Biopur- Der Maßstab für biologische Reinheit...Nr 042 | Februar 2012 Biopur® – Der Maßstab...
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Nr 042 | Februar 2012 Biopur® – Der Maßstab für biologische Reinheit Zusammenfassung Userguide Natascha Weiß, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Einleitung Im Labor eingesetzte Verbrauchsartikel, die in direkten Kontakt mit Probenmaterial kommen, dürfen dieses nicht beeinträchtigen oder damit durchgeführte Analysen ver- fälschen. Besonders für Anwendungen, in denen mit lebenden Zellen oder Nukleinsäuren gearbeitet wird, ist eine hohe Reinheit der verwendeten Verbrauchsartikel notwendig. Viele Verbrauchsartikel können zwar durch Autoklavieren sterilisiert werden, aber Moleküle wie DNA, RNasen und Endotoxine sind sehr stabil und lassen sich auf diese Art nicht vollständig entfernen bzw. inaktivieren. Daher ist der Einsatz von gebrauchsfertigen sterilen Pro- dukten, die zudem frei von molekular- und zellbiologisch relevanten Molekülen sind, vorteilhaft. Diese können direkt verwendet werden, was Zeit und Geld spart sowie höchste Sicherheit bietet. Mit dem Reinheitsgrad Biopur hat Eppendorf vor zwanzig Jahren einen einzigartigen Reinheitsstandard für Verbrauchs- artikel definiert, dessen Testkriterien ab dem Jahr 2012 noch um die Freiheit von DNase und PCR-Inhibitoren erweitert wurden. Pipettenspitzen, Eppendorf Safe-Lock Tubes, twin.tec PCR Plates und Combitips, die das Biopur-Siegel aufweisen, werden in einem aufwändigen automatisierten Produktionsprozess hergestellt, so dass eine Kontamination mit Nukleinsäuren, Proteinen oder Mikroorganismen durch menschlichen Kontakt oder andere Quellen ausgeschlos- sen wird. Weiterhin erfolgt eine Sterilisierung der Produkte durch Bestrahlung oder Ethylenoxidbehandlung. Jede Charge wird von einem unabhängigen Labor überprüft und nur bei Erfüllung aller Testkriterien zertifiziert. Durch das Zertifikat (Abb. 1) wird die Reinheit aller Biopur- Produkte von Eppendorf garantiert. Darin sind die Grenzwerte für Sterilität, Pyrogene (Endotoxine), DNA, DNase, RNase, ATP und PCR-Inhibitoren aufgeführt. Die chargen-spezifischen Zertifikate sind unter www.eppendorf.de/zertifikate erhältlich. Das Biopur-Siegel (Abb. 2) steht für die Sicherheit, mit der die Produkte direkt für alle Anwendungen eingesetzt werden können, bei denen es auf höchstmögliche Reinheit ankommt. Alle Artikel mit diesem Siegel sind: Steril (Bestrahlung oder Ethylenoxidbehandlung, SAL von 10 -6 ) Pyrogen-frei (< 0,001 EE/mL, kinetisch- turbidimetrischer LAL-Test, FDA Richtlinie) ATP-frei (< 5,5 fg) RNase-frei (< 1,0 x 10 -9 Kunitz Einheiten) DNase-frei (< 1,0 x 10 -6 Kunitz Einheiten) – Neu! Human-DNA-frei (< 2 pg; weniger als eine menschliche Zelle) Bakterien-DNA-frei (< 50 fg; weniger als 10 E. coli Zellen) PCR-Inhibitor-frei (weniger als 10 amplifi- zierbare Targets) – Neu! Abb. 1: Biopur-Zertifikat Biopur-Produkte werden Charge für Charge durch ein externes Labor geprüft und zertifiziert. Abb. 2: Biopur-Siegel Der zertifizierte Standard Biopur wurde entwickelt, um höchstmögliche Reinheit für Verbrauchsartikel im Labor zu gewährleisten. Diese können in der Zellkultur, in IVF- und Diagnostiklabors und in anderen Bereichen, in denen der Schutz vor Kontaminationen von großer Bedeutung ist, eingesetzt werden. In diesem Bericht werden Hintergrundin- formationen zu den für die Reinheit dieser Produkte entscheidenden Parametern und ihren Testverfahren gegeben.
