Bernhard-Strigel-Gymnasium Kollgestufe Jahrgang:......2007/2009Memmingen Leistungskurs:.....................Biologie Kollegiatin:..................Nadja Kühne

Facharbeit

Blau-Weiß-Selektion

Abgegeben am: 30.01.2009

Bewertung:

Facharbeit: Note: __________ Punkte: __________

Mündliche Prüfung: Note: __________ Punkte: __________

Datum und Unterschrift des Kursleiters: ____________________________________

Eingetragen in das Kursblatt: _____________________________________________

INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung ............................................................................................................................... . 3

2. Material

2.1 Verwendete Chemikalien ................................................................................................ . 5

2.2 Verwendete Gerätschaften ............................................................................................... . 5

3. Methoden

3.1 Herstellen von LB-Agarplatten ........................................................................................ . 6

3.2 Anlegen einer Übernachtkultur ........................................................................................ . 6

3.3 Plasmidpräparation

3.3.1 Einführung ................................................................................................................ . 6

3.3.2 Durchführung ............................................................................................................ . 7

3.4 Nachweis durch die Agarosegelelektrophorese

3.4.1 Einführung ................................................................................................................ . 8

3.4.2 Durchführung ............................................................................................................ . 9

3.5 Blau-Weiß-Selektion

3.5.1 Herstellen der Chemikalien ...................................................................................... 10

3.5.2 Durchführung ............................................................................................................ 10

4. Auswertung

4.1 Plasmidpräparation ........................................................................................................... 11

4.2 Blau-Weiß-Selektion ........................................................................................................ 12

4.3 Anwendung der Cracking-Methode .................................................................................. 12

4.4 Durchführung der Plasmidpräparation .............................................................................. 13

5. Nachwort ................................................................................................................................ 14

6. Literaturverzechnis................................................................................................................ 15

6.1 Literaturquellen ................................................................................................................. 15

6.2 Internetquellen ................................................................................................................... 15

7. Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................... 16

8. Erklärung des Kollegiaten..................................................................................................... 17

3

1. Einleitung

Thema meiner Facharbeit ist die Blau-Weiß-Selektion, die auch unter dem Namen

„Alpha-Komplementations-Test“ bekannt ist. Das Prinzip der Blau-Weiß-Selektion beruht

auf der „einfachere[n] Selektion der gewünschten Klone nach einer Klonierung.“

(MÜHLHARDT, 2003: S. 130)

Plasmide besitzen eine so genannte Klonierungsstelle, die zur Aufnahme von

Fremd-Desoxyribonucleinsäure (Fremd-DNA) mehrere Schnittstellen enthält, weshalb man

von einer „multiple cloning site“ (MCS) spricht. Durch die Klonierung eines DNA-Fragments

kann ein Gen über diese Klonierungsstelle deaktiviert werden. Genau dies geschieht bei der

Blau-Weiß-Selektion, bei der das lacZ-Gen, ein Gen der β-Galactosidase, durch die Insertion

von Fremd-DNA unterbrochen wird. Das Markergen lac-Z enthält die kodierende Sequenz

für das N-terminale α-Fragment der β-Galactosidase, welches aber „alleine keine

β-Galactosidase-Aktivität besitzt“ (MÜHLHARDT, 2003: S. 130) Um diese Aktivität

herzustellen, müssen Komplementäre verwendet werden, die im Genom die kodierende

Sequenz für das C-terminale Fragment der β-Galactosidase enthalten. Dies wird als

„α-Komplementation“ bezeichnet. Die Zugabe des Induktors Isopropyl-1-thio-β-D-Galaktose

(IPTG), der am Repressor bindet, führt dazu, dass die Transkription des lacZ-Gens

freigegeben wird und das Enzym β-Galactosidase produziert werden kann. Der Indikator

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Galaktosid (X-Gal), ebenfalls auf den Agarplatten

ausgestrichen, wird durch dieses Enzym „unter Freisetzung eines blauen Farbstoffes

gespalten“ (www2.vetmed.uni-muenchen.de, 2007 a: S.11).

Bakterien, die pUC18 enthalten, „sind ampicillinresistent und besitzen überdies eine

funktionsfähige β-Galactosidase“ (KNIPPERS, 2001: S. 291), weshalb sie auf den Agarplatten

blaue Kolonien bilden.

