1

Biotechnologie und Klinische Pharmazie

Praktikum

Institut für Pharmazeutische Biotechnologie

Universität des Saarlandes

Liebe KursteilnehmerInnen,

dieser Kurs soll Ihnen einen ersten Einblick in die vielfältigen Arbeitsmethoden der Biochemie

gewähren. Dazu ist es natürlich notwendig, den theoretischen Hintergrund- sprich: das

physikalische Prinzip - der einzelnen Methoden und die praktische Umsetzung kennenzulernen.

Die Theorie wird an jedem Versuchstag von den betreuenden AssistentInnen ausführlich mit

Ihnen durchgesprochen. Damit Sie sich auf diese Vorbesprechungen vorbereiten können,

erhalten Sie am ersten Kurstag ein Methoden-Skript.

Im praktischen Teil führen Sie die hier beschriebenen Versuche durch. Bevor Sie sich jedoch

an die Durchführung des vorgesehenen Versuches wagen, sprechen Sie Ihre geplante

Vorgehensweise noch einmal mit den zuständigen AssistentInnen durch. Wenn Sie

Schwierigkeiten haben, mit einer automatischen Pipette umzugehen oder die Menge NaCl zu

berechnen, die Sie für 169 ml einer 0,294 M Lösung brauchen, dann fragen Sie die

AssistentInnen! Scheuen Sie sich bitte nicht, vermeintlich dumme Fragen zu stellen! Sie sind

TeilnehmerIn an diesem Kurs, um die Arbeit mit Laborgeräten, die zum Teil eine Stange Geld

kosten, zu lernen.

Quetschen Sie uns also ruhig aus, dann werden Ihnen weniger Fehler unterlaufen. Außerdem

verpflichten wir Sie dazu, daß Sie, wenn Sie Ihren „Labortag“ beenden, Ihre Ergebnisse und

Ihre Ideen zur Auswertung mit dem jeweiligen Assistenten noch einmal durchsprechen. So

gerne Sie vielleicht nach Hause möchten. Insgesamt werden Sie Zeit einsparen, da sich durch

das Ausräumen von Mißverständnissen unter Umständen eine Korrektur des Protokolls

erübrigt!

3

Hinweise zum Sicheren Arbeiten im Labor

Den Anweisungen der Kursassistentinnen und Kursassistenten ist in jedem Falle Folge zu

leisten. Alle besonderen Vorkommnisse müssen umgehend einer Assistentin oder Assistenten

gemeldet werden. Dies gilt insbesondere für jede Art von Verletzung.

Essen und Rauchen sind im Labor verboten. Im Labor ist grundsätzlich ein Arbeitskittel aus

Baumwolle zu tragen, sowie festes und geschlossenes Schuhwerk. Bei Arbeiten, die mit

besonderen Gefahren für die Augen verbunden sind (z.B. Arbeiten mit ätzenden Flüssigkeiten,

Lösungsmitteln, evakuierten Apparaturen, Druckbehältern etc.), ist unbedingt eine Schutzbrille

zu tragen.

Arbeiten, bei denen gesundheitsschädliche Gase oder Dämpfe auftreten (z.B. mit organischen

Lösungsmitteln, rauchenden Säuren etc.), müssen in Abzügen ausgeführt werden. Es darf

grundsätzlich nicht mit dem Mund pipettiert werden. Alle Geräte dürfen erst nach Einweisung

durch eine Assistentin oder einen Assistenten benutzt werden.

Für Glasbruch stehen besondere Abfallbehälter bereit. Organische Lösungsmittel werden in

besonderen Abfallflaschen gesammelt, die im Abzug stehen müssen.

Giftige Abfälle müssen in gesonderten, genau beschrifteten Abfallflaschen gesammelt werden.

Alle angesetzten oder umgefüllten Lösungen bzw. Chemikalien sind genau zu beschriften und

gegebenenfalls mit einem Warnhinweis zu versehen.

Vor Aufnahme der Arbeiten hat sich jede/jeder im Labor Beschäftigte mit der Verhaltensregeln

im Brandfall bzw. bei Unfällen, den Standorten von Augendusche, Notdusche, Löschdecke,

Feuerlöscher, Telefon und Verbandskasten sowie den Flucht- und Rettungswegen vertraut zu

machen.

Wichtige Telefonnummern (Hängen auch im Labor aus!):

Kursleiter: -70201 (Prof. Dr. R. Müller), -70204 (Dr. Silke Wenzel)

Notarzt: 2242

Ersthelfer: -70204 (Dr. Silke Wenzel), -70221 (Sara Andes, Anja Reich)

Feuerwehr: 0-112

Alle im Labor Beschäftigten haben für Ordnung und Sauberkeit zu sorgen. Am Ende eines

Praktikumstages sind die Arbeitstische aufzuräumen. Gas- und Wasserhähne sind zu schließen,

elektrische Apparaturen abzuschalten.

Für stillende und werdende Mütter gelten besondere Richtlinien. Bei Vorliegen dieser

Tatbestände ist umgehend der Kursleiter, Dr. Andriy Luzhetskyy, zu informieren, damit

entsprechende Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden können.

4

HINWEISE ZUM SICHEREN ARBEITEN IM LABOR ............................................................ 3

ALLGEMEINES ............................................................................................................................. 5

Sicherheit am Arbeitsplatz .......................................................................................................... 5

Umgang mit Laborausstattung und Chemikalien ..................................................................... 6

VERSUCHE ...................................................................................................................................... 8

VERSUCH 1: Klonierung und heterologe Expression einer Typ III PKS aus Saccharopolyspora

erythraea in S. albus........... 8

VERSUCH 2: Transposon Mutagenese in Streptomyces albus J1074 ..................... 18

VERSUCH 3: Heterologe Expression Naturstoff-Biosynthesewege .............. 24

VERSUCH 4: Chemisches und biologisches Screening ausgewählter Naturstoffproduzenten .. 33

VERSUCH 5: Isolierung von chromosomaler DNA aus Streptomyces albus J1074............... 34

VERSUCH 6: Proteinanalytik .................................................................................................. 36

VERSUCH 7: Erstellen der physikalischen Karte eines Plasmides ......................................... 41

VERSUCH 8: Identifizierung eines klonierten DNA Fragmentes mittels Datenbanksuche .......... 42

Allgemeines

Sicherheit am Arbeitsplatz

Umsichtiges Handeln am Arbeitsplatz gibt Ihnen und Ihren Kollegen den besten Unfallschutz.

Die Liste der folgenden unbedingt einzuhaltenden Sicherheitsmaßnahmen soll Ihnen helfen,

Unfälle zu vermeiden und Gefahrenquellen am Arbeitsplatz zu erkennen. Unfälle, die durch

leichtsinniges Handeln zustande kommen, werden von den Versicherungsgesellschaften nicht

als schadenersatzpflichtig anerkannt!

1. Beim Umfüllen von Säuren und Laugen sowie bei der Verarbeitung von Glas (Schneiden,

Schmelzen u.a.) ist stets eine Schutzbrille zu tragen.

2. Für das Pipettieren sämtlicher Löungen, insbes. flüssiger Chemikalien wie Säuren, Laugen,

Lösungsmittel (Chloroform, Aceton etc.) und konzentrierter Salzlösungen, sind immer

entsprechende Pipettierhilfen, wie z.B. Peleusball oder Pipetman, zu benutzen. Es darf nichts

mit dem Mund pipettiert werden.

3. a) Vor dem Umgang mit Krankheitserregern, z. B. Salmonella-Bakterien, ist der Betreuer

davon zu unterrichten (Meldepflicht lt. Gesetzblatt), damit zusammen mit dem

Sicherheitsbeauftragten Schutzvorkehrungen getroffen werden können.

b) Kulturgefäße, Pipetten etc., die mit Krankheitserregern verseucht sind, dürfen nur an

Arbeitsplätzen stehen, die deutlich markiert sind: VORSICHT - INFEKTIÖS. Dasselbe gilt

für die Aufbewahrung von Krankheitserregern in der Kühl- und Brutkammer oder anderweitig.

c) Mit Krankheitserregern verseuchtes Arbeitsgerät ist sobald wie möglich zu autoklavieren.

Für die sichere Abtötung der Krankheitserreger ist der Experimentator verantwortlich.

d) Nach allen Arbeiten mit Krankheitserregern muss sich der Experimentator die Hände für 3-4

Min. mit Sterillium-Lösung desinfizieren, bevor er das Labor verlässt oder zu anderen Arbeiten

übergeht (Händedesinfektion).

4. Zerbrochene Glasgeräte niemals in den Papierkorb, sondern nur in einen mit Glasbruch

deutlich beschriftetes Gefäß legen.

5. Hautkontakt mit allen Chemikalien, insbesondere mit Mutagenen und Cancerogenen, ist

strikt zu vermeiden. Arbeitsgeräte, die mit solchen Chemikalien verunreinigt sind, sofort nach

Gebrauch unter fließendem Leitungswasser selber spülen. Danach erst in die Spülküche

geben. Zum Spülen Einweg-Plastikhandschuhe benutzen und danach wegwerfen.

6. Vor dem Verlassen des Labors (Mittagspause und abends) vergewissern, dass alle Gashähne

und Fenster geschlossen sind und gefahrenträchtige Geräte, wie z.B. Autoklaven, Heizplatten

6

etc., abgeschaltet sind.

7. Jeder Benutzer eines Gerätes muss sich vorher über die betriebsgerechte Benutzungsweise

informieren, entweder durch Befragen eines Betreuers oder Durchlesen der entsprechenden

Betriebsanleitung.

8. Beugen Sie der Stolpergefahr vor, insbesondere dadurch, dass Sie sowenig wie möglich

Geräte, Drahtkörbe etc. auf dem Boden der Labore aufbewahren. Fußangeln vermeiden!

Schubfächer nach Gebrauch sofort schließen.

