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Das Phytochrom-Regulon und eine Phosphodiesterase als Beispiele zur

Wahrnehmung von Umweltsignalen in Pseudomonas aeruginosa

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.))

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen/ AG Physiologie der Mikroorgansmen

vorgelegt von

Sabrina Heine

aus

Reutlingen

Bochum April 2014

Referentin: Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel Korreferent: Prof. Dr. Ulrich Kück

The phytochrome regulon and a phosphodiesterase as paradigms

for perception of environmental signals in Pseudomonas aeruginosa

Dissertation to obtain the degree Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology International Graduate School of Biosciences

Ruhr-University Bochum

Department of Microbiology/ Physiology of Microorganisms

submitted by

Sabrina Heine

from Reutlingen

Bochum April 2014

First Supervisor: Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel Second Supervisor: Prof. Dr. Ulrich Kück

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel

verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um

sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten

und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 22.04.2014 Sabrina Heine

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei meiner Doktormutter Prof. Dr. Nicole

Frankenberg-Dinkel für die Bereitstellung der interessanten Themen, die

fortwährende Unterstützung und die stetige Diskussionsbereitschaft in einer sehr

angenehmen Atmosphäre bedanken. Ebenfalls bedanke ich mich für die

Ermöglichung der Teilnahme an internationalen Konferenzen.

Für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens danke ich Herrn Prof. Dr. Ulrich

Kück.

Ein großes Dankeschön gilt auch Dr. Bernd Masepohl für das Interesse an dieser

Arbeit und die zahlreichen, sowie hilfreichen Diskussionen.

Bei Prof. Dr. Karin Sauer und ihrer Doktorandin Yi Li der Binghamptom University,

USA bedanke ich mich für die gelungene Kooperation.

Für die Bereitstellung der Transposonstämme danke ich Prof. Dr. Susanne Häussler

(HZI, Braunschweig). Prof. Dr. Wofgang Gärtner (MPI, Mühlheim), Prof. Dr. Amanda

Oglesby-Sherrouse (University of Maryland, USA) und Prof. Dr. Eric Deziel (Centre

INRS-Institut Armand-Frappier, Kanada) danke ich für die zur Verfügung gestellten

Plasmide.

Für die Durchführung der in vivo-Quervernetzungsexperimenten bedanke ich mich

bei Anette Hettwer, sowie Dr. Sina Langklotz und Jun.-Prof. Dr. Julia Bandow (RUB)

für die massenspektrometrischen Analysen.

Bedanken möchte ich mich auch beim gesamten Lehrstuhl für das gute Arbeitsklima.

Vor allem möchte ich allen jetzigen und ehemaligen „FKB-lern“ Danke sagen: Danke

Julia, Krissy, Basti und natürlich allen „kleinen“ für die wunderbare Zeit in und

außerhalb des Labor. Ein ganz herzliches Dankeschön geht auch an Britta für die

tägliche Unterstützung im Labor.

Nicht zuletzt möchte ich mich bei all meinen Freunden bedanken, die trotz der

manchmal nicht ganz so leichten Zeit immer für mich da waren.

Inhaltsverzeichnis

I

II Abkürzungsverzeichnis VI

1. Einleitung 1

1.1 Der Modellorganismus Pseudomonas aeruginosa 1

1.2 Transkriptionsregulation durch Sigmafaktoren 2

1.3 Zwei-Komponenten-Systeme 3

1.3.1 Allgemeiner Aufbau und Signaltransduktion 3

1.3.2 Sensor-Histidin-Kinasen 6

1.3.3 Antwortregulatoren 7

1.3.4 Zwei-Komponenten-Systeme in P. aeruginosa 8

1.4 Photorezeption 8

1.5 Phytochrome 9

1.5.1 Allgemeine Eigenschaften von Phytochromen 9

1.5.2 Phytochrome in heterotrophen Bakterien 13

1.5.3 Das Phytochromsystem aus P. aeruginosa 13

1.6 Die Quorum-Sensing Systeme in P. aeruginosa 14

1.7 Second messenger vermittelte Signaltransduktion durch c-di-GMP 17

1.7.1 Einfluss von c-di-GMP auf den Biofilmzyklus 19

1.7.2 NbdA ist essentiell für die Biofilmauflösung in P. aeruginosa 21

1.8 Zielsetzung 23

2. Material und Methoden 24

2.1 Bakterienstämme 24

2.2 Vektoren und rekombinante Plasmide 27

2.3 Oligonukleotide 28

2.4 Medien und Zusätze 29

2.4.1 Medien 29

2.4.2 Antibiotika und Medienzusätze 30

2.5 Enzyme, Antiserum, Kits und Chemikalien 30

Inhaltsverzeichnis

II

2.5.1 Enzyme, Antiserum und Kits 30

2.5.2 Chemikalien 31

2.6 Geräte und Software 32

2.7 Mikrobiologische Methoden 33

2.7.1 Bakterienkultivierung 33

2.7.1.1 Plattenkulturen 33

2.7.1.2 Flüssigkulturen 33

2.7.2 Lagerung von Bakterien 33

2.7.3 Messung der Zelldichte 33

2.7.4 Anzucht von P. aeruginosa unter verschiedenen Bedingungen 34

2.8 Molekularbiologische Methoden 34

2.8.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen 34

2.8.2 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen 35

2.8.3 Diparentales Mating zur Transformation in P. aeruginosa 35

2.8.4 Präparation von Plasmid-DNA 35

2.8.5 Präparation chromosomaler DNA aus P. aeruginosa 36

2.8.6 Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration 37

2.8.7 Amplifikation von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion 37

2.8.8 Agarose-Gelelektrophorese 38

2.8.9 Reinigung von DNA-Fragmenten 39

2.8.10 Hydrolytische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 39

2.8.11 Ligation von DNA-Fragmenten 39

2.8.12 Sequenzierung 40

2.9 Promotoranalysen 40

2.9.1 Herstellung von lacZ-Reportergenfusionen 40

2.9.2 Konstitutive Expression von rhlR 41

2.9.3 Bestimmung der ß-Galaktosidase-Enzymaktivität 42

Inhaltsverzeichnis

III

2.10 Herstellung von Deletionsmutanten 43

2.11 DNA mobility shift assay (DMSA) 44

2.12 Phänotypische Untersuchungen 45

2.12.1 Osmotischer Stress 45

2.12.2 Motilität 46

2.12.3 SDS-Hemmhoftest 46

2.12.4 Extraktion von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ) 46

2.13 Proteinbiochemische Methoden 47

2.13.1 Heterologe Proteinproduktion in E. coli 47

2.13.1.1 Produktion von Strep-tagII-Fusionsproteinen 47

2.13.1.2 Produktion von (His)6-tag Fusionsproteinen 47

2.13.2 Homologe Proteinproduktion in P. aeruginosa 47

2.13.3 Chromosomal integrierte PaBphP Strep-tagII-Fusion 48

2.13.4 Zellaufschluss 48

2.13.5 Affinitätschromatographische Reinigung der Fusionsproteine 49

2.13.6 Reinigung des Transkriptionsregulators LasR 49

2.13.7 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese 50

2.13.8 Western-Blot-Transfer von Proteinen 52

2.13.9 Immunologischer Nachweis von Strep-tagII-Fusionsproteinen 52

2.13.10 Dialyse 53

2.13.11 Konzentrieren von Proteinen 54

2.13.12 Photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration 54

2.13.13 Proteinbestimmung nach Bradford 54

2.13.14 UV/Vis-Spektroskopie 55

2.13.15 Proteinkinaseexperimente 55

2.13.15.1 Autophosphorylierung 55

2.13.15.2 Phosphorylgruppenübertragung 56

Inhaltsverzeichnis

IV

2.13.16 In vivo-Degradation 56

2.13.17 In vivo-Quervernetzung 57

3. Ergebnisse 58

Kapitel I 58

3.1.1 Biochemische Charakterisierung des Phytochroms PaBphP

aus P. aeruginosa PA14 58

3.1.1.1 Isolierung von PaBphP aus PA14 58

3.1.1.2 Photoisomerisierung von homolog isoliertem PaBphP 60

3.1.1.3 Der native Chromophor von PaBphP 61

3.1.1.4. Autophosphorylierung 64

3.1.2 Phänotypische Charakterisierungen von Phytochrommutanten 66

3.1.2.1 Osmotischer Stress 66

3.1.2.2 Synthese von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ) 67

3.1.2.3 Auswirkung von SDS auf die Membran 68

3.1.2.4 Motilitätsverhalten 69

3.1.2.5 Pyocyaninproduktion 70

3.1.3 Die Regulation von bphOP und bphP 71

3.1.3.1 Vergleichende Promotoraktivitätsstudien 71

3.1.3.2 LasR-abhängige Regulation 73

3.1.3.3 RhlR-abhängige Regulation 76

3.1.4.4 RpoS-abhängige Regulation 78

3.1.4 Die intrazelluläre Signaltransduktion von PaBphP 81

3.1.4.1 Entwicklung eines genetischen Screens zur Identifizierung putativer

Phytochrom-Antwortregulatoren 81

3.1.4.2 Phosphorylgruppenübertragung auf die putativen Regulatoren 86

3.1.5 In vivo-Quervernetzung zur Identifikation von PaBphP

Interaktionspartnern 91

Inhaltsverzeichnis

V

3.1.6 Pull-down-Experimente zur Identifikation von PaBphP

Interaktionspartnern 94

3.1.7 Proteolytischer Abbau von PaBphP 95

Kapitel II 99

3.2.1 Die Transkriptionsregulation von nbdA 99

3.2.1.1 Identifikation des Transkriptionsregulators 100

3.2.1.2 Charakterisierung der Regulation von nbdA durch FhpR 102

4. Diskussion 105

Kapitel I 105

4.1.1 P. aeruginosa besitzt ein funktionelles Phytochrom 105

4.1.2 Die Transkriptionsregulation des Phytochroms aus PA14 ist

komplex 108

4.1.2.1 bphP besitzt einen eigenen Promotor 108

4.1.2.2 Das bphOP-Cotranskript: RpoS- und RhlR-reguliert? 112

4.1.3 Einblicke in die Signaltransduktion von PaBphP 114

4.1.4 PaBphP ist möglicherweise in verschiedene metabolische Vorgänge

involviert 119

4.1.5 PaBphP- mehr als nur ein Rotlichtrezeptor? 120

4.1.6 Das Phytochrom-Regulon 123

Kapitel II 125

4.2.1 Wird die Transkription von nbdA durch NO induziert? 126

5. Zusammenfassung 129

6. Summary 131

7. Literaturverzeichnis 133

8. Anhang 149

8.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation 149

8.2 Lebenslauf 151

Abkürzungsverzeichnis

VI

II Abkürzungsverzeichnis Es gelten die die SI-Einheiten (Système International d’unités) und weden nicht

gesondert aufgeführt.

A.dest . Aqua destilla (destiliertes Wasser)

AHT Anhydrotetrazyklin

ATP Adensointriphosphat

AR Antwortregulator

BV Biliverdin

BON Domäne, bacterial OsmY and nodulation

BSA bovine serum albumin; Rinderserumalbumin

ß-Gal ß-Galaktosidase

bp Basenpaare

C- Carboxy-

CA katalytische Domäne einer Sensor-Histidin-Kinase

c-di-GMP zyklisches di-Guanosinmonophosphat

Da Dalton

DGC Diguanylatzyklase

DMSA DNA mobility shift assay, Bandshift-Analyse

DMSO N,N-Dimethylsulfoxid

dNTPs Desoxynukleotidtriphosphat

DHp Dimerisierungs- und Phosphotransferdomäne einer

Sensor-Histidin-Kinase

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EPS extrazelluläre polymere Substanzen

GAF Domäne, die zuerst beschrieben wurde in cGMP

spezifischen Phosphodiesterasen, Adenylatzyklasen und

bakteriellen Formiathydrogenlyase Transkriptionsfaktor

FhlA

GTP Guanosintriphosphat

HAMP Domäne in Histidinkinasen, Adenylatzyklasen,

Methylakzeptorproteinen und Phosphatasen


VII

HAQ 2-Heptyl-4-quinolon

HHQ Heptyl-4-hydroxy-quinolon (Autoinduktor)

HKD Histidinkinase-Domäne

HPt Histidinphosphotransferase

HSL Homoserinlakton

HTH helix turn helix

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosid

LB Luria Bertani (Medium)

MU Miller-Units

N- Amino-

NO Stickstoffmonoxid

oD optische Dichte

ONPG o-Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid

orf open reading frame; offener Leserahmen

PA Pseudomonas aeruginosa

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PAS Domäne, PER (periodic clock), ARNT (aromatic

hydrocarbon receptor tranlocater), SIM (single minded)

PCB Phycocyanobilin

PCR polymerase chain reaction;Polymerase-Kettenreaktion

PDE Phosphodiesterase

Pfr dunkelrotlichtabsorbierende Form des Phytochroms

PHY Phytochrom-Domäne

PQS Pseudomonas Quinolon Signal (4-Heptyl-3-Hydroxy-4-

quinolone)

Pr hellrotlichtabsorbierende Form des Phytochroms

PΦB Phytochromobilin

PVDF Polyvinylidenfluorid

pGpG 5´-Phosphoguanylyl-(3´-5´)-guanosin

QS Quorum-Sensing

SDS Natriumdodecylsulfat

STAS Domäne in Sulfattransportern und Anti-Sigmafaktor

Antagonisten

RNAP RNA-Polymerase


VIII

SHK Sensor-Histidin-Kinase

SV Säulenvolumen

TSS Transkriptionsstartpunkt

üN über Nacht

UpM Umdrehung pro Minute

v/v volume per volume, Volumen pro Volumen

WT Wildtyp

w/v wight per volume, Gewicht pro Volumen

ZKS Zwei-Komponenten-System

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Der Modellorganismus Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa ist ein Gram-negatives, stäbchenförmiges γ-Proteo-

bakterium und bildet zusammen mit P. putida, P. fluorescens und P. syringae die

Gattung der Pseudomonaden. P. aeruginosa gilt als einer der anpassungsfähigsten

Mikroorganismen überhaupt, was sich in der ubiquitären Verbreitung des Bakteriums

wiederspiegelt (Spiers et al., 2000). Durch die Fähigkeit über 100 verschiedene

Kohlenstoffquellen verstoffwechseln zu können, dazu zählen neben

unterschiedlichen Kohlenhydraten auch Fettsäuren, Alkohole und aromatische

Verbindungen, können sie auch unter minimalsten Nährstoffbedingungen überleben

(Van der Wauven et al., 1984). Unter anaeroben Bedingungen ist P. aeruginosa in

der Lage über eine Denitrifikation NO3- und NO2

- als terminalen Elektronenakzeptor

zu nutzen, und alternativ eine anaerobe Arginin- oder Pyruvatfermentation

durchzuführen (Spiers et al., 2000). Das opportunistische Pathogen zählt zu den

wichtigsten nosokomialen Keimen und ist für zahlreiche Krankheitsbilder wie

beispielsweise Harnwegs- und Wundinfektionen sowie Pneumonien verantwortlich,

die sich vor allem bei immunsupprimierten Patienten manifestieren (Govan & Deretic,

1996). In diesem Zusammenhang ist die Fähigkeit des Bakteriums zur Biofilmbildung

von Bedeutung. Insbesondere TypIV-Pili ermöglichen eine Anheftung an biotische

und abiotische Oberflächen, was dort die Ausbildung einer Biofilmmatrix aus

verschiedenen EPS (extrazelluläre polymere Substanzen) zur Folge haben kann

(O'Toole et al., 1998). Die Organisation in solchen Biofilmen begünstigt eine hohe

Resistenz gegenüber Antibiotika, wodurch die Behandlung einer Pseudomonas-

Infektion erschwert wird (Hentzer et al., 2001; Yoon et al., 2002). Die Virulenz des

Pathogens ist außerdem durch die Sekretion unterschiedlicher Virulenzfaktoren

geprägt. Zu diesen zählen neben Exotoxin A und Exoenzym S auch verschiedene

Phospholipasen, Elastasen und das grünpigmentierte Pyocyanin (Ostroff et al., 1990;

Van Delden et al., 1998). Zu den weitverbreitesten und infolgedessen am besten

untersuchten P. aeruginosa Spezies gehören die Stämme PA14 und PAO1

(Wiehlmann et al., 2007). Die Genome beider Unterarten sind bereits vollständig

sequenziert und zählen mit 6,23 Mbp für PAO1 bzw. 6,54 Mbp für PA14 zu den

Einleitung

2

größten bakteriellen Genomen (Stover et al., 2000; Winsor et al., 2009). Beide

Stämme weisen eine sehr hohe Sequenzhomologie von etwa 96 % auf. Rund 9 %

aller offenen Leserahmen kodieren dabei für beschriebene oder vorhergesagte

Transkriptionsfaktoren sowie Ein- oder Zwei-Komponenten-Systeme (Stover et al.,

2000).

1.2 Transkriptionsregulation durch Sigmafaktoren

Die Transkription eines Gens kann in mehrere Phasen unterteilt werden. Sie beginnt

mit der Transkriptionsinitiation, der sich die Elongation anschließt und endet mit der

Termination. Bei diesem Prozess dient die Initiation als elementarer Kontrollpunkt,

der von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase (RNAP) übernommen wird. Die

bakterielle RNAP setzt sich aus mehreren Untereinheiten (α2ββ´ω) zusammen und

existiert in zwei Formen. Als Kern-Enzym kann es zwar an die DNA binden, aber

nicht die Transkription initiieren. Dazu muss die RNAP zuvor mit einem

Sigmafaktor (σ) assoziieren wodurch das holo-Enzym entsteht. Dieser Sigmafaktor

ist für die Erkennung von Promotorstukturen verantwortlich und rekrutiert die RNAP

an die entsprechende Region (Helmann et al., 1988). Dabei dienen innerhalb der

Promotorregion zwei Hexanukleotidsequenzen, die nach ihrer Position relativ zum

Transkriptionsstartpunkt als -10 und -35 Region bezeichnet werden, als

Erkennungssequenzen (Gross et al., 1998). Neben dem primären Sigmafaktor RpoD

(σ70), der die Transkription von Haushaltsgenen unter „normalen“ Bedingungen

initiiert, besitzt P. aeruginosa 23 alternative Sigmafaktoren. Diese erkennen

spezifische Promotorsequenzen und vermitteln die Adaptation an diverse

Stress-Situationen (Potvin et al., 1997). Zu den besonders gut untersuchten

alternativen Sigmafaktoren gehört RpoS, der Sigmafaktor der stationären Phase

(Fujita et al., 1994). Durch globale Transkriptomanalysen konnten in P. aeruginosa

über 700 Gene identifiziert werden, die mit Beginn der stationären Phase durch

RpoS reguliert werden (Schuster et al., 2003). Der Sigmafaktor kontrolliert unter

anderem die Transkription von Genen, die zur Synthese von Pyocyanin sowie

verschiedener Exotoxine benötigt werden. Auch die Synthese der Flagellen wird

beispielsweise durch einen alternativen Sigmafaktor (RpoF) reguliert (Starnbach et

al., 1992; Tanaka et al., 1993). Eine weitere größere Subklasse der alternativen

Sigmafaktoren bilden die ECF-Sigmafaktoren (extracytoplasmic function). Diese

Einleitung

3

regulieren Gene, deren Produkte eine Funktion außerhalb der Zelle einnehmen

(Missiakas et al., 1998). P. aeruginosa besitzt 19 ECFs, von denen bislang jedoch

nur drei näher charakterisiert wurden (Potvin et al., 2008).

Eine weitere Gruppe stellen die σ54 (RpoN)-Sigmafaktoren dar. In den meisten

Organismen, wie auch in P. aeruginosa, gibt es nur einen Vertreter dieser Klasse

(Gruber et al., 2003). RpoN unterscheidet sich in der Transkriptionsinitiation zu den

anderen Sigmafaktoren. So befinden sich zum einen die Bindestellen der σ54-

assoziierten RNAP in den Regionen -12 und -24 relativ zum Transkriptionsstartpunkt,

und zum anderen wird mindestens ein Aktivatorprotein benötigt, der unter ATP-

Verbrauch zusammen mit der holo-RNAP die Transkription initiiert (Thony et al.,

1989).

Die Expression der meisten Gene ist jedoch nicht nur von einer

Sigmafaktor-assoziierten RNAP abhängig, sondern benötigt in vielen Fällen einen

weiteren Transkriptionsregulator. Für P. aeruginosa werden 550 verschiedene

Transkriptionsregulatoren postuliert (Potvin et al., 2008). Diese können dabei

entweder als Aktivatoren oder Repressoren fungieren. Die Aktivität dieser

Transkriptionsfaktoren wird durch spezifische intra- oder extrazelluläre Reize

reguliert. Durch die Bindung beispielsweise eines Signalmoleküls, ändern sie ihre

Konformation und können im Anschluss mit der RNAP interagierten, wodurch die

Transkription des Zielgens initiiert oder verstärkt wird (Ramos et al., 2005). Die

Aktivität eines Transkriptionsfaktors kann aber auch über eine Modifikation, wie z.B.

durch eine Phosphorylierung, reguliert werden. Letzteres findet häufig im

Zusammenhang einer Signaltransduktion durch Zwei-Komponenten-Systeme statt,

die im nächsten Kapitel näher vorgestellt werden.

1.3 Zwei-Komponenten-Systeme

1.3.1 Allgemeiner Aufbau und Signaltransduktion

Zwei-Komponenten-Systeme (ZKS) sind für die Wahrnehmung und Weiterleitung von

diversen extra- und intrazellulären Signalen und die daraufolgende Auslösung einer

physiologischen Antwort zuständig (Gao et al., 2009). Obwohl sie auch in Archaeen,

Pilzen, Hefen und einigen Pflanzenarten vorkommen, spielen ZKS vor allem in der

Regulation der prokaryotischen Genexpression eine wichtige Rolle (Chang et al.,

1993; Smith et al., 1997; Nagahashi et al., 1998). Die Anzahl an ZKS variiert dabei je

Einleitung

4

nach Bakterienspezies und Lebensraum. Generell weisen frei lebende und

pathogene Arten eine höhere Anzahl an ZKS auf, als Mikroorganismen mit einer

kleinen ökologischen Nische. So besitzen beispielsweise einige Mycoplasmen, wie

der obligate Parasit Mycoplasma genitalium, der ausschließlich im Genitalbereich

von Primaten vorkommt, keine derartigen Signaltransduktionssysteme (Fraser et al.,

1995). Im Vergleich dazu zeichnet sich der Tuberkuloseerreger Mycobacterium

tuberculosis durch 28 Gene aus, die für Bestandteile von ZKS kodieren (Parish et al.,

2003). Die höchste Anzahl solcher Komponenten besitzt jedoch das opportunistische

Pathogen P. aeruginosa und nehmen eine wichtige Funktion in der Vermittlung der

Virulenz sowie der Resistenz gegenüber Antibiotika ein (Tomenius et al., 2006;

Gooderham & Hancock, 2009).

Ein typisches bakterielles ZKS besteht aus einer reizerkennenden Sensor-Histidin-

Kinase (SHK) und einem dazugehörigen Antwortregulator (AR) (Stock et al., 2000).

Beide Komponenten zeichnen sich durch einen modularen Aufbau aus (Abb. 1). Die

SHK besteht aus einer N-terminalen Sensor- und einer C-terminalen Kinasedomäne.

Letztere ist wiederum in eine katalytische Domäne (CA) und eine Dimerisierungs-

und Phosphotransferdomäne (DHp) unterteilt. Die Erkennung eines spezifischen

Reizes der Sensordomäne führt zu einer Konformationsänderung der SHK, wodurch

die CA-Domäne ein ATP bindet und den Transfer der γ-Phosphorylgruppe auf einen

konservierten Histidinrest innerhalb der DHp-Domäne katalysiert.

Alle bisherigen untersuchten SHK bilden Homodimere und in der Regel

phosphoryliert die CA-Domäne des einen Monomers den Histidinrest der DHp-

Domäne des anderen Monomers wodurch diese Reaktion in trans verläuft (Stock et

al., 2000). Die phosphorylierte Kinase wird dadurch zu einem Phosphodonor und im

Zuge der Signalweiterleitung wird die Phosphorylgruppe auf den korrespondierenden

AR übertragen.

Dieser AR kann ebenfalls in zwei Domänen, eine N-terminale Empfänger- und eine

C-terminale Effektordomäne unterteilt werden (Abb. 1). Die Phosphorylgruppe der

SHK wird auf einen konservierten Aspartatrest innerhalb der Empfängerdomäne

übertragen. Dies führt zu einer Strukturveränderung, die in der Regel eine

Dimerisierung zur Folge hat. Dadurch nimmt der AR seine aktive Form ein und kann

eine physiologische Antwort beispielsweise durch Modifikation der Transkription

spezifischer Gene auf den eingegangenen Reiz vermitteln (Stock et al., 2000).

Einleitung

5

Abb. 1: Aufbau eines klassischen bakteriellen Zwei-Komponenten-Systems Nach der Reizwahrnehmung durch die Sensordomäne der Sensorkinase kommt es zu einer Autophosphorylierung innerhalb der Kinasedomäne. Die katalytische Domäne (CA) bindet das ATP

und katalysiert den Transfer der γ-Phosphorylgruppe auf einen konservierten Histidinrest in der

Dimerisierungs-und Phosphotransferdomäne (DHp). In einem zweiten Schritt erfolgt die Übertragung der Phosphorylgruppe auf einen konservierten Aspartatrest (D) innerhalb der Empfängerdomäne des Antwortregulators. Dies bewirkt eine Konformationsänderung, worauf dieser seine aktive Form einnimmt (modifiziert nach Stock et al., 2000).

SHK besitzen neben der hier beschriebenen Kinase- und Phosphotransferaktivität

meistens zusätzlich eine intrinsische Phosphataseaktivität, durch die der AR wieder

dephosphoryliert werden kann und das System in den Ausgangszustand

zurückgesetzt wird (Kenney, 2010).

Neben dem prototypischen ZKS bestehend aus einer SHK und einem AR, gibt es

eine hohe Variabilität, wodurch der Mechanismus der Signaltransduktion deutlich

komplexer werden kann. So besteht die Möglichkeit einer Kreuzreaktion (cross talk).

Dabei kann sowohl eine SHK mehrere AR phosphorylieren (one-to-many-Prinzip) als

auch ein AR von mehreren SHK aktiviert werden (many-to-one-Prinzip) (Laub et al.,

2007). Auf diese Weise können einerseits verschiedene eingehende Signale die

gleiche Zellantwort generieren, andererseits kann so ein einzelnes Signal gleich

mehrere Gene parallel aktivieren.

Oftmals erfolgt die Weiterleitung auch über ein sogenanntes Phosphorelay-System.

Dabei erfolgt die Übertragung der Phosphorylgruppe der SHK zunächst auf ein

zwischengeschaltetes Regulatorprotein. Dieses kann direkt mit der SHK fusioniert

sein oder als alleinstehendes Protein vorliegen. Dieses leitet das Signal auf eine

Histidin-Phosphotransferase (HPt) weiter und erst in einem weiteren Schritt erhält der

finale AR die Phosphorylgruppe (Appleby et al., 1996).

Einleitung

6

1.3.2 Sensor-Histidin-Kinasen

Sensor-Histidin-Kinasen werden aufgrund ihrer Lokalisation in drei Hauptgruppen

eingeteilt (Mascher et al., 2006). Die meisten SHK sind über zwei Membranhelices in

der Membran verankert, wobei die Sensordomäne extrazelluläre Reize wahrnimmt.

Die Kinasedomäne ist dabei, wie bei allen anderen SHK auch, im Zytosol lokalisiert.

Diese SHK sind meistens an der Wahrnehmung von Nährstoffen und weiteren

kleinen gelösten Stoffen beteiligt. Eine weitere Klasse von SHK bilden membran-

durchspannende Rezeptoren, die keine periplasmatische Sensordomäne besitzen.

Sie nehmen Reize innerhalb der Zytoplasmamembran wie mechanischen Stress

oder den Tugordruck wahr. In der dritten Gruppe sind SHK zusammengefasst, die

entweder an der Membran verankert sind oder sich löslich im Zytosol befinden. Sie

nehmen neben löslichen Stoffen vor allem intrazelluläre Reize wahr. Jedoch sind nur

in wenigen Fällen die genauen Signalmoleküle bzw. Reize bekannt, die von der

Sensordomäne wahrgenommen werden (Laub, 2011).

Die Fähigkeit der verschiedenen SHK, unterschiedlichste Reize zu erkennen, geht

auf die N-terminale Sensordomäne zurück. Zu den am häufigsten vorkommenden

Sensordomänen zählen die PAS- GAF- und HAMP-Domänen. Benannt wurden

Domänen nach Proteinen in denen sie erstmals beschrieben wurden. So leitet sich

die PAS-Domäne von dem „periodic clock“-Protein (PER) aus Drosophila

melanogaster, der „aromatic hydrogen receptor translocater“ (ARNT) aus Vertebraten

und „singe minded“ (SIM) aus D. melanogaster ab (Aravind & Ponting, 1997). PAS-

Domänen können kleine Moleküle wie Häme, Flavine oder planare aromatische

Verbindungen als Kofaktor binden. Daher sind sie in der Lage Licht, Sauerstoff sowie

den Redoxzustand zu registrieren (Taylor & Zhulin, 1999). Den PAS-Domänen

strukturell sehr ähnlich sind die GAF-Domänen. Sie wurden erstmals für cGMP-

spezifische Phosphodiesterasen aus Vertebraten, cyanobakteriellen Adenylatzy-

klasen und dem bakteriellen Formiathydrolase-Transkriptionsfaktor FhlA beschrieben

(Avarind & Ponting, 1999). Sie können ebenfalls kleine Liganden binden (Ho et al.,

2000). HAMP-Domänen (beschrieben in Histidinkinasen, Adenylatzyklasen,

Methylakzeptorproteinen und Phosphatasen) hingegen leiten extrazytoplasmatische

Signale die intrazellulär lokalisierte Kinasedomäne weiter. Sie befinden sich direkt an

der Zytoplasmamembran und vermitteln den eingegangenen Reiz durch eine

Konformationsänderung (Parkinson, 2010). Im Gegensatz zu der Sensordomäne, die

aufgrund der verschiedenen Domänen sehr variabel sein kann, sind die C-terminal

Einleitung

7

gelegenen Domänen, die katalytische ATP-bindende Domäne (CA) und die

Dimerisierungs- und Phosphotransferdomäne (DHp) hochkonserviert (Grebe et al.,

1999).

1.3.3 Antwortregulatoren

Wie SHK bestehen AR ebenfalls aus zwei Domänen, einer Empfängerdomäne und

einer regulatorischen Effektordomäne. Innerhalb der N-terminalen Empfänger-

domäne befindet sich ein konservierter Aspartatrest der die Phosphorylgruppe der

SHK erhält. Alternativ dazu kann ein AR auch nur aus einer Empfängerdomäne

bestehen wie beispielsweise CheY des Chemotaxissystems aus E. coli (Karatan et

al., 2001; Galperin, 2006).

Bei einem klassischen AR ist die Effektordomäne die ausführende Domäne und

zeichnet sich entweder durch ein DNA-Bindemotiv oder durch eine Enzymaktivität

aus. Über 60% aller AR besitzen in ihrer Effektordomäne ein DNA-Bindemotiv,

sodass sie als Transkriptionsregulatoren fungieren können. Sie werden aufgrund von

Sequenz- und Strukturvergleiche mit klassifizierten AR in drei Hauptfamilien

unterteilt: OmpR-, NarL- und NtrC-ähnliche Regulatoren (Galperin, 2006) (Abb. 2).

Abb. 2: Domänenaufbau verschiedender AR mit DNA-Bindemotiven Innerhalb der DNA-bindenden AR können diese in drei Hauptklassen eingeteilt werden: AR mit einer hohen Ähnlichkeit zu OmpR mit einem winged helix turn helix-Motiv (wHTH), NarL-ähnliche AR mit einem helix turn helix-Motiv (HTH) und NtrC-ähnliche AR mit einer intrinsischen ATPase-Domäne (AAA+) und einer FIS-Domäne (verändert nach Galperin, 2006).

Die Klassifizierung der AR geht auf die unterschiedliche Ausprägung der

Sekundärstrukturelemente zurück, die an die DNA binden. Dabei zeichnet sich die

Gruppe der OmpR-ähnlichen AR durch ein sogenanntes winged helix turn helix-DNA-

Einleitung

8

Bindemotiv aus, während NarL-ähnliche AR in der Regel vier helix turn helix-

Domänen besitzen. NtrC-ähnliche AR weisen neben einem DNA-bindenden helix

turn helix-Motiv innerhalb der FIS-Domäne (factor of inversion stimulation) eine

ATPase-Domäne auf. Sie agieren als Transkriptionsaktivatoren für die σ54-assoziierte

RNAP.

1.3.4 Zwei-Komponenten-Systeme in P. aeruginosa

Die enorm hohe Anpassungsfähigkeit an verschiedenste Habitate sowie die

Pathogenität von P. aeruginosa hat zur Folge, dass der Organismus auf viele

unterschiedliche Umweltreize reagieren muss. Daher ist es nicht verwunderlich, dass

diese Spezies eine sehr große Anzahl an regulatorischen Elementen besitzt. Es

kodieren etwa 9 % aller Gene für beschriebene oder putative Transkriptionsfaktoren

sowie mögliche Bestandteile von Ein- oder Zwei-Komponenten-Systemen (Stover et

al., 2000). P. aeruginosa besitzt die größte bisher bekannte Anzahl dieser

Signalweiterleitungssysteme. Die genaue Anzahl der ZKS variiert jedoch in der

Literatur. So postulieren Stover et al. nach der Genomsequenzierung von PAO1 118

SHK und AR, während Rodriges et al. im selben Jahr 63 SHK und 64 AR postulieren

(Rodrigue et al., 2000; Stover et al., 2000). Wenige Jahre später erhöhte sich die

Anzahl der postulierten SHK und AR auf 64 SHK und 72 AR (Gooderham &

Hancock, 2009). Durch den zunehmen wissenschaftlichen Fortschritt werden

demnach immer mehr Komponenten dieser Signaltransduktionsmechanismen

entdeckt. In der Pseudomonas-Datenbank (www.pseudomonas.com) werden alle

diese Daten fortwährend aufgezeichnet und aktualisiert. Zu Beginn dieser Arbeit

(2010) waren bereits 107 beschriebene sowie putative AR in dieser Datenbank

gelistet.

1.4 Photorezeption

Die Signalwahrnehmung durch Licht ist für viele Organismen von entscheidender

Bedeutung (van der Horst et al., 2004). Dabei spielen Photorezeptoren, die in den

verschiedenen sprektralen Bereichen des Lichtes absorbieren können, eine zentrale

Rolle. In der Regel handelt es sich dabei um Chromoproteine, die aus einem apo-

Protein und einem lichtsensorischen Chromophor bestehen. Die Absorption von Licht

http://www.pseudomonas.com/

Einleitung

9

führt dabei meist zu einer strukturellen Änderung des Proteins. Dies induziert eine

Signaltransduktionskaskade mit einer anschließenden Aktivierung der zellulären

Antwort (Hellingwerf, 2000). Anhand des gebundenen Chromophors und somit der

Absorptionseigenschaften werden Photorezeptoren in verschiedene Klassen

eingeteilt: Die blaulichtabsorbierenden Chryptochrome, und Phototropine, die

grünlichtabsorbierenden Rhodopsine, sowie die rotlichtsensorischen Phytochrome

(van der Horst & Hellingwerf, 2004).

1.5 Phytochrome

1.5.1 Allgemeine Eigenschaften von Phytochromen

Phytochrome sind hellrot/dunkelrotlichtabsorbierende Photorezeptoren. Sie bestehen

aus einem apo-Protein und verwenden ein offenkettiges Tetrapyrrol (Bilin) als

Chromophor, welches für die Lichtrezeption verantwortlich ist (Rockwell et al., 2006).

Die Assemblierung der prosthetischen Gruppe zum holo-Phytochrom erfolgt über

einen autokatalytischen Mechanismus (Lagarias et al., 1989). Abhängig von dem

eingestrahlten Licht kommt es zu einer reversiblen Photokonversion zwischen der

hellrotlichtabsorbierenden Pr- und der dunkelrotlichtabsorbierenden Pfr-Form

(Abb. 3-A) (Braslavsky et al., 1997). Die Absorption von hellrotem Licht in der

Pr-Form führt zu einer cis/trans-Isomerisierung des Chromophors an der

C15-C16-Doppelbindung zwischen dem C- und D-Ring des Tetrapyrrols und

resultiert in der Pfr-Form. Umgekehrt bewirkt die Anregung der Pfr-Form durch

dunkelrotes Licht die Umwandlung in die Pr-Form. Beide Formen sind relativ stabil

und besitzen unterschiedliche spektrale Eigenschaften (Abb. 3-B). Durch die

Überlappung beider Spektren herrscht ein Photogleichgewicht zwischen der Pr- und

der Pfr-Form (Sharrock, 2008). Ohne Einwirkung von Licht findet eine sogenannte

Dunkelreversion statt, wobei eine langsame Isomerisierung in die Pr-Grundform

erfolgt (Chen et al., 2004).

Einleitung

10

Abb. 3: Spektrale Eigenschaften eines pflanzlichen Phytochroms (A) Cis/trans-Isomerisierung des Chromophors Phytochromobilin unter Hellrot- (660 nm) und Dunkelrotlicht (750 nm). In Abwesenheit von Licht tritt eine Dunkelreversion auf. (B) Absorptions-spektren eines pflanzlichen holo-Phytochroms unter Hellrot- und Dunkelrotlicht (modifiziert nach Chen et al., 2004).

Phytochrome wurden zuerst in Pflanzen entdeckt, in denen sie essentielle Prozesse

wie die Induktion der Keimung, der Blütenbildung sowie den Photoperiodismus

regulieren (Butler et al., 1959; Mathews, 2006). Erst viel später wurden diese

Rotlichtrezeptoren auch in Pilzen, Cyanobakterien und sogar heterotrophen

Bakterien nachgewiesen (Montgomery et al., 2002). Als Beispiel für die Bedeutung

von Phytochromen in Pilzen kann die rotlichtabhängige sexuelle Vermehrung

genannt werden (Blumenstein et al., 2005). In Cyanobakterien gibt es eine große

Variabilität an Phytochromen und Phytochrom-ähnlichen Proteinen. Über die

Funktion des klassischen Phytochroms, wie beispielsweise Cph1 aus Synechocystis

sp. PCC6803, wird eine Adaptation an die vorherrschende Lichtbedingungen

Einleitung

11

spekuliert, da eine Deletion des Gens zu einem deutlichen Wachstumsdefizit unter

Rotlichtdedingungen führt (Fiedler et al., 2004; Garcίa-Domίnguez et al., 2000). Die

Rolle dieser Rotlichtrezeptoren in heterotrophen Bakterien, vor allen in nicht-

photosynthetischen Arten, ist bisher kaum verstanden.