Abbildung 1: pUC-Plasmid

4

Durch die Insertion von Fremd-DNA wird jedoch die Transkription des lacZ-Gens

unterbrochen, es kann keine β-Galactosidase mehr gebildet werden, es führt zur Bildung von

weißen Kolonien auf den LB–Agar–IPTG–X-Gal–Platten.

Abbildung 2: Vorgang der Blau-Weiß-Selektion

Abbildung 3: Kolonienbildung der Blau-Weiß-Selektion

5

2. Material

2.1 Verwendete Chemikalien

• LB–Zubereitung (Firma Merck)

• Agar-Agar

• destilliertes Wasser

• Bakterien „Escherichia coli“

• Kulturmedium

• TAE-Puffer

• Gelladungspuffer

• QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen AG)

• DNA Längenstandard "Gene Ruler™ 1kb DNA Ladder" (Fermentas)

• Ethidiumbromidlösung

• Agarose

• IPTG

• Ethanol (100 %)

• X–Gal

• Dimethylformamid

2.2 Verwendete Gerätschaften

• Laborwaage

• Pipette mit sterilen Spitzen

• Mikrowelle

• Magnetrührer

• Schüttler

• Zentrifuge

• Vortexer

• Agarosegelkammer mit passendem „Kamm“

• Spannungsquelle

• UV-Leuchttisch

• Autoklav

• Bunsenbrenner

• Drigalski–Spatel

• Impföse aus Platin

• Kühlschrank

6

• Heizblock

• Autoklav

3. Methoden

3.1 Herstellen von LB–Agarplatten

Zur Herstellung der Agarplatten wird die von der Firma Merck vorgegebene Menge der

LB-Zubereitung für 500 ml Fertigmedium abgewogen und anschließend 7,5 g Agar-Agar und

500 ml Wasser, gemäß dem Labor-Protokoll von Herrn Schmitt, hinzugefügt. Diese

Mischung wird nun in der Mikrowelle zum Kochen gebracht und mit dem Magnetrührer

gerührt, bis eine klare Lösung entsteht. Danach wird bei 121 °C autoklaviert und auf ca. 60 °C

abgekühlt; das nun noch flüssige Medium wird vorsichtig in sterile Petrischalen gegossen, die

Schalen mit einem Deckel verschlossen und auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend

können die Agarplatten in einer Plastiktüte im Kühlschrank aufbewahrt werden. (Vgl.:

SCHMITT, 2005: S. 13)

3.2 Anlegen einer Übernacht–Kultur

Hierzu werden die Bakterien E.coli mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze in ein mit 3 ml

Kulturmedium gefülltes Reagenzglas gegeben. Zunächst pipettiert man ca. 5 µl Ampicillin in

das Kulturmedium, damit nur Bakterien mit funktionsfähiger Ampicillin-Resistenz überleben.

Eine neue sterile Pipettenspitze wird anschließend kurz in die Stammkultur eingetaucht und

ohne Berührung des Reagenzglases und des Eppendorfcaps, in dem sich die Bakterien

befinden, abgeworfen; danach wird das Reagenzglas mit einer Aluminium–Kappe

verschlossen und bei ca. 37 °C über Nacht und unter Schütteln inkubiert. (Vgl.: SCHMITT,

2005: S. 13)

3.3 Plasmidpräparation

3.3.1 Einführung

„Plasmide sind zirkuläre, doppelsträngige DNA–Moleküle, die sich unabhängig vom

bakteriellen Genom in Bakterien vermehren können.“ (MÜHLHARDT, 2003: S.129) Sie

bestehen aus einem Replikationsstart (origin of replication), einem Selektionsgen und einer

Klonierungsstelle. Da sich Plasmide sehr leicht isolieren und einschleusen lassen, haben sie

sich zu einem bedeutenden Hilfsmittel in der Molekularbiologie entwickelt.

