Die Bedeutung des Asymmetrischen Dimethylarginins für die ... fileAus der Medizinischen Klinik IV...

Aus der Medizinischen Klinik IV

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. K.-U. Eckardt

Die Bedeutung des Asymmetrischen Dimethylarginins für die Pathogenese der Endorganschäden bei Angiotensin II-induzierter

Hypertonie der Maus

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Kilian Sebastian Koch

aus Wörth a.d. Donau

Gedruckt mit Erlaubnis derMedizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Priv. Doz. Dr. med. Johannes Jacobi

Korreferent: Prof. Dr. med. Renke Maas

Tag der mündlichen Prüfung: 27. 10. 2010

Gewidmet meinen Großeltern

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung.........................................................................................11.1 Hintergrund und Ziele................................................................................1

1.2 Methoden...................................................................................................1

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen................................................................1

1.4 Praktische Schlussfolgerungen.................................................................1

2 Summary..........................................................................................................22.1 Background and aim of the study..............................................................2

2.2 Methods.....................................................................................................2

2.3 Results.......................................................................................................2

2.4 Conclusions...............................................................................................2

3 Einleitung.........................................................................................................34 Fragestellung – Hypothesen........................................................................165 Material und Methoden.................................................................................17

5.1 Versuchstiere...........................................................................................17

5.2 Genotypisierung der Mäuse.....................................................................18

5.3 Induktion der Hypertonie mittels Ang II....................................................19

5.4 Metabolische Käfige...............................................................................20

5.5 Blutentahme durch retroorbitale Phlebotomie.........................................21

5.6 Blutdruckmessung...................................................................................21

5.7 Blut- und Organentnahme.......................................................................22

5.8 Färbung und Auswertung histologischer Schnitte in PAS-Technik.........24

5.9 Immunhistochemische Färbungen .........................................................25

5.10 Oxidativer Stress (Dihydroethidium-Fluoreszenz).................................27

5.11 Messung der ADMA-Spiegel.................................................................27

5.12 Bestimmung der Aldosteronspiegel.......................................................28

5.13 Bestimmung der mRNA-Expression mittels Real-Time RT-PCR..........29

5.14 Statistik...................................................................................................31

6 Ergebnisse.....................................................................................................336.1 Tiere.........................................................................................................33

6.2 Effekte von Ang II auf Blutdruck und Herzfrequenz................................33

Metabolische Käfige......................................................................................36

6.3 Herzhypertrophie und vaskuläre Hypertrophie........................................36

6.4 Plasma-Aldosteron-Spiegel unter Ang II-Infusion...................................36

6.5 ADMA-Plasmaspiegel unter Ang II-Infusion............................................39

6.6 Glomerulosklerose, interstitielle Fibrose und Inflammation.....................44

6.7 Oxidativer Stress......................................................................................46

6.8 PRMT/DDAH mRNA Expression in der Niere.........................................48

Diskussion ......................................................................................................49 Literaturverzeichnis........................................................................................58 Abkürzungsverzeichnis..................................................................................65 Danksagungen.................................................................................................67

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) ist ein endogen gebildeter,

kompetitiver Hemmstoff der NO-Synthase. Erhöhte ADMA-Spiegel gelten als

kardiovaskulärer Risikofaktor und sind mit Herz-Kreislauferkrankungen

assoziiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, im Tierversuch einen möglichen

Zusammenhang von ADMA und Angiotensin II (Ang II) bei der Pathogenese der

Hypertonie und ihrer Endorganschäden zu untersuchen.

1.2 Methoden

Die Versuche wurden an transgenen (TG) Mäusen durchgeführt, die die

humane Form des ADMA abbauenden Enzyms DDAH1 überexprimieren. Die

TG Mäuse sowie Wildtyp (WT) Geschwistertiere erhielten Ang II (1.0µg/kg/min

oder 3.0µg/kg/min) bzw. gepufferte Kochsalzlösung (PBS) als subkutane

Infusion über eine Dauer von vier Wochen.

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

Die Infusion von Ang II erzeugte bei allen Mäusen eine Hypertonie sowie

hypertoniebedingte Endorganschäden. Allerdings bestanden keine signifikanten

Unterschiede zwischen den Genotypen, lediglich das Ausmaß der renalen

interstitiellen Fibrose und des oxidativen Stress in der Aorta war bei DDAH1

transgenen Mäusen vermindert.. Die transgenen Mäuse wiesen insgesamt

deutlich niedrigere ADMA-Spiegel auf. Die Infusion von Ang II hatte keinerlei

Einfluss auf die ADMA-Spiegel. In der RT-PCR zeigte sich eine gesteigerte

Expression der Enzyme DDAH2 und PRMT1 in der Niere nach Ang II Gabe.

1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Die in dieser Arbeit erhobenen Daten sprechen insgesamt gegen einen engen

Zusammenhang zwischen ADMA und Ang II bei der Genese hypertensiver

Organschäden. Interessant scheint der Einfluss von ADMA auf die renale

interstitielle Fibrose sowie den vaskulären oxidativen Stress. Hierin liegen

Ansatzpunkte für weiterführende Experimente zur Aufklärung der

pathophysiologischen Relevanz von ADMA.

2 Summary

2.1 Background and aim of the study

Asymmetric dimethylarginine (ADMA) is an endogenous competitive inhibitor of

NO-synthase. Elevated ADMA levels are predictive of cardiovascular risk and

are associated with cardiovascular disease. The aim of the present study was to

elucidate a possible link between ADMA and angiotensin II (Ang II) in the

pathogenesis of hypertension and resulting target organ damage.

2.2 Methods

Transgenic (TG) mice overexpressing the human isoform 1 of the ADMA

degrading enzyme DDAH as well as wildtype (WT) littermates were treated with

Ang II (1.0µg/kg/min or 3.0µg/kg/min) or phosphate buffered saline solution

(PBS) via subcutaneous infusion using osmotic minipumps over a period of four

weeks.

2.3 Results

Infusion of Ang II caused hypertension and target organ damage in all mice.

Except for renal interstitial fibrosis and vascular oxidative stress that were less

pronounced in TG mice no differences between the two genotypes were

observed. As expected, TG mice had markedly lower ADMA levels.

Interestingly, infusion of Ang II had no effect on plasma ADMA levels. RT-PCR

revealed an increased renal expression of ADMA degrading (DDAH2) and

ADMA generating (PRMT1) enzymes following Ang II infusion.

2.4 Conclusions

The data presented herein do not support a clear link between ADMA and Ang

II in the pathogenesis of hypertension or hypertensive target organ damage.

Interestingly, TG mice were resistant to Ang II induced renal interstitial fibrosis

and vascular oxidative stress. This observation needs further exploration in

future studies to investigate the pathophysiological relevance of ADMA.

3 Einleitung

Stickstoffmonoxid (NO) bzw. EDRF (endothelium derived relaxing factor) ist der

potenteste Vasodilatator, der bis heute bekannt ist (61). Dieses in

Endothelzellen gebildete vasoaktive Autakoid entsteht aus dem physiologischen

Substrat, der Aminosäure L-Arginin, über die Oxidation von L-Arginin in zwei

Schritten zu L-Citrullin. Die Oxidation der Aminosäure und Bildung des

Effektormoleküls NO wird über das Enzym NO-Synthase katalysiert (siehe

Abbildung 1).

Von dem Enzym NO-Synthase gibt es 3 verschiedene Isoformen, die neuronale

(nNOS oder NOS I), induzierbare (iNOS oder NOS II) und endotheliale NOS

(eNOS oder NOS III) (21, 27, 50, 51). Die Isoformen werden in Geweben

unterschiedlich stark exprimiert und haben unterschiedliche Funktionen. Die

nNOS wird in neuronalen Geweben exprimiert und wurde zuerst im Kleinhirn

von Ratte und Schwein nachgewiesen (7). Die eNOS kommt im Gefäßendothel

vor, nicht dagegen in der glatten Gefäßmuskulatur (61). Während nNOS und

eNOS konstitutiv exprimiert werden, ist die iNOS eine induzierbare Isoform, die

z.B. durch stimulierte Makrophagen aktiviert wird (89).

Die Effekte von NO im Organismus sind vielfältig. Im Endothel gebildetes NO

diffundiert in die umliegenden glatten Muskelzellen und aktiviert dort die lösliche

Guanylatzyklase. Dies führt zu einem Anstieg von zyklischem

Guanosinmonophosphat (cGMP), einem Botenstoff („second messenger“), der

letztendlich eine Vasodilatation der glatten Muskulatur der Gefäße induziert

(50). Auf diese Weise reguliert NO den Blutdruck und Gefäßwiderstand im

Organismus (66, 80). Neben der Beeinflussung des Vasotonus ist NO das

wichtigste anti-atherogene Molekül im menschlichen Körper. So hemmt NO die

Proliferation glatter Muskelzellen, die Plättchenaggregation, die Expression von

Adhäsionsmolekülen und pro-inflammatorischen Zytokinen, um nur einige

weitere wichtige Funktionen dieses Moleküls zu nennen (23, 35, 64, 83). Eine

verminderte NO-Synthese spielt somit eine Schlüsselrolle in der Pathogenese

der Atherosklerose.

Die Bioverfügbarkeit von NO im menschlichen Organismus unterliegt einer

komplexen Regulation, an der die Methylarginine als endogene Hemmstoffe

der NO-Synthase entscheidend beteiligt sind. Asymmetrisches Dimethylarginin

(ADMA), der wichtigste Vertreter der Methylarginine, ist ein kompetitiver

Inhibitor aller drei NO-Synthasen (siehe Abbildung 2). Dieses Molekül

konkurriert mit der Aminosäure L-Arginin um das Enzym und vermindert somit

die Bioverfügbarkeit von NO (81).

Abbildung 1: ADMA, ein endogener kompetitiver Inhibitor der NO-Synthase

Neben ADMA gibt es weitere beim Menschen vorkommende Methylarginine,

die sich durch die Anlagerung von Methylgruppen am Guanidinostickstoffatom

von der Aminosäure L-Arginin unterscheiden. Durch Substitution eines

Wasserstoffatoms gegen eine Methylgruppe am Guanidinostickstoffatom

entsteht NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA). Eine weitere Methylierung an

diesem Stickstoffatom führt zur Bildung von NG,NG-Dimethyl-L-Arginin

(asymmetrisches Dimethylarginin oder auch ADMA). Eine Substitution zweier

Wasserstoffatome durch Methylgruppen an den beiden unterschiedlichen

Stickstoffatomen der Guanidinogruppe führt zur Bildung von NG,NG`-Dimethyl-L-

Arginin (symmetrisches Dimethylarginin oder auch SDMA). Lediglich L-NMMA

und ADMA sind dabei kompetitive Inhibitoren der NO-Synthase, wohingegen

SDMA aufgrund der sterischen Konformation inert gegenüber dem Enzym ist

(siehe Abbildung 2).

Abbildung 2: Endogen beim Menschen vorkommende Methylarginine

Wenngleich SDMA die Aktivität von NOS nicht hemmt, so konkurriert dieses

Molekül ebenso wie L-NMMA und ADMA mit der Aminosäure L-Arginin um die

zelluläre Aufnahme über den kationischen Aminosäuretransporter (y+Carrier

hCAT-2B) (13). Dieser Transporter reguliert ca. 70% der intrazellulären

Aufnahme von L-Arginin. Die Präsenz aller drei Methylarginine (L-NMMA,

ADMA und SDMA) vermindert somit die intrazelluläre Bereitstellung von L-

Arginin. Die Nomenklatur von ADMA bzw. SDMA ist aus chemischer Sicht

unglücklich, da ADMA kein chirales bzw. asymmetrisches Stickstoffatom

aufweist bzw. die chemische Struktur von SDMA kein Symmetriezentrum

beinhaltet. Begrifflich sind ADMA und SDMA somit keine Stereoisomere,

sondern Strukturisomere, in der Literatur hat sich jedoch fälschlicherweise die

Bezeichnung asymmetrisches bzw. symmetrisches Dimethylarginin

durchgesetzt.

Erstmalig wurden Methylarginine 1970 von Kakimoto und Akazawa im Urin

mittels Ionenaustauschchromatographie beim Menschen detektiert (32).

Interessanterweise konnten die Autoren zeigen, dass die Urinkonzentrationen

von einer exogenen L-Arginingabe unbeeinflusst blieben, was als erster

Hinweis gedeutet wurde, dass Methylarginine nicht durch Methylierung von

freiem L-Arginin entstehen (32). Ihre Biosynthese wurde indes erst 1988 durch

Ghosh et al. aufgeklärt (24). Methylarginine entstehen durch die

posttranslationelle Methylierung von Argininresten in Proteinen. Erst durch

anschließende Proteolyse im Rahmen des natürlichen Proteinumsatzes der

Zelle erfolgt eine Freisetzung der nun modifizierten Aminosäuren in die

Zirkulation. Die Methylierung von L-Arginin erfolgt dabei durch Enzyme aus der

Familie der Proteinmethylasen (siehe Abbildung 3), welche sich in drei

verschiede Gruppen unterteilt, die wie folgt benannt wurden:

• Protein Methylase I (Protein-Arginin-Methyltransferase) (58)

• Protein Methylase II (Protein-Carboxyl-Methyltransferase) (33)

• Protein Methylase III (Protein-Lysin-Methyltransferase) (59)

Für die Synthese der Methylarginine ist lediglich die Proteinmethylase I

(Protein-Arginin-N-Methyltransferase oder kurz PRMT) von Bedeutung. Bis dato

wurden 9 PRMT-Gene (PRMT 1-9) identifiziert. Diese werden in Abhängigkeit

von ihrer Substratspezifität in 2 Typen (PRMT vom Typ 1 bzw. 2) eingeteilt (24,

34, 75). PRMTs vom Typ 1 produzieren ADMA und L-NMMA durch

Methylierung von Seitenketten in Histonen und Ribonukleinsäure (RNA)-

bindenden Proteinen, davon insbesondere in hnRNPs (Heterogeneous nuclear

ribonucleoproteins) (5, 53). PRMTs vom Typ 2 generieren SDMA und L-NMMA

und verwenden u.a. myelin-basisches Protein als Substrat (79).

Abbildung 3: Protein-Methylasen; PRMT=Protein-Arginin-N-Methyltransferase

Die Tatsache, dass beide Enzymgruppen L-NMMA produzieren, dessen

Konzentration im Plasma jedoch ca. 10-fach unter der von ADMA liegt, lässt

vermuten, dass L-NMMA in-vivo nur als Zwischenprodukt bei der Bildung von

ADMA und SDMA anfällt (79, 82). Hinzu kommt, dass bis heute keine PRMT

bekannt ist, die ausschließlich L-NMMA produziert (34).

