und langzeitkultvierten Wildtyp- und dnmAKO –Zellen, wobei der Effekt in letzteren am

stärksten ausgeprägt war (Kuhlmann et al. 2005). Das Retrotransposon DIRS-1 wird in den

genannten Zellen nicht erhöht exprimiert. Mittels quantitativer Southern-Blots (mit skipper RT

Sonde) konnte in dnmAKO-Zellen eine leichte Zunahme an skipper Integrationen (ca. 1,5)

detektiert werden, die in den langzeitkulitivierten dnmAKO-Zellen auf das ca. 1,7fache Anstieg

(Kuhlmann et al. 2005). Allerdings konnten die skipper Integrationen nicht im Genom lokalisiert

werden (Kuhlmann et al. 2005). Im Gegensatz zu skipper wurden für das Retrotransposon DIRS-

1 siRNAs nachgewiesen, die nahezu die gesamte Sequenz des Retrotransposons abdeckten.

Mittlerweile wurden auch für skipper acht miRNA

ähnliche kleine RNAs publiziert, die einer partiellen

skipper Kopie auf dem Chromosom 2 zuzuordnen

sind. Einige von ihnen könnten aber auch von

vollständigen skipper Kopien an anderen Stellen

des Genoms stammen (Hinas et al. 2007). Sechs der

acht kleinen RNAs entstehen aus einer Hairpin

ähnlichen Struktur, die einem miRNA Präkursor

ähnelt (Abbildung 51).

dnmAKO-Mutanten sowie langzeitkultivierte Zellen sollten auf das Vorkommen der kleinen RNAs

untersucht werden. Zusätzlich wurde überprüft, ob Überexpression von DnmA im Knockout-

Hintergrund die erhöhte Expression von skipper kompensieren kann.

10.5.1. Untersuchung kleiner RNAs des Retrotransposons skipper

Als Sonde für Northern-Blot Analysen auf kleine skipper RNA in verschiedenen dnmA-Mutanten

wurde ein Oligonukleotid verwendet, dass dem Loop des putativen miRNA Präkursors

komplementär ist (Abbildung 51).

Überraschenderweise konnte in allen untersuchten dnmA-Mutanten (Knockout- und

Überexpressionsstämmen) eine moderate Erhöhung der kleinen skipper RNAs festgestellt

10. Ergebnisse

125

werden (Abbildung 52). Eine erste Vermutung, dass sowohl Überschreiten als auch

Unterschreiten des endogenen DnmA Levels zur Hochregulation kleiner skipper RNAs führt,

konnte in Folgeexperimenten nicht belegt werden. Überexpression von ausschließlich GFP von

einem integrierenden high copy Plasmid verursachte ebenfalls diesen Effekt. GFP Expression von

einem extrachromosomalen Plasmid zeigte dagegen Wildtyplevel an kleinen skipper RNAs

(Abbildung 52A). Moderate Hochregulation der kleinen skipper RNA ist demnach kein DnmA

spezifischer Effekt. Dass jedoch nicht jede genetische Manipulation einer Zelle in Dictyostelium

den beschriebenen Effekt zeigt, bestätigen die Knockout-Mutanten von Argonaut A und B. Im

AgnBKO sind die kleinen RNAs ebenso wie im Wildtyp kaum zu detektieren, wohingegen der

AgnAKO eine starke Anreicherung kleiner RNAs zeigt

Argonaut A abhängige siRNAs des Retrotransposon DIRS-1 entsprachen in allen untersuchten

DnmA-Mutanten dem Wildtyp Niveau (Abbildung 52).

Abbildung 52: Northern-Blots zur Detektion kleiner RNAs der Retrotransposons DIRS-1 und skipper. Alle untersuchten DnmA Mutanten (Knockout und Überexpressionsstämme) sowie ein GFP-Überexpressionsstamm zeigen eine moderate Erhöhung kleiner skipper RNAs (A, B). Zum Vergleich ist RNA von Knockout-Mutanten der Argonauten A und B mit aufgetragen worden (B). SnoRNA 5 (sno5, 81 nt) dient als zusätzliche Ladekontrolle. Die Größe der kleinen RNAs wurde mit Hilfe des microRNA Markers (N2102S, NEB) auf 21 nt bestimmt. Expositionszeiten: Blot A/Blot B. Die RNA der Argonaut-Knockouts wurde von B. Boesler zur Verfügung gestellt.

10.5.2. Analyse der skipper Transkription in DnmA-Mutanten

Inwiefern die gleichzeitige Anreicherung von kleinen skipper RNAs und Volllängetranskripten

korrelieren, wurde mittels quantitativer Real-time PCR (relative Quantifizierung) der skipper-

Transkripte untersucht. Experimente mit gag und RT Primern (Abbildung 53) konnten die von

Kuhlmann et al. beschriebene erhöhte Transkription in dnmAKO und langzeitkultivierten

dnmAKO-Zellen bestätigen (Abbildung 54). In Langzeitkultur gewachsene Wildtyp-Zellen zeigten

A B

10. Ergebnisse

126

im Gegensatz zu den von Kuhlmann et al. verwendeten Zellen keine erhöhte skipper

Transkription (Abbildung 54). Die in dieser Arbeit analysierten Zellen waren 28 Monate

vegetativ in Schüttelkultur gewachsen und hatten nicht wie die in der ersten Studie genutzten

Zellen 16 Entwicklungszyklen durchlaufen (Kuhlmann et al. 2005).

Abbildung 53: Schematische Darstellung des Retrotransposons skipper (nach Genbank: F049230.1) sowie der in dieser Arbeit verwendeten Primerpaare. Skipper gehört zur Familie der gypsy/Ty3 Retrotransposons und zeigt den dafür typisch Aufbau von LTR-GAG-PRO-INT-LTR. LTR: long terminal

repeat, gag: group-specific antigen (Capsid/Nukleocapsid Domäne), pro: Protease, pol: kodiert für die Reverse Transkriptase (RT) und Integrase (IN). Gag und pro werden durch ein einziges Stop-Codon getrennt, pro wird von pol durch einen +1 Frameshift sowie einer Überschneidung des Leserahmens für elf AS separiert (Leng et al. 1998).

Überraschend zeigte der neu generierte dnmAKO“rox“ Stamm (V. Maximov, C. Joppich,

unveröffentlichte Daten) keine verstärkte skipper Transkription (Abbildung 54).

Abbildung 54: Bestimmung des skipper Expressionslevels mittels Real time-PCR in verschiedenen Dictyostelium Stämmen. LZ: Langzeitkultur (28 Monate). Fehlerbalken: Mean with range; gepaarter t-Test: p = 0,151 (*) (wt/dnmAKO), p = 0,0059 (**) (wt/dnmAKO LZ), p = 0,0065 (**) (wt/dnmA-GFP/dnmAKO).

10. Ergebnisse

127

Auch konnte keine Kompensation der erhöhten skipper Transkription durch Überexpression von

DnmA festgestellt werden. Überexpressionen von DnmA-GFP, hDnmt2-GFP sowie GFP im

Wildtyp-Hintergrund verursachten keine abweichende skipper Expression vom Wildtyp-Niveau.

Die in dieser Arbeit ermittelten Daten sprechen damit gegen eine spezifische Rolle von DnmA

bei der skipper Regulation.

10.5.3. Relative Bestimmung der skipper Kopienzahl in DnmA-Mutanten

Quantitative Real-Time PCR mit den gag und RT Primern konnten die von (Kuhlmann et al.

2005) detektierten zusätzlichen skipper-Kopien nicht bestätigen (Abbildung 55). Ein vorläufiges

Experiment mit LTR-Primern entsprach in etwa dem Trend veröffentlichten Daten, konnte aber

in weiterführenden Southern-Blot Experimenten mit anti-LTR Sonde nicht zuverlässig bestimmt

werden (pers. Mitteilung von S. Fuhrmann, Abt. Nellen, Universität Kassel).

10.5.4. In vitro Methylierung von DIRS-1 LTR und skipper RT Fragmenten

Amplikons der Bereiche skipper RT, DIRS-1 LTR sowie doppelsträngiger Homopolymere (28 bp)

konnten in vitro nicht methyliert werden (Daten nicht gezeigt). Der Zusatz von Dictyostelium

Kernlysat zum Methylierungsansatz zeigte ebenfalls keinen Effekt (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 55: Bestimmung der Kopienzahl der skipper Integrationen mittels Real time-PCR in verschiedenen Dictyostelium Stämmen. LZ: Langzeitkultur (28 Monate). Fehlerbalken: Mean with range. LTR: n = 1, *Triplikate wichen mehr als 0,5 Ct-Werte voneinander ab.

10. Ergebnisse

128

10.6. Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen

In einem Pulldown Experiment mit DnmA-TAP und anschließender MS/MS-Analyse

identifizierte V. Maximov das zentrosomale Protein CEP192 (score 1444) als putativen

Interaktionpartner der Methyltransferase. Neben Heat shock Proteinen wurden noch PAN3

poly(A) specific ribonuclease subunit (score 186) und mitotic phosphoprotein N´end (score 555)

mit guter Abdeckung identifiziert. Mit geringem score (40-60) wurden neben DNA assoziierten

Proteinen (structural maintenance of chromosome protein und die DNA Topoisomerase II), ein

RNA bindendes Protein sowie zwei RNA Helikasen nachgewiesen, von denen eine DEAD/H box

Helikase des U5 snRNP ist (Maximov 2010). In weiteren Experimenten mit TAP-DnmA konnten

die Ergebnisse nicht zuverlässig bestätigt werden.

Eine Erweiterung der Experimente von V. Maximov durch Immunopräzipitaionen mit der GFP-

Nanotrap von DnmA-GFP aus Dictyostelium Zellen mit dnmAKO Hintergrund ergab mittels

massenspektrometrischer Analyse (O. Bertinetti, Abt. Herberg, Uni Kassel), dass nahezu

ausschließlich DnmA-GFP präzipitiert wurde (Abbildung 56A).

Abbildung 56: SDS-PAGE (12%) immunopräzipitierter DnmA-GFP und GFP (A) und nach Affinititätschromatographie eluierter DnmA-StrepII (B). Die in der massenspektrometrische Analyse analysierten Banden sind markiert. Ergenisse der MS Analyse aus B sind in Tabelle 21 aufgeführt.

