Die prognostische Aussagefähigkeit von Rad51, Ki-67, uPA und PAI … · 2015-05-11 · KI...

Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. K. Diedrich

in Kooperation mit dem

Institut für Pathologie

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. A. C. Feller

Die prognostische Aussagefähigkeit von Rad51, Ki-67, uPA und

PAI-1 für das Mammakarzinom

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Universität zu Lübeck

- Aus der Medizinischen Fakultät -

vorgelegt von

Stefanie Schierholz

aus Lüneburg

Lübeck 2010

1. Berichterstatter/in: Priv.- Doz. Dr. med. Dorothea Fischer

2. Berichterstatter/in: Priv.-Doz. Dr. med. Jens Habermann PhD

Tag der mündlichen Prüfung: 27.07.2011

zum Druck genehmigt. Lübeck, den 27.07.2011

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen ................................................... IV

Abbildungen ............................................................................................................................... IV

Tabellen....................................................................................................................................... V

Abkürzungsverzeichnis .................................................................................. VII

1. Einleitung ...........................................................................1

1.1 Epidemiologie .............................................................................................. 1

1.2 Diagnose, Prognose und Therapie des Mammakarzinoms ..................... 1

1.2.1 Prognostische Parameter .................................................................................................. 2

1.2.2 Prädiktive Parameter.......................................................................................................... 3

1.2.3 Risikoadaptierte Therapie .................................................................................................. 4

1.2.4 Therapiegrundsätze .......................................................................................................... 5

1.3 Serinproteasen ............................................................................................ 8

1.4 Rad51 ............................................................................................................ 9

1.5 Ki-67 ............................................................................................................ 11

1.6 Zielsetzung ................................................................................................. 13

2. Material und Methodik ....................................................14

2.1 Gutachten der Ethikkommission ............................................................. 14

2.2 Verbrauchsmaterialien mit Bezugsquelle ............................................... 14

2.3 Charakterisierung der verwendeten Antikörper ..................................... 16

2.4 Herstellung der Lösungen und Puffer ..................................................... 17

2.5 Untersuchungsgut ..................................................................................... 19

2.5.1 Material ............................................................................................................................ 19

2.5.1 Aufbereitung der Gewebeschnitte .................................................................................... 20

2.5.2 Vorbehandlung der Gewebeschnitte ................................................................................ 20

2.5.3 Färbeprotokolle ................................................................................................................ 20

2.5.4 Kontrollen ......................................................................................................................... 26

2.5.5 Auswertung der gefärbten Präparate ............................................................................... 26

2.6 Statistische Analyse.................................................................................. 30

3. Ergebnisse .......................................................................31

3.1 Patientinnenkollektiv ................................................................................. 31

3.2 Klinische und histopathologische Parameter ......................................... 32

Inhaltsverzeichnis

II

3.3 Durchgeführte Therapien .......................................................................... 36

3.3.1 Operative Therapie .......................................................................................................... 36

3.3.2 Radiatio im Zusammenhang mit operativer Therapie ...................................................... 36

3.3.3 Endokrine Therapie .......................................................................................................... 36

3.3.4 Chemotherapie ................................................................................................................. 37

3.4 Immunhistochemische Färbungen der Parameter ................................. 38

3.4.1 Rad51 ............................................................................................................................... 38

3.4.2 Ki-67 ................................................................................................................................. 41

3.4.3 Uroplasminogenaktivator (uPA) ....................................................................................... 43

3.4.4 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) ....................................................................... 43

3.5 Rezidiv- und metastasenfreies Überleben .............................................. 44

3.5.1 Rezidivfreies Überleben im Gesamtkollektiv ................................................................... 44

3.5.2 Metastasenfreies Überleben im Gesamtkollektiv ............................................................. 49

3.5.3 Subgruppenanalyse der nodalnegativen Patientinnen .................................................... 52

3.5.4 Chi-Quadrattest nach Pearson für die Parameter Rad51, Ki-67, uPA und PAI-1 ........... 54

3.6 Die Therapien der einzelnen Untergruppen für Rad51 und Ki-67 ......... 59

4. Diskussion .......................................................................60

4.1 Patientinnenkollektiv ................................................................................. 60

4.1.1 Das Alter der Patientinnen ............................................................................................... 60

4.1.2 Histologischer Typ ............................................................................................................ 60

4.1.3 Primärtumorgröße ............................................................................................................ 60

4.1.4 Nodalstatus ...................................................................................................................... 61

4.1.5 Histologisches Grading .................................................................................................... 62

4.1.6 Hormonrezeptorstatus...................................................................................................... 62

4.1.7 Tumorprogredienz ............................................................................................................ 63

4.2 Färbeverfahren .......................................................................................... 64

4.3 Analyse der Studienergebnisse ............................................................... 66

4.3.1 DNA-Reparatur ................................................................................................................ 68

4.3.2 Das biologische Modell von Rad51 .................................................................................. 69

4.3.3 Rad51 – seine übergeordnete Regulation ....................................................................... 70

4.3.4 Rad51 als Prognoseparameter ........................................................................................ 71

4.3.5 Rad51 – Ergebnisse der Arbeitsgruppe im Vergleich ...................................................... 73

4.3.6 Rad51 und Ki-67 - prognostische Aussagekraft .............................................................. 74

4.3.7 PAI-1, uPA und Rad51 - prognostische Aussagekraft ..................................................... 75

4.3.8 PAI-1 und uPA im Zusammenhang mit dem nodalnegativen Kollektiv ........................... 76

4.4 Ausblick ..................................................................................................... 76

5. Zusammenfassung .........................................................78

Inhaltsverzeichnis

III

6. Literaturverzeichnis ........................................................80

7. Anhang .............................................................................97

7.1 TNM Klassifikation .................................................................................... 97

8. Danksagung ...................................................................100

9. Lebenslauf .....................................................................101

Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen

IV


Abbildungen Abb. 1: Altersverteilung der Mammakarzinomtodesfälle 2004 in Deutschland. ...... 1

Abb. 2: Schematisch vereinfachte Darstellung des Plasminogenaktivators (uPA),

seines Rezeptors (uPAR) sowie eines seiner Inhibitoren PAI-1. ...................... 9

Abb. 3: Vereinfacht dargestellt ist die homologe Rekombination als mögliche

Zellantwort auf einen DNA-Doppelstrangbruch mit ihrem wesentlichen

Bestandteil Rad51. ......................................................................................... 10

Abb. 4: Schematische Darstellung der Färbeschritte zu Protokoll I ...................... 24

Abb. 5: Referenzabbildungen für die Färbungen mit Rad51 und Ki-67 ................ 27

Abb. 6: Altersverteilung des Studienkollektivs bei Diagnosestellung .................... 31

Abb. 7: Nachbeobachtungszeitraum des Gesamtkollektivs .................................. 32

Abb. 8: Hormonrezeptorstatus im Zusammenhang mit der endokrinen Therapie 37

Abb. 9: Chemotherapieformen des Patientinnenkollektivs ................................... 37

Abb. 10: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit niedriger Rad51

Expression ...................................................................................................... 39

Abb. 11: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit höherer Rad51

Expression ...................................................................................................... 39

Abb. 12: Rad51 Expression im Studienkollektiv.....................................................38

Abb. 13: Graphische Darstellung zum Schwellenwert von Rad51........................ 40

Abb. 14: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit niedriger Ki-67

Expression ...................................................................................................... 41

Abb. 15: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit höherer Ki-67

Expression ...................................................................................................... 42

Abb. 16: Ki-67 Expression im Studienkollektiv ..................................................... 42

Abb. 17: Graphische Darstellung zum Schwellenwert von Ki-67 .......................... 43

Abb. 18: Kaplan-Meier-Kurven des rezidivfreien Überlebens der signifikanten

Parameter ....................................................................................................... 47

Abb. 19: Kaplan-Meier-Kurven des metastasenfreien Überlebens der signifikanten

Parameter ....................................................................................................... 51


V

Tabellen Tab. 1: Aussagefähigkeit von pathologischen Prognoseparametern beim

Mammakarzinom. ............................................................................................. 3

Tab. 2: Aussagefähigkeit von prädiktiven Parametern beim Mammakarzinom. ..... 4

Tab. 3: Risikogruppen nach St. Gallen 2007. ......................................................... 5

Tab. 4: Standardchemotherapieschemata CMF und EC. ....................................... 7

