Charakterisierung eines in vivo Modells zur Untersuchung ... · Aus dem Lehrstuhl für Anatomie II...

Aus dem Lehrstuhl für Anatomie II

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktorin: Prof. Dr. Elke Lütjen-Drecoll

Charakterisierung eines in vivo Modells zur

Untersuchung der Wimpernbiologie und Trichomegalie:

Mäusewimpern Morphologie, Entwicklung,

Wachstumszyklus und Prolongation von Anagen durch

Bimatoprost

Inaugural-Dissertation

Zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorgelegt von

Tobias Andreas Fuchs

aus

Regensburg

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Elke Lütjen-Drecoll

Korreferent: Prof. Dr. med. Michael Eichhorn

Tag der mündlichen Prüfung: 20. Juli 2011

Meinen Eltern Inge und Bernhard Fuchs

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung und Abstract 1

1.1 Zusammenfassung 1

1.2 Abstract 2

2. Einleitung 4

2.1 Trichomegalie und Wimpernwachstum 4

2.2 PGF-2α Analoga 5

2.2.1 Chemie von PGF-2α Analoga 5

2.2.2 Haarwachstum stimulierende Potenz von PGF-2α 8

2.3 Ein Tiermodell zur Untersuchung des Wimpernwachstums 9

2.4 Einfluss von Bimatoprost auf das Wimpernwachstum bei

der Maus 10

3. Material und Methodik 11

3.1 Tiere 11

3.2 Probengewinnung 11

3.3 Bimatoprostbehandlung 12

3.3.1 Makroskopische Untersuchung 13

3.3.2 Histologische Untersuchung 14

3.4 Statistische Analyse 15

4. Ergebnisse 16

4.1 Morphologie des Augenlids 16

4.2 Morphologie der Wimper 18

4.2.1 Histologischer Aufbau des Wimpernfollikels 18

4.2.2 Makroskopische Beschreibung des Wimpernschaftes 18

4.3 Unterteilung des Wimpernwachstumszyklus 19

4.3.1 Telogen 20

4.3.2 Anagen-early 21

4.3.3 Anagen-middle 22

4.3.4 Anagen-late 22

4.3.5 Katagen-early 23

Inhaltsverzeichnis

4.3.6 Katagen-late 25

4.4 Morphogenese und erster Zyklus der Wimper 27

4.4.1 Makroskopie 27

4.4.2 Histologie 27

4.4.2.1 Morphogenese in Woche 0 post partum 27

4.4.2.2 Morphogenese in Woche 1 post partum 29

4.4.2.3 Beginn des ersten Wimpernzyklus in Woche 2 post

partum 30

4.4.2.4 Woche 3 post partum 30




4.5 Bimatoprostbehandlung 33

4.5.1 Makroskopische Untersuchung 33

4.5.2 Histologische Untersuchung 36

5. Diskussion 40

5.1 Vergleich der Morphologie der Wimpern der Maus mit

menschlichen Wimpern und mit Fellhaaren 40

5.2 Vergleich der Morphogenese und der frühen Entwicklung der

Wimpern mit der der Fellhaare 40

5.3 Vergleich des Wachstumszyklus und des Exogens der

Wimper mit der dorsaler Fellhaare 41

5.4 Effekte von Bimatoprostbehandlung 41

5.5 Zunahme der Wimperndicke und Hyperpigmentierung

durch Bimatoprost 42

5.6 Wimpernverlängerung durch Bimatoprost 43

6. Literaturverzeichnis 44

7. Abkürzungsverzeichnis 49

8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 51

9. Danksagung 52

1

Zusammenfassung

1. Zusammenfassung und Abstract

1.1 Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele: Hypertrichosis oder Alopezie der Wimpern ist sowohl

mit unterschiedlichen Krankheiten als auch mit bestimmten Therapeutika

assoziiert. Veränderungen der Wimpern können optisch störend und damit,

gerade weil die Gesichtsregion betroffen ist, psychisch belastend sein und zu

Schäden am Auge, zu Therapieabbrüchen und zu Non-Compliance führen. Da

die Mechanismen des Wimpernwachstums und die damit zugrundeliegenden

Ursachen der Wimpernhypotrichose oder Wimpernhypertrichose weitgehend

unklar sind, ist auch die Therapie limitiert. Ziel dieser Studie war es zunächst zu

untersuchen, ob die Maus ein Tiermodell für das Wimpernwachstum darstellt

und wie der Wimpernzyklus sich zu dem Haarzyklus der Maus verhält. Bei

menschlichen Augen induziert die Behandlung mit Prostaglandin F-2α, das zur

Augeninnendrucksenkung bei Glaukompatienten angewandt wird, eine

Hypertrichose der Wimpern. In einem zweiten Versuchsaufbau wurde dann die

pharmakologische Beeinflussung des Wimpernfollikels durch Behandlung mit

dem Prostaglandin F-2α Analog Bimatoprost untersucht.

Methoden: Obere Augenlider und definierte Abschnitte dorsaler Rückenhaut

wurden weiblichen 0,1,2,3,4,5 und 6 Wochen alten C57BL-6J Mäusen

entnommen (pro Gruppe=2-4). Die Wimpern der rechten Augenlider wurden

unter dem Stereomikroskop gezählt. Die linken Augenlider und die Haut wurden

in Epon eingebettet und 1µm dicke, mit Toluidinblau gefärbte Serienschnitte

(160 Schnitte; 160µm/Augenlid) zur histologischen Beschreibung der

Morphogenesestadien und des ersten Wachstumszyklus angefertigt.

Die rechten Augenlider von 4 Wochen alten weiblichen C57BL-6J Mäusen

wurden 14 Tage mit 0,03% Bimatoprost bzw. mit Vehikel behandelt (pro

Gruppe=10). Die Wimpern der entnommenen oberen Augenlider wurden

gezählt und der basale Durchmesser vermessen. Serienschnitte wurden

angefertigt (160 Schnitte; 160µm/Augenlid). Alle Wimpernfollikel innerhalb der

160 Serienschnitte wurden gezählt, einer Wachstumsphase zugeordnet, der

Durchmesser des Bulbus und der dermalen Papille vermessen und die Anzahl

der Melaningranula quantifiziert.

2

Zusammenfassung

Ergebnisse und Beobachtungen: Augenlider von Mäusen wiesen die

gleichen anatomischen Strukturen auf wie humane Augenlider. Die generellen

morphologischen Eigenschaften der Wimpern von Mäusen (Schaft, Follikel,

Morphogenese und Wachstumszyklus) waren mit denen der dorsalen Fellhaare

vergleichbar. Es fehlte jedoch der M. arrector pili. Nach der Morphogenese der

Mäusewimpern wurde ein synchroner Zyklus beobachtet, welcher früher

begann und schneller voranschritt, als bei den dorsalen Fellhaaren. Exogen

fand während jedes Zyklus in Katagen statt. Bimatoprostbehandlung

prolongierte signifikant die Dauer von Anagen und induzierte die Bildung

längerer und dickerer Wimpern. Es gab keine Anzeichen für eine durch

Bimatoprost induzierte de-novo Follikulogenese.

Praktische Schlussfolgerungen: Wimpern von Mäusen eignen sich

hervorragend als gut standardisierbares in-vivo-Modell zur quantitativen und

qualitativen Analyse der Morphologie, der Morphogenese, des

Wachstumszyklus und der Bestimmung des Zeitpunktes von Exogen. Anhand

dieses Wimpernmodells können molekulare Kontrollmechanismen des

Wachstumszyklus analysiert und neuartige Medikamente zur Therapie von

Wimpernfehlregulationen entwickelt werden. Die durch Bimatoprost induzierte

Hypertrichose der Wimpern beruht wahrscheinlich auf einer Verlängerung von

Anagen, so dass vermehrt Follikel mit zwei Wimpern pro Follikel verblieben.

1.2 Abstract

Background and intention: Hypertrichosis or alopecia of eyelashes can be

associated with various diseases or treatments. Eyelash disorders can be

optically disturbing and thus, due to the affection of the face region,

psychologically strain. In addition, changes in number and morphology of

eyelashes can result in eye damage, discontinuation of treatment or non-

compliance. As mechanisms of growth controls of eyelashes and the underlying

causes of eyelash hypo- or hypertrichosis are largely obscure, available therapy

is limited. The intention of this study was, to investigate whether the mouse can

serve as a model for eyelash morphogenesis and to compare the eyelash cycle

with the hair cycle of the mouse. In a second experimental setup changes in

3

Zusammenfassung

eyelash follicle biology were described following treatment with Bimatoprost, an

antiglaucoma drug, that induces hypertrichosis of eyelashes in a number of

patients.

Methods: Upper eyelids and defined regions of dorsal skin were excised from

female C57BL-6J mice at 0,1,2,3,4,5 and 6 weeks of age (2-4/age). Eyelashes

of right eyelids were counted under a stereomicroscope. Left eyelids were

embedded in epon and serial sections of 1µm (160 sections; 160µm/eyelid)

were prepared and stained with toluidineblue to describe histologically

morphogenesis and the first growth cycle.

Right eyelids of 4 week old female C57BL-6J mice were treated with 0,03%

bimatoprost or its vehicle (10/each). Eyelashes of excised eyelids were counted

and basal thickness was measured. Serial sections were prepared (160

sections; 160µm/eyelid). Eyelash follicles within this sections were counted,

growth phase was determined, diameter of the bulb and the dermal papilla was

measured and number of melanin granules was quantified.

Results and observations: Mouse eyelids exhibited the same anatomic

features as human eyelids. General morphological features of mouse

eyelashes, regarding to shaft, follicle, morphogenesis, and growth cycle, were

comparable to those of pelage hair follicles. Eyelashes had no m. arrector pili.

After morphogenesis of mouse eyelashes, a synchronized cycle was observed,

that initiated earlier and progressed faster, compared to pelage hairs. Eyelash

exogen occurred during each cycle during catagen. Treatment with bimatoprost,

significantly extended the duration of anagen and induced generation of longer

and thicker eyelashes. There was no evidence of bimatoprost-induced de-novo

folliculogenesis.

Conclusions: Mouse eyelashes offer an excellent in-vivo-model for the

quantitative and qualitative analysis of eyelash morphology, morphogenesis,

growth cycle and determination of exogen. This model will help to analyze the

molecular controls of eyelash growth and to develop novel drugs to treat

eyelash disorders. Hypertrichosis following treatment with bimatoprost is

presumably due to an extended anagen, leading to an increased number of two

shaft follicles.

4

Einleitung

2. Einleitung

2.1 Trichomegalie und Wimpernwachstum

Hypertrichosis der Wimpern oder Trichomegalie ist definiert als Längen-,

Dicken-, Steifigkeits- und Pigmentzunahme sowie die Neigung der Wimpern,

sich zu kringeln.[58] Dabei tritt Trichomegalie oft in Verbindung mit einer

steigenden Anzahl der Wimpern, einer additiven Reihe und erhöhtem Übergang

von Vellushaar zu terminalem Haar auf.[58] 1965 wurde Trichomegalie erstmals

als kongenitaler Symptomkomplex von Oliver-McFarlane beschrieben.[46] Heute

ist sowohl die Assoziation von Trichomegalie mit vielen Krankheitsbildern

bekannt, als auch das Auftreten von Trichomegalie als Nebenwirkung von

systemischen und lokalen Therapeutika. So tritt eine Trichomegalie bei

okulokutanem Albinismus Typ I,[47] sowie bei systemischen Erkrankungen wie

Dermatomyositis,[64] systemischem Lupus Erythematosus,[57] HIV Typ I[30] oder

lokalen Infektionen wie Uveitis[2] auf. Auch systemische Therapie mit Interferon-

alpha,[22] Topamirat,[58] Immunsuppressoren wie Cyclosporin[77] oder

Tacrolimus,[76] Therapie mit Anti-EGRF (epidermal growth factor receptor)

rekombinanten Antikörpern wie Cetuximab[31] oder EGFR-

Tyrosinkinaseinhibitoren wie Erlotinib[4] oder Gefitinib[47] kann Trichomegalie

verursachen. Auch lokale Applikation von Cyclosporin[51] als Augentropfen kann

zu Trichomegalie führen.