Die Ergebnisse der Massenspektrometrie von DnmA-StrepII (Abbildung 56B) sind in Tabelle 21

aufgeführt. Das Bait-Protein DnmA-StrepII ist in Fettdruck hervorgehoben. Proteine, die

bekanntermaßen Biotin oder an die Matrix binden und damit unspezifisch angereichert wurden,

sind grau hinterlegt. Alle verbleibenden Proteine wurden mit einen score ≤ 45 sowie einer

Abdeckung von nur 1-5 Peptiden detektiert. Keines dieser Proteine entspricht den von V.

Maximov identifizierten Proteinen. Unter der Berücksichtigung, dass die endogene DnmA

A B

10. Ergebnisse

129

Expression sehr gering ist und bei Pulldowns mit überexprimierter DnmA im dnmAKO-

Hintergrund Interaktionspartner vermutlich stöchiometrisch zum endogenen DnmA Level

erwartet werden können, sind Interaktionspartner mit dieser Methode nur schwer

identifizierbar. Von den mit geringer Abdeckung identifizierten Proteinen sind diejenigen, die

mit DNA assoziiert werden oder mit RNA Modfikationen in Verbindung gebracht werden, kursiv

gedruckt.

10. Ergebnisse

130

Tabelle 21: Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse putativer Interaktionspartner von DnmA-StrepII. Bande UniProtKB Genprodukt MW

(kD) Score/ Queries matched

Bemerkung

1 -- 2 Q54TE8

TATA binding protein (TBP)-associated factor A

SNF2-related domain-containing protein, helicase, protein chromatin remodelling complex subunit R

(CHR) protein; SWI2/SNF2 homolog

115 39/2

3 Q553S7 Propionyl-CoA carboxylase 80 539/29 Bindet Biotin Q54KE6 Methylcrotonyl-CoA carboxylase 77 460/25 Bindet Biotin Q55C64 Hsp70 71 78/4 Q557E0 Hypothetical protein (Hsp) 70 62/4 Q54HP6 Transmembrane protein 79 54/1 Q54JH6 DnmA 44 53/4 Bait protein Q55CS9 Atp5b, ATP Synthase subunit (mitoch.) 71 40/2 Q54BE0 Heat shock cognate protein Hsc70-3 70 40/5 Q54SG9 Gxcf, RhoGEF domain-containing protein 105 39/2 Q54Q46 Leucine-rich repeat-containing protein (LRR) 28 37/1 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 36/2 4 Q551S6 Hypothetical protein (BLAST: Acetyl-CoA carboxylase alpha subunit) 61 726/27 Bindet Biotin Q54JH6 DnmA 44 266/14 Bait protein Q8T2J9 Similar to A. tumefaciens Methyl-crotonoyl-CoA carboxylase beta subunit 64 244/15 Bindet Biotin Q54SG9 Gxcf, RhoGEF domain-containing protein 105 43/1 Q54Q46 Leucine-rich repeat-containing protein 28 40/1 Q553S7 Propionyl-CoA carboxylase 80 40/3 Bindet Biotin Q54DG6 Hypothetical protein (BLAST: Methyltransferase like protein 17, SAM-MTase (mitoch. Isoform), rRNA

methylation)

145 39/4

Q54TE8 TBP-associated factor A 115 39/2 5 Q54JH6 DnmA 44 1262/67 Bait protein 6 Q54JH6 DnmA 44 1101/57 Bait protein Q54PL8 Hypothetical protein 28,9 45/6 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 AAA33164 Adenylyl cyclase aggregation protein 98,3 38/1 Q552Q3 Hypothetical protein, weakly similar to ints10, component of a multiprotein mediator of small

nuclear RNA processing

116 36/3

7 Q54JH6 DnmA 44 662/35 Bait protein Q54Q30 RNA-binding region-containing protein (RNP-1) 32 44/2

10. Ergebnisse

131

Q54TE8 TBP-associated factor A 115 39/1 8

Q54JH6

DnmA

44

547/33

Bait protein

O97470 ADP/ATP translocase (mitoch.) 33 48/1 Q54LP0 60S acidic ribosomal protein 32 41/3 Q54WI3 Hypothetical protein 86 37/2 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 37/1 Q86K45 protein KRP-A Similar to Aplysia californica, 40S ribosomal protein S3A (Lysine-rich) 30 36/5 9 Q55C60 Galactose-binding domain-containing protein 29 499/12 Bindet Matrix Q54CX1 Discoidin II 29 285/10 Bindet Matrix Q54JH6 DnmA 44 270/13 Bait protein DLDOIA Discoidin I chain A 28 76/3 Bindet Matrix DLDOIC Discoidin I chain C 28 68/3 Bindet Matrix Q54IG0 Hypothetical protein, Uncharacterized N-acetyltransferase 18 42/4 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 40/3 Q54MA9 ATP-dependent DNA helicase 10 36/2 10 Q54JH6 DnmA 44 293/17 Bait protein Q54CX1 Discoidin II 29 67/3 RpgG, 40S ribosomal protein S3 24 63/1 Q558U1 Eukaryotic translation initiation factor 2 alpha (EIF2alpha) kinase 27 41/4

Q54TE8 TBP-associated factor A 115 39/1 11 Q54JH6 DnmA 44 122/10 Bait protein Q54TE8 TBP-associated factor A 115 41/2 12 Q54JH6 DnmA 44 40/5 Bait protein Q54BQ3 Ribosomal protein L23a 18 37/2 13 Q75JV4 PksA 28 38/3 Q54Q46 Leucine-rich repeat-containing protein 28 37/2 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 36/1 14 Q54JH6 DnmA 44 137/11 Bait protein Q55BE6 Ribosomal protein L27 16 40/1 15 Q55EJ4 Hypothetical protein 96 42/3

10. Ergebnisse

132

10.7. Analyse speziesübergreifender Dnmt2 Funktionen

Um konservierte Dnmt2-Funktionen speziesübergreifend besser studieren zu können, wurden

vorbereitende Arbeiten für heterologe Expression verschiedener Dnmt2-Homologe

durchgeführt.

10.7.1. Heterologe Expression humaner Dnmt2 in Dictyostelium

DnmA-GFP in Dictyostelium lokalisiert unabhängig vom Wildtyp- oder dnnAKO-Hintergrund

überwiegend im Zellkern (Abbildung 57 und Kuhlmann et al. 2005). Dnmt2-Überexprimierer in

Drosophila oder Fibroblastenzellen der Maus wurden bisher ubiquitär oder verstärkt im

Cytoplasma angesiedelt (Kunert et al. 2003; Goll et al. 2006). Auch in Dictyostelium lokalisiert

hDnmt2 gleichermaßen nukleär und cytoplasmatisch, wenn sie analog zu DnmA vom pDneo2a-

Vektor mit C-terminalen GFP exprimiert wird (Abbildung 57). Mit Hilfe des SV40-

Kernlokalisationssignals kann hDnmt2-GFP zuverlässig in den Zellkern von Dictyostelium-Zellen

lokalisiert werden (Abbildung 57).

Abbildung 57: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von DnmA-GFP, hDnmt2-GFP und hDnmt2-NLS-GFP überexprimierenden Dictyostelium-Zellen. NLS: nuclear localisation signal

(Die Bilder von hDnmt2-NLS-GFP wurden freundlicherweise von H. Ziegler zur Verfügung gestellt.)

10.7.2. Klonierung von DnmA in einen Drosophila Expressionsvector

Um eine mögliche Kompensation des Verlustes der H4K20me3-Methylierung im Drosophila

dnmt2-/- Stamm zu untersuchen, wurde DnmA in einen pP{GS[vermillion+,UASV5]}-

Expressionsvektor auf der Basis des GAL4/UAS-Systems kloniert (Kapitel 8.18). Nach Injektion

des pP{GS[v+,UASDnmAV5]} in einen Vermillion-Rosy Fliegenstamm (v[1]/Y; +/+;

10. Ergebnisse

133

ry[506]/ry[506], lässt eine vorläufige Beobachtung auf eine dosisabhängige Reduktion von

Lebensfähigkeit und Fertilität durch DnmA schließen (pers. Mitteilung von O. Nickel, AG Reuter,

Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg). Zusätzlich wurde in einem ersten Experiment eine

DnmA abhängige partielle Stilllegung des white-Markergen am euchromatisch lokalisierten

Actin/GAL4 Konstrukt beobachtet, die nicht mit Heterochromatin-Spreading in benachbarte

Genombereiche erklärt werden kann (pers. Mitteilung von O. Nickel, AG Reuter, Martin-Luther-

Universität Halle-Wittenberg).

10.8. Einzelmoleküluntersuchungen des 5mC-bindenden Proteins EhMLBP aus

E. histolytica

Im Gegensatz zu Säugetieren sind in “Dnmt2-only“-Organismen, außer einem inaktiven Homolog

in Drosophila, bisher keine Methyl-CpG-bindenden Proteinen bekannt. Vor einigen Jahren wurde

in E. histolytica das Protein EhMLBP identifiziert, welches präferenziell methylierte DNA bindet,

aber keine Homologie zu bekannten MBDs zeigt (Lavi et al. 2006). Mittels

Immunopräzipitationen konnten RT-LINE (Long interspersed nuclear elements), rDNA, sowie

vier weitere Gene als Targets für EhMLBP identifiziert werden (Lavi et al. 2009). Genauere

Analysen der Targetsequenzen ergaben, dass alle A/T-reiche Bereiche beinhalten. In weiteren

Bindungsstudien wurde gezeigt, dass Distamycin A, das die kleinere Furche von DNA in

überwiegend A/T reichen Regionen bindet, die Interaktion von EhMLBP zur Ziel-DNAs inhibiert

(Lavi et al. 2008). RT LINE DNA beinhaltet zwei A/T-reiche Regionen, einmal von Nukleotid

20281 bis 20292 „AAAGAAAAGAAA“ und des weiteren von 10447 bis 10461

„AAAAGAAAATCCAAA“ (Lavi et al. 2009). Mittels Rasterkraftmikroskopie (RKM) wurde die

Bindung des Methyl-C-bindenden EhMLBP zur RT-LINE DNA untersucht, um festzustellen, ob

das Protein einen Bereich der DNA präferenziell bindet. Dazu wurde die C-terminale DNA

Bindedomäne des EhMLBP Proteins in E. coli exprimiert und affinitätsgereinigt, da die

Expression des Volllänge Proteins trotz Optimierungsversuchen nicht in ausreichendem Maße

möglich war (Daten nicht gezeigt). Ein Fragment der RT-LINE DNA, welches die beiden A/T-

reichen Regionen enthielt, wurde aus einem pGEM-T-Easy Vektor unter Verwendung von m5C

und dem SP6/T7-Primerpaars amplifiziert, so dass die RT-LINE DNA von Plasmidsequenzen

flankiert wurde (Abbildung 58).