Tab. 5: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll I. .................................... 20

Tab. 6: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll II. ................................... 20

Tab. 7: Semiquantitative Kategorieeinteilung und repräsentative Abbildungen von

uPA und PAI-1. ............................................................................................... 28

Tab. 8: Immunhistochemische Klassifikation der Her-2 Expression ..................... 29

Tab. 9: Immunreaktiver Score nach Remmele und Stegner ................................. 34

Tab. 10: Übersicht über die histopathologischen Parameter des Studienkollektives

....................................................................................................................... 35

Tab. 11: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf

das rezidivfreie Überleben .............................................................................. 45

Tab. 12: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen

auf das rezidivfreie Überleben ........................................................................ 48


das metastasenfreie Überleben ...................................................................... 49

Tab. 14: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen

auf das metastasenfreie Überleben ................................................................ 51


das rezidivfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen.......................... 52

Tab. 16: Statistische Analyse (univariat) bezogen auf das metastasenfreie

Überleben der nodalnegativen Patientinnen................................................... 53

Tab. 17: Statistische Analyse (multivariat) bezogen auf das rezidiv- und

metastasenfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen. ....................... 54

Tab. 18: Chi-Quadrattest nach Pearson: Rad51. ................................................. 55

Tab. 19: Chi-Quadrattest nach Pearson: Ki-67..................................................... 57

Tab. 20: Kreuztabelle von uPA mit PAI-1. ............................................................ 58

Tab. 21: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Rad51-

Subklassen ..................................................................................................... 59


VI

Tab. 22: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Ki-67-

Subklassen ..................................................................................................... 59

Tab. 23: Literaturübersicht: Anteil nodalnegativer Patientinnen ........................... 61

Tab. 24: Histologisches Grading in verschiedenen Mammakarzinomkollektiven . 62

Tab. 25: Prozentualer Anteil hormonrezeptorpositiver Tumore ............................ 62

Tab. 26: Anteil der Patientinnen mit Rezidiv oder Fernmetastasierung im

medianen Nachbeobachtungszeitraum. ......................................................... 63

Tab. 27: Qualitätskriterien für Prognoseparameter. .............................................. 66

Tab. 28: Überblick der prognostischen Faktoren des Mammakarzinoms mit

entsprechendem Evidenzlevel ........................................................................ 67

Tab. 29: Beispielhaft ausgewählte Studien verschiedener Autoren zur

prognostischen Aussagefähigkeit des Proliferationsmarkers Ki-67 ................ 75

Tab. 30: pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms zum Diagnosezeitpunkt .... 97

Tab. 31: aktuelle pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms ............................. 99

Abkürzungsverzeichnis

VII


Abb. Abbildung

AGO Arbeitsgemeinschaft für Gynäkologische Onkologie

ASCO American Society of Clinical Oncology

BET brusterhaltende Therapie

BIR „break induced replication”

BSA „buffered serum albumine“

CMF Polychemotherapie mit Cyclophsphamid, Methotrexat, Fluorouracil

DAB Diaminobenzidin

DNA Desoxyribonukleinsäure („desoxyribonucleic acid“)

EBCTCG Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group

EC Polychemotherapie mit Epirubicin und Cyclophosphamid

ELISA „Enzyme-linked-Immuno-Sorbend-Assay“

ER Östrogenrezeptor; Östrogenrezeptorstatus

FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

G Grading

GnRH „Gonadotropin releasing hormone”

HNPCC Hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom

Hrsg. Herausgeber

Ig Immunglobulin

IRS Immunreaktiver Score nach Remmele und Stegner

KI Konfidenzintervall

kD Kilo-Dalton

M Fernmetastasen

min. Minuten

MMR Mismatch Reparatursystem

n Anzahl

N, pN Nodalstatus; pathologisch beurteilter Nodalstatus

ns nicht signifikant

p Irrtumswahrscheinlichkeit (lat. probabilitas)

PAI-1 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1

PBS „phosphate buffered saline“


VIII

PCI „positive stained cell index“

pos. positiv

PR Progesteronrezeptor; Progesteronrezeptorstatus

RIA Radio-Immunassay

RPA Replication Protein A

RR relatives Risiko

rRNA ribosomale Ribonukleinsäure

s signifikant

s. siehe

SDSA „synthesis-dependent-strand-annealing”

SSA „single strand annealing“

Std. Stunde

T, pT Tumorgröße, pathologisch beurteilte Tumorgröße

Tab. Tabelle

uPA Uroplasminogenaktivator

uPAR Uroplasminogenaktivator-Rezeptor

z. B. zum Beispiel

Die verwendeten Maßeinheiten entsprechen dem internationalen Standard, den

SI-Einheiten und sind daher hier nicht aufgeführt.

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Epidemiologie Diese Arbeit bezieht sich auf die häufigste Krebserkrankung der Frau in der

westlichen Welt: das Mammakarzinom. In Deutschland erkrankt im Durchschnitt

ungefähr jede 9.-10. Frau im Laufe ihres Lebens an dieser Tumorform [Sauer,

2005]. Die geschätzte Inzidenz liegt bundesweit bei 47.500 Neuerkrankungen pro

Jahr [Giersiepen et al., 2005]. Im Jahr 2006 handelte es sich um die 5. häufigste

Todesursache der weiblichen Bevölkerung. Betrachtet man nur die malignen

Neoplasien mit Todesfolge, war es im Jahr 2006 die häufigste Todesursache:

17.286 Todesfälle sind auf die maligne Entartung der Brustdrüse zurückzuführen

[stat. Bundesamt Wiesbaden, 2007]. Die Altersverteilung der

Mammakarzinomtodesfälle ist in Abb. 1 dargestellt. Bei jüngeren Frauen von 35 –

bis 54 Jahren handelt es sich um die häufigste Todesursache [Remmele, 1997].

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

>5 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Alter in Jahren

Todesfälle

Abb. 1: Altersverteilung der Mammakarzinomtodesfälle 2004 in Deutschland. In diesem Jahr sind 17.592 Frauen am Mammakarzinom verstorben [stat. Bundesamt Wiesbaden, 2005].

1.2 Diagnose, Prognose und Therapie des Mammakarzinoms Patientinnen mit Mammakarzinom haben eine schlechtere Überlebensrate im

Vergleich zur weiblichen Normalbevölkerung: Daten des Tumorregisters München

zeigen, dass das relative Überleben der Brustkrebspatientinnen unterhalb der

Überlebenserwartung des entsprechenden Normalkollektivs liegt [Sauer 2005]. In

den USA findet sich seit 1981 ein stabiles Niveau bzw. ein Rückgang der

Mortalität bei Patientinnen mit Mammakarzinom, besonders bei jenen, die zum

Diagnosezeitpunkt das 30. Lebensjahr vollendet hatten und von verbesserten

Screeningprogrammen und Therapiestrategien profitierten [Bleyer et al., 2006]. In

Einleitung

2

Deutschland gibt es kein einheitlich bundesweites Krebsregister, die Inzidenzen

sind daher Hochrechnungen. Es wird davon ausgegangen, dass insbesondere die

Früherkennung als auch effektivere und standardisierte Therapien eine

wesentliche Rolle bei der Prognoseverbesserung spielen. Ein weiterer Vorteil

könnte sich durch eine individualisierte Therapie ergeben: Das Ziel ist, bei guter

Verträglichkeit und geringen Nebenwirkungen, den Progress der Erkrankung zu

verhindern, im Idealfall eine Heilung zu erreichen. Grundlage für eine

individualisierte Therapie ist die genaue Kenntnis der jeweiligen Tumorbiologie

und des Erkrankungsstadiums. Neue prognostische und prädiktive Parameter sind

dafür notwendig.

Derzeit besteht der pathologische Standard des Mammakarzinoms aus folgenden

Komponenten: histologische Tumorentität, Primärtumorgröße, Nodalstatus,

Metastasierungsstatus, histologisches Grading, Östrogen-, Progesteron-, und

HER-2-Rezeptorstatus. Bedeutend für die Therapiefestlegung in der adjuvanten

Situation sind weiterhin der Menopausenstatus, das Alter der Patientin,

Begleiterkrankungen sowie der Wunsch der Patientin [Opitz, 2002; Sauer, 2005].

