CHE 324 Anorganische Chemie V - chem.uzh.chffffffff-8715-1fc6-ffff-ffffb5f38e... · ACV HS 2012-1....

ACV HS 2012-1

Bioanorganik: Metalle in der Biochemie und BiologieBioanorganik: Metalle in der Biochemie und BiologieCHE 324 Anorganische Chemie VCHE 324 Anorganische Chemie V

R. Alberto, E. Freisinger, G. Gasser G. Patzke, R. Sigel, B. Spingler, F. ZelderHS 2012

ACV HS 2012-2

Übersicht

Woche 1 – 2: R. Alberto; Einführung – Hydrogenase - Nitrogenase

Woche 3 – 4: B. Spingler; DNA / RNA / Cisplatin

Woche 5 – 6: E. Freisinger-Sigel; Metallohomöostasis– Detoxifikation

Woche 7 – 8: G. Patzke; Biomineralisation – Polyoxometallate

Woche 8: Verteilung der Vortragsthemen

Woche 9 – 10: F. Zelder; Tetrapyrrole - Corrine und Corphine

Woche 11 – 12: R. Sigel; ATP Hydrolyse / Polymerase

Woche 13 – 14: Vorträge

CHE324 Anorganische Chemie VCHE324 Anorganische Chemie V

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W. Kaim, B. Schwederski: Bioanorganische Chemie, Teubner Studienbücher, 2005

S.J. Lippard, J.M. Berg: Principles of Bioinorganic ChemistryUniversity Science Books, 1994 (1995 in German)

H.A.O. Hill, P.J. Sadler, A.J. Thomson (eds.): Metal sites in proteins and models, Springer (series)1999

J.A. Cowan: Inorganic Biochemistry, Wiley-VCH 1997

R.J.P. Williams, J.J.R. Frausto da Silva: The natural selection of the elementsClarendon Press, 1997

Literatur:


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1. Die speziellen Eigenschaften von Übergangsmetallkationen

2. Die Selektion der Elemente

3. Ausgewählte Beispiele

3.1. Kupferhaltige O2 Transporter und Aktivierer

3.2. Nitrogenasen / N2 – Fixierung

3.3. Hydrogenasen und Wasserstoff

3.4. Metallfreie Hydrogenase, a fake ?


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In biologischen Systemen sind Übergangsmetallkationenessentielle Bestandteile

- Das sogenannte "biologische Periodensystem" gibt Auskunft überessentielle metallische und nicht-metallische Elemente

- Einige dieser Elemente sind echte Spurenelemente, andere kommen in grösseren Mengen vor. Von einigen ist der essentielle Charakter ungewiss.

1. Die speziellen Eigenschaften von Übergangsmetallkationen1. Die speziellen Eigenschaften von Übergangsmetallkationen

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Rollen von Metallkationen:

- als katalytische Zentren

- in Transportprozessen

- als Strukturbildner

- als Speichermedien

In Prozessen, in denen Metalle involviert sind, genügt die reine Reaktion nicht, Es sind noch andere Charakteristika verlangt, die eben nur Metalle übernehmen können

z. Bsp. Phosphatesterspaltung

Die speziellen Eigenschaften von ÜbergangsmetallkationenDie speziellen Eigenschaften von Übergangsmetallkationen

Metallkationen sind im dem Sinne nicht einmalig,

Viele rein organische Enzyme können einige der prinzipiellen Reaktionstypen katalysieren.

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high spin low spin

— — — —

— — — — — —

Ionenradien

- high spin / low spin Wechsel durch verändertes Ligandenfeld oder -wechsel

Einfluss auf den Ionenradius rFe2+ (hs) = 78 (65) pm vs rFe2+ (ls) = 61 (55) pm

Einfluss auf Koordinationsgeometrie, Kinetik und Thermodynamik

z. Bsp. [FeIIpor]-Cl vs [FeIIpor]-CO

Die speziellen Eigenschaften von ÜbergangsmetallkationenDie speziellen Eigenschaften von Übergangsmetallkationen

Übergangsmetallkationen haben eine variable d-Elektronenbesetzung

Eigenschaften welche inhärent an diese dx Konfiguration gebunden sind

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Wechsel der Grösse bei gleicher Oxidationsstufe ist nur bei Übergangsmetallen möglich

Konsequenzen für die Bioanorganik

Variable Anzahl von Liganden und Koordinationsgeometrie

Metall induzierte strukturelle Veränderungen im Proteingerüst

induzierte Aktivität an anderen Stellen im Enzym.

Die speziellen Eigenschaften: IonenradienDie speziellen Eigenschaften: Ionenradien

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- Redoxpotentiale spielen eine wichtige Rolle, sei das bei reinen Elektronenübertragungsreaktionen oder bei Atomtransferreaktionen (Oxygenasen, Hydrogenasen etc.)

- Eine einmalige Eigenschaft der Übergangsmetallkationen ist die Verfügbarkeit von verschiedenen Oxidationsstufen, welche für wässerige Systeme teilweise recht

ungewöhnlich sein können.

- Da die Grösse der Redoxpotentiale inhärent mit der elektronischen Struktur verbunden ist, können diese einfach beeinflusst werden.