Ziel der Plasmidpräparation ist die reine Isolation eines Plasmides aus einem Bakterium, um

„sie außerhalb der Zelle (in vitro) und in gereinigter Form, d.h. frei von anderen

7

Zellbestandteilen wie Proteinen, Enzymen und Lipiden, vorliegen zu haben.“

(www.genetik.uni-koeln.de, 1996 a)

Hierzu wird zunächst die Zellmembran der Bakterien durch das Detergens

Natriumdodecylsulfat (SDS) zerstört, weshalb man von einer alkalischen Lyse spricht. Zur

Abtrennung unbrauchbarer, großer Substanzen, wie z.B. chromosomale DNA und

Zelltrümmer, sowie durch Zentrifugation und Zugabe von Hochsalz, erhält man eine

verunreinigte Plasmidlösung. Diese wird schließlich durch die Reinigungssäule des

Quiaprep–Kits und der Bearbeitung mit ausgewählten Puffern von Proteinen und Puffersalzen

gelöst, bis man eine gereinigte Plasmidlösung erhält. (Vgl. Abbildung: www.nugi-zentrum.de,

2006 a)

3.3.2 Durchführung

Die Durchführung der Plasmidpräparation erfolgt nach dem Handbuch des Quiaprep–Kits,

das bereits im Vorjahr von der Kollegiatin Martha Dziuk zur einfacheren Durchführung

übersetzt wurde. (Vgl.: QUIAGEN, 2003: S.22 ff)

Dazu werden 1,5 ml der am Vortag angesetzten Übernacht–Kultur mit Escherichia coli

(E.coli), die das pUC18–Plasmid enthält, mit Hilfe einer Pipette in ein steriles Eppendorfcap

überführt. Die Bakterienlösung wird 5 Minuten zentrifugiert (13000 rpm) und der Überstand

anschließend verworfen. Das entstandene Pellet wird nun mit 250 µl des Puffers P1 so lang

resuspendiert, bis keine Zellklumpen mehr sichtbar sind. Nun werden 250 µl des Puffers P2

hinzugefügt und die Bakterienlösung 4–6 mal zum Mischen gedreht. Dieser Schritt muss

zügig, aber vorsichtig durchgeführt werden, damit die DNA nicht zerrissen wird. Es entsteht

eine dickflüssige, leicht durchsichtige Lösung. Bei Bedarf muss das Eppendorfcap öfter

gedreht werden, die Lyse darf jedoch nicht länger als 5 Minuten dauern. Anschließend werden

noch 350 µl des Puffers N3 hinzugefügt und die Lösung wieder 4–6 mal gedreht, es sollte

eine trübe Lösung entstehen. Diese Lösung wird 10 Minuten zentrifugiert; es entsteht ein

festes, weißes Pellet. Der Überstand, der das Plasmid enthält, muss nun mit Hilfe einer

sterilen Pipettenspitze in eine QIAprep-Säule überführt werden, die in einem neuen sterilen

Eppendorfcap steckt. Daraufhin wird 30–60 Sekunden zentrifugiert und der Durchlauf, der

Proteine und Puffersalze enthält, verworfen. Nun muss die Reinigungssäule mit 0,5 ml des

Puffers PB gewaschen und 30–60 Sekunden zentrifugiert werden. Dieser Schritt wird

nochmals mit 0,75 ml des Puffers PE durchgeführt. Der Durchlauf wird entfernt und die

Reinigungssäule nochmals 1 Minute zentrifugiert, um den Puffer PE vollständig zu entfernen.

Die QIAprep-Säule wird nun in ein neues steriles 1,5 ml Eppendorfcap gesteckt und

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anschließend 50µl Wasser hinzugefügt, um einen Durchlauf mit Plasmid–DNA zu erhalten.

Dieser Schritt kann alternativ auch mit 50 µl des Puffers EB durchgeführt werden; wir

verwendeten jedoch Wasser, um bei der Gelelektrophorese ein besseres Ergebnis zu erzielen.

Die Lösung wird 1 Minute stehen gelassen und anschließend 1 Minute zentrifugiert. Der nun

entstandene Rest, der sich im Eppendorfcap befindet, ist die Plasmid–Lösung.

Abbildung 4: Durchführung der Plasmidpräparation mit Hilfe eines Kits

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3.4 Nachweis durch die Agarosegelelektrophorese

3.4.1 Einführung

„Die Agarose–Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, mit der

DNA-Fragmente zwischen 0,5 und 25 kB Länge voneinander getrennt und identifiziert

werden können.“ (SCHMITT, 2005: S. 20)

Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die negativ geladenen DNA-Fragmente

durch das Agarosegel, das aus Agarose und Elektrophoresepuffer besteht, zur positiv

geladenen Anode. Die Geschwindigkeit der Fragmentwanderung durch das Gel ist abhängig

von deren Ladung und Größe. Je kleiner das DNA-Fragment ist, umso schneller kann es sich

durch die Poren des Gels bewegen.