Innerhalb der Phytochrom-Familie gibt es in den verschiedenen Organismen sowohl

Gemeinsamkeiten, als auch Unterschiede. Der größte Unterschied besteht in der Art

des verwendeten Chromophors (Tab. 1). Die Synthese des Chromophors beginnt

jedoch immer ausgehend von einem Häm-Molekül. Durch die Spaltung des Häms an

der α-Position durch eine Hämoxygenase entsteht Biliverdin IXα (BV IXα)

(Frankenberg, 2004). Dieses offenkettige Tetrapyrrol dient fungalen und bakteriellen

Phytochromen ohne weitere Syntheseschritte als Chromophor. Cyanobakterielle und

pflanzliche Chromophore werden durch eine weitere regiospezifische Reduktion

durch Bilinreduktasen weiter zu Phycocyanobilin (PCB) bzw. Phytochromobilin (PФB)

modifiziert (Frankenberg et al., 2001).

Aufgrund der verschiedenen Bilin-Derivate sind ebenfalls die Absorptionsmaxima

verändert. BV IXα besitzt ein stärker ausgeprägtes π-Elektronensystem als PCB und

PФB, wodurch es Licht höherer Wellenlänge absorbiert (Rottwinkel et al., 2010).

Tab. 1: Eigenschaften verschiedener Chromophore

Strukturell zeichnen sich Phytochrome durch einen gemeinsamen Domänenaufbau

aus. Unabhängig von dem Organismus bestehen sie aus einer N-terminalen

photosensorischen Domäne und einer C-terminalen regulatorischen Domäne

(Abb. 4). Der Chromophor wird innerhalb der photosensorischen Domäne gebunden,

Einleitung

12

die sich wiederum in die PAS-, GAF- und PHY-Domäne unterteilt. Die PHY-Domäne

ist den GAF-Domänen sehr ähnlich und leitet sich evolutionär von dieser ab. Die

genaue Funktion ist bisher nicht bekannt, jedoch wird postuliert, dass die PHY-

Domäne einen Einfluss auf die spektrale Integrität des Phytochroms ausübt

(Montgomery & Lagarias, 2002).

Abb. 4: Allgemeine Domänenorganisation von klassischen Phytochromen Phytochrome bestehen aus einer N-terminalen photosensorischen und einer C-terminalen regulatorischen Domäne. Innerhalb der photosensorischen Domäne wird der Chromophor entweder in der PAS- oder GAF-Domäne gebunden. Die regulatorische Domäne zeichnet sich durch den Aufbau einer typischen Histidin-Kinasedomäne (HKD) einer bakteriellen SHK aus (modifiziert nach Montgomery & Langarias, 2002).

Der Chromophor wird in einer autokatalytischen Reaktion an einem konservierten

Cysteinrest im apo-Protein, über eine Thioether-Brücke, kovalent gebunden.

Allerdings unterscheidet sich in den Phytochromen verschiedener Organismen die

Binderegion des Tetrapyrrols. So binden pflanzliche und cyanobakterielle

Phytochrome das PФB bzw. PCB an einen konservierten Cysteinrest innerhalb der

GAF-Domäne, wohingegen bakterielle und fungale Phytochrome BVI Xα an einem

konservierten Cysteinrest innerhalb der PAS-Domäne assemblieren (Montgomery &

Lagarias, 2002).

Die C-terminale regulatorische Domäne der Phytochrome weist den typischen

Aufbau einer bakteriellen Histidin-Kinasedomäne (HKD) eines SHK eines ZKS auf.

Pflanzliche Phytochrome besitzen im Gegensatz zu anderen Arten keinen

konservierten Histidinrest in der regulatorischen Domäne. Sie sind Serin-oder

Threonin-Kinasen, die sich von den bakteriellen Histidin-Kinasen ableiten (Yeh et al.,

1998).

Einleitung

13

1.5.2 Phytochrome in heterotrophen Bakterien

Mit der Entdeckung eines Phytochrom-ähnlichen Proteins in dem heterotrophen

Bakterium Deinococcus radiodurans änderte sich die allgemein vorherrschende

Meinung, dass Rotlichtrezeptoren ausschließlich in phototrophen Organismen

vorkommen (Davis et al., 1999). Die Photobiologie einiger Phytochrome dieser

Organismen ist zwar bereits gut untersucht, jedoch gibt es nur wenige Beispiele in

denen die physiologische Rolle geklärt werden konnte.

Alle bislang untersuchten heterotrophen Bakterien genieren das holo-Protein durch

die Assemblierung mit BVI Xα (Bhoo et al., 2001). Anhand der spektralen

Eigenschaften lassen sich Bakteriophytochrome in zwei Klassen einteilen.

Prototypische Rotlichtrezeptoren, wie sie auch in Pflanzen vertreten sind, weisen

ohne Bestrahlung von Licht eine hellrotlichtabsorbierende Pr-Form auf. Bathy-

Phytochrome hingegen haben ihren Grundzustand im langwelligen Bereich, in der

Pfr-Form. Andere Bakterienarten wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens oder

P. syringae besitzen sogar zwei der rotlichtabsorbierenden Photorezeptoren. Die

Kinaseaktivitäten dieser Phytochrome sind bereits untersucht. In P. syringae konnte

dabei bei beiden Phytochromen eine klare chromophorabhängige, jedoch nur für

PsBphP1 eine lichtregulierte Phosphorylierungsaktivität beobachtet werden (Bhoo et

al., 2001; Schwach, 2010). In A. tumefaciens hingegen weisen beide Phytochrome

eine lichtregulierte Kinaseaktivität auf. Dabei sind diese jedoch in ihrer Aktivität

gegensätzlich. Während für AtBphP1 die Kinaseaktivität in der Pr-Form höher ist,

besitzt AtBphP2 eine höhere Autophosphorylierungsaktivität in der Pfr-Form. Beiden

gemein ist jedoch die höhere Phosphorylierungsaktivität in der apo-Form ohne

gebundenen Chromophor (Lamparter et al., 2002; Karniol et al., 2003).

1.5.3 Das Phytochromsystem aus P. aeruginosa

P. aeruginosa zählte zu den ersten heterotrophen Bakterienarten, in denen ein

Phytochrom (PaBphP) entdeckt wurde. Das Gen bphP, kodierend für das apo-

Phytochrom und ist mit der Hämoxgenase bphO zusammen in einem Operon

organisiert (Bhoo et al., 2001; Barkovits et al., 2008) (Abb. 5). Die Expression ist

zelldichteabhängig und wird durch den alternativen Sigmafaktor RpoS reguliert

(Barkovits et al., 2008). Anders als beispielsweise in D. radiodurans, P. putida oder

Rhizobium leguminosarium (Bhoo et al., 2001) ist kein putativer AR stromabwärts

Einleitung

14

von bphP lokalisiert, der an der Phytochrom-vermittelten Signaltransduktion beteiligt

sein könnte.

Abb. 5: Die genetische Organisation von bphO und bphP in P. aeruginosa Die Gene bphO, kodierend für die Hämoxygenase, und bphP, kodierend für das apo-Phytochrom, bilden ein bicistronisches Operon. Dabei liegt bphO stromaufwärts von bphP.

Biochemische Analysen anhand von rekombinant produzierten Proteinen bestätigten

die Spaltung von Häm zu BV IXα durch die Hämoxgenase BphO (Wegele et al.,

2004). Die Bindung des Chromophors an das apo-Phytochrom mit der dabei

verbundenen rotlichtinduzierten Photokonversion sowie die Kinaseaktivität von

PaBphP konnte ebenfalls bereits in vitro gezeigt werden. Dabei scheint die

Autophosphorylierung unabhängig von einem gebundenen Chromophor oder den

vorliegenden Lichtbedingungen abzulaufen (Tasler et al., 2005).

Obwohl globale Transkriptomanalysen einer ∆bphO- und ∆bphP-Deletionsmutante

eine Regulation von über 120 Genen durch das Phytochrom aufdeckten, konnte die

physiologische Funktion von PaBphP nicht geklärt werden. Allerdings fiel in diesen

Untersuchungen auf, dass etwa 50 % der identifizierten Gene zelldichteabhängig,

über das Quorum-Sensing-System (QS) reguliert werden (Barkovits et al., 2011).

1.6 Die Quorum-Sensing-Systeme in P. aeruginosa

Die Fähigkeit von Bakterien, die eigene Populationsdichte wahrzunehmen und die

Genexpression in Abhängigkeit der Zelldichte zu regulieren, wird als Quorum-

Sensing (QS) bezeichnet. Die Grundlage dieses Systems bilden kleine

Signalmoleküle (Autoinduktoren), die jede Bakterienzelle kontinuierlich durch die

Membran in ihre Umgebung abgibt. Mit zunehmender Zelldichte steigt die

Konzentration dieser Autoinduktoren somit proportional an. Bei Erreichen eines

Schwellenwertes diffundieren diese Signalmoleküle zurück in die Zelle und binden an

einen Transkriptionsregulator, der daraufhin die Expression spezifischer Gene

steuert (Waters & Bassler, 2005).

Einleitung

15

Die Fähigkeit zur Zell-Zell-Kommunikation wurde erstmals 1979 in dem marinen

Bakterium Vibrio fischeri im Zusammenhang mit der Regulation der Biolumineszenz

entdeckt (Nealson et al., 1979). Diese wird durch die beiden Genprodukte des Lux-

Operons, LuxI und LuxR, vermittelt. Die Autoinduktor-Synthase LuxI produziert

ausgehend von S-Adenosylmethionin das Signalmolekül N-(-3-oxo-hexanoyl)-L-

Homoserinlakton. Nach der Diffusion zurück in die Zelle bindet der Autoinduktor an

den Transkriptionsregulator LuxR. Neben vielen anderen Genen, induziert LuxR

auch das Lux-Operon selbst, wodurch es einer positiven Rückkopplungs-Regulation

unterliegt.

P. aeruginosa besitzt mehrere QS-Systeme die miteinander verbunden sind und

gehören dadurch zu den komplexesten bisher bekannten Regulationsnetzwerken

(Jimenez et al., 2012). Zu den Lux-Systemen, die Homoserinlaktone (HSL) als

Autoinduktoren verwenden, zählen das Las- und das Rhl-System. Diese sind

hierarchisch aufgebaut, wobei das Las- dem Rhl-System übergeordnet ist (Abb. 6).

Innerhalb des Las-Regulons synthetisiert LasI den Autoinduktor N-(3-oxo-

dedecanoyl)-L-Homoserinlakton (3-oxo-C12-HSL), welcher an den korrespon-

dierenden Transkriptionsregulator LasR bindet (Pearson et al., 1994). Dieser reguliert

unter anderem die Genexpression vieler Virulenzfaktoren, die in der akuten Infektion

involviert sind und die Wirtszellen schädigen. Darunter befinden sich verschiedene

Elastasen, Exotoxine und Proteasen (Toder et al., 1991; Gambello et al., 1993;

Jones et al., 1993).

Das zweite System bilden die Genprodukte von rhlI und rhlR, die beide ebenfalls

durch LasR induziert werden. Dabei bindet RhlR den durch RhlI synthetisierten

Autoinduktor N-butanoyl-HSL (C4-HSL) (Pearson et al., 1995). Das Rhl-System

reguliert ebenfalls viele Gene, deren Produkte entscheidend für die

Virulenzeigenschaften von P. aeruginosa sind. So unterliegen beispielsweise die

Gene für die Rhamnolipid-, Hydrogencyanid- oder Phenanzinsynthese einer Kontrolle

durch RhlR (Ochsner et al., 1994; Latifi et al., 1995). Neben diesen Faktoren wird

auch RpoS, der Sigmafaktor der stationären Phase, durch RhlR reguliert (Latifi et al.,

1996). Trotz des hierarchischen Aufbaus beider QS-Systeme, ist die Transkription

von rhlI und rhlR nicht komplett von LasR abhängig. In einer ∆lasR-Mutante ist die

Transkription dieser Gene nicht vollständig reprimiert, sondern werden verzögert

exprimiert (Schuster et al., 2003).

Einleitung

16

Zusätzlich zu den beiden dargestellten QS-Systemen die HSL als Autoinduktoren

verwenden, besitzt P. aeruginosa noch ein weiteres System, in welchem 4-Hydroxy-

2-Alkylquinole (HAQs) für die Zell-Zell-Kommunikation synthetisiert werden (Pesci et

al., 1999). Ausgehend von Anthranilat synthetisieren die Enzyme PqsABCD zunächst

das Molekül 2-Heptyl-4-quinolon (HHQ). In einem weiteren Schritt wird HHQ durch

PqsH in 2-Heptyl-3Hydroxy-4-quinolon (PQS) umgesetzt. Letzteres kann aufgrund

seiner hydrophoben Eigenschaften nicht durch die Membran diffundieren und wird

deshalb mittels Membranvesikel nach außen transportiert (Mashburn et al., 2005).

Beide, sowohl HHQ als auch PQS, fungieren als Autoinduktoren für den zugehörigen

Transkriptionsregulator PqsR (Abb. 6). Dieser wiederrum kontrolliert einige Gene, die

für verschiedene Virulenzfaktoren kodieren (Wade et al., 2005; Xiao et al., 2006).

Zum Großteil handelt es sich dabei um Gene, die ebenfalls durch LasR bzw. RhlR

induziert werden (Deziel et al., 2005). Sowohl pqsR als auch pqsH unterliegen einer

Kontrolle von LasR wodurch diese QS-Systeme miteinander verknüpft sind (Deziel et

al., 2005)

Einleitung

17

Abb. 6: Überblick über die QS-Systeme in P. aeruginosa P. aeruginosa besitzt zwei QS-Systeme, die HSL als Autoinduktoren verwenden: Das Las- und das Rhl-System. LasI produziert den Autoinduktor 3-oxo-C12-HSL, wohingegen RhlI C4-HSL synthetisiert. Beide binden an ihren dazugehörigen Transkriptionsregulator LasR bzw. RhlR und induzieren die Expression vieler Gene, sowie ihre eigene Expression. LasR kontrolliert ebenfalls die Transkription von rhlI und rhlR. Auch pqsR und pqsH unterliegen einer Kontrolle durch LasR. Die Quinolone HHQ und PQS diesen als Autoinduktoren für PqsR. Ausgehend von Anthranilat wird durch die Genprodukte von pqsABCD das Signalmolekül HHQ synthetisiert. Durch eine weitere enzymatische Katalyse von durch PqsH wird HHQ zu PQS umgesetzt. Das hydrophobe PQS wird mittels Membranvesikeln in die extrazelluläre Umgebung abgegeben (modifiziert nach Sifri, 2008).

1.7 Second messenger vermittelte Signaltransduktion durch

c-di-GMP

Neben den bereits beschriebenen ZKS und der charakteristischen Transphospho-

rylierung wird die intrazelluläre Signalweiterleitung auf ein eingehendes Signal

oftmals auch über second messenger vermittelt. Dabei handelt es sich um kleine

endogene Moleküle, deren Konzentration als Reaktion auf einen äußeren Reiz (first

messenger) hin verändert wird. In der Regel bindet solch ein Botenstoff an ein

Einleitung

18

Effektorprotein, welches daraufhin seine Konformation ändert und schließlich die

zelluläre Antwort auf das eingegangene Signal einleitet (Hengge, 2009). Dieser

Mechanismus der Signaltransduktion ist in allen Domänen des Lebens vertreten.

Sekundäre Botenstoffe auf der Basis von zyklischen Nukleotiden sind die

weitverbreitetsten Signalmoleküle und kommen sowohl in Eu- als auch in

Prokaryoten vor (Gomelsky, 2011). Zyklische Dinukleotide hingegen wurden bislang

nur in Bakterien entdeckt. Vor allem der second messenger zyklisches-di-

Guanosinmonophosphat (c-di-GMP) hat in den letzten Jahren durch die Aufdeckung

seiner Beteiligung an zentralen metabolischen Prozessen zunehmend an

Aufmerksamkeit gewonnen. Der ubiquitär in Bakterien vorkommende Botenstoff

reguliert unter anderem die Synthese von Adhäsinen, Exopolysacchariden, Alginat

sowie der Flagellen (Lee et al., 2007; Merighi et al., 2007; Wolfe et al., 2008).

Infolgedessen gilt c-di-GMP mittlerweile als der zentrale sekundäre Botenstoff für die

Regulation zwischen einer motilen und sessilen Lebensweise. Dabei ist die

intrazelluläre Konzentration von c-di-GMP entscheidend. Während ein niedriger

c-di-GMP-Spiegel die Motilität und planktonische Lebensweise fördert, induziert eine

hohe Konzentration die sessile Lebensweise und begünstigt somit die Ausbildung

von Biofilmen (Römling et al., 2005). Die Konzentration des second messengers wird

durch zwei Enzyme reguliert, die in ihrer Funktion gegensätzlich sind (Abb. 7). Dabei

katalysieren Diguanylatzyklasen (DGC) die Synthese von c-di-GMP durch die

zyklische Verknüpfung zweier Moleküle Guanosintriphosphat (GTP) über

3´-5´-Phosphodiesterbrücken. Der Abbau wird von Phosphodiesterasen (PDE) durch

die Spaltung einer dieser beiden Phosphodiesterbindungen zu dem linearen Produkt

5´-Phosphoguanylyl-(3´-5´) guanosin (pGpG) reguliert. Beide Enzymgruppen

enthalten konservierte Domänen, die nach der Aminosäuresequenz ihres

katalytischen Zentrums benannt wurden. So besitzen DGCs ein GGDEF-Motiv, PDEs

hingegen zeichnen sich durch eine EAL-Domäne aus (Hengge, 2009).

Einleitung

19

Abb. 7: Synthese und Hydrolyse von c-di-GMP Diguanylatzyklasen (DGC) mit einer charakteristischen GGDEF-Domäne katalysieren die Synthese von c-di-GMP aus zwei Molekülen Guanosintriphosphat (GTP). Phosphodiesterasen (PDE) mit einer charakteristischen EAL-Domäne hydrolysieren das zyklische Molekül zu dem linearen Produkt pGpG.

GGDEF- und EAL-Domänen kommen häufig in Kombination vor, wobei die EAL-

Domäne meist N-terminal gelegen ist. Für gewöhnlich weist dabei eine der beiden

Domänen ein degeneriertes Motiv auf, welches einen modulierenden Einfluss auf die

katalytisch aktive Domäne ausübt. Bifunktionale Proteine, die in vivo beide Aktivitäten

besitzen, sind selten (Jenal et al., 2006). Gesteuert wird der Auf- oder Abbau von

c-di-GMP meistens über eine N-terminal fusionierte Sensordomäne. Genau wie bei

SHK ist diese sehr variabel und spiegelt die Diversität der Signalintegration auf

verschiedene Reize wieder (Galperin et al., 2001). Neben PAS- und GAF-Domänen

sind DGCs und PDEs auch häufig mit REC-Domänen oder DNA-bindenden

Domänen fusioniert, wodurch sie Teil eines ZKS darstellen (Paul et al., 2004). Durch

die Wahrnehmung der vorherrschenden Umweltbedingungen über diese

Sensordomänen wird der c-di-GMP-Pool dahingehend angepasst und die

Lebensform, planktonisch oder sessil in Biofilmen, reguliert.

1.7.1 Einfluss von c-di-GMP auf den Biofilmzyklus

Sowohl eine planktonische Lebensform, als auch eine hochstrukturierte Organisation

in Biofilmen bietet den Organismen Vorteile. Frei schwimmende, planktonische

Zellen sind beispielsweise in der Lage, neue Habitate mit für sie optimalen

Nährstoffbedingungen zu erschließen. Die Ansammlung von Bakterien, umhüllt von

einer Matrix aus verschiedenen extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), bietet

den Organismen dahingegen einen enormen Schutz gegenüber äußeren Einflüssen.

Es wird geschätzt, dass etwa 90 % aller Bakterien in einer derartigen

Lebensgemeinschaft angesiedelt sind (Costerton, 1995). Die Ausbildung eines

Einleitung

20

solchen Biofilms ist ein sehr komplexer Prozess und kann in verschiedene Stadien

eingeteilt werden. (Abb. 8). Zunächst lagern sich einzelne motile Zellen an eine

Oberfläche an (1). Es folgt die initiale Anheftung, die durch die Flagellen und TypIV-

Pili vermittelt wird. Nach der Anlagerung bilden sich die Flagellen zurück, wodurch

die Anheftung irreversibel wird (2). Parallel wird die Sekretion von EPS, vor allem das

Zuckerpolymer Alginat, induziert (Davies et al., 1993; Garrett et al., 1999). Neben

Alginat werden auch Proteine, Nukleinsäuren sowie verschiedene Lipide sezerniert

(Flemming et al., 2010). Durch die Anlagerung weiterer Zellen bilden sich zunächst

kleine Mikrokolonien aus (3). Innerhalb dieser vermehren sich die angehefteten

Bakterien und produzieren weiter EPS, wodurch der Biofilm kontinuierlich wächst und

komplexe dreidimensionale Strukturen ausbildet (4). In diesem Stadium ist er von

kleinen Gängen durchzogen, um einerseits die Nährstoffversorgung der im inneren

lebenden Zellen zu gewährleisten und andererseits anfallende Stoffwechselprodukte

abzutransportieren (Costerton, 1995; Espinosa-Urgel, 2003). Trotz dieses

Tunnelsystems ist das Milieu in einem solchen reifen Biofilm nicht homogen. Sowohl

der pH-Wert als auch der Sauerstoffgehalt sinkt mit zunehmender Schichttiefe und es

entstehen anoxische Bereiche (Xu et al., 1998). Das letzte Stadium stellt die

Auflösung des Biofilms dar (5). Dabei werden motile Zellen freigesetzt, die neue

Habitate besiedeln können.

Abb. 8: Stadien der Biofilmbildung Die Biofilmbildung kann in fünf Phasen eingeteilt werden. 1: Reversible Anheftung; 2: Irreversible Anheftung; 3: Bildung von Mikrokolonien; 4: Reifung des Biofilms, 5: Biofilmauflösung. Die genauen Vorgänge sind im Text beschrieben (entnommen aus Sauer, 2003).

Einleitung

21

Der second messenger c-di-GMP ist in allen Stadien der Biofilmbildung unmittelbar

involviert. In P. aeruginosa ist die Konzentration des sekundären Botenstoffes in

Biofilmzellen etwa 10-fach höher, als in aufgelösten Zellen (Barraud et al., 2006).

Diese Messungen korrelieren dabei mit einer niedrigen PDE-Aktivität der sessilen

bzw. einer erhöhten Aktivität der aufgelösten Zellen. Die Dispersion des Biofilms

unter nativen Bedingungen wird beispielsweise durch das endogen freigesetzte

Stickstoffmonoxid (NO), welches bei der Denitrifikation entsteht, induziert. Das

entstandene Gas hat dabei einen positiven Einfluss auf die PDE-Aktivität, wodurch

die Auflösung des Biofilms eingeleitet wird (Barraud et al., 2009). Diese Auflösung

kann auch gezielt unter Laborbedingungen durch eine Zugabe von NO oder durch

Änderung des Nährstoffangebots, wie z.B. eine erhöhte Glutamatmenge,

hervorgerufen werden (Sauer et al., 2004; Barraud et al., 2009). In P. aeruginosa

konnten bereits verschiedenen Proteine und PDEs identifiziert werden, die essentiell

für die NO-induzierten Biofilmauflösung sind (Morgan et al., 2006; An et al., 2010;

Roy et al., 2012). Gemeinsam haben diese PDEs, dass sie nicht selbst in der Lage

sind NO wahrzunehmen und die katalytische Aktivität somit nicht direkt durch NO

reguliert wird.

1.7.2 NbdA ist essentiell für die Biofilmauflösung in P. aeruginosa

Mit NbdA wurde eine PDE identifiziert, die direkt an der NO-Wahrnehmung beteiligt

zu sein scheint (Li et al., 2013). Dieses Protein zeichnet sich durch eine EAL-

Domäne und degeneriertes GGDEF-Motiv (AGDEF) aus und gehört zu einem der 16

Proteinen mit beiden Motiven (Kulasakara et al., 2006). Biochemische Analysen von

verkürzten Varianten sowie phänotypische Untersuchungen einer ∆nbdA-Mutante

bestätigten die PDE-Aktivität (Li et al., 2013; Heine, 2009). Die beiden zytosolisch

lokalisierten GGDEF- und EAL-Domänen sind mit einer N-terminal gelegenen MHYT-

Sensordomäne fusioniert. Diese Domäne wurde ebenfalls nach einer konservierten

Aminosäuresequenz benannt. Sie besteht aus sechs Transmembranhelices und

weist konservierte Methionin- und Histidinreste nahe der äußeren Membran auf.

Daher wird postuliert, dass diese Domäne putativ ein Kupferion binden kann, und

über dieses diatomische Gase wie Sauerstoff, Kohlenstoffmonoxid oder NO

wahrgenommen werden kann (Galperin et al., 2001). Anders als bei bisher in

P. aeruginosa beschriebene PDEs könnte der c-di-GMP-Abbau direkt über die

Einleitung

22

Bindung des Gases an diese Domäne reguliert werden. Die Bedeutung von NbdA

auf die NO-regulierte Biofilmauflösung konnte zudem bereits gezeigt werden (Li et

al., 2013). Dabei führt eine Deletion des Gens zu einem Verlust der NO-induzierten

Biofilmauflösung, weshalb es auf Basis dieser Funktion NO-induced biofilm

dispersion locus A, kurz NbdA annotiert wurde (Li et al., 2013).

Einleitung

23

1.8 Zielsetzung

Phytochrome sind weit verbreitete Photorezeptoren, die vor allem in autotrophen

Organismen dafür bekannt sind, zelluläre Funktionen auf hellrotes und dunkelrotes

Licht zu vermitteln. Mit fortschreitender Technik auf dem Gebiet der Genom-

sequenzierung sind Phytochrom-ähnliche Rezeptoren inzwischen auch für

heterotrophe Organismen wie Pilze und Bakterien beschrieben. Sie zeichnen durch

ihre Histidin-Kinase-Domäne als Bestandteile eines Zwei-Komponenten-Systems

aus. Obwohl die biochemischen Eigenschaften dieser Phytochrome bereits gut

verstanden sind, bleibt die Bedeutung von Rotlichtrezeptoren in nicht-

photosynthetischen, heterotrophen Bakterien immer noch offen. Zu den ersten dieser

heterotrophen Bakterienarten, in denen ein Phytochrom nachgewiesen wurde, gehört

auch der Modellorganismus P. aeruginosa.

In der vorliegenden Arbeit sollte durch eine Kombination verschiedener

experimenteller Ansätze ein Überblick über die Funktion des Phytochroms aus

P. aeruginosa (PaBphP) in vivo gewonnen werden. Durch die homologe Isolierung

des Phytochroms mit anschließender Charakterisierung der Photobiochemie,

insbesondere im Hinblick auf den nativ gebundenen Chromophor, sowie die

Untersuchung der Kinaseeigenschaften, sollte das bestehende Wissen erweitern.

Neben der Untersuchung der genetischen Regulation des Phytochroms, sollte

ebenfalls die weiterführende Signaltransduktionskaskade aufgedeckt, sowie putative

Interaktionspartner von PaBphP identifiziert werden. Darüber hinaus sollten

phänotypische Analysen von Deletionsmutanten ebenfalls Hinweise auf die Funktion

des Phytochroms in P. aeruginosa liefern.

In einem weiteren Projekt sollte die Transkriptionsregulation von nbdA, kodierend für

eine Phosphodiesterase (PDE), näher charakterisiert werden. PDEs regulieren durch

den Abbau des sekundären Botenstoffes c-di-GMP den Biofilmzyklus. Dabei ist NbdA

maßgeblich an der NO-induzierten Dispersion beteiligt. Es zeigte sich, dass NO

dabei auch einen Einfluss auf die Transkription von nbdA hat, was bisher einzigartig

für eine PDE ist. Mittels Reportergenanalysen sollte diese Regulation, mit dem Fokus

auf der Identifizierung des entsprechenden Transkriptionsfaktors, aufgeklärt werden.

Material und Methoden

24

2. Material und Methoden

2.1 Bakterienstämme

Tab. 2: Verwendete E. coli-Stämme

Stamm relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft JM83 ara, ∆lac-pro, strA, thi, [Φ80lacZ∆M15] Vieira et al., 1982

BL21 (λDE3) F- ompZ r

-m

- lysPlacUV5-T7-GenlPlac

q-lacI Studier et al., 1990

S17-I Ec294::[RP4-2(Tc::Mu)(Km::Tn7), pro, res, recA, Tp

R, Sm

R

de Lorenzo & Timmis, 1994

Tab. 3: Verwendete P. aeruginosa Wildtypstämme

Stamm relevante Eigenschaft Referenz/Herkunft PAO1 Pseudomonas aeruginosa Wildtyp PAO1 Dunn et al., 1971

PA14 Pseudomonas aeruginosa Wildtyp UCBPP-14 Rahme et al., 1995

Tab. 4: Verwendete P. aeruginosa Deletionsstämme

Stamm relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft PAO1∆fhpR PAO1∆fhpR::[Tc] Lewenza et al., 2005

PAO1∆rpoS PAO1∆rpoS::[Gm] Barkovits et al., 2008

PAO1∆lasR PAO1∆lasR::[Gm] Diese Arbeit

PAO1∆rpoN PAO1∆rpoN TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆rhlR PA14_∆rhlR TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆bphO PA14_∆bphO::[Gm] Heckmann, 2010, RUB

PA14_∆bphP PA14_∆bphP::[Gm] Heckmann, 2010, RUB

PA14_∆hemO PA14_∆hemO::[Gm] Diese Arbeit

Verwendete Transposonstämme für den „genetischen Screen“

PA14_∆00430 Putativer AR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆02260 AR CheY2, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆05320 AR PilG, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆05330 AR PilH, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆07840 AR AgtR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆06060 AR CreB, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆06950 Putativer Transkriptionsregulator, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆09690 AR BifR, TM [Gm] Liberati et al., 20061



PA14_∆12780 AR RocA1, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆12810 AR RocR, TM [Gm] Liberati et al., 20061



PA14_∆16500 AR WspR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆17670 AR ErdR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆20780 Hypothetisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆22940 AR GltR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆23130 Hypothetisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆24350 AR CprR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆24710 AR RocA2, TM [Gm] Liberati et al., 20061


25



PA14_∆27810 AR CpoR, TM [Gm] Liberati et al., 20061


PA14_∆27950 Hytothetisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆30650 AR GacA, TM [Gm] Liberati et al., 20061


PA14_∆31960 AR CzcR, TM [Gm] Liberati et al., 20061


PA14_∆33920 Putativer Transkriptionsregulator Liberati et al., 20061

PA14_∆38930 AR ErbR Liberati et al., 20061


PA14_∆41260 AR ParR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆41490 Hypotheteisches Protein, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆42970 Transkriptionsregulator Sfa2, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆45620 AR CheY, TM [Gm] Liberati et al., 20061



PA14_∆49180 AR PhoP, TM [Gm] Liberati et al., 20061


PA14_∆50180 AR FleR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆50220 Transkriptionsregulator FleQ, TM [Gm] Liberati et al., 20061



PA14_∆55810 AR PprB, TM [Gm] Liberati et al., 20061




PA14_∆58300 AR RoxR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆59770 AR RcsB, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆60260 AR PilR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆62540 AR CbrB, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆63150 AR PmrA, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆63210 PDE, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆65540 FimX, TM [Gm] Liberati et al., 20061


PA14_∆64570 AR IrlR, TM [Gm] Liberati et al., 20061


PA14_∆67680 AR NtrC, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆68250 AR DctD, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆69470 AR AlgR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆70750 AR PhoB, TM [Gm] Liberati et al., 20061


PA14_∆72720 AR MifR, TM [Gm] Liberati et al., 20061

PA14_∆72380 AR AlgB, TM [Gm] Liberati et al., 20061

*Bereitgestellt von Prof. Dr. S. Häussler, HZI Braunschweig; TM:Transposon-Mutante, CGm:15 µg/ml


26

Tab. 5: Verwendete P. aeruginosa Reportergenstämme

Stamm relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft Untersuchung der bphOP-Promotoraktivität

PA14 bphOP-lacZ PA14 attp::pSHP25 Diese Arbeit

PA14_∆rpos bphOP-lacZ PA14∆rpos attp::pSHP25 Diese Arbeit

PA14_∆lasR bphOP-lacZ PA14∆lasR attp::pSHP25 Diese Arbeit

PA14_∆rhlR bphOP-lacZ PA14∆rhlR attp::pSHP25 Diese Arbeit

Untersuchung der bphP-Promotoraktivität

PA14 bphP-lacZ PA14 attp::pJKP01 Diese Arbeit

PAO1∆rpos bphP-lacZ PA14∆rpos attp::pJKP01 Diese Arbeit

PA14_∆lasR bphP-lacZ PA14∆lasR attp::pSHP25 Diese Arbeit

PA14_∆rhlR bphP-lacZ PA14∆rhlR attp::pJKP01 Diese Arbeit

Untersuchung der nbdA-Promotoraktivität

PAO1 nbdA-lacZ PAO1attp::pSHP48 Diese Arbeit

PAO1∆fhpR nbdA-lacZ PAO1∆fhpR attp::pSHP48 Diese Arbeit

PAO1∆lasR nbdA-lacZ PAO1∆lasR attp::pSHP48 Diese Arbeit

PA14_∆rhlR mucR-lacZ PA14∆ rhlR attp::pSHP48 Diese Arbeit

PAO1∆rpoN nbdA-lacZ PAO1∆rpoN attp::pSHP48 Diese Arbeit

Untersuchung der PA4739-Promotoraktivität („genetischer Screen“)

PA14 4739-lacZ PA14 attp::pKBP10 Heckmann, 2010, RUB

PA14_∆bphP 4739-lacZ PA14_∆bphP attp::pKBP10 Heckmann, 2010, RUB

PA14_∆38930 4739-lacZ PA14_∆38930 attP::pKBP10 Hettwer, 2013, RUB









PA14_∆00430 4739-lacZ PA14_∆00430 attP::pKBP10 Diese Arbeit




























27








































2.2 Vektoren und rekombinante Plasmide

Tab. 6: Verwendete Vektoren

Vektor relevante Eigenschaften Referenz/Herkunft

mini-CTX1 Tc

r; selbtintegrierbarer Vektor mit Ω-Frt-

attP-MCS, ori, int und oriT, TcR

Becher & Schweizer, 2000

pASK-IBA3 PtetA, OtetA, tet-Repressor, Strep-tagII, AmpR IBA GmbH

pASK-IBA3_bphP Kodierender Bereich von bphP aus PAO1 in pASK-IBA3, Amp

R

Tasler et al., 2005

pBBR-mcs2 Mob, pBBR1-Replicon broad-host-range-Vektor, Kan

R,

Kovach et al., 1995

pBSL15 pUC-Derivat, Amp

R, Kan

R, Ursprung

Kanamycin-Kassette für pSHP48 Alexeyev, 1995


28

pET14b-lasR Kodierender Bereich von lasR aus PAO1 in pET14b mit Amp

R

Seet et al., 2011

pET21a DrbphR Kodierender Bereich von bphR aus Deinococcus radiodurans pET21a , Kan

R

Bhoo et al., 2001

pET52-PsbphP1-holo Kodierender Bereich des PsbphOP1-Operons aus P. syringae in pET52 , Kan

R

Shah et al., 2012

pEX18Ap_∆hemO Plasmid zur Deletion von hemO, Basisvektor: pEX18Ap, Amp

R

Prof. Dr. A. Oglesby-Sherrouse; University of Maryland

pHERD20T PBAD araC; E. coli/P. aeruginosa shuttle vector, erlaubt homologe Überproduktion in P. aeruginosa, Tc

R

Qiu et al., 2008

pJK01 Promotorregion von bphP (849 bp) in mini-CTX1, Tc

R

Konieczny, 2011

pSB219.9A pRIC380, Plasmid zur Deletion von lasR, Basisvektor: pEX18Ap, Amp

R, Gm

R

Beatson et al., 2002

pUCPKS_rhlR Kodierender Bereich von rhlR in pUCPKS, lac-Promotor, Amp

R

Dekimpe & Deziel, 2009

pYPRUB137II pACYC184-Derivat, Ursprung „lacZ-Kan

R-

oriT-Kassette, KanR, Cm

R

Pfänder, RUB

pSHP10 Promotorbereich von nbdA (621 bp) in mini-CTX1, Tc

R

Heine, 2009

pSHP23 Kodierender Bereich von PA14_02260 in pASK-IBA3, Amp

R

Diese Arbeit

pSHP24 Kodierender Bereich von PA14_27950 in pASK-IBA3,Tc

R

Diese Arbeit

pSHP25 Promotorregion von bphOP in miniCTX1 (550bp),Tc

R

Diese Arbeit

pSHP42

pASK-IBA3_bphP mit „lacZ-KanR-oriT-

Kassette aus pYPRUB137II, zur C-terminal chromosomalen Integration des Strep-tagII von bphP, Amp

R, Kan

R

Diese Arbeit

pSHP46 pHERD20T mit bphP-Strep-tagII aus pASK-IBA3_bphP, zur homologen Überproduktion in PA14, Tc

R, Amp

R

Diese Arbeit

pSHP48 Promotorregion von nbdA in mini-CTX1 mit Kan

R-Kassette, Tc

R, Kan

R

Diese Arbeit

pSHP59 Kodierender Bereich von PA14_62540 in pASK-IBA3, Amp

R

Diese Arbeit

2.3 Oligonukleotide

Die in Tabelle 7 aufgeführten Oligonukleotide (Primer) dienten zur Amplifikation

bestimmter DNA-Abschnitte mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und wurden

von der Firma MWG-Biotech AG, Ebersberg bezogen.