Die speziellen Eigenschaften: RedoxpotentialeDie speziellen Eigenschaften: Redoxpotentiale

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Art der Ligandeni) HSAB Prinzip, passt der Ligand zur Oxidationsstufe?

ii) Coliganden, nicht vom Makromolekül abgeleitet (i.e. Porphyrine, Corrine...)

Geometrie der Ligandeni) starre Geometrie, der Oxidationsstufe angepasst / nicht angepasst

ii) flexible Geometrieiii) Donor / Akzeptorfähigkeiten

- Metallzentrumi) Mögliche Oxidationsstufenii) Nachbarmetalle (Cluster)

Wie in der Koordinationschemie werden Redoxpotentiale durch verschiedene Faktoren beeinflusst und können für ein bestimmtes Zentrum von

oxidierend bis reduzierend gehen.

Einflussfaktoren:


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Im Gegensatz zu den p-Elementen: d-Elemente wechseln ihre Bindungspartner leicht

Dies bedeutet jedoch nicht, dass die Bindungen sehr schwach sindsondern nur dass eine kleine Energiebarriere überwunden werden muss.

schneller Ligandaustausch: mechanistisches Prinzip und weniger thermodynamisches

Damit der Ligandaustausch schnell erfolgen kann, muss:

- die LFSE klein sein (im Idealfall 0)

die Geometrie des „Grundzustandes“ nahe beim Übergangszustand sein -(s. entatisches Prinzip später)

der Übergangszustand stabilisiert sein

Die speziellen Eigenschaften: AustauschreaktionenDie speziellen Eigenschaften: Austauschreaktionen

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Eine wichtige Kenngrösse stellt die Wasserselbstaustauschrate dar.


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- Schnelle biochemische Katalyse: Substrat/Produkt on/off rate muss gross sein.

Typische inerte Kationen werden in der bioanorganischen Chemie selten gefunden.


Es sind keine e--Transferreaktionen zwischen Metalloproteinen bekannt, welche nach dem Innensphärenmechanismus ablaufen.

-Elektronentransferreaktionen meistens nach Aussensphärenmechanismus(mechanistisch grosses Interesse)

nieder koordinierte Kationen (KZ

4): assoziativ (Kinetik 2. Ordnung)

höheren Koordinationszahlen KZ

6): dissoziativ (Kinetik 1. Ordnung)

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Die spezielle elektronische Struktur der Übergangsmetallkationen bewirkt über die Koordination von Substratmolekülen deren Aktivierung.

Diese Aktivierung erfolgt auf vielerlei Art und Weise

Erniedrigung des pKa von koordinierte H2 O resp. Stabilisierung von M-OH

Die speziellen Eigenschaften: Aktivierung kleiner MoleküleDie speziellen Eigenschaften: Aktivierung kleiner Moleküle

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Lewis Acidität erleichtert den nucleophilen Angriff an nicht aktivierten Substratmolekülen

Reaktion ist ohne Metalle unter physiologischen Bedingungen nicht beobachtbar

M = Cu2+ > Co2+ < Mn2+ < Ca2+ (I-W Reihe)


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Die meisten Reaktionen mit O2 und organischen Substraten sind verboten und deshalb sehr langsam (Spinmutliplizität)

Durch „Spinübertragung“ auf das Metallzentrum werden sie erlaubt.z. Bsp. die meisten O-Übertragungsreaktionen aus O2

Isomerisierungen bei Vitamin B12

R CO

HR—CH3 + O2 + H2 O

S T S S

2 CuI + O2 2 CuII + O22- + 2 CuI + H2 OR C

O

H

Angeregt T

T D + D S S SSonst S

- Stabilisierung und Generierung von Radikalen

2 H+ + 2 e-


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- Koordination von inaktiven Molekülen wie N2 oder CH4 oder CO2 .

-Reduzierende (elektronenreiche) Mo-Cluster können über -Rückbindung N2 koordinieren und reduzieren. Initialschritt ist die Koordination von N2

H3N NH3

H3N N

Ru

NH3

NH3N

2+

Ru N N

-

+

-

+

-

- +

+ -

Bindungsmodell:

Gefüllte Orbitale schraffiert

Trotz Aktivierung ein langsamer Prozess mit grossem ATP Bedarf


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Viele Metallkationen nehmen mit sterisch anspruchlosen Liganden eine streng definierteGeometrie ein, in der Regel KZ = 6 oder 4 mit den entsprechenden Geometrien

Wie vorher gesehen, können biologische Makromoleküle einem Metallkation eine Geometrie aufzwingen und damit die Metalleigenschaften bestimmen.

Mn+ + Protein M-Protein inaktiv aktiv

vs Mn+ + Protein M-Protein

inaktiv aktiv

Mn+ + Protein M-Protein inaktiv aktiv

vs Mn+ + Protein M-Protein

inaktiv aktiv

- Der eigentlich aktive Teil ist nicht das Metall sondern das Protein

der umgekehrte Fall wird häufig angetroffen

ohne Metall ist das Enzym (Apoenzym) wirkungslos.

