Biophysikalische Charakterisierung des Cl /H -Austauschers ... · Biophysikalische...

Biophysikalische Charakterisierung

des Cl-/H

+-Austauschers ClC-7

vorgelegt von

M. Sc. in Biomedizin

Lilia Leisle

geb. in Beresniki

von der Fakultät II – Mathematik und Naturwissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktorin der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Roderich Süssmuth

1. Gutachter: Prof. Dr. Thomas J. Jentsch

2. Gutachter: Prof. Dr. Thomas Friedrich

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 28.10.2011

Berlin 13.01.2012

D 83

Diese Arbeit wurde unter der Anleitung von Prof. Dr. Dr. Thomas J.

Jentsch am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) und

Leibniz-Institut für molekulare Pharmakologie (FMP) in Berlin angefertigt.

für meinen Bruder

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich herzlich bei Thomas Jentsch bedanken. Er gab mir

die Möglichkeit, in einer höchst kompetenten und stimulierenden wissenschaftlichen

Atmosphäre meine Doktorarbeit anzufertigen. Seine außerordentlich klare Denkweise

und unermüdliche Diskussionsbereitschaft bereicherten jede Fragestellung. Er

schaffte es genügend Freiheit bei der Bearbeitung von Projekten zu lassen und

zugleich Raum für Gelegenheiten zu bieten, von ihm direkt zu lernen – was mir

besonders am Herzen lag. Ich habe sehr viel bei Dir gelernt, Thomas. Vielen Dank

dafür!

Für die Begutachtung meiner Arbeit und den einfachen Einstieg in die TU möchte ich

mich herzlich bei Prof. Thomas Friedrich sowie Prof. Roderich Süssmuth bedanken.

Besonderer Dank gilt auch Tobias Stauber für seine wissenschaftliche und mentale

Unterstützung vor allem im letzten Jahr. Ohne ihn hätte Einiges viel länger gedauert.

Ich bin auch wirklich dankbar, dass er mich für meine ständige und manchmal

sicherlich lästige Fragerei nicht zum Teufel gejagt hat. Es hat Spaß gemacht, mit ihm

zusammen zu arbeiten!

Bei Anselm Zdebik und vor allem Ioana Neagoe möchte ich mich für die Einführung in

die Elektrophysiologie herzlichst bedanken. Ohne sie wäre ich anfänglich wohl

sicherlich an den set-ups und Fragen einige Male verzweifelt.

Andrew Plested empfing jedes wissenschaftliche Anliegen stets mit offenen Armen,

egal wie sehr er gerade selbst unter Zeitdruck stand. Er wusste außerdem genau,

wann eine Aufheiterung von Nöten war und meisterte es mit seinem britischen

Humor. Herzlichsten Dank dafür!

Silke Zimmermann danke ich für ihr großes Interesse an unserer gemeinsamen Arbeit

und die gewissenhafte Unterstützung im Labor. Unser humorvolles Miteinander

werde ich vermissen!

Bei allen aktuellen Mitarbeitern der AG Jentsch sowie den ehemaligen Kollegen

Ruben, Ioana, Patricia, Vanessa, Gesa, Gaia und Carsten möchte ich mich herzlich für

die angenehme und fruchtbare Arbeitsatmosphäre bedanken. Einigen davon (und

diejenigen wissen schon, wen ich meine) gilt außerordentlich herzlicher Dank nicht

nur für die Zeit im Labor, sondern auch außerhalb. Durch ihre stetige Hilfsbereitschaft

und Unterstützung in jeglicher Hinsicht sowie ihren Humor fühlte ich mich sehr wohl.

Ich habe die Zeit mit ihnen sehr genossen und neue Freunde gewonnen!

Ganz besonderer Dank gilt meinen Freunden, die mich stets unterstützt haben (ganz

gleich wie weit weg sie waren) und das Leben genießen ließen, egal wie grau der

Forscherhimmel erschien.

Mein allergrößter Dank gilt meinem Bruder und meinen Eltern. Ohne sie wäre Einiges

auf diesem Wege erschwert oder gar unmöglich gewesen.

Zusammenfassung

ClC-7 ist ein nahezu ubiquitär exprimiertes, spät-endosomales/lysosomales Säuger-

CLC-Protein von tragender Bedeutung für die intra-lysosomale Cl--Akkumulation und

für die Ansäuerung von Resorptionslakunen in Osteoklasten. Ostm1 ist bekannt als

seine Hilfsuntereinheit. So führen Mutationen in beiden Proteinen zu lysosomalen

Speicherkrankheiten und Osteopetrose. Die intrazelluläre Lokalisation dieses Cl-/H+-

Austauschers verwehrte seine biophysikalische Untersuchung. Durch Mutation

einiger Erkennungssequenzen für die zelluläre Sortierungsmaschinerie ist eine

partielle Umleitung des Proteins zur Plasmamembran gelungen und ermöglichte den

elektrischen Zugang über elektrophysiologische Standardmessmethoden. So konnte

im Rahmen der vorliegenden Arbeit ClC-7 als letztes Mitglied der Säuger-CLCs einer

biophysikalischen Grundcharakterisierung unterzogen werden.

ClC-7, genauer gesagt seine Plasmamembran-lokalisierte Mutante, ist ein langsam

gesteuerter, auswärts-gerichteter 2Cl-/1H+-Austauscher, der nur unter Anwesenheit

seiner Hilfsuntereinheit Ionen transportieren kann.

Seine starke Zeitabhängigkeit unterscheidet ClC-7 von den restlichen intrazellulären

Säuger-CLCs. Der Aktivierungsprozess läuft ca. zehn Mal langsamer ab als die

Deaktivierung und ist auch fast zwei Mal stärker Temperatur-abhängig, was auf eine

größere Konformationsänderung während der Aktivierung hinweist. In den

vorliegenden Experimenten konnte unter keinen Bedingungen ein stationärer

Zustand des Cl-/H+-Austausches erreicht werden.

Die starke Spannungsabhängigkeit ist allen Säuger-CLC-Antiportern gemein. Hier

konnte am Beispiel von ClC-7 zum ersten Mal gezeigt werden, dass die

Ionentranslokation durch den offenen Transporter nahezu linear von der

elektrochemischen Triebkraft abhängig ist und dass somit die Rektifizierung dem

Steuerungsverhalten des Proteins zu Grunde liegen muss. Es konnte ein V0,5 von 82

mV und eine Schaltladung von 1,32 bestimmt werden.

Sowohl die Zeit- als auch die Spannungsabhängigkeit konnte wie bei den anderen

CLCs durch Mutieren des gating-Glutamats, des molekularen Korrelats für das

schnelle gate der CLCs, aufgehoben werden – es entstand eine pure, nahezu

ohm‘sche Cl--Leitfähigkeit. Durch Mutation des intrazellulären H+-Akzeptors (Proton-

Glutamat) wurde ebenfalls wie bei den anderen Säuger-CLC-Antiportern nicht nur der

H+-Transport sondern auch der Anionen-Transport gänzlich unterbunden.

Der Transport von extrazellulären Anionen wurde in folgender Reihenfolge präferiert:

Cl- > Br- > NO3- > I-. Dabei konnte die Präferenz von Cl- über NO3

- durch Substituieren

des für die Selektivität verantwortlichen Serins (Sercen) mit einem Prolin umgekehrt

werden, was bereits vorher an mehreren anderen CLCs demonstriert wurde.

Die ClC-7-Transportaktivität konnte auch durch extrazelluläre Protonen moduliert

werden. Während basische pHa-Werte die Stromamplitude erhöhten und die

Aktivierungskinetik beschleunigten, bewirkten saure pHa-Werte das Gegenteil.

Im Gegensatz zu einigen anderen CLCs konnte keine Abhängigkeit von ATP festgestellt

werden.

Neben der biophysikalischen Charakterisierung von ClC-7, die den Weg für

weiterführende Struktur-Funktions-Studien ebnet, konnte durch diese Arbeit auch

das Konzept des Spannungs-abhängigen Schaltverhaltens über Kanäle hinaus auf

Transporter erweitert werden.

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG ............................................................................................................... 15

1.1 Membranpotenzial ......................................................................................... 15 1.2 Ionen-leitende Membranproteine – Ionenkanäle versus Ionentransporterer ........................................................................................ 17

1.2.1 Schaltverhalten (gating) ......................................................................... 18 1.2.2 Selektivität .............................................................................................. 22 1.2.3 Hilfsuntereinheiten ................................................................................. 23

1.3 CLCs – eine Familie von Cl--Kanälen und Cl-/H+-Antiportern ......................... 23 1.3.1 Molekulare Architektur ........................................................................... 25 1.3.2 Ionentransportpfade und gates .............................................................. 28 1.3.3 Selektivität .............................................................................................. 32 1.3.4 2Cl-/1H+-Transportmechanismus ............................................................ 32 1.3.5 Funktionen der CBS-Domänen ................................................................ 34

1.4 ClC-7 – ein spät-endosomaler/lysosomaler Cl-/H+-Antiporter ....................... 36 1.4.1 Phänotyp der ClC-7-Knockout-Maus ...................................................... 37 1.4.2 Bedeutung von ClC-7 für die lysosomale Physiologie ............................. 39 1.4.3 Bedeutung von ClC-7 für die Knochenresorption durch Osteoklasten .. 41 1.4.4 Ostm1 – die Hilfsuntereinheit von ClC-7 ................................................ 43

1.5 Fragestellung .................................................................................................. 44

2. ERGEBNISSE ............................................................................................................... 45

2.1 ClC-7 ist ein Depolarisations-aktivierter Cl-/H+-Austauscher mit langsamer Kinetik ........................................................................................... 45 2.2 Ostm1 ist unabdingbar für die Transportaktivität von ClC-7 ......................... 50 2.3 ClC-7 ist ein 2:1 gekoppelter Cl-/H+-Austauscher ........................................... 51 2.4 Spannungsabhängigkeit von ClC-7 liegt dem Steuerungsverhalten zu Grunde ............................................................................................................ 53 2.5 Abhängigkeit von extrazellulären Anionen .................................................... 56 2.6 Abhängigkeit von extrazellulären Protonen .................................................. 57 2.7 ClC-7 ist moderat Temperatur-sensitiv .......................................................... 59 2.8 ClC-7 ist nicht ATP-abhängig .......................................................................... 62 2.9 ClC-7 weist einen aktivitätsbedingten Run-down-Effekt auf ......................... 63

3. DISKUSSION ............................................................................................................... 65

3.1 Ostm1 – die essenzielle β-Untereinheit von ClC-7 ........................................ 66 3.2 ClC-7 – ein Depolarisations-aktivierter 2Cl-/1H+-Austauscher mit langsamer Kinetik ........................................................................................... 66 3.3 Modulation von ClC-7 durch extrazelluläre Anionen und Protonen sowie durch intrazelluläres ATP ..................................................................... 70 3.4 Wie sieht ClC-7-vermittelte Transportaktivität in Lysosomen aus? .............. 71

3.5 Ausblick ........................................................................................................... 73

4. MATERIALIEN & METHODEN ..................................................................................... 75

4.1 Materialien ..................................................................................................... 75 4.1.1 Chemikalien, Enzyme, Antikörper ........................................................... 75 4.1.2 Lösungen ................................................................................................. 75 4.1.3 Vektoren und verwendete Konstrukte.................................................... 77 4.1.4 Zellen ....................................................................................................... 78

4.1.4.1 Bakterienzellen .................................................................................... 78 4.1.4.2 Säuger-Kulturzellen ............................................................................. 78 4.1.4.3 Xenopus laevis Oozyten ....................................................................... 79

4.1.5 Software .................................................................................................. 79 4.2 Methoden ....................................................................................................... 79

4.2.1 Mikrobiologische Methoden ................................................................... 79 4.2.1.1 Herstellung elektro-kompetenter Bakterien ....................................... 79 4.2.1.2 Transformation von Bakterien mittels Elektroporation ...................... 80 4.2.1.3 Kultivierung und Lagerung transformierter Bakterien ........................ 80

4.2.2 Molekularbiologische Methoden ............................................................ 80 4.2.2.1 Isolation von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien ................ 80 4.2.2.2 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA .................................................. 81 4.2.2.3 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren ................................................ 81 4.2.2.4 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen................................. 81 4.2.2.5 In vitro Transkription ........................................................................... 81 4.2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ................................. 82

4.2.3 Zellbiologische Methoden ....................................................................... 82 4.2.3.1 Kultur von HeLa- und tsA201-Zellen .................................................... 82 4.2.3.2 Trypsinisieren von Kulturzellen ........................................................... 82 4.2.3.3 Einfrieren und Auftauen von Kulturzellen ........................................... 83 4.2.3.4 Transiente Transfektion von Kulturzellen ........................................... 83 4.2.3.5 Präparation von Xenopus laevis Oozyten ............................................ 84 4.2.3.6 Mikroinjektion und Haltung von Xenopus laevis Oozyten .................. 84 4.2.3.7 Bestimmung der Expression von Plasmamembranproteinen in X.laevis Oozyten ................................................................................... 84

4.2.4 Elektrophysiologische Methoden ............................................................ 85 4.2.4.1 Zwei-Elektroden-Spannungsklemme ................................................... 85 4.2.4.2 Fluorozyte – Fluoreszenz-basierte Messung von intrazellulären pH-Wert-Änderungen in X.laevis Oozyten .......................................... 87 4.2.4.3 patch-clamp-Technik ........................................................................... 88

4.2.5 Auswertung elektrophysiologischer Daten ............................................. 89 4.2.5.1 Ermittlung von Strom-Spannungs-Beziehungen ................................. 89 4.2.5.2 Quantifizierung der Kinetik .................................................................. 89 4.2.5.3 Berechnung der Stöchiometrie............................................................ 90 4.2.5.4 tail-current-Analyse ............................................................................. 91 4.2.5.5 Quantifizierung der relativen Leitfähigkeiten von Anionen und der Abhängigkeit von ClC-7 vom extrazellulären pH-Wert ................. 92 4.2.5.6 Quantifizierung der Temperaturabhängigkeit ..................................... 92

5. ANHANG .................................................................................................................... 95

5.1 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................... 95 5.2 Literaturverzeichnis ........................................................................................ 97 5.3 Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 108 5.4 Tabellenverzeichnis ...................................................................................... 108 5.5 Eidesstattliche Versicherung ........................................................................ 109 5.6 Erklärung ...................................................................................................... 109 5.7 Publikationsliste ........................................................................................... 109

1. EINLEITUNG

15

1. EINLEITUNG

Die Zelle stellt die elementare funktionelle Einheit aller Lebewesen dar. Zur Umwelt

abgegrenzt wird sie durch die sogenannte Zellmembran, eine Doppelschicht aus

amphiphatischen Lipiden. Da diese Lipid-Doppelschicht nur für Gase, lipophile

Substanzen und teilweise auch für kleine polare Moleküle wie z.B. Wasser und

Harnstoff permeabel ist, wird im Zellinneren ein isolierter Raum mit klar definierten

Mengen an größeren polaren Molekülen sowie Teilchen mit permanenten Ladungen

gewährleistet. Zum Überleben der Zelle ist die Kommunikation mit der Außenwelt

unabdingbar. So inkorporiert diese Lipid-Doppelschicht auch Proteine, die

verschiedensten zellulären Prozessen wie Ionentransport, Signaltransduktion und

Zelladhäsion dienen. In eukaryotischen Zellen gibt es außerdem ein internes

Membransystem, welches das Zellinnere in Kompartimente (Organellen) einteilt und

somit verschiedene zellbiologische Reaktionsabläufe separiert.

Ein regulierter Ionentransport ist essenziell für das Überleben. In der einzelnen Zelle

vermittelt er beispielsweise Volumen- sowie pH-Regulation, Signaltransduktion und

bestimmt die an der Membran anliegende elektrische Spannung. Das Calcium-Ion

beispielsweise kann bei der Signaltransduktion selbst ein chemisches Signal

darstellen. Für das Einstellen des Membranpotenzials spielen vor allen K+- und Na+-

Ströme eine Rolle, Cl--Ströme stabilisieren eher das Membranpotenzial und

vermitteln Volumenregulation. Diese zellbiologischen Vorgänge äußern sich in

höheren Organismen in Prozessen wie Nervenzellaktivität, Muskelkontraktilität,

Hormonsekretion und Befruchtung.

1.1 Membranpotenzial

Zwischen der Innen- und Außenseite von Zellmembranen bestehen Unterschiede in

der Konzentration verschiedener Ionen (Tab. 1) und somit auch Unterschiede in der

elektrischen potenziellen Energie. Die dadurch entstehende elektrische Spannung an

der Membran wird als Membranpotenzial bezeichnet und dient als elektrische

Energiequelle, die Arbeit am System verrichten kann. Das Membranpotenzial ergibt

sich aus der Differenz des Potenzials an der Innenseite der Zellmembran und des

Potenzials an der Außenseite. Da beispielsweise das Zytoplasma der Zelle im

1. EINLEITUNG

16

Vergleich zur Extrazellulärflüssigkeit normalerweise negativ geladen ist, hat auch das

Membranpotenzial normalerweise ein negatives Vorzeichen.

Die unterschiedlichen Ionenkonzentrationen an beiden Seiten der Membran sind auf

die Aktivität von Ionen-leitenden Membranproteinen, also Ionenkanäle und

Ionentransporter, zurückzuführen. Diese beiden Proteinklassen werden im nächsten

Kapitel näher betrachtet.

Auf Grund der geringen Membrandicke (ca. 10 nm) reicht ein winziger Ionenfluss über

die Membran bereits aus, um das Membranpotenzial zu verändern. Dabei bleiben die

Ionenkonzentrationen praktisch unbeeinflusst. Bei der Bewegung von Ionen spielen

zwei Faktoren eine Rolle. In Folge der Brown’schen Molekularbewegung sind die

Teilchen bestrebt von einer höheren zur niedrigeren Konzentration zu diffundieren.

Außerdem erfahren sie auf Grund ihrer permanenten Ladung eine dem

Konzentrationsgradienten entgegengesetzte elektrische Kraft. Die Kombination

beider Bestrebungen wird als elektrochemischer Gradient bezeichnet. Bei einer

bestimmten Spannung heben sich beide Kräfte gegenseitig auf; der elektrochemische

Gradient beträgt somit null und es findet kein Netto-Ionenfluss über die Membran

mehr statt. Dieses sogenannte Gleichgewichtspotenzial bzw. Umkehrpotenzial lässt

sich für ein bestimmtes Ion (X) über die Nernst-Gleichung berechnen:

wobei EX das Gleichgewichtspotenzial des Ions X, R die Gaskonstante, T die absolute

Temperatur, F die Faraday-Konstante, zX die Ladung des Ions X, [X]i und [X]a die

Konzentration des Ions X innerhalb bzw. außerhalb der Zelle darstellen. Ist die

Membran nur für ein Ion selektiv durchlässig, wird das Membranpotenzial vollständig

von diesem Ion bestimmt und lässt sich somit im Gleichgewicht über die Nernst-

Gleichung errechnen. In Tabelle 1 sind Konzentrationen und nach Nernst errechnete

Gleichgewichtspotenziale für die wichtigsten Ionen einer Säuger-Muskelzelle

Ion Extrazelluläre Konzentration

Intrazelluläre Konzentration

Nernst- Potenzial

Na+ 145 12 +67

K+ 4 155 -98

Ca2+ 1,5 100 * 10-6

+129

Cl- 123 4,2 -90

Tabelle 1 Die wichtigsten freien Ionen einer Säugetier-Skelettmuskelzelle mit ihren intra- und extra-zellulären Konzentrationen (in mM) und den nach Nernst berechneten Gleichgewichts-Potenzialen (in mV); adaptiert von Hille, 2001.

R * T

zX * F EX = - * ln

[X]i

[X]a

1. EINLEITUNG

17

aufgelistet (Hille, 2001). Physiologische Membranen sind jedoch für verschiedene

Ionen permeabel und je mehr die Membran für ein bestimmtes Ion durchlässig ist,

desto mehr bestimmt das Gleichgewichtspotenzial dieses Ions das

Membranpotenzial. Diese gewichtete Betrachtung der Summe aller Nernst-Potenziale

der beteiligten Ionen gibt die Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung wieder (Goldman,

1943; Hodgkin & Katz, 1949). Hier ist sie für das Beispiel einer Kationen- und Anionen-

permeablen Membran dargestellt:

wobei R, T und F die übliche Bedeutung haben (s. Nernst-Gleichung), EM symbolisiert

das Membranpotenzial, z stellt die Valenz der Netto-transportierten Ladungen dar, pX

ist die Permeabilität der Membran für das jeweilige einwertige Kat- (X+) bzw. Anion

(X-) und [X]i bzw. [X]a ist die Konzentration des jeweiligen einwertigen Kat- (X+) bzw.

Anions (X-) innerhalb bzw. außerhalb der Zelle. Folglich wird ersichtlich, dass das

Membranpotenzial je nach Zelltyp (also je nach Zusammensetzung verschiedener

Ionen-leitender Proteine) unterschiedlich sein kann und bei erregbaren Zellen (also

Zellen, die ihre Permeabilität für bestimmte Ionen temporär ändern können) sogar

innerhalb eines Zelltyps variieren kann.

1.2 Ionen-leitende Membranproteine –

Ionenkanäle versus Ionentransporter

Membranproteine, die den Ionenaustausch zwischen dem Cytosol und dem

Extrazellulär-Raum bzw. dem Organellen-Inneren gewährleisten, können im

klassischen Sinne in zwei große Gruppen eingeteilt werden: Ionenkanäle und

Ionentransporter.

Kanäle leiten Ionen passiv, d.h. sie lassen in ihrer offenen Konformation Ionen entlang

ihres elektrochemischen Gradienten durch die Pore diffundieren und dissipieren

somit den bestehenden Gradienten. Ionentransporter hingegen befördern Ionen

unter Energieverbrauch, also aktiv, entgegen dem jeweiligen elektrochemischen

Gefälle und dienen damit dem Gradientenaufbau. Während primär aktive

Transporter, die auch als Pumpen oder ATPasen bezeichnet werden, ihre Energie aus

der Hydrolyse von ATP beziehen, befördern sekundär aktive Transporter Ionen passiv

entlang ihres elektrochemischen Gradienten und nutzen die darin gespeicherte

Energie für den aktiven Transport eines Substrats. Erfolgt der Transport beider

R * T

z * F

Σ(pX+ * [X+]i) + Σ(pX- * [X-]a)

Σ(pX+ * [X+]a) + Σ(pX- * [X-]i) EM = - * ln

1. EINLEITUNG

18

Teilchen in die gleiche Richtung, spricht man von Symportern, beim Transport in

entgegengesetzte Richtungen von Antiportern.

Aufgrund der unterschiedlichen Transportmechanismen ergeben sich verschiedene

Transportraten: Ionenkanäle können über Diffusion durch die offene Pore 106-108

Ionen pro Sekunde leiten und Transporter, die außerdem auch keine Pore im

klassischen Sinne besitzen, weisen eine Rate von nur 1-102 s-1 (primär aktiv) bzw. 102-

104 s-1 (sekundär aktiv) auf (Gadsby, 2009).

Ionen-leitende Membranproteine sind sehr divers. Momentan sind beispielweise im

menschlichen Genom weit über 300 Gene bekannt, die dafür kodieren

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), wobei aus einem Gen über die Nutzung

alternativer Promotoren, über alternatives Spleißen und Ähnliches zusätzlich

verschiedene Isoformen entstehen können. Eingeteilt werden die Genprodukte auf

Grundlage ihrer Sequenzhomologie in Familien, die im klassischen Sinne lediglich

einer Art von Transportmechanismus dienen sollen.

Studien der letzten Jahrzehnte erweichen die Starrheit der historischen

Unterscheidung zwischen Kanälen und Transportern mit zahlreichen Beispielen, die

die Grauzone zwischen den beiden Transportmechanismen ausbilden. CFTR (Cystic

Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) ist ein Cl--Kanal, gehört jedoch

aufgrund seiner Sequenzidentität zur Familie der ABC-Transporter (Gadsby et al.,

2006). Viele Neurotransmitter-Transporter weisen Kanal-ähnliche Leckströme auf

(Otis et al., 1997; Ryan & Mindell, 2007). Des Weiteren lässt sich ein Shaker K+-Kanal

durch eine einzige Punktmutation im Spannungssensor in einen H+-Transporter

umwandeln (Starace & Bezanilla, 2004). Am interessantesten ist jedoch die CLC-

Familie, die sowohl Cl--Kanäle als auch Cl-/H+-Antiporter in einer Gruppe vereint

(Jentsch, 2008; Accardi & Picollo, 2010). Diese Proteine bedienen also zwei komplett

unterschiedliche Transportmechanismen auf einer eng verwandten strukturellen

Basis. Dies bietet exzellente Möglichkeiten für die Untersuchung der bestimmenden

Faktoren beider Transportmechanismen.

Bevor hier näher auf diese Protein-Familie eingegangen wird, sollen im Folgenden die

zwei Haupteigenschaften Ionen-leitender Membranproteine, Schaltverhalten und

Selektivität, kurz erläutert werden. Diese Haupteigenschaften dienen unter anderem

der Klassifizierung Ionen-leitender Membranproteine, wobei zwischen Kanälen und

Transportern nicht unterschieden wird.

1.2.1 SCHALTVERHALTEN (GATING)

Das Schaltverhalten, besser bekannt als gating, verbildlicht den Übergang vom

geschlossenen (nicht-leitenden) in den offenen (leitenden) Zustand als Antwort auf

spezifische Stimuli. Dazu braucht jedes Protein einen Schalter, das sogenannte gate.

In der klassischen Schwarz-Weiß-Welt benötigt ein Ionenkanal nur einen einzigen

1. EINLEITUNG

19

Schalter, wohingegen der Transporter mindestens zwei aufweisen muss, die niemals

zur gleichen Zeit geöffnet sein dürfen, damit ein stöchiometrisch gekoppelter, aktiver

Transport gewährleistet ist (Abb. 1; Hille, 2001; Gadsby, 2009). Dies begründet auch

die unterschiedlichen Transportraten.

Was wäre nun das molekulare Korrelat dieses Schalters? Proteinstrukturstudien

zeigten, dass es sich meist um Teile des Proteins handelt, die im geschlossenen

Zustand auf verschiedenste Art und Weise eine physische Barriere für die

Ionenbewegung darstellen. Bei den Pore-loop-Kanälen bilden die an der Pore

anliegenden Transmembranpeptide eine Art ausklappbaren Schalter, der sich nach

außen bewegt, um den Kanal zu öffnen (Jiang et al., 2002; Webster et al., 2004). In

CLC-Kanälen reicht dafür wahrscheinlich sogar die Bewegung einer einzigen

Aminosäure aus (Dutzler et al., 2003).

Gesteuert wird das Schaltverhalten über diverse biologische Signale, wie z.B. das

Binden intra- oder extrazellulärer Liganden, Membranpotenzial, Temperatur,

mechanische Reize oder über biochemische Reaktionen wie beispielsweise

Phosphorylierung. Hier soll nun die Spannungsabhängigkeit näher betrachtet werden.

Der makroskopische Strom I wird definiert über

I = n * i(U) * po (U, t)

wobei n die Anzahl der Kanäle bzw. Transporter darstellt, i(U) beschreibt die

Einzelkanalleitfähigkeit als Funktion der Spannung und po(U,t) die

Offenwahrscheinlichkeit des Kanals bzw. Transporters als Funktion der Spannung und

Zeit und steht somit stellvertretend für das gating. Demnach kann die

Spannungsabhängigkeit sowohl aus dem Schaltverhalten als auch aus dem Ionenfluss

durch das offene Protein resultieren. Diese beiden Faktoren lassen sich bei langsam

gesteuerten Kanälen über bestimmte Spannungsklemm-Protokolle separieren.

Abbildung 1 Ionenkanal versus Ionentransporter. (A) Schematische Darstellung eines Ionenkanals als Membran-durchdringende Pore (grün), durch den die Bewegung von Ionen (rote Kreise) über einen einzigen Schalter gesteuert wird. (B) Schematische Darstellung eines Ionentransporters (grün), durch den die Bewegung von Ionen (rote und blaue Kreise) über ein alternierendes Öffnen und Schließen von zwei getrennten Schaltern kontrolliert wird, damit die stöchiometrische Kopplung der Ionen sowie der aktive Transport gewährleistet sind. Adaptiert von Gadsby, 2009.

1. EINLEITUNG

20

Bei Spannungssprüngen ändert sich i(U) instantan. Das Spannungs-gesteuerte Ändern

des Schaltverhaltens ist jedoch zeitabhängig, da es meist mit einer

Konformationsänderung des Proteins verbunden ist. Verläuft dieser Prozess langsam

genug, um messbar zu sein, kommen sogenannte Schwanzströme (tail currents) zum

Vorschein und ermöglichen das Separieren beider spannungsabhängigen Faktoren.

Für die Untersuchung der Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit i, muss

der Kanal bzw. Transporter zunächst auf eine bestimmte Offenwahrscheinlichkeit

aktiviert werden (Prä-Puls), um dann auf eine Test-Spannung (Test-Puls) zu springen

(Abb. 2A). Sollen mehrere Spannungen getestet werden, so muss die

Offenwahrscheinlichkeit (reflektiert im gemessenen Gesamtstrom) im Prä-Puls

unbedingt konstant gehalten werden (Abb. 2A). Genau zum Zeitpunkt des

Spannungssprunges auf die Test-Spannung bleibt po gleich und relaxiert erst mit der

Zeit zu einem neuen Gleichgewichtszustand, die Einzelkanalleitfähigkeit ändert sich

dagegen sofort. Folglich wird der zum Zeitpunkt des Spannungssprunges gemessene

Gesamtstrom I direkt proportional zu i und spiegelt die Spannungsabhängigkeit des

Einzelkanalstroms wider. Für die Bestimmung der Spannungsabhängigkeit des

Schaltverhaltens bzw. der Offenwahrscheinlichkeit wechselt man von verschiedenen

Test-Spannungen auf eine immer gleiche Spannung (Post-Puls), die natürlich vom

Gleichgewichtspotenzial des untersuchten Ionenstromes unterschiedlich sein muss

(Abb. 2A). Durch das Messen der Strom-Relaxationen bei dieser Spannung wird der

Term n*i(U) konstant gehalten und damit nur die Spannungsabhängigkeit des po

betrachtet. Dabei ist zu beachten, dass po im Test-Puls das Gleichgewicht erreichen

muss. Das Extrapolieren der tail currents auf den Zeitpunkt des Spannungssprunges

zum Post-Puls ergibt die Abhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit von den Test-

Spannungen.