In den letzten Jahren wurde eine Trichomegalie durch Therapie des Glaukoms

mit lokalen PGF-2α Analoga beschrieben. Bei lokaler antiglaukomatöser

Therapie mit Latanoprost[14] und mit Bimatoprost[6],[20],[21],[63],[71] trat

Trichomegalie als unerwünschter Nebeneffekt auf (Abbildung 1).

Abbildung 1: Das

linke mit dem

PGF-2α Analogon

Bimatoprost be-

handelte Auge

zeigt unilaterale

Trichomegalie im

Gegensatz zum unbehandelten rechten Auge. Quelle: Tosti A., Pazzaglia M.,

Voudouris S. and Tosti G. (2004). "Hypertrichosis of the eyelashes caused by

bimatoprost." J Am Acad Dermatol 51: S149-50. [71]

5

Einleitung

Eine Fehlregulation des Wimpernwachstums kann optisch störend und damit,

gerade weil die Gesichtsregion betroffen ist, psychisch belastend sein und zu

Non-Compliance bis hin zum Therapieabbruch führen. Auch wurde ein

unnötiger Verbrauch des Medikaments aufgrund des erschwerten

Zugangsweges durch zu lange Wimpern beschrieben.[63]

Andererseits könnten gerade diese Trichomegalie induzierenden Substanzen

aufgrund der Haarwachstum stimulierenden Potenz als Medikamente zur

Therapie von Wimpernwachstumsstörungen verwendet werden.[8] So könnten

PGF-2α Analoga zum Beispiel zur Therapie der Alopezie von Wimpern,[35] wie

auch der Milphosis, einer lokalen Alopecia areata der Wimpern,[56] eingesetzt

werden. Zusätzlich zur psychischen Belastung sind bei diesen Erkrankungen,

infolge des Verlustes der Schutzfunktion der Wimpern vor Sonnenlicht oder

Partikeln, auch Schäden der Kornea möglich. Ursachen von Milphosis, dem

alleinigen Verlust der Wimpern oder Madarosis, einem kombinierten Wimpern

und Augenbrauenverlust sind beispielsweise Infektion, Trauma oder Allergie.[56]

Auch wurde Madarosis bei Autoimmunkrankheiten wie dem diskoiden Lupus

Erythematosus[62] und Milphosis bei endokrinologischen Erkrankungen wie

Hyperthyreose[29] oder bei kongenitalen Erkrankungen[11] beschrieben. Häufig

ist der Ausfall von Wimpern Folge von Chemotherapie[40] oder Botulinum

Injektion[32].

Der Mechanismus, durch den sowohl die Trichomegalie als auch der

Wimpernverlust verursacht wird, ist bisher nicht einheitlich geklärt. Auch der

Einfluss von Prostaglandinen wird widersprüchlich beschrieben. In einzelnen

klinischen Falldarstellungen wird eine erfolgreiche Therapie von Alopecia areata

der Wimpern durch lokale Applikation von PGF-2α Analoga dargestellt,[35],[37] in

anderen Studien konnte ein Wiederwachsen von Wimpern durch Therapie mit

PGF-2α Analoga nicht nachgewiesen werden.[54]

2.2 PGF-2α Analoga

2.2.1 Chemie von PGF-2α Analoga

Die bisher unter dem Terminus PGF-2α Analoga zusammengefasste Gruppe

chemischer Strukturen ist eine Sammelbezeichnung für Gewebshormone, die

ihre Namensgebung Ulf Svante von Euler verdanken, welcher diese 1934

6

Einleitung

erstmals aus der Prostata extrahierte.[17] 1960-1962 wurden sie von Sune

Bergström entsprechend ihrer Löslichkeit in Ethylether oder Phosphat in PGE

oder PGF unterteilt.[3] Weitere Prostaglandine wurden später u.a. 1973 von B.

Samuelsson entdeckt.[19] 1982 erhielten Sune Bergström, Bengt Samuelsson

und John Vane den Nobelpreis für ihre Entdeckungen.[17] Prostaglandine

werden auf einem der drei Hauptwege der Arachidonsäurekaskade, dem

sogenannten Cyclooxigenase-Pathway, synthetisiert (Fig. 1).

Fig. 1: Prostaglandinsynthese. Arachidonsäure wird durch eine Phospholipase aus

Phospholipiden der Zellmembran freigesetzt. Aus freier Arachidonsäure werden in

Abhängigkeit von den Enzymen der unterschiedlichen Zellen Prostaglandin H2 (PGH2)

Leukotriene und Epoxyeicosatriensäuren synthetisiert. PGH2 ist Substrat der

Prostaglandinsynthasen (PG-S), Thromboxansynthase (Tx-S) und

Prostacyclinsynthase (PGI2-S). Modifiziert aus Quelle Smith W.L., Marnett l.J. and

DeWitt D.L. (1991). „Prostaglandin and thromboxane biosynthesis.“ Pharmacol Ther

49: 153-79 [65]

Neben den zur Therapie von Glaukom eingesetzten Prostaglandin-Analoga,

zählt das zur Anregung des Wimpernwachstums eingesetzte Therapeutikum

Bimatoprost durch Substitution einer Ethylamid-Gruppe an C-1 zur chemischen

Subgruppe der Prostamide.[79] Parallel zur Synthese von Prostaglandin-G2 aus

Arachidonsäure bei den Prostaglandinen wird Prostamid-G2 aus Anandamid

(=Arachidonylethanolamid) durch eine Cyclooxygenase synthetisiert.[79]

Während Arachidonsäure durch beide Isoenzyme COX-1 und COX-2 zu PGG2

oxidiert werden kann, erfolgt die Oxidierung von Anandamid nur durch COX-

7

Einleitung

2.[79] Analog zur Prostaglandinsynthese dient Prostamid H2 als Substrat für

verschiedene Prostamide, darunter Prostamid-F2α (Fig. 2).[79] Bimatoprost bindet

an den Prostaglandin-FP-Rezeptor, interagiert aber möglicherweise mit dem

FP-altFP-Rezeptor Heterodimer, Splicing Varianten des FP-Rezeptors.[33]

Fig. 2: Prostaglandin- und Prostamidsynthese im Vergleich. Anandamid dient im

Gegensatz zur Arachidonsäure nicht den beiden Isoenzymen Cycloxygenase-1 und -2

(COX-1,-2) als Substrat, sondern nur COX-2. Modifiziert aus Quelle Woodward D. F.,

Liang Y. and Krauss A. H. (2008). "Prostamides (prostaglandin-ethanolamides) and

their pharmacology." Br J Pharmacol 153: 410-9. [79]

Bei einer steigenden Tendenz der Prävalenz des primären

Offenwinkelglaukoms aufgrund der demographischen Entwicklung, erfahren die

PGF-2α Analoga eine häufige Anwendung, um eine der weltweit häufigsten

Ursachen für Blindheit infolge der Degeneration des N. Optikus zu reduzieren.[5]

Dabei senken diese durch eine Erhöhung vor allem des uveoskleralen sowie

des trabekulären Kammerwasserabflusses,[25] u.a. in Folge von Aktivierung der

Matrix-Metalloproteinasen,[45] den Augeninnendruck. Die Innovation

Prostaglandine als Therapeutika für Glaukom zu verwenden entwickelten Bito

8

Einleitung

und Camras in den 1980igern.[25] Heute zählen zu den in der

antiglaukomatösen Therapie eingesetzten PGF-2α Analoga u.a. Prostaglandin

F2α-Isopropyl-Ester, Latanoprost, Travoprost, Bimatoprost und Tafluprost (Fig.

3).[25]

Fig. 3: Antiglaukomatöse Prostaglandin Derivate.

Prostaglandin F2α-Isopropyl-Ester, Latanoprost, Travoprost, Bimatoprost (Substitution

einer Ethylamid-Gruppe an C-1 und Substitution einer Phenylgruppe) und Tafluprost.

Modifiziert aus Quelle: Ishida N., Odani-Kawabata N., Shimazaki A. and Hara H.

(2006). "Prostanoids in the therapy of glaucoma." Cardiovasc Drug Rev 24: 1-10 [25]

2.2.2 Haarwachstum stimulierende Potenz von PGF-2α Analoga

Dass PGF-2α Analoga nicht nur Augeninnendruck senkende, sondern auch

Haarwachstum stimulierende Potenz aufweisen, wurde erstmals 1997

entdeckt.[8],[27] Sogar erfolgreiche Therapie von Wimpernausfall und diffuser

9

Einleitung

Verdünnung von Kopfhaaren wurde in klinischen Einzelstudien

beschrieben.[35],[37],[78] Die Potenz von PGF-2α Analoga, dünnes, kurzes,

unpigmentiertes Vellushaar in dickes, langes pigmentiertes terminales Haar zu

differenzieren, wurde beispielsweise in der Wangenregion[20],[21],[27] beschrieben

(Abbildung 2). Wachstum oder Ausdifferenzierung von Haaren, auch in

Regionen androgener Alopezie,[72] lässt darauf schließen, dass möglicherweise

Therapie von Alopecia areata nicht nur auf Wimpern beschränkt, sondern auch

in anderen Körperregionen möglich ist.

Abbildung 2: Pigmentierung des Vellushaares in

der malaren Region nach lokaler Applikation von

Bimatoprost (siehe Pfeil). Modifiziert aus Quelle:

Hart J. and Shafranov G. (2004). "Hypertrichosis

of vellus hairs of the malar region after unilateral

treatment with bimatoprost." Am J Ophthalmol

137: 756-7.[20]

So wurde beschrieben, dass PGF-2α in dorsalen Fellhaarfollikeln der Maus

Telogen zu Anagen-Konversion induzieren kann.[59] Follikel, lokalisiert an

unterschiedlichen Stellen des Körpers, werden jedoch durch unterschiedliche

molekulare Kontrollmechanismen gesteuert.[12],[66] Dies hat zur Folge, dass die

gleiche Substanz auf Haare unterschiedlicher Regionen unterschiedliche

Wirkungen haben kann. Beispielsweise induzieren Androgene zwar in der Bart-

und Achselregion während der Pubertät die Differenzierung von Vellushaar zu

terminalem Haar und dennoch ist die gleiche Substanz Ursache androgener

Alopezie.[18],[52] Auch für PGF-2α Behandlung wurden unterschiedliche

Reaktionen beschrieben. Während Alopecia areata in der Region der

Augenbrauen nicht erfolgreich mit Latanoprost therapiert werden konnte,[55]

wurde ein Wiederwachsen der Wimpern nach Alopezie infolge von

Latanoprosttherapie beschrieben.[35],[37]

2.3 Ein Tiermodell zur Untersuchung des Wimpernwachstums

Den klinischen Studien, die den wachstumsstimulierenden Effekt von PGF-2α

Analoga auf Wimpern oder sogar auf Haare anderer Regionen beschreiben,

10

Einleitung

steht nur eine geringe Zahl an tierexperimentellen Studien gegenüber. Während

sowohl die Morphogenese als auch der Wachstumszyklus dorsaler Hauthaare

von C75BL/6 Mäusen bereits intensiv erforscht wurde,[7],[49],[41],[43],[68] ist die

genaue Biologie des Wimpernfollikels, der Wimpernwachstumszyklus mit

seinen Kontrollmechanismen, sowie die Morphogenese der Wimpern

weitgehend unklar. Erst durch ein systematisches Beschreiben der Morphologie

des Wimpernzyklus können pathologische Fehlregulationen oder die Wirkung

von Pharmaka erkannt werden.