Die Menge an ADMA, die mittels dieses Stoffwechselweges beim Menschen

generiert wird, wurde auf ca. 300µmol pro Tag geschätzt (2). Initial ging man

davon aus, dass Methylarginine unverändert renal eliminiert werden, passend

hierzu wurden die höchsten ADMA-Plasmaspiegel bei Patienten mit terminaler

Niereninsuffizienz gemessen, bei denen dieses Molekül akkumuliert (82).

Untersuchungen mit radioaktiv markierten Methylargininen am Kaninchen durch

Protein-Methylasen

Protein-Methylase I

(PRMT)

Protein-

Methylase II

Protein-

Methylase III

PRMT Typ I PRMT Typ II Nicht klassifiziert

PRMT 1,3,4,6

und 8

PRMT 5, 7

und 9

PRMT 2

Produkte:

NMMA,

ADMA

Produkte:

NMMA,

SDMA

McDermott et al. aus dem Jahre 1976 sprachen jedoch früh dafür, dass

Methylarginine im Organismus weiter verstoffwechselt werden (45). So lag die

Wiederfindungsrate im Urin für L-NMMA und ADMA lediglich bei 0.14% bzw.

5.1%, die für SDMA hingegen bei 66%. Dies legte nahe, dass insbesondere L-

NMMA und ADMA über weitere Abbauwege aus dem Körper eliminiert werden.

Erst 1987 gelang einer japanischen Arbeitsgruppe der Nachweis eines Enzyms,

welches L-NMMA und ADMA metabolisiert (55, 56). Das Enzym

Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) katalysiert dabei die

Hydrolyse von ADMA zu L-Citrullin und Dimethylamin, bzw. im Falle von L-

NMMA zu L-Citrullin und Monomethylamin (siehe Abbildung 4).

Abbildung 4: Synthese und Metabolismus der Methylarginine

SAM = S-Adenosyl-Methionin; SAH = S-Adenosyl-Homozystein; PRMT = Protein-Arginin-N-Methyltransferase; DDAH = Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (modifiziert nach (30))

Bei dem Enzym DDAH handelt es sich um ein Protein mit einem

Molekulargewicht von ca. 33 kDA. Im Jahre 1999 gelang Leiper der Nachweis

einer zweiten Isoform dieses Enzyms (DDAH1 und DDAH2) (38). Die

Sequenzhomologie beider Isoenzyme liegt bei 62%. Entscheidende

Unterschiede zwischen den Isoformen ergeben sich in ihrem

Expressionsmuster in den verschiedenen Geweben. DDAH1 überwiegt dabei in

Geweben, in denen die neuronale Form der NO-Synthase (nNOS) exprimiert

wird, wohingegen DDAH2 in Geweben dominiert, in denen vornehmlich die

endotheliale Isoform der NO-Synthase (eNOS) anzutreffen ist (38, 78).

Im Gegensatz zu L-NMMA und ADMA ist SDMA kein Substrat von DDAH, was

wiederum an der sterischen Konformation (Methylierung beider Stickstoffatome

der Guanidinogruppe) des Moleküls liegt. Für SDMA wurde neben der

unveränderten Ausscheidung über die Nieren bis dato kein weiterer

Eliminationsweg beschrieben, L-NMMA und ADMA werden zu 10-15%

unverändert über den Urin ausgeschieden, der weitaus größte Teil (85-90%)

wird über DDAH abgebaut (2, 45, 56, 81) (siehe Abbildung 4).

Für die Aktivität sowohl von DDAH1 als auch von DDAH2 sind die drei

Aminosäuren (Cystein, Aspartat und Histidin) im katalytisch aktiven Zentrum

des Enzyms von Bedeutung. Unter diesen drei ist offenbar das Cystein mit

seiner Sulfhydrylgruppe entscheidend (52). Dies wurde durch die endgültige

Strukturaufklärung der humanen Isoform DDAH1 mittels Kristallographie

bestätigt (52). Substanzen, die eine hohe Affinität zu Sulfhydrylgruppen

aufweisen, wie z.B. Quecksilberchlorid, bzw. divalente Metallionen (z.B.

Cadmium, Zink oder Kupfer) führen zu einer potenten Hemmung der DDAH-

Enzymaktivität in-vitro (56).

Der synthetische DDAH-Inhibitor S-2-amino-4(3-methylguanidino)butansäure

(4124W) führt in-vitro zu einem Anstieg von ADMA, nicht jedoch von SDMA,

zudem bewirkt diese Substanz eine Vasokonstriktion isolierter Aortenringe von

Ratten, welche durch Gabe von L-arginin antagonisierbar ist (43).

Neben den beschriebenen Hemmern des Enzyms DDAH führt eine

Nitrosylierung der Sulfhydrylgruppe im Cystein des katalytischen Zentrums von

DDAH zu einer Hemmung der Enzymaktivität (36). Hierdurch besteht ein

direkter Rückkopplungsmechanismus („feedback“), indem NO durch

Nitrosylierung von DDAH zu einer Hemmung der DDAH-Aktivität und einem

Anstieg von ADMA führt, welches dann konsekutiv durch Hemmung der NOS-

Aktivität eine verminderte Bioverfügbarkeit von NO zur Folge hat (siehe

Abbildung 5).

Durch diesen Mechanismus wird bei exzessiver NO-Produktion (wie z.B. im

Rahmen der Sepsis durch Stimulation der induzierbaren NO-Synthase) über

eine Hemmung des ADMA abbauenden Enzyms die NO-Synthese gedrosselt.

Abbildung 5: Nitrosylierung von DDAH durch NO

Die Michaelis-Menten Konstante (Km), welche die Substratkonzentration bei

halbmaximaler Reaktionsgeschwindigkeit eines Enzyms beschreibt, liegt für das

Enzym DDAH bei ca. 180µM und somit sehr viel höher als die im Plasma von

Gesunden ermittelten ADMA-Spiegel, die im Bereich von ca. 0.3-0.5µM liegen

(46). Der Km-Wert des Enzyms DDAH suggeriert, dass die intrazellulären

ADMA-Konzentrationen deutlich über den im Plasma gemessenen Werten

liegen. Hierzu gibt es bis heute leider nur sehr wenige Daten. In-vitro

Untersuchungen an bovinen aortalen Endothelzellen (BAECs) ergaben jedoch

intrazelluläre ADMA-Konzentrationen, die ca. 10-fach über den im Plasma

gemessenen Spiegeln lagen (8). Dennoch wird angezweifelt, dass die im

Plasma bzw. intrazellulär gemessenen ADMA-Konzentrationen ausreichen, um

eine relevante Hemmung der NO-Synthase zu bewirken, da die im Plasma

gemessenen physiologischen Konzentrationen von L-Arginin mit ca. 50-60µM

ca. 100fach über denen von ADMA liegen.

Eine ähnliche, auch als L-Arginin-Paradoxon bezeichnete Problematik ergibt

sich bei näherer Betrachtung der L-Arginin Konzentrationen, die sowohl

intrazellulär (ca. 100-800µmol/l) als auch extrazellulär deutlich über dem am

aufgereinigten Enzym eNOS in-vitro ermitteltem Km-Wert von 2.9µM liegen (21,

63). Selbst unter pathophysiologischen Bedingungen mit vermindertem

Substratangebot liegen die L-Argininkonzentrationen immer noch deutlich über

dem Km-Wert, so dass das Enzym gesättigt sein sollte und eine exogene

Substratzufuhr keinen Effekt auf die NO-Produktion haben sollte.

Dies widerspricht jedoch in-vivo Befunden am Kaninchen (14) und beim

Menschen (19), in denen die exogene Gabe von L-Arginin zu einer

Verbesserung der endothelabhängigen Vasodilatation führte. Neuere

Untersuchungen lassen jedoch berechtigte Zweifel am Nutzen einer L-

Argininsubstitution aufkommen. So musste eine plazebo-kontrollierte Studie an

Patienten mit stattgehabten Myokardinfarkt, bei denen der Effekt einer additiven

Therapie mit L-Arginin (3x3g/Tag) getestet wurde, vorzeitig wegen einer

gehäuften Sterblichkeit in der Verumgruppe abgebrochen werden (68). Eine

weitere Studie an 133 Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit,

die zusätzlich zur Standardmedikation entweder über 6 Monate L-Arginin

(3g/Tag) oder Plazebo erhielten, zeigte eine geringere Verbesserung der

schmerzfreien Gehstrecke unter L-Argininsubstiution (88).

Die bis dato vorliegenden Untersuchungen erlauben somit keine klare Aussage,

ob eine Substratzufuhr zu einer gesteigerten Bioverfügbarkeit von NO führt.

Eine plausible Erklärung für das L-Arginin-Paradoxon könnte die NOS-

Hemmung durch Methylarginine darstellen. Allerdings stellt sich hier, wie bereits

oben erwähnt, die Frage, ob die im Plasma gemessenen ADMA-Spiegel beim

Gesunden (0.3-0.5µM) bzw. 10fach höhere Werte im Intrazellulärraum

ausreichen, um signifikant in Konkurrenz zu L-Arginin (extra- und intrazelluläre

Konzentrationen s.o.) die Enzymaktivität der NO-Synthase zu beeinflussen. In-

vitro Untersuchungen an bovinen aortalen Endothelzellen (BAECs) belegen,

dass physiologische Konzentrationen von ADMA zu keiner Hemmung von NOS

führen, pathophysiologisch relevante Konzentrationen (5µM) führen indes bei

Abwesenheit von L-Arginin zu einer 38%igen Hemmung der NO-Produktion, in

Anwesenheit physiologischer L-Argininkonzentrationen zu einer 12%igen

Hemmung des Enzyms (8).

Unabhängig von diesen stöchiometrischen Überlegungen wird die

pathophysiologische Relevanz erhöhter ADMA-Plasmaspiegel seit der

klinischen Erstbeschreibung beim Menschen durch Vallance et al. (82) nicht

angezweifelt. Zahlreiche klinische Studien, die seitdem publiziert wurden,

zeigen eine enge Assoziation erhöhter ADMA-Spiegel mit allen etablierten

kardiovaskulären Risikofaktoren, wie Hypercholesterinämie,

Hypertriglyzeridämie, Hyperhomozysteinämie, Diabetes mellitus,

Bluthochdruck, Nikotinabusus, aber auch für Inflammationsmarker wie z.B. CRP

(1, 3, 6, 31, 41, 71, 73, 86, 93). Erhöhte ADMA-Plasmaspiegel wurden zudem

bei Patienten mit manifester koronarer Herzkrankheit (KHK), zerebraler

Ischämie (Apoplex) und peripherer arterieller Verschlusskrankheit (pAVK)

gemessen (6, 47-49, 90). Hierbei handelt es sich jedoch meistens um

Querschnittstudien mit kleiner Patientenfallzahl, große, randomisierte,

prospektive Studien mit harten Endpunkten zu dieser Thematik sind rar. Neuere

klinische Studien belegen jedoch, dass ADMA ein unabhängiger Risikofaktor für

kardiovaskuläre Ereignisse ist. Dies haben Zoccali et al. in mehreren Studien an

Patienten mit Niereninsuffizienz untersucht (91-95). Auch in nierengesunden

Patientenkollektiven sind erhöhte ADMA-Spiegel ein Prädiktor für

kardiovaskuläre Ereignisse, wie z.B. Schlaganfälle (84) oder Myokardinfarkte

(47, 67, 86). ADMA wird daher zunehmend als prognostisch relevanter

Biomarker diskutiert.

Aufgrund der mangelnden Vergleichbarkeit vorliegender Studien, die auf der

großen Variabilität gemessener ADMA-Spiegel beruht (30), ist eine

abschließende Beurteilung der pathophysiologischen Relevanz von ADMA zum

jetzigen Zeitpunkt nicht möglich. Hauptproblem ist dabei eine Standardisierung

der ADMA-Analytik und die Etablierung von Referenzwerten an definierten

Patientenkollektiven. Die vorliegenden klinischen Studien erlauben

insbesondere nicht die Beantwortung der Frage, ob erhöhte ADMA-Spiegel

kausal an der Pathogenese der Atherosklerose beteiligt sind, oder erst infolge

der Gefäßschädigung ansteigen. Zur Klärung dieser Frage lag es nahe,

genetische Mausmodelle zu etablieren, die mit einer Modulation der ADMA-

Spiegel einhergehen, um die funktionelle Relevanz dieses Moleküls zu

beweisen. Betrachtet man Synthese und Metabolismus der Methylarginine,

bietet sich das Enzym DDAH in idealer Weise als Target an.

Bis dato gibt es verschiedene Tiermodelle, in denen das Enzym DDAH

entweder ausgeschaltet (DDAH knock-out) oder überexprimiert wird. Die

Arbeitsgruppe von Leiper generierte DDAH1 defiziente Mäuse (37). Der

homozygote knock-out dieser Isoform führte zu einem embryonal letalen

Phänotyp, was die Bedeutung dieses Enyzms in der Embryonalentwicklung

unterstreicht. Heterozygote Tiere sind lebensfähig und weisen gegenüber

Wildtyptieren erhöhte ADMA-Plasma- und Gewebespiegel auf. Die DDAH-

Aktivität ist um ca. 50% reduziert. Zudem weisen die Tiere einen signifikant

höheren Blutdruck und eine gestörte Endothelfunktion auf (37). Den genau

umgekehrten Phänotyp haben DDAH1 transgene Mäuse, in denen die humane

Isoform 1 dieses Enzyms unter Kontrolle eines β-actin Pomotors ubiquitär

überexprimiert wird (16). Diese Tiere haben signifikant niedrigere ADMA-

Plasmaspiegel (40%), zudem weisen diese Mäuse einen tendenziell niedrigeren

arteriellen Mitteldruck (ca. 10%) sowie eine verbesserte endothelabhängige

Vasodilatation auf (16, 17) (siehe Abbildung 6).

Abbildung 6: Effekte einer Defizienz bzw. Überexpression von DDAH 1 (nach

(37), (16, 17)

Zum jetzigen Zeitpunkt ist eine weitere Charakterisierung dieser Mausstämme

zur Klärung der Bedeutung erhöhter ADMA-Spiegel notwendig. Die bis dato

vorliegenden Ergebnisse sprechen jedoch für eine funktionelle Relevanz

erhöhter ADMA-Spiegel im Rahmen von Gefäßschäden.