9. Lagern brennbarer, ätzender oder anderweitig gefährlicher Chemikalien nur in kleinen

und dichtschließenden Gefäßen und nur an sicherem Standort, also nicht auf evtl. wackeligen

Regalen, nicht in Heizungsnähe oder an sonnigen Standorten.

10. Vergewissern Sie sich immer wieder:

a) Wo ist der nächste Feuerlöscher?

b) Wo ist der nächste Erste-Hilfe-Kasten?

11. Alle Unfälle melden und in Verbandbuch eintragen.

Rufen Sie bei plötzlicher Gefahr sofort HILFE und verlassen Sie den Gefahrenplatz, wenn

Sie persönlich Erste Hilfe benötigen oder unsicher sind, ob Sie die Gefahrenquelle sachgerecht

ausschalten können. Unsachgemäße Gefahren-bekämpfung gefährdet Sie.

Melden Sie alle Dienst-Unfälle oder Verletzungen, auch zuerst unwichtig erscheinende,

umgehend dem Betreuer und dem Sicherheitsbeauftragten.

Umgang mit Laborausstattung und Chemikalien

Chemikalien: Die verwendeten Chemikalien haben in der Regel die Qualität "p.a.". Deshalb

bitte dafür Sorge tragen, dass die Qualität erhalten bleibt (sauberen Spatel mit Wasser

abspülen, trocknen).

Mit geruchsintensiven und giftigen Chemikalien unter dem Abzug arbeiten! Dort auch starke

Säuren und Laugen aufbewahren. Etliche Nährbodenmaterialen (z. B. Difco-Präparate) sind

stark hygroskopisch. Die Gefäße sind deshalb nach Gebrauch fest zu verschließen.

Geräte: Bitte bedienen Sie kein Gerät ohne vorherige Einweisung.

1. Waagen: Das zu wiegende Material in einem Gefäß oder auf einem Stück Pergamentpapier

auf den Waagenteller bringen, dann erst Arretierung lösen. Nach Benutzung die Waage und

insbesondere die Waagenteller reinigen und die Waage ausstellen.

2. Zentrifugen: Die Lagerung der Zentrifugenköpfe wird beschädigt und die Zentrifuge wird

unbrauchbar, wenn die eingebrachten Becher (ggf. inklusive etwaiger Einsätze) nicht austariert

7

sind (Waage benutzen). Eventuell übergelaufene Flüssigkeit sofort nach Benutzung der

Zentrifuge auswischen.

3. Photometer: 30 Minuten vor Beginn der Messung einschalten. Nachdem ausgeschaltet

wurde, erst wieder einschalten, wenn das Gerät abgekühlt ist, sonst ist der Verschleiß der

Lampen zu groß. Küvettenhalter sauber halten.

4. Sterilisation der Medien: Alle zur Kultivierung der Bakterien verwendeten Medien müssen

vor dem Gebrauch sterilisiert werden. Die allgemein übliche Sterilisationsmethode ist das

Autoklavieren. Hierzu werden die Medienbestandteile (ohne Agar) zunächst in deionisiertem

Wasser gelöst und der pH-Wert eingestellt. Bei Festmedien wird zuletzt der Agar zugegeben,

da dieser sich erst bei 100 °C löst. Anschließend erfolgt die Sterilisation im Autoklaven. Hier

wird das Medium für 20 Minuten in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre bei einem

Druck von 1,0 bar und einer Temperatur von 121 °C sterilisiert. Nicht autoklavierbare

Lösungen, wie z. B. Zucker-, Vitamin- oder Antibiotikum-Lösungen, werden mit speziellen

Filtern sterilfiltriert.

5. Sterilisation der Arbeitsplätze: Tischplatten (speziell vor dem Gießen von Agarplatten)

werden mit 70%igem Spiritus oder vergälltem Alkohol gereinigt. Impfösen und Impfnadeln

werden in der Bunsenbrennerflamme ausgeglüht, die Ränder steriler Glasgefäße werden nach

dem Entfernen und vor dem Wiederaufsetzen der Aluminiumdeckel abgeflammt.

6. Biologische Sicherheit Alle kontaminierten Flüssigkeiten (Bakterienkulturen,

Zentrifugenüberstände, usw.) werden in gekennzeichneten Behältern gesammelt und

autoklaviert. Kontaminiertes Einwegmaterial (Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen, Kanülen,

usw.) sowie Plattenmüll wird in autoklavierbaren Müllbeuteln gesammelt. Für gebrauchte

Glaspipetten steht an jedem Arbeitsplatz ein spezieller Behälter. Achten sie darauf, dass dieser

mit Desinfektionslösung gefüllt ist.

8

VERSUCHE

VERSUCH 1:

KLONIERUNG UND HETEROLOGE EXPRESSION einer Typ III PKS aus

Saccharopolyspora erythraea in S. albus

Das Gen rppA kodiert für eine Typ III Polyketidsynthase und wurde erstmals in

Streptomyces griseus untersucht (Ueda et al 1995), wo es an der Melaninproduktion beteiligt

ist. RppA wandelt fünf Malonyl-CoA Moleküle in 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalen um, das

dann spontan mit dem Luftsauerstoff zu Flaviolin, einem dunkelroten Chinon, oxidiert. Diese

Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um rppA als Reportergen zu verwenden. Die Detektion

der Aktivität des RppA Reporterproteins erfolgt über die Messung des Flaviolins. Dieses ist

löslich, wird aus der Zelle transportiert und kann durch spektrophotometrische Messung des

Kulturüberstandes schnell quantifiziert werden (Magdevska et al 2010). Der im Chromosom

von Saccharopolyspora erythraea identifizierte PAL-codierende Genbereich (rppA) soll in

diesem Praktikumsversuch über PCR amplifiziert und in den pSET152-Vektor ligiert werden.

Schematische Darstellung der Reaktionen zur Bildung von Flaviolin.

Das dabei erhaltene Plasmid soll nun über triparentale Konjugation in den heterologen

Wirtsorganismus S. albus transformiert werden. Die dabei erhaltenen Mutanten werden

anschließend auf die Produktion des Biosyntheseproduktes Flaviolin analysiert[5]. Hierzu

werden die Mutanten sowie S. albus Wildtyp, der das Flaviolin-Biosynthesegen nicht enthält,

kultiviert, extrahiert und die Extrakte anschließend phänotypisch verglichen (Rotfärbung bei

Flaviolinproduktion!).

Schematische Darstellung der pSET152-Vektor:

int – Integrase, oriT – origin of transfer, aac(3)IV –

Apramycinresistenz Gen, ori pUC18 – origin of

replication in E.coli, lacZα –Ein Fragment des beta-

Galaktosidasegens.

9

Versuchsablauf:

PCR Amplifizierung des PAL-codierenden Genbereichs

aus dem Chromosom von Saccharopolyspora

erythraea

Agarosegelelektrophorese & Gelelution des ~1.5 kb großen PCR-Produktes mit dem NucleoSpin® Extract 2 Kit (Macherey-Nagel)

EcoRV Restriktion - des aufgereinigten PCR-Produktes

(anschließend Hitzeinaktivierung der Enzyme) - des pSET152-Vektors (anschließend

Aufreinigung aus dem Gel)

Ligation des EcoRV geschnittenen PCR-Produktes in den

EcoRV geschnittenen pSET152-Vektor

Elektroporation des Ligationsansatzes in E. coli DH10B

(„Blau-Weiß-Selektion“)

Übernachtkulturen einzelner Transformanten animpfen

1,5 ml Übernachtkultur zentrifugieren

Zellen: Isolierung der Plasmid-DNA

EcoRV Restriktion & Gelelektrophorese

triparentale Konjugation in den heterologen

Wirtsorganismus S. albus

10

1.1. Amplifizierung von DNA Fragmenten aus genomischer DNA mittels PCR

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein in vitro-Verfahren zur selektiven Anreicherung

von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz. Man lässt die

Nukleinsäure mit einem Überschuss von zwei chemisch synthetisierten Oligonukleotiden

(Primer), die aus den Randbereichen der zu amplifizierenden Sequenz stammen und

strangspezifisch sind, reagieren. Bei Wiederholung der Reaktionsfolge aus DNA-

Denaturierung, Anlagerung der Primer und Auffüllreaktion mit Hilfe einer hitzestabilen

DNA-Polymerase kommt es unter geeigneten Bedingungen zur exponentiellen, selektiven

Amplifizierung der DNA-Fragmente.

Für die folgende Klonierung wurden die Primer so modifiziert, dass sie künstliche

Schnittstellen enthalten, die nicht in dem eigentlich zu amplifizierenden DNA Abschnitt

vorkommen. Im fertigen PCR-Produkt sind diese Schnittstellen dann vorhanden und können

entsprechend genutzt werden.

Jede Gruppe pipettiert 2 PCR-Ansätze, wobei sich diese nur in ihrer template-DNA

unterscheiden. Der eine Ansatz enthält genomische DNA aus Saccharopolyspora erythraea,

der zweite Ansatz Kontroll-DNA.

Das Pipettieren eines PCR-Ansatzes (Gesamtvolumen 25 µL) sollte immer auf Eis geschehen,

wobei die Polymerase als letztes hinzugegeben wird. Auch sollten die einzelnen Bestandteile

der PCR (außer das DMSO) bis zu ihrer Verwendung auf Eis gelagert werden.

Pipettierschema:

PCR-Ansatz (25 µl)

µl je Ansatz

template DNA 0,5

Primer I (5 pmol/µL) 2,5

Primer II (5 pmol/µL) 2,5

dNTPs 4

5x HF-Puffer 5

DMSO 1,25

Wasser 8,95

Phusion Polymerase 0,3

Nach Zusammenpipetttieren den PCR-Ansatz nochmals gut durchmischen.