10. Ergebnisse

134

Abbildung 58: Schematische Darstellung des RT-LINE Fragments mit angrenzender Vektorsequenz (516 bp).

In Zusammenarbeit mit M. Bussiek unter Beteiligung von N. Arens und L. Hupfeld wurden

Bindungsereignisse zwischen EhMLBP C-ter und der methylierten RT LINE DNA mittels

Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Abbildung 59).

Abbildung 59: Abbildung der Bindung von EhMLBP C-ter an methylierte RT-LINE DNA mittels RKM. Freie DNA (1), an das RT-LINE Fragment gebundenes EhMLBP C-ter (2), unspezifisches Endbindungsereignis (3).

Da die Orientierung der DNA Fragmente nicht bekannt war, wurde jeweils die Distanz des

Bindungsereignisses zum kürzeren Ende ermittelt. Grundsätzlich ist anzumerken, dass

Bindungsereignisse selten, d. h. bei nur ca. 1 - 2% der abgebildeten DNA Moleküle, auftraten.

Außerdem wurden die Längen der DNA Fragmente bestimmt und ausschließlich

Bindungsereignisse auf Fragmenten, die innerhalb des Fehlerbereichs von 166 ± 16 nm lagen

berücksichtigt (Abbildung 60A). Sieht man von den Endbindungsereignissen ab, die von vielen

DNA bindenden Proteinen als unspezifische Bindungen bekannt sind, liegt der Peak der

Bindungsereignisse im Intervall von 60-70 nm (Abbildung 60B).

10. Ergebnisse

135

Abbildung 60: Längenbestimmung der m5C-RT-LINE DNA (A) und Bestimmung der Bindeposition von EhMLBP C-ter an der m5C-RT-LINE DNA (B), Fehlerbalken: sqrt(Anzahl/Intervall). Die Graphiken wurden freundlicherweise von N. Arens zur Verfügung gestellt.

Bei Umrechnung der kürzesten Distanzen der Bindungsereignisse von nm in bp (0,32 nm/bp)

ergibt sich ein Wert von 188-219 bp. Da die Orientierung des DNA Fragmentes nicht bekannt ist,

kann die präferenzielle Bindung an dieser Stelle sowohl aus Richtung des T7- als auch des SP6-

Primeres erfolgen (Abbildung 58). Betrachtet man die bevorzugte interne Bindestelle aus der

Richtung des SP6-Primers, fällt diese mit der A/T reichen Region „AAAGAAAAGAAA“ (Nukleotid

20281 bis 20292 im RT LINE) zusammen (Abbildung 61).

Abbildung 61: Kartierung der möglicherweise von EhMLBP bevorzugten Bindestelle auf dem untersuchten Fragment der RT-LINE DNA. Flankierende Vektorsequenzen sind kursiv dargestellt, Primerbindestellen sind zusätzlich unterstrichen. Da die Orientierung des DNA Fragmentes nicht bekannt ist, kommen zwei Bereiche auf der DNA als bevorzugte Bindestelle in Frage: Aus Richtung des T7-Primers ist dieser Bereich türkis, aus Richtung des SP6-Primers grün markiert. Die beiden von Lavie et al. identifizierten A/T-reichen Regionen sind rot gefärbt. Es ist nur der +-Strang des DNA Moleküls dargestellt.

T7-PRIMER

TGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTAGCACTCTCC

AGCCTCTCACCGCAGATCCAGCACAGAAATAGGAGAAATGATAGAAGCAATAAAAGAAAATCCAAATGGAATAATTAAAAGAATGAATAA

AGCATTTGGTAAGAAGATTAATTTTAATGAATTAATGAATGTAATAGAATTAAATGAAAGAAAGCACAATGCAAAGGAAATATTTGAATG

GGTAAATAATGAATTAAATGAAAGATATTTAAGTGAATGGAAAGAAAAGAAATGTGGTGAATATATAAGATGTGCAAATGGCACTTTTAA

TGATAAGAAATTAACAGTAGCCACTTGGAGATCTGCGGTGAGAGGCTGGAGAGTGCTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTC

GACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAAT

SP6-PRIMER

A B

11. Diskussion

136

11. Diskussion

11.1. tRNA Methylierung als konservierte Dnmt2 Funktion

11.1.1. DnmA und Pmt1 sind aktive tRNA Methyltransferasen

Nachdem Goll et al. (2006) erstmals zeigen konnten, dass humane Dnmt2 eine deutlich stärkere

Enzymaktivität als tRNA- anstatt als DNA-Methyltransferase hat, ist mittlerweile für die Dnmt2-

Homologe aus D. melanogaster und E. histolytica ebenfalls eine tRNA Methylierungsaktivität

nachgewiesen worden (Meusburger 2008; Tovy et al.). Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt,

dass das Dnmt2-Homolog aus D. discoideum (DnmA) ebenfalls tRNAs methylieren kann.

Überraschend war, dass auch für Pmt1 aus S. pombe tRNA-Methylierungsaktivität detektiert

wurde, da bisher die fehlende DNA-MTase Aktivität dieses Enzyms auf die P zu S Mutation im

Motiv IV zurückgeführt wurde (Wilkinson et al. 1995) (Abbildung 62). Entgegen den

Erwartungen scheint diese Mutation für die Erkennung einer tRNA als Substrat keine

Beeinträchtigung zu sein.

Im Rahmen der in vitro Methylierungsstudien dieser Arbeit wurde für rekombinante DnmA und

hDnmt2 eine optimale Mg2+-Konzentration für die Methylierungsreaktion von 5 mM ermittelt.

Diese konnte bei Reaktionen mit verschiedenen Substraten bestätigt werden. Eine Erhöhung auf

10 mM Mg2+-Ionen in der Reaktion führte zur starken Reduktion der Methylierung

angereicherter kleiner RNA und bei in vitro transkribierter tRNA sogar fast zum vollständigen

Verlust des radioaktiven Signals. Diese Daten weichen von den Beobachtungen von

M. Meusburger ab, die 10 mM Mg2+-Ionen als optimale Magnesiumkonzentration identifiziert

hatte (Meusburger 2008). Magnesiumionen sind in der Reaktion vor allem auch für die korrekte

Faltung der tRNA Struktur verantwortlich. Grundsätzlich geht man davon aus, dass sich

modifizierte und unmodifizierte Transkripte in vitro erst in Anwesenheit von Mg2+-Ionen mit

einer Konzentration von 10 mM in ihren biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften

gleichen (zusammengefasst in Motorin et al. 2011).

11. Diskussion

137

Abbildung 62: Alignment von Dnmt2-Homologen aus verschiedenen Organismen. Die katalytischen Motive sind jeweils unterstrichen und mit der entsprechenden römischen Zahl gekennzeichnet. Die P zu S Mutation im Motiv IV von S. pombe ist mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. TRD: Target recognition domain. Die Farbgebung erfolgte nach der Konservierung in Prozent:

I II III

IV V VI

VII VIII

IX X

TRD

11. Diskussion

138

11.1.2. tRNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen

Als gemeinsames Hauptsubstrat aller bisher untersuchten Dnmt2-Homologe konnte die

tRNAAsp(GUC) identifiziert werden. Sowohl in vitro als auch in vivo konnte tRNAAsp Methylierung in

den Organismen Drosophila, Mus, Dictyostelium, Schizosaccharomyces und Entamoeba

nachgewiesen werden. Bei Dictyostelium liegt der detektierte m5C-Gehalt an der Position 38 in

Wildtyp-Zellen jedoch bei nur 30%. In Drosophila wurden je nach RNA Präparation zwischen 40-

70% C38-Methylierung in den Wildtyp-Populationen detektiert (pers. Mitteilung, M. Schäfer,

Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg). Inwiefern die cDNA Synthese bei der RNA-Bisulfitsequenzierung

auf wenig oder unmodifizierte tRNAs selektiert, ist unklar (siehe auch Kapitel 11.3). In

Dictyostelium konnte eine leichte Erhöhung der tRNAAsp-Methylierung durch Überexpression der

DnmA und hDnmt2, in S. pombe sogar 100% tRNAAsp-Methylierung durch Überexpression von

Pmt1 erreicht werden (pers. Mitteilung, M. Becker, Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität

Duisburg-Essen).

11.1.3. Endogene Dnmt2-Aktivität unterliegt vermutlich Umwelteinflüssen

Sowohl bei unseren in vitro Studien zur indirekten Detektion der endogenen DnmA Aktivität

sowie Studien anderer Arbeitsgruppen war auffällig, dass die in vivo Methylierung der tRNAs

durch Dnmt2-Homologe variiert. Erste Hinweise, dass tRNA Methylierung in der Erhaltung der

tRNA Stabliltät bei Hitzestress (HS) involviert sein könnte (Schaefer et al. 2010b), führten zu der

Vermutung, dass die tRNA Methylierung bei HS möglicherweise zunimmt. RNA Bisulfitanalysen

mit RNA aus Dictyostelium-Zellen, die über einem Zeitraum von zwei Stunden einem Hitzestress

(30°C) ausgesetzt waren, zeigten jedoch keine Erhöhung der endogenen DnmA Aktivität.

Weiterhin konnten vierstündige Hungerphasen sowie Langzeitkultivierung als Umweltfaktoren

ausgeschlossen werden.

In S. pombe scheint die Pmt1-Aktivität aufgrund des Peptongehalts im Medium zu variieren

(pers. Mitteiliung, M. Becker, Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen). Zugabe von

Pepton zum Medium erzeugt eine Erhöhung der tRNAAsp Methylierung auf 100%. Erste

Vermutungen zielen darauf ab, dass die Eigenschaft von Pepton als Stickstoffquelle der

entscheidende Faktor ist. Die erhöhte Aktivität des Enzyms scheint jedoch nicht mit erhöhter

Expression von Pmt1 einherzugehen.

In E. histolytica wird durch Glucoseentzug die tRNAAsp-Methylierung durch Ehmeth reduziert.

Hingegen konnte gezeigt werden, dass Stickstoffmonoxid zur Erhöhung der tRNAAsp

Methylierung führt, da es die Komplexbildung zwischen Ehmeth und Enolase, die als

Methylierungsinhibitor identifiziert wurde, verhindert (pers. Mitteilung von S. Ankri, Technion,

Haifa, Israel).