3.4.2 Durchführung

Die Durchführung der Agarosegelelelektrophorese erfolgt nach dem Labor-Protokoll von

SCHMITT (2005: S.20 ff)

Zur Herstellung eines 1%-igem Agarosegels werden 0,2 g Agarose abgewogen und mit dem

TAE-Puffer auf 20 ml in einer Glasflasche mit Schraubdeckel aufgegossen. Um einen

Siedeverzug zu vermeiden, gibt man einen Rührfisch in die Flasche und kocht das Gel unter

Beobachtung in der Mikrowelle auf; hierbei sollten Handschuhe getragen werden. Das heiße

Gel wird nun vorsichtig in die Gelkammer gegossen und der Kamm eingesetzt, anschließend

lässt man es abkühlen, bis es leicht trüb wird. Der Kamm kann nun entfernt und das Gel mit

TAE-Puffer bedeckt werden, bis die Taschen gefüllt und das Gel leicht bedeckt ist.

Nun werden 5 µl der Plasmid-Lösung mit 2µl Gelladungspuffer in einem sterilen

Eppendorfcap gemischt, einige Sekunden zentrifugiert und in die Taschen des Gels pipettiert.

Hierbei sollte beachtet werden, dass das Gel nicht durchstochen wird. Links und rechts der

Plasmidlösungen werden zur Identifizierung der Fragmente jeweils 5 µl des Längenstandars

„1kb DNA Ladder" (Fermentas) in eine Tasche pipettiert. Nun wird eine Spannungsquelle

angeschlossen; dabei ist die Polung zu beachten und auf maximal 7 Volt Spannung je

Zentimeter Elektrodenabstand anzulegen. Die Elektrophorese ist beendet, wenn die blauen

Banden fast das Ende des Gels erreicht haben. Die anschließende zehnminütige Färbung des

Gels in der krebserregenden Ethidiumbromidlösung und das Übertragen auf den

UV-Leuchttisch wird durch den Versuchsleiter durchgeführt.

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3.5 Blau – Weiß – Selektion

3.5.1 Herstellen der Chemikalien

IPTG Konzentrierung 1-fach, gebrauchsfertig

Volumen 1 ml

Zusammensetzung: Subatanz Menge Molarität Molekulargewicht Lieferfirma, Bestellnummer

IPTG 30 mg/ml 126 mM 238,3 g/mol Fluka, 59740

Ethanol 100% 1 ml -- 46,07 g/mol Fluka, 02855

Herstellung: Bei -20°C aufbewahren. Für Blau-Weiß-Screening je 40 µl auf den Agarplatten ausplattieren.

Sicherheitsdatenblatt IPTG, Ethanol

Abbildung 5: Herstellung von IPTG

X-Gal

Konzentrierung 1-fach, gebrauchsfertig

Volumen 1 ml

Zusammensetzung: Subatanz Menge Molarität Molekulargewicht Lieferfirma, Bestellnummer

X-Gal 20 mg/ml 49 mM 408,6 g/mol Fluka, 16665

Dimethyformamid 1 ml -- 73,1 g/mol Merck, 02855

Herstellung: Substanz lösen und bei -20°C lichtgeschützt aufbewahren.

Anwendung: Für Blau-Weiß-Screening je 40 µl auf einer Agarplatten mit einem Drigalskispatel ausplattieren.

Sicherheitsdatenblatt X-Gal, Dimethylformamid Abbildung 6: Herstellung von X-Gal

3.5.2 Durchführung

Zur Durchführung der Blau–Weiß–Selektion werden die unter Punkt 3.4.1 in der Tabelle 1

und 2 angegeben Substanzen in einem sterilen Eppendorfcap gemischt und mittels einem

ebenfalls sterilen Drigalski-Spatel zu jeweils 40 µl auf den schon hergestellten

LB-Agarplatten (ohne Ampicillin) ausplattiert; die Agarplatten werden anschließend 30

Minuten stehen gelassen.

