TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN

Chirurgische Klinik und Poliklinik des Klinikums rechts der Isar

(Direktor: Univ.-Prof. Dr. H. Friess) und

Institut für präklinische Forschung (Direktor: Univ.-Prof. Dr. B. Gänsbacher)

Die Ausprägung des Ischämie-/Reperfusionsschadens nach orthotoper Lebertransplantation mit retrograder

Reperfusion im Rattenmodell

Hans Dietrich Kern

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Medizin (Dr. med.) genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. D. Neumeier Prüfer der Dissertation: 1. Priv.-Doz. Dr. M.J. Stangl 2. Univ.-Prof. Dr. H. Friess

Diese Dissertation wurde am 24.06.2008 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Medizin am 22.10.2008 angenommen.

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Inhaltsverzeichnis 1 Allgemeiner Teil ........................................................................................ 4

1.1 Klinische Lebertransplantation .................................................................................. 4 1.1.1 Historischer Rückblick.................................................................................................. 4 1.1.2 Aktueller Stand der Lebertransplantation...................................................................... 5

1.1.2.1 Die orthotope Lebertransplantation ....................................................................................... 5 1.1.2.2 Die heterotope Lebertransplantation...................................................................................... 5 1.1.2.3 Die Split-Lebertransplantation............................................................................................... 5 1.1.2.4 Die „Piggy-Back“ Technik .................................................................................................... 6

1.2 Pathophysiologie des Ischämie-/Reperfusionsschadens............................................ 8

1.2.1 Primäres Organversagen ............................................................................................... 8 1.2.2 Der Ischämie-/Reperfusionsschaden ............................................................................. 8

1.2.2.1 Einfluss des Ischämie-/Reperfusionsschadens auf Gefäßendothelzellen............................... 9 1.2.2.2 Freie Sauerstoffradikale....................................................................................................... 10 1.2.2.3 Die Rolle der Leukozyten beim Ischämie-/Reperfusionsschaden........................................ 11 1.2.2.4 Zusammenspiel Proinflammatorischer Mediatoren ............................................................. 11

1.3 Korrelation zwischen Organqualität und Ischämie-/Reperfusionsschaden ......... 13

1.4 Therapieansätze zur Vermeidung des Ischämie-/Reperfusionsschadens ............. 14

1.4.1 Pharmakologische Strategien ...................................................................................... 14 1.4.1.1 Antioxidantien ..................................................................................................................... 14 1.4.1.2 Adenosin und Stickoxid-(NO) Donatoren ........................................................................... 15 1.4.1.3 Pentoxyphyllin..................................................................................................................... 16 1.4.1.4 Prostaglandine...................................................................................................................... 16

1.4.2 Gentechnologische Strategien ..................................................................................... 16 1.4.3 Chirurgische Strategien ............................................................................................... 17

1.5 Die Rattenlebertransplantation ................................................................................ 20 1.5.1 Die Morphologie der Rattenleber................................................................................ 20

1.5.1.1 Makroskopische Anatomie .................................................................................................. 20 1.5.1.2 Lobierung............................................................................................................................. 21 1.5.1.3 Gefäßversorgung.................................................................................................................. 21 1.5.1.4 Ligamente ............................................................................................................................ 22 1.5.1.5 Gallengang und Gallenblase ................................................................................................ 22

1.5.2 Mikroskopische Anatomie .......................................................................................... 23 1.5.2.1 Leberläppchen...................................................................................................................... 24 1.5.2.2 Portalvenenläppchen............................................................................................................ 25 1.5.2.3 Leberazinus.......................................................................................................................... 26

1.5.3 Das Gallengangssystem............................................................................................... 26 1.5.4 Der zelluläre Aufbau der Leber................................................................................... 27

1.5.4.1 Hepatozyten ......................................................................................................................... 27 1.5.4.2 Kupfferzellen ....................................................................................................................... 28 1.5.4.3 Ito-Zellen ............................................................................................................................. 28 1.5.4.4 Pit-Zellen ............................................................................................................................. 29

1.5.5 Entwicklung der orthotopen Rattenlebertransplantation ............................................. 29

2 Fragestellung ...........................................................................................32

2

3 Material und Methode............................................................................33

3.1 Genehmigung der Tierversuche................................................................................ 33

3.2 Versuchstiere .............................................................................................................. 33

3.3 Versuchsgruppen........................................................................................................ 34

3.4 Chirurgisches Vorgehen ............................................................................................ 34 3.4.1 Operationsvorbereitung und Anästhesie ..................................................................... 34 3.4.2 Operationstechnik........................................................................................................ 36

3.4.2.1 Präparationsphase der Spenderoperation ............................................................................. 36 3.4.2.2 Perfusionsphase und Organkonservierung........................................................................... 37 3.4.2.3 Präparationsphase der Empfängeroperation......................................................................... 38 3.4.2.4 Einführen eines Splints in die A. hepatica communis.......................................................... 38 3.4.2.5 Explantation der Eigenleber................................................................................................. 39 3.4.2.6 Anastomosierung der suprahepatischen V. cava inferior..................................................... 39 3.4.2.7 Anastomosierung der Pfortader ........................................................................................... 40 3.4.2.8 Anastomosierung der infrahepatischen V. cava inferior...................................................... 40 3.4.2.9 Wiederherstellung der arteriellen Versorgung..................................................................... 40 3.4.2.10 Reperfusion der Transplantatleber....................................................................................... 40 3.4.2.11 Rekonstruktion des Gallengangs.......................................................................................... 41

3.5 Postoperative Nachsorge............................................................................................ 42 3.5.1 Blutentnahmen ............................................................................................................ 42 3.5.2 Sektion......................................................................................................................... 42

3.6 Untersuchungsmethoden ........................................................................................... 42 3.6.1 Intraoperatives Monitoring.......................................................................................... 42 3.6.2 Leberfunktionsparameter............................................................................................. 43

3.6.2.1 Laborchemische Bestimmungsmethoden ............................................................................ 43 3.6.3 Histologie .................................................................................................................... 44

3.7 Statistische Auswertung............................................................................................. 45

4 Ergebnisse ................................................................................................52

4.1 Makroskopischer Aspekt nach Reperfusion............................................................ 52

4.2 Der postoperative Verlauf ......................................................................................... 52

4.3 Auswertung der Laborparameter............................................................................. 53 4.3.1 GOT............................................................................................................................. 53 4.3.2 GPT ............................................................................................................................. 55 4.3.3 Bilirubin ...................................................................................................................... 57 4.3.4 Alkalische Phosphatase ............................................................................................... 58 4.3.5 GLDH.......................................................................................................................... 60

4.4 Auswertung der Histologie ........................................................................................ 62 4.4.1 Nekrosetypen............................................................................................................... 62 4.4.2 Perivaskuläres Ödem................................................................................................... 63 4.4.3 Anzahl der Nekroseherde ............................................................................................ 64 4.4.4 Minimale Größe der Nekroseherde ............................................................................. 66 4.4.5 Maximale Größe der Nekroseherde ............................................................................ 68 4.4.6 Zonenaufteilung der Nekrosen .................................................................................... 70

3

5 Diskussion ................................................................................................72

5.1 Problematik des I-/R-Schadens bei der Lebertransplantation .............................. 72 5.2 Die Ratte als Versuchstier ......................................................................................... 74

5.3 Vergleich verschiedener Lebertransplantationsmodelle ........................................ 75

5.4 Intra- und postoperative Komplikationen ............................................................... 77

5.4.1 Komplikationen hervorgerufen durch die Narkose ..................................................... 77 5.4.2 Komplikationen bei der Präparation des Spenders...................................................... 77 5.4.3 Komplikationen bei der Lebertransplantation............................................................. 78

5.5 Aussagekraft der Laborwerte ................................................................................... 79

5.6 Interpretation der Ergebnisse................................................................................... 80

6 Zusammenfassung...................................................................................84

7 Literatur...................................................................................................88

8 Abkürzungen .........................................................................................109

9 Danksagung ...........................................................................................110

10 Lebenslauf..............................................................................................111

4

1 Allgemeiner Teil

1.1 Klinische Lebertransplantation

1.1.1 Historischer Rückblick

Am 01. März 1963 wurde die weltweit erste klinische Lebertransplantation von Thomas E.

Starzl in Denver durchgeführt (114). Jedoch blieben dieser, sowie zahlreiche weitere

Versuche erfolglos, bis Starzl 1967 die erste erfolgreiche Lebertransplantation vornahm. 1968

und 1969 berichteten Sir Roy Calne in Cambridge und A. Gütgemann in Bonn ebenfalls über

gelungene Lebertransplantationen. Nach zunehmender Erfahrung in der klinischen

Nierentransplantation und in der experimentellen Lebertransplantation startete R. Pichlamyr

1972 ein Transplantationsprogramm für die Lebertransplantation in Hannover

(14,15,90,101).

Die Ergebnisse der klinischen Lebertransplantation mit einer Einjahres-Überlebensrate von

unter 30% waren jedoch sehr unbefriedigend und wurden bis 1978 im Wesentlichen nur in

drei Kliniken kontinuierlich durchgeführt, nämlich in Denver/Pittsburg (Starzl), Cambridge

(Calne) und Hannover (Pichlmayr) (116).

Im Laufe der Zeit erlebte die Lebertransplantation eine rasante Aufwärtsentwicklung, die

durch folgende Faktoren begründet war:

• Im Jahre 1978 verabreichte Calne erstmals Cyclosporin A an

Transplantationspatienten, nachdem er in umfangreichen Studien an Hunden eine

deutliche Verbesserung der Überlebenszeit nach Nierentransplantation festgestellt

hatte (18).

• Eine Verminderung des operativen Risikos konnte durch die Verwendung eines

extrakorporalen Bypass-Systems in der anhepatischen Phase sowie der Verbesserung

der Gefäß- und Gallengangsanastomosierung erreicht werden.

• Durch die Möglichkeit zur Mehrorganentnahme vergrößerte sich die Anzahl der

transplantierbaren Organe.

• Die Entwicklung von Organkonservierungslösungen ermöglichte den weiteren

Transport von Organen und eine bessere Organqualität bei der Transplantation (56).

5

• Eine Erweiterung der Operationsindikationen und die Vorverlegung des

Operationszeitpunktes verbesserten die postoperative Prognose.

Diese Weiterentwicklungen führten letztendlich zu einer Etablierung der Lebertransplantation

als Standardverfahren.

1.1.2 Aktueller Stand der Lebertransplantation

Die Lebertransplantation (LTx) ist mittlerweile ein Standardverfahren zur Therapie von sich

im Endstadium befindlichen, irreversiblen Lebererkrankungen (115).

Während die Anzahl der Lebertransplantationen in Deutschland im Jahre 1985 lediglich 58

betrug, wurden im Jahre 2005 bereits 885 Lebertransplantationen durchgeführt (35). Die 1-

Jahres-Überlebenszeit nach Lebertransplantation beträgt heute weit über 80%, die 5-Jahres-

Überlebenszeit über 70% (46,10).

Im Wesentlichen unterscheidet man heute zwischen einer orthotopen, einer heterotopen, einer

Split- und einer „Piggy-Back“ Lebertransplantation.

1.1.2.1 Die orthotope Lebertransplantation

Hierbei erfolgt die End-zu-End-Anastomosierung von infra- und suprahepatischer V. cava

inferior, Anastomosierung des Spender-Truncus coeliacus auf die A. hepatica communis am

Konfluenz der A. gastroduodenalis, End-zu-End-Anastomosierung der Pfortader und End-zu-

Seit-Anastomosierung des Gallengangs. Der venöse Blutfluss zwischen der oberen und

unteren Körperhälfte wird während der anhepatischen Phase mit Hilfe eines femoro-porto-

axillären Bypasses sichergestellt.

1.1.2.2 Die heterotope Lebertransplantation

Das Spenderorgan wird unterstützend zum geschädigten Eigenorgan an anderer anatomischer

Stelle implantiert.

1.1.2.3 Die Split-Lebertransplantation

Die Split-, sowie die Verwandten-Lebertransplantation gewinnt aufgrund des bestehenden

Organmangels immer mehr an Bedeutung. Ursprünglich für die Lebertransplantation bei

Kindern verwendet, wurde später eine Leberteilungstechnik entwickelt, bei der zwei

Leberhälften für je einen erwachsenen Empfänger gewonnen werden.

6

1.1.2.4 Die „Piggy-Back“ Technik

Diese Technik birgt den Vorteil, dass der Verlauf der V. cava inferior nicht unterbrochen

wird. Vielmehr wird die Spender-V. cava mit der linken und mittleren Lebervene des

Empfängers anastomosiert. Die rechte Lebervene wird, wie die infrahepatische Spender-

V.cava ligiert. Die Rekonstruktion von Arterie, Pfortader und Gallengang erfolgt wie bei der

orthotopen Lebertransplantation.

Die Indikation zur Lebertransplantation ist immer dann zu erwägen, wenn bei einem Patienten

eine chronische, progrediente Lebererkrankung vorliegt und alle konservativen

Therapiekonzepte ausgeschöpft sind. Krankheitsbilder, die eine Lebertransplantation

notwendig machen können, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Dringlichkeit einer

Lebertransplantation wird mit dem MELD-Score erfasst, welcher 1998 vom „US Department

of Health and Human Services“ festgelegt wurde und den bis dahin gültigen Child-Turcotte-

Pugh-Score ablöste.

Tabelle 1: Indikationen zur Lebertransplantation

Leberparenchymerkrankungen

• posthepatitisch (Hepatitis B, C, D) • autoimmun • alkoholisch • kryptogen

Cholestatische Lebererkrankungen

• Primär biliäre Zirrhose (PBC) • Sekundär biliäre Zirrhose • Primär sklerosierende Cholangitis (PSC) • Sekundär sklerosierende Cholangitis (SSC) • Extrahepatische Gallengangsatresie • Progressive familäre intrahepatsiche Cholestase (Morbus Byler) • Alagille-Syndrom • Kongenitale Fibrosen • Graft-versus-Host-Disease (GvHD) • Chronische Abstossung • Cholestatisch verlaufende Sarkoidose • Medikamentös-toxische Cholestase • Caroli-Syndrom

Primäre Stoffwechselerkrankungen

• a1-Antitrypsinmangel • Morbus Wilson • Hämochromatose • Tyrosinämie • Galaktosämie • Glykogen-Speicherkrankheiten • Lysomale Speicherkrankheiten

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• Crigler-Najjar Typ I • Primäre Hyperoxalurie Typ I • Erythropoetische Protoporphyrie • Primäre Blutungsstörungen (ggf. mit Budd-Chiari-Syndrom) • Störungen des Harnstoffzyklus (z.B. Citrullinämie) • familiäre Amyloidose

Sekundäre Stoffwechselerkrankungen

• Kurzdarmsyndrom

Vaskuläre Erkrankungen

• Fulminante Virushepatitis (Hepatitis A,B,C,D,E) • Intoxikationen

• Amanita phalloides (Knollenblätter Pilz), • Paracetamol (Acetaminophen), • Halothan, • Tetrachlorkohlenstoff, • Ecstasy u.a.

• Akute Schwangerschaftsfettleber • HELLP-Syndrom • Budd Chiari Syndrom • Primäre Nichtfunktion

Maligne Erkrankungen

• Hepatozelluläres Karzinom • Neuroendokrine Tumore (strenge Indikationsstellung) • Hepatoblastom • Cholangiozelluläres Karzinom

Andere Ursachen

• Leberzysten • Lebertrauma

Ein großes Problem, welches heute noch nicht gelöst ist, stellt die zunehmende

Organknappheit dar, welche dazu führt, dass ein erheblicher Teil der Patienten vor Erhalt

einer geeigneten Spenderleber versterben (78,36). Aus diesem Grund werden immer mehr

marginale („schlechte“) Organe transplantiert, welche sich überwiegend durch Zirrhose oder

Leberverfettung auszeichnen (2,45). Die Leberverfettung ist einer der Hauptgründe für das

initiale Leberversagen nach Transplantation (107).

8

1.2 Pathophysiologie des Ischämie-/Reperfusionsschadens

1.2.1 Primäres Organversagen

Die schwerste Komplikation, die nach Lebertransplantation durch einen Ischämie-

/Reperfusionsschaden verursacht werden kann, ist das primäre Organversagen PNF=primary

non function). Die Häufigkeit des Auftretens eines primären Organversagens wird in der

Literatur nicht einheitlich angegeben (4,2-8,4%) (11,80,94,95).

Das primäre Organversagen nach Transplantation stellt ein multifaktorielles Geschehen dar,

welches sich aus schädigenden Einflüssen während der Spenderleberentnahme, der

Organkonservierung und der Reperfusion nach Transplantation zusammensetzt. Die Schwere

des Schadens ist abhängig von der kalten und warmen Ischämiezeit der Leber, der

Konservierungslösung, in der die Spenderleber bis zur Transplantation aufbewahrt wurde, als

auch von der Art der Reperfusion. Weiterhin besteht ein enger Zusammenhang zwischen

vorbestehender Schädigung der Leber, insbesondere einer Verfettung und dem Ischämie-

/Reperfusionsschaden (12,19). Technische Probleme, die zu einem frühen Versagen des

Spenderorgans führen, sind insbesondere Gefäßverschlüsse, so zum Beispiel die Thrombose

der A.hepatica oder der Pfortader.

1.2.2 Der Ischämie-/Reperfusionsschaden

Jedes Organ, das für eine Transplantation vorgesehen ist, muss primär konserviert werden.

Nach langen Phasen des Experimentierens wurde Mitte der 80er Jahre die heute weit

verbreitete University of Wisconsin Konservierungslösung in den klinischen Alltag mit

großem Erfolg eingeführt (8,56). Weitere Konservierungslösungen, welche heute im

klinischen Alltag Verwendung finden sind die HTK-Bretschneider-Lösung, die Eurocollins-,

sowie die Celsiorlösung (92,99,124,127). In der Lebertransplantation ist die University of

Wisconsin Lösung die am häufigsten verwendete Konservierungslösung.

Durch den zunehmenden Organmangel ist die Notwendigkeit gegeben, jedes verfügbare

Organ zu transplantieren und neue Strategien zur Minimierung des Schadens, hervorgerufen

durch Konservierung, Ischämie und Reperfusion, zu entwickeln.

Zunächst werden drei verschiedene Phasen, in denen es zur Organischämie kommt

unterschieden: die Phase der kalten Ischämie, die Phase der warmen Ischämie und die Phase

der Wiedererwärmung. Die kalte Ischämie ist beabsichtigt im Rahmen der Konservierung von

zu transplantierenden Organen, um metabolische Prozesse zu verlangsamen. Die warme

9

Ischämie entsteht im Rahmen von Trauma, Schock, Leberchirurgie (Pringle Manöver) und

Transplantation, also dann, wenn die physiologische Leberdurchblutung gestört ist. Die Phase

der Wiedererwärmung entsteht während der Organimplantation vor der Freigabe des

Blutflusses. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf den Bedingungen der

Lebertransplantation und somit auf der kalten Ischämie und der Ischämie während der

Wiedererwärmung.

Der Ischämie-/Reperfusionsschaden ist für ca.10 % des primären Organversagens nach

Lebertransplantation verantwortlich und eine gefährliche Komplikation, die das Leben des

Patienten unmittelbar gefährdet (38). Zwar gibt es Strategien, welche zu einer Reduktion das

Ischämie-/Reperfusionsschadens führen, jedoch gibt es bis heute noch keine

Behandlungsmöglichkeit, die einen Ischämie-/Reperfusionsschaden verhindern könnte.

1.2.2.1 Einfluss des Ischämie-/Reperfusionsschadens auf Gefäßendothelzellen

An der Entstehung des Ischämie/Reperfusionsschadens sind aktivierte Kupfferzellen,

Granulozyten, Sinusendothelzellen (SEC), Epithelzellen der postsinusoidalen Venolen und

freie Sauerstoffradikale beteiligt. Die Interaktion dieser Elemente führt zu strukturellen

Gewebeschäden, welche wiederum zu einer hepatozellulären Dysfunktion führen. Dabei sind

nichtparenchymatöse Zellen (Kupfferzellen, SEC) anfälliger für einen Schaden,

hervorgerufen durch kalte Ischämie, als Hepatozyten (66). Von den Gefäßwänden spalten sich

SEC ab und prolabieren in das Gefäßlumen, dabei werden das Zytoplasma und das

Zytoskelett dieser Zellen verändert. Durch die so entstandene Schädigung der Gefäßwand

kommt es zur Adhäsion von Thrombozyten und Leukozyten, was eine Störung der

Mikrozirkulation nach sich zieht (16,76). Außerdem kommt es im Rahmen der kalten

Ischämie zur Thrombozytendhäsion an SEC und zur Apoptose dieser (22,123). Als

Konsequenz dieser Vorgänge kommt es zur Gewebshypoxie, welche den Energiestoffwechsel

und die Funktion einzelner Enzyme beeinträchtigt. Es resultiert eine Entleerung von Adenosin

Triphosphat (ATP), eine Verminderung der Aktivität der membranständigen Natrium-

Kalium-ATPase und daraus folgend eine Erhöhung des intrazellulären Natriums und ein

Zellödem(8). Ein wichtiges Element in der Entstehung des Ischämie-/Reperfusionsschadens

ist die Aktivierung von geschädigten Epithelzellen (39). Diese exprimieren

Adhäsionsmoleküle auf ihrer Oberfläche (z.B. ICAM-1 und VCAM-1) sowie major

histocompatibility complex (MHC) Antigene, was zu einer Interaktion zwischen Leukozyten

und Epithelzellen führt (66). Das wichtigste Adhäsionsmolekül auf Epithelzellen der

postsinusoidalen Epithelzellen ist P-Selektin (118,130). Dieses kann nicht von SEC gebildet

10

werden. Allerdings können SEC eine Reihe von anderen Adhäsionsmolekülen ausbilden. Die

durch diese Interaktion aktivierten Leukozyten führen ihrerseits zu einer Gewebsschädigung.