Gestützt durch die enge Assoziation erhöhter ADMA-Plasmaspiegel mit

etablierten kardiovaskulären Risikofaktoren stellt sich die Frage, ob ADMA-

Spiegel therapeutisch gesenkt werden können und ob dies mit einer Besserung

funktioneller bzw. struktureller Gefäßschäden einhergeht. Bis dato gibt es keine

Substanz, die ADMA-Spiegel spezifisch zu senken vermag. Betrachtet man die

Synthese und den Metabolismus von ADMA, so wäre eine Senkung der ADMA-

Spiegel durch verminderte Bildung über PRMTs, gesteigerte Ausscheidung

über die Nieren bzw. gesteigerten enzymatischen Abbau durch DDAH denkbar.

Da DDAH als Schlüsselenzym den Metabolismus von ADMA reguliert, ergibt

sich hier ein Hauptangriffspunkt für die Entwicklung pharmakologischer

Substanzen, die dieses Enzym in seiner Aktivität stabilisieren bzw. induzieren.

Die Entwicklung derartiger Substanzen befindet sich derzeit noch in klinischer

Erprobung.

Zum jetzigen Zeitpunkt wurden zahlreiche Substanzen, die durch Modulation

etablierter Risikofaktoren Ihren Stellenwert in der Reduktion kardiovaskulärer

Ereignisse klinisch eindeutig unter Beweis gestellt haben, dahingehend

untersucht, ob diese auch zu einer Beeinflussung der ADMA-Plasmaspiegel

führen. Hierzu zählen insbesondere die Klasse der

Cholesterinsyntheseenzymhemmer (CSE-Hemmer oder Statine) bzw.

Bluthochdruckmedikamente (Antihypertensiva), hierbei insbesondere

Medikamente, welche durch Hemmung des Renin-Angiotensin-Systems (RAS)

die Bildung (Angiotensin Converting Enzym Hemmer oder kurz ACE-Hemmer)

oder die pharmakologische Wirkung (Angiotensin II-Rezeptorblocker oder kurz

AT1-Blocker) von Angiotensin II (Ang II) hemmen. Betrachtet man die Gruppe

der Statine, so zeigen die vorliegenden klinischen Studien trotz signifikanter

Senkung der Cholesterinspiegel überraschenderweise keinen Effekt auf ADMA-

Plasmaspiegel (42). Einzige Ausnahme hiervon scheint der in Deutschland für

die Behandlung gerade zugelassene CSE-Hemmer Rosuvastatin zu sein,

vermutlich handelt es sich dabei um einen substanzspezifischen Effekt (40).

Anders sieht die Datenlage für die Gruppe der ACE-Hemmer bzw. AT1-Blocker

aus. In einer randomisierten, plazebokontrollierten cross-over Studie konnten

Delles et al. 2002 in einem Kollektiv von 20 jungen, männlichen Patienten mit

milder essentieller Hypertonie zeigen, dass sowohl durch den ACE-Hemmer

Enalapril als auch durch den AT1-Rezeptorblocker (ARB) Eprosartan bzw. eine

Kombination beider Substanzen ADMA-Plasmaspiegel signifikant gesenkt

werden konnten (18). Dieser Effekt wurde nach nur einwöchiger Therapie mit

den entsprechenden Substanzen beobachtet und war unabhängig von der

Blutdrucksenkung, da die Monotherapie beider Substanzen zu keiner

signifikanten Blutdrucksenkung führte (18). In der Folge konnte auch für andere

Erkrankungen gezeigt werden, dass eine Intervention des RAS die ADMA-

Spiegel senkt, so bei dialysepflichtiger Niereninsuffizienz (4), bei Syndrom X

(10) und Diabetes mellitus Typ II (28).

Tierexperimentelle Daten und in-vitro Befunde an Endothelzellen sprechen für

eine Assoziation erhöhter ADMA-Spiegel mit dem RAS. In diesem

Zusammenhang untersuchten Chen und Kollegen Zellkulturen aus humanen

Nabelschnurendothelzellen (HUVECs), die über 24 Stunden mit Angiotensin II

(1µM) inkubiert wurden (11). Im Kulturmedium zeigte sich ein signifikanter

Anstieg von ADMA um ca. 100%, welcher mit einer Hemmung der DDAH-

Aktivität von 75% einherging (11). Neben diesen in-vitro-Befunden gibt es auch

in-vivo Daten in einem DDAH2 transgenen Mausmodell, die zeitgleich mit den

im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Versuchen von einer

japanischen Arbeitsgruppe veröffentlicht wurden (26). Hier führte die

kontinuierliche Infusion von Ang II in einer Konzentration von 1.0µg/kg/min über

2 Wochen mittels osmotischer Minipumpen zu einer Verdoppelung der ADMA-

Plasmaspiegel bei Wildtypmäusen, bei DDAH2 transgenen Tieren war dieser

Anstieg signifikant vermindert (26). Weitgehend unklar ist, über welchen

Mechanismus Ang II zu einem Anstieg von ADMA führt.

Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Rolle von ADMA bzw. seines abbauenden

Enzyms DDAH bei Ang II induzierter Hypertonie in einem Mausmodell unter

Verwendung DDAH1 transgener Mäuse näher zu untersuchen.

4 Fragestellung – Hypothesen

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Frage nachgegangen, welche Rolle

ADMA bzw. sein abbauendes Enzym DDAH im Rahmen eines Ang II

induzierten Hochdruckmodells der Maus spielt. Zur Klärung dieser

Fragestellung wurde der Effekt einer chronischen Infusion von Ang II auf

ADMA-Plasmaspiegel, Bluthochdruck und Endorganschädigung an

Wildtypmäusen sowie DDAH1 transgenen Mäusen untersucht.

Hypothesen:

Die chronische Infusion von Ang II führt zu einem Anstieg der ADMA-

Plasmaspiegel.

ADMA ist von pathophysiologischer Relevanz hinsichtlich Ang II-induzierter

Endorganschäden.

Die Überexpression von DDAH1 geht mit erniedrigten ADMA-Plasmaspiegeln

einher und schützt vor Ang II-induzierten Endorganschäden.

5 Material und Methoden

5.1 Versuchstiere

Bei den für die Versuche verwendeten DDAH1 transgenen (TG) Mäusen

handelte es sich um Tiere, an deren Generierung und Charakterisierung Herr

PD Dr. J. Jacobi im Rahmen eines Postdoktorandenstipendiums der Deutschen

Forschungsgemeinschaft in den USA bei Prof. John P. Cooke (Dept. of

Cardiovascular Medicine, Stanford University) beteiligt war (16). Einige

transgene Tiere wurden von Herrn Prof. Cooke freundlicherweise zur Verfügung

gestellt und nach Deutschland importiert.

Im Biotechnologischen Entwicklungslabor (BTE) der Universität Erlangen-

Nürnberg erfolgte zunächst die Sanierung der Kolonie mittels Embryotransfer,

um die Tiere anschließend in die Barrierehaltung überführen zu können.

DDAH1 TG Mäuse exprimieren zusätzlich zur murinen Form die humane

Isoform DDAH1 heterozygot auf einem C57BL/6J Hintergrund (hDDAH1+/-). Die

Expression des Transgens unterliegt dabei der Kontrolle eines β-Actin-

Promotors, wodurch eine konstitutive Expression in allen Zellen erfolgt. Die

Phänotypisierung der Tiere in den USA zeigte, dass die Überexpression von

DDAH mit erniedrigten systemischen ADMA-Plasmaspiegeln und konsekutiv

mit einer gesteigerten NOS-Aktivität einherging (16). Zudem waren der arterielle

Mitteldruck und der systemische Gefäßwiderstand bei transgenen Mäusen

tendenziell vermindert (16). In unserer Arbeit wurden 4 Monate alte, männliche,

heterozygote DDAH1 TG Mäuse und deren Wildtyp-Geschwistertiere (WT) aus

dem gleichen Wurf verwendet. Für den Versuch wurden je Genotyp drei

Behandlungsgruppen untersucht.

Gruppe 1: WT und DDAH1 TG Mäuse (je n=7) mit Infusion von Phosphat-

gepufferter Kochsalzlösung (PBS) über 4 Wochen (Kontrollgruppe)

Gruppe 2: WT und DDAH1 TG Mäuse (je n=13) mit Infusion von Ang II in einer

Dosierung von 1.0µg/kg/min über 4 Wochen

Gruppe 3: WT (n=9) und DDAH1 TG Mäuse (n=10) mit Infusion von Ang II in

einer Dosierung von 3.0µg/kg/min über 4 Wochen (Hochdosis Ang II)

Das Versuchsprotokoll wurde von der Tierschutzkommission der Regierung von

Mittelfranken (Bezirksregierung Mittelfranken, AZ 54-2531.31-1/06) genehmigt.

Die Haltung der Versuchstiere erfolgte in einem klimatisierten Tierstall, die

Temperatur betrug konstant 22 +/- 2°C bei einer Luftfeuchtigkeit von 50-60%.

Über eine automatische Zeitschaltuhr wurde ein zwölfstündiger Tag-Nacht

Rhythmus erzeugt. Die Versuchstiere hatten freien Zugang zu Leitungswasser

und Futter (Standard-Diät Nr. 1324, Altromin, Lage).

5.2 Genotypisierung der Mäuse

Die Genotypisierung der Mäuse erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion

(PCR) aus isolierter Schwanz-DNA unter Verwendung transgen-spezifischer

Primer (s.u.). Die Isolierung der DNA erfolgte mit Hilfe eines DNA-Isolationskits

(NucleoSpin Tissue-Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co KG, Düren). Hierbei

erfolgte zunächst ein Gewebeverdau im Wasserbad (56°C) unter Inkubation mit

Proteinase K. Nach anschließender Zentrifugation wurde die an der Membran

des Filters befindliche DNA in einem zweiten Zentrifugationsschritt eluiert und

die DNA-Konzentration mittels Photometer (Ultrospec 3000 pro, Amersham

Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) gemessen. Hieraus wurde die

einzusetzende DNA-Menge für die PCR errechnet.

Mittels PCR wurde ein 282 Basenpaar-Fragment des humanen DDAH1-Gens

amplifiziert. Die Primersequenzen wurden dabei so gewählt, dass die Maus-

Isoform des Enzyms nicht amplifiziert wurde. Hierzu wurden die

Primersequenzen mittels Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) des

National Center for Biotechnical Information (NCBI) auf ihre Spezifität hin

überprüft. Die PCR erfolgte über einen Thermocycler (Biometra GmbH,

Göttingen). Folgende Primer (MWG Biotech AG, Ebersberg) wurden verwendet:

Tabelle 1. Primersequenzen für die Genotypisierung

Primer SequenzDDAH forward 5’-ATG-CAA-CTT-TAG-ATG-GCG-GAG-3’DDAH reverse 5’-TCA-TCA-GGC-ACA-GTG-AGT-TTG-3’

Die Zyklen der PCR waren wie folgt aufgebaut:

Denaturieren: 15 min bei 95°C

Insgesamt 35 Amplifikationszyklen, bestehend aus

Denaturieren: 1 min bei 94° C

Annealing: 1 min bei 55° C

Extension: 1 min bei 72° C

Schlussphase: 10 min bei 72° C

Ende: Kühlung bei 4° C bis zur Entnahme der Proben

Im Anschluss an die PCR erfolgte eine Gelelektrophorese (1% Agarose-Gel,

Spannung 70 Volt, NEEO Ultra-Qualität, Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe).

Mittels Ethidiumbromid (Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe) wurden die

Banden im ultravioletten Licht sichtbar gemacht. Zur Skalierung diente eine 100

Basenpaar- (bp) DNA-Leiter (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA).

5.3 Induktion der Hypertonie mittels Ang II

Im Alter von 16 Wochen erfolgte die Implantation osmotischer Minipumpen

(Alzet, Modell 2004, DURECT Corporation, Cupertino, CA), welche mit PBS

bzw. Ang II (1.0 bzw. 3.0µg/kg/min) befüllt wurden.

Das Funktionsprinzip der osmotischen Minipumpen beruht darauf, dass sie in

verschiedene Kammern aufgeteilt sind. In der Hauptkammer befindet sich das

Reservoir für die zu infundierende Substanz, welches komprimierbar ist. Das

Reservoir ist durch eine impermeable Membran von einer Kammer getrennt,

welche eine hochosmolare Salzmischung enthält. Diese ist wiederum nach

außen hin durch eine semipermeable Membran begrenzt. Nach Implantation

der Pumpe wird durch Osmose Wasser aus der Umgebung in die Salzkammer

gezogen. Dadurch nimmt das Volumen letzterer zu und komprimiert das

Reservoir der Hauptkammer, wodurch der Inhalt mit einer konstanten Rate

herausgedrückt wird (76).

Für die Infusion von Ang II (Bachem AG, Weil a. Rhein) wurden die Minipumpen

wie im Folgenden beschrieben befüllt. Zunächst wurde unter Berücksichtigung

der Förderrate der Pumpe (6µl/Tag) für jedes Tier einzeln die Menge an Ang II

(in mg) berechnet, die in die jeweilige Pumpe appliziert werden muss, damit

jedes Tier die angestrebte Infusionsrate von 1.0 oder 3.0µg/kg/min erhält.

Zur Befüllung der Pumpen wurde alsdann eine Stammlösung hergestellt, indem

100mg Ang II in 4ml PBS aufgelöst wurden, die Konzentration der

Stammlösung lag somit bei 25mg/ml bzw. 25µg/µl. Dividiert man nun die für

jedes Tier spezifische Menge an einzusetzendem Ang II (in mg) durch obige

Konzentration, erhält man das Volumen an Stammlösung, welches in den

Ansatz zum Befüllen der Pumpe gegeben werden muss. Dieses Volumen füllt

man mit PBS auf, bis ein Gesamtvolumen von 250µl vorliegt. Das Füllvolumen

der Pumpe liegt bei 200µl, aufgrund des Restvolumens im Spritzenansatz

wurde bewusst ein Volumen von 250µl zur Befüllung der Pumpen angesetzt.

Bei den Kontrolltieren wurden die Pumpen mit reiner PBS-Lösung befüllt.

Die Implantation der Minipumpen erfolgte unter Inhalationsnarkose (2%

Isofluran, Abbot GmbH & Co KG, Wiesbaden) mittels eines entsprechenden

Verdampfersystems (Völker GmbH, Kaltenkirchen). Zur Narkoseeinleitung

wurden die Tiere in eine Plexiglaskammer mit Narkosegasanschluss gelegt, zur

Aufrechterhaltung der Narkose diente eine Kunststoffmaske. Am narkotisierten

Tier wurde zwischen den Schulterblättern die Haut rasiert, dann erfolgte ein

Hautquerschnitt über ca. 5mm mittels Skalpell, durch anschließende stumpfe

Präparation mit Nadelhalterklemmen wurde atraumatisch eine Tasche im

Subkutangewebe präpariert, um die Pumpen widerstandslos und steril

implantieren zu können. Der Wundverschluss erfolgte durch Einzelknopfnähte

unter Verwendung eines Fadens der Stärke 5-0 (Ethicon Prolene, Johnson &

Johnson GmbH, Düsseldorf).

