Biochrom AG Internet: www.biochrom.de Seite 1 von 3 Leonorenstr. 2-6 E-Mail: info@biochrom.de 12247 Berlin Tel.: +49 (30) 77 99 06-0 Deutschland Fax: +49 (30) 771 00 12 Stand: 25.01.2010

Coaten von KulturgefäßenCoaten von KulturgefäßenCoaten von KulturgefäßenCoaten von Kulturgefäßen:::: AnwendungsemAnwendungsemAnwendungsemAnwendungsemppppfehlung fehlung fehlung fehlung zu Czu Czu Czu Collollollollaaaagen Agen Agen Agen A

Information der Biochrom AG Wachstum und Differenzierung von Zellen in vitro werden wesentlich vom verwendeten Sub-strat (Glas oder Kunststoff) beeinflusst. Beschichtet man die Oberflächen von Kulturgefäßen mit Adhäsionsfaktoren wie Fibronectin, Collagen, Gelatine oder Polylysin, wird häufig ein besseres Zellwachstum erreicht. So kann beispielsweise die Überlebenszeit von Hepatozy-ten auf Collagen bis zu einem Monat betragen. Darüber hinaus wird durch Adhäsionsfakto-ren die Neigung vieler Zellen zur Entdifferenzierung verhindert. Die Biochrom AG vertreibt zwei verschiedene Collagene: Collagen A (Kat. Nr. L 7220) und Collagen G (Kat. Nr. L 7213), säurelösliche Collagene aus der Kalbshaut. Collagen A dient zum Coaten von Kulturgefäßen. (Collagen G wird zur Herstellung von Gelen eingesetzt.) Die Empfehlung zur Herstellung von beschichteten Oberflächen von Zellkulturgefäßen mit Collagen A hat die Biochrom AG komplett überarbeitet: Kulturgefäße können entweder mit monomerem Collagen A oder mit fibrillärem Collagen A beschichtet werden, wobei das mo-nomere Collagen A durch seine glatte Oberfläche unsichtbar ist und sich so besser zum Fo-tografieren eignet. In welcher Form Collagen A jeweils vorliegt, richtet sich nach dem jeweili-gen pH-Wert, der Ionenkonzentration und der Temperatur der Lösung. Je nachdem, ob Sie die Kulturgefäße sofort verwenden möchten oder eine längere Lagerung vorgesehen ist, empfiehlt die Biochrom AG unterschiedliches Vorgehen. 1 Beschichten von Kulturgefäßen mit monomerem Collagen A Als Monomere in Lösung bleiben die Collagenmoleküle bei einem pH-Wert unter 3,8 und niedriger Ionenkonzentration erhalten, es kommt nicht zu einer Fibrillenbildung. Die Biochrom AG empfiehlt zwei verschiedene Beschichtungen, je nachdem, wofür Sie die Kulturgefäße benötigen: entweder sofort nach der Herstellung oder erst nach längerer Lage-rung. 1.1 Zur sofortigen Verwendung des Kulturgefäßes

� 1 ml Collagen A (Kat. Nr. L 7220) mit jeweils gleichem Volumen Reinstwasser (Kat. Nr. L 0015, L 0020) oder mit 1x PBS (Kat. Nr. L 1815), das auf einen pH-Wert von 3,0-3,5 eingestellt worden ist, mischen. Die PBS-Lösung (Kat. Nr. L 1815) wird wie folgt auf einen pH-Wert von 3,0-3,5 eingestellt: Zugabe von 1 ml 1 N HCl zu 100 ml PBS-Lösung.

� Pro 10 cm² Bodenfläche 2 ml der verdünnten Collagenlösung in das Kulturgefäß ge-ben und 2-3 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur (≤ 25 °C) inkubieren (al-ternativ 30 min bei 35-37 °C). Lösung absaugen und mit Reinstwasser oder mit 1x PBS (pH ca. 7,3) waschen. Das Kulturgefäß sofort verwenden.