Ziel dieser Studie war es, die Wimpern von C57BL/6 Mäusen, dem bisher in der

Haarforschung am besten charakterisierten Tiermodell[7],[49],[41] zu beschreiben

und mit menschlichen Wimpern zu vergleichen. Dabei wurden die Morphologie

des Augenlids und der Wimpern, die Morphogenese, die Wachstumsstadien

und der Zeitpunkt des Exogen beschrieben und mit den am dorsalen Hauthaar

der Tiere erhobenen Befunden verglichen.

2.4 Einfluss von Bimatoprost auf das Wimpernwachstum bei der

Maus

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Morphologie und das Wachstum der

Mäusewimpern mit den menschlichen Wimpern gut vergleichbar ist, wurde der

Einfluss von Bimatoprost auf die Morphologie der Wimpern und ihrer Follikel

hinsichtlich der Anzahl, der Dicke, der Pigmentierung qualitativ und quantitativ

untersucht und die Modulation des Wimpernzyklus durch Bimatoprost

beschrieben.

11

Materialien und Methodik

3. Material und Methodik

3.1 Tiere

Es wurden weibliche C57BL/6J Mäuse von Harlan-Winkelman (Borchen,

Deutschland) verwendet, wobei Mäuse im Alter von drei bis sechs Wochen

direkt erworben wurden. Zur exakten Altersbestimmung jüngerer Tiere wurden

trächtige Mäuse gekauft und deren Würfe benutzt. Die Tiere lebten in Gruppen

von vier bis sechs bzw. die trächtigen Mäuse einzeln in einem Käfig, in dem ad

libidum Nahrung sowie Wasser zur Verfügung stand. Sowohl die Temperatur,

die Luftfeuchtigkeit, als auch der 12 Stunden Tag-Nacht Rhythmus wurden im

Laboratorium geregelt und überwacht. Alle Tierversuche wurden von der

Bewilligungsbehörde der Regierung von Mittelfranken genehmigt.

3.2 Probengewinnung

Zur Beschreibung der Morphologie der Wimper, der Entwicklung des Augenlids

und der Morphogenese der Wimpernfollikel im Vergleich zur Morphogenese des

dorsalen Fellhaares wurden unbehandelte Mäuse im Alter von 0,1,2,3,4,5, und

6 Wochen in sieben Gruppen von jeweils zwei bis vier Mäusen unterteilt. Mäuse

bis zu einem Alter von einer Woche wurden durch Dekapitation, die älteren

durch zervikale Dislokation getötet, um chirurgisch bilateral die oberen

Augenlider und dorsal, kaudal des Halses, mittig zwischen den beiden

Schulterblättern, eine Fläche von zwei cm2 Haut zu entnehmen (Fig. 4).

Die rechten oberen Augenlider wurden für vier Stunden in 4%

Paraformaldehyd-PBS fixiert und mit PBS gespült. Sie dienten der

makroskopischen Analyse. Dazu wurden die Wimpernschafte pro Augenlid in

jeder Altersgruppe (n=2-4 pro Gruppe) unter einem Stereomikroskop (Carl

Zeiss, Göttingen, Deutschland) dreimal gezählt und der Mittelwert gebildet.

Manche Augenlider wurden mithilfe einer Rasierklinge dünn geschnitten und auf

einen Objektträger aufgebracht, um die Wimpern unter einem Lichtmikroskop

(Carl Zeiss) betrachten oder Fotografien einziehen zu können (Software: Qwin,

Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland).

Die linken oberen Augenlider wurden eine Nacht in Ito-Lösung fixiert (2,5%

Glutaraldehyd, 2,5% Paraformaldehyd, 0,01% Pikrinsäure in 0,1 mM Cacodylat-

12


Puffer) und im Anschluss daran in Epon eingebettet. Von den Eponblöcken

wurden 1µm dicke Schnittserien (160 Schnitte je Wimper) hergestellt, jeder

zweite mit Toluidinblau (Sigma, Hannover, Deutschland) angefärbt, fotografiert

(Software: Qwin, Leica Microsystems GmbH) und die darin angeschnittenen

Papillen unter dem Lichtmikroskop (Carl Zeiss) einem Morphogenesestadium

bzw. einer Wachstumsphase zugeordnet. Die Wachstumsphase der

Wimpernfollikel wurde mithilfe einer Modifikation der Phaseneinteilung dorsaler

Fellhaare (siehe Kap. 4.3) lichtmikroskopisch bestimmt.

Um die Wimpernmorphogenese mit der Morphogenese der dorsalen Fellhaare

vergleichen zu können, wurde die dorsal entnommene Haut desselben Tieres

oder eines Tieres desselben Wurfes (1 Woche p.p.) analog zur Prozedur des

linken Augenlids präpariert und histologisch, lichtmikroskopisch die

Wachstumsphase der Haare in Serienschnitten bestimmt. Alle Chemikalien

wurden von Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) erworben, sofern nicht anders

vermerkt.

Fig. 4: Schemazeichnung der Probengewinnung.

Es wurden bilateral die oberen Augenlider (Pfeile schwarz) und

dorsal, kaudal des Halses, mittig zwischen den beiden

Schulterblättern, eine 2 cm² große Hautfläche zwischen den

Schulterblättern entnommen (Rechteck weiß).

3.3 Bimatoprostbehandlung

Um den Effekt von Bimatoprost hinsichtlich der Anzahl, der Länge, der Dicke

und der Pigmentierung der Wimpern zu evaluieren, wurden Wimpern von

Mäusen mit 0,03% Bimatoprost Augentropfen (Lumigan®; Allergan, Irvine, CA)

bzw. mit dem Vehikel (NaCl, Na2HPO4, Zitronensäure und Benzalkoniumchlorid

als Konservierungsmittel in gereinigtem Wasser; Allergan, Irvine CA) behandelt.

Vier Wochen alte Mäuse wurden in zwei Gruppen unterteilt, Vehikel (n=10) und

13


Bimatoprost (n=10). Täglich einmal morgens im Zeitraum von 14 Tagen wurden

mit der Pipette in das rechte Auge 3µl 0,03% Bimatoprost Augentropfen, bzw.

Vehikel appliziert. Die linken Augen blieben unbehandelt und dienten als

unbehandelte Kontrolle. Am 15. Tag, im Alter von sechs Wochen, wurden die

Tiere getötet und die oberen Augenlider entnommen. Als Basis-Kontrollgruppe

dienten unbehandelte Mäuse (n=10) derselben Altersgruppe (Fig. 5).

Fig. 5:

Therapieschema.

Schematische Dar-

stellung der Thera-

pie von Basis-

kontroll-, Vehikel-

und Bimatoprost-

gruppe.

3.3.1 Makroskopische Untersuchung

Die oberen Augenlider wurden eine Nacht in Ito-Lösung fixiert (2,5%

Glutaraldehyd, 2,5% Paraformaldehyd, 0,01% Pikrinsäure in 0,1 mM Cacodylat-

Puffer), mit PBS gespült und die Wimpern pro Augenlid unter dem

Stereomikroskop (Carl Zeiss, Göttingen, Deutschland) gezählt. Danach wurde

der temporale Anteil des Augenlids unter dem Stereomikroskop (Carl Zeiss)

exzidiert, mit einer Rasierklinge dünn getrimmt, auf einen Objektträger

aufgebracht und lichtmikroskopisch fotografiert (Mikroskop: Carl Zeiss;

Software: Qwin, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland). Pro

Augenlid wurden drei Wimpern randomisiert aus jeder von drei Längengruppen

(kurz~250µm; mittel~450µm; lang~2500µm) nach technischen Gesichtspunkten

gewählt und der basal, direkt an das Epithel angrenzende Durchmesser dieser

Wimpernschafte, mit geeigneter Software gemessen (Qwin; Leica

Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland).

14


3.3.2 Histologische Untersuchung

Der nasale Rest der Augenlider wurde in Epon eingebettet und je 160 mit

Toluidinblau (Sigma, Hannover, Deutschland) gefärbte Serienschnitte mit einer

Dicke von je 1µm angefertigt (160x1µm/Augenlid). Jeder zweite Schnitt einer

Serie wurde histologisch unter dem Lichtmikroskop fotografiert (Mikroskop: Carl

Zeiss; Software: Qwin, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland). Der

Aufbau des Augenlids wurde beschrieben und Wimpernfollikel von den

Fellhaarfollikeln – von nun an als Haarfollikel bezeichnet – anhand ihrer

Lokalisation, der Wachstumsrichtung und ihrer Schnittachse differenziert. Alle

Wimpernfollikel mit sichtbarer dermaler Papille innerhalb des 160µm

Serienschnittes wurden auf den digital fotografierten Bildern nummeriert und

damit die totale Follikelanzahl pro 160µm evaluiert. Die Wachstumsphase jedes

nummerierten Follikels wurde mithilfe einer Modifikation der

Phasenbestimmung dorsaler Fellhaare lichtmikroskopisch bestimmt (siehe Kap.

4.3). Damit konnte der prozentuale Anteil jeder Wachstumsphase errechnet

werden. Der Durchmesser der dermalen Papille und des Bulbus wurde

lichtmikroskopisch bestimmt, indem die größte Messung der vertikalen

Verbindungslinie relativ zur Achse der Wimper als maximaler Durchmesser

definiert wurde (Fig. 6). Dazu wurde innerhalb des Serienschnittes der

maximale Durchmesser der dermalen Papille bzw. des Bulbus gesucht, dieser

Schnitt lichtmikroskopisch digital fotografiert und mit geeigneter Software die

Länge der Verbindungslinie gemessen (Mikroskop: Carl Zeiss; Software: Qwin,

Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland). Bei dieser Analyse wurden

nur Follikel berücksichtigt, deren Zentrum und damit der

dickste Anteil, innerhalb der 160µm lag.

Fig. 6: Follikel- und Papillendurchmesser.

Der maximale Durchmesser der Papille und des Follikels

wurden lichtmikroskopisch vermessen (siehe rote

Doppelpfeile).

15


In den Serienschnitten der Anagen-late Follikel wurde der Schnitt mit der

maximalen Anzahl der Melaningranula in der keratinogenen Zone gewählt. Die

Melaningranula wurden auf einer Fläche von circa drei Zellen (~60µm) unter

dem Lichtmikroskop gezählt und diese Fläche nach dem Einziehen des

Schnittes mit geeigneter Software vermessen (Mikroskop: Carl Zeiss; Software:

Qwin, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland), so dass die Anzahl

der Melaningranula pro Einheit berechnet werden konnte.

3.4 Statistische Analyse

Die Anzahl der Wimpernschafte der Bimatoprost- gegenüber der Vehikelgruppe

bzw. der Bimatoprost- gegenüber der Basiskontrollgruppe, sowie Vehikel-

gegenüber der Basiskontrollgruppe wurde mit dem zweiseitigen Student„s t-Test

geprüft. Für den Vergleich von behandelten und kontralateral unbehandelten

Wimpern des gleichen Tieres wurde der zweiseitig verbundene t-Test

angewandt. Analog dazu wurde der Durchmesser der Wimpernschafte der

Bimatoprost- zur Vehikelgruppe mit dem zweiseitigen Student‟s t-Test, sowie

behandelte Wimpern versus kontralateral unbehandelte Wimpern des gleichen

Tieres mit dem zweiseitigen verbundenen t-Test auf Signifikanz überprüft. Die

Durchschnittslänge in jeder Behandlungsgruppe wurde zuvor mit einfaktorieller

Varianzanalyse (ANOVA) getestet, um zu bestätigen, dass die Dicke nicht

durch die Varianz in der Länge beeinträchtigt wird. Die Anzahl der Follikel von

Bimatoprost- versus Vehikelgruppe, Bimatoprost- versus Basiskontrollgruppe

und Vehikel- versus Basiskontrollgruppe wurde anhand des zweiseitigen

Student‟s t-Test verglichen. Der prozentuale Anteil jeder Phase wurde durch

den zweiseitigen Z-Test überprüft (Bimatoprost versus Vehikel, Bimatoprost

versus Basiskontrollgruppe und Vehikel versus Basiskontrollgruppe). Der

Durchmesser der Follikel und Papillen sowie die Anzahl der Melaningranula

wurden in Bimatoprost- gegen Vehikelgruppe durch den zweiseitigen Student‟s

t-Test auf Signifikanz überprüft. Für alle Analysen galten p-Verhältnisse kleiner

als 0,05 als statistisch signifikant.