Die speziellen Eigenschaften: KoordinationsgeometrieDie speziellen Eigenschaften: Koordinationsgeometrie

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Metallkation aktiviert Enzym Kontrollmechanismus über [Mn+]

Steuerung über bevorzugte Liganden oder Koordinationsgeometrie

Anspruchsvolle Koordinationssphären: KoordinationsgeometrieZn2+, Zn-Finger, Genregulation

Anspruchslose Geometrie, variable DonorenCa2+, Calmodulin, second messenger

Die speziellen Eigenschaften: KoordinationsgeometrieDie speziellen Eigenschaften: Koordinationsgeometrie

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1) Metallkationen können variable Koordinationszahlen haben

Anbindung und Aktivierung von Substraten wegen resultierender Lewisacidität

2) Metallkationen können variable Koordinationsgeometrien haben

fine tuning von elektronischen Eigenschaften wie Redoxpotentialen

3) Liganden können mit geringen Strukturveränderungen substituiert werden

schneller Ligandaustausch, schnelle (aber unspezifische) Katalyse

4) Metallkationen können die Grösse (bei gleicher Oxidationszahl)ändern

variable Anzahl Liganden, redox(in)aktiv

5) Metallkationen können über breite Oxidationsstufen variieren

Atomtransferreaktionen, Redoxreaktionen, Elektronenspeicher

Funktion der Metalloenzyme

Die speziellen Eigenschaften: ZusammenfassungDie speziellen Eigenschaften: Zusammenfassung

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je nach gewünschter Reaktion kann ein bestimmtes Metallzentrum gewählt werden

z. Bsp. schnelle Hydrolyse von Peptiden

Ansprüche:

- Substratanbindung- Lewisacidität ( Acidifizierung von H2 O)

- geringe Strukturänderungen- kein Redox

Lösung: Zn2+!!

Die speziellen Eigenschaften: ZusammenfassungDie speziellen Eigenschaften: Zusammenfassung

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In dieser vereinfachten Darstellung wird Ea auf Ea' reduziert, oder :

Stabilisierung des Übergangszustandes

- Damit wird er statistisch wahrscheinlicher und die Reaktion schneller

- Die meisten „chemischen“ Katalysen folgen diesem Prinzip

Katalysatoren dienen der Beschleunigung von Reaktionen, die Energiedes Übergangszustandes wird erniedrigt

Das entatische PrinzipDas entatische Prinzip

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Möglich, indem im Grundzustand keine reguläre, sondern eine verzerrte und damit

aktivierte Geometrie vorliegt, welche den Übergangszustand schon vorgebildet hat.

Das Protein ist damit in einem gespannten (entatischen) Zustand. Es zwingt

dem Metall eine “nicht optimale“ Koordinationsgeometrie auf.

Das gleiche Ziel wird erreicht, wenn der Grundzustand destabilisiert wird


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Viele Enzyme zeigen im metalllosen (Apoenzym) und im metallhaltigen Zustand

keine oder nur geringfügige strukturelle Veränderungen auf.


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Die meisten Reaktionsabläufe welche enzymkatalysiert ablaufen, folgen einem sogenannten Michaelis-Menten Mechanismus

E + S ES P + E

Damit entspricht der Mechanismus in etwa einem Vorgleichgewichtsmechanismus mit Ausnahme, dass E wieder in dieses Ggw eingreift.

k1

k1 'k2

k1 [E][S]k1 ' + k2

k1 ([E0 ] - [ES]) [S]k1 ' + k2

E = Enzym, S = Substrat mit [E] + [ES] = [E0 ]

mit [S] = [S0 ]

[ES] =

[ES] =

Michaelis-Menten KinetikMichaelis-Menten Kinetik

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variiert also linear mit [E0 ] woraus k2 direkt abgelesen werden kann

k1 [E0 ][S]k1 ' + k2 + k1 [S]

dPdt

k2 [S]KM + [S]

k1 ' + k2

k1

dPdt = k2 [E0 ]

= k [E0 ] mit k =

die Michaeliskonstante ist

nach Umformung folgt

[ES] =

wobei KM =

Substrat in sehr grossem Überschuss: Gleichung reduziert sich auf

oder mit


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Die Reaktion ist O. Ordnung in S

k2 heisst maximal turn over Zahl [sec-1] und

kB [E0 ] die maximale Geschwindigkeit der enzymatischenReaktion.

für Verhältnisse [S] << [Km]:

1 1 KMk k2 k2 [S]= +

Plot von 1/k gegen 1/[S] gibt direkt KM (und k2 )

ohne jedoch k1 ' und k1 zu ergeben aus


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Auswahl der Elemente für biologische Prozesse: abhängig von mehreren Faktoren

-Die absolute Menge an Element in der Erdkruste oder im Wasser

-Die chemische Form der Elemente

-Die Möglichkeit zur Mobilisierung dieser Elemente

Während der erste Punkt in absoluten Werten mehr oder weniger fixiert ist, ist der 2. und 3. Punkt ganz wesentlich von Umgebungsbedingungen abhängig,

vorwiegend pH und Redoxpotentialen.

Diese Variablen beeinflussten im Laufe der Evolution sowohl die chemische Form wie damit auch die Verfügbarkeit.

2. Die Selektion der Elemente2. Die Selektion der Elemente

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Während die Elemente der 2. und 3. Übergangsmetalle an sich schon selten und damit schwierig verfügbar sind, sind die

Elemente der 1. Übergangsmetallreihe vergleichsweise häufig.