Beim nächsten Arbeitsschritt werden die E.coli-Bakterien aus der am Vortag angesetzten

Übernachtkultur mit Hilfe einer Impföse aus Platin auf den LB–Agar–IPTG–X-Gal–Platten

ausgestrichen. Um die Impföse zu sterilisieren, taucht man sie zunächst in Ethanol, glüht sie

im Bunsenbrenner aus und lässt sie abkühlen. Anschließend wird die sterile Impföse in die

Bakterienkultur eingetaucht und gemäß dem Muster in Abbildung 4 auf der Platte

ausgestrichen. Die Öse sollte zwischen den 5 Schritten immer wieder ausgeglüht und

anschließend abgekühlt werden. Danach sind die Platten mit Parafilm zu verschließen und bei

37 °C im Brutschrank zu inkubieren. Am nächsten Tag kann das Ergebnis abgelesen werden.

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Abbildung 7: Ausstreichschema

4. Ergebnisse und Fehleranalyse

4.1. Plasmidpräparation

Die Plasmidpräparation, die S. Funk, N. Makowski und die Autorin am 23.10.2008 im Labor

des Bernhard-Strigel-Gymnsiums durchführten, ergab ein zwiespältiges Ergebnis, da die

Banden der Plasmid-Lösungen beim Nachweis durch die Agargelelektrophorese nicht

ansatzweise die durch den Marker „1kb DNA Ladder" im Gel vorgegebene Länge des

pUC18-Plasmids erreichten. Das Plasmid pUC18 besitzt 2686 Basenpaare (bp). Das bedeutet,

dass unsere Proben in der Reihe des Markers, ausgewertet durch die dazugehörige Legende,

zwischen dem 7. und 8. „Strich“ der Bande liegen müssten. Wie STUPPERICH

(www.nugi-zentrum.de, 2006 b) eingehend erläutert, findet man häufig „auch einen diffusen

Schmier, der bei kleinen Fragmentlängen auftritt“. Dieser „Schmier“ ist auch in unserem

Ergebnis deutlich sichtbar und könnte darauf zurückzuführen sein, dass unsere verwendeten

Bakterien zu wenig Plasmid enthielten.

Überlegung: Unterlief uns als Laborneulingen ein Fehler bei der Durchführung der

Plasmidpräparation, oder waren die Bakterienstämme und der Quiaprep-Kit fehlerhaft?

Ein kleiner Fehler unterlief uns auch bei der Reinigung der Plasmidlösung mit den

ausgewählten Puffern, da wir anstatt wie oben geschrieben, zunächst den Puffer PE und

anschließend den Puffer PB der Plasmidlösung hinzufügten.

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Eine weitere Fehlerquelle könnte gewesen sein, dass das Wasser unseres Labors, welches wir

bei den gesamten Experimenten verwendeten, zu sauer war.

Abbildung 8: Ergebnis der Gelelektrophorese vom 23.10.2008

4.2 Blau-Weiß-Selektion

Die Blau-Weiß-Selektion, die ich am 13.11.2008 im Labor des Bernhard-Strigel-Gymnasiums

durchführte, erbrachte leider keine Ergebnisse. Nachdem ich, wie vorgeschrieben, 40 µl des

Induktors IPTG und 40 µl des Indikators X-Gal auf meinen LB-Agarplatten ausgestrichen

hatte, stellte ich die Platten bei ca. 37 °C in den Inkubator und wartete bis zum nächsten Tag

auf das Ergebnis, doch bereits wie im Vorjahr waren nur weiße Kolonien sichtbar. Da X-Gal

lichtempfindlich ist, bewahrte ich meine Platten noch einige Tage abgedunkelt auf, doch auch

die veränderte Lagerung führte nicht zu dem erwarteten Ergebnis. Es stellte sich erneut die

Frage, wo die Ursache des Fehlversuchs liegen könnte. Da die Chemikalien IPTG und X-Gal

vom Labor erst neu gekauft wurden, schieden diese Chemikalien als Fehlerquelle aus.