11

PCR-Programm:

Initiale Denaturierung 98°C 3 min Denaturierung

98°C 15 sek

Anlagerung der Primer 58°C 20 sek 30x

Verlängerung der Primer 72°C 60 sek

Abschließende Verlängerung 72°C 10 min

1.2. Agarosegelektrophorese

Da Nukleinsäuren aufgrund ihres Zucker-Phosphat-Rückgrats bei allen pH-Werten negativ

geladen sind, wandern sie im elektrischen Feld proportional zu ihrem Molekulargewicht in

Richtung Anode. Diese Eigenschaft wird bei der Elektrophorese genutzt um DNA-Fragmente

nach ihrer Größe oder Konformation zu trennen. Konformationsunterschiede treten nur bei

ringförmigen DNA-Molekülen auf und man unterscheidet zwischen den Konformationen

coiled, supercoiled und relaxed.

Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten wird eine elektrisch neutrale, feste Gelmatrix aus

Agarose verwendet. Die Agarosekonzentration wird je nach gewünschter Auftrennungsgröße

variiert. Will man eher kleine Fragmente optimal auftrennen werden höhere

Agarosekonzentrationen verwendet, bei größeren Fragmenten niedrigere Konzentrationen. In

den meisten Fällen wird mit einer Agarose-konzentration von 1 % gearbeitet.

Die Detektion der getrennten DNA-Fragmente erfolgt mit Hilfe des Farbstoffes

Ethidiumbromid (KREBSERREGEND!!!), der sich in die Doppelhelix der DNA interkaliert.

Wird nun mit UV-Licht bestrahlt, fluoresziert der Farbstoff und die DNA-Banden werden

sichtbar.

Die Agarose-Gelelektrophorese kommt sowohl bei der

analytischen Auftrennung, als auch bei der präparativen

Isolierung von DNA-Fragmenten zum Einsatz. Für die im

Praktikum durchgeführten Elektrophoresen wird Tris-Acetat

(TAE) Puffer verwendet. Die Abbildung zeigt den 1 kb DNA-

Marker von Fermentas.

[bp]

12

Herstellung eines 1 % Agarosegels

1 g Agarose in 100 ml 1x TAE-Puffer durch Erhitzen vollständig lösen, 3 µl Ethidiumbromid

zufügen und in eine horizontale Gelelektrophoresekammer gießen. Entsprechenden Kamm in

das noch flüssige Gel stecken. Nach der Polymerisation das Gel horizontal in die mit 1x TAE

gefüllte Gelelektrophoreseapparatur legen. Die DNA-Proben mit 1/6 Volumen 6x DNA-

Probenpuffer versetzen und in die Geltaschen pipettieren.

Die DNA bei einer Spannung von 80 V (bzw. 120V bei großen Gelen) auftrennen. Nach dem

Lauf werden die aufgetrennten Nukleinsäuren unter UV-Bestrahlung ( = 302 nm) auf einem

Transilluminator analysiert.

50x TAE

242,0 g Tris

82,0 g NaAcetat

18,6 g Eisessig

Mit Essigsäure pH 7,5 einstellen

6x DNA-Probenpuffer:

0,25 % Bromphenolblau

0,25 % Xylen Cyanol FF

15 % Ficoll

1.3. Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus dem Gel

Die Aufreinigung erfolgt mit dem Nucleospin Extract 2 Kit von Macherey und Nagel.

Durchführung:

- Ausschneiden der DNA-Bande aus dem Gel

- Zugabe von 800 µL NT-Puffer ; Inkubation bei 55 °C bis sich das Gelstückchen

vollständig gelöst hat (5-10 min)

- Laden der Flüssigkeit auf die Säule. Zentrifugieren: 1 min, 13.000 rpm

(gegebenenfalls wiederholen)

- Waschen der Säule mit 600 µL NT3-Puffer. Zentrifugieren: 1 min, 13.000 rpm

- 2 min, 13.000 rpm zentrifugieren zum Trocknen der Säule

- Elution (in ein neues Eppi!): Zugabe von 25 µL Elutionspuffer und 2 min bei Raum-

temperatur inkubieren (WICHTIG!); anschließend 2 min 13.000 rpm zentrifugieren

13

1.4. Restriktionsspaltung von DNA

DNA-Moleküle können mit Enzymen (Restriktionsendonukleasen) an spezifischen

Erkennungssequenzen in diskrete Fragmente geschnitten werden.

In der Regel werden 0,2 - 1 µg DNA pro Verdau eingesetzt. Restriktionsenzyme werden vor

Gebrauch mit Enzymverdünnungspuffer auf eine geeignete Aktivitätskonzentration (1Unit/µl)

verdünnt. Die Einheit Unit bezeichnet die Menge an Enzym, die notwendig ist um 1 µg DNA

in 60 min komplett zu schneiden. Die meisten Enzyme benötigen sehr spezifische

Bedingungen (Temperatur, Puffer) um effizient schneiden zu können. Sind die Bedingungen

für ein Enzym nicht optimal gewählt, können unspezifische Spaltungen auftreten.

Restriktionsansatz (20µL):

0,2- 1 µg DNA in TE-Puffer oder H2O

1 µL je (gegebenenfalls verdünntes) Restriktionsenzym (2-4 u)

2 µL 10-fach Restriktionspuffer

Ansatz wird mit Wasser auf 20 µL aufgefüllt.

Die für diesen Versuch verwendeten Enzyme heißen EcoRV.

Der Reaktionsansatz wird für 1-2 h oder über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Die Inaktivierung der Enzyme erfolgt bei 80 °C für 30 min.

Die Restriktionsansätze werden in einem Agarosegel aufgetrennt und aus dem Gel

aufgereinigt.

1.5. Ligation von DNA-Fragmenten

Ligase ist ein Enzym, das in der Molekularbiologie genutzt wird um zwei fremde DNA-

Stränge miteinander zu verbinden. In unserem Fall soll das PCR-Produkt mit dem zuvor

verdauten Plasmid pSET152 ligiert werden.

Restriktionsfragmente, die durch die Ligasereaktion miteinander verknüpft werden sollen,

werden nach Restriktion der DNA und Inaktivierung der Restriktions-endonukleasen in einem

geeigneten Verhältnis miteinander gemischt. Das molare Verhältnis von Insert-DNA zu

Vektor-DNA sollte etwa 3:1 betragen. Für die Effizienz von Ligasereaktionen, bei der

verschiedene DNA-Moleküle miteinander verknüpft werden sollen, ist es wichtig, hohe DNA-

Konzentrationen vor allem vom PCR-Produkt einzusetzen.

14

Ligationsansatz (10µL)

1 µl Vektor-DNA

7 µl Insert-DNA

1 µl 10fach T4 DNA-Ligase Puffer

1 µl T4 DNA-Ligase

Über Nacht bei 16°C inkubieren.

1.6. Elektroporation

Die meisten Bakterien, darunter auch E. coli, nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur

in begrenztem Umfang auf. Um diese Bakterien wirksam mit DNA transformieren zu können

müssen die Zellen zunächst physikalisch und/oder chemisch behandeln werden. Dadurch wird

ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen. Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen

haben, bezeichnet man als kompetent.

1.6.1. Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen

- 1,4 ml LB-Medium in Eppendorfgefäß

- mit 20 µl E. coli Übernachtkultur animpfen (mit einer sterilen Kanüle durchlöchern)

- in einem Thermomixer bei 37 °C ca. 2 h inkubieren (bis OD600 = 0,4)

- Zellen 30 sek bei 13.000 rpm in Eppendorfzentrifuge zentrifugieren

- Überstand abgießen

- Pellet mit 1 ml eiskaltem H2O resuspendieren

- Dieser Waschschritt 1 x wiederholen

- Das Pellet mit H2O (ca. 50 µl) resuspendieren

- Alle Schritte auf Eis durchführen

Elektroporationsansatz:

- 50 µl komp. Zellen + 2 µl Ligationsansatz

- in eine 1 mm-Elektroporationsküvette überführen

- Küvette mit einem Papiertuch abtrocknen

- Küvette in Pulskammer stellen

Elektroporationsbedingungen (1 mm Küvette):

Spannung 1800 V

Kapazität 25 µF

Wiederstand 200 Ω

15

Nach Elektroporation 1 ml LB-Medium zugeben und 1 h bei 37 °C inkubieren;

ausplattieren auf Antibiotika-haltigem Selektivmedium (Amp 100 µg/ml) + X-Gal.

LB-Medium (pH 7)

10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl

H2O ad 1 Liter

Agar: 1,5 %

1.7. Animpfen der positiven Klone in 1.5 ml Eppies mit Antibiotikum

Jede Gruppe impft 2 „weiße“, 1 „blauen“ (Negativkontrolle) sowie 1 Klon von der

Positivkontrolle (pSET152 mit bereits kloniertem rppA-Gen, wird vom Betreuer zur

Verfügung gestellt) in 2 ml LB Amp (LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin) an.

1.8. Klonanalyse

1.8.1. Isolierung von Plasmid-DNA

DNA kann leicht aus prokaryotischen Zellen isoliert werden. Dazu wird in den meisten

Fällen die alkalische Lyse verwendet. Durch die Zugabe von NaOH zum Zellextrakt wird der

pH-Wert weit ins Alkalische verschoben. Dadurch lösen sich die

Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären DNA-Strängen sowohl der

chromosomalen als auch der Plasmid-DNA, wobei die Plasmid-DNA aufgrund ihrer

Konformation in der Lage ist, vollständig zu renaturieren. Die chromosomale DNA, die durch

die einzelnen Präparationsschritte zerstückelt wurde, kann nach Neutralisation des pH-Wertes

mit Kaliumacetat und Eisessig nicht renaturieren, es bilden sich DNA-Doppelstränge mit nur

kurzen komplementären Bereichen und durch die ungerichtete Verbindung vieler DNA-

Einzelstränge kommt es zur Ausbildung einer verworrenen DNA-Masse. Diese kann relativ

leicht zusammen mit dem durch die Neutralisation ausgefallenem Kalium-SDS

abzentrifugiert werden. Bei diesem Zentrifugationsschritt setzen sich ferner Zellmembran-

und Zellwand-Bestandteile sowie Proteine als Pellet ab. Die Plasmid-DNA befindet sich nach

der Zentrifugation im Überstand und wird im letzten Schritt mit Isopropanol gefällt.