5.4 Metabolische Käfige

Eine Woche vor Pumpenimplantation sowie drei Tage vor der Organentnahme

wurden die Mäuse für 24 Stunden in metabolischen Stoffwechselkäfigen

gehalten (STT 100, Ebeco GmbH, Castrop-Rauxel).

Leitungswasser und gemahlene Standard-Diät waren ad libitum vorhanden. Der

24h Urin der Tiere wurde in einem Sammelbehälter aufgefangen. Mittels einer

Präzisionswaage (BP 2100, Sartorius AG, Göttingen) wurde die absolute

Urinmenge der Mäuse bestimmt, aus der später die Diurese errechnet wurde.

Anschließend wurde der Urin zentrifugiert, der Überstand abpipettiert, aliquotiert

und umgehend bei -20°C zur späteren Bestimmung von Albumin und Kreatinin

tiefgefroren. Auch Wasser- und Futterbehälter der Mäuse wurden vor und nach

Einsetzen in den Käfig zur Bestimmung der Trink- und Futtermenge gewogen.

Die Albuminkonzentration im Urin wurde mit einem ELISA (Enzyme linked

immunosorbent assay) gemäß den Herstellerangaben gemessen (Mouse

Albumin Elisa Quantification Kit, Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, Texas).

Die Absorption des Substrats Tetramethylbenzidin (TMB) wurde bei 450nm

photometrisch gemessen. Bei allen Urinproben erfolgte eine

Doppelbestimmung, aus der anschließend der Mittelwert berechnet wurde.

Die Kreatininkonzentration im Urin wurde im Zentrallabor der Kinder- und

Jugendklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg bestimmt.

5.5 Blutentahme durch retroorbitale Phlebotomie

Bei den Tieren, die Ang II in der höheren Dosierung (3.0µg/kg/min) erhielten,

wurden die ADMA-Plasmaspiegel sowohl vor als auch nach Infusion von Ang II

gemessen. Die Bestimmung der basalen ADMA-Plasmaspiegel (vor Ang II

Infusion) erfolgte aus Blutproben, welche mittels retroorbitaler Phlebotomie

gewonnen wurden. Die Blutentnahme fand dabei unter Inhalationsnarkose (2%

Isofluran) statt. Es wurden kleine Glaskapillaren (Hettich Zentrifugen,

Tuttlingen) verwendet, mit denen durch eine langsam kreisende Bewegung

nach Luxation des Auges aus dem Bulbus der retroorbitale Venenplexus

vorsichtig eröffnet wurde. Das in die Kapillare aufgesogene Blut (ca. 150µl)

wurde in ein Eppendorf-Gefäß überführt, umgehend zentrifugiert und das

Plasma anschließend bei -20° C gelagert.

5.6 Blutdruckmessung

Die Blutdruckmessung erfolgte nicht-invasiv mittels Schwanzplethysmographie

über ein vollautomatisches Messgerät (Blood Pressure 209000, TSE Systems,

Bad Homburg). Um die Tiere an die Meßmethode zu gewöhnen, wurde mit den

Messungen bereits vier Wochen vor dem eigentlichen Versuchsbeginn

begonnen, dabei erfolgten alternierende Blutdruckmessungen in Abständen von

2-3 Tagen.

Zur Blutdruckmessung wurden die Tiere auf eine auf Körpertemperatur

vorgeheizte Wärmeplatte gesetzt und mittels magnetisch haftender Restrainer

an der Flucht gehindert. Dann wurde der Schwanz der Mäuse durch die

automatisch aufblasbare Manschette geführt, in einen optischen Pulssensor

eingelegt und mit einem Stück Pflaster fixiert, um Bewegungsartefakte zu

vermeiden. Das Blutdruckmessgerät verfügte über sechs Kanäle, die eine

simultane Datenerfassung von sechs Tieren zuließen. Das Messprotokoll wurde

für diesen Versuch wie folgt gewählt.

Nach fünfminütiger Akklimatisationszeit wurden zunächst 10 Testmessungen

vorgenommen, erst im Anschluss wurden 20 weitere Messungen durchgeführt,

die in die Versuchsauswertung gelangten. Während der Blutdruckmessung

wurde der Cuff computergesteuert aufgeblasen, bis der Blutfluss in der

Schwanzarterie sistierte. Dann wurde der Cuff-Druck automatisch schrittweise

abgesenkt, bis mittels des optischen Lichtsensors eine Pulskurve detektiert

werden konnte. Der Cuff-Druck, bei dem diese Kurve gemessen wurde,

entsprach dem systolischen Blutdruck. Zusätzlich wurde die Herzfrequenz zu

den jeweiligen Messungen aufgezeichnet.

Die Werte aus den Einzelmessungen wurden in eine Excel-Datentabelle (Excel,

Version 2003, Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA)

überführt und der Durchschnitt für Mitteldruck und Herzfrequenz aus 20

Messungen errechnet.

Die für die Auswertung verwendeten Blutdruckmessungen erfolgten am Tag vor

Implantation der osmotischen Minipumpen, sowie an den Tagen 2, 3, 7, 14, 21

und 28.

5.7 Blut- und Organentnahme

Vier Wochen nach Pumpenimplantation (Tag 28) erfolgte die Tötung der Tiere

zum Zwecke der Gewinnung von Blut- und Organproben. Nach einer

abschließenden Blutdruckmessung und Erfassung des Körpergewichtes

wurden die Tiere in Narkose (2% Isofluran) versetzt, um einen arteriellen

Katheter für die Blutentnahme zu legen. Die Anlage der arteriellen Katheter

erfolgte, um eine verlässliche und standardisierte Bestimmung der Plasma-

Aldosteronspiegel durchführen zu können.

Zur Katheteranlage wurde am narkotisierten Tier ein medianer Hautschnitt am

Hals gesetzt, anschließend erfolgte eine Feinpräparation der Arteria carotis

sowie des begleitenden Nervus vagus und der Vena jugularis. Als nächstes

wurde die Arterie proximal mit einem dünnen Faden ligiert, während das

Gefäßlumen kaudal mit einer Gefäßklemme vorübergehend okkludiert wurde.

Mit einer Irisschere wurde ein Loch in die Arterienwand geschnitten, welches

gerade groß genug war, um einen Polyethylenkatheter (Innendurchmesser

0.28mm, Außendurchmesser 0.61mm, NeoLab, Migge Laborbedarf-Vertriebs

GmbH, Heidelberg) mit einer Führungspinzette einzuführen. Der Katheter

wurde im Gefäß bis zur Klemme vorgeschoben und mit zwei Fäden fixiert. Dann

wurde der arterielle Blutsstrom durch Öffnen der Klemme freigegeben.

Nachdem sich eine pulsatile Blutsäule im Katheter zeigte, wurde dieser mit

einem Metallstift verschlossen. Über einen weiteren Hautschnitt hinter dem Ohr

wurde ein subkutaner Tunnel präpariert, durch den der Katheter zur weiteren

Fixierung geführt wurde.

Nach erfolgreicher Katheteranlage wurden die Tiere in tiefer Narkose (5%

Isofluran) über den arteriellen Katheter entblutet. Hierzu wurde ein 2ml

Eppendorf-Gefäß (Eppendorf AG, Hamburg) verwendet, in welches zunächst

30µl Ethylendiamintetraacetat (pEDTA, Merck, Darmstadt) pipettiert wurden.

Das gewonnene Blut wurde umgehend zentrifugiert, das Plasma in Aliquots

aufgeteilt und bei -80°C tiefgefroren.

Unmittelbar im Anschluss erfolgte die Organentnahme. Hierfür wurden mit einer

Schere Abdomen und Thorax eröffnet, der rechte Vorhof mittels Pinzette

rupturiert und der linke Ventrikel mit einer Butterflykanüle (21 Gauge) kanüliert,

über die der Kreislauf mit 4°C kalter physiologischer Kochsalzlösung (0.9%

NaCl, Berlin Chemie AG, Berlin) perfundiert wurde. Alsdann erfolgte die

Entnahme und Gewichtsbestimmung der Nieren. Von der linken Niere wurde

die obere und untere Polkappe in flüssigem Stickstoff zur späteren Isolierung

von messenger RNA (mRNA) eingefroren. Der Rest der Niere wurde in zwei

gleich große Stücke unterteilt, die in Methylcarnoylösung (MC) bzw.

Gefriermedium (TissueTek, Sakura, Zoeterwoude, Niederlande) eingebettet

wurden. Anschließend wurde das Herz im Ganzen entnommen und gewogen.

Daraufhin erfolgte die Präparation der Aorta bis zum Diaphragma zur Entnahme

verschiedener Teilstücke. Die Aorta aszendens (distal der Aortenwurzel) und

deszendens (in Höhe des Diaphragmas) wurden für spätere Gefrierschnitte in

TissueTek-Medium eingebettet und sofort bei -80°C tiefgefroren. Ein weiteres

Stück der Aorta abdominalis (unterhalb des Diaphragma) wurde in MC

eingebettet.

Die für die Fixation der Gewebe benötigte MC-Lösung bestand aus einem

Gemisch aus 60% Methanol, 30% Chloroform und 10% Eisessig, welches vor

der Organentnahme frisch angesetzt wurde. Nach Fixation der Gewebeproben

in MC-Lösung und Prozessierung in einer aufsteigenden Methanolreihe (70-

100%) und Isopropanol (beide Merck, Darmstadt) erfolgte eine

Gewebeeinbettung in Paraffin. Aus den Gewebeblöcken wurden mit Hilfe eines

Mikrotoms (HM 335 E, Microm International GmbH, Walldorf) 2µm dicke

Schnitte angefertigt und auf Objektträger aufgebracht.

5.8 Färbung und Auswertung histologischer Schnitte in PAS-Technik

Paraffinschnitte der linken Niere sowie der Aorta deszendens wurden nach

Entparaffinisierung und anschließender Rehydratation einer PAS-Färbung

(Perjodsäure-Leukofuchsin-Färbung) unterzogen.

Als Maß für die Gefäßhypertrophie wurde das Wanddicken-Lumen-Verhältnis

(wall to lumen ratio) der Aorta lichtmikroskopisch bestimmt (Mikroskop: Nikon

Eclipse 80i, Nikon, Tokio, Japan). Mittels einer an das Mikroskop

angeschlossenen Kamera (Spot RT, Diagnostic Instruments Inc., Sterling

Heights, MI, USA) wurden unter 40-facher Vergrößerung Bilder der Aorten

gespeichert. Die Berechnung des Wanddicken-Lumen-Verhältnis erfolgte

flächenbasiert nach Kalibrierung für das entsprechende Objektiv. Für die

Eichung wurde ein entsprechender Objektträger mit Linealmarkierung

verwendet. Die Berechnung der Wand- und Lumenfläche erfolgte

computergestützt mit dem Bildbearbeitungsprogramm MetaVue (Version 4.6r9;

Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), der Quotient aus beiden Flächen

(Wanddicken-Lumen-Verhältnis) wurde in einer Excel-Tabelle gespeichert.

An PAS-gefärbten Nierenschnitten wurde das Ausmaß der glomerulären

Schädigung mittels eines standardisierten Glomerulosklerose-Scores

semiquantitativ erfasst. In jeder Niere wurden 100 Glomeruli zufällig

ausgewählt. Je nach Schweregrad der Glomerulosklerose wurde jedem

Glomerulum ein Score von 0 (keine Glomerulosklerose) bis 4 (schwerste

Glomerulosklerose) zugeordnet (25). Nachdem erste Auswertungen an Ang II

infundierten Mäusen lediglich eine leichtgradige glomeruläre Schädigung

erkennen ließen (Score von 0-2), beschlossen wir, anstelle des Scores den

Anteil geschädigter Glomeruli in Prozent anzugeben.

5.9 Immunhistochemische Färbungen

Zum Nachweis der Ang II-induzierten Inflammation in der Niere wurde die

Makrophageninfiltration mittels spezifischer Antikörper analysiert. Für

Paraffinschnitte erfolgte eine Färbung unter Verwendung eines Antikörpers

gegen das Antigen F4/80 (Ratte anti Maus, Klon CI:A3-1, Verdünnung 1:100,

AbD Serotec, MorphoSys AG, Planegg). Dieser Klon erkennt das Maus F4/80

Antigen, ein 160kD Glykoprotein, welches von Makrophagen der Maus

exprimiert wird.

Vor der Inkubation erfolgte ein hitzeinduziertes Antigen-Retrieval durch

Aufkochen der Objektträger in einer Zitratpufferlösung. Nach Inkubation mit

dem Primärantikörper über Nacht erfolgte die Inkubation mit einem Biotin-

markierten Sekundärantikörper (Pferd-anti-Ratte, Verdünnung 1:1000, Vector

Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) über eine Stunde. Anschließend

wurden die Objektträger mit Avidin-D (Verdünnung 1:2000, Vector Laboratories,

Inc., Burlingame, CA, USA) inkubiert. Avidin D ist an das Enzym Peroxidase

aus der Meerrettich-Pflanze (Horseradish peroxidase) gekoppelt und bindet mit

hoher Affinität an die Biotinylgruppe der Sekundärantikörper. Mittels

Diaminobenzidin (DAB-Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)

wurde die Färbung entwickelt. Die im Kit enthaltenen H2O2 –Moleküle werden

dabei von der Peroxidase des Avidin umgesetzt. Es entstehen Protonen, die

das Diaminobenzidin oxidieren und so braun färben. Die Spezifität der Färbung

wurde bei jedem Tier durch Weglassen des Primärantikörpers

(Negativkontrolle) überprüft.