Tab. 7: Verwendete Oligonukleotide

Name Sequenz (5´ 3´) Primer zur Erstellung der Reportergenfusion pSHP25 (Promorregion von bphOP)

pSHP25 fwd, XhoI GCCTCGAGGAGCGCGCCCGCT

pSHP25 rev, HindIII GCAAGCTTCGCACCCCGGTTGCCTG

Primer zur Überprüfung der chromosomalen Integration der Reportergenfusionen

miniCTX fwd ACCTAGGATCTCGATCCCGGTCG

miniCTX rev ATCCACCGGCGCGCGTAATACG


29

Primer zur Erstellung der Überproduktionskonstrukte (CheY2, PA14_24950, CbrB)

pSHP23 fwd, BsaI ATGGTAGGTCTCAAATGGGCAAACCGATTCTGATCGTCG

pSHP23 rev, BsaI ATGGTAGGTCTCAGCGCTGGGCAGGACCTTGCGCGTCA

pSHP24 fwd, BsaI ATGGTAGGTCTCAAATGAGTACCGGTAAAATCCAGTTTGCC

pSHP24 rev, BsaI ATGGTAGGTCTCAGCGCTATGGCGCTCCAGGGCGCTGA

pSHP59 fwd BsaI ATGGTACGTCTCAAATGGCACATATTCTGATCGTCGAAGAC

pSHP59 rev BsaI ATGGTACGTCTCAGCGCTCGAGTCGGCCGA GGCCCCT

Primer zur Erstellung der Promotorfragmente der LasR-Bindestudien (DMSA)

rhlR fwd TTGTCACAACCGAGTATCG

rhlR rev TCTCGCTACGCAAACCGTCC

bphO fwd TGCTACCGGGTGGTGCAG

bphO rev GGTGGCGTCGCGGAGT

bphP fwd CGGGGCTACGGCCAGGCAAC

bphP rev CCTCCTCGCGGCAAGCGAGAACAT

2.4 Medien und Zusätze

2.4.1 Medien

Alle Medien wurden 20 min bei 121 °C und 120 kPa autoklaviert. Hitzelabile

Komponenten wurden sterilfiltriert (Millipore Membranfilter, Porendurchmesser

0,2 µm) und den autoklavierten Medien bei einer Temperatur unter 60 °C zugesetzt.

Für feste Medien wurden zusätzlich, soweit nicht anders angegeben, 1,5 % (w/v)

Agar vor dem Autoklavieren zugegeben.

LB-Medium

Als Komplexmedium wurde für E. coli und P. aeruginosa Luria-Bertani (LB) Medium

verwendet.

Trypton 10 g/l Hefe-Extrakt 5 g/l NaCl 10 g/l Synthetisches Medium

Für die Promotorstudien unter Zugabe von Stickstoffmonoxid-Donoren Nitrat und

Nitrit wurde ein synthetisches Medium (SM) als Minimalmedium verwendet (Wood,

1978).

Glutamat 6,76 g/l KH2PO4 4,76 g/l

NaNO3 3,4 g/l MgSO4 x 7*H2O 0,09 g/l

FeSO4 0,0022 g/l CuSO4 x 5*H2O. 0,0037 g/l (NH4)2Mo2O7 0,00019 g/l


30

2.4.2 Antibiotika und Medienzusätze

Alle Antibiotika und Medienzusätze wurden sterilfiltriert (Millipore Membranfilter,

Porendurchmesser 0,2 µm) und dem abgekühlten Medium nach dem Autoklavieren

bzw. der Kultur zur Induktion der Proteinproduktion zu verschiedenen Zeitpunkten

zugegeben.

Tab. 8: Verwendete Antibiotika

Antibiotikum E. coli [µg/ml] P. aeruginosa [µg/ml] Ampicillin 100 -

Carbenicillin - 500

Tetrazyklin 10 100

Gentamicin 10 200

Kanamycin 50 200

Tab. 9: Verwendete Zusätze

Zusatz Stammlösung Endkonzentration x-Gal 100 mg/ml 100 µg/ml

Succrose 50 % (w/v) 5 % (w/v)

Arabinose 50 % (w/v) 0,2-1 % (w/v)

AHT 2 mg/ml 0,2 µg/ml

2.5 Enzyme, Antiserum, Kits und Chemikalien

2.5.1 Enzyme, Antiserum und Kits

Die Enzyme (Tab. 10) wurden inklusive ihrer zugehörigen Puffersysteme

nach Angaben des Herstellers verwendet.

Tab.10: Verwendete Enzyme

Enzym Hersteller Restriktionsendonukleasen Fermentas, Thermo Scientific

RNase A Fermentas, Thermo Scientific

T4-Ligase Fermentas, Thermo Scientific

Pfu-Polymerase RUB, Bochum LS Biologie der Mikroorganismen

Taq-Polymerase Biotherm, Genecraft

Tab. 11: Verwendetes Antiserum

Antiserum Hersteller Antikörperkonjugat Strep-Tactin Alkalische Phosphatase

IBA GmbH


31

Tab. 12: Verwendete Kits

Bezeichung Hersteller

Nucleo Spin Extract II Macherey & Nagel

Nucleo Spin Plasmid Macherey & Nagel

2.5.2 Chemikalien

Tab. 13: Verwendete Chemikalien

Artikel Hersteller

[γ32P]-ATP Hartmann Analytic

ß-Mercaptoethanol Serva

Acryalamid/Bisacrylamid (30%) BioRad

Agar-Agar Roth

Agarose Serva

Anhydrotetrazyklin (AHT) IBA GmBH

Antibiotika Serva, Sigma Aldrich

Ammoniumpersulfat BioRad

Arabinose Sigma-Aldrich

Bacto Tryptone Difco

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) Sigma-Aldrich

5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-Galaktopyranosid (x-Gal)

Roth

Bromphenolblau Serva

Chloroform Prolabo

Coomassie Brilliant Blue R 250 Serva

Desthiobiotin Sigma-Aldrich

Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) Fermentas, Thermo Scientific

DMSO J.T.Barker

EDTA Merck

Ethidiumbromid Sigma-Aldrich

Hefe-Extrakt Gibco BRL

2-[4´-Hydroxy-Benzenazo] Benzoesäure (HABA) Sigma-Aldrich

MAHMA NONOate Sigma-Aldrich

p-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) Biomol

o-Nitrophenyl β-D-Galaktosid (ONPG) Serva

Rinderserumalbumin (BSA) Serva

S-Nitroglutathion Sigma-Aldrich

Sodiumdodecylsulfat (SDS) Applichem

Sodium Nitroprussid (SNP) Sigma-Aldrich

Strep-Tactin Sepharose IBA GmbH

TEMED BioRad

Tween-20 Serva


32

2.6 Geräte und Software

Tab. 14: Verwendete Geräte

Gerät Bezeichnung Hersteller

Agarose-Gelelektrophorese ChomPhor L mini BioRad

Autoklav LVSA50/70 Zirbus

Blotapparatur Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell

BioRad

Chromatographie-System Äkta Explorer 10 Amersham Bioscienes

Geldokumentationsanlage Multi Image Light Cabinet Biozym

Inkubationsschüttler SM-30 Control Bühler

Innova 4230 New Brunswick Scientifics

Aquatron Infors

Feinwaage BL1500 Sartorius

PCR-Gerät My CyclerTM BioRad

pH-Messgerät Seven Easy Mettler Toledo

Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab

8453 UV visible system Agilent Technologies

Genesys 20 Thermo Scientific

Phospoimager BAS 1000 Fuji

Phospho-Imager-Platte BAS-MS2040 Fuji

Rotoren SS34 Sorvall

SLA 3000 Sorvall

A4-44 Eppendorf

Reinstwasseranlage Purelab Ultra ELGA

Rotlichtfilter 690 nm Oriel Instruments

750 nm Kodak

SDS-PAGE Apparatur Mini PROTEAN® 3 System BioRad

Spannungsgeber PowerPac 300 BioRad

Thermoblock Thermostat plus Eppendorf

Ultraschallgerät Sonifier 250 Branson

Zentrifugen Tischzentrifuge5415 D Eppendorf

Kühlzentrifuge 5810 Eppendorf

Kühlzentrifuge RC-5C Sorvall

Alle weiteren Geräte entsprachen den laborüblichen Standards. Tab. 15: Verwendete Software/Open Source-Programme

Software Hersteller/Beschreibung Clone Manager Sci-Ed

Seqman DNASTAR

Protein calculator http://protcalc.sourceforge.net

Prodoric Database http://prodoric.tu-bs.de

Pseudomonas-Datenbank http://pseudomonas.com

Pfam Database http://pfam.sanger.ac.uk

http://protcalc.sourceforge.net/

http://prodoric.tu-bs.de/

http://pseudomonas.com/


33

2.7 Mikrobiologische Methoden

2.7.1 Bakterienkultivierung

2.7.1.1 Plattenkulturen

Für die Anzucht von E. coli und P. aeruginosa auf Festmedium wurden Bakterien aus

einer Glycerinkultur (vgl. 2.7.2) mit einer sterilen Impföse entnommen und auf eine

LB-Agar-Platte ausgestrichen. Diese war bei Bedarf mit entsprechenden Zusätzen

versehen. Die Platten wurden anschließend über Nacht (üN) bei 37 °C inkubiert und

dienten als Stammplatten für Vorkulturen in Flüssigmedium.

2.7.1.2 Flüssigkulturen

Für Vorkulturen wurden je nach Bedarf 5 ml Medium in Reagenzgläsern oder

20-50 ml Medium in Schikanekolben mit entsprechenden Antibiotika versetzt und mit

einer Einzelkolonie einer Stammplatte inokuliert. Die Ansätze wurden üN bei 37 °C

und 200 Umdrehungen pro Minute (UpM) im Brutroller bzw. Rundschüttler inkubiert.

Diese Vorkulturen werden im Weiteren als Übernacht-Kulturen (ÜNK) bezeichnet.

2.7.2 Lagerung von Bakterien

Die Lagerung von Bakterienstämmen erfolgte in Glycerinkultur. Dazu wurden 0,7 ml

einer ÜNK mit 0,7 ml einer 80 %-igen (v/v) Glycerin-Stammlösung versetzt und bei

-80 °C gelagert.

2.7.3 Messung der Zelldichte

Die Messung der Zelldichte einer Flüssigkultur wurde photometrisch über die

optische Dichte (oD) bei einer Wellenlänge von 578 nm bestimmt. Eine oD578 nm von

1 entspricht etwa 1x109 Zellen/ml Kultur. Als Referenz diente das entsprechende

Medium.


34

2.7.4 Anzucht von P. aeruginosa unter verschiedenen Bedingungen

P. aeruginosa wurde unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen angezogen.

Ausgehend von einer aerob angewachsenen ÜNK bei 37 °C und 200 UpM wurden

Hauptkulturen mit einer oD578nm von 0,1, ohne Zugabe von Antibiotika, inokuliert. Für

das Wachstum unter aeroben Bedingungen wurden 30 ml LB- bzw. SM beimpft und

in 100 ml-Schikanekolben bei 37 °C und 200 UpM inkubiert. Sauerstofflimitierende

Bedingungen wurden durch die Inkubation von 40 ml Medium bei 50 UpM

geschaffen. In LB-Medium wurden dabei zudem 50 mM des alternativen

Elektonenakzeptors Natriumnitrat gegeben (in SM bereits enthalten). Es wurden zu

verschiedenen Zeitpunkten Proben für die Bestimmung der Zellzahl über Messung

der oD578 nm bzw. zusätzlich Proben für die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität

(vgl. 2.10) entnommen.

2.8 Molekularbiologische Methoden

2.8.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen

Die Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen erfolgte nach der Calciumchlorid

Methode (Sambrook et al., 1989). Dazu wurden 70 ml LB-Medium 1/100 mit einer

ÜNK des gewünschten E. coli Stammes inokuliert und bei 37 °C und 200 UpM bis zu

einer oD578 nm von 0,4-0,6 inkubiert. Anschließend wurden je 25 ml Kultur in

Zentrifugenröhrchen überführt und die Zellen 10 min bei 4000 UpM und 4 °C

sedimentiert (Eppendorf 5810, Rotor A4-44). Das Pellet wurde in 12,5 ml kaltem

TMF-Puffer aufgenommen und 1 h auf Eis inkubiert. Nach anschließender

Zentrifugation für 10 min und 4000 UpM bei 4 °C (Eppendorf 5810, Rotor A4-44)

wurde das Sediment in 2,5 ml TMF-Puffer resuspendiert und 750 µl kaltes Glycerol

zugegeben. Die Zellen wurden in Aliquots zu 200 µl bei -80 °C gelagert.

TMF-Puffer

CaCl2 100 mM MnCl2 x 2*H2O 40 mM RbCl x 4*H2O 50 mM


35

2.8.2 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen

Für die Transformation von Plasmid-DNA (Sambrook et al., 1989) in chemisch

kompetente E. coli Zellen wurden 100 µl TMF-Puffer und 0,1 - 1 µg DNA bzw. 20 µl

Ligationsansatz zu den kompetenten Zellen gegeben. Nach einer 30-minütigen

Inkubation auf Eis erfolgte ein Hitzeschock bei 42 °C für 2 min. Anschließend wurden

0,7 ml LB-Medium zugegeben und bei 37 °C für 60-90 min bei 200 UpM inkubiert.

Volumina von 50 µl, 100 µl und der sedimentierte, resuspendierte Rest wurden auf

Selektivmedium ausplattiert und üN bei 37 °C inkubiert. Ansätze ohne zugegebene

Plasmid-DNA dienten der Kontrolle.

2.8.3 Diparentales Mating zur Transformation in P. aeruginosa

Die Konjugation von Plasmid-DNA in P. aeruginosa erfolgte mit Hilfe von E. coli

S17-I-Zellen. Diese enthalten für diesen Prozess benötigten tra-Gene. Dafür wurden

ÜNK von E. coli S17-I-Zellen mit dem entsprechenden Plasmid, sowie der

gewünschte P. aeruginosa Stamm ohne Antibiotika üN angezogen. Für das

diparentale Mating wurden die beiden Kulturen in einem Verhältnis 9:1

(Donor:Rezipient) in einem Endvolumen von 2 ml gemischt und 30 min bei RT

inkubiert. Der Ansatz wurde anschließend 1 min bei 4000 UpM zentrifugiert

(Eppendorf 5415 D), das Pellet in 100 µl LB vorsichtig resuspendiert, als Tropfen auf

eine LB-Platte gegeben und für 24 h bei 37 °C inkubiert. In dieser Zeit wird das

mobilisierbare Plasmid von E. coli nach P. aeruginosa übertragen. Die Zellen wurden

anschließend mit einer Glaspipette von der Platte abgenommen, auf

LB-Selektivplatten ausgestrichen und bei 37 °C für 24 h-48 h inkubiert.

2.8.4 Präparation von Plasmid-DNA

Die zur Plasmid-Präparation verwendete Methode beruht auf dem Prinzip der

alkalischen Lyse (Birnboim & Doly, 1979). Dazu wurden 1,5 ml einer E. coli ÜNK mit

dem entsprechenden Plasmid 1 min bei 13 000 UpM sedimentiert (Eppendorf

5415 D) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 100 µl Mix 1

aufgenommen und nach Zugabe von 200 µl Mix 2 mehrmals invertiert. Nach 3-5 min

bei RT wurde anschließend 150 µl Mix 3 dazugegeben, gut gemischt und 10-60 min

auf Eis inkubiert. Zelltrümmer sowie die präzipitierte chromosomale DNA wurden


36

durch eine Zentrifugation bei 13 000 UpM (15 min, Eppendorf 5415 D) sedimentiert.

Die im Überstand enthaltene Plasmid-DNA wurde abgenommen und verbleibende

Proteinverunreinigungen durch Zugabe von 400 µl Phenol/Chlorform/Isoamylalkohol

(Verhältnis 25:24:1) entfernt. Der Ansatz wurde gemischt und anschließend 3 min bei

13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D). Die Oberphase wurde erneut

abgenommen und mit 400 µl Isoamylalkohol/Chloroform (Verhältnis 24:1) versetzt

und 3 min bei 13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D). Die darauf folgende

Ethanolfällung diente der Entfernung von Salzen und anderen Verunreinigungen. Zu

der Oberphase wurden 1000 µl Ethanol (100 % (v/v)) dazugegeben und für

mindestens 30 min bei -20 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Präzipitation der

Plasmid-DNA durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 13 000 UpM (Eppendorf

5415 D). Die Oberphase wurde verworfen und die DNA wurde mit 1000 µl Ethanol

(70 % (v/v)) gewaschen (13 000 UpM, 2 min; Eppendorf 5415 D). Der Überstand

wurde restlos abgenommen und das Pellet bei RT getrocknet. Die gewonnene

Plasmid-DNA wurde in 30-100 µl A. dest. aufgenommen, für 20 min bei 70 °C gelöst

und anschließend bei -20 °C gelagert.

Lösungen für die Plasmid-Präparation

Mix 1 (pH 8) Tris-HCl 50 mM

EDTA 10 mM

Mix 2 NaOH 200 mM

SDS 1 % (w/v)

Mix 3 (pH 5,5) Kaliumacetat 3 M Natriumformiat 1,8 M

2.8.5 Präparation chromosomaler DNA aus P. aeruginosa

Zur Isolierung von genomischer DNA aus P. aeruginosa wurden 1,5 ml einer ÜNK mit

einem Volumen Chloroform/Phenol/Isoamylalkohol (Verhältnis 25:24:1) versetzt und

der Ansatz für 5 min bei 13 000 UpM und 4 °C zentrifugiert (Eppendorf 5810 R, Rotor

F45-30-11). Die Oberphase wurde abgenommen, mit einem Volumen Chloroform

versetzt und erneut 5 min bei 13 000 UpM und 4 °C zentrifugiert (Eppendorf 5810 R;

Rotor F45-30-11). Der erneut erhaltenen Oberphase wurden 1000 µl eiskaltes


37

Ethanol (100 % (v/v)) zugegeben und 5 min bei 13 000 UpM und 4 °C zentrifugiert

(Eppendorf 5810 R, Rotor F45-30-11). Das Sediment wurde anschließend mit

Ethanol (70 % (v/v)) gewaschen (5 min, 13 000 UpM, 4 °C; Eppendorf 5810 R, Rotor

F45-30-11) und bei 37 °getrocknet. Die isolierte chromosomale DNA wurde in 50 µl

A. dest. aufgenommen, 10 min bei 70 °C gelöst und bei -20 °C gelagert.

2.8.6 Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration

Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit von DNA-Lösungen erfolgte

photometrisch (Nanodrop, Peqlab) durch Ermittlung der Absorption bei 260 nm und

280 nm. Eine oD260 nm von 1 entspricht einer Doppelstrang-DNA (dsDNA)-

Konzentration von etwa 50 µg/ml. Für die Bestimmung des Reinheitsgrades von

DNA-Lösungen wurde der Quotient der Absorption bei 260 nm (DNA) und 280 nm

(Protein) gebildet. Dieser sollte für eine nahezu proteinfreie Lösung zwischen 1,8 und

2 liegen.

2.8.7 Amplifikation von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) diente der Amplifikation von DNA-Abschnitten

(Mullis et al., 1987). Bei dieser Methode wird die Eigenschaft der DNA-Polymerase

ausgenutzt, einzelsträngige DNA-Matrizen von einem Startpunkt aus zu

vervollständigen. Als Startpunkt dienen Primer (Oligonukleotide), die komplementär

zu den Randbereichen des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts sind. Es wurde

sowohl die thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq), als auch

die aus Pyrococcus furiosus (Pfu) verwendet. Ein typischer PCR-Ansatz setzte sich

wie folgt zusammen:

PCR-Ansatz

Template-DNA (33 ng/µl) 1,5 µl Primer fwd (20 µM) 1 µl Primer rev (20 µM) 1 µl dNTPs (25 mM) 1 µl DMSO (10 % v/v) 2,5 µl


38

Verwendung bei Taq-Polymerase zusätzlich:

10-fach Taq-Puffer 5 µl Taq-Polymerase 0,5 µl A.dest. ad 50 µl Verwendung von Pfu-Polymerase zusätzlich:

PCR-Puffer 5 µl Pfu-Polymerase 1 µl A.dest. ad 50 µl

Die Amplifikation der DNA wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Amplifikationsbedingungen

Erste Denaturierung 98 °C 2 min Denaturierung 95 °C 1 min Annealing 55-65 °C 1 min 35x Elongation 72 °C 2 min/kb Produktgröße (Pfu) 72 °C 1 min/kb Produktgröße (Taq) Finale Elongation 72 °C 10 min

Die Überprüfung der Amplifikate erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese.

2.8.8 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese diente der Analyse von PCR-Amplifikaten, DNA-

Restriktionen, der Mengen- und Größenabschätzung linearisierter DNA sowie der

präparativen Isolierung von DNA-Fragmenten (Sambrook et al, 1989). Dabei trennen

sich die negativ geladenen DNA-Fragmente in einem elektrischen Feld proportional

zum negativen Logarithmus ihrer Größe in Richtung Anode auf. Es wurden

1-3 %-ige (w/v) Agarosegele verwendet. Die entsprechende Menge Agarose wurde

in TAE-Puffer gelöst und aufgekocht. Die DNA-Proben wurden in 5-fach

DNA-Probenpuffer aufgenommen und in die Taschen gegeben. Die Trennung

erfolgte bei einer Spannung von 90-120 V. Die Größen- bzw. Mengenabschätzung

erfolgte durch Vergleich mit einem zusätzlich aufgetragenen Größenstandard („Gene

Ruler DNA Ladder Mix“; Fermentas, Thermo Scientific). Die Visualisierung der DNA

erfolgte im Anschluss mit Ethidiumbromid (0,05 % (v/v)). Ethidiumbromid interkaliert


39

in die DNA und die Fragmente können anschließend unter UV-Licht bei einer

Wellenlänge von 312 nm detektiert werden.

Lösungen und Puffer für die Gelelektrophorese

TAE-Puffer (pH 8) Tris-Acetat 40 mM EDTA 1 mM 5-fach-DNA-Probenpuffer EDTA 250 mM Glycerin 49,98 % (v/v) Bromphenolblau 0,04 % (w/v)

2.8.9 Reinigung von DNA-Fragmenten

Die Reinigung von PCR-Produkten erfolgte mit Hilfe des Kits „Nucleo Spin

Extraction II“ der Firma Machery & Nagel nach Angaben des Herstellers. Die DNA

wurde anschließend in 15-50 µl A. dest. aufgenommen.

2.8.10 Hydrolytische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Die gezielte Spaltung von DNA erfolgte mittels Restriktionsendonukleasen. Diese

Enzyme erkennen spezifische DNA-Sequenzen, hydrolisieren die Phosphodiester-

bindungen und führen so zur Spaltung der DNA. Die verwendeten Restriktions-

endonuklasen entsprechen dem Typ II und spalten die DNA innerhalb oder nahe

ihrer Erkennungssequenz. Die Durchführung der Restriktionen erfolgte nach

Angaben des Herstellers (Fermentas, Thermo Scientific). Die Spaltprodukte wurden

mittels Agarose-Gelelektrophorese (vgl. 2.8.8) überprüft.

2.8.11 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten in einen restringierten Vektor wird durch die T4-

Ligase katalysiert. Die Ligase bewirkt, unter ATP-Hydrolyse, die kovalente

Verknüpfung benachbarter 3`-Hydroxy- und 5`-Phosphatenden doppelsträngiger

DNA-Moleküle (Sambook et al., 1989). Die Phosphodiesterbindung kann dabei

zwischen zwei komplementären, überhängenden Enden („sticky ends“) oder

zwischen zwei glatten Enden („blunt ends“) gebildet werden. Für die Ligation von


40

DNA-Fragmenten mit einem Vektor wurde ein 3-facher Überschuss an DNA-Insert-

Fragment eingesetzt. Der Ansatz wurde entweder 1 h bei 16 °C oder üN bei 4 °C

inkubiert. Die Ligase wurde durch Erhitzen auf 80 °C für 10 min inaktiviert.

Anschließend erfolgte eine Transformation in chemisch kompetente E. coli-Zellen

(vgl. 2.8.2).

2.8.12 Sequenzierung

Die in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte wurden durch Sequenzierung überprüft.

Diese wurde von der Firma MWG (Ebersberg) durchgeführt. Die Auswertung der

Sequenzierung erfolgte computerbasierend mit dem Programm Seqman der Firma

Lasergene.

2.9 Promotoranalysen

Die Regulation von Genen kann mittels Reportergenfusionen analysiert werden.

Dabei wird der Promotorbereich des zu untersuchenden Gens entweder

trankriptionell oder translational mit einem gewünschten Reportergen fusioniert. Über

die Messung der Aktivität des gebildeten Reporterenzyms wird indirekt die Aktivität

des Promotors bestimmt. Das in dieser Arbeit verwendete promotorlose lacZ-

Reportergen aus dem Laktose-Operon von E.coli kodiert für die ß-Galaktosidase.

Über die Umsetzung eines alternativen Substates zu einem Farbstoffe durch die

ß-Galaktosidase kann somit die Stärke der Genexpression ermittelt werden.

2.9.1 Herstellung von lacZ-Reportergenfusionen

Für die Erstellung der Reportergenfusionen wurde der Vektor mini-CTX1 verwendet

(Becher & Schweizer, 2000). Dieser Vektor besitzt ein promotorloses lacZ-Gen

stromabwärts der multiple cloning site (MCS) mit einer eigenen Shine-Delgarno-

Sequenz und einer RNAseIII Schnittstelle. So wird ein translationaler Einfluss des

eingebrachten Promotorbereichs auf die entstandene ß-Galaktosidase verhindert.

Der Vektor besitzt weiterhin eine attp-Seite und ist somit in der Lage ist in die

genetische Plattform, den attB-Locus, in das Genom zu P. aeruginosa zu integieren.

Dies erfolgt durch eine Interagase-vermittelte Rekombination.


41

Für die Konstruktion der Reportergenfusionen wurde zunächst ein etwa 600 bp

langes Fragment der Promotorregion, ausgehend von genomischer DNA aus

P. aeruginosa, mittels PCR amplifiziert. Dabei wurden etwa 500 bp aus dem

stromaufwärts des annotierten Startcodons und 100 bp der kodierenden Sequenz

gewählt. Die verwendeten Primer besaßen an ihren 5´-Enden Restriktions-

schnittstellen, die eine gerichtete Klonierung in den gewünschten Vektor

ermöglichten (Tab. 7).

Nach Amplifikation der gewünschten Promotorbereiche wurden diese gereinigt und

mit entsprechenden Restiktionsendonukleasen verdaut. Die Fragmente wurden

anschließend in den Vektor ligiert, in chemisch kompetente JM83 Zellen transformiert

und die Transformanden auf Tetrazyklin selektioniert. Nach Isolierung der Plasmid-

DNA folgten eine Restriktionsanalyse zur Überprüfung sowie eine Sequenzierung der

Konstrukte. Diese wurden anschließend in E. coli S17-Zellen transformiert, mittels

diparentalen Mating in den gewünschten P. aeruginosa Stamm eingebracht und

erneut auf Tetrazyklin selektioniert. Eine erfolgreiche Integration wurde, neben der

Antibiotikaresistenz, durch Isolierung von genomischer DNA mit einer

anschließenden PCR-Reaktion verifiziert. Die verwendeten Primer (Tab. 7) binden an

den Randbereichen der MCS des mini-CTX1-Vektors und eine Amplifikation ist nur

durch eine erfolgreiche chromosomale Integration des Vektors möglich.

Die Herstellung des Plasmids pSHP48 zur Analyse der nbdA-Expression erfolgte

Analog der beschriebenen Methode. Aufgrund der Tetrazyklinresistenz der FhpR-

Transpononmutante, in dieser die Reportergenaktivität gemessen werden sollte,

wurde in das Reportergenplasmid (pSHP10) anschließend eine Kanamycin-

Resistenzkassette (aus pBSL15) eingebracht. Die Selektion erfolgte nach dem

diparentalen Mating somit auf Tetrazyklin und Kanamycin.

2.9.2 Konstitutive Expression von rhlR

Ein positiver Einfluss von RhlR auf die Promotoraktivtät wurde mittels einer

plasmidkodierten konstitutiven Expression von rhlR ermittelt (Dekimpe & Deziel,

2009). Dazu wurde das Plasmid (pUCPKS-rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) mittels

diparentalen Mating in die entsprechenden P. aeruginosa-Reportergen-stämme

gebracht. Durch die im LB-Medium enthaltene Laktose wird die Expression von rhlR


42

durch den N-terminal funionierten lac-Promotor geringfügig, jedoch kontinuierlich

induziert.

2.9.3 Bestimmung der ß-Galaktosidase-Enzymaktivität

Die Promotoraktivität der untersuchten Gene wurde durch die Aktivität der gebildeten

Menge an ß-Galaktosidase ermittelt. Die Bestimmung erfolgte nach Miller (Miller,

1970), bei der die ß-Galaktosidase-Aktivität quantitativ über die Spaltung des

farblosen Substrats o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid (ONPG) in Galaktose und

den gelben Farbstoff o-Nitrophenolat ermittelt wird. Letzteres wird dabei

photometrisch bei einer Wellenlänge von 420 nm gemessen, wodurch die relative

Aktivität der gebildeten ß-Galaktosidase berechnet werden kann.

Für die Bestimmung der Promotoraktivität wurden Hautkulturen mit einer oD578nm von

0,1 angelegt und zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums Proben für die

spätere Aktivitätsbestimmung entnommen. Das Probenvolumen variierte je nach Zell-

dichte zwischen 1 ml und 30 µl.

Die Proben wurden 5 min bei 13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D) und der

Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 800 µl Z-Puffer, 25 µl Chloroform und

25 µl SDS (0,1 w/v) versetzt um die Zellmembranen zu permeabilisieren. Der Ansatz

wurde mehrmals invertiert und anschließend 5 min bei RT inkubiert. Gestartet wurde

die Reaktion durch Zugabe von 200 µl ONPG-Lösung (4 mg/ml). Nach eintretender

Gelbfärbung wurde die Reaktion durch Zugabe von 500 µl Na2CO3 (1 M) abgestoppt.

Trat keine Färbung ein, erfolgte das Abstoppen des Ansatzes nach 20 min. Die

Proben wurden für 20 min bei 13 000 UpM zentrifugiert (Eppendorf 5415 D) und der

Überstand photometrisch bei 420 nm gemessen. Als Referenz diente A. dest..

Die ß-Galaktosidase-Aktivität in Miller-Units [MU] wurde nach folgender Gleichung

bestimmt.


43

oD420nm Aktivität in Miller-Units: t [min] × OD578 nm× V [ml] oD420nm Optische Dichte des Reaktionsansatzes nach Abstoppen der Reaktion oD578nm Optische Dichte der eingesetzten Zellsuspension V [ml] Volumen der eingesetzten Zellsuspension t [min] Zeit der Enzymreaktion bis zum Abstoppen Die Anzahl der Miller-Units gibt die spezifische Aktivität in µmol des gespaltenen

Substrats (ONPG) pro min und Zelldichte (oD578nm) an (Miller et al., 1970).

Z-Puffer Na2HPO4 60 mM NaH2PO4 40 mM KCl 10 mM MgSO4 1 mM ß-Mercaptoethanol 50 mM

2.10 Herstellung von Deletionsmutanten

Zur Herstellung einer PA14_∆lasR- bzw. PA14_∆hemO-Deletionsmutante wurde das

Plasmid pSB219.9A (Beatson et al., 2002) bzw. pEX18Ap_∆hemO (Prof. Dr. A.

Oglesby-Sherrous, University of Maryland) verwendet. Diese Konstrukte basieren auf

dem Suizid-Vektor pEX18Ap und beinhalten die flankierenden Bereiche der zu

deletierenden Gene. Zwischen diese Bereiche wurde außerdem zu

Selektionszwecken jeweils eine Gentamicin-Resistenzkassette eingebracht. Für die

Deletion der Gene wurden die Plasmide zunächst in E. coli S17-I Zellen transformiert

und mittels diparentalen Mating in P. aeruginosa eingebracht. Die Selektion erfolgte

anschließend auf LB-Platten mit Carbenicillin (alternativ zu Ampicillin für

P. aeruginosa) und Gentamicin. Nur die P. aeruginosa-Zellen, die den Suizidvektor

stromaufwärts oder stromabwärts des Zielgens in das Genom integrierten, konnten

auf diesem Medium wachsen (Abb. 9). Erst durch ein weiteres cross-over im zweiten

homologen Bereich erfolgt die Deletion des Gens, wodurch der restliche

Plasmidanteil herausgeschnitten wird. Dieses kann durch das auf dem Suizid-Vektor

enthaltende sacB-Gen, welches für eine Levansucrase kodiert, induziert werden. Die


44

Levansucrase wandelt den Zucker Succrose enzymatisch in ein toxisches Produkt

um. Daher können nur Kolonien auf Succrose wachsen, die das sacB-Gen nicht

mehr besitzen. Es handelt sich dabei um einen negativen Selektionsmarker. Die

Selektion erfolgte auf LB-Platten mit 5 % Succrose (w/v) und Gentamicin. Die

gewünschten Kolonien konnten auf diesem Medium wachsen und zeigten sich

sensitiv gegenüber Carbenicillin.

Abb. 9: Schematische Darstellung zur Konstruktion von Deletionsmutanten Die Deletion auf der Basis des Suizid-Vektors pEX18Ap erfolgt durch eine doppelte homologe Rekombination in das Genom von PA14. Gm: Gentamicin-Resistenzkassette; sacB: kodierend für die Levansucrase; bla: Ampicilin-Resistenzkassette. Eine detailierte Beschreibung ist dem Text zu entnehmen.

2.11 DNA mobility shift assay (DMSA)

Eine direkte DNA-Protein-Interaktion kann in vitro anhand von DNA mobility shift

assays (DMSA) nachgewiesen werden. Dabei werden beide Komponenten in einem

Ansatz inkubiert und anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. Eine Bindung des

Proteins an die DNA führt zu einer Laufweitenverschiebung. In dieser Arbeit wurde

die Bindung von LasR an die Promotorregionen von bphO und bphP untersucht.

Dafür wurde zunächst ausgehend von genomischer DNA diese Bereiche, sowie als

Positivkontrolle die Promotorregion von rhlR, mittels PCR amplifiziert. Nach


45

anschließender Reinigung der Fragmente wurden diese auf eine Konzentration von

50 ng/µl eingestellt.

Nach Inkubation der Fragmente mit dem gereinigten Transkriptionsregulator (vgl.

2.13.6) für 20 min bei RT, wurden die Proben über ein 3 %-iges Agarosegel

aufgetrennt. Die DNA wurde anschließend duch Inkubation des Agarosegels via

Etidiumbromid visualisiert. Zu jedem Ansatz wurde der unspezifische Kompetitor

poly-dl-dc (eng.: Poly (deoxyinosinic-deoxycytidylic) acid sodium salt) gegeben umd

unspezifische Bindungen zu minimieren. LasR benötigt unter nativen Bedingungen

das Signalmolekül 3-oxo-C12-HSL zur Dimerisierung und wurde daher sowohl bei

der Anzucht, Reinigung als auch bei der Durchführung der DMSA hinzugegeben.

Ansatz (10 µl)

DNA (50 ng) 1 µl poly-dl-dc 1 µl Protein 0,1 - 0,6 µg 3-oxo-C12-HSL 5 µM Bindepuffer 1-5 µl

Bindepuffer

Tris-HCl, pH 7,5 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM MgCl2 5 mM Glycerol 2,5 % NP-40 0,05 %

2.12 Phänotypische Untersuchungen

2.12.1 Osmotischer Stress

Die Tolerenz gegenüber osmotischem Stress in Form von hohen Salz-

konzentrationen wurde anhand von Hochsalz-LB-Platten untersucht. Dafür wurden

ausgehend von Hauptkulturen (oD578 nm 3,5) Verdünnungsreihen (10-1 - 10-8) angelegt

und jeweils 2 µl auf eine LB-Platte, die nach dem Autoklavieren mit 0,9 M NaCl

versehen war, aufgebracht. Diese wurden anschließend bei 37 °C für 48 h inkubiert.


46

2.12.2 Motilität

Die Motilität wurde anhand von LB-Platten mit einer Agarkonzentration von 0,3 %

und 0,5 % untersucht. Petrischalen wurden mit 25 ml des Mediums befüllt und 30 min

unter einer Sterilbank getrocknet. Direkt im Anschluss wurden 5 µl einer Hauptkultur

(oD578 nm 3,5) auf die Platte aufgetropft und 16 h bei 37 °C inkubiert.

2.12.3 SDS-Hemmhoftest

Die Wirkung von SDS auf das Wachstumsverhalten wurde anhand eines

Hemmhoftests durchgeführt. Dafür wurden 50 µl einer Hauptkultur (oD578 nm 3,5) auf

eine LB-Agar-Platte ausplattiert. Anschließend wurden Filterpapierplättchen

(Durchmesser 0,55 mm) mit 5 µl 10%-igem SDS versehen und auf die Platte gelegt.

Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 37 °C wurden die entstandenen

Hofdurchmesser bestimmt.

2.12.4 Extraktion von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ)

Die Analyse der produzierten HAQs erfolgte mittels dünnschichtchromatografischer

Trennverfahren (Jensen et al., 2006). Ausgehend von einer Hauptkultur (oD578 nm 3,5)

wurden 2 ml in ein Eppendorfgefäß überführt und die Zellen durch Zentrifugation

(2 min, 13 000 UpM, Eppendorf 5415 D) pelletiert. Die Extraktion der HAQs erfolgte

durch Zugabe von 1000 µl Dichlormethan zu je 500 µl des erhaltenen Überstandes.

Die Ansätze wurde gründlich gemischt und erneut zentrifugiert (10 min, 13 000 UpM,

Eppendorf 5415 D). Die in der unteren organischen Phase befindlichen HAQs

wurden entnommen und üN eingedampft. Für die Dünnschichtchromatografie wurden

Kieselgelplatten (60F254, Merck) verwendet die zuvor 30 min in einer 5 %-igen

KH2PO4 (w/v) Lösung getaucht und 1 h bei 100 °C aktiviert wurden. Die Isolierten

HAQs wurden in 12 µl Dichlormethan aufgenommen und auf die Platte aufgetragen.

Als Laufmittel diente ein Gemisch aus 95:5 Dichlormethan/Methanol (v/v). Die

Visualisierung erfolgte unter UV-Licht (312 nm).