Diese folgt einer Boltzmann-Verteilung, die über die folgende Gleichung beschrieben

werden kann:

wobei U die Testspannung, U0,5 die zur halbmaximalen Aktivierung notwendige

Spannung, T die Temperatur, k die Boltzmann-Konstante, e0 die Elementarladung und

z die sogenannte Schaltladung (gating-Ladung) darstellen. Die Boltzmann-Gleichung

beschreibt also den Anteil offener Kanäle bzw. Transporter in einem bestimmten

Gleichgewichtszustand und zeigt somit, dass die Thermodynamik keinen konkreten

Schwellenwert für das Öffnen zulässt (Hille, 2001). Aus dem Anstieg der Boltzmann-

Funktion lässt sich außerdem die Schaltladung errechnen. Bevor wir klären, was das

ist, soll hier erläutert werden, wie Membranproteine elektrische Spannung

wahrnehmen können.

po = 1 + e z * e0 * (U0,5 – U)/(k * T)

1

1. EINLEITUNG

21

Damit das durch die Spannung verursachte elektrische Feld das Steuerungsverhalten

beeinflussen kann, muss es Arbeit am System verrichten, also Ladungen bewegen,

was letztendlich im Öffnen eines Kanals oder Transporters resultiert. Dies kann auf

Abbildung 2 Spannungsabhängigkeit Ionen-leitender Membranproteine. (A) Die tail-current-Analyse ermöglicht es bei Kanälen bzw. Transportern mit langsamer Kinetik, die Spannungsabhängigkeit des Steuerungsverhaltens oder der Ionentranslokation getrennt voneinander zu betrachten (hier am Beispiel von ClC-0, Pusch et al., 1995). Oben, dafür entwickeltes Spannungsklemm-Protokoll; unten, entsprechende Stromantwort von ClC-0; Erklärung siehe Haupttext. (B) Schematische Darstellung möglicher Spannungssensoren

(Bezanilla, 2008). Ein Membranprotein (orange Ellipse mit grünen und gelben Zylindern als α-Helices) kann auf Änderungen der an der Membran anliegenden Spannung mit Konformationsänderungen reagieren (+, positives Potenzial auf einer Membranseite; -, negatives Potenzial auf anderer Membranseite). Spannungssensoren leiten diese Konformationsänderungen ein. Geladene Aminosäuren (oben links), Aminosäuren mit einem

intrinsischen Dipolmoment (oben rechts), eine ganze α-Helix mit ihrem intrinsischen Dipolmoment (unten links, Rechteck mit Gradient von rot zu blau) oder freie bzw. an das Protein gebundene Ionen (unten rechts) können solche Spannungssensoren darstellen.

1. EINLEITUNG

22

verschiedene Arten geschehen. Geladene Aminosäuren wie Aspartat, Glutamat,

Arginin, Lysin und Histidin können sich im elektrischen Feld verschieben, wie es für

Mitglieder der Superfamilie von Spannungs-abhängigen Kationenkanälen beschrieben

wurde (Bezanilla, 2008; Abb. 2B links oben). Auch für Aminosäuren mit einem

intrinsischen Dipolmoment wie Tyrosin wäre dies denkbar (Bezanilla, 2008; Abb. 2B

rechts oben). α-Helices besitzen ebenfalls ein intrinsisches Dipolmoment und könnten

sich im elektrischen Feld bewegen, jedoch sind in der Natur dafür noch keine

Beispiele bekannt (Bezanilla, 2008; Abb. 2B links unten). Schließlich können auch freie

Ionen durch eine Veränderung im elektrischen Feld bewegt werden. Falls sich diese

Ionen in Einbuchtungen des Proteins befinden, könnte ihre Bewegung

Konformationsänderungen hervorrufen (Bezanilla, 2008; Abb. 2B rechts unten).

Natürlich ist es vorstellbar, dass die Wahrnehmung von Spannung über Kombination

mehrerer eben beschriebener Mechanismen erfolgt, wie es beispielsweise bei der

Na+/K+-ATPase der Fall ist (Nakao & Gadsby, 1986; Holmgren et al., 2000; Morth et al.,

2007). All diese bewegten Ladungen werden als Schaltladungen bezeichnet. Im

engeren Sinne steht eine gating-Ladung der Größe 1 für eine Elementarladung, die

über den ganzen Abfall der Spannung, also die gesamte Breite der Lipid-

Doppelschicht, transportiert wird, oder für zwei Elementarladungen, die über die

Hälfte dieser Strecke oder drei Elementarladungen, die über ein Drittel dieser Strecke

und so weiter bewegt werden. Sie fungieren somit als molekulare

Spannungssensoren. Ihre Bewegung kann mit Spannungsklemm-Protokollen in Form

von transientem, elektrischem Strom gemessen werden (Armstrong & Bezanilla,

1973, 1974). Dieser Strom geht dem ionischen Strom voraus und wird als gating-

Strom bezeichnet.

1.2.2 SELEKTIVITÄT

Kanäle bzw. Transporter besitzen die Fähigkeit, zwischen verschiedenen Ionen zu

unterscheiden – sie leiten Ionen also selektiv. Die dafür zuständige strukturelle

Einheit wird als Selektivitätsfilter bezeichnet. Die größten Poren, wie z.B. die von Gap-

junction-Kanälen, nutzen lediglich die Ionengröße zur Selektion und fungieren

dadurch als molekulare Siebe (Unwin & Ennis, 1984). Acetylcholin-Rezeptoren lassen

nur Kationen passieren. Sie besitzen eine große, Wasser-gefüllte Pore mit einem Ring

aus negativ geladenen Aminosäureseitenketten, die auf Anionen elektrostatisch

abstoßend wirken (Unwin, 2005). Manche Anionen-selektive Kanäle wie z.B. GABA-

und Glycin-Rezeptoren besitzen im Gegenzug Ringe aus positiv geladenen

Aminosäuren (Jensen et al., 2005). Die meisten Kanäle bzw. Transporter sind jedoch

viel selektiver gegenüber ihrer permeablen Ionen. Pore-loop-K+-Kanäle zeigen

beispielsweise eine 100- bis 1000-fach größere Permeabilität für K+ als für Na+ (Hille,

2001). Ermöglicht wird dies durch einen sehr spezialisierten Selektivitätsfilter, der hier

1. EINLEITUNG

23

als Beispiel beschrieben werden soll. Dieser Filter wird aus dem Polypeptid-Rückgrat

gebildet, wobei die Carbonyl-Sauerstoffatome der Peptidbindungen so ausgerichtet

sind, dass sie die Rolle des Sauerstoffs in den Wassermolekülen der K+-Hydrathülle

übernehmen können. Die dadurch entstehenden, energetisch stabilisierten

Positionen für K+ im Selektivitätsfilter erleichtern das Dehydratisieren des K+ und

damit auch seine Passage durch die Pore. Dem Selektivitätsfilter schließt sich ein

Wasser-gefüllter Raum an, wo das K+ sofort wieder hydratisiert wird. Na+-Ionen

werden trotz ihrer kleineren Atomdurchmesser durch den Selektivitätsfilter

ausgeschlossen, da die Carbonyl-Sauerstoffatome für sie zu weit entfernt sind und

somit die zum Dehydratisieren benötigte Energie größer wäre als der Energiegewinn,

der durch die Interaktion mit diesen Sauerstoffatomen entstehen würde (Doyle et al.,

1998).

1.2.3 HILFSUNTEREINHEITEN

Die große Variation der Ionen-leitenden Membranproteine wird durch Interaktion mit

anderen Funktions-unterstützenden Proteinen, sogenannten Hilfsuntereinheiten,

zusätzlich erhöht. In der Regel sind diese Untereinheiten kleiner als ihre

Interaktionspartner und mehrere verschiedene Hilfsuntereinheiten können mit einer

Ionen-leitenden Hauptuntereinheit einen funktionellen Komplex ausbilden. Die

Modifikation der Funktion der Kanäle bzw. Transporter kann sich auf verschiedensten

Ebenen wie z.B gating, trafficking oder Proteinstabilität auswirken. Viele

Hilfsuntereinheiten fungieren als Chaperone und unterstützen ihre

Interaktionspartner beim trafficking beispielsweise zur Plasmamembran. In ihrer

Abwesenheit kann die Anzahl der Kanäle entweder reduziert sein, wie im Falle von

Cav-Kanälen (Richards et al., 2004), oder die Kanäle fehlen vollständig wie bei KATP-

Kanälen (Zerangue et al., 1999). Andere Untereinheiten modulieren direkt die Kanal-

bzw. Transporter-Aktivität.

1.3 CLCs – eine Familie von Cl--Kanälen und Cl

-/H

+-Antiportern

Der erste Schritt in dieses Feld erfolgte mit der Identifizierung eines Cl--Kanals im

elektrischen Organ des Torpedo californica, heute bekannt als ClC-0 (White & Miller,

1979; Miller & White, 1980). Die Expressionsklonierung dieses Kanals (Jentsch et al.,

1. EINLEITUNG

24

1990) legte das Fundament für die Identifizierung der gesamten Genfamilie (Jentsch,

2008). Die CLCs sind über alle Phyla hinweg konserviert. In Säugern gibt es neun

Mitglieder, die aufgrund ihrer Homologie in drei Gruppen eingeteilt werden können

(Abb. 3). Die erste Gruppe (ClC-1, ClC-2, ClC-Ka, ClC-Kb) repräsentiert Cl--Kanäle, die

hauptsächlich in der Plasmamembran liegen. Dort regulieren sie muskuläre

(Steinmeyer et al., 1991; Koch et al., 1992) und neuronale (Staley et al., 1996; Rinke et

al., 2010) Erregbarkeit und tragen zur extrazellulären Ionen-Homöostase (Bösl et al.,

2001; Blanz et al., 2007) sowie zum transepithelialen Ionen-Transport (Simon et al.,

1997; Matsumura et al., 1999; Abb. 3) bei. Die Mitglieder des zweiten (ClC-3, ClC-4,

ClC-5) und des dritten (ClC-6, ClC-7) Homologiezweiges stellen hingegen Cl-/H+-

Antiporter dar und erfüllen ihre Funktion in Membranen intrazellulärer Vesikel

entlang des endosomal-lysosomalen Pfades. Sie sind durch Bereitstellen eines

Gegenstroms für die H+-ATPase und durch luminale Cl--Akkumulation an der

Regulation der vesikulären Ionen-Homöostase beteiligt (Günther et al., 2003; Graves

et al., 2008; Novarino et al., 2010; Weinert et al., 2010; Abb. 3). Mutationen in fünf

der neun CLCs (ClC-1, ClC-Ka, ClC-Kb, ClC-5, ClC-7) verursachen vererbbare

Erkrankungen im Menschen (Koch et al., 1992; Lloyd et al., 1996; Simon et al., 1997;

Kornak et al., 2001; Schlingmann et al., 2004), was ihre physiologische Bedeutung

zusätzlich hervorhebt (Abb. 3).

Abbildung 3 Die Säuger-CLC-Familie. Phylogenetischer Stammbaum der Säugetier-CLC-Familie mit Angaben über die Expression und Funktion des jeweiligen CLC-Proteins sowie über damit in Verbindung stehende humane Erkrankungen. Für ClC-Ka bzw. ClC-Kb und ClC-7 sind die β-Untereinheiten Barttin und Ostm1 (in grau) bekannt. Adaptiert von Jentsch, 2008.

1. EINLEITUNG

25

Wie bereits aufgrund der ersten elektrophysiologischen Studien an ClC-0 vermutet

(Miller, 1982), dimerisieren die CLCs, um die funktionelle Quartärstruktur

einzunehmen (Ludewig et al., 1996; Middleton et al., 1996; Weinreich & Jentsch,

2001; Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010). Einige CLC-Proteine des gleichen

Homologiezweiges können außerdem auch Heterodimere bilden (Lorenz et al., 1996;

Weinreich & Jentsch, 2001; Suzuki et al., 2006). Die physiologische Relevanz dessen

ist jedoch noch ungewiss.

Jedes Monomer besitzt eine eigene Pore (Ludewig et al., 1996; Middleton et al., 1996;

Weinreich & Jentsch, 2001; Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010). Diese Poren

können unabhängig voneinander durch das sogenannte „schnelle“ gate oder

zusammen durch das sogenannte „gemeinsame“ bzw. „langsame“ gate gesteuert

werden. Während das „schnelle“ gate auf die Bewegung einer einzigen Aminosäure

zurückgeführt werden konnte, ist die strukturelle Basis des „gemeinsamen“ gates

noch weitgehend ungeklärt.

Des Weiteren haben mindestens drei der CLCs Hilfsuntereinheiten (Abb. 3). ClC-Ka

und ClC-Kb assemblieren mit Barttin (Estévez et al., 2001) und ClC-7 mit Ostm1 (Lange

et al., 2006). Diese Hilfsuntereinheiten modulieren die zelluläre Lokalisation sowie die

Stabilität ihrer Ionen-leitenden Interaktionspartner; Barttin beeinflusst außerdem

auch die Transportaktivität von ClC-Ka bzw. ClC-Kb (Estévez et al., 2001; Waldegger et

al., 2002; Lange et al., 2006; Scholl et al., 2006; Rickheit et al., 2008; Janssen et al.,

2009). Mutationen in ihren Genen verursachen die gleichen genetischen Krankheiten

wie Mutationen in den entsprechenden CLCs (Birkenhäger et al., 2001; Lange et al.,

2006).

1.3.1 MOLEKULARE ARCHITEKTUR

Weder die Aminosäuresequenz noch die Struktur der CLC-Proteine birgt

Ähnlichkeiten mit anderen Membranprotein-Klassen. Die CLCs bestehen aus einem

großen, den Ionen-Transport vermittelnden Transmembranteil mit intrazellulärem N-

und C-Terminus. Der N-Terminus ist relativ kurz und bisher größtenteils nicht

kristallisierbar (Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010; Abb. 4A). Der C-Terminus

hingegen beinhaltet bei ca. 50% der prokaryotischen sowie bei allen eukaryotischen

CLC-Proteinen zwei klar definierte Domänen, die CBS(Cystathionin-β-Synthase)-

Domänen (Abb. 4A). Darauf wird zum Ende dieses Kapitels eingegangen.

Interessanterweise werden die CLCs nur als Dimere funktionell (Dutzler et al., 2002;

Feng et al., 2010; Abb. 4B, D), obwohl jedes Monomer über die komplette, für den

Ionentransport notwendige Grundausstattung verfügt – wie kürzlich eindrucksvoll am

Beispiel eines prokaryotischen CLCs demonstriert wurde (Robertson et al., 2010).

Heute existieren hoch-aufgelöste Kristallstrukturen von zwei prokaryotischen CLC-

Proteinen, dem EcClC-1 aus Escherichia coli und dem StClC aus Salmonella

1. EINLEITUNG

26

typhimurium, sowie von einem eukaryotischen CLC, dem CmClC aus der thermophilen

roten Alge Cyanidioschyzon merolae (Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010). Alle drei

Proteine stellen Cl-/H+-Antiporter dar; es ist jedoch anzunehmen, dass die Struktur in

ihren Grundzügen auch der von CLC-Kanälen entspricht. Da die beiden

prokaryotischen CLCs keine CBS-Domänen besitzen, gelang durch die Kristallisation

des eukaryotischen CLC zum ersten Mal die Strukturbestimmung der

Transmembranregion gemeinsam mit den CBS-Domänen.

Jedes CLC-Monomer bildet vom Extrazellulärraum auf die Transmembranregion

gesehen eine dreieckige Struktur aus, die sich im Dimer zu einem Rhombus

zusammensetzt (Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010; Abb. 4B). Bei CmClC wurde die

kurze Diagonale des Rhombus auf ca. 45 Å und die lange auf ca. 95 Å bestimmt (Feng

et al., 2010; Abb. 4B). Senkrecht zur Membranebene gesehen ist der CmClC-

Transporter etwa 75 Å lang und größtenteils in der Lipid-Doppelschicht eingebettet

(Feng et al., 2010; Abb. 4C, D).

In der Transmembranregion interagieren die Monomere über eine Fläche von ca.

1300 Å2 (Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010; Robertson et al., 2010). Dieses wird

hauptsächlich durch vier fast senkrecht zur Membranebene verlaufende α-Helices

(αH, αI, αP, αQ) bestimmt, wobei die Inter-Monomer-Kontakte über hydrophobe

Leucine und Isoleucine vermittelt werden (Dutzler et al., 2002; Robertson et al.,

2010). Aminosäuren, die Wasserstoffbrückenbindungen oder ionische

Wechselwirkungen ausbilden würden, fehlen hier komplett (Dutzler et al., 2002;

Robertson et al., 2010). Interessanterweise weist diese Interaktionsfläche eine sehr

hohe Form-Komplementarität auf, die mit Antigen/Antikörper-Kontakten zu

vergleichen wäre (Robertson et al., 2010).

Die Transmembranregion birgt eine komplexe Membrantopologie in sich: Jedes

Monomer besteht aus 18 α-Helices (αA-αR) unterschiedlicher Länge (Abb. 4A), die zu

verschiedenen Graden in Relation zur Membranebene geneigt sind (Abb. 4C). Helices

αB-αR sind entweder vollständig oder teilweise in der Membran eingebettet (Dutzler

et al., 2002; Feng et al., 2010). Trotz der geringen Sequenzidentität (<25%) zwischen

den kristallisierten eukaryotischen und prokaryotischen CLCs stimmen die ermittelten

Strukturen gut überein.

Ein spannender Aspekt, der bis zur Kristallisation der CLCs unbemerkt blieb, ist die

strukturelle Verwandtschaft der N-terminale Hälfte der Transmembran-Region (αA-

αI) zur C-terminalen Hälfte (αJ-αR) (Dutzler et al., 2002; Abb. 4A). Auf der Suche nach

einer Sequenzverwandtschaft findet man jedoch außer einer ähnlichen Anordnung

der Glycine kaum eine signifikante Korrelation (Dutzler et al., 2002). Beide Strukturen

haben eine entgegengesetzte Orientierung in der Membran – sie verlaufen also

antiparallel – und bilden somit eine pseudo-zweifache Symmetrieachse innerhalb der

Membran (Dutzler et al., 2002).

Wie für Ionentransporter erwartet, fand man in den bis heute publizierten

Kristallstrukturen der CLCs keine offensichtliche, Wasser-gefüllte Pore (Dutzler et al.,

2002; Feng et al., 2010). Im Zentrum jedes kristallisierten Monomers befindet sich ein

1. EINLEITUNG

27

Cl-, welches vollständig vom Protein umgeben wird und somit von außerhalb

unzugänglich erscheint (Dutzler et al., 2002). Die komplexe Anordnung der α-Helices

ermöglicht es, im Zentrum des Proteins Aminosäuren aus weit auseinander liegenden

Segmenten der Polypeptidkette (N-Termini der αD, αF, αN, αR; Abb. 4A) zusammen

zu bringen, um den Selektivitätsfilter und die Bindungsstellen für Cl- auszubilden

(Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010; Abb. 5). Im Kapitel 1.3.2 sollen diese

Strukturen im Zusammenhang mit den Ionentransportwegen detaillierter

beschrieben werden.

Der C-Terminus der CLC-Proteine ist variabel in Aminosäure-Sequenz,

Hydrophobizität und Länge. Strukturell haben jedoch alle eukaryotische sowie einige

Abbildung 4 Molekulare Architektur der CLCs. (A) Topologie eines CLC-Monomers mit

intrazellulärem N-Terminus, 18 α-Helices (αA-αR; Rechtecke) und zwei CBS-Domänen (Ellipsen) im intrazellulären C-Terminus (grau). Die Farben grün und blau sollen auf die strukturelle

Verwandtschaft beider Proteinabschnitte (αA-αI und αJ-αR) hinweisen. Mit rot sind die Regionen markiert, die zum Aufbau des Selektivitäts-filters beitragen; + und - symbolisieren das

Dipolmoment der jeweiligen α-Helix. (B) Aufsicht auf das CmClC-Dimer (ein Monomer in blau, das andere in rot) in ribbon-Darstellung (PyMOL) mit einem Cl--Ion (grün) im jeweiligen Selektivitätsfilter. (C) Seitenansicht eines CmClC-Monomers in ribbon-Darstellung (PyMOL) mit farbkodiertem Proteinverlauf (von blau am N-Terminus bis rot am C-Terminus) zur Verdeutlichung der komplexen Struktur. (D) Seitenansicht eines CmClC-Dimers, wobei die in B dargestellte Struktur um 90° an der x-Achse gedreht wurde. grau, Lipid-Doppelschicht; a, außen; i, innen.

1. EINLEITUNG

28

prokaryotische CLCs eine Gemeinsamkeit: sie besitzen zwei CBS-Domänen. Im CmClC

besteht jede CBS-Domänen aus zwei α-Helices und zwei β-Strängen, die in der

folgenden Reihenfolge angeordnet sind: alpha-beta-beta-alpha (Feng et al., 2010). In

der Tertiärstruktur bilden die β-Stränge ein antiparalleles β-Faltblatt aus, worüber die

Interaktion zwischen den beiden CBS-Domänen hergestellt wird (Feng et al., 2010).

Die α-Helices zeigen dabei gepaart von jeder Domäne nach außen (Feng et al., 2010).

Hier spiegelt sich die Pseudo-Zweifach-Symmetrie der Transmembranregion wider.

Zusätzlich findet man eine α-Helix vor CBS 1 sowie einen β-Strang vor CBS 2 (Feng et

al., 2010). Eine lange Aminosäurekette folgt der letzten Helix der

Transmembranregion (αR), umspannt CBS 2, um schließlich CBS 1 zu erreichen. Auf

diese Weise wird CBS 2 mit dem extremen C-Terminus in die Nähe der

Transmembranregion gebracht und CBS 1 nach außen positioniert. Die

Interaktionsfläche von etwa 3600 Å2 zwischen dem C-Terminus und der

Transmembrandomäne weist wie auch die Monomer-Monomer-Kontaktfläche der

Transmembranregion eine hohe Form-Komplementarität auf (Feng et al., 2010). Im

Dimer interagieren die C-Termini mit ca. 1800 Å2 vor allem über die CBS 2-Domänen

(Feng et al., 2010).

Für CBS-Domänen verschiedener Proteine ist es bekannt, dass sie Adenosyl-Gruppen

von Nukleotiden wie AMP und ATP im Spalt zwischen den β-Faltblättern binden

können (Zhang et al., 1999; Kemp, 2004; Meyer & Dutzler, 2006). Jedoch ist es nicht

für alle Proteine der Fall – auch welche Funktionen die CBS-Domänen in den CLCs

genau tragen ist noch nicht vollkommen verstanden. Darauf soll im Kapitel 1.3.5

näher eingegangen werden.

1.3.2 IONENTRANSPORTPFADE UND GATES

Die Pore ähnelt der Form einer Sanduhr mit wässrigen Einbuchtungen der intra- und

extrazellulären Proteinoberflächen, die durch ein enges Segment, den

Selektivitätsfilter, miteinander verbunden werden.

Der Cl--Transportweg enthält drei Bindungsstellen für Anionen – eine interne, eine

externe und eine zentrale (Sin, Sex, Scen; Abb. 5A, B). Das Cl- muss diese auf seinem

Weg durch die Membran passieren. Während Sin und Sex in direktem Kontakt zum

Intra- bzw. Extrazellulärraum stehen, ist Scen komplett isoliert und liegt etwa in der

Mitte der Lipid-Doppelschicht. An dieser Bindungsstelle scheinen die Anionen fast

oder komplett dehydratisiert vorzuliegen – für eine genaue Aussage reicht die

Auflösung der Proteinstruktur nicht aus (Dutzler et al., 2003). Im EcClC-1 wurden

Bindungsaffinitäten für Cl- im mM-Bereich bestimmt, wobei Cl- am stärksten an Scen

und am schwächste an Sin bindet (Lobet & Dutzler, 2006; Picollo et al., 2009). Im Scen

wird das Cl- wird über die Sauerstoffatome der Hydroxylgruppen von Ser107 (Sercen)

1. EINLEITUNG

29

und Tyr445 (Tyrcen) sowie über die Seitenkette des Glu148 (Gluex) koordiniert, im Sex

über Stickstoffatome der Amidgruppen des Proteinrückgrads von Gly149, Ile356,

Phe357(alle Nummerierungen beziehen sich auf EcClC-1; Abb. 5B; Dutzler et al., 2002,

2003). Die Koordination von Anionen im Sin ist noch unklar. Am Abstand der drei

Anionen-Bindungsstellen (~6 Å) beurteilt, können mehrere Anionen mit geringer

Distanz zueinander an das Protein binden ohne großartig miteinander zu

wechselwirken (Lobet & Dutzler, 2006; Picollo et al., 2009). Dies spricht dafür, dass

zumindest im EcClC-1 die gegenseitige elektrostatische Abstoßung durch die

Interaktion mit dem Protein kompensiert wird. In den CLC-Kanälen hingegen findet

eine starke Interaktion der Anionen statt und die elektrostatische Abstoßung

beschleunigt die Diffusion der Ionen durch die Pore (Pusch et al., 1995; Rychkov et al.,

1998; Dutzler et al., 2003; Cohen & Schulten, 2004). Alessio Accardi vermutet, dass

dies das Schlüsselelement für die Unterscheidung zwischen CLC-Kanälen und CLC-

Transportern sein könnte (Accardi & Picollo, 2010).

Gibt es molekulare Korrelate in den bekannten Strukturen der CLCs zu den

theoretischen gates von Kanälen und Transportern? Das Gluex ist die einzige

Aminosäure, die in der geschlossenen Konfiguration des Proteins das Anion an der

Passage zum Extrazellularraum sterisch hindert, da die Seitenkette von Gluex mit dem

Anion um seine Bindungsstelle konkurriert (Dutzler et al., 2002, 2003). Diese

Abbildung 5 Ionentransportpfade und Selektivitätsfilter eines CLC-Antiporters. (A) Der Cl-- bzw. H+-Transportweg ist als gestrichelter grüner bzw. roter Pfeil durch eine Untereinheit des CmClC-Dimers (hell grau) verbildlicht. Die dabei wichtigsten Aminosäuren sind durch Raum-füllende Modelle (Gluex und Gluin in rot, Tyrcen und Sercen in gelb) und das Cl--Ion durch eine grüne Kugel repräsentiert. Das CmClC besitzt an homologer Position zum Gluin ein Thr. (B) Struktur des Selektivitätsfilters und des „schnellen“ gates im EcClC-1 Wildtyp (links) und EcClC-1(E148Q) (rechts) mit ausgewählten Aminosäuren (S107 entspricht Sercen, Y445 Tyrcen und

E148 Gluex) und Namen entsprechender α-Helices. Die drei Cl--Bindungsstellen (Sext, Scen, Sint) sind mit grau unterlegt. Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen den gebundenen Cl--Ionen (rote Kugeln) bzw. Gluex und dem Protein sind als gestrichelte Linien angedeutet. In der geschlossenen Konformation besetzt Gluex Sext (links), nach Protonierung dieser Seitenkette schwingt sie nach außen und erlaubt die Bindung von Cl- an Sext (rechts) – der Transporter ist nun offen. Adaptiert von Dutzler, 2004.

1. EINLEITUNG

30

Aminosäure ist mit Ausnahme der ClC-K-Kanäle sowohl in Kanälen als auch in

Transportern der CLC-Familie konserviert. Wird dieses Glutamat protoniert, mit

Glutamin substituiert oder wird die Seitenkette verkürzt, schwingt es von der

Bindungsstelle weg und öffnet den Durchgang für das Anion. Dies wurde

eindrucksvoll mit der Kristallstruktur der E148Q bzw. E148A Mutante des EcClC-1

präsentiert und funktionell bewiesen – diese Mutanten werden zu konstitutiv offenen

Proteinen, die keinen messbaren H+-Transport mehr aufweisen und somit Cl-

unabhängig von H+ leiten (Dutzler et al., 2003; Accardi & Miller, 2004). Die

Transportrate wird dabei nicht erhöht (Accardi & Miller, 2004). Das Gleiche konnte

auch für einige Säuger-CLC-Antiporter gezeigt werden (Picollo & Pusch, 2005; Scheel

et al., 2005; Neagoe et al., 2010). Das Gluex fungiert folglich als das „schnelle“ gate

und ist deshalb besser bekannt als das gating Glutamat. Dies gilt auch für die CLC-

Ionenkanäle (Chen & Chen, 2003; Niemeyer et al., 2003). Zwischen den Strukturen

von CmClC und EcClC-1 gibt es einen signifikanten Unterschied: während das gating

Glutamat im EcClC-1 mit Sex interagiert, besetzt es im CmClC-Kristall das Scen (Dutzler

et al., 2002; Feng et al., 2010). Feng et al. nehmen an, dass dabei eine zusätzliche

Konformation im Transportzyklus detektiert wurde und postulieren auf dieser Basis

einen Transportmechanismus, der die 2Cl-:1H+-Stöchiometrie erklären würde (Feng et

al., 2010). Dies wird im Kapitel 1.3.4 detailliert dargestellt.

Des Weiteren verengen Tyrcen und Sercen den Transportweg auf der intrazellulären

Seite und könnten möglicherweise, wie von Alessio Accardi vorgeschlagen, zu einem

zusätzlichen intrazellulären gate beitragen (Accardi & Picollo, 2010). Das

Seitenkettenvolumen von Tyrcen minimierende Mutationen öffnen den Zugang zum

Intrazellulärraum (Accardi et al., 2006; Walden et al., 2007). Dies führt bei EcClC-1 zu

einer verringerten Anionenbindung an Scen sowie zu einer Aufhebung oder

Minimierung der Kopplung von Anionen an H+ (Accardi et al., 2006; Walden et al.,

2007). Sercen spielt eher eine Rolle für die Selektivität der CLCs und wird näher im

Kapitel 1.3.3 beschrieben. Mutiert man sowohl Gluex als auch Tyrcen in EcClC-1, steigt

die Transportrate etwa um das 20-fache an (Jayaram et al., 2008). Mit ca. 35000

Ionen/s wäre dieser Transporter ohne gates immer noch ca. 20-mal langsamer als der

langsamste CLC-Kanal (Saviane et al., 1999). Ob es nun ein ungewöhnlich schneller

Transporter oder ein schleichender Kanal ist, ist schwer zu beantworten. Einige

Arbeiten unterstützen jedoch mit folgenden Argumenten das Letztere: diese Mutante

transportiert Cl- passiv über eine durchgängige Pore, ist an keine

Konformationsänderung gekoppelt und der Transportraten-limitierende Schritt stellt

das Lösen des Ions vom Protein dar (Jayaram et al., 2008; Elvington et al., 2009;

Picollo et al., 2009).