Kupfferzellen, die gewebsständigen Makrophagen des Lebergewebes, sind ebenfalls an der

Entstehung des Ischämie-/Reperfusionsschadens beteiligt. Sie werden durch die Reperfusion

nach kalter Ischämie aktiviert (17,30). Nach ihrer Aktivierung setzen die Kupfferzellen eine

Reihe von Entzündungsmediatoren frei, wie z.B. TNF-α, IL-1 und IFN-γ. Außerdem werden

von aktivierten Kupfferzellen freie Sauerstoffradikale freigesetzt, welche als direkte

Zytotoxine an SEC, Hepatozyten und Leukozyten wirken (102).

1.2.2.2 Freie Sauerstoffradikale

Freie Sauerstoffradikale gelten als einer der wichtigsten Faktoren für die Entstehung einer

Gewebeschädigung nach der Reperfusion von ischämischen Organen (27). Sie sind weiterhin

eines der am frühesten erkennbaren Zeichen eines Ischämie-/Reperfusionsschadens und schon

wenige Minuten nach Reperfusion in erhöhter Konzentration im zirkulierenden Blut

nachweisbar. Zu Beginn der Reperfusion nach kalter Ischämie werden freie Sauerstoffradikale

von Kupfferzellen exprimiert (51,52). Die spätere Bildung der Radikale geschieht im

Zytochrom-P450-Metabolismus, beim Abbau von Hypoxanthin zu Xanthin im

Purinstoffwechsel, in aktivierten Granulozyten und in SEC (53). Eine erhöhte Konzentration

von freien Sauerstoffradikalen führt zur Schädigung von Proteinen, Enzymen, Nukleinsäuren,

des Zytoskeletts und der Zellmembran, hier hauptsächlich der Lipidkomponenten (31). Als

Konsequenz aus diesen Schädigungsmechanismen kommt es zur erhöhten Permeabilität der

Zellmembran, was in der Lyse der Zelle resultieren kann. Der Schaden, den freie

Sauerstoffradikale an SEC verursachen, führt zu Mikrozirkulationsstörungen und somit zu

einer Verschlechterung der Transplantatdurchblutung. Die Ischämiezeit und die

Reperfusionsart korrelieren mit der Bildungsrate von freien Sauerstoffradikalen (64,72,128).

Auch konnte ein direkter Zusammenhang zwischen Konzentration freier Sauerstoffradikale

und primärem Leberversagen nach Transplantation nachgewiesen werden (23,136).

Die Bildung von freien Sauerstoffradikalen ist ein essentielles Schlüsselereignis für die

Entstehung des Ischämie-/Reperfusionsschadens. Die Entwicklung neuer Strategien, welche

die Radikalbildung unterdrücken ist ein viel versprechender Ansatz zur Reduktion des

Ischämie-/Reperfusionsschadens und des primären Organversagens nach

Lebertransplantation.

11

1.2.2.3 Die Rolle der Leukozyten beim Ischämie-/Reperfusionsschaden

Durch die Aktivierung von Kupfferzellen und deren Ausschüttung freier Sauerstoffradikale

kommt es zur Schädigung und Aktivierung von SEC und Epithelzellen der postsinusoidalen

Venolen, welche auf diesen Stress mit der Ausbildung von Adhäsionsmolekülen (z.B. ICAM-

1 und VCAM-1) reagieren (5,137). Weiterhin schütten aktivierte Kupfferzellen

Entzündungsmediatoren aus (z.B. IL-1 und TNFα), was zusammen mit der erhöhten

Konzentration von freien Sauerstoffradikalen zu einer Aktivierung von neutrophilen

Granulozyten führt (54). Adhäsionsmoleküle neutrophiler Granulozyten interagieren mit den

Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen. Die erste Stufe dieser Interaktion ist die Annäherung

von neutrophilem Granulozyt und Epithelzelle („Tethering“), für welche Selektine

verantwortlich sind. Durch die charakteristische Eigenschaft der Selektinbindung, innerhalb

kürzester Zeit aktiviert und deaktiviert werden zu können, kommt es zum typischen

Phänomen des „Rolling“. Weitere Zell-Zell-Verbindungen führen zur Anhaftung des

Granulozyten am Epithel („Arrest“) und schließlich zur „Transmigration“ durch das Epithel

hindurch in den extravasalen Raum (98,126). Einmal im extravasalen Raum angelangt,

adherieren neutrophile Granulozyten über das Oberflächenantigen LFA-1 an ICAM-1

Molekülen der Hepatozyten. Darüber hinaus wird über das Oberflächenantigen Mac-1 die

Degranulation der Granulozyten bewirkt. Es kommt zur direkten Schädigung der Hepatozyten

durch Proteasen und freie Sauerstoffradikale (82,111).

Wie etliche Studien belegen, sind auch T-Lymphozyten an der Entstehung des Ischämie-

/Reperfusionsschadens beteiligt. Bereits kurze Zeit nach Reperfusion im Anschluss an kalte

Ischämie kommt es zur Adhäsion von T-Lymphozyten an SEC der Leber (24). Analog zu den

Granulozyten kommt es zu einer Extravasion der T-Lymphozyten. Extravasal bilden sie

Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle, was zu Chemotaxis und erhöhter Adhäsion

von weiteren T-Lymphozyten an SEC führt (37). Auch konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-

Lymphozyten an der Rekrutierung neutrophiler Granulozyten beteiligt zu sein scheinen (139).

Es wird angenommen, dass die Beteiligung von T-Lymphozyten am Ischämie-

/Reperfusionsschaden mit der Ausprägung einer Abstoßungsreaktion in Zusammenhang steht,

was die Notwendigkeit, den Ischämie-/Reperfusionsschaden nach Organtransplantation so

gering wie möglich zu halten unterstreicht (91).

1.2.2.4 Zusammenspiel Proinflammatorischer Mediatoren

Während der frühen Phase der Reperfusion kommt es zur Freisetzung zellulärer Proteine, was

zu einer Komplementaktivierung führt. Komplementfaktoren führen zu einer erhöhten

12

Expression von Mac-1 Oberflächenantigenen auf neutrophilen Granulozyten und bewirken

ihre Rekrutierung in die Lebersinusoide (4,119,134). Des Weiteren mündet die

Komplementkaskade in der Bildung des Membranangriffskomplexes, welcher zu lytischen,

porenförmigen Läsionen in Zellmembranen führt.

Während der Reperfusion werden chemotaktisch wirksame Moleküle wie Zytokine, z.B.

TNF-α und IL-1 von aktivierten Kupfferzellen freigesetzt (122). Wie Komplementfaktoren

führen auch Zytokine zu einer Erhöhung von Mac-1 Oberflächenantigenen auf neutrophilen

Granulozyten und zu deren Rekrutierung durch Chemotaxis (134). Während der frühen Phase

der Reperfusion werden durch Zytokine auch CD4+ T-Lymphozyten chemotaktisch rekrutiert.

Diese Zellen produzieren Mediatoren wie TNF-β, IFN-γ und G-CSF, welche wiederum die

Aktivität der Kupfferzellen verstärken und chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten

wirken (139).

Von Endothelzellen der Sinusoide und der postsinusoidalen Venolen wird während der

Reperfusion nach kalter Ischämie Thrombozyten aktivierender Faktor (PAF) freigesetzt. PAF

bewirkt die Produktion von freien Sauerstoffradikalen in neutrophilen Granulozyten und führt

so zu einer zusätzlichen Schädigung von Lebergewebe (6).

13

1.3 Korrelation zwischen Organqualität und Ischämie-

/Reperfusionsschaden

Wie bereits oben erwähnt, korreliert die Qualität einer Spenderleber mit der Ausprägung des

Ischämie-/Reperfusionsschadens nach Transplantation. Besonders verfettete Lebern sind

anfällig für diese Art der Schädigung und infolge dessen anfälliger für ein primäres

Organversagen nach Transplantation (121,88). Durch die zunehmende Organknappheit wird

aber der Druck, qualitativ minderwertigere, marginale Lebern zu transplantieren immer

größer.

In etlichen Studien konnte nachgewiesen werden, dass der Grad der Verfettung von

Spenderlebern mit dem Auftreten des primären Organversagens in Zusammenhang steht

(88,107). Jedoch besteht keine Einigkeit darüber, ab welchem Grad der Verfettung mit einer

erhöhten Gefahr für das Auftreten eines primären Organversagens oder sonstiger Schädigung

zu rechnen ist. In Lebern mit gering ausgeprägter Verfettung konnte kein signifikanter

Unterschied in der Transplantatüberlebenszeit im Vergleich zu nicht verfetteten Lebern

nachgewiesen werden (113). Dagegen konnte nachgewiesen werden, dass in Lebern, die einen

höheren Grad von Verfettung aufweisen, der Ischämie-/Reperfusionsschaden sehr ausgeprägt

ist (88). So werden in diesen Organen im Vergleich zu nicht verfetteten Organen vermehrt

freie Sauerstoffradikale gebildet, vermehrt Zellschäden beobachtet und eine Verminderung

der Galleproduktion gemessen. Auch die Anzahl adhärenter Leukozyten in Lebersinusoiden

und postsinusoidalen Venolen ist erhöht.

Jedoch nicht nur die Verfettung der Leber führt zu deren Qualitätsverlust, sondern auch

andere Faktoren, wie z.B. chronischer Alkoholkonsum des Spenders. Die alkoholisch

geschädigte Leber zeigt nicht nur metabolische Störungen, sondern auch Störungen der

Mikrozirkulation, was zu einer Hypoxie führen kann. Außerdem kommt es im Darm durch

den erhöhten Alkoholkonsum zu einer veränderten Kolonisation (63). Dies führt zu einer

erhöhten Permeabilität des Darms und somit zu einer ständigen Endotoxinämie. Auch diese

Faktoren führen zu einer Erhöhten Anfälligkeit der Leber auf eine Schädigung durch Ischämie

und Reperfusion.

14

1.4 Therapieansätze zur Vermeidung des Ischämie-

/Reperfusionsschadens

In den letzten Jahren konnte das Prinzip des Ischämie-/Reperfusionsschadens durch intensive

Forschung immer besser nachvollzogen werden. Dieses Verständnis führte zu einer ganzen

Reihe von Therapieansätzen zur Verminderung dieser Organschädigung. Verschiedene

Strategien wurden entwickelt, welche hier in 1. pharmakologische, 2. gentechnologische und

3. chirurgische Strategien unterteilt werden. Im Folgenden werden diese Therapieansätze

besprochen.

1.4.1 Pharmakologische Strategien

Es existiert eine große Anzahl von Substanzen, welche in Bezug auf ihre Wirksamkeit in der

Unterdrückung des Ischämie-/Reperfusionsschadens untersucht wurden. Die Wirkung solcher

Substanzen liegt darin, dass sie entweder die schädigenden Mechanismen in der Zelle

unterbrechen, oder eine pharmakologisch induzierte Präkonditionierung erreichen. Bei der

pharmakologischen Präkonditionierung wird durch die Substanz ein geringes Stresslevel in

den Leberzellen erzeugt. Dies führt zu einer Aktivierung von zellulären

Abwehrmechanismen, welche die Zellen während des bevorstehenden, intensiveren Stresses

schützt. Substanzen, welche die Leber vor einem Ischämie-/Reperfusionsschaden schützen

werden im Folgenden in Gruppen unterteilt besprochen.

1.4.1.1 Antioxidantien

Freie Sauerstoffradikale tragen wesentlich zur Entstehung des Ischämie-

/Reperfusionsschadens bei. Die Hauptquelle für die Entstehung der freien Sauerstoffradikale

stellen Kupfferzellen dar (83). In Hepatozyten führen proinflammatorische Zytokine wie z.B.

TNF-α, IL-1 oder Interferon-γ zur Radikalproduktion und -freisetzung. Weitere Bildungsorte

sind Makrophagen und Leukozyten (54). Das wohl am meisten toxisch wirkende freie

Sauerstoffradikal, welches in Mitochondrien gebildet wird, ist das Hydroxyl-Radikal (OH·).

Sein Hauptangriffspunkt stellt die mitochondriale DNS dar. Freie Sauerstoffradikale zerstören

außerdem die Membranen von Zellen durch Lipidperoxidation. Weiterhin sind freie

Sauerstoffradikale in der Leber wesentlich an der Apoptose von Hepatozyten und

Endothelzellen beteiligt (26). Der oxidative Stress führt zur Steigerung der

Membranpermeabilität von Mitochondrien, was einen entscheidenden Schritt bei der

Apoptose darstellt. Aus den geschilderten Mechanismen resultiert die Idee, den Ischämie-

15

/Reperfusionsschaden durch Dezimierung der freien Sauerstoffradikale abschwächen zu

können. Einige Beispiele für medikamentöse Therapieansätze zur Reduktion des oxidativen

Stresses nach kalter Ischämie und Reperfusion sind im Folgenden aufgelistet:

• α-Tocopherol

• Idebenone

• Desferroxamin

• Gluthation

• N-Acetylcystein

• Bucillamin

Im Tierversuch konnte allen diesen Substanzen ein protektiver Effekt auf den Ischämie-

/Reperfusionsschaden nachgewiesen werden (1, 43, 85, 103, 106, 133). Allerdings fand keine

dieser Substanzen den Eingang in den klinischen Alltag, da, obwohl im Tierexperiment Erfolg

versprechend für keines der Medikamente ein positiver Effekt am Menschen nachweisbar

war.

1.4.1.2 Adenosin und Stickoxid-(NO) Donatoren

Während Ischämie und Reperfusion kommt es im Gewebe zur Akkumulation von Adenosin,

welches einen starken Schutz gegen einen Ischämie-/Reperfusionsschaden bewirkt (9). Der

schützende Mechanismus, den Adenosin auf das Gewebe ausübt, beruht auf einer Induktion

des Enzyms Stickoxid-Synthase (108). Dies führt zu einem erhöhten Stickoxidspiegel, was

den Schaden, den Hepatozyten und Endothelzellen während Ischämie und Reperfusion

nehmen erheblich vermindert. Pharmakologisch besteht die Möglichkeit der Intervention auf

mehreren Ebenen. Zum einen kann der Adenosinrezeptor (A2A) direkt durch Agonisten

stimuliert werden (z.B. CGS 21680), zum anderen führen Stickoxid-Donatoren wie z.B.

FK409 und L-Arginin zu einem Schutz vor dem Ischämie-/Reperfusionsschaden (9,73). Im

Rattenmodell konnte für eine Reihe von Substanzen ein protektiver Effekt aufgezeigt werden,

jedoch konnte dieser für den Ischämie-/Reperfusionsschaden nach Lebertransplantation am

Menschen nicht nachgewiesen werden. Auch gibt es Anzeichen dafür, dass ein erhöhter

Stickoxid-Spiegel mit verstärkter Ausprägung einer Organabstoßung einhergeht (75).

16

1.4.1.3 Pentoxyphyllin

Die Methylxanthinverbindung Pentoxyphyllin wird als Standardmedikament in der Therapie

peripherer Gefäßerkrankungen eingesetzt. Sein Wirkungsmechanismus besteht in der

reduzierten Synthese von TNFα und deren Sekretion in verschiedenen Organen (120). Die

Effekte, welche Pentoxyphyllin in der Leber ausüben bestehen in einer verminderten

Aktivierung von Kupfferzellen und einer Verbesserung der Mikrozirkulation (86). Ein

Nachweis für die Wirksamkeit von Pentoxyphyllin nach Lebertransplantation beim Menschen

steht noch aus.

1.4.1.4 Prostaglandine

Die Wirkung der Prostaglandine, welche in der Leber hauptsächlich von aktivierten

Kupfferzellen freigesetzt werden besteht in deren Fähigkeit, die Leberdurchblutung zu

steigern, die Thrombozytenadhäsion zu unterdrücken und einen zytoprotektiven Effekt zu

besitzen. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die Prostaglandine I2 und E1 die

Proteasenfreisetzung und die Freisetzung freier Sauerstoffradikale in aktivierten Leukozyten

vermindern (44,81). Die Wirksamkeit der Prostaglandine nach Lebertransplantation beim

Menschen ist umstritten, zumal auch die systemischen Nebenwirkungen dieser Medikamente

ihren Einsatz limitieren.

1.4.2 Gentechnologische Strategien

In den letzten Jahrzehnten wurde eine Reihe von gentechnologischen Werkzeugen entwickelt,

die es ermöglichten, Gentherapie auch in der Transplantationsmedizin Erfolg versprechend

einzusetzen. Zu diesen Werkzeugen gehört eine Vielzahl verschiedener Viren. Im Einzelnen

handelt es sich dabei um adeno-assoziierte Viren, Adenoviren, Alphaviren, Lentiviren und

Retroviren. Im Hinblick auf die Lebertransplantation scheint eine Genübertragung von Genen,

deren Effekt z.B. die Bildung von freien Sauerstoffradikalen verhindert, oder Proteine zur

Radikalneutralisierung bildet, auf die Spenderleber sinnvoll (84). Allerdings handelt es sich in

den meisten Fällen der Leberexplantationen um dringliche, nicht aufschiebbare Eingriffe, was

eine Gentherapie aus zeitlichen Gründen erschwert. Eine mögliche Indikation zur Gentherapie

am Spender ist bei der Lebendleberspende gegeben. Hier ist, durch den ellektiven Charakter

der Operation der zeitliche Rahmen ausreichend. Im Wesentlichen werden bei der

Gentherapie zwei Strategien verfolgt, nämlich die antioxidative und die antiapoptotische.

Bei der antioxidativen Strategie zur Vermeidung des Ischämie-/Reperfusionsschadens mittels

Gentherapie werden die Bildung oder die Wirkung von freien Sauerstoffradikalen

17

unterdrückt. Ein Beispiel für eine derartige Therapie ist der Gentransfer von Genen, welche

für mitochondriale oder cytosolische Superoxiddismutase codieren. In tierexperimentellen

Studien konnte so eine Verminderung des Ischämie-/Reperfusionsschadens erreicht werden

(69). Auch für den Gentransfer von Häm-Oxigenase-1, auch heat shock protein 32 (hsp32)

genannt, konnte im Tierexperiment eine Verbesserung der Spenderleberfunktion und der

Überlebenszeit festgestellt werden (25).

Die antiapoptotische Strategie zur Vermeidung der Ischämie-/Reperfusionsschadens mittels

Gentherapie versucht, den programmierten Zelltod von Hepatozyten nach

Lebertransplantation zu verhindern. Z.B. konnte im Tierversuch gezeigt werden, dass ein

adenoviraler Transfer des Onkogens Bcl-2 die Anzahl apoptotischer Hepatozyten nach

Ischämie und Reperfusion signifikant verminderte. Proteine, die von dem Bcl-2 Gen codiert

werden, sind Regulatoren des programmierten Zelltodes und können sowohl die Apoptose

verhindern, als auch zu selbiger führen (61).

1.4.3 Chirurgische Strategien

Es gibt mehrere Möglichkeiten, den Ischämie-/Reperfusionsschaden durch chirurgische

Maßnahmen zu vermindern. Eine Möglichkeit ist die sogenannte ischämische

Präkonditionierung (3). Dabei wird vor einer geplanten Leberexplantation oder einem

größeren Lebereingriff eine Phase der warmen Ischämie erzeugt, indem mittels Gefäßklemme

oder Loop das Ligamentum hepatoduodenale temporär okkludiert wird (Pringle-Manöver).

Diese Phase der ischämischen Präkonditionierung sollte zwischen 10 und 15 Minuten

andauern (108). Darauf folgend werden die Leberzuführenden Gefäße wieder eröffnet und

eine 10-15-minütige Reperfusion zugelassen. Nach erneuter Okklusion beginnt die

eigentliche, lange andauernde ischämische Phase.

Abbildung 1: Schema der ischämischen Präkonditionierung bei der Lebertransplantation

Okklusion Reperfusion Explantation

10-15 min 10-15 min

Implantation

mehrere Stunden

warme Ischämie kalte Ischämie

18

Der Mechanismus, durch den es bei der ischämischen Präkonditionierung zu einer Protektion

der Leber gegenüber einem Schaden durch Ischämie und Reperfusion kommt, ist bis heute

noch nicht vollständig verstanden. Man nimmt an, dass durch die kurze ischämische Phase,

die einen harmlosen Reiz darstellt, „Schutzmechanismen“ in der Zelle aktiviert werden, die

die Zelle während der nachfolgenden langen Ischämie widerstandsfähiger machen.

Mediatoren, welchen eine entscheidende Rolle bei der Präkonditionierung zukommt, sind das

Adenosin, Stickstoff Monoxid, oxidativer Stress, die sogenannten heat shock proteine, dabei

besonders das HSP 72 und Heme Oxigenase-1 (HSP 32), sowie TNFα. TNFα induziert die

Apoptose in Hepatozyten und Endothelzellen (109).