47

2.13 Proteinbiochemische Methoden

2.13.1 Heterologe Proteinproduktion in E. coli

2.13.1.1 Produktion von Strep-tagII-Fusionsproteinen

Die Herstellung von C-terminalen Strep-tagII Fusionsproteinen erfolgte auf der Basis

des Vektors pASK-IBA3 der Firma IBA. Die Expression wird dabei durch einen

Anhydrotetrazyklin (AHT)-induzierbaren tetA-Promotor reguliert. Die verwendeten

Konstrukte wurden jeweils mittels gerichteter Kolnierung über BsaI-

Restriktionsschnittstellen hergestellt (pSHP23, pSHP24, pSHP59). Für die

Proteinproduktion wurden die Konstrukte in E. coli BL21(DE3)-Zellen transformiert

und je 1 l LB-Medium 1/100 der entsprechenden ÜNK unter Selektionsdruck

(Amp 100 µg/ml) inokuliert und bei 37 °C und 120 UpM inkubiert. Bei Erreichen einer

oD578 nm von 0,5 wurde die Kultur auf 17 °C abgekühlt und die Expression durch

Zugabe von 2 µg/ml AHT induziert. Nach 16 h wurden die Zellen durch eine

15-minütige Zentrifugation bei 4 °C (Sorvall RC-3C, SLA 3000, 4000 UpM) geerntet

und bis zur weiteren Verarbeitung bei -20 °C gelagert.

2.13.1.2 Produktion von (His)6-tag Fusionsproteinen

Ausgehend einer ÜNK von E. coli BL21(DE3)-Zellen mit dem entsprechenden

Konstrukt wurde 1 l LB-Medium 1/100 unter Selektionsdruck (Kan 100 µg/ml)

inokuliert und bis Erreichen einer oD578 nm von 0,5 bei 37 °C und 120 UpM inkubiert.

Nach Abkühlen der Kultur auf 17 °C wurde die Proteinproduktion durch Zugabe von

1 mM IPTG induziert, üN weiter inkubiert und anschließend geerntet (15 min, Sorvall

RC-3C, SLA 3000, 4000 UpM, 4 °C).

2.13.2 Homologe Proteinproduktion in P. aeruginosa

Die homologe Proteinproduktion von PaBphP erfolgte mittels des Shuttle-Vektors

pHERD20T (Qiu et al., 2008). Dieser Expressionsvektor besitzt einen Arabinose-

induzierbaren pBAD-Promotor. Aufgrund eines fehlenden Affinitäts-tags des Vektors

für eine weitere affinitätschromatographische Reinigung wurde das bphP-Gen mit

dem fusionierten Strep-tagII aus dem bereits vorliegenden Vektor pASK-IBA3_bphP

(Tasler et al., 2005) durch gerichtete Klonierung in den Vektor eingebracht (pSHP46).

Anschließend erfolge ein diparentalen Mating nach P. aeruginosa. Für die


48

Proteinproduktion wurde ausgehend von einer ÜNK 2 l LB-Medium 1/100 inokuliert

und unter Selektionsdruck (Tet 100 µg/ml) bei 37 °C und 120 UpM inkubiert. Bei

Erreichen einer oD578 nm von 3,0 wurde die Expression durch Zugabe von 1% (w/v)

Arabinose induziert und nach weiteren 2 h die Zellen geerntet (15 min, 4°C,

4000 UpM, Sorvall RC-3C, SLA 3000).

2.13.3 Chromosomal integrierte PaBphP Strep-tagII-Fusion

Für die Isolierung von PaBphP unter der Kontrolle des nativen Promotors wurde das

Gen chromosomal mit einem Strep-tagII fusioniert. Dies erfogte auf der Basis des

bereits vohandenen Vektors pASK-IBA_bphP (Tasler et al., 2005). Dieser Vektor

besitzt jedoch nur einen “origin of transfer” (oriT) für E. coli, nicht aber für

P. aeruginosa. Daher wurde ein entsprechender oriT zunächst, kombiniert mit einer

Kanamycin-Resistenzkassette (aus pYPRUB137II), in das Konstrukt eingebracht

(pSHP42). Nach Übertragung des Plasmids mittels diparentalen Mating nach

P. aeruginosa erfolgte die Selektion auf Kanamycin und Carbenicillin. Das Plasmid ist

nicht in der Lage in P. aeruginosa frei zu replizieren und es erfolgt eine einfache

homologe Rekombination in das Chromosom, wodurch das native bphP-Gen gegen

das plasmidkodierte Strep-tagII-fusionierte bphP ersetzt wird. Für die Isolierung des

PaBphPs wurden 4 l des Stammes 1/100 mit einer ÜNK inokuliert und unter

Selektionsdruck (Kan 200 µg/ml) bei 37 °C und 120 UpM inkubiert. Bei Erreichen

einer oD578 nm von 3,5 wurden die Zellen geerntet (15 min, 4°C, 4000 UpM, Sorvall

RC-3C, SLA 3000).

2.13.4 Zellaufschluss

Die geernteten Zellen wurde auf Eis aufgetaut und in Waschpuffer (10 ml pro 1 ml

Pellet) resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte mittels Ultraschallbehandlung

(Sonifier 250, Branson, 5-15 x 30 s, 50 % Amplitude). Im Anschluss wurden die

Zelltrümmer durch Zentrifugation für 1 h bei 19000 UpM (Sorvall, SS34, 4 °C)

sedimentiert und der erhaltene Rohextrakt mit den löslichen Proteinen zweimal

filtriert (Millipore, Membranfilter, Porendurchmesser 0,45 µm).


49

2.13.5 Affinitätschromatographische Reinigung der Fusionsproteine

Die Reinigung der Strep-tagII fusionierten Proteine erfolgte mittels einer Strep-Tactin

Sepharose Tropfsäule mit einem Säulenvolumen (SV) von 0,5 – 3 ml. Diese wurde

zunächst mit 5 SV Waschpuffer äquilibriert und anschließend der Rohextrakt

aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit mindestens 10 SV Waschpuffer

gewaschen. Die Elution der Proteine erfolgte mittels Desthiobiothin (2,5 mM in

Elutionspuffer). Es wurden 6 – 10 Elutionsfraktionen á 0,5 – 1 ml Eluat gesammtelt.

Die Reinigung von (His)6-tag-Fusionsproteine erfolgte an Ni-NTA Tropfsäulen mit

einem SV von 1 ml. Der Reinigungsprozess erfolgte analog der Reinigung von Strep-

tagII-Fusionsproteinen. Die Fusionsproteine wurden mittels Imidazol (150 mM in

Elutionspuffer) eluiert.

Alle erhaltenen Eluate wurden im Anschluss mittels SDS-PAGE auf ihren

Proteingehalt und Reinheit überprüft (vgl. 2.13.7).

Puffer für die Reinigung von Strep-tagII-Fusionsproteinen

Waschpuffer Tris-HCl pH 8,0 100 mM NaCl 150 mM Elutionspuffer

Waschpuffer mit Desthiobiothin 2,5 mM

Puffer für die Reinigung von (HIS)6-Fusionsproteinen

Waschpuffer pH 8,2 Na2HPO4 50 mM NaCl 300 mM

Elutionspuffer pH 7,0 Waschpuffer mit Imidazol 150 mM

2.13.6 Reinigung des Transkriptionsregulators LasR

Die Überproduktion von LasR erfolgte unter Verwendung des IPTG-induzierbaren

Plasmids pET14b-lasR rekombinant in E. coli BL21(DE3)-Zellen (Qihui et al., 2011).

Für die Expression wurde LB-Medium mit 2 µM 3-oxo-C12-HSL verwendet. Der


50

Autoinduktor wird von LasR gebunden und erhöht die Löslichkeit des Proteins. Es

wurde 1 l Medium mit einer ÜNK 1/100 inokuliert und bei 37 °C und 120 UpM bis

Erreichen einer oD578 nm von 0,5 inkubiert. Nach Abkühlen der Kultur auf 18 ° C

wurde die Proteinproduktion durch Zugabe von 500 µM IPTG induziert, üN weiter

inkubiert und anschließend die Zellen geerntet (15 min, 4 °C, 4000 UpM, Sorvall RC-

3C, SLA 3000). Das Pellet wurde in 25 ml Lysepuffer aufgenommen und die Zellen

mittels Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die Reinigung erfolgte mit Hilfe eines

Äkta Chromatographie Systems (Äkta Prime, Amersham Biosciences). Der erste

Reinigungsschritt erfolgte durch auftragen des Lysats auf eine HiTrapTM-Heparin HP

Säule (GE Healtcare). Die Matrix aus Heparin-Sepharose ist ein Polyanion und somit

negativ geladen. Proteine die eine positive Nettoladung besitzen werden so durch

elektrostatische Wechselwirkungen gebunden.

Nach der Waschung mit 5 SV Lysepuffer erfolgte die Elution des Proteins durch

einen NaCl-Gradienten (150 mM-1000 mM). Die Elutionsfraktionen wurden mittels

SDS-PAGE analysiert und die proteinhaltigen Fraktionen vereinigt. Das

anschließende Auftragen dieser Fraktionen auf eine Anionenaustauschersäule

(MonoQ) diente der Entsalzung. Der aufgefangene Durchlauf wurde zur weiteren

Reinigung erneut auf die HiTrapTM-Heparin HP-Säule gegeben und anschließend

eluiert.

Lysepuffer

Tris-HCl ph 7,5 25 mM NaCl 150 mM DTT 1 mM EDTA 1 mM Glycerol 10 % Tween-20 0,05 % 3-oxo-C12-HSL 200 nM

2.13.7 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ermöglicht eine vertikale

Auftrennung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen. Das denaturierend

wirkende anionische Detergenz SDS überdeckt die Eigenladung der Proteine,

wodurch sie nur aufgrund ihrer molekularen Masse in einem elektrischen Feld

getrennt werden (Laemmli, 1970). Es wurden 5,25 %-ige Sammelgele zur

Fokussierung der Proteine und 10 bzw. 15 %-ige Trenngele zur Auftrennung


51

verwendet. Die Verwendung von großporigen Sammelgelen und kleinporigen

Trenngelen erhöht die Bandenschärfe und Trennleistung der SDS-PAGE

(Righetti, 1990). Die Proteinproben wurde vor dem Auftragen mit 2-fach

SDS-Probenpuffer versetzt und 2 min bei 95 °C inkubiert und 1 min bei 13 000 UpM

zentrifugiert (Eppendorf 5451 D). Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei

einer konstanten Spannung von 200 V (Mini Protean 3 System, Biorad) in

Elektrophoresepuffer. Als Größenreferenz diente der „Prestaind Protein Ladder“ von

Fermentas.

Im Anschluss wurden die aufgetrennten Proteine mittels einer Coomassielösung in

dem Polyacrylamidgel fixiert und angefärbt. Durch die Behandlung mit einer

Entfärbelösung wurde die Hintergrundfärbung entfernt. Alternativ wurden die

Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert. In diesem Fall erfolgte keine Färbung.

Puffer und Lösungen für die SDS-PAGE

4 x Trenngelpuffer Tris-HCl pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % (w/v)

4 x Sammelgelpuffer Tris-HCl pH 6,8 1,5 M SDS 0,4 % (w/v) Sammelgel (Acrylamid-Konz. 5,25 %) Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) 1,4 ml 4 x Sammelgelpuffer 2,0 ml A. dest. 4,6 ml APS 10 % (w/v) 30 µl TEMED 20 µl

Trenngel (Acrylamid-Konz. (10/15 %)) Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) 6,7 ml/8,0 ml 4 x Sammelgelpuffer 4 ml/4 ml A. dest. 5,3 ml/4 ml APS 10 % (w/v) 80 µl/80 µl TEMED 8 µl/8 µl Die Mengenangaben von Sammel- und Trenngel beziehen sich jeweils auf vier Gele. Elektrophoresepuffer Tris-HCl pH 8,8 50 mM Glycin 380 mM SDS 0,1% (w/v)


52

4 x SDS-Probenpuffer Tris-HCl pH 6,8 100 mM SDS 110 mM Glycerin 40 % (w/v) ß-Mercaptoethanol 2 mM Bromphenolblau 1 % (w/v)

Färbelösung Essigsäure 10,% (v/v) Isopropanol 30,% (v/v) Coomassie Brillant Blue-G250 0,25 % (w/v) Entfärbelösung Ethanol 30 % (v/v) Essigsäure 10 % (v/v)

2.13.8 Western-Blot-Transfer von Proteinen

Der Western-Blot ist eine Technik, mit Hilfe der die durch SDS-PAGE aufgetrennten

Proteine durch Elektrotransfer auf eine Membran irreversibel übertragen werden

können. Dazu wurde eine PVDF-Membran zunächst mit Methanol aktiviert. Diese,

sowie zwei dicke Blotpapiere und das SDS-Gel wurden anschließend in Towbinpuffer

äquilibriert. Die Proteine wurden durch das „semidry-Blot“ Verfahren auf die

Membran bei einer Spannung von 15 V für 30 min transferiert (BioRad).

Towbin-Puffer Tris-HCl pH 8,3 25 mM Glycin 192 mM

Im Anschluss erfolgte ein immunochemisches Nachweisverfahren mittels

Antikörperkonjugat gegen die immobilisierten Fusionsproteine.

2.13.9 Immunologischer Nachweis von Strep-tagII-Fusionsproteinen

Nach Transfer der Proteine auf deine PVDF-Membran wurde zur Absättigung

unspezifischer Antikörperbindungen die Membran zunächst 1 h bei RT oder üN bei

4 °C mit BSA blockiert. Die überschüssige Blockierungslösung wurde durch

dreimaliges Waschen für 5 min mit PBST-Puffer entfernt. Die Behandlung mit 2 µg/ml

Avidin in PBST-Puffer verhindert eine endogene Reaktion mit unspezifisch


53

biotinylierten Proteinen. Nach 10-minütiger Inkubation wurde die Membran 1 h mit

dem Antikörperkonjugat Strep-Tactin Alkalische Phosphatase (IBA, 3 µl in 10 ml

PBS-Puffer) inkubiert. Anschließend wurde die Membran dreimal mit PBST-Puffer

und zweimal mit PBS-Puffer für je 1 min gewaschen. Die Detektion erfolgte in AP-

Puffer mit je 33 µl Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und 5-Bromo-4Chlor-

3-indolylphosphat (BCIP). Die an den Antikörper gekoppelte Alkalische Phosphatase

katalysiert das NBT und BCIP, sodass eine bläuliche Farbreaktion eintritt. Die

Reaktion wurde im Anschluss durch die Zugabe von H2O gestoppt.

Puffer und Lösungen für die Antikörperbehandlung

10 x PBS-Puffer NaCl 1,37 M KCl 27 mM Na2HPO4 50 mM KH2PO4 15 mM

Blockierungslösung

BSA 5 % (w/v) Tween 20 0,5 % (v/v)

in 1 x PBS-Puffer

PBS-Tween-Puffer Tween 20 0,1 % (v/v) in 1 x PBS-Puffe

AP-Puffer Tris-HCl pH 9,5 100 mM MgCl2 5 Mm NaCl 100 mM

NBT 100 mg/ml NBT in 70 % DMF

BCIP 50 mg/ml BCIP in DMF

2.13.10 Dialyse

Die Umpufferung von Proteinlösungen erfolgte je nach Volumen in

Dialyseschläuchen (Volumen > 1ml) oder in Dialyseknöpfen (Volumen < 1 ml) gegen


54

das mind. 100-fache Volumen des gewünschten Puffers. Die Auschlussgrenze

betrug dabei je nach verwendetem Dialyseschlauch 10 kDa bzw. 4 kDa.

2.13.11 Konzentrieren von Proteinen

Die Einengung von Proteinen erfolgte mit Hilfe von Centricon 10 (Amicon)

Ultrafiltrationsmembrankonzentratoren mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDA

nach Angaben des Herstellers.

2.13.12 Photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Konzentration der gereinigten Proteine wurde spektroskopisch bei einer

Wellenlänge von 280 nm bestimmt. Bei dieser Wellenlänge absorbieren die

Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Durch ihre Häufigkeit in einem

Protein kann der Extinktionskoeffizient ermittelt werden. Dieser Wert wurde mit Hilfe

des Computerprogramms ProteinCalculator bestimmt.

Die Proteinkonzentration wurde nach dem Lambert-Beer-Gesetz ermittelt:

c [mol/l)= A280nm/ε280nm x d

c [mol/l]: Proteinkonzentration

A280 nm: Absorption bei 280nm

ε280nm [M-1cm-1]: molarer Extinktionskoeffizient bei 280nm

d [cm]: Schichtdicke der Küvette

2.13.13 Proteinbestimmung nach Bradford

Die Gesamtproteinkonzentration von Rohextrakt wurde mittels Bradford-Reagenz

(BioRad) nach Angaben des Herstellers bestimmt. Dazu wurde zunächst eine

Eichgerade mittels Rinderserumalbumin (BSA) mit verschiedenen Konzentrationen

erstellt (0,05/0,1/0,2/0,4 µg/µl). Von jeder Verdünnung wurden in einer Doppel-

bestimmung 20 μl mit 1 ml Bradford-Reagenz versetzt, 10 min bei RT inkubiert und

anschließend die Absorption bei 595 nm gegen den Leerwert (20 μl A. dest. in 1 ml

Bradford-Reagenz) gemessen und aus den erhaltenen Werten eine Eichgerade

erstellt. Der Rohextrakt wurde im Verhältnis 1/10, 1/50 und 1/100 verdünnt und wie


55

beschrieben vorgegangen. Über die Absoption konnte mit Hilfe der erstellten

Eichgerade anschließend die Konzentration bestimmt werden.

2.13.14 UV/Vis-Spektroskopie

Bakterielle Phytochrome können ausgehend von dem absorbierten Licht in zwei

verschiedenen Konformationen vorliegen. Nach Absorption von hellrotem Licht

(690 nm) liegt das Phytochrom in der Pfr-Form vor, nach Absorption von dunkelrotem

Licht (750 nm) in der Pr-Form. Dies wurde mittels Bestrahlung durch Interferenzfilter

erreicht (je 3 min). Es wurden Spektren im Bereich von 500 – 800 nm aufgenommen

und anschließend durch Subtraktion des Pfr- von dem Pr-Spektrum ein Differenz-

spektum berechnet.

2.13.15 Proteinkinaseexperimente

2.13.15.1 Autophosphorylierung

Die Fähigkeit der Autophosphorylierung wurde mittels radioaktiv markierten

[γ32P]-ATP untersucht. Dafür wurde zunächst das gereinigte apo- bzw. holo-

Phytochrom gegen 1 x Kinasepuffer ohne ß-Mercapthoethanol üN dialysiert. Die

Ansätze wurden anschließend unter verschiedenen Lichtbedingungen (690 nm bzw.

750 nm) 30 min bei RT bestrahlt. Die Autophoshorylierung erfolgte durch Zugabe von

ATP-Mix. Nach weiteren 20 min Bestrahlung wurde die Reaktion durch Zugabe von

10 µl SDS-Probenpuffer abgestoppt. Die Proben wurden über eine SDS-PAGE

aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Durch Auflegen einer

Phospho-Imagerplatte konnten die Signale am Phosphoimager (BAS, Fuji) nach 24 h

detektiert werden.

Puffer und Lösungen für die Proteinkinaseexperimente

5x Kinasepuffer Tris-HCl ph7,7 125 mM EDTA 1 mM MgCl2 25 mM ß-Mercaptoethanol 12 mM


56

ATP-Mix [γ32P]-ATP 0,25 µl ATP 0,25 µl A.dest 2 µl

Ansatz 5 x Kinasepuffer 4 µl ATP-Mix 4 µl Phytochrom 5 µg A.dest. ad 20 µl

2.13.15.2 Phosphorylgruppenübertragung

Die für viele Zwei-Komponenten-Systeme typische Phosphorylgruppenübertragung

einer Sensorkinase auf den Antwortregulator wurde mittels radioaktiv markierten,

autophoshoryliertem Phytochrom untersucht. Dazu wurde der potentielle Regulator in

einem Verhältnis 1:2 mit dem zuvor autophosphoryliertem Phytochrom für 30 min

unter verschiedenen Lichtbedingungen inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion

durch Zugabe von SDS-Probenpuffer wurden die Proteine mittels SDS-PAGE

separiert und auf eine PVDF-Membran transferiert. Durch Auflegen einer Phospho-

Imagerplatte konnten die Signale nach 24 h an einem Phosphoimager (BAS, Fuji)

detektiert werden (BAS, Fuji).

2.13.16 In vivo-Degradation

Der intrazelluläre Abbau von PaBphP wurde anhand von in vivo-

Degradationsexperimenten untersucht. Ausgehend des homologen Überproduktions-

stammes (PA14 x pSHP46) wurde die Expression durch Zugabe von 1% Arabinose

bei einer oD578 nm 3,5 induziert. Nach 30-minütiger Inkubation wurde die Translation

sämtlicher Proteine durch Gentamicin gestoppt (400 µg/µl). Gentamicin bindet an die

30S-Untereinheit der Ribosomen und verhindert so die Translation aller Proteine. Im

Anschluss wurden Proben zu verschiedenen Zeitpunkten (eingestellt auf eine

Konzentration von 1 ml einer oD578 nm von 0,5) entnommen, via SDS-PAGE

aufgetrennt und mittels immunulogischer Detektion gegen das Strep-tagII des

Fusionsproteins analysiert.


57

2.13.17 In vivo-Quervernetzung

Die Kopplung von Interaktionspartnern an PaBphP efolgte durch in vivo-

Quervernetzungen (crosslinking). Diese wurde im Rahmen der Materarbeit von A.

Hettwer durchgeführt (Hettwer, 2013). Dafür wurde die homologe Überproduktion von

PaBphP (PA14 x pSHP46) duch Zugabe von 1 % Arabinose bei einer oD578 nm 3,0

induziert und die Zellen nach einer Inkubationsdauer von 2 h in Zentrifugenröhrchen

(je 50 ml) überführt und sedimentiert (15 min, 4000 UpM, Eppendorf 5810 R, Rotor

F45-30-11). Die Pellets wurden mit je 10 ml PBS-Puffer gewaschen (15 min,

4000 UpM, Eppendorf 5810 R, Rotor F45-30-11), in 10 ml Reaktionspuffer

aufgenommen und die quervernetzende Substanz (Formaldehydlösung: 1 %,

DSP: 1,5 mM) zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation unter kontinuierlicher

Bewegung wurde die Reaktion durch Zugabe einer Stopplösung (20 mM) beendet.

Nach Sedimentation (15 min, Eppendorf 5810 R, Rotor F45-30-11) erfolgte eine

affinitätschromatographische Reinigung des PaBphP-Fusionsproteins an Strep-

Tactin-Sepharose (2.13.5). Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-

Reagenz bestimmt und auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt. Die

crosslinker wurden bei 98 °C für 20 min abgespalten. Alle weiteren Schritte der

tryptische Verdau, die Probenvorbeitung sowie die massensprektrometrische Analyse

(nanoACQUITY UPLC Systems, Synapt G2-S-HDMS Anlage, Waters) und die

Auswertung erfolgten in Kooperation mit Jun. Prof. Dr. J. Bandow der NG Mikrobielle

Antibiotikaforschung, der Ruhr-Universität Bochum.

Lösungen für die in vivo-Quervernetzung

Reaktionspuffer (pH 7,4)

Na3PO4 25 mM

Stopplösung (pH 7,4)

Tris-HCl 1 M Formaldehydlösung PBS-Puffer mit 0,4 % Paraformaldehyd (w/v) DSP Stocklösung: 50 mM in DMSO

Ergebnisse

58

3. Ergebnisse

Kapitel I

3.1.1 Biochemische Charakterisierung des Phytochroms PaBphP

aus P. aeruginosa PA14

Phytochrome zählen neben den Cryptochromen und Phototropinen zu der

wichtigsten Klasse an Photorezeptorproteinen (van der Horst & Hellingwerf, 2004).

Ihre Existenz in der Pflanzenwelt ist schon seit etwa 1950 bekannt. Erst Jahre später

wurden Rotlichtrezeptoren ebenfalls in Pilzen, Cyanobakterien und sogar heterotroph

lebenden Bakterien entdeckt. P. aeruginosa gehört dabei zu einer der ersten

heterotrophen Bakterienarten, in denen ein Phytochrom gefunden wurde. Die bio-

chemischen Eigenschaften des Rotlichtrezeptors PaBphP aus P. aeruginosa wurden

bisher jedoch lediglich über ein in E. coli heterolog produziertes Protein

charakterisiert (Tasler et al., 2005). Um ein besseres Verständnis für die Funktion

des Rotlichtrezeptors unter physiologischen Bedingungen zu gewinnen, wurde

PaBphP in der vorliegenden Arbeit erstmalig homolog produziert und isoliert. Die

putative Sensorkinase wurde anschließend mit Hilfe von spektroskopischen

Methoden und Phosphorylierungsexperimenten hinsichtlich der Funktion als

Rotlichtrezeptor bzw. als Kinase analysiert.

3.1.1.1 Isolierung von PaBphP aus PA14

Für die homologe Expression des Phytochroms aus P. aeruginosa PA14 in

zellphysiologischen Mengen wurde eine chromosomal integrierte C-terminale

Strep-tagII-Fusion hergestellt. Auf diese Weise konnte die Expression des Gens

durch seinen nativen Promotor reguliert und zugleich ein Affinitäts-tag zur einfachen

und schnellen Isolierung an das Protein gekoppelt werden.

Zu Beginn dieser Arbeiten war bereits bekannt, dass die Expression des

Phytochromgens zelldichteabhängig reguliert wird (Barkovits et al., 2008). Um eine

möglichst hohe Ausbeute von homologen PaBphP zu erhalten, wurde das Protein

Ergebnisse

59

aus 4 l Zellkultur der stationären Phase (oD578 nm 3,5) gereinigt. Die Eluate der

affinitätschromatographischen Isolierung wurden anschließend mittels SDS-PAGE

(Abb. 10-A) sowie immunologischer Nachweisverfahren analysiert (Abb. 10-B).

Abb. 10: SDS-PAGE-Analyse und immunologische Detektion von chromosomal Strep-tagII-fusionierten PaBphP aus PA14 (A) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10 %) nach affinitätschromatographischer Reinigung von PaBphP aus PA14. Es wurden jeweils 10 µl der Fraktionen Pellet (P), Lysat (L), Durchlauf (D), letzte Waschfraktion (W), sowie die Elutionsfraktionen (E2 - E10) aufgetragen. (B) Zu (A) korrespondierende immunologische Detektion mittels Strep-Tactin-Alkalische Phosphatase Antikörperkonjugat gegen das Strep-tagII nach Elektro-Transfer auf eine PVDF-Membran. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Trotz mehrmaliger Waschschritte konnte kein absolut reines Fusionsprotein ge-

wonnen werden. Über die immunologische Detektion gegen das Strep-tagII des

Fusionsproteins wurde in den Elutionsfraktionen ein Protein bei etwa 80 kDa

nachgewiesen. Dies entspricht der theoretischen Größe eines PaBphP-Monomers,

sodass von einer erfolgreichen Reinigung von homolog produziertem PaBphP

ausgegangen werden kann. Da zudem kein Signal in der Pelletfraktion

nachgewiesen wurde, scheint PaBphP ein vollständig lösliches Protein zu sein.

Insgesamt betrug die Ausbeute von homologem PaBphP ca. 25 µg/l Zellkultur. Dies

entspricht einer theorethischen Menge von etwa 52 Molekülen PaBphP pro Zelle.

Ergebnisse

60

3.1.1.2 Photoisomerisierung von homolog isoliertem PaBphP

Phytochrome können aufgrund ihres gebundenen Chromophors zwischen zwei

Formen photoisomerisieren. Dabei kommt es in Abhängigkeit der Lichtbedingungen

zu einer Konformationsänderung des Chromophors und das Phytochrom kann

reversibel zwischen einer hellrotlichtabsorbierenden Pr-Form und einer

dunkelrotlichtabsorbierenden Pfr-Form wechseln. Durch eine Subtraktion des Pfr-

Spektrums vom Pr-Spektrum ergibt sich ein für Phytochrome charakteristisches

Differenzspektrum.

Das unter nativen Bedingungen synthetisierte PaBphP wurde daher mit hellrotem

(690 nm) sowie dunkelrotem (750 nm) Licht bestrahlt und anschließend das

Differenzspektrum berechnet. Dabei konnten die Absorptionsmaxima der Pr- und der

Pfr-Form bei 700 nm bzw. bei 754 nm nachgewiesen werden (Abb. 11).

Abb. 11: Absorptionsspektren der Pr- und der Pfr-Form sowie das Differenzspektrum des homolog isolierten PaBphPs aus PA14 (A) Das gereinigte PaBphP aus PA14 wurde mit hellrotem (690 nm) und dunkelrotem (750 nm) Licht bestrahlt und die Absorptionsspektren der Pfr- bzw. Pr-Konformation aufgenommen. (B) Berechnetes Differenzspektrum aus (A). Eingesetzt wurde eine Proteinkonzentration von 8 µM.

Ergebnisse

61

Aufgrund dieser Photokonversion kann angenommen werden, dass unter

physiologischen Bedingungen das Phytochrom als holo-Phytochrom mit einem

gebundenen Chromophor vorliegt. Nach der Bestrahlung mit hellrotem Licht zeigte

sich weiterhin keine vollständige Isomerisierung in die Pfr-Form. Es handelt sich

dabei um eine Pfr-angereichterte Form. Um den Grundzustand des Phytochroms zu

ermitteln, wurde das PaBphP im Dunkeln gereinigt und ein Absorptionsspektrum

aufgenommen (Daten nicht gezeigt). Es zeigte sich eine Pfr-angereicherte Form,

wodurch PaBphP zu den sogenannten bathy-Phytochromen zählt (Rottwinkel et al.,

2010). Anhand dieser spektralen Eigenschaften von homolog isoliertem PaBphP

konnte auch unter physiologischen Bedingungen die Funktionalität eines aktiven

Phytochroms aus P. aeruginosa nachgewiesen werden.

3.1.1.3 Der native Chromophor von PaBphP

P. aeruginosa besitzt im Gegensatz zu allen anderen sequenzierten Bakterienarten

zwei Hämoxygenasen: HemO und BphO. Beide Enzyme sind in der Lage, Häm zu

Biliverdin (BV) zu spalten. Sie unterscheiden sich dabei jedoch in ihrer

Regiospezifität. So spaltet HemO das Häm-Molekül an der δ- und β-

Kohlenstoffbrücke, wodurch BV IXδ und BVI Xβ in einem Verhältnis von 70:30

entstehen (Ratliff et al., 2001). BphO hingegen öffnet den Porphyrinring an der

α- Kohlenstoffbrücke und erzeugt somit BV IXα (Wegele et al., 2004). In bisherigen

in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass letzteres als Chromophor für

PaBphP dient. Weiterhin wurde in vitro eine Photoisomerisierung von PaBphP auch

nach Zugabe von BVI Xδ beobachtet (Tasler et al., 2005).

Um in vivo den natürlichen Chromophor von PaBphP zu identifizieren, wurde

PaBphP aus einer ∆bphO- bzw. ∆hemO-Deletionsmutante gereinigt. Die isolierten

PaBphPs wurden daraufhin hinsichtlich einer Photokonversion untersucht, wobei das

homolog produzierte PaBphP aus dem Wildtypstamm als Referenz diente. Da die

native Synthesemenge von PaBphP sehr gering ist (vgl. 3.1.1.1), wurde ein Konstrukt

zur homologen Überproduktion in P. aeruginosa auf der Basis des Arabinose-

induzierbaren pHERD-Vektors konstruiert (Qiu et al., 2008).

Ergebnisse

62

Die Reinheitsanalyse der erhaltenen Eluate nach der affinitätschromatographischen

Isolierung erfolgte mittels SDS-PAGE (Abb. 12).

Abb. 12: SDS-PAGE-Analyse von homolog überproduziertem und isoliertem PaBphP aus verschiedenen PA14-Stämmen Für die homologe Überproduktion von PaBphP wurde mittels diparentalen Mating das entsprechende Konstrukt (pSHP46) in den PA14 WT, einer ∆bphO- und ∆hemO-Mutante eingebracht. Dargestellt ist eine Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10 %) nach affinitätschromatographischer Reinigung von PaBphP. Es wurden jeweils 10 µl der vereinigten Elutionsfraktionen aufgetragen. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Anhand der SDS-PAGE zeigt sich, dass aus allen Stämmen ein nahezu homogenes

Fusionsprotein in vergleichbaren Konzentrationen gewonnen werden konnte.

Demnach hatte das Fehlen der Hämoxygenase BphO bzw. HemO keinen Einfluss

auf die Proteinproduktion und -stabilität.

Um den in vivo gebundenen Chromophor zu identifizieren, wurde die Fähigkeit einer

Photokonversion der isolierten PaBphPs getestet. Dazu wurden erneut die

lichtabsorbierenden Eigenschaften des Chromophors auf der Basis der

rotlichtabhängigen Photoisomerisierung charakterisiert (Abb. 13). Die

spektroskopische Analyse ergab eine lichtinduzierte Umwandlung für PaBphP aus

dem WT und der ∆hemO-Mutante. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe,

dass die BV-Isomere BV IXβ und BVI Xδ für die Assemblierung eines funktionellen

holo-Phytochroms nicht benötigt werden. Das PaBphP, isoliert aus der ∆bphO-

Mutante, zeigte keine Photoisomerisierung. Daraus kann geschlussfolgert werden,

dass BV IXα, das durch die Hämspaltung der BphO-Hämoxygenase generiert wird,

der native Chromophor von PaBphP ist. Anders als in den durch Tasler et al.

Ergebnisse

63

durchgeführten in vitro-Analysen, kann die Assemblierung eines holo-Phytochroms in

vivo nicht mit dem Spaltprodukt der HemO-Hämoxgenase, BV IXδ, erfolgen.

Abb. 13: Differenzspektren von homolog überproduzierten PaBphPs aus verschiedenen PA14-Stämmen Berechnete Differenzspektren nach Bestrahlung mit hellrotem (690 nm) und dunkelrotem (750 nm) Licht der homolog überproduzierten und isolierten PaBphPs aus dem WT (schwarzes Spektrum) und den Hämoxygenase-Mutanten ∆hemO (rotes Spektrum) und ∆bphO (grünes Spektrum). Eingesetzt wurden jeweils 15 µM Protein.

Durch die Zugabe äquimolarer Menge von BVI Xα konnte ein funktionelles PaBphP

holo-Phytochrom aus der ∆bphO-Mutante generiert werden. Daraufhin wurden die

spektroskopischen Eigenschaften der homolog überproduzierten Phytochrome aus

dem WT und der ∆hemO-Mutante ebenfalls unter Zugabe von BV IXα bestimmt. Dies

hatte eine deutliche Zunahme der Differenzspektren zur Folge. Durch diese Zugabe

stieg die relative Absorptionsdifferenz (∆∆ A) von etwa 0,004 auf 0,2 (Abb. 14).

Ergebnisse

64

Abb. 14: Relative Absorptionsdifferenz vor und nach Zugabe von BV IXα Berechnete relative Absorptionsdifferenz (∆∆ A) der PaBphPs aus verschiedenen PA14-Stämmen vor und nach Zugabe von äquimolarem BVI Xα (15 µM) und Bestrahlung mit hellrotem (690 nm) und dunkelrotem (750 nm) Licht.

Anhand von Berechnungen der Differenz vor und nach Zugabe von BV IXα wird

deutlich, dass nur ein kleiner Teil des isolierten PaBphPs mit einem Chromophor

besetzt war (~2 %). Durch dieses Experiment wurden auch neue Erkenntnisse über

die enzymatischen Eigenschaften der BphO- Hämoxygenase gewonnen. Die

Synthese des Chromophors scheint unabhängig von der vorliegenden Menge an

apo-Phytochrom zu sein und die Enzymaktivität wird nicht dahingehend angepasst.

3.1.1.4. Autophosphorylierung

Aufgrund ihres Domänenaufbaus sind bakterielle Phytochrome Rotlichtsensoren mit

Kinaseeigenschaften. Eine lichtregulierte Autophosphorylierung eines holo-

Phytochroms konnte bereits für einige bakterielle Phytochrome nachgewiesen

werden (Davis et al., 1999; Bhoo et al., 2001). Eine aktuelle Publikation weist zudem

darauf hin, dass eine lichtregulierte Autophosphorylierung auch ohne gebundenem

Chromophor stattfinden kann (Fixen et al., 2014).

Unter Berücksichtigung dieser Studien wurde in der vorliegenden Arbeit das homolog

überproduzierte PaBphP auf eine mögliche lichtregulierte Autophosphorylierung

durch Zugabe von radioaktiv markiertem [γ32-P]-ATP in der holo- und der apo-Form

Ergebnisse

65

des Proteins untersucht. Dazu wurden die homolog gereinigten PaBphPs aus dem

WT und der ∆bphO-Mutante verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass die

Autophosphorylierung der untersuchten PaBphPs unabhängig sowohl von den

vorherrschenden Lichtbedingungen, als auch unabhängig von einem assemblierten

Chromophor erfolgen kann (Abb. 15).

Abb. 15: Lichtabhängige Autophosphorylierung von homolog überproduzierten PaBphPs in der holo- und apo-Form

(A) Autoradiogramm nach Inkubation mit [γ32-P]-ATP und 30-minütiger Bestrahlung mit dunkelrotem

(750 nm) sowie hellrotem (690 nm) Licht des holo-Phytochroms (PaBphP überproduziert und isoliert aus dem WT) bzw. des apo-Phytochroms (PaBphP überproduziert und isoliert aus der ∆bphO-Mutante). (B) Proteinkontrolle mittels SDS-PAGE (10 %) und anschließender Coomassiefärbung.

Da in vorangegangenen Arbeiten gezeigt wurde, dass nach einer homologen

Überproduktion von PaBphP aus dem WT nur ein kleiner Anteil der synthetisierten

Proteine mit Chromophor abgesättigt ist (vgl. 3.1.1.2), wurde die

Autophosphorylierung nach einer vollständigen Chromophorylierung des

Phytochroms wiederholt (Daten nicht gezeigt). Das resultierende Autoradiogramm

zeigte jedoch keine signifikanten Unterschiede zu den Ergebnissen der ersten

Untersuchung. Somit wurde eine chromophorunabhängige Autophosphorylierung

und damit die Kinaseaktivität für beide Formen bestätigt.