Neben der lichtmikroskopischen Immunhistochemie wurde für F4/80 auch eine

Immunfluoreszenz durchgeführt. Die Schnitte wurden hierfür mit dem

identischen Primärantikörper analog zur Lichtmikroskopie über einen Zeitraum

von zwei Stunden inkubiert. Als Sekundärantikörper wurde ein

fluoreszenzmarkierter Antikörper (Alexa-555, Ziege anti Ratte, Verdünnung

1:250, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) verwendet. Bei dem

verwendeten Sekundärantikörper erscheinen die Makrophagen unter dem

Immunfluoreszenzmikroskop in Rotfluoreszenz. Zellkerne wurden mittels

Hoechst 33342 (Verdünnung 1:1000, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR,

USA) angefärbt. Dieser Farbstoff bindet an doppelsträngige DNA und emittiert

eine Blaufluoreszenz. Zur Färbung glatter Muskelzellen erfolgte zudem eine Ko-

Inkubation mit einem Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)-markierten Antikörper

gegen α-Actin glatter Muskelzellen der Gefäße (Verdünnung 1:500, Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Glatte Muskelzellen der Gefäße erscheinen

so unter dem Immunfluoreszenzmikroskop in Grünfluoreszenz. Die Analyse und

Auswertung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse 80i,

Nikon, Tokio, Japan) unter Verwendung der für die Emission der verwendeten

Sekundärantikörper benötigten Filter. Mittels der am Mikroskop integrierten

Digitalkamera (Spot RT, Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA)

wurde die Zahl der F4/80 positiven Zellen pro Gesichtsfeld bestimmt. Sowohl

für die Licht- als auch die Fluoreszenzmikroskopie wurde die Anzahl F4/80

positiver Zellen an 20 zufällig gewählten, nicht überlappenden Kortexschnitten

ausgezählt.

Zusätzlich zur F4/80 Färbung erfolgte an Gefrierschnitten eine Färbung mit dem

Maus-Makrophagenmarker MOMA-2 (Verdünnung 1:100, BMA Biochemicals

AG, Augst, Switzerland). Die Färbung wurde floureszenzmikroskopisch

dargestellt, eine weitere Quantifizierung wurde nicht vorgenommen.

Zur Erfassung der Ang II-induzierten renalen interstitiellen Fibrose sowie

Glomerulosklerose erfolgte eine immunhistochemische Färbung für Kollagen I

(Verdünnung 1:100, Biogenesis Ltd., Poole, England, UK) und Kollagen IV

(Verdünnung 1:500, Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL,

USA) als Proteine des Bindegewebes.

Die Expression von Kollagen I in der Niere dient als Marker für das Ausmaß

einer renalen interstitiellen Fibrose. Die semiquantitative Auswertung erfolgte

mittels Lichtmikroskopie unter Verwendung eines Okulars, in welches ein

Rastergitter bestehend aus 100 Kästchen eingearbeitet ist. Mittels dieses

Rasters wurde die Kollagenfärbung im Interstitium des Nierenkortex (Anzahl

positiver Felder von 100) quantifiziert. Die Auswertung erfolgte an insgesamt 20

nicht überlappenden Gesichtsfeldern unter 400-facher Vergrößerung. Auf diese

Weise wurde für jedes Tier das Ausmaß der Fibrose im Interstitium der Niere

semiquantitativ abgeschätzt.

Die Auswertung der Kollagen IV-Färbung als Maß der glomerulären Sklerose

erfolgte computergestützt mit dem Bildbearbeitungsprogramm MetaVue

(Hersteller und Version s.o.). Pro Nierenschnitt wurden bei dieser Technik 30

Glomeruli zufällig ausgewählt und zunächst deren Fläche bestimmt. Für die

Braunfärbung, die Kollagen IV anzeigt, wurde ein Schwellenwert, ab dem diese

von der Software detektiert wurde, definiert. Im Anschluss wurde der

prozentuale Anteil von Kollagen IV an der Gesamtfläche eines jeden

Glomerulus bestimmt. Zur besseren Vergleichbarkeit der Messergebnisse

wurden für alle Schnitte die gleichen Geräteeinstellungen verwendet.

5.10 Oxidativer Stress (Dihydroethidium-Fluoreszenz)

Unfixierte Gefrierschnitte (10µm) der Aorta aszendens (distal der Aortenwurzel)

und Aorta deszendens (in Höhe des Diaphragma) wurden mit dem Fluorophor

Dihydroethidium (DHE, 8µM, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) über

eine Stunde bei 37°C unter Lichtabschirmung inkubiert.

In Anwesenheit reaktiver Sauerstoffradikale (z.B. Superoxidanionen) wird

Dihydroethidium zu Ethidiumbromid oxidiert, welches mit der DNA der

entsprechenden Zellen interkaliert und nach Anregung bei einer Wellenlänge

von 488nm im Fluoreszenzmikroskop Licht der Wellenlänge 610nm emittiert

(Rotfluoreszenz).

Um die Spezifität der Fluoreszenz zu verifizieren, wurden zur Kontrolle einige

Schnitte vor Inkubation mit Dihydroethidium mit dem Enzym Polyethylen-Glycol-

Superoxid-Dismutase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) vorbehandelt,

welches freie Sauerstoffradikale degradiert.

Die Auswertung des Fluoreszenzsignals erfolgte unter dem

Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse 80i, Nikon, Tokio, Japan) mit integrierter

Digitalkamera (Spot RT, Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI,

USA). Mit Hilfe des Programms MetaVue (Hersteller und Version s.o.) wurde für

jeden Schnitt das Fluoreszenzsignal detektiert und das Flächenverhältnis von

fluoreszierenden Pixeln zur Gesamtpixelzahl der Wandfläche des Gefäßes

bestimmt. Um Vergleichbarkeit zu gewährleisten, wurden für alle Schnitte die

gleichen Einstellungen verwendet.

5.11 Messung der ADMA-Spiegel

Die Bestimmung der ADMA-Plasmaspiegel erfolgte mittels eines kommerziellen

ELISA Assays (DLD Diagnostika GmbH, Hamburg). Dabei handelt es sich um

einen kompetitiven ELISA, bei dem das Antigen in der Probe mit in der

Festphase gebundenem Antigen um eine feste Anzahl freier

Antikörperbindungsstellen konkurriert. Die ADMA-Konzentration der

Plasmaproben verhält sich somit umgekehrt proportional zu der Anzahl der

gemessenen Antigen-Antikörper-Komplexe.

In einem ersten Reaktionsschritt wurde ADMA durch Inkubation mit einem

Acylierungsreagenz in N-Acyl-ADMA überführt. Die entsprechend

vorbehandelten Plasmaproben, Kontrollen und Standards wurden anschließend

mit Antiserum (Kaninchen-anti-N-Acyl-ADMA Antikörper) inkubiert. Die

Antikörper binden kompetitiv entweder an das freie Antigen der Proben, oder an

das gebundene Antigen, mit dem die Platten beschichtet sind. Die Inkubation

erfolgte über Nacht im Kühlschrank bei 4°C.

Am Folgetag wurde das Enzym-Konjugat (Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase)

hinzugefügt und der ELISA mittels Substratlösung (Tetramethylbenzidin)

entwickelt. Nach Inkubation über einen Zeitraum von 30 Minuten wurde die

Reaktion durch eine Stopplösung beendet und die Absorption bei einer

Wellenlänge von 450nm photometrisch gemessen.

Alle Proben wurden doppelt bestimmt und der Mittelwert berechnet. Der

Variationskoeffizient innerhalb des Assays lag bei 8.7%.

Bei den Tieren, die Ang II in der Dosis 3.0µg/kg/min erhielten, wurden die

ADMA-Spiegel zusätzlich zum ELISA auch mittels

Tandemmassenspektrometrie (LC-MS) bestimmt, und zwar vor und nach Ang

II-Gabe. Die Analyse erfolgte in Kollaboration mit Herrn Prof. Rainer Böger

(Institut für experimentelle und klinische Pharmakologie, Universitätsklinik

Hamburg-Eppendorf) nach der von Schwedhelm et al. beschriebenen Methode

(69).

5.12 Bestimmung der Aldosteronspiegel

Im Rahmen der Tötung der Mäuse wurde den Tieren u.a.

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) - Plasma zur Bestimmung der Plasma-

Aldosteronspiegel entnommen. Dies diente der Kontrolle, ob Ang II erfolgreich

infundiert wurde.

Die Bestimmung der Aldosteronspiegel erfolgte durch einen

Radioimmunoassay (RIA; Adaltis Italia S.p.A., Bologna, Italien, Handelsname

Aldosteron MAIA). Hierbei handelt es sich um einen kompetitiven Assay, bei

dem unmarkiertes, „kaltes“ Antigen der zu messenden Probe und radioaktiv

markiertes, „heißes“ Antigen (Tracer) um eine definierte Anzahl an

Antikörperbindungsstellen konkurrieren. Mittels eines magnetisch markierten

Sekundärantikörpers können gebundenes und ungebundenes Antigen getrennt

werden.

Nach Inkubation mit dem Tracer in einem Reagenzröhrchen und Zugabe des

magnetischen Antikörpers werden die Proben auf eine Magnetplatte gebracht.

Dann wird der Überstand dekantiert, während die Röhrchen noch auf der Platte

sind. Die Antigen-Antikörper-Komplexe verbleiben so im Röhrchen, das

ungebundene Antigen wird entfernt. Die Messung der Radioaktivität erfolgt über

eine Minute im Gammacounter (1261 Multigamma, LKB Wallac, Turku,

Finnland). Die counts per minute (cpm)-Werte der doppelt gemessenen

Ansätze wurden gemittelt.

Da der Assay kompetitiv ist, ist die gemessene Radioaktivität der Proben

umgekehrt proportional zum Aldosterongehalt der Probe. Alle gemessenen

Werte wurden auf den Nullstandard (B0) bezogen, der die höchste Radioaktiviät

aufwies, die mit 100% gleichgesetzt wurde. Die so normierten Werte der

mitgeführten Standards wurden anschließend gegen B0 logarithmisch

aufgetragen. Mittels dieser Standardkurve konnte den Messwerten der Proben

eine absolute Aldosteronkonzentration zugeordnet werden.

5.13 Bestimmung der mRNA-Expression mittels Real-Time RT-PCR

Aus den Polkappen der linken Niere von Mäusen, die PBS oder Ang II in der

Dosis 1.0µg/kg/min erhielten, wurde die mRNA-Expression verschiedener

Proteine mittels Real-Time RT-PCR bestimmt. Von den ADMA-generierenden

Enzymen wurde die Expression von PRMT1 und PRMT3 näher untersucht, von

den ADMA-abbauenden Enzymen die murine Expression von DDAH1 und

DDAH2. Des Weiteren wurde die Kollagen I mRNA Expression in der Niere

gemessen.

Die RNA-Extraktion erfolgte nach der Methode von Chomczynski (12). Hierbei

handelt es sich um ein 1-Schritt-Verfahren, welches nach dem Prinzip einer

Flüssigphasenseparation abläuft. Zunächst wird das Gewebe mechanisch

homogenisiert und mit TriFast-Reagenz (peqGOLD, Peqlab, Erlangen)

versetzt. Es bildet sich eine wässrige Phase, die die RNA enthält, welche

abpipettiert und weiter verarbeitet werden kann. Nach adäquater Verdünnung

der gewonnenen RNA mit RNAse freiem Wasser wird diese in copy DNA

(cDNA) transkribiert. Hierfür wird eine Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR)

durchgeführt, die ihrem Prinzip nach einer normalen PCR ähnelt, außer dass

der Master-Mix eine reverse Transkriptase enthält. Es wurden Kontrollen

sowohl ohne reverse Transkriptase als auch ohne RNA mitgeführt. Als Primer

dienten Random Hexamere, es wurde die Multiscribe Reverse Transcriptase

verwendet. Der Master-Mix (TaqMan Reverse Transcription Reagents, Applied

Biosystems by Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, USA) wurde

gemäß Herstellerangaben angesetzt, die Volumina wurden so gewählt, dass

sich ein Probenvolumen von 20µl ergab.

Zur Quantifizierung der so gewonnenen und adäquat verdünnten cDNA wurde

als nächstes die eigentliche Real-Time-PCR durchgeführt (je 40 Zyklen). Zur

Normierung der Ergebnisse wurde 18s ribosomale RNA (rRNA) als endogene

Kontrolle mitgeführt. Folgende Primer (MWG Biotech AG, Ebersberg) wurden

eingesetzt:

Tabelle 2. Primer für die Real-Time-PCR

Zum Primerdesign wurde die Software Primer Express (Version 2.0, Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet. Die Primersequenzen wurden

mit Hilfe des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) des National Center

for Biotechnical Information (NCBI) auf ihre Spezifität überprüft. Die DDAH1

Primer wurden spezifisch für die Maus-Isoform des Enzyms konzipiert, um eine

Kreuzreaktion mit dem humanen Transgen auszuschließen.

Zur Erzeugung des Fluoreszenzsignals wurde der SYBR-Green Master-Mix von

Applied Biosystems (Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, USA)

verwendet. Als Gerät diente das Sequence Detection System 7000 (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) mit ABI Prism 7000 SDS-Software (gleicher

Hersteller). Es wurden 96-Well Platten verwendet, alle Proben wurden doppelt

bestimmt. Durch anschließende Schmelzkurvenanalyse wurde die Spezifität

des SYBR-Green-Signals verifiziert.

Zur Berechnung der Ergebnisse wurde anhand mitgeführter Kalibratoren eine

Eichgerade erstellt, mittels der die cycle of threshold (ct)-Werte der Proben in

Kopienzahlen umgerechnet wurden. Die geschah sowohl für die 18s rRNA als

auch für die spezifischen mRNAs, um im Anschluss die Ergebnisse als relative

Kopienzahl bezogen auf 18s rRNA anzugeben.

5.14 Statistik

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS (Version

16.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Initial erfolgte eine Überprüfung aller

Variablen auf Normalverteilung mittels Kolmogorov-Smirnov Test.

Für die anschließende statistische Auswertung kam ein univariates, allgemein-

lineares Modell zum Einsatz, um Unterschiede zwischen den Genotypen und

Behandlungsgruppen zu ermitteln. Dafür wurden Genotyp (WT versus TG) und

Behandlungsgruppen (PBS versus Ang II 1.0µg/kg/min. versus Ang II

Gen Forward-Primer Reverse-PrimerDDAH1 CATGTCTTGCTGCACCGAAC GACCTTTGCGCTTTCTGGDDAH2 GGTTGATGGAGTGCGTAAAGC TCCACAATTCGGAGTCCCAAPRMT1 AATGGGATGAGCCTCCAGC TGCTTGGCCACAGGAAACTTPRMT3 TTACCCTGAGAACCACAAAGACG AGTACCCAGCAACTGCCGTGKollagen I TCACCTACAGCACCCTTGTGG CCCAAGTTCCGGTGTGACTC

3.0µg/kg/min.) als feste Faktoren gewählt, was für jeden der Faktoren einen

eigenen p-Wert zur Überprüfung der Nullhypothese lieferte. Bei multiplem

Testen (Behandlungseffekte) wurde ein Bonferroni-Test als Post-Hoc-Test

durchgeführt, um das Signifikanzniveau zu adjustieren.