Protokoll:

16

- 1,5 ml E. coli-Übernachtkultur abzentrifugieren (1 min bei 13.000 rpm)

- in 250 µl P1-Puffer resuspendieren

- 250 µl Puffer P2 hinzufügen, Eppi 10x invertieren, bis Zellsupension klarer wird

- 250 µl Puffer P3 hinzufügen, sofort 15x invertieren

- 5 min bei 13.000 rpm zentrifugieren

- Überstand in neues Eppendorfgefäß überführen,

in dem bereits 600 µl Isopropanol vorgelegt wurden

- durch Invertieren mischen bis keine Schlieren mehr sichtbar sind

- 10 min bei 13.000 rpm zentrifugieren

- Überstand quantitativ entfernen

- 700 µl 70 % Ethanol hinzufügen, mischen

- 5 min bei 13.000 rpm zentrifugieren

- Überstand quantitativ entfernen (pipettieren)

- DNA-Pellet trocknen (10 min bei 37 °C auf Thermomixer) und in 30 µl bidest. H2O

resuspendieren

P1 P2 P3

50 mM Tris-HCl, pH 8,0 200 mM NaOH 3M KAcetat, pH 5,5

10 mM EDTA 1 % SDS WICHTIG: pH mit

100 µg/ml RNase A Eisessig einstellen

1.9.2. Plasmidverdau und Kontrollgel

Um die richtigen Klone zu verifizieren, wird ein Restriktionsverdau mit EcoRV durchgeführt

und anschließend auf einem Kontrollgel überprüft. Da in diesem Fall vier Plasmide

gleichzeitig verdaut werden, wird ein so genannter Mastermix hergestellt. In einem

Mastermix werden die Komponenten Puffer, Enzyme und Wasser für alle 4 Verdaue

zusammenpipettiert und anschließend auf die Eppis mit der vorgelegten Plasmid-DNA

verteilt.

1.9.4. Konjugation in S. albus – Triparentales Mating

Durchführung:

1. Je 1 ml Übernachtkultur (LB mit entsprechendem Antibiotikum) des Donors E. coli

GB2005/pSETP21RppA (AmR), des Helfers E. coli pUB307 (KanR) in ein Eppi

überführen und abzentrifugieren (RT, 9.300 rpm, 3 min).

17

- Eine Sporensuspension des S. albus J1074 Rezipienten (Akezptors) vorbereiten. 6 ml

LB-Media auf die Platte geben und Sporen mit der Impföse abkratzen. 1 ml der

Sporen in 1,5-ml- Eppis sammeln. Sporen schocken bei 42°C für 10 Minuten.

Zentrifugieren, 3 min, 9.300 rpm)

- Zellen jeweils in 300 µl LB (ohne Antibiotikum!) resuspendieren

- Pro Konjugation: der Suspension des Donors, Helfers und Rezipienten in die Mitte

einer MS-Platte (ohne Antibiotikum!) tropfen, mischen und trocknen lassen

- Platten für 8 Stunden bei 28C° inkubieren.

- Nach 8 Stunden 1ml steriles Wasser, welches 2mg Apramycin und 2mg

Phosphomycin enthält, auf die Platten geben. Alles für 3-4 Tage bei 28°C inkubieren

bis die Kolonien sichtbar sind.

- Ein paar Kolonien auf frische MS-Medien, die mit Apramycin (100μg/ml) und

Phosphomycin (100μg/ml) angereichert, ausplattieren.

1.9.5. Kontrolle der phänotypischen Expression von Flaviolin

2. Ein Klon vom S. albus J1074, die pSETP21RppA plasmid enthalten, in 100ml-Kolben

mit 50ml TSB- Medium animpfen. Als Negativ-Kontrolle ein Kolben mit S. albus

J1074 animpfen und bei 28°C im für 2 Tage ON wachsen lassen.

3. 2ml jeder Kultur in 2ml-Eppis für weitere DNA- Isolierung sammeln. Für 3 Minuten

bei 14000rpm abzentrifugieren.

4. War die heterologe Expression erfolgreich kann man bei den Mutanten eine rot/orange

Färbung sehen in TSB, der Wildtyp in TSB weist keine Färbung auf.

Kontrollfragen:

1. Wie berechnet man die Härtetemperatur von Primer, die für PCR genutzt

werden?

18

VERSUCH 2

2. TRANSPOSON MUTAGENESE IN STREPTOMYCES ALBUS J1074

Streptomyceten gehören zu den Bodenbakterien und sind bekannt für ihre Fähigkeit,

zahlreiche biologisch aktive Verbindungen zu produzieren. Diese Naturstoffe beinhalten unter

anderen Antibiotika, Insektizide, Herbizide und Immunmodulatoren. Einige Streptomyceten

Stämme wie S. coelicolor, S. lividans, S. venezuaele, S avermitilis und S. albus gelten als

klassische oder Muster-Stämme. S. coelicolor nimmt unter diesen Musterstämmen eine

gesonderte Rolle ein, da mit ihm das gesamte Feld der Streptomycetengenetik seinen

Ursprung genommen hat. S. albus besitzt das kleinste Genom von allen bisher untersuchten

Streptomyceten und wird deshalb oft als heterologer Wirt zur Expression von Genen zur

Antibiotikaproduktion anderer Aktinomyceten verwendet.

Die Sequenzierung des S. albus Genoms zeigte die Präsenz von 22 Genclustern für die

Sekundärstoffproduktion. Die meisten dieser Cluster sind unter normalen Laborbedingungen

nicht aktiv und ihre Produkte sind nicht bekannt. Einige dieser Cluster konnten kürzlich durch

Manipulation der Promotoren der verantwortlichen Gene oder durch Veränderung der

Wachstumsbedingungen aktiviert werden, und deren Produkte wurden identifiziert. Jedoch

bleibt der Großteil dieser Cluster weiterhin inaktiv.

Um diese stillen Gencluster zu aktivieren, können verschiedene Strategien angewandt werden.

Angefangen bei den Nährstoffen und allgemeinen Wachstumsbedingungen bis hin zur

Überexpression bestimmter regulatorischer Gene [1].

Die Transposonmutagenese wir zu einem immer leistungsfähigerem Werkzeug, um die Gene,

der Sekundärstoffproduktion und morphologischen Differenzierung in Streptomyceten zu

identifizieren. Das Transposon-System besteht in der Regel aus einem Vektor, der das

Transposase-Gen und das transposable Element trägt [2]. Das transposable Element wird von

Sequenzwiederholungen flankiert, welche von der Transposase erkannt, ausgeschnitten und in

das Genom des Zielstammes inseriert werden. Das so freie transposable Element kann wie im

Falle der Tn5 Transposase zufällig ins Genom inseriert werden und schaltet Gene in die es

inseriert wurde aus. Das transposable Element trägt oft verschiedene Elemente, wie z.B.

Replikationsursprung oder Resistenzmarker, um die Selektion der Mutanten, das Klonen und

die Identifikation der gezielten Gene zu vereinfachen. Ein wichtiges Merkmal des benutzten

Vektors ist die Fähigkeit sich ihm möglichst einfach wieder zu entledigen. Deshalb werden in

den meisten Fällen Plasmid-Vektoren mit einem temperaturempfindlichen Replikon oder

Suizidvektoren verwendet, um das Transposon-System in den Empfängerstamm zu inserieren.

19

In diesem Versuch verwenden wir das Transposon-System pAHT, welches auf einem

Suizidvektor basiert. Das Tranposase-Gen in diesem Konstrukt wurde unter den konstitutiven

Promoter des φC31 Integrase-Gens geklont und benötigt daher keine zusätzlichen Faktoren

zur Induktion der Transposase oder zur Entfernung des Plasmids aus dem Genom. Die

erhaltenen Exconjuganten enthalten dann eine Kopie des Transposons, welche in das Genom

integriert wurde. Dennoch ist die Zeit zwischen dem Moment in dem das Plasmid in die S.

albus Zelle gebracht und eliminiert wird, nicht ausreichend um eine beachtliche Anzahl an

Mutanten zu erzeugen. Man erhält für gewöhnlich nur ein Duzend Kolonien pro Platte nach

der Konjugation mit pAHT.

Jedes Mutagenese Projekt beinhaltet eine Screening Strategie, welche zur Identifikation der

Mutanten dient. Verschiedene Ziele erfordern verschiedene Strategien für das Screening. Um

Gene zu identifizieren, die die morphologische Differenzierung beeinflussen, werden

Kolonien einfach nach dem gewünschten Phänotyp selektiert. Bei Mutanten mit veränderter

Antibiotikaproduktion ist eine phenotypische Selektion nicht immer möglich. Hierbei ist ein

sekundäres Screening notwendig. Die Nutzung von Reporter Systemen ist eine der besten

Lösungen die eine direkte Identifikation der gewünschten Mutanten ermöglicht. Um ein

bestimmtes Cluster zu untersuchen kann der Promoter dieses Clusters vor das Reporter

System kloniert werden, was eine einfache Detektion und Quantifizierung des Genprodukts

ermöglicht. Für den Gebrauch in Streptomyceten wurden viele verschiedene Reporter

Systeme entwickelt oder angepasst [1]. Eines der neuesten und auch verlässlichsten

Reportersysteme, welches auch einfach Nachzuweisen ist, basiert auf dem gusA Gen welches

für die β-glucuronidase codiert [3]. Seine Aktivität kann auf verschieden Arten ermittelt

werden, da die β-glucuronidase ein weites Spektrum an gewerblich erhältlichen Substraten

akzeptiert.

