INT. J. RADIAT. BIOL., 1967, VOL. 12, NO. 5, 453-458

Die Aktivitit der Phosphofruktokinase und der Fruktose-i, 6-diphosphatase im Lebergewebe der Maus nach Ganz-koirperbestrahlung

J(RGEN BERNDT und RENATE GAUMERT

Radiologisches Institut der Universitat, Freiburg i.Br., Albertstrasse 23,Deutschland

(Received 8 June 1967)

In der Mauseleber wurde nach einer Ganzk6rperbestrahlung mit 690 R dieAktivitat der Phosphofruktokinase (PFK) und der Fruktose-1, 6-Diphosphatase(FDPase) fiber einen Zeitraum von 17 Tagen nach der Bestrahlung gemessen.Die Aktivitit der PFK ist bei geffitterten Miusen vom 8. Tag p.r. bis zum 14.Tag p.r. erh6ht, bei 24 h hungernden Miusen erfolgt ein gleichmaf3iger Anstiegder Aktivitat bereits vom 4. Tag p.r. an und erreicht am 12. Tag p.r. Werte,die um 150% fiber der Aktivitit unbestrahlter Hungermause liegen. DerselbeAktivitaitsverlauf tritt auch nach Bestrahlung mit 810 R auf. Die Ergebnissedeuten auf eine erhohte Enzymsynthese nach der Bestrahlung hin.

Dagegen ist die Aktivitat der FDPase bei gefitterten Mausen nur am 11.Tag p.r., bei 24 h hungernden Maiusen vom 11-17. Tag p.r. geringffigigerh6ht. Der Aktivitaitsverlauf dieser beiden Enzyme nach der Bestrahlungstftzt die Annahme, dab3 nach einer Ganzk6rperbestrahlung die Glycolysenicht erniedrigt ist.

1. EinleitungIn frfuheren Arbeiten wurde gezeigt, daB der Glycogengehalt der Leber

bei 24 h hungernden Mausen nach einer Ganzkorperbestrahlung mit 690 Rstark ansteigt (Streffer 1966, Berndt und Gaumert 1967, Berndt und Ulbrich1967). Dieser Anstieg des Leberglycogens kann seine Ursache entweder ineinem durch die Strahleneinwirkung bedingten verminderten Abbau desGlycogens haben, was in einer Aktivitatsabnahme der glycogenolytischen oderglycolytischen Enzyme zum Ausdruck kommen sollte, oder aber in einer ver-starkten Bildung von Glucose und Glycogen. Die bisherigen Befunde sprechendafiIr, daB die Glycolyse-und damit der Abbau des Glycogens-iber einenZeitraum von mindestens vierzehn Tagen nach Bestrahlung mit 690 R nichterniedrigt zu sein scheint (Berndt und Ulbrich 1967, Streffer 1966).

Im Zusammenhang mit diesen Untersuchungen haben wir die Aktivititder Phosphofruktokinase (E.C. 2.7.1.11, ATP: D-Fruktose-6-Phosphat-1-Phosphotransferase) und der Fruktose-1, 6-Diphosphatase (E.C.3.1.3.11,D-Fruktose-1, 6-Diphosphat-1-Phosphathydrolase) im Lebergewebe der Mausnach einer Ganzkorperbestrahlung mit 690 R (LD90/30 Tage) fiber einenlangeren Zeitraum nach der Bestrahlung gemessen. Die Phosphofruktokinaseist eines der die Glycolyse regulierenden Enzyme (Passonneau und Lowry 1964,Weber, Singhal und Srivastava 1965) und katalysiert die Bildung des Fruktose-1,6-Diphosphates aus Fruktose-6-Phosphat. Die Umkehrung dieser Reaktion,die Spaltung des Fruktose-1, 6-Diphosphates wird durch die Fruktose-1,6-Diphosphatase katalysiert und ist einer der geschwindigkeitsbestimmenden

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Schritte der Gluconeogenese (Weber et al. 1965, Krebs 1963). ber Akti-vititsbestimmungen der Fruktose-1, 6-Diphosphatase in der Maiuseleber nachBestrahlung mit 690R wurde bereits von Streffer (1966) kurz berichtet; unjedoch die Aktivitaten der beiden Enzyme vergleichen zu k6nnen, haben wir dieFruktose-1, 6-Diphosphatase unter unseren Bedingungen mit bestimmt.