Die Verfügbarkeit hat sich aber im Laufe der Evolution signifikant verändert

Die Selektion der ElementeDie Selektion der Elemente

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Im Gegensatz dazu ist heute Fe2+ nicht vorhanden, während Cu2+ und Zn2+ existent sind.

Ein guter Überblick über die Verhältnisse sowie über die Verfügbarkeiten gibt diefolgende Figur, welche die Leichtigkeit darstellt, mit welcher die Elemente aus der

Kruste herausgelöst werden können.

Die Selektion der ElementeDie Selektion der Elemente

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-Redoxaktivität, welche über die Ligandsphäre getunt werden kann,

-eine Koordinationsgeometrie die stark vom Oxidationszustand abhängig ist

-sehr schnellen Ligand/substrataustausch

- starke Lewisacidität

Aktivierung von Substraten

Tatsächlich finden sich für viele aktiven Eisenenzyme funktionell ähnliche Kupferenzyme

Kupfer als aktives Metall kann Eisen in vielen Reaktionen ersetzen.

Hr: Hemerythrin Fe2+-Fe2+ Fe2+-Fe3+ Fe3+-Fe3+

Hc: Hemocyanin Cu+-Cu+ Cu+-Cu2+ Cu2+-Cu2+

deoxy semi-met met

O2 Transporter

3. Ausgewählte Beispiele: Cu-haltige O2 Transporter und Aktivierer3. Ausgewählte Beispiele: Cu-haltige O2 Transporter und Aktivierer

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Die verschiedenen Zentren in Cu-Enzymen geben Hinweise auf ihre Funktion

Typ 1 Typ 2

- koordinativ gesättigt- stabile Liganden

- stark tetraedrisch verzerrt

- koordinativ ungesättigt- praktisch planar

- ESR aktiv

CuN N

S-

SCH3

HN NH

(met)

(His) (His)

(Cys-)

- dimeres mit und ohne Brücke- 2 oder 3 histidine

-ESR inaktiv -(antiferromagnetisch gekoppelt)

Typ 3

3. 1. Cu-haltige O2 Transporter und Aktivierer3. 1. Cu-haltige O2 Transporter und Aktivierer

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O2 Bindung in Typ III Kupferzentren

-staggered imidazoles along Cu……Cu bond

-kein Brückenligand

- praktisch planar

Hämocyanin (Arthropoden und Mollusken) Struktur von deoxy-Hc

(his)3 Cu……Cu(his)3

Cu-haltige O2 Transporter und AktiviererCu-haltige O2 Transporter und Aktivierer

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- Im Unterschied zu Hb ist Hc ein teilweise kooperatives System

- Hr und Hc kommen in einigen Wirbellosen vor

-Im Gegensatz zu Hb/Mb, wo O2 im wesentlichen als Neutralmolekülgebunden ist, findet Hc (und Hr) ein 2-Elektronen Redoxprozess statt

- Gebunden ist in jedem Fall O22- wie über Resonanz-Ramanspektroskopie

eindeutig gezeigt werden konnte

Hemocyanin

O2 Bindung zwingt strukturelle Änderung auf.

praktisch planare N2 (O2 )N2 Koordination ein his in quadratisch-planare Anordnung

Basis für Kooperation in den multimeren Hc Proteinen.z. Bsp. trigonal antiprismatisches Hexamer

(bis 48 subunits bekannt)


ACV HS 2012-37

- In Oxy-Hc sind die beiden Cu (II) Zentren so stark antiferromagnetischgekoppelt, dass der Komplex diamagnetisch ist.

- Intensive Übergänge bei 450 bis 700 nm stark blau- Ramanaktive Bande bei 803 cm-1 (O-O stretching)

- Modellkomplex mit III zeigte grosse Ähnlichkeit mit Hc

- Annahme dass Struktur so aussieht, bevor X-ray des Proteins erhältlich war

CuO

OCu

Cu Cu OO

oder CuO

CuO

oder


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-O2 Reduktion und Aktivierung für den Einbau stellt ein Mehrelektronenprozess dar

- Oxidasen koppeln den 1-, 2- oder 4-e- Prozess der Substratoxidation zum 2- oder 4- e-

der Reduktion von O2 zu H2 O2 oder H2 O

- Oxygenasen bauen entweder 1 oder 2 Sauerstoffatome ins Substrat ein

oxidases 2 electron 2 RH + O2 2 R + H2O2RH2 + O2 R + H2O24 RH + O2 4 R + 2 H2O

4 electron 2 RH2 + O2 2 R + 2 H2ORH4 + O2 R + 2 H2O

monooxygenases External(uncoupled)

S + RH2 + O2 SO + R + H2OS' + RH2 + O2 S' + R' + H2O2

Internal SH2 + O2 SO + H2Odioxygenases Intramolecular S + O2 SO2

Intermolecular S + Co + O2 SO + CoO

aRHn = reductant; S = substrate; S' = poor substrate; Co = cofactor

Oxidase and Oxygenase Reactions

Der Übergang von Cu-O2 Transportern zu Oxidasen, Oxygenasen


ACV HS 2012-39

Mechanismus einer Aminoxidase


ACV HS 2012-40

- zeigen sowohl C-H Oxidation in aromatischen Systemen, wie auch Oxidation von phenolischen Gruppen zu Ketogruppen (Catecholase, Cresolase)