Ergebnisse

66

3.1.2 Phänotypische Charakterisierungen von Phytochrommutanten

Durch die im vorherigen Abschnitt biochemischen Untersuchungen von homolog

gereinigtem PaBphP konnte die Funktionalität eines Rotlichtrezeptors in vivo

nachgewiesen werden. Daran knüpft die Frage der physiologischen Bedeutung des

Phytochroms in P. aeruginosa an. Hinweise auf eine Rolle in der stationären Phase

lieferten bereits durchgeführte transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen (Barkovits

et al., 2008). Auch wurde anhand von Transkriptiomanalysen eine Vielzahl

deregulierter Gene in einer ∆bphO- sowie ∆bphP-Mutante identifiziert (Barkovits et

al., 2011). Diese sind jedoch nicht einem funktionellen Bereich zuzuordnen, wodurch

kein eindeutiger Rückschluss in Hinblick auf die physiologische Funktion des

Phytochroms gezogen werden kann. Auch bisherige phänotypische Untersuchungen

von PAO1 ∆bphO- und ∆bphP-Deletionsmutanten konnte diese Frage nicht klären.

Innerhalb dieser Arbeit wurde diese Phänotypisierung zur Aufklärung der zellulären

Funktion fortgeführt. Dafür wurde im Unterschied zu den bisherigen Analysen der

Parentalstamm PA14, sowie die entsprechenden Mutanten verwendet. Da keine

lichtabhängige Regulation von PaBphP, in Form einer Kinaseaktivität, nachgewiesen

wurde (vgl. 3.1.1.4), erfolgten die weiteren Untersuchungen ohne definierte

Lichtbedingungen.

3.1.2.1 Osmotischer Stress

Innerhalb der bereits durchgeführten Transkriptionsstudien wurde eine erhöhte

Anzahl an Genen identifiziert, die durch osmotischen Stress induziert werden. Um

einen möglichen Einfluss von PaBphP bei der osmotischen Adaptation zu

analysieren, wurde die Sensibilität der Stämme gegenüber hohen Salz-

konzentrationen analysiert. Dazu wurden Verdünnungsreihen, ausgehend von

Hauptkulturen aus der stationären Phase (oD578 nm 3,5) angelegt und durch

Aufbringen auf Hochsalz-LB-Platten (0,9 M) untersucht (Abb. 16). Aus diesem Test

geht hervor, dass der Unterschied zwischen dem WT und den Deletionsmutanten

gegenüber osmotischen Stress nur marginal ist. Daher kann ein Einfluss des

Phytochroms an der osmotischen Stressantwort unter diesen Bedingungen

weitgehend ausgeschlossen werden.

Ergebnisse

67

Abb. 16: Untersuchung der Sensibilität gegenüber hohen Salzkonzentrationen von WT und einer ∆bphO- sowie ∆bphP-Mutante Ausgehend von Hauptkulturen einer oD578 nm 3,5 wurden Verdünnungsreihen angelegt. Davon wurden jeweils 2 µl auf eine Hochsalz-Agar-Platte aufgebracht (0,9 M NaCl) und 48 h bei 37 °C inkubiert.

3.1.2.2 Synthese von 4-Hydroxy-2-alkyl-quinolonen (HAQ)

Die Transkriptomdaten (Barkovits et al., 2011) deuten weiterhin auf eine mögliche

Regulation der Synthesegene der Autoinduktoren HHQ und PQS hin, woduch das

Phytochrom einen Einfluss auf die Produktion dieser Signalmoleküle haben könnte.

Um dieser Hypothese nachzugehen, wurden HHQ und PQS aus dem

Kulturüberstanden der Stämme bei einer oD578 nm von 3,5 isoliert und

dünnschichtchromatographisch aufgetrennt (Abb. 17). Da weder ein HHQ- noch ein

PQS-Standard zu Verfügung stand, und keine Rf-Werte bekannt sind, wurden die

separierten Moleküle mittels Literaturvergleich bestimmt (Jensen et al., 2006).

Ergebnisse

68

Abb. 17: Extraktion von HAQs aus Kuturüberständen von WT und einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante Dünnschichtchromatographische Auftrennung der Signalmoleküle HHQ und PQS aus dem Kulturüberstand des WTs, einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante. Diese wurden ausgehend von Hauptkulturen mit einer oD578 nm von 3,5 mittels Dichlormethan extrahiert. Als Laufmittel diente ein Gemisch aus 95:5 (v/v) Dichlormethan/Methanol.

Die dargestellte dünnschichtchromatographische Auftrennung der Signalmoleküle

zeigt, dass eine Deletion von bphO und bphP keinen Einfluss auf die Synthese von

HHQ hat, da es in nahezu gleicher Menge nachgewiesen wurde. Jedoch ist in beiden

Mutanten die Menge an gebildeten PQS deutlich geringer als im WT.

3.1.2.3 Auswirkung von SDS auf die Membran

Innerhalb der Transkriptomanalysen (Barkovits et al., 2011) wurden auch einige

wenige deregulierte Gene identifiziert, deren Produkte entweder in der Membran

lokalisiert, oder an der Synthese von Komponenten der Lipopolysaccharidschicht

beteiligt sind. Die Analyse, ob sich durch eine Deletion von bphO oder bphP die

Membranstabilität beeinflusst wird, wurde mittels des Detergenz Natrium-

dodecylsulfat (SDS) untersucht. Nach Ausplattieren der Stationärphasenkulturen

einer oD578 nm von 3,5 auf eine LB-Agar-Platte wurde die Sensibilität gegen das

Detergenz (10 %) mittels eines Plättchentests untersucht und nach 24 h die

entstandenen Hemmhöfe bestimmt. Sowohl der WT als auch die ∆bphO-Mutante

wiesen einen durchschnittlichen Hemmhof von 1,0 cm auf. Im Gegensatz dazu war

der Hemmhof der ∆bphP-Mutante mit 1,3 cm deutlich größer, wodurch ein möglicher

Einfluss des Phytochroms auf die Membranintegrität besteht.

Ergebnisse

69

3.1.2.4 Motilitätsverhalten

Ein Phytochrom-reguliertes, lichtabhängiges Motilitätsverhalten wurde kürzlich bei

dem Verwandten von P. aeruginosa, P. syringae B728a entdeckt. Dabei hat das

PsBphP1 einen negativen Effekt auf die Fortbewegung, was sich in einer erhöhten

Motilität der entsprechenden Mutante wiederspiegelt (Wu et al., 2013). Zur Klärung,

ob das Phytochrom aus P. aeruginosa ebenfalls eine Rolle in der Fortbewegung

einnimmt, wurde diese durch LB-Platten mit verschiedener Agar-Konzentration

untersucht. Die Fortbewegung wird durch eine Kombination aus Flagellen und TypIV-

Pili vermittelt. Bei einer niedrigen Agar-Konzentration (0,3 %) beruht die Motilität

überwiegend auf den Flagellen, was als „Schwimmen“ bezeichnet wird (Wolfe &

Visick, 2008). Hingegen beruht die Fortbewegung bei einer Verwendung von 0,5 %

Agar auf einer Kombination aus Flagellen und TypIV-Pili und wird als „Schwärmen“

bezeichnet (Mattick, 2002) (Abb. 18).

Sowohl bei einer Verwendung von 0,3 %-igen als auch bei 0,5 %-igen Agar-Platten

wies die ∆bphO-Mutante ein WT-ähnliches Motilitätsverhalten auf. Durch die Deletion

von bphP hingegen konnte eine leicht reduziertes Schwimmverhalten bei einer Agar-

Konzentration von 0,3 % im Vergleich zum WT beobachtet werden (Abb. 18-A).

Weiterhin war eine markante Grünfärbung der Zellen der ∆bphP-Mutante auffällig.

Dies könnte auf eine erhöhte Produktion des für P. aeruginosa charakteristischen

grün pigmentierten Virulenzfaktors Pyocyanin zurückgeführt werden, und wurde

dahingehend weiter analysiert.

Abb. 18: Untersuchung des Motilitätsverhalten im WT und einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante Für die Analyse der Motilität wurden je 5 µl einer Hauptkultur des WT, einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante mit einer oD578 nm von 3,5 auf eine LB-Platte gegeben und üN bei 37 °C inkubiert. (A) Agar-Konzentration der LB-Platte: 0,3 %. (B) Agar-Konzentration der LB-Platte: 0,5 %.

Ergebnisse

70

3.1.2.5 Pyocyaninproduktion

Pyocyanain ist ein blau-grün pigmentierter sekundärer Metabolit. Strukturell handelt

es sich um Phenanzin-Derivat mit zwitterionischem Aufbau. Dadurch kann es leicht

die Membran passieren und durch seine Redox-Eigenschaften ein großes Spektrum

an Zellschäden verursachen (Lau et al., 2004). Der Wirkmechanismus ist bisher noch

nicht geklärt, jedoch ist bekannt, dass Pyocyanin einer der wichtigsten

Virulenzfaktoren von P. aeruginosa ist. Pyocyanin kann nach der Extraktion aus dem

Kulturüberstand, aufgrund seiner colorimetrischen Eigenschaften, spektral untersucht

werden. Eine erhöhte Synthese des Virulenzfaktors im Kulturüberstand der ∆bphP-

Mutante wurde jedoch nicht nachgewiesen. Interessanterweise konnte die verstärkte

Grünfärbung nur bei einer Anzucht auf Agar-Platten, jedoch nicht in Flüssigkultur,

beobachtet werden. Versuche das Pigment aus den Plattenkulturen zu extrahieren,

lieferte ebenfalls nicht den Nachweis einer erhöhten Pyocyaninproduktion der

∆bphP-Mutante.

Ergebnisse

71

3.1.3 Die Regulation von bphOP und bphP

Die genetische Organisation von bphP, kodierend für das apo-Phytochrom und

bphO, kodierend für die Hämoxygenase, ist innerhalb vieler bakterieller

Phytochromsysteme gleich (Bhoo et al., 2001). In der Regel sind beide Gene auf

dem Chromosom in unmittelbarer Nähe lokalisiert, wobei bphO direkt stromaufwärts

von bphP liegt. In P. aeruginosa sind diese beiden Gene durch eine kleine

intergenische Region von 26 bp getrennt. Dies deutet auf eine bicistronische

Operonstruktur von bphO und bphP hin und wurde bereits durch Reverse-

Transkriptase-PCR-Experimente bestätigt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass

die Transkription des Operons von RpoS, dem Sigmafaktor der stationären Phase,

induziert wird (Barkovits et al., 2008). Mehrere unabhängige globale Transkriptom-

analysen geben außerdem Hinweise auf eine mögliche zweite Promotorregion

stromaufwärts von bphP (Schuster et al., 2003; Schuster et al., 2004; Gilbert et al.,

2009). Dies würde eine zusätzliche, von bphO unabhängige, Transkription des apo-

Proteins bedeuten. Darüber hinaus wird eine Quorum-Sensing-regulierte (QS;

vgl. 1.6) Transkription, vermittelt durch LasR, postuliert (Gilbert et al., 2009).

Aufgrund dieser Hypothese wurde im Rahmen dieser Arbeit die Transkriptions-

regulation dieser Gene weiter im Detail untersucht.

3.1.3.1 Vergleichende Promotoraktivitätsstudien

Um das Vorhandensein eines putativen bphP-Promotors zu überprüfen, wurde eine

transkriptionelle lacZ-Fusion des putativen Promotorbereichs von bphP konstruiert.

Der verwendete Vektor mini-CTX1 ist in der Lage, in das Genom von P. aeruginosa

durch eine Integrase-vermittelte Rekombination in den attB-Locus, zu integrieren.

Diese genomische Verankerung bietet den Vorteil einer einzelnen zusätzlichen Kopie

des Promotorbereiches ohne das der native Ort des zu untersuchenden Gens

beeinflusst wird (Becher & Schweizer, 2000). Über die Messung der Aktivität der

gebildeten ß-Galaktosidase kann indirekt auf die Stärke der Promotoraktivität des zu

untersuchenden Gens geschlossen werden. Die Aktivität der bphP-Reportergen-

fusion wurde in verschiedenen Wachstumsphasen bestimmt und mit einer

transkriptionellen lacZ-Fusion des bphOP-Promotors verglichen (Abb. 19).

Ergebnisse

72

Abb 19: Promotoraktivität von bphOP und bphP in verschiedenen Wachstumsphasen Für die Untersuchung der Promotoraktivitäten von bphOP und bphP wurden transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen in das Genom des PA14 WT integriert. Die Messungen erfolgten in der logarithmischen (oD578 nm 0,5), exponentiellen (oD578 nm 1,5), stationären (oD578 nm 4,5) und der späten stationären Phase (oD578 nm 5,5) durch Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) Schematische Darstellung der erstellten transkriptionellen lacZ-Reportergenfusionen von bphOP und bphP. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP- und bphP-lacZ-Reportergenfusion im WT in verschiedenen Wachstumsphasen.

Eine stationärphaseninduzierte bphOP-Genexpression war bereits zu Beginn dieser

Arbeit bekannt (Barkovits et al., 2008) und konnte unabhängig bestätigt werden.

Darüber hinaus wurde aber auch eine Promotoraktivität für bphP nachgewiesen.

Diese Beobachtung unterstützt die Hypothese der eigenständigen

Expressionskontrolle für bphP. Durch die durchgeführten Aktivitätsbestimmungen

wurde weiterhin eine ebenfalls zelldichteabhängige Transkription von bphP, mit

maximaler Induktion in der Stationärphase, ermittelt. Verglichen mit der Aktivität des

bphOP-Promotors ist diese in allen analysierten Wachstumsphasen um etwa

20 - 40 % geringer. Die Regulation der bphP-Transkription wurde weiterhin bezüglich

der postulierten QS-Abhängigkeit genauer analysiert (QS: vgl. 1.6).

Ergebnisse

73

3.1.3.2 LasR-abhängige Regulation

Wie bereits gezeigt werden konnte, wird bphP nicht nur zusammen mit bphO in

einem bicistronischen Operon cotranskribiert, sondern verfügt auch über einen

eigenen Promotor. Gilbert et al. postulieren weiterhin eine Transkriptionsaktivierung

von bphP durch den QS-Regulator LasR (Gilbert et al., 2009). Die Induktion des

bphOP-Cotranskripts hingegen wird von RpoS reguliert (Barkovits et al., 2008). Die

Genexpression des Sigmafaktors wird jedoch indirekt von LasR über RhlR,

gesteuert. Dabei ist nicht auszuschließen, dass auch eine zusätzliche direkte

Regulation durch LasR möglich ist. Die Expressionskontrolle vieler Gene ist sehr

dynamisch und kann auch durch mehrere Regulatoren gesteuert werden. Um einen

möglichen Einfluss von LasR auf die bphP- und bphOP-Transkription zu überprüfen,

wurde eine ∆lasR-Mutante erstellt, die Reportergenfusionen in das Genom integriert

und anschließend die Aktivität über die Messung der gebildeten ß-Galaktosidase

bestimmt (Abb. 20). Da die vorausgegangenen Promotorstudien eine maximale

Induktion des Reportergens in der stationären Phase aufzeigten, wurden die

folgenden Analysen jeweils bei einer oD578 nm von 3,5 durchgeführt.

Abb. 20: Promotoraktivität von bphP und bphOP im WT und einer ∆lasR-Mutante Für die Untersuchung einer LasR-abhängigen Promotorinduktion von bphOP und bphP wurden transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen in das Genom von PA14 WT und einer ∆lasR-Mutante integriert. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galakosidaseaktivität der bphP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆lasR-Mutante. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆lasR-Mutante.

Ergebnisse

74

Das Fehlen des Transkriptionsregulatoes LasR hat eine fast vollständige Repression

des bphP-Promotors zur Folge (Abb. 20-A). Auch die Aktivität der bphOP-lacZ-

Fusion ist in der ∆lasR-Mutante im Vergleich zu WT ebenfalls um ca. 85 % reduziert

(Abb. 20-B). Damit konnte LasR als Aktivator der Transkription von bphP und auch

für das bphOP-Cotranskript nachgewiesen werden. Aufgrund der hierarchischen

Organisation der QS-Systeme mit LasR als übergeordneten Regulator, lassen die

durchgeführten experimentellen Ansätze jedoch keine Aussage darüber zu, ob die

Induktion der Genexpression direkt oder indirekt erfolgt. Eine direkte Aktivierung setzt

eine DNA-Bindung des Regulators an die Promotorregion voraus. Hinweise auf eine

solche direkte Bindung an die DNA geben oftmals konservierte palindromische

Sequenzen in der Promotorregion, die auch als las-Boxen bezeichnet werden

(Schuster et al., 2004). Eine solche Las-Box wurde auch für den intergenischen

Bereich von bphO und bphP postuliert. Eine direkte Bindung von LasR an diese

Region konnte jedoch bisher nicht gezeigt werden (Gilbert et al., 2009).

Darauf aufbauend wurden im Rahmen dieser Arbeit DNA-Bindestudien sowohl mit

der stromaufwärts von bphO gelegenen, als auch mit der putativen bphP-

Promotorregion durchgeführt.

Um das für die DNA mobility shiftt assays (DMSA) benötigte LasR-Protein zu

gewinnen, wurde der Transkriptionsregulator heterolog in E. coli überproduziert und

affinitätschromatographisch mittels Heparin-Sepharose isoliert (Qihui et al., 2011).

Die Überprüfung des Reinheitsgrades des isolierten Proteins erfolgte anschließend

gelelektrophoretisch (Abb. 21). Dabei wurde ein Protein ohne weitere Verun-

reinigungen bei 26 kDa detektiert, was der theoretischen berechneten Größe eines

LasR-Monomers entspricht. LasR konnte somit einer nahezu 100 %-igen

Homogenität isoliert werden.

Ergebnisse

75

Abb. 21: SDS-PAGE Analyse von heterolog überproduziertem und isoliertem LasR Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10 %) nach zweimaliger affinitätschromatographischer Reinigung mittels Heparin-Sepharose von LasR (pET14b-lasR; Quihui et al,. 2001). Aufgetragen wurde 10 µl der vereinigten Elutionsfraktionen. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Die zu untersuchenden Promotorregionen wurden mittels PCR amplifiziert und die

erhaltene DNA mit aufsteigenden Konzentrationen des Regulators inkubiert. Die

Auftrennung der potentiellen DNA-Protein-Komplexe erfolgte anschließend über ein

3 %-iges Agarosegel (Abb. 22). Als Positivkontrolle diente die Promotorregion von

rhlR.

Abb. 22: DMSA mit LasR und den putativen Promotorregionen von bphOP und bphP Für die Bindestudien wurden jeweils 50 ng der PCR-amplifizierten DNA-Fragmente mit steigenden LasR-Konzentrationen (0,1 µg - 0,6 µg) inkubiert und anschließend über ein 3 %-iges Agarosegel aufgetrennt. Die Visualisierung der DNA erfolgte mit Ethidiumbromid. (-): ohne Proteinzugabe. (A) Positivkontrolle: 193 bp der Promotorregion von rhlR. (B) 320 bp der putativen Promotorregion von bphP. (C) 200 bp der putativen bphOP-Promotorregion. (*): freie DNA; (**): gebundene DNA.

Die Auswertung der Bindestudien zeigte eine Verschiebung der Laufweite für die

PCR-amplifizierte rhlR-Promotorregion mit zunehmender LasR-Konzentration infolge

einer direkten Bindung. Dies impliziert, dass der Transkriptionsfaktor in seiner aktiven

Form isoliert wurde. Im Vergleich dazu konnte eine direkte Bindung von LasR an die

Ergebnisse

76

Promotorbereiche von bphOP und bphP nicht beobachtet werden (Abb. 22-B und C).

Um auszuschließen, dass die LasR-Bindung in vivo noch von weiteren Faktoren für

eine DNA-Bindung abhängig ist, wurden die Experimente unter Zugabe von

P. aeruginosa-Rohextrakt aus der stationären Phase wiederholt. Jedoch wurde auch

in diesen Experimenten keine Laufweitenverschiebung im DMSA detektiert (Daten

nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass LasR in seiner Funktion

Transkriptionsaktivator für bphOP und bphP nicht direkt mit der DNA interagiert.

3.1.3.3 RhlR-abhängige Regulation

Da die vorausgegangenen DMSA-Studien eine direkte Kontrolle der bphOP- und

bphP-Genexpression durch LasR vermutlich ausschließen, wurde im Folgenden die

Möglichkeit einer indirekten Regulation über den LasR-abhängigen

Transkriptionsfaktor RhlR untersucht. Dazu wurden die bphOP- und bphP-

Reportergenfusionen in das Genom einer ∆rhlR-Mutante integriert und die

Promotorinduktion analysiert. Die Messungen ergaben jeweils eine um etwa 50 %

verringerte ß-Galaktosidaseaktivität beider Reportergenfusionen in der Mutante im

Vergleich zum WT (Abb. 23). Diese Beobachtungen deuten auf eine RhlR-abhängige

Transkriptionskontrolle von sowohl bphOP als auch bphP hin.

Abb. 23: Promotoraktivität von bphP und bphOP im WT und einer ∆rhlR-Mutante Für die Untersuchung einer RhlR-abhängigen Promotorinduktion von bphP und bphOP wurden transkriptionelle lacZ-Reportergenfusionen in das Genom des PA14 WT und einer ∆rhlR-Mutante integriert. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galaktosidaseaktivität der bphP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆rhlR-Mutante. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP-lacZ-Reportergenfusion im WT und in einer ∆rhlR-Mutante.

Ergebnisse

77

Da im Rahmen dieser Arbeit kein funktionsfähiges rhlR-Überproduktionskonstrukt

erzeugt werden konnte, wurde alternativ eine plasmidkodierte konstitutive Expression

des Regulators gewählt (Dekimpe & Deziel, 2009). Durch die erhöhte Expression des

Regulators steigt folglich im Falle einer Transkriptionsaktivierung durch RhlR auch

die Induktion der entsprechenden Promotoren.

Als Bestandteil des QS-Systems liegt RhlR erst bei einer hohen Zellzahl in seiner

aktiven Form vor. Eine konstitutive Expression hingegen ist von der hohen

Populationsdichte unabhängig, wodurch eine Induktion der regulierten Gene bereits

bei einer geringeren Zellzahl möglich ist. Dementsprechend wurde das Plasmid

(pUCPKS_rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) in die WT-Stämme mit den bereits

integrierten bphP- und bphOP-Reportergenfusionen eingebracht und die

Promotoraktivität erneut bestimmt.

Es zeigte sich, dass die erhöhte Regulatorkonzentration nur eine geringfügige

Zunahme der Promotoraktivität von bphP zur Folge hatte (Abb. 24-A). Somit kann

eine direkte Regulation durch RhlR vermutlich ausgeschlossen werden. Im Vergleich

dazu führte die konstitutive Expression von rhlR zu einer deutlich verstärkten Aktivität

der bphOP-lacZ-Fusion, die dabei bereits bei niedriger Zellzahl (oD578 nm 2,5) zu

beobachten war (Abb. 24-B).

Ergebnisse

78

Abb. 24: Einfluss einer konstitutiven Expression von rhlR auf die Promotoraktivitäten von bphP und bphOP Für die Untersuchung der Promotoraktivitäten von bphP und bphOP wurden lacZ-Reportergenfusionen in das Genom von PA14 WT integriert. Im Anschluss wurde mittels diparentalem Mating das plasmidkodierte rhlR (pUCPSK_rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) in die Stämme eingebracht. Die Messung der Promotoraktivitäten erfolgte in der frühen stationären Phase (oD578 nm 2,5) sowie in der stationären Phase (oD578 nm 3,5) durch Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galaktosidaseaktivität der bphP-Reportergenfusion im WT sowie im WT mit konstitutiver Expression von rhlR (WT/rhlR

C).(B) ß-Galaktosidaseaktivität der bphOP-Reportergenfusion im WT

sowie im WT mit konstitutiver Expression von rhlR (WT/rhlRC).

3.1.4.4 RpoS-abhängige Regulation

Die bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass RhlR zwar die Transkription von

bphP moduliert, jedoch eine direkte Aktivierung wahrscheinlich ausgeschlossen

werden kann. Aufgrund der hierarchischen Struktur des QS-Systems besteht jedoch

erneut die Möglichkeit einer durch RhlR indirekten Transkriptionsaktivierung durch

RpoS. Um dies zu testen, wurde die Aktivität der bphP-Reportergenfusion in einer

entsprechenden ∆rpoS-Mutante analysiert (Abb. 25). Dabei konnte eine um 50 %

reduzierte bphP-Promotoraktivität im Vergleich zum WT festgestellt werden. Da keine

vollständige Repression durch das Fehlen des alternativen Sigmafaktors vorlag, ist

die Beteiligung weiterer Transkriptionsaktivatoren sehr wahrscheinlich.

Ergebnisse

79

Abb. 25: Promotoraktivität von bphP im WT und einer ∆rpoS-Mutante Für die Untersuchung einer RpoS-abhängigen Promotoraktivität von bphP wurden eine transkriptionelle lacZ-Reportergenfusion in das Genom von PA14 WT und einer ∆rpoS-Mutante integriert. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidase-aktivität.

Durch die Analyse der bphOP-Promotoraktivität bei konstitutiver Expression von rhlR

konnte ein Einfluss des QS-Regulators auf die Induktion gezeigt werden (Abb. 25).

Ob es sich dabei um eine direkte oder durch RpoS-vermittelte indirekte Kontrolle

handelt, wurde die Promotoraktivität von bphOP in einer ∆rpoS-Mutante, einer

∆rpoS-Mutante mit konstitutiv exprimiertem rhlR gegenübergestellt (Abb. 26). Die

Aktivität der bphOP-Reportergenfusion in einer ∆rpoS-Mutante ist dabei zwar stark

verringert, jedoch nicht vollständig reprimiert. Hingegen führte eine konstitutive

Expression von rhlR in der ∆rpoS-Mutante zu einer stark erhöhten Induktion des

bphOP-Promotors. Diese Ergebnisse bestätigen einerseits die vorliegenden Daten

einer Regulation durch RpoS, andererseits konnte weiterhin aufgezeigt werden, dass

RhlR ebenfalls in die Transkriptionsaktivierung von bphOP involviert ist.

Ergebnisse

80

Abb. 26: Promotoraktivität von bphOP bei konstitutiver Expression von rhlR in einer ∆rpoS-Mutante Für die Untersuchung einer RpoS-abhängigen Promotorinduktion von bphOP wurden eine transkriptionelle bphOP-lacZ-Reportergenfusion in das Genom von PA14 WT und einer ∆rpoS-Mutante integriert. Im Anschluss wurde mittels diparentalem Mating das plasmidkodierte rhlR (pUCPKS_rhlR, Dekimpe & Deziel, 2009) in die Stämme eingebracht. Die Messung erfolgte bei einer oD578 nm von 3,5 durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität.

Ergebnisse

81

3.1.4 Die intrazelluläre Signaltransduktion von PaBphP

Nachdem die Regulation der Gene bphO und bphP untersucht wurde, sollte die

weiterführende Signaltransduktionskaskade von PaBphP analysiert werden. Dabei

stand die Identifizierung der korrespondierenden Antwortregulatoren von PaBphP im

Fokus. In den meisten Prokaryoten bilden die kodierenden Gene für das

apo-Phytochrom, die chromophor-erzeugende Hämoxygenase und dem AR oftmals

ein Operon oder sie befinden sich in räumlicher Nähe (Bhoo et al., 2001).

Bioinformatische Analysen ergaben, dass diese Co-Lokalisation in P. aeruginosa

nicht vorliegt und es ferner keine Hinweise auf einen putativen AR der Sensorkinase

gibt. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein „genetischer Screen“

auf der Basis von Transkriptomdaten einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante (Barkovits et

al., 2011) durchgeführt. Darüber hinaus wurde die Signalweiterleitung durch einen

Transfer der Phosphorylgruppe auf die dabei identifizierten putativen Regulatoren

untersucht.

3.1.4.1 Entwicklung eines genetischen Screens zur Identifizierung putativer

Phytochrom-Antwortregulatoren

Dieser Arbeit vorausgegangenen globalen Expressionsanalysen identifizierten eine

Vielzahl an Genen, deren Regulation durch eine Deletion von bphO bzw. bphP

beeinflusst wird (Barkovits et al., 2011). Dabei fiel unter anderem die starke

Repression des Gens PA4739 (Faktor 19) auf. Das Genprodukt von PA4739 ist ein

hypothetisches Protein mit putativ periplasmatischer Lokalisation und noch

unbekannter Funktion. Strukturell weist PA4739 eine 60 %-ige Ähnlichkeit zu OsmY

aus E. coli auf. Diese Übereinstimmung basiert auf der N-terminal gelegenen BON-

Domäne (bacterial OsmY and nodulation). Da weiterführende transkriptionelle

lacZ-Reportergenanalysen die PaBphP-abhängige Regulation von PA4739

verifizieren konnten (Barkovits et al., 2001), diente dieses Gen als Basis für einen

Screen zur Identifikation putativer AR von PaBphP. Das Prinzip dieses genetischen

Screens beruhte auf der Hypothese, dass die Genexpression von PA4739 über den

korrespondierenden AR von PaBphP reguliert wird. Eine Deletion des

entsprechenden Regulators sollte somit ein zur ∆bphP-Mutante vergleichbares

Expressionsprofil von PA4739 aufweisen.

Ergebnisse

82

Nach der Festlegung des experimentellen Ansatzes musste zunächst geklärt werden,

welche AR getestet werden sollten. Von allen bekannten Bakterienarten besitzt

P. aeruginosa die größte Anzahl an Genen, deren Produkte regulatorische Elemente

sind. Durch bioinformatische Datenbank-Recherchen konnten 107 annotierte und

putative AR ermittelt werden (www.pseudomonas.com). Ausgehend von diesen 107

putativen AR wurden zunächst 72 ausgewählt. Dabei standen AR, deren zugehörige

Sensorkinase noch nicht bekannt ist, besonders im Vordergrund.

Den Transkriptomanalysen von Barkovits et al. lag der P. aeruginosa-Stamm PAO1

zugrunde. Die verwendeten AR-Mutanten zur Durchführung des Screens wurden

hingegen von einer Transposon-Bibliothek, basierend auf dem PA14-Wildtypstamm,

bezogen (Liberti et al., 2006). Die Genome beider Stämme sind jedoch zu 96 %

homolog (Stover et al., 2000; Winsor et al., 2009), wobei die verwendete

Promotorregion von PA4739 sogar zu 99 % identisch mit dem Homolog aus PA14

PA14_62690 ist. Es konnte weiterhin kein Unterscheid in der Expression von

PA4739 in den beiden Stämmen beobachtet werde. Infolgedessen sind Effekte durch

einen Stammwechsel sehr unwahrscheinlich.

Für die Identifikation des korrespondierenden AR von PaBphP wurden 64

Transposonmutanten der PA14-Transposon-Bibliothek bezogen (Liberti et al., 2006;

bereitgestellt von Prof. Dr. S. Häussler, HZI Braunschweig). Weitere acht Gene die

für putative AR kodierenden, wurden im Rahmen einer Masterarbeit mittels

Plasmidintegration deletiert (Hettwer, 2013). In diese Stämme wurde eine PA4739-

lacZ-Reportergenfusion in das Genom integriert und die Promotoraktivität durch

Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität ermittelt. Die Werte wurden jeweils mit der

Reportergenaktivität im WT und der ∆bphP-Mutante verglichen. Die Messung erfolgte

sowohl in der frühen stationären Phase (oD578 nm 2,5), als auch in der stationären

Phase (oD578 nm 3,5). Die Ergebnisse des genetischen screenings sind in

nachfolgender Tabelle zusammengefasst (Tab. 16). Die Werte der PA4739-lacZ-

Promotoraktivität in den Mutanten sind dabei relativ zur bestimmten Promotoraktivität

im WT dargestellt.

Ergebnisse

83

Tax. 16: Zusammenfassung der PA4739-lacZ-Promotoraktivität in den Mutanten-Stämmen

PA14_ Gennummer

1

Funktion1

Charakteristische Domäne

2

oD578nm 2,5 [%]

oD578 nm 3,5 [%]

∆bphP Bakteriophytochrom Histidinkinase-D 57 8

PA14_00430 Putativer AR RRR-D 49 103

PA14_02260 AR CheY2 CheY-D 68 31

PA14_03470H Hypothetisches Protein RRR-D - 137

PA14_05320 AR PilG CheY-D 76 114

PA14_05330 AR PilH CheY-D 77 97

PA14_07840 AR AgtR RRR-D 128 94

PA14_06060 AR CreB RRR-D 108 121

PA14_06950 Putativer Transkriptionsregulator RRR-D 57 84

PA14_09690 AR BifR RRR-D 124 94



PA14_12780 AR RocA1 RRR-D 61 95

PA14_12810 AR RocR EAL-D, RRR-D 61 125

PA14_15290 Putativer Transkriptionsregulator HTH-D 113 106


PA14_16500 AR WspR GGDEF-D 93 108

PA14_17670 AR ErdR RRR-D 77 94

PA14_20780 Hypothetisches Protein SpoIIE-D, RRR-D 48 72

PA14_22940 AR GltR RRR-D 62 73

PA14_23130 Hypothetisches Protein GGDEF-D 100 97

PA14_24350 AR CprR RRR-D 81 132

PA14_24710 AR RocA2 RRR-D 78 109

PA14_26570 Putativer Transkriptionsregulator HTH-D 69 113

PA14_26830H Putativer AR RRR-D 95 109

PA14_27810 AR CpoR RRR-D 101 120



PA14_27950 Hypothetisches Protein STAS-D 144 37

PA14_30580H Regulator VqsR HTH-D 76 66

PA14_30650 AR GacA RRR-D 104 88


PA14_31960 AR CzcR RRR-D 92 78


PA14_33920 Putativer Transkriptionsregulator RRR-D 107 108

PA14_38900 AR EraR RRR-D 82 89

PA14_38930H AR ErbR RRR-D 85 113

PA14_39360 Putativer Transkriptionsregulator σ

54-Interaktions-D,

HTH -D 97 85

PA14_41260 AR ParR RRR-D 79 111

PA14_41490 Hypothetisches Protein ANTAR-D 94 90

PA14_42970 Transkriptionsregulator Sfa2 σ

54-Interaktions-D,

HTH-D 107 90

PA14_43340H AR KdpE HTH-D 85 92

Ergebnisse

84

PA14_45620 AR CheY CheY-D 110 114




PA14_49180 AR PhoP RRR-D 77 100


PA14_50180 AR FleR RRR-D 102 82

PA14_50220 Transkriptionsregulator FleQ HTH-D 140 121



PA14_55810 AR PprB RRR-D 94 104



PA14_57140 Putativer AR GGDEF-D 129 86

PA14_58300 AR RoxR RRR-D 159 75

PA14_59770 AR RcsB RRR-D 121 106

PA14_60260 AR PilR RRR-D 113 79

PA14_62540 AR CbrB RRR-D 56 20

PA14_63150 AR PmrA RRR-D 77 106

PA14_63210 PDE RRR-D 107 107

PA14_65540 FimX EAL-D 92 100

PA14_64050 Putativer AR GGDEF-D 152 100

PA14_64570 AR IrlR HTH-D 95 110


PA14_67680 AR NtrC RRR-D 123 104

PA14_68250 AR DctD RRR-D 72 88

PA14_69470 AR AlgR RRR-D 78 89

PA14_70750 AR PhoB RRR-D 45 74


PA14_72720 AR MifR RRR-D 102 98

PA14_72380 AR AlgB σ

54-Interaktions-D,

RRR-D 102 93

Prozentuale Promotoraktivität von PA4739 im Vergleich zum WT

0 100 200 [%]

1:Annotierte PA14-Gennummern und Funktionen sind der Pseudomonas-Datenbank entnommen

(www.pseudomonas.com). 2: Durch die Pfam-Datenbank vorhergesagte Domänenstruktur (RRR-D: Empfängerdomäne eines

typischen ZKS mit N-terminaler DNA-bindender Effektordomäne; CheY-D: Phosphatempfänger-domäne; EAL: Phosphodiesterase-Motiv, GGDEF: Diguanylatzyklase-Motiv; STAS-D: Sulfat-Transporter- und Anti-Sigmafaktor Antagonist-Domäne; σ

54-Interaktions-D: σ

54-bindende Domäne;

SpoIIE: Domäne des Phase II Sporulationsproteins E; ANTAR: RNA-bindende Domäne) (www.pfam.sanger.ac.uk). H: Herstellung der Mutante sowie die Messungen erfolgten durch A. Hettwer (Hettwer, 2013).


http://www.pfam.sanger.ac.uk/

Ergebnisse

85

Anhand der durchgeführten Expressionsanalysen zur Regulation von PA4739

konnten in drei der 72 untersuchten Stämme eine signifikant reduzierte

Promotoraktivität im Vergleich zum WT beobachtet werden (Tab. 16). Die Induktion

der PA4739-lacZ-Fusion in der ∆PA14_02260- (cheY2), ∆PA14_27950- sowie

∆PA14_62540- (cbrB) Mutante war dabei im Schnitt um etwa 70 % reduziert

(Abb. 27).

Abb. 27: Aktivität der PA4739-lacZ-Reportergenfusion in verschiedenen PA14-Stämmen In die Genome des WTs sowie in die 72 Mutanten mit inaktivierten putativen AR wurde eine transkriptionelle PA4739-lacZ-Reportergenfusion integriert. Die Messung der Expression erfolgte durch Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität bei einer oD578 nm von 3,5. Dargestellt sind die Ergebnisse der drei Mutanten mit signifikant reprimierter Reportergenaktivität im Vergleich zum WT. Die Werte sind dabei relativ zum WT gesetzt.

Die verminderte Promotoraktivität der PA4739-Reportergenfusion der über einen

genetischen Screen identifizierten Regulatoren impliziert, dass diese in der

Signaltransduktionskaskade der Phytochrom-vermittelten Transkriptionsaktivierung

von PA4739 involviert sind. Der dabei identifizierte AR CbrB weist mit einer

Empfänger- und einer DNA-bindenden Domäne die strukturellen Charakteristika

eines typischen AR eines Zwei-Komponenten-Systems auf. Daher könnte CbrB die

Transkription von PA4739 direkt aktivieren. Hingegen besitzen CheY2 und

PA14_27950 keine DNA-bindende Region, wodurch eine direkte Transkriptions-

initiation von PA4739 ausgeschlossen werden kann. CheY2 gehört in die Klasse der

Ergebnisse

86

CheY-ähnlichen AR. Aufgrund der STAS-(Sulfat-Transporter und Anti-Sigmafaktor

Antagonist) Domäne ist PA14_27950 als putativer Anti-Sigmafaktor Antagonist

annotiert. Es ist jedoch bekannt, dass Proteine mit einer STAS-Domäne, durch

Phosphorylierung reguliert werden können (Aravind & Koonin, 2000).