(1 ml Collagen A/10 cm²=100 µg Collagen/cm²)

Biochrom AG Internet: www.biochrom.de Seite 2 von 3 Leonorenstr. 2-6 E-Mail: info@biochrom.de 12247 Berlin Tel.: +49 (30) 77 99 06-0 Deutschland Fax: +49 (30) 771 00 12 Stand: 25.01.2010

1.2 Zur längeren Lagerung der Kulturgefäße

� 1 ml Collagen A mit gleichem Volumen Reinstwasser (Kat. Nr. L 0015, L 0020) mi-schen.

� Pro 10 cm² Bodenfläche 2 ml der verdünnten Collagenlösung in das Kulturgefäß ge-ben bzw. 20 µl pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte.

� Über Nacht bei Raumtemperatur (≤ 25 °C) offen im Luftstrom einer Laminar-Airflow Anlage inkubieren und die Beschichtungslösung zu einem Collagenfilm eintrocknen lassen. Steril verpackt können die Kulturgefäße bis zum Gebrauch gelagert werden (kühle, trockene Lagerung). Vor Gebrauch kurz mit Kulturmedium spülen.

2 Beschichten von Kulturgefäßen mit fibrillärem Collagen A Die Collagen-Fibrillenbildung erfolgt bei einem pH-Wert über 4,0, insbesondere bei physiolo-gischem pH-Wert 7,0-8,0, bei physiologischer Ionenkonzentration und Erwärmung bis maxi-mal 37 °C. Die Biochrom AG empfiehlt für fibrilläres Collagen A zwei verschiedene Beschichtungen, je nachdem, wofür Sie die Kulturgefäße benötigen: entweder sofort nach der Herstellung oder erst nach längerer Lagerung. Zur Herstellung der neutralisierten Collagenlösung werden zunächst alle verwendeten Lö-sungen im Eiswasserbad auf ca. 2-8 °C abgekühlt und gemischt. 2.1 Zur sofortigen Verwendung des Kulturgefäßes

� 2 ml Collagen A mit 0,2 ml PBS-Lösung (10x) (Kat. Nr. L 1835) mischen. � Den pH-Wert durch Zugabe von ca. 10 µl 1 N NaOH auf pH 7,3 ± 0,2 einstellen. � Pro 10 cm² Bodenfläche 2 ml der Lösung in das Kulturgefäß geben und mindestens

3 h oder über Nacht bei Raumtemperatur (≤ 25 °C) inkubieren (alternativ mindestens 60 min bei 35-37 °C).

� Lösung absaugen und mit 1x PBS (pH ca. 7,3) oder mit Nährlösung waschen. Das Kulturgefäß sofort verwenden.

2.2 Zur längeren Lagerung der Kulturgefäße

� 1 ml Collagen A mit gleichem Volumen 0,3 M NaCl-Lösung mischen und mit 1N NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 7,0-8,0 einstellen. � Pro 10 cm² Bodenfläche 2 ml der verdünnten Collagenlösung in das Kulturgefäß ge-

ben, bzw. 20 µl pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte. � Über Nacht bei Raumtemperatur (≤ 25 °C) offen im Luftstrom der Laminar-Airflow An-

lage inkubieren und die Beschichtungslösung eintrocknen lassen. Steril verpackt können die Kulturgefäße bis zum Gebrauch gelagert werden (kühle, trockene Lage-rung). Vor Gebrauch kurz mit Kulturmedium spülen.

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3 Produktdetails

Collagen A

Kat. Nr. L 7220 Einheit 1x (6x5 ml) Konzentration 0,1 %ige Collagenlösung in HCl Lagertemperatur +2 - +8 °C Rohstoff Kalbshaut Verwendungszweck Zum Coaten von Kulturgefäßen für die Zellkultur Hinweis Nur für den in vitro-Gebrauch bestimmt