Monooxygenase vom Typ Tyrosinase (dimere Typ III Cu-Einheit)

+ O22 2 + 2 H2 O

+ AH2 + O2 + A + H2 O


ACV HS 2012-41

OHHO

CuII CuIIN O

N O N

N

O O

CuII CuIIN O

N O N

N

Cu+ Cu+N

N N

N

OHHO

OO

CuIICuIIN N

OH NN

CuII CuIIN

N N

N

OH

OO

O

CuII CuIIN O

N O N

N

OH

+ H2 OH+

2H+

met

oxy-D

oxy

oxy-T

H+

Diphenolasecycle

Monophenolasecycle

deoxymet-D

3H+

+ H2 O2H+

O2

OO

Oxidation von Phenolen zu Chinonen

Mechanismus einer dinuklearen Tyrosinase

ACV HS 2012-42

Es ist eine interessante Parallele zwischen Hc/ Tyrosinase und den dinuklearen Fe-Zentren in Hr und MMO feststellbar

beide haben

- reversible O2 Anbindung

- gemischte Funktionen als Oxidasen/Oxygenasen,

abhängig von Proteinstruktur in welche sie eingebettet sind.


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Begriffe im globalen N2 Kreislauf

-N2 - Fixierung N2 + 3H22NH3

H°R = -46.2 kJ / molS°R = -198 en6° R = -16.7 kJ / mol

N2 + 10H+ + 8e-

eNitrogenas

bar1/C20

'A/K/Fe

bar100/C400

-Nitrifizierung NH4+ + 2O2 NO3

- + H2 O + 2e-

-Denitrifizierung 2NO3- + 12H+ + 10e- N2 + 6H2 O

z.B. Flavobakterien für O2 Gewinnung

2 [NH4 ]+ + H2

Dies ist eine relativ grobe Einteilung, es sind auch N-Verbindungen in anderen

Oxidationsstufen beteiligt z.Bsp. NO2-, NO etc.

3.2. Nitrogenase – N2 Fixierung3.2. Nitrogenase – N2 Fixierung

ACV HS 2012-44

Vor der Einführung des Haber Prozesses, waren Gewitter und vulkanische Aktivitäten die einzigen Zulieferer von fixiertem N2 neben der bakteriellen Tätigkeit.

Heute ist die N2 Fixierung aus menschlichen Prozessenvergleichbar mit natürlichen Kreisläufen.

Gesamt Umsatz N2 :

250 – 300 · 106 t/y = 1 ppm von N2 gesamt

Jedes N-Atom ca. 4000 x transformiert(O2 nur ca. 60 x)

Nitrogenase – N2 FixierungNitrogenase – N2 Fixierung

ACV HS 2012-45


ACV HS 2012-46

N2 wird ausschliesslich durch ....

.....Prokaryonten (Z.B. Azobacter)

.....Rhizobium Knöllchenbakterien

.....Blaualgen....

Bilanzen:Gewitter + 30 ·106 t Dünger + 80 ·106

Biologie + 175 ·106 t Nitrifikation –20 ·106

Denitrifikation – 210 ·106

gesamt ~O

....fixiert und in eigene Aminosäuren etc. eingebaut oder als NH4+ abgegeben.


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NH4+ + 3O2 + 2H2 O 2NO2

- + 4H3 O+

2NO3- + O2 2NO3

-

dann NO3- - NH2

resp. -NH2 CO(NH2 )2 NH3 + CO2

Pflanzen bevorzugen NO2- und nicht NH4

+, deshalb bauen aerobeMikroorganismen NH4

+ über NO2- zu NO3

- unter Energiegewinn ab.

Nitrosomas:

Nitrobacter:

damit ist der Kreislauf wieder geschlossen


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Mikroorganismen: diazotroph

Azobacter vinelandii: aerobClostridium pasteurianum: anaerobKlebsiella pneumoniae: je nachdem

die meisten haben keine agronomische Bedeutung, da freilebend (schwimmend)

nur symbiotische sind von Bedeutung

N2 + 8H+ + 16 Mg ATP + 8 e- 2 NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 PO4 3-N2 + 8H+ + 16 Mg ATP + 8 e- 2 NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 PO43-

4 Klassen von N2 -Enzymen, 3 sehr ähnlich, eine ist Superoxidabhängig.

in allen Mo-abhängigen Nitrogenasen ist die Struktur stark konserviert

Annahme gilt auch für Rhizobia (agronomisch relevant)


ACV HS 2012-49

Die overall Struktur von Nitrogenase aus Azobacter vinelandii

setzt sich aus 2 Komponenten zusammen.Komponente II

Komponente I


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Das Fe-Protein ist eine homodimere Einheit,

wobei der [4Fe-4S] Cluster die beiden Einheiten verbindet.

Das Fe-Protein enthält zusätzlich 2 Bindungsstellen für Nukleotide,

eine auf jeder Einheit.