Die Apoptose ist einer der zwei Mechanismen, die in der postischämischen Phase zum Zelltod

führt, der zweite ist die Nekrose. Durch die ischämische Präkonditionierung wird die

Apoptose in geringerem Maße angeregt, wobei sich der Übergang von Apoptose zu Nekrose

fließend darstellt (70,135). Ein wichtiger Mechanismus der Präkonditionierung ist die

Aktivierung der NO-Synthase durch Adenosin (87). NO vermindert durch direkte Blockade

von Caspasen die Apoptose. Weiterhin wird durch die ischämische Präkonditionierung ein

oxidativer Stress im Gewebe ausgelöst, was zur Aktivierung von zelleigenen

Schutzmechanismen führt (112). Unter anderem handelt es sich bei diesen

Schutzmechanismen um Protein Kinase C, AMP-aktivierte Protein Kinase, p38 aktivierte

Protein Kinase, IK Kinase und die Aktivierungsmöglichkeit von Transkriptionsfaktor I (108).

Alle diese Faktoren schützen die Zelle vor Apoptose, aktivieren antioxidative Prozesse und

führen zum Eintritt in den Zellzyklus.

Ergänzend wird erwähnt, dass bei Operationen an der Leber, die es verlangen, dass der

Blutzufluss unterbrochen wird, um einen größeren Blutverlust zu vermeiden (Pringle-

Manöver), ein der ischämischen Präkonditionierung ähnliches Verfahren zur Verminderung

eines Ischämie-/Reperfusionsschadens angewendet wird. Es handelt sich dabei um das

Verfahren des intermittierenden Abklemmens. Dabei wird Ischämie und Reperfusion im

Wechsel durchgeführt. Als die besten Zykluszeiten wurde in einer randomisierten Studie eine

15-minütige Ischämie mit darauf folgender 5-minütiger Reperfusion gefunden (7).

Interessanterweise kann ein Ischämie-/Reperfusionsschaden auch durch das Erwärmen des

gesamten Körpers oder des siebten Interkostalnervengebietes vor einem größeren

Lebereingriff oder einer Leberexplantation vermindert werden (71). Dieses Verfahren wird als

hypertherme Präkonditionierung bezeichnet und hat in zahlreichen Tierexperimenten einen

positiven Effekt auf Leberfunktion und Überleben nach Lebertransplantation gezeigt (79).

Verantwortlich für den protektiven Effekt dieser Behandlung ist die Induktion von Heat

19

Shock Proteinen (HSP), besonders HSP 70, HSP 72 und Heme Oxigenase-1 (HSP 32) (20).

Diese Proteine gehören zu der Klasse der Chaperone und sind an der räumlichen Faltung und

dem Transport von anderen Proteinen beteiligt. Im Tierexperiment konnte außerdem

beobachtet werden, dass es durch die hypertherme Präkonditionierung zu einer verminderten

Freisetzung von proinflammatorischen Faktoren wie TNFα, IL-6 und IL-10, einer verbesserte

Leberdurchblutung, einer verminderten Expression von ICAM-1 und einer verminderten

Infiltration von neutrophilen Granulozyten nach Lebertransplantation kam, verglichen mit

nicht vorbehandelten Lebern (132).

Als viel versprechend ist der Einsatz von extrakorporalen Perfusionssystemen zu bewerten.

Die biologische Zersetzung des Organs im Laufe der Zeit wird durch die ständige Versorgung

mit essentiellen Substanzen wie Glucose, Aminosäuren, Nukleotiden und Sauerstoff, sowie

durch die Elimination von Giftstoffen verhindert. Somit bleibt eine gute Organqualität über

längere Zeit erhalten, was sich wiederum positiv auf den Schaden auswirkt, den das Organ

nach Reperfusion erleidet (42). Jedoch ist die Handhabung solcher Geräte zur extrakorporalen

Perfusion derzeit noch relativ kompliziert, weswegen ein standardmäßiger Einsatz in der

Klinik momentan nicht möglich ist.

Auch die Art der initialen Reprefusion nach Lebertransplantation übt einen Einfluss auf den

Ischämie-/Reperfusionsschaden nach Lebertransplantation aus. Man unterscheidet hier vier

verschiedene Arten der Reperfusion:

1. initiale portale Reperfusion

2. initiale arterielle Reperfusion

3. simultane arterielle und portale Reperfusion

4. retrograde Reperfusion.

In einer Reihe von Studien, welche die ersten drei der oben genannten Reperfusionsarten

vergleichen, konnte allerdings keine Einigkeit darüber erzielt werden, bei welcher es zur

geringsten Ausprägung des Ischämie-/Reperfusionsschadens kommt, allerdings sehen die

meisten Studien den positivsten Effekt bei der simultanen Reperfusion (13,74). Die

Überlegung, die zur initialen portalen Reperfusion führt, ist die Verkürzung der warmen

Ischämie durch Organerwärmung in situ während der Anastomosierung und in besonderem

Maße die Verkürzung der anhepatischen Phase. Demgegenüber steht die Erkenntnis, dass eine

prolongierte Phase der alleinigen portalen Perfusion der Leber vor Rearterialisierung zu einer

unzureichenden Sauerstoffversorgung bei schneller Erwärmung führt. Weiterhin konnte

20

gezeigt werden, dass es während der alleinigen portalen Perfusion zu einer ausgeprägten

Mikrozirkulationsstörung in der Spenderleber kommt (97). Auch, da die Gallenwege zum

größten Teil arteriell versorgt werden, sind diese bei der initialen portalen Reperfusion einem

Intervall der warmen Ischämie ausgesetzt, was in einem erhöhten Auftreten von biliären

Komplikationen, verglichen mit der simultanen Reperfusion, resultiert. Für die initiale

arterielle Reperfusion konnte in mehren Studien eine Verminderung des Ischämie-

/Reperfusionsschadens, verglichen mit der initialen portalen Reperfusion nachgewiesen

werden (128). Weiterhin zeigten sich in klinischen Studien eine Verkürzung und ein milderer

Verlauf des Postreperfusionssyndroms, eine Verkürzung der Operationszeit, sowie ein

niedrigerer Bedarf an Transfusionen und antifibrinolytischer Therapie. Die initiale retrograde

Reperfusion über die V. cava mit nachfolgender anterograder Reperfusion über die Pfortader

bei der „Piggy Back-Technik“ stellt eine neue Methode in der Lebertransplantation dar.

Bisher wurde sie im Rahmen retrospektiver Studie erst in zwei Zentren evaluiert. Im Rahmen

dieser Studien wurde eine verminderte Transaminasenfreisetzung bei nur unwesentlicher

Störung der Hämodynamik im Sinne eines Postreperfusionssyndroms festgestellt.

1.5 Die Rattenlebertransplantation

In dieser Studie wurden drei hämodynamisch verschiedene Reperfusionsarten bei der

orthotopen Rattenlebertransplantation evaluiert. Aus diesem Grunde sollen zunächst die

Morphologie der Rattenleber und die Technik der orthotopen Rattenlebertransplantation

dargestellt werden.

1.5.1 Die Morphologie der Rattenleber

1.5.1.1 Makroskopische Anatomie

Die Leber liegt als größte Drüse des Körpers subdiaphragmal und bei der Ratte annähernd in

der Transversalebene an der facies abdominalis des Zwerchfells. Mit der facies visceralis liegt

sie den Baucheingeweiden an. Durch den Bauchfellüberzug ist die Oberfläche der Leber glatt

und glänzend. Bei ein und derselben Rasse und gleicher Ernährung der Tiere besteht eine gute

Korrelation zwischen dem Gewicht der Ratte und dem der Leber. Bei Lewis-Ratten, welche in

dieser Studie als Versuchstiere verwendet wurden, beträgt das Lebergewicht ca. 3% des

Körpergewichts (131).

21

1.5.1.2 Lobierung

Fissuren (incisurae interlobulares) unterteilen die Leber in vier verschiedene Leberlappen

(lobi hepatici). Diese vier Lappen stehen über eine parenchymatöse Achse um die V. cava

inferior herum miteinander in Verbindung. Im Einzelnen handelt es sich um den

1. Lobus medianus

2. Lobus lateralis sinister

3. Lobus lateralis dexter

4. Lobus caudatus

Die Fissura umbilicalis unterteilt den trapezförmigen Lobus medianus in einen linken und

einen rechten Anteil. An dieser Stelle setzt das Ligamentum falciforme als Aufhängeband des

Lobus medianus an und stellt eine Verbindung zum Diaphragma dar.

Der rhombenförmige Lobus lateralis sinister wird teilweise vom Lobus medianus bedeckt und

verdeckt seinerseits den Lobus caudatus. Der Lobus lateralis dexter wird durch eine tiefe

frontale Fissur in zwei gleichgroße, pyramidenförmige (ventrale und dorsale) Anteile

unterteilt. Der Lobus caudatus wird ebenfalls durch eine tiefe frontale Fissur in zwei Anteile

unterteilt. Zwischen diesen verläuft der Ösophagus.

Wie beim Menschen kann man auch bei der Rattenleber durch die portale Aufteilung eine

Differenzierung in VIII Segmente vornehmen.

1.5.1.3 Gefäßversorgung

Die Leber besitzt eine doppelte Blutversorgung. Zum einen bekommt sie aus den unpaarigen

Bauchorganen über die Pfortader (V. portae) nährstoffreiches venöses Blut, zum anderen

fließt sauerstoffreiches arterielles Blut über die Leberarterie (A. hepatica propria), welche

einen Endast des Truncus coeliacus darstellt, zur Leber. Den Hauptanteil an der

Blutversorgung übernimmt mit 70-80% die V. portae. 20-30% des Blutes wird von der A.

hepatica propria geliefert. Die Pfortader verläuft im Ligamentum hepatoduodenale und tritt

zusammen mit der Leberarterie in die Leberpforte (Porta hepatis) ein. Hier spaltet sich die

Pfortader in ihre Lappen- und Segmentäste auf. Über Äste unterschiedlicher Ordnung wird

das Blut bis in die Vv. interlobulares verteilt. Das sinusoidale Kapillarnetz wird über Rr.

terminales aus den Vv. interlobulares versorgt. Die arterielle Versorgung der Leber geschieht

überwiegend aus der A. hepatica propria. Jedoch werden der mediale und craniale Anteil des

Lobus medianus zusätzlich von der A. hepatica sinistra, einem Endast aus der A. gastrica

22

sinistra versorgt. Die Aufzweigung der beiden Arterien in ihre Lappen- und Segmentäste

erfolgt bis zu den Aa. interlobulares weitgehend entsprechend der der Pfortader. Jedoch

münden die Interlobulararterien nicht ausschließlich in das sinusoidale Kappilarnetz, sondern

ergießen sich auch in das interlobuläre Gewebe. Die A. hepatica, die Vena portae und der

Ductus choledochus, sowie deren Äste verlaufen stets gemeinsam zu den einzelnen

Segmenten (55).

In die Sinusoide tritt sowohl das arterielle, wie auch das portal-venöse Blut ein. Nach

Durchfließen der Sinusoide gelangt das „Mischblut“ in die Zentralvenen (Vv. centrales)

innerhalb des Leberläppchens. Am Außenrand des Läppchens stößt die Zentralvene senkrecht

auf eine Schaltvene. Schaltvenen verlaufen entlang der Läppchenbasis und vereinigen sich zu

Sammelvenen. Das venöse Blut konfluiert schließlich läppchen- und segmentweise zu den

Lebervenen (Vv. hepaticae), welche in die V. cava inferior münden.

1.5.1.4 Ligamente

Die Ligamente der Rattenleber sind sehr fein ausgeprägt. Das Ligamentum falciforme hepatis

ist sichelförmig und entspringt an der Fissura umbilicalis, welche den Lobus medianus in

einen rechten und einen linken Anteil unterteilt und verbindet die Leber mit dem Zwerchfell

und der Bauchwand. Im Ligamentum falciforme hepatis verläuft die obliterierte Nabelvene als

Ligamentum teres hepatis. Das Ligamentum coronarium hepatis, welches ventral und lateral

am Austritt der V. cava inferior entspringt, stellt eine weitere Verbindung zwischen Leber und

Zwerchfell dar. Das kleine Netz (Omentum minus) setzt sich aus dem Ligamentum

hepatogastricum und dem Ligamentum hepatoduodenale zusammen. Es zieht von der kleinen

Magenkurvatur (Curvatura gastrica minor) zur Visceralfläche der Leber und ist mit der

Leberpforte verbunden. Sowohl der Lobus medianus, als auch der Lobus lateralis dexter sind

über das Ligamentum triangulare sinister bzw. dexter, welche von der Leber aus nach

dorsolateral ziehen, mit dem Zwerchfell verbunden.

1.5.1.5 Gallengang und Gallenblase

Der ductus choledochus der aus der Konfluenz der Gallengänge der Leberlappen entsteht,

verläuft im Ligamentum hepatoduodenale. Der Ductus choledochus ist zwischen 12 und 16

mm lang und misst etwa einen Millimeter im Durchmesser. Er verläuft dorsal am Duodenum

und ventral an Teilen der Pankreas. Der Gallengang mündet etwa 20 mm distal des Pylorus in

einer einen Millimeter hohen Papille in das Duodenum. Vor der Einmündung erhält der

ductus choledochus Zuläufe der Bauchspeicheldrüse. Eine Gallenblase besitzt die Ratte nicht.

23

1.5.2 Mikroskopische Anatomie

Die Leber ist von einer subserösen, bindegewebigen, dünnen Kapsel, der Glissonschen

Kapsel, umgeben. Ihre Ausläufer strahlen von der Leberpforte ausgehend als feines

Bindegewebsgerüst in das Leberinnere ein, gliedern das Parenchym der Leber als

interlobuläres Bindegewebe in Läppchen und umschließen die Gefäße der Glissonschen Trias.

Als Glissonsche Trias bezeichnet man die an den Kontaktkanten benachbarter Leberläppchen

verlaufenden Aa. und Vv. interlobulares und die interlobulären Gallengänge. Insgesamt ist der

Bindegewebsanteil der Rattenleber sehr gering.

Es gibt drei Konzepte zur Strukturierung des Leberparenchyms: das Leberläppchen, das

Portalvenenläppchen und den Leberazinus (Abbildung 2).

Abbildung2: Gliederung der Leber. (LIEBICH 1999)

A: periportale Läppchen mit Lebertrias

B: Leberazini mit zonaler Gliederung nach Rappaport

C: klassisches Leberläppchen mit Zentralvene

1: periportale Zone

2: midzonale Zone

3: perizentrale Zone

24

1.5.2.1 Leberläppchen

Das Leberläppchen stellt die anatomische Grundeinheit der Leber dar. Durch die radiäre

Anordnung der Leberzellbälkchen und der Sinusoide kommt es zu seiner charakteristischen

Struktur. Im Querschnitt hat das Leberläppchen im Idealfall die Form eines Sechsecks, dessen

Zentrum eine abführende Zentralvene bildet. Die periportalen Felder zwischen drei bis vier

Leberläppchen beinhalten die Gefäße der Glissonschen Dreiecke. Die Höhe eines

Leberläppchens beträgt ca. 2 mm, sein Durchmesser misst ca. 1mm. Es setzt sich aus

Leberzellplatten, welche aus ein bis maximal zwei Hepatozytenlagen bestehen, zusammen.

Diese bilden ein dreidimensionales Gerüst. Im Inneren der Läppchen wird durch Gitterfasern

ein zartes Raumnetz gebildet, worin die Hepatozyten eingebettet sind. Dazwischen liegen die

Leberkapillaren (Sinusoide), welche ebenfalls ein feines, dreidimensionales Netzwerk bilden.

Ihre Ernährung geschieht durch die Endäste der Triasgefäße. Die Sinusoide streben dem

Zentrum des Läppchens zu und vereinigen sich dort in der Zentralvene. Im Gegensatz zu

normalen Kapillaren besitzen sie keine Basalmembran. Ihre Innenauskleidung besteht zum

größten Teil aus Endothelzellen, jedoch findet man auch Kupffer-, Ito- und Pitzellen. Über

Poren und interzelluläre Öffnungen steht das Kapillarlumen mit dem perikapillären Spalt

(Disse`scher Raum) in Verbindung. Die Mikrovilli der Hepatozyten ragen in den Disse`schen

Raum hinein und führen so zu einem direkten Kontakt zwischen Leberzelle und Kapillarblut.

Auf diese Weise entsteht eine große Kontaktfläche zwischen Leberzellen und

Leberkapillaren. Durch Öffnungen in den Leberzellplatten kommt es zur Verbindung

zwischen verschiedenen Sinusoiden. Diese werden als intersinusoidale Sinusoide bezeichnet.

Die Grenzplatte schließt das Leberläppchen gegen das interlobuläre Bindegewebe ab, es

bleiben jedoch sehr kleine Öffnungen für den Durchtritt von Terminalgefäßen frei. Das

Leberläppchen wird vor allem als anatomische Einheit gesehen. Da die Bindegewebsbildung

in der Rattenleber nur gering ausgeprägt ist, kann die Läppchengliederung nicht immer

deutlich erkannt werden.

25

Abbildung 3:

Klassisches

Leberläppchen

ACap: arterielle

Kapillaren

BD: Gallengang

HP: Hepatozytenplatten

IlA: interlobuläre

Arterie

IlV: interlobuläre Vene

InV: interlobuläre

Venolen

LP:Lamina terminalis

LS: Lebersinusoide

O: interzelluläre

Öffnungen

PC: Trias

SV: sublobuläreVene

VCap:venöse Kapillaren

1.5.2.2 Portalvenenläppchen

Die Gliederung dar Leber in Portalvenenläppchen ist mehr auf funktionellen Zusammenhänge

begründet. Es ist durch drei Zentralvenen definiert, welche sich um einen zentralen

Gallengang gruppieren. Auf diese weise beschreibt es den Versorgungsbezirk bzw. den

Parenchymbereich, dessen Galle in den gemeinsamen interlobulären Gallengang fließt. Die

Gliederung der Leber in Portalvenenläppchen beschreibt also den funktionell, sekretorischen

Drüsencharakter der Leber.

26

1.5.2.3 Leberazinus

Als weitere funktionelle Einheit der Leber definierte Rappaport den Leberazinus. Besonderes

Augenmerk legte Rappaport dabei auf die mikrozirkulatorische Komponente des Azinus. Ein

Leberazinus besteht aus einer Geweberegion, deren Achse aus einem Gefäßbündel

zuführender Terminaläste der Pfortader und der Leberarterie, sowie einem terminalen

Gallengang gebildet wird. Ein Glisson-Feld bildet jeweils Anfang und Ende der Gefäßachse.

Die anderen Eckpunkte des Leberazinus werden von zwei benachbart liegenden Zentralvenen

gebildet. Die Sinusoide verlaufen radiär von der Achse des Azinus zu den Zentralvenen. Im

Verlauf der Sinusoide ordnet man die um die Sinusoide angeordneten Hepatozyten drei

metabolischen, unterschiedlich gut durchbluteten Zonen zu. In Richtung auf die Zentralvene

zu verlangsamt sich der Blutstrom in den Sinusoiden. In Zone 1 liegen diejenigen

Hepatozyten, die unmittelbar um die Azinusachse herum angeordnet sind und somit als erste

mit dem Blut, das die Leber passiert in Kontakt treten. Die Flussgeschwindigkeit in Zone 1 ist

schnell und das arterio-portale Mischblut noch sauerstoffreich. In den Zonen 2 und 3

vermindern sich die Flussgeschwindigkeit und der Sauerstoffgehalt des Blutes zunehmend.

Aus diesem Sachverhalt ergibt sich die Erkenntnis, dass die Hepatozyten der Zone 3 im

Zentralvenenbereich am vulnerabelsten auf Hypoxie, Nährstoffmangel und

Burchblutungsschwankungen reagieren. Die Beziehung Leberläppchen-Azinus lässt sich nach

Rappaport folgendermaßen gliedern (Abbildung 2):

• Periportale Zone: Zone 1

• Midzonale Zone: Zone 2

• Perizentrale Zone: Zone 3

Die Gliderung der Leber in Leberazini folgt einer funktionell-stoffwechselaktiven

Beurteilung.

1.5.3 Das Gallengangssystem

Die von der Leber gebildete Galle wird in einem eigenen Drainagesystem gesammelt. Dieses

System besteht aus Gallekapillaren, welche netzförmig angeordnet sind. Gallekapillaren

besitzen keine epitheliale Gefäßwand. Vielmehr bilden modifizierte Oberflächenmembranen

von Hepatozyten ihre Begrenzung. Somit kommt es durch die Erweiterung des interzellulären

Raumes zur Entstehung eines tubulären Gangsystems. Dieses Gangsystem, welches primär

die Galle aufnimmt, setzt sich aus Gallenkanälchen (Canaliculi biliferi) zusammen. Sie

27

besitzen einen Durchmesser von ca. 0,5 bis 1 µm. Hier fließt die Galle in einer dem Blut

entgegengesetzten Richtung. Schließlich gelangt sie in Gallengänge, die noch außerhalb der

periportalen Felder beginnen. Diese werden als Hering-Kanälchen bezeichnet und haben

einen Durchmesser von 15-20 µm. Hering-Kanälchen münden im periportalen Feld in

Gallengänge (Ductus interlobulares bilifer), welche von einem kubischen bis

hochprismatischen Epithel ausgekleidet werden. Durch den Zusammenschluss von Ductus

interlobulares entstehen immer größere Gallengänge (Ductus bilifer), die sich endlich im

Hauptausführungsgang, dem Ductus hepaticus vereinen. Dieser verlässt an der Leberpforte

das Organ.

1.5.4 Der zelluläre Aufbau der Leber

Das Lebergewebe setzt sich aus einem zellulären Volumen von etwa 80-84% und einem

Extrazellulärraum (Sinusoide, Dissescher Raum, Gallengänge, extrazelluläre Matrix) von ca.

16-20% zusammen. Den größten Anteil am zellulären Volumen bilden mit ca. 74% die

Hepatozyten. Die restlichen ca. 7% bilden die mesenchymalen, sinusoidalen Nicht-

Parenchymzellen. Diese Gruppe setzt sich zusammen aus sinusoidalen Endothelzellen,

Kupfferzellen, Ito-Zellen und Pit-Zellen.