Das strukturelle Korrelat für das „gemeinsame“ gate der CLCs ist noch weitgehend

unverstanden – für alle CLCs, die CBS-Domänen besitzen, wird eine

Konformationsänderung, in die der C-Terminus involviert ist, vermutet (Chen, 1998;

Fong et al., 1998; Estévez et al., 2004; Bykova et al., 2006). Dies wird im Kapitel 1.3.5

kommentiert.

1. EINLEITUNG

31

Wie eben beschrieben, sind die Aminosäuren, die Anionen während der Passage

koordinieren, zwischen den Vertretern der beiden thermodynamisch

entgegengesetzten Mechanismen gut konserviert und der Anionen-Transportweg ist

tiefgründig erforscht. Dagegen ist der Pfad, dem die H+ durch die Antiporter folgen,

noch weitgehend im Dunkeln. Wie H+ CLC-Kanäle modulieren ist auch noch nicht für

alle CLCs vollständig verstanden. Die Rolle des Gluex wurde in diesem Kapitel bereits

erläutert. An dieser Aminosäure treffen sich also beide Transportwege (Abb. 5A). Mit

der Ausnahme von CmClC besitzen alle Antiporter der CLC-Familie außerdem noch ein

intrazelluläres Glutamat, das sogenannte Protonen-Glutamat (E203 in EcClC-1; Gluin;

Abb. 5A), welches auch als intrazellulärer H+-Akzeptor fungiert (Accardi et al., 2005).

Mutiert man eines dieser Glutamate zu einer nicht-protonierbaren Aminosäure, wird

der H+-Transport vollständig aufgehoben (Accardi & Miller, 2004; Picollo & Pusch,

2005; Scheel et al., 2005; Zdebik et al., 2008; Lim & Miller, 2009; Neagoe et al., 2010).

Der Austausch von Gluin in Säuger-CLC-Antiportern führt sogar zu einer Vernichtung

der Cl--Transports, was in EcClC-1 nicht der Fall ist (Accardi et al., 2005; Zdebik et al.,

2008; Lim & Miller, 2009; Neagoe et al., 2010). In CLC-Kanälen ist diese Aminosäure

durch nicht-protonierbare, hydrophobe Aminosäuren wie Valin und Leucin ersetzt

(Accardi et al., 2005). Im CmClC-Austauscher findet man ein Threonin an der Position

des Protonen-Glutamats, welches auch H+ binden kann (Feng et al., 2010). Gluin und

Gluex sind also die Ein- und Ausgangspunkte für H+ in Antiportern. Sie liegen jedoch

ca. 14 Å (in EcClC-1) auseinander (Accardi & Picollo, 2010) – ein Abstand, der über

weitere H+-Akzeptoren und -Donatoren überbrückt werden muss. Dieser Prozess ist

noch unbekannt. Generell kann H+-Transfer über den Grotthuss-Mechanismus

erfolgen. Dabei werden in einem Wasserstoffbrücken-Netzwerk (z.B. in Wasser oder

an protonierbaren Aminosäuren) kovalente Bindungen transient auf- und abgebaut.

Momentan existieren für den H+-Transport in CLC-Antiportern mehrere Hypothesen.

Ein an Scen gebundenes Cl- könnte als H+-Akzeptor zwischen Gluin und Gluex fungieren.

Dabei würde sich transient ein HCl-Molekül in Scen bilden. Theoretisch würde dann

eine verminderte Besetzung von Scen mit Cl- den H+-Transport reduzieren, was von

mehreren Arbeiten indirekt bestätigt wurde (Accardi et al., 2006; Nguitragool &

Miller, 2006; Alekov & Fahlke, 2009; Matsuda et al., 2010; Zifarelli & Pusch, 2009).

Direkte Beweise gibt es jedoch noch nicht. Eine andere Hypothese besagt, dass Gluin

nach Protonierung eine Rotation erfährt, die den transienten Aufbau einer

durchgehenden Kette an Wassermolekülen zwischen Gluin und Gluex schafft und somit

den H+-Transfer ermöglicht (Wang & Voth, 2009). Auch hierfür existieren noch keine

direkten Beweise.

Bemerkenswerterweise existiert vermutlich auch im ClC-0 ein degradierter H+-

Transport als Relikt der Evolution (Lísal & Maduke, 2008; Zifarelli et al., 2008). Wie

der H+-Transfer hier erfolgt, ist ebenfalls unverstanden. Es wird debattiert, ob ein

ähnlicher Pfad wie in den Austauschern oder ein komplett anderer benutzt wird

(Chen & Chen, 2001; Traverso et al., 2006; Lísal & Maduke, 2008; Zifarelli et al., 2008).

Fakt ist, dass die Schließrate des Kanals durch die intrazelluläre H+-Konzentration

1. EINLEITUNG

32

beeinflusst wird und dass ClC-0 einen Cl--Kanal darstellt, der mit mehreren Millionen

Cl--Ionen auch ein H+ passiv leiten kann (Lísal & Maduke, 2008; Zifarelli et al., 2008).

1.3.3 SELEKTIVITÄT

Wie Anionen durch das Protein geleitet werden, wurde in Kapitel 1.3.2 beschrieben.

Hier soll auf die inter-anionische Selektivität eingegangen werden.

Die meisten CLC-Transporter weisen mit SCN- > NO3- > Cl- > Br- > I- eine ähnliche

Selektivitätsreihe auf; die CLC-Kanäle leiten jedoch NO3- weniger als Cl- (Steinmeyer et

al., 1995; Rychkov et al., 1998; Friedrich et al., 1999; Accardi et al., 2004; Nguitragool

& Miller, 2006; Neagoe et al., 2010). Tatsächlich scheint die Fähigkeit der CLCs,

zwischen verschiedenen Anionen zu präferieren, durch eine einzige Aminosäure

bestimmt zu werden: Sercen (Bergsdorf et al., 2009). Der NO3-/H+-Austauscher von

Arabidopsis thaliana, AtClC-a, besitzt ein Prolin an Stelle des Sercen (De Angeli et al.,

2006). Mutagenese dieses Prolins zu Serin wandelte AtClC-a zu einem Cl-/H+-

Antiporter um (Bergsdorf et al., 2009; Picollo et al., 2009; Zifarelli & Pusch, 2009).

Auch die umgekehrte Mutagenese des Sercen zu Prolin in mehreren CLC-Antiportern

und ClC-0 kehrte deren Selektivität zu NO3-> Cl- um (Bergsdorf et al., 2009; Picollo et

al., 2009; Zifarelli & Pusch, 2009).

1.3.4 2CL-/1H+-TRANSPORTMECHANISMUS (postuliert von Feng et al., 2010)

Auf Grundlage der momentan verfügbaren Kristallstrukturen von CmClC, StClC und

EcClC-1 mit den entsprechenden Mutanten schlägt MacKinnon mit seinen Kollegen

den in Abbildung 6 dargestellten Transportmechanismus für den Austausch von 2 Cl-

gegen 1 H+ vor (Feng et al., 2010).

Die Konformationen a und b zeigen die deprotonierte und protonierte Zustandsform

der Struktur, wie sie von CmClC bestimmt wurde (Abb. 6). Die Zustände d und e

repräsentieren die protonierte und deprotonierte Konformation des EcClC-1 E148Q

und f den Zustand des EcClC-1 Wildtyps (Abb. 6). Von a nach b wird die

Carboxygruppe des gating Glutamats von der intrazellulären Seite protoniert (Abb. 6).

Dadurch ändert sich die Orientierung dieser Carboxygruppe (Zustand c) – das gating

Glutamat schwingt nach außen – und zwei Cl--Ionen gelangen von außen in die Pore

(Zustand d; Abb. 6). Nachdem das gating Glutamat wieder deprotoniert wird (Zustand

e), schwingt es zurück Richtung Zellinneres und interagiert zunächst mit Sex, wobei es

ein Cl--Ion ins Zellinnere verdrängt (Zustand f), um dann in die Ausgangsposition,

1. EINLEITUNG

33

Interaktion mit Scen, zurückzukehren und das zweite Cl--Ion nach innen freizusetzen

(Zustand a; Abb. 6). Dieser Zyklus würde die Stöchiometrie von 2 Cl- zu 1 H+ erklären

und nur unter einer Dissipation des elektrochemischen Cl--oder H+-Gradienten

funktionieren, um den aktiven Gegentransport des jeweils anderen Ions zu

gewährleisten (Feng et al., 2010). Dabei soll jede Zustandsänderung reversibel sein

(Feng et al., 2010).

Es gibt jedoch offensichtliche Probleme mit diesem Modell. Um den Verlust einer

stöchiometrischen Kopplung der zu transportierenden Substrate und somit den

Verlust eines aktiven Transportes zu vermeiden, müssen beim Übergang von c nach d

die Cl--Ionen von außen in die Pore eintreten. Außerdem sind die Zustände d und e

für Transporter prinzipiell verboten, da sie eher Ionenkanälen im klassischen Sinne

entsprechen (Kap. 1.2). Beide Probleme können mit der Annahme einer großen

Abbildung 6 Model für den Transportmechanismus der CLC-Antiporter. Schematische Darstellung der „CLC-Pore“ mit den relevanten Aminosäuren Sercen (S), Tyrcen (Y) und Gluex (E) in den verschiedenen Zuständen des Transportzykluses (a-f), so wie sie im Haupttext erklärt werden. Cl--Ionen werden als rote Kugeln präsentiert und H+-Ionen in lila. Adaptiert von Feng et al., 2010.

1. EINLEITUNG

34

kinetischen Barriere, die schnellen Austausch von Cl- zwischen Sin und Scen verhindert,

umgangen werden (Feng et al., 2010). Folglich würde beim Übergang von c nach d Cl-

nur von außen einströmen und wenn dies schnell genug erfolgt, wäre der Zustand c

nur von transienter Natur. Auch Zustände d und e wären dann legitim.

Die Simulation dieses Transportmodells bestätigt alle experimentell ermittelten

Haupteigenschaften der CLC-Antiporter (Feng et al., 2010). Da CLC-Kanäle ein pH-

gesteuertes Schaltverhalten aufweisen, könnte man anhand dieses Modells

außerdem spekulieren, dass sie – wie für ClC-0 bereits gezeigt – einfach stark

entkoppelte Cl-/H+-Transporter mit einer hohen Cl--Transportrate (in Konformation d

und e) darstellen (Feng et al., 2010). Interessanterweise, entkoppeln Mutationen in

Austauschern den Transport der Substrate eher teilweise als vollständig (Walden et

al., 2007). Dieses Modell würde vorhersagen, dass sie sich beispielsweise auf die

Interaktion des gating Glutamats mit der Pore auswirken könnten oder die

Transportraten in den Stadien d und e beeinflussen (Feng et al., 2010).

1.3.5 FUNKTIONEN DER CBS-DOMÄNEN

Die Bedeutung der CBS-Domänen für die Funktionalität der CLCs wird unter anderem

dadurch verdeutlicht, dass Erbkrankheiten, die durch Fehlfunktionen der CLC-

Proteine verursacht werden, nicht nur auf Mutationen in den Transmembranregionen

dieser Proteine sondern auch auf Mutationen in den C-Termini zurückzuführen sind

(Lloyd et al., 1996, 1997; Estévez et al., 2001; Kornak et al., 2001, 2006). Wie die CBS-

Domänen ihre Funktion erfüllen – ob selbst, über Protein-Protein-Interaktion oder

über Bindung von Adenosinnukleotiden – ist noch weitgehend unverstanden.

In manchen CLCs modulieren sie die Kanal- bzw. Transporteraktivität (Estévez et al.,

2004; Hebeisen et al., 2004; Mo et al., 2004; Yusef et al., 2006). Dies wird durch die

starke Interaktion der C-Termini mit den Transmembranregionen überzeugend

vorstellbar (Feng et al., 2010). Dabei sind drei strukturelle Elemente von Bedeutung.

Die αR-Helix, die das Cl--koordinierende Tyrosin Tyrcen trägt, ist mit den CBS-Domänen

direkt verbunden (Feng et al., 2010; Abb. 7). CBS 2 steht auch im Kontakt mit der αD-

Helix, die das Ionenselektivitäts-bestimmende Sercen beherbergt (Feng et al., 2010;

Abb. 7). So können Konformationsänderungen im C-Terminus direkt auf den

Ionentranslokationsweg übertragen werden. Außerdem interagiert die Schleife, die

αH mit αI verbinden, mit dem C-Terminus, was auch einen Einfluss auf die

Transportaktivität haben könnte, da beide α-Helices an der Inter-Momomer-

Interaktionsfläche beteiligt sind (Feng et al., 2010; Abb. 7). Diese enge Interaktion

unterstützt also die Hypothese, dass der C-Terminus am „gemeinsamen“ gate

beteiligt sein könnte (Chen, 1998; Fong et al., 1998; Estévez et al., 2004; Bykova et al.,

2006).

1. EINLEITUNG

35

Außerdem kommt es bei manchen CLCs wie ClC-0, ClC-1, gef1p unter Fehlen der CBS-

Domänen zum fehlerhaften subzellulären Transport des Proteins (Schmidt-Rose &

Jentsch, 1997; Maduke et al., 1998; Schwappach et al., 1998; Estévez et al., 2004).

Bemerkenswerterweise kann dieser Phänotyp durch Co-Expression der fehlenden

Domänen gerettet werden (Schmidt-Rose & Jentsch, 1997; Maduke et al., 1998; Mo

et al., 2004).

Die Bindung von Adenosin-Nukleotiden an die CBS-Domänen konnte für manche CLCs

(ClC-1, ClC-2, ClC-Ka, ClC-5, atClC-a) nachgewiesen werden (Bennetts et al., 2005;

Wellhauser et al., 2006; Meyer et al., 2007; De Angeli et al., 2009; Zifarelli & Pusch,

2009b). Dabei können die Kanäle bzw. Transporter sowohl inhibiert als auch aktiviert

werden (Bennetts et al., 2005, 2007; Meyer et al., 2007; Tseng et al., 2007; De Angeli

et al., 2009; Zifarelli & Pusch, 2009b). Bei ClC-1 beispielsweise moduliert ATP das

„gemeinsame“ gate – erhöhte ATP-Konzentrationen verschieben den Mittelpunkt der

Verteilung der Offenwahrscheinlichkeit zu positiveren Potenzialen und reduzieren

somit die Fraktion an offenen Kanälen unter physiologischen Bedingungen (Bennetts

et al., 2005). Interessanterweise können mit einer Ausnahme, dem AtClC-a, alle

beschriebenen Adenosin-Nukleotide-bindenden CLCs kaum zwischen AMP, ADP und

ATP selektieren (Meyer et al., 2007; Markovic & Dutzler, 2007; De Angeli et al., 2009).

Somit bleibt auch die physiologische Rolle von ATP für die betreffenden CLCs unter

Debatte. Für AtClC-a, einem NO3-/H+-Antiporter aus Arabidopsis thaliana, der für die

vakuoläre Nitrat-Akkumulation zuständig ist, ist die Kopplung der Transporterfunktion

an den metabolischen Status der Zelle am besten bekannt (De Angeli et al., 2009).

Abbildung 7 Interaktion

zwischen C-Terminus und

Transmembranregion. Vereinfachte Darstellung eines CLC-Monomers mit drei gebundenen Cl--Ionen (rote Kreise) in der „Pore“. Der zytosolische C-Terminus interagiert hauptsächlich über die CBS2-Domäne mit der Transmembranregion – genauer gesagt mit αD und αR (die an der Ionentranslokation

beteiligt sind) sowie αH und αI (die an der Monomer-Monomer-Interaktionsfläche

liegen). αN und αF tragen Aminosäuren, die Sext ausbilden. Adaptiert von Strange, 2011.

1. EINLEITUNG

36

1.4 ClC-7 – ein spät-endosomaler/lysosomaler Cl-/H

+-Antiporter

ClC-7 wurde parallel zu ClC-6 kloniert – sie teilen 45% Sequenzidentität und bilden

zusammen die dritte Untergruppe der CLC-Familie (Brandt & Jentsch, 1995; Abb. 3).

Wie auch ClC-6 kommt ClC-7 wahrscheinlich nur als Homodimer vor (Suzuki et al.,

2006). Und im Gegensatz zu ClC-6 ist für ClC-7 eine Hilfsuntereinheit, Ostm1, bekannt,

mit der ClC-7 zu einem funktionellen Komplex assembliert (Kap. 1.3 und 1.4.4; Lange

et al., 2006).

ClC-7 mRNA fand man in allen untersuchten Gewebs- und Zelltypen mit höchster

Expression in Hirn, Auge, Knochen, Sertoli-Zellen so wie in Epithelien der Trachea, des

Pankreas und des proximalen Tubulus der Niere (Brandt & Jentsch, 1995; Kida et al.,

2001; Kornak et al., 2001; Kasper et al., 2005; Wartosch et al., 2009). Knockout-Maus-

kontrollierte Immunohistochemie bestätigte das nahezu ubiquitäre

Expressionsmuster von ClC-7 (Brandt & Jentsch, 1995; Kida et al., 2001; Kornak et al.,

2001; Kasper et al., 2005; Wartosch et al., 2009).

Sowohl im nativen Gewebe als auch nach Überexpression in heterologen Systemen

co-lokalisiert ClC-7 auf subzellulärer Ebene mit dem spät-endosomalen und

lysosomalen Marker Lamp-1 und vertritt somit die CLC-Familie als einziges Mitglied

auf Lysosomen (Abb. 8 oben; Kornak et al., 2001; Kasper et al., 2005; Lange et al.,

2006; Poët et al., 2006; Suzuki et al., 2006; Wartosch et al., 2009). Das subzelluläre

Sortieren (sorting) von ClC-7 wird über die Interaktion mit Adaptorproteinen des

Adaptor-Protein-Komplexes AP sowie mit GGAs (Golgi-associated, γ-adaptin-ear-

containing, Arf-binding proteins) vermittelt, wobei die N-terminalen

Erkennungsmotive für Adaptorproteine sowie mindestens ein noch nicht

identifiziertes, C-terminales Motiv für die spät-endosomale/lysosomale Lokalisation

ausschlaggebend sind (Stauber & Jentsch, 2010). Durch Zerstörung aller

Erkennungssequenzen für APs und GGAs würde das Sortieren von ClC-7 vollständig

unterbunden werden, wodurch es wie alle nicht-sortierten Proteine dem

Standardweg zur Plasmamembran folgen würde. Beim rClC-7 beispielsweise ist die

Mutation zweier N-terminaler Di-Leucin-Motive (rClC-7LL23/24AA;LL36/37AA) bereits

ausreichend, um es teilweise in die Plasmamembran zu bringen (Abb. 8 unten;

Stauber & Jentsch, 2010).

Die ausschließlich intrazelluläre Lokalisation verwehrt eine biophysikalische

Charakterisierung von ClC-7 – die bisher für ClC-7 publizierten Plasmamembran-

Ströme (Diewald et al., 2002; Kajiya et al., 2009; Ohgi et al., 2011) sind sehr

wahrscheinlich auf endogene Ströme des jeweiligen Expressionssystems

zurückzuführen (Jentsch, 2008). Die Tatsache, dass ClC-7 wie auch die anderen

Austauscher der CLC-Familie, ClC-3 bis ClC-6, ein Protonen-Glutamat besitzt, ließ eine

Funktion als elektrogenen Cl-/H+-Antiporter vermuten. Der finale Beweis dafür kam

1. EINLEITUNG

37

durch Transportstudien an nativen, über Zellfraktionierung aufgereinigten Lysosomen

(Graves et al., 2008; Weinert et al., 2010).

1.4.1 PHÄNOTYP DER CLC-7-KNOCKOUT-MAUS

Für die Aufklärung der Funktion von ClC-7 im Körper wurden ClC-7-Knockout-Mäuse

(Clcn7-/-) generiert (Kornak et al., 2001). Im Vergleich zu Wildtyp-Kontolltieren zeigten

sie eine kleinere Körpergröße und starben bereits etwa sechs Wochen nach der

Geburt (Kornak et al., 2001). Nähere Untersuchungen offenbarten eine starke

Verdichtung der Knochenmasse mit Kalzifizierung der Knochenmarkhöhlen (Abb. 9A)

– also eine schwere Osteopetrose, was sekundär eine extramedulläre Blutproduktion

verursachte und die Zahnerruption unterband (Kornak et al., 2001). Das ClC-7-Protein

konnte in mehrkernigen Zellen des mononukleär-phagozytären Systems, den

Osteoklasten, nachgewiesen werden (Kornak et al., 2001). Der diesen Phänotyp

erklärende Mechanismus wird in Kapitel 1.4.3 behandelt.

Des Weiteren wiesen die Knockout(KO)-Mäuse eine schnelle und progrediente,

postnatal auftretende Degeneration der Retina auf – sie waren also blind (Kornak et

al., 2001; Abb. 9B). Es konnte gezeigt werden, dass diese Degeneration Gewebs-

Abbildung 8 Subzelluläre Sortierung von ClC-7 über N-terminale Motive. Immunfluoreszenz-Färbungen von Ratte-ClC-7- bzw. Ratte-ClC-7LL23/24AA;LL36/37AA-exprimierenden HeLa-Zellen (Stauber & Jentsch, 2010). Oben, Wildtyp-ClC-7 (grün) co-lokalisiert mit dem spät-endosomalen/lysosomalen Marker Lamp-1 (rot; Überlagerung ergibt gelb). Unten, Mutagenese zweier N-terminaler Di-Leucin-Motive reicht für eine partielle Umleitung von ClC-7 zur Plasmamembran aus.

1. EINLEITUNG

38

intrinsische Ursachen unterliegt (Kasper et al., 2005), welchen genau ist jedoch bis

heute nicht bekannt.

Abbildung 9 ClC-7-Knockout-Maus. (A) Röntgenaufnahmen eines Tibia-Knochens von einer Wildtyp- (links, WT) und einer Knockout-Maus (rechts, KO) zeigen eine starke Verdichtung der Knochensubstanz (Osteopetrose) im KO-Tier. Adaptiert von Kornak et al., 2001. (B) Ultradünn-Schnitte der Retina veranschaulichen die progrediente Degeneration des Gewebes im KO-Tier. Bei P14 (links) erscheint die KO-Retina noch normal (Vergleich mit WT-Retina), bei P28 (mitte) sind kaum noch Photorezeptoren in der äußeren Körnerschicht (ONL) vorzufinden. RPE, retinales Pigment-Epithelium; OS, äußere Segmente der Photorezeptoren; IS, innere Segmente der Photorezeptoren; ONL, äußere Körnerschicht; OPL, äußere plexiforme Schicht; INL, innere Körnerschicht; IPL, innere plexiforme Schicht; GCL, Ganglienzellschicht. Adaptiert von Kornak et al., 2001. (C) Elektronenmikroskopische Aufnahme eines kortikalen KO-Neurons zeigt Ablagerungen von lysosomalem Speichermaterial im Soma (schwarze Punkte). Rechts, Vergrößerung der in links umrahmten Region (Soma und Axon-Initial-Segment). Nu, Nukleus. Adaptiert von Kasper et al., 2005. (D) Immunfluoreszenz-Färbungen von proximalen Tubuli der Nieren einer Nieren-spezifischen KO-Maus, die ein Mosaik-artiges Muster aus ClC-7-WT- (grün) und ClC-7-KO-Epithelzellen aufweist. Diese Tiere wurden zuvor mit einem Fluoreszenz-

markierten β-Laktoglobulin (rot) injiziert, welches über Endozytose aufgenommen und in Lysosomen degradiert werden sollte. Die Akkumulation von β-Laktoglobulin in den ClC-7-KO-Zellen zeigt die verlangsamte, proteolytische Degradation der Lysosomen. Adaptiert von Wartosch et al., 2009.

1. EINLEITUNG

39

Neben der Retina-Degeneration zeigten die Clcn7-/--Mäuse im zentralen

Nervensystem starke Ablagerungen von lysosomalem Speichermaterial, die zu

progredientem Verlust von Nervenzellen führen (Kasper et al., 2005). Diese

elektronen-dichte, autofluoreszente Ablagerungen wurden im gesamten

Nervenzellsoma verteilt vorgefunden (Kasper et al., 2005; Abb. 9C). Sie waren positiv

für die c-Untereinheit der mitochondrialen ATP-Synthase – ein Markenzeichen für

neuronale Ceroid-Lipofuszinose (NCL), einem Typ von lysosomalen

Speicherkrankheiten (Goebel & Wisniewski, 2004; Kasper et al., 2005). Für manche

Osteopetrose-Patienten wurden ebenfalls neurologische Symptome beschrieben

(Frattini et al., 2003).

Lysosomales Speichermaterial wurde auch in Epithelzellen der proximalen Tubulus

der Niere nachgewiesen (Kasper et al., 2005; Lange et al., 2006). Die Lokalisation des

spät-endosomalen/lysosomalen Markers Lamp-1 scheint sowohl im proximalen

Tubulus als auch in Neuronen verändert zu sein: in Clcn7-/--Neuronen erscheint das

Lamp-1-Signal verstärkt und diffuser im Vergleich zum Wildtyp, im proximalen

Tubulus hingegen sind die Lamp-1-positiven Strukturen vergrößert (Kasper et al.,

2005; Wartosch et al., 2009). Während die Endozytose unverändert geblieben ist, ist

die proteolytische Degradation im proximalen Tubulus der Clcn7-KO-Maus

verlangsamt (Wartosch et al., 2009; Abb. 9D). Auch eine Minimierung der Endozytose

konnte die Akkumulation von Speichermaterial im proximalen Tubulus nicht

reduzieren (Wartosch et al., 2009). Zusammenfassend kann man also sagen, dass ClC-

7 eine wichtige Rolle in der lysosomalen Physiologie spielt. Dies soll nun im nächsten

Kapitel näher erläutert werden.

1.4.2 BEDEUTUNG VON CLC-7 FÜR DIE LYSOSOMALE PHYSIOLOGIE

Lysosomen stellen Membran-begrenzte, katabolische Organellen eukaryotischer

Zellen dar (de Duve et al., 1955). Im Gegensatz zu den meisten anderen Zellorganellen

sind sie sehr heterogen in Größe und Morphologie und können bis zu 5% des

intrazellulären Volumens einnehmen (de Duve, 2005). Funktionell werden sie als

terminale, degradative Kompartimente des endocytotischen Pfades angesehen.

Außerdem verdauen sie auch intrazelluläres Material, welches bei der Autophagie

anfällt. In spezialisierten Zellen findet man auch Lysosomen-verwandte Organellen

(z.B. Melanosomen und zytotoxische T-Zell-Granula), die für Zelltyp-spezifische

Aufgaben Proteine speichern und sezernieren können. Für ihre katabolische Funktion

sind Lysosomen mit zahlreichen sauren Hydrolasen (wie z.B. Proteasen, Glykosidasen,

Lipasen, Phosphatasen, Sulfatasen) ausgestattet, die ihre Substrate in kleinstmögliche

Einheiten zerlegen, welche dann über spezifische Transportwege das Lysosom

verlassen. Das pH-Optimum dieser Enzyme liegt, wie der Name schon sagt, im sauren

Bereich. Für die Azidifizierung und Aufrechterhaltung des sauren lysosomalen pH-

1. EINLEITUNG

40

Wertes (4,6 – 6,0) gegenüber dem neutralen zytosolischen pH-Wert (7,0 – 7,3) ist die

vesikuläre V-Typ H+-ATPase verantwortlich (Abb. 10A). Das aktive Reinpumpen von H+

ist ein elektrogener Prozess, der ohne einen zusätzlichen neutralisierenden Strom aus

energetischen Gründen vor Erreichen des sauren pH-Wertes zum Erliegen kommen

würde. Die Kompensation der intralysosomalen Akkumulation positiver Ladungen von

H+ kann theoretisch entweder über Ausstrom anderer positiver Ladungen oder

Einstrom negativer Ladungen erfolgen (Abb. 10A).

So wurde vermutet, dass ClC-7 an der Aufrechterhaltung des lysosomalen pH-Wertes

durch den Einstrom negativer Ladung beteiligt sein könnte. Jedoch zeigten

ratiometrische Messungen mit einem floureszierenden pH-Indikator in Lysosomen

von kultivierten Neuronen, Fibroblasten und alveolären Makrophagen, dass die

Aktivität von ClC-7 zumindest in diesen Zellen für die Aufrechterhaltung des

lysosomalen pH-Wertes nicht notwendig ist (Kasper et al., 2005; Lange et al., 2006;

Steinberg et al., 2010; Weinert et al., 2010; Abb. 10B links). Ein gekoppelter Cl-/H+-

Austausch trägt demnach nicht zum Erreichen des sauren steady state pH-Werts bei

(Abb. 10B links). Wie ist das mit einem einfachen, von H+ entkoppelten Cl--Einstrom,

der eine sich beim Ansäuern entwickelnde Spannung reduzieren würde? Um diese

Frage zu beantworten wurde eine Maus generiert, deren ClC-7 an Stelle des gating

Glutamats ein Alanin trug und somit unabhängig vom H+-Gradienten Cl--Ionen

transportierte (Weinert et al., 2010). Auch der Cl--Einstrom schien für die lysosomale

Azidifizierung durch die H+-ATPase sowie für den Gleichgewichts-pH-Wert entbehrlich

zu sein (Weinert et al., 2010; Abb. 10B links). Der Ladungsausgleich, der eine

effiziente Ansäuerung der Lysosomen gewährleisten würde, scheint demnach über

Kationenausstrom zu erfolgen (Van Dyke, 1993; Steinberg et al., 2010).

Desweiteren ist es vorstellbar, dass die Cl-/H+-Austauschaktivität von ClC-7 der Cl--

Akkumulation in Lysosomen dienen könnte – vergleichbar mit der Funktion von

AtClC-a in Vakuolen von Arabidopsis thaliana (Jentsch, 2007; De Angeli et al., 2009).

Somit wäre Cl- nicht als Ladung sondern als Substrat für die lysosomale Physiologie

von Bedeutung. Tatsächlich war die intralysosomale Cl--Konzentration sowohl in ClC-

7-defizienten Fibroblasten als auch in Fibroblasten mit einem entkoppelten ClC-7 im

Vergleich zum Wildtyp reduziert (Weinert et al., 2010; Abb. 10B rechts). Die Knockin-

Mäuse (KI) litten im gleichen Ausmaß wie die Knockout-Mäuse an Ablagerungen von

lysosomalem Speichermaterial und neuronaler Degeneration (Weinert et al., 2010).