ACV HS 2012-51

Das FeMo-Protein ist ein 2 2 tetramer, welche je einen neuartigen

[8Fe-7S] Cluster (P-Cluster) und einen MoFe Cofaktor enthalten


ACV HS 2012-52

Insgesamt stellt sich die Organisation in der Nitrogenase schematisch wie folgt dar:

ACV HS 2012-53

Mechanistische Vorstellung des Transfers von einem Elektron

- Das Fe-Protein scheint nur die Rolle eines Reduktionsmittels zu spielen,

Rolle in Wirklichkeit viel komplexer

- Es finden Wechselwirkungen zwischen Fe-Cluster, Nucleotiden und

Bindungsstelle FeMo-Protein statt

-Substrat (N2 ) Reduktion findet ausschliesslich mit dem Fe-Protein statt

-Der FeMoCo kann reduziert oder oxidiert werden (durch kleine Moleküle)

es findet aber keine N2 -Reduktion ohne die anderen Teile statt

" Driving force" ist nicht der beschränkende Schritt


ACV HS 2012-54

Bild der Situation im Fe-Protein

Fe-Protein ist nicht nur Reduktionsmittel

rot: ohne gebundenens Nukleotidblau: mit gebundenem MgADP und [AlF4 ]-


ACV HS 2012-55

Wichtige (ungelöste) Fragen:

- Wie ist MgATP Bindung mit e--Transfer und Substrat Reduktion verknüpft?

- Was ist die Rolle des P-Clusters im e- -Transfer?

- Wie bindet das Substrat im FeMoco?

Nukleotid-[4Fe-4S] Cluster: ~15Å

Signal Übertragung durch Konfromationsänderung

Signal Übertragung bis zum eigentlichen Substrat

Switches


ACV HS 2012-56

[4Fe-4S]

Geht je zu einem terminalen cystein in [4Fe-4S]

Signifikante Konformationsunterschiedemit / ohne Nukleotid

Nukleotid Bindung wird an [4Fe-4S] weitergegeben

Mechanistische Betrachtungen


ACV HS 2012-57

Wichtiger Schritt ist auch die Assoziation von Fe-Protein mit FeMo-Protein

Diese Konformationsänderung wird als Switch I bezeichnet

Gemäss Stöchiometrie muss nach jedem e- Transfer das Fe-Protein

dissozieren und einer neuen Komponente II Platz machen!!!

Rate limiting step

-Switch I ist Kommunikationsweg zwischen Fe-Protein und FeMo-Protein

Postulat für Mechanismus:

MgATP + Fe-Protein

Assoziation

Dissoziation

e--Transfer

HydrolyseMgADP + Fe-Protein


ACV HS 2012-58

Der [8Fe-7S] – Cluster – P-Cluster

liegt an der Granzfläche -, -subunit, ~10Å im Inneren verborgen

und ungefähr äquidistant zu [4Fe-4S] und [FeMoCo]

Cluster Struktur:

Zwei Würfel, über ein gemeinsames, sechsfach koordiniertes “S“ verbrückt.

Im Proteingerüst verankert, 2-terminale cys, 2 verbrückende cys pro subunit

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Katalytische Rolle des P-Clusters

Elektronen fliessen von Fe-Protein zu P-Cluster,

welcher diese(s) an den FeMoCo weitergibt.

sehr kurzlebiges Intermediat

zuerst Oxidation (durchFeMoCo) und dann Reduktion oder v.v ??


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Elektronentransfer von P-Cluster zu FeMoCo

DistanzDonor - Akzeptor E0 Unterschiede

Natur des “Mediums”Effizienz in biologischem e--Transfer abhängig von:

vier parallele -Helizes gehen von P-Cluster zu FeMoCo,

zwei davon sind direkt über cys in P-Cluster verankert

und führen in die direkte Umgebung von FeMoCo


ACV HS 2012-61

Das Herz des Katalysators, der Eisen-Molybdän Cofaktor (FeMoCo)

FeMoCo vollständig in -subunit der Komponente I

aufgebaut aus [4Fe-3S] und [3Fe-3S-Mo], abgeleitet aus würfelartigen Strukturen

homocitrat an Mo gebunden

gegenseitige Enden über cys / his im Proteingerüst verankert


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Mo Koordination, 3S, 2O, 1N

entlang der Proteinachse


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In der ursprünglichen Ansicht sind 6 Fe trigonal (!) koordiniert

Eine neuere hochaufgelöste Struktur zeigt aber in der Mitte der

Cluster ein unbekanntes Atom X (N, C, oder O?)

Einsle et al. Science, 2002, 279, 1696


ACV HS 2012-64

Das Herz des Katalysators, der Eisen-Molybdän Cofaktor (FeMoCo)Spielt dieses X eine Rolle im katalytischen Zyklus?

Reaktivitätsstudien mit 15N2 haben gezeigt, dass X nicht durch

15N in der Katalyse ausgetauscht wird (ENDOR Messungen)


ACV HS 2012-65

Substrat Bindungsstellen am FeMoCo

Verschiedene Möglichkeiten, aber keine eindeutig verifiziert

- Kleine, olefinische Substrate reagieren mit Nitrogenase und werden

reduziert, z.Bsp. C2 H2 , CS2 , C2 H4 etc

- CO ist ein potenter Inhibitor

Diese kleinen Moleküle verlangen aber nur wenig Elektronen

2 H+ + 2e- H2

C2 H2 + 2 H+ + 2e- C2 H4


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Substrat Bindungsstellen am FeMoCo


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Mechanismus Substratbindung und Reduktion