3.1.4.2 Phosphorylgruppenübertragung auf die putativen Regulatoren

PaBphP besitzt mit dem C-terminalen Histidin-Kinase-Motiv das typische

Charakteristikum einer Zwei-Komponenten-Sensorkinase. Die Kinaseaktivität konnte

bereits in dieser Arbeit gezeigt werden (vgl. 3.1.1.4). Demzufolge besteht die

Möglichkeit einer Phosphorylgruppenübertragung auf die identifizierten Regulatoren.

Ob ein solcher Phosphotransfer stattfindet, wurde anhand von Transphosphorylier-

ungsexperimenten untersucht. Für die Durchführung dieser Analysen wurden

zunächst C-terminale Strep-tagII-Fusionskonstrukte zur heterologen Überproduktion

der putativen AR CheY, CbrB und PA14_27950 konstruiert und anschließend

affinitätschromatographisch gereinigt. Für diese Experimente wurde PaBphP

ebenfalls heterolog in E. coli synthetisiert. Um die Abhängigkeit der

Transphosphorylierung von der Bindung eines Chromophors zu untersuchen, wurde

sowohl das apo- als auch das holo-Phytochrom verwendet. Die Synthese des holo-

Phytochroms erfolgte über eine Coexpression mit dem Hämoxygenase-Gen bphO

ebenfalls heterolog in E. coli. Als Positivkontrolle diente die bereits nachgewiesene

Übertragung der Phosphorylgruppe von dem holo-Phytochrom aus

P. syringae pv. tomato DC3000 (holo-PsBphP1) auf den Phytochrom-AR aus

Deinococcus radiodurans (DrBphR) (Bhoo et al., 2001). Diese beiden Proteine

wurden ebenfalls heterolog überproduziert und isoliert. Das PsBphP1 wurde

zusammen mit der Hämoxygenase in einem Operon C-terminal mit einem His6-tag

fusioniert und als holo-Phytochrom isoliert (Shah et al., 2012). Der Phytochrom-AR

DrBphR wurde mit Hilfe eines C-terminal fusionierten His6-tags gereinigt

(Bhoo et al., 2001) (Abb. 28).

Ergebnisse

87

Abb. 28: SDS-PAGE-Analyse von heterolog überproduzierten und isolierten Proteinen verschiedener Phytochrome und Regulatoren (A) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (15 %) nach affinitätschromatographischer Reinigung mittels Strep-Tactin-Sepharose von CheY2, PA14_27950 und CbrB. (B) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (10%) nach affinitätschromatographischer Reinigung mittels Strep-Tactin-Sepharose von holo- und apo-PaBphP. (C) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (15 %) nach affinitätchromatographischer Reinigung mittels Ni-NTA von holo-PsBphP1 und DrBphR. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Die dargestellten SDS-PAGE-Analysen zeigen eine erfolgreiche Isolierung aller

Fusionsproteine. Bis auf CbrB, konnte ein Laufverhalten der Proteine entsprechend

der berechneten Größe beobachtet werden (Tab. 17). CbrB migrierte in der SDS-

PAGE bei etwa 60 kDa und weicht damit um etwa 7 kDa von der berechneten

molekularen Masse ab. Dieses divergente Laufverhalten konnte bereits in anderen

Arbeiten beobachtet werden (Abdou et al., 2011).

Tab.17: Berechnete molekulare Massen der überproduzierten und isolierten Proteine

Protein Berechnete molekulare

Masse [kDa]

CheY2 13,1

PA14_27950 17,7

CbrB 53,4

holo- / apo-BphP 80,8

holo-PsBphP1 82,2

DrBphR 15,6

Nach der Isolierung wurde zunächst eine mögliche Autophosphorylierung der

putativen Regulatoren bzw. die Kinaseaktivität der Phytochrome getestet. Diese

wurde durch die Inkubation mit radioaktiv markierten [γ32-P]-ATP mit anschließender

autoradiographischer Auswertung analysiert (Abb. 29).

Ergebnisse

88

Abb. 29: Kontrolle der Autophosphorylierungsaktivitäten verschiedener Phytochrome und Regulatoren

Autoradiogramm nach 20-minütiger Inkubation mit [γ32-P]-ATP der gereinigten Phytochrome, putative

AR CheY und CbrB, des putativen Anti-Sigmafaktor Antagonisten PA14_27950 sowie des Phytochrom AR DrBphR. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Auswertung erfolgte durch einen Phosphoimager. (*): ungefähr erwartete Bandenhöhe der Regulatoren.

Das resultierende Autoradiogramm zeigte deutliche Signale der autophosphorylierten

Phytochromproteine. Diese Kinaseaktivitäten deuteten darauf hin, dass die Proteine

in ihrer strukturell intakten Form gereinigt werden konnten. Die putativen AR CheY2

und CbrB sowie PA14_27950 und DrBphR wiesen hingegen wie erwartet keine

Autophosphorylierungsaktivität auf. Somit wurde im nächsten Schritt die

Transphosphorylierung untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Regulatoren jeweils

in einem Konzentrationsverhältnis von ~ 1:2 mit dem zuvor autophosphorylierten

Phytochrom inkubiert. Eine mögliche chromophorabhängige Phosphorylgruppen-

übertragung wurde durch die Verwendung von apo- (Abb. 30-A) bzw. holo-PaBphP

(Abb. 30-B) analysiert. Als Positivkontrolle diente der Transfer der Phosphorylgruppe

von holo-PsBphP1 auf DrBphR. Parallel wurde auch eine Übertragung von PaBphP

auf DrBhpR untersucht.

Ergebnisse

89

Abb. 30: Chromophorabhängige Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf die putativen Regulatoren

Autoradiogramm nach 20-minütiger Inkubation der zuvor mit [γ32-P]-ATP autophosphorylierten

Phytochrome mit den verschiedenen Regulatoren. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Auswertung erfolgte durch einen Phosphoimager. Als Positivkontrolle wurde jeweils das holo-PsBphP1 zusammen mit DrBphR inkubiert (Spur 2). Der PaBphP Negativkontrolle wurde jeweils kein Regulator zugegeben (Spur 6). (A) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von apo-PaBphP auf die putativen Regulatoren CheY2 (Spur 3), PA14_27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5). (B) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von holo-PaBphP auf die putativen AR CheY2 (Spur 3), PA14_27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5). (*): ungefähr erwartete Bandenhöhe der aufgetrennten Regulatoren.

Aus dem Autoradiogramm geht hervor, dass neben der Positivkontrolle, dem

Phosphotransfer von holo-PsBphP1 auf den Phytochrom-AR DrBphR, auch eine

Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf den AR DrBphR beobachtet

werden konnte. Dieser Transfer scheint dabei unabhängig einer Chromophorbindung

abzulaufen, da sowohl nach Inkubation mit apo- als auch mit holo-PaBphP der

Regulator phosphoryliert wurde. Hingegen konnte eine Übertragung der

Phosphorylgruppe von PaBphP auf putativen AR CheY2 und CbrB sowie

PA14_27950 nicht nachgewiesen werden.

Eine lichtunabhängige Autophosphorylierung der PaBphP-Kinaseaktivität konnte

bereits innerhalb dieser Arbeit gezeigt werden (vgl. 3.1.1.4). Aus der Literatur geht

weiterhin hervor, dass auch die Möglichkeit einer lichtregulierten Phosphoryl-

gruppenübertragung besteht (Bhoo et al., 2001). Daher wurden diese Versuche mit

holo-PaBphP in einem weiteren Ansatz unter definierten Hellrot- und

Dunkelrotlichtbedingungen durchgeführt. Parallel wurde ebenfalls die Trans-

phosphorylierung auf den AR aus D. radiodurans unter diesen Bedingungen näher

betrachtet (Abb. 31).

Ergebnisse

90

Abb 31: Lichtabhängige Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf die putativen Regulatoren

Autoradiogramm nach 20-minütiger Inkubation der zuvor mit [γ32-P]-ATP autophosphorylierten

Phytochrome mit den verschieden Regulatoren unter Dunkelrotlicht (750 nm; Generierung der Pr-Form) und Hellrotlicht (690 nm; Generierung der Pfr-Form). Die Proben wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Auswertung erfolgte durch einen Phosphoimager. Als Negativkontrolle diente jeweils das PaBphP ohne zugegebenen Regulator (Spur 1). (A) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von holo-PaBphP auf DrBphR (Spur 2), die putativen Regulatoren CheY2 (Spur 3), PA14_27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5) unter Dunkelrotlicht. (B) Autoradiogramm der Phosphorylgruppenübertragung von holo-PaBphP auf DrBphR (Spur 2), die putativen Regulatoren CheY2 (Spur 3), PA27950 (Spur 4) und CbrB (Spur 5) unter Hellrotlicht. (*): ungefähr erwartete Bandenhöhe der Regulatoren.

Die Ergebnisse des Autoradiogramms impizieren einen von den Lichtbedingungen

unabhängigen Transfer der Phosphorylgruppe von PaBphP auf DrBphR, da sowohl

für die Pr- als auch für die Pfr-Form eine Übertragung beobachtet wurde. Im

Gegensatz dazu konnte auch unter definierten Rotlichtbedingungen vermutlich kein

Phosphotransfer auf die putativen Regulatoren festgestellt werden.

In der Pr-Form des Phytochroms scheint eine Phosphorylgruppenübertragung auf

CheY2 stattzufinden (Abb. 31-A), jedoch nimmt die Signalstärke des

phosphorylierten PaBphPs nicht wie bei der Transphosphorylierung auf DrBphR ab.

Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich nicht um eine echte Phosphorylierung

von CheY2, sondern es sich dabei um freies [γ32-P]-ATP handeln könnte.

Ergebnisse

91

3.1.5 In vivo-Quervernetzung zur Identifikation von PaBphP

Interaktionspartnern

In den vorangegangenen Transphosphorylierungsexperimenten konnte keine direkte

Überragung der Phosphorylgruppe von PaBphP auf die potentiellen Regulatoren

nachgewiesen werden. Aus diesem Grund wurde die Suche nach putativen AR

alternativ durch eine sogenannte in vivo-Quervernetzung (crosslinking) weitergeführt.

Bei der Phosphorylgruppenübertragung kommt es zu einer transienten Interaktion

zwischen der Sensorkinase und dem dazugehörigen AR. Dieser Moment kann durch

quervernetzende Agenzien (crosslinker) fixiert werden. Darüber hinaus ist es

möglich, durch diese Methode weitere Interaktionspartner des Phytochroms zu

identifizieren. Diese Arbeiten wurden im Rahmen der Masterarbeit von A. Hettwer

durchgeführt (Hettwer, 2013). Die Fixierung der putativen Interaktionspartner erfolgte

durch die Verwendung zweier verschiedener homobifunktionaler, quervernetzender

Substanzen: Formaldehyd und 2-2-Dithiobis(succinylpropionat) (DSP). Beide

Reagenzien unterscheiden sich dabei sowohl in der Art, als auch in dem Abstand der

reaktiven Gruppen. Formaldehyd besitzt ein Aldehyd als reaktive Gruppe und kann

sowohl mit primären, sekundären Aminogruppen sowie den Seitenketten von Lysin

und Tryptophan binden. Durch die sehr kurze Länge des „spacer Arms“ von 2,3-2,7 Å

werden Proteine, die sich in unmittelbarer Umgebung zueinander befinden, fixiert.

DSP wiederum kennzeichnet sich durch eine Armlänge von 12 Å zwischen den NHS-

Estern als reaktive Enden aus und vernetzt primären Aminogruppen.

Für die Quervernetzung wurde PaBphP in PA14 in der stationären Phase homolog

überproduziert und anschließend die quervernetzenden Substanzen den Kulturen

zugegeben. Als Kontrolle dienten unbehandelte Ansätze. Nach dem Abstoppen der

Reaktion wurde PaBphP mit den gebundenen Proteinen mittels affinititäts-

chromatographischer Reinigung isoliert und tryptisch verdaut. Die Identifizierung der

gebundenen Peptide erfolgte massenspektrometrisch in Kooperation mit der NG

Mikrobielle Antibiotikaforschung, der Ruhr-Universität Bochum.

Die größte Klasse an identifizierten Proteinen beinhaltet ribosomale Proteine sowie

Elongationsfaktoren. Diese können weitgehend als physiologische Interaktions-

partner ausgeschossen werden und sind vermutlich auf die Überproduktion von

PaBphP während der Quervernetzung zurückzuführen. Unter Ausschluss dieser

Proteine sind die erhaltenen Ergebnisse in nachfolgender Tabelle (Tab. 18)

aufgeführt.

Ergebnisse

92

Tab. 18: Zusammenfassung der durch MS identifizierten Interaktionspartner von PaBphP nach der Quervernetzung mit Formaldehyd und DSP

Gennummer1 Funktion1 MG (kDa)1 Ident.

Peptide2

Theor.

Peptide2

PA14_10700F,D

PaBphP 80,8 6 14

Transkription

PA14_08780(rpoC) F

RNA-Polymerase β-UE 154,4 34 129

PA14_63170(cueR)D Transkriptionsregulator 15,0 4 17

Energiemetabolismus

PA14_01290(coxB)F Cytochrom-C-Oxidase-UE 42,2 6 30

PA14_24445 (gdhB)D

NAD-abhängige Glutamat-

Dehydrogenase 18,3 7 137

PA14_30190 (icd)F Isocitrat-Dehydrogenase 45,6 13 34

PA14_30380(galU)F

UTP-Glukose-1-phosphat-

Uridyltransferase 31,2 10 15

PA14_43940 (sucD)F Succinyl-CoA-Synthetase α-UE 41,5 4 12

PA14_43950 (sucC)F Succinyl-CoA-Synthetase β-UE 30,2 11 24

PA14_43970 (ipdG)F,D

Dihydrolipamin-Dehydrogenase 5,01 16 32

PA14_73290 (atpF)F,D

F0F1 ATP-Synthase UE B 16,9 11 15

Lipidstoffwechsel

PA14_23370 (orfK)F

UDP N-Acetylglucosamin-2-

Epimerase 42,9 13 38

PA14_43680 (fabA)F

3-Hydroxy-decanoyl ACP-

Dehydratase 18,7 6 13

Chaperone und Proteasen

PA14_01710 (ahpC)F Alkyl-Hyperoxydase 20,5 9 15

PA14_41230 (clpx)F

APT-abhängige Protease, ATP-

bindende UE 46,9 14 33

PA14_57010 (groEL)F Chaperon GroEL 57,0 3 10

PA14_62970 (dnaK)F Chaperon DnaK 68,4 4 23

PA14_66790 (hslU)F

ATP-abhängige Protease, ATP-

bindende UE 50,0 12 42

Andere funktionelle Klassen

PA14_16630 (lptF)D

Äußeres Membranprotein,

Lipotoxin F 28,5 3 16

PA14_23420F Dehydrogenase 77,9 20 50

PA14_36110F Hypothetisches Protein 36,1 8 30

PA14_41250F Triggerfaktor 48,5 3 61

PA14_41570 (oprF)D Vorstufe der Porin-Pore der

äußeren Membran

37,6 5 23

PA14_58730 (pilA)F,D

TypIV-Pilin-UE 18,0 5 10

PA14_60800F ABC-Transporter, ATP-

bindendesProtein

77,9 20 50



1: Gennummer, Funktion und molekulare Masse wurden der Pseudomonas-Datenbank entnommen

(www.pseudomonas.com). 2: Ident. Peptide: identifizierte Peptide; Theor. Peptide: Theoretische Anzahl an Peptiden nach dem

trypischen Verdau. F: mit Formaldehyd als quervernetzendes Reagenz identifiziert.

D: mit DSP als quervernetzendes Reagenz identifiziert.


Ergebnisse

93

Insgesamt wurden 53 putative Interaktionspartner mit Hilfe der massenspektro-

metrischen Analysen identifiziert. Durch den Einsatz von Formaldehyd als

quervernetzendes Reagenz wurden im Vergleich zu DSP deutlich mehr Peptide an

PaBphP gekoppelt (Tab.18). Dabei wurden 21 Proteine nach der Behandlung mit

Formaldehyd, hingegen nur sieben nach Zugabe von DSP, identifiziert. Eine

Überschneidung in beiden Ansätzen war nur bei drei Genprodukten der Fall

(PA14_43970/IpdG; PA14_73290/ AtpF; PA14_57830/PilA).

Generell sind die identifizierten Interaktionspartner des Phytochroms keiner

spezifischen funktionellen Gruppe zuzuordnen. So befinden sich unter den

potentiellen Interaktionspartnern verschiedene Enzyme des Energie- und

Lipidstoffwechels. Weiterhin konnte so auch der Transkriptionsregulator CueR als

möglicher AR für PaBphP aufgedeckt werden. Dabri handelt es sich um einen

Regulator des MerR-Typs und ist an der Kupferstress-Antwort beteiligt (Thaden et

al., 2010). Ebenfalls wurde eine Gruppe von Proteinen an PaBphP gekoppelt, die an

oder in der Membran lokalisiert sind. Darunter befindet sich auch das Protein

PA14_62690, das in PAO1 dem Genprodukt von PA4739 entspricht. Wie im

vorherigen Abschnitt dargestellt, wird die Transkription dieses Gens von PaBphP

reguliert.

Ergebnisse

94

3.1.6 Pull-down-Experimente zur Identifikation von PaBphP

Interaktionspartnern

Neben dem in vivo-crosslinking gehören Pull-down-Experimente zu den gängigsten

Methoden um unbekannte Protein-Protein-Interaktionen aufzudecken. Ziel war dabei

die detektierten Interaktionspartner der in vivo-Quervernetzung zu verifizieren. Für

den Pull-down-Ansatz wurde das heterolog in E. coli überproduzierte und isolierte

PaBphP durch das fusionierte Strep-tagII an Strep-Tactin-Sepharose immobilisiert.

Für die globale Analyse der Protein-Protein-Interaktion wurde PA14-Rohextrakt mit

den löslichen Proteinen aus der stationären Phase (oD578 nm 3,5) dem an die Matrix

gekoppelten PaBphP zugegeben und 20 min inkubiert. Die weiteren Schritte

erfolgten analog einer affinitätschromatographischen Reinigung mit anschließender

SDS-PAGE-Analyse. Es konnte jedoch weder das Phytochrom noch potentielle

Interaktionspartner nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis

implizierte, dass PaBphP in dem zugegebenen Rohextrakt nicht stabil war. Um diese

Vermutung näher zu analysieren, wurde „freies“ PaBphP 20 min mit Zelllysat

inkubiert. Der Nachweis des PaBphPs erfolgte immunologisch gegen das Strep-tagII

des Fusionsproteins (Abb. 32). Eine Detektion des Fusionsproteins war jedoch nach

Zugabe des Rohextrakts nicht mehr möglich. Daraus kann vermutet werden, dass

PaBphP nicht stabil in dem zugegebenen Lysat ist und impliziert eine mögliche

proteolytische Degradation des Proteins. Daher ist es nicht möglich, anhand von in

vitro-Experimenten in dieser Form putative Interaktionspartner von PaBphP zu

identifizieren.

Abb. 32: Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation mit PA14-Rohextrakt Nach 20-minütiger Inkubation von PaBphP mit PA14-Rohextrakt aus der stationären Phase (oD 578 nm 3,5) wurden die Proteine mittels SDS-PAGE separiert, auf eine PVDF-Membran transferiert und PaBphP durch immonologischer Nachweisverfahren gegen das Strep-tagII das Fusionsprotein detektiert. Es wurden 5 µg PaBphP und 15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat eingesetzt. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Ergebnisse

95

3.1.7 Proteolytischer Abbau von PaBphP

Die Protein-Protein-Interaktionsstudien mittels Pull-down-Experimenten deuteten

darauf hin, dass das Phytochrom nach Zugabe von Rohextrakt nicht stabil ist und

möglicherweise eines proteolytischen Abbaus unterliegt. Neben der Regulation der

Genexpression, ist eine posttranslationale Regulation durch verschiedene Proteasen,

einer der wichtigsten Regulationsmechanismen in einer Zelle. Die regulierte

Proteolyse ist sehr effektiv und verläuft wesentlich schneller ab, als eine Änderung

des Expressionsprofils (Jenal et al., 2003). Dadurch wird eine rasche Adaptation an

sich änderte Umweltbedingungen gewährleistet. Auch unterliegen synthetisierte

Proteine einer Qualitätskontrolle und fehltranslatierte Polypeptide werden daraufhin

degradiert (Gottesman, 2003). Neben dieser Qualitätskontrolle wird auch die

Quantität des Proteoms an die gegeben Umweltbedingungen angepasst.

Überschüssige oder gar toxische Proteine werden ebenfalls durch verschiedene

Proteasen degradiert (Gottesmann, 2003).

Für die weitergehenden Analysen einer möglichen Degradation von PaBphP wurden

zuvor einige Kontrollexperimente durchgeführt um einen möglichen unspezifischen

Abbau auszuschließen. Dabei wurde ein genereller Abbau überproduzierter Proteine,

mit dem Ursprung aus P. aeruginosa sowie aus anderen Organsimen, analysiert. In

allen Fällen blieben die Proteine in Rohextrakt aus PA14 stabil und konnten durch

SDS-PAGE oder durch immunologische Nachweisverfahren gegen den Fusions-tag

nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Die durchgeführten Untersuchen implizierten eine spezifische Degradation von

PaBphP durch eine oder mehrere Proteasen und wurde genauer untersucht.

PaBphP wird unter nativen Bedingungen zelldichteabhängig in der stationären Phase

gebildet. Um zu untersuchen, ob der Abbau ebenfalls mit der Populationsdichte

zusammenhängt, wurde PaBphP mit Rohextrakt aus verschiedenen

Wachstumsphasen inkubiert. Dabei wurden jeweils 5 µg des Phytochroms sowie

15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat eingesetzt und die Reaktion nach 20 min durch

Zugabe von SDS-Probenpuffer und 10-minütiger Inkubation bei 95 °C gestoppt. Die

Analyse erfolgte durch eine immunologische Detektion gegen das fusionierte

Strep-tagII (abb. 33). Anhand dieser Analyse geht hervor, dass eine Degradation von

PaBphP erst bei Erreichen der stationären Phase, in der das Phytochrom unter

nativen Bedingungen exprimiert wird, stattfindet. Der proteotytische Abbau beginnt

Ergebnisse

96

ab einer oD578 nm von 2,5 und bei Zugabe von Lysat ab einer oD578nm von 3,5 ist nach

20-minütiger Inkubation kein Fusionsprotein mehr nachweisbar.

Abb. 33. Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation von PA14-Rohextrakt aus verschiedenen Wachstumsphasen Eine zelldichteabhängige Degradation von PaBphP wurde durch eine 20-minütige Inkubation von PaBphP und PA14-Rohextrakt aus verschiednen Wachstumsphasen analysiert. Die Detektion von PaBphP erfolgte mittels immunologischer Nachweisverfahren gegen das Strep-tagII des Fusionsproteins. Es wurden jeweils 5 µg PaBphP und 15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat eingesetzt. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Weiterhin wurde mittels einer Zeitreihe die Halbwertszeit von PaBphP in Rohextrakt

bestimmt (Abb. 34). Hierfür wurde Rohextrakt aus der stationären Phase

(oD578 nm 3,5) verwendet. Der Abbau von PaBphP ist sehr rasch und bereits nach

wenigen Minuten ist kein Fusionsprotein mehr detektierbar. Die Halbwertszeit von

PaBphP in Rohextrakt unter diesen Bedingungen beträgt etwa 5 min.

Abb. 34. Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation von PA14-Rohextrakt nach verschiedenen Zeitpunkten Um die Halbwertszeit von PaBphP zu bestimmen wurde 5 µg PaBphP mit 15 µg Gesamtprotein aus Zelllysat (oD 578 nm 3,5) inkubiert und nach verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen. Der Nachweis von PaBphP erfolgte immunologisch gegen dass Strep-tagII des Fusionsprotein. K: Kontrolle, PaBphP ohne Lysatzugabe; M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Proteasen werden im Allgemeinen aufgrund ihrer Aktivitäten und ihrem

Katalysemechanismus in vier Klassen eingeteilt: Serin-, Cystein-, Apartat- und

Metalloproteasen. Welche Art von Protease/n für die Degradation von PaBphP

verantwortlich ist, wurde durch Zugabe verschiedener Inhibitoren analysiert. Der

verwendete Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche) blockiert die Aktivität von Serin-

sowie Cystein-Proteasen, wohingegen EDTA als Metallchelator die Aktivität von

Metalloproteasen hemmt. Um den Effekt dieser Inhibitoren auf die Stabilität von

Ergebnisse

97

PaBphP zu untersuchen, wurden den Ansätzen aus 5 µg Phytochrom und 15 µg

Gesamtprotein aus Zelllysat, der Protease-Inhibitor-Cocktail nach Angaben des

Herstellers, bzw. 20 mM ETDA zugefügt.

Nach einer 20-minütigen Inkubation erfolgte die immunologische Detektion des

Strep-tagII des PaBphP-Fusionsproteins (Abb. 35). Ohne Zugabe eines Inhibitors

wurde PaBphP fast vollständig abgebaut. Eine Blockierung der Serin- und Cystein-

Proteasen, durch einen Protease-Inhibitor-Cocktail, führte ebenfalls zu einer fast

vollständigen, jedoch verzögerten Degradation von PaBphP. Dies lassen die

zahlreichen detektierten Abbau-Fragmente vermutet. Die Chelierung aller Metalle im

Rohextrakt durch EDTA führt zu einer deutlich erhöhten Stabilität von PaBphP.

Jedoch konnte dadurch der Abbau nicht vollständig inhibiert werden.

Abb. 35: Immunologische Detektion von PaBphP nach Inkubation von PA14-Rohextrakt mit verschiedenen Proteaseinhibitoren Der Einfluss von verschiedenen Proteasen-Inhibitoren auf die Stabilität von PaBphP in PA14-Rohextrakt wurde durch Zugabe eines Protease-Inhibitor-Cocktails (Roche, nach Angaben des Herstellers) und bzw. EDTA (20 mM) analysiert. Es wurden jeweils 5 µg PaBphP und 15 µg Gesammtprotein aus Zelllysat (oD578 nm 3,5) eingesetzt. Nach einer 20-minütigen Inkubation erfolgte die Detektion von PaBphP immunologisch gegen das Strep-tagII des Fusionsproteins. K: Kontrolle ohne Lysat; M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Es handelt sich den Analysen zufoge um mindestens eine metallabhängige

Protease, die an der Degradation von PaBphP beteiligt ist. Eine Beteiligung weiterer

Serin- und Cystein-Protasen kann jedoch nicht ausgeschlossen werden.

Bei den vorliegenden Daten handelt es sich in allen Fällen um in vitro-Experimente.

Ob PaBphP ebenfalls in der lebenden Zelle eines Abbaus unterliegt, wurde anhand

einer in vivo-Degradation analysiert. Dies wurde auf der Basis einer homologen

Ergebnisse

98

Überproduktion von PaBphP in PA14 durchgeführt. Durch eine Inhibierung der

Translation und der anschließenden quantitativen Analyse des Proteins über eine

immunologische Detektion lassen sich Rückschlüsse auf eine mögliche vorliegende

Degradation ziehen. Die homologe Überproduktion in PA14 wurde in der stationären

Phase bei einer oD578 nm von 3,5 induziert und nach 30-minütiger Inkubation die

Translation aller Proteine durch Zugabe des Antibiotikums Gentamicin inhibiert.

Durch die Bindung von Gentamicin an die ribosomale 30S-Untereinheit wird die

Synthese sämtlicher Proteine blockiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden der

Kultur Proben entnommen und wie zuvor durch den immunologischen Nachweis

gegen das Strep-tagII analysiert (Abb. 36).

Abb. 36: In vivo-Degradation von PaBphP Immunologische Detektion gegen das Strep-tagII des PaBphP-Fusionsproteins. Die homologe Überproduktion von PaBphP in PA14 wurde durch Zugabe von 0,75 % (w/v) Arabinose bei einer oD578 nm von 3,5 induziert. Nach 30 min wurde die Translation durch Zugabe von Gentamicin (400 µg/ml) gestoppt und zu verschiedenen Zeitpunkten der Kultur Proben entnommen. M: Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas).

Analog zu den in vitro-Untersuchungen, konnte in vivo ebenfalls eine Degradation

nachgewiesen werden. Diese verläuft in gleicher Weise sehr schnell ab und nach

etwa 15 min nach Abstoppen der Translation ist PaBphP nicht mehr detektierbar.

Ergebnisse

99

Kapitel II

3.2.1 Die Transkriptionsregulation von nbdA

Neben der Wahrnehmung von Licht durch Photorezeptoren, ist es für Organismen

ebenso von großer Bedeutung auf vorherrschende Gase zu reagieren. Ähnlich wie

bei der Adaptation an verschiedene Lichtbedingungen, müssen Organsimen ihren

Metabolismus ebenfalls dahingehend anpassen. In P. aeruginosa wird

beispielsweise Sickstoffmonoxid (NO) durch den Denitrifikationsprozess unter

anaeroben Bedingungen freigesetzt. Dieses Gas spielt vor allem innerhalb einer

Lebensgemeinschaft in Biofilmen eine Rolle. Durch die im inneren der Matrix

liegenden, anaerob wachsenden Zellen wird dieses Gas freigesetzt und führt ab

einem gewissen Schwellenwert zur Auflösung des Biofilms. Der Prozess der

Biofilmbildung- und auflösung wird unter anderem durch den second messenger

c-di-GMP reguliert. Dabei geht eine hohe Konzentration mit einer sesshaften in

Biofilmen, eine geringen mit einer motilen Lebensweise einher (Merritt et al., 2007).

Der Aufbau von c-di-GMP wird durch Diguanylatzyklasen (DGC), der Abbau von

Phosphodiesterasen (PDE) katalysiert

In Kooperation mit Prof. Dr. Karin Sauer der Binghampton University, USA wurde die

erste PDE in P. aeruginosa identifiziert, die durch Stimulation von NO an der

Biofilmauflösung beteiligt sein könnte. Basierend auf dieser Eigenschaft wurde das

Protein NbdA (NO-induced biofilm disperion locus A) benannt (Li et al., 2013). NbdA

ist durch die N-terminal lokalisierte MHYT-Domäne, die putativ das Gas wahrnehmen

kann und darüber die enzymatische Aktivität der PDE steuern könnte,

gekennzeichnet. Interessanterweise deckten Messungen der mRNA-Menge von

nbdA anhand von qRT-PCR-Experimenten eine erhöhte Transkription des Gens

nach einer NO-Zugabe auf. Der Einfluss des Gases auf die nbdA-Expression konnte

dabei sowohl in planktonisch lebenden Zellen, vor allem jedoch in den aufgelösten

Zellen, gezeigt werden (Li et al., 2013).

Unklar war bisher jedoch, wie die Transkription von nbdA dabei reguliert wird und

wurde daher in der vorliegenden Arbeit näher untersucht. Die Messungen erfolgten

zunächst in planktonisch wachsenden Zellen. Dies sollte Grundlage für weitere

Analysen unter Biofilmbedingungen schaffen.

Ergebnisse

100

3.2.1.1 Identifikation des Transkriptionsregulators

Bis heute gibt es nur wenig beschriebene Transkriptionsregulatoren in P. aeruginosa

die direkt mit NO interagieren. In der Regel ändern diese Regulatorproteine nach

Bindung des Gas-Liganden ihre Konformation und wirken dann regulierend auf die

Expression spezifischer Gene. Darunter befindet sich z.B. NsrR, ein Mitglied der Rrf2

Familie (Rodionov et al., 2005). Diese Klasse an Regulatoren fungiert jedoch als

Repressoren und NsrR kann daher vermutlich als Regulator von nbdA

ausgeschlossen werden. Der bekannteste NO-bindende Transkriptionsaktivator DNR

ist an der Regulation der Denitrifikation unter anaeroben Bedingungen beteiligt. DNR

induziert die Expression der Gene nirS, nirQ, norBC und nos, wodurch die

Nitratatmung gewährleistet wird (Rodionov et al., 2005). Diese Regulation ist schon

sehr gut verstanden und es ist bekannt, dass DNR an hochkonservierte

Konsensussequenzen an die DNA bindet. Eine Regulation von DNR kann aufgrund

dieser fehlenden Sequenz im Promotorbereich von nbdA auch weitgehend

ausgeschlossen werden. Zu einer weiteren wichtigen Klasse der NO-bindenden

Transkriptionsaktivatoren zählt FhpR. Dieser Transkriptionsregulator induziert das

Gen fhp. Dies kodiert für ein Flavohämoglobin, das an der NO-Detoxifizierung unter

aeroben Bedingungen beteiligt ist (Arai et al., 2005). Neben einer direkten Regulation

durch einen dieser genannten Transkriptionsfaktoren, die NO wahrnehmen können,

besteht ebenfalls die Möglichkeit einer indirekten Aktivierung. Eine solche indirekte

Regulation kann beispielsweise durch die QS-Systeme erfolgen. Diese haben sowohl

beim Aufbau des Biofilms, als auch bei der Auflösung einen bedeutenden Einfluss

durch die Regulation vieler biofilmassoziierter Genprodukte. Dabei sind vor allem die

beiden QS-Regulatoren LasR und RhlR involviert (de Kievit, 2009).

Um die Regulation von nbdA näher zu untersuchen, wurde eine transkriptionelle

lacZ-Reportergenfusion des Promotorbereichs von nbdA erstellt und in das Genom

des PAO1-WT integriert. Um eine mögliche Regulation durch FhpR bzw. den QS-

Regulatoren LasR und RhlR zu untersuchen, wurde die nbdA-lacZ-Reportergen-

fusion ebenfalls in die entsprechenden Mutantenstämme integriert. Bereits

vorliegende Daten belegen eine stationärphasenabhängige Expression von nbdA

(Heine, 2009). Basierend darauf wurde die Reportergenaktivität der nbdA-lacZ-

Fusion im WT und in einer ∆fhpR-, sowie ∆lasR- und ∆rhlR-Mutante durch

Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität nach einer 8-stündigen Anzucht und

Erreichen der stationären Phase ermittelt. Die Messungen der Reportergenaktivität

Ergebnisse

101

wurden sowohl unter aeroben Bedingungen, als auch unter sauerstofflimitierenden

Bedingungen durchgeführt (Abb. 37). Die Promotoraktivität von nbdA im weißt im WT

keinen Unterscheid unter aeroben und sauerstofflimitierenden Bedingungen auf.

Weiterhin scheinen unter aeroben Bedingungen weder FhpR, noch die QS-

Regulatoren LasR und RhlR einen Einfluss auf die Expression von nbdA zu haben

(Abb. 37-A). Ebenfalls ist die Reportergenaktivität unter sauerstofflimitierenden

Bedingungen durch das Fehlen der QS-Regulatoren LasR und RhlR unverändert

zum WT. Im Gegensatz dazu konnte eine etwa 60 % reduzierte Aktivität der nbdA-

lacZ-Fusion in der ∆fhpR-Mutante beobachtet werden (Abb.37-B).

Abb. 37: Promotoraktivität von nbdA in verschiedenen Deletionsmutanten Für die Untersuchung einer QS-abhängigen Regulation durch RhlR und LasR bzw. durch den Transkriptionsregulator FhlR wurde eine trankriptionelle nbdA-lacZ-Reportergenfusion in die Genome des PAO1 WT sowie einer ∆rhlR-, ∆lasR- und ∆fhpR-Mutante integriert. Die Messung erfolgte nach einer 8-stündigen Inkubation durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität. (A) ß-Galaktosidaseaktivität der nbdA-Reportergenfusion im WT und den Mutanten unter aeroben Bedingungen. (B) ß-Galaktosidaseaktivität der nbdA-Reportergenfusion im WT und in den Mutanten unter sauerstofflimitierenden Bedingungen.

Anhand dieser Untersuchungen kann ein Einfluss auf die Expression von nbdA durch

das QS-Systems weitgehend ausgeschlossen werden. Hingegen impliziert die stark

verringerte Reportergenaktivität in der ∆fhpR-Mutante unter sauerstoffarmen

Bedingungen, eine FhpR-vermittelte Transkriptionskontrolle und wurde im Hinblick

darauf weiter charakterisiert.

Ergebnisse

102

3.2.1.2 Charakterisierung der Regulation von nbdA durch FhpR

FhpR besitzt neben einer GAF-Domäne, über die das NO-Gas registriert wird, eine

σ54-Interaktions- sowie eine DNA-Bindedomäne. FhpR ist somit ein Transkriptions-

aktivator für die σ54-assoziierte RNA-Polymerase. Die Transkriptionsinitiation ist

daher ebenfalls von diesem alternativen Sigmafaktor (RpoN) abhängig. Dies konnte

bereits für die Transkriptionsaktivierung von fhp gezeigt werden (Arai et al., 2005).

Um zu untersuchen, ob dies auch für die Expression von nbdA zutrifft, wurde die

Reportergenfusion in eine ∆rpoN-Mutante eingebracht und nach einer 8-stündigen

Anzucht unter sauerstofflimitierenden Bedingungen die Promotoraktivität über die

Messung der ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt (Abb. 38). Im Gegensatz zur

vorherigen Messung in einer ∆fhpR–Mutante wurde ein WT-ähnliches

Expressionsprofil in der ∆rpoN-Mutante ermittelt. Daraus kann vermutete werden,

dass der alternative Sigmafaktor keinen Einfluss auf die Trankription von nbdA hat.

Abb. 38: Vergleichende Promotoraktivität von nbdA im WT und einer ∆rpoN-Mutante Für die Untersuchung einer RpoN-abhängigen Promotorinduktion von nbdA wurde eine transkriptionelle lacZ-Reportergenfusion in das Genom des PAO1 WT sowie einer ∆rpoN-Mutante integriert. Die Messung erfolgte nach einer 8-stündigen Inkubation durch die Bestimmung der ß-Galaktosidaseaktivität.