Somit ist die für beide Mausmodelle beschriebene Dysfunktionen der Lysosomen

wahrscheinlich auf eine reduzierte lysosomale Cl--Konzentration zurückzuführen

(Weinert et al., 2010). Für eine effiziente Cl--Akkumulation ist folglich eine Kopplung

des Cl--Transports an den H+-Gradienten notwendig (Weinert et al., 2010; Abb. 10B

rechts). Welche genauen Aufgaben das lysosomale Cl- nun erfüllt, bleibt momentan

eine offene Frage. Zurzeit gibt es mehrere Hypothesen. Einerseits könnte Cl- direkt

enzymatische Aktivität regulieren, wie es für Cathepsin C bereits gezeigt wurde (Cigic

& Pain, 1999). Andererseits könnte sekundär-aktiver Transport von Metaboliten den

Cl--Gradienten als Energiequelle nutzen. Des Weiteren wäre auch eine indirekte Rolle

von Cl- in der Fusion und Fission von Organellen vorstellbar: Ca2+ wird als einer der

1. EINLEITUNG

41

Regulatoren dieser Prozesse vermutet und luminales Cl- wurde bereits als Modulator

von endosomalen Ca2+-Kanälen beschrieben (Luzio et al., 2007; Saito et al., 2007).

1.4.3 BEDEUTUNG VON CLC-7 FÜR DIE KNOCHENRESORPTION DURCH

OSTEOKLASTEN

Knochengewebe besteht aus verschiedenen Zelltypen und mineralisierter

Extrazellulärmatrix mit Kollagenfibrillen und Hydroxylapatit-Kristallen als

Hauptkomponenten (Lüllmann-Rauch & Rauch, 2003). Dieses Gewebe befindet sich

zeitlebens im Umbau, welcher durch das Zusammenspiel Knochen-aufbauender

Zellen, den Osteoblasten, und Knochen-abbauender Zellen, den Osteoklasten, erfolgt.

Für den Prozess des Knochenabbaus lagert sich der aktive Osteoklast der

mineralisierten Matrix direkt an und es kommt zu einer massiven Fusion von

Lysosomen mit der dem Knochen zugewandten Membran. Dadurch vergrößert sich

diese Membran stark und faltet sich auf – es entsteht eine spezialisierte

Bürstensaumzellmembran, die sogenannte ruffled border (Abb. 11). Der Raum

zwischen dieser Membran und dem Knochen wird als Resorptionslakune bezeichnet.

Durch die lysosomale Exozytose ist diese Membran reich an der V-Typ H+-ATPase und

die Resorptionslakune an sauren Hydrolasen. Die H+-ATPase säuert die

Abbildung 10 ClC-7 in der lysosomalen Physiologie. (A) Vereinfachte Darstellung eines Lysosoms mit H+-ATPase (rot) und hypothetischen Mechanismen zur Kompensation der intravesikulären Akkumulation positiver Ladungen (Anionen-Influx über ClC-7 oder Kationen-Efflux, blau). (B) Lysosomale pH-Wert- (links) und Cl--Messungen (rechts) an Fibroblasten des jeweils gekennzeichneten Genotyps (mittels Oregon-Green 488 als fluoreszierenden pH-Indikator und MEQ/Tetramethylrhodamin als fluoreszierenden Cl--Indikator). Links, Gleichgewichts-pH-Werte unterscheiden sich nicht in Abhängigkeit vom ClC-7-Genotyp. Rechts, ClC-7-KO- und ClC-7-KI-Lysosomen weisen niedrigere Cl--Konzentrationen im Vergleich zum Wildtyp auf. Adaptiert von Weinert et al., 2010.

1. EINLEITUNG

42

Resorptionslakune bis zu einem pH-Wert von ca. 4.6 an, was zum einen dem Lösen

des Hydroxylapatits aus dem Knochen dient und zum anderen das pH-Optimum für

die Hydrolasen gewährleistet, die die organische Matrix verdauen.

ClC-7 ist ebensfalls sowohl auf Lysosomen als auch in der ruffled border lokalisiert

(Kornak et al., 2001; Abb. 11). Das von ClC-7 transportierte Cl- neutralisiert die

Ladung, die durch die H+-ATPase in die Resorptionslakune gepumpt wird, und

unterstützt somit die Ansäuerung dieses Raums (Kornak et al., 2001; Neutzsky-Wulff

et al., 2008). Demzufolge ist die Azidifizierung sowie die Degradation von

kalzifiziertem Knochenmaterial in ClC-7 KO Mäusen stark vermindert – sie entwickeln

eine schwere Osteopetrose (Kornak et al., 2001). Außerdem ist auch die Region der

ruffled border unterentwickelt, was auf eine Rolle von ClC-7 in der lysosomalen

Exozytose hindeutet (Kornak et al., 2001). Bemerkenswerterweise entwickeln die ClC-

7-gating-Glutamat-KI-Mäuse eine mildere Osteopetrose als die KO-Mäuse (Weinert et

al., 2010). Folglich scheint eine entkoppelte ClC-7-Aktivität auszureichen, um das

Reinpumpen von H+ teilweise elektrisch zu neutralisieren und die Ansäuerung der

Resorptionslakune zu einem gewissen Grade zu ermöglichen (Weinert et al., 2010).

Auch im Menschen führen Mutationen im ClC-7-Gen (CLCN7) zu Osteopetrose. Bis

heute sind ca. 50 verschiedene krankheitsauslösende Mutationen bekannt, die über

das gesamte Protein verteilt sind (Cleiren et al., 2001; Kornak et al., 2001; Campos-

Xavier et al., 2003; Frattini et al., 2003; Waguespack et al., 2003; Letizia et al., 2004;

Waguespack et al., 2007; Besbas et al., 2009; Zhang et al., 2009; Pangrazio et al.,

2010; Phadke et al., 2010). Interessanterweise führen die meisten Mutationen zu

dem Austausch einer einzigen Aminosäure. Für einige wenige Mutanten wurde

festgestellt, dass sie nach der Translation im ER zurückgehalten werden oder dass sie

im nativen Gewebe instabil sind (Kornak et al., 2001; Schulz et al., 2010); für die

meisten ist jedoch die Ursache der Fehlfunktion des Antiporters noch unbekannt.

Desweiteren wurden im Menschen sogar Polymorphismen in ClC-7 mit Variationen in

der Knochendichte assoziiert (Pettersson et al., 2005; Kornak et al., 2006).

Abbildung 11 Der Knochensubstanz angelagerter, aktiver Osteoklast. Lokalisation der H+-ATPase (rot) und ClC-7/Ostm1 (grün) in lysosomaler Membran und der ruffled border ist dargestellt. Blau, Osteoklast-Zytosol; orange, saures Millieu des Lysosomen und der Resorptionslakune; gelb, Knochensubstanz. Adaptiert von Jentsch, 2008.

1. EINLEITUNG

43

1.4.4 OSTM1 – DIE HILFSUNTEREINHEIT VON CLC-7

Ostm1 (Osteopetrose-assoziiertes Membranprotein 1) wurde zunächst als Gen

identifiziert, welches den schweren osteopetrotischen Phänotyp einer spontanen

Mausmutante, der grey lethal Maus, verursachte (Chalhoub et al., 2003). Das Ostm1-

Genprodukt ist ein kleines (ca. 300 Aminosäuren) Typ-I-Membranprotein mit einem

langen, intraluminalen N-Terminus, einer Transmembrandomäne und einem kurzen

zytosolischen C-Terminus (Lange et al., 2006; Abb. 12). Der N-Terminus wird

proteolytisch gespalten – es ist noch unbekannt durch welche Protease, nach welcher

Aminosäure und ob die Spaltung auf dem Weg zum Lysosomom oder im Lysosom

selbst erfolgt (Lange et al., 2006). Nach der Spaltung bleiben die Spaltprodukte über

Disulfidbrücken miteinander verbunden (Lange et al., 2006; Abb. 12). Außerdem ist

der N-Terminus stark N-glykosyliert (Lange et al., 2006; Abb. 12). Da ClC-7 selbst keine

Konsensus-Sequenzen für putative Glykosylierungsstellen aufweist und als einziges

CLC auf Lysosomen vertreten ist, nimmt man an, dass der stark glykosylierte N-

Terminus von Ostm1 ClC-7 vor proteolytischem Angriff schützt (Lange et al., 2006).

Tatsächlich ist ClC-7 in der Ostm1-KO-Maus auf Proteinebene zu ca. 5% des Wildtyp-

Levels reduziert (Lange et al., 2006).

Ostm1 konnte auch wie ClC-7 auf späten Endosomen sowie Lysosomen ubiquitär und

an der ruffled border der Osteoklasten nachgewiesen werden (Chalhoub et al., 2003;

Fischer et al., 2003; Lange et al., 2006). Beide Proteine co-lokalisieren perfekt und

konnten co-immunopräzipitiert werden (Lange et al., 2006; Majumdar et al., 2011).

Ostm1 braucht ClC-7 für ein korrektes trafficking – ohne ClC-7 wird es im ER

zurückgehalten (Lange et al., 2006; Stauber & Jentsch, 2010). So ist Osmt1 in der ClC-

7-KO-Maus auf Proteinebene stark reduziert, was möglicherweise auf eine ER-

assoziierte Degradation zurückzuführen ist (Lange et al., 2006).

Die Tatsache, dass die Phänotypen beider KO-Mäuse einander gleichen, bestätigt die

Annahme von Ostm1 und ClC-7 als funktionellen Komplex (Lange et al., 2006).

Außerdem wurden auch Mutationen im Ostm1-Gen bei Osteopetrose-Patienten

gefunden; alle verursachten ein verfrühtes Stopp-Codon und damit den

Funktionsverlust von Ostm1 (Chalhoub et al., 2003; Quarello et al., 2004; Ramírez et

al., 2004; Pangrazio et al., 2006; Souraty et al., 2007; Maranda et al., 2008).

Abbildung 12 Membrantopologie von

Ostm1. Ostm1 ist ein Typ-I-Membran-Protein mit extrazytosolischem N-Terminus, einer Transmembran-Helix und intrazytosolischem C-Terminus. Es ist stark N-glykosyliert (Y, N-Glykan) und wird auf eine noch unbekannte Art proteolytisch prozessiert (Pfeil), wonach die Spaltprodukte über eine Disulfidbrücke (S-S, rot) kovalent aneinander gebunden bleiben. Adaptiert von Lange et al., 2006.

1. EINLEITUNG

44

1.5 Fragestellung

ClC-7 ist das letzte biophysikalisch nicht-charakterisierte Mitglied der CLC-Familie in

Säugern. Aufgrund seiner intrazellulären Lokalisation (mit Ausnahme der ruffled

border) war es für biophysikalische Standardmessmethoden unzugänglich. Lediglich

Transportstudien an isolierten Lysosomen konnten zeigen, dass es sich hierbei wie bei

den anderen intrazellulären Säuger-CLCs um einen elektrogenen Cl-/H+-Austauscher

handelt (Graves et al., 2008; Weinert et al., 2010) – essenzielle biophysikalische

Eigenschaften wie Spannungsabhängigkeit, Kinetik und Substratspezifität blieben

jedoch verborgen. Durch Manipulation von ClC-7-internen Erkennungsmotiven für die

zelluläre Sortierungsmaschinerie ist eine partielle Umleitung von ClC-7 zur

Plasmamembran gelungen (Abb. 8 unten; Stauber & Jentsch, 2010). In der

vorliegenden Arbeit soll nun eine biophysikalische Grundcharakterisierung vom

Plasmamembran-lokalisierten ClC-7 vorgenommen werden. Dabei sollen neben der

Untersuchung der Abhängigkeit von Spannung, von extrazellulären Anionen und

Protonen sowie der Stöchiometrie-Bestimmung auch weitere für andere Mitglieder

der CLC-Familie bereits bekannte Eigenschaften, wie die Abhängigkeit von ATP und

Temperatur, untersucht werden. Außerdem soll getestet werden, ob die ClC-7-

Transportaktivität von seiner β-Untereinheit Ostm1 abhängig ist.

2. ERGEBNISSE

45

2. ERGEBNISSE

Die ClC-7-Varianten rClC-7LL23/24AA;LL36/37AA oder hClC-7LL23/24AA;LL68/69AA, deren

Erkennungssequenzen für die zelluläre Sortierungsmaschinerie im N-Terminus

teilweise mutiert sind, lokalisieren in der Plasmamembran verschiedener heterologer

Expressionssysteme (Stauber & Jentsch, 2010; Abb. 8 unten, Abb. 13D). Diese

Mutanten sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit stellvertretend für den ClC-7-

Wildtyp einer biophysikalischen Charakterisierung mittels Zwei-Elektroden-

Spannungsklemme an X.laevis Oozyten und patch-clamp in der whole-cell-

Konfiguration an HeLa- bzw. tsA201-Zellen unterzogen werden. Da sowohl rClC-

7LL23/24AA;LL36/37AA als auch hClC-7LL23/24AA;LL68/69AA in den getesteten

Expressionssystemen voneinander nicht unterscheidbare Ströme lieferten (Daten

nicht gezeigt), sollen sie im Folgenden vereinfacht als ClC-7PM (PM für

Plasmamembran) bezeichnet werden.

2.1 ClC-7 ist ein Depolarisations-aktivierter Cl-/H

+-Austauscher

mit langsamer Kinetik

ClC-7PM, coexprimiert mit Ostm1, bringt auswärts rektifizierende Ströme zum

Vorschein, die sich durch eine langsame Kinetik auszeichnen (Abb. 13A). Die

Auswärtsrektifizierung ist charakteristisch für alle intrazellulären Säuger-CLCs (ClC-3

bis ClC-6), die langsame Kinetik hingegen ist ein Alleinstellungsmerkmal für ClC-7

(Steinmeyer et al., 1995; Friedrich et al., 1999; Li et al., 2000; Neagoe et al., 2010).

Nach einer 2-sekündigen Depolarisation wurde die maximale Aktivierung von ClC-7PM

nicht erreicht (Abb. 13A). Sogar bis zu 60 s lange Aktivierungspulse brachten ClC-7PM

nicht in einen stationären Zustand – es war lediglich eine langsame Aktivierung zu

verzeichnen, die sich an einem gewissen Wendepunkt in eine noch langsamere

scheinbare Inaktivierung umwandelte (Abb. 13B, C). Vermutlich ist diese scheinbare

Inaktivierung auf eine Dissipation des eigenen elektrochemischen Gradienten

zurückzuführen. Aus diesen Gründen wurden im Folgenden

Spannungsklemmprotokolle mit Aktivierungsphasen von maximal 2 s verwendet. Die

Deaktivierung des offenen ClC-7PM durch Hyperpolarisation führte zu langsam

deaktivierenden Schwanzströmen, deren Amplitude durch erhöhte intrazelluläre Cl--

Konzentration in patch-clamp-Experimenten vergrößert werden konnte (Pfeile in Abb.

2. ERGEBNISSE

46

13A). Alle drei von uns getesteten Expressionssysteme (HeLa- und tsA201-Zellen

sowie Xenopus laevis Oozyten) zeigten identische Ergebnisse für ClC-7 (Abb. 13A),

was zum Einen die Wahrscheinlichkeit eines Artefakts durch Aktivierung eines

endogenen Stromes minimiert und zum Anderen die Möglichkeit bietet, für die

jeweilige Fragestellung das am besten geeignete Expressionssystem zu wählen.

Abbildung 13 ClC-7 ist ein langsam gesteuerter Auswärtsrektifizierer. Alle Aufnahmen wurden an ClC-7PM/Ostm1-exprimierenden Zellen mittels patch-clamp (HeLa, tsA201) bzw. TEVC (Oozyten) durchgeführt (Spannungsklemm-Protokolle sind jeweils angegeben). (A) Gegenüberstellung von repräsentativen Aufnahmen ClC-7-vermittelter Ströme in verschiedenen heterologen Expressionssystemen: sie zeichnen sich durch Auswärtsrektifizierung und langsame Kinetik aus. Pfeile deuten auf tail currents. (B) ClC-7 erreicht kein steady state nach 10-sekündiger Aktivierung. (C) Selbst 60s-lange Aktivierung führt ClC-7 nicht ins steady state, eine scheinbare Inaktivierung wird im Verlauf des Stimulationspulses sichtbar. (D) Oberflächenexpression von ClC-7PM in X.laevis Oozyten wurde über einen Lumineszenz-basierten Test detektiert (Mittelwerte aus n ≥ 42 pro Bedingung, normiert auf das ClC-7PM-exHA-Signal, Standardfehler als Fehlerbalken). Zur Bestimmung des Hintergrundsignals dienten uninjizierte und ClC-7-injizierte Oozyten. Die Coexpression von ClC-7PM und Ostm1 supprimiert die Oberflächen-Detektion von ClC-7PM, obwohl Ströme messbar sind (A).

2. ERGEBNISSE

47

Die Plasmamembranlokalisation von ClC-7PM in HeLa-Zellen ist in Abbildung 8 (unten)

dargestellt (Stauber & Jentsch, 2010). Aus derzeit noch unbekannten Gründen scheint

die Zerstörung des trafficking zum Lysosom in HeLa-Zellen effizienter zu sein als in

tsA201-Zellen, da der Anteil an tsA201-Zellen mit ClC-7-Plasmamembran-Präsenz

deutlich geringer ausfiel als bei HeLa-Zellen (Daten nicht gezeigt). Deswegen wurden

bei der Durchführung von patch-clamp-Experimenten HeLa-Zellen als heterologes

Expressionssystem verwendet. In X.laevis Oozyten wurde die Plasmamembran-

Expression von ClC-7PM mittels eines Chemilumineszenz-basierten Oberflächentest

detektiert (Daten von Tobias Stauber). Dabei wird über einen Antikörper, der an ein

extrazellulär ins Protein eingebrachtes HA-tag bindet, das ClC-7-Protein detektiert.

Das Fehlen eines Signals bei Coexpression mit Ostm1 suggeriert fälschlicherweise das

Fehlen von ClC-7PM an der Zelloberfläche (Abb. 13D). Es ist vorstellbar, dass der lange

und stark N-glykosylierte N-Terminus von Ostm1 das Epitop verdeckt und somit den

Antikörper am Zugang hindert. Das Umsetzten des HA-tags in andere extrazelluläre

loops von ClC-7 brachte keinen Erfolg (Daten nicht gezeigt), was auf eine stark

gefächerte Glykanhülle deutet und die Hypothese, dass Ostm1 ClC-7 in Lysosomen

vor Proteolyse schützt (Lange et al., 2006), unterstützt.

Mit Hilfe von sogenannten Fluorozyte-Messungen konnten wir den H+-Transport

isoliert untersuchen. Diese Experimente sind etablierte Messungen des

intrazellulären pH-Wertes in X. laevis Oozyten und sind an die Zwei-Elektroden-

Spannungs-Klemme (TEVC oder two electrode voltage clamp) gekoppelt, was die

gleichzeitige Aufnahme des Gesamtstromes sowie des isolierten H+-Transportes

ermöglicht (Zdebik et al., 2008). Dazu wird vor den Messungen BCECF, ein

fluoreszierender pH-Indikator, in Oozyten injiziert. Durch die Aktivität von ClC-7 bei

Depolarisation kommt es zum Auswärtstransport von H+ und somit zu einer

Alkalinisierung auf der intrazellulären Seite der Plasmamembran, was die Emission

von BCECF erhöht (Abb. 14). Somit wird der Anstieg der Fluoreszenz zum Maß für die

H+-Transportrate. Die nicht-ratiometrischen Fluoreszenz-Messungen erlauben jedoch

keine Quantifizierung. Ein direkter Vergleich der Transportraten ist allenfalls

innerhalb derselben Oozyte möglich. Wie in Abbildung 14 dargestellt, wird der H+-

Transport durch Depolarisation stimuliert. Dabei aktiviert die intrazellulär positive

Spannung nicht nur ClC-7, sondern stellt zugleich die Triebkraft für den gekoppelten

Cl-/H+-Austausch bereit. Der Auswärtstransport von H+ kann auch bei einem sauren

extrazellulären pH-Wert (pHa = 5.5), also gegen seinen elektrochemischen

Gradienten, erfolgen (Abb. 14A). Außerdem benötigt der H+-Ausstrom durch ClC-7

extrazelluläres Cl-, d.h. er ist an den Einstrom von Cl- gekoppelt und kann ohne das

Vorhandensein von Anionen nicht stattfinden (Abb. 14B). Durch diese beiden

Beobachtungen wird der sekundär aktive Transport, wie er auch für die anderen CLC-

Austauscher publiziert wurde (Accardi & Miller, 2004; Picollo & Pusch, 2005; Scheel et

al., 2005), demonstriert.

2. ERGEBNISSE

48

Wie bei allen anderen Säugetier-CLC-Transportern (Friedrich et al., 1999; Li et al.,

2002; Neagoe et al., 2010) wird die Spannungs- und Zeitabhängigkeit auch im Falle

von ClC-7 durch Mutieren des gating Glutamats zu Alanin (E245A in rClC-7) eliminiert

– es entsteht ein nahezu ohm‘scher Widerstand (Abb. 15A links, 15C). Das

Substituieren des Protonen-Glutamats mit Alanin (E312A in rClC-7) unterbindet wie

auch bei anderen intrazellulären Säuger-CLCs die Transportaktivität gänzlich (Abb.

15A rechts, 15C; Zdebik et al., 2008; Neagoe et al., 2010). Wie erwartet führen beide

Abbildung 14 ClC-7 ist ein gekoppelter Cl-/H

+-Antiporter. Repräsentative Aufnahmen

zeigen H+-Transport-Messungen (mittels Fluorozyte, unten) und gleichzeitige Nettotransport-Messungen (mittels TEVC, oben) an ClC-7PM/Ostm1-exprimierenden Oozyten. Aktivierungs- und Deaktivierungs-Spannungen sind für die jeweilige Dauer angegeben, in der übrigen Zeit lag das Haltepotenzial bei -30 mV (in den Lösungswechselphasen wurde die Spannung nicht geklemmt). Fluoreszenz-Signal wurde auf den Wert zu Anfang des Experiments normalisiert (Signalerhöhung symbolisiert Alkalinisierung). (A) H+-Auswärtstransport kann gegen den H+-Gradienten (pHa = 5,5) erfolgen, jedoch erschwert (Vergleich mit pHa = 7,5), und ist somit an den Cl--Einwärtstransport gekoppelt. (B) Ohne das Vorhandensein permeabler Anionen (0 Cl-) findet kein H+-Transport statt – ein weiterer Beweis für die Kopplung beider Ionen (Positivkontrolle bei 96 mM Cl-).

2. ERGEBNISSE

49

Mutationen zum Erliegen des H+-Transports (Abb. 15B), da beide Aminosäuren

essenzielle Elemente des H+-Pfades durch das Protein darstellen (Kap. 1.3.2).

Die Stimmigkeit dieser Ergebnisse überzeugt, dass die gemessenen Ströme wirklich

durch ClC-7 vermittelt werden.

Abbildung 15 Neutralisierung des gating- und Protonen-Glutamats in ClC-7.

Typische TEVC- (A) bzw. Fluorozyten-Aufnahmen (B) der Gluex- (E245A, links) und Gluin-Mutante (E312A, rechts). Neutralisierung des Gluex unterbindet die Spannungsabhängigkeit (A links) sowie den H+-Transport (B links) – es entsteht eine Cl--Leitfähigkeit mit nahezu linearer Strom-Spannungs-Beziehung (C). Neutralisierung von Gluin schafft den Transport beider Ionen ab (A rechts, B rechts), die Ströme unterscheiden sich nicht vom Hintergrund-Strom (C). Alle Experimente wurden unter Coexpression von Ostm1 durchgeführt. Spannungsklemm-Protokolle sind angegeben. (C) Strom-Spannungs-Kurven beider Mutanten sind im Vergleich zu ClC-7PM (Abbildung 13A rechts) und nicht injizierten Oozyten (uninj.) dargestellt (Mittelwerte ± Standardfehler; n=20 für ClC-7PM, n=13 für E245A, n=11 für E312A, n=16 für uninj.).

2. ERGEBNISSE

50

2.2 Ostm1 ist unabdingbar für die Transportaktivität von ClC-7

Ostm1 erreicht seinen zellulären Bestimmungsort nur gemeinsam mit ClC-7 und im

Gegenzug dazu stabilisiert es den Transporter auf eine bis jetzt ungeklärte Art (Lange

et al., 2006). Interessanterweise konnten ohne eine Coexpression mit Ostm1 keine

ClC-7-vermittelten Ströme gemessen werden (Abb. 16), obwohl ClC-7PM in der

Plasmamembran lokalisiert war (Abb. 8, 13D; Stauber & Jentsch, 2010). Die in

Abbildung 16 dargestellten patch-clamp-Messungen in HeLa-Zellen erscheinen klar:

ClC-7PM-vermittelter Cl-/H+-Austausch findet nur in Anwesenheit von Ostm1 statt;

Ströme von Zellen, die nur ClC-7PM exprimieren, sind eindeutig Hintergrundströme. In

X.laevis Oozyten waren die Ergebnisse jedoch nicht ganz so eindeutig und sollen

deshalb hier nicht gezeigt werden. Festzuhalten ist lediglich, dass durch die alleinige

Anwesenheit von ClC-7 endogene Cl--Ströme unbekannter Herkunft mit einer

höheren Selektivität für I- als für Cl-, was für die CLCs ungewöhnlich wäre, induziert

wurden (Daten nicht gezeigt). Sie waren deutlich höher als die Ströme Wasser-

injizierter Oozyten, erreichten jedoch nie die Amplitude von ClC-7PM/Ostm1-

vermittelten Strömen (Daten nicht gezeigt). Manchmal ähnelten diese artifiziellen

Ströme auswärts rektifizierenden, Nukleotid-sensitiven Cl--Strömen ICln, die den

Oozyten endogen sind und durch Expression verschiedener, strukturell unverwandter

Proteine (u.a. auch ClC-6) induziert werden können (Buyse et al., 1997). Gleiches

konnte auch bei der Expression der Transport-defizienten Protonen-Glutamat-

Mutante von ClC-7 in X.laevis Oozyten beobachtet werden (Daten nicht gezeigt), was

ebenfalls auf die artifizielle Natur der gemessenen Ströme hinweist.

Abbildung 16 ClC-7-Transportaktivität benötigt Ostm1. ClC-7PM und GFP bzw. ClC-7PM und Ostm1-GFP exprimierende HeLa-Zellen wurden patch-clamp-Messungen unterzogen (rechts, repräsentative Aufnahmen; links, Stromdichte-Spannungs-Beziehungen, Mittelwerte ± Standardfehler, n=9 für ClC-7PM/Ostm1, n=12 für ClC-7PM, n=10 für n.t.). Ohne Ostm1-Coexpression konnten keine vom Hintergrund (n.t., nicht transfiziert) signifikant unterschiedlichen Ströme gemessen werden.

2. ERGEBNISSE

51

Folglich wurden die zuvor im Kapitel 2.1 und die in allen folgenden Kapiteln

beschriebenen Experimente zur biophysikalischen Charakterisierung von ClC-7 stets

unter Coexpression mit Ostm1 durchgeführt, auch wenn es nicht nochmals explizit

erwähnt wird.

2.3 ClC-7 ist ein 2:1 gekoppelter Cl-/H

+-Austauscher

Die Stöchiometrie von 2 Cl- zu 1 H+ scheint als gemeinsames Merkmal der CLC-

Austauscher anerkannt zu sein. Dieses Ionen-Kopplungsverhältnis wurde zunächst für

EcClC-1 (Accardi & Miller, 2004) und später auch für ClC-5 (Zifarelli & Pusch, 2009)

bestimmt. Die langsame Kinetik des lysosomalen Austauschers ClC-7 bietet die

Möglichkeit, trotz der starken Rektifizierung die Stöchiometrie eines Säuger-CLC-

Austauschers erstmals über Bestimmung von Umkehrpotenzialen zu ermitteln. Dafür

wurden bei verschiedenen extrazellulären Cl--und H+-Konzentrationen, also bei

verschiedenen Cl--und H+-Gradienten, Umkehrpotenziale über die tail currents

bestimmt (Kap. 4.2.5.3). Die Experimente wurden an ClC-7PM und Ostm1 co-

transfizierten HeLa-Zellen in der whole-cell-Konfiguration durchgeführt. Um lokale

Konzentrationsänderungen während den Messungen zu verhindern, wurde das

intrazelluläre Cl- sowie die intrazelluläre H+-Pufferkapazität hoch gehalten (121 mM

Cl-, 40 mM HEPES). Das Umkehrpotenzial der Hintergrundleitfähigkeiten von HeLa-

Zellen wurde über kurze (50 ms), ClC-7 noch nicht aktivierende Kontrollpulse vor den

eigentlichen Testpulsen ermittelt (Beispielaufnahmen s. Abb. 17A oben, B oben). Die

gemessenen Umkehrpotenziale wurden dann durch Subtraktion der

Hintergrundumkehrpotenziale sowie der Flüssigkeits-Grenzpotentiale (liquid junction

potentials) auf die ClC-7-vermittelten Umkehrpotenziale korrigiert (Kap. 4.2.5.3). Die

Ergebnisse der Messungen sowie Beispielaufnahmen für alle untersuchten

Bedingungen sind in Abbildung 17 demonstriert. Wie dargestellt stimmen unsere

Daten für ClC-7 am besten mit einer 2 Cl- zu 1 H+ Stöchiometrie überein. Die

Abweichung im basischen Bereich ist möglicherweise auf experimentelle

Unzulänglichkeiten zurückzuführen. Es ist vorstellbar, dass eine Änderung der H+-

Konzentrationen in der Extrazellulär-Lösung in unmittelbarer Nähe zur

Plasmamembran durch den Auswärtsstrom von H+ verursacht werden könnte. Die

relative Änderung wäre im basischen pH-Bereich viel größer als im sauren und würde

somit bei pH 8,4 bestimmten Umkehrpotenzialen mehr verfälschen als bei pH 6,4.

Eine andere Möglichkeit wäre, dass ClC-7 bei niedriger extrazellulärer H+-

Konzentration entkoppelt wird. Dies müsste in Folgestudien geklärt werden. Dafür

gibt es unter den CLCs keine direkten Beispiele. Es erscheint auch eher

2. ERGEBNISSE

52

unwahrscheinlich, da ClC-3 angeblich durch hohe extrazelluläre H+-Konzentration

entkoppelt wird (Matsuda et al., 2010). Dies konnte von Feng et al. dadurch erklärt

werden, dass bei einer hohen extrazellulären H+-Konzentration theoretisch der

Übergang von der Konformation e zu d im Transportmechanismus (Kap. 1.3.4) größer

werden könnte als vom Zustand e zu f (Feng et al., 2010).