4.3 Anwendung der Cracking-Methode

Um den Problemen auf den Grund zu gehen, führten wir am 4.12.2008 eine von Herr

SCHMITT verkürzte Form der Cracking-Methode durch. (Vgl.: www.nugi-zentrum.de, 2006

c)

„Im cracking-Verfahren werden Bakterien aus Kolonien oder aus Flüssigkulturen im

cracking-Puffer aufgeschlossen. Dieser Zellaufschluss wird in der Agarosegelelektrophorese

analysiert. Nach Anfärben des Agarosegels mit Ethidiumbromid erkennt der Experimentator,

ob Plasmide in den Klonen vorhanden sind oder nicht.“ (www.nugi-zentrum.de, 2006 d)

Wir verwenden also das Verfahren, um festzustellen, ob in den Bakterien unseres Labors

überhaupt oder genügend pUC18-Plasmid vorhanden ist.

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Zunächst wird 2 Minuten 50 µl einer am Vortag angesetzten Übernachtkultur in einem

Eppendorfcap abzentrifugiert, der Überstand verworfen.

Anschließend fügen wir, im Gegensatz zum Autor der Nugi-Homepage, statt den

vorgeschriebenen 50 µl, 75 µl Aufschlusspuffer hinzu, und verwenden den TE-Puffer nicht.

Dieser Ansatz wird nun 5 Minuten lang bei 70 °C auf dem Heizblock gekocht, sodass sich die

Zellklumpen auflösten. Zur Abkühlung werden die Eppendorfcaps mit der Lösung 5 Minuten

in ein Eisbad gelegt. Danach zentrifugiert man 5 Minuten, pipettiert den Überstand, der die

Plasmide enthält und 2 µl des Gelladungspuffers in ein neues steriles Eppendorfcap.

Mit Hilfe unserer Plasmid-Lösung und einem Marker führten wir dann nochmals eine

Agargelelektrophorese durch.

Abbildung 9: Ergebnis der Gelelektrophorese vom 4.12.2008

Wie die Abbildung 9 deutlich macht, war das Ergebnis der 2. Gelelektrophorese noch

schlechter. Von unseren Plasmid-Proben war nur der Ansatz im Gel leicht zu erkennen, eine

Wanderung durch das Gel zur positiven Anode hat jedoch nicht stattgefunden. Auch die

Banden des Markers waren nur sehr schwammig zu erkennen.

Beide Ergebnisse zeigten aber, dass der Fehler bei den Bakterien unseres Labors liegen

müsste. Nach weiteren Überlegungen entschlossen wir uns, mit neu bestellten Bakterien und

einem neuen Kit erneut eine Plasmidpräparation durchzuführen.

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4.4 Durchführung der Plasmidpräparation

Die Plasmidpräparation, die wir am 17.12.2008 vornahmen, führte dann schlussendlich am

8.01.2009 durch die Agarosegeleleklektrophorese zum optimalen Ergebnis, wie die

Abbildung 10 zeigt. Somit waren wir uns sicher, dass der Fehler bei den Bakterien unseres

Labors liegen müsste.

Abbildung 10: Ergebnis der Gelelektrophorese vom 8.01.2009

Die Bakterien, die ich bei der Durchführung meiner Blau-Weiß-Selektion verwendete, waren

defekt oder enthielten zu wenig Plasmid, das sowohl zu den weißen Kolonien der

Blau-Weiß-Selektion als auch zum Ergebnis der Plasmidpräparationen führte. Um mit den

neuen Bakterien nochmals eine Blau-Weiß-Test durchzuführen, fehlte im Anschluss leider die

Zeit für weiterführende Laborversuche.

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5. Nachwort

Da ich aufgrund meines Stundenplans am Labor-Praktikum bei Herrn Schmitt in der 12.

Jahrgangsstufe nicht teilnehmen konnte, war für mich der Einstieg in die Labormethoden

etwas erschwert. Die Laborleiter, Herr Schmitt und Herr Weber, waren jedoch stets bereit,

mich nach intensiven, vorangegangenen Studien im Internet und des Labor-Protokolls zu

unterstützen. Nach einigen Anfangs- und Verständigungsschwierigkeiten mit der

Labormethode gelang es uns mit oben genannter Unterstützung, die Fehlerquellen dennoch zu

erkennen und die Grundlagen für das Verständnis mikro- und molekularbiologischer

Denkweisen zu legen.