In diesen Teil des Praktikums, wurde der Promoter des Polyketide-Synthase-Gens eines

unbekannten polyketide Biosynthesis-Gencluster von S. albus sal2P2 vor das gusA Gen

geklont und in S. albus J1074 gebracht, was zu S. albus SAI2P2-gusA führte. Die Aktivität

des Promoters kann durch einen β-Glucuronidase-Test ermittelt werden. Die Insertion des

Transposons in diesen Stamm führt zur Entstehung von Insertions-Mutanten. Sollten einige

dieser Mutationen die Expression des sal2P2-gusA-Konstrukts beeinflussen, wird es durch

zunehmende oder abnehmende Aktivitäten der β-glucuronidase ermittelt.

Überblick:

- Konjugation von Streptomyces albus Sal2P2-gusA und E. coli WM60265 (pAHT)

20

- Überschichten der Tanskonjuganten mit X-gluc Lösung

- Selektion und Picken der Klone, die am meisten und am wenigsten Aktivität zeigten, auf

eine frische MS-Platte und Inokulation in NL19 Flüssigmedium

- Messung der GusA-Aktivität in Kultur-Lysaten in vitro

- Extraktion der Sekundärstoffe und TLC-Analyse

- Identification des Transposon-Insertions-Orts

2.1 Konjugation von Streptomyces albus Sal2P2-gusA und E. coli WM60265

Materialien: LB Flüssig-Medium, MS Agar-Platten, 1.5 sterile Eppis, sterile 1ml-Spitzen, S.

albus Sal2P2-gusA und E. coli WM6026 (pAHT) ON-Stämme, Antibiotika Lösungen

Hygromycin (50mg/ml) und Phosphomycin (100mg/ml).

Protokoll:

1. Bereite eine Sporensuspension von S. albus Sal2P2-gusA vor: 6 ml LB-Medium auf die

Platte geben und Sporen mit der Impföse abkratzen. 1 ml der Sporen in 1,5-ml-Eppis

sammeln. Sporen schocken bei 42°C für 10 Minuten.

2. Spender-Stamm vorbereiten: 6ml LB-Medien auf die Platte mit der E. coli MW6026

(pAHT)-Kultur geben, Zellen mit der Impföse abkratzen und in 1,5ml Eppis füllen.

3. Die Eppis der Spender- und Empfängerzellen abzentrifugieren, Überstand verwerfen,

Zellen im letzten Tropfen LB-Medium resuspendieren. Spender- und Empfängerzellen

vermischen und die Mixtur auf zwei trockenen MS-Platten ausplattieren. Platten für 8

Stunden im Brutschrank bei 28°C inkubieren.

4. Nach 8 Stunden 1ml steriles Wasser, welches 2mg Hygromycin und 2mg Phosphomycin

enhält, auf die Platten geben. Alles für 3 Tage bei 28°C inkubieren, bis Kolonien sichtbar

sind.

2.2. Analyse der GusA Aktivität bei Tn Mutanten von S. albus Sal2P2-gusA Himar1

1. 1mM Lösung von 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-gluc) in Wasser

vorbereiten, indem 250mM DMSO Stammlösung von X-gluc mit sterilem Wasser verdünnt

wird.

2. Die Platten der erhaltenen Transkonjuganten mit 1ml der vorbereiteten X-gluc-Lösung

Überschichten.

3. Platten bei 28°C für eine Stunde inkubieren.

4. Das Auftreten blauer Farbe, die Intensität und Größe der Zonen beobachten.

21

3 Analyse der GusA Aktivität in vitro

1. Drei Transkonjuganten-Kolonien und eine Kolonie des Ursprungs-Stamms S. albus

Sal2_2 gusA in 25ml NL19-Medium in 250ml Kolben animpfen. Bei 28°C für 3 Tage im

Schüttler inkubieren.

2. 1ml jeder Kultur abnehmen, das Myzel durch abzentrifugieren ernten, einmal mit

destilliertem Wasser waschen und in 0,5ml Lyse-Puffer (50 mM Phosphat-Puffer [pH 7.0], 5

mM Dithiothreitol [DTT], 0.1% Triton X-100, 1 mg/ml lysozyme) resuspendieren.

3. 0,5ml des Lysats sammeln und 5 μl 0.2 M p-nitrophenyl-β-D-glucuronide hinzufügen, bei

37°C für 20 Minuten inkubieren und die optische Dichte bei 415nm (OD415) messen. Als

Referenz sollte der Lysat-Puffer verwendet werden.

4. 1ml jeder Kultur in ein 1,5ml Eppi geben, 3 Minuten bei 12,000 rpm ab zentrifugieren,

Überstand verwerfen und die Biomasse wiegen.

5. Die GusA Aktivität der verschiedenen Klone, durch Normalisierung des Gewichts der

Biomasse, vergleichen.

2.4 Extraktion von Metaboliten der Tn-Mutanten

1. 1 ml der aktivsten Kultur in ein 1,5 ml Eppi geben, bei 14000 rpm für 3 Minuten

abzentrifugieren, Überstand verwerfen und bei -20°C lagern

2. die übrigen Kulturen in 50ml Falcons übertragen

3. 15 ml Ethyl-Acetat hinzufügen, im Inkubator bei RT Schütteln und für 60 Minuten

inkubieren

4. Die Falcons bei 4000 rpm für 10 Minuten zentrifugieren. Die obere organische Phase mit

einer Pasteur-Pipette abnehmen und im Rotationsverdampfer bis zur Trockene einengen

5. Die Extrakte in 100 μl MeOH resuspendieren. Die Proben werden mit TLS und HPLC

analysiert.

2.5 Klonen der Tn insertions loci. Miniprep der Chromosomal-DNA der Mutantstämme

1. Die Biomasse der aktivsten Stämme in DNA-Lyse-Puffer resuspendieren (20 mM Tris

HCl pH 7.2, 20 mM EDTA, Lysozym 1 mg/ml)

2. Bei 37 °C für 30 Minuten inkubieren. In dieser Zeit den Heizblock auf 65° vorheizen

3. 50 μl 5M NaCI hinzufügen, die Eppis durch Invertieren schonend mischen, 120 μl einer

10% SDS-Lösung hinzufügen und bei 65°C für 15 Minuten inkubieren.

4. 240 μl 5M KAc-Lösung hinzufügen, die Eppis durch Invertieren schonend mischen und

15 Minuten auf Eis inkubieren

22

5. Das Präzipitat bei 14000 rpm für 10 Minuten bei 4°C abzentrifugieren. Überstand in ein

neues Eppi geben.

6. 600 μl Isopropanol hinzufügen, durch Invertieren mischen, bei RT für 10 Minuten

inkubieren und die DNA bei 14000 rpm für 10 Min bei 4°C abzentrifugieren

7. Überstand verwerfen und DNA mit 700μl 70% Ethanol waschen. Die DNA bei 14000

rpm für 10 Minuten bei 4°C abzentrifugieren. Überstand verwerfen, für 30 Sekunden

abzentrifugieren und den letzten Rest EtOH mit einer Pipette abnehmen.

8. DNA bei RT für 5 Minuten trocknen und in 33 μl MQ Wasser lösen

2.6 Verdau von Chromosomal-DNA mit Sacll

1. 4 μl Enzyme-Puffer und 3 μl Sacll zur DNA-Probe hinzugeben

2. ON bei 37°C inkubieren

3. 30 μl 5M NaAc, 300 μl H2O und 400 μl Isopropanol hinzufügen. Bei 14000 rpm für 10

Minuten bei 4°C abzentrifugieren, den Überstand verwerfen und die DNA mit 70% Ethanol

waschen. Bei RT trocknen und mit 20μl Wasser resuspendieren.

4. Das Ligationsgemisch mit 1 μl T4 DNA Ligasepuffer, 8 μl Sacll verdauter DNA und 1

μl T4 DNA-Ligase mischen. Durch Pipettieren mischen und bei 16 °C für 2 Stunden

inkubieren.

2.7 Transformation von E. coli Transformax (λpir)

1. Elektrokompetente E. coli Transformax (λpir) Zellen wie in Punkt 1.6 beschrieben

vorbereiten.

2. Elektroporation der Zellen mit 2 μl des Ligationsgemischs.

3. Die Transformanten auf LB mit Hygromycin (100 μg/ml) ausplattieren.

4. Die Platten ON bei 37°C inkubieren.

2.8 Isolierung und Sequenzierung der Plasmide

1. 2 Transformanten (E. coli Kolonien nach der Transformation) in 5 ml LB-Medium,

welches Hygromycin (100 µg/ml) enthält, innokulieren und ON bei 3 °C inkubieren.

2. pDNA wie unten beschrieben aufreinigen

3. pDNA wie unten beschrieben mit Sacll verdauen

4. 5μl von jedem Plasmid mit 5μl des 5pmol/μl sequenzier Primers TNseq mischen.

5. Die Eppis mit den LightRun Sequenzierungs Labeln kennzeichnen

23

DC- und HPLC-Analytik

Bei der Dünnschichtchromatographie handelt es sich um eine einfache Analysentechnik, die

ohne großen apparativen Aufwand auskommt. Es können sowohl unpolare als auch polare

Substanzen analysiert werden. Man verwendet abhängig von der zu untersuchenden Substanz

polare Phasen mit unpolaren Laufmitteln (Kieselgel mit organischen Lösungsmitteln) oder

unpolare Phasen mit polaren Laufmitteln (RP-Kieselgel mit wässrigen mobilen Phasen).

Meist wird diese Technik analytisch als „Vorab-Info“ verwendet, sie kann aber auch zur

präparativen Aufreinigung benutzt werden. Die zu untersuchende Substanz oder der Extrakt

wird in einem Lösungsmittel gelöst und mittels einer Tüpfelkapillare auf die DC-Platte

aufgebracht. Diese wird dann in einem passenden Laufmittelsystem in der DC-Kammer

entwickelt und die einzelnen Zonen durch UV-Absorbtion, Fluoreszens, und/oder chemische

Reaktionen mittels spezifischer Färbereagenzien sichtbar gemacht. Alternativ kann auch ein

Bioassay zur antibiotischen Aktivität durchgeführt werden.