Abbildung 17 ClC-7 ist ein 2Cl-/1H

+-Antiporter. Bestimmung der Kopplungsstöchiometrie

über Berechnung von Umkehrpotenzialen bei verschiedenen Cl-- (A) und H+-Gradienten (B) anhand von patch-clamp-Messungen an ClC-7PM/Ostm1-exprimierenden HeLa-Zellen. Extrazelluläre Konzentrationen des jeweiligen Ions ([Cl-]a, pHa) wurden variiert, Beispielaufnahmen (A oben, B oben) sind entsprechend gekennzeichnet. Spannungsklemm-Protokolle waren ähnlich wie in Abbildung 18B, mit dem Unterschied, dass die Aktivierungspuls-Dauer variiert wurde und die Schwanzströme bei nur drei verschiedenen Spannungspulsen gemessen wurden (in jeweiliger Beispielaufnahme entsprechend

2. ERGEBNISSE

53

2.4 Spannungsabhängigkeit von ClC-7 liegt dem Steuerungsverhalten

zu Grunde

Der Cl-/H+-Austauscher ClC-7PM (coexprimiert mit Osmt1) öffnet bei positiven

Spannungen und stellt somit einen Auswärts-Rektifizierer dar (Abb. 13A, 15C). Die

langsame Kinetik der Aktivierung und Deaktivierung lässt sich durch eine mono-

exponentielle Funktion beschreiben, wobei die Aktivierung ca. 10-fach langsamer

erfolgt als die Deaktivierung (Abb. 18A). Die Zeitkonstanten beider Prozesse weisen

eine Spannungsabhängigkeit auf (Abb. 18A). Die Aktivierungszeitkonstanten verteilen

sich Glocken-förmig über einen Spannungsbereich von +20 mV bis +100 mV mit

einem Maximum von ca. 1,5 s bei +60 mV (Abb. 18A links). Die

Spannungsabhängigkeit der Deaktivierungskinetik ist weniger ausgeprägt: mit

zunehmender Depolarisation von +20 mV bis +60 mV sinkt die Zeitkonstante von ca.

150 ms auf ungefähr 100 ms und bleibt konstant auf diesem Wert im

Spannungsbereich von +60 mV bis +100 mV (Abb. 18A rechts).

Die langsame Deaktivierungskinetik von ClC-7PM bietet unter den intrazellulären

Säuger-CLCs eine einzigartige Möglichkeit, Schwanzströme, also Cl-/H+-Austausch im

negativen Spannungsbereich, zu messen. Zum ersten Mal kann nun die Frage wirklich

klar beantwortet werden, worauf die strenge Spannungsabhängigkeit der

intrazellulären CLCs zurückzuführen ist. Ist das Steuerungsverhalten dafür

verantwortlich – ist es also eine Protein-intrinsische Eigenschaft? Oder stellt die

Ionentranslokation durch den offenen Transporter an sich den Spannungs-

abhängigen Prozess dar? Dafür wurde von für Ionenkanäle entwickelten Protokollen

Gebrauch genommen, wie sie bereits in der Einleitung (Kap. 1.2.1) beschrieben

wurden. Um die Amplitude der Schwanzströme zu erhöhen, sollte die intrazelluläre

Cl--Konzentration hoch gehalten werden (121 mM), deshalb wurden patch-clamp-

Experimente in der whole-cell-Konfiguration mit ClC-7PM/Ostm1-exprimierenden

HeLa-Zellen durchgeführt. Für die Untersuchung der Spannungsabhängigkeit des

Ionentransports durch den offenen Austauscher wurde ClC-7PM durch eine

Depolarisation von +80 mV auf eine immer wieder gleiche Offenwahrscheinlichkeit,

hier repräsentiert durch eine immer wieder gleiche Stromamplitude, gebracht (Abb.

angegeben). Umkehrpotenziale der endogenen Ströme wurden am Anfang über kurze Spannungspulse abgeschätzt (0 mV, -40 mV, -80 mV). Die korrigierten ClC-7PM-Potenziale sind als Funktion der jeweiligen extrazellulären Ionenkonzentration (A unten, B unten) dargestellt. Kreuz, individuelle Messung (n=7 für jede [Cl-]a, n=6 für pHa 7,4 und 8,4, n=4 für pHa 6,4); Kreis, Mittelwert aus Einzelmessungen; Fehlerbalken, Standardabweichung; Linien, Vorhersagen für einen mCl-/H+-Austauscher mit m=1, 2, 3 und einen Cl--Kanal mit 1:0. Die 2:1-Stöchiometrie liegt den Messergebnissen am nächsten.

2. ERGEBNISSE

54

18B links). Aus dieser Position wurde auf Testspannungen von -100 mV bis +100 mV

in 20 mV Schritten umgeschaltet (Beispielaufnahme und Spannungsklemm-Protokoll

s. Abb. 18B links). Der Verlauf der Schwanzströme wurde an eine mono-exponentielle

Funktion angepasst und zum Zeitpunkt des Spannungssprunges extrapoliert, um die

jeweiligen Stromamplituden zu erfassen. Die Spannungsabhängigkeit dieses Stromes

durch den offenen Transporter ist in Abbildung 18B (rechts) dargestellt. Zum

Vergleich mit dieser Strom-Spannungs-Beziehung wurde die Spannungsabhängigkeit

des ClC-7PM-Stromes nach einer 2-sekündigen Stimulation gemäß dem

Spannungsklemm-Protokoll in Abbildung 13A gegenübergestellt (Abb. 18B rechts).

Die nahezu lineare Strom-Spannungs-Beziehung des offenen Transporters schließt

damit den Prozess der Ionentranslokation als Ursache für die starke Rektifizierung

von ClC-7 aus. Aufgrund des hohen Verwandtschaftsgrades könnte diese Aussage mit

hoher Wahrscheinlichkeit auf die restlichen intrazellulären Mitglieder der CLC-Familie

in Säugern ausgeweitet werden. Die Ionentranslokation durch den offenen CLC-

Transporter ist also wahrscheinlich direkt proportional zur Triebkraft.

Somit muss das Steuerungsverhalten der auswärts-gerichteten CLCs für die

Spannungsabhängigkeit verantwortlich sein. Symbolisiert wird das

Steuerungsverhalten durch die Offenwahrscheinlichkeit (po). Für die Messung einer

Offenwahrscheinlichkeit muss der Kanal bzw. Transporter einen stabilen bzw.

stationären Zustand, ein sogenanntes steady state, erreichen. Diese Situation ist im

ClC-7PM nicht gegeben, so waren wir gezwungen, bei der Bestimmung der

Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit auf eine ClC-7-Mutante

auszuweichen. ClC-7(R762Q) schien uns als geeignet, da diese Mutation die

Aktivierungsgeschwindigkeit drastisch erhöht und bereits nach ca. 400 ms den

stationären Zustand erreicht (Abb. 18C links). Ursprünglich wurde diese Mutation in

einem Osteopetrose-Patienten identifiziert (Kornak et al., 2001). ClC-7PM(R762Q)

wurde bei Testspannungen von -40 mV bis +140 mV (in 10 mV Schritten) in einen

steady state geführt und von dort auf eine konstante Spannung von +80 mV gebracht,

um die Schwanzströme zu messen (Beispielaufnahme und Spannungsklemm-

Protokoll s. Abb. 18C links). Diese wurden wieder an mono-exponentielle Funktionen

angepasst und zum Zeitpunkt des Spannungssprunges extrapoliert. Der zu diesem

Zeitpunkt gemessene Gesamtstrom ist direkt proportional zur

Offenwahrscheinlichkeit und spiegelt somit auch deren Spannungsabhängigkeit wider

(Kap. 1.2.1). Die in Abbildung 18C (rechts) dargestellte Spannungsabhängigkeit der

Offenwahrscheinlichkeit folgt einer Boltzmann-Verteilung. Über die Boltzmann-

Gleichung konnte V1/2 auf ca. 82 mV und die gating-Ladung auf ca. 1.32 bestimmt

werden. Natürlich sollte hier nochmals darauf aufmerksam gemacht werden, dass wir

für unsere Analyse eine Mutante herangezogen haben. Wir vermuten jedoch stark,

dass die ermittelten Werte auch dem Wildtyp-ClC-7 entsprechen würden, da sie sehr

gut mit den für ClC-4 bestimmten Werten übereinstimmen (Orhan et al., 2011).

2. ERGEBNISSE

55

Abbildung 18 Spannungsabhängigkeit von ClC-7. (A) Prozess der Aktivierung (links) ist ca. 10-fach langsamer als Prozess der Deaktivierung (rechts). Zeitkonstanten beider Prozesse sind Spannungs-abhängig (Mittelwerte aus n=17, Standardfehler als Fehlerbalken). (B) Links, Beispielaufnahme (mit Spannungsklemm-Protokoll) zur Bestimmung der Spannungsabhängigkeit der Ionentranslokation durch den offenen Transporter über tail-

current-Analyse. Rechts, dabei ermittelte Ströme (Mittelwert ± Standardfehler) sind nahezu direkt proportional zur Spannung (offener Transporter; n=8), im Vergleich dazu die Strom-Spannungs-Beziehung des Austauschers im pseudo-steady-state (Stromantwort auf Spannungsklemm-Protokoll wie in Abbildung 13A, gemessen am Ende des Aktivierungspulses; n=19), falls Fehlerbalken nicht sichtbar sind, ist der jeweilige Standardfehler kleiner als das Symbol. (C) Links, Beispielaufnahme (mit Spannungsklemm-Protokoll) zur Bestimmung der Spannungsabhängigkeit des Steuerungsverhaltens über tail-current-Analyse. Rechts, Boltzmann-Verteilung der scheinbaren Offenwahrscheinlichkeit in Abhängigkeit von der Spannung (Mittelwert ± Standardfehler; n=5). Es ergab sich ein V0,5 von ca. 82 mV und eine gating-Ladung von ca. 1,32. Alle Daten (A-C) sind aus patch-clamp-Experimenten an HeLa-Zellen unter Coexpression von Ostm1 entstanden.

2. ERGEBNISSE

56

2.5 Abhängigkeit von extrazellulären Anionen

ClC-7PM (coexprimiert mit seiner Hilfsuntereinheit) leitet die von uns in TEVC-

Experimenten getesteten extrazellulären Anionen mit folgender Präferenz: Cl- > Br- >

NO3- > I- (Abb. 19A). Beim Betrachten der Ergebnisse ist zu beachten, dass die

Ermittlung der Reihenfolge hier nicht über Umkehrpotenziale erfolgte und somit nicht

als Selektivität, sondern eher als eine zu Cl- relative Leitfähigkeit zu verstehen ist. Die

Präferenz von Cl- über Br- über I- stimmt genau mit den anderen intrazellulären

Säuger-CLCs überein (Steinmeyer et al., 1995; Friedrich et al., 1999; Li et al., 2000;

Neagoe et al., 2010), die geringere Leitfähigkeit für NO3- als für Cl- ist jedoch neu für

die CLC-Austauscher. Die anderen intrazellulären Säuger-CLCs werden durch NO3-

entkoppelt und zeigen auf Grund einer gestiegenen Anionen-Transportrate eine

höhere Leitfähigkeit für NO3- (Steinmeyer et al., 1995; Zdebik et al., 2008; Alekov &

Fahlke, 2009; Zifarelli & Pusch, 2009). Mit Hilfe der semi-quantitativen Fluorozyte-

Messungen konnten wir keine offensichtliche Entkopplung durch NO3- feststellen;

auch die anderen getesteten Anionen zeigten keine diesbezüglichen Auffälligkeiten

(Daten nicht gezeigt). Eine exakte Untersuchung einer möglichen Entkopplung durch

NO3- über die Bestimmung der Stöchiometrie mittels Umkehrpotenzial-Messungen in

patch-clamp-Experimenten blieb uns auf Grund der stark verminderten

Schwanzstrom-Amplituden verwehrt (Daten nicht gezeigt). Durch Ersetzen des für die

Cl--Selektivität verantwortlichen Serins zu Prolin (S202P in rClC-7) konnte das

Präferenzverhältnis von ClC-7PM zu NO3- über Cl- umgedreht werden (Abb. 19B). Dies

gelang auch zuvor mit anderen CLC-Transportern und ClC-0 (Bergsdorf et al., 2009;

Picollo et al., 2009; Zifarelli & Pusch, 2009; Neagoe et al., 2010).

Abbildung 19 Intra-anionische Präferenz von ClC-7. (A) Zu Cl- relative Leitfähigkeiten von gezeigten Anionen, ermittelt über Austausch von extrazellulärem Cl- gegen das jeweilige Anion während TEVC-Messungen von ClC-7PM/Ostm1- (weiss) bzw. ClC-7PM(S202P)/Ostm1-exprimierenden (grau) Oozyten. Es ergab sich folgende Präferenz: Cl- > Br- > NO3

- > I-. Dargestellt sind Mittelwerte (aus n ≥ 5 pro Bedingung) mit Standardfehlern von den jeweils auf Cl- normalisierten Stromamplituden bei +80 mV. Die Mutation S202P (grau) kehrt die Präferenz des Wildtyps von Cl- über NO3

- um. (B) Repräsentative Aufnahmen (mit Spannungsklemm-Protokoll) von ClC-7PM(S202P) unter Cl- (links) bzw. NO3

- (rechts).

2. ERGEBNISSE

57

Abschließend sollte angemerkt werden, dass Glukonat von den CLCs höchst

wahrscheinlich nicht transportiert wird. Für ClC-7PM wird dies in Abbildung 14B an den

Fluorozyte-Messungen mit „0 Cl-“ ersichtlich. Deshalb stellt die scheinbare

Leitfähigkeit für Glukonat in Abbildung 19A wahrscheinlich eher das Niveau des

Oozyten-Hintergrundstromes dar.

2.6 Abhängigkeit von extrazellulären Protonen

Auch die Abhängigkeit von extrazellulären Protonen wurde in TEVC-Experimenten an

ClC-7PM/Ostm1-exprimierenden X.laevis Oozyten untersucht. ClC-7 ändert seine

Transportaktivität wie die anderen intrazellulären Säuger-CLCs in Abhängigkeit von

der extrazellulären H+-Konzentration (Abb. 20). Für ClC-4 und ClC-5 wurde eine

Reduktion der Stromamplitude bei sauren pH-Werten beschrieben (Friedrich et al.,

1999; Picollo et al., 2010; Orhan et al., 2011). Ein basischer extrazellulärer pH-Wert

hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stärke der Transportaktivität (Picollo et al., 2010;

Orhan et al., 2011). Bei ClC-6 hingegen ist neben der Inhibierung des Stromes bei

sauren pH-Werten auch eine verstärkte Transportaktivität im basischen Milieu zu

verzeichnen (Neagoe et al., 2010). ClC-7 verhielt sich ähnlich: während eine niedrige

extrazelluläre H+-Konzentration die Cl-/H+-Austauschaktivität erhöhte, sank die

Transportaktivität mit zunehmender extrazellulärer H+-Konzentration (Abb. 20A, B).

Dieser Effekt könnte einfach einer Reduktion des elektrochemischen Gradienten für

einen gekoppelten Cl--Einstrom und H+-Ausstrom zu Grunde liegen. Unter diesen

Umständen sollte bei einem 2Cl-/1H+-Austauscher eine Spannungserhöhung um etwa

20 mV theoretisch die H+-Konzentrationserhöhung um eine pH-Einheit kompensieren

(Picollo et al., 2010). Das heißt, dass die Stromamplituden bei pH 8,5 und +40 mV

sowie bei pH 7,5 und +60 mV bzw. bei einem pH-Wert von 7,5 und +20 mV, bei pH 5,5

und +60 mV sowie bei pH 4,5 und +80 mV von einander nicht signifikant

unterschiedlich sein sollten. Wie in Abbildung 20C ersichtlich ist es beim Übergang

von pH 7,5 zu 8,5 bzw. von 7,5 zu 5,5 nicht der Fall. Dies würde dafür sprechen, dass

die Protonen zusätzlich zu ihrer Rolle als zu transportierendes Substrat eine

regulatorische Funktion am Protein erfüllen. Im sauren pH-Bereich wurde dieses

Phänomen bereits als Protonen-Block für ClC-5 beschrieben, momentan gilt das

gating-Glutamat als möglicher Kandidat für den verantwortlichen Protonen-Akzeptor

(Picollo et al., 2010). Für ClC-4 wird Gleiches vermutet (Orhan et al., 2011). So könnte

ein ähnlicher Mechanismus auch bei ClC-7 vorliegen. Dies bleibt in Folgestudien zu

klären. Was den Effekt im basischen pH-Bereich betrifft, zählt ebenfalls zu den noch

offenen Fragen. Interessanterweise ist die Stromamplitude zwischen pH 5,5 bei +60

2. ERGEBNISSE

58

mV und pH 4,5 bei +80 mV nicht signifikant voneinander unterschiedlich (Abb. 20C

rechts), dies konnte außerdem bei allen Testspannungen, bei denen ClC-7 aktiv ist,

beobachtet werden (Abb. 20B). So scheint dieser Effekt tatsächlich aus einer

Reduktion des elektrochemischen Gradienten zu resultieren. Man könnte mutmaßen,

dass ab einer bestimmten extrazellulären H+-Konzentration der Block bzw. das Binden

der H+ an das Protein saturiert und der zusätzliche inhibitorische Effekt lediglich durch

eine Reduktion der Triebkraft erfolgt. Zugegebenermaßen ist dies höchst spekulativ

und obliegt einer experimentellen Beweisführung. Außerdem setzt es voraus, dass ein

maximaler Protonen-Block keine vollständige Inhibierung der Transportaktivität mit

sich bringt.

Abbildung 20 Abhängigkeit von ClC-7 von extrazellulären Protonen. (A) Typische TEVC-Aufnahmen (mit Spannungsklemm-Protokoll) bei dem jeweils angegebenen extrazellulären pH-Wert (pHa) (B) Strom-Spannungs-Kurven aller Bedingungen normalisiert auf die Stromamplitude bei +80 mV und pHa=7,5 (Mittelwerte aus n ≥ 6 pro Bedingung, falls Fehlerbalken nicht sichtbar sind, ist der jeweilige Standardfehler kleiner als das Symbol). (C) Gegenüberstellung von Stromamplituden für angegebene Spannung und pHa-Wert (Auswahl aus B). Die Stromamplituden-Reduktion beruht nicht auf einer Reduktion des elektrochemischen Gradienten, ausgenommen vom Übergang von pHa 5,5 zu 4,5. (D) Aktivierungskinetik wird durch basischen extrazellulären pH beschleunigt und durch sauren verlangsamt (Mittelwerte aus n ≥ 6 pro Bedingung, Standardfehler sind kleiner als das Symbol, falls Fehlerbalken unsichtbar). (E) Zeitabhängigkeit der Deaktivierung wird kaum durch die extrazelluläre H+-Konzentration beeinflusst (Mittelwert ± Standardfehler, n ≥ 6 pro Bedingung).

2. ERGEBNISSE

59

Außerdem konnten wir eine Abhängigkeit der Kinetik vom extrazellulären pH-Wert

feststellen (Abb. 20A, D, E). Während im basischen pH-Bereich die Aktivierungskinetik

beschleunigt wird, wird sie im sauren verlangsamt (Abb. 20A, D). Das Letztere wurde

auch für ClC-4 beschrieben (Orhan et al., 2011). Zu beachten ist, dass die bei pH 5,5

und 4,5 ermittelten Zeitkonstanten sich nicht unterscheiden (Abb. 20D). Die

Deaktivierung wird überaschenderweise durch alle getesteten von pH 7,5

abweichenden pH-Werte zu einem ähnlichen Wert verlangsamt (Abb. 20E). Dies

erscheint contra-intuitiv und sollte mit Vorsicht betrachtet werden, da auch Oozyten-

endogene Ströme tail currents aufweisen und ein mögliches unvorteilhaftes

Signal/Hintergrund-Verhältnis die Analyse vor allem von kleinen tail currents

verfälschen könnte. In Abbildung 20D und E sind die aus der Stromantwort auf +80

mV ermittelten Zeitkonstanten der Aktivierung und Deaktivierung als Funktion des

pH-Wertes dargestellt. Somit wird also bei einem pH-Wert von 8,5 die Aktivierung

beschleunigt und die Deaktivierung verlangsamt, beides führt zu einer höheren

Stromamplitude im Vergleich zu pH 7,5 (Abb. 20B, D). Bei pH 5,5 und 4,5 steigt die

Zeitkonstante der Aktivierung um etwa 50% gegenüber pH 7,5 an, die

Deaktivierungszeitkonstante um ca. 20% (Abb. 20D, E). Folglich ist der Anteil der

verlangsamten Aktivierung groß genug, um die verlangsamte Deaktivierung zu

überlagern und zu reduzierten Stromamplituden zu führen (Abb. 20B).

2.7 ClC-7 ist moderat Temperatur-sensitiv

Die Untersuchung von Temperaturabhängigkeiten der Einzelkanalleitfähigkeit oder

des Schaltverhaltens kann Einblicke in die Thermodynamik dieser Prozesse gewähren.

Bei den meisten Ionenkanälen unterscheidet sich die Temperaturabhängigkeit der

Leitfähigkeit nicht großartig von der Temperaturabhängigkeit diffusions-limitierter

Prozesse mit Q10-Werten von ca. 1,2 bis 1,7 (DeCoursey & Cherny, 1998). Dagegen

kann das Schaltverhalten mit Q10-Werten von ca. 1,5 bis 40 eine viel stärkere

Temperaturabhängigkeit aufweisen (DeCoursey & Cherny, 1998). Das langsame gate

von ClC-0 mit einem Q10 von ungefähr 40 ist eines der Temperatur-sensitivsten

biologischen Prozesse, die man heutzutage kennt (Pusch et al., 1997). Diese starke

Temperaturabhängigkeit impliziert eine Konformationsänderung größeren Ausmaßes

während des Schaltens (Pusch et al., 1997).

Hier sollte nun die Temperaturabhängigkeit von ClC-7 untersucht werden, wobei

zwischen den Effekten auf die Kinetik des Steuerungsverhaltens und den Effekten auf

die Stromamplitude unterschieden werden sollte. Es wurden drei verschiedene

Temperaturen (21°C, 29°C, 37°C) an ClC-7PM/Ostm1-exprimierenden X.laevis Oozyten

2. ERGEBNISSE

60

getestet (Abb. 21A). Beim Erwärmen der Oozyten auf 37°C wurde zusätzlich zum ClC-

7-spezifischen Strom eine linear-aktivierende Stromkomponente ca. 300 ms nach

Beginn des Stimulationspulses sichtbar, die auch in uninjizierten Kontrolloozyten

beobachtet werden konnte. Auf Grund dieses Wärme-induzierten endogenen

Stromes wurden lediglich die ersten 250 ms der ClC-7-Stromantwort zur Analyse der

Aktivierungskinetik herangezogen, wodurch Abweichungen zu den in Abbildung 18A

und 20D gezeigten Zeitkonstanten zu erklären sind. Aus dem gleichen Grund wurde

auf die Auswertung der Deaktivierungskinetik bei 37°C völlig verzichtet.

Eine Temperaturerhöhung von 21°C auf 29°C beschleunigte die Aktivierung um das 2-

fache und eine Erhöhung auf 37°C sogar um fast das 6-fache (Abb. 21B links). Die

Berechnung der relativen Veränderung der Aktivierungskinetik bei einer

Temperaturerhöhung um 10°C mit Hilfe der van’t Hoff’schen Regel (Kap. 4.2.5.6)

ergab einen Q10-Wert von etwa 2,1 für den Vergleich von 21°C mit 29°C. Bei der

Änderung von 21°C auf 37°C wurde ein Q10-Wert von ca. 3,0 ermittelt. Beide Werte

weichen geringfügig voneinander ab. Hierbei soll dem ersten Wert mehr Vertrauen

geschenkt werden, da die Temperaturänderung von 16°C möglicherweise zu groß ist,

um die van’t Hoff’sche Regel zuverlässig anzuwenden. Auch die Deaktivierungskinetik

wurde durch die Temperaturerhöhung von 21°C auf 29°C beschleunigt, jedoch nur

geringfügig; die Zeitkonstante sank von ca. 90 ms auf ca. 70 ms herab (Abb. 21B

rechts). Dies ergab einen Q10-Wert von 1,4. Damit scheint die Kinetik des

Steuerungsverhaltens von ClC-7 moderat Temperatur-sensitiv zu sein. Die

Aktivierungskinetik ist mit ihrem größeren Q10-Wert stärker Temperatur-abhängig als

die Deaktivierungskinetik, was vermuten lässt, dass nicht der gleiche (reversible)

Schritt in beiden Prozessen Raten-limitierend ist und dass während der Aktivierung

möglicherweise größere Konformationsänderungen stattfinden als während der

Deaktivierung. Außerdem weist der Prozess der Aktivierung eine mehr als 2-fach

größere, nach Arrhenius berechnete Aktivierungsenergie (Kap. 4.2.5.6) auf als der

Prozess der Deaktivierung (Ea(AKT) = 13,5 kcal/mol; Ea(DEAKT) = 5,8 kcal/mol). Bei der

Aktivierung muss also eine höhere energetische Barriere überwunden werden, was

die vorherigen Vermutungen unterstützt. Generell liegt die Temperaturabhängigkeit

der Kinetik von ClC-7 im Bereich der meisten anderen publizierten Q10-Werte für

Transporter verschiedener Familien (DeCoursey & Cherny, 1998). Um ein paar

Beispiele für Mitglieder der CLC-Familie zu nennen, für ClC-1 wurden Q10-Werte von

ca. 3 (schnelles gate) bzw. 4 (langsames gate) beschrieben und für das schnelle gate

von ClC-0 ungefähr 2,2 (Pusch et al., 1997; Bennetts et al., 2001).

Auch die Stromamplitude wies eine Temperaturabhängigkeit auf. Sie nahm mit einer

Temperaturerhöhung zu, wofür ein Q10-Wert von ca. 1, 9 errechnet wurde (Abb. 21B).

Für ClC-1 wurde ein Q10-Wert von 1,6 publiziert (Bennetts et al., 2001). Da die

Berechnung des Q10-Wertes von ClC-7PM auf Stromamplituden aus einem nicht-

stationären Zustand beruhte, sollte die relative Veränderung der Stromamplitude in

Abhängigkeit von der Temperatur auch für die zeitunabhängige ClC-7-gating-

Glutamat-Mutante, ClC-7PM(E245A), bestimmt werden (Abb. 21D). Als weitere

Referenz neben ClC-1 sollte das näher verwandte ClC-5 dienen. Es ergab sich ein Q10

2. ERGEBNISSE

61

von etwa 1,6 für ClC-7PM(E245A) und von ca. 1,4 für ClC-5. Damit liegen all diese

Werte nah beieinander - im Bereich diffusions-limitierter Prozesse - und zeigen, dass

auch bei ClC-7 das Schaltverhalten stärker Temperatur-abhängig ist als die

Einzelkanalleitfähigkeit. Die Arrhenius-Aktivierungsenergie ist für die ClC-7-gating-

Glutamat-Mutante mit 8,4 kcal/mol etwas größer als für ClC-5 (5,8 kcal/mol). Wild

spekuliert, könnte dies darauf hinweisen, dass die Permeation durch ClC-7

möglicherweise stärker limitiert wäre als durch ClC-5, was zumindest geringfügig

unterschiedliche Transportvorgänge bei diesen eng verwandten Austauschern

suggerieren würde.

Abbildung 21 ClC-7 ist moderat Temperatur-abhängig. (A) Beispiele für TEVC-Aufnahmen (mit Spannungsklemm-Protokoll) von ClC-7PM/Ostm1-exprimierenden Oozyten unter der jeweils angegebenen Temperatur. (B) Temperaturerhöhung bewirkt eine Beschleunigung der Aktivierung (links) sowie der Deaktivierung (rechts); Mittelwerte von Zeitkonstanten der Stromantwort auf +80 mV, n ≥ 8 pro Bedingung, Fehlerbalken sind unsichtbar, falls Standardfehler kleiner sind als Symbole. (C) Auch die Stromamplitude wird erhöht (Mittelwerte aus n ≥ 8 pro Bedingung, normalisiert auf die Stromamplitude bei +80 mV und 21°C, Fehlerbalken wie bei B). (D) Stromamplitude der gating-Glutamat-Mutante nimmt durch Temperaturerhöhung ebenfalls zu.

29°C

21°C

29°C

21°C

29°C

21°C

2. ERGEBNISSE

62

2.8 ClC-7 ist nicht ATP-abhängig

Eine Modulation der Transportaktivität durch ATP würde eine Verbindung zwischen

der Ionentransportaktivität und dem metabolischen Status einer Zelle darstellen.

Einige CLCs sind aufgrund ihrer CBS-Domänen prinzipiell dazu befähigt Nukleotide zu

binden. Dies wurde schon für ClC-1, ClC-2, ClC-Ka, ClC-5 und atClC-a beschrieben (Kap.

1.3.5; Meyer et al., 2007; Bennetts et al., 2005; De Angeli et al., 2009; Wellhauser et

al., 2006; Zifarelli & Pusch, 2009b). Da ClC-7 CBS-Domänen besitzt, sollte dieser

Transporter auch auf eine mögliche Abhängigkeit von ATP getestet werden. Dafür

wurden patch-clamp-Experimente in der whole-cell-Konfiguration mit und ohne ATP

in der intrazellulären Lösung durchgeführt werden. Eine Beispielaufnahme für ClC-

7PM/Ostm1 ohne ATP ist in Abbildung 22A dargestellt. ClC-7 scheint für seine

Transportaktivität kein ATP zu benötigen – es konnte weder eine signifikant

veränderte Stromamplitude, noch Kinetik oder Spannungsabhängigkeit in

Abwesenheit von ATP festgestellt werden (Abb. 22).

links, Beispielaufnahmen (mit Spannungsklemm-Protokoll) bei entsprechender Temperatur. rechts, Strom-Spannungs-Kurven (Mittelwerte normalisiert wie bei C, Fehlerbalken wie bei C, n=6). (E) Temperaturabhängigkeit von ClC-5 zum Vergleich mit ClC-7. links, typische TEVC-Aufnahmen (mit Spannungsklemm-Protokoll). rechts, Strom-Spannungs-Kurven (wie bei C normalisierte Mittelwerte aus n ≥ 4 mit Fehlerbalken wie bei C).