Bei der Diagnosestellung werden zwei Parametergruppen unterteilt: die

prognostischen und die prädiktiven Parameter. Ein prognostischer Parameter

korreliert in Abwesenheit einer weiteren Therapie mit dem Gesamtüberleben und

dem krankheitsfreien Überleben [AGO, 2010]. Hiervon abzugrenzen sind die

prädiktiven Parameter, die eine Aussage über das Ansprechen einer Therapie

treffen: also direkt für oder wider eine Therapieform sprechen [AGO, 2010].

1.2.1 Prognostische Parameter Die wichtigsten prognostischen Parameter des Mammakarzinoms sind der TNM-

Status (Primärtumorgröße, Nodalstatus, Metastasierungsstatus), die

Tumormorphologie (Grading, histologischer Typ, peritumorale Gefäßinvasion) und

der Steroidhormonrezeptorstatus (Progesteron- und Östrogenrezeptorstatus) zum

Diagnosezeitpunkt, das Alter der Patientin sowie der mittels ELISA bestimmte

uPA/PAI-1-Status [AGO, 2010].

Einleitung

3

Einen Überblick über die wesentlichen Aussagen der einzelnen Parameter gibt

Tabelle 1. Die TNM-Klassifikation ist im Anhang, Tab. 30 (zum Diagnosezeitpunkt

dieses Kollektivs) und Tab. 31 (aktuell) zu finden.

Prognostischer Parameter Korrelation zur Gesamtüberlebenszeit und zum rezidivfreien Überleben

TNM-Status: • Primärtumorgröße • Je größer der Primärtumor ist, umso kürzer ist das

Überleben. Eine Studie von Engel et al. zeigt folgende relative prozentuale Anteile für das Gesamtüberleben nach 15 Jahren: pT1: 77,6%; pT2: 52,3%; pT3: 31,4%; pT4 24,1% [Engel et al., 2003]. Andere Autoren berichten von ähnlichen Ergebnissen [Michaelson et al., 2002].

• Nodalstatus • Stärkster Prognosefaktor in Bezug auf das Überleben in der adjuvanten Situation: Je ausgeprägter der Lymphknotenbefall ist, desto schlechter ist die individuelle Prognose [Sauer, 2005; Engel et al., 2003].

• Metastasierungsstatus • Ein fortgeschrittenes Tumorleiden hat weiterhin eine schlechtere Prognose und gilt prinzipiell als nicht heilbar.

Morphologie • Grading • Je undifferenzierter der Tumor ist, umso schlechter ist die

Prognose (Rezidiv-, Fernmetastasierungsrisiko) [AGO, 2010].

• Histologischer Typ • Das duktale Karzinom hat eine schlechtere Prognose als Karzinome histologischer Sonderformen (muzinös, tubulär, papillär) [Sauer, 2005]. Das lobulär invasive Karzinom vom klassischen Typ ist gegenüber dem invasiv duktalen Karzinom prognostisch günstiger [Toikkanen et al., 1997; Silverstein et al., 1994].

• Hämangiosis • Je invasiver sich der Tumor im histologischen Umfeld zeigt, desto schlechter ist die Prognose und umso höher ist das Risiko eines lokalen Rezidivs [AGO, 2010].

Steroidhormonrezeptorstatus • Nodalpositive Patientinnen ohne adjuvante Hormontherapie zeigen bei positivem Östrogenrezeptorstatus ein um 20% besseres Überleben als solche Patientinnen mit negativem Hormonrezeptorstatus [Esteva und Hortobagyi, 2004]. Ein signifikant besseres Überleben von rezeptorpositiven im Vergleich zu rezeptornegativen Patientinnen wurde nachgewiesen und ist bereits länger bekannt [Colleoni et al., 2004; Crowe et al., 1991].

Tab. 1: Tabelle zur Aussagefähigkeit von pathologischen Prognoseparametern beim Mammakarzinom.

1.2.2 Prädiktive Parameter Zu den lange etablierten prädiktiven Markern beim Mammakarzinom gehören der

Menopausenstatus, der Steroidhormonrezeptorstatus und der HER-2-

Rezeptorstatus [Sauer, 2005].

Einleitung

4

Zum Hormonrezeptorstatus werden der Östrogen- und der

Progesteronrezeptorstatus gezählt. Häufig in diesem Zusammenhang wird die

HER-2-Expression erwähnt. Bei HER-2 oder früher c-erbB-2 handelt es sich um

ein Onkogen [Stemmler et al., 2005], dessen Translationsprodukt beim

Mammakarzinom erhöht sein kann. In der Literatur finden sich verschiedene

Angaben von vermehrter Expression bei Mammakarzinompatientinnen. Diese

belaufen sich zwischen 10-30 % [Ellsworth et al., 2008; Gown et al., 2008; Lal et

al., 2004; Owens et al. 2004; Yaziji et al. 2004; Slamon et al., 2001]. Es ist

unbehandelt mit einer signifikant schlechteren Gesamtüberlebensrate und mit

einem verkürzten krankheitsfreien Überleben assoziiert [Muss et al., 1994] und

wird als „Aktivator“ zellulärer Differenzierung, Adhäsion und Motilität angesehen

[Ignatoski et al., 2000; Adam et al., 1998; Xu et al., 1997]. Die Bestimmung dieses

Parameters erfolgt entweder mittels Immunhistochemie oder Fluoreszenz-in-situ-

Hybridisierung (FISH).

Die prädiktive Aussagefähigkeit des Steroidrezeptorstatus und des HER-2-

Rezeptorstatus ist Tab. 2 zu entnehmen.

Prädiktiver Parameter Aussagefähigkeit zu entsprechender Therapieform

Steroidhormonrezeptorstatus • Eine endokrine Therapie ist nur bei positivem Hormonrezeptorstatus indiziert [Sauer et al., 2005]. Rezeptorpositive Patientinnen zeigen unter Tamoxifentherapie ein besseres Überleben [Green et al., 2002; Muss et al., 1994]; jedoch gilt dieses mit Einschränkungen [Hayaschi und Yamaguchi, 2005].

• Steroidhormonrezeptornegative Tumore reagieren gut auf eine Chemotherapie [Tordai et al., 2007; Mazouni et al., 2007]: Es konnten mehr pathologische Komplett- Remissionen nachgewiesen werden, eine bessere Wirksamkeit ist für die adjuvante und neoadjuvante Chemotherapie anzunehmen [Colleoni et al., 2004].

HER-2-Rezeptorstatus • Die Therapie mit dem humanisierten Antikörper Trastuzumab ist indiziert bei HER-2-Überexpression [Sauer, 2005].

Tab. 2: Aussagefähigkeit von prädiktiven Parametern beim Mammakarzinom.

1.2.3 Risikoadaptierte Therapie Für die jeweilige Therapieempfehlung werden die Patientinnen Risikogruppen

zugeordnet. Nach den Konsensusempfehlungen des internationalen

Expertentreffens in St. Gallen zur adjuvanten Therapie des Mammakarzinoms

werden derzeit drei Risikogruppen unterschieden: niedriges, mittleres und hohes

Einleitung

5

Risiko. Diese orientieren sich an den prädiktiven und prognostischen Parametern

(siehe Tab. 3).

Niedriges Risiko Intermediäres Risiko Hohes Risiko Nodalnegativ Nodalnegativ Nodalpositiv

und alle nachfolgenden Charakteristika: • Primärtumorgröße:

pT < 2 cm • Grading: G I • keine starke peritumorale

vaskuläre Invasion • ER und/oder PR positiv • HER-2 negativ • Alter > 35 Jahre

und mindestens eines der nachfolgenden Charakteristika: • Primärtumorgröße:

pT > 2 cm • Grading: G II - III • starke peritumorale

vaskuläre Invasion • ER und PR negativ • HER-2 positiv • Alter < 35 Jahre

1-3 Lymphknoten befallen und:

• ER und PR negativ oder

• HER-2 positiv > 4 befallene Lymphknoten

Nodalpositiv (1-3 befallene Lymphknoten)

und alle nachfolgenden Charakteristika: • ER und/oder PR positiv • HER-2 negativ

Tab. 3: Risikogruppen nach St. Gallen 2007 [Kapp et al., 2007].

1.2.4 Therapie des Mammakarzinoms Die adjuvante Therapie des Mammakarzinoms setzt sich aus mehreren

Bestandteilen zusammen: Operation, Radiatio, Chemotherapie, endokrine

Therapie und/oder Antikörpertherapie. Schwerpunkt nachfolgender Betrachtungen

sind die 90’er Jahre, in denen die Erstdiagnosen der Patientinnen dieses

Kollektivs gestellt wurden (1992-1998): Es wird die zum damaligen Zeitpunkt als

Standard angesehene Therapie dargestellt.