Bei einem p-Wert von <0.05 wurde ein Ergebnis als statistisch signifikant

akzeptiert. Die Messwerte sind als Mittelwert ± SEM (Standardfehler des

Mittelwertes) angegeben.

Bei Box-plot Abbildungen repräsentiert der obere und untere Rahmen die 75.

bzw. 25. Perzentile, die horizontale Linie in der Box die 50. Perzentile, welche

dem Median entspricht.

Korrelationskoeffizienten zwischen zwei Variablen wurden mittels Pearson Test

berechnet. Die Konkordanz der beiden Meßmethoden für die ADMA-Analytik

(ELISA versus LC-MS) wurde mittels Bland-Altman Plot (Auftragen der

Differenz beider Meßmethoden gegen den gemeinsamen Mittelwert) sowie

durch Ermittelung des Konkordanz-Korrelationskoeffizienten nach Lin (39) wie

folgt berechnet:

Hierbei sind µx und µy die Mittelwerte beider Variablen, σ2x und σ2

y die

korrespondierenden Varianzen, und ρ der bivariate Korrelationskoeffizient

zwischen beiden Variablen.

ρc=

2ρσxσy

σ2x + σ2

y + (µ

x - µ

y)2

6 Ergebnisse

6.1 Tiere

Insgesamt verstarben 3 Tiere unter Ang II Behandlung vor Abschluss des

Versuchs. Hierbei handelte es sich um ein WT-Tier, welches mit Ang II in der

Dosierung 1.0µg/kg/min infundiert wurde, sowie zwei TG Mäuse aus der

Hochdosisgruppe (3.0µg/kg/min). Das WT Tier starb zwei Wochen nach

Pumpenimplantation, eine postmortale Obduktion ergab keinen eindeutigen

Hinweis auf die zugrunde liegende Todesursache. Die beiden TG Mäuse

verstarben vier bzw. sechs Tage nach Pumpenimplantation, die Autopsie zeigte

bei beiden Tieren einen Hämatothorax, als wahrscheinlichste Todesursache

kommt somit eine Aortendissektion in Betracht.

Bei den Kontrollmäusen (PBS-Infusion) kam es zu einem signifikanten Anstieg

des Körpergewichtes (korrigiert auf das Pumpengewicht) während der

vierwöchigen Behandlung, wohingegen bei den Ang II infundierten Tieren ein

signifikanter Gewichtsverlust auftrat (Tabelle 3).

Tabelle 3. Gewichtsverlauf unter Ang II Infusion

WT TG

PBSAng II

1.0µg/kg/min

Ang II 3.0µg/kg/

minPBS

Ang II 1.0µg/kg/mi

n

Ang II 3.0µg/kg/mi

n

Gewicht Tag 0 (g) 25.9 ±0.4

27.9 ±0.5

30.6 ±0.4 25.9±1.0 26.4±0.4 30.3±0.6

Gewicht Tag 28 (g) 28.3 ±0.3

26.0 ±0.6

28.2 ±0.6 27.0±0.7 25.9±0.6 28.0±0.7

∆Gewicht Tag 28-Tag 0 (g)

2.4 ±0.4*

-1.9 ±0.6*

-2.4 ±0.4‡ 1.2±0.4* -0.6±0.6 -2.3±0.6†

* p<0.05, † p<0.01, ‡ p<0.001

6.2 Effekte von Ang II auf Blutdruck und Herzfrequenz

Die mittels Schwanzplethysmographie ermittelten systolischen Blutdruckwerte

vor Pumpenimplantation waren zwischen den drei Behandlungsgruppen und

den beiden untersuchten Genotypen identisch. DDAH transgene Mäuse hatten

tendenziell niedrigere Blutdruckwerte, dieser Effekt war statistisch jedoch nicht

signifikant.

Die Infusion von Ang II führte bei allen behandelten Tieren zu einem raschen

und signifikanten Blutdruckanstieg (Abbildung 7). Das Blutdruckmaximum

wurde nach zwei Wochen erreicht, danach blieb der Blutdruck konstant. Der

Blutdruckanstieg war zwischen den Genotypen identisch, interessanterweise

zeigte sich kein additiver Effekt der höheren Ang II Dosierung auf den

Blutdruck, der mittlere systolische Blutdruckanstieg war in beiden Dosierungen

identisch und lag bei ca. 35-45mmHg (Abbildung 7). Bei Mäusen der

Kontrollgruppe (Infusion von PBS) blieb der Blutdruck über den

Beobachtungszeitraum von vier Wochen konstant.

In der bivariaten Korrelation nach Pearson ergab sich weder für den

Ausgangsblutdruck bzw. Endblutdruck noch für die Blutdruckdifferenz eine

Korrelation mit den ADMA-Plasmaspiegeln (Endblutdruck: r=0.02, p= nicht

signifikant (n.s.); Blutdruckdifferenz: r=-0.17, p=n.s.).

Die Infusion von Ang II führte zu einer Abnahme der Herzfrequenz. Dieser

Effekt war nach zwei Wochen statistisch signifikant (WT Mäuse, PBS vs. Ang II

1.0µg/kg/min vs. Ang II 3.0µg/kg/min: 646 ± 13 vs. 537 ± 15 vs. 530 ± 19

Schläge/min, p<0.001; TG Mäuse, PBS vs. Ang II 1.0µg/kg/min vs. Ang II

3.0µg/kg/min: 629 ± 15 vs. 574 ± 14 vs. 541 ± 31 Schläge/min, p<0.001).

Auch der Genotyp beeinflusste die Herzfrequenz. In einem allgemeinen

linearen Modell für Messwiederholungen mit den verschiedenen

Messzeitpunkten als Innersubjektfaktoren zeigte sich, dass der Einfluss des

Genotyp auf die Herzfrequenz signifikant war (p= 0.013).

Abbi

ldun

g 7.

Effe

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ruck

.

Metabolische Käfige

Die Urinausscheidung über 24 Stunden war vor der Pumpenimplantation

zwischen allen Behandlungsgruppen gleich, der Mittelwert lag bei den WT

Mäusen bei 46.6 ± 3.3µl/g/Tag, bei den TG Tieren bei 49.2 ± 4.2µl/g/Tag

(p=n.s.). Die Infusion von Ang II, nicht jedoch von PBS führte zu einem

signifikanten Anstieg der Diurese (Tabelle 4). Die Urinausscheidung lag bei den

mit Ang II behandelten Mäusen in etwa dreifach über der Menge der

Kontrolltiere und war zwischen beiden Ang II Dosierungen vergleichbar.

Unterschiede zwischen den Genotypen fanden sich nicht (Tabelle 4).

Neben einer Steigerung der Diurese führte die Ang II Gabe auch zu einer

signifikanten und vergleichbaren Zunahme der Proteinurie bei beiden

Genotypen.

6.3 Herzhypertrophie und vaskuläre Hypertrophie

Die Infusion von Ang II führte zu einer signifikanten Zunahme des auf die

Körpermasse normierten Herzgewichtes (Tabelle 4). Es zeigte sich dabei kein

dosisabhängiger Effekt von Ang II auf die Herzhypertrophie, des Weiteren

ergaben sich keinerlei Unterschiede zwischen den beiden Genotypen.

Eine analoge Konstellation ergab sich für das Wanddicken-Lumen-Verhältnis

der Aorta. Auch hier zeigte sich eine deutliche Hypertrophie der Gefäßwand

unter Ang II (Tabelle 4, Abbildung 8), wiederum ohne Dosis- bzw. Genotyp-

Effekt.

6.4 Plasma-Aldosteron-Spiegel unter Ang II-Infusion

Die mittels Radioimmunoassay ermittelten Plasma-Aldosteronspiegel waren bei

den mit Ang-II behandelten Tieren gegenüber den PBS-Tieren signifikant erhöht

(Tabelle 4). Hierbei fand sich ein klar dosisabhängiger Effekt von Ang II, der

Anstieg der Plasma-Aldosteronspiegel war zwischen beiden Genotypen

identisch.

Tabe

lle 4

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Ald

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und

AD

MA

-Pla

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pieg

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Ang

II.

Abbildung 8. Ang II und vaskuläre Hypertrophie an der Aorta (Beide

Abbildungen in 40-facher Vergrößerung).

6.5 ADMA-Plasmaspiegel unter Ang II-Infusion

Die gemessenen ADMA-Werte sind Abbildung 9 und Abbildung 10 zu

entnehmen. Die ADMA-Spiegel wurden mit ELISA und LC-MS gemessen,

wobei die Tandemmassenspektrometrie nur bei den Hochdosis-Tieren zur

Anwendung kam. DDAH transgene Mäuse hatten erwartungsgemäß

hochsignifikant niedrigere ADMA-Plasmaspiegel, dies galt für alle untersuchten

Gruppen sowohl vor als auch nach Ang II-Infusion. Der Mittelwert der ADMA

Plasmaspiegel (ELISA) aus allen drei Gruppen lag bei den WT Mäusen bei 0.95

± 0.04µM, bei den DDAH TG Mäusen bei 0.60 ± 0.03µM (WT vs. TG,

p<0.00001), der Effekt des Transgens auf die ADMA-Plasmaspiegel lag somit

bei ca. 37%.

Ein vergleichbarer Unterschied der ADMA-Spiegel von ca. 35% zeigte sich

auch mittels LC-MS in der Hochdosis Ang II Gruppe (WT vs. TG: 0.70 ± 0.06

vs. 0.46 ± 0.04µM, p=0.007). Demgegenüber waren die Werte für SDMA bzw.

L-Arginin zwischen beiden Genotypen identisch (SDMA: 0.17 ± 0.02 vs. 0.17 ±

0.01µM; L-Arginin: 66 ± 4 vs. 76 ± 7µM, p=n.s.).

Entgegen unserer Arbeitshypothese führte die Infusion von Ang II zu keiner

signifikanten Erhöhung der mittels ELISA am Ende der vierwöchigen

Behandlungsphase gemessenen ADMA-Spiegel gegenüber der Kontrollgruppe

(Abbildung 9). In der Hochdosisgruppe Ang II, in der ADMA sowohl mittels

ELISA als auch LC-MS sowohl vor als auch nach Behandlung gemessen

wurde, zeigte sich ebenfalls kein Effekt des Vasopressors auf die ADMA-

Plasmaspiegel (Abbildung 10). Lediglich mittels ELISA fand sich ein marginaler,

wenngleich signifikanter, Anstieg der ADMA-Spiegel im Vorher-Nachher

Vergleich (Abbildung 10). Dieser konnte mittels LC-MS jedoch nicht bestätigt

werden (Abbildung 10), zudem waren die Werte unter Ang II vergleichbar zu

denen der Kontrolltiere.

Die ADMA-Plasmaspiegel wiesen keine Korrelation mit den Aldosteronwerten

(r= -0.22, p=n.s.) auf.

Im direkten Methodenvergleich (ELISA versus LC-MS) zeigte sich eine

exzellente Korrelation der ADMA-Werte (r= 0.95, p<0.001, Abbildung 11),

wenngleich die Werte mittels LC-MS insgesamt niedriger ausfielen. Die mittlere

Differenz zwischen ELISA und LC-MS gemessenen ADMA-Spiegeln lag bei

0.12µM bzw. 17% (0.685 vs. 0.569µM, p=0.008). Im Bland-Altman Plot wurde

die Differenz aus beiden Meßmethoden (ELISA minus LC-MS) gegen den

gemeinsamen Mittelwert (ELISA + LC-MS / 2) aufgetragen. Hierbei lagen

nahezu alle Messwerte innerhalb der zweifachen Standardabweichung der

mittleren Differenz, was für eine hinreichende Übereinstimmung beider

Meßmethoden spricht (Abbildung 12).

Der Konkordanz-Korrelations-Koeffizient (CCC) lag bei 0.68, was einer starken

Konkordanz beider Meßmethoden entspricht (Tabelle 5).

Tabelle 5: Interpretation des Konkordanz-Korrelations-Koeffizienten (CCC),

nach (39).

CCC-Wert Konkordanzniveau<0,10 Keine Konkordanz

0.10-0.40 Schwach

0.41-0.60 Erheblich

0.61-0.80 Stark

0.81-1.00 Nahezu vollständig

Abbi

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I 3.

0µg/

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LC

-MS

)

Abbildung 11. Korrelation der ADMA-Werte mittels ELISA versus LC-MS

Abbildung 12. Konkordanz ELISA versus LC-MS (Bland-Altman Plot), SD =

Standardabweichung

6.6 Glomerulosklerose, interstitielle Fibrose und Inflammation

Das Ausmaß der Glomerulosklerose wurde an PAS gefärbten Schnitten der

Niere bestimmt. Unter Infusion von Ang II kam es zu einem signifikanten

Anstieg der Glomerulosklerose, wobei die Anzahl bzw. das Ausmaß der

geschädigten Glomeruli milde war (Abbildung 13a+c). Das Schädigungsmuster

der Niere war zwischen beiden untersuchten Genotypen identisch. Dieser

Befund konnte immunhistochemisch mittels Kollagen IV Färbung bestätigt

werden, hierbei zeigte sich nur in der Hochdosisgruppe ein signifikanter Anstieg

der Kollagen IV Expression in der Niere (WT: PBS vs. Ang II 1.0µg/kg/min vs.

Ang II 3.0µg/kg/min: 10.9 ± 0.8% vs. 11.2 ± 0.9% vs. 18.3 ± 0.8%; TG: PBS vs.

Ang II 1.0µg/kg/min vs. Ang II 3.0 µg/kg/min: 9.6 ± 0.5% vs. 9.6 ± 0.7% vs. 18.6

± 0.6%; p-Wert Behandlung: p<0.001, p-Wert Genotyp: p=n.s.).

Bei Kollagen I als Marker für die renale interstitielle Fibrose war eine

signifikante Erhöhung bei Behandlung mit Ang II festzustellen (Abbildung 13b).

Interessanterweise war das Ausmaß der interstitiellen Fibrose bei den DDAH

transgenen Mäusen signifikant geringer ausgeprägt (Abbildung 13b). Der

immunhistochemische Befund konnte mittels RT-PCR auch auf

transkriptioneller Ebene bestätigt werden. Hier zeigte sich eine verstärkte

mRNA-Expression für Kollagen I (siehe Tabelle 6).

Die F4/80-Färbung zur Makrophagendetektion zeigte ein perivaskuläres und

periglomeruläres Verteilungsmuster für diesen Marker, die Glomeruli blieben

weitestgehend ausgespart. Die Ang II Infusion war mit einer deutlichen

Makrophageninfiltration assoziiert, ein Unterschied zwischen den Genotypen

fand sich dabei nicht (Abbildung 14a-c).