11. Diskussion

139

In vegetativ wachsenden Dictyostelium-Zellen wurde mittels qPCR die schwache Expression der

endogenen DnmA nachgewiesen (Kuhlmann et al. 2005 und pers. Mitteilung von I. Windhof).

Das Wachstum von Dictyostelium-Zellen für wenige Tage in einem Minimalmedium führte in

einem ersten Experiment zur Erhöhung der DnmA Expression. Inwiefern diese mit erhöhter

Methylierungsaktivität einhergeht, steht noch aus. Zusätzlich wurde bei DnmA-

Überexpressionsstämmen eine verspätete Entwicklung bei 16 Stunden beobachtet, die sich bis

zur vollständigen Ausbildung der Fruchtkörper nach 24 Stunden aber wieder aufhebt

(persönliche Mitteilung von I. Windhof).

Inwieweit möglicherweise vorhandene DNA-Methylierungsaktivität der Dnmt2-Homologe

Umwelteinflüssen unterliegt, bleibt ebenfalls Spekulation. Kontroverse Ergebnisse

verschiedener Arbeitsgruppen und teilweiser Verlust der Expression der Dnmt2–Homologe aus

Drosophila- und Entamoeba-Laborstämmen (pers. Mitteilung von G. Reuter, Universität Halle-

Wittenberg und S. Ankri, Technion, Haifa, Israel), lassen jedoch vermuten, dass Dnmt2

längerfristige Auswirkungen bei intrazellulären Reaktionen auf Umweltherausforderungen

wildlebender Organismen hat.

11.2. Dnmt2 als Multisubstrat-(t)RNA-Methyltransferase

Die Arbeitsgruppe von F. Lyko (DKFZ, Heidelberg) zeigte, dass in Drosophila zusätzlich zur

tRNAAsp(GUC) die tRNAGly(GCC) und tRNAVal(AAC) durch Dnmt2 in vivo methyliert werden (Schaefer et

al. 2010b). Im Rahmen dieser Arbeit konnte in vitro die tRNAGlu(UUC) aus Dictyostelium als

weiteres tRNA Substrat für DnmA und hDnmt2 identifiziert werden, wenngleich hier die

Methylierungseffizienz im Vergleich zur tRNAAsp deutlich geringer ausfällt. Bisulfitsequenzierung

der tRNAGlu in verschiedenen Dictyostelium Stämmen (Bsp.: wt, OE) konnte diese tRNA als in vivo

Substrat bisher nicht bestätigen. Auch hier ist unklar, inwiefern der Schritt der Reversen

Transkription auf wenig oder unmodifizierte RNAs selektiert (siehe auch Kapitel 11.3). In S.

pombe konnte in vitro und in einem Überexpressionsstamm auch in vivo tRNAGlu als weiteres –

wenn auch schwächeres - Substrat bestätigt werden (pers. Mitteilung, M. Becker, Abt.

Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen).

11.2.1. Ist die RNA Methylierung durch Dnmt2 sequenzspezifisch?

Mark Helm postulierte vor wenigen Jahren, dass hDnmt2 eine tRNA dann an der Position C38

effizient methyliert, wenn im Kontext des Anticodonstem und -loops ein bestimmtes

Sequenzmuster (C32, A37, C40) vorkommt (pers. Mitteilung, M. Helm, Johannes-Gutenberg

Universität, Mainz). Die in vitro Experimente mit verschiedenen Dictyostelium tRNAs bestätigten

11. Diskussion

140

diese Vermutung, da von den getesteten tRNAs ausschließlich die tRNAAsp und tRNAGlu dieses

Sequenzmuster zeigten und bisher auch nur diese beiden sowie eine synthetisch hergestellte

suppressor tRNAGlu als Substrate identifiziert wurden. Die beiden zusätzlichen Substrate

tRNAGly(GCC) und tRNAVal(AAC) aus Drosophila beinhalten ebenfalls das Erkennungsmuster

(Schaefer et al. 2010b). Eine weitere Gemeinsamkeit aller bisher identifizierten natürlichen

tRNA-Substrate ist, dass im Anticodon an der Position 36 ein Cytidin zu finden ist, d.h. es handelt

sich um tRNAs, die Codons erkennen, die mit einem Guanosin beginnen.

Die in vitro Blockierungsexperimente deuten daraufhin, dass möglicherweise noch weitere RNA

Spezies in der Größenordnung einer tRNA methyliert werden können. Im Rahmen des RNA-CLIP

Experiments mit Illumina®-Sequenzierung wurden zusätzlich Fragmente der tRNAGly(GCC) aus

Dictyostelium verstärkt mit DnmA angereichert gefunden. Allerdings fehlt dieser tRNA das C40

für ein vollständiges Erkennungsmuster. Interessanterweise hat auch die tRNAGlu aus S. pombe

ebenfalls nur ein unvollständiges Muster ohne C40, dient aber trotzdem als Substrat (pers.

Mitteilung, M. Becker, Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen). Die tRNAGly(GCC),

deren Drosophila-Homolog wie beschrieben bereits als Substrat bestätigt wurde, ist damit ein

interessanter neuer DnmA-Substratkandidat.

Allerdings scheinen andere Aspekte wie z. B. strukturelle Eigenschaften der tRNAs die

Enzymaktivität ebenfalls zu beeinflussen, da die bisher identifizierten Substrate mit deutlich

unterschiedlicher Effizienz methyliert werden. Die Beschaffenheit der tRNA-Enden haben jedoch

wenig oder keinen Einfluss auf die Substraterkennung, da auch eine in ein größeres Transkript

(gus-PSTVd) eingebettete tRNA Sequenz als Substrat erkannt wurde.

Dass das Vorkommen des vollständigen Erkennungsmusters in der Primärstruktur einer RNA

nicht allein ausschlaggebend für die Substraterkennung durch Dnmt2-Homologe ist, sondern

auch strukturelle Aspekte der RNA eine Rolle spielen müssen, bestätigen auch die Experimente

zur Methylierung von U-snRNAs. Trotz vollständiger Erkennungssequenz konnte die U4-snRNA

im Gegensatz zur U2-snRNA durch Dnmt2-Homologe in vitro nicht methyliert werden. Da die

U2-snRNA das potientielle Erkennungsmuster zweimal zeigt, wurden jeweils die möglichen

Zielcytosine C73 und C155 (Abbildung 41) zu A mutiert. Die Einzelmutanten zeigten jedoch

keinen Verlust der Methylierbarkeit durch Dnmt2. Inwiefern beide Cytosine parallel als Substrat

dienen, wird in Experimenten mit der U2-snRNA Doppelmutante C73A/C155A adressiert

werden. Eine weitere Hypothese besteht darin, dass ein Cytosin aus dem Stem loop IIa als

Zielnukleotid fungiert. Diese Annahme beruht darauf, dass der Stem loop IIa der U2-snRNA von

Dictyostelium möglicherweise einen U-turn beinhaltet, der von Anticodonloops in tRNAs

bekannt ist. Der U-turn ermöglicht in tRNAs, dass sich die drei Nukleotide des Anticodons durch

eine Drehung um die Phosphodiesterbindungen aus der tRNA herausklappen um so mit mRNAs

paaren zu können. Erstmalig wurde der U-turn im Anticodonloop der tRNAPhe beschrieben

11. Diskussion

141

(Quigley et al. 1976), später auch in anderen RNAs wie z. B. dem T-loop und Anticodonloop der

tRNAAsp (Westhof et al. 1985) sowie im Stem loop IIa der U2-snRNA aus Hefe (Stallings et al.

1997). Ein U-turn tritt auf, wenn in der RNA Struktur ein (Y)UNR-Motiv (Y-Pyrimidin, U – Uracil,

N – beliebiges Nukleotid, R – Purin) vorkommt (Abbildung 63). Sowohl der Stem loop IIa der

humanen als auch der Dictyostelium U2-snRNA zeigt das UNR-Motiv. Zusätzlich fällt in der

Dictyostelium U2-snRNA auf, dass im 3´-Bereich nach dem U-turn ein Cytosin zu finden ist. Geht

man von dieser Position als potentielles Zielnukleotid aus, entsprechen zwei weitere Cytosine

jeweils den Positionen „C32“ und „C40“ aus dem Erkennungsmuster (Abbildung 63).

Abbildung 63: Schematische Darstellung der Sekundärstruktur der U2-snRNA. Zusätzlich ist eine Übersicht über den Stemloop IIa der U2-snRNAs aus S. cerevisiae, H. sapiens und D. discoideum gezeigt. Das Vorkommen eines UNR-Motivs deutet auf einen U-turn hin, der von Anticodonloops aus tRNAs bekannt ist. Bei tRNAs scheinen U-turns auch ohne vollständiges UNR-Motiv aufzutreten. Im Stem loop IIa von D. discoideum tritt ein potientielles Zielcytosin (rot) auf. Vergleicht man die Positionen relativ zu diesem Cytosin mit denen der tRNA, lassen sich in der U2-snRNA je ein äquivalentes Nukleotid zum „C32“ und „C40“ (magenta) der tRNA feststellen.

Möglicherweise ist eine Kombination aus dem U-turn mit Teilen des Erkennungsmotivs

ausreichend um die U2-snRNA aus Dictyostelium mit Dnmt2-Homologen zu in vitro schwach zu

methylieren. Eine entsprechende tRNA mit allen Nukleotiden des Erkennungsmusters außer

dem A37 kommt in Dictyostelium natürlicherweise nicht vor und wurde daher auch in unserer

11. Diskussion

142

Studie nicht berücksichtigt. Die humane U2-snRNA zeigt zwar das UNR-Motiv, hat aber kein

Cytosin als potientielles Zielnukleotid im Loop. Bisher konnte auch keine Methylierung der

humanen U2-snRNA gezeigt werden. Die U4-snRNA diente in den Methylierungsstudien

ebenfalls nicht als Substrat und soweit bekannt, wurden für diese RNA bisher auch keine U-turn

Motive beschrieben.

11.2.2. Methylierung vs. Bindung - dynamische Substraterkennung durch Dnmt2

Die Methylierungsreaktion der Dnmt2 ist durch das Auftreten eines kovalenten

Übergangszustandes gekennzeichnet. Allgemein wird angenommen, dass bei Auftreten dieses

kovalenten Komplexes zwischen Enzym und Substrat die Methylierungsreaktion nur noch in die

Richtung des Transfers der Methylgruppe auf das Substrat ablaufen kann.