Eine Erweiterung der DC stellt die HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dar,

die zwar einen größeren apparativen Aufwand bedeutet, jedoch auch exaktere Ergebnisse

liefert. Aufgrund der höheren Trennleistung (theoretische Bodenzahl) der HPLC gelingt es

hier auch Substanzen voneinander zu trennen, die per DC nur schwer getrennt werden

können. Desweiteren kann durch die Verwendung von Gradientenmischungen als

Laufmittelsysteme die Trenndauer deutlich verkürzt werden, während gleichzeitig die

Trennleistung für spät eluierende Analyte verbessert wird. Die HPLC kann außerdem noch

mit zahlreichen Detektoren gekoppelt werden, von denen hier nur die Massenspektrometrie

und UV-Spektroskopie genannt werden soll. Da auch Mehrfach-Kopplungen (HPLC-UV-

MS) möglich sind, können so im hohen Durchsatz viele Substanzen pro Trennung identifiziert

oder wenigstens teilweise charakterisiert werden.

24

VERSUCH 3

HETEROLOGE EXPRESSION NATURSTOFF-BIOSYNTHESEWEGE

Myxobakterien und Streptomycetes produzieren zahlreiche Naturstoffe, die oft eine

antibakterielle oder cytotoxische Aktivität aufweisen. Allerdings werden diese Naturstoffe

meist nur in sehr geringen Mengen hergestellt und sind daher nur bedingt industriell nutzbar.

Ziel der heterologen Expression ist es, die für die Naturstoffbiosynthese verantwortlichen

Gencluster in andere Wirtsorganismen zu überführen und somit eine Steigerung der

Produktion zu erhalten.

In diesem Praktikumsversuch sollen Naturstoffbiosynthesegencluster in geeignete

Wirtsorganismen transformiert werden und die erzeugten Mutanten anschließend genotypisch

und phänotypisch analysiert werden. In Versuch 3A soll eine Typ III Polyketidsynthase

(PKS) in S. albus und in Versuch 3B der Aranciamycin Gencluster von S. echinatus in S.

albus übertragen und heterolog exprimiert werden.

Die beiden Versuche unterscheiden sich in zwei Punkten:

1. Art der Transformation

Die Konjugation von Streptomyces albus mit E. coli der ein Cosmid mit Ara-

Gencluster beinhaltet.

2. Art des transformierten Plasmids (= Expressionskonstrukt)

Bei dem S. albus-Experiment befindet sich das Biosynthesegen (Typ III PKS) auf einem

integrativen Plasmid unter Kontrolle des indizierbaren Cumate Systems. Sollte dies nicht

vorhanden sein, ist die Expression der rppA blockiert. Unter Hinzugabe von Cumate wird die

Expression des rppA angeschaltet und Flaviolin wird produziert.

Das Aranciamycin-Gencluster wird in einen Cosmidvektor geklont, der auf ein Actinophage-

Intergrations-System basiert, welches eine Site-spezifische Integration des gesamten Clusters

in den Empängergenom-Stamm (host) erlaubt. Zusätzlich stabilisiert es das Konstrukt ohne

die antibiotische Auswahl während weiterer Experimente.

25

Versuchsdurchführung

Spenderstamm impfen

Spenderstamm impfen

Konjugation Donor: E. coli MW6026(41-

2C-06 cosmid) Akzeptor: S. albus

ÜN ohne Antibiotikaselektion inkubieren

mit Apramycinlösung überziehen

mit Apramycinlösung überziehen

Klone phänotypisch auf Flaviolinproduktion

überprüfen

Genotypische Analyse:

PCR

VERSUCH 3A VERSUCH 3B

Flaviolin Produktion analysieren mit und ohne Cumate in TSB

Einzelklone analysieren

Konjugation Donor: E. coli

pUB307(pGUSCymRppA) Akzeptor: S. albus

Positiv- und Negativ-Kontrolle (von den

Betreuern) werden mit EtAc extrahiert

Phänotypische Analyse: DC/HPLC-MS

26

VERSUCH 3A

Heterologe Expression einer stillen Typ III PKS aus Sorangium cellulosum in

Pseudomonas putida

Zur heterologen Expression einer Typ III PKS (katalysiert die Bildung von Flaviolin) aus dem

Sacch. erythraea wurde das kodierende Gen zunächst in einen geeigneten Expressionsvektor

ligiert. Das dabei erhaltene Plasmid pGUSCymRRppA soll nun Konjugation in den

heterologen Wirtsorganismus S. albus transformiert werden. Die dabei erhaltenen Mutanten

werden anschließend auf die Produktion des Biosyntheseproduktes Flaviolin analysiert[5].

Hierzu werden die Mutanten sowie P. putida Wildtyp, der das Flaviolin-Biosynthesegen nicht

enthält, kultiviert, extrahiert und die Extrakte anschließend phänotypisch verglichen

(Rotfärbung bei Flaviolinproduktion!).

1. Cortés J(1), Velasco J, Foster G, Blackaby AP, Rudd BA, Wilkinson B. Identification and

cloning of a type III polyketide synthase required for diffusible pigment biosynthesis in

Saccharopolyspora erythraea. Mol Microbiol. 2002, 44(5):1213-24.

3A.1. Konjugation in S. albus

Durchführung:

Konjugation von S. albus J1074 mit E. coli pUB307 (pGUSCymRRppA).

1. Eine Sporensuspension von S. albus J1074 und S. albus SAM1 soll vorbereitet

werden. Dazu werden 6 ml LB-Medium auf die Platte gegeben und die Sporen mit

der Impföse abgekratzt. 1 ml der Sporensuspension wird in ein 1,5-ml- Eppis gegeben.

Die Sporen werden mit einem Hitzeschock (42°C, 10 Minuten) für die Konjugation

vorbereitet.

S-R

O

O

O

COOH

OO

S-R

O

OH

OH

COOH

O

O

OHOH

OH

O

5 Malonyl-CoA

Typ III PKS

Typ III PKS

Flaviolin

27

2. Spender-Stamm vorbereiten: 6ml LB-Medien auf die Platte mit der E. coli pUB307

(pGUSCymRRppA)-Kultur geben, Zellen mit der Impföse abkratzen und in 1,5ml

Eppis füllen.

3. Die 2 Eppis der Spenderzellen und die 2 Eppis der Empfängerzellen abzentrifugieren,

Überstand verwerfen. Zellen im letzten Tropfen LB-Medium resuspendieren. Spender-

und Empfängerzellen vermischen und die Mixtur auf zwei trockene MS-Platten

ausplattieren. Platten für 8 Stunden bei 28C° inkubieren.

4. Nach 8 Stunden 1ml steriles Wasser, welches 2mg Apramycin und 2mg

Phosphomycin enthält, auf die Platten geben. Alles für 3-4 Tage bei 28°C inkubieren

bis die Kolonien sichtbar sind.

5. Ein paar Kolonien auf frische MS-Medien, die mit Apramycin (100μg/ml) und

Phosphomycin (100μg/ml) angereichert, ausplattieren.

3.A.2 Kontrolle der phänotypischen Expression von Flaviolin

1. Ein Klon von S. albus J1074, der pGUSCymRRppA plasmid enthält, in einem 100ml-

Erlenmeyerkolben mit 50ml TSB- Medium und Cumate animpfen. Als Negativ-

Kontrolle ein Kolben mit S. albus J1074 pGUSCymRRppA+ ohne Cumate animpfen

und bei 28°C für 2 Tage wachsen lassen.

2. 2ml jeder Kultur in 2ml-Eppis für weitere DNA- Isolierung sammeln. Für 3 Minuten

bei 14000rpm abzentrifugieren.

3. War die heterologe Expression erfolgreich kann man bei den Mutanten in TSB-

Medium welches Cumate enthält eine rot/orange Färbung sehen, der Mutanten in TSB

ohne Cumate weist keine Färbung auf.

VERSUCH 3B

EXPRESSION DES ARANCIAMYCINGENCLUSTER IN S. ALBUS

Aranciamycin ist ein Anthracycline-Antibiotikum, welches aus Streptomyces enchinatus

produziert wird. Es besteht aus einem tetracyclischen aromatischen Polyketidgerüst, welches

mit L-Deoxyzucker gekoppelt ist. Antitumor Aktivitäten des Aranciamycin werden durch

seiner Inhibition der Topoisomerase II Aktivität verursacht. Wie andere Anthracycline wird es

durch Typ II (iterative) PKS, begleitet von Post-PKS Modifikationen einschließlich

Glycosylation und Acetylation, synthetisieren. Der Aranciamycin Biosynthese-Gencluster

wurde im Genom S. echinatus entdeckt und umfasst eine DNA-Region von 36 kbp in der

Länge, welches 24 offene Leserahmen beinhaltet.

28

Das Ara Gencluster wurde in ein Cosmidvektor geklont, welcher auf dem øC31

Actinophagen-Integrationssystem basiert. Dieses erlaubt eine Site-spezifische

(ortsspezifische) Integration in den Genom des Empfängerstamms (host) und eine stabile

Aufrechterhaltung des Konstrukts ohne Antibiotika-Selektion. Dieses Cosmid 41-2C-06 wird

durch eine intergenerischeKonjugation in zwei S. albus Stämme eingeführt. Das S. albus

J1074 Genom beinhaltet zwei Intergrationsloci für øC31 Actinophage. Das ursprüngliche

wird attB und das zweite pseB4 genannt. Auf diese Weise wird der „wild type“ Stamm nach

der Konjugation zwei Kopien des Cosmids enthalten. Das mutante Cosmid, ohne attB-Site

wurde erstellt, um den Einfluss auf die Gendosierung bei der Produktion von sekundären

Metaboliten zu studieren. Es wird als zweiter Host in diesem Experiment benutzt werden.