Abbildung 22 ClC-7 ist nicht abhängig von ATP. (A) Repräsentative patch-clamp-Messung (mit Spannungsklemm-Protokoll) ohne intrazelluläres ATP an einer ClC-7PM und Ostm1-GFP coexprimierenden HeLa-Zelle unterscheidet sich nicht von den Messungen mit ATP (Abb. 13A links). (B) Stromdichte-Spannungs-Kurven zeigen keine Veränderungen der Stromamplituden in Abhängigkeit von ATP (Mittelwerte aus n ≥ 8 pro Bedingung, Standardfehler als Fehlerbalken).

2. ERGEBNISSE

63

2.9 ClC-7 weist einen aktivitätsbedingten Run-down-Effekt auf

Bei wiederholten TEVC-Messungen an der gleichen X.laevis Oozyte, die ClC-7PM und

Ostm1 co-exprimierte, konnte eine graduelle Abnahme der ClC-7PM-Stromamplitude

beobachtet werden. Die Experimente von Carmen F. Ludwig (AG Jentsch) zeigten,

dass der run-down-Effekt von ClC-7PM durch die eigene Transportaktivität verursacht

wird und somit wahrscheinlich auf eine Dissipation des elektrochemischen

Gradienten für einen Cl-/H+-Austausch zurückzuführen ist (Daten von Carmen F.

Ludwig nicht gezeigt). In Abbildung 23A ist die Reduktion der Stromamplitude von

ClC-7PM im Verlauf von vier nacheinander folgenden Aktivitätsphasen im 2-minütigen

Abstand beispielhaft dargestellt (Spannungsklemm-Protokoll s. Abb.13A rechts). Bei

der zweiten Aufnahme ist die ClC-7-Aktivität um ca. 20% reduziert, bei der dritten

sogar um etwa 30% (Abb. 23A). Einen ähnlichen Effekt konnten wir auch für ClC-5

feststellen (Abb. 23B), was noch nicht publiziert wurde. Interessanterweise fiel der

run-down-Effekt der gating-Glutamat-Mutante von ClC-7 geringer als beim Wildtyp-

Transporter aus (Abb. 23C). So könnte man spekulieren, dass der Aktivitätsverlust

nicht nur durch Zerstörung des elektrochemischen Gradienten erfolgt, sondern zum

geringen Anteil auch durch Inhibierung der eigenen Aktivität durch H+, die heraus

transportiert werden. Zugegebenermaßen ist dies sehr spekulativ.

Abbildung 23 ClC-7 weist einen Run-down-Effekt auf. Die kontinuierliche Abnahme der Stromamplituden mit zunehmender Anzahl von Aktivitätsphasen (Spannungsklemm-Protokoll-Durchläufen) wurde an ClC-7PM/Ostm1- (A), ClC-7PM(E245A)/Ostm1- (B) und ClC-5-exprimierenden (C) Oozyten mittels TEVC beurteilt (Spannungsklemm-Protokolle wie in Abbildung 21A, D, E). Übersichtshalber wurden Stromamplituden bei +80 mV normalisiert auf die jeweils erste Aktivitätsphase dargestellt (Mittelwert aus n ≥ 5 pro Bedingung, Standardfehler als Fehlerbalken).

3. DISKUSSION

65

3. DISKUSSION

Erstmals kann im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine biophysikalische

Grundcharakterisierung von ClC-7 präsentiert werden. Damit wären nun alle

intrazellulären Säuger-CLCs in ihren Grundzügen beschrieben.

Wie bereits in Transportstudien an über Zellfraktionierung aufgereinigten Lysosomen

vom Mindel- (Graves et al., 2008) und Jentsch-Labor (Weinert et al., 2010) gezeigt

und durch die Präsenz des Protonen-Glutamats angedeutet, ist ClC-7 tatsächlich ein

Cl-/H+-Austauscher. Der Nettotransport ist wie bei ClC-3 bis ClC-6 (Li et al., 2002;

Friedrich et al., 1999; Steinmeyer et al., 1995; Neagoe et al., 2010) stark auswärts

rektifizierend. Auch die gating- und Proton-Glutamat-Mutanten verhielten sich in

Analogie zu ClC-3 bis ClC-6 (Li et al., 2002; Friedrich et al., 1999; Picollo & Pusch, 2005;

Scheel et al., 2005; Zdebik et al., 2008; Neagoe et al., 2010): die Neutralisation des

gating-Glutamats eliminierte die Spannungs- und Zeitabhängigkeit des Antiporters

sowie den H+-Transport und resultierte in einer nahezu ohm‘schen Cl--Leitfähigkeit;

die Neutralisation des Protonen-Glutamats unterband sowohl den Cl-- als auch den

H+-Transport innerhalb der vorliegenden Messgenauigkeit vollständig. Diese

Beobachtungen sowie die Tatsache, dass ClC-7-induzierte Ströme in verschiedenen

Expressionssystemen (Säugerzellen und X.laevis Oozyten) reproduzierbar waren,

sprechen für die Vertrauenswürdigkeit der Identität dieser Ströme. Die zuvor

publizierten angeblich ClC-7-vermittelten Plasmamembran-Leitfähigkeiten (Diewald

et al., 2002; Kajiya et al., 2009; Ohgi et al., 2011) ähneln in keiner Weise den hier

gezeigten Aufnahmen und sind ohne Coexpression der Hilfsuntereinheit Ostm1

gemessen worden. Somit sind sie definitiv, wie bereits vermutet (Jentsch, 2008), auf

Artefakte zurückzuführen.

Zugegebenermaßen machten wir uns für die Charakterisierung von ClC-7 eine partiell

Sortierungs-defiziente Mutante zu Nutze (Stauber & Jentsch, 2010). Wir nehmen an,

dass die vier Punktmutationen keinen Einfluss auf die biophysikalischen

Eigenschaften des Transporters haben – ausschließen können wir es jedoch nicht. Es

gibt einige Argumente, die dafür sprechen: die betreffenden Aminosäuren liegen im

extremen N-Terminus (vor αA); dieser Teil ist kaum konserviert und wahrscheinlich

intrinsisch ungefaltet (Dutzler et al., 2002; Feng et al., 2010) und erscheint somit als

perfekte Plattform für Interaktionspartner (wie beispielsweise die Adaptorproteine).

Außerdem gibt es derzeit noch keine Berichte über einen potenziellen Beitrag des

extremen N-Terminus zur Transportaktivität von CLC-Transportern. Lediglich beim

CLC-Kanal ClC-2 ist es bekannt, dass ein Teil des N-Terminus in den Prozess des

gatings involviert ist (Gründer et al., 1992; Jordt & Jentsch, 1997). Jedoch ist der N-

Terminus von ClC-7 um einiges länger als von ClC-2, so dass die entsprechenden

3. DISKUSSION

66

Regionen nicht miteinander überlappen. Dennoch müsste man für eine vollkommene

Sicherheit beispielsweise patch-clamp-Experimente an ClC-7- bzw. ClC-7PM-

exprimierenden Lysosomen durchführen, was derzeit noch mit Problemen behaftet

ist.

3.1 Ostm1 – die essenzielle ββββ-Untereinheit von ClC-7

ClC-7-vermittelte Transportaktivität kommt nur in Anwesenheit von seiner

Hilfsuntereinheit Ostm1 zum Vorschein. Damit ist Ostm1 sowohl für die Stabilität

(Lange et al., 2006) als auch für die Aktivierung des Ionentransports seiner α-

Untereinheit verantwortlich. Dies steht in Analogie zu Barttin, einem ähnlich kleinen

Protein, welches die Hilfsuntereinheit der CLC-Kanäle ClC-Ka und ClC-Kb darstellt

(Estévez et al., 2001; Waldegger et al., 2002; Scholl et al., 2006; Rickheit et al., 2008;

Janssen et al., 2009). Unter den CLC-Transportern in Säugern ist es jedoch momentan

noch ein Einzelbeispiel.

Ostm1-KO-Mäuse weisen eine stark reduzierte Proteinmenge an ClC-7 auf – ca. 5%

des Wildtyps (Lange et al., 2006). Folglich wäre auch dieser geringe Anteil nicht mehr

funktionell.

Da wir Ströme von der Plasmamembran ableiten, können wir außerdem festhalten,

dass die proteolytische Spaltung des N-Terminus von Ostm1 entweder nicht im

Lysosomen erfolgt oder falls doch, dass sie für die Aktivierung von ClC-7 nicht

notwendig ist.

3.2 ClC-7 – ein Depolarisations-aktivierter 2Cl-/1H

+-Austauscher

mit langsamer Kinetik

Die Auswärtsrektifizierung von ClC-7 ist vergleichbar mit den anderen intrazellulären

Säuger-CLCs (Li et al., 2002; Friedrich et al., 1999; Steinmeyer et al., 1995; Neagoe et

al., 2010). Die Spannung für eine halbmaximale Aktivierung dieses Transporters

wurde auf ca. 82 mV bestimmt und stimmt damit mit der Spannungsabhängigkeit

beispielweise von ClC-4 gut überein – für ClC-4 wurde im entkoppelten Zustand ein

V0,5 von ca. 85 mV ermittelt (Orhan et al., 2011).

3. DISKUSSION

67

Wodurch ClC-7 sich von den anderen intrazellulären Säuger-CLCs abhebt, ist die

langsame Kinetik der Aktivierung und Deaktivierung. Die absoluten Werte der

Aktivierungszeitkonstante liegen im Sekundenbereich und sind somit vergleichbar mit

der Zeitabhängigkeit der „gemeinsamen“ gates von ClC-0 und ClC-2 (Richard & Miller,

1990; Zúñiga et al., 2004). Die Spannungsabhängigkeit der Aktivierungskinetik gleicht

jedoch eher der von ClC-4 im entkoppelten Zustand (Orhan et al., 2011). Dagegen ist

die Deaktivierungskinetik moderat Spannungs-abhängig. Aber sie ist ca. 10-fach

schneller als die Aktivierung, was vermuten lässt, dass nicht der gleiche Schritt Raten-

limitierend ist. Außerdem weist der Prozess der Aktivierung eine stärkere

Temperaturabhängigkeit (Q10 ≈ 2,1) auf als die Deaktivierung (Q10 ≈ 1,4) und somit

eine größere Aktivierungsenergie, die beim Öffnen aufgewendet werden muss.

Vermutlich findet während des Öffnungsprozesses eine größere

Konformationsänderung statt als beim Schließen. Generell liegt die

Temperaturabhängigkeit der Kinetik von ClC-7 im Bereich der meisten anderen

publizierten Q10-Werte für Transporter verschiedener Familien (DeCoursey & Cherny,

1998).

Interessant wäre es zu erfahren, ob eines der beiden für die CLCs bekannten gates

(„schnelles“ oder „gemeinsames“) bei einem der Prozesse (Aktivierung oder

Deaktivierung) dominiert. Bei ClC-0 liegen die Q10-Werte beider gates weit

auseinander (~2,2 für das „schnelle“ und ~40 für das „gemeinsame“; Pusch et al.,

1997). Bei ClC-1 und ClC-2 lassen sich die gates schwerer voneinander trennen

(Bennetts et al., 2001; Zúñiga et al., 2004). Zum Beispiel hat ClC-1 einen Q10-Wert von

ca. 3 für das „schnelle“ gate und von ca. 4 für das „langsame“ (Bennetts et al., 2001).

Damit können die Q10-Werte zur Beantwortung dieser Frage nicht dienen.

Die langsame Kinetik von ClC-7 bringt Vorteile mit sich: sie ermöglicht das Messen des

Cl-/H+-Austausches auch im negativen Spannungsbereich, was zuvor bei keinem

anderen intrazellulären Säuger-CLC realisiert werden konnte. Der Ionentransport

kann also prinzipiell in beide Richtungen erfolgen. Außerdem kann über die tail-

current-Analyse die Spannungsabhängigkeit der Ionentranslokation durch den

offenen Transporter untersucht werden. Überraschenderweise ergab sich eine

nahezu lineare Strom-Spannungs-Beziehung. Dies beweist, dass die starke

Rektifizierung von ClC-7 allein auf die Spannungsabhängigkeit des Steuerverhaltens

zurückzuführen ist. Aufgrund der sehr ähnlichen Rektifizierung und der gemeinsamen

strukturellen Basis lässt sich diese Beobachtung sehr wahrscheinlich auch auf die

anderen intrazellulären Vertreter der CLC-Familie in Säugern übertragen. Damit wäre

die für ClC-5 aufgestellte Hypothese, dass die starke Rektifizierung aus einem

Spannungs-getriebenen Transport von H+ zum gating Glutamat resultiert (Zdebik et

al., 2008), widerlegt – zumindest für ClC-7. Sie wurde außerdem auch schon vorher

selbst für ClC-5 stark angezweifelt (Picollo et al., 2010; Smith & Lippiat, 2010). In

unseren Experimenten ist die Abhängigkeit der Ionentranslokation durch den offenen

Transporter von der Spannung nahezu, jedoch nicht perfekt, linear. Dies könnte

möglicherweise auf geringfügige Unterschiede in Cl--und H+-Konzentrationen

3. DISKUSSION

68

zwischen der intra- und extrazellulären Lösung zurückzuführen sein. Dies muss in

weiteren Experimenten unter verschiedenen Konzentrationsbedingungen geklärt

werden. Wir postulieren dennoch, dass der Cl-/H+-Austausch an sich direkt

proportional zu seiner Triebkraft sein könnte und dass ClC-7 sich somit im Prinzip wie

ein gesteuerter Kanal verhalten würde, lediglich mit dem Unterschied einer nicht-

diffusiven Pore.

Für die Untersuchung der Spannungsabhängigkeit des Schaltverhaltens mussten wir

von einer Mutante Gebrauch nehmen, denn der Wildtyp, genauer gesagt ClC-7PM,

erreichte unter unseren experimentellen Bedingungen selbst nach einer 60-

sekündigen Aktivierung kein steady state. Möglicherweise könnte dies durch eine

Dissipation des eigenen Gradienten erklärt werden, worauf auch der beobachtete

run-down-Effekt hindeutet. Die Mutante R762Q befand sich dagegen schon nach ca.

400 ms im stationären Zustand. Die Aminosäure Arg762 liegt in der CBS2-Domäne. In

der CmClC-Struktur wäre die homologe Position auf der Oberfläche der CBS2-Domäne

angrenzend an die Transmembranregion lokalisiert – eine Position, die vermutlich Teil

des „gemeinsamen“ gates ist (Chen, 1998; Fong et al., 1998; Estévez et al., 2004;

Bykova et al., 2006; Feng et al., 2010). So wäre es vorstellbar, dass diese Mutation

sich über das „gemeinsame“ gate beschleunigend auf ClC-7 auswirkt.

Bei der Bestimmung der Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit von ClC-

7 (stellvertretend für das Schaltverhalten) wurde sich also dieser Mutante und wieder

einer tail-current-Analyse bedient. Die Spannungsabhängigkeit folgte genau einer

Boltzmann-Verteilung und zeigte, wie bereits oben erwähnt, ein mit anderen CLCs

vergleichbares V0,5 von ca. 82 mV. Desweiteren konnte eine gating Ladung von ca.

1,32 ermittelt werden. Diese ähnelt den bereits bekannten Werten für andere CLCs

(ClC-0: ca. 1 (Pusch et al., 1995); ClC-1: 0,9 (Pusch et al., 1994); ClC-2: ca. -1 (de

Santiago et al., 2005); ClC5: 1,3 (Smith & Lippiat, 2010)) und spricht für eine eher

schwache Spannungsabhängigkeit im Vergleich zu Mitgliedern der Spannungs-

abhängigen Kationen-Kanal-Superfamilie (z.B. Shaker-K+-Kanal: z ≈ 12 (Schoppa et al.,

1992)). Die Spannungsabhängigkeit von ClC-7 scheint also eine Protein-intrinsische

Eigenschaft darzustellen, d.h. das Protein müsste theoretisch während des Schaltens

Spannungs-induzierten Konformationsänderungen ausgesetzt sein und somit einen

sogenannten Spannungssensor aufweisen. Für ClC-5 wurden sogar gating Ströme

gemessen (Smith & Lippiat, 2010). Dabei konnte gezeigt werden, dass eine

Konformationsänderung als Antwort auf eine Spannungsänderung erfolgt und dass

diese durch Cl- moduliert werden kann (Smith & Lippiat, 2010). Die Bewegung von Cl-

trägt ca. 30% zur für ClC-5 bestimmten gating Ladung bei (Smith & Lippiat, 2010). Es

ist jedoch noch völlig unklar, ob die restliche gating Ladung auf eine Bewegung von

geladenen Aminosäuren, von Aminosäuren mit intrinsischen Dipolen oder sogar von

ganzen α-Helices mit ihren intrinsischen Dipolmomenten zurückzuführen ist. Die

wahrscheinlichste Erklärung für die Beobachtungen einer Modulation des gatings

durch Cl- wäre, dass Cl--Bindung an sich nicht Spannungs-abhängig ist (auch unsere

Ergebnisse zur Ionentranslokation durch den offenen Transporter unterstützen das),

3. DISKUSSION

69

dass aber das gebundene Ion bei Depolarisation eine strukturelle Änderung bewirkt,

die sich letztendlich auf den Ionentranslokationsweg auswirkt (Smith & Lippiat, 2010).

Ähnliches wurde bereits auch für das Spannungs-abhängige Schaltverhalten von ClC-0

postuliert (Pusch et al., 1995; Chen & Miller, 1996). Dennoch benötigt die Idee eines

Spannungssensors bei CLCs eine experimentelle Verifizierung. Bei ClC-4 konnten

beispielsweise keine gating Ströme gemessen werden (Orhan et al., 2011). Es wäre

interessant zu erfahren, ob ClC-7 welche aufweist. Am spannendsten ist natürlich die

Frage nach der Identität des Spannungssensors, falls dieser tatsächlich existiert. Das

Schaltverhalten spielt sich bei den CLCs über zwei verschiedene gates ab. Welches

von ihnen mehr zur Spannungsabhängigkeit von ClC-7 beiträgt bzw. überhaupt

Spannungs-abhängig ist, wäre eine weitere offene Frage, die man vielleicht mit

„Einzelkanal“-Aufnahmen klären könnte (vorausgesetzt die „Einzelkanal“-Leitfähigkeit

von ClC-7 ist groß genug). Außerdem ist die Spannungsabhängigkeit der

Aktivierungskinetik, wie oben erwähnt, scheinbar stärker ausgeprägt als die der

Deaktivierungskinetik. So stellt sich die Frage, ob es möglich ist, dass einer dieser

beiden Prozesse mehr zur Spannungssensitivität beiträgt?

Die Neutralisation des gating-Glutamats (Glu245 in Ratte ClC-7) ist momentan die

einzige unter den intrazellulären Säuger-CLCs bekannte Mutation, die die

Spannungsabhängigkeit der Transporter vollständig aufheben kann (Friedrich et al.,

1999; Li et al., 2002; Picollo & Pusch, 2005; Scheel et al., 2005; Neagoe et al., 2010).

Diese Aminosäure wird als das molekulare Korrelat des „schnellen“ gates betrachtet

(Dutzler et al., 2002, 2003; Feng et al., 2010). Die geringe Bewegung, die es nach der

Protonierung erfährt, könnte jedoch niemals eine gating Ladung von ca. 1 bewirken

und ist somit als alleiniger Spannungssensor ausgeschlossen.

Die Möglichkeit, den Cl-/H+-Austausch auch im negativen Spannungsbereich zu

messen, erlaubte es, die Umkehrpotenziale ClC-7-vermittelter Ströme zu bestimmen

und somit die Stöchiometrie der Cl-/H+-Kopplung zu berechnen. Unsere Ergebnisse

stimmen am besten mit den theoretischen Werten eines 2Cl-/1H+-

Kopplungsverhältnisses überein, wie es ursprünglich für EcClC-1 beschrieben wurde

(Accardi & Miller, 2004) und kürzlich in einem Modell des Transportmechanismus

erklärt werden konnte (Feng et al., 2010). Für die restlichen CLC-Transporter in

Säugern war die Anwendung dieser Methode aufgrund ihrer schnellen Kinetik nicht

anwendbar. Für ClC-5 wurde die Stöchiometrie mittlerweile mit einer neu

entwickelten Bild-gebenden Methode an X. laevis Oozyten ebenfalls auf 2:1 bestimmt

(Zifarelli & Pusch, 2009). Wahrscheinlich weisen alle CLC-Transporter dieses

Kopplungsverhältnis auf (Accardi & Picollo, 2010).

3. DISKUSSION

70

3.3 Modulation von ClC-7 durch extrazelluläre Anionen und Protonen

sowie durch intrazelluläres ATP

Für ClC-7 konnte eine intra-anionische Präferenz mit folgender Reihenfolge bestimmt

werden: Cl- > Br- > NO3- > I-. Mit der Ausnahme von NO3

- stimmt sie mit der von ClC-3

bis ClC-6 überein (Li et al., 2000; Friedrich et al., 1999; Steinmeyer et al., 1995;

Neagoe et al., 2010). NO3- entkoppelt den Anionen- vom H+-Transport bei diesen CLCs

und führt über eine gestiegene Anionen-Transportrate zu einer höheren Leitfähigkeit

für NO3- (Zdebik et al., 2008; Alekov & Fahlke, 2009; Zifarelli & Pusch, 2009). Leider

verwehrten die kleinen Schwanzströme unter NO3- die Untersuchung, ob es für ClC-7

vielleicht nicht zutrifft. Dies hätte auf geringfügige strukturelle Unterschiede in der

„Pore“ hingewiesen. Wie erwartet, ist auch bei ClC-7 das Sercen für die Präferenz von

Cl- über NO3- verantwortlich. Ebenfalls wie bei den anderen CLC-Transportern ist ein

H+-Transport in Abwesenheit von permeablen Anionen nicht möglich, der Transport

beider Ionen ist also aneinander gekoppelt (Accardi & Miller, 2004; Picollo & Pusch,

2005; Scheel et al., 2005).

Extrazelluläre H+ haben sowohl einen Effekt auf die Kinetik als auch auf die

Stromamplitude von ClC-7. Wie bereits für ClC-6 berichtet (Neagoe et al., 2010), sinkt

bei saurem pH die Transportaktivität, bei basischem nimmt sie zu. Bei ClC-4 und ClC-5

konnte im sauren Milieu ein ähnlicher Effekt beobachtet werden; im basischen

Bereich fehlte jedoch jegliche Art von Modulation (Friedrich et al., 1999; Picollo et al.,

2010; Orhan et al., 2011). Es konnte für ClC-7 gezeigt werden, dass im Bereich von pH

8,5 bis 5,5 der Effekt extrazellulärer H+ auf die Cl-/H+-Austauschaktivität nicht auf

einer veränderten Triebkraft für H+ basiert. Somit dienen H+ nicht nur als Substrat

sondern auch einer Modulation der Transporteraktivität. Diese Rolle der H+ wurde

bereits für den sauren pH-Bereich als Protonen-Block bei ClC-5 beschrieben (Picollo et

al., 2010). Ähnliches nimmt man auch für ClC-4 an (Orhan et al., 2011).

Interessanterweise spielt bei ClC-7 im stärker sauren pH-Bereich (pH 5,5 – 4,5), was

dem lysosomalen pH-Wert näher kommt, die Veränderung der Triebkraft die

tragende Rolle. Somit bleiben viele offene Fragen für Folgestudien. Für vollkommene

Sicherheit über die beobachteten Effekte wäre jedoch zuvor eine Wiederholung

dieser Versuche in patch-clamp-Experimenten ratsam, da vor allem im sauren pH-

Bereich – also bei kleinen ClC-7 vermittelten Stromamplituden – bei TEVC an X.laevis

Oozyten ein unvorteilhaftes Signal/Hintergrund-Verhältnis entstehen könnte, welches

die Analyse verfälschen würde.

Für eine modulatorische Rolle extrazellulärer H+ sprechen auch die Auswirkungen auf

die Zeitabhängigkeit des Schaltverhaltens: im sauren Bereich wird die Aktivierung des

Transporters langsamer, im basischen schneller; jedoch gibt es keinen Unterschied

zwischen pH 5,5 und 4,5. Überraschenderweise zeigt sich kaum ein Effekt auf die

3. DISKUSSION

71

Deaktivierung. Auch diese Daten sollten aus den oben benannten Gründen in patch-

clamp-Experimenten verifiziert werden.

Für ClC-4 konnte außerdem eine durch extrazelluläre H+ bedingte Veränderung der

Spannungsabhängigkeit vermerkt werden (Orhan et al., 2011). Momentan kann für

ClC-7 darüber keinerlei Aussagen getroffen werden, da steady-state-Messungen an

ClC-7 (genauer ClC-7PM) zum gegebenen Zeitpunkt nicht möglich sind. Um diese Frage

zu klären, wären Messungen an ClC-7PM(R762Q) oder einer anderen Mutante

denkbar, die keinen Einfluss auf die Spannungsabhängigkeit hat und lediglich die

Kinetik bis zum steady state beschleunigt.

Die Modulation der Transportaktivität durch intrazelluläres ATP scheint bei ClC-7 im

Gegensatz zu ClC-1, ClC-2, ClC-Ka, ClC-5 und atClC-a (Bennetts et al., 2005; Wellhauser

et al., 2006; Meyer et al., 2007; De Angeli et al., 2009; Zifarelli & Pusch, 2009b) nicht

statt zu finden. Wir konnten weder Veränderungen der Stromamplitude, noch der

Kinetik oder der Spannungsabhängigkeit in Abwesenheit von ATP feststellen. Subtile

Modifikationen innerhalb unserer Standardabweichungen können wir jedoch nicht

ausschließen.

3.4 Wie sieht ClC-7-vermittelte Transportaktivität in Lysosomen aus?

Diese Frage kann natürlich bis zum Zeitpunkt, an dem elektrophysiologische

Messungen an Lysosomen gemacht werden, nicht mit Sicherheit beantwortet

werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ClC-7 nicht in seiner nativen Umgebung

charakterisiert, so können Abweichungen von den hier ermittelten Ergebnissen nicht

ausgeschlossen werden. Es sind mehrere Faktoren vorstellbar, die zu einer

Modulation der Transportaktivität unvorhersagbaren Ausmaßes führen könnten.

Unterschiede in der Lipidzusammensetzung der lysosomalen Membran im Vergleich

zur Plasmamembran könnten dabei eine Rolle spielen (van Meer et al., 2008).

Außerdem könnte ClC-7 auch durch eine der zahlreichen Substanzen, die sich im

Lysosomen während der katabolischen Prozesse ansammeln, beeinflusst werden.

Und falls die proteolytische Prozessierung von Ostm1 im Lysosomen stattfindet, wäre

eine Modifizierung der ClC-7-Transportaktivität möglich. In Anbetracht dieser

Möglichkeiten könnte beispielsweise auch die Tatsache, dass ClC-7 unter den von uns

getesteten Bedingungen niemals ein steady state erreichte, in Lysosomen anders

sein.

3. DISKUSSION

72

Es gibt mindestens zwei kontra-intuitive Aspekte, die sogar generell einem

Vorhandensein der Transportaktivität in seiner nativen Umgebung widersprechen

würden. Im Lysosomen liegt auf Grund der H+-ATPase-Aktivität ein intravesikulär-

positives, also ein intrazytosolisch-negatives Potenzial vor (Van Dyke, 1993; Koivusalo

et al., 2011) - ClC-7 wäre bei diesen Spannungen nicht aktiv. Der lysosomale pH-Wert

beträgt im Gleichgewichtszustand ca. 4,6 - bei diesen H+-Konzentrationen wird ClC-7

jedoch inhibiert. Diese Eigenschaften sind auch durch die endosomalen ClC-4 und ClC-

5 vertreten und verwundern das Feld seit Langem (Jentsch, 2008). Kürzlich konnte

jedoch mit Hilfe eines mathematischen Modells demonstriert werden, dass die

elektrogene Aktivität eines Cl-/H+-Austauschers an sich theoretisch ein intravesikulär-

negatives Potenzial gewährleisten könnte und somit selbst seine Aktivität

unterstützen würde (Weinert et al., 2010). Für den Block durch Protonen existiert

momentan noch keine plausible Erklärung.

Unsere Daten zeigen, dass die Spannungsabhängigkeit dem Schaltverhalten, also

einer Protein-intrinsischen Eigenschaft, zu Grunde liegt. Die Tatsache, dass die

Rektifizierung allen intrazellulären CLC-Transportern in Säugern gemein ist und dass

das dafür verantwortliche Schaltverhalten Protein-intrinsisch, also sozusagen

„genetisch kodiert“ ist, spricht für eine physiologische Relevanz der Rektifizierung.

Eine weitere überraschende Entdeckung war sicherlich die starke Zeitabhängigkeit

der Transportaktivität – ein Merkmal, welches ClC-7 von den anderen intrazellulären

Säuger-CLCs abgrenzt. Ob auch dies für die lysosomale Physiologie von Bedeutung ist,

stellt eine weitere offene Frage dar. Fakt ist, dass fast alle bis heute bekannten

Osteopetrose verursachenden Mutationen im Menschen Punktmutationen darstellen

und ca. die Hälfte davon im C-Terminus liegt – eine Region, die in das „gemeinsame“

gating involviert sein soll (Chen, 1998; Fong et al., 1998; Estévez et al., 2004; Bykova

et al., 2006; Feng et al., 2010). Einige der Mutationen liegen sogar an der Grenzfläche

zwischen den CBS-Domänen und dem Transmembranteil (Feng et al., 2010), die hier

(auf Grund ihrer schnelleren Kinetik) verwendete R762Q-Mutante wäre eine davon.

Bei ClC-5, einem schnellen Cl-/H+-Austauscher, findet man unter den die Dent’sche

Erkrankung verursachenden Mutationen dagegen nur eine einzige Punktmutation im

C-Terminus; der Rest sind Trunkationen (Plans et al., 2009). Es müssten weitere

humane ClC-7-Mutationen elektrophysiologisch untersucht werden, um zu wissen, ob

auch diese eine schnellere Kinetik entwickeln. Und auch dann wäre die physiologische

Relevanz der langsamen Kinetik sehr schwer zu erklären.

Für ein weitreichendes Verständnis der Bedeutung von ClC-7 für die lysosomale

Physiologie sind Struktur-Funktions-Studien in heterologen Expressionssystemen zwar

nützlich, jedoch elektrophysiologische Messungen direkt an Lysosomen sehr

wünschenswert.