16

Ergebnisse

4. Ergebnisse

4.1 Morphologie des Augenlids

Das Augenlid der adulten Maus zeigte die gleichen anatomischen Strukturen,

wie sie für das menschliche Augenlid beschrieben wurden.[53] Zentral wurde es

durch den Tarsus, das Bindegewebsskelett, gestützt, welchem außen die Pars

palpebralis des M. orbicularis oculi anlag, die von subkutanem Fettgewebe und

Epithel bedeckt wurde. Auf der den Augapfel bedeckenden Innenseite des

Tarsus befanden sich die holokrinen Gll. tarsales, die Meibom-Drüsen, und das

Epithel der Konjunktiva. Das Epithel des Augenlids konnte in drei

unterschiedliche Abschnitte unterteilt werden (Fig. 7), die Konjunktiva, das

Epithel, aus welchem die Wimpern austraten, von nun an mit dem Terminus

Wimpernepithel bezeichnet, und das Hautepithel. Das Epithel der Konjunktiva,

welches dicker als das Hautepithel war, bestand aus einem nicht verhornten

Plattenepithel mit reichhaltig Pigmentgranula im Stratum basale und spinosum

(Fig. 7a). Das Epithel der Haut, aus welchem die Hauthaare austraten, war

dünner und bestand aus verhorntem Plattenepithel. Es konnten keine

Pigmentgranula im Epithel beobachtet werden, nur vereinzelt im dermalen

Bindegewebe (Fig. 7c). Zwischen der Haut und der Konjunktiva, begrenzt durch

den Limb. palpebralis ant. und den Limb. palpebralis post., wobei der Limb.

palb. ant. mikroskopisch durch den Übergang in das Hautepithel dargestellt

werden konnte und der Limb. palb. post. durch den Austritt des

Ausführungsganges der Gll. tarsales, befand sich das Epithel, aus dem die

Wimpern austraten. Dieses Epithel besaß ein dickes Stratum corneum, ein gut

entwickeltes Stratum granulosum mit großen Keratohyalingranula und ein

dickes Stratum spinosum und Stratum basale. Es konnten viele Pigmentgranula

im Stratum basale, spinosum und granulosum beobachtet werden (Fig. 7b).

Wimpern konnten aufgrund ihrer Lokalisation zwischen dem M. orbicularis oculi

und den Gll. tarsales und ihrer Wachstumsrichtung von Fellhaaren

unterschieden werden. Sie wuchsen entgegengesetzt zu den Fellhaaren, so

dass die Wimpern in diesen Schnitten longitudinal und die Hauthaare

transversal geschnitten wurden.

17

Ergebnisse

Fig. 7: Morphologie des Augenlids der Maus.

1µm Semidünnschnitt durch das Augenlid einer sechs

Wochen alten Maus (Toluidinblau) Das Wimpernepithel

befand sich zwischen dem Limbus palbebralis anterior

(Limb. palb. ant) und dem Limbus palbebralis post.

(Limb. palb. post.). Die Wimpernfollikel (W) mit den Gll.

sebaceae (Gl. s) befanden sich zwischen dem M.

orbicularis oculi (MO) und den Gll. tarsales (Gll. t). Sie

waren longitudinal angeschnitten und traten aus dem

Wimpernepithel aus. Dadurch konnten sie von den

Fellharen (FH) unterschieden werden, welche

transversal angeschnitten waren und aus dem

Hautepithel austraten. [Skala=100µm]

(a-c) Vergrößerung der markierten Regionen aus dem

Semidünnschnitt des Augenlids. (a) Das Epithel der

Konjunktiva enthielt Pigmentgranula im Stratum basale

und spinosum (weiße Pfeilspitzen) und im dermalen

Bindegewebe (weiße Pfeile). (b) Das Wimpernepithel

war dick und reich an Pigmentgranula im Stratum

basale, spinosum und granulosum (weiße Pfeilspitzen)

69

18

Ergebnisse

und im dermalen Bindegewebe (weiße Pfeile). (c) Nur

vereinzelt Pigmentgranula im dermalen Bindegewebe

der Haut (Pfeil weiß).

[Skala a-c=10µm; gepunktete Line trennt Epidermis

von dermalem Bindegewebe]

4.2 Morphologie der Wimper

4.2.1 Histologischer Aufbau des Wimpernfollikels

Der morphologische Aufbau des Wimpernfollikels der Maus glich im

Wesentlichen dem der Fellhaare, jedoch besaßen Wimpernfollikel keinen M.

arrector pili (Fig. 8). Die dermale mesenchymale aus Fibroblasten bestehende

Haarpapille im Zentrum des distalen Endes des Follikels besaß in Anagen eine

zwiebelartige Struktur, änderte ihre Form jedoch in anderen Wachstumsphasen.

Diese war von den epithelialen Strukturen im Haarbulbus eingebettet.

Fig. 8: Morphologie des

Wimpernfollikels.

In der lichtmikroskopischen

Darstellung eines mit Toluidinblau

gefärbten Wimpernfollikels in

Anagen konnten alle Strukturen

analog zum Haar dargestellt

werden, es existierte jedoch kein

M. arrector pili. [Skala = 50µm;

IRS: innere Wurzelscheide, ORS:

äußere Wurzelscheide; Gl:

Glandula]

4.2.2 Makroskopische Beschreibung des Wimpernschaftes

Wimpern adulter Mäuse unterschieden sich hinsichtlich ihrer Länge, Dicke,

Pigmentierung und Medullastrukturen. Die Länge der Wimpern variierte

zwischen minimal 0,1 und maximal 2,5mm, die Dicke zwischen 7 und 25µm,

19

Ergebnisse

wobei die Länge mit der Dicke korrelierte. Alle Wimpernschafte wiesen eine

leichte Biegung auf (Fig. 9a). Sie unterschieden sich nicht nur hinsichtlich ihrer

Länge und Dicke, sondern auch hinsichtlich ihrer Pigmentierung und dem

Aufbau der Medulla. Die langen, dicken Wimpern zeigten die stärkste

Pigmentierung, einen dicken Kortex und es wurden Lufteinschlüsse in der

Medulla beobachtet. Die Medulla war in ein- bis zweireihige Septen gegliedert

und könnte damit eine Ein- bis Zweisäulen Struktur formen. Diese war jedoch

auf die dicken Anteile der Wimpern begrenzt (Fig. 9b,c). Einige Wimpern

besaßen einen fibrösen gut pigmentieren Kortex, jedoch keine Medulla (Fig.

9d). Es existierten ebenso Velluswimpern ohne Pigmentierung (Fig. 9e).

Fig. 9: Länge und Matrixstruktur

der Mäusewimpern. (a) Wimpern

von Mäusen unterschiedlicher

Länge und Dicke. Jeder

Wimpernschaft wies eine Biegung

auf. (b-d) Vergrößerung der in

Figur 9a markierten Regionen. Die

Medulla des dicksten Anteils einer

langen Wimper wies eine

Zweisäulen-Struktur infolge von

Lufteinschlüssen auf (b), während

im dünneren Anteil eine

Einsäulen-Struktur beobachtet

werden konnte (c). Diese Bilder

wurden aufgrund der dichten

Pigmentierung überbelichtet, um die Strukturen zu zeigen. Wimpernschaft mit

Pigmentierung des fibrösen Kortex, doch ohne Medullastruktur (d). Vergrößerte

Ansicht einer kurzen und dünnen Wimper (~100µm) ohne Pigmentierung und

Medullastruktur (e). [Skala b-e: 10µm]

4.3 Unterteilung des Wimpernwachstumszyklus

Mithilfe der in den seriell sagittalen Semidünnschnitten lichtmikroskopisch

sichtbaren morphologischen Merkmale (Form, Struktur, Größe der dermalen

Papille und des Bulbus, Zellphasen, Melaningranula, Form bzw. Vorhandensein

69

20

Ergebnisse

der inneren Wurzelscheide, der äußeren Wurzelscheide und des

Wimpernschaftes) wurde der Wachstumszyklus der Wimper in sechs Stadien

unterteilt. Verglichen mit dorsalen Fellhaaren erforderte die Einteilung teilweise

andere Kriterien, da beispielsweise im Augenlid eine Unterteilung in Epidermis,

Dermis und Subkutis nicht möglich war. Deshalb wurden die Kriterien für die

Phasen des dorsalen Fellhaares der Maus[41] in dieser Studie für die Wimpern

modifiziert und mit einer Gliederung in die sechs Phasen Telogen, Anagen-

early, Anagen-middle, Anagen-late, Katagen-early und Katagen-late

vereinfacht.

4.3.1 Telogen

Wimpernfollikel in Telogen (Fig. 10a), der Ruhephase der Wimpern, drangen

meist nicht tiefer als bis zum oberen Drittel des Lids ein. Morphologisch war ein

Wimpernschaft – die Kolbenwimper – zu sehen. Charakteristisch für dieses

Stadium war die relativ kleine, rundlich geformte dermale Papille mit dicht

kondensierten Fibroblasten, lokalisiert im distalen Ende des Follikels. Weder

Zeichen eines neu wachsenden Haares, noch die innere Wurzelscheide noch

Melaningranula konnten in dieser Wachstumsphase detektiert werden.

Telogen

IRS/WS: WS der Kolben-wimper sichtbar.

DP: Am distalen Ende des Follikels war eine runde, kleine kondensierte DP zu sehen.

MG: --- --- ---

Zellphase: --- --- ---

Äquivalent: Telogen

Durchmesser: DP: 14,6±0,6 (µm) Bulbus: 18,2±0,1 (µm) DP/Bulbus: 83,8±2,4 (%) (Mittelwert±SEM; n=35)

Fig. 10a. Wimpernfollikel in Telogen (Ausschnitt eines 1µm dicken mit Toluidinblau

gefärbten Schnittes durch das Augenlid der adulten Maus, Skala=50µm). IRS/ORS:

innere/äußere Wurzelscheide, WS: Wimpernschaft, DP: dermale Papille, MG:

Melaningranula, Gl.: Glandula

69

21

Ergebnisse

4.3.2 Anagen-early

Das Anagen wurde in dieser Studie in die Phasen Anagen-early (Äquivalent:

Anagen I-II), Anagen-middle (Äquivalent: Anagen IIIa-IIIc) und Anagen-late

(Äquivalent: Anagen IV-VI) unterteilt. Analog zu Telogen besaßen die

Wimpernfollikel in Anagen-early (Fig. 10b), der frühen Proliferationsphase,

einen Wimpernschaft. Es wurden nie mehrere Kolbenwimpern in einem Follikel

beobachtet. Durch die Proliferation der Zellen in der dermalen Papille nahm

diese an Größe zu, die Fibroblasten erschienen nicht mehr so dicht gedrängt

wie in Telogen, sondern eher aufgelockert. Durch die Proliferation der

Keratinozyten zwischen der Kolbenwimper und der dermalen Papille nahm der

Abstand des Kolbenhaares zur Papille zu, der Follikel prolongierte in die Tiefe

und Mitosen waren zu sehen. Die äußere Wurzelscheide wurde dicker, um den

die dermale Papille umgebenden Bulbus zu formen. Die innere Wurzelscheide

war noch nicht vorhanden. Melaningranula konnten vereinzelt oberhalb der

dermalen Papille und um sie herum beobachtet werden.

Anagen- early

IRS/WS: WS der Kolben-wimper sichtbar.

DP: DP wurde größer, die Fibroblasten waren locker organisiert.

MG: Vereinzelt MG über und um DP.

Zellphase: Mitose

Äquivalent: Anagen I-II


Fig. 10b. Wimpernfollikel in Anagen-early (Ausschnitt eines 1µm dicken mit

Toluidinblau gefärbten Schnittes durch das Augenlid der adulten Maus, Skala=50µm).