1.5.4.1 Hepatozyten

Hepatozyten sind 15-30 µm groß, besitzen eine sechseckige Form und weisen einen, ihren

vielfältigen Leistungen entsprechenden, adäquaten Zellorganellenbestand auf. Hepatozyten

können entsprechend ihres Funktionszustandes mehrere polyploide Zellkerne besitzen. Auch

ist die große Anzahl von Mitochondrien (bis zu 3000/ Zelle und bis zu 20% ihres

Zytoplasmavolumens) auffallend. Diese dienen dem Stoffwechsel der Zelle als

Energieliferant. Das rauhe endoplasmatische Retikulum liegt in den Hepatozyten als dichtes

Netz vor. Seine Funktion ist die Proteinsynthese (Globuline, Fibrinogen,

Gerinnungsfaktoren). Das glatte endoplasmatische Retikulum ist im Zytoplasma der

Hepatozyten diffus verteilt. Es ist am Fettstoffwechsel beteiligt, z.B. an der Synthese von

Lipoproteinen, Phospholipiden, Cholesterin, Triglyceriden und freien Fettsäuren. Weiterhin

hat es eine zentrale Rolle in der Biotransformation endogener und exogener toxischer

Substanzen. Auch ist es für die Produktion und Ausscheidung der Galle zuständig. Dabei

werden Cholesterine zu Gallensäuren bzw. Gallensalzen umgewandelt und gemeinsam mit

Wasser und Bilirubin in die Gallenkanälchen abtransportiert. Der Golgi-Apparat speichert die

Substanzen, die im rauhen und glatten endoplasmatischen Retikulum gebildet werden.

28

Gleichzeitig ist er der Bildungsort zahlreicher Enzyme und von intrazellulären Membranen.

Innerhalb der Zelle befinden sich weiterhin Einschlusskörper wie Glykogen und Fettvakuolen.

Die im Normalzustand seltenen Fetttröpfchen sind während pathologischer Vorgänge

vermehrt. Aufgrund der hohen Anzahl von Mitochondrien und glattem endoplasmatischen

Retikulum ist das Zytoplasma der Hepatozyten eosinophil. Die sogenannten basophilen

Körper entstehen durch Ansammlungen von rauhem endoplasmatischen Retikulum.

1.5.4.2 Kupfferzellen

Kupffer-Zellen stammen von Monozyten ab, welche mit dem Blut in die Leber gelangen. Sie

sind Bestandteil des retikuloendothelialen Systems. Kupfferzellen bilden einen Teil der

endothelialen Wandauskleidung und sind häufig an strategischen Punkten des sinusoidalen

Lumens zu finden. Mit ihren Zytoplasmafortsätzen haften sie reversibel am Kapillarendothel

der gleichen aber auch der gegenüberliegenden Seite an, oder sie durchdringen die

Kapillarwand und ragen in den Disse`schen Raum. Die Kupfferzellen übernehmen

phagozytische Aufgeben. So entnehmen sie dem vorbeiströmenden Blut zirkulierende

Zellfragmente, geschädigte Blutzellen und Mikroorganismen. Kupfferzellen machen etwa ein

Drittel der Sinusoidwandzellen aus. Sie besitzen einen großen, ovalen und relativ

chromatinreichen Kern, welcher häufig eine Hervorbuchtung ins Gefäßlumen zeigt. Die

Kupfferzellen sind reich an Zellorganellen, besonders an Peroxisomen. Sie zeichnen sich

durch eine hohe Peroxidaseaktivität aus.

1.5.4.3 Ito-Zellen

Ito-Zellen befinden sich subendothelial im Disse`schen Raum und werden auch als

Fettspeicherzellen bezeichnet, da sie Vitamin-A haltige Lipidtropfen enthalten. Ito-Zellen

können zwei Funktionszustände einnehmen, den ruhenden und den aktiven. Im ruhenden

Zustand speichern sie Fetttröpfchen, welche mit dem Blut angeschwemmt werden. Durch

Botenstoffe wie TNFα, IL-1 und TGF-β werden sie in den aktiven Zustand überführt.

Aktiviert können sich Ito-Zellen in Fibroblasten umwandeln, welche extrazelluläre Matrix,

also Bindegewebe produzieren. Auch besitzen Ito-Zellen Zytoplasmafortsätze, welche

kontraktile Elemente enthalten. Diese Fortsätze umschlingen Endothelzellen und führen bei

Kontraktion zur Einengung des Lumens von Sinusoiden.

29

1.5.4.4 Pit-Zellen

Pit-Zellen sind in das Endothel der Sinusoide eingebettete, ortsständige Lymphozyten, welche

als Natürliche Killerzellen fungieren.

1.5.5 Entwicklung der orthotopen Rattenlebertransplantation

Das Erste Modell, das die orthotope Transplantation einer Rattenleber beschrieb, wurde 1973

von S. Lee publiziert (67). Um das Splanchnikus-Gebiet während der anhepatischen Phase zu

entlasten, in dem während dieses Zeitraums erhöhte Druckverhältnisse herrschen, benutzte er

analog der Lebertransplantation beim Menschen einen extrakorporalen, porto-jugulären

Bypass. Die Anastomosen der suprahepatischen und infrahepatischen Vena cava inferior

sowie der Vena portae führte er in mikrochirurgischer Nahttechnik durch. Die arterielle

Versorgung der Transplantatleber rekonstruierte er, indem er an der Spenderleber ein langes

Aortensegment stehen ließ, das er End-zu-Seit mit der Aorta das Empfängers anastomosierte.

Der Gallengang des Spenders wurde in das Duodenum des Empfängers implantiert. Jedoch

war diese Methode extrem anspruchsvoll und mit einer Überlebensrate von 74% nicht

zufriedenstellend (67).

Eine weniger anspruchsvolle und leichter zu reproduzierende Technik veröffentlichte S. Lee

zwei Jahre später. Bei seiner neuen Technik verzichtete er auf die Arterialisierung der

Spenderleber mit der Begründung, dass die transplantierte Rattenleber ohne Arterie sowohl

die Transplantation gut vertrage, als auch für eine lange Zeit normal im Empfänger arbeite.

Weiterhin änderte er die Reihenfolge der Anastomosen und auch den Zeitpunkt der

Reperfusion. Während der anhepatischen Phase anastomosierte er zuerst die suprahepatische

Vena cava inferior, gefolgt von der Vena portae. Nach diesen beiden Anastomosen gab er

dem Blutfluss durch die Leber frei und erreichte so eine Verkürzung der anhepatischen Zeit

von 35-45 Minuten auf etwa 25 Minuten. Erst nach der Reperfusion anastomosierte er die

infrahepatische Vena cava inferior. Durch diese Modifikation konnte S. Lee auf die

Benutzung des extrakorporalen Shunts verzichten (68).

Eine revolutionäre Technik der ortothopen Rattenlebertransplantation veröffentlichten N.

Kamada und Roy Y. Calne im Jahre 1979. Sie verzichteten wie S. Lee auf eine

Arterialisierung und einen extrakorporalen Shunt. Jedoch anastomosierten sie die Vena portae

und später auch die infrahepatische Vena cava inferior mittels eines Polyäthylen-Cuffs (57).

Sie konnten mit dieser Methode die anhepatische Phase auf 15-17 Minuten verkürzen. Eine

Weitere Modifikation stellte die Rekonstruktion des Gallengangs dar. Hierbei verwendeten N.

Kamada und Roy Y. Calne zwei Kunststoff-Splints, die sie nach Platzierung in den

30

Gellengängen von Spenderleber und Empfänge teleskopartig ineinander schoben und

fixierten. Die Überlebensrate (länger als eine Woche), die durch dieses neue Modell erreicht

wurde, betrug 83,3% (57).

Eine weitere Vereinfachung der orthotopen Rattenlebertransplantation veröffentlichte F. A.

Zimmermann ebenfalls im Jahre 1979. Er verwendete für die Rekonstruktion des Gallengangs

lediglich einen Teflon-Splint, über welchen er sowohl den Gallengang der Spenderleber als

auch den des Empfängers stülpte und in dieser Position fixierte (138).

M. Miyata veränderte 1980 die orthotope Rattenlebertransplantation dahingehend, dass er

auch die Anastomose der suprahepatischen Vena cava inferior mit der Cuff-Technik

anastomosierte. Er konnte damit eine Verkürzung der anhepatischen Phase auf 13-14 Minuten

erreichen. Nach einer Woche lebten noch 85 % der Tiere, nach zwei Monaten zeigte sich eine

Überlebensrate von 55% (77).

Eine weitere Technik, die es vorsieht, die suprahepatische Vena cava mit einem Cuff zu

anastomosieren wurde 1986 von A. Settaf publiziert. Er erreichte eine Verkürzung der

anhepatischen Phase auf 11 Minuten. Die 2-Monats-Überlebensrate betrug bei dieser Technik

70% (110).

Eine ähnliche Methode publizierte S. Tsuchimoto im Jahre 1988 und erreichte eine 100-Tage-

Überlebensrate von 71,4% (125).

1985 publizierte Engemann eine Rattenlebertransplantationstechnik mit Rearterialisierung.

Diese erreichte er durch die End-zu-Seit Anastomosierung eines Spenderaortensegmentes mit

der Empfängeraorta. Die Rekonstruktion des Gallenganges führte er mit Hilfe eines Teflon-

Splintes durch, analog zu dem von F.A. Zimmermann beschriebenen Modell. Jedoch

verwendete er nicht die Cuff-Technik zur Anastomosierung der Venen, sondern

anastomosierte sie mittels mikrochirurgischen Nähten (33).

Ein besonderes Augenmerk liegt bei der Rattenlebertransplantation auf der Arterialisierung.

Einige Studien konnten erfolgreiche Rattenlebertransplantationen ohne Rearterialisierung

aufgezeigt (57,68). Jedoch besteht heutzutage Einigkeit darüber, dass eine Arterialisierung der

Leber nach orthotoper Rattenlebertransplantation die Transplantatleber von dieser Maßnahme

profitieren lässt (37).

In der Literatur werden zahlreiche Techniken zur Rearterialisierung beschrieben. So

veröffentlichte Y. Hasuike 1988 eine Methode, bei der er nach rechtsseitiger Nephrektomie

die rechte Arteria renalis des Empfängers mit einem Spender-Aortensegment in Cuff-Technik

anastomosierte (47).

31

1989 wurde von R. Steffen ein Modell vorgestellt, bei dem er den Truncus coeliacus des

Spenders mit der Arteria hepatica communis das Empfängers in Cuff-Technik anastomosierte

(117).

Der Erste, der einen Kunststoffsplint für die Anastomosierung der Leberarterie benutzte, war

W. Gao im Jahre 1993 (40).

32

2 Fragestellung

Es existiert eine Vielzahl von Studien, welche sich mit der Sequenz der Reperfusion bei der

Lebertransplantation und deren Einfluss auf den Ischämie-/Reperfusionsschaden beschäftigen.

Im Einzelnen handelt es sich dabei um folgende Arten der Reperfusion:

• Sequentielle, initial portale Reperfusion

• Sequentielle, initial arterielle Reperfusion

• initiale simultane Reperfusion

• initiale retrograde Reperfusion.

Während die ersten drei genannten orthograden Reperfusionsarten bereits in etlichen

tierexperimentellen, sowie klinischen Studien verglichen und untersucht wurden, existieren

momentan nur zwei retrospektive Studien für die retrograde Reperfusion.

Somit erschien es sinnvoll, eine tierexperimentelle Studie zu dieser Thematik durchzuführen,

da hierbei durch das Versuchsdesign die Rahmenbedingungen in allen Gruppen exakt die

Selben sind.

In der hier Vorliegenden Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden:

1. Ist die retrograde Reperfusion im Rattenmodell durchführbar?

2. Zeigen retrograd reperfundierte Lebern nach Lebertransplantation laborchemisch

einen geringeren Ischämie-/Reperfusionsschaden als orthograd, initial portal und

orthograd, initial simultan reperfundierte Lebern?

3. Kann histologisch eine bessere Organqualität 48 Stunden nach Lebertransplantation

festgestellt werden, wenn die initiale Reperfusion retrograd durchgeführt wurde, im

Vergleich zur anterograd durchgeführten Reperfusion?

33

3 Material und Methode

3.1 Genehmigung der Tierversuche

Die für diese Studie durchgeführten Tierversuche waren gemäß des Tierschutzgesetzes von

der zuständigen Behörde (Regierung von Oberbayern, München) unter dem Aktenzeichen

209.1/211-2531-89/04 vor Beginn genehmigt worden.

3.2 Versuchstiere

Für die Experimente wurden männliche syngene Lewis-Ratten (Charles-River Wiga GmbH,

Sulzfeld, BRD) verwendet. Es handelt sich hierbei um Tiere aus Inzuchtstämmen, für deren

Aufbau 10-50 Jahre kontrollierter Zuchtarbeit erforderlich sind. Über mindestens 20

Generationen wird in engster Verwandtschaftspaarung ein Zuchtkern fortgeführt, bei dem die

Weiterführung zur nächsten Generation für die ganze Population jeweils auf einem einzigen

Bruder-Schwester Paar beruht. Durch regelmäßige Kontrollen an vielen verschiedenen

Genorten wird gewährleistet, dass es sich tatsächlich um genetisch nahezu identische Tiere

handelt.

Das Gewicht der Tiere betrug 250-300 g, wobei das Gewicht des Empfängers um ca. 20

Gramm höher sein sollte als das des Spenders, da somit eine technische Erleichterung der

Transplantation erreicht wird.

Die Tiere wurden einzeln in Microlonkäfigen (Ehret GmbH, Emmendingen, BRD) auf

Einstreu und bei einer Raumtemperatur von 19-24 °C sowie einem Beleuchtungsintervall von

6.00 bis 18.00 Uhr im Tierstall des Zentrums für präklinische Forschung (ZPF), Klinikum

rechts der Isar der Technischen Universität München, gehalten. Sie erhielten Wasser und eine

Haltungsdiät (Pressfutter, Altromin 1324 Standarddiät, Lage, BRD) jeweils ad libitum.

34

3.3 Versuchsgruppen

Insgesamt wurden 3 Versuchsgruppen gebildet. Es wurden nur solche Tiere in die

Auswertung einbezogen, die folgende Überlebenskriterien erfüllten: Keinerlei intraoperative

Komplikationen, intraoperativer Blutverlust unter 0,5 ml, anhepatische Phase unter 25

Minuten, Gesamt-Anästhesie- und Operationsdauer unter 1,5 Stunden.

Gruppe I Die Reperfusion der Transplantatleber erfolgte primär über die V.portae, wobei

die Eröffnung der A.hepatica propria 6 Minuten danach erfolgte. (n=7)

Gruppe II Die Reperfusion der Transplantatleber erfolgte synchron sowohl über die

V.portae als auch über die A.hepatica propria. (n=7)

Gruppe III Die Reperfusion der Transplantatleber erfolgte retrograd über die

infrahepatische V.cava inferior. (n=7)

Die Blutentnahmen erfolgten 1h, 24h und 48h post operationem, wobei jeweils 0,6 ml Blut

aus der V. femoralis zur Bestimmung der Leberfunktionsparameter entnommen wurden. Im

Anschluss an die letzte Blutentnahme wurde die Leber zur histologischen Aufarbeitung

entnommen ( siehe 3.5.2).

3.4 Chirurgisches Vorgehen

3.4.1 Operationsvorbereitung und Anästhesie

Präoperativ mussten die Tiere eine 8-stündige Nahrungskarenz einhalten. Vor der

Transplantation musste eine Bronchopneumonie ausgeschlossen werden. Diese häufigsten

Infektionen in der Rattenzucht können die Widerstandsfähigkeit der Tiere gegenüber dem

atemdepressorisch wirkenden und atemwegsreizendn Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluoräthyl-

difluormethyläther) soweit herabsetzen, dass es schon bei niedrigen Dosierungen zu

unverhältnismäßig tiefen Narkosen oder sogar zum Atemstillstand kommen kann. Symptom

dieser Pneumonien sind deutlich hörbare Rasselgeräusche bei der Auskultation. Bei der

35

Sektion erkrankter Tiere fanden sich ausgedehnte Lungenabszesse und Atelektasen. Tiere in

schlechtem Allgemeinzustand wurden von den Versuchen ausgeschlossen.

Der operative Eingriff, die Blutentnahmen und die Sektion wurden unter Forene® (Abbot

GmbH, Wiesbaden, BRD) Inhalationsnarkose durchgeführt. Diese Narkose hat den Vorteil

der guten Steuerbarkeit und der mit 0,17% sehr niedrigen Metabolisierungsrate des Isoflurans,

was eine Nieren- und Leberschädigung nicht erwarten lässt. Auch lässt sich diese Narkose in

der anhepatischen Phase sehr gut steuern.

Die Isofluran-Narkose führt zur reversiblen Ausschaltung des Bewusstseins, einer

Verminderung der Schmerzempfindung, einer Abschwächung der Schmerz- und

Schutzreflexe, sowie zur Muskelrelaxation.

Die therapeutische Konzentration des Isoflurans liegt bei 1,0-2,0 Vol.%, welche mittels eines,

in einem Narkosegerät (Fa. Völker, BRD) integrierten Verdampfers geregelt wird. Als

Trägergas wurde O2 100% verwendet. Die Narkosetiefe lässt sich durch Beobachtung der

Atmung und des Muskeltonus bestimmen. Ist eine ausreichende Narkosetiefe vorhanden, ist

die Atmung ruhig und regelmäßig, der Muskeltonus aufgehoben und die Muskelreflexe

erloschen.

Eine Prämedikation ist bei der Isofluran-Narkose bei der Ratte nicht notwendig. Die Narkose

wird in einer Ganzkörperkammer eingeleitet. Dabei handelt es sich um einen

Kunststoffzylinder mit einer Länge von ca.30 cm und einem Durchmesser von ca.10cm. An

beiden Deckflächen der Kammer befindet sich ein Anschluss für den Gas zu- und Gas

abführenden Schlauch des Narkosegerätes.

Nach Einsetzen der Ratte in die Ganzkörperkammer wird eine Isoflurankonzentration von 5

Vol% in selbiger erzeugt, was nach ca. einer Minute zu einer vollständigen Anästhesie des

Tieres führt. Nach Erlöschen der Stellreflexe kann die Ratte aus der Ganzkörperkammer

genommen und auf der Operationsunterlage positioniert werden. Zur Aufrechterhaltung der

Narkose wird der vordere Teil des Kopfes in eine Kopfkammer verbracht. Dabei handelt es

sich um einen Kunststoffzylinder mit einer Länge von ca. 6cm und einem Durchmesser von

4cm an dessen Seitenfläche sich zwei Anschlüsse für den Gas zu- und Gas abführenden

Schlauch des Narkosegeräts befinden. Weiterhin ist eine Deckfläche durch eine

Kunststoffmembran ersetzt, in deren zentralem Teil eine Öffnung für den vorderen Teil des

Rattenkopfes liegt. In der Kopfkammer wird eine Isofluran-Konzentration von 1,5-2,5 Vol%

aufrechterhalten.

36

Ein Nachteil der Isofluran-Narkose ist die Abnahme des Blutdrucks, jedoch stehen dem die

Vorteile der einfachen Handhabung, der guten Steuerbarkeit, der Abnahme des portalen

Gefäßwiderstandes und des schnellen postoperativen Erwachens gegenüber(28,105).

Um einem Auskühlen der Versuchstiere entgegenzuwirken, wurde die Operationsunterlage

mittels einer Wärmematte (Fa. Horn GmbH, Gottmadingen, BRD) auf 37°C erwärmt.

3.4.2 Operationstechnik

Die Operation wurde als arterialisierte orthotope Rattenlebertransplantation (oRLTx) mit

mikrochirurgischer Nahttechnik durchgeführt. Die arterielle Versorgung wurde mittels einer

extrem schnell durchführbaren Splinttechnik rekonstruiert, um eine direkte Vergleichbarkeit

der Versuchsgruppen zu gewährleisten.

3.4.2.1 Präparationsphase der Spenderoperation

Zu Beginn wurde die Bauchhaut rasiert und desinfiziert. Nach medianer Laparotomie von der

Symphyse bis zum Xyphoid wurde der Situs mittels vierer Haltehaken exponiert und in dieser

Position fixiert. Das Xiphoid wurde mit Hilfe einer Haltenaht nach kranial gezogen und

fixiert. Nach Durchtrennung des Lig. falciforme wurde die linke V. phrenica doppelt ligiert

und abgesetzt. Weiterhin wurden die hepatophrenischen und hepatogastrischen Bänder

abgesetzt und das Gefäßbündel zwischen Leber und unterem Ösophagus koaguliert und

abgesetzt.