1.2.4.1 Operation

Die operative Therapie besteht beim Mammakarzinom abhängig von der

Primärtumorgröße, der Tumorlokalisation, der Art des Tumors und dem Wunsch

der Patientin entweder in einer brusterhaltenden Therapie (BET) oder einer

Mastektomie. Diese kann modifiziert radikal erfolgen, jedoch auch unter Erhalt der

Haut oder des Mamillen-Areolakomplexes durchgeführt werden. Die

Überlebensraten nach BET mit Radiatio und modifiziert radikaler Mastektomie

zeigen keinen Unterschied, wenn der BET eine Radiatio folgt [Veronesi et al.,

2002; Fisher et al., 2002]. Vor Etablierung des Sentinel Lymphknotenverfahrens

Einleitung

6

wurde standardmäßig eine Axillarevision der Lymphknoten Level I und II

durchgeführt. Dieses entspricht den Lymphknoten der unteren und mittleren Axilla

[Schmidt-Matthießen et al., 2002].

1.2.4.2 Radiatio

Die postoperative Radiatio ist Voraussetzung für ein operativ brusterhaltendes

Vorgehen. Durch die Bestrahlung wird der Anteil der Patientinnen, die ein

intramammäres Rezidiv erleiden, um den Faktor zwei bis drei reduziert [Fisher et

al., 2002; EBCTCG, 2000]. Der Nutzen der Radiatio konnte auch im Überblick

mehrerer randomisierter Studien gezeigt werden [Clarke et al., 2005]. In der Regel

wird die betroffene Mamma mit einer Gesamtdosis von 50 Gy konventioneller

Fraktionierung (2 Gy) und zusätzlichem Tumorboost von 10 Gy bestrahlt.

Gegebenenfalls werden auch noch die parasternalen, supra- und infraclaviculären

Lymphknotenareale, selten auch die axillären Lymphknoten bestrahlt. Die

adjuvante Radiatio nach Mastektomie ist ebenfalls bei Risikopatientinnen indiziert.

Bei diesen verbessert sich die 10-Jahres- Überlebenswahrscheinlichkeit bis zu

10% [Schmidt-Matthießen et al., 2002].

1.2.4.3 Chemotherapie

In der kurativen Situation unterscheidet man die neoadjuvante (präoperativ) von

der adjuvanten Chemotherapie. Ein weiterer Einsatz der Chemotherapie liegt im

palliativen Bereich.

Mitte bis Ende der 90’er Jahre wurden adjuvant zwei Chemotherapieschemata als

Standard verabreicht: CMF und EC (siehe Tab. 4). Die Indikation wurde

risikoabhängig gestellt, wobei der Nodalstatus eine besondere Bedeutung

eingenommen hat: Nodalnegative Patientinnen erhielten, sofern eine nur

endokrine Therapie nicht ausreichend war, eine Chemotherapie nach dem CMF-

Schema nach Bonadonna. Selbiges galt für nodalpositive Patientinnen mit

maximal drei positiven Lymphknoten und keinen weiteren Risikofaktoren. Bei mehr

als drei positiven Lymphknoten erhielten die Patientinnen das EC-Schema mit

anschließend drei Zyklen CMF [Müllerleile et al., 2002].

Die bessere Wirkung anthrazyklinhaltiger Chemotherapieschemata wurde in

Langzeitbeobachtungen bestätigt: Eine Metaanalyse von mehr als 14.000

Patientinnen der Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (EBCTCG)

Einleitung

7

zeigt nach 15 Jahren Nachbeobachtungszeit, dass anthrazyklinhaltige

Chemotherapieschemata gegenüber dem klassischen CMF-Schema das

Rezidivrisiko senken und das Gesamtüberleben erhöhen [Glück 2005].

CMF-Schema nach Bonadonna

(6 Zyklen, Wiederholung Tag 29)

EC-Schema

(4 Zyklen, Wiederholung Tag 22)

Cyclophosphamid 500 mg/m² i.v. Tag 1 + 8 Epirubicin 90 mg/m²

Methotrexat 40 mg/m² i.v. Tag 1 + 8 Cyclophosphamid 600mg/m²

Fluorouracil 600 mg/m² i.v. Tag 1 + 8

Tab. 4: Standardchemotherapieschemata CMF und EC des Mammakarzinoms [Schmidt-Matthiesen et al., 2002].

1.2.4.4 Endokrine Therapie

In Abhängigkeit vom Hormonrezeptorstatus ist eine endokrine Therapie indiziert.

Bei der Auswahl der Substanzen wird der Menopausenstatus berücksichtigt.

Derzeit stehen drei endokrine Therapieprinzipien zur Auswahl: die

Östrogenrezeptorblockade bzw. Modulation des Östrogenrezeptors, die

Östrogensynthesehemmung und die Suppression der Ovarialfunktion. Betroffene

mit stark positivem Hormonrezeptorstatus in der Postmenopause profitieren am

meisten von einer antiöstrogenen Therapie. Zum Diagnosezeitpunkt des

betrachteten Kollektives galt Tamoxifen als das Standardmedikament. In der

Prämenopause wurden zusätzlich GnRH-Analoga eingesetzt. Der Einsatz von

Aromatasehemmern hat sich in der Postmenopause der alleinigen

Tamoxifentherapie überlegen gezeigt: Es resultierte in einigen Studien ein

verbessertes Überleben sowie ein häufigeres ereignisfreies Überleben [Boccardo

et al., 2006; Jakesz et al., 2005; Thurlimann et al., 2005; Coombes et al., 2004].

1.2.4.5 Antikörpertherapie

Eine Antikörpertherapie mit Trastuzumab, dem ersten beim Mammakarzinom

eingesetzten monoklonalen Antikörper, wird in Abhängigkeit vom HER-2

Rezeptorstatus eingesetzt. Unter dieser Therapie zeigte sich ein verlängertes

Überleben in der adjuvanten sowie in der metastasierten Situation [Gianni, 2002].

Einleitung

8

1.3 Serinproteasen Es werden weitere Marker erforscht, die bei der Tumorgenese relevant sein

können. Zu diesen Parametern gehören neben Onkogenen auch Enzyme. So wird

unter anderem das Urokinase Plasminogen Aktivator System untersucht, welches

zu den Serinproteasen gezählt wird, einem Enzymsystem, das an der

Degradierung von extrazellulären Matrixbestandteilen und am Abbau der

Basalmembran beteiligt ist [Danø et al., 2005; Andreasen et al., 1997; Boyd,

1996]. Der Aktivitätszustand dieses Enzymsystems kann als Maß für die

Invasivität und Metastasierungsbereitschaft eines Tumors gesehen werden [Han

et al., 2005; Duffy, 1996]. Die Namensgebung dieses Enzymsystems erfolgte nach

seinem ersten Nachweisort: dem Urogenitaltrakt. Am Mammakarzinom sind vor

allem zwei der Komponenten dieses Enzymsystems bisher untersucht worden: der

Uroplasminogenaktivator (uPA) und einer seiner Inhibitoren, der

Plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1). Dieses Enzymsystem katalysiert die

Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin, welches unter anderem Bestandteile der

extrazellulären Matrix, wie Fibronectin, Laminin und Vitronectin spalten kann

[Behrendt, 2004]. Die Funktion dieser beiden Faktoren ist in Abb. 2 schematisch

dargestellt (s. Seite 9).

Beim Mammakarzinom führt eine erhöhte Konzentration von uPA und/ oder PAI-1

zu einem geringeren rezidiv- und metastasenfreien Überleben und

Gesamtüberleben [Look et al., 2002]. Retrospektiv zeigte sich, dass Patientinnen

mit hohem uPA und PAI-1 einen signifikant größeren Nutzen von adjuvanter

Chemotherapie haben als solche mit niedriger uPA und PAI-1 Expression

[Harbeck et al., 2002]. Nodalnegative Patientinnen mit geringen Werten von uPA

und PAI-1 haben eine sehr gute Prognose, so dass eine adjuvante Chemotherapie

bei diesen Patientinnen nicht indiziert scheint [Jänicke et al., 2001]. Vor allem für

nodalnegative Patientinnen scheinen die Serinproteasen eine bisher existente

Lücke von prognostischer Aussagefähigkeit zu schließen [Han et al., 2005].