2. Material und Methoden2.1. Tiermaterial

Mannliche weif3e Mause stammten aus einem institutseigenen Auszucht-stamm, die Tiere erhielten Altromin als Standardkost und Wasser ad libitum.Hungertieren wurde 24 h vor dem Abtoten das Futter entzogen. Wasserwurde jedoch ad libitum verabreicht.

Die Bestrahlungsbedingungen waren dieselben wie friiher angegeben (Berndtund Gaumert 1967).

2.2. Bereitung des GewebshomogenatesDen Miusen wurde unter leichter Athernarkose die Leber entnommen und

das Organ sofort im 5-fachen Volumen 0,25 M Saccharoselosung, die 10-3 Man Cystein war, 3 min bei 0° im Potterhomogenisator homogenisiert, das Homo-genat im Verhaltnis 1:1 mit Homogenisierungsmedium verduiinnt und anschliel3-end 45 min bei 105 000 g zentrifugiert (Spinco L 50). Die Enzymaktivitatenwurden im klaren, partikelfreien tUberstand gemessen.

Die Bestimmung des Proteingehaltes erfolgte nach der Biuretmethode(Beisenhertz, Boltze, Biicher, Czok, Garbade, Meyer-Arendtund Pfleiderer 1953).

2.3. Bestimmung der Phosphofruktokinase-Aktivitdt (PFK)Die Bestimmung der PFK-Aktivitt erfolgte nach der Methode von Ling,

Byrne und Lardy (1955). Der auf Grund der Protein-, ATP-, F-6-P-, Mg++-und pH-Abhangigkeit ausgearbeitete Testansatz hatte folgende Zusammen-setzung: in einem Gesamtvolumen von 1,00ml. waren enthalten, 100/LMoleTrispuffer pH8,2, 6Mole ATP, 3Mole MgCI2 , 10/Mole Cystein, jeweils0,01ml. der Enzymsuspensionen der Aldolase, Triosephosphatisomerase undGlycerinphosphatdehydrogenase (Boehringer, Mannheim), etwa 0,2 jMoleDPNH sowie 0,005-0,01ml. (0,1-0,4mgProtein) des 105000 g tCberstandes.Nach einem Verlauf von 3 min bei 37° wurde die Reaktion durch Zugabe von3/aMolen Fruktose-6-Phosphat gestartet, und die Extinktionsabnahme fibermindestens 3 min verfolgt. Messung bei 366mx bei 37° im Photometer Eppen-dorf.

2.4. Bestimmung der Fruktose-1, 6-Diphosphat-Aktivitiit (FDPase)Die Aktivititsbestimmung der FDPase erfolgte nach der Methode von

Racker (1962). Aufgrund der Fruktose-1, 6-Diphosphat-, Protein- und Mg++.-Abhangigkeit erffillte folgende Testzusammensetzung alle Bedingungen einesenzymatischen Testes: In einem Gesamtvolumen von 1,00ml. waren enthalten100/[Mole Trispuffer pH 8,8, 5Mole F-1, 6-P, 2/Mole MgK2 -EDTA, 0,01 ml.Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, 0,01 ml. Phosphoglucose-Isomerase (beideHilfsenzyme als Kristallsuspensionen von Boehringer, Mannheim) sowie 0,01 ml.(0,1-0,35mg Protein) des 105000 g berstandes. Messung bei 366 m imPhotometer EpFendorf bei 37 ° . Start der Reaktion nach 2min. Vorlauf

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durch Zugabe von 1 tMol TPN. Gemessen wurde die Extinktionszunahmefiber mindestens 3 min.