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Nr 042 | Februar 2012
Biopur® – Der Maßstab für biologische Reinheit
Zusammenfassung
Userguide
Natascha Weiß, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Einleitung
Im Labor eingesetzte Verbrauchsartikel, die in direkten Kontakt mit Probenmaterial kommen, dürfen dieses nicht beeinträchtigen oder damit durchgeführte Analysen ver-fälschen. Besonders für Anwendungen, in denen mit lebenden Zellen oder Nukleinsäuren gearbeitet wird, ist eine hohe Reinheit der verwendeten Verbrauchsartikel notwendig. Viele Verbrauchsartikel können zwar durch Autoklavieren sterilisiert werden, aber Moleküle wie DNA, RNasen und Endotoxine sind sehr stabil und lassen sich auf diese Art nicht vollständig entfernen bzw. inaktivieren. Daher ist der Einsatz von gebrauchsfertigen sterilen Pro-dukten, die zudem frei von molekular- und zellbiologisch relevanten Molekülen sind, vorteilhaft. Diese können direkt verwendet werden, was Zeit und Geld spart sowie höchste Sicherheit bietet.Mit dem Reinheitsgrad Biopur hat Eppendorf vor zwanzig Jahren einen einzigartigen Reinheitsstandard für Verbrauchs-artikel definiert, dessen Testkriterien ab dem Jahr 2012 noch um die Freiheit von DNase und PCR-Inhibitoren erweitert wurden. Pipettenspitzen, Eppendorf Safe-Lock Tubes, twin.tec PCR Plates und Combitips, die das Biopur-Siegel aufweisen, werden in einem aufwändigen automatisierten Produktionsprozess hergestellt, so dass eine Kontamination mit Nukleinsäuren, Proteinen oder Mikroorganismen durch menschlichen Kontakt oder andere Quellen ausgeschlos-sen wird. Weiterhin erfolgt eine Sterilisierung der Produkte durch Bestrahlung oder Ethylenoxidbehandlung.Jede Charge wird von einem unabhängigen Labor überprüft und nur bei Erfüllung aller Testkriterien zertifiziert. Durch das Zertifikat (Abb. 1) wird die Reinheit aller Biopur-
Produkte von Eppendorf garantiert. Darin sind die Grenzwerte für Sterilität, Pyrogene (Endotoxine), DNA, DNase, RNase, ATP und PCR-Inhibitoren aufgeführt. Die chargen-spezifischen Zertifikate sind unter www.eppendorf.de/zertifikate erhältlich.Das Biopur-Siegel (Abb. 2) steht für die Sicherheit, mit der die Produkte direkt für alle Anwendungen eingesetzt werden können, bei denen es auf höchstmögliche Reinheit ankommt. Alle Artikel mit diesem Siegel sind: Steril (Bestrahlung oder Ethylenoxidbehandlung, SAL von 10-6) Pyrogen-frei (< 0,001 EE/mL, kinetisch- turbidimetrischer LAL-Test, FDA Richtlinie) ATP-frei (< 5,5 fg) RNase-frei (< 1,0 x 10-9 Kunitz Einheiten) DNase-frei (< 1,0 x 10-6 Kunitz Einheiten) – Neu! Human-DNA-frei (< 2 pg; weniger als eine menschliche Zelle) Bakterien-DNA-frei (< 50 fg; weniger als 10 E. coli Zellen) PCR-Inhibitor-frei (weniger als 10 amplifi- zierbare Targets) – Neu!