Sie finden sich in den Empfehlungen der Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische

Onkologie e. V. (AGO) [AGO, 2010] sowie in den Leitlinien der American Society

of Clinical Oncology (ASCO). Problematisch ist jedoch weiterhin die aufwändige

und teure Bestimmung mittels ELISA am Frischgewebe, was einer der Gründe ist,

warum sich diese Parameter bisher noch nicht in der Routine durchgesetzt haben

und die Bestimmung wenigen Zentren vorbehalten bleibt: Nur 15 Laboratorien in

Einleitung

9

Deutschland arbeiten derzeit mit dem kommerziell vertriebenen Femtelle®-Test

zur Bestimmung von uPA und PAI-1 mittels ELISA.

Abb. 2: Schematisch vereinfachte Darstellung des Plasminogenaktivators (uPA), seines Rezeptors (uPAR) sowie eines seiner Inhibitoren (PAI-1). In Teilabbildung A ist die aktive Form von uPA

dargestellt, die zu einer Aktivierung der Vorstufe Plasminogen zu Plasmin führt. In Teilabbildung B ist die Inhibierung des Uroplasminogenaktivators durch seinen Inhibitor 1 dargestellt. In diesem Fall

erfolgt keine Aktivierung von Plasminogen.

Im Rahmen der NNBC-3-Studie wurde untersucht, inwiefern die Gabe einer

Chemotherapie bei nodal-negativen Patientinnen vom Status der Serinproteasen

abhängig gemacht werden kann [German Breast Group, 2006]. Erste Ergebnisse

werden für 2010 erwartet.

Im Rahmen dieser Dissertation ist die immunhistochemische Färbung dieser

beiden Parameter erfolgt.

1.4 Rad51 Rad ist die Kurzform des englischen Wortes „radiation“ (Strahlung).

Zurückzuführen ist diese Namensgebung auf Untersuchungen im Jahre 1992 an

Hefe-Mutanten (Saccharomyces cerevisiae), welche eine hohe Sensitivität

gegenüber Röntgenstrahlen zeigen. Die einzelnen Mutanten wurden im Rahmen

der damaligen Untersuchung durchnummeriert und die verursachenden Gene in

Einleitung

10

der anschließenden Auswertung mit der jeweiligen Nummer benannt. Im Verlauf

weiterer wissenschaftlicher Untersuchungen konnte Rad51 als das eukaryontische

Homolog des prokaryontischen RecA-Protein aus Escherichia coli nachgewiesen

werden [Opitz, 2002; Knippers, 2001].

Es handelt sich bei Rad51 um einen wesentlichen Faktor der homologen

Rekombination, einem Reparaturmechanismus der Zelle (Abb. 3). Der

Schwerpunkt dieses Reparaturmechanismus liegt dabei in der Reparatur von

DNA-Doppelstrangbrüchen.

Abb. 3: Vereinfacht dargestellt ist die homologe Rekombination als mögliche Zellantwort auf einen DNA-Doppelstrangbruch mit ihrem wesentlichen Bestandteil Rad51. Sie ermöglicht ein Fortsetzen des Zellzyklus. (SDSA – sythesis–dependent-strand-annealing, SSA – single-strand annealing, BIR – break

induced replication.) [Sung und Klein, 2006].

Die Brustkrebssuszeptibilitätsgene des hereditären Mammakarzinoms, BRCA I

und BRCA II, interagieren im Rahmen der homologen Rekombination mit Rad51

[Venkitaraman, 2001].

Eine vermehrte Expression von Rad51 wurde in verschiedenen Tumorzelllinien

nachgewiesen [Raderschall et al., 2002]: Es zeigte sich für das humane

Adenokarzinom des Pankreas [Han et al., 2002; Maacke et al., 2000a], für das

Einleitung

11

nicht kleinzellige Bronchialkarzinom [Qiao et al., 2005] und das invasive

Mammakarzinom [Maacke et al., 2000b] eine erhöhte Expression. Das invasiv

duktale Mammakarzinom weist eine Korrelation mit dem histologischen Grading

auf [Maacke et al., 2000b]. Als unabhängiger prognostischer Marker stellt es sich

beim nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom dar [Qiao et al., 2005].

Interessant scheint Rad51 noch aus einem weiteren Grund: Von einigen Autoren

wird die Hypothese aufgestellt, dass ein Zusammenhang zwischen

Pharmakoresistenz und Rad51 Expression besteht [Christodoulopoulos et al.,

1999]. Eine induzierte geringe Expression von Rad51 wurde mit erhöhter

Strahlensensitivität in Verbindung gebracht [Collis et al., 2001; Ohnishi et al.,

1998].

Bisher fehlt eine Einordnung von Rad51 in den Gesamtzusammenhang der

prognostischen Parameter des Mammakarzinoms.

1.5 Ki-67 Der im Jahre 1983 entdeckte Antikörper Ki-67 dient zum Nachweis des Ki-67

Antigens der Zelle. Die Namensgebung erfolgte nach der Stadt der Entdeckung

Kiel und dem 67. Antikörperklon einer Versuchsreihe. Von 164 Antikörperklonen

zeigte sich der 67. Klon im Rahmen der damaligen Studie als ein möglicher

Marker für Proliferation und Zellaktivität [Gerdes et al., 1983]. Ki-67 zeigte eine

unterschiedliche Expression in den einzelnen Phasen des Zellzyklus [Gerdes et

al., 1984]. Das Antigen konnte in allen Phasen des Zellzyklus außer in ruhenden

Zellen nachgewiesen werden, so dass eine Aussage zur Wachstumsfraktion eines

entsprechenden Gewebes möglich ist [Scholzen und Gerdes, 2000]. Die

Geschwindigkeit, mit der sich ein Gewebe teilt, wird dabei nicht beschrieben.

Bereits in den neunziger Jahren wurde der Ki-67 Expression eine bessere

Aussagefähigkeit zur Wachstumsfraktion eines Gewebes zugesprochen als dem

Mitoseindex [Schwarting, 1993]. Eine prognostische Bedeutung konnte

insbesondere beim Prostata- [Borre et al., 1998; Aaltomaa et al., 1997] und beim

Mammakarzinom nachgewiesen werden. Bei letzterem konnte Ki-67 in vielen

Studien als ein unabhängiger prognostischer Parameter für das Gesamtüberleben

Einleitung

12

und/oder für das rezidivfreie Überleben nachgewiesen werden [Colozza et al.,

2005; Trihia et al., 2003; Jansen et al., 1998; Railo et al., 1997; Brown et al., 1996;

Domagala et al., 1996; Querzoli et al., 1996; Seshadri et al., 1996; Pinder et al.,

1995; Gaglia et al., 1993; Railo et al., 1993]. Aufgrund einer widersprüchlichen

Datenlage und fehlender Standardisierung der Bestimmung ist dieser Parameter

nicht fest etabliert. Die genaue Funktion dieses Kernproteins ist trotz erfolgter

Strukturanalyse unklar, wahrscheinlich ist eine regulative Funktion im Rahmen des

Zellzyklus [Scholzen und Gerdes, 2000]. Eine Veröffentlichung mutmaßt eine

Rolle bei der Regulation höher geordneter Chromatinstrukturen [Scholzen et al.,

2002]. 2006 wurde ein Zusammenhang mit der Promotor- und

Transkriptionsregion von rRNA beschrieben, welcher eine Funktion von Ki-67 für

die rRNA-Synthese vermuten lässt [Bullwinkel et al., 2006].

Einleitung

13

1.6 Zielsetzung Am Mammakarzinom sollen mittels immunhistochemischer Färbung retrospektiv

folgende Fragestellungen im Kontext der etablierten klinisch-pathologischen

Parameter (histologisches Grading, Primärtumorgröße, Nodalstatus,

Fernmetastasierungsstatus, Östrogen-, Progesteron-, HER-2-Rezeptorstatus,

Alter) bearbeitet werden:

1.) Ist Rad51 ein Prognoseparameter beim Mammakarzinom?

2.) Stellt Ki-67 als Proliferationsmarker möglicherweise einen unabhängigen

prognostischen Parameter für das Mammakarzinom dar?

3.) Besteht eine Korrelation von Rad51 und Ki-67 zu neueren

Prognoseparametern wie uPA und PAI-1?