Zur Präparation des Lig. hepatoduodenale wurde zunächst der Lobus medianus der Leber in

Kunststofffolie eingeschlagen und nach kranial geklappt. Das Darmkonvolut wurde in eine

feuchte Mullkompresse eingeschlagen und nach links gelagert. Zunächst wurde der Ductuc

choledochus freipräpariert und leberfern ligiert. Unter leichtem Zug am Ligaturfaden wurde

der Ductus choledochus nun inzidiert, ein an den Enden angeschrägter Gallengangssplint

(6mm Länge, BD Vasculon Plus 0.6 x 19mm) in sein Lumen eingeführt und mit einer Ligatur

(Pharma-Hand Seide, 7-0) in seiner Position fixiert. Hierbei ist darauf zu achten, dass der

Splint nicht zu weit in den Leberhilus hineingeschoben wird, damit eine Drainage aller sich

im Hilus zum Ductus choledochus vereinigenden Gallengänge gewährleistet ist. Nun folgte

die doppelte Ligatur und Durchtrennung der V. gastroduodenalis sowie das Freipräparieren

der V. portae von der Einmündung der V. lienalis bis zum Leberhilus. Nach Verlagerung des

Darmkonvoluts nach rechts wurde die A. gastroduodenalis doppelt ligiert und abgesetzt, dann

der Verlauf der A. hepatica propria und A. hepatica communis bis zum Truncus coeliacus

freipräpariert. Nach Rückverlagerung des Darmkonvoluts nach links wurden die Abgänge der

37

A. gastrica sinistra und der A. lienalis aufgesucht, die Arterien freipräpariert, doppelt ligiert

und abgesetzt. Um den Truncus coeliacus im ganzen einsehen zu können, wurde die V.

splenica doppelt ligiert und abgesetzt. Nun konnte der Truncus coeliacus bis zur Aorta

freipräpariert werden, sodass nun die arterielle Versorgung der Leber isoliert und von der

Aorta bis zum Leberhilus mobilisiert war. Dabei ist darauf zu achten, dass sich zwischen

Truncus coeliacus und A. mesenterica superior eine derbe Bindegewebsplatte befindet.

Der infrahepatische Verlauf der V. cava inferior wurde oberhalb der Einmündung der linken

V. renalis isoliert und die rechte V. suprarenalis sowie die benachbarte Lumbalvene cavanah

koaguliert und abgesetzt. Darauf folgte die Ligatur der rechten V. renalis. Durch kurzzeitiges,

linksseitiges Verlagern der Leber konnten Leber und suprahepatische V.cava inferior von

dorsal eingesehen und von Retroperitoneum und Diaphragma abgelöst werden.

Nach stumpfem Präparieren des Retroperitonealraumes folgte die Freilegung des

Aortensegments vom Zwerchfelldurchtritt bis zur Bifurkation. Mittels eines Microgefäßclips

(Mehdorn-Biemer-Gefäßclip, Aesculap AG&Co KG, Tutlingen, BRD) wurde die

Aortenbifurkation abgeklemmt.

Während der gesamten Spenderoperation wurde darauf geachtet, dass die Manipulationen an

der Leber auf das Notwendigste beschränkt blieben und diese so schonend wie möglich

erfolgten, da sich schon leichte Manipulationen negativ auf die Qualität der Spenderleber

auswirken können (104).

3.4.2.2 Perfusionsphase und Organkonservierung

Die Perfusionsphase wurde mit dem Abklemmen der infrahepatischen V. cava inferior

zwischen der Einmündung der rechten und linken V. renalis mittels Microgefäßclip begonnen.

Im Anschluss daran wurde die Aorta oberhalb des Truncus coeliacus mit einem

Microgefäßclip abgeklemmt. Zur Auswaschperfusion wurde die Aorta abdominalis

bifurkationsnah punktiert und ein Perfusionskatheter (Venflon Pro 0,9x25mm) eingeführt. Als

Perfusionslösung wurde NaCl 0,9% Lösung mit einer Temperatur von 4°C verwendet. Der

Perfusionsdruck lag bei 100 mmHg. Dies entspricht dem physiologischen Aortendruck der

Ratte. Es wurden 50 ml der NaCl-Lösung perfundiert. Dies entspricht dem zur Äquilibrierung

erforderlichen 6-fachen Organgewicht (49).

Unmittelbar nach Beginn der Perfusion wurde über einen Zwerchfellschnitt die

supraphrenische V. cava inferior großzügig inzidiert, um einen, durch die Perfusion bedingten

Überdruck, zu vermeiden und den Abfluss von Blut und Perfundat zu ermöglichen. Während

der Perfusion wurde die suprahepatische V. cava inferior direkt am Gefäß-Zwerchfell-

38

Übergang zirkulär abgesetzt. Die infrahepatische V. cava inferior wurde unmittelbar proximal

der Einmündung der rechten V. renalis abgesetzt. Nach Durchtrennung der V.portae proximal

der Einmündung der V.splenica und des Absetzens des Truncus coeliacus unter Belassen

eines Aortenpatches wurde die simultane portale Perfusion beendet. Die Leber wurde an

einem, am Stumpf der infrahepatischen V.cava inferior platzierten Microgefäßclip

entnommen und für zwei Stunden in einem 4°C kühlen Konservierungsbad (NaCl-Lösung

0,9%) gelagert.

3.4.2.3 Präparationsphase der Empfängeroperation

In Isofluran-Allgemeinnarkose erfolgte nach Rasieren und Desinfizieren der Bauchhaut die

Eröffnung des Abdomens durch eine mediane Laparotomie von der Symphyse bis zum

Xyphoid. Die Bauchhöhle wurde mit Hilfe von vier Bauchdeckenhaken aufgespannt. Das

Xyphoid wurde wie bei der Spenderoperation nach kranial fixiert.

Wie bei der Spenderoperation wurde zunächst das Lig. falciforme durchtrennt und die linke V.

phrenica doppelt ligiert und abgesetzt. Anschließend wurden die hepatophrenischen und

hepatigastrischen Bänder durchtrennt, sowie das Gefäßbündel zwischen Leber und Ösophagus

koaguliert und abgesetzt.

Bei der sich nun anschließenden Präparation des Lig. hepatoduodenale wurde der Ductus

choledochus lebernah freigelegt, knapp distal seiner Aufzweigungen im Leberhilus ligiert und

proximal der Ligatur abgesetzt. Dabei wurde ein Ende des Ligaturfadens etwa 0,5 cm lang

belassen, was das spätere Auffinden erleichterte. Die V. gastroduodenalis wurde aufgesucht,

doppelt ligiert und abgesetzt. Die V. portae wurde bis zur Einmündung der V. lienalis

freipräpariert.

Die infrahepatische V. cava inferior wurde zwischen Leber und Einmündung der rechten V.

renalis freipräpariert. Die rechte V. suprarenalis und deren benachbarte Lumbalvene wurden

lebernah koaguliert und abgesetzt. Durch kurzzeitiges Verlagern der Leber nach links konnte

diese von dorsal eingesehen und mobilisiert werden.

3.4.2.4 Einführen eines Splints in die A. hepatica communis

Zunächst wurde das Darmkonvolut nach links verlagert und der Abgang der A. hepatica

communis aus dem Truncus coeliacus aufgesucht. Direkt distal des Abgangs wurde die A.

hepatica communis mit einem Microgefäßclip abgeklemmt. Dabei war darauf zu achten, dass

weder die A. splenica noch die A. gastrica sinistra abgeklemmt wurden. Nach

Rückverlagerung des Darmkonvolutes nach rechts konnten die A. gastroduodenalis und A.

39

hepatica propria ligiert werden. Nun wurde die A. hepatica communis direkt an der

Bifurkation inzidiert und ein, mit Heparin beschichteter Splint (BD Vasculon Plus 0.6 x

19mm) in das Lumen vorgeschoben und mittels Ligatur (Pharma-Hand Seide, 7-0) in seiner

Position fixiert. Abschließend konnten A. gastroduodenalis und A. hepatica propria proximal

ihrer Ligaturen abgesetzt werden.

3.4.2.5 Explantation der Eigenleber

Initial wurde die infrahepatische V. cava inferior proximal der Einmündung der rechten V.

renalis, dann die V. portae an der Einmündung der V. splenica mittels Microgefäßclip

abgeklemmt. Nun wurde eine Satinsky-Klemme an der suprahepatischen V. cava inferior

angebracht, die Leber mittels Vessel-loop nach kaudal verlagert und die Klemme am

Übergang von suprahepatischer V. cava inferior und Zwerchfell geschlossen. Daraufhin

konnten die suprahepatische und infrahepatische V. cava sowie die V. portae lebernah

abgesetzt und die Leber entnommen werden. Nach Verschluss der V. portae begann die

kritische anhepatische Phase, die einen Zeitraum von 25 Minuten nicht überschreiten sollte.

Vor Einbringung des Transplantats wurde eine feuchte, gekühlte Mullkompresse in das

Leberbett eingelegt. Anschließend wurde die zu transplantierende Leber aus dem

Konservierungsbad gehoben und orthotop im Empfängersitus platziert. Um einen

Leberschaden durch Austrocknung zu verhindern, wurde das Spenderorgan mit

Kunststofffolie abgedeckt.

3.4.2.6 Anastomosierung der suprahepatischen V. cava inferior

Mittels Eckfäden (9-0 Prolene, Fa. Ethicon, Norderstedt, BRD) wurden die Ecken der

suprahepatischen V. cava inferior von Spender und Empfänger verknotet. Die Hinterwand

wurde daraufhin fortlaufend von innen genäht. Beim Erreichen der gegenüberliegenden

Ecknaht wurde dieser Faden nun am zwerchfellseitigen Stumpf nach außen durchgestochen,

mit dem zweiten Eckfaden verknotet und anschließend für die Naht der Vorderwand

verwendet. Um Luftbläschen zu eliminieren und dadurch eine Luftembolie zu vermeiden

sollte vor Vervollständigung der Anastomose das Gefäßlumen geflusht werden.

40

3.4.2.7 Anastomosierung der Pfortader

Nach Entfernung der Mullkompresse und Hochlagern des Lobus medianus und des Lobus

lateralis sinister ließ sich die Leberpforte darstellen. Die beiden Ecknähte (9-0 Prolene)

wurden so angelegt, dass der kleinere Kreisbogen von der Hinterwand gebildet wurde, und

sich dadurch die Hinterwand stärker als die Vorderwand anspannte. So konnte die Hinterwand

fortlaufend von innen genäht werden. Nach Erreichen der gegenüberliegenden Ecknaht und

Ausstechen des Fadens wurde er mit dem zweiten Eckfaden verknotet. Mit demselben Faden

wurde nun die Vorderwand genäht.

3.4.2.8 Anastomosierung der infrahepatischen V. cava inferior

Die Gefäßnaht der infrahepatischen V. cava inferior erfolgte ebenfalls mit einem 9-0 Prolene-

Faden in einer zur Pfortaderanastomosierung analogen Technik.

3.4.2.9 Wiederherstellung der arteriellen Versorgung

Der sich an der Transplantatleber befindliche arterielle Schenkel, bestehend aus A. hepatica

propria, A. hepatica communis, Truncus coeliacus und Aortenpatch wurde an letzterem

gegriffen und der -zuvor in die A. hepatica communis des Empfängers eingebrachte- Splint in

das Lumen des Truncus coeliacus geschoben. Mittels Ligatur ( Pharma-Hand Seide, 7-0)

wurde er in seiner Position fixiert. Dieser Operationsschritt hat eine Zeitspanne von 30

Sekunden nicht überschreiten.

3.4.2.10 Reperfusion der Transplantatleber

Die Reperfusion der Transplantatleber wurde gruppenspezifisch vorgenommen.

Gruppe I: Unmittelbar nach Fertigstellung der V. portae-Anastomose wurde die Satinsky-

Klemme an der suprahepatischen V. cava inferior und der Microgefäßclip an der

V. portae entfernt. Damit war der temporäre Blutstau in den unpaarigen

Bauchorganen aufgehoben und die kritische anhepatische Phase beendet. Die

arterielle Versorgungsbahn wurde wiederhergestellt und der Microgefäßclip an

der A. hepatica communis des Empfängertieres nach 6 Minuten entfernt.

41

Gruppe II: Hier wurde nach Fertigstellung der V. portae-Anastomose direkt die arterielle

Versorgung rekonstruiert. Im Anschluss daran wurden die Satinsky-Klemme der

suprahepatischen V. cava inferior sowie die Microgefäßclips an V. portae und A.

hepatica communis zeitgleich entfernt.

Gruppe III: Im Gegensatz zu den beiden anderen Gruppen wurde hier nach der

Anastomosierung der suprahepatischen V. cava inferior nicht die V. portae,

sondern die infrahepatische V. cava anastomosiert. Nach Fertigstellung der Naht

wurde der Microgefäßclip an der infrahepatischen V. cava inferior entfernt.

Somit wurde die Transplantatleber retrograd über die V. cava inferior

perfundiert. Nach einem Blutverlust von 0,2-0,3 ml über den Gefäßstumpf der

Spender- V. portae wurde dieser mit einem Microgefäßclip abgeklemmt und die

Naht der Pfortader vorgenommen. Nach Fertigstellung der Anastomose wurden

Satinsky-Klemme und die Microgefäßclips an der V. portae entfernt. Nun wurde

die arterielle Versorgung wiederhergestellt und der Microgefäßclip der A.

hepatica communis 6 Minuten nach Eröffnen der Pfortader entfernt.

3.4.2.11 Rekonstruktion des Gallengangs

Im Anschluss an die Reperfusion und Arterialisierung des Transplantats folgte die

Rekonstruktion des Gallengangs. Der Gallengang des Empfängers wurde quer inzidiert und

der durch eine Ligatur im Spender-Gallengang fixierte Splint an seinem freien Ende in den

Empfänger-Gallengang eingeführt. Über den Splint wurden die beiden Gallengangsstümpfe

mittels zweier Ligaturen miteinander verbunden und fixiert (Pharma-Hand Seide, 7-0).

Die Empfängeroperation wurde mit mehrmaliger Spülung der Bauchhöhle (NaCl-Lösung

0,9%) und Verschluss der Bauchdecke in zwei Schichten (Muskel/Faszie und Haut)

abgeschlossen.

42

3.5 Postoperative Nachsorge

Nach der Operation kamen die Tiere in Einzelkäfige und hatten sofort Zugang zu

Trinkwasser. Weiterhin wurde eine Wärmezufuhr mittels Infrarotlampe während der ersten 12

Stunden durchgeführt. Die Nahrungskarenz wurde postoperativ nicht weitergeführt. Die

postoperative Beobachtungszeit betrug 48 Stunden.

3.5.1 Blutentnahmen

Blutentnahmen wurden 1, 24 und 48 Stunden nach der Operation vorgenommen. Dazu wurde

in Isofluran-Inhalationsnarkose die V. femoralis punktiert und ca.600 µl Blut entnommen und

in einer heparinisierten Eppendorf-Kanüle aufgefangen. Nach 10-minütigem Zentrifugieren

bei 3000 Umdrehungen pro Minute (EBA 12; Fa. Hettich, Tuttlingen, BRD) wurde das

Plasma abpipettiert und bis zur laborchemischen Auswertung der Serumwerte bei -80°C

aufbewahrt.

3.5.2 Sektion

Nach 48 Stunden wurde die Sektion vorgenommen. In tiefer Isofluran-Inhalationsnarkose

wurde die Leber explantiert und die rechte Hälfte des Lobus medianus, des Lobus lateralis

dexter, sowie des Lobus lateralis sinister zur weiteren histologischen Bearbeitung

entnommen. Zuvor wurde die Durchgängigkeit aller transplantatversorgenden Gefäße,

insbesondere der A. hepatica distal der Anastomosen mittels Inzision überprüft.

3.6 Untersuchungsmethoden

3.6.1 Intraoperatives Monitoring

Intraoperativ wurde die Atemfrequenz, Herzfrequenz pro Minute, die periphere

Sauerstoffsättigung des Blutes und die Körpertemperatur beim Spendertier nach Laparotomie,

beim Empfängertier nach Laparotomie und Reperfusion gemessen.

43

3.6.2 Leberfunktionsparameter

Serum-GOT, -GPT, Gesamtbilirubin, AP, und -GLDH wurden beim Empfänger 1 Stunde, 24

Stunden und 48 Stunden postoperativ bestimmt. Oben genannte Leberfunktionsparameter

wurden mit optimierten Standardmethoden der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie

im Mikroanalysegerät (Hitachi® 747, Institut für Klinische Chemie und Pathobiochemie,

Klinikum rechts der Isar der TU München) photometrisch bestimmt.

3.6.2.1 Laborchemische Bestimmungsmethoden

Bei der Bestimmung der GOT-Aktivität handelt es sich um einen optimierten UV-Test nach

den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie:

GOT

L-Aspartat + 2-Oxoglutarat Oxalacetat + L-Glutamat

MDH

Oxalacetat + NADH + H+ Malat + NAD+

Die Geschwindigkeit der NADH-Abnahme wird photometrisch bei einer Wellenlänge von

340 nm und einer Temperatur von 37°C bestimmt. Sie ist der GOT-Aktivität im

Probenmaterial direkt proportional.

Auch die Bestimmung der GPT-Aktivität ist ein optimierter UV-Test nach der Empfehlung

der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie:

GPT

L-Alanin + 2-Oxoglutarat Pyruvat + L-Glutamat

LDH

Pyruvat + NADH + H+ L-Lactat + NAD+

Auch bei dieser Messung wird die NADH-Abnahme bei einer Wellenlänge von 340 nm und

einer Temperatur von 37°C bestimmt. Sie ist der GPT-Aktivität im Probenmaterial direkt

proportional.

Die Bilirubinkonzentration wird photometrisch nach der Methode von Jandrassik und Grof

durchgeführt. Das an Glucuronsäure gebundene („direkte“) Bilirubin wird mit diazotierter

44

Sulfanilsäure gespalten. Dadurch kommt es zur Bildung eines Azopigmentes mit

Indikatoreigenschaften, welches im alkalischen Milieu photometrisch gemessen wird.

Das nicht glucuronidierte („indirekte“) Bilirubin ist im Serum an Albumin gebunden. Vor der

Reaktion mit diazotierter Sulfanilsäure wird es mit Coffeinsäure aus dieser Bindung gelöst

werden. Nach dieser Methode wird das Gesamtbilirubin bestimmt.

Bei der Bestimmung der alkalischen Phosphatase handelt es sich um einen optimierten UV-

Test, dem folgende Reaktion zugrunde liegt:

AP, pH 10

p-Nitrophenylphosphat + H2O p-Nitrophenolat + HPO4 2-

Das entstandene p-Nitrophenolat wird bei 405 nm photometrisch gemessen.

Die GLDH wird photometrisch wie folgt bestimmt:

GLDH

2-Oxoglutarart + NH4+ + NADH L-Glutamat + NAD+ + H2O

Die Abnahme von NADH wird photometrisch bei 340 nm gemessen.

3.6.3 Histologie

Für die histologische Auswertung wurde in allen drei Gruppen die Leber nach 48 Stunden

entnommen und bis zur Weiterverarbeitung in 6%igem Formalin fixiert und vor Lichteinfall

geschützt. Das so fixierte Gewebe wurde in Paraffin eingebettet. Nach Erhärten der so

gewonnenen Blöcke konnten 5 µm dünne Gewebsschichten mit Hilfe eines Mikrotoms

gewonnen werden. Diese wurden anschließend auf einen Objektträger aus Glas aufgebracht.

Nach Aufbringen des Gewebes auf den Objektträger folgte die Färbung mit Hematoxylin und

Eosin.

In allen Gruppen wurden die rechte Hälfte des Lobus medianus, der Lobus lateralis dexter,

sowie der Lobus lateralis sinister untersucht.

Die histologische Auswertung geschah durch zwei Pathologen, welche die Schnitte geblindet,

sowie unabhängig voneinander auswerteten.

45

Die Proben wurden anhand des Typs und der Ausdehnung der Nekrosen, bezogen auf

Rappaport-Zonen, der Anzahl von Nekroseherden pro Gesichtsfeld, sowie auf das begleitende

perivaskuläre Ödem beurteilt.

3.7 Statistische Auswertung

Von allen gemessenen Werten wurde gruppenbezogen der arithmetische Mittelwert (mean)

gebildet, sowie die Standardabweichung des Mittelwertes (SEM) ermittelt. Sämtliche in

dieser Arbeit gefundenen Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung des

Mittelwertes angegeben. Die Berechnung des Signifikanzniveaus erfolgte mit dem

kommerziell erhältlichen Statistikprogramm SPSS. Die graphischen Darstellungen wurden

mit dem kommerziell erhältlichen Statistikprogramm „Microsoft Excel“ für Office XP

erstellt.

Bei der Auswertung der Laborwerte wurde zum Vergleich der Werte von mehr als zwei

Gruppen die „one-way ANOVA“ Varianzanalyse angewendet. Wurden zwei Gruppen direkt

miteinander verglichen, kam als „post hoc test“ der T-Test zur Anwendung. Für eine

statistische Signifikanz wurde ein p-Wert kleiner 0,05 angenommen. Als Tendenz galt ein p-

Wert kleiner 0,15.

Bei der statistischen Auswertung der histologischen Ergebnisse kam aufgrund einer nicht

anzunehmenden Normalverteilung der „exakte Test nach Fischer“, sowie der „Kruskal Wallis

Test“ zur Anwendung.

46

Abbildung 4: Darstellung des Leberhilus

Abbildung 5: Darstellung des Lebersitus mit rechter V. phrenica

47

Abbildung 6: Situs nach Einsetzen des Gallengangssplints und Präparation der Leberarterie

Abbildung 7: Perfusion der Spenderleber über die Aorta

48

Abbildung 8: Die Leber nach erfolgter Explantation

Abbildung 9: Vorbereitung der Leberarterie zum Einbringen des Splints

49

Abbildung 10: Situs nach Platzierung des Arteriensplintes

Abbildung 11: Naht der Rückwand der suprahepatischen V. cava inferior

50

Abbildung 12: Fertiggestellte Anastomose der suprahepatischen V. cava inferior

Abbildung 13: Anastomosierung der V. portae

51

Abbildung 14: Die Leber nach der Transplantation (Gallengang noch nicht anastomosiert)

Abbildung 15: Situs nach Lebertransplantation und Vollendung aller Anastomosen

52

4 Ergebnisse

Die Ergebnisse, die im Laufe dieser Arbeit erhoben wurden, setzen sich aus den indirekten

Zeichen einer Leberschädigung, nämlich den Laborwerten GOT, GPT, AP, Bilirubin und

GLDH, als auch aus dem histologischen Aspekt, als direkte Methode zur Objektivierung einer

Lebergewebsschädigung zusammen. Aber auch der intraoperative Befund war

ausschlaggebend für eine Aufnahme in eine der Versuchsgruppen.