V. Maximov charakterisierte den kovalenten Übergangszustand der Methylierungsreaktion von

tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC) mit rekombinanter DnmA und hDnmt2 (Maximov 2010). Analysen

zur Kinetik ergaben, dass die Bildung des kovalenten Übergangszustands zwischen

DnmA/hDnmt2 und den tRNA Substraten zeitabhängig ist (Maximov 2010). Die Zunahme und

darauf folgende Abnahme der Anzahl kovalenter Komplexe spiegelt den Umsatz von nicht-

methylierten zu methylierten tRNAs in der Reaktion wieder. Das Maximum kovalenter

Komplexe wird mit der tRNAGlu deutlich später (nach ca. 10 min Reaktionszeit) als mit der

tRNAAsp (nach ca. 1 min Reaktionszeit) erreicht (Abbildung 64) und entspricht damit dem

Ergebnis der Methylierungsstudien: tRNAAsp ist gegenüber der tRNAGlu das effizientere Substrat.

Abbildung 64: Kinetik der kovalenten Komplexbildung zwischen Dnmt2-Homologen und tRNAAsp , tRNAGlu

und einem ssDNA-Oligo (28nt C). Radioaktiv markierte Substrate wurden mit SAM und rekombinanter DnmA/hDnmt2 inkubiert und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Exposition und Auswertung erfolgte mit Hilfe des Phosphoimagers (Fujifilm FLA-7000) und der Auswertungssoftware Multigauge. Das stärkste Signal wurde auf 100% normalisiert. Diese Graphik wurde zusammengestellt aus Daten der Doktorabeit von V. Maximov (2010) und der Examensarbeit von S. Junk (2010).

11. Diskussion

143

In Zusammenarbeit mit S. Junk wurde die Analyse kovalenter Komplexe auf weitere tRNAs

ausgeweitet (Junk 2010). Abgesehen von tRNALeu(UAG) zeigten nur die tRNAs, die auch als

Methylierungssubstrat dienten, kovalente Komplexbildung (Tabelle 22). S. Junk konnte mit

tRNALeu(UAG) einen schwachen zeitabhängigen kovalenten Komplex nachweisen, der nach ca. 60

min nicht mehr detektierbar war (Junk 2010). Eine signifikante Methylierung dieser tRNA

konnte nicht nachgewiesen werden (Kapitel 10.1.4).

Tabelle 22: tRNAs, die hinsichtlich kovalenter Komplexbildung und Methylierungssubstrat getestet wurden.

Zielnukleotid & Sequenzmuster Aktivität

tRNA

C38 C32, A37, C40 -CH3 Komplex

Asp(GUC-1) + + + +

Asp(GUC-1) C38A - + -

Glu(UUC-5) + + + +

Glu(UUC-5) C38A - + - -

Antisense Glu(UUC-5) - - - -

Sup. Glu(CUA) + - + +

Antisense sup. Glu(CUA) - - - -

Leu(UAG-1) + nur C40 - +

Leu(AAG-8) + - - -

Val(CAC-1) + nur A37 - -

Phe(GAA-1) - nur C32 - -

V. Maximov und S. Junk wiesen zusätzlich mit einzelsträngigen DNA Oligonukleotiden (z. B. 28nt

Cytosin) eine zeitabhängige kovalente Komplexbildung nach. Allerdings bildet sich der Komplex

aus DnmA/hDnmt2 mit dem DNA Oligonukleotid deutlich langsamer und zeigt keinen Rückgang

über einen Zeitraum von 240 min (Abbildung 64). Das Poly-C-DNA Oligonukleotid diente in

Methylierungsstudien mit hDnmt2 und DnmA nicht als Substrat (Daten nicht gezeigt).

Vermutlich werden ssDNA-Oligonukleotide unspezifisch vom aktiven Zentrum des Enzyms

gebunden, da die SDS-resistenten Komplexe auch mit der hDnmt2 E119A-Mutante vorkamen.

Das Glutamat E119 stabilisiert den kovalenten Übergangszustand (Kapitel 6.1.3).

Überraschenderweise waren die Komplexe mit der Mutante hDnmt2 C79A zwar deutlich

reduziert, aber immer noch schwach detektierbar (Junk 2010). Das C79 ist das katalytische

Cystein aus Motiv IV (Kapitel 6.1.3).

11. Diskussion

144

Die gewonnen Daten geben einen Hinweis darauf, dass Substraterkennung durch Dnmt2 ein

hochdynamischer Prozess ist und kovalente Komplexbildung auch nicht-produktiv auftreten

kann (Maximov 2010).

Aus den bisher bekannten Daten lässt sich schlussfolgern, dass Dnmt2-Homologe eine

konservierte Aktivität hinsichtlich der tRNA-Methylierung haben und vermutlich Multisubstrat-

tRNA-MTasen sind. Dabei ist die tRNAAsp Methylierung die robusteste Enzymaktivität. Die

Substraterkennung durch Dnmt2 unterliegt keinem Alles-oder-Nichts-Prinzip, sondern ist ein

hochdynamischer Prozess, bei dem neben einem spezifischen Sequenzmuster vermutlich auch

strukturelle Aspekte eine wichtige Rolle spielen. Ob alle bisher identifizierten RNA-Substrate

biologische Relevanz haben, muss noch gezeigt werden. Die Dnmt2-abhängige tRNA-Stabilität

unter Stress wurde für mehrere tRNA-Substrate in Drosphila bestätigt (Schaefer et al. 2010b).

11.3. Identifizierung von neuen putativen RNA-Substraten mittels RNA-CLIP

Zur Identifikation von potientiellen neuen Dnmt2-Substraten wurden zwei Crosslink-RNA-

Immunopräzipitationen mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt. Da

die Datensätze der beiden Experimente nur wenige Gemeinsamkeiten zeigen, sollen an dieser

Stelle die methodischen Unterschiede zwischen den beiden RNA-CLIP Ansätzen beschrieben

werden (Abbildung 65).

Bei der ersten RNA-Immunopräzipitation wurde Formaldehyd-Crosslinking verwendet.

Formaldehyd ist ein effizienter Crosslinker, jedoch führt dieses Reagenz im Gegensatz zu UV-

Licht häufig zu unspezifischen Vernetzungen (pers. Mitteilung, J. Vogel, Universität Würzburg).

Außerdem wurde zunächst ein mildes Crosslink Reversal durchgeführt um Degradation der RNA

zu vermeiden. Vermutlich war dieses Crosslink-Reversal zu mild, so dass Reste des Proteins an

den assoziierten RNAs verblieben. Dies führte wahrscheinlich zu häufigem Abbruch der

Reversen Transkription bei der für die nachfolgende Sequenzierung benötigten cDNA-Synthese.

Dies könnte eine Erklärung für die kaum vorhandenen tRNA Sequenzen in dem Datensatz des

ersten RNA-CLIP Experiments sein. Endogene tRNAs sind aufgrund der Modifikationen ohnehin

oft nur unzureichend revers transkribierbar. Beispielsweise ist für die Modifikation N1-

Methyladenosin in human tRNAs bekannt, dass Primerextension-Reaktionen an dieser Stelle

abbrechen (Saikia et al. 2010).

11. Diskussion

145

Abbildung 65: Übersicht über die methodischen Unterschiede der beiden RNA-CLIP Experimente.

Beim Vergleichen von Sequenzhäufigkeiten aus Next-Generation-Sequenzierungen muss

grundsätzlich bedacht werden, dass die cDNA-Synthese durch verschiedene Komponenten

beeinflusst wird und die cDNA-Bibliothek möglicherweise nicht die realen Sequenzhäufigkeiten

widerspiegelt. Beispielsweise inhibiert 2´-O-Methylierung am 3´-Ende einer RNA die Ligation

des Poly-A-Linkers, der als Primer-Bindestelle bei der Reversen Transkription fungiert

(Abbildung 35). RNAs mit der genannten Modifikation sind folglich in cDNA Bibliotheken häufig

nicht repräsentativ vertreten (Munafo et al. 2010).

Bei dem ersten RNA-CLIP Experiment handelte es sich um ein Pilot-Experiment, bei dem nur

20.000 Sequenzen pro Probe (DnmA-GFP und GFP-Kontrolle) erhoben wurden. Da davon ca.

19.000 Sequenzen rRNAs zugeordnet werden konnten, verblieben nur ca. 700 Sequenzen, die zu

genomischer DNA passten. Aufgrund der geringen Datenmenge wurde keine Normalisierung

durchgeführt. Die Illumina®-Sequenzierung des zweiten RNA-CLIP Experiments ergab 5,5 Mio.

Sequenzen pro Probe. Davon ließen sich bei der DnmA-GFP Probe ca. 1 Mio. und bei der GFP-

Kontrolle ca. 500.000 Sequenzen der genomischen DNA zuordnen. Die rDNA Sequenzen sind bei

diesem Experiment in Tabelle 18 mit nur 5000 – 6800 Sequenzen angegeben. Dies entspricht

vermutlich nicht der Realität, da viele rRNA Sequenzen von Dictyostelium in zusätzlichen Contigs

auf der Dictybase gespeichert sind, da diese Sequenzen keiner Position im Genom oder dem

rDNA Palindrom zugeordnet werden konnten. Diese Contigs wurden in der Auswertung der

RNA-CLIP Daten nicht erfasst. Es ist also wahrscheinlich, dass die verbleibenden 4 Mio. bzw. 4,5

Mio. Sequenzen den rRNA-Contigs zugeordnet werden können. Zusätzlich wurde bei der

Auswertung der Daten des zweiten RNA-CLIP Experiments eine Normalisierung der Daten

11. Diskussion

146

durchgeführt um die Sequenzhäufigkeiten zwischen DnmA-GFP und GFP auszugleichen. RNA

Kandidaten, die im Rahmen dieser Auswertung als mit DnmA angereichert identifiziert wurden,

unterlagen damit den strengeren Auswahlkriterien.

Im Folgenden sollen zunächst die in beiden Experimenten vorkommenden snoRNA, snRNA und

intergenischen Sequenzen diskutiert werden, wobei ein Schwerpunkt auf der U2-snRNA liegt.