4.) Sind immunhistochemische Untersuchungsergebnisse von uPA und PAI-1

vergleichbar mit Ergebnissen anderer Studien, die deren Expression mittels

Enzyme linked Immuno Sorbend Assay (ELISA) bestimmt haben?

Material und Methodik

14

2. Material und Methodik

2.1 Gutachten der Ethikkommission Die Genehmigung dieser Studie erfolgte durch die Ethik-Kommission der

Universität zu Lübeck (Aktenzeichen: 98-039). Das positive Votum vom 11. Mai

1998 wurde mit einem Schreiben vom 23.01.2003 erweitert.

2.2 Verbrauchsmaterialien mit Bezugsquelle Alle im Folgenden aufgeführten Substanzen entsprechen den üblichen

analytischen Reinheitsgraden. Zur besseren Übersicht erfolgen die nachfolgenden

Auflistungen tabellarisch.

2.2.1 Chemikalien und Biochemikalien Substanz Hersteller

• Albumine Bovine Fraction Serva, Heidelberg

• Aqua bidest. destilliert im Hause

• Avidin/Biotin Blocking Kit Vector Laboratories, Burlinghame,

USA

• Borg Decloaker (pH = 9,5) Sanova Pharma GesmbH, Wien,

Österreich

• DAB Substrate Kit Vector Laboratories, Burlinghame,

USA

• Chem MateTM Detection Kit

Peroxide DAB, Rabbit/Mouse,

Kit 5001

Dako Cytomation Denmark A/S,

Glostrup, Dänemark

• Di-Natriumhydrogen-

phosphat (Na2HPO4 * 2H2O)

Merck KgaA, Darmstadt

• Ethanol 100% Apotheke der Universität zu Lübeck

• Eukitt (Eindeckmedium) O. Kindler GmbH, Freiburg

• Kaliumchlorid Merck KgaA, Darmstadt

• Kaliumdihydrogenphosphat Merck KgaA, Darmstadt

• Mayer’s Hämalaunlösung Waldeck GmbH & CoKG, Münster


15

• Natriumchlorid Merck KgaA, Darmstadt

• Natriumcitrat, Monohydrat Sigma, Steinheim

• Natriumhydroxid Merck KgaA, Darmstadt

• Peroxidase Blocking Solution Dako Cytomation Denmark A/S,

Glostrup, Dänemark

• Pertex (Eindeckmedium) Medite GmbH, Burgdorf

• Salzsäure Merck KgaA, Darmstadt

• Tris Base Sigma, Steinheim

• Tris HCl Sigma, Steinheim

• Triton X-100 Sigma, Steinheim

• Tween Merck-Schuchardt, Hohenbrunn

• Vectastain Elite ABC-

Peroxidase-Kit

Vector Laboratories, Burlinghame,

USA

• Wasserstoffperoxidlösung Apotheke der Universität zu Lübeck

• Xylol Apotheke der Universität zu Lübeck

2.2.2 Seren Serum Verdünnung Hersteller

Normalserum (Horse) 15 µl/ml

Pufferlösung

Vector Laboratories,

Burlinghame, USA

2.2.3 Zusätzlich verwendeter Laborbedarf

Laborbedarf Hersteller

• Feuchte Kammer

• Dampfdrucktopf

• Dampfgarer Multi Gourmet Braun GmbH, Kronberg/Taunus

• Deckgläschen Menzel-Gläser, Braunschweig

• Eindeckelmaschine Firma Mersei

• Eppendorf Pipetten Eppendorf AG, Hamburg

• Eppendorf Easypet Eppendorf AG, Hamburg

• Küvetten/Messgefäße

• Magnetrührer


16

• Objekträger: Chem Mate

Capillary Gap Microscope

Slides, 75 µm

Dako Cytomation Denmark A/S,

Glostrup, Dänemark

• Pap Pen G. Kisker, Steinfurt

• Pasteurpipetten

• Pinzetten/Spatel

• Stoppuhren

2.3 Charakterisierung der verwendeten Antikörper Die Charakterisierung bezieht sich auf die jeweiligen Herstellerangaben. Die

entsprechende Verdünnung aller nicht vom Hersteller gebrauchsfertigen

Antikörper erfolgte in 5%-iger BSA/PBS-Blocking-Lösung (Herstellung siehe 2.4)

mit 15 µl/ml Normalserum.

2.3.1 Anti-Rad51-Antikörper (1G8) (Konzentration: 1:2000) Es handelt sich um einen monoklonalen Antikörper, der die Aminosäuren 16-20

des humanen Rad51 als Bindungspunkt erkennt. Untersuchungen mit diesem

Antikörper wurden bereits zuvor an Paraffinmaterial durchgeführt [Opitz, 2002;

Maacke et al., 2000b]. Der Antikörper entstammt eigener Herstellung [Buchhop et

al., 1996].

2.3.2 Anti-Ki-67-Antikörper (Konzentration: 1:400) Der monoklonale Maus-Antikörper ermöglicht den Nachweis von humanem Ki-67-

Antigen. Bindungspunkt ist das C-terminale Ende des Proteins. Erworben wurde

dieser Antikörper von der Firma Oncogene Research Products, San Diego, USA.

2.3.3 Anti-uPA-Antikörper, Produktnr. 3689 (Konzentration: 1:100) Dieser monoklonale murine IgG1 Antikörper dient dem Nachweis der B-Kette des

uPA. Extrahiert wurde dieser Antikörper vom Hersteller American Diagnostica inc.,

Stamford, USA, aus Zellkulturen mit anschließender Aufreinigung in der

Agarosegelsäule (agarose gel column). Reaktivität zeigt der Antikörper gegenüber

dem B-Kettenepitop der humanen Urokinase in der Nähe der katalytischen


17

Einheit. Die Bindung erfolgt mit der rezeptorgebundenen, einzeln vorliegenden

Urokinase und mit dem B-Kettenfragment (33 kD). Immunhistochemische

Untersuchungen mit diesem Antikörper wurden bereits durchgeführt [Constantini

et al., 1996; Jankun et al., 1993].

2.3.4 Anti-PAI-1-Antikörper, Produktnr. 3785 (Konzentration: 1:25) Zur immunhistochemischen Darstellung des PAI-1-Antigens diente der

monoklonale Antikörper gegen humanes PAI-1 der Firma American Diagnostica

inc., Stamford, USA. Aufbereitet wurde dieser vom Hersteller aus der humanen

Melanomzelllinie MJZJ. Es handelt sich um einen IgG-Antikörper, dessen

spezifischer Bindungsort nicht beschrieben ist: Die Bindung erfolgt mit PAI-1 und t-

PA/PAI-1. Der Antikörper wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen verwendet

[Constantini et al., 1996; Jankun et al., 1993].

2.3.5 Anti-Mouse (Horse IgG H+L), biotinyliert (Konzentration: 1:200) Dieser Antikörper kann als biotinylierter Sekundärantikörper zum Nachweis von

IgG (H + L) Mausantikörpern verwandt werden. Bezugslabor ist das Vector

Laboratories, Burlinghame, USA.

2.3.6 Chem MateTM Link, biotinylated secondary antibody-aus dem Kit 5001 Diese von der Firma Dako Cytomation Denmark A/S (Glostrup, Dänemark)

gebrauchsfertige Antikörperlösung enthält biotinylierte Anti-Maus und Anti-

Kaninchen Ziegen-Immunglobuline in gepufferter Lösung mit stabilisierendem

Protein und Natriumazid.

2.4 Herstellung der Lösungen und Puffer • ABC-Peroxidase-Kit: 30 Minuten vor Gebrauch werden zu 2,5 ml

Blocking-Lösung ein Tropfen „Reagenz A“ und ein Tropfen „Reagenz B“

gegeben und anschließend bei Raumtemperatur inkubiert.

• BSA/PBS-Blocking-Lösung, 5%: Für eine 5%-ige Lösung werden 5g

„buffered serum albumine“ (BSA) mit „phoshate buffered saline“ (PBS) auf


18

ein Volumen von 100 ml aufgefüllt, wobei zu starkes Rühren wegen der

Proteine zu vermeiden ist. Die Lösung kann als Vorrat bei –20 °C

eingefroren werden, sollte aber besser frisch angesetzt werden.

• Chromogen DAB (3,3’-Diaminobenzidintetrahydrochlorid)-

Färbelösung: 20 µl Chromogen DAB werden unter dem Abzug zu 1000 µl

„HRP Substrate Puffer“ aus dem Kit 5001 hinzugegeben.