Weiterhin ist bekannt, das die Expression von fhp bei einer erhöhten

NO-Konzentration unter sauerstofflimitierenden Bedingungen induziert wird (Arai et

al., 2005). Die in Kooperation durchgeführten qRT-PCR-Messungen zur

Quantifizierung der nbdA-mRNA-Menge wurde ebenfalls bereits eine NO-induzierte

nbdA-Transkription beobachtet (Li et al., 2013). Diese Messungen sollten im Rahmen

dieser Arbeit unabhängig durch die alternative Methode der Reportergenanalyse

verifiziert werden. Hierfür wurden die Kulturen mit verschiedenen NO-Donoren

Ergebnisse

103

versetzt. Zum einen wurde dazu Natriumnitroprussid (SNP), welcher in den qRT-

PCR-Experimenten eingesetzt wurde, sowie die NO-Donoren S-Nitroglutathion

(GSNO) und 6-(2-Hydroxy-1-Methyl-Nitrohydrazion)-N-Methyl-1-Hexamin (NONOate)

verwendet. Diese unterscheiden sich sowohl in der zeitlichen Freisetzung der NO-

Moleküle, als auch in dem molekularen Ablauf des NO-Freisetzungsprozesses. Zur

Analyse, ob NO einen Effekt auf die Promotoraktivität von nbdA hat, wurden den

Kulturen nach einer 6-stündigen Anzucht die NO-Donoren zugegeben. Es wurden zu

verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen und die Reportergenaktivität

analysiert. Es wurden dabei verschiedene Konzentrationen der NO-Donoren

eingesetzt und die Messungen ebenfalls in definiertem Minimalmedium durchgeführt.

Jedoch konnte unter keinen Bedingungen eine Steigerung der Reportergenaktivität

festgestellt werden. In Abb. 39 ist beispielhalt die Messung durch die Zugabe von 50

µM NONOate gezeigt. Diese Ergebnisse implizieren, dass unter den gewählten

Bedingungen NO keinen Einfluss auf die Expression von nbdA hat.

Abb. 39: Promotoraktivität von nbdA im WT unter Zugabe von 50 µM des NO-Donors NONOate Für die Untersuchung der Promotoraktivität von nbdA in Anwesenheit von NO wurde eine transkriptionelle nbdA-lacZ-Reportergenfusion in das Genom des PAO1 WT integriert. Nach einer 6-stündigen Inkubation wurde der Kultur 50 µM des NO-Donors NONOate zugegeben und zu verschiedenen Zeiten Proben entnommen und die ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt. Als Kontrolle diente eine unbehandelte Kultur.

Neben einer NO-induzierten Expression von fhp, kann ebenfalls eine Zunahme der

Transkription durch Nitrat und Nitrit erfolgen. Eine mögliche Induktion der nbdA-

Ergebnisse

104

Expression wurde dahingehend ebenfalls untersucht. Dafür wurden den Kulturen

nach einer 6-stündigen Inkubation 5 mM NO2 bzw. 20 mM NO3 zugegeben. Die

dargestellten Messungen in Abb. 40 zeigen die Reportergenaktivität nach einer

Inkubationsdauer von 1 h. Eine Änderung der Aktivität der nbdA-Reportergenfusion

im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle wurde nicht detektiert. Auch eine

verlängerte Inkubationsdauer, sowie die Verwendung eines definierten

Minimalmediums zeigten keinen signifikanten Unterschied zu dem dargestellten

Ergebnis.

Abb. 40: Promotoraktivität von nbdA im WT unter Zugabe von NO2 und NO3 Für die Untersuchung der Promotoraktivität von nbdA in Anwesenheit von NO2 bzw. NO3 wurde eine transkriptionelle nbdA-lacZ-Reportergenfusion in das Genom von PAO1 WT integriert. Nach einer 6-stündigen Inkubation wurde den Kulturen 5 mM NO2 bzw. 20 mM NO3 zugegeben, nach 1 h Proben entnommen und die ß-Galaktosidaseaktivität bestimmt. Als Kontrolle diente eine unbehandelte Kultur.

Diskussion

105

4. Diskussion

Kapitel I

Phytochrome sind eine weitverbreitete Klasse von Rotlichtrezeptoren, deren

Vorkommen und Funktion vor allem bei Pflanzen gut verstanden ist. Der rasante

Fortschritt auf dem Gebiet der Genomsequenzierung führte seit Mitte der 90er Jahre

zur Aufdeckung von Phytochrom-Homologen auch in Cyanobakterien, Pilzen und

heterotrophen Bakterien. Vor allem in Organismen, die nicht zu einer oxygenen

Photosynthese befähigt sind, ist die physiologische Rolle von Rotlichtsensoren bis

heute nahezu ungeklärt. Das nosokomiale Pathogen P. aeruginosa gehört zu den

ersten nicht-photosynthetischen, heterotrophen Organismen, in denen ein

Phytochrom identifiziert wurde. Bisherige funktionale Analysen wurden jedoch

ausschließlich anhand von heterolog produziertem PaBphP in vitro durchgeführt und

auch konnte die physiogische Bedeutung des Photorezeptors bisher nicht eindeutig

geklärt werden (Tasler et al., 2005; Barkovits et al., 2008; Barkovits et al., 2011). Um

die Besonderheit eines Phytochroms in diesem heterotrophen Organismus

ganzheitlich verstehen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit neben der

biochemischen Charakterisierung von homolog produziertem PaBphP und

phänotypischen Untersuchungen von Deletionsmutanten, ebenfalls die genetische

Regulation sowie die weiterführende intrazelluläre Signaltransduktionskaskade

analysiert.

4.1.1 P. aeruginosa besitzt ein funktionelles Phytochrom

In früheren Untersuchungen konnte anhand von rekombinant hergestelltem PaBphP

bereits die Funktion eines Rotlichtrezeptors sowie eine Kinaseaktivität nachgewiesen

werden (Tasler et al., 2005). Da sich durch in vitro-Studien gewonnene Erkenntnisse

jedoch nicht immer analog auf den lebenden Organismus übertragen lassen, wurde

das Phytochrom in dieser Arbeit erstmals mittels einer chromosomal integrierten

Strep-tagII-Fusion homolog unter der Kontrolle seines nativen Promotors isoliert. Die

anschließende Analyse der spektralen Eigenschaften ergaben Absorptionsmuster,

wie sie bereits für das heterolog produzierte PaBphP beobachtet wurden

Diskussion

106

(Tasler et al., 2005). Die ermittelten Absorptionsmaxima bei 700 nm und 754 nm sind

typisch für bakterielle Phytochrome, die Biliverdin zur Assemblierung eines holo-

Phytochroms nutzen (Bhoo et al., 2001).

Biliverdin (BV) ist das Produkt einer enzymatischen Spaltung von Häm durch eine

Hämoxygenase. Im Gegensatz zu allen anderen sequenzierten Bakterienarten,

besitzt P. aeruginosa mit BphO und HemO zwei solcher Hämoxygenasen, die Häm

regiospezifisch zu BV IXα bzw. BV IXβ und BV IXδ spalten können (Ratliff et al.,

2001; Wegele et al., 2004).

Die Isolierung und spektroskopische Analyse von homolog produziertem PaBphP

aus den entsprechenden ∆bphO- und ∆hemO-Deletionsmutanten ergab, dass

BV IXα der native Chromophor des Phytochroms aus P. aerugionsa ist. Dies stimmt

mit den Daten für das heterolog gereinigte PaBphP überein (Tasler et al., 2005). Im

Gegensatz dazu konnte eine Bindung von BVI Xδ an PaBphP (Tasler et al., 2005),

für das homolog isolierte Phytochrom nicht betätigt werden. Diese Diskrepanz ist

vermutlich darauf zurückzuführen, dass es sich bei Tasler et al, um einen in vitro-

Versuch handelte, bei dem der Chromophor im Überschuss vorlag.

Bei der Katalyse von Häm zu BV wird das zentrale Eisenatom des Häms freigesetzt.

Untersuchen zur Funktion von HemO zeigten, dass durch diese Hämoxygenase

extrazellulär importiertes Häm unter Eisenmangelbedingungen gespalten wird und

der Gewinnung des divalenten Kations dient (Ratliff et al., 2001). Die dabei

entstanden BV-Isomere BV IXβ und BV IXδ, nicht aber BV IXα, können zudem im

Kulturüberstand nachgewiesen werden (Barker et al., 2012). Es kann daher vermutet

werden, dass die Assemblierung von BV IXδ an PaBphP nur in vitro stattfindet und

für P. aeruginosa in vivo keine physiologische Relevanz hat.

Die durchgeführten spektroskopischen Analysen zeigten weiterhin eine

unvollständige Photokonversion in die Pfr-Form. Die Bedeutung dieser Pfr-

angereicherten Form ist bisher noch ungeklärt, wurde aber ebenfalls für andere

Rotlichtrezeptoren beschrieben. So zeichnet sich beispielsweise das Phytochrom aus

A. tumefaciens AtBphP2 sowie Avp1 aus A. vitis S4 durch eine distinkte Pr- und eine

Pfr-angereicherte Form aus (Karniol & Vierstra, 2003; Rottwinkel et al., 2010). Die

Pfr-angereicherte Form ist zugleich der Grundzustand von PaBphP, d.h. die Form in

der das Phytochrom ohne Bestrahlung vorlieg. Diese sogenannte bathy-Grundform

wurde bereits bei mehreren bakteriellen Phytochromen nachweisen, vor allem in

Organismen der Ordnung Rhizobiales (Rottwinkel et al., 2010). Durch die

Diskussion

107

symbiontische Lebensart mit Pflanzen bekommen diese Organismen wenig Licht,

wodurch sich die langwellige Grundform entwickelt haben könnte. P. aeruginosa als

ubiquitär vorkommender Organismus ist nahezu in allen ökologischen Nischen

anzutreffen. Licht längerer Wellenlänge hat eine weitere Reichweite in den Boden als

kurzwelliges Licht (Smith, 1982). So könnte das PaBphP aus ähnlichen Gründen, wie

einige Rhizobiales, die in der Erbe leben, eine dunkelrotlichtabsorbierende

Grundform entwickelt haben, die gewähreistet auch auf Licht zu reagieren, wenn sie

sich nicht direkt an der Oberfläche befinden.

Die gewonnene Proteinmenge des synthetisierten Phytochroms unter der Kontrolle

des nativen Promotors war mit einer Konzentration von 25 µg/l Zellkultur sehr gering.

Unter Berücksichtigung der Verunreinigungen kann eine theoretische Menge von

~52 Molekülen PaBphP pro Zelle in P. aeruginosa in der stationären Phase

berechnet werden. Das Phytochrom Cph1 aus Synechocystis sp. wurde unter ähnlich

nativen Bedingungen isoliert und Berechnungen zufolge befinden sich etwa 23

Moleküle des Rotlichtrezeptors in jeder Zelle (Hübschmann et al., 2001). Für die

Phytochrome aus A. tumefaciens werden, basierend auf spektroskopischen Analysen

des Zellextraktes unter Einbezug des molaren Extinktionskoeffizienten der Pr- und

Pfr-Form, zehn für das AtBphP1 und 19 Moleküle für das AtBphP2 pro Zelle

postuliert (Oberpichler et al., 2006). Die Autoren geben jedoch zu bedenken, dass

aufgrund der angewandten Methode nicht auszuschließen ist, dass sich ein Teil der

Phytochromproteine in der unlöslichen Fraktion befand. Da mittels immunologischen

Nachweisverfahren sichergestellt wurde, dass sämtliches PaBphP löslich war, kann

eine derartige Messungenauigkeit hier ausgeschlossen werden.

Bakterielle Rotlichtrezeptoren sind in der Regel Sensorproteine eines typischen Zwei-

Komponenten-Systems (Bhoo et al., 2001). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt

werden, dass das Phytochrom aus P. aeruginosa zwar die spektralen Eigenschaften

mit anderen untersuchten Rotlichtrezeptoren teilt, sich jedoch hinsichtlich der

Kinaseaktivität unterscheidet. So scheint die Autophosphorylierung von PaBphP

nicht von einer Chromophorbindung oder den vorherrschenden Lichtbedingungen

abhängig zu sein. Generell sind Phytochrome zwar im klassischen Sinne

Photorezeptoren, jedoch kann ihre Kinaseaktivität auch durch weitere Stimuli

reguliert werden. Das Phytochrom AtBphP1 aus A. tumefaciens z.B. weist neben

Licht ebenfalls eine temperaturabhängige Modulation der

Diskussion

108

Autophosphorylierungsaktivität auf. Dabei ist die Kinaseaktivität bei 25 °C am

höchsten und sinkt mit zunehmender Temperatur (Njimona et al., 2011). Die

Analysen zur Kinaseaktivität von PaBphP wurden bisher jedoch nur bei RT

durchgeführt. Eine temperaturbedingte Regulation ist für ein ubiquitär verbreitetes

Bakterium wie P. aeruginosa durchaus möglich und könnte in zukünftigen Studien

untersucht werden. Es ist auch weiterhin nicht auszuschließen, dass PaBphP

generell phosphoryliert vorliegt. Dies könnte z.B. durch SDS-PAGE-Analysen unter

Zugabe von Phos-tagTM geklärt werden. Phos-tagTM bindet spezifisch phosphorylierte

Gruppen und verändert so das Laufverhalten der Proteine in einer SDS-PAGE. Der

Vergleich von dephosphorylierten PaBphP, durch Behandlung mit alkalischer

Phosphatase, und dem nativ isolierten Protein könnte diese Frage klären.

4.1.2 Die Transkriptionsregulation des Phytochroms aus PA14 ist

komplex

Um ein besseres Verständnis für die Rolle von PaBphP in P. aeruginosa zu erlangen,

sollten im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von Promotorstudien detaillierte Einblicke in

die Transkriptionsregulation des Phytochroms gewonnen werden. Zu Beginn der

Arbeit war bereits bekannt, dass die für die Ausbildung eines holo-Phytochroms

kodierenden Gene bphO und bphP in einem bicistronischen Operon organisiert sind,

dessen Transkription unter der Kontrolle von RpoS steht (Barkovits et al., 2008). Die

in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Daten deuten jedoch auf eine weitaus

komplexere Regulation der Phytochromkomponenten hin.

4.1.2.1 bphP besitzt einen eigenen Promotor

Die durchgeführten Promotorstudien deckten erstmals eine von bphO unabhängige

Expression für bphP auf. Die Induktion des Promotors ist analog zu dem bphOP-

Cotranskript zelldichteabhängig und in der stationären Phase maximal. Die

postulierte Regulation durch den übergeordneten QS-Regulator LasR (Schuster et

al., 2004; Gilbert et al., 2009) konnte anhand der durchgeführten Reportergenstudien

einer bphP-lacZ-Fusion in einer ∆lasR-Mutante nachgewiesen werden. Die in diesem

Zusammenhang beschriebene putative LasR-Bindestelle, in dem intergenischen

Diskussion

109

Bereich zwischen bphO und bphP, wurde mittels DMSA-Studien mit isoliertem LasR

überprüft. Es wurde jedoch keine Bindung des Regulatorproteins an die postulierte

DNA-Bindestelle nachgewiesen. Die mit Hilfe von bekannten LasR-Bindestellen

ermittelte Konsensussequenz weist zudem lediglich eine geringe Homologie zu

diesem Bereich auf (Gilbert et al., 2009). Daher ist anzunehmen, dass die

Transkriptionskontrolle von bphP durch LasR indirekt erfolgt. Weitere

Untersuchungen in Form von Reportergenanalysen sollten dahingehend näheren

Aufschluss über die beteiligten Regulatoren geben.

Aufgrund der Netzwerk-Architektur der QS-Systeme in P. aeruginosa ist LasR unter

anderem an der Expressionskontrolle von rhlR beteiligt. RhlR ist, wie LasR, ein

Transkriptionsregulator für viele Gene, deren Produkte die Pathogenität von

P. aeruginosa vermitteln. Weiterhin unterliegt auch rpoS, der alternative Sigmafaktor

der stationären Phase, einer Regulation durch RhlR.

Es wurde zwar eine verringerte Aktivität der bphP-Reportergenfusion in einer ∆rhlR-

Mutante festgestellt, jedoch konnte bei einer konstitutiven Expression von rhlR keine

erhöhte Promotorinduktion beobachtet werden. Daher ist RhlR vermutlich ebenfalls

kein direkter Transkriptionsaktivator von bphP. Die verringerte Expression von bphP

in der ∆rhlR-Mutante unterliegt somit wahrscheinlich ebenfalls einem indirekten

Effekt. Da RhlR ein Transkriptionsaktivator von rpoS ist, wurde die bphP-

Promotoraktivität entsprechend in einer ∆rpoS-Mutante analysiert. Die reprimierte

Aktivität der Reportergenfusion in dieser Mutante deutet an, dass bphP durch den

alternativen Sigmafaktor reguliert wird. Globale Transkriptomanalysen einer ∆rpoS-

Mutante unterstützen diese Ergebnisse (Schuster et al., 2004). In diesen

Untersuchungen wurde ebenfalls eine reprimierte Expression von bphP festgestellt.

Anhand von Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierungen (RNA-Seq) konnte ein

putativer Transkriptionsstartpunkt (TSS) in der potentiellen Promotorregion von bphP

ermittelt werden (Häussler, unveröffentlichte Daten). Dieser liegt dabei 59 bp

stromaufwärts des ATG-Startcodons und befindet somit im kodierenden Bereich von

bphO (Abb. 42-A). Die Bindesequenz des alternativen Sigmafaktors RpoS (σS) an

den Promotorbereich in der -10-Region, relativ zum TSS, ist konserviert

(CATATACT) (Schuster et al., 2004). Durch eine 72 %ige Übereinstimmung dieser

Sequenz in der -10-Region vor dem TSS von bphP kann eine RpoS-Bindestelle

vermutet werden (Abb. 42-B).

Diskussion

110

Abb. 42: Promotorbereich von bphP mit postulierter σ

S-Bindestelle

(A) Durch Reportergenanalysen konnte eine RpoS-abhängige Transkriptionskontrolle von bphP gezeigt werden. Unter Einbezug des putativen TSS bei -59 bp relativ zum Translationsstartpunkt (Häussler, unveröffentlichte Daten) ist die mögliche Bindestelle des alternativen Sigmafaktor RpoS in der -10 Region dargestellt. Grün unterstrichen: postulierte LasR-Bindestelle; schwarz unterstrichen: TGA: Translationsstopp von BphO, ATG: Translationsstart von BphP. (B) Vergleich der RpoS-Konsensussequenz mit der putativen RpoS-Bindestelle.

Da es sich bei den RNA-Seq-Experimenten um einen globalen Ansatz handelt, sollte

der postulierte TSS durch ein weiteres Experiment verifiziert werden. Dies könnte

beispielsweise durch 5´RACE-Analysen (rapid amplification of cDNA ends) erfolgen.

Bei dieser Methode werden ausgehend von isolierter mRNA an die 5´Enden

Oligonukleotidlinker ligiert und cDNA mit einem genspezifischen Primer synthetisiert.

Darauf folgt eine Standard-PCR-Reaktion mit einem genspezifischen und einem zu

dem ligierten Oligonukleotidlinker komplementären Primer. Dies liefert den

vollständigen 5´-untranslatierten Bereich eines Gens.

Da die Aktivität der bphP-lacZ-Reportergenfusion in der ∆rpoS-Mutante nicht

vollständig reprimiert ist, deutet auf die Beteiligung von mindestens einem weiteren

Regulator hin. In den durchgeführten Promotorstudien wurde auch eine indirekte

Modulation durch den QS-Regulator LasR nachgewiesen. LasR kontrolliert über eine

positive rhlR-Transkription nicht nur das zweite QS-System in P. aeruginosa, sondern

ist auch an der Regulation vieler weiterer globaler Transkriptionsregulatoren beteiligt.

So wurden infolge von globalen Transkriptomanalysen etwa 300 LasR-abhängige

Gene identifiziert (Schuster et al., 2003; Waite et al., 2005). Darunter befinden sich

auch beispielsweise der alternative Sigmafaktor PvdS, der die Synthese der

Pyoverdine reguliert, RsaL, der die Expression von Genprodukten kontrolliert, die an

Diskussion

111

der Motilität und Biofilmbildung beteiligt sind, oder VqsR (Gilbert et al., 2009). Der

globale Transkriptionsfaktor VqsR (virulence and quorum sensing regulation) ist

dabei ein noch nicht lang bekannter Masterregulator der virulenzinduzierten

Genexpression. Die Expression von vqsR wird direkt über die Bindung von LasR an

die Promotorregion reguliert und induziert unter artifiziellen Virulenzbedingungen die

Transkription von 113 Genen (Li et al., 2007). Interessanterweise zeigte sich in

diesen globalen Transkriptomanalysen einer ∆vqsR-Mutante eine Repression von

bphP auf. Unter Berücksichtigung dieses Hinweises auf eine VqsR-abhängige

Transkriptionsregulation des Phytochroms, ist es also möglich, dass PaBphP eine

Rolle in der Pathogenität von P. aeruginosa einnehmen könnte.

Erste Belege für diese Hypothese ergeben sich aus den phänotypischen

Untersuchungen der ∆bphO- und ∆bphP-Mutanten. In der stationären Phase wurde

in beiden Deletionsstämmen signifikant weniger PQS im Vergleich zum WT

detektiert. Auch Transkriptomdaten dieser Mutanten deuteten diesen Einfluss suf die

PQS-Synthese bereits an. Dieser konnte jedoch bisher nicht bestätigt werden

(Barkovits et al., 2011). Die Bildung von PQS verläuft über mehrere Schritte und wird

von den Genprodukten des Operons pqsA-D sowie von pqsH synthetisiert. Dabei

übernimmt PqsH den letzten Schritt der Synthese von HHQ zu PQS (Abb. 43).

Abb. 43: PQS-Syntheseweg Ausgehend von Anthranilat wird über mehrere Zwischenstufen durch PqsABCD HHQ gebildet. Die Umsetzung von HHQ zu PQS erfolgt durch PqsH.

In der ∆bphO- und ∆bphP-Mutante ist jeweils die PQS-Menge verringert, nicht aber

das Vorläufermolekül HHQ. Dies deutet darauf hin, dass der letzte Schritt der der

PQS-Synthese, die Umsetzung von HHQ zu PQS, durch das Phytochrom beeinflusst

werden könnte. Anhand der Transkriptomanalysen einer ∆vqsR-Mutante wurde

ebenfalls eine Repression des Gens pqsH festgestellt (Juhas et al., 2004). Diese

Diskussion

112

Regulation verläuft jedoch vermutlich indirekt, da in DMSA-Experimenten mit

isoliertem VqsR keine Bindung an die Promotorregion von pqsH festgestellt wurde

(Liang et al., 2012). Diese Regulation von pqsH könnte daher möglicherweise über

das Phytochrom erfolgen. Um die Hypothese zu prüfen, könnte in zukünftigen

Untersuchungen zum einen die Transkription von bphOP und bphP in einer ∆vqsR-

Mutante, und zum anderen die Transkription von pqsH in einer ∆bphO- und ∆bphP-

Mutante durch Reportergenanalysen untersucht werden.

4.1.2.2 Das bphOP-Cotranskript: RpoS- und RhlR-reguliert?

Zu Beginn der Arbeit bereits bekannt, dass die Gene bphO und bphP in einem

bicistronischen Operon organisiert sind und die Transkription durch den alternativen

Sigmafaktor RpoS reguliert wird (Barkovits et al., 2008). Die Expression des Operons

ist jedoch in einer ∆rpoS-Mutante nicht vollständig reprimiert und deutet auf das

Mitwirken eines oder mehrere zusätzlicher Transkriptionsregulatoren hin. Die

Expression des bphOP-Cotranskripts wurde daher analog zu bphP auf eine mögliche

Regulation durch die QS-Systeme analysiert. Die Aktivität bphOP-lacZ-Fusion war

dabei in einer ∆lasR-Mutante um etwa 50 % reprimiert. Jedoch kann anhand von

DMSA-Analysen eine direkte Bindung von LasR an den Promotorbereich

stromaufwärts von bphO vermutlich ausgeschlossen werden. Diese Ergebnisse

deuten eine indirekte Kontrolle von LasR auf die bphOP-Transkription an. Die

weiterführenden Analysen in der ∆rhlR-Mutante wiesen ebenfalls eine verringerte

Expression des bphOP-Promotors auf. Um wiederum einen indirekten Effekt von

RhlR durch die Kontrolle von rpoS auszuschließen, wurde rhlR konstitutiv in einer

∆rpoS-Mutante exprimiert. Ob die dabei beobachtete erhöhte Reportergenaktivität

der bphOP-lacZ-Fusion durch eine direkte Interaktion von RhlR an die

Promotorregion resultiert oder ob dies auf einen indirekten Effekt zurückzuführen ist,

kann anhand dieser Analysen jedoch nicht abschließend geklärt werden. Hierfür

müssten weitere Experimente in Form von DMSA-Analysen erfolgen. Jedoch ist der

Großteil von heterolg produzierten RhlR unlöslich, sodass eine Reinigung erschwert

wird (Medina et al., 2003). Schuster and Greenberg postulieren allerdings, dass eine

erhöhte Promotorinduktion, bei einer erhöhten rhlR-Expression, meistens auf eine

direkte Interaktion von DNA und dem Transkriptionsaktivator zurückgeht (Schuster et

al., 2007). Durch bioinformatische Analysen des Promotorbereichs konnte zudem

Diskussion

113

eine putative RhlR-Bindestelle in dieser Region ermittelt werden (www.prodoric.com).

Die kombinierte Transkriptionskontrolle durch RpoS und einem QS-Regulator, wie sie

bei bphOP vermutlich auch zutrifft, scheint nicht ungewöhnlich zu sein. Dies wurde

bereits für diverse QS-regulierte Gene ebenfalls nachgewiesen (Winzer et al., 2000;

Schuster et al., 2004; Waite et al., 2005). Darunter befindet sich beispielsweise das

Gen lecA, welches für das zytotoxische Lektin kodiert. Die Expression von lecA

benötigt sowohl RpoS als auch RhlR für eine vollständige Geninduktion (Winzer et

al., 2000).

Anhand von Primer-Extension-Analysen wurde ein Transkriptionsstartpunkt (TSS)

stromaufwärts von bphO (-59 bp relativ zum TSS) nachgewiesen (Barkovits et al.,

2008). Die putative Bindestelle von RhlR befindet sich 45 bp stromaufwärts von

diesem TSS (Abb. 43). Die Organisation dieser regulatorischen Elemente ist in der

bereits erwähnten lecA-Promotorregion sehr ähnlich. So wird auch 42 bp

stromaufwärts vor dem TSS eine RhlR-Bindestelle postuliert (Winzer et al., 2000).

Der Abstand zwischen der Bindestelle eines QS-Regulators scheint generell eine

wichtige Rolle zu spielen und ist möglicherweise ein Indiz für eine direkte Interaktion

mit der DNA (Winzer et al., 2000). Detaillierte Analysen der Promotorregionen von

beispielsweise dem Operon rhlAB, welches ebenfalls einer Transkriptionskontrolle

von RhlR unterliegt, weist ebenfalls eine Bindestelle 40 bp vor dem TSS auf

(Pearson et al., 1997). Diese Beispiele unterstützen die Hypothese einer RhlR-

Bindestelle in der Promotorregion stromaufwärts von bphO.

Abb. 43: Promotorbereich von bphOP mit postulierter σ

S- und RhlR-Bindestelle

Durch Primer-Extension-Experimente wurde ein TSS bei -59 bp relativ zum Translationsstart (ATG, nicht dargestellt) ermittelt. Die postulierte RpoS-Bindestelle in der -10 Region (Barkovits et al., 2008) ist blau dargestellt. Die putative RhlR-Bindestelle wurde bioinformatisch ermittelt (grün, www.prodoric.com). TSS: Transkriptionsstartpunkt.

http://www.prodoric.com/

http://www.prodoric.com/

Diskussion

114

4.1.3 Einblicke in die Signaltransduktion von PaBphP

Bakterielle Phytochrome zeichnen sich durch den Aufbau einer typischen Sensor-

Histidin-Kinase (SHK) eines Zwei-Komponenten-Systems aus. Diese Funktion

konnte im Rahmen dieser Arbeit sowohl für das apo- sowie für das holo-Protein

bestätigt werden. Der Signaltransduktionsweg in einem deratigen System erfolgt im

Anschluss an die Autophosphorylierung der SHK durch eine Phosphorylgruppen-

übertragung auf einen zugehörigen Antwortregulator (AR), der daraufhin die

Transkription spezifischer Gene aktiviert. Anders als bei einigen anderen bakteriellen

Phytochromsystemen befindet sich der zugehörige AR nicht zusammen mit der

Hämoxygenase bphO und dem apo-Phytochrom bphP in einem tricistronischen

Operon. Um diesen AR von PaBphP zu identifizieren, wurden zwei verschiedene

experimentelle Ansätze gewählt. Zum einen sollten mittels eines genetischen

Screens putative Regulatoren, die an der Phytochrom-vermittelten Signaltransduktion

beteiligt sind ermittelt werden. Anschließende Phosphotransferexperimente sollten

klären, ob eine direkte Übertragung der Phosphorylgruppe auf die identifizierten

putativen Regulatoren stattfindet. Zum anderen wurde auf der Basis einer in vivo-

Quervernetzung die transiente Interaktion einer Sensorkinase mit einem AR bei der

Phosphorylgruppenübertragung genutzt, um diesen Moment zu fixieren. Durch diese

Methode werden neben putativen AR ebenfalls weitere Interaktionspartner an das

Protein gekoppelt. Die Identifizierung dieser Interaktionspartner sollte weiterhin

Rückschlüsse über die zellulären Funktionen oder beteiligten Signaltransduktions-

wege von PaBphP zulassen. Im Folgenden wird zunächst näher auf die

identifizierten putativen AR von PaBphP eingegangen.

Der genetische Screen zur Identifizierung von putativen AR von PaBphP basierte auf

den bereits bestehenden Transkriptomdaten einer ∆bphO- und ∆bphP-Mutante. In

beiden Mutanten fiel die starke Repression des orfs PA4739 auf und wurde daher als

Basis genutzt. Eine RpoS-regulierte Transkription von PA4739 konnte bereits

beobachtet werden (Barkovits et al., 2011). Die Expression von PA4739 weist in

einer ∆rpoS-Mutante eine 50 % verringerte Induktion im Vergleich zum WT auf. Wie

ebenfalls in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, unterliegt PaBphP ebenfalls einer

Kontrolle durch RpoS. Die Transkription von PA4739 ist in einer ∆bphO- sowie

∆bphP-Mutante im Vergleich zum WT um etwa 90 % reduziert. Daher ist es sehr

Diskussion

115

wahrscheinlich, dass der Effekt durch RpoS auf die Transkription von PA4739

indirekt ist und über PaBphP verläuft.

Die Grundlage des genetischen Screens basierte auf der Hypothese, dass der

korrespondierende AR von PaBphP an der Regulation von PA4739 beteiligt ist. Die

Aktivität einer PA4739-lacZ-Reportergenfusion sollte demnach in einen Stamm mit

einer Deletion des gesuchten AR eine vergleichbare Aktivität aufweisen, wie in der

∆bphP-Mutante.

Anhand der durchgeführten Experimente wurden von 72 getesteten AR drei putative

Regulatoren ermittelt, die an der PaBphP-abhängigen Transkriptionsaktivierung von

PA4739 involviert sind: CheY2 (PA14_02260), PA14_27950 und CbrB

(PA14_62540). Die Identifizierung von mehr als einem Regulator ist nicht

ungewöhnlich (Bijlsma et al., 2003) und impliziert womöglich ein weitverzweigtes

Netzwerk der PaBphP-Signaltransduktion. Eine Regulation durch mehrere

Transkriptionsaktivatoren wird auch dadurch angedeutet, dass in keinem Fall eine

vollständige Repression der Promotoraktivität von PA4739 beobachtet wurde.

Als einer der putativen Regulatoren wurde das PA14_02260 Genprodukt CheY2

identifiziert. Dieser Regulator ist als AR des che2-Systems annotiert, das eine hohe

Homologie zu dem Chemotaxis cheY-System aus E. coli aufweist (Parales et al.,

2004). P. aeruginosa besitzt im Gegensatz zu E. coli zwei dieser Che-Systeme. Die

Funktion des zweiten Homologs aus P. aeruginosa ist noch weitgehend unbekannt.

Es wird postuliert, dass es eine modulierende Funktion auf das Che-System hat und

somit an der Flagellen-vermittelten Fortbewegung beteiligt ist (Guvener et al., 2006).

Bioinformatische Vorhersagen implizieren eine Operon-Struktur der che2-Gene. Die

Expression des che2-Systems ist RpoS-abhängig, wodurch es in der stationären

Phase exprimiert wird (Schuster et al., 2004). Der AR CheY2 besteht nur aus einer

Phosphatempfängerdomäne und besitzt kein DNA-Bindemotiv. Eine direkte

Transkriptionsaktivierung des Gens PA4739 durch CheY2 ist demnach nicht möglich.

Ein weiterer putativer Regulator, der über den genetischen Screen ermittelt wurde, ist

PA14_27950. Dabei handelt es sich nicht um einen typischen AR eines Zwei-

Komponenten-Systems. Aufgrund der STAS-Domäne ist das Protein als putativer

Anti-Sigmafaktor Antagonist annotiert. Über Proteine mit einer STAS-Domäne ist

bislang nur bekannt, dass sie an der globalen Regulation von Sigmafaktoren beteiligt

sind und mit membranständigen Sulfattransportern fusioniert sein können (Aravind &

Koonin, 2000). Die genaue Funktion dieser Proteine für den Organismus, wie auch

Diskussion

116

für P. aeruginosa ist bisher noch unklar. Oftmals sind sie mit verschiedenen

Sensordomänen fusioniert, wodurch sich die Funktion oder Prozesse postulieren

lassen, an denen diese Proteine beteiligt sind (Aravind & Koonin, 2000).

PA14_27950 besteht jedoch nur aus einer alleinstehende STAS-Domäne, wodurch

sich die Funktion nicht vorhersagen lässt. Auch besitzt diese Domäne kein DNA-

Bindemotiv, sodass eine direkte Transkriptionsaktivierung von PA4739

ausgeschlossen werden kann.

Neben CheY2 und PA14_27950 wurde CbrB (PA14_62540) als putativer AR der

PaBphP-Signaltransduktionskaskade identifiziert. CbrB besitzt den Aufbau eines

klassischen AR mit einer Phosphatempfängerdomäne und einem DNA-Bindemotiv.

Mit der zugehörigen Sensorkinase CbrA reguliert das CbrA/B-System viele Gene

deren Produkte im Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus involviert sind (Nishijyo et

al., 2001). Das CbrA/B Zwei-Komponenten-System ist weiterhin an der Regulation

der Motilität, Virulenz sowie der Biofilmbildung beteiligt (Yeung et al., 2011). Es

werden jedoch neben CbrB noch weitere unbekannte AR für die Sensorkinase CbrA

postuliert (Yeung et al., 2011). Dementsprechend wäre es ebenfalls möglich, dass

auch CbrB mit PaBphP als weiterer Sensorkinase interagiert.

Die Ergebnisse des genetischen Screens deuten darauf hin, dass alle drei

Regulatoren an der Phytochrom-abhängigen Transkriptionsaktivierung von PA4739

beteiligt sind. In einem weiteren Schritt wurde eine direkte Übertragung der

Phosphorylgruppe des autophosphorylierten PaBphPs auf diese Regulatorproteine

analysiert. Einen für Phytochrome typischen lichtabhängigen Phosphotransfer von

PaBphP auf diese Regulatoren konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Damit

müssen die identifizierten Regulatoren jedoch nicht zwangsläufig als AR für PaBphP

ausgeschlossen werden. Es ist möglich, dass unter den gewählten Bedingungen das

initiierende Signal für die Transphosphorylierung nicht vorhanden war. So könnte

neben Licht ein weiterer Stimulus nötig sein, um die Phosphorylgruppenübertragung

zu ermöglichen. In diesem Zusammenhang muss berücksichtigt werden, dass die

durchgeführten Promotorstudien zur Identifizierung dieser Regulatoren in vivo

ermittelt wurden. Die anschließenden Untersuchungen hingegen erfolgen auf der

Basis von heterolog produzierten Proteinen in einem in vitro-Ansatz. Eine Zugabe

von Rohextrakt zur Verifizierung der Hypothese, dass ein intrazelluläres Signal

benötigt wird, war aufgrund der Instabilität von PaBphP in Rohextrakt jedoch nicht

Diskussion

117

möglich. Die aus diesen Ergebnissen hervorgehende mögliche Signaltransduktion-

kaskade ausgehend von PaBphP zur Aktivierung der Transkription von PA4739 ist in

nachfolgender Abb. 44 dargestellt.

Abb. 44 Mögliche Signaltransduktionskaskade von PaBphP zur Transkriptionsaktivierung von PA4739 durch die identifizierten Regulatoren CheY2 und PA14_27950 (Anti-Sigmafaktor Antagonist, AσA) könnten zwar über eine Phosphoryl-gruppenübertragung von PaBphP aktiviert werden, benötigen aber aufgrund einer fehlenden DNA-Bindedomäne mindestens einen weiteren zwischengeschalteten Regulator X, um die Transkription von PA4739 zu initiieren. CbrB hingegen könnte nach Erhalt der Phosphorylgruppe direkt die Transkription von PA4739 induzieren. Das Signal für die Initiierung der Phosphorylgruppen-übertragung ist nicht bekannt.

Dieses Modell zeigt zum einen, dass die Signaltransduktion sehr komplex zu sein

scheint und zum anderen, dass neben Licht noch weitere Faktoren benötigt werden,

um die Transkription von PA4739 zu induzieren.

Alternativ kann die Signaltransduktion auch über ein komplexes Phosphorelay-

System verlaufen. Neben einem klassischen AR besitzen einige Phytochrom-AR nur

eine Phosphatempfängerdomäne und keine Effektordomäne zur Bindung an die DNA

(Bhoo et al., 2001; Karniol, 2006). Daher gehören diese zur Gruppe der CheY-

ähnlichen AR. Dieser Typ von AR kann auf direktem Wege mit dem Zielpartner

interagieren oder ist eine Komponente eines Phosphorelay-Systems. Die

Signaltransduktion über ein solches Phosphorelay-System zur Aktivierung von

PA4739 könnte somit auch auf die Signalweiterleitung von PaBphP zutreffen. Im

Rahmen des genetischen Screens wurden 72 der 103 putativen AR getestet, daher

besteht die Möglichkeit, das neben CheY2, PA14_27950 und CbrB noch weitere

Regulatoren an der Signaltransduktionskaskade beteiligt sein könnten und ein

derartiges Phosphorely-System bilden.