4.1 Makroskopischer Aspekt nach Reperfusion

In eine der Studiengruppen wurden nur Tiere aufgenommen, deren Transplantatleber direkt

nach Reperfusion eine homogene, sowie ausreichende Durchblutung zeigte. Die Lebern

zeigten eine intensive und rasche, dunkelrote Färbung unmittelbar nach Eröffnen der Klemme

an der V. portae in den Gruppen I und II. In der Gruppe III wurde die Leber bereits durch die

retrograde Reperfusion intensiv dunkelrot gefärbt.

Tiere, bei denen es nach der Reperfusion (anterograd oder retrograd) nicht zu einer

homogenen Durchblutung kam, was auf eine operationstechnische Komplikation hindeutet,

wurden aus der Studie ausgeschlossen.

4.2 Der postoperative Verlauf

In der hier vorgestellten Studie wurden insgesamt 21 erfolgreiche

Rattenlebertransplantationen durchgeführt (drei Gruppen mit jeweils 7 Versuchstieren). Die

Überlebensrate bis zur Entnahme der Transplantatleber 48 Stunden nach Beendigung der

Operation betrug in allen drei Gruppen 100%.

Interessanterweise kam es nach Beendigung der Operation bei den Tieren der Gruppe III

(retrograde Reperfusion) deutlich schneller zu einem Erwachen aus der Narkose, als bei den

Tieren aus den Gruppen I und II (anterograde Reperfusion). Während die Tiere der Gruppen I

53

und II zwischen 20 und 25 Minuten zur Wiedererlangung ihres Bewusstseins benötigten,

erwachten die Tieren der Gruppe III schon nach 10 bis 15 Minuten aus der Narkose.

Weiterhin erholten sich die Tiere gut von der Operation, was anhand der Fellqualität, der

Agilität und der Bereitschaft zu fressen zu erkennen war. Die Tiere fingen unmittelbar nach

Erwachen aus der Narkose mit der Fellpflege an. Diese führten sie auch im weiteren

postoperativen Verlauf durch. Auch wurden die Tiere im postoperativen Verlauf immer

aktiver. 24 Stunden nach der Operation war in Bezug auf Agilität schon kein Unterschied

zwischen operierten und nicht operierten Tieren feststellbar.

4.3 Auswertung der Laborparameter

4.3.1 GOT

Der Mittelwert der Aktivität der GOT war in allen drei Versuchsgruppen 48 Stunden nach der

Operation bereits wesentlich gegenüber dem eine Stunde nach der Operation gemessenen

Wert abgefallen. In der Gruppe I fiel die GOT von 1893,4 ± 402,4 U/l, gemessen eine Stunde

post OP über 1723,7±235,5 U/l, 24 Stunden nach der Transplantation auf einen Wert von

425±86,9 U/l, 48 Stunden nach der Operation. In der Gruppe II stieg der im Serum

gemessene GOT-Wert zunächst von 2026,4±350,7 U/l (nach einer Stunde) auf 2613,3±343,9

U/l, gemessen nach 24 Stunden, um dann endlich auf 588,3±67,9 U/l zu fallen. Die geringsten

Serum GOT-Werte konnten in der Gruppe III gemessen werden. Der anfängliche GOT-Wert

nach einer Stunde betrug im Mittel 1756,0±367,3 U/l. Nach 24 Stunden war bereits eine

Abnahme auf 1186,4±252,9 U/l nachweisbar. 48 Stunden nach der Lebertransplantation war

die GOT bereits auf 213,7±44,1 U/l abgesunken.

Signifikante Unterschiede (p<0,05) ergaben sich bei der GOT erstmals bei den 24 Stunden

nach der Lebertransplantation gemessenen Werten. Dabei unterschieden sich im direkten

Vergleich der Gruppen die Serumwerte der Gruppen I und II , sowie die der Gruppen II

und III . Zwischen Gruppe I und III konnte 24 Stunden nach der Operation kein

signifikanter Unterschied in Bezug auf die GOT festgestellt werden.

Beim direkten Vergleich der Serum-GOT Werte nach 48 Stunden zeigte sich ein signifikanter

Unterschied bei allen drei Gruppen (Abb. 16).

54

GOT im Verlauf

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

2700

3000

1 24 48

Stunden nach Lebertransplantation

U/l

Gruppe 1

Gruppe 2

Gruppe 3

Abbildung 16: Serum GOT Aktivität

Signifikanzen nach 24 Stunden: zwischen Gruppe I und Gruppe II: p=0,008; zwischen

Gruppe II und Gruppe III: p<0,001

Signifikanzen nach 48 Stunden: zwischen Gruppe I und Gruppe II: p=0,039; zwischen

Gruppe I und Gruppe III: p=0,01; zwischen Gruppe II und Gruppe III: p<0,001

55

4.3.2 GPT

Wie auch die GOT, waren die Mittelwerte der gemessenen Serumaktivität der GPT im

zeitlichen Verlauf rückgängig. In der Gruppe I betrug der gemessene Mittelwert der GPT-

Aktivität im Serum eine Stunde nach der Operation 1688,86 U/l±442,80. Dieser fiel im

weiteren Verlauf stark ab. Nach 24 Stunden war noch ein Wert von 1089,71±171,02 U/l

messbar, 48 Stunden nach der Operation lediglich noch eine Aktivität von 214,57±46,1 U/l.

Die Gruppe II zeigte eine Stunde nach der Operation eine gemessene Serumaktivität an GPT

von 1677,71±285,85 U/l. Dieser Wert sank bis zur 24. postoperativen Stunde nur wenig auf

einen Wert von 1598,43±159,36 U/l. Innerhalb der nächsten 24 Stunden sank der Serum-GPT

Wert jedoch stark ab, auf einen Wert von 332,0±43,9 U/l. Am geringsten waren im Mittel die

Serumaktivitätswerte der GPT in der Gruppe III . Bei einem initialen Wert von

1462,14±357,52 U/l nach einer Stunde sank die gemessene Aktivität bis zur 24. Stunde nach

Lebertransplantation auf 662,57±160,7 U/l ab. 48 Stunden nach der Operation war nur noch

eine Serumaktivität der GPT in Höhe von 106,29±31,99 U/l messbar.

Signifikante Unterschiede (p<0,05) in Bezug auf den Mittelwert der Serumaktivitäten der

GPT ergaben sich zwischen allen drei Gruppen bei den Werten, gemessen 24 Stunden und 48

Stunden nach der Lebertransplantation (Abb. 17).

56

GPT im Verlauf

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

1 24 48

Stunden nach Lebertransplantation

U/l

Gruppe 1

Gruppe 2

Gruppe 3

Abbildung 17: Serum GPT Aktivität

Signifikanzen nach 24 Stunden: zwischen Gruppe I und Gruppe II: p=0,009; zwischen

Gruppe I und Gruppe III: p=0,025; zwischen Gruppe II und Gruppe III: p<0,001

Signifikanzen nach 48 Stunden: zwischen Gruppe I und Gruppe II: p=0,016; zwischen

Gruppe I und Gruppe III: p=0,024; zwischen Gruppe II und Gruppe III: p<0,001

57

4.3.3 Bilirubin

Der Bilirubinwert wies zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede auf. Auch waren alle

Werte stets im Normbereich (Abb. 18).

Bilirubin im Verlauf

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

1 24 48

Stunden nach Lebertransplantation

mg/

dl

Gruppe 1

Gruppe 2

Gruppe 3

Abbildung 18: Serum-Konzentration des Bilirubins

Keine Signifikanzen feststellbar

58

4.3.4 Alkalische Phosphatase

Eine Stunde nach der Lebertransplantation lag der Serumwert der alkalischen Phosphatase bei

allen drei Gruppen in einem ähnlichen Bereich. Der niedrigste Wert konnte bei der Gruppe

III gemessen werden und lag bei 113,57±9,47 U/l. In der Gruppe II betrug die gemessene

Serumaktivität 126,29±9,90 U/l, in der Gruppe I 120,29±12,90 U/l. Während die

Serumaktivität der alkalischen Phosphatase nach 24 Stunden in der Gruppe III nahezu

konstant blieb und eine Aktivität von 111,43±13,18 U/l aufwies, fiel sie in der Gruppe II auf

94,86±9,07 U/l und in der Gruppe I auf 88,0±19,65 U/l. Bis zur Stunde 48 nach der

Operation war die Serumaktivität in allen drei Gruppen erneut angestiegen. Dabei zeigte sich

ein starker Anstieg in der Gruppe I auf 142,86±13,69 U/l. Die Gruppe II zeigte bis zur 48.

postoperativen Stunde den geringsten Anstieg der Serumaktivität der alkalischen Phosphatase

auf 108,57±16,52 U/l. In der Gruppe III stieg der Wert auf 145,14±12,03 U/l.

Ein signifikanter Unterschied (p<0,05) war zwischen den Gruppen I und II , sowie zwischen

den Gruppen II und III 48 Stunden nach der Transplantation nachweisbar (Abb. 19).

59

alkalische Phosphatase im Verlauf

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1 24 48

Stunden nach Lebertransplantation

U/l

Gruppe 1

Gruppe 2

Gruppe 3

Abbildung 19: Serumaktivität der alkalischen Phosphatase

Signifikanzen nach 48 Stunden: zwischen Gruppe I und Gruppe II: p=0,037; zwischen

Gruppe II und Gruppe III: p=0,027

60

4.3.5 GLDH

Der Anstieg der GLDH-Aktivität war in allen drei Gruppen während der ersten 24 Stunden

nach der Transplantation sehr groß. So stieg die Aktivität in der Gruppe I von 138,89±52,55

U/l auf 975,71±426,84. In der Gruppe II war der stärkste Anstieg der Aktivität zu

verzeichnen. Diese stieg während der ersten 24 Stunden nach der Operation von

180,97±63,51 U/l auf 1500,57±323,75 U/l. Die Aktivität in der Gruppe III stieg während der

ersten 24 Stunden von 237,63±103,84 U/l auf 610,0±211,47 U/l. 48 Stunden nach der

Lebertransplantation war die GLDH-Aktivität in allen drei Gruppen wieder abgesunken. Die

stärkste Abnahme der Aktivität wurde in der Gruppe III gefunden. Die Aktivität sank hier

auf 267,81±66,51 U/l. In der Gruppe I wurde 48 Stunden post operationem noch eine

Aktivität von 489,0±145,96 U/l gefunden, in der Gruppe II noch 921,97±178,19 U/l.

Signifikant niedriger (p<0,05) waren hier die Mittelwerte der Gruppe III im Vergleich zu

denen der Gruppe II nach 24 Stunden. Nach 48 Stunden waren sowohl die Aktivitäten der

Gruppen I und III niedriger als die der Gruppe II (Abb. 20).

61

GLDH im Verlauf

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

1 24 48

Stunden nach Lebertransplantation

U/l

Gruppe 1

Gruppe 2

Gruppe 3

Abbildung 20: Serum GLDH Aktivität

Signifikanzen nach 24 Stunden: zwischen Gruppe II und Gruppe III: p=0,002

Signifikanzen nach 48 Stunden: zwischen Gruppe I und Gruppe II: p=0,009; zwischen

Gruppe II und Gruppe III: p<0,001

62

4.4 Auswertung der Histologie

4.4.1 Nekrosetypen

In der vorliegenden Arbeit wurde zwischen vier verschiedenen Arten von Nekrosen

unterschieden:

• Keine Nekrosen

• Einzelzellnekrosen

• Isolierte Nekrosen

• Konfluierende Nekrosen.

Tabelle 2 gibt die Verteilung der verschiedenen Nekrosearten pro Gruppe wieder.

Versuchstier Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

1 3 1 2

2 3 3 2

3 3 3 0

4 3 3 0

5 2 3 3

6 3 2 0

7 3 0 2

Tabelle 2: Verteilung der Nekrosearten pro Gruppe

0= keine Nekrose

1= Einzelzellnekrose

2= Isolierte Nekrose

3= Konfluierende Nekrose

63

Eine Prozentuale Verteilung der einzelnen Nekrosetypen pro Gruppe ist in Tabelle 3

dargestellt.

Nekroseart Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

keine 0% 14,30% 42,90%

Einzelzelln. 0% 14,30% 0%

isoliert 14,30% 14,30% 42,90%

konfluierend 85,70% 57,10% 14,30%

Tabelle 3: Nekrosetypen pro Gesichtsfeld in Prozent

In einem statistischen Vergleich, welcher eine Verteilung der Nekrosen in Bezug auf deren

Ausdehnung zwischen den einzelnen Gruppen untersucht, ergibt sich ein signifikanter

Unterschied zwischen der Gruppe I und der Gruppe III . Der hierfür ermittelte p-Wert

beträgt p=0,029. Der Vergleich zwischen den Gruppen II und III (p=0,184) und den

Gruppen I und II (p=0,706) ergab keine Signifikanz.

4.4.2 Perivaskuläres Ödem

Das Vorkommen eines perivaskulären Ödems wird in Tabelle 4 aufgezeigt.

Versuchstier Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

1 1 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 1 0

5 1 1 0

6 1 0 0

7 0 0 0

Tabelle 4: Verteilung des perivaskulären Ödems pro Gruppe

0= kein Ödem

1= Ödem

64

Die Auszählung zeigt hier das Vorkommen eines Ödems in der Gruppe I bei 3 Tieren

(42,9%), in Gruppe II bei 2 Tieren (28,6%) und in der Gruppe III bei keinem der

Versuchstiere (0%). Jedoch kann hier aufgrund der geringen Fallzahl kein signifikanter

Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden.

4.4.3 Anzahl der Nekroseherde

Die Anzahl der Nekroseherde im hepatischen Gewebe wurde pro Gesichtsfeld ausgezählt.

Hierbei zeigte sich eine signifikant geringere Anzahl in der Gruppe III gegenüber den

Gruppen I und II . Die genaue Verteilung der Nekrosen ist in Tabelle 5 dargestellt.

Versuchstier Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

1 13 2 3

2 5 11 1

3 29 13 0

4 3 14 0

5 2 11 6

6 9 12 0

7 20 0 1

Tabelle 5: Anzahl der Nekroseherde pro Gesichtsfeld

Im Mittel ergibt sich in der Gruppe I eine Anzahl von Nekroseherden von 11,57±4,97, in der

Gruppe II eine Anzahl von 9,0±2,8 und in der Gruppe III eine Anzahl von 1,57±1,1.

Signifikanzen ergeben sich zwischen der Gruppe I und der Gruppe III (p=0,007), sowie

zwischen der Gruppe II und der Gruppe III (p=0,026) (Abb. 21).

65

Anzahl der Nekroseherde

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3

Gruppe

Anz

ahl 1

2

3

Abbildung 21: Anzahl der nekrotischen Herde pro Gesichtsfeld

Signifikanzen zwischen Gruppe I und Gruppe III: p=0,007 und zwischen Gruppe II und

Gruppe III: p= 0,026.

66

4.4.4 Minimale Größe der Nekroseherde

Die durchschnittliche Mindestgröße der im Lebergewebe vorkommenden nekrotischen Herde

erbrachte keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. Im Einzelnen

gibt Tabelle 6 Auskunft über die Verteilung in den einzelnen Gruppen.

Versuchstier Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

1 0,3 0 0,1

2 0,7 0,1 0,1

3 0,1 0,3 0

4 0,05 0,2 0

5 0,05 0,1 0,02

6 0,05 0,05 0

7 0,05 0 0,02

Tabelle 6: Durchschnittliche, minimale Größe der Nekroseherde in mm

Durchschnittlich betrug die minimale Größe der nekrotischen Herde in Gruppe I 0,19±0,12

mm, in der Gruppe II 0,11±0,05 mm und in der Gruppe III 0,03±0,02 mm (Abb. 22).

67

min. Größe der Nekrosen

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

1 2 3

Gruppe

mm

1

2

3

Abbildung 22: Durchschnittliche Mindestgröße der nekrotischen Herde

Keine Signifikanzen nachweisbar

68

4.4.5 Maximale Größe der Nekroseherde

Als wesentlicher Bestandteil der histologischen Auswertung wurde die durchschnittliche

Maximalgröße der Nekroseherde bestimmt. Hierbei ergab sich der geringste Wert für die

Gruppe III (Tabelle 7).

Versuchstier Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

1 4 0 1

2 4 1 0

3 4 3 0

4 2 1,8 0

5 1 9 1,5

6 2 2 0

7 4 0 0

Tabelle 7: Durchschnittliche, maximale Größe der Nekroseherde in mm

Der durchschnittliche Wert für die maximale Größe der Nekroseherde betrug für die Gruppe

I 3±0,65 mm, für die Gruppe II 2,4±1,55 mm und für die Gruppe III 0,36±0,31 mm.

Signifikant war hier der Unterschied zwischen der Gruppe I und der Gruppe III (p=0,001).

Zwischen der Gruppe II und der Gruppe III war eine Signifikanztendenz erkennbar

(p=0,073).

69

max. Größe der Nekrosen

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 2 3

Gruppe

mm

1

2

3

Abbildung23: Durchschnittliche Maximalgröße der nekrotischen Herde

Signifikanter Unterschied zwischen Gruppe I und Gruppe III feststellbar (p=0,001).

70

4.4.6 Zonenaufteilung der Nekrosen

Weiterhin wurde in der histologischen Auswertung des Transplantatlebergewebes die

Verteilung der Nekrosen zwischen den verschiedenen Zonen eines Leberazinus nach

Rappaport untersucht (Tabelle 8)

Versuchstier Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3

1 1,2,3 3 3

2 1,2,3 2,3 3

3 1,2,3 1,2,3 0

4 1,2,3 1,2,3 0

5 2,3 1,2,3 2,3

6 1,2,3 2,3 0

7 2,3 0 3

Tabelle 8: Vorkommen von Nekrosen in den einzelnen Zonen der Leberazini

Im Einzelnen zeigt sich hier für die Zone 1 eine Nekrosehäufigkeit für die Gruppe I von

71,4%, für die Gruppe II von 42,9 % und für die Gruppe III von 0%. Eine Signifikanz

ergibt sich zwischen der Gruppe I und der Gruppe III (p=0,021).

In der Zone II zeigte sich eine Nekrosehäufigkeit von 100% in der Gruppe I, 71,4% in der

Gruppe II und 14,3% in der Gruppe III . Signifikant war hier der Unterschied zwischen der

Gruppe I und der Gruppe III (p=0,005).

In Zone III konnten in allen Gruppen die größte Häufigkeit eines Nekrosevorkommens

festgestellt werden. In Gruppe I kam mit einer Häufigkeit von 100% zu einer Nekrose. In

Gruppe II betrug die Häufigkeit 85,7% und in Gruppe III noch 57,1%. Signifikante

Unterschiede zwischen den Gruppen ließen sich hier nicht feststellen.

71

Abbildung 24: Veranschaulichung der Nekroseverteilung zwischen den Gruppen

A=Gruppe I, B=Gruppe II und C=Gruppe III

72

5 Diskussion

5.1 Problematik des Ischämie-/Reperfusionsschadens bei der

Lebertransplantation

Eine der folgenschwersten Komplikationen nach einer Lebertransplantation stellt das primäre

Organversagen dar. Nach einer erfolgreichen Lebertransplantation kommt es mit einer

Wahrscheinlichkeit von 4,2-8,4% zu einem primären Organversagen, was für den Patienten

eine absolut lebensgefährliche Situation darstellt, welche lediglich mit einer Re-

Transplantation zu beheben ist (11,80,94,95).

Eine der Hauptursachen für das Versagen einer Leber kurz nach der Transplantation ist der

Ischämie-/Reperfusionsschaden. Dieser wiederum ist in seiner Ausprägung von

verschiedensten Faktoren wie Dauer der Ischämiezeit, Grad der Leberverfettung und Art der

Reperfusion abhängig.

Hauptsächlich sind freie Sauerstoffradikale für die Entstehung eines Ischämie-

/Reperfusionsschadens und den daraus folgenden, teilweise erheblichen Leberschaden

verantwortlich. Freie Sauerstoffradikale werden nach kalter Ischämie, gefolgt von

Reperfusion hauptsächlich von Kuppferzellen, aber auch von Leukozyten und Hepatozyten

freigesetzt (51,52,53).

Es wurden in den letzten 20 Jahren zahlreiche Studien mit dem Ziel durchgeführt, den

Ischämie-/Reperfusionsschaden nach Lebertransplantation zu verringern. Dabei wurden

verschiedene Strategien verfolgt. Im Einzelnen handelt es sich dabei, wie im allgemeinen Teil

ausführlich besprochen, um pharmakologische, gentechnologische und chirurgische

Strategien.

Besonders kontrovers diskutiert wird nach wie vor, welche Sequenz der Reperfusion den

geringsten Ischämie-/Reperfusionsschaden nach sich zieht. Dabei unterscheidet man zwischen

initialer portaler Reperfusion, initialer arterieller Reperfusion und synchroner Reperfusion.