Thorneley-Lowe stellten ein Modell vor, welches der sukzessiven

Elektronenlokalisation am FeMoCo Rechnung trägt

Dieser Mechanismus ist prinzipiell akzeptiert


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Mechanismus Substratbindung und Reduktion: DFT

Bei der Katalyse wird immer ein H2 frei pro Reduktion von einem N2

auch bei hohen (50 atm) N2 Drucken.

ohne N2 wird H+ sehr effizient zu H2 reduziert

Bei der Katalyse wird immer ein H2 frei pro Reduktion von einem N2

auch bei hohen (50 atm) N2 Drucken.

ohne N2 wird H+ sehr effizient zu H2 reduziert


ACV HS 2012-69

Nitrogenase: Mechanismus, nochmaliger Überblick


ACV HS 2012-70

Die einfachste Reaktion in der Chemie

2H+ + 2e- H2

Benötigt sehr komplexe Enzyme, um sie in Wasser und bei RT durchzuführen

Intensive biologische und chemische Studien werden gemacht, um diese

Reaktionen in Brennstoffzellen oder zur H2 -Produktion zu verwenden.

Wasserstoff Zeitalter

3.3. Hydrogenasen3.3. Hydrogenasen

ACV HS 2012-71

H2 existiert als ortho- und para-Wasserstoff

o-H2 p-H2 G0 = -0.08 kJ/mol

Umwandlung ohne Katalysatoren dauert Jahre

Mit Katalysatoren (paramagnetische Substanzen) Sekunden

durch Absorption an Al2 O3 kann o-H2 in 99% Reinheit gewonnen werden

Hydrogenasen: Einige Eigenschaften von H2 Hydrogenasen: Einige Eigenschaften von H2

ACV HS 2012-72

H2 2H+ + 2 e- Eo = -0.41V (pH=7)

Die einfachste Reaktion der Welt

Ei = +1312 kJ/mol ED = 436 kJ/molEa = -73 kJ/mol pKs = 39 ( entspricht H- = 10-32 M)H+:Hhyd = -1168 kJ/mol H-:Hhyd = -350 kJ/mol

- genügend reduzierendes Potential für chemische / biologische Reaktionen

Koordination von H2 an ein Metall kann pKs bis zu pKs von H2 SO4 reduzieren

Heterogene H2 Spaltung


ACV HS 2012-73

H2 2H+ + 2 e- Eo = -0.41V (pH=7)

- Genügend stark reduzierendes Potential für chemische Reaktionen

- H-H Bindung sehr stark ~ 400 kJ/mol

- pKa von H2 sehr hoch ~ 35

- Koordination von H2 an ein Metall kann pKa bis um 20 erniedrigen

Heterogene Spaltung

H2 Produktion und Verbrauch in Mikroorganismen: ~ 200 Mio t/y!!!

H2 Herstellung heute: - elektrolytisch (teuer)- Wasser-Gas-Shift Reaktion- aus Methan oder KW


ACV HS 2012-74

Die biochemische Wassergas-Shift Reaktion

H2 O + CO H2 + CO2 H0 = - 42 kJ/mol

Verschiedene Enzyme sind in die CO Produktion involviert

Das bekannteste ist die CO Dehydrogenase (CODH)

Bacterial roles of H2ases

Methanogenic

Photosynthetic Nitrogen fixing

AcetogenicSulfate reducing

[Fe only] [NiFe] [NiFeSe]H2 production

Activity 10 - 100 x [NiFe]H2ase

Most O2 sensitive H2ase

H2 consumption

Majority of H2ases

H2 affinity 100 x [Fe]H2ase

H2 consumption

Terminal S-Cys Se-Cys

Least O2 sensitive H2ase

D.J. Evans et al. Chem. Soc. Rev. 2003, 32, 268Desulvoibrio desulfuricans Desulvovibrio gigar

HydrogenasenHydrogenasen

ACV HS 2012-75

-methanogenen-acetogenen

-Nitrat- und Sulfatreduzierenden Bakterien-anaeoroben archae Bakterien

-anaeoroben Algen

-methanogenen-acetogenen

-Nitrat- und Sulfatreduzierenden Bakterien-anaeoroben archae Bakterien

-anaeoroben Algen

Produktion aus anaerober Fermentierung von Kohlehydraten, Fetten etc.

H+ als Elektronenempfänger Methanogene als H2 EmpfängerCO2 + H2 CH4 + H2 O

oder Sulfatreduzierer als ultimative Elektronenempfänger


Hydrogenasen erstmals 1931 entdeckt

gefunden in:

ACV HS 2012-761FEH J.W. Peters et al. Science, 1998, 282, 1853

Fe-only Hydrogenase aus Clostridium pasteurianum

eine Stelle an Fe ist frei (weit entferntes Wasser Molekül) kann ..

.. aber leicht durch exogenes CO besetzt werden (1C4A)

vacant site


ACV HS 2012-77

Der proximale Cluster geht über den medialen zum distalen, Abstände ca. 10Å, optimal für e- Leitung sogenannter “hard wire“.