Inwiefern identische intergenische Transkripte in den beiden RNA-CLIP-Ansätzen angereichert

wurden, wurde bisher nicht analysiert, wird aber ein Schwerpunkt zukünftiger Arbeiten sein. In

einem weiteren Kapitel werden im Anschluss die ausschließlich im zweiten RNA-CLIP

Experiment aufgetreten tRNA Fragmente thematisiert.

11.3.1. U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA Substrat der Dnmt2

In den Daten des ersten RNA-CLIP-Experiments mit 454-Sequenzierung waren vor allem U-

snRNAs, snoRNAs sowie intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Von ausgewählten

RNAs konnte nur für die U2-snRNA (rnu2a/b), aber nicht für die U4-snRNA (rnu4a) sowie die

snoRNA (sno7) und zwei intergenische Sequenzen, schwache Methylierung durch Dnmt2-

Homologe in vitro detektiert werden. Außerdem konnte bisher weder das Zielnukleotid

identifiziert (siehe auch Kapitel 11.2.1) noch ein eine m5C-Methylierung der U2-snRNA in vivo

bestätigt werden. Zusätzlich war die Anreicherung der U2-snRNA mit DnmA mit der zweiten

RNA-CLIP nicht reproduzierbar. Hierbei wurde jedoch die U1b-snRNA deutlich angereichert

gefunden.

Hinweise, dass Dnmt2-Homologe mit dem Spleißosom assoziiert sein könnten, geben allerdings

die in HeLa-Zellen identifizierten Interaktionen von Dnmt2 mit Proteinen der RNA

Prozessierungsmaschinerie (Thiagarajan et al. 2010). Darunter sind u. a. die Proteine NonO und

SfpQ, die bevorzugt mit prä-mRNA assoziiert sind und für die Bildung des Spleißosoms benötigt

werden (Thiagarajan et al. 2010). In einem der Pulldownexperimente von V. Maximov war mit

geringem score eine U5 small nuclear ribonucleoprotein DEAD/DEAH box Helikase (ascc3l)

vertreten (Maximov 2010).

In Vertebraten gilt die U2-snRNA mit einem 5´-Trimethylguanosin-Cap, zehn 2´-O-

Methylierungen und 13 Pseudouridinen als die spleißosomale RNA mit den meisten bekannten

Modifikationen (Yu et al. 1998). Davon kommt die Mehrheit im 5´-Bereich der U2-snRNA vor,

wobei drei Pseudouridine und fünf 2´-O-Methylierungen in den ersten 20 Nukleotiden für die

Assemblierung des spleißosomalen E-Komplexes essentiell sind (Donmez et al. 2004). Ebenfalls

sind Basenmethylierungen wie m6A, m6Am und m2G, jedoch bisher kein m5C, in U-snRNAs

beschrieben worden (zusammengefasst in Massenet et al. 1998).

11. Diskussion

147

Aus den bisherigen Daten kann noch keine eindeutige Aussage getroffen werden, ob Dnmt2-

Homologe die U2-snRNA zuverlässig modifizieren (siehe Kapitel 11.2.1). Unwahrscheinlich, aber

nicht auszuschließen ist, dass die in vitro beobachtete Modifikation durch eine Kontamination

der rekombinanten DnmA und hDnmt2-Präparationen aus E. coli verursacht wird.

Für eine Interaktion von DnmA mit snoRNAs gibt es aus der Literatur keine weiteren Hinweise.

Allerdings wurde - wenn auch mit geringer Abdeckung - in dem Pulldown mit StrepII-DnmA eine

rRNA MTase identifiziert, die einen indirekten Hinweis auf eine Interaktion mit snoRNAs, die in

die 2´O-Methylierung von rRNAs involviert sind, geben könnte.

11.3.2. DnmA ist mit tRNA-Fragmenten assoziiert

Die Ergebnisse des zweiten RNA-CLIP Experiments zeigen eine deutliche Anreicherung von

verschiedenen tRNA-Fragmenten in der DnmA-GFP Fraktion. Diese Fragmente sind ca. 20 –

24 nt lang und stammen überwiegend aus einem Bereich, der im Anticodonloop der tRNA

beginnt und sich bis zum T-Loop erstreckt („mid“-Fragmente). Entsprechend der Annahme, dass

tRNAAsp(GUC) das Hauptsubstrat von DnmA darstellt, sind „mid“-Fragmente dieser tRNA am

häufigsten verteten. Mit abnehmender Sequenzhäufigkeit folgen Fragmente der beiden

tRNAGlu(UUC/CUC) sowie der tRNAGly(GCC) (Abbildung 66). Die Vergleiche der Sequenzhäufigkeiten

der „mid“-Fragmente beruhen auf der Annahme, dass die Effizienz der cDNA-Synthese der

verschiedenen tRNA-Fragmente etwa gleich war.

Auch wenn die tRNAGlu(UUC) bisher nur in vitro als Substrat identifiziert werden konnte, geben die

Daten des RNA-CLIP Experiments einen Hinweis darauf, dass sowohl die tRNAGlu(UUC) als auch die

tRNAGlu(CUC) möglicherweise auch in vivo als Substrate dienen könnten. Dass die tRNAGlu-

Fragmente mit geringerer Sequenzhäufigkeit vertreten sind als die der tRNAAsp(GUC), steht im

Einklang mit den Beobachtungen, dass die Methylierungseffizienz der tRNAGlu(UUC) im Vergleich

zur tRNAAsp(GUC) deutlich reduziert war. Überraschend war die hohe Affinität der DnmA zu

Fragmenten der tRNAGly(GCC), denn im Gegensatz zu den tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) besitzt

die tRNAGly(GCC) das Erkennungsmuster nur unvollständig (siehe Kapitel 11.2.1).

Grundsätzlich besteht die Möglichkeit, dass tRNAGlu und tRNAGly in vivo keine

Methylierungssubstrate sind, aber trotzdem mit DnmA assoziieren. Von den in vitro

Bindungsstudien ist beispielsweise bekannt, dass DnmA Affinität zu allen getesteten

Nukleinsäuren besaß und selbst mit RNAs wie der tRNALeu(UAG), die in vitro nicht effizient

methyliert wurden, unter denaturierenden Bedingungen stabile Komplexe ausbilden konnte

(Junk 2010; Maximov 2010).

Bezüglich der tRNA „mid“-Fragmente kann nicht ausgeschlossen werden, dass diese als Folge

selektiver Reverser Transkription in den Daten überrepräsentiert sind. Aufgrund ihrer geringen

11. Diskussion

148

Länge und damit geringerer Anzahl an möglicherweise störenden Modifikationen können die

Fragmente effizienter in cDNA umgeschrieben werden als Volllänge tRNA. Da Volllänge tRNAs in

im Gegensatz zu den tRNA-Fragmenten meist in der DnmA-GFP-Probe und in der GFP Kontrolle

gleichermaßen verteten waren, deutet dies auf eine spezifische Interaktion zwischen DnmA und

den „mid“-Fragmenten. Allerdings besteht die Möglichkeit, dass spezifisch von DnmA gebundene

Volllänge-tRNAs während des Experiments degradieren und ausschließlich das vom Enzym

gebundene Teilstück intakt bleibt („Footprint“).

Einen indirekten Hinweis für die Spezifität der mit DnmA assoziierten tRNA Fragmente geben

zusätzlich Daten einer Next-Generation-Sequenzierung kleiner RNA aus vegetativ wachsenden

Dictyostelium-Zellen der Arbeitsgruppe von Fredrik Söderbom. Ein Screening der Daten auf

tRNA Fragmente (10 – 35 nt) ergab, dass die meisten tRNA Fragmente eine Größe von ca. 15 nt

hatten (pers. Mitteilung von F. Söderbom, Uppsala Centre for Comparative Genomics, Universität

Uppsala). Ein Vergleich der RNA-CLIP Daten zu den Daten von F. Söderbom zeigt, dass die RNA-

CLIP-Ergebnisse nicht den Durchschnitt der tRNA-Fragmente in vegetativen Zellen

widerspiegeln (Abbildung 66). Nach diesen Daten stellen Fragmente der tRNAIle(AAU), tRNALys(UUU)

und tRNAArg(ACG) die meisten kleinen tRNA-Fragmente in Dictyostelium-Zellen.

Abbildung 66: Darstellung der relativen Häufigkeiten ausgewählter tRNA-Fragmente in vegetativ gewachsenen Dictyostelium-Zellen im Vergleich zu tRNA-Fragmenten aus den RNA-CLIP Daten. Die RNA-CLIP Daten stellen jeweils die Differenz der tRNA-Fragmente aus der DnmA-GFP-Probe und der GFP-Kontroll-fraktion dar. Die Größe und Position der tRNA Fragmente wurden in dieser Darstellung nicht berücksichtigt. Die Daten der tRNA-Fragmente aus vegetativen Zellen wurden freundlicherweise von F. Söderbom (Universität Uppsala) zur Verfügung gestellt.

11. Diskussion

149

tRNA Fragmente und deren Funktion in anderen Organismen

Die Existenz von tRNA-Fragmenten ist mittlerweile in vielen Organismen nachgewiesen.

Meistens handelt sich hierbei aber um Fragmente des 5´- oder 3´-Endes der tRNA oder so

genannte „halbe“-tRNA (~ 30 – 40 nt). In HeLa-Zellen wurden beispielsweise 19 nt große

Fragmente des 5´-Endes verschiedener tRNAs (Lys, Val, Gln, Arg) nachgewiesen, die sich durch

2´-O-Methylierung am 3´-Ende auszeichneten und Dicer-abhängig generiert wurden, aber nicht

mit Argonauten präzipitieren (Cole et al. 2009). Eine weitere Studie berichtet hingegen über

überwiegend mit Argonauten assoziierte tRNA-Fragmente mit 5´-Monophosphat und 3´-

Hydroxylgruppe (Haussecker et al. 2010). Gemeinsam ist den genannten tRNA-Fragmenten, dass

sie überwiegend cytoplasmatisch vorkommen. In Wurzeln von Arabidopsis mit Phosphatdefizit

wurde ebenfalls eine Anreicherung von 19nt-Fragmenten des 5´-Endes von tRNAs detektiert

(Hsieh et al. 2010). In Tetrahymena sind ~18-22 nt lange 3´-tRNA-Fragmente mit dem Piwi-

protein Twi12 assoziiert (Couvillion et al. 2010). Zusätzlich kommen in humanen Zellen durch

RNAseZ generierte 3´-tRNA Fragmente vor, die bevorzugt mit Ago3 und Ago4 interagieren

(Haussecker et al. 2010). Aus der Assoziation mit Argonauten erwächst auch die Vermutung,

dass kleine tRNA-Fragmente (tRFs, tsRNAs) möglicherweise siRNA oder miRNA ähnliche

Funktionen im Rahmen RNA vermittelter Genregulation, wie z.B. dem RNAi-Mechanismus,

spielen könnten (Thompson et al. 2009). Eine weitere Studie weist außerdem daraufhin, dass

sich hinter einigen annotierten humanen miRNAs tRNA-Fragmente verbergen (Schopman et al.).