Abb. 1: Biopur-ZertifikatBiopur-Produkte werden Charge für Charge durch ein externes Labor geprüft und zertifiziert.
Abb. 2: Biopur-Siegel
Der zertifizierte Standard Biopur wurde entwickelt, um höchstmögliche Reinheit für Verbrauchsartikel im Labor zu gewährleisten. Diese können in der Zellkultur, in IVF- und Diagnostiklabors und in anderen Bereichen, in denen der Schutz vor Kontaminationen von großer Bedeutung ist, eingesetzt werden. In diesem Bericht werden Hintergrundin-formationen zu den für die Reinheit dieser Produkte entscheidenden Parametern und ihren Testverfahren gegeben.
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Abb. 3: Nordamerikanischer Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus
In Übereinstimmung mit einer Initiative des Europäischen Dachverbandes der Medizinprodukteindustrie (EUCOMED) wurde eine Kontaminationswahrscheinlichkeit von 10-6 mit lebenden Mikroorganismen nach einem Sterilisierungspro-zess als Grad für die zuverlässige Sterilisierung spezifiziert. Dieses entspricht einem SAL-Wert (Sterility Assurance Level) von 10-6 und bedeutet: Nur ein Mikroorganismus überlebt in einer Probe von 106 oder in einer Menge von 106 Gegenständen befindet sich nach der Sterilisation genau ein nicht-steriler Gegenstand.
Für Biopur-Produkte wird Sterilität mit einem SAL von 10-6 durch Bestrahlung oder Behandlung mit Ethylenoxid (EtO) erreicht. Dabei wird die notwendige Sterilisationsdosis ex-perimentell über die Verkeimungsrate und durch Sterilitäts-tests ermittelt. Sie spiegelt die Qualität des Produktions-prozesses wieder. Nach der Validierung des Sterilisations-verfahrens und der Produktsterilität mit geeigneten bakteri-ellen Indikatoren (Bacillus pumilus) wird der weitere Prozess mit Dosimetern gemäß der USP XXII (United States Pharmacopoeia), DAB 10 (Deutsches Arzneibuch) und Ph. Eur. (Europäisches Arzneibuch) überwacht.
Sterilisation durch Bestrahlung kann grundsätzlich mit Betastrahlung (beschleunigte Elektronen) oder Gamma-strahlung (energiereiche elektromagnetische Strahlung) erzielt werden. Zu beachten ist, dass beide Strahlungsarten je nach Dosis Einfluss auf die Materialbeschaffenheit und damit die mechanischen Eigenschaften von Plastikprodukten nehmen können. Die Eppendorf Biopur Produkte werden vollautomatisch ohne menschliche Intervention und unter Reinraumbedingungen produziert. Die dadurch erzielte geringe Vorverkeimung ermöglicht es, die Strahlendosis, die zur Sterilisation erforderlich ist, sehr niedrig anzusetzen.
Eine weitere und sehr wirkungsvolle Sterilisationsmethode ist die Behandlung mit Ethylenoxid, die vielfach für Medizin-produkte im Krankenhaus eingesetzt wird. Vorteilhaft ist, dass die mechanischen Eigenschaften des Materials nicht verändert werden. Eine genaue Durchführung des Prozes-ses und eine ausreichend lange Entlüftungszeit der sterilisi-erten Artikel sind hierbei wichtig.
Proben der Eppendorf Produkte werden für die Testung auf Sterilität in Thioglykolat- und CaSo-Bouillon gespült und anschließend 15 Tage bebrütet. Der Test wird entsprechend der Ph. Eur. 2.6.1. „Prüfung auf Sterilität“ durchgeführt.