Nahe beim distalen Cluster findet man oft Bindungstasche für Cytochrome


ACV HS 2012-78


neuere Erkenntnis

F.A. Armstrong, Curr. Opin. Chem. Biol., 2004, 8, 133M. Frey, ChemBioChem, 2002, 3, 153

D2 O + H2 HOD + HD

Fe-only HydrogenasenFe-only Hydrogenasen

ACV HS 2012-79

Das aktive Zentrum enthält in seiner reduzierten Form ungewöhnliche Einheiten

Fe2 hat eine freie Koordinationsstelle und scheint da mit H2 zu reagieren

Ebenfalls Koordination von CO und CN

Hoch Feld Liganden low spin Fe

Fe-only Hydrogenase aus aus D. desulfuricans (DdHase)


ACV HS 2012-80

Mechanistische Betrachtungen Möglicher katalytischer Zyklus

H-Cluster = Fe2 -Zentrum, Anbingungsstelle ist 5-fach koordiniertes Fe

Heterolytische H2 -Spaltung

Fe Fe

S

COCN CN

CO

HSH SH

HH2

Cluster

Cys

N

H+


ACV HS 2012-81


Reaktionszentren (in Hydrogenasen) enthalten alle Metallspezifischen Merkmale

- Redoxfähigkeit- Flexibilität in Koordinationssphäre- wechselnde Anzahl Bindungspartner- schneller Substrat- Ligandenaustausch- variable elektronische Struktur - hoher Substrat Durchsatz 9000 H2 /sec-1 (200‘000 l/sec.mol)

Fe-only Hydrogenase Fe/Ni Hydrogenase Überlagerung


ACV HS 2012-82

Übersicht Struktur

“Fe-only”FeNi



ACV HS 2012-83

3[4Fe-4S] Clusteractive site : 2 kerniges Fe-Zentrummw : 46 kDVm (H2 ) : 10000mol/min/mg (mit MV+ als Donor)aerobic (Ausnahme)

CO blockt in allen Fällen die Reaktion

Wichtige Sequenzen sind in allen Fe-only Hydrogenasen konserviert (~80)



Einige Eigenschaften

ACV HS 2012-84

Einbindung in biologische Kreisläufe

Relative Grösse und Metallgehalt der verschiedenen Enzyme



ACV HS 2012-85

Daneben enthält es eine Brücke aus [-S-CH2 -NH-CH2 -S-]

Funktion als interne Base

Weiter ist über ein verbrückendes Cysteinder proximale [4Fe-4S] Cluster angekoppelt



ACV HS 2012-86

Enzym aus methanogenen Archaea katalysiert die Reduktion eines Pterins

[HC

H4 MPT]+ + H2

H2 C

H4 MPT + H+ G° = -5.5 kJ/mg

-Diese Reaktion ist ein Intermediärschritt der CH4 Bildung aus CO2 + H2

-Vergleichbar mit der Bildung von Carbokationen in Supersäuren

Metallfreie HydrogenasenMetallfreie Hydrogenasen

ACV HS 2012-87

Gleichgewicht der Reaktion ist pH-abhängig:

Sauer: Dehydrogenerierung bevorzugt

Basisch: Hydrogenerierung bevorzugt

H4 MPT vergleichbar mit Tetrahydrofolat H4 F, gilt auch als "1-C" Reagens.

pKa N5 in H4 MPT = 4.8N10 in “ = 2.4

Stereochemische Reaktion


ACV HS 2012-88

- Reaktionsgeschwindigkeit mit D2 und H2 ungefähr gleich

- folgt M-M Kinetik

Km ~ 50 · 10-6M

Vmax ~1000 U/mg

-Kein H2 / H+ Austausch ohne HC

H4 MPT

resp. H2 + D+ HD + H+

H2 + 2D+ D2 + 2H4

para H2 ortho H2

(alle HC

H4 MPT+ abhängig)


ACV HS 2012-89

Der Mechanismus ist vergleichbar mit Supersäuren

(H3 C)3 C-H + H+(H3C)3--H

H(H3 C)3 C++H2

Das C14 hat ähnliche Eigenschaften

[HC

H4 MPT]+

HN

N+ + H2 H

N

N

H+ H+


ACV HS 2012-90

Für Carbokation werden Supersäuren gebraucht

im Gegensatz ist die Bildung von H2 aus H2 C

H4 MPT bei pH=7 bereitsexergonisch

spiegelt die Delokalisierung der Ladung und Solvatation

- H2 C-H4 MPT muss so eingerastet sein, dass die Ione-pairs anti-periplanarzum “H-” sind

- Planare Form muss destabilisiert werden, damit Reaktion mit H2 möglich

schliesslich ....


ACV HS 2012-91

Ein Beispiel aus der Bioanorganik: HydrogenasenEin Beispiel aus der Bioanorganik: Hydrogenasen

.... war alles ein Irrtum und das Enzym eine Fe Hydrogenase

The Crystal Structure of [Fe]-Hydrogenase Reveals the Geometry of the Active Site Science 2008 321, 572.

Allgemeiner Review: Structure–function relationships of anaerobic gas- processing metalloenzymes Nature 2009 460, 814.

ACV HS 2012-92

3. Ein Beispiel aus der Bioanorganik: Hydrogenasen3. Ein Beispiel aus der Bioanorganik: Hydrogenasen

Möglicher Mechanismus der Fe Hydrogenase:

The Crystal Structure of an [Fe]-Hydrogenase-

Substrate Complex Reveals the Framework for H2 Activation Source Angew. Chem. Int. Ed.

2009 48, 6457.

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