In dem RNA-CLIP Experiment aus Dictyostelium waren 17nt Fragmente der 5´-Enden der

tRNACys(GCA) und tRNATrp(UGU) mit DnmA leicht angereichert. Deutliche Präferenz für DnmA zeigte

ein 3´-Fragment (20nt) der tRNAAla(AGC) sowie ein 42nt 3´-Fragment der tRNAGly(GCC). Mit welcher

Häufigkeit diese Fragmente in Wildtypzellen vorkommen und ob sie eine biologische Funktion

erfüllen, wird Inhalt zukünftiger Projekte sein.

Grundsätzlich müssen die konstitutiv generierten tRNA-Fragmente jedoch von stress-

induzierten tRNA Fragmenten (tiRNA – tRNA-derived stress-induced RNAs) unterschieden

werden, die Produkte von Ribonukleasen wie RNY1 aus Hefe und Angiogenin im Menschen

darstellen (zusammengefasst in Thompson et al. 2009) und meist im Anticodonloop geschnitten

werden. Für stress-induzierte 5´-tiRNA (aber nicht 3´-tiRNA) ist gezeigt worden, dass diese die

Translation (z. B. durch Beteiligung an der Verdrängung von Translations-Initiationsfaktoren

von der mRNA) inhibieren können (Ivanov et al. 2011). Zusätzlich sind 5´-tiRNAs an der

Induktion von Stressgranula beteiligt (Emara et al. 2010). Der Dnmt2-abhängigen tRNA

Methylierung ist eine Bedeutung bei der Erhaltung der tRNA Stabilität unter Stress

zugesprochen worden und es gibt erste Hinweise, dass Dnmt2 unter Stress in Stressgranula

lokalisiert (Schaefer et al. 2010b; Thiagarajan et al. 2010). Zudem wurde mittels

Immunopräzipitation eine Interaktion von Dnmt2 mit Proteinen aus RNA-

11. Diskussion

150

Prozessierungsmechanismen (u.a. dem Tranlationsinititationfaktor eIF4E) nachgewiesen

(Thiagarajan et al. 2010).

Die Interaktion von DnmA mit antisense-tRNA-Fragmenten

Ein überraschendes Ergebnis war die Entdeckung kurzer antisense-tRNA-Fragmente, die

ausschließlich mit DnmA-GFP präzipitierten. Inwiefern die as-Fragmente der tRNAGlu tatsächlich

deutlich verstärkt zu anderen as-tRNA-Fragmenten vorkommen, wird Gegenstand zukünftiger

Untersuchungen sein. Auch unter der Annahme, dass die RNA-CLIP-Daten aufgrund der

methodischen Grenzen nicht exakt die Stöchiometrie zwischen sense und antisense tRNA-

Fragmenten widerspiegeln, ist unwahrscheinlich, dass es sich bei den tRNA-Fragmenten um

Dicer-Produkte handelt. Geht man von einem Hybrid aus sense und antisense Fragmenten aus,

sind die as-Fragmente an jeder Seite ein paar Nukleotide kürzer. Klassische Dicerprodukte

hingegen würden sich durch 2nt 3´-Überhänge an jedem Ende des Hybrids auszeichnen. Das

Auftreten von kleinen antisense tRNA-Fragmenten wurde meines Wissens in der Literatur

bisher noch nicht beschrieben.

11.4. Biologische Funktionsanalyse von Dnmt2

11.4.1. Einfluss der tRNAAsp Methylierung auf die Translationseffizienz

Die Untersuchung des Einflusses der tRNAAsp Methylierung auf die Translationseffizienz sollte

gleichzeitig zwei Fragen beantworten:

a) Führt der Verlust der tRNAAsp-Methylierung durch DnmA zu einer Reduktion der

Translationseffizienz von Aspartat-reichen Regionen?

b) Inwiefern beeinflusst die DnmA-abhängige tRNA-Modifikation das „Wobbling“ der

tRNAAsp, da in Dictyostelium nur eine tRNAAsp(GUC)-Spezies bekannt ist, die das seltene GAC

Codon erkennt, aber keine tRNAAsp(AUC), die komplementär zum häufig benutzten GAU

Codon ist?

Das Experiment resultierte entgegen der Erwartung in einer leicht effizienteren Translation der

Asp-Leader-GFP-Reportergene in dnmAKO-Zellen im Vergleich zum Wildtyp. Grundsätzlich

scheint die Translationseffizienz zwischen Populationen mit dem gleichen genetischen

Hintergrund von Transformation zu Transformation jedoch stark zu variieren. Nur bei

paarweiser Betrachtung der Populationen mit Wildtyp- und Knockout-Hintergrund, die an einem

11. Diskussion

151

Tag entstanden sind, waren die Differenzen in der Translationseffizienz des Reportergens

zwischen Wildtyp- und dnmAKO-Zellen signifikant. Zusätzlich wurde entgegen der Erwartung das

seltenere GAC-Codon sowohl im Wildtyp als auch in den dnmAKO-Mutanten im Vergleich zum

GAU-Codon verstärkt translatiert. Inwiefern die beschriebenen Beobachtungen tatsächlich

vorliegen oder aufgrund der verwendeten Methoden resultiert, kann derzeit nicht eindeutig

geklärt werden.

Ein methodischer Einfluss könnte von der Bestimmung der mRNA Menge der Zellpopulationen

ausgegangen sein, die mittels relativer Quantitfizierung (qPCR) mit der ΔΔCt-Methode erfolgte.

Ein limitierender Faktor dieser Auswertungsmethode besteht darin, dass beispielsweise leichte

Unterschiede zwischen zwei Zellpopulationen verstärkt dargestellt werden, da von einer

Verdopplung des PCR-Produktes pro Zyklus ausgegangen wird. Da die Translationseffizienz als

Quotient aus der Fluoreszenz des GFP-Reportergens und dem zugehörigen mRNA Gehalt

definiert wurde, führt ein möglicherweise zu gering berechneter mRNA Gehalt zu einer

Erhöhung der Translationseffizienz. Ein nächster Schritt zur Überprüfung der Daten könnten

Kompensationsexperimente mit heterolog exprimierter DnmA in dnmAKO-Zellen sein.

In mehreren Wachstumsexperimenten, in denen Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO-Zellen über

mehrere Wochen cokultiviert wurden, überwuchs die Mutante den Wildtyp-Stamm (pers.

Mitteilung von S. Kasten). Ob eine erhöhte Wachstumsrate der Mutanten mit potentiell erhöhter

Translationseffizienz einhergeht, ist noch unklar.

Nakamura et al. (2006) stellten mit Hilfe eines in vitro Translationssystems fest, dass in

Chloroplasten von Tabakpflanzen die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens mit

vorgeschaltetem Codon-Block nicht unbedingt mit der Häufigkeit der Codons korreliert.

Beispielsweise wurden das Phenylalanin-Codon UUU sowie das Tyrosin-Codon UAC doppelt so

gut translatiert, obwohl es sich hierbei um die seltenen Codons der jeweiligen Codon-Familie

handelte. Zusätzlich hatte das GCU von den getesteten Alanin-Codons die höchste

Translationseffizienz, obwohl das Chloroplastengenom für keine tRNAAla(AGC) kodiert (Nakamura

et al. 2007).

In dem eukaryotischen Modellorganismus S. cerevisiae wurde ebenfalls mit Hilfe eines

Reportergens eine codonspezifische Rolle bei der Translationselongation für die TRM9-

vermittelte Modfikation der Position U34 beschrieben (Begley et al. 2007). TRM9 katalysiert den

letzten Schritt bei der Bildung von mcm5U34 und mcm5s2U34 der tRNAArg und tRNAGlu. Zur

Messung der Translationseffizienz wurde hier ein lacZ-Reportergen generiert, welches fünf-

oder zehnmal die Arginin-Codons AGA oder AGG enthielten. Bei gleicher Transkriptmenge ging

die Menge des Reporterenzyms ß-Galactosidase in TRM9-Mutanten um den Faktor 6 – 10

zurück. Weiterführende Experimente deuten daraufhin, dass die TRM9-abhängige Modifikation

vor allem die Translationseffizienz des AGA-Codons beeinflusst (Begley et al. 2007).

11. Diskussion

152

Ein Translationssystem der Arbeitsgruppe von A. Jeltsch, bei dem die Menge eines Asp-leader

Fluoreszenzproteins gegen ein Referenzprotein ohne Leader bestimmt wurde, zeigte in

vorläufigen Experimenten eine reduzierte Fluoreszenz des Reporterproteins in dnmt2-/- MEF-

Zellen (pers. Mitteilung von A. Jeltsch, Abt. Biochemie, Jacobs University, Bremen) und

widerspricht damit den in dieser Arbeit generierten Daten. Ein zweiter Ansatz dieser

Arbeitsgruppe adressiert außerdem die Beladung der tRNAAsp durch die Aminoacyl-tRNA-

Synthetase, da die Dnmt2-abhängige tRNA Modifikation die Translation auch auf diese Weise

beeinflussen könnte.

11.4.2. Protein-Protein-Interaktionen

Mittels Pulldown-Experimenten und nachfolgender Massenspektrometrie konnten in

Dictyostelium bisher keine Protein-Interaktionspartner von DnmA identifiziert werden. Die in

dieser Studie mit StrepII-DnmA leicht angereicherten Proteine, z. B. ein SNF2 ähnliches Protein

als Bestandteil eines Chromatin-remodeling-Komplex, eine eIF2a Kinase, eine ribosomale SAM-

MTase sowie RNA bindende Proteine, die in RNA Prozessierung im Kern involviert sind, ließen

sich aufgrund ihres thematischen Kontext als potentielle Dnmt2-Interaktionspartner einordnen.

Beispielsweise führten Mutationen in Proteinen aus Chromatin-remodeling-Komplexen wie der

SNF2-Familie zu veränderten DNA Methylierungsmustern in Pflanzen und Tieren (Jeddeloh et al.