IRS/ORS: innere/äußere Wurzelscheide, WS: Wimpernschaft, DP: dermale Papille,

MG: Melaningranula, Gl.: Glandula

69

22

Ergebnisse

4.3.3 Anagen-middle

Im Follikel von Anagen-middle (Fig. 10c) entstand die innere Wurzelscheide,

welche den neu entstehenden Wimpernschaft umhüllte. Es bestand keine

Verbindung der Spitze der inneren Wurzelscheide mit dem Wimpernkanal. Es

waren deutlich mehr Melaningranula, v. a. in der keratinogenen Zone und der

Matrixzone sichtbar, welche von den Trichozyten aufgenommen und in

Richtung des Haarschafts transportiert wurden. Sowohl die dermale Papille, als

auch der Bulbus erreichten ihre fast maximale Größe, weshalb die Fibroblasten

in der dermalen Papille locker organisiert erschienen. Aufgrund des Wachstums

konnten, wie in allen Phasen des Anagens, Mitosen beobachtet werden.

Fig. 10c. Wimpernfollikel in Anagen-middle.

(Ausschnitt eines 1µm dicken mit Toluidinblau gefärbten Schnittes durch das Augenlid

der adulten Maus, Skala=50µm) IRS/ORS: innere/äußere Wurzelscheide, WS:

Wimpernschaft, DP: dermale Papille, MG: Melaningranula, Gl.: Glandula

4.3.4 Anagen-late

In Anagen-late (Fig. 10d) erreichte die innere Wurzelscheide Anschluss an den

Haarkanal des Kolbenhaares, wodurch der in Anagen entstandene Schaft aus

Anagen-middle

IRS/WS: Trichozyten produ-zierten Trichohyalingranula, um den IRS zu formen (gestrichelte Pfeile). Am Ende der Phase entstand ein neuer WS, jedoch erreichte IRS des WS noch nicht den Wimpernkanal.

DP: DP erreichte fast maximale Größe, die Fibroblasten waren locker organisiert.

MG: Zahlreiche MG von der Matrixzone bis zur Medulla.

Zellphase: Mitosen v.a. im Bulbus (weiße Pfeile).

Äquivalent: Anagen IIIa-IIIc


69

23

Ergebnisse

dem Epithel austrat. Der Schaft des Kolbenhaares verblieb im Haarkanal und

war noch nicht epiliert, so dass in Anagen-late immer zwei aus dem Epithel

austretende Schafte beobachtet wurden. Es wurden Melaningranula nicht nur in

der keratinogenen Zone, sondern auch um die dermale Papille aufsteigend in

die Matrixzone und im Wimpernschaft beobachtet. Der Durchmesser der

dermalen Papille und des Bulbus hatte ungefähr dieselbe Größe wie in Anagen-

early. Die Zellen in der dermalen Papille erschienen weiterhin locker organisiert.

Aufgrund der Proliferation konnten Mitosen beobachtet werden.

Anagen-late

IRS/WS: Spitze der IRS des neu geformten WS erreichte Wimpernkanal und trat aus dem Epithel aus. Die Kolbenwimper verblieb im Follikel.

DP: Fibroblasten der DP waren locker organisiert.

MG: MG über und um DP sowie in der Matrixzone (Pfeile weiß).

Zellphase: Mitose

Äquivalent: Anagen IV-VI


Fig. 10d. Wimpernfollikel in Anagen-late und selber Follikel 12µm vom Schnitt entfernt.

(Ausschnitte 1µm dicker mit Toluidinblau gefärbter Schnitte durch das Augenlid der

adulten Maus, Skala=50µm) IRS/ORS: innere/äußere Wurzelscheide, WS:

Wimpernschaft, DP: dermale Papille, MG: Melaningranula, Gl.s.: Glandula sebacea

4.3.5 Katagen-early

Die Regressionsphase wurde in dieser Studie in Katagen-early (Äquivalent

Katagen I-VI) und Katagen-late (Äquivalent: Katagen VII-VIII) unterteilt. Im

Katagen-early (Fig. 10e) fing der Abbau mit der Degeneration der inneren

Wurzelscheide an, welcher am distalen Ende beginnend langsam zum

proximalen Ende hin fortschritt, weshalb hier Apoptosen beobachtet werden

konnten. Der Schaft des Kolbenhaares verblieb weiterhin im Haarkanal, so dass

69

69

24

Ergebnisse

in dieser Phase analog zum Anagen-late zwei aus dem Epithel austretende

Schafte pro Follikel beobachtet wurden. Die Medulla des neuen

Wimpernschaftes wies in der Nähe der dermalen Papille eine bürstenförmige

Struktur auf. Melaningranula waren zwar vorhanden, aber die Anzahl nahm

stark ab, so dass sie nur noch oberhalb der dermalen Papille in der

keratinogenen Zone lokalisiert waren, jedoch nicht mehr um die dermale Papille

herum. Der Durchmesser der rundlich, ovalen dermalen Papille mit kugelig

dicht gedrängten Zellen war deutlich reduziert. Auch der Durchmesser des

Bulbus nahm ab. Die Degeneration der äußeren Wurzelscheide war deutlich

sowohl an der Abnahme ihres Durchmessers als auch an dem Auftreten von

Apoptosen zu erkennen. Insgesamt nahm auch die Länge des Follikels ebenso

wie der Durchmesser ab, so dass der Follikel kleiner erschien.

Fig. 10e: Wimpernfollikel in Katagen-early und selber Follikel 24µm vom Schnitt

entfernt. (Ausschnitte 1µm dicker mit Toluidinblau gefärbter Schnitte durch das

Augenlid der adulten Maus, Skala=50µm) IRS/ORS: innere/äußere Wurzelscheide,

WS: Wimpernschaft, DP: dermale Papille, MG: Melaningranula, Gl.s.: Glandula

sebacea

Katagen-early

IRS/WS: Degeneration der IRS begann distal. Die Medulla des WS wies ein fibröses, bürstenförmiges Ende in der Nähe der DP auf. Die Kolbenwimper verblieb im Follikel.

DP: DP war klein mit dicht orga-nisierten Zellen.

MG: Deutlich weniger MG, nur noch über keratinogener Zone sichtbar.

Zellphase: Apoptosen im ORS und am proximalen Ende des IRS.(schwarze Pfeilspitzen)

Äquivalent: Katagen I-VI

Durchmesser DP: 21,1±1,9 (µm) Bulbus: 37,6±5,1 (µm) DP/Bulbus: 59,1±8,3 (%) (Mittelwert±SEM; n=4)

69

69

25

Ergebnisse

4.3.6 Katagen-late

In Katagen-late (Fig. 10f) war die innere Wurzelscheide fast vollständig

degeneriert, nur noch fokale Reste im mittleren Drittel des Wimpernfollikels

waren vorhanden. Infolge des Effluviums der Kolbenwimper (Exogen) war nur

noch der in Anagen neu produzierte Wimpernschaft im Haarkanal zu

beobachten. Man konnte viele Apoptosen finden mit einer lokalen Betonung

über der dermalen Papille und um den Schaft, der Stelle der degenerierten

inneren Wurzelscheide. Die dermale Papille wurde kleiner, nahm fast die Größe

analog zu Telogen an, die Zellen erschienen stark kondensiert. Die dermale

Papille befand sich näher am Ende des neuen Wimpernschaftes.

Fig. 10f: Wimpernfollikel in Katagen-late. (Ausschnitt eines 1µm dicken mit Toluidinblau

gefärbten Schnittes durch das Augenlid der adulten Maus, Skala=50µm) IRS/ORS:

innere/äußere Wurzelscheide, WS: Wimpernschaft, DP: dermale Papille, MG:

Melaningranula, Gl.s.: Glandula sebacea

Während des Wimpernzyklus war damit der Durchmesser der dermalen Papille

und des Bulbus in Telogen am kleinsten. In Anagen nahmen die Durchmesser

zu und erreichten in Anagen-middle und Anagen-late ihre maximale Größe.

Katagen-late

IRS/WS: Zurückbildung des IRS mit sichtbarem Rest. Das alte Kolbenhaar wurde aus-gestoßen (Exogen) und war nicht mehr sichtbar.

DP: DP war klein mit konden-sierten Zellen und befand sich nahe am Ende des WS.

MG: --- --- ---

Zellphase: Apoptosen im ORS (schwarze Pfeilspitzen).

Äquivalent.: Katagen VII-VIII

Durchmesser: DP: 14,9±1,0 (µm) Bulbus: 21,1±1,3 (µm) DP/Bulbus: 73±4,2 (%) (Mittelwert±SEM; n=26)

69

26

Ergebnisse

Dabei war der Anstieg des Durchmessers des Bulbus verhältnismäßig größer,

so dass das Verhältnis von dermaler Papille zu Bulbus in Anagen-middle und

Anagen-late kleiner war. (DP/Bulbus: Telogen 82,8%, Anagen-early 85,6%,

Anagen-middle 39,0%, Anagen-late 41,6%, Katagen-early 59,1%, Katagen-late

73,3%). In Katagen nahm der Durchmesser der dermalen Papille und des

Bulbus wieder ab (Fig. 11).

Fig. 11: Durchmesser des Bulbus und der dermalen Papille.

Sowohl der Durchmesser der dermalen Papille, als auch der Durchmesser des Bulbus

stieg in Anagen-middle und Anagen-late an und sank während Katagen, wobei durch

einen verhältnismäßig größeren Anstieg des Durchmessers des Bulbus das Verhältnis

von dermaler Papille zu Bulbus in Anagen-middle und Anagen-late kleiner war.

Im gesamten Wimpernzyklus wurden keine Wimpernfollikel mit zwei

Kolbenhaaren beobachtet. Follikel in Katagen-early besaßen zwei

Wimpernschafte, den Schaft des Kolbenhaares aus Telogen (Wimper alt) und

den neu in Anagen produzierten Schaft (Wimper neu) und Follikel in Katagen-

late nur einen Schaft (Wimper alt). Diese Beobachtung ließ darauf schließen,

dass Exogen während Katagen in jedem Zyklus stattfinden muss (Fig. 12).

27

Ergebnisse

Fig. 12: Anzahl der aus dem Epithel

austretenden Wimpernschafte pro

Follikel. In Katagen-early waren Follikel

mit zwei austretenden Wimpernschaften

vorhanden, in Katagen-late besaßen die

Follikel nur einen Wimpernschaft.

4.4 Morphogenese und erster Zyklus der Wimper

4.4.1 Makroskopie

Bei der Geburt waren die Augenlider der Mäuse verschlossen und es konnten

mithilfe des Stereomikroskops keine Wimpernschafte an der Oberfläche

beobachtet werden. Ab der ersten Lebenswoche wurden vereinzelt

Wimpernschafte sichtbar, wobei die Anzahl bis zu einem Alter von drei Wochen

post partum rasch anstieg. Danach blieb die Anzahl der Wimpern pro Augenlid

während des Beobachtungszeitraumes konstant bei einem Wert zwischen 130

und 150 (Fig. 13).

Fig. 13: Anzahl der

Wimpern während der

Morphogenese. Die

Anzahl der Wimpern

stieg bis zur dritten

Woche an und blieb

danach konstant.

4.4.2 Histologie

4.4.2.1 Morphogenese in Woche 0 post partum

Die generellen Merkmale der Wimpernmorphogenese entsprachen der

Morphogenese dorsaler Hauthaare.[49] Zwar waren bei Geburt Wimpernschafte

an der Oberfläche des Augenlids noch nicht sichtbar, doch die Anfangsstadien

der Morphogenese waren bereits unter der Haut des noch verschlossenen

28

Ergebnisse

Augenlids in den mikroskopischen Schnitten zu beobachten (Fig. 14a, links).