• Citratpuffer, 0,01 M, pH = 6,0: In 1000 ml Aqua bidest. werden 2,1g

Natriumcitrat gelöst. Der pH wird entsprechend mit Natronlauge oder

Salzsäure eingestellt.

• DAB (3,3’-Diaminobenzidin)-Färbelösung: Zu 2,5 ml Aqua bidest.

werden 1 Tropfen „Buffer Stock Solution“, zwei Tropfen „DAB Stock

Solution“ und 1 Tropfen „Hydrogen Peroxide Solution“ aus dem „DAB

Substrate Kit“ hinzugegeben. Vor Zugabe der jeweils nächsten Substanz ist

auf eine ausreichende Mischung der Lösung zu achten. Da DAB

wahrscheinlich karzinogen ist, sollte auf entsprechende

Vorsichtsmaßnahmen geachtet werden. Bei lichtgeschützter Aufbewahrung

und einer Temperatur von 4 °C ist diese Färbelösung bis zu sechs Stunden

stabil.

• Phosphate Buffered Saline (PBS), pH = 7,4: Benötigt werden 8g

Natriumchlorid (137 mmol/l), 0,2g Kaliumchlorid (2,7 mmol/l), 1,44g di-

Natriumhydrogenphosphat (8 mmol/l) und 0,24 g

Kaliumdihydrogenphosphat (1,8 mmol/l). Gelöst werden diese Substanzen

zunächst in 1000 ml Aqua bidest. Die Lösung sollte einen pH-Wert von 7,4

haben, sollte das nicht der Fall sein, muss gegebenenfalls mit Salzsäure

korrigiert werden. Es ist empfehlenswert, mit einer 10-fach konzentrierten

Stammlösung zu arbeiten.

• Triton X-100-Lösung, 0,2%: Unter Rühren und bei einer Temperatur von

50 °C werden 200 µl Triton X-100 zu 100 ml PBS-Lösung hinzugegeben.

• TRIS und Tween Pufferlösung, 0,003%, pH=7,45: In 1000 ml Aqua

bidest. werden 8,78g Natriumchlorid, 0,9 g Tris Base, 6,85 g Tris-HCl und

300 µl Tween unter Rühren gelöst.


19

2.5 Untersuchungsgut

2.5.1 Material Die Untersuchung wurde an formalinfixiertem, paraffineingebettetem Material von

invasiv-duktalen und invasiv-lobulären Mammakarzinomen durchgeführt, welches

freundlicherweise vom Institut für Pathologie des Städtischen Klinikums Lüneburg

(Direktorin: Dr. med. A. Peters) zur Verfügung gestellt wurde. Erfasst wurden

Patientinnen, die im Städtischen Klinikum Lüneburg mit der Erstdiagnose eines

Mammakarzinoms im Zeitraum von 1996 – 1998 behandelt wurden. Bei nicht

ausreichenden Nachbeobachtungsdaten wurden zusätzlich weitere Fälle mit

Erstdiagnosestellungen der Jahre 1992 – 1995 eingeschlossen. Es lagen

insgesamt 358 Fälle vor, von denen 143 mit hinreichendem Follow-up ausgewertet

werden konnten. Die Datenerhebung erfolgte anhand der Auswertung von

archivierten Krankenhausakten und mit Unterstützung des niedersächsischen

Krebsregisters [Onkologische Nachsorgeleitstelle, Elbinger Straße 2, 37083

Göttingen].

Es handelt sich bei den ausgewerteten Fällen um 19 lobulär-invasiv und 124

duktal-invasiv wachsende Tumore.

Das histologische Grading erfolgte von Seiten des Pathologen Prof. Dr. med.

Stefan Krüger aus dem Institut für Pathologie des Universitätsklinikums SH,

Campus Lübeck (Direktor: Prof. Dr. med. A. C. Feller) an Hämatoxilin-Eosin

gefärbten Präparaten. Die Färbung erfolgte im Routinelabor des Institutes. Dieses

Vorgehen diente dem Ausschluss unterschiedlicher Befundung durch mehrere

Untersucher. Die histologische Klassifizierung erfolgte nach den Grading Kriterien

von Elston und Ellis [Elston und Ellis, 1991].

An weiteren Paraffinschnitten derselben Tumorblöcke erfolgten die im Folgenden

beschriebenen immunhistochemischen Färbungen.

Normalgewebe wurde im Rahmen der Untersuchung dieser Präparate nicht

beurteilt, da es fraglich ist, ob es sich bei tumornahem Gewebe um

repräsentatives Normalgewebe handelt.


20

2.5.1 Aufbereitung der Gewebeschnitte Das formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe wurde nach dem

Schneiden in einer Schichtdicke von 4µm im Streckbad auf die Objektträger

aufgezogen und anschließend über Nacht bei 37 °C im Brutschrank getrocknet.

Die anschließende Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.

2.5.2 Vorbehandlung der Gewebeschnitte

Die Paraffinschnitte werden ausgehend vom Xylol in der absteigenden

Alkoholreihe entparaffiniert. Die einzelnen Zeitangaben sind in den nachfolgenden

Tabellen 5 und 6 aufgelistet:

Alkoholform Verweildauer in entsprechendem Alkohol (min.)

Xylol 2 x 15’ Ethanol 100% 2 x 15’ Ethanol 80% 2’ und anschließend 1’ Ethanol 70% 2’ Ethanol 50% 1’

Tab. 5: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll I.

Alkoholform Verweildauer in entsprechendem Alkohol (min.)

Xylol 3 x 10’ Ethanol 100% 2 x 1’ Ethanol 80% 2 x 1’

Tab. 6: Entparaffinierungsschema nach Färbeprotokoll II.

2.5.3 Färbeprotokolle Es wurden zwei Protokolle für die immunhistochemischen Färbungen angewandt.

Der Ki-67-Antikörper wurde nach einem in der Arbeitsgruppe etablierten Verfahren

gefärbt, alle weiteren Antikörper wurden mit einem Verfahren, das an ein

Routinefärbeverfahren des Institutes für Pathologie des Universitätsklinikums SH,

Campus Lübeck angelehnt ist, gefärbt (Protokoll II). Zunächst wird das

Färbeprotokoll für Ki-67 erläutert (Protokoll I).

2.5.3.1 Protokoll zur Färbung von Ki-67 (Protokoll I)

Die Vorbehandlung der Gewebeschnitte erfolgte durch Entparaffinieren nach

Tabelle 5. Die durch die Fixierungsmethode bedingten Aldehydquervernetzungen

mit der Folge der dreidimensionalen Strukturveränderungen des

nachzuweisenden Antigens wurden durch mindestens dreiminütiges Kochen der


21

Gewebeproben in einem handelsüblichen Dampfdrucktopf bei maximalem

Dampfdruck gelöst. Als umgebendes Medium der Gewebeproben diente

Citratpuffer 0,01 M, pH=6,0. Das Abkühlen des Dampfdrucktopfes wurde mit

Leitungswasser beschleunigt. Im Anschluss wurde der Gewebebereich auf dem

Objektträger mit einem Pap Pen umrahmt, der als eine Art hydrophobe Barriere

diente, um den Verbrauch der nachfolgend eingesetzten Substanzen zu

minimieren und deren Benetzung auf der Gewebeprobe zu verbessern. Es erfolgte

eine Permeabilisierung der Membranen mit Triton-X-Lösung (0,2%) für einen

Zeitraum von zehn min., um dem Antikörper den Zugang zum Antigen zu

ermöglichen. Zur Verminderung von Hintergrundfärbungen wurden endogene

Peroxidasen blockiert. Dazu wurden die Gewebeschnitte mit 3%-iger

Wasserstoffperoxidlösung für fünf min. bedeckt. Im Anschluss werden endogene

Biotine blockiert. Da die Färbemethode auf biotinylierten Substanzen beruht, wird

somit die Spezifität der Färbungen erhöht. Diese wurde mit Avidin, das vier

Bindungsstellen für Biotin besitzt, durchgeführt. Dazu wurden die Gewebeschnitte

für 15 min. in der gebrauchsfertigen Avidinlösung inkubiert. Im Anschluss wurde

für weitere 15 min. exogenes Biotin hinzugegeben, so dass an die zuvor noch

freien drei Bindungstellen von Avidin nachfolgend keine biotinylierten Substanzen