3. DISKUSSION

73

3.5 Ausblick

Es gibt viele interessante Fragestellungen für Struktur-Funktions-Studien an ClC-7, die

in Zukunft detailliert untersucht werden könnten. Am spannendsten ist wohl die

Suche nach einem möglichen Spannungssensor, was für das gesamte CLC-Feld von

großer Bedeutung wäre. Es liegt nahe, neben den in der Diskussion bereits erwähnten

Experimenten, auch die Abhängigkeit des Schaltverhaltens von intra- und

extrazellulären Anionen sowie Protonen zu ergründen, um die Funktionsweise von

ClC-7 tiefgründiger zu verstehen. Das Gleiche gilt auch für den Prozess der

Ionentranslokation durch den offenen Transporter. Die dabei beobachteten Effekte

könnten dann, falls möglich, über Rausch-Analyse sogar auf Einzelkanalebene erklärt

werden. Außerdem könnte auch die Interaktion zwischen ClC-7 und Ostm1 näher

betrachtet werden, wobei möglicherweise sogar die genaue Interaktionsstelle an

beiden Proteinen identifiziert werden könnte. Auch die Frage nach der Rolle der N-

Glykanhülle von Ostm1 für ClC-7 könnte geklärt werden.

Bei all diesen Folgestudien würden sich außerdem weitere Gemeinsamkeiten und

Unterschiede zu den anderen CLCs heraus kristallisieren. Dies würde einerseits zum

Verständnis der allgemeinen Funktionsweise der Säuger-CLC-Antiporter beitragen.

Andererseits könnten neue Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie auf einer

strukturellen Basis zwei thermodynamisch unterschiedliche Ionentranslokations-

Mechanismen existieren können und durch welche Determinanten diese im

Allgemeinen charakterisiert sind.

Des Weiteren ist der durch die PM-Mutante geschaffene Zugang zu ClC-7 über die

Standardmethoden der Elektrophysiologie sowie Struktur-Funktions-Studien an

diesem Protein auch für die pharmazeutische Industrie von Interesse. Osteoporose,

eine häufige Erkrankung post-menopausaler Frauen ausgezeichnet durch einen

Knochendichteschwund, steht in ihrem Krankheitsbild im Gegensatz zur

Osteopetrose, einer Knochenverdichtung verursacht unter anderem durch fehlende

ClC-7-Aktivität. So könnte die Hemmung von ClC-7 in Osteoklasten zu einer

Verbesserung der klinischen Symptomatik verhelfen (Kornak et al., 2001; Schaller et

al., 2005).

4. MATERIALIEN & METHODEN

75


4.1 Materialien

4.1.1 CHEMIKALIEN, ENZYME, ANTIKÖRPER

Soweit nicht anders angegeben, wurden Standardchemikalien in der Qualität „p.a.“

bzw. „reinst“ der folgenden Firmen verwendet: VWR, Roche, Fluka, Merck, Roth,

Serva, Gibco und Sigma. Zellkulturmedien, Trypsin sowie Antibiotika wurden von PAN

Biotech GmbH bezogen, Restriktionsenzyme von Fermentas und Antikörper von

Roche und Jackson ImmunoResearch Laboratories.

4.1.2 LÖSUNGEN

Für alle Lösungen wurde deionisiertes Wasser (ddH2O, MembranPure) verwendet.

Falls nicht anders angegeben, wurde der pH-Wert mittels NaOH oder HCl eingestellt.

Bei erwünschter Sterilisierung wurden die Lösungen 20 min bei 121°C/2x105Pa

autoklaviert. Für elektrophysiologische Experimente wurden alle Lösungen über eine

PES-Membran (0,22 µm, TRR) steril filtriert. Die Osmolarität aller bei der

Elektrophysiologie verwendeten Lösungen wurde mit dem Gefrierpunkt-Osmometer

OSMOMAT 030 (Gonotec) bestimmt und falls notwendig mit Saccharose eingestellt.

Die Osmolarität der TEVC-Lösungen betrug ca. 200 mOsmol/l, der intrazellulären

Lösungen für patch-clamp-Experimente ca. 295-300 mOsmol/l und der extrazellulären

Lösungen für patch-clamp-Experimente ca. 305-310 mOsmol/l. Alle in dieser Arbeit

verwendeten Lösungen sind in der folgenden Tabelle dargestellt.


76

Tabelle 2 Bei der vorliegenden Arbeit verwendeten Lösungen.

Name Zusammensetzung

Blockierlösung 1% (w/v) BSA in ND96-Haltelösung

DNA-Ladepuffer (6x) 15% (w/v) Ficoll, 0,25% (w/v) Orange G

DEPC-Wasser 900 μl Diethylpyrocarbonat in 450 ml H2O

Einfriermedium für Kulturzellen 10% DMSO im jeweiligen Zellkulturmedium

Extrazelluläre Lösung

139 mM Cl-, pH 7,4

130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM

Glukose, 20 mM HEPES pH 7,4

Extrazelluläre Lösung 39 mM Cl- 100 mM Na-Glukonat, 30 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,

1 mM CaCl2, 10 mM Glukose, 20 mM HEPES pH 7,4

Extrazelluläre Lösung 19 mM Cl- 120 mM Na-Glukonat, 10 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,

1 mM CaCl2, 10 mM Glukose, 20 mM HEPES pH 7,4

Extrazelluläre Lösung pH 6,4 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM

Glukose, 20 mM MES pH 6,4

Extrazelluläre Lösung pH 8,4 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM

Glukose, 20 mM Tris pH 8,4 (mit Glukonsäure)

Intrazelluläre Lösung 110 mM CsCl, 10 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2, 1 mM EGTA, 2 mM

MgATP, 20 mM HEPES pH 7,2

Intrazelluläre Lösung 0 ATP 110 mM CsCl, 10 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2, 1 mM EGTA, 2 mM

MgCl2, 20 mM HEPES pH 7,2

Kollagenase A Lösung 2 mg/ml Kollagenase A in OR2-Lösung

LB-Agarplatten 1 l LB-Medium, 15 g Agar

LB-Medium 0,5% (w/v) NaCl, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 0,1% (w/v) Glukose,

pH 7

ND96-Haltung 96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM

HEPES pH 7,5, 50 mg/l Gentamyzin

ND96 Cl-, pH 7,5 (Messung) 96 mM NaCl, 2 mM K-Glukonat, 1,8 mM Ca-Glukonat, 1 mM

Mg-Glukonat, 5 mM HEPES pH 7,5

ND96 I- 96 mM NaI, 2 mM K-Glukonat, 1,8 mM Ca-Glukonat, 1 mM


ND96 Br- 96 mM NaBr, 2 mM K-Glukonat, 1,8 mM Ca-Glukonat, 1 mM


ND96 NO3- 96 mM NaNO3, 2 mM K-Glukonat, 1,8 mM Ca-Glukonat, 1 mM

Mg-Glukonat, 5 mM HEPES pH 7,5 (mit HNO3)

ND96 Glukonat (0 Cl-) 96 mM NaBr, 2 mM K-Glukonat, 1,8 mM Ca-Glukonat, 1 mM

Mg-Glukonat, 5 mM HEPES pH 7,5 (mit Glukonsäure)

ND96 pH 4,5 96 mM NaCl, 2 mM K-Glukonat, 1,8 mM Ca-Glukonat, 1 mM

Mg-Glukonat, 10 mM Phosphat-Puffer pH 4,5


Mg-Glukonat, 5 mM MES pH 5,5


Mg-Glukonat, 5 mM Tris pH 8,5

OR2-Lösung 82,5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 7,5


77

Name Zusammensetzung

SOC-Medium 20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 20 mM Glucose, 2,5

mM KCl, 10 mM MgCl2 in 1 l H20, pH 7

TAE-Puffer (50x) 200 mM Tris-Acetat, 10mM EDTA, pH 7,4

Zellkulturmedium für HeLa RPMI mit 5% (v/v) FCS, 1% (v/v) Penicillin-Streptomyzin

Zellkulturmedium für tsA201 DMEM mit 5% (v/v) FCS, 1% (v/v) Penicillin-Streptomyzin

4.1.3 VEKTOREN UND VERWENDETE KONSTRUKTE

Alle in Tabelle 3 aufgelisteten Konstrukte, die nicht bereits aus früheren Arbeiten

vorhanden waren, sondern für die vorliegende Arbeit neu hergestellt werden

mussten, wurden von Tobias Stauber (AG Jentsch) konstruiert. Als DNA-Rückgrat

dienten folgende Vektoren:

- pcDNA3 bzw. pcDNA3.1(+) (Vektor von Invitrogen zur Expression in Säugerzellen;

CMV- und T7-Promotor, BGH-Polyadenylierungssignal und Transkriptions-

Terminations-Sequenz zur Erhöhung der mRNA-Stabilität, Ampicillin- und

Neomyzin-Resistenz, SV40-Replikationsursprung)

- pEGFPN3 (Vektor von Clontech zur C-terminalen Markierung von Proteinen

mit EGFP (enhanced green fluorescent protein) und deren Expression in

Säugerzellen; CMV-Promotor, Kanamyzin-Resistenz, SV40-Replikations-Ursprung)

- pTLN (Vektor für cRNA-Synthese und Expression in Xenopus laevis Oozyten;

Abkömmling des Vektors pSP64T (Krieg & Melton, 1984), SP6-Promotor, 5´- und

3´-untranslatierte Region (UTR) des β-Globin-Gens aus Xenopus laevis zur

Expressionssteigerung (Lorenz et al., 1996), Polyadenylierungs-Sequenz und

Linearisierungsschnittstellen nach der 3‘-UTR (Lorenz et al., 1996))

Tabelle 3 Bei der vorliegenden Arbeit verwendete DNA-Konstrukte.

Name Vektor Protein-

Spezies Mutationen Referenz

rClC-7 pcDNA3

und pTLN

R.norvegicus - Kornak et al., 2001

Leisle et al., 2011

rClC-7PM

pcDNA3

und pTLN

R.norvegicus L23A, L24A, L36A,

L37A

Stauber & Jentsch, 2010,

Leisle et al., 2011

rClC-7PM

S202P pTLN R.norvegicus L23A, L24A, L36A,

L37A, S202P

Leisle et al., 2011

rClC-7PM

E245A pTLN R.norvegicus L23A, L24A, L36A,

L37A, E245A

Leisle et al., 2011

rClC-7PM

E312A pTLN R.norvegicus L23A, L24A, L36A,

L37A, E312A

Leisle et al., 2011


78

Name Vektor Protein-

Spezies Mutationen Referenz

hClC-7-exHA pTLN H.sapiens HA-tag (YPYDVPDYA)

zw. E168 u. K169

Leisle et al., 2011

hClC-7PM

-exHA pTLN H.sapiens L23A, L24A, L68A,

L69A, HA-tag

(YPYDVPDYA) zw.

E168 u. K169

Leisle et al., 2011

hClC-7PM

R762Q

pcDNA3.1(+) H.sapiens L23A, L24A, L68A,

L69A, R762Q

Leisle et al., 2011

mOstm1 pEGFP N3

und pTLN

M.musculus EGFP entfernt aus

pEGFP N3

Lange et al., 2006

Leisle et al., 2011

mOstm1-GFP pEGFP N3 M.musculus Ostm1-GFP-Linker:

VDGTAGPGSIAT

Stauber & Jentsch, 2010

hClC-5 pTLN H.sapiens - Lloyd et al., 1996

4.1.4 ZELLEN

4.1.4.1 Bakterienzellen

Zur Amplifikation von DNA im prokaryotischen System wurde der folgende Abkömmling des Escherichia coli Sicherheitsstamms K12 verwendet: XL-1 Blue (endA1, hsdR17 (rK-, mK+), supE44, recA1, gyrA46, thi-1, relA1, lac-, F proAB, lac1q, lacZMDΔ15, tetr).

4.1.4.2 Säuger-Kulturzellen

Für patch-clamp-Experimente an überexprimiertem ClC-7 bzw. ClC-7-Mutanten

wurden folgende Säugerzelllinien verwendet:

- tsA201 (Derivat der HEK293-Zelllinie, welches ein Temperatur-sensitives SV40-T-

Antigen stabil exprimiert; Sigma-Aldrich)

- HeLa (humane, epitheliale Cervix-Karzinom-Zelllinie abstammend von Henrietta

Lacks (1951); horizontaler Gentransfer des humanen Papillomavirus 18 in die

Cervix-Epithelzellen von H. Lacks bewirkte Genomveränderungen, die zur

Immortalisierung der Zellen führten; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

und Zellkulturen)


79

4.1.4.3 Xenopus laevis Oozyten

Für Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Experimente an überexprimiertem ClC-7 bzw.

ClC-7-Mutanten wurden Oozyten des Entwicklungsstadiums V und VI von 2 Arten von

Xenopus laevis (südafrikanischer Krallenfrosch) verwendet: pigmentierte und Albino-

Oozyten (NASCO).

4.1.5 SOFTWARE

Für die elektronische Datenverarbeitung und Datenanalyse wurden folgende

Programme herangezogen: pClamp 9.2 (Axon Instruments), Patchmaster (HEKA),

Excel (Microsoft), Origin (Origin Labs), IGORPro 4.0 (WaveMetrics), Lasergene

(DNASTAR). Datenbankrecherchen erfolgten am NCBI (National Center for

Biotechnology Information). PyMOL (DeLano Scientific LLC) wurde zum Anschauen

von Proteinstrukturen und für das Verfassen der Abbildungen 4B-D und 5A

verwendet.

4.2 Methoden

4.2.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN

4.2.1.1 Herstellung elektro-kompetenter Bakterien

Zur Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen wurden ausschließlich autoklavierte Gegenstände und Lösungen verwendet. Eine Übernachtkultur des jeweiligen Bakterienstammes in LB-Medium wurde 1:60 in frisches LB-Medium überimpft und bei 37°C und 220-250 rpm inkubiert. Sobald die Kultur eine bei 600 nm gemessenen optische Dichte (OD600) von 0,5-0,6 (log-Wachstumsphase) erreicht hatte, wurden die Zellen durch Zentrifugation (Beckmann-Zentrifuge, JA-10-Rotor, 20 min, 4200 rpm, 4°C) sedimentiert. Das Zellpellet wurde zweimal mit sterilem, deionisiertem Wasser und zweimal mit einer 10%-igen Glyzerollösung gewaschen, bevor es in 4 Volumen dieser Lösung aufgenommen wurde. Die Zellsuspension wurde in 50μl-Aliquots in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -80°C gelagert.


80

4.2.1.2 Transformation von Bakterien mittels Elektroporation

Zur Transformation der Bakterien (XL1 Blue) wurden diese mit maximal 1 µg des

gewünschten Plamids vermischt und folglich mittels des GenePulser (Bio-Rad) unter

den folgenden Einstellungen elektroporiert: 400 Ω, 2,5 kV, 25 µF, 7,5 ms. Nach der

Elektroporation wurden die Zellen in 0,8 ml SOC-Medium aufgenommen, 30 min bei

37°C inkubiert und auf LB-Agarplatten (mit entsprechendem Antibiotikum)

ausgestrichen.

4.2.1.3 Kultivierung und Lagerung transformierter Bakterien

Nach einer Über-Nacht-Inkubation der transformierten Bakterien (auf LB-Agarplatten)

bei 37°C wurden resistente Kolonien mittels steriler Zahnstocher oder Pipettenspitzen

von den Platten in jeweils 3 ml (Minikultur) oder 50 ml (Midikultur) LB-Medium (mit

entsprechendem Antibiotikum) überführt. Für eine Vermehrung der auserwählten

Klone wurden die Bakteriensuspensionen unter Luftzufuhr bei 37°C und 220-250 rpm

über Nacht geschüttelt und danach zur DNA-Präparation verwendet. Zur dauerhaften

Lagerung transformierter Bakterien wurden 800 µl Übernachtkultur mit 200 µl

Glycerin vermischt, schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt. Auch auf Agarplatten

konnten die Bakterien mehrere Wochen bei 4°C gelagert werden.

4.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN

4.2.2.1 Isolation von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien

Für die Isolation von Plasmid-DNA aus bakteriellen Minikulturen (Kap. 4.2.1.3) wurde

das E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit 1 (Peqlab Biotechnologie GmbH) verwendet. Dieses

Kit kombiniert die Methoden der alkalischen Lyse (Birnboim & Doly, 1979) mit der

selektiven und reversiblen Bindung der DNA an eine Silikamembran. Die

Durchführung erfolgte gemäß den Herstellerangaben. Die Ausbeute dieser Minipreps

betrug 10-20µg.

Die Isolation von Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien im Midi-Maßstab

erfolgte mit dem PureLink (Invitrogen) basierend auf dem gleichen Prinzip ebenfalls

nach Angaben des Herstellers. Die Ausbeute betrug 100-200 µg.


81

4.2.2.2 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA

Für eine saubere cRNA-Synthese mussten die pTLN-Konstrukte nach der 3‘-UTR

mittels Restriktionsenzyme linearisiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte

stets MluI (Fermentas) verwendet werden. Dabei wird die Plasmid-DNA mit einem

eineinhalb-fachen Enzymüberschuß der für die DNA-Menge berechneten

Enzymeinheiten 1-16 h verdaut. Die Reaktionsbedingungen wurden entsprechend

den Empfehlungen der Enzymhersteller gewählt. Die Restriktionen wurden durch

thermische Inaktivierung (75°C, 10 min) des Restriktionsenzyms gestoppt.

4.2.2.3 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren

Zur Analyse von DNA- bzw. RNA-Präparationen, DNA-Restriktionen und zur Isolierung

von DNA-Fragmenten wurde DNA bzw. RNA in horizontalen Agarosegelen

elektrophoretisch aufgetrennt (5-15 V/cm). Dazu wurde Agarose in 1xTAE gelöst und

mit Ethidiumbromid (0,5 μg/ml Endkonzentration), welches der Visualisierung der

Nukleinsäuren diente, versetzt. Die Konzentration der Agarose im Gel (typischerweise

1% (w/v)) hing von der Größe der zu trennenden Nukleinsäure-Fragmente ab. Die

DNA-Proben wurden mit einem selbst angesetzten DNA-Ladepuffer und die RNA-

Proben mit einem RNA-Ladepuffer (Ambion) vermischt. Als Laufpuffer diente 1xTAE

und als Größenvergleich ein 1 kb-DNA-Marker von Invitrogen.

Die aufgetrennten DNA- bzw. RNA-Fragmente wurden auf einem UV-Transilluminator

bei 312 nm über das in die Nukleinsäuren interkalierte Ethidiumbromid visualisiert.

Mit Hilfe eines Digital-Video-Systems wurden davon Bilder aufgenommen und auf

Thermopapier ausgedruckt.

4.2.2.4 Isolierung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen

Falls die visualisierten Nukleinsäure-Fragmente aus dem Agarosegel isoliert werden

sollten, wurden diese aus dem Gel ausgeschnitten und mittels des High Pure PCR

Product Purification Kit (Roche) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Bei dieser

Prozedur wurde durch chaotrope Substanzen die Agarose bei 55°C aufgelöst und die

DNA über Anionen-Austauscher-Säulen aufgereinigt.

4.2.2.5 In vitro Transkription

Zur Injektion von Xenopus laevis Oozyten wurde cDNA in komplementäre cRNA

umgeschrieben. Standardmäßig befanden sich die kodierenden Sequenzen im

Expressionsvektor pTLN, welcher zunächst mit MluI 3`-wärts der Polyadenylierungs-


82

Sequenz linearisiert wurde (Kap. 4.2.2.2). Dafür wurden 5-10 µg DNA eingesetzt. Die

Vollständigkeit der Linearisierung wurde durch Agarosegelelektrophorese überprüft.

Die linearisierte DNA wurde mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Roche)

aufgereinigt und in 30 μl DEPC-Wasser aufgenommen. Die RNA-Synthese erfolgte mit

dem mMESSAGEmMACHINE SP6 Kit (Ambion) gemäß den Herstellerangaben unter

Einsatz von 1 µg template-DNA. Die RNA-Konzentration wurde photometrisch

bestimmt (Kap. 4.2.2.6) und die Integrität der RNA mittels Agarosegelelektrophorese

überprüft (Kap. 4.2.2.3).

4.2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren erfolgte photometrisch mit Hilfe

eines Spektrophotometers NanoDrop ND-1000 (PEQLAB GmbH). Dabei entspricht

eine Absorption (A) von 1 bei 260 nm 50 μg/ml doppelsträngiger DNA bzw. 40 μg/ml

RNA. Als Indikator für die Reinheit der Nukleinsäure-Präparation wurde der Quotient

aus A(260nm)/A(280nm) herangezogen, wobei dieser bei einer Protein-freien

Nukleinsäure-Lösung ca. 1,8 betragen sollte.

4.2.3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN

4.2.3.1 Kultur von HeLa- und tsA201-Zellen

Alle Zelllinien wurden in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre unter 5% CO2 bei 37°C

im Inkubator (Heraeus) gehalten. Medien und Lösungen wurden vor Benutzung auf

37°C erwärmt. Die tsA201-Zellen wurden in DMEM-Medium (PAN Biotech GmbH) mit

5% FCS (PAN Biotech GmbH) und 1% Penicillin-Streptomyzin-Mix (PAN Biotech GmbH)

kultiviert, die HeLa-Zellen in RPMI-Medium (PAN Biotech GmbH) mit gleichen

Konzentrationen von FCS und Penicillin-Streptomyzin-Mix. Alle verwendeten

Werkzeuge und Lösungen waren steril.

4.2.3.2 Trypsinisieren von Kulturzellen

Da beide Zelllinien adhärente Zellen darstellen, müssen sie trypsinisiert werden, falls

ein Wechsel des Kulturgefäßes oder eine Veränderung der Zelldichte erwünscht ist.

Dafür wurden der Zellrasen mindestens zweimal mit Ca2+-freiem PBS gespült, um

inhibierende Einflüsse von Serumbestandteilen auf die Trypsinaktivität zu verhindern

und die Ca2+-abhängigen Adhärenzkontakte zu schwächen. Nach dem Absaugen des


83

PBS wurden die Zellen für ca. 3 min mit Trypsin/EDTA (0,05%; PAN Biotech GmbH) bei

37°C inkubiert. Nach mikroskopischer Erfolgskontrolle der Zellablösung wurde die

Trypsin-Reaktion durch Zugabe des entsprechenden Serum-haltigen Mediums

gestoppt (mindestens 1:10 Verdünnung des Trypsins). Die Zellen wurden durch

mehrfaches Auf- und Abpipettieren weiter vereinzelt und in der gewünschten Dichte

neu ausgesät. Für patch-clamp-Experimente wurden die Zellen auf Glas-Deckgläschen

in einer Dichte, die kaum die Entwicklung von Zell-Zell-Kontakten zuließ, überführt.

Nach ca. 1 h hatten die Zellen sich gesetzt und konnten für die elektrophysiologischen

Messungen herangezogen werden.

4.2.3.3 Einfrieren und Auftauen von Kulturzellen

Für eine langfristige Aufbewahrung von Zellen mussten diese eingefroren werden.

Dafür wurden die Zellen trypsinisiert (Kap. 4.2.3.2), in Medium aufgenommen und

sedimentiert (3 min, 200 x g). Nach Absaugen des Überstandes wurden sie in 1 ml

Einfriermedium aufgenommen und in Einfrierröhrchen überführt. Danach werden sie

langsam bei -80°C eingefroren und am folgenden Tag zur Lagerung in flüssigen

Stickstoff überführt.

Zur Revitalisierung wurden die Zellen im Wasserbad bei 37°C schnell aufgetaut. Die

Zellsuspension wurde in 5 ml Kulturmedium überführt und sedimentiert (3 min, 200 x

g). Das Medium wurde abgesaugt, das Zellpellet in Medium resuspendiert und in eine

Zellkulturschale überführt.

4.2.3.4 Transiente Transfektion von Kulturzellen

Für die heterologe Expression einzelner oder mehrerer Gene in Säugetierzellen

wurden diese transient transfiziert. Als Transfektionsreagenz wurde FuGENE (Roche,

Basel), eine Lipidmischung unbekannter Rezeptur, verwendet. Die Transfektion

erfolgte gemäß den Herstellerangaben mit 50-80% konfluenten Zellen und einem

Verhältnis von Transfektionsreagenz-Volumen zu DNA-Masse von 3:1. Soweit nicht

anders angegeben wurde ClC-7 (in pcDNA3 bzw. pcDNA3.1(+)) stets mit Ostm1 (in

pEGFP N3 ohne GFP) co-transfiziert. Damit transfizierte Zellen identifiziert werden

konnten, wurde der Transfektionsmischung GFP (in pEGFP N3) beigemengt. Um die

Wahrscheinlichkeit, dass alle drei Plasmide sich in der selben transfizierten Zelle

befinden, wurde folgendes Mischungsverhältnis der DNA-Konstrukte angewandt: 7

(ClC-7) : 2 (Ostm1) : 1 (GFP). Für elektrophysiologische Messungen der ClC-7 Mutante

R762Q wurde mit Ostm1-GFP (in pEGFP) in einem Verhältnis von 4:1 co-transfiziert.

Bei den Untersuchungen, ob ClC-7 auch ohne Ostm1 eine Transportaktivität aufweist,

wurde ClC-7 (in pcDNA3) mit GPF (in pEGFP N3) co-transfiziert (4:1). Als Kontrolle

dienten ClC-7 und Ostm1-GFP (in pEGFP N3) co-transfizierte Zellen (4:1). Für alle


84

patch-clamp-Experimente wurden Zellen erst mindestens 36 h nach der transienten

Transfektion verwendet.

4.2.3.5 Präparation von Xenopus laevis Oozyten

Weibliche Krallenfrösche der Spezies Xenopus laevis wurden für 15 min in 0,1%-iger,

wässriger Tricainlösung (Sigma) anästhesiert. Danach wurde eine gewünschte Menge

an Ovar operativ entnommen und während der weiteren Versorgung des Frosches in

Ca2+-freier OR2-Lösung gelagert. Zur Entfernung des Bindegewebes, welches die

Oozyten im Ovar zusammen hält, sowie der Follikularmembran wurden die Oozyten

mit Kollagenase A (2 mg/ml, Sigma) in Ca2+-freier OR2-Lösung inkubiert

(Horizontalschüttler, RT, mindestens 1 h). Zwischendurch wurde die Lösung mehrmals

gewechselt und dabei der Status des Verdaus kontrolliert. Bei einer ausreichenden

Vereinzelung der Oozyten wurden sie mehrmals mit Ca2+-freier OR2-Lösung

gewaschen und in die ND96-Haltelösung zum Selektieren überführt. Bei der optischen

Selektion wurden Oozyten der Stadien V und VI ausgewählt und auf Eis

zwischengelagert. Im gleichen Medium wurden die selektierten Oozyten bis zur

Injektion der cRNA (mehrere Stunden bis über Nacht) bei 17°Caufgehoben.

4.2.3.6 Mikroinjektion und Haltung von Xenopus laevis Oozyten

Injektionspipetten wurden aus Glaskapillaren (Bestellnumer 3-000-203-G/X,

Drummond) mit einem horizontalen Pipettenziehgerät Typ L9P (Sutter Instruments)

hergestellt. Diese wurden mit Silikonöl DC 200 (Sigma) gefüllt und in einen Mikro-

Injektor Nanoliter 2000 (Drummond) eingespannt. Von der hergestellten cRNA-

Lösung (Kap. 4.2.2.5) wurde 2-3 μl aufgenommen und jeweils 46 ng Gesamt-cRNA pro

Oozyte injiziert. ClC-7- bzw. ClC-7-Mutanten-cRNA und Ostm1-cRNA wurden dabei 1:1

gemischt, so dass also 23 ng von jedem Konstrukt in jede Oozyte injiziert wurden. Für

eine ausreichende Proteinexpression wurden die Oozyten nach der Injektion drei

Tage bei 17°C in ND96-Haltelösung gelagert. Dabei wurde jeden Tag die Haltelösung

ausgewechselt sowie tote Oozyten aussortiert.

4.2.3.7 Bestimmung der Expression von Plasmamembranproteinen

in X.laevis Oozyten

Zur Bestimmung der Oberflächenexpression von ClC-7 bzw. ClC-7PM wurden humane

Konstrukte verwendet und ein extrazelluläres HA-Epitop in die Proteine eingeführt

(Kap. 4.1.3). So konnten die an der Zelloberfläche exprimierten Proteine mit

Antikörpern gegen das Epitop markiert und über eine enzymatische Reaktion unter


85

Lumineszenz-Freisetzung detektiert werden. Die bei dieser Reaktion freigesetzte

Lichtmenge ist direkt proportional zur Anzahl der Oberflächen-exprimierten Proteine.

Für diesen Oberflächenexpressionstest wurden injizierte Oozyten nach 3-tägiger

Inkubation benutzt. Alle Schritte wurden dabei, falls nicht anders angegeben, auf Eis

durchgeführt. Nach einem 30-minütigen Blockieren (1% BSA, ND96-Haltelösung) der

ausgesuchten Oozyten, wurden sie mit dem anti-HA-Antikörper (1:500, Klon rat3F10,

Roche) für 1 h bei 4°C inkubiert, ca. vier Mal mit der Blockierlösung gewaschen und

für weitere 30 min mit dem zweiten Antikörper (anti-rat HRP-gekoppelt, 1:1000,

Jackson ImmunoResearch Laboratories) bei 4°C inkubiert. Danach wurden die

Oozyten wieder ca. sechs Mal mit der Blockierlösung und zwei Mal mit der ND96-

Haltelösung gewaschen und anschießend in die Chemilumineszenz-Lösung überführt

(Power Signal ELISA Kit, Pierce). Die Oozyten wurden einzeln im Luminometer TD-

20/20 (Turner Designs) gemessen. Alle Experimente wurden an mindestens drei

unabhängigen Oozyten-Präparationen durchgeführt, wobei die Gesamtzahl der

ausgewerteten Oozyten in der Abbildungsbeschriftung angegeben wird.

4.2.4 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE METHODEN

4.2.4.1 Zwei-Elektroden-Spannungsklemme

(two electrode voltage clamp, TEVC)

Der Stromfluss durch die in der Oozyten-Plasmamembran exprimierten Ionen-

leitenden Proteine kann in Abhängigkeit vom Membranpotenzial mittels der Zwei-

Elektroden-Spannungsklemme gemessen werden. Diese Technik geht auf Arbeiten

von Cole und Curtis zurück und wurde in der vorliegenden Arbeit modifiziert nach

Stühmer (Stühmer, 1992) durchgeführt.