Während die initiale Reperfusion über die V. portae direkt nach Fertigstellung der

Gefäßanastomose über einen langen Zeitraum als Goldstandard in der Lebertransplantation

gesehen wurde, da dadurch die warme Ischämiezeit des Organs so kurz wie möglich gehalten

wird, sind heute auch alternative Reperfusionsarten in der Praxis gebräuchlich. So konnten

73

z.B. P.C.B. Massarollo, S. Mies und S. Raia einen protektiven Effekt der simultanen

arteriellen und portal-venösen Reperfusion auf das Gallengangssystem, im Vergleich zur

initialen portalen Reperfusion, feststellen (74). Diese Ergebnisse wurden von der

Arbeitsgruppe um Brockmann JG untermauert, welche einen klaren Vorteil in der

Organfunktion simultan reperfundierter Lebern nach Lebertransplantation aufzeigte (13).

Auch war in den Ergebnissen dieser Arbeitsgruppe der größte Leberschaden, hervorgerufen

durch Ischämie und Reperfusion bei initial arteriell reperfundierten Lebern zu finden. Diese

Ergebnisse stehen in Kontrast zu den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um van As AB, welche

einen geringeren Leberschaden nach initial arterieller Reperfusion zeigte, verglichen mit

initial portaler Reperfusion (128). Eine weitere Arbeitsgruppe, welche von Polak WG geleitet

wurde, konnte weder einen signifikanten Vorteil für die primär portale Reperfusion, noch für

die simultane Reperfusion feststellen (93).

Neben den oben genannten Möglichkeiten der Reperfusion wurde in den letzten Jahren eine

neue Reperfusionsvariante publiziert, die sich von den bisher genannten durch die initiale

Flussrichtung des Blutes durch die Leber unterscheidet. Dabei wird der Blutstrom durch die

Leber schon nach Fertigstellung der Anastomose zwischen V. cava inferior und Lebervenen

bei der Piggy-Back-Technik freigegeben, was zu einer langsamen, retrograden Reperfusion

der Leber mit cavalem Blut führt (65). In mehreren retrospektiven klinischen Studien konnte

ein Vorteil dieser Reperfusionstechnik gegenüber der klassischen initial portalen Reperfusion,

sowie gegenüber der simultanen Reperfusion gezeigt werden (29,48).

Es existiert also eine Vielfalt von Studien zu den unterschiedlichen Arten der Reperfusion,

welche die unterschiedlichsten Ergebnisse aufweisen. Weiterhin existiert allerdings keine

tierexperimentelle Studie, welche unter standardisierten Rahmenbedingungen die retrograde

Reperfusion mit anderen Arten der Reperfusion vergleicht.

Daher war das Ziel dieser tierexperimentellen Studie den vermeintlichen Vorteil der

retrograden Reperfusion nach orthotoper Lebertransplantation unter standardisierten

Bedingungen zu evaluieren.

74

5.2 Die Ratte als Versuchstier

Bei der Entstehung des Ischämie-/Reperfusionsschadens spielen eine große Anzahl

verschiedenster Faktoren eine entscheidende Rolle. Bei der humanen Lebertransplantation

sind diese Faktoren nur schwer beeinflussbar. So spielen z.B. das Alter von Spender und

Empfänger, die Zeit, die ein Spender auf der Intensivstation verbracht hat und die Medikation,

die dieser bekommen hat eine entscheidende Rolle für das Ergebnis einer

Lebertransplantation. Auch ist die Lebensführung, die ein Spender hatte wesentlich an der

Qualität seiner Organe beteiligt. Im Gegensatz zur klinischen Situation können die

Versuchsbedingungen im Tiermodell konstant gehalten werden, so dass der Fokus auf einen

bestimmten Parameter, in diese Arbeit ist es der Ischämie-/Reperfusionsschaden, konzentriert

werden kann.

Die Entscheidung für die Ratte als Versuchsobjekt wurde in dieser Studie aus mehreren

Gründen getroffen. Zum einen stellt die Unterbringung auch einer großen Anzahl von Ratten

kein wesentliches Problem dar und die Pflege dieser Tiere ist unkompliziert. Ein weiterer

wichtiger Vorteil der Ratte ist die ständige Verfügbarkeit großer Mengen von Tieren mit

demselben Alter und Gewicht. Auch ist die Ratte wesentlich preisgünstiger als andere

Versuchstiere wie z.B. Schweine oder Hunde.

Für die experimentelle Chirurgie eignen sich Ratten ausgezeichnet aufgrund ihrer, auch für

aufwendige Operationen, ausreichenden Größe. Während einer tierexperimentellen Operation

ist die Wahrung von Sterilität, wie es während einer Operation im klinischen Alltag Standard

ist, nur sehr schwer möglich. Aus dieser Problematik ergibt sich ein erneuter Vorteil der Ratte

als Versuchstier, da für das Überleben des Tieres Sterilität nicht zwingend notwendig ist.

Auch sind Ratten gegenüber einem hohen Blutverlust sehr resistent. Aufgrund der geringen

Größe der Rattenleber wird diese während der Perfusion in der Spenderoperation schnell

abgekühlt, so dass keine langen Zeiten warmer Ischämie entstehen.

Für diese Studie war weiterhin die Existenz von Inzuchtstämmen mit genau bekannten

Gewebsantigenen bei der Ratte ein wesentliches Kriterium für die Entscheidung für dieses

Versuchstier. Bei der Ratte existieren ein MHC (=RT1)-System, sowie mehrere nicht-MHC

Systeme. Das RT1-System beinhaltet drei verschiedene Subloci, A, B und C. Der Sublocus A

codiert für Klasse I-Antigene, welche auf allen Körperzellen der Ratte gefunden werden

können. Der Sublocus B kodiert für Klasse II-Antigene, die vor allen Dingen auf B-

Lymphozyten und Makrophagen exprimiert sind. Der Sublocus C kodiert für Klasse I-

75

Antigen ähnliche Genprodukte, die nur auf Lymphozyten gefunden werden. Auf die nicht-

MHC-Systeme soll hier nicht weiter eingegangen werden.

Bei der genetischen Identität von Spender und Empfänger, wie es bei der Verwendung der

LEWIS-Ratte als Versuchstier der Fall ist, spricht man von einer syngenen Kombination.

Alloreaktionen gegen Transplantationsantigene treten hier nicht auf. Somit ist es möglich,

nach erfolgter Lebertransplantation isoliert den Ischämie-/Reperfusionsschaden zu beurteilen

(67).

5.3 Vergleich verschiedener Lebertransplantationsmodelle

Wie bereits im Allgemeinen Teil beschrieben, existiert eine Vielzahl von

Lebertransplantationsmodellen in der Ratte. Das ursprüngliche Modell, welches Lee im Jahre

1973 publizierte, orientierte sich weitgehend an der Anatomie der Ratte und hatte die exakte

Rekonstruktion selbiger zum Ziel (67). Weitere Modelle zur Transplantation, wie z.B. das von

Kamada und Calne 1979 veröffentlichte, verzichtete auf die Arterialisierung sowie auf eine

weitgehend physiologische Gefäßanastomosierung zu Gunsten einer Vereinfachung der

Methode (57). Trotz der fehlenden Leberarterie überlebten 95,3 % der Tiere.

Dennoch wurde für die, dieser Arbeit zugrunde liegenden Studie ein arterialisiertes

Lebertransplantationsmodell gewählt, da neuere Veröffentlichungen zeigen konnten, dass die

Arterialisierung der Leber für deren einwandfreie Funktion von großer Wichtigkeit ist (37).

Das arterielle Blut aus der Leberarterie hat Einfluss auf die:

• Sauerstoffversorgung ( 96)

• Mikrozirkulation (96)

• Abstoßungsreaktion ( 41)

• initiale Transplantatfunktion (96)

• Transplantatmorphologie (34)

• Komplikationen der Gallengänge (50)

• Überlebensrate (40)

Bisher wurde eine Vielzahl von Techniken zur Fertigung der Anastomose der Leberarterie

publiziert. Im Einzelnen handelt es sich hierbei um die mikrochirurgische Naht (67), die Cuff-

Technik (57), die Teleskop-Technik (59) und die Splint-Technik (138). In der Vorliegenden

76

Studie wurde die Splint-Technik zur Arterialisierung der Leber verwendet, da eine sehr

schnelle Durchführbarkeit dieses Operationsschrittes von enormer Wichtigkeit für die

Vergleichbarkeit der drei Gruppen war. So betrug die Zeit zur Fertigstellung der arteriellen

Anastomose, welche nach den Anastomosen von suprahepatischer V. cava und V. portae

durchgeführt wurde lediglich 25-30 Sekunden.

Für die Durchführung der Anastomosen von infra- und suprahepatischer V. cava und V.

portae stehen zwei Methoden zur Auswahl: die Cuff-Technik und die mikrochirurgische Naht.

Beide Methoden haben spezifische Vor- und Nachteile. Der größte Vorteil der Cuff-Technik

ist ohne Zweifel der Zeitgewinn, welchen man durch diese Technik erzielt. Als N. Kamada

1979 die Cuff-Technik einführte, konnte er die anhepatische Phase auf 15-17 Minuten

verkürzen (58). Die Anastomose der suprahepatischen V. cava in Cuff-Technik, wie sie von

M. Miyata publiziert wurde, konnte sich auf Dauer nicht durchsetzen (77). Es konnte sogar

gezeigt werden, dass dieser Cuff zu Leberabflussstörungen und somit zum Leberschaden und

zum frühen Tod der Empfängerratte führt (117). Werden V. portae und infrahepatische V.

cava mit einem Cuff anastomosiert, kann es dabei zu einer Fremdkörperreaktion und damit zu

einer Bindegewebsbildung kommen. Zweitere führt ihrerseits zu einer Stenosierung der

Anastomose, was zu einer portalen Hypertension und einer Bildung von Kollateralvenen führt

(62).

Eine Stenosierung durch eine Fremdkörperreaktion ist bei der mikrochirurgischen Naht der

Anastomosen nicht zu befürchten. Allerdings kann es hier zu einer mechanischen Stenose

durch zu starken Zug am Faden kommen. Dieses zu vermeiden, sowie die Durchführung der

Anastomosen von suprahepatischer V. cava und der V. portae unter der kritischen Grenze von

25 Minuten erfordert viel Übung des Operateurs. Da in der humanen Lebertransplantation

eine Anastomosierung nur mittels Naht durchgeführt wird, ist die Technik der

mikrochirurgischen Naht an der Ratte realitätsnäher.

Aufgrund der Realitätsnähe der mikrochirurgischen Gefäßnaht und dem Zeitvorteil, den die

arterielle Rekonstruktion mittels Splint-Technik gegenüber anderen arteriellen

Rekonstruktionsmöglichkeiten bietet, entschlossen wir uns, für diese Studie eine orthotope

Rattenlebertransplantation mit mikrochirurgischen venösen Gefäßanastomosen und

arteriellen, sowie biliären Splint-Anastomosen durchzuführen.

Die Zeitspanne zwischen der Explantation der Eigenleber beim Empfängertier und der

Reperfusion war durch die verwendete Technik in allen drei Gruppen identisch. Dies

ermöglichte einen direkten Vergleich der drei Gruppen und insbesondere einen direkten

Vergleich von antegrader Reperfusion mit der retrograden Reperfusion.

77

5.4 Intra- und postoperative Komplikationen

5.4.1 Komplikationen hervorgerufen durch die Narkose

Die Isofluran-Anästhesie stellt eine sehr komplikationsarme Form der Narkose dar. Für die

Langzeitanästhesie bei der Ratte ist sie aus mehreren Gründen ein sehr attraktives Modell. So

ist die Isofluran-Narkose aufgrund des günstigen Blut-Gas-Verteilungskoeffizienten von

Isofluran (λ=1,4) sehr gut steuerbar. Auch wirkt Isofluran bronchodilatatorisch, was eine gute

Oxigenierung des Organismus der Ratte unterstützt. Entscheidendes Kriterium für die

Narkose mit Isofluran in dieser Studie war die fehlende Hepatotoxizität von Isofluran

gegenüber anderen Anästhetika.

Allerdings birgt die Verwendung von Isofluran als Anästhetikum die Gefahr der Atem- und

Kreislaufdepression. Nicht selten kann es so zu einer gefährlichen Hypoxämie, gefolgt von

Atemstillstand kommen. Auch bewirkt Isofluran eine Myokarddepression, was hauptsächlich

in der, für das Herz der Ratte extrem belastenden anhepatischen Phase von Belang ist

(60,100).

5.4.2 Komplikationen bei der Präparation des Spenders

Gleich zu Beginn der Spenderoperation wurde die linke V. phrenica dargestellt und von der

V.cava aus wenige Millimeter in ihrem Verlauf zirkulär freipräpariert. Dabei kann es zu einer

Ruptur des Gefäßes kommen, was zu einer schwer beherrschbaren Blutung führt. Nach

Auftreten dieser Komplikation ist eine erfolgreiche Leberexplantation nach unseren

Erfahrungen in der Regel nicht mehr möglich.

Nach der Präparation des Gallengangs wurde dieser leberfern inzidiert und mit einem Splint

versorgt. Dabei besteht die Gefahr, den Splint zu weit in den Gallengang vorzuschieben und

somit die Gallendrainage eines oder mehrerer Leberlappen zu Verlegen. Außerdem besteht

die Gefahr, den Gallengang in seiner gesamten Länge zu inzidieren, wenn der Splint an

seinem Ende kleinste Stufen, hervorgerufen durch unsaubere Anfertigung, aufweist.

Während der Perfusion kann es dazu kommen, dass ein oder mehrere Leberlappen nicht, oder

nur unzureichend perfundiert werden. Der Grund dafür liegt meistens in einer Torsion dieser

Leberlappen. Besteht diese Torsion bereits über einen längeren Zeitraum, ist eine vollständige

Perfusion dieses Leberlappens nicht mehr möglich, weswegen eine derart geschädigte Leber

nicht mehr für die experimentelle Transplantation infrage kommt.

78

5.4.3 Komplikationen bei der Lebertransplantation

Die Komplikationen bei der Präparation des Empfängers waren weitgehend dieselben wie die

bei der Spenderoperation.

Weitere Komplikationen können während der Durchführung der Gefäßanastomosen in

mikrochirurgischer Nahttechnik entstehen. Zum einen kommt es bei nicht exakt orthotoper

Platzierung des Spenderorgans im Empfängersitus zu großen Zugkräften an bereits vernähten

Gefäßbezirken, was an diesen Stellen zum Einreißen dieser Bezirke führen kann. Auch ist

eine Gefäßanastomose, die in fortlaufender Nahttechnik durchgeführt wurde derart gefährdet,

dass durch zu starken Zug am freien Fadenende eine Stenosierung des Gefäßes auftritt. Eine

Stenosierung kann weiterhin durch einen Gefäßspassmus hervorgerufen werden. Dieser ist

allerdings in den meisten Fällen früh reversibel. Teilweise kommt es nach der Eröffnung eines

anastomosierten Gefäßes zur Entstehung einer Thrombose im Anastomosenbereich. Dieses

kann allerdings durch Spülen der Anastomose mit einer heparinisierten NaCl-Lösung vor dem

Setzen des letzten Stiches der Naht und der Eröffnung des Gefäßes vermieden werden. Dieses

Spülen der Anastomose sollte auch deswegen durchgeführt werden, da es sonst leicht zu einer

Luftembolie durch im Lumen verbleibende Luft kommen kann. Wie bereits oben erwähnt, ist

die Zeit, in der die Anastomosen angefertigt werden begrenzt. Die anhepatische Phase wird

von der Ratte nicht länger als 25 Minuten toleriert (33). Dies liegt daran, dass einerseits das

Herzminutenvolumen der Empfängerratte in der anhepatischen Phase durch den Verschluss

der V. portae und der V. cava inferior massiv absinkt und andererseits durch den Blutstau im

Splanchnikusgebiet und in den Nierenvenen ein Schock hervorgerufen wird, den das Tier

nach unseren Erfahrungen nicht länger als 25 Minuten überlebt. Nach Anfertigung der

Gefäßanastomosen und deren Wiedereröffnung kann es zu Blutungen aus diesen Bereichen

kommen. Eine solche Blutung kann oftmals durch leichte Kompression gestillt werden. Ist

dies nicht der Fall, kann versucht werden, den lecken Bereich zu übernähen. Allerdings ist

dieses nur in seltenen Fällen ohne erheblichen Blutverlust möglich.

Eine besondere Komplikation kann beim Abklemmen der suprahepatischen V. cava durch die

Satinski-Klemme entstehen. Diese kann durch Reizung des N. phrenicus einen Atemstillstand

hervorrufen. Dieser ist nach unseren Erfahrungen allerdings wieder reversibel, verringert man

den Druck auf den Nerven, indem man die Klemme ein wenig löst.

In dieser Studie wurde für die Anastomosierung der Gallengänge von Spender und Empfänger

die 1979 von Zimmermann eingeführte Splint-Technik verwendet (138). Diese Methode ist

praktikabel und arm an Komplikationen. Außer der fehlenden Drainage einzelner Leberlappen

79

bei zu weitem Hineinschieben des Splints in den Spender ist für einen Zeitraum von mehreren

Wochen nicht mit sonstigen Komplikationen zu rechnen.

5.5 Aussagekraft der Laborwerte

Das Organ, dessen Schaden im Rahmen dieser Studie untersucht worden ist, ist die Leber. Die

gängigen Parameter, um einen Leberschaden über Serumwerte abschätzen zu können sind

besonders die GOT und GPT, sowie alkalische Phosphatase, Bilirubin und die GLDH. Diese

Laborwerte stellen einen Standard in der Abschätzung eines Leberschadens dar (21,89).

Die GOT stellt dabei ein Enzym dar, welches hauptsächlich in der Leber vorkommt und dort

die größte Konzentration in den Mitochondrien aufweist. Allerdings kommt sie auch in

größeren Konzentrationen in Herz und Skelettmuskel vor.

Die GPT hingegen ist überwiegend in der Leber lokalisiert und zeigt ihre größten

Konzentrationen im Cytoplasma der Hepatozyten. Daraus folgt, dass bereits ein geringer

Leberschaden zu einer Erhöhung der GPT führen kann, während die GOT noch im

Normbereich steht.

Die Bestimmung der alkalische Phosphatase wird hauptsächlich für die Diagnostik von

Knochenerkrankungen durchgeführt. Allerdings ist die alkalische Phosphatase auch ein

aussagekräftiger Cholestaseparameter und ist bei 60% der hepatobiliären Erkrankungen

erhöht. Aus diesem Grund sollte sie nicht bei einer kompletten Leberdiagnostik fehlen.

Bilirubin ist ein Produkt aus dem körpereigenen Abbau von Hämoglobin. Es fällt im Körper

primär als wasserunlösliches, „indirektes“ Bilirubin an, welches an Albumin gebunden zur

Leber transportiert wird. Dort geschieht die Glukuronideirung zu wasserlöslichem, „direktem“

Bilirubin. Liegt ein erhöhter Gesamtbilirubinwert im Serum vor und kann ein prähepatischer

Ikterus, sowie ein Verschluss der posthepatischen Gallenwege ausgeschlossen werden, spricht

der erhöhte Wert für das Vorliegen einer Leberfunktionsstörung. Für die Entstehung eines

prähepatischen Ikterus gab es im Kollektiv der Versuchstiere in dieser Studie keinen Anhalt.

Ein Verschluss der posthepatischen Gallenwege wurde bei der Sektion des Tieres 48 h nach

der Operation anhand des makroskopischen Aspektes der Leber und des Gallengangssplintes

ausgeschlossen.

Die höchste Aktivität der GLDH findet sich überwiegend in den Mitochondrien von

Hepatozyten und hier hauptsächlich in zentroazinären Zellen. Daraus folgt, dass hohe GLDH

Werte mit einer tiefgreifenden Zerstörung von Leberzellen einhergehen.

80

5.6 Interpretation der Ergebnisse

Der Ischämie-/Reperfusionsschaden stellt ein bereits seit langem bekanntes Phänomen dar,

welches sowohl bei der Transplantation solider Organe als auch im Rahmen von

Organischämien, wie sie z.B. bei Operationen vorkommen, beobachtet wird. Über eine Reihe

von zellulären und extrazellulären Mechanismen führt der Ischämie-/Reperfusionsschaden zu

einer Schädigung des betroffenen Organs.

In der vorliegenden Studie wurden LEWIS Ratten als Versuchstiere verwendet. Durch die

Syngenität dieser Tiere ist davon auszugehen, dass sich der Schaden, den eine

Transplantatleber im Laufe der Transplantation nimmt, sich lediglich in der Ausprägung des

Ischämie-/Reperfusionsschadens von dem Schaden anderer Transplantatlebern unterscheidet,

da alle für das Organ schädigenden Faktoren zwischen den unterschiedlichen Gruppen

identisch waren. Schädigende Faktoren waren z.B. die kalte Ischämiezeit, die langsame

Wiedererwärmungszeit während der Transplantation und die Manipulationen an der

Spenderleber im laufe von Explantation und Transplantation.

Die Ausprägung des Leberschadens und somit die Ausprägung des Ischämie-

/Reperfusionsschadens wurde hier anhand der oben genannten Laborparameter 1, 24 und 48

Stunden nach der Operation und anhand der 48 Stunden nach der Operation gewonnenen

Histologie bestimmt. Dabei zeigte sich bei allen drei Gruppen eine Stunde nach der Operation

ein erheblicher Leberschaden. Dieser wurde besonders anhand der Transaminasen sichtbar,

welche sich eine Stunde nach der Transplantation in einem Maximum befanden. Lediglich in

der Gruppe II stieg die GOT bis zur 24. Stunde nach der Lebertransplantation an, was für

einen tiefgreifenden Leberzellschaden in dieser Gruppe spricht. Allerdings kann die GOT

aufgrund ihres Vorkommens in anderen Organen, wie z.B. Herz, Skelettmuskel und Gehirn

durchaus nicht als leberspezifisch angesehen werden. Somit kann ein alleiniger Anstieg der

GOT, ohne gleichzeitigen Anstieg, oder sogar Abfall der GPT auch ein Zeichen für eine

andersartig bedingte Pathologie sein, wie z.B. einen Schaden größerer Muskulaturanteile nach

einer Operation.