Abbildung 13. Glomerulosklerose und interstitielle Fibrose, (Vergrößerung in

Abbildung 13c: 400-fach)

Abbildung 14. Makrophageninfiltration in der Niere (F4/80 Immunhistochemie);

(Vergrößerung in Abb. 14b 200fach, in Abb. 14c 400fach), HPF= high power

field

6.7 Oxidativer Stress

Der oxidative Stress in der Aorta wurde mittles DHE-Fluoreszenzmikroskopie

ermittelt. Die Gabe von Ang II führte zu einer Zunahme der DHE-Fluoreszenz

und damit des oxidativen Stress in der Aorta. Dieser Effekt war dosisabhängig

und zwischen den Genotypen signifikant verschieden. Bei DDAH transgenen

Mäusen führte die Infusion von Ang II zu signifikant weniger oxidativem Stress

(Abbildung 15a+b), d.h. die Überexpression des Enzyms schützte vor

vaskulärer Inflammation.

Abbildung 15. Oxidativer Stress in der Aorta unter Ang Ii, (Vergrößerung der

Abbildungen: 40-fach)

6.8 PRMT/DDAH mRNA Expression in der Niere

Mittels RT-PCR wurde die mRNA Expression ADMA generierender (PRMT1

und PRMT3) sowie ADMA abbauender Enzyme (DDAH1 und DDAH2) in der

Niere analysiert (Tabelle 6). Hierbei zeigte sich unter Ang II Infusion eine

Hochregulation der Expression von DDAH2 und PRMT1, während die

Expression der murinen DDAH1 und PRMT3 Expression unbeeinflusst blieb.

Die Expression von Kollagen I bestätigte den immunhistochemisch erhobenen

Befund einer verminderten renalen interstitiellen Fibrose bei Mäusen mit

Überexpression von DDAH.

Tabelle 6. Expression ADMA generierender und abbauender Enzyme

Diskussion

Die wichtigsten Ergebnisse dieser Dissertation lauten wie folgt. Die vierwöchige

Infusion von Ang II geht mit deutlicher Hypertonie und Endorganschädigung im

Mausmodell einher, führt jedoch zu keiner signifikanten Erhöhung der

systemischen ADMA-Plasmaspiegel. Die Überexpression des ADMA

abbauenden Enzyms DDAH1 schützt vor Ang II induzierter interstitieller Fibrose

in der Niere und vor vaskulärem oxidativem Stress.

Der fehlende Effekt der Ang II Infusionen auf die ADMA-Plasmaspiegel war für

uns überraschend und entsprach nicht unserer Arbeitshypothese. Die

Ergebnisse stehen somit in klarem Widerspruch zu Untersuchungen einer

japanischen Arbeitsgruppe, deren Daten zeitgleich mit den hier vorliegenden

veröffentlicht wurden (26).

In jener Studie wurde Ang II ebenfalls mittels osmotischer Minipumpen bei WT

und DDAH2 TG Mäusen infundiert. Die Autoren verwendeten dabei die gleiche

Dosierung (1.0µg/kg/min) wie sie bei einem Teil unserer Versuchstiere appliziert

wurde, die Infusionsdauer war mit zwei Wochen jedoch nur halb so lang. Im

Gegensatz zu unseren Ergebnissen führte die Ang II Infusion bei WT Mäusen

zu einer Verdoppelung der ADMA-Spiegel gegenüber Kontrolltieren, die eine

Kochsalzlösung infundiert bekamen (26). Der Anstieg der ADMA-Plasmaspiegel

war bei DDAH2 TG Mäusen nur halb so hoch wie bei den WT Tieren.

Wir fanden bei gleicher Dosierung von Ang II weder bei WT noch DDAH1 TG

Mäusen eine Änderung der ADMA-Plasmaspiegel. Lediglich unter

Hochdosisinfusion (3.0µg/kg/min) zeigte sich mittels ELISA ein marginaler

Anstieg der ADMA-Spiegel im Plasma. Hierbei handelte es sich aber nur um

einen Vergleich der ADMA-Spiegel vor und nach Applikation von Ang II, also

innerhalb der Behandlungsgruppe. Gegenüber den mit PBS behandelten

Kontrolltieren war kein Anstieg der ADMA-Plasmaspiegel nachweisbar. Zudem

ließ sich der im ELISA gemessene Anstieg nicht mittels

Tandemmassenspektrometrie (LC-MS), dem Goldstandard der ADMA-Analytik,

verifizieren. In jedem Falle steht der im ELISA gemessene Anstieg der ADMA-

Plasmaspiegel von 14% in klarem Kontrast zu dem von der japanischen

Arbeitsgruppe beobachteten Anstieg von 100%.

Eine schlüssige Erklärung für die diskrepanten Befunde gibt es nicht,

insbesondere bei den genetisch identischen WT Tieren (C57Bl/6J Hintergrund)

in beiden Studien sollten reproduzierbare Effekte von Ang II auf die ADMA-

Spiegel nachweisbar sein.

Einen möglichen Erklärungsansatz könnten die unterschiedlichen

Messmethoden darstellen. Während unsere Gruppe auf einen ELISA und die

LC-MS zurückgriff, verwendeten Hasegawa et al. die Hochdruck-

Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ohne anschließende

Massenspektrometrie zur Messung der ADMA-Spiegel (26).

Eine weitere Erklärung könnte die unterschiedliche Dauer der Ang II-Infusion in

beiden Arbeiten darstellen, da bei uns Ang II über vier Wochen infundiert

wurde, bei Hasegawa et al. dagegen nur zwei Wochen. Es wäre denkbar, dass

Ang II einen passageren Anstieg der ADMA-Spiegel provoziert, der nach zwei

Wochen nachweisbar ist, nach vier Wochen allerdings bereits wieder

abgeklungen ist. Als Ursache hierfür kämen beispielsweise gegenregulatorische

Genexpressionsmuster ADMA modulierender Enzyme in Frage, wie wir sie in

der RT-PCR messen konnten.

Wir halten die von uns erhobenen Befunde für valide und glaubhaft, da wir

durch diverse Maßnahmen mögliche Störgrößen kontrolliert haben. Die von uns

gewählten Gruppengrößen der mit Ang II behandelten Tiere lagen deutlich

höher als in der japanischen Arbeit, in der lediglich fünf Tiere je Gruppe

untersucht wurden, so dass eine höhere statistische Irrtumswahrscheinlichkeit

gegeben ist. Zudem haben wir den fehlenden Effekt von Ang II durch Gabe

einer höheren Dosis (3.0µg/kg/min) verifiziert und dabei sowohl ADMA-

Plasmaspiegel vor als auch nach Behandlung gemessen. Schlussendlich haben

wir dabei zwei unterschiedliche Meßmethoden zur ADMA-Analytik gewählt, die

letztlich keinen signifikanten Effekt von Ang II auf systemische ADMA-Spiegel

nachweisen konnten. Trotz leichter Differenzen beider Methoden, die am

ehesten auf der Präanalytik der Proben beruhen, zeigte sich eine gute

Konkordanz zwischen ELISA und LC-MS. Zudem ergab sich nahezu keine

Überlappung der ADMA-Werte zwischen WT und DDAH TG Mäusen, was die

Messgenauigkeit der Verfahren zusätzlich untermauert.

Ein technisches Versagen der Infusionspumpen erscheint sehr

unwahrscheinlich, da alle Ang II behandelten Tiere eine Hypertonie und

entsprechende Endorganschäden aufwiesen und zudem ein dosisabhängiger

Anstieg der Aldosteronspiegel im Blut zu verzeichnen war.

Trotz der eingangs erwähnten Diskrepanzen unserer Ergebnisse mit denen der

Gruppe von Hasegawa et al. (26), gab es auch zahlreiche Gemeinsamkeiten. In

beiden Arbeiten wurde mittels Schwanzplethysmographie unabhängig vom

Genotyp ein vergleichbarer Anstieg der Blutdruckwerte unter Ang II Infusion

gemessen, der den Erwartungen an dieses Hypertoniemodell entsprach.

Während die DDAH-Überexpression im Ang II Hypertoniemodell keinen Schutz

vor Glomerulosklerose, renaler Makrophageninfiltration und vaskulärer

Hypertrophie bot, konnte ein Effekt auf den oxidativen Stress in der Aortenwand

sowie auf die renale interstitielle Fibrose nachgewiesen werden. Die

letztgenannten Befunde decken sich mit den Ergebnissen von Hasegawa et al.,

die bei DDAH2 transgenen Mäusen unter Ang II ebenfalls einen verminderten

oxidativen Stress und eine geringere perivaskuläre Fibrose beschrieben (26).

Eine Abnahme der interstitiellen Fibrose in der Niere durch DDAH wurde zudem

auch in einem subtotalen Nephrektomiemodell der Ratte beobachtet (44). Hier

führte die Überexpression von DDAH1 mittels eines adenoviralen Vektors

neben einer verminderten Fibrose auch zu einer Abnahme der

Kapillarrarefizierung und somit zu einer verbesserten Organprotektion (44). Die

Überexpression von DDAH ging dabei mit einer verminderten Expression des

Fibrosemarkers TGF-β (transforming growth factor β) einher. Gleiche Effekte

wurden von den Autoren auch in einem Diabetesmodell der Ratte beschrieben

(70).

Im Gegensatz dazu waren im vorliegenden Hypertoniemodell die signifikant

niedrigeren ADMA-Spiegel der DDAH1 TG Mäuse nicht protektiv im Hinblick auf

die hypertensiven Endorganschäden an Niere und Gefäßen

(Glomerulosklerose, renale Inflammation, vaskuläre Hypertrophie). In diesem

Zusammenhang ist es erstaunlich, dass die von Hasegawa et al. untersuchten

DDAH2 TG Tiere unter Ang II Infusionen signifikant weniger Schäden an den

Koronargefäßen - gemessen an Wandverdickung und perivaskulärer Fibrose -

im Vergleich zu WT Mäusen aufwiesen (26).

Aufschluss über diesen scheinbaren Widerspruch könnte eine wegweisende

Arbeit von Wang et al. geben (85). Diese Arbeitsgruppe untersuchte Ratten, bei

denen mittels RNA-Interferenz ein selektiver Knockdown von DDAH1 bzw.

DDAH2 induziert wurde (85). Die Autoren beobachteten, dass DDAH2

vorrangig in der Gefäßwand exprimiert wird und dort vermutlich über die lokalen

ADMA-Spiegel die NO-vermittelte Vasodilatation reguliert, während die

systemischen ADMA-Spiegel maßgeblich von der Aktivität der DDAH1

beeinflusst werden, welche vorwiegend in Leber und Nierenkortex exprimiert

wird. Hieraus lässt sich für die vorliegende Arbeit ableiten, dass für die

hypertensiven Gefäßschäden ebenfalls die lokalen, durch DDAH2 modulierten

ADMA-Spiegel von Bedeutung sind, die von DDAH1 regulierten systemischen

ADMA-Spiegel in der Pathophysiologie dagegen eine untergeordnete Rolle zu

spielen scheinen. Der Befund von Wang et al. erklärt ferner, warum die ADMA-

Plasmaspiegel, die vornehmlich durch die Aktivität bzw. Expression von DDAH1

reguliert werden, durch Überexpression der DDAH2 in Mäusen nur um etwa

25% gesenkt werden, während der Effekt bei DDAH1 TG Mäusen bei ca. 40-

50% liegt (16, 26). Eine Limitation unserer Arbeit wie auch der Studien von

Hasegawa et al. und Wang et al. (26, 85) stellt die Tatsache dar, dass ADMA

nur im Plasma nicht jedoch im Gewebe bzw. Organen gemessen wurde.

Allgemein muss festgehalten werden, dass aufgrund der unterschiedlichen

ADMA-Analytik ein direkter Vergleich mit Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen

generell schwierig ist. In der Literatur finden sich bei Verwendung der am

breitesten zum Einsatz kommenden HPLC als Meßmethode stark schwankende

ADMA-Werte in vergleichbaren, gesunden Kontrollkollektiven. Dies hat zur

Folge, dass es bis dato keine validierten bzw. verbindlichen Normwerte für

ADMA gibt. Exemplarisch sei hier auf eine Publikation hingewiesen, in der

zunächst die Streuung der ADMA-Werte in der Literatur näher beleuchtet wird

und die im Folgenden den Versuch unternimmt, Normwerte für Gesunde zu

ermitteln (46). Eine Zusammenstellung publizierter ADMA-Werte an gesunden

Kontrollkollektiven aus zwölf klinischen Studien zeigt dabei eine Streuung der

ADMA-Spiegel zwischen 0.12-2.77µM. Da in zahlreichen klinischen Studien

bereits leichte Anstiege von ADMA im Bereich von 0.2-0.5µM mit erhöhter

Morbidität und Mortalität assoziiert sind (47, 67), ist diese Variabilität nicht

hinnehmbar und unterstreicht die Wichtigkeit der Analytik dieses im

mikromolaren Bereich anzutreffenden Moleküls.

Zur Etablierung von Normwerten für die HPLC-Methode untersuchten Meinitzer

et al. in der Folge ein Kollektiv von 292 Männern im Alter von 20-75 Jahren. Der

Median der ADMA-Werte variierte je nach Altersquartile zwischen 0.58-0.64µM

und stieg somit nur marginal im Alter an (46). Normwerte für Nierengesunde

dürften somit im Bereich von 0.5µM liegen.

Die von Meinitzer et al. monierte Streuung der ADMA-Werte in der Literatur

findet sich auch bei Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion, bei denen

ADMA akkumuliert. Eine systematische Analyse aller publizierten Daten zu

diesem Thema, in welche 17 Studien eingeschlossenen wurden, ergab

Mittelwerte zwischen 0.36-1.40µM bei nierengesunden Kontrollpersonen bzw.

0.46-4.20µM bei Patienten mit chronischer, nicht dialysepflichtiger

Niereninsuffizienz (30). Hieraus ergibt sich eine deutliche Überlappung der

Werte nierengesunder und nierenkranker Populationen. Aufgrund dieser

Streubreite hat die routinemäßige Bestimmung von ADMA trotz zahlreicher, viel

versprechender epidemiologischer Studien bis dato keinen Eingang in die Klinik

gefunden.

Ob tatsächlich ein Zusammenhang zwischen Ang II und ADMA besteht, ist

anhand bisher vorliegender Daten zu diesem Thema nicht klar ersichtlich. Da

Ang II zu einer endothelialen Dysfunktion mit verminderter Bioverfügbarkeit von

NO führt, liegt die Vermutung nahe, dass ein Anstieg des endogenen NOS

Inhibitors ADMA eine entscheidende pathophysiologische Rolle spielen könnte.