Sterilität Pyrogene
Pyrogene (a. d. Griechischen: pyr, pyros = Feuer, genes = erzeugen) sind Substanzen, die bei parenteraler Verabrei-chung Fieber verursachen. Endotoxine als wichtigste Pyrogen-Klasse werden für Biopur-Produkte über den kinetisch-turbidimetrischen LAL-Test kontrolliert. LAL ist die Abkürzung für Limulus-Amöbozyten-Lysat. Dieses Lysat aus Amöbozyten der Hämolymphe von Limulus polyphemus (Pfeilschwanzkrebs, Abb. 3) reagiert sehr empfindlich aufgeringste Mengen von LPS (Lipopolysacchariden) aus Zell-wänden gram-negativer Bakterien (bakterielle Endotoxine). Wird endotoxinhaltige Lösung zu dem Lysat gegeben, wird die Mischung trübe, zeigt Ausfällungen oder geliert.
Die Amöbozyten werden aus dem Blut von Pfeilschwanz-krebsen gewonnen, die glücklicherweise hierfür nicht getötet werden müssen. Seit 1987 hat die Ph. Eur. (Euro-päisches Arzneibuch) und seit 1988 die FDA (Federal Drug Administration, USA) Richtlinien zur Verwendung von Gel-tests und kinetisch-turbidimetrischen Tests mit LAL auf-gestellt.
Der LAL-Test für Biopur-Produkte wird mit Endotoxin-Standards (d.h. WHO-Standard 84/650 oder Endotoxin BRS) oder Kontrollstandard-Endotoxinen durchgeführt. Dafür werden die Produkte mit Endotoxin-freiem Wasser gespült und der Test entsprechend der Ph. Eur. 2.6.14 „Prüfung auf Bakterien-Endotoxine“ durchgeführt.
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ATP
ATP kann als genereller Indikator für die Anwesenheit biolo-gischer Kontaminationen verwendet werden, da dieses energiereiche Molekül in allen lebenden Zellen vorkommt. Biopur-Produkte sind frei von ATP, was über die Verkei-mungsrate nachgewiesen wird und sind damit optimal für den Einsatz mit ATP Quantifizierungs-Kits geeignet. In die-sen Kits wird für gewöhnlich das Enzym Luziferase verwen-det, das in Organen des Leuchtkäfers vorkommt. Dieses katalysiert die Entstehung und Oxidation von Adenyl-Luciferin unter Aussendung von Licht. Die Biolumineszenz dient als Indikator für Stoffwechselaktivitäten oder für die Anwesenheit von biologischem Material.
DNA, DNasen und RNasen
Verunreinigungen durch Nukleinsäuren und Enzyme, die DNA oder RNA schneiden, sind sehr kritisch, da sie mole-kularbiologische Experimente, die PCR oder andere Ampli-fikationstechniken erheblich beeinflussen können. Während des Produktionsprozesses wird die Kontamination von Verbrauchsarikel mit DNA, DNasen und RNasen meist durch menschlichen Kontakt oder durch Verunreinigung aus der Luft verursacht. Für den gesamten Biopur-Herstellungspro-zess kann dieses ausgeschlossen werden.
Zur Testung der Biopur-Produkte werden diese mit Nuklein-säure- und Nuklease-freiem Wasser gespült und dieses für folgende Analysen eingesetzt:Der Nachweis von DNA erfolgt über real-time PCR. Konta-minationen mit bakterieller DNA werden durch die Amplifi-kation eines hoch-konservierten 110 bp-Fragments der 16S rDNA angezeigt. Für humane DNA wird ein 294 bp-Fragment vervielfältigt, das in mehr als 105 Kopien in menschlichen Zellen vorliegt. Eine Verdünnungsreihe von 16 pg – 2 pg dieses DNA-Fragments dient als Positivkontrolle bzw. Vergleichsstandard (Abb. 4).
Das Vorhandensein von DNasen oder RNasen wird durch Inkubation der Spüllösung mit einer 100 bp-DNA-Leiter bzw. einer 100 b-RNA-Leiter bei 37° C für 24 h und an-schließender Auswertung über Gelelektrophorese überprüft.