Die Enzymaktivitaiten sind angegeben als spezifische Aktivitaten: MoleUmsatz pro mg Protein pro 60 Min bei 37 ° . Jeder Punkt in den Kurven derFiguren entspricht dem Mittel aus 10 Messungen mit 10 Lebern. Die Balkenan den Kurven sind Standardabweichungen. Die Signifikanz der Abweichungengegeniiber den jeweiligen Normalwerten wurde durch den Student-t-Testgeprfift.

3. Ergebnisse und Diskussion3.1. Die Aktivitdt der Phosphofruktokinase

Unter den Bedingungen unseres Testes fanden wir fuir die PFK in der Lebergefitterter Mause eine spezifische Aktivitit von 2,62+0,10FMole Umsatzpro mg Protein pro 60min bei 37° (=240/Mole pro g Frischgew./h bei 37°).Bei 24 h hungernden Miusen sinkt die Aktivitdt der PFK auf 1,75 [tMole/mg/60min bei 37° (137 pMole/g/h bei 37°). Die Aktivitat der PFK ist in der Lebergefitterter und 24 h hungernder Miuse sehr niedrig und sie ist neben derHexokinase eines der 'key glycolytic enzymes' (Weber et al. 1965).

Nach einer Ganzk6rperbestrahlung mit 690 R bleibt die Aktivitait der PFKbis auf einen geringffigigen Anstieg am 2. Tag p.r. bis zum 7. Tag p.r. gegen-fiber dem Normalwert unverindert (Figur 1).

pMt glh

..... ,,- ,. , 1 o 1i/ o.p.r

Figur 1. Die Aktivitait der Phosphofruktokinase in der Miuseleber nach 690 R. Geftitterte( -) und 24 h hungernde ( -- ) Tiere.

Vom 8.-14. Tag p.r. erfolgt ein teilweise betrichtlicher Aktivititsanstieg.Es hat den Anschein, daB diese erh6hten Aktivititen ihre Ursache in derStrahlenwirkung haben. Wre nmlich die Aktivitatsanderung eine Folge derbekannten Appetitlosigkeit der Tiere nach der Bestrahlung, dann sollte maneinen Aktivitiitsabfall der PFK erwarten, da die Aktivitat hungernder Tieretiefer als die geffitterter liegt.

DaB es sich bei den hohen PFK-Aktivitdten um einen Strahleneffekt handelt,wird durch die Ergebnisse bei 24 h hungernden Mausen gestfitzt. Diese Tieresind zur Zeit der Leberentnahme alle im selben Erniihrungszustand. Auchhier erfolgt, und zwar bereits ab 4. Tag nach der Bestrahlung, ein gleich-maBiger Aktivitiitsanstieg auf Werte, die teilweise um 150 Prozent fiber demunbestrahlter Hungermause liegen (Figur 1 und Tabelle). Diese Erh6hung

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ist auch bei 24h hungernden Miusen zu beobachten, die mit 810R bestrahltwurden (LD 100/30 Tage). Der Aktivitatsanstieg ist bei beiden Strahlendosensehr hnlich (Figur 3).

PFK FDPase

gefitt. Hunger gefitt. Hunger

12 h - 0,005-0,001 - -1. - 0,05-0,025 - 0,02-0,012. 0,05-0,025 - - -3. - - - -

4. - 0,025 5. - 0,01-0,005 0,10-0,05 -6. - 0,01 0,10-0,05 -7. - 0,025 - -8. 0,05-0,025 0,025 - 0,30-0,209. < 0,001 < 0,001 0,05-0,025 0,20-0,10

10. 0,10-0,05 < 0,001 - 0,20-0,1011. 0,05-0,025 < 0,001 0,05-0,025 0,05-0,02512. 0,10-0,05 < 0,001 0,30-0,20 0,05-0,02513. 0,001 < 0,001 - 0,005-0,00114. 0,005-0,001 < 0,001 - 0,025-0,0217. - <0,001 - 0,005

Unsere Befunde stehen im Einklang mit denen von Weber und Cantero(1959), die bei 18 h hungernden Ratten nach 600 R ufiber 8 Tage p.r. einen Anstiegder PFK in der Leber fanden.