Enthaltene Klone werden durch PCR analysiert. Dafür verwendet man Primer, die

komplementär zu Glycosyltransferase (ORF21) und PKS KSα Genen (ORF11) stehen, um die

Präsenz des Clusters in den Chromosomen zu beweisen. Die Metaboliten werden extrahiert

und der Produktionslevel von Aranciamycin des S. albus wild-type Stammes und der Mutant

ohne attB-Site werden miteinander verglichen.

3.B.1 Konjugation von S. albus J1074 und SAM1 (ΔattB) mit E. coli MW6026 (41-2C-

06).

6. Eine Sporensuspension des S. albus J1074 und S. albus SAM1 vorbereiten. 6 ml LB-

Media auf die Platte geben und Sporen mit der Impföse abkratzen. 1 ml der Sporen in

1,5-ml- Eppis sammeln. Sporen schocken bei 42°C für 10 Minuten.

29

7. Spender-Stamm vorbereiten: 6ml LB-Medien auf die Platte mit der E. coli MW6026

(41-2C-06)-Kultur geben, Zellen mit der Impföse abkratzen und in 1,5ml Eppis füllen.

8. Die 2 Eppis der Spenderzellen und die 2 Eppis der Empfängerzellen abzentrifugieren,

Überstand verwerfen, Zellen im letzten Tropfen LB-Medien-Abfall resuspendieren.

Spender- und Empfängerzellen vermischen und die Mixtur auf zwei trockenen MS-

Platten ausplattieren. Platten für 8 Stunden bei 28C° inkubieren.

9. Nach 8 Stunden 1ml steriles Wasser, welches 2mg Apramycin und 2mg

Phosphomycin enthält, auf die Platten geben. Alles für 3-4 Tage bei 28°C inkubieren

bis die Kolonien sichtbar sind.

10. Ein paar Kolonien auf frische MS-Medien, die mit Apramycin (100μg/ml) und

Phosphomycin (100μg/ml) angereichert, ausplattieren.

3.B.2 Animpfen der Produktion von Kulturen und (Extraktion der Aranciamycin)

4. Ein Klon vom S. albus J1074 und ein Klon vom S. albus SAM1, die 41-2C-06

Cosmid enthalten, in 100ml-Kolben mit 10ml TSB- Medium animpfen. Als Negativ-

Kontrolle ein Kolben mit S. albus J1074 animpfen und bei 28°C im ON wachsen

lassen.

5. 1ml der Übernachtkultur in 30ml SG- Medium Animpfen. Bei 28°C für 3 Tage

wachsen lassen.

6. 1ml jeder Kultur in 2ml-Eppis für weitere DNA- Isolierung sammeln. Für 3 Minuten

bei 14000rpm abzentrifugieren. Bei -20°C aufbewahren.

7. 20ml der Kulturen in 50ml Falcon übertragen, 15ml EtAc zugeben und im RT mit

Agitation für 1 Stunde inkubieren.

8. Für 10 Minuten bei 4000rpm die Falcon abzentrifugieren, die obere organische Phase

sammeln und im Rotovap eindampfen lassen.

9. Die Extrakte in 200μl MeOH auflösen.

3.B.3 Isolierung der chromosomalen DNA von rekombinanten Stämmen

Die chromosomale DNA von den rekombinanten Stämmen und dem S. albus J1074 Stamm,

wie unter 2.5 beschrieben, isolieren

3.B.4. PCR-Analyse der rekombinanten Stämme

Die PCR unter Benutzung der chromosomalen DNA als ein Template und zwei Primern

durchführen: araGTF/R und araKSaF/R.

30

Komponenten µl je Ansatz

DNA-Template-DNA 2,0

Primer I 1,0

Primer II 1,0

dNTPs, 10 mM 1,0

10x Puffer 2,5

DMSO 0,75

Wasser 11,55

Taq polymerase 0,2

Programm:

Initiale Denaturierung +

Aktivierung der Hotstart-Taq-Polymerase 95 °C 3 Min

Denaturatierung: 95 °C 20 Sek

Anlagerung der Primer („Annealing“): 50 °C 30 Sek 30 Cyclen

: Verlängerung der Primer 72 °C 40 Sek

Beenden und Enden füllen

Abschließende Verlängerung 72°C 7 Min

Es wird ein Mastermix für 5 PCR-Reaktionen hergestellt und je 23 µl in 4 PCR Eppis

pipettiert, dann 2µl Template hinzu pipettieren (3x Mutanten, 1 x Positivkontrolle).

Die PCR Produkte durch eine Gel-Electrophoresis in 1% Agarose Gel analysieren. Die

erwarteten Größen der PCR Produkte sind 700bp.

3.B.5 Analyse der Extrakte mit TLC, HPLC und/oder LC-MS

1. 15µl der Extrakte auf Silicia TLC-Platten laden. Trocknen und die TLC Analyse im

Lösungsmittelsystem chlorophorm:methanol 9:1 laufen lassen.

2. das erhaltene Extrakt durch HPLC und/oder LC-MS trennen. 1µl des Extrakts

injizieren. Das molekulare Gewicht des Aranciamycin beträgt 544.5.

3.B.6 Papier-Platten AssayUm die bakterizide Aktivität des Aranciamycin zu testen, muss

das Papier-Platten Assay durchgeführt werden.

1. 100µl Übernacht-Kultur des Bacillus subtilis auf freshe LB-Platte ausplattieren.

2. 15µl der Extrakte auf Paperdisc laden. An der Luft für 10 Minuten trocknen.

31

3. Die Disk auf die Platten mit dem Bacillus subtilis auflegen (legen).

4. die Platten Für 8-12 Stunden bei 37°C inkubieren.

5. Die Wachstumsinhibitionszonen herausfinden, Größe berechnen und vergleichen.

Fragen zu diesem Kapitel:

1. Welche Rt-Werte haben die heterolog produzierten Substanzen?

2. Was können Sie ausgehend von UV und MS über diese oder andere Substanzen

aussagen?

32

VERSUCH 4

CHEMISCHES UND BIOLOGISCHES SCREENING AUSGEWÄHLTER

NATURSTOFFPRODUZENTEN

In diesem Versuch sollen ausgewählte Naturstoffproduzenten auf die Bildung von biologisch

aktiven Naturstoffen hin untersucht werden. Dafür sollen sowohl DC- als auch HPLC-

Analysen an diversen Stämmen durchgeführt werden. Nach Herstellung von mikrobiellen

Extrakten werden kleine Mengen dieser Extrakte zunächst auf DC-Platten entwickelt. Die

DC-Platten werden daraufhin mit einem Testkeim (hier Micrococcus luteus) überschichtet.

Nach Inkubation zeigen Hemmhöfe im Wachstum des Testkeims biologisch aktive

Substanzen an. Dabei dürfen die DC-Platten zuvor keinesfalls mit üblichen Reagentien wie

Iod oder Kaliumpermanganatlösung behandelt worden sein. Derartige Indikationsmethoden

gehen stets mit einer Zerstörung der Analysensubstanz einher.

Desweiteren wird ein Teil der Extrakte für HPLC-MS-Messungen vorbereitet und dem

Betreuer überreicht. Die Rohdaten der HPLC-MS-Messungen werden gemeinsam unter

Zuhilfenahme diverser Softwarelösungen ausgewertet.

Versuchsdurchführung (Extrakt-Herstellung und Analyse) und Auswertung erfolgt analog wie

in den Versuchen 2 und 3. Welche Stämme kultiviert werden und unter welchen Bedingungen

wird mit dem Betreuer besprochen.

Overlayassay

20 µl Übernachtkultur von Micrococcus luteus (Gram-positives Bakterium) mit 10 ml Soft-

LB Agar in 15 ml Falcons mischen und damit die entwickelte und NICHT angesprühte DC-

Platte überschichten.

Am nächsten Tag wird kontrolliert, ob auf der Platte Hemmhöfe zu sehen sind. Die Rf-Werte

der Hemmhöfe werden ausgehend vom Zentrum des Hemmhofes bestimmt und müssen im

Protokoll genannt werden. Ebenso sollte die Größe (Durchmesser) der Hemmhöfe aus dem

Protokoll ersichtlich sein.

33

VERSUCH 5

ISOLIERUNG VON CHROMOSOMALER DNA AUS STREPTOMYCES

Die chromosomale, bakterielle DNA liegt als ringförmig geschlossener Strang vor und bildet

im Komplex mit den bakteriellen Nucleoproteinen ein einziges Chromosom

(Bakterienchromosom). Auf der chromosomalen DNA sind alle Gene eines Organismus

kodiert und sie verfügt über eine dementsprechende Größe (6.8 Mbp für S. albus). Möchte

man nun mit chromosomaler DNA arbeiten, besteht die Schwierigkeit vor allem darin ein

derart gigantisches Molekül aufzureinigen ohne es allzu sehr zu beschädigen. Die schonendste

Methode ist die Chloroformextraktion. Dabei werden die Zellen zunächst aufgeschlossen. Im

Anschluss erfolgt die proteolytische Zersetzung der Zellproteine durch das Enzym Proteinase

K. Zur vollen Entfaltung der Aktivität benötigt dieses Enzym die Gegenwart von SDS

(Sodium Dodecylsulfate). Diese löst als Detergenz die Phospholipide und Protein-

komponenten der Zellmembranen. Die Behandlung mit Proteinase K dient insbesondere dem

vollständigen Aufschluss der Nucleoproteine.

Durch einen Extraktionsschritt mit Chloroform werden anschließend die Proteine von der

DNA getrennt. Chloroform denaturiert die Proteine, die nach dem Ausschütteln größtenteils

in der so genannten Interphase zwischen der wässrigen Nucleinsäure-Lösung und der

Chloroform-Phase ausfallen. Ein Teil der denaturierten Proteine liegt bereits nach dem ersten

Extraktionsschritt in der Chloroform-Phase gelöst vor. Anschließend wird die DNA mit

Isopropanol gefällt.