Die Facharbeit hat dazu beigetragen, meine Erkenntnisse zur theoretischen und praktischen

Vorgehensweise in der Gentechnik deutlich zu erweitern; trotz Fehlversuchen hat mir die

Beschäftigung mit diesen Themen viel Freude bereitet.

Meinen Lehrkräften danke ich für die wertvolle Unterstützung.

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6. Literaturverzeichnis

6.1 Literaturquellen

1) Facharbeit: DZIUK Martha, 2008: Herstellung kompetenter Zellen und Nachweis

durch Blau-Weiß-Selektion

2) KNIPPERS, Rolf, 2001: Molekulare Genetik. 8. Auflage. Stuttgart: Thieme Verlag.

ISBN-10: 3134770083

3) MÜHLHARDT, Cornel, 2003: Der Experimentator. Molekularbiologie/Genomics. 4.

Auflage. München: Spektrum Akademischer Verlag. ISBN 3-8274-1460-1

4) SCHMITT Patrick, 2005: Einführung in die Grundarbeitstechnicken der

Molekularbiologie

5) QUIAGEN, 2003: „QIAprep® Miniprep Handbook“ Cat.No.27990.

6.2 Internetquellen

1) www.genetik.uni-koeln.de, 1996 a: MENZ, Volkmar: Plasmidpräparation mittels

Kochlyse (Nährbodenplatte). [Stand: 28.01.2009]

http://www.genetik.uni-koeln.de/teaching/lehramt/material/menz/kap52.html

2) www.nugi-zentrum.de, 2006 a: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität

Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]

http://www.nugi-zentrum.de/pdf_Dateien/Plasmid/Plasmidisolierung_erklaerg

3) www.nugi-zentrum.de, 2006 b: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität

Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]

http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/Agarosegel/

Diskussion.html

4) www.nugi-zentrum.de, 2006 c: Stupperich, Erhard: Netwerk Universität Gymnasium

Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]

http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/cracking/Methode.html

5) www.nugi-zentrum.de, 2006 d: Stupperich, Erhard: Netzwerk Universität Gymnasium

Industrie, Ulm. [Stand: 28.01.2009]

http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/cracking.html

6) www2.vetmed.uni-muenchen.de, 2007 a: S.11. [Stand: 28.01.2009]

http://www2.vetmed.uni-muenchen.de/tiph_c//Vorlesungen/chNukl.pdf

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7. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: bearbeitet: OSPRIAN, Ingrid: Labordiagnostik in der Molekularbiologie.

[Stand: 27.01.2009]

http://biomed.umit.at/upload/methoden_ss06_part10.pdf

Abbildung 2: bearbeitet: http://www.bioworkx.de: Klonieren Teil A. [Stand: 27.01.2009]

http://www.bioworkx.de/PDF/02%20Klonieren%20A.pdf

Abbildung 3: BITTNER, Diana, FLEMMING, Katrin und RAFF,

Johannes Dr.: Forschungszentrum Dresden Rossendorf. [Stand: 27.01.2009]

http://www.fzd.de/db/Pic?pOid=23357

Abbildung 4: Plasmidisolation mit Hilfe eines Kits, von Autorin erstellt

Abbildung 5: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand:

27.01.2009]

http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Allgemeines/Rezepte_Medien.html#IPTG

Abbildung 6: STUPPERICH, Erhard: Netzwerk Universität Gymnasium Industrie, Ulm. [Stand:

27.01.2009]

http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Allgemeines/Rezepte_Medien.html#X_Gal

Abbildung 7: bearbeitet: SCHMITT, Patrick: Einführung in die Grundarbeitstechniken der

Molekularbiologie. [Stand: 27.01.2009]

http://www.strigel.de/biotech/download/kursskript.pdf

Abbildung 8: Ergebnis der Gelelektrophorese im Labor des Bernhard-Strigel-Gymnasiums

vom 23.10.2008

Abbildung 9: Ergebnis der durchgeführten Cracking-Methode im Labor des Bernhard-Strigel-

Gymnasiums vom 4.12.2008

Abbildung 10: Ergebnis der durchgeführten Plasmidpräparation im Labor des Bernhard

Strigel Gymnasiums vom 8.01.2009

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8. Erklärung des Kollegiaten

Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im

Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Bad Grönenbach, den 30.01.2009 ……………………………………………… (Unterschrift des Kollegiaten)