Es werden zwei fein ausgezogene Messelektroden aus Glas in die Oozyte

eingestochen – eine Spannungs- und eine Stromelektrode. Mit der

Spannungselektrode misst man die Potenzialdifferenz zwischen dem Oozyteninneren

und der Badlösung, wobei das Potenzial der Badlösung definitionsgemäß ein

Potenzial von 0 V besitzt. Über die Stromelektrode kann Ladung in die Oozyte injiziert

werden, so dass der Oozyte ein vom Ruhezustand abweichendes Membranpotenzial

aufgezwungen werden kann. Ein Rückkopplungsverstärker vergleicht ständig das „Ist-

Potenzial“ mit dem vom Experimentator vorgegebenen „Soll-Potenzial“ (Kommando-

Puls) und korrigiert entsprechend über die Stromelektrode. Zu einem gegebenen

Zeitpunkt entspricht der gemessene Strom dem Gesamtfluss an geladenen Teilchen

durch alle Ionenkanäle und etwaige andere elektrogene Transporter oder Lecks in der

Oozytenmembran sowie dem kapazitativen Strom. Bei starker Expression des zu

untersuchenden Ionen-leitenden Membranproteins und Wahl geeigneter


86

Versuchsbedingungen dominiert der Strom durch dieses Membranportein. Eine

Computersteuerung lässt es zu, bestimmte Abfolgen von „Soll-Potenzialen“

einzustellen, was im Folgenden als Spannungsklemm-Protokoll bezeichnet wird.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Elektroden aus Borosilikatglaskapillaren

(Bestellnummer 1403005; Hilgenberg) mit einem horizontalen Pipettenziehgerät Typ

L9P (Sutter Instruments) hergestellt. Beim Aufbau der Versuchsapparatur wurden

diese mit 3 M KCl gefüllt und in die Elektrodenhalter eingespannt, so dass Kontakt mit

den chlorodierten Silberdrähten jeder Elektrode hergestellt wurde. Die

Elektrodenhalter waren auf Mikromanipulatoren befestigt und wurden unter

optischer Kontrolle durch ein Binokularmikroskop (Zeiss) bewegt. Die zu messende

Oozyte wurde in die Badlösung (ND96-Messlösung) eingetaucht. Die Badlösung war

über Agarbrücken (3 M KCl, 1% Agarose) mit den Badelektroden, die sich in 3 M KCl

befanden, verbunden. Diese räumliche Trennung der Badelektroden vom eigentlichen

Bad sollte Messartefakte minimieren. Bevor unter optischer Kontrolle mit der

Spannungs- und Strom-Elektrode in die Oozyte eingestochen wurde, wurden ihre

Elektrodenpotenziale mit Hilfe eines TurboTEC-Verstärkers (NPI Instruments)

gegeneinander abgeglichen und der Pipettenwiderstand überprüft (Sollwert: 0,5-3

MΩ). Danach wurde gewartet bis das Ruhemembranpotenzial sich stabilisiert hat, es

wurde protokolliert und in den Spannungsklemm-Modus geschaltet. Falls der

Leckstrom sich im zulässigen Bereich befand (maximal 0,03 µA bei einer Spannung,

bei der der Transporter nicht aktiv ist), wurde das gewünschte Spannungsklemm-

Protokoll gestartet. Das beim jeweiligen Experiment verwendete Spannungsklemm-

Protokoll wird stets in den entsprechenden Abbildungen gezeigt. Die gemessenen

Ströme wurden über einen TurboTEC-Verstärker (NPI Instruments) und das Digidata-

1320-Interface (Molecular Devices) an einen IBM-kompatiblen Pentium-PC geleitet.

Die Daten-Akquisition und deren Auswertung erfolgte mit der pCLAMP 9.2 Software

(Axon Instruments). Mit der gleichen Software wurden die Spannungsklemm-

Protokolle erzeugt und gesteuert.

Die Charakterisierung von ClC-7PM bzw. ClC-7PM-Mutanten wurde an mindestens drei

unabhängigen Oozyten-Präparationen durchgeführt. Die Gesamtzahl der für das

jeweilige Experiment ausgewerteten Oozyten wird in den jeweiligen

Abbildungsbeschriftungen angegeben. Mit Ausnahme der Experimente zur

Temperaturabhängigkeit erfolgten alle Messungen bei Raumtemperatur. Falls

dieselbe Oozyte in mehreren Lösungen gemessen werden sollte, wurde die Oozyte

mit jeder Lösung mindestens 1 min perfundiert, bevor eine neue Messung gestartet

wurde. Auf Grund des beobachteten run-down-Effekts wurde bei der Bestimmung der

intra-anionischen Präferenz sowie der Abhängigkeit der Gesamtstromamplitude von

der extrazellulären H+-Konzentration jede Oozyte folgender Perfusionsreihenfolge

ausgesetzt: ND96-Messlösung, zu untersuchende Lösung, ND96-Messlösung. So

konnte der gemessene Effekt der zu untersuchenden Lösung auf die ND96-

Messlösung vor und nach der jeweiligen Aufnahme normalisiert werden. In den

finalen Graphen wurde der Mittelwert aus beiden normalisierten Effekten dargestellt.

Bei der Bestimmung der Temperaturabhängigkeit von ClC-7PM, ClC-7PM(E245A) und


87

ClC-5 wurden die das jeweilige Protein exprimierenden Oozyten zunächst mit

raumtemperieter (21°C) ND96-Messlösung perfundiert und anschließend mit der

über einen automatischen Durchlauferhitzer Typ TC-344 (Warner Instruments) auf

29°C bzw. 37°C erwärmten ND96-Messlösung.

4.2.4.2 Fluorozyte – Fluoreszenz-basierte Messung von intrazellulären

pH-Wert-Änderungen in X.laevis Oozyten

Die Fluorozyte wurde zum ersten Mal von Zdebik et al., 2008 beschrieben. Stark

vereinfacht gesagt, ist es ein Fluoreszenzsensor, der in das Oozytenbad eingebaut und

mit der TEVC-Apparatur kombiniert wurde, was eine gleichzeitige Aufnahme des

Gesamtstromes sowie einer intrazellulären Fluoreszenzänderung in der gemessenen

Oozyte ermöglicht. Die Apparatur wurde auf der Basis der pH-sensitiven Erregung (bei

488 nm) von BCECF (Invitrogen) entwickelt. BCECF ist ein fluoreszierender pH-

Indikator. Wird dieser vor den Messungen in die Oozyten injiziert (jeweils 23 nl einer

gesättigten, wässrigen Lösung der freien Säure von BCECF), so kann über die

Detektion der intrazellulären pH-Wert-Änderungen in der Nähe der Plasmamembran

der H+-Transport isoliert vom Gesamtstrom betrachtet werden. Dafür wurde die

BCECF-injizierte Oozyte über ein Loch (d = 0,8 mm) platziert, was die Fläche der

Emissionsdetektion festlegte. Während des gesamten Experiments wurde sowohl die

gesamte Oozyte als auch die Membranfläche über dem Loch stetig mit der

Messlösung perfundiert. Die detektierte Emission wurde gefiltert (Bandpassfilter 512-

565 nm), über eine Photodiode zu Strom umgewandelt, über das Digidata-1320-

Interface (Molecular Devices) digitalisiert und zur pCLAMP-9.2-Software geleitet. Dort

wurde das Signal zusätzlich bei 1 Hz Bessel-gefiltert und gespeichert. Die Steuerung

und Kopplung der Fluoreszenzmessungen an das Spannungsklemm-Protokoll erfolgte

ebenfalls über diese Software. Um die Fluoreszenzdetektion nicht zu beeinträchtigen,

wurden bei diesen Versuchen Albino-Oozyten verwendet, und zwar von mindestens

drei unabhängigen Oozyten-Präparationen.

Bei den hier beschriebenen Experimenten wurde folgendes Spannungsklemm-

Protokoll verwendet: zunächst wurde die Oozyte für mehrere Sekunden auf -30 mV,

eine Spannung, bei der ClC-7 nicht aktiv ist, gehalten, um die Stabilität des BCECF-

Signals zu überprüfen. Danach folgte eine 10s-lange Depolarisation auf +80 mV. Das

dadurch aktivierte ClC-7 bewirkte einen Auswärtstransport von H+ und somit eine

Alkalinisierung auf der intrazellulären Seite der Plasmamembran, was die Emission

von BCECF erhöhte. So wird der Anstieg der Fluoreszenz zum Maß für die H+-

Transportrate. Da die nicht-ratiometrischen Fluoreszenz-Messungen keine

Quantifizierung erlauben, ist ein direkter Vergleich der Transportraten nur innerhalb

derselben Oozyte möglich. Gestoppt wurde die ClC-7-Aktivität durch einen

Spannungssprung auf -80 mV für 3 s, gefolgt von mehreren Sekunden bei -30 mV. Für

die Darstellungen der H+-Transport-Messungen in Abbildung 14 und 15B wurde die


88

gemessene Fluoreszenz jeweils auf das Fluoreszenz-Signal zu Anfang der jeweiligen

Aufnahme normalisiert.

4.2.4.3 patch-clamp-Technik

Eine weitere Methode der Elektrophysiologie, mit der man Strom durch Kanäle bzw.

elektrogene Transporter in Abhängigkeit der Spannung, an Säugetierzellen messen

kann ist die patch-clamp-Technik. Hierbei stehen folgende Konfigurationen zur

Auswahl: cell-attached, whole-cell oder excised-patch (Hille, 2001). In der

vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich in der whole-cell-Konfiguration gemessen,

wobei die Gesamtheit aller Leitfähigkeiten der Plasmamembran zum abgeleiteten

Strom beiträgt. Im Gegensatz zu TEVC wird hierbei nur eine Elektrode sowohl zur

Potenzialmessung als auch zur Strominjektion benutzt. Dies ermöglicht ein

optimierter Differenzialverstärker (Hodgkin et al., 1952).

Die zu messenden Säugetierzellen wurden auf einem Glas-Deckgläschen in ein Bad,

welches mit gewünschter extrazellulärer Messlösung gefüllt war, eingebracht. Das

Bad war auf einem inversen Mikroskop (Axiovert 200, Zeiss) befestigt, wodurch die zu

messenden Zellen und die Pipettenbewegungen optisch kontrolliert wurden. Aus

Borosilikatglaskapillaren (Bestellnummer 1403203, Hilgenberg) wurden mit Hilfe

eines horizontalen Pipettenziehgeräts Typ L9P (Sutter Instruments) Elektroden

gezogen und mittels eines Microforge (List Medical) unter einem inversen Mikroskop

(Zeiss) poliert. Folglich wurden die Elektroden mit der intrazellulären Lösung gefüllt

und an den Elektrodenhalter, der für die Herstellung eines elektrischen Kontakts

einen chloridierten Silberdraht besaß, befestigt. Der Elektrodenhalter stand in

Verbindung mit einem Vorverstärker, der das Signal zum Hauptverstärker EPC-10

(HEKA) weiterleitete. Dieser besitzt einen eingebauten Digitalisierer und leitet somit

das Signal weiter zum Computer. Mit der darauf gespeicherten Software Patchmaster

(HEKA) wurden sowohl die Spannungsklemm-Protokolle generiert und gesteuert als

auch die Messdaten akquiriert. In Vorbereitung auf die Messungen wurde die

Elektrode in die Badlösung eingetaucht, wobei ständiger positiver Druck von ca. 2 cm

H2O (Drucksystem MPCU-3, Lorenz) an die Elektrode angelegt wurde. Das Potenzial

der Badlösung wurde über die Badelektrode gemessen, die in 3 M KCl eingetaucht

und über eine Agarbrücke (3 M KCl, 1% Agarose) mit der Badlösung elektrisch

verbunden war. So konnten die zwischen der Badlösung und der Elektrodenlösung

(intrazelluläre Lösung) bestehenden Potenzialdifferenzen ausgeglichen werden. Der

Elektrodenwiderstand wurde über kurze 5mV-Pulse bestimmt (hier: 3-6 MΩ).

Daraufhin wurde die Elektrode mittels des Mikromanipulators Model MW0-3

(Narishige) unter optischer Kontrolle zur ausgewählten Zelle bewegt bis sie auf die

Plasmamembran aufgesetzt wurde. Nun wurde ein starker negativer Druck an die

Elektrode angelegt, um die maximale Abdichtung zwischen Membran und Elektrode,

den sogenannten Giga-Seal (Widerstand im GΩ-Bereich), zu erreichen (cell-attached).


89

Für den Übergang in die whole-cell-Konfiguration wurden über ein an das

Drucksystem angeschlossene Mundstück starke Saugstöße durch die Elektrode

ausgeübt, so dass ein Loch in die Membran gerissen werden konnte. Nun konnte das

Zytoplasma durch die intrazelluläre Lösung in der Elektrode ausgetauscht werden.

Dafür wurde mindestens 1 min Zeit gelassen. Alle Messungen fanden bei

Raumtemperatur und kontinuierlicher Perfusion statt. Die jeweils verwendeten

Spannungsklemm-Protokolle sind den entsprechenden Abbildungen zu entnehmen.

Die Messdaten wurden je nach Anforderung mit IGORPro 4.0 (WaveMetrics), Origin

7.5 (Origin Labs) und Excel 2010 (Microsoft) ausgewertet (Details s. Kap. 4.2.5).

4.2.5 AUSWERTUNG ELEKTROPHYSIOLOGISCHER DATEN

4.2.5.1 Ermittlung von Strom-Spannungs-Beziehungen

Bei den TEVC-Experimenten wurde die Gesamtstromamplitude 1,95 s nach Beginn

des Test-Pulses (Spannungssprünge zwischen -80 und +80 mV) gegen die

entsprechende Spannung aufgetragen. Für ClC-7PM sowie ClC-7PM-Mutanten, die in

dieser Zeit kein steady state erreicht hatten, wurden also Stromwerte aus einem

nicht-stationärem Zustand verwendet. Für die finalen Graphen, wie sie in den

Abbildungen dargestellt sind, wurden der Mittelwert aus allen gemessenen Oozyten

sowie der Standardfehler gebildet.

Bei den patch-clamp-Experimenten wurden die Strom-Spannungs-Beziehungen auf

die gleiche Art ermittelt – nur mit der Ausnahme, dass die Stromwerte nicht als

absolute Gesamtstromamplituden, sondern als Stromdichte (also normalisiert auf die

jeweils gemessene Zellkapazität) dargestellt wurden.

Für die in Abbildung 18B gezeigte Strom-Spannungs-Beziehung von ClC-7PM im

Pseudo-Gleichgewichtszustand wurden die Stromwerte nicht auf die Zellkapazität,

sondern auf die gemessene Maximalstromamplitude (Stromamplitude bei +100 mV)

der jeweiligen Zelle normalisiert, um die Rektifizierung zu verdeutlichen.

Die Ermittlung der Strom-Spannungs-Beziehung mit Hilfe der tail-current-Analyse ist

unter Kapitel 4.2.5.4 nachzulesen.

4.2.5.2 Quantifizierung der Kinetik

Für die Quantifizierung der Kinetik wurden die gesamten Phasen der Aktivierung bzw.

Deaktivierung der ClC-7PM-Aktivität an eine mono-exponentielle Funktion der

folgenden Form angepasst und somit die Zeitkonstanten des jeweiligen Prozesses

bestimmt:


90

I(t) = A * et/τ + C

wobei I(t) den Strom in Abhängigkeit der Zeit darstellt, A die fraktionelle Amplitude

der Zeit-abhängigen Komponente, t die Zeit, τ die Zeitkonstante der Zeit-abhängigen

Komponente und C die Zeit-unabhängige fraktionelle Amplitude. Beim fitten wurde

ausreichend Abstand zu den kapazitativen Transienten genommen.

Bei der Untersuchung der Spannungsabhängigkeit der Kinetik wurden die ermittelten

Zeitkonstanten gegen die entsprechende Spannung aufgetragen (Abb. 18A). Bei der

Ermittlung der Abhängigkeit der Kinetik von der extrazellulären H+-Konzentration

wurden die für +80 mV ermittelten Zeitkonstanten dem jeweils untersuchten pH-

Wert gegenübergestellt (Abb. 20D, E).

Bei der Bestimmung des Einflusses der Temperatur auf die Kinetik wurden lediglich

die ersten 250 ms der Aktivierung an die oben beschriebene mono-exponentielle

Funktion angepasst, da danach bei 37°C ein endogener Strom unbekannter Herkunft

aktiviert wurde. Deshalb wurde auch auf die Auswertung der Deaktivierungskinetik

bei 37°C gänzlich verzichtet. Zur Bestimmung der Zeitkonstanten der Deaktivierung

bei 21°C und 29°C wurde wieder der gesamte Verlauf dieser Phase herangezogen.

4.2.5.3 Berechnung der Stöchiometrie

Die Berechnung der Stöchiometrie des Cl-/H+-Austauschers ClC-7 erfolgte über

Bestimmung von Umkehrpotenzialen bei verschiedenen Cl-- und H+-Gradienten (Abb.

17). Dafür wurde ein Spannungsklemm-Protokoll entwickelt, bei dem zunächst durch

kurze (50 ms) Pulse (-80 mV, -40 mV, 0 mV) das Umkehrpotenzial der Hintergrund-

Leitfähigkeiten und danach das Gesamt-Umkehrpotenzial der ClC-7-transfizierten

Zelle über tail currents bei 0 mV, +20 mV, +40 mV bzw. -20 mV, 0 mV, +20 mV

abgeschätzt werden konnte. Dieses gemessene Gesamt-Umkehrpotenzial ist also die

Summe aus zwei Komponenten, dem ClC-7-spezifischen Umkehrpotenzial und dem

Hintergrund-Umkehrpotenzial, die jeweils gemessen an deren Proportion am

Gesamtstrom unterschiedlich viel zum Gesamt-Umkehrpotenzial beitragen. Dies kann

durch folgende Gleichung beschrieben werden:

wobei Eges für das Gesamt-Umkehrpotenzial, EH für das Hintergrund-Umkehrpotenzial

und EClC-7 für das ClC-7-spezifische Umkehrpotenzial stehen. γges beschreibt die

gemessene Gesamtleitfähigkeit bzw. Gesamtstrom (also γges = γH + γClC-7) und γH den

durch die Hintergrund-Leitfähigkeiten bestimmten Strom. Aus den Messdaten

wurden Eges und EH durch Interpolation sowie γH/γges bestimmt und durch Umstellen

der obigen Gleichung zu

EClC-7 = Eges – EH * γH/γges

1 – γH/γges

Eges = * EH + γges - γH

γges * EClC-7

γH

γges


91

das ClC-7-spezifische Umkehrpotenzial ausgerechnet. Diese Ergebnisse wurden

folglich auf die Flüssigkeits-Grenzpotenziale (liquid junction potentials) korrigiert, die

für die jeweiligen Lösungen und Konfigurationen mit dem liquid-junction-potential-

Tool JPCalcW von Clampex 9.2 (pClamp 9.2), berechnet wurden. Die korrigierten, ClC-

7-spezifischen Umkehrpotenziale wurden gegen die variierten Cl-- bzw. H+-

Konzentrationen aufgetragen. In die gleichen Diagramme wurden über die folgende

Gleichung für verschiedene Cl-:H+-Stöchiometrien (1:0, 1:1, 2:1, 3:1) vorhergesagte

Umkehrpotenziale geplottet:

wobei R, T und F ihre gewöhnliche Bedeutung als Gaskonstante, Temperatur und

Faraday-Konstante haben. [Cl-]a und [Cl-]i bzw. [H+]a und [H+]i stehen für die extra- und

intrazelluläre Cl-- bzw. H+-Konzentrationen. Die stöchiometrischen Kopplungsfaktoren

eines m Cl- zu n H+ gekoppelten Austauschers stellen m und n dar.

4.2.5.4 tail-current-Analyse

Die theoretischen Grundlagen der tail-current-Analyse sind im Kapitel 1.2.1 im Detail

erläutert. Sowohl für die Erfassung der Spannungsabhängigkeit der Ionen-

Translokation durch den offenen Transporter als auch der Spannungsabhängigkeit des

Steuerungsverhaltens wurde der Verlauf der Schwanzströme an eine mono-

exponentielle Funktion, wie sie im Kapitel 4.2.5.2 beschrieben wurde, angepasst und

zum Zeitpunkt des Spannungssprunges extrapoliert. Dadurch konnten die zur

jeweiligen Test-Spannung gehörenden Stromamplituden berechnet werden.

Zur Darstellung der Spannungsabhängigkeit der Ionentranslokation durch den

offenen Transporter wurden die ermittelten Werte auf die Stromamplitude bei +100

mV der jeweiligen Zelle normalisiert und Mittelwerte sowie Standardfehler aus allen

Zellen gebildet. Die Mittelwerte wurden gegen die entsprechende Spannung

aufgetragen (Abb. 18B rechts).

Für die Bestimmung der Offenwahrscheinlichkeit wurde von den wie oben

beschrieben ermittelten Stromwerten der Mittelwert endogener Ströme bei + 80 mV

(Post-Puls) subtrahiert. Dieser Mittelwert wurde aus unabhängigen Messungen von

nicht-transfizierten HeLa-Zellen ermittelt. Die korrigierten Werte wurden dann auf

den Maximalwert der jeweiligen Zelle (Strom bei +140 mV) normalisiert und

gemittelt. Nach dem Auftragen gegen die entsprechende Spannung wurde ein

Boltzmann-Fit vollzogen, wie er in Kapitel 1.2.1 beschrieben ist. Die scheinbare

Offenwahrscheinlichkeit ergab sich durch eine zusätzliche Normalisierung der

Offenwahrscheinlichkeiten, damit po = 1 bei V � ∞ gewährleistet ist. Diese Werte

wurden schließlich für den finalen Graphen in Abbildung 18C (rechts) verwendet.

EClC-7 = – R * T

(m + n) * F

[Cl-]am * [H+]i

n

[Cl-]im * [H+]a

n * ln


92

4.2.5.5 Quantifizierung der relativen Leitfähigkeiten von Anionen und

der Abhängigkeit von ClC-7 vom extrazellulären pH-Wert

Bei der vorliegenden Arbeit wurde nicht die intra-anionische Selektivität von ClC-7

sondern die zu Cl- relative Leitfähigkeit der untersuchten Anionen bestimmt. Dabei

wurden die Experimente wie in Kapitel 4.2.4.1 beschrieben durchgeführt und die

Strom-Spannungs-Beziehungen gemäß Kapitel 4.2.5.1 ermittelt. Für die Berechnung

der relativen Leitfähigkeiten wurde zunächst die unter dem jeweiligen Anion

gemessene Stromantwort auf die zuvor gemessene Stromantwort unter Cl-

normalisiert. Zusätzlich wurde die unter diesem Anion gemessene Stromantwort auch

auf die danach gemessene Stromantwort unter Cl- normalisiert. Aus diesen beiden

normalisierten Werten wurden der Mittelwert sowie der Standardfehler berechnet

und die bei +80 mV ermittelten Ergebnisse für das finale Diagramm in Abbildung 19A

verwendet. Diese doppelte Normalisierung ist sinnvoll, damit die Verunreinigung der

Ergebnisse mit dem Run-down-Effekt minimiert werden konnte.

Für die Abhängigkeit der ClC-7-Stromamplituden im Pseudo-Gleichgewichtszustand

von der extrazellulären H+-Konzentration wurde die Auswertungen auf die gleiche Art

wie eben beschrieben durchgeführt. Für die finale Darstellung wurden jedoch die

gesamten normalisierten Strom-Spannungs-Beziehungen verwendet (Abb. 20 B).

4.2.5.6 Quantifizierung der Temperaturabhängigkeit

Die van’t Hoff’sche Regel, auch als Reaktionsgeschwindigkeits-Temperatur-Regel

bezeichnet, besagt, dass chemische Reaktionen mit erhöhter Temperatur schneller

ablaufen und der Faktor, um den die Reaktionsgeschwindigkeit bei einer

Temperaturerhöhung von 10°C konkret ansteigt ist der Q10-Wert. Dies lässt sich auch

auf biologische Prozesse übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde die durch

Temperaturerhöhung bedingte relative Veränderung der Aktivierungs- und

Deaktivierungs-Kinetik sowie der Stromamplitude betrachtet. Für die Berechnung der

Q10-Werte wurde die van’t Hoff’sche Regel der folgenden Form angewendet:

Dabei stellen T1 und T2 die bei der Messung jeweils angewandten Temperaturen dar

(in °C oder K), wobei T1 < T2. X1 und X2 beschreiben bei Betrachtung der

Stromamplituden die bei der jeweiligen Temperatur gemessenen Stromamplituden

selbst und bei Betrachtung der Kinetik die Ratenkonstanten (r), die sich über folgende

Gleichung aus den Zeitkonstanten (τ) der jeweiligen Prozesse (Kap. 4.2.5.2)

gemessen bei der jeweiligen Temperatur ergeben:

r = 1/τ

X2

X1 Q10 =

10/(T2 – T1)


93

Außerdem lässt sich über die Temperaturabhängigkeit auch die Aktivierungs-Energie

des jeweiligen Prozesses bestimmen. Dafür wurde die Arrhenius-Gleichung der

folgenden Form herangezogen:

wobei T1 und T2 wieder die Messtemperaturen (in K) mit T1 < T2 darstellen. R hat die

übliche Bedeutung der Gaskonstante (1,9872 cal*K-1*mol-1) und X1 bzw. X2 wurde

oben bereits erläutert.

Alle unter diesem Kapitel beschriebenen Berechnungen wurden für Stromantworten

auf +80 mV angewendet.

Ea = R * T1 * T2

T2 – T1

* ln X2

X1

5. ANHANG

95

5. ANHANG

5.1 Abkürzungsverzeichnis

A Amper

Abb. Abbildung

Br- Bromid-Ion(en)

°C Grad Celsius

c centi

C Kapazität

ca. etwa (circa)

Cl- Chlorid-Ion(en)

C-Terminus Carboxy-Terminus

DNA Desoxyribonukleinsäure

E Glutamat

F Farad

F Floureszenz

g gram

Gluk- Glukonat-Ion(en)

h Stunde

H+ Wasserstoff-Ion(en) bzw. Proton(en)

Hz Hertz

I Strom

I- Iodid-Ion(en)

J Joule

k kilo

K Kelvin

Da Dalton

l Liter

μ micro

m milli

m Meter

M molar

min Minute(n)

n nano

NO3- Nitrat-Ion(en)

N-Terminus Amino-Terminus

5. ANHANG

96

Ω Ohm

p pico

P Prolin

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperature

S Serin

s Sekunde(n)

Tab. Tabelle

U Spannung

V Volt

v/v Volumen/Volumen

w/v Gewicht/Volumen (weight/volume)

Y Tyrosin

5. ANHANG

97

5.2 Literaturverzeichnis

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5. ANHANG

108

5.3 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Ionenkanal versus Ionentransporter.

Abbildung 2 Spannungsabhängigkeit Ionen-leitender Membranproteine.

Abbildung 3 Die Säuger-CLC-Familie.

Abbildung 4 Molekulare Architektur der CLCs.

Abbildung 5 Ionentransportpfade und Selektivitätsfilter eines CLC-Antiporters.

Abbildung 6 Model für den Transportmechanismus der CLC-Antiporter.

Abbildung 7 Interaktion zwischen C-Terminus und Transmembranregion.

Abbildung 8 Subzelluläre Sortierung von ClC-7 über N-terminale Motive.

Abbildung 9 ClC-7-Knockout-Maus.

Abbildung 10 ClC-7 in der lysosomalen Physiologie.

Abbildung 11 Der Knochensubstanz angelagerter, aktiver Osteoklast.

Abbildung 12 Membrantopologie von Ostm1.

Abbildung 13 ClC-7 ist ein langsam gesteuerter Auswärtsrektifizierer.

Abbildung 14 ClC-7 ist ein gekoppelter Cl-/H+-Antiporter.

Abbildung 15 Neutralisierung des gating- und Protonen-Glutamats in ClC-7.

Abbildung 16 ClC-7-Transportaktivität benötigt Ostm1.

Abbildung 17 ClC-7 ist ein 2Cl-/1H+-Antiporter.

Abbildung 18 Spannungsabhängigkeit von ClC-7.

Abbildung 19 Intra-anionische Präferenz von ClC-7.

Abbildung 20 Abhängigkeit von ClC-7 von extrazellulären Protonen.

Abbildung 21 ClC-7 ist moderat Temperatur-abhängig.

Abbildung 22 ClC-7 ist nicht abhängig von ATP.

Abbildung 23 ClC-7 weist einen Run-down-Effekt auf.

5.4 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Die wichtigsten freien Ionen einer Säugetier-Skelettmuskelzelle.

Tabelle 2 Bei der vorliegenden Arbeit verwendeten Lösungen.

Tabelle 3 Bei der vorliegenden Arbeit verwendete DNA-Konstrukte.

5. ANHANG

109

5.5 Eidesstattliche Versicherung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt

und keine anderen als die hier angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

5.6 Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich mich bei keiner anderen Hochschule außer der

Technischen Universität Berlin zur Promotionsabsicht angemeldet habe.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden im EMBO Journal 2011 veröffentlicht (Leisle et

al., 2011).

5.7 Publikationsliste

1. Leisle L, Ludwig CF, Wagner FA, Jentsch TJ & Stauber T; ClC-7 is a slowly

voltage gated 2Cl-/1H+-exchanger and requires Ostm1 for transport activity;

EMBO J., 2011

2. Knierim E, Leisle L, Wagner C, Weschke B, Lucke B, Bohner G, Dreier JP &

Schuelke M; Recurrent stroke due to a novel voltage sensor mutation in

Cav2.1 responds to verapamil; Stroke, 2011

3. Scheper GC, van Berkel CG, Leisle L, de Groot KE, Errami A, Jentsch TJ & Van

der Knaap MS; Analysis of CLCN2 as Candidate Gene for Megalencephalic

Leukoencephalopathy with Subcortical Cysts; Genet Test Mol Biomarkers,

2010

4. Kadurin I, Golubovic A, Leisle L, Schindelin H, Gründer S; Differential effects of

N-glycans on surface expression suggest structural differences between the

acid-sensing ion channel (ASIC) 1a and ASIC1b; Biochem J., 2008

5. Leisle L, Parkin ET, Turner AJ & Hooper NM; Angiotensin-converting enzyme as

a GPIase: a critical reevaluation; Nature Medicine (correspondence), 2005

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