Epidermale Verdickungen, Wimpernknospen, des relativ dicken und

Keratohyalingranula haltigen Epithels waren infolge einer Kumulation von

Keratinozyten und Fibroblasten sichtbar (St. 1). In die Tiefe elongierte Keime

mit einer Ansammlung von Fibroblasten am distalen Ende wurden beobachtet

(St. 2) und ein beginnender Einschluss dieser Fibroblasten in den Haarkeim (St.

3) deuteten die Entwicklung der dermalen Papille an (Fig. 14a, Mitte).

Insgesamt konnte zu diesem Zeitpunkt kurz nach der Geburt nur eine begrenzte

Anzahl an Follikeln unterschiedlicher Morphogenesestadien beobachtet

werden.

Diese Stadien ähnelten den Morphogenesestadien der dorsalen Fellhaare (Fig.

14a, rechts).

Fig. 14a: Woche 0 post partum.

Skala schwarz=100µm, Skala weiß=20µm, M.o.: Muskulus orbicularis oculi

Fig 14a-g: 1µm dicke mit Toluidinblau angefärbte Schnitte durch das Augenlid (links)

bzw. durch die dorsale Haut (rechts) einer Maus des entsprechenden Alters mit

vergrößerter Ansicht von nummerierten Wimpernfollikeln (Mitte).

Links: Die weiße gepunktete Linie trennt das noch verschlossene Ober- vom

Unterlid. Es waren Follikel in den Morphogenesestadien 1-3 sichtbar

(schwarze Pfeile).

Mitte: Vergrößerte Ansicht von Follikel 1;2;3 im Serienschnitt 9;9;4µm entfernt.

Epidermale Verdickung und Ansammlung dermaler Fibroblasten im St. 1(1).

Kondensation der Fibroblasten im St. 2(2). Entstehung der dermalen Papille

im St. 3 (3).

Graph: Alle im linken Schnitt angeschnittenen Follikel befanden sich in den

Morphogenesestadien 1-3.

Rechts: Die dorsalen Hauthaare desselben Tieres waren in unterschiedlichen

Morphogenesestadien.

69

29

Ergebnisse

4.4.2.2 Morphogenese in Woche 1 post partum

Die Augenlider waren zwar auch in der ersten Woche post partum noch

verschlossen, doch nahm die Anzahl der Follikel (Fig. 14b, links) rasch zu und

es konnten bereits vereinzelt Wimpern an der Oberfläche beobachtet werden.

Die Follikel befanden sich in unterschiedlichen Wachstumsphasen der

Morphogenese (Fig. 14b, Mitte). Es waren Follikel in frühen

Morphogenesestadien zu finden, in welchen die äußere Wurzelscheide begann

die dermale Papille zu umschließen. Aber auch spätere Stadien waren sichtbar,

in welchen sich die innere Wurzelscheide und die Melanogenese entwickelten

und Sebozyten die Talgdrüse formten.

Die meisten Fellhaare befanden sich zu diesem Zeitpunkt im Stadium 8 der

Morphogenese (Fig. 14b, rechts).

Fig. 14b: Woche 1 post partum.

Skala schwarz=100µm, Skala weiß=20µm, M.o.: M. orbicularis oculi, Gll.t. Gll. tarsales

Links: Die weiße gepunktete Linie trennt die noch verschlossenen Lider. Follikel im

St. 3 (schwarzer Pfeil 1); St. 4 (weiße Pfeilspitze), wobei die dermale Papille

fast von der äußeren Wurzelscheide umschlossen war; St. 6 (weißer Pfeil) mit

Entwicklung des IRS und Melanogenese und St. 8 (schwarzer Pfeil 2).

Mitte: Vergrößerung von Follikel 1;2 im Serienschnitt 1;20 µm entfernt. Der

Wimpernkeim war im St. 3 (oben) noch nicht von der äußeren Wurzelscheide

umschlossen. Eine Wimper im St. 8 (unten) mit fast entwickelter Talgdrüse

erreichte fast den Haarkanal.

Graph: Die im linken Schnitt angeschnittenen Follikel befanden sich in

unterschiedlichen Morphogenesestadien. (nicht eindeutig zuordenbare

Stadien im Graph zwischen den Phasen dargestellt)

Rechts: Die dorsalen Hauthaare eines Tieres desselben Wurfes befanden sich am

Ende der Morphogenese.

69

30

Ergebnisse

4.4.2.3 Beginn des ersten Wimpernzyklus in Woche 2 post partum

In der zweiten Woche post partum hatten alle Wimpernfollikel die

Morphogenese abgeschlossen (Fig. 14c, links). Ein großer Anteil der Follikel

befand sich in Katagen und Telogen, vereinzelt wurden aber auch Follikel in

Anagen-early gefunden (Fig. 14c, Mitte). Damit hatte der Eintritt in den ersten

Wachstumszyklus bereits begonnen. Im Gegensatz dazu befanden sich alle

dorsalen Hauthaare in Katagen oder Telogen (Fig. 14 c, rechts).

Fig. 14c: Woche 2 post partum.

Skala schwarz=100µm, Skala weiß=20µm, M.o.: M. orbicularis oculi

Links: Follikel in Katagen-early (weiße Pfeilspitzen), Katagen-late (weiße Pfeile) und

Anagen-early (schwarzer Pfeil).

Mitte: Vergrößerte Ansicht vom Follikel (schwarzer Pfeil) im selben Schnitt (1) bzw.

39µm entfernt (2), aus welcher Ebene das Kolbenhaar und damit der Beginn

von Anagen deutlich wird.

Graph: Die meisten im linken Schnitt angeschnittenen Follikel befanden sich in

Katagen und Telogen, teilweise aber auch in Anagen.

Rechts: Die dorsalen Hauthaare desselben Tieres befanden sich in Katagen und

Telogen.

4.4.2.4 Woche 3 post partum

In der dritten Woche post partum befanden sich alle Wimpernfollikel in Anagen-

middle oder Anagen-late, somit in Anagen und damit synchron in einer Phase

des Wachstumszyklus (Fig. 14d links). Alle dorsalen Hauthaare konnten

Telogen zugeordnet werden (Fig. 14d rechts).

69

31

Ergebnisse

Fig. 14d: Woche 3 post partum.

Skala schwarz=100µm, M.o.: M. orbicularis oculi, Gll. t.: Gll. tarsales

Wimpernfollikel in Anagen (links und Graph), die dorsalen Hauthaare desselben Tieres

in Telogen (rechts). (nicht eindeutig zuordenbare Stadien im Graph zwischen den

Phasen dargestellt)


In der vierten Woche post partum befand sich der Großteil der Wimpern in

Telogen (Fig. 14e, links), nur ein kleiner Teil in Katagen oder Anagen-early

(nicht gezeigt). Die dorsalen Hauthaare hingegen wurden synchron in Anagen-

early vorgefunden (Fig. 14e, rechts).

Fig. 14e: Woche 4 post partum.


Wimpernfollikel in Telogen, vereinzelt in Katagen-late (links und Graph), die dorsalen

Hauthaare desselben Tieres in Anagen (rechts).


In der fünften Woche post partum begann der zweite Zyklus der Wimpern,

welche sich teilweise in Telogen, teilweise in Anagen-early (Fig. 14f, links)

befanden. Die dorsalen Hauthaare wurden noch in Anagen-late vorgefunden.

(Fig. 14f, rechts).

69

69

32

Ergebnisse

Fig. 14f: Woche 5 post partum.


Ein neuer Zyklus der Wimpernfollikel begann mit Telogen und Anagen (links und

Graph), die Hauthaare desselben Tieres befanden sich in Anagen-late (rechts).


In der sechsten Woche post partum ließen sich Wimpernfollikel in

verschiedenen Wachstumsphasen darstellen (Fig. 14g, links).

Die Synchronität des Wachstumszyklus der dorsalen Hauthaare blieb noch

erhalten. Sie befanden sich in Katagen (Fig. 14g, rechts).

Fig. 14g: Woche 6 post partum.

Skala schwarz=100µm, Skala weiß=20µm M.o.: M. orbicularis oculi

Links: Follikel in unterschiedlichen Phasen, z. B. in Telogen (Pfeil 1), Anagen-early

(Pfeil 2) und Anagen-late (Pfeile 3).

Mitte: Vergrößerte Ansicht von Follikel 1;2;3 im Serienschnitt 18;0;50µm entfernt.

Kompakte dermale Papille in Telogen (1). Aktive Proliferation und große

dermale Papille in Anagen-early (2). Aktive Proliferation und Melanogenese in

Anagen-late (3).

Graph: Die im linken Schnitt angeschnittenen Wimpernfollikel wurden in

verschiedenen Phasen beobachtet.

Rechts: Die dorsalen Hauthaare desselben Tieres befanden sich in Katagen-late.

69

69

33

Ergebnisse

Zusammenfassend endete die Morphogenese der Wimpern analog zum

Fellhaar zwischen der ersten und zweiten Woche. Sofort nach der

Morphogenese begann der erste Wimpern- bzw. Haarzyklus. Dieser erste

synchrone Wimpernzyklus schritt schneller voran, verglichen mit dem dorsalen

Hauthaar (Fig. 15).

Fig. 15: Chronologische Darstellung der Morphogenese und des ersten Zyklus der

Wimper im Vergleich zum Hauthaar.

Sowohl bei den Wimpern als auch bei den dorsalen Fellhaaren begann ein

synchronisierter Zyklus sofort nach der Morphogenese, welcher bei den Wimpern

schneller voranschritt.

4.5 Bimatoprostbehandlung

4.5.1 Makroskopische Untersuchung

Die Analyse der Wimpern unter dem Stereomikroskop ergab keine Anomalitäten

als Folge der Bimatoprostbehandlung im Vergleich zu den kontralateralen

unbehandelten Wimpern (Fig. 16).

Fig. 16: Makroskopischer Vergleich

der Wimpern.

Kein makroskopischer Unterschied

zwischen repräsentativen kontra-

lateralen unbehandelten (Bimato-

prost-kl) und mit Bimatoprost be-

handelten Wimpern (Bimatoprost).

[Skala=100µm]

Die Anzahl der Wimpernschafte pro Augenlid stieg unter

Bimatoprostbehandlung signifikant von ~142 bei den Kontrollen auf ~168 bei

Bimatoprost behandelten Tieren an (Fig. 17). Damit erhöhte sich die Anzahl

der Wimpern pro Augenlid unter Bimatoprostbehandlung statistisch signifikant,

69

34

Ergebnisse

verglichen mit der Basiskontrollgruppe, der Vehikelbehandlung und den

unbehandelten kontralateralen Wimpern. Zwischen den unbehandelten

Kontrollen (Basiskontrollgruppe und kontralateral unbehandelte Wimpern) und

Vehikel-behandelten Wimpern gab es keinen Unterschied.

Fig. 17: Anzahl der Wimpern.

Grafik: Die Anzahl der Wimpern nahm unter Bimatoprostbehandlung signifikant zu im

Vergleich zu allen anderen Gruppen. (*: signifikanter Unterschied (p<0,05), ns: nicht

signifikanter Unterschied)

Tabelle: Anzahl der Wimpern pro Augenlid als Mittelwert±SEM

[n=10 pro Gruppe, Basis: Basiskontrollgruppe; Vehikel/Bimatoprost: rechte behandelte

Augen der Vehikel/Bimatoprost Gruppe; Vehikel-KL/Bimatoprost-KL: linke

unbehandelte Augen der Vehikel/Bimatoprost Gruppe]

Die Wimpern wurden anhand ihrer Länge in drei Gruppen unterteilt

(lang~2570µm, mittel~451µm, kurz~250µm). Die detaillierte Länge,

aufgeschlüsselt nach Behandlungsgruppen, entnehme man Tab. 1. Die

Mittelwerte jeder Behandlungsgruppe wurden mit der einfaktoriellen

behandeltes Auge unbehandeltes Auge (KL)

Basis 144,15±5,34

Vehikel 145,65±5,42 140,35±6,62

Bimatoprost 168,30±3,89 138,75±5,43

35

Ergebnisse

Varianzanalyse ANOVA auf signifikante Unterschiede innerhalb der jeweiligen

Längengruppe überprüft, um eine mögliche Interferenz der Dicke durch zu

große Varianz in der Länge auszuschließen.