1999; Gibbons et al. 2000). eIF2-Kinasen phosphorylieren den Translationsinitiationsfaktor eIF2

im Rahmen von zellulären Stressantworten, was zu globaler Translationsreduktion sowie

induzierter Translation spezifischer mRNAs spezieller Transkriptionsfaktoren führte (Wek et al.

2006). Insgesamt kommen die oben genannten Proteine aber mit zu geringerer Abdeckung vor

um eindeutig identifiziert zu werden. Möglicherweise ist dies auf die geringe endogene DnmA

Expression zurückzuführen, sofern Interaktionspartner in stöchiometrischen Mengen erwartet

werden. Ähnliche Interaktionsstudien mit Pmt1 aus S. pombe sowie ein Synthetic-lethal-Screen

konnten ebenfalls keine Interaktionspartner identifizieren (pers. Mitteilung, M. Becker, Abt.

Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen).

Für das Dnmt2-Homolog Ehmeth ist eine Interaktion mit dem glykolytischen Protein Enolase

beschrieben, welches inhibitorisch auf die tRNAAsp Methylierung durch Ehmeth wirkt (Tovy et al.

2010). Außerdem wurden kürzlich Troponin ähnliches Protein (keine Homologe in anderen

Organismen) und Krip1, ein Protein das in die Pathogenität von Entamoeba involviert ist, als

potentielle Interaktionspartner von Ehmeth entdeckt (pers. Mitteilung von S. Ankri, Technion,

Haifa, Israel). Wie im Kapitel 11.3 angesprochen, konnte außerdem gezeigt werden, dass Dnmt2

aus HeLa-Zellen mit Proteinen der RNA Prozessierungsmaschinerie interagiert (Thiagarajan et

al. 2010).

11. Diskussion

153

11.4.3. Beeinflusst DnmA die Aufnahme von Fremd-DNA?

Beobachtungen, dass Transformationen von Dictyostelium dnmAKO-Zellen mit integrierenden

Plasmiden häufig ineffizienter ausfielen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen und dass andere

Arbeitsgruppen über reduzierte DNA Aufnahme in Säugerzellen mit Dnmt2-Deletion berichteten

(pers. Mitteilung von M. Schäfer, Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg und T. Jurkowski, Abt. Jeltsch,

Jacobs University, Bremen), gaben Anlass dieses Phänomen systematisch zu untersuchen. Die

Hypothese bestand darin, dass DnmA möglicherweise in die DNA Reparatur involviert ist, wenn

das Transgen ins Genom inseriert, da in vorherigen Versuchen bereits gezeigt wurde, dass die

Anzahl an Integrationen von Transgenen in den dnmAKO-Stamm reduziert ist (Kapitel 10.3.4).

Über eine Methyltransferase aus Aspergillus, die an RAD5-ähnliche SWI2/SNF2 ATPasen

gekoppelt ist, wurde berichtet, dass die MTase Aktivität vermutlich auf bestimmte

Gegebenheiten wie z.B. DNA Reparatur beschränkt ist (Iyer et al. 2011). Dnmt1 wird

beispielsweise ebenfalls zu DNA Reparaturstellen gebracht um dort die Methylierung wieder

herzustellen (Mortusewicz et al. 2005).

Entgegen der Erwartung zeigte ein zweiter dnmAKO–Stamm (dnmAKO „rox“) keine reduzierte

Transformierbarkeit mit einem integrierenden Plasmid im Vergleich zur zuerst untersuchten

dnmAKO-Mutante. Gleichzeitig zeigte der dnmAKO „rox“- Stamm auch keine Mobilisierung des

Retrotransposons skipper (Kapitel 9.5.2 und 10.5.2 10.5.3). Die dnmAKO „rox“-Zellen wurden

durch ein anderes Konstrukt generiert und die Resistenzkassette im Nachhinein entfernt. Der

Knockout-Status wird durch ein einziges Stop-Codon erhalten. Wie der dnmAKO-Stamm ist der

dnmAKO „rox“-Stamm durch RT-PCR und Southern-Blot bestätigt worden (Daten nicht gezeigt

und pers. Mitteilung von C. Joppich und I. Windhof). Außerdem ist in beiden Stämmen die C38

Methylierung der tRNAAsp nicht detektierbar und im Rahmen der Translationsstudien verhielten

sich beide Stämme ähnlich, so dass es bisher keine Erklärung für das unterschieliche Verhalten

der beiden Stämme bezüglich der Transformierbarkeit und der skipper-Regulation gibt. Ob das

instabilere Genom durch die Mobilisierung des Retrotransposons im dnmAKO-Stamm mit der

reduzierten Transformationsfähigkeit mittels integrierender Plasmide in Verbindung steht, ist

bisher nicht untersucht. Eine systematische Untersuchung verschiedener Klone eines Stammes

zur Bestimmung der biologischen Varianzen genetisch identischer Organismen ist

möglicherweise erforderlich.

Im Vergleich zu den oben diskutierten Ergebnissen war ebenfalls unerwartet, dass der dnmAKO

„rox“- Stamm bezüglich der Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids signifikant

reduzierte Transformierbarkeit zeigte. Für das unterschiedliche Verhalten des dnmAKO „rox“-

Stammes bezüglich der verschiedenen Plasmide gibt es bisher ebenfalls keine Erklärung. Die

beiden Plasmide werden mit unterschiedlichen Antibiotika selektiert. Inwiefern die Ausbildung

11. Diskussion

154

der verschiedenen Resistenzen gegen Blasticidin und Geniticin (G418) die

Transformationseffizienz beeinflusst, ist ebenfalls nicht untersucht.

11.4.4. DnmA - ein Regulator des Retrotransposons skipper?

Die in dieser Arbeit erhobenen Daten lassen keine eindeutige Zuordnung der skipper

Mobilisierung als DnmA-Funktion zu. Nur der dnmAKO–Stamm, aber nicht der Stamm

dnmAKO „rox“, zeigt erhöhte Expression des Retrotransposons skipper. Im Gegensatz zu den

veröffentlichten Daten (Kuhlmann et al. 2005) konnten außerdem keine zusätzlichen

genomischen Integrationen von skipper gefunden werden. Erhöhte Transkriptionslevel von

Transposons ohne nachfolgende Transposition sind von Arabidopsis-Setzlingen bekannt, die im

Syntheseweg für 24nt-siRNA mutiert sind (Ito et al. 2011). 24 nt-siRNA sind an RNA vermittelter

DNA Methylierung beteiligt. In Arabidopsis können Teile von Transposons – meist einzelne LTRs

– als zirkuläre extrachromosomale Kopien vorkommen. Ob Retrotransposons in Dictyostelium

einzeln extrachromsomal vorliegen, ist bisher nicht bekannt. Experimente mit einer synthetisch

hergestellten Form des Retrotransposon TRE5-A integrierten jedoch reproduzierbar in das

extrachromosmale rDNA Palindrom (Siol et al. 2011). Sollten in den dnmAKO-Zellen zusätzliche

skipper-Kopien in einer extrachromosomalen Form vorliegen, ist wahrscheinlich, dass diese bei

der zur DNA Präparation genutzten Methode nicht erfasst wurden. Inwiefern die in dieser Arbeit

ermittelten vorläufigen qPCR-Daten tatsächlich auf zusätzliche LTR-Kopien in dnmAKO-Zellen

hinweisen, wird in Folgeexperimenten geprüft werden.

Zwischen dem Auftreten kleiner skipper RNAs und der Expression von Volllängetranskripten

konnte bisher kein Zusammenhang hergestellt werden. Die Synthese moderater Mengen kleiner

skipper RNAs ist nicht DnmA spezifisch.

Weitere Expressionsanalysen des Retrotransposons DIRS-1 sowie TRE5, das überwiegend in der

Nähe von tRNA-Genen inseriert, zeigten im dnmAKO-Stamm keine erhöhte Transkription (pers.

Mitteilung B. Boesler, Universität Kassel und T. Winckler, Friedrich-Schiller-Universität Jena).

In Drosophila wurde vor einigen Jahren die Deletion von Dnmt2 mit dem Verlust von H4K20me3-

Methylierung und der damit verbundenen Mobilisierung von Retrotransposons in somatischem

Gewebe in Verbindung gebracht (Phalke et al. 2009). Neueste Daten der Arbeitsgruppe von

F. Lyko bestätigen die erhöhte Expression von Retrotransposons in Drosophila-Dnmt2-

Mutanten. Außerdem konnten mittels inverser PCR neue genomische Insertionen lokalisiert

werden (pers. Mitteilung, M. Schäfer, Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg). Inwiefern die beschriebenen

Effekte mit DNA Methylierung in Verbindung stehen oder ob die Dnmt2-abhängige tRNA-

Modifikationen Auswirkungen auf möglicherweise auftretendes tRNA-Priming bei der

Retrotransposition hat, bleibt momentan Spekulation.

11. Diskussion

155

11.5. Das Bindeverhalten des Methylated-LINE-Binding-Proteins aus E. histolytica

Die mittels Rasterkraftmiksroskopie erhobenen Daten geben einen ersten Hinweis darauf, dass

das Methylated LINE Binding-Protein aus E. histolytica (EhMLBP) bevorzugt eine der beiden A/T-

reichen Regionen der RT-LINE DNA bindet. EhMLBP weist damit nicht nur keine Homolgien zu

„klassischen“ Methyl-CpG-bindenen Proteine (MBDs) auf, sondern zeigt zusätzlich mit der

Präferenz für asymmetrische C-Atome, die in A/T reiche Sequenzen eingebettet sind, eine

weitere Besonderheit. In Dicytostelium wurden bisher keine MBD-Homologe beschrieben. Die

selektive Bindung an asymmetrisch methylierte CpA/T-Dinukleotide des MBD2-Homologs aus

Drosophila konnte nicht zuverlässig reproduziert werden (Roder et al. 2000; Marhold et al.

2004), so dass EhMLBP auch unter den „Dnmt2-only“ Organismen eine Sonderrolle spielt. In

weiteren RKM-Studien kann die genaue Bindungsposition ermittelt werden, wenn biotinylierte

Primer verwendet werden und so ein Ende des RT-LINE Fragments spezifisch definiert werden

kann.

12. Literaturverzeichnis

156


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Internetquellen

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Dictybase: http://dictybase.org

13. Erklärung

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13. Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte

Hilfe angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt

habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten

Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in

einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden.

Kassel, 27.10.2011

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