Die GLDH war in allen drei Gruppen eine Stunde nach der Transplantation auf ihrem

Tiefststand und erreichte erst innerhalb der ersten 24 Stunden ihre maximalen Werte. Dies

spricht offensichtlich am ehesten dafür, dass sich ein Leberzellschaden nicht nur in der Zeit

der kalten Ischämie, sondern viel mehr auch im weiteren Verlauf nach Lebertransplantation

als Folge der Reperfusion und der daraus resultierenden schädigenden Mechanismen

entwickelte. Während die Transaminasen, bis auf die GOT in Gruppe II schon 24 Stunden

81

nach der Lebertransplantation abgefallen waren und bis zur 48. Stunde weiter abfielen,

begann sich die Serumaktivität der GLDH erst nach 24 Stunden zu verringern. Dies kann

durchaus als Zeichen dafür interpretiert werden, dass nach ca. 24 Stunden die „akute Phase“

des Ischämie-/Reperfusionsschadens vorüber ist, zumal sich die Transaminasen zwischen der

24. und 48. Stunde rapide verbesserten. Ein ähnlicher Verlauf von Transaminasen und GLDH

konnte auch von der Arbeitsgruppe um Heidenhain C in einer klinischen Studie zur

retrograden Reperfusion festgestellt werden (48). Der günstige Verlauf der Transaminasen

konnte weiterhin auch von der Gruppe um Tscheliessnigg K.-H. nachgewiesen werden. Auch

konnte diese Gruppe einen direkten Vorteil der retrograden Reperfusion gegenüber der

Kontrollgruppe, welche initial portal reperfundiert wurde, in Bezug auf die Syntheseleistung

der Leber anhand von Prothrombinzeit und Antithrombin III feststellen (64).

Im Gegensatz zu diesen erfreulichen Ergebnissen steht das erhöhte Auftreten von

Komplikationen der Gallenwege nach retrograder Reperfusion in einer klinischen Studie (48).

Um den Leberzellschaden, der nach einer Lebertransplantation auftritt zu objektivieren,

wurde in dieser Studie das Gewebe der transplantierten Lebern, welche 48 Stunden nach der

Transplantation entnommen wurden, histologisch untersucht. Besonderes Augenmerk wurde

in der histologischen Begutachtung auf den Nekrosenachweis gesetzt. Die Entstehung einer

Nekrose durch den Ischämie-/Reperfusionsschaden kann auf unterschiedliche Weise

geschehen. So kommt es durch den Ischämie-/Reperfusionsschaden zu einer Schädigung des

Gefäßendothels, was zu Mikrozirkulationsstörungen und somit zu einer Gewebehypoxie führt

(16,76). Ein weiterer Entstehungsmechanismus einer Nekrose durch den Ischämie-

/Reperfusionsschaden ist der direkte zytotoxische Effekt von freien Sauerstoffradikalen auf

parenchymatöse Zellen der Leber. Aber auch neutrophile Granulozyten, genauso wie T-

Lymphozyten führen nach Aktivierung und Extravasion zu einem Untergang von Leberzellen.

Vereinfacht kann man davon ausgehen, dass je ausgeprägter der Schaden, hervorgerufen

durch kalte Ischämie ist, sich umso mehr und größere, also ausgeprägtere Nekroseherde

finden.

In der vorliegenden Studie konnten die größten Nekroseformationen in der Gruppe I

gefunden werden und waren sogar signifikant größer als die Nekroseformationen in der

Gruppe III . Zusammen mit der Auszählung der Nekroseherde, welche in er Gruppe III , also

der retrograd reperfundierten Gruppe, verglichen mit den beiden anderen Gruppen eine

signifikant geringere Anzahl zeigte, kann man von einer geringeren Ausprägung des

Ischämie-/Reperfusionsschadens in der Gruppe III ausgehen. Auch wird diese These von der

Tatsache untermauert, dass die maximale Größe der Nekroseherde in Gruppe III signifikant

82

geringer war als in Gruppe I und tendenziell geringer als in der Gruppe II .

Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass in der Versuchsgruppe, in der die

Transplantatlebern initial retrograd reperfundiert wurden die Nekrosen seltener vorkamen und

kleiner waren als in den beiden übrigen Gruppen, die anterograd reperfundiert wurden.

Eine weitere wichtige Frage ist diejenige nach der zonalen Verteilung der Nekrosen. Als

Bezugsformation wurde der Leberazinus nach Rappaport gewählt. Hierbei bilden die

terminalen Arteriolen von Pfortader und Leberarterie eine von Leberzellen umgebene Achse.

Das in den Azinus gelangende Blut aus Vene und Arterie fließt dann von dieser Achse zu den

Vv. centrales, wobei es drei verschiedene Zonen durchfließt. Die Zellen der einzelnen Zonen

haben, wie bereits im Allgemeinen Teil besprochen verschiedene Spezialisierungen in Bezug

auf den Stoffwechsel. Ein weiterer wichtiger Aspekt der Zoneneinteilung nach Rappaport ist

der absteigende Sauerstoff- und Nährstoffgehalt des Blutes entlang der Strecke durch die drei

Zonen. Diese nehmen von der Zone 1 (peripher) bis zur Zone 3 (zentralvenennah)

kontinuierlich ab. Daraus ergibt sich, dass die Zellen der Zone 3 am vulnerabelsten für eine

Hypoxie oder einen Nährstoffmangel sind.

In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass es nach einer Lebertransplantation in

der Ratte bei der Verwendung der retrograden Reperfusion signifikant seltener zu einer

Nekrose in den Zonen 1 und 2 kommt, als nach Lebertransplantation mit initial portaler,

antegrader Reperfusion. Ein essentielles Element des Ischämie-/Reperfusionsschadens ist die

Mikrozirkulationsstörung. Je ausgeprägter ein Ischämie-/Reperfusionsschaden im Gewebe

stattfindet, desto stärker ausgeprägt ist auch die Mikrozirkulationsstörung und desto geringer

das Sauerstoffangebot in den Zonen 1 bis 3, was eine vermehrten Hypoxie in den Leberzellen

in Zentralvenennähe bedeutet. Je größer also der Ischämie-/Reperfusionsschaden, desto weiter

wandert die Gewebshypoxie mit ihrer begleitenden Gewebsnekrose von der Leberazinus-

Zone 3 in Richtung Zone 1. In Zusammenschau mit den hier gewonnenen Ergebnissen kann

von einem geringeren Ischämie-/Reperfusionsschaden nach retrograder Reperfusion

ausgegangen werden.

83

Mit Hilfe der Ergebnisse, welche in dieser Studie gewonnen wurden können folgende

Schlüsse gezogen werden:

• Die Lebertransplantation mit retrograder Reperfusion ist an der Ratte standardisiert

durchführbar.

• Laborchemisch ist der Leberschaden nach einer Rattenlebertransplantation signifikant

geringer, wenn die Technik der retrograden Reperfusion zum Einsatz kommt, als nach

antegrader Reperfusion.

• Achtundvierzig Stunden nach einer Rattenlebertransplantation kann histologisch eine

geringere Ausprägung eines Leberschadens bei retrograd reperfundierten

Transplantatlebern gefunden werden, verglichen mit antegrad reperfundierten

Transplantatlebern.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen unter standardisierten Bedingungen einen deutlichen

Vorteil der retrograden Reperfusion bei der Lebertransplantation verglichen mit der

antegraden Reperfusion in der Ratte. Es erscheint anhand dieser Ergebnisse sinnvoll, die

retrograde Reperfusion auch in der klinischen Lebertransplantation weiter zu evaluieren.

84

6 Zusammenfassung

Die Lebertransplantation ist heute eine Standardtherapie in der Behandlung von

Lebererkrankungen, welche mit einem Organversagen einhergehen. Trotz ihrer Stellung als

Standardverfahren ist die Lebertransplantation noch immer mit einer Reihe von Risiken

behaftet. Eine der schwerwiegendsten Komplikationen der Lebertransplantation ist das

primäre Organversagen. Hierbei kommt es kurze Zeit nach der Transplantation zu einem

Leberausfall, welcher mit einer hohen Mortalität einhergeht.

Einer der Hauptrisikofaktoren für die Entstehung eines primären Organversagens ist der

Ischämie-/Reperfusionsschaden. Dieser ist als ein multifaktorielles Ereignis zu verstehen, bei

dessen Entstehung eine Vielzahl von Faktoren beteiligt sind. Besonders anfällig für einen

Schaden durch Ischämie und darauf folgende Reperfusion sind Lebern mit einem hohen Grad

an Verfettung. Aufgrund der vorherrschenden Organknappheit werden allerdings immer mehr

Fettlebern zur Lebertransplantation angenommen. Dies unterstreicht die klinische Relevanz,

protektive Mechanismen gegen den Ischämie-/Reperfusionsschaden zu entwickeln.

Nach einer erfolgreichen Lebertransplantation ist es für den Empfänger erforderlich, sich

einer lebenslangen immunsupressiven Therapie zu unterziehen, da es in dessen Körper sonst

zu einer Abstoßungsreaktion kommen würde. Diese Therapie ist allerdings mit enormen

Nebenwirkungen verbunden, welche nicht zuletzt in ihrer Ausprägung dosisabhängig sind.

Die Schwere des Ischämie-/Reperfusionsschadens korelliert hier mit der Schwere einer

chronischen Abstoßungsreaktion. Dies unterstreicht erneut dessen klinische Relevanz.

Ein viel versprechender Ansatz zur Minimierung des Ischämie-/Reperfusionsschadens ist die

retrograde Reperfusion der Spenderleber über die infrahepatische V. cava inferior. Eine

Tierexperimentelle Studie zu diesem Thema wurde jedoch bislang nicht durchgeführt.

Ziel der vorliegenden Studie war es also, 1. ein tierexperimentelles Modell mit einer

retrograden Reperfusion bei der Lebertransplantation in der Ratte zu entwickeln, 2. zu

evaluieren, ob laborchemisch ein geringerer Ischämie-/Reperfusionsschaden nach retrograder

Reperfusion, verglichen mit der anterograden Reperfusion nachweisbar ist und 3., ob auch

histomorphologische Unterschiede zwischen anterograder und retrograder Reperfusion

nachgewiesen werden können.

85

Modell:

In der vorliegenden Arbeit wurden drei verschiedene Operationstechniken der

Lebertransplantation anhand dreier verschiedener Versuchsgruppen miteinander im

Rattenmodell verglichen. Die Gruppengröße betrug 7 Tiere. Als Versuchstiere wurden

LEWIS-Ratten verwendet. Diese zeichnen sich dadurch aus, dass durch jahrelange Inzucht

genetisch identische Tiere entstehen. Durch diese genetische Identität kann nach der

Lebertransplantation eine Abstoßungsreaktion weitestgehend vermieden werden.

Für die Gruppe I, sowie die Gruppe II kamen etablierte Rattenlebertransplantationsmodelle

zum Einsatz. Dabei unterschieden sich diese beiden Gruppen lediglich in dem Zeitpunkt der

arteriellen Reperfusion. Während diese in der Gruppe I erst 6 Minuten nach der portalen

Reperfusion stattfand, wurde in der Gruppe II eine synchrone Reperfusion durchgeführt, bei

der Pfortader und A. hepatica gleichzeitig die Reperfusion ausmachten.

Für die Lebertransplantationen der Gruppe III (retrograde Reperfusion via V. cava) musste im

Rahmen dieser Studie ein neues Lebertransplantationsmodell an der Ratte entwickelt werden.

Dabei wurde nach der Fertigstellung der Anastomose der suprahepatischen V. cava inferior

nicht wie in den bisherigen Rattenlebertransplantationsmodellen die Anastomose der

Pfortader gefertigt, sondern vorerst die infrahepatische V. cava inferior anastomosiert. Nun

konnte durch Freigabe des Blutstromes in der infrahepatischen V. cava inferior eine

retrograde Reperfusion stattfinden.

Da der Zeitaufwand für die Anastomosierung der Pfortader oder der infrahepatischen V. cava

inferior etwa derselbe ist, war die Zeitspanne zwischen Leberexplantation und Reperfusion in

allen drei Gruppen nahezu identisch.

Nach 1, 24 und 48 Stunden post transplantationem wurden bei den Versuchstieren

Blutentnahmen durchgeführt und die Serumwerte von GOT, GPT, Bilirubin, alkalischer

Phosphatase und GLDH im Institut für klinische Chemie und Pathobiochemie des Klinikums

rechts der Isar der TU-München bestimmt.

48 Stunden nach der Lebertransplantation wurden die Versuchstiere sarkifiziert und die

Transplantatlebern entnommen. Diese wurden im Institut für Pathologie und pathologische

Anatomie des Klinikums rechts der Isar der TU-München aufgearbeitet und histologisch

untersucht.

86

Ergebnisse:

Die retrograd reperfundierten Transplantatlebern zeigten sowohl laborchemisch, wie auch

histologisch geringere Anzeichen für eine Schädigung als die anterograd reperfundierten

Lebern. So war die Aktivität der GOT in der Gruppe III bereits nach 24 Stunden signifikant

geringer als in der Gruppe II. Nach 48 Stunden war der Wert der Gruppe III signifikant

geringer als in den beiden anderen Gruppen. Ähnlich verhielt sich die Aktivität der GPT.

Diese war sowohl 24 als auch 48 Stunden nach der Lebertransplantation in der Gruppe der

retrograden Reperfusion (Gruppe III) signifikant geringer als in den Gruppen mit anterograder

Reperfusion. Auch die alkalische Phosphatase zeigte einen signifikanten Vorteil zugunsten

der retrograden Reperfusion verglichen mit der simultanen Reperfusion, allerdings erst nach

48 Stunden. Die GLDH-Aktivität war in der Gruppe III sowohl nach 24, als auch nach 48

Stunden signifikant geringer als in der Gruppe II. Die Bilirubinwerte waren in den drei

Gruppen zu keinem Zeitpunkt signifikant different.

Zwischen den Gruppen I und II zeichnete sich ein Vorteil für die Gruppe mit nicht simultaner

Reperfusion ab. Signifikant niedriger war hier in der Gruppe I im Vergleich zur Gruppe II die

Serumaktivität von GOT und GPT nach 24, sowie nach 48 Stunden und die Aktivität der

GLDH nach 48 Stunden.

Die durchgeführte histologische Untersuchung der Transplantatlebern konnte das Ergebnis

der laborchemischen Untersuchungen untermauern. Hierbei konnten in der Gruppe der

retrograden Reperfusion signifikant weniger Nekroseherde gefunden werden, als in den

Gruppen I und II. Auch die maximale Größe der gefundenen Nekrosen war in der Gruppe III

signifikant geringer als in der Gruppe I. Die Nekrosenverteilung in den verschiedenen Zonen

eines Leberazinus zeigte ein signifikant häufigeres Vorkommen von Nekrosen in den Zonen 1

und 2 der Gruppe I im Vergleich zu denen der Gruppe III.

87

Schlussfolgerung:

Nach einer Lebertransplantation kommt es in der Transplantatleber zu einem Ischämie-

/Reperfusionsschaden, welcher zu einer Mikrozirkulationsstörung und Zelluntergang führt.

Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass der Ischämie-/Reperfusionsschaden, den eine

Transplantatleber nach einer Lebertransplantation in der Ratte erfährt, deutlich geringer

ausgeprägt ist, wenn die initiale Reperfusion nicht anterograd, also über die Pfortader und die

Leberarterie geschieht, sondern retrograd, von der V. cava inferior aus stattfindet.

Gegenstand weiterer Forschungen sollte es nun sein, die Auswirkungen der retrograden

Reperfusion auf die Transplantatfunktion in der klinischen Lebertransplantation weiter zu

evaluieren und die Technik der retrograden Reperfusion im klinischen Alltag zu verbessern.

Die Technik der retrograden Reperfusion könnte so zu einer Minimierung von

Komplikationen nach einer Lebertransplantation und zu einer Verbesserung des Überlebens

von Patienten führen.

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8 Abkürzungen

AMP Adenosin 5` Monophosphat

AP alkalische Phosphatase

ATP Adenosin-Triphosphat

G-CSF Granulozyten koloniestimuliernder Faktor

GLDH Glutamatdehydrogenase

GOT Glutamatoxalacetattransaminase

GPT Glutamatpyruvattransaminase

γ-GT Gamma-Glutamyltranspeptidase

HSP-32 Hitzeschock-Protein-32

HSP-72 Hitzeschock-Protein-72

ICAM-1 Intrazelluläres Adhäsionsmolekül-1

IFN-γ Interferon- γ

IL-1 Interleukin-1

LFA-1 Leukozyten-Funktions-Antigen-1

LTx Lebertransplantation

MHC major histocompatibility complex

PAF platelet activating factor

PNF primäres Organversagen

SEC Sinusendothelzellen

TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor- α

VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1

110

9 Danksagung

Zunächst gilt mein Dank meinem Doktorvater Herrn PD Dr.med. M. Stangl für die

Möglichkeit, dieses interessante Thema bearbeiten zu dürfen und für die großzügige

Unterstützung während des Lernprozesses der für diese Arbeit notwendigen Methodik.

Außerdem möchte ich meinem Doktorbetreuer Dr.med.E. Matevossian für die ausgezeichnete

wissenschaftliche Betreuung und für das Lehren der Methodik danken. Er lehrte mich das

wissenschaftliche Arbeiten und hatte immer ein offenes Ohr bei auftretenden Problemen.

Auch möchte ich an dieser Stelle Herrn Prof. Dr. med. F. Fend und Dr. med. C.W. von

Weyhern für die histologische Bearbeitung und Auswertung der Gewebeproben danken.

Für die laborchemischen Serumanalysen und insbesondere für die aufwendige Bestimmung

der GLDH gilt mein Dank Fr. I. Cephea aus dem Institut für klinische Chemie und

Pathobiochemie der TU-München.

Für die wertvollen Anregungen und die vielfältige Hilfe während der tierexperimentellen

Arbeit möchte ich Fr. PD Dr.med. vet. J. Henke, sowie Herrn Dr.med.vet. T. Brill ganz

herzlich danken.

Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Zentrums für präklinische Forschung der TU-

München möchte ich an dieser Stelle für das angenehme Arbeitsklima und die freundliche

Unterstützung danken.

Ein besonderer Dank gilt Herrn C. Bald, ohne dessen unermüdliche Hilfe bei den Versuchen

und ohne die so oft wichtigen Aufmunterungen die Durchführung dieser Arbeit wesentlich

erschwert gewesen wäre.

Frau A. Poczatek sei ganz herzlich für die optische Gestaltung der Arbeit gedankt.

In tiefer Dankbarkeit wende ich mich an meine Eltern und Großeltern, die mir das Studium

der Humanmedizin und die Durchführung der vorliegenden Arbeit ermöglichten.

111

10 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Hans Dietrich Kern

Geburtsdatum: 16.10.1977

Geburtsort: München

Schulbildung

1989-1991 Gymnasium Gilching

1991-1997 Internat Schule Schloss Salem

1996-1997 Kommandant der Werksfeuerwehr Schloss Salem/Spetzgart

1996-1998 Erhalt der allgemeinen Hochschulreife an der Schule Schloss Salem

Arbeitserfahrung

1997-1998 Zivildienstleistender als Rettungssanitäter beim BRK Kreisverband

München

1998-1999 Hauptamtliche Tätigkeit als Rettungssanitäter an der

Rettungswache München-Ismaning

2000-2001 Tätigkeit als Präparationsassistent für die deutschen

Medizinstudenten an der Universität Szeged ; Albert Szent-Györgyi

Medizinisches und Pharmazeutisches Zentrum , Ungarn

März 2002 Famulatur am Klinikum rechts der Isar in der II. Med. Abteilung

März 2003 Famulatur an der Klinik Dr. Michael Schreiber, München, im

Bereich Unfall- und Viszeralchirurgie

Okt.2003 Teilnahme am Operationskurs experimentelle Nieren- und

Lebertransplantation Universitätsklinikum Münster

Sept.2004 Famulatur im Institut für exp. Onkologie und Therapieforschung

der TU-München

2005-2006 Praktisches Jahr am Klinikum rechts der Isar in München

Wahlfach: Orthopädie

112

Juli 2006-April 2007 Tätigkeit als Arzt auf der Station 1/2 des Klinikums rechts der Isar

der Technischen Universität München. Hierbei Betreuung von

Studienpatienten (z.B. MUNICON II).

April 2007-Januar 2008 Tätigkeit als Arzt im chirurgischen Notfallzentrum des

Klinikums rechts der Isar der Technischen Universität München.

Seit Januar 2008 Tätigkeit als Prüfarzt im Münchner Studienzentrum im Bereich

klinische Studien der Chirurgie

Hochschulausbildung

1999 Beginn des Studiums der Humanmedizin an der Universität Szeged,

Albert Szent-Györgyi Medizinisches und Pharmazeutisches

Zentrum, Ungarn

2001 Ärztliche Vorprüfung

Wechsel an die TU München

2002 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung

2005 Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung

2006 Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung mit Erhalt der Approbation

Sprachkenntnisse

Deutsch Muttersprache

Englisch fließend in Wort und Schrift

Latein großes Latinum

Ungarisch gute Kenntnisse