Vehikel Vehikel-KL Bimatoprost Bimatoprost-KL Mittelwert

lang 2616,72±42,66 2565,51±32,09 2605,32±45,42 2493,58±44,38 2570,28±20,95

mittel 441,95±10,67 440,54±16,22 451,52±10,32 468,37±11,91 450,60±6,25

kurz 246,46±6,49 244,99±6,91 261,69±5,72 247,19±6,51 250,08±3,23

Tab. 1: Länge der Wimpern, aufgeschlüsselt nach Behandlungsgruppen.

Mittelwert der Länge der Wimpern in µm±SEM [n=3 Wimpern pro Längengruppe bei 10

Augenlidern pro Behandlung] in den Gruppen lang, mittel und kurz aufgeschlüsselt

nach der jeweiligen Behandlung (Vehikel, Vehikel kontralateral (KL), Bimatoprost und

Bimatoprost kontralateral (KL).

Unter Bimatoprostbehandlung nahm der Durchmesser von mittellangen und

kurzen Wimpern signifikant zu (Fig. 18). Es resultierte in keiner Längengruppe

ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Dicke zwischen mit Vehikel

behandelten und kontralateral unbehandelten Augen. Im Gegensatz dazu

waren die mit Bimatoprost behandelten Wimpern signifikant dicker in den

Gruppen „mittel“ und „kurz“, verglichen mit den unbehandelten kontralateralen

Augen, nicht jedoch in Gruppe „lang“. Analog dazu konnte eine Signifikanz

hinsichtlich der Dicke bei den mit Bimatoprost behandelten Wimpern im

Vergleich zu Vehikel behandelten Wimpern in den Gruppen „mittel“ und „kurz“

nachgewiesen werden, nicht jedoch in Gruppe „lang“.

36

Ergebnisse

Vehikel Vehikel-KL Bimatoprost Bimatoprost-KL

lang 22,74±0,82 21,62±0,74 23,19±0,79 21,99±0,70

mittel 12,54±0,60 12,01±0,62 15,75±0,84 12,14±0,65

kurz 7,19±0,42 7,70±0,42 9,79±0,64 7,80±0,55

Fig. 18: Durchmesser der Wimpern.

Grafik: Der Durchmesser der Wimpern nahm unter Bimatoprostbehandlung

(Bimatoprost) signifikant bei mittellangen und kurzen Wimpern zu, nicht jedoch bei den

langen Wimpern, verglichen mit kontralateralen unbehandelten Wimpern (Bimatoprost-

KL/Vehikel-KL) und mit Vehikel behandelten Wimpern (Vehikel). (*: signifikanter

Unterschied (p<0,05), ns: nicht signifikanter Unterschied)

Tabelle: Durchmesser der Wimpern als Mittelwert in µm±SEM

[(n(Wimper)=3 pro Augenlid; n(Augenlid)=10 pro Längengruppe]

4.5.2 Histologische Untersuchung

Die Anzahl der Follikel stieg unter Bimatoprostbehandlung nicht an. Die

Follikelanzahl ergab innerhalb 160µm in der unbehandelten Basiskontrollgruppe

(4 Wochen p.p.) 14,60±0,64 [n=10], unter Vehikelbehandlung (6 Wochen p.p.

am Ende der Behandlung) 15,33±1,01 [n=9] und unter Bimatoprostbehandlung

(6 Wochen p.p. am Ende der Behandlung) 16,00±1,05 [n=9] [Mittelwert±SEM].

Die Anzahl war somit in allen Gruppen ähnlich, es konnte kein signifikanter

Unterschied nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass der

wachstumsstimulierende Effekt von Bimatoprost trotz der höheren

Wimpernanzahl (siehe oben) nicht auf eine de novo Bildung von Wimpernfollikel

zurückgeführt werden konnte (Fig. 19).

Fig. 19: Anzahl der Follikel.

Kein Unterschied hin-

sichtlich der Follikelanzahl

in der Basiskontrollgruppe

(n=10), der Vehikel Gruppe

(n=9) und der Bimatoprost

Gruppe (n=9).

37

Ergebnisse

Der prozentuale Anteil von Anagen stieg und der von Telogen sank unter

Bimatoprostbehandlung. Alle gezählten Follikel innerhalb der 160µm eines

Augenlids wurden einer der sechs Phasen des Wachstumszyklus der Wimper

zugeordnet (Kriterien siehe oben). Aufgrund der mangelnden Anzahl der Follikel

in Anagen-middle und Anagen-late wurden diese beiden Phasen in der

Berechnung zusammengefasst. Zwischen der Basiskontrollgruppe und der mit

Vehikel behandelten Gruppe waren keine signifikanten Unterschiede in der

prozentualen Phasenverteilung feststellbar. Im Gegensatz dazu sank der

prozentuale Anteil von Telogen und Katagen-late unter Bimatoprostbehandlung

signifikant und der Anteil von Anagen-early und Anagen-middle/late stieg

signifikant im Vergleich zur vier Wochen alten Kontrollgruppe an. Katagen als

Gruppe (Katagen-early und Katagen-late) wies keinen signifikanten Unterschied

beim Vergleich von Bimatoprost- zur Kontrollgruppe auf. Unter

Bimatoprostbehandlung ließ sich ein signifikanter Unterschied von Telogen,

Anagen-middle/late und Anagen als Gesamtgruppe, verglichen mit der

Vehikelbehandlung, feststellen (Fig. 20). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin,

dass Bimatoprost den prozentualen Anteil der Anagenfollikel, vor allem den in

der Anagen-middle/late Phase, erhöhte.

38

Ergebnisse

Telogen Anagen-early

Anagen-middle/late

Katagen-early

Katagen-late

Basis 56,3 12,5 11,7 3,9 11,6

Vehikel 51,2 20,9 13,5 6,4 7,5

Bimatoprost 38,1 25,2 22,6 6,4 4,6

Fig. 20: Prozentuale Verteilung der Phasen.

Grafik: Phasenanteil in Kontrollgruppe (4 Wochen p.p.; n=10), Vehikel Gruppe (6

Wochen p.p.; n=9) und Bimatoprost Gruppe (6 Wochen p.p.; n=9). Nicht

klassifizierbare Follikel innerhalb der 160µm wurden als unbekannt bezeichnet. Kein

signifikanter Unterschied zwischen Kontroll- und Vehikelgruppe. Signifikanter

Unterschied zwischen Bimatoprost und Basiskontrollgruppe (Basis) (p<0,05, Sterne) in

Telogen, Katagen-late, Anagen-early und Anagen-middle/late. Signifikanter

Unterschied zwischen Bimatoprost und Vehikelgruppe (p<0,05, Kreuze) in Telogen,

Gesamtanagen und Anagen-middle/late.

Tabelle: Prozentangaben der Phasenverteilung.

Der Durchmesser der Follikel in Anagen-early vergrößerte sich unter

Bimatoprostbehandlung. Da der Durchmesser des Haarschaftes direkt mit dem

Volumen der dermalen Papille korreliert,[70],[73] wurde der maximale

Durchmesser der Papille und des Bulbus unabhängig voneinander in Anagen-

early und Anagen-late gemessen (Tab. 2). Der Durchmesser des Bulbus unter

Bimatoprostbehandlung war signifikant größer in Anagen-early, verglichen mit

Vehikelbehandlung, nicht jedoch in Anagen-late. Diese Ergebnisse deuteten

darauf hin, dass die durch Bimatoprost induzierte Verdickung der

Wimpernschafte mit der Verdickung der dermalen Papille korrelierte.

Anagen-early Anagen-late

dermale Papille Bulbus dermale Papille Bulbus

Vehikel 18,4±1,1 25,1±3,0 27,9±2,5 69,4±4,7

Bimatoprost 20,25±0,8 32,5±2,4*

25,8±1,6 68,6±3,6

Tab. 2: Durchmesser der dermalen Papille und des Bulbus.

Mittelwert der Länge in µm ± SEM, n=22 (Vehikel, Anagen-early), n=33 (Bimatoprost,

Anagen early), n=15 (Vehikel, Anagen-late), n=12 (Bimatoprost Anagen-late).

*: Signifikanter Unterschied (p<0,05)

39

Ergebnisse

Die Anzahl der Melaningranula unter Bimatoprostbehandlung war nicht

signifikant erhöht. Da die Hyperpigmentierung der Wimpern in Folge von

Therapie mit PGF-2α Analoga beschrieben wurde,[27] wurde die Anzahl der

Melaningranula im Bulbus von Follikeln in Anagen-late analysiert. Die Anzahl

der Melaningranula betrug 1,13±0,06 unter Vehikelbehandlung und 1,44±0,18

unter Bimatoprostbehandlung (Mittelwert pro µm2±SEM). Es konnte kein

signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen nachgewiesen

werden (Fig. 21).

Fig. 21: Zahl der Melaningranula.

Die Anzahl der Melaningranula pro µm

in Anagen-late schien in der

Bimatoprostgruppe höher, war jedoch

nicht signifikant (n=12 pro Gruppe).

40

Diskussion

5. Diskussion

5.1 Vergleich der Morphologie der Wimpern der Maus mit

menschlichen Wimpern und mit den Fellhaaren

Die Morphologie des Augenlids der Maus glich im Wesentlichen der des

menschlichen Augenlids.[53] Analog zu den menschlichen Wimpern[42]

existierten auch bei der Maus Wimpern unterschiedlicher Länge, Dicke und

Pigmentierung, sowie mit unterschiedlich aufgebauter Medulla. Betrachtete man

den Wimpernschaft, so wiesen die Wimpern der Maus, verglichen mit dem

dorsalen Hauthaar, einen dickeren Kortex, eine stärkere Pigmentierung und

eine gerade Struktur ohne Knicke auf, wie sie in dorsalen Zig-Zag Haaren der

Maus beobachtet wurden.[15] Dies untermauert die Funktion der Wimpern zum

Schutz vor Partikeln oder Sonnenlicht. Der Aufbau der Medulla der Wimper

ähnelte dem Monotrich-Haar.[13] (auch als Guard-Haar bezeichnet[15],[60]). Im

Gegensatz dazu zählte der größte Anteil dorsaler Fellhaare zur Gruppe der Zig-

Zag Haare.[15] Dies könnte auf einen unterschiedlichen Ursprung oder

verschiedene Regulationsmechanismen der Wimpern im Gegensatz zu

Fellhaaren hindeuten. Die Wimpern waren in der Regel gut pigmentiert, wobei

die Pigmentierung bei dicken Wimpern stärker ausgeprägt war.

5.2 Vergleich der Morphogenese und der frühen Entwicklung der

Wimpern mit der der Fellhaare

Analysen hinsichtlich der Morphogenese und der frühen Entwicklung der

Wimpern wurden zur Planung des optimalen zeitlichen Ablaufs der

experimentellen Studie durchgeführt. Im Wesentlichen unterschied sich im

Modell der Maus die Morphogenese der Wimpernfollikel nicht von der

Morphogenese dorsaler Fellhaarfollikel. Die makroskopischen Beobachtungen

hinsichtlich der austretenden Wimpernschafte deuteten auf einen ähnlichen

zeitlichen Ablauf der Morphogenese, verglichen mit dem dorsalen Fellhaar,

hin.[50] Im Anschluss an die Morphogenese durchliefen die Wimpern den ersten

synchronisierten Zyklus analog zum dorsalen Fellhaar, welcher jedoch etwas

früher begann, nämlich schon in der zweiten Woche, und schneller

voranschritt.[49] Die in der Haarwissenschaft oft als Angriffspunkt benutzte

41

Diskussion

synchrone Telogenphase dorsaler Fellhaare, in der siebten Woche p.p., am

Ende des ersten Zyklus vor der Transition in den asynchronen Zyklus,

entspräche bei den Wimpern wohl am ehesten der vierten Woche post partum.