Die Aktivitit der PFK wird unter physiologischen Bedingungen durcheine Reihe von Faktoren wesentlich beeinfluBf3t: so verursachen AMP, FDPsowie anorg. Phosphat eine Aktivierung des Enzyms (Passonneau und Lowry1964), whrend ATP, Mg++ und Citrat hemmen. Wir haben die Aktivitatdes Enzyms unter optimalen Bedingungen gemessen (vergl. Methoden) undglauben annehmen zu knnen, dat die beobachteten erh6hten spezifischenAktivititen nach beiden Strahlendosen eher auf eine vermehrte Enzymsynthesezuriickzuffihren sind als auf eine Aktivierung von inaktivem Enzymproteindurch z.B. anorganischesPhosphat oder FDP, die nach einer Ganzkorper-bestrahlung vermehrt auftreten (Berndt und Gaumert 1967, Waldschmidt:unver6ffentlicht).

Die bereits friiher geiuBerte Vermutung, daB nach der Bestrahlung dieGlycolyse auch bei Hungertieren gegenuiber dem unbestrahlten Tier erhohtzu sein scheint, wird durch die Messungen an der PFK weiter bestitigt. Wederdie PFK noch die Pyruvatkinase (Berndt und Ulbrich 1967) vermindern nachder Bestrahlung den Abbau des Glucose-6-Phosphates zum Pyruvat, zu einemZeitpunkt, wenn das Leberglycogen wesentlich erh6ht gefunden wird (Streffer1966, Berndt und Gaumert 1967). Wir haben Anzeichen dafir, daB auch dieAktivitat der Hexokinase nach 690 R fiber den Normalwert ansteigt.

3.2. Die Aktivitdt der Fruktose-1, 6-DiphosphataseDie FDPase katalysiert die Umkehrung der durch die PFK katalysierten

FDP-Bildung und ist eines der limitierenden Enzyme der Gluconeogenese.

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Wir fanden fr die Aktivitat dieses Enzyms in der Leber gefitterter Miuseeine spezifische Aktivitit von 6,88 +0,47/Mole Umsatz pro mg Protein pro60 min bei 37 ° . In der Leber 24 h hungernder Miuse betrug die spez. Aktivitit6,05 + 0,60 pMole/mg Protein/60 min bei 37 ° . Normal- und Hungerwert sinddamit nicht signifikant voneinander verschieden.

Nach einer Ganzk6rperbestrahlung mit 690 R ist die FDPase-Aktivititin gefuitterten Miusen nur am 9. und 11. Tag p.r. geringffigig, aber signifikant,erhoht (Figur 2 und Tabelle).

Figur 2. Die Aktivitait der Fruktose-1, 6-Diphosphatase in der Mauseleber nach 690 RGefuitterte ( ) und 24 h hungernde (- - - -) Tiere.

jMImrIg/h

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

Alv ... . i , , i f i i i i i i ji I I i

212181 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 d.pr.

Figur 3. Phosphofruktokinase- und Fruktose-1, 6-Diphosphatase-AktivitAt in der Leber24 h hungernder Mause nach 690 R ( ) bzw. 810 R (----).

Bei 24h hungernden Mausen tritt eine Aktivititssteigerung nur vom 11.bis zum 14. Tag p.r. auf. Dieser spite Anstieg wurde auch von Streffer (1966)gefunden.