Diskussion

118

Dass PaBphP grundsätzlich die Fähigkeit besitzt, nach einer Autophosphorylierung

die gebundene Phosphorylgruppe an einen AR zu transferieren, konnte anhand der

Übertragung auf den Phytochrom-AR aus D. radiodurans nachgewiesen werden.

Anders als bei dem Phytochrom aus P. syringae PsBphP1 (Bhoo et al., 2001) findet

dieser Transfer unabhängig von einem Chromophor statt, da sowohl ausgehend von

dem apo-, als auch von dem holo-Phytochrom eine Transphosphorylierung

beobachtet wurde. Auch konnte kein Unterschied unter Hellrot- und Dunkelrotlicht

verzeichnet werden. Der Tansfer scheint somit ebenfalls nicht lichtreguliert zu sein.

Bislang ist noch nicht genau geklärt, welche Aminosäuren für die Spezifität einer

Transphosphorylierung verantwortlich sind. Es wird vermutet, dass vor allem die

Transmitterdomäne der Kinase sowie die Empfängerdomäne des AR daran beteiligt

sind (Laub & Goulian, 2007). Da die speziesübergreifende Phorphorylgruppen-

übertragung möglicherweise auf eine hohe Ähnlichkeit von DrBhpR zu dem AR des

Phytochroms basiert, wurden in silico Aminosäuresequenzvergleiche mit der

N-terminalen Region von DrBphR und der Pseudomonas-Datenbank durchgeführt

(www.pseudomonas.com). Innerhalb dieser Analysen konnten zwar einige Proteine

ermittelt werden, die eine gewisse Ähnlichkeit mit DrBphR haben, jedoch lassen sich

aufgrund der niedrigen Homologie keine eindeutigen Rückschlüsse ziehen, ob einer

dieser Regulatoren der AR von PaBphP ist.

Um auf einer globaleren Ebene die AR die durch einen Transfer der

Phosphorylgruppe von PaBphP phosphoryliert werden zu identifizieren, könnte das

Phosphoproteom untersucht werden. Durch eine affinitätschromatographische

Anreicherung aller phosphorylierten Proteine des WTs und einer ∆bphP-Mutante mit

einer anschließenden massenspektrometrischen Analyse, sollte Aufschluss darüber

geben, welche Proteine spezifisch von PaBphP eine Phosphorylgruppe empfangen.

Neben diesem genetischen Screen wurden ebenfalls durch in vivo-cross-

Quervernetzungs-Experimente durchgeführt, um putative AR von PaBphP zu

ermitteln. Innerhalb dieser Analysen wurde der AR CueR als weiterer putativer AR

des Phytochroms identifiziert. Dieser Regulator wird durch eine direkte Bindung von

LasR aktiviert und reguliert seinerseits die Transkription des Kupferstress-Regulons

(Thaden et al., 2010). Da die Aktivität von CueR nicht durch eine Phosphorylierung,

sondern durch eine Bindung von Kupfer reguliert wird, ist es bisher unklar, inwiefern

Diskussion

119

PaBphP hierbei einen Einfluss hat. Es kann lediglich vermutet werden, dass PaBphP

möglicherweise einen modulierenden Effekt auf die Aktivität von CueR durch eine

Interaktion ausübt.

4.1.4 PaBphP ist möglicherweise in verschiedene metabolische

Vorgänge involviert

Im Rahmen der durchgeführten in vivo-Quervernetzungen konnten neben CueR als

putativen AR von PaBphP ebenfalls weitere zahlreiche putative Interaktionspartner

ermittelt werden. Diese Interaktionspartner können nicht einer einzelnen funktionellen

Klasse zugeordnet werden, sondern sind in unterschiedliche metabolische Vorgänge

involviert. Durch die Interaktion mit mehreren Proteinen des Citratzykluses könnte

vermutet werden, dass PaBphP einen generellen Einfluss auf die Energiegewinnung

hat. In phänotypische Untersuchungen einer ∆bphP-Mutante wurde jedoch kein

Unterschied im Wachstum, weder in komplexem Vollmedium noch unter definierten

Minimalbedingungen, beobachtet (Barkovits et al., 2008, Barkovits, unveröffentlichte

Daten). Demnach könnte PaBphP zwar auf den Energiemetabolismus einzuwirken,

dieser Effekt ist jedoch nicht essentiell für den Organismus.

Im Zuge der in vivo-Quervernetzung wurden auch einige putative

membranlokalisierte Proteine identifiziert, mit denen PaBphP zu interagieren scheint.

Zu diesen zählen beispielsweise LptF (PA14_16630) und OprF (PA14_41570).

Während LptF an der Adhäsion von P. aeruginosa an Oberflächen beteiligt ist, bildet

OprF unter anderem eine membrandurchspannende Pore durch die unspezifisch

kleine polare Moleküle durchfließen können (Nestorovich et al., 2006). Darüber

hinaus ist OprF noch für weitere zelluläre Prozesse von Bedeutung. Eine Deletion

von oprF führt zu einer verringerten Adhäsion an die Oberfläche, sowie zu einer

verringerten Produktion von Exotoxinen, Pyocyanin und dem QS-Molekül PQS.

Aufgrund dieser Eigenschaften wird OprF eine wichtige Rolle in der Virulenz von

P. aeruginosa zugeschrieben (Fito-Boncompte et al., 2011). Weiterhin konnte

ebenfalls PA14_62690, das Homolog zu PA4739 aus PAO1, als putativer

Interaktionspartner von PaBphP nachgewiesen werden. Das periplasmatisch

Diskussion

120

lokalisierte Protein unterliegt, wie bereits im vorherigen Abschnitt gezeigt, einer

Transkriptionskontrolle von PaBphP.

Da es sich bei PaBphP um ein zytosolisches Protein handelt, ist es sehr

wahrscheinlich, dass vorwiegend lösliche, zytosolische Proteine mit PaBphP

wechselwirken. Eine experimentelle Einschränkung bei einer in vivo-Quervernetzung

ist jedoch, dass neben tatsächlich wechselwirkenden Partner auch Proteine in

unmittelbarer räumlicher Nähe aneinander gekoppelt werden. Daher ist nicht

auszuschließen, dass die Verknüpfung, vor allem mit den membranintegrierten

Proteinen, vielmehr auf eine Lokalisation von PaBphP in der Nähe der Membran

hindeutet. Eine räumliche Lokalisation zur Zytoplasmamembran wird zudem durch

bioinformatische Analysen unterstützt (http://db.psort.org).

4.1.5 PaBphP- mehr als nur ein Rotlichtrezeptor?

Die biochemische Charakterisierung des homolog gereinigten PaBphPs aus

P. aeruginosa bestätigten die Eigenschaften eines Rotlichtrezeptors. Die innerhalb

dieser Arbeit durchgeführten Analysen deuten jedoch auf noch weitere Funktionen

des Phytochroms innerhalb der Zelle hin. Dies zeigte beispielsweise an der Licht-

und chromophorunabhängigen Regulation der Kinaseaktivität. Weiterhin sprechen

die vorliegenden Ergebnisse für eine Bedeutung des Phytochroms in der stationären

Phase. Durch die Transkriptionsregulation der QS-Systeme, sowie die mögliche

Vermittlung QS-Regulierter Funktionen scheint PaBphP eine globale Rolle in der

Zelle einzunehmen. Die eigenständige Regulation des bphP-Promotors, impliziert

eine mögliche unabhängige Funktion des apo-Phytochroms. Diese Vermutung wird

zudem durch die phänotypischen Analysen unterstützt, in denen die ∆bphP-Mutante

weitere phänotypische Veränderungen aufwies, die in einer ∆bphO-Mutante nicht zu

beobachten waren. In beiden Stämmen wurde eine verringerte Menge des

Signalmoleküls PQS nachgewiesen. Dies könnte zum einen bedeuten, dass die

Hämoxygenase selbst auch einen Einfluss auf die Synthese von PQS hat. Zum

anderen könnte vermutet werden, dass das Phytochrom in seiner chromophorylierten

Form als holo-Protein vorliegen muss, um einen Einfluss auf die Bildung des

Signalmoleküls auszuüben. Sowohl PQS als auch HHQ fungieren als Autoinduktoren

http://db.psort.org/

Diskussion

121

für den Regulator PqsR und sind zusammen an der Vermittlung vieler RhlR-

abhängiger Funktionen beteiligt (Williams & Camara, 2009). Ein Verlust von PQS

führt beispielsweise zu einer verminderten Synthese des Virulenzfaktors Pyocyanin.

Bei einer Deletion von bphP, jedoch nicht bei einer Deletion von bphO, wurde eine

deutliche Grünfärbung der Kolonien bei einem Wachstum auf Festmedium

beobachtet. Dieser Phänotyp deutete zunächst auf eine erhöhte Pyocyanin-

Produktion hin. Bei der Extraktion des Pigments konnte dies jedoch nicht bestätigt

werden. Dies würde auch im Widerspruch zu der detektierten verringerten PQS-

Synthese stehen, da PQS als Autoinduktor für PqsR fungiert, und dieser die Gene

die zur Pyocyaninsynthese benötigt werden, induziert (Diggle et al., 2003). Da neben

Pyocyanin kein weiteres grünes Pigment in P. aeruginosa bekannt ist, das unter

diesen Bedingungen synthetisiert wird, kann bisher keine Aussage über die

Bedeutung dieser Grünfärbung getroffen werden.

Desweiteren führt die Deletion von bphP, nicht aber von bphO, zu einer erhöhten

Sensibilität gegenüber SDS. Das Detergenz hat die Eigenschaft Lipide zu emulgieren

und greift so die Zellmembran an. Die reduzierte SDS-Toleranz dieser Mutante

könnte möglicherweise auf einer destabilisierten Membran beruhen. Eine Membran

kann auf vielerlei Wege destabilisiert werden, wie beispielsweise eine Veränderung

der Lipidkomposition, der Fettsäurereste der Lipide und/oder auch durch die in oder

an der Membran assoziierten Strukturproteine (Zhang et al., 2008).

Die Transkriptomdaten der Phytochrommutanten bestärken die Annahme einer

möglichen veränderten Membranintegrität. In der ∆bphP-, jedoch nicht in der ∆bphO-

Mutante, sind einige wenige Gene, die für membranassoziierte Proteine kodieren,

reprimiert (Barkovits et al., 2011). Darunter befinden sich beispielsweise OmpA, die

Vorstufe eines äußeren Membranproteins, sowie das Lipoprotein OsmE und weitere

hypothetischen Proteine mit vorhergesagter Membranlokalisation.

Die Untersuchungen zur Motilität deckten ebenfalls eine leicht eingeschränkte

Flagellen-basierte Fortbewegung (Schwimmen) der ∆bphP-Mutante auf. Aufgrund

der Membranverankerung der Flagelle, ist die Integrität der Membran für Funktion

der Flagelle von entscheidender Bedeutung. Der Zusammenhang zwischen einer

veränderten Membran und einer reduzierten Motilität wurde bereits in mehreren

Untersuchungen gezeigt. Dabei korreliert eine defekte bzw. abnormale

Lipopolysaccharidschicht oder Membrankomposition mit einem Verlust der

Flagellenfunktion (Toguchi et al., 2000; Kim et al., 2005; Huang et al., 2006). Dieser

Diskussion

122

Effekt müsste jedoch auch bei den durchgefühten Analysen zum Schwärmverhalten,

welches, auf einer Kombination von Flagellen und TypIV-Pili basiert (Mattick, 2002),

zu beobachten sein. Dies wurde jedoch nicht nachgewiesen und sollte in weiteren

Experimenten geklärt werden.

Insgesamt betrachtet bestätigen diese Daten die Hypothese, dass PaBphP in sehr

unterschiedlichen Prozessen in der Zelle involviert ist und darüber hinaus das apo-

Phytochrom weitere Funktionen einnimmt.

Der Einfluss von PaBphP spiegelt sich auch anhand des proteolytischen Abbaus

wieder. Die Kombination aus in vitro- und in vivo- Degradationsanalysen deuten

darauf hin, dass PaBphP bei einer unphysiologisch hohen Menge proteolytisch

abgebaut wird. Eine Proteolyse von Phytochromen wurde bereits bei einigen

pflanzlichen Rotlichtrezeptoren nach Zugabe von Rohextrakt beobachtet. Diese

Regulation läuft dabei jedoch lichtabhängig und aufgrund der Spaltung des Proteins

in 2-3 Fragmente, reguliert ab (Vierstra et al.,1984). Im Gegensatz dazu wird PaBphP

in P. aeruginosa vollständig abgebaut. Daher handelt es sich vermutlich um eine

unregulierte Degradation. In der Regel dient ein derartig unregulierter proteolytischer

Abbau zum Schutz gegen eine toxische Proteinaggregation oder vor der Anhäufung

missgefalteten Proteine (Gottesman, 2003). Aufgrund der Löslichkeit des homolog

überproduzierten PaBphPs und den anschließenden Analysen zur Funktion ist eine

falsche Faltung des Proteins eher unwahrscheinlich. Da der Abbau von PaBphP in

vitro durch den Metallchelator EDTA stark verzögert wurde, handelt es sich

vermutlich um mindestens eine metallabhängige Protease. Ob es sich dabei um eine

ATP-abhängige Protease handelt, konnte abschließend nicht geklärt werden. Jedoch

kann aufgrund der hohen Geschwindigkeit des proteolytischen Abbaus vermutet

werden, dass dieser Prozess ATP-abhängig ist. Energieabhängige Proteasen sind

für über 90 % aller intrazellulären proteolytische Vorgänge verantwortlich

(Gottesman,2003; Jenal & Hengge-Aronis, 2003). Die bekanntesten Vertreter dieser

Proteasen sind Lon, ClpAP, ClpXP, HslUV und FtsH. Lediglich die enzymatische

Aktivität der membranintegrierten Protease FtsH ist von der Bindung von eines

Zinkions abhängig (Tomoyasu et al., 1993). Da in den in vitro-Experimenten die

Membranfraktion jedoch separiert wurde, kann ein Abbau durch diese Protease sehr

wahrscheinlich ausgeschlossen werden. In dem Genom von P. aeruginosa PA14

kodieren mindestens fünf weitere Gene für putative Proteasen, die metallabhängig

sind und daher an der Degradation beteiligt sein könnten (www.pseudomonas.com).

Diskussion

123

Da der Abbau von PaBphP durch die Chelierung der Metallionen nicht komplett

inhibiert wurde, impliziert die Beteiligung noch weiterer Proteasen. Die Behandlung

des Lysates mit einem Protease-Inhibitor-Cocktails, der die Aktivität von Serin- und

Cystein-Proteasen hemmt, bestärkt diese Annahme, da in Folge dieser der

proteolytische Abbau von PaBphP ebenfalls leicht verzögert wurde. In den in vivo-

Quervernetzungs-Experimenten wurden die Serin-Proteasen-Untereinheiten HslU

und ClpX an PaBphP gekoppelt und könnte ein Indiz auf eine mögliche Beteiligung

dieser Proteasen sein.

Durch die Inkubation von PaBphP mit Rohextrakt aus verschiedenen

Wachstumsphasen konnte zudem eine zelldichteabhängige Degradation gezeigt

werden. Dies lässt vermuten, dass die Protease/n entweder erst in der stationären

Phase synthetisiert werden oder dass eine unphysiologische Menge des

Phytochroms erst bei einer hohen Populationsdichte eine Degradation induziert. Ein

Ungleichgewicht des Proteoms in dieser Phase, durch eine erhöhte PaBphP Menge,

könnte einen schädigenden Einfluss auf die Zelle haben, wodurch sie sich durch

einen rapiden Abbau des Proteins schützt.

4.1.6 Das Phytochrom-Regulon

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Phytochrom des nicht-photosynthestisch,

heterotroph lebenden Bakteriums P. aeruginosa aus unterschiedlichen Blickwinkeln

durch eine Kombination verschiedener experimenteller Ansätze analysiert, um einen

Gesamtüberblick über die physiologische Bedeutung des Rotlichtrezeptors zu

erhalten. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse sind in Abb. 45 zusammengefasst.

Diskussion

124

Abb. 45 Überblick über das Phytochrom-Regulon Zusammenfassung aller erhaltenen Erkenntnisse zur Aufklärung der physiologischen Bedeutung von PaBphP. Eine nähere Beschreibung ist dem Text zu entnehmen.

Durch Reportergenanalysen wurde eine komplexe Transkriptionskontrolle des

bphOP-Cotranskripts, sowie eine von bphO entkoppelte eigenständige Expression

von bphP nachgewiesen werden (1). Die Hämoxygenase BphO ist dabei für die

Generierung des nativen Chromophors BVI Xα in vivo verantwortlich. Durch die

Assemblierung mit BV IXα an das apo-Protein entsteht das holo-Phytochrom (2).

Durch in vivo-Quervernetzung konnte eine Vielzahl von putativen

Interaktionspartnern für PaBphP ermittelt werden (3). Untersuchungen zur

intrazellulären Signaltransduktionskaskade ausgehend von PaBphP deckten

mehrere putative AR des Phytochroms auf (4). Der globale Einfluss des Phytochroms

auf diverse zelluläre Funktionen wurde ebenfalls durch phänotypische Analysen von

Phytochrommutanten bestätigt (5).

Zusammengefasst konten im Rahmen dieser Arbeit viele neue Erkenntnisse über

das Phänomen eines Phytochroms in einem heterotrophen Organismus gewonnen

werden. In P. aeruginosa scheint dieser Rotlichtrezeptor nicht „nur“ der

Lichtwahrnehmung zu dienen, sondern nimmt eine weitaus vielseitigere Rolle ein.

Diskussion

125

Kapitel II

Die Lebensgemeinschaft in Form von hochstrukturierten Biofilmen verschafft

Mikroorgansimen wie P. aeruginosa einen großen Vorteil gegenüber verschiedener

äußeren Einflüssen, wie beispielsweise eine erhöhte Toleranz gegenüber Antibiotika

(Hentzer et al., 2001; Yoon et al., 2002). Die Bildung dieser Biofilmen ist ein sehr

stringent regulierter Prozess und kann in verschiedene Stadien eingeteilt werden

(Sauer et al., 2002; Petrova et al., 2009). Die ersten Stadien umfassen die initiale

Anheftung sowie Reifung des Biofilms, wohingegen es in der letzten Phase zur

Auflösung des Biofilms kommt. Dadurch wird die Besiedelung neuer Habitate

ermöglicht. In allen Phasen der Biofilmbildung spielt die intrazelluläre Konzentration

des sekundären Botenstoffes c-di-GMP eine wichtige Rolle. Eine hohe Konzentration

fördert die Biofilmbildung, eine niedrige Konzentration korreliert mit einer motilen

Lebensweise (Römling et al., 2005). Der Abbau von c-di-GMP wird von

Phosphodiesterasen (PDE) katalysiert, deren katalytische Aktivität in den aufgelösten

Zellen besonders hoch ist (Barraud et al., 2009). Die Dispersion kann durch

verschiedene externe und interne Faktoren, wie Nährstoffangebot oder

Stickstoffmonoxid (NO) induziert werden. In anderen Bakterienarten wie

beispielsweise Shewanella woodyi oder S. oneidensis MR-1 sind sogenannte H-NOX

(heme nitric oxide binding)-Domänen, die das NO wahrnehmen können, an der

Modulierung der intrazellulären c-di-GMP-Konzentration beteiligt. In S. woodyi konnte

zudem bereits gezeigt werden, dass NO über die H-NOX-Domäne die PDE-Aktivität

stimuliert wird, während die c-di-GMP-abbauende Diguanylatzyklase-Aktivität des

bifunktionalen Enzyms gehemmt wird (Liu et al., 2012; Plate & Marletta, 2012). In

dem Genom von P. aeruginosa kodieren jedoch keine Gene für ein Protein mit einer

derartigen NO-wahrnehmenden H-NOX-Domäne.

Jedoch konnten auch bereits in P. aeruginosa einige wenige PDEs identifiziert

werden, die an der NO-induzierten Dispersion beteiligt sind (An et al., 2010; Roy et

al., 2012). Diese sind jedoch aufgrund ihrer Domänenstruktur nicht in der Lage NO

direkt zu registrieren und darüber die enzymatische Aktivität der PDE zu steuern.

In Kooperation mit Prof. Dr. Karin Sauer der Binghampton University, USA wurde mit

NbdA die erste PDE in P. aeruginosa identifiziert, die möglicherweise direkt an der

NO-induzierten Biofilmauflösung beteiligt ist (Li et al., 2013). Hierbei könnte die die

MHYT-Domäne im N-terminalen Abschnitt von NbdA direkt das Gas binden (Galperin

Diskussion

126

et al., 2001). Innerhalb der Untersuchugen zur Charakterisierung von NbdA fiel auf,

dass NO einen positiven Einfluss auf die Transkription von nbdA, sowohl in

planktonisch wachsenden, vor allem jedoch in den aufgelösten Zellen, hat (Li et al.,

2013). Eine solche Regulation wurde bislang noch für keine PDE beschrieben und

wurde daher näher untersucht.

4.2.1 Wird die Transkription von nbdA durch NO induziert?

Anhand der durchgeführten Reportergenanalysen zur Transkriptionskontrolle von

nbdA konnte FhpR als möglicher Transkriptionsregulator unter sauerstoff-

limitierenden Bedingungen identifiziert werden. Aus der Literatur ist FhpR bisher

lediglich als Transkriptionsaktivator von fhp bekannt, dessen Genprodukt ein

Flavohämoglobin ist (Arai et al., 2005). Unter aeroben Bedingungen, führt sowohl

eine Deletion von fhp, als auch von fhpR, zu einem deutlichen Wachstumsdefizit in

Anwesenheit hoher NO-Konzentrationen. Daher wird postuliert, dass Fhp und FhpR

unter diesen Bedingungen zusammen ein NO-Detoxifikationssystem bilden (Arai et

al., 2005). Durch die Regulation von FhpR könnte vermutet werden, dass auch NbdA

eine Funktion in der Detoxifikation von NO unter sauerstofflimitierenden Bedingungen

bei hohen Konzentrationen des schädlichen Gases einnimmt. NbdA als PDE besitzt

jedoch weder eine für Flavohämoglobine typische NO-Dioxygenase oder

NO-Reduktaseaktivität (Poole et al., 2000). Die mögliche schützende Funktion vor

hohen NO-Konzentrationen könnte demnach in der Auflösung des Biofilms bestehen

woduch die Zellen wieder eine planktonische Lebensweise einnehmen und eine

aerobe Atmung durchführen können. Im weiteren Verlauf wurde die Transkription von

nbdA vergleichend zu dem bekannten FhpR-reguliereden Gen fhp, untersucht. Die

hier vorliegenden Ergebnisse implizieren keine analoge Regulation für nbdA. Im

Gegesatz zu fhp (Arai et al., 2005) wird die Transkription nicht durch verschiedene

NO-Donoren, Nitrat oder Nitrit induziert. Dies steht jedoch im Widerspruch mit der

gemesenen erhöhten mRNA-Transkriptmenge von nbdA nach einer Zugabe des

NO-Donors SNP (Li et al., 2013). Die Ursache für diese Diskrepanz konnte bisher

nicht geklärt werden.

Für die Regulation durch FhpR ist darüber hinaus bekannt, dass dieser ein

σ54 -Transkriptionsaktiviator ist und somit die Transkriptionsinitiation von fhp neben

dem Regulator auch der alternative Sigmafaktor benötigt wird (Arai et al., 2005). In

Diskussion

127

den durchgeführten Reportergenanalysen in einer ∆rpoN-Mutante wurde diese

Abhängigkeit für nbdA jedoch nicht beobachtet. An dieser Stelle soll darauf

hingewiesen werden, dass es sich bei der verwendeten ∆fhpR-Mutante um eine

Transposonmutante eines anderen PAO1-Widtypstammes handelt (Lewenza et al.,

2005). Daher ist nicht auszuschließen, dass die verringerte nbdA-Expression in der

∆fhpR-Mutante auf die dabei unterschiedlichen WT-Stämme zurückzuführen ist. Da

diese reprimierte Transkription allerdings nur unter sauerstofflimitierenden

Bedingungen verzeichnet wurde, impliziert wiederrum einen reelen Einfluss des

Regulators. Um jedoch einen Einfluss durch den Stammwechsel auszuschließen,

sollte eine markerlose Deletionsmutante erstellt, und die Reportergenanalysen

fortgeführt werden.

Neben einer direkten Transkriptionsaktivierung von nbdA durch einen NO-bindenden

Regulator gibt es weiterhin ebenfalls die Möglichkeit einer indirekten Regulation. Die

QS-Systeme mit den Regulatoren LasR und RhlR sind in P. aeruginosa an der

Regulation vieler biofilmassoziierter Geneprodukten beteiligt (Parsek et al., 2005; de

Kievit, 2009). Die Reportergenstudien in einer ∆lasR- und ∆rhlR-Mutante konnte

jedoch kein Einfluss auf die Expression von nbdA nachgewiesen werden und daher

kann eine Beteiligung dieser beiden QS-Systeme vermutlich ausgeschlossen

werden.

Auf Basis der bisherigen Daten, kann weiterhin vermutet werden, dass noch weitere

Faktoren an der Transkriptionskontrolle beteiligt sind, da die Aktivität der

nbdA-Reportergenfusion in einer ∆fhpR-Mutante nicht vollständig reprimiert ist.

Sensorproteine mit einer GAF- oder PAS-Domäne sind beispielsweise in der Lage,

über ein gebundenen Häm- oder Eisen-Kofaktor, NO wahrzunehmen (Taylor &

Zhulin,1999). So wäre es denkbar, dass eine Sensorkinase eines Zwei-

Komponenten-Systems das NO registriert, die Signaltransduktionskaskade daraufhin

einleitet und der zugehörige AR die Expression von nbdA initiiert. Zur Identifizierung,

welche Sensorkinase dabei von Bedeutung ist, könnte durch einen genetischen

Screen geklärt werden (vgl. 3.3). Dabei sollten alle Sensorkinasen, die putativ NO als

Signal detektieren können, deletiert werden. Der Vergleich der nbdA-Expression im

WT und diesen Deletionsstämmen könnte die entsprechende Sensorkinase

identifizieren.

Diskussion

128

Insgesamt betrachtet zeigen die hier durchgeführten Expressionsanalysen, dass die

Transkriptionskontrolle von nbdA einer Regulation von FhpR unterliegt. Diese ist nur

unter sauerstofflimitierenden Bedingungen zu beobachten, ähnlich den Bedingungen,

die innerhalb eines Biofilms herrschen. Weiterhin konnte, anders als in den

qRT-PCR-Experimenten (Li et al., 2013), keine Induktion der Transkription nach einer

NO-Zugabe beobachtet werden. Anhand der im Rahmen dieser Arbeit

durchgeführten Untersuchungen scheint NO nur eine untergeordnete Rolle im

Hinblick auf die Expression von nbdA zu spielen. Es kann daher vermutet werden,

dass NO möglicherweise keinen großen Einfluss auf die Neusynthese von NbdA hat.

Dies würde die Hypothese bestärken, dass NO einen regulatorischen Effekt auf die

PDE-Aktivität ausübt. Bisherige biochemische Analysen zur Aktivität wurden

lediglich mit verkürzten Varianten ohne die membranintegrale Sensordomäne

durchgeführt (Li et al., 2013). Der Einfluss von NO auf die PDE-Aktivität kann jedoch

nur durch die Isolierung des Volllängenproteins ganzheitlich geklärt werden. Initiale

Experimente wurden hierfür bereits durchgeführt (Daten nicht gezeigt), jedoch waren

die Proteinausbeuten bisher zu gering, um entsprechende Analysen durchzuführen.

Zusammenfassung

129

5. Zusammenfassung

Phytochrome sind hellrot/dunkelrotlicht-absorbierende Photorezeptoren, deren

lichtsensorische Eigenschaften durch ein kovalent gebundenen Chromophor

vermittelt werden. Diese Chromoproteine sind nicht wie ursprünglich angenommen

auf die Pflanzenwelt beschränkt, sondern wurden mittlerweile ebenfalls in Pilzen,

Cyanobakterien und auch heterotrophen Bakterien entdeckt. Vor allem das

Vorkommen von Phytochromen in heterotrophen, nicht-photosynthetischen Bakterien

wirft immer noch große Fragen auf hinsichtlich ihrer physiologischen Bedeutung. Zu

einer dieser Bakterienarten gehört auch das opportunistische Pathogen

Pseudomonas aeruginosa. Mit den Genprodukten von bphO und bphP ist

P. aeruginosa in der Lage ein holo-Phytochrom zu assemblieren. Dabei kodiert bphO

für eine Hämoxygenase, die durch Spaltung eines Häm-Moleküls den Chomophor

BV IXα generiert, wohingegen bphP für das apo-Protein kodiert. Bakterielle

Phytochrome zeichnen sich weiterhin durch eine N-terminal lokalisierte Histidin-

Kinase-Domäne aus, wodurch sie Sensorproteine eines klassischen Zwei-

Komponenten-Signaltransduktionssystems darstellen.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand verschiedener experimenteller Ansätze ein

Überblick über die Bedeutung des bakteriellen Phytochroms aus P. aeruginosa in

vivo gewonnen werden. Die homologe Isolierung des Proteins mit anschließender

biochemischer Charakterisierung ergänzen die bereits vorliegenden Erkenntnisse

und bestätigen eine Funktion als Rotlichtrezeptor mit BV IXα als dem nativen

Chromophor sowie die Funktion einer lichtunabhängigen Sensorkinase.

Reportergenanalysen deckten eine komplexe Regulation des Phytochrom-Operons

auf. Neben der bekannten RpoS-Abhängigkeit des bphOP-Cotranskripts konnte

ebenfalls ein Einfluss des Quorum-Sensing-Systems nachgewiesen werden. Zudem

identifizierten diese Analysen einen zusätzlichen Promotor für bphP, welcher

ebenfalls zelldichteabhängig reguliert wird.

Um einen Einblick in die weiterführende Signaltansduktionskaskade von PaBphP zu

erlangen, wurde ein genetischer Screen auf der Basis von vorausgegangenen

Transkriptomdaten etabliert. Dabei konnten drei putative Antwortregulatoren ermittelt

werden. Eine direkte Phosphorylgruppenübertragung von PaBphP auf diese

Regulatoren konnte unter den getesteten Bedingungen nicht beobachtet werden, da

Zusammenfassung

130

vermutlich entweder das Signal zur Transphosphorylierung fehlte, oder sie

Komponenten eines Phosphorelay-Systems sind.

Auf der Basis von in vivo-Quervernetzungen konnten neben einem weiteren

Antwortregulator, eine Vielzahl an putativen Interaktionspartnern nachgewiesen

werden, die in verschiedene grundlegende metabolische Vorgänge involviert sind.

Phänotypische Analysen einer ∆bphO- und ∆bphP-Deletionsmutante deuten auf eine

Rolle des Phytochroms in der Zell-Zell-Kommunikation hin. Letztendlich liefert die

vorliegende Arbeit Hinweise, dass das apo-Phytochrom noch in weitere

physiologische Prozesse involviert zu sein scheint.

Zudem konnte gezeigt werden, dass das Phytochrom in der Stationärphase eines

proteolytischen Abbaus unterliegt.

In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der

Phosphodiesterase nbdA näher charakterisiert. Phosphodiesterasen sind durch ihre

enzymatische Hydrolyse des sekundären Botenstoffes c-di-GMP an der Regulation

zwischen einer planktonischen und sessilen Lebensweise in Biofilmen beteiligt. NbdA

vermittelt dabei eine NO-induzierte Dispersion des Biofilms. Die in diesem

Zusammenhang postulierte erhöhte Transkription von nbdA in Anwesenheit von NO

konnte jedoch nicht bestätigt werden. Dies impliziert daher eher eine Regulation der

NO-induzierten Biofilmauflösung auf Proteinebene über die N-terminal lokalisierte

membranständige MHYT-Domäne, die putativ als Gassensor fungiert. Die

durchgeführten Reportergenanalysen deuten weiterhin auf eine Transkriptions-

kontrolle durch den Flavohämoglobin-Regulator FhpR unter sauerstofflimitierenden

Bedingungen hin.

.

Summary

131

6. Summary

Phytochromes are red/far-red light sensing photoreceptors whose light absorbing

properties are mediated by a bound chromophore. Originally believed to be limited to

plants, they were nowadays also found in fungi, cyanobacteria and heterotrophic

bacteria. Especially their occurrence in non-photosynthetic, heterotrophic organisms

remains a mystery. Among those organisms is the opportunistic pathogen

Pseudomonas aeruginosa. With the gene products of bphO and bphP, P. aeruginosa

is able to form a holo-phytochrome. While bphO encodes a heme oxygenase, which

produces the chromophore BV IXα by heme cleavage, bphP encodes the apo-

protein. Bacterial phytochromes consist of an N-terminal histidine kinase domain and

therefore represent sensor proteins of a two component signal transduction system.

Using different experimental strategies this thesis presents an overview of the in vivo

role of the bacterial phytochrome of P. aeruginosa. The homolog isolation and

subsequent biochemical characterization supplement the existing data and confirm

the functionality of a red/far-red light photoreceptor with BV IXα as the native

chromophore as well as the light-independent kinase activity.

Reporter gene analysis discovered a complex regulation of the phytochrome operon.

Besides the known RpoS-dependent regulation of the bphOP-cotranscript, an

influence of the quorum sensing systems was observed. In addition, this analysis

revealed an additional promoter for bphP, which is also regulated in a cell-density

dependent manner.

To gain insight into the downstream signaling pathway of PaBphP, a genetic screen

was established based on already existing transcriptome data. This study discovered

three putative response regulators. A direct phosphotransfer of these regulators

failed, probably due to the absence of a signal for transphosphorylation or because

these regulators represent components of a more complicated phosphorelay system.

In vivo cross-linking experiments identified another putative response regulator in

addition to several further putative interaction partners, which are involved in different

basic metabolic pathways.

Summary

132

Furthermore, phenotypical investigations of ∆bphO- and ∆bphP-mutants imply a role

for the phytochrome during cell-to-cell-communication. Finally, this thesis provides

hints for the involvement of the apo-phytochrome in other physiological processes.

In addition it was demonstrated the phytochrome undergoes proteolysis in the

stationary phase.

The aim of the second part of this thesis was to characterize the transcriptional

regulation of the phosphodiesterase nbdA. Based on the ability of

phosphodiesterases to hydrolyze the second messenger c-di-GMP, they are involved

in the regulation between a planktonic and sessile lifestyle in biofilms. In this regard,

NbdA has an impact on the NO-induced dispersion of biofilms. The postulated

increased nbdA-expression though NO could not be verified. This rather implicates a

regulation of the NO-induced biofilm dispersion via controlling the protein activity

mediated by the N-terminal membrane-bound MHYT-sensor domain, which putatively

binds gas. However, expression studies also indicate a transcriptional regulation by

the flavohemoglobin regulator FhpR under oxygen limited conditions.

Literaturverzeichnis

133

7. Literaturverzeichnis

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Anhang

149

8. Anhang

8.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation

Publikationen

Barkovits, K., Schubert B., Heine, S., Scheer, M. and Frankenberg-Dinkel, N.

(2011). „Function oft he bacteriophytochrome BphP in the RpoS/Las quorum-sensing

network of Pseudomons aeruginosa.“ Microbiologie 157(6):1651-1664.

Li, Y., Heine, S., Entian, M., Sauer, K. and Frankenberg-Dinkel, N. (2013). „NO-

induced biofilm dispersion in Pseudomonas aeruginosa is mediated by an MHYT

domain-coupled phosphodiesterase.“ J Bacteriol 195(16):3531-3542.

Konferenzbeiträge

Posterpräsentationen:

Heine S., Barkovits K., Scheer M. and Frankenberg-Dinkel N. (2011).

„The phytochrome regulon of Pseudomonas aeruginosa“

Annual Meeting of the VAAM (Vereinigung für Allgemeine und Angewandte

Mikrobiologie), Karlsruhe, Book of abstracts p. 239



International conference on tetrapyrrol photoreceptors of photosynthetic organisms

(ICTPPO), Berlin, Book of abstracts poster no: P-D10 Heine S., Barkovits K., Scheer M. and Frankenberg-Dinkel N. (2011).


Pseudomonas Conference, Sydney, Australia, Book of abstracts p. 77

Anhang

150




Mikrobiologie), Tübigen, Book of abstracts p. 239

Vorträge:

Heine S., Barkovits K., Scheer M. und Frankenberg-Dinkel N. (2011).

„Das Phytochrom-Regulon in Pseudomonas aeruginosa“

Tetrapyrrol Retreat, Bochum, no book of abstracts

Heine, S., Li, Y., Entian, M., Sauer, K. and Frankenberg-Dinkel, N. (2013).

„NO-induced dispersion of Pseudomonas aeruginosa biofilms is mediated by the

phosphodiesterase NbdA“


Mikrobiologie), Bremen, Book of abstracts p. 211

Anhang

151

8.2 Lebenslauf

Name: Sabrina Heine

Anschrift: Wittener Strasse 99, 44803 Bochum

Geburtsdatum: 24.08.1983

Geburtsort: Reutlingen

Familienstand: ledig

Staatsangehörigkeit: Deutsch

Schulausbildung:

1990-1994 Grundschule, Mössingen 1994-1999 Firstwaldgymnasium, Mössingen 1999-2001 Realschule, Dußlingen Abschluss Mittlere Reife 2001-2004 Ernährungswissenschaftliches Gymnasium,

Tübingen-Derendingen Abschluss der allgemeinen Hochschulreife

Studium:

10/2004-12/2009 Diplomstudiengang Biologie, Ruhr-Universität Bochum Abschluss Diplom

Promotion:

seit 6/2010 Anfertigung Doktorarbeit an der Ruhr-Universität Bochum Lehrstuhl Biologie der Mikoorganismen AG Physiologie der Mikroorganismen

Berufstätigkeit:

3/2009-7/2009 Studentische Hilfskraft Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen Ruhr-Univeristät Bochum

seit 06/2010 Wissenschaftliche Mitarbeiterin, Ruhr-Universität Bochum

Lehrstuhl Biologie der Mikoorganismen AG Physiologie der Mikroorganismen

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