Abb. 4: Real-time PCR einer Verdünnungsreihe von Human-DNADie Abbildung zeigt 4 Fluoreszenz-Doppelkurven, die den Doppelan-sätzen der Human-DNA-Verdünnungsreihe entsprechen (von links nach rechts = 16, 8, 4, 2 pg L1-DNA).
PCR-Inhibitoren
Es gibt Stoffe, die die Vervielfältigung von DNA in der PCR stören. Zur Detektion von möglichen PCR-Inhibitoren in Biopur-Produkten werden diese mit DNA-freiem Wasser gespült und damit eine real-time PCR durchgeführt, bei der ein 294 bp-Fragment amplifiziert wird, das in 105 Kopien in menschlichen Zellen vorliegt. Die Ct-Werte der Proben werden mit der Positivkontrolle (beinhaltet 16 pg humane DNA) verglichen, wobei der Unterschied im Ct-Wert von Proben und Kontrolle im Bereich +/- 2 Zyklen liegen muss.
Cycle
Amplification Plot
0,70
0,65
0,60
0,55
0,50
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
∆R
n
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
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Bezeichnung Bestell-Nr.
epT.I.P.S.® Singles, Biopur®, einzeln geblistert
0,1–20 µL, 40 mm, 100 Tips 0030 010.019
2–200 µL, 53 mm, 100 Tips 0030 010.035
50–1.000 µL, 71 mm, 100 Tips 0030 010.051
epT.I.P.S.® Racks, Biopur® 0,1–20 µL, 40 mm, 5 Racks à 96 Tips = 480 Tips 0030 075.005
2–200 µL, 53 mm, 5 Racks à 96 Tips = 480 Tips 0030 075.021
20–300 µL, 55 mm, 5 Racks à 96 Tips = 480 Tips 0030 075.048
50–1.000 µL, 71 mm, 5 Racks à 96 Tips = 480 Tips 0030 075.064
50–1.250 µL, 76 mm, 5 Racks à 96 Tips = 480 Tips 0030 075.080
50–1.250 µL L, 103 mm, 5 Racks à 96 Tips = 480 Tips 0030 075.129
500–2.500 µL, 115 mm, 5 Racks à 48 Tips = 240 Tips 0030 075.102
1–10 mL, 165 mm, 5 Racks à 24 Tips = 120 Tips 0030 075.145
Eppendorf Combitips® plus/Eppendorf Combitips®, Biopur®
einzeln geblistert (100 Stück)
Combitips plus 0,1 mL 0030 069.404
Combitips plus 0,2 mL 0030 069.412
Combitips plus 0,5 mL 0030 069.420
Combitips plus 1,0 mL 0030 069.439
Combitips plus 2,5 mL 0030 069.447
Combitips plus 5,0 mL 0030 069.455
Combitips plus 10 mL 0030 069.463
Combitips plus 25 mL 0030 069.390
Combitips plus 50 mL 0030 069.471
Combitips 1,25 mL 0030 048.407
Combitips 12,5 mL 0030 048.431
25 mL Adapter (Satz à 7 Stück) 0030 069.498
50 mL Adapter (Satz à 7 Stück) 0030 069.480
Eppendorf Safe-Lock Tubes, Biopur® 0,5 mL (à 50 Stück) 0030 121.570
1,5 mL (à 100 Stück) 0030 121.589
2,0 mL (à 100 Stück) 0030 121.597
Eppendorf twin.tec® microbiology PCR Plate 96, skirted, Biopur®, 10 Stück
Farblos 0030 129.300
Blau 0030 129.318
Eppendorf twin.tec® microbiology PCR Plate 96, semi-skirted, Biopur®, 10 Stück
Farblos 0030 129.326
Blau 0030 129.334
Eppendorf twin.tec® microbiology PCR Plate 384, Biopur®, 10 Stück
Farblos 0030 129.342
Blau 0030 129.350