In Figur 3 sind die Aktivititen der PFK und der FDPase in der Leber 24hhungernder Mause nach Bestrahlung mit 690 R dargestellt. Es ist bemerkens-wert, daB zur selben Zeit, in der die PFK-Aktivitat stark erh6ht ist, auch dieAktivitat der FDPase hher ist, wenn auch deren Aktivitatsanstieg wesentlichgeringer ist. Bei erh6hter PFK-Aktivitt wre im Normaltier aber eineverringerte Aktivitat der FDPase als dem entgegengesetzt wirkenden Enzym

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zu erwarten. Andernfalls m3te es zu einer Art 'Kurzschluss' kommen,weil das gebildete FDP sofort wieder hydrolytisch gespalten wird.

Bei den komplexen Vorgangen nach einer Ganzkorperbestrahlung imSaugetier ist es denkbar, daB solche enzymatischen 'Kurzschlisse' als Folgeeiner gestorten Regulation auftreten und es ist auffallend, daB gerade zu einemZeitpunkt der akuten Strahlenkrankheit und parallel mit einem steilen Anstiegder Absterbekurve der Mause die starksten Schwankungen der Enzymaktivititenauftreten.

ANERKENNUNG

Dem Bundesministerium fr wissenschaftliche Forschung sowie der StiftungVolkswagenwerk danken wir fir die grol3zfiigige Unterstiitzung dieser Arbeiten.

The activities of phosphofructokinase (PFK) and fructose-1,6-diphosphatase (FDPase)were measured in mouse liver over a period of 17 days after whole-body x-irradiation.PFK-activity is enlarged in fed mice from the 8th to the 14th day after irradiation, while inmice starved for 24 hours a continuous increase is observed from the 4th day up to the 2j-foldincrease of the unirradiated controls. This course of PFK-activity is also observed after810 R. It is assumed that an enhanced enzyme synthesis takes place after irradiation.FDPase-activity is only little increased 11 days p.r. in fed mice and from 11 to 17 daysafter irradiation in mice starved for 24 hours. The activity of these two enzymes seemsto confirm the assumption that glycolysis is not diminished after whole-body x-irradiation.

Apres l'irradiation corporelle totale d'une souris aux rayons X(690 R), on a mesuredans le foie, 17 jours apres l'irradiation, l'activit6 de la phosphofructinase (PFK) et de lafructose-1,6-diphosphatase (FDPase). Chez les souris alimentees, l'activit6 de PFKest lev6e du 86me jour au 14mne jour apres l'irradiation; chez les souris jeun depuis 24heures, on a trouve un accroissement continu de l'activite, d6j a A partir du 4bme jour apres'irradiation, et qui atteint au 126me jour, des rsultats 150 pour cent plus eleves que chez lessouris non aliment~es et non irradi6es. On a trouve aussi qui l'activite PFK suivait le memecours, apres exposition A 810 R. Les resultats montrent une synthcse amplifiee des enzymesapres l'irradiation.

Par contre, l'activite FDPase n'augmente que trs peu 11 jours, apres l'irradiationchez les souris aliments, et de 11 a 17 jours apres l'irradiation chez les souris jeun depuis24 heures. L'activit6 de ces deux enzymes semble confirmer l'hypothese que la glycolysen'est pas diminue par irradiation corporelle totale aux rayons X.

LITERATUR

BEISENHERTZ, G. H., BOLTZE, J., BUCHER, TH., CZOK, R., GARBADE, K. H., MEYER-ARENDT,E., und PFLEIDERER, G., 1953, Z. Naturf. B, 8, 555.

BERNDT, J., und GAUMERT, R., 1967, Int. . Radiat. Biol., 11, 593.BERNDT, J., und ULBRICH, O., 1967, Strahlentherapie, 133, 288.KREBS, H. A., 1963, Advances in Enzyme Regulation, Vol. 2 (New York: Pergamon Press),

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Vol. 3 (New York: Pergamon Press), S. 43.

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