Bis heute gibt es hierzu nur wenig veröffentlichte Daten.

In-vitro führt die Inkubation von Nabelschnurendothelzellen mit Ang II zu einem

Anstieg der ADMA-Spiegel im Kulturmedium (11). Parallel beobachteten die

Autoren dabei eine Abnahme der DDAH-Aktivität in den Zellen. Abgesehen von

der Tatsache, dass es sich hierbei um einen in-vitro Befund handelt, wurden die

Zellen mit supraphysiologischen Konzentrationen von Ang II inkubiert (1µM).

Auch die DDAH-Aktivitätsmessung erfolgte unter supraphysiologischer

Inkubation mit exogen zugeführtem ADMA (500µM), so dass diese Befunde

nicht ohne weiteres auf in-vivo Bedingungen übertragbar sind (11). Interessant

an dieser Veröffentlichung ist jedoch, dass die Inkubation mit Ang II und ADMA

mit einer Erhöhung freier Sauerstoffradikale im Medium einherging (11), was an

den von uns erhobenen Befund eines vermehrten oxidativen Stress unter Ang II

Infusion erinnert.

An dieser Stelle soll auch die Möglichkeit erwähnt werden, dass eine

umgekehrte Abhängigkeit nicht ausgeschlossen werden kann, d.h. dass ADMA

seinerseits die Ang II Spiegel bzw. das RAS beeinflusst. Das vorliegende

Tierexperiment eignete sich nicht zur Überprüfung dieser Hypothese, allerdings

existiert eine Publikation, in der die Infusion von ADMA bei eNOS-defizienten

Mäusen zu einer gesteigerten Expression des Angiotensin-Converting-Enzyms

(ACE) führte (72).

Abgesehen von der Arbeit von Hasegawa et al. gibt es bisher keine weiteren in-

vivo Experimente, die den Zusammenhang zwischen Ang II induzierter

Hypertonie und ADMA näher untersucht haben. In der vorliegenden in-vivo

Studie fanden wir keinen Zusammenhang zwischen Hypertonie und ADMA-

Plasmaspiegeln.

Dies steht in Widerspruch zu klinischen Studien, die eine Assoziation zwischen

Bluthochdruck und ADMA zeigen konnten (15, 29, 62, 73). Hierbei handelt es

sich jedoch um Studien mit sehr kleinen Fallzahlen. In prospektiven

Kohortenstudien an weit mehr als tausend Patienten konnte diese Assoziation

hingegen nicht bestätigt werden (47, 67). Unterstützt werden die Befunde einer

fehlenden Assoziation von Blutdruck und ADMA-Plasmaspiegeln zudem durch

Ergebnisse einer kleineren Studie (n=67 Patienten), in der 24h-

Langzeitblutdruckmessungen durchgeführt wurden (60). Auch hier fand sich

keine Assoziation zwischen ADMA und Blutdruck. Zum Teil können die

diskrepanten Befunde auf die bereits diskutierte unterschiedliche ADMA-

Analytik zurückgeführt werden. Damit muss eine abschließende Bewertung zu

dieser Thematik abgewartet werden, die Evidenz für eine enge Assoziation

zwischen Bluthochdruck und ADMA-Plasmaspiegeln ist zum jetzigen Zeitpunkt

nicht überzeugend.

Ebenfalls ungeklärt ist, inwiefern das Renin-Angiotensin-System bzw. eine

Blockade desselbigen ADMA-Spiegel beim Menschen moduliert.

Hier wurde insbesondere der Effekt einer RAS-Blockade mittels Inhibitoren des

Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE-Hemmer) bzw. Angiotensin-

Rezeptorblockern (AT1-Blocker) näher untersucht. In einer kleinen, doppel-blind

randomisierten cross-over Studie an n=20 Hypertonikern untersuchten Delles et

al. den Effekt einer einwöchigen Gabe des ACE-Hemmers Enalapril (20mg/Tag)

oder des AT1-Blockers Eprosartan (600mg/Tag) bzw. einer Kombination beider

Medikamente (Enalapril 10mg/Tag + Eprosartan 300mg/Tag) auf die ADMA-

Plasmaspiegel (18). In einer vierten Phase wurden die Patienten mit einem

Plazebo behandelt (Kontrolle). Zwischen den jeweiligen Behandlungsphasen

erfolgte eine zweiwöchige Auswaschphase der Medikamente. In der

Plazebophase lagen die ADMA-Spiegel bei 1.69µM, unter Enalapril

Monotherapie bei 1.41µM, unter Eprosartan Monotherapie bei 1.42µM und in

der Kombination bei 1.38µM. Die Reduktion der Plasmaspiegel war dabei

blutdruckunabhängig (18). Ähnliche Befunde wurden bei Hypertonikern von

anderen Autoren beschrieben (29, 54).

Eine Reduktion von ADMA durch RAS-Blockade wurde auch bei Patienten mit

dialysepflichtiger Niereninsuffizienz (4), bei Syndrom X (10) und Diabetes

mellitus Typ II (28) gefunden. Bei den genannten Studien, die eine Reduktion

von ADMA unter RAS-Blockade fanden, ist kritisch anzumerken, dass es sich

um kleine Fallzahlen handelt. Zudem zeigt sich auch hier eine hohe Variabilität

der publizierten ADMA-Werte.

Prospektive Studien mit größeren Fallzahlen, in denen ADMA mittels moderner

Analytik gemessen wurde, konnten eine Beeinflussung der ADMA-

Plasmaspiegel durch RAS-Blockade indes nicht bestätigen (20, 22, 87).

Trotz fehlenden Effekts von Ang II auf die systemischen ADMA-Plasmaspiegel

sahen wir in unserem Experiment einen vom Genotyp unabhängigen Anstieg

der mRNA Expression von PRMT1 und DDAH2 unter Ang II-Infusion in der

Niere. Dieser Sachverhalt könnte einen Grund für das Ausbleiben eines ADMA-

Anstiegs darstellen, da eine gesteigerte ADMA-Produktion durch PRMT1 durch

einen vermehrten Abbau über DDAH2 kompensiert werden könnte, so dass

sich zwar der ADMA-Umsatz erhöht, nicht aber die resultierenden

Serumspiegel. Einschränkend muss jedoch hinzugefügt werden, dass das

genannte Expressionsmuster nicht auf Proteinebene verifiziert wurde.

Es existieren bereits andere Studien, die die Expression von DDAH und PRMT

unter pathophysiologischen Bedingungen untersucht haben, und deren Befunde

den hier erhobenen ähneln. In einem Diabetesmodell der Ratte, welches mit

erhöhten Ang II und ADMA-Spiegeln einhergeht, führte die Gabe des AT1-

Blockers Telmisartan zu einer Herabregulation der Proteinexpression von

DDAH2 und PRMT1 in der Niere, d.h. die RAS-Blockade lieferte ein gegenüber

unseren Versuchen spiegelbildliches Expressionsmuster (57). In einem

Salzmodell der Ratte führte die Kochsalzrestriktion zu einer Aktivierung des

RAS und einer vermehrten DDAH-Expression in der Niere. Letztere erfolgte

Ang II abhängig und konnte durch einen AT1-Blocker gehemmt werden (77).

Ähnliche Beobachtungen wurden bei Ratten unter kochsalzreicher Diät mit Ang

II Infusion gemacht (77). Die von uns und anderen erhobenen Befunde einer

Änderung der Expression einzelner DDAH- und PRMT-Isoenzyme durch

Modulation des RAS bedürfen jedoch weiterer experimenteller Studien.

Interessanterweise beobachteten wir in unseren Versuchen, dass die

Überexpression von DDAH mit einem verminderten vaskulären oxidativen

Stress in der Aorta unter Ang II einherging. Ang II vermag eine gefäßständige

NADH/NADPH-Oxidase zu aktivieren, was zu einer verstärkten Produktion

freier Sauerstoffradikale (•O2-) führt. Dies erklärt den erhöhten vaskulären

oxidativen Stress bei Ang II induzierten Schädigungsmodellen (65). Ferner führt

Ang II über Sauerstoffradikale zu einer Herabregulation der

Dihydrofolatreduktase, was zu einer Abnahme der Konzentration von

Tetrahydrobiopterin führt, welches als Co-Substrat für die eNOS dient (9). Fehlt

der eNOS das Cosubstrat, überträgt sie Elektronen nicht auf ihr eigentliches

Substrat Arginin, sondern auf molekularen Sauerstoff, d.h. eNOS produziert nun

selbst Sauerstoffradikale. Dieses Phänomen wird als Entkopplung der NOS

(NOS-uncoupling) bezeichnet (9). Der Vorgang wird offenbar durch ADMA

begünstigt, welches ebenfalls eine Entkopplung der NOS zu induzieren vermag,

indem es das Substrat Arginin vom aktiven Zentrum der NOS verdrängt und zu

einem funktionellen Substratmangel führt (74). Vor diesem Hintergrund

erscheint unser Befund plausibel, dass DDAH1 TG Tiere aufgrund ihrer

niedrigeren ADMA-Spiegel weniger anfällig für oxidativen Stress durch Ang II

sind.

Als weiterer Erklärungsansatz könnte die Tatsache dienen, dass die DDAH ein

redox-sensitives Enzym ist, d.h. in ihrer Aktivität durch oxidativen Stress

gedämpft wird. Für die katalytische Aktivität der DDAH sind drei Aminosäuren

(Cystein, Aspartat und Histidin) im aktiven Zentrum des Enzyms verantwortlich

(36). Von diesen ist offenbar Cystein entscheidend, sowohl für die Katalyse als

auch für die Redoxsensitiviät (36, 37, 52). Präziser ausgedrückt wird davon

ausgegangen, dass eine Oxidation der Sulfhydrylgruppe durch

Sauerstoffradikale die DDAH-Aktivität vermindert.

Abschließend stellt sich die Frage, warum in unserer Studie offenbar die

niedrigeren ADMA-Spiegel der TG Tiere einen positiven Effekt auf den

oxidativen Stress haben konnten, wenn doch die Spiegel, die wir bei den WT

Tieren vor und nach Ang II messen konnten, weitestgehend normal waren

(<1.0µM). Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch diese „normalen“

ADMA-Spiegel zur Pathogenese von Gefäßschäden beitragen, wenn andere

Noxen, wie in diesem Fall ein Ang II induzierter Hypertonus, hinzukommen.

Unter diesen Umständen mögen physiologische ADMA-Spiegel relativ zu hoch

sein, man könnte hier von einer permissiven Rolle von ADMA für

Gefäßschäden sprechen.

Zusammenfassend zeigen unsere Befunde, dass die Infusion von Ang II in

pathophysiologisch relevanten Konzentrationen zu keiner Beeinflussung der

systemischen ADMA-Plasmaspiegel führt. Die Überexpression des ADMA-

abbauenden Enzyms DDAH schützte jedoch vor Ang II induzierter interstitieller

Fibrose im Nierenstromgebiet und vor vaskulärem oxidativen Stress in der

Aorta.

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Abkürzungsverzeichnis

ACE-Hemmer Angiotensin Converting Enzyme-HemmerADMA Asymmetrisches Dimethylarginin; Synonym:

NG,NG-Dimethyl-L-ArgininAng II Angiotensin IIARB Angiotensin II-RezeptorblockerAT1-Blocker Angiotensin II-RezeptorblockerBAECs bovine aortale EndothelzellenBLAST Basic Local Alignment Search Toolbp BasenpaareBTE Biotechnologisches EntwicklungslaborCCC Konkordanz-Korrelations-KoeffizientcDNA copy DNAcGMP zyklisches Guanosinmonophosphatcpm counts per minuteCSE-Hemmer Cholesterinsyntheseenzymhemmerct cycle of thresholdDDAH Dimethylarginin-DimethylaminohydrolaseDHE DihydroethidiumDNA DesoxyribonukleinsäureEDRF endothelium derived relaxing factorEDTA EthylendiamintetraessigsäureELISA enzyme linked immunosorbent assayeNOS endotheliale NO-SynthaseFITC FloureszeinisothiocyanathnRNPs heterogeneous nuclear ribonucleoproteinsHPF high power fieldHPLC Hochdruck-FlüssigkeitschromatographieHUVECs humane NabelschnurendothelzelleniNOS induzierbare NO-SynthaseKHK koronare HerzkrankheitKm Michaelis-Menten KonstanteLC-MS TandemmassenspektrometrieL-NMMA NG-Monomethyl-L-ArgininMC MethylcarnoymRNA messenger RNAn.s. nicht signifikantNCBI National Center for Biotechnical InformationnNOS neuronale NO-SynthaseNO StickstoffmonoxidNOS NO-SynthasePAS-Färbung Perjodsäure-Leukofuchsin-FärbungpAVK periphere arterielle VerschlusskrankheitPBS Phosphat-gepufferte KochsalzlösungPCR Polymerase-KettenreaktionPRMT Protein-Arginin-N-Methyltransferase

r Korrelationskoeffizient RAS Renin-Angiotensin-SystemRIA RadioimmunoassayRNA RibonukleinsäurerRNA ribosomale RNART-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-

KettenreaktionSAH S-Adenosyl-HomozysteinSAM S-Adenosyl-MethioninSD StandardabweichungSDMA NG,NG`-Dimethyl-L-Arginin; Synonym:

Symmetrisches DimethylargininSEM Standardfehler des MittelwertesSH- Sulfhydryl-TG TransgenTGF-β transforming growth factor βTMB TetramethylbenzidinWT Wildtyp

Danksagungen

Herrn PD Dr. med. Johannes Jacobi danke ich für die vielen Hilfestellungen und

die hervorragende und unkomplizierte Betreuung bei allen Aspekten der

Doktorarbeit.

Ich möchte mich bei Herrn Prof. Dr. med. Karl F. Hilgers für die Überlassung

des Themas und die Unterstützung bei der Planung und Durchführung der

Arbeit bedanken.

Frau Michaela Arend danke ich für die äußerst kompetente Unterstützung bei

der Durchführung der Arbeiten im Labor.

Danken möchte ich ferner Frau Dr. Nada Cordasic für die Hilfe bei den

operativen Eingriffen und den weiteren Teammitgliedern der AG Hilgers für die

Unterstützung bei diversen Aufgaben im Rahmen der Labortätigkeiten.

Für die Tätigkeit als Korreferent möchte ich mich bei Prof. Dr. med. Renke

Maas bedanken.

Herrn Prof. Dr. med K.-U. Eckardt danke ich für die Arbeitsmöglichkeit in den

Laboreinrichtungen der Medizinischen Klinik IV sowie für die Möglichkeit der

Teilnahme an Doktorandenseminaren.

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