5.3 Vergleich des Wachstumszyklus und des Exogens der Wimper

mit der dorsaler Fellhaare

Gerade in taktilen Haaren und damit auch in Guard-Haaren und Tasthaaren ist

Exogen ein streng regulierter Prozess, vermutlich um mit nur einem Kolbenhaar

pro Follikel die taktile Funktion zu gewährleisten.[13],[24] Im Gegensatz dazu

findet das Effluvium dorsaler Fellhaare nicht während jedes Zyklus statt.[39] Das

Exogen des Hauthaares ereignet sich während Anagen,[39] im Tasthaar läuft es

während des Überganges von Anagen zu Katagen ab,[13],[24] in der Wimper

während des Katagens. Die Daten dieser Studie zeigten, dass das Exogen der

Wimpern analog zu taktilen Haaren während des Durchlaufens jedes Zyklus

stattfand. Fehlregulationen des Exogen könnten hinsichtlich des

Pathomechanismus der Trichomegalie eine wichtige Rolle spielen.

5.4 Effekte von Bimatoprostbehandlung

Die Untersuchungen dieser Studie zeigten, dass durch Bimatoprost bei der

Maus tatsächlich Trichomegalie erzeugt werden konnte, wie es beim Menschen

beschrieben ist.[34],[35],[44],[71] Trotz der Zunahme der Anzahl der Wimpernschafte

nahm die Anzahl der Wimpernfollikel nicht zu. Es gab es in dieser Studie keinen

Hinweis für de-novo Follikelerzeugung. Die Induktion einer de-novo

Follikelgeneration aus adultem Epithel ist beispielsweise durch Überexpression

des Wnt/β-Catenin Pathways möglich.[16],[26] Diese Studie ergab jedoch keine

Hinweise auf morphologisch unreife oder anormale Wimpernfollikel, welche

Follikelneogenese aus dem mit Bimatoprost behandelten Epithel

wiederspiegeln würden. Eine de-novo Generation von Follikeln wurde ebenso

nicht beim Auftragen anderer PGF-2α Analoga auf dorsale Haut beschrieben.[59]

Viele Haarwachstum stimulierende Substanzen, wie Cyclosporin, Minoxidil oder

PGF-2α Analoga induzieren den Anagen-Eintritt von ruhenden

Haarfollikeln.[36],[38],[59] Dennoch konnte ein Anstieg der Wimpernzahl nicht allein

42

Diskussion

durch die Induktion von Anagen und einen daraus resultierenden schnelleren

Progress des Wachstumszyklus erklärt werden, da die Wimpernfollikel Exogen

während jedes Zyklus durchliefen und damit jeder Wimpernfollikel nur eine

Kolbenwimper besaß.

Eine mögliche Erklärung für die steigende Anzahl der Wimpern durch

Bimatoprost Therapie könnte eine steigende Anzahl der Wimpernschafte bei

gleich bleibender Follikelanzahl sein. Das Exogen der Wimpern fand während

jedes Zyklus in jedem Follikel statt, so dass die Follikel während Anagen-late

bis Katagen-early ein zwei-Schaft-pro-Follikel Verhältnis aufwiesen.

Bimatoprost beeinflusste die Regulation von Exogen und das ein-Schaft-pro-

Follikel Verhältnis nicht. Doch Bimatoprost beeinflusste die Anagenphase, was

zu einer erhöhten Anzahl der Follikel in der zwei-Schaft-pro-Follikel Phase

führte, im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Wimpern. Dies würde eine

erhöhte Anzahl an Wimpernschaften ohne steigende Follikelanzahl erklären.

5.5 Zunahme der Wimperndicke und Hyperpigmentierung durch

Bimatoprost

Es ist bekannt, dass PGF-2α Analoga Vellushaar in terminales ausgereiftes

Haar, beispielsweise im Bereich der Wangen- und Kanthalregion,

umwandeln[20],[27] und die Melanogenese in Haarfollikeln aktivieren.[59] In dieser

Studie induzierte die Bimatoprostbehandlung eine Zunahme der Dicke der

mittellangen und kurzen Wimpern, welche durch die histologische Evaluation

der Bulbusdicke weiter verifiziert wurde. Da Veränderungen hinsichtlich der

Form und Dicke nach dem Entstehen der massiven inneren Wurzelscheide

während des Wachstumszyklus nur schwer möglich sind,[28] wird die Dicke und

Form der Wimper in Anagen-early bestimmt. Zwar war die Behandlung in dieser

Studie kurz, doch resultierte eine effektive Verdickung der Anagen-early

Follikel. Dennoch schien eine makroskopische Verdickung der mittellangen und

kurzen Wimpern im Widerspruch zur nicht nachgewiesenen Vergrößerung der

Follikel in Anagen-late zu stehen. Ursache hierfür könnte die kurze

Behandlungsdauer und die geringe Anzahl der Follikel in Anagen-late sein,

welche die Evaluationskriterien erfüllten, so dass eine Größenzunahme der

Follikel nicht signifikant validiert werden konnte.

43

Diskussion

Eine Hyperpigmentierung durch PGF-2α Analoga wurde nicht nur in

Wimpern,[74],[27] sondern auch in der Iris,[1],[10],[61],[67] dem Augenlid,[27]

periokulär[23],[75] und im dorsalen Fellhaarfollikel[59] beschrieben. In der Iris war

die Verdunklung auf eine Größenzunahme der Melaningranula ohne

Einflussnahme auf die Anzahl zurückzuführen.[9],[10] In dieser Studie konnte

ebenfalls keine Zunahme der Melaningranula durch die Bimatoprost Therapie

nachgewiesen werden, eine Veränderung der Melaningranula wäre möglich,

war jedoch lichtmikroskopisch nicht messbar. Die unterschiedliche Dichte der

Melaningranula im selben Follikel, die variierende Größe der Follikel selbst und

die lichtmikroskopisch nicht messbare Größe der Melaningranula, limitierten die

morphometrische Methodik.

5.6 Wimpernverlängerung durch Bimatoprost

Die durch Bimatoprost induzierte Wimpernverlängerung wurde in dieser Studie

indirekt durch die Bestimmung der Wachstumsphase jedes einzelnen Follikels

dargestellt. Da die Dauer der Anagen-Phase die Länge der Wimper

bestimmt,[48] deuteten die Daten dieser Studie auf eine Verlängerung der

Wimpern als Folge einer Beeinflussung des Wachstumszyklus hin. Die

prozentuale Verteilung der Wachstumsphasen unter Bimatoprost Therapie

könnte dahingehend interpretiert werden, dass Telogen Wimpernfollikel früher

in die Anagenphase eintraten. Diese Induktion der Telogen zu Anagen

Konversion stimmt mit beschriebenen Mechanismen durch Applikation von

PGF-2α Analoga auf dorsale Fellhaare überein.[59] Dennoch resultiert nicht

allein aus der Induktion des Anagen eine längere Dauer der Anagenphase. In

dieser Studie wurde gezeigt, dass der Anteil der induzierten Anagen Follikel

nicht in Anagen-early, sondern in Anagen-middle/late größer war. Dies indiziert,

dass Bimatoprost hauptsächlich Anagen-middle/late prolongierte, indem es

möglicherweise den Übergang in Katagen behinderte. Während der Anagen-

middle/late Phase der Wimpern, der äquivalenten Anagen IIIa-c Phase der

dorsalen Fellhaarfollikel, entstand der Haarschaft und es wurde aktive

Keratinisierung beobachtet.

44

Literaturverzeichnis

6. Literaturverzeichnis

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2010 Br J Dermatol: 162(6) 1186-97 Mit freundlicher Genehmigung von John Wiley und Söhne

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49

Abkürzungsverzeichnis

7. Abkürzungsverzeichnis

A(e) Anagen-early

A(l) Anagen-late

A(m) Anagen-middle

ant. anterior

Äqu. Äquivalenz

bzw. beziehungsweise

C Kohlenstoff

ca. circa

COX Cyclooxygenase

DP dermale Papille

EGRF epidermal growth factor receptor

Fig. Figur

Gl. Glandula

Gl. s. Glandula sebacea

Gll. t. Glandulae tarsales

HIV Human Immunodeficiency Virus

IOP intraocular pressure (Intraokularer Druck)

IRS innere Wurzelscheide (inner root sheath)

K(e) Katagen-early

KL kontralateral

K(l) Katagen-late

Limb. Limbus

M. Musculus

MG Melaningranula

M. o. Musculus orbicularis oculi

N. Nervus

n Anzahl

ns nicht signifikant

ORS äußere Wurzelscheide (outer root sheath)

palp. palpebralis

PBS phosphate buffered saline

PGE Prostaglandin E

50

Abkürzungsverzeichnis

PGF Prostaglandin F

PGF-2α Prostaglandin F-2α

PGG Prostaglandin G

post. posterior

p.p. post partum

SEM standard error of the mean

St. Stadium

T Telogen

Tab. Tabelle

v.a. vor allem

WS Wimpernschaft

µm µMeter

51

Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

8. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

M. Tauchi, T.A. Fuchs, D. F. Woodward, E. Lütjen-Drecoll “Characterization of

Eyelash Growth in Mice.” The 13th Annual Meeting of European Hair Research

Society, Genoa, Italy (2008)

M. Tauchi, T.A. Fuchs, D.F. Woodward, E. Lütjen-Drecoll “Bimatoprost-induced

hypertrichosis of eyelashes: murine model.” The Association for Research in

Vision and Ophthalmology, annual meeting, Fort Lauderdale, Florida, U.S.A.

(2009)

Tauchi M., Fuchs T.A., Woodward D.F., Lütjen-Drecoll E. “Murine eyelashes as

a study model for hypertrichosis or alopecia of eyelashes.” The Society of

Investigational Dermatology, annual Meeting, Montreal, Canada (2009)

Tauchi M, Fuchs TA, Woodward DF, Lütjen-Drecoll E “Murine Eyelashes as a

Study Model for Hypertrichosis or Alopecia of Eyelashes.” The 14th annual

Meeting of European Hair Research Society, Graz, Austria (2009)

M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, R. Paus, E. Lütjen-

Drecoll “Characterization of an in vivo-model for the study of eyelash biology.”

The 6th World Congress for Hair Research, Cairns, Australia (2010)

M. Tauchi, T.A. Fuchs, A.J. Kellenberger, D.F. Woodward, R. Paus, E. Lütjen-

Drecoll. “Characterization of an in vivo-model for the study of eyelash biology

and trichomegaly: Mouse eyelash morphology, development, growth cycle, and

anagen prolongation by bimatoprost.” British Journal of Dermatology (2010)

52

Lebenslauf

9. Danksagung

Mein größter Dank gilt Frau Prof. Dr. med. Lütjen-Drecoll, Direktorin des

Anatomischen Institutes II der Universität Erlangen-Nürnberg, die mich von

Anfang an für die Anatomie begeistert hat. Ich danke ihr ganz herzlich für die

Themenstellung. Ohne ihre uneingeschränkte Förderung, ihre Unterstützung,

ihren Antrieb und ihr Engagement wäre diese Arbeit nie möglich gewesen.

Frau Dr. med. vet. Dr. rer. nat. Miyuki Tauchi, wissenschaftliche Mitarbeiterin

des Anatomischen Institutes II, an die ich mich jederzeit bei Fragen jeglicher Art

wenden konnte, danke ich sehr für ihre Anleitung und Einführung in die

Thematik, ihre Hilfe und ihre freundliche Art.

Den medizinisch-technischen Assistentinnen Elke Kretzschmar, Gertrud Link

und Anke Fischer danke ich für ihre technische Expertise und Unterstützung.

Meinen Eltern möchte ich an dieser Stelle ganz herzlich danken, dass sie mir

das Studium ermöglicht und mich immer gefördert haben. Lucia möchte ich für

die liebevolle Unterstützung danken.

Charakterisierung eines in vivo Modells zur Untersuchung ... · Aus dem Lehrstuhl für Anatomie II...

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