Protokoll:

- Zellen in 50 ml TSB-Medium

- Pro Gruppe 15 ml Kultur in einem 15 ml Falcon-Tube 10 min bei 10.000 rpm

zentrifugieren

- Pellet in 5 ml STE-Puffer resuspendieren

- 1/10 Volumen 10 % SDS und 1/10 Volumen Proteinase K zugeben und vorsichtig

mischen. Etwa 1 h bei 55 °C inkubieren, Tube gelegentlich invertieren.

- 1/3 Volumen 5 M NaCl zugeben und vorsichtig mischen.

- 1 Volumen Chloroform zugeben und 30 min drehen.

- 10 min bei 4.000 rpm zentrifugieren

34

- Die wässrige Phase (obere Phase) abnehmen und in ein frisches Tube überführen. 1

Volumen Isopropanol zugeben. Tube mehrmals invertieren und 10 min bei

Raumtemperatur inkubieren.

- 10 min bei 13.000 rpm zentrifugieren, Pellet 2 x mit 70 % Ethanol waschen und

über Nacht trocknen lassen

- Am nächsten Tag das Pellet in 500 µl TE-Puffer aufnehmen.

- 10 µl der isolierten genomischen DNA werden anschließend auf ein Kontrollgel

aufgetragen.

Genomische DNA sollte nur wenig ins Gel laufen, gescherte DNA ist als Schmier auf dem

Gel sichtbar.

STE-Puffer (pH 7,5)

75 mM NaCl

25 mM EDTA

20 mM Tris

Proteinase K

1 mg/ml in H2O

TE-Puffer (pH 8)

10 mM Tris

1 mM EDTA

35

VERSUCH 6

PROTEINANALYTIK: HETEROLOGE EXPRESSION VON TYP III PKS IN E.

COLI BL21 MIT ZELLAUFSCHLUSS, BESTIMMUNG DER

PROTEINKONZENTRATION UND SDS-PAGE

Heterolog hergestellte Proteine können aufgereinigt und so in vitro auf Funktion und Aktivität

getestet werden. In diesem Versuch soll eine Typ III PKS aus dem Myxobakterium

Sorangium cellulosum als Fusionsprotein (Nus-Tag/His-Tag) in E. coli exprimiert werden.

Für dieses Enzym ließ sich im Ursprungsstamm keine Funktion bzw. kein

Biosyntheseprodukt zuordnen. Mit einem in vitro Assay könnten sowohl die Substrattoleranz

und Produkte analysiert werden.

Die heterologe Expression von Proteinen hängt zum einen vom Expressionsvektor und zum

anderen vom Expressionswirt und den Kultivierungsbedingungen ab. Im hier durchgeführten

Versuch wurde ein Expressionsvektor gewählt, der die Löslichkeit der heterologen Proteine in

E. coli erhöht und zum anderen ihre Detektion und Aufreinigung mittel eines N-terminalen

His-Tags ermöglicht. Die Induktion der Expression erfolgte bei einer OD600 von 0,5-0,7 mit

0,1 mM IPTG. Die Ernte der Zellen erfolgt nach 24 h bei 16 °C. Diese Bedingungen sind von

Protein zu Protein unterschiedlich und müssen individuell ermittelt werden.

Der Aufschluss der Zellen erfolgt durch ebenfalls heterolog exprimiertes Lysozym, dass die

Zellwände nach einmaligem Einfrieren auflöst und so eine zusätzliche mechanische Lyse

nicht notwendig ist.

Der Bradford-Assay basiert auf der Farbveränderung des roten Coomassie Blue G Farbstoffs

zu blau bei Proteinbindung. Die Veränderung der UV-Adsorption wird im Photometer

gemessen und die Proteinkonzentration anhand einer Eichgeraden bestimmt.

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese trennt die Proteine nach Größe und Ladung auf.

Sie können durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue sichtbar gemacht werden. Das SDS-

PAGE ist der erste Schritt zur Analyse der Proteinexpression und ermöglicht zudem die

Detektion der Proteine durch Western-Blot bzw. MALDI-TOF- Analyse.

36

Versuchablauf

Durchführung

Aufschluss der Zellen bei 4°C!:

Resuspendieren des Zellpellets in 500 µl Lysispuffer

Überführen in 1,5 ml Eppi

weiter resuspendieren durch vortexen und pipettieren

falls die Lösung zu viskos ist, 0,5 µl Benzonase zugeben, 30 min warten

zentrifugieren 10 min, bei 13.000 rpm oder bis Überstand und Pellet getrennt sind

Überstand in neues Eppi überführen

Proteinkonzentrationsbestimmung mit BRADFORD (1976):

2 ml Bradfordreagenz mit 8 ml H2O verdünnen

je 200 µl davon in Mikrotiterplatte pipettieren

Eichlösungen aus 2 mg/ml BSA herstellen

5 µl Überstand mit 45 µl H2O verdünnen

10 µl Überstand mit 40 µl H2O verdünnen

Vorkultur Hauptkultur Induktion

Ernte (wird vom Betreuer vorbereitet)

Zellaufschluss

Bestimmung der Proteinkonzentration Probenvorbereitung Eichgerade Berechnung der Konzentration

SDS-PAGE Trenn-und Sammelgel gießen Probenvorbereitung Beladen

Färbung mit Coomassie Entfärbung

37

5 µl der Verdünnung pro well in Mikrotiterplatte geben

5 µl der Eichlösungen pro well in Mikrotiterplatte geben

Anordnung an der Tafel notieren

Extinktion bei 595 nm messen

Eichgerade erstellen

Proteinkonzentrationen berechnen

SDS-PAGE:

Trenngel gießen

Sammelgel gießen (Kamm nicht vergessen)

20 µg Protein mit 6 µl Ladepuffer versetzten

10 min bei 95 °C kochen

zentrifugieren

SDS-Gel beladen (Anordung notieren, Marker nicht vergessen)

80 V bis zum Trenngel

120 V bis blaue Front aus dem Gel gelaufen ist

Gel in Färbelösung überführen, ca. 30 min färben

Gel in Entfärber überführen bis der Hintergrund entfernt ist (ca. 2 h)

Gel scannen

Puffer und Lösungen:

Acrylamid-/Bisacrylamid-Stammlösung: 30 % Acrylamid, 0,8 % Bisacrylamid

TEMED: Tetraethylmethylendiamin (100 %)

BioRad Dye Reagent Concentrate

Lysis-Puffer:

150 mM NaCl

50 mM Tris-HCl

0,1 % Triton X-100

1 Tablette complete protease inhibitor

pH 7,5

38

SDS-Sammelgelpuffer

0,5 M Tris/HCl, pH 6,8

0,4 % SDS

SDS-Trenngelpuffer

1,5 M Tris/HCl, pH 8,8

0,4 % SDS

SDS-Laufpuffer (10x konzentriert)

2,5 M Tris, pH 8,5

1,9 M Glycin

1 % (w/v) SDS

SDS-Probenpuffer (4x konzentriert)

0,25 M Tris/HCl, pH 6,8

8 % (w/v) SDS

20 % (v/v) Glycerol

0,04 % Bromphenolblau

0,4 % ß-Mercaptoethanol (bzw. Dithiothreitol)

APS-Lösung: Ammoniumpersulfat (10 % w/v)

Zusammensetzung des Trenngels (12,5 % T)

Acrylamid-Stammlösung 10 ml

Trenngelpuffer 6 ml

Milli-Q Wasser 7,8 ml

10 %ige APS-Lösung 190 µl

TEMED 10 µl

Zusammensetzung des Sammelgels (6,25 % T)

Acrylamid-Stammlösung 3 ml

Sammelgelpuffer 3 ml

Milli-Q Wasser 5,8 ml

10 %ige APS-Lösung 190 µl

TEMED 10 µl

39

Weiterführende Literatur

Gentechnologie von A bis Z, H. Ibelgaufts, VCH, 1993

Bioanalytik, F. Lottspeich & H. Zorbas, Spektrum Verlag, 1998

Der Experimentator, Proteinbiochemie, H. Rehm, Gustav Fischer-Verlag, 1997

Proteomics in Practice, R. Westermeier & T. Naven, Wiley-VCH, 2002

Electrophoresis in Practice, R. Westermeier, VCH, 1997

40

VERSUCH 7

ERSTELLEN DER PHYSIKALISCHEN KARTE EINES PLASMIDES

Mittels verschiedener Restriktionsenzyme soll ein Plasmid wie unten dargestellt geschnitten

werden, so dass dann eine Karte des Plasmids erstellt werden kann. Es werden Einfach- und

Doppel-Restriktionsspaltungen durchgeführt.

Auswertung

1. Grösse des Plasmides?

2. Lage der Resriktionsschnittstellen (soweit bestimmbar)?

41

VERSUCH 8

IDENTIFIZIERUNG EINES KLONIERTEN DNA FRAGMENTES MITTELS

DATENBANKSUCHE

Ist man endlich soweit, dass man das Lieblings-Gen kloniert hat, möchte man natürlich auch

sicher wissen, ob sich all die Mühe gelohnt hat. Dazu wird das entsprechende DNA-Fragment

sequenziert und mittels einer Datenbanksuche identifiziert bzw. bestätigt.

Da es sich z.B. bei Myxobakterien um GC-reiche Organismen handelt, ist es unter Umständen

sinnvoll, die DNA erst in Protein zu übersetzen (warum?).

Als Programm für die Bearbeitung der DNA verwenden wir „Vector NTI“ und zur

Datenbanksuche den NCBI Blast Server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Um näheres

über das entsprechende Protein zu erfahren verwenden wir Pubmed

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi).

Aufgaben fürs Protokoll

Beschreiben Sie die Vorgehensweise bei Ihrer Datenbanksuche, insbesondere die Wahl der

Suchparameter. Geben Sie außerdem die zur Suche verwendeten Sequenzen in voller Länge

im Protokoll an.

Fragen:

1. Um was für ein DNA Fragment könnte es sich handeln?

2. Wo spielen die entsprechenden Proteine eine wichtige Rolle

oder wo kommen sie vor?

1. Beantworten Sie die Frage aus der Versuchsbeschreibung