mehr binden können, wenn im nachfolgenden Färbeprozess biotinylierte

Substanzen verwendet werden. Jetzt wurden die Gewebeproben für eine Std. mit

Normalserum, welches in Blockingpuffer verdünnt wurde (15µl/ml), inkubiert, um

Hintergrundfärbungen, bedingt durch Bindung des Antikörpers an die

Objektträgeroberfläche, zu reduzieren. Es erfolgte eine Bindung des

Primärantikörpers Ki-67 (Konzentration: 1:400) an die Antigenstrukturen. Beim

Lösungsmedium des Antikörpers handelte es sich um BSA/PBS-Blocking-Lösung

mit 15µl/ml Normalserum. Die Inkubationszeit betrug eine Std.. Zur Darstellung

des Primärantikörpers ist eine weitere einstündige Inkubation mit dem zweiten

biotinylierten Antikörper notwendig. Das Signal des gebundenen Zweitantikörpers

(Anti-Mouse (Horse IgG H+L), biotinyliert, Konzentration: 1:200) wurde durch eine

wiederum einstündige Inkubation mit ABC-Kit verstärkt, der eine halbe Std. zuvor

zubereitet und anschließend bei Raumtemperatur abgedunkelt aufbewahrt wurde.

Dieser enthält Avidin gebunden mit biotinylierter Meerrettichperoxidase. Das

Avidin dient als Bindeglied zwischen dem sekundären Antikörper und der

Peroxidase zur Signalverstärkung. Gefärbt wurden die Gewebeproben im


22

Anschluss für 60 sec. mit DAB. Dieses führte zu einer Braunfärbung im Bereich

der mit Meerrettichperoxidase markierten Bereiche. Die Färbereaktion wurde

durch die kontinuierliche Zufuhr von fließendem Leitungswasser von mindestens

fünf min., jedoch maximal zehn min. beendet. Eine Kerngegenfärbung wurde mit

Hämalaun-Färbelösung nach Mayer für einen Zeitraum von drei min. durchgeführt.

Überschüssige Färbelösung wurde durch 5- minütiges Bläuen unter Zugabe von

fließendem Wasser entfernt und die Reaktion beendet. Das Eindeckeln der

Gewebeschnitte erfolgte mit der Eindeckelmaschine der Firma Mersei. Dazu war

zunächst eine Behandlung der Gewebeschnitte mit der aufsteigenden

Alkoholreihe nötig (jeweils 15’’ Spülung in Ethanol 70%, 96%, 2 x 100%, in

Isopropanol, 3 x in Xylol), da das Eindeckmedium (Pertex ®) auf hydrophober

Basis aufgebaut ist. In Ausnahmefällen wurde manuell mit Eukitt ® eingedeckelt.

Das zwischenzeitige Waschen nach jedem einzelnen Schritt der

immunhistochemischen Färbung wurde mit einfachem PBS- Puffer durchgeführt.

In der Regel erfolgte das Waschen für jeweils fünf min. nach jedem einzelnen

Färbeschritt bis zur DAB-Färbung. Ausnahmen waren die Schritte der Avidin- und

Biotinzugabe, an deren Anschluss nur eine Spülung der Gewebeschnitte erfolgte.

Es folgt ein schematischer Abbildungsüberblick für dieses Färbeverfahren:


23

a.) Ausgangszustand der Gewebeprobe, Ak=Antikörper

b.) Zustand nach Demaskierung der Gewebeprobe, Ak=Antikörper

c.) Zustand nach Permeabilisierung der Zellmembran der Gewebeprobe, Ak=Antikörper

d.) Zustand nach Blockierung endogener Peroxidasen der Gewebeprobe, Ak=Antikörper

e.) Zustand nach Bindung von Avidin an endogenes Biotin, Ak=Antikörper

f.) Zustand nach Bindung von exogenem Biotin an Avidin, Ak=Antikörper

Abb. 4: In den Teilabbildungen a.)-f.) sind die einzelnen Färbeschritte für den Ki-67 Antikörper schematisch dargestellt.


24

g) Zustand nach Bindung des Erstantikörpers

h.) Zustand nach Bindung des biotinylierten Zweitantikörpers an den Primärantikörper

i.) Zustand nach Bindung der biotinylierten Meerrettichperoxidase an den biotinylierten Sekundärantikörper,

Ak=Antikörper

Abb. 4: In den Teilabbildungen g.)-i.) sind die einzelnen Färbeschritte für den Ki-67 Antikörper (Protokoll I) schematisch dargestellt.

2.5.3.2. Protokoll zur Färbung von Rad51, uPa, PAI-1 (Protokoll II) Dieses Protokoll wurde für die Antikörperfärbungen Rad51, PAI-1 und uPA

angewandt. Da dieses Verfahren prinzipiell dem Protokoll I ähnelt, wurde auf eine

schematische Abbildungsdarstellung verzichtet. Es werden im Folgenden nur


25

wesentliche Unterschiede dargestellt: Das Entparaffinieren erfolgt in der

absteigenden Alkoholreihe, siehe dazu Tab. 6. Beim verwendeten Spülmedium

handelte es sich bei diesem Protokoll um TRIS und Tween Pufferlösung, 0,003%.

Die Demaskierung erfolgte hier für einen Zeitraum von 45 min. im Dampfgarer der

Firma Braun. Die Gewebeproben sind dabei vollständig von Borg Decloaker

umgeben. Diese Lösung dient der Unterstützung der hitzeinduzierten

Antigendemaskierung im Temperaturbereich von 90-95 °C. Dieses Verfahren

ermöglichte, auf den Schritt der Membranpermeabilisierung von Protokoll I zu

verzichten.

Im Anschluss erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper für einen Zeitraum

von 30 min. Die Antikörper wurden in folgendem Konzentrationsverhältnis im obig

beschriebenen Lösungsmedium gelöst: Anti-Rad51-Antikörper (1G8) 1:2000, Anti-

uPA-Antikörper 1:100 und Anti-PAI-1-Antikörper 1:25. Für weitere 15 min. wurde

der gebrauchsfertige biotinylierte Sekundärantikörper (Chem MateTM Link,

biotinylated secondary antibody - aus dem Kit 5001) hinzugegeben. Zur

Signalspezifizierung durch Blockierung endogener Peroxidasen wurden die

Gewebeschnitte mit der „Peroxidase Blocking Solution“ für 5 min bedeckt. Dieser

Schritt wurde drei Mal wiederholt und erst im Anschluss an diese drei

Wiederholungen gespült. Bei dieser Lösung handelte es sich nach

Herstellerangaben u. a. um Phosphatpuffer mit Wasserstoffperoxid (15 mmol/l).

Das Signal der gebundenen Antikörper wurde mit dem „Streptavidin HRP-

Komplex“ aus dem Kit 5001 vervielfacht. Diese Lösung enthält einen Komplex aus

Streptavidin, welcher an Meerrettich Peroxidase konjugiert ist. Zu diesem Zweck

erfolgte eine Inkubation von 15 min. mit dieser Substanz.

Die eingesetzte Färbelösung ist 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid aus dem

Kit 5001 in einer Konzentration von 1:50. Es erfolgte eine Braunfärbung der zuvor

markierten Bereiche. Die Dauer dieser Färbung ist für exakt acht min. festgelegt,

um eine Vergleichbarkeit der Proben zu gewährleisten. Beendet wurde die

Färbereaktion mittels Spülung in Leitungswasser. Die Kerngegenfärbung und das

Eindeckeln erfolgte analog zu Protokoll I. Ein versuchsweise zusätzlicher Schritt

mit zusätzlicher Inkubation mit Normalserum zeigte keine optimierten

Färbeverhältnisse, so dass dieser nicht durchgeführt wurde.


26

2.5.4 Kontrollen

2.5.4.1 Negativkontrolle Die Negativkontrolle wurde stichprobenartig an Tumorpräparaten ohne

Primärantikörper, also nur dem Lösungsmedium ohne Antikörper, durchgeführt.

Die übrigen Färbebedingungen entsprachen den Färbeprotokollen.

2.5.4.2 Positivkontrolle Die Positivkontrolle bei Rad51 im Zusammenhang mit Protokoll II erfolgte mittels

eines Blasen- bzw. Pankreaskarzinom bekannt hoher Rad51 Expression. Für uPA

und PAI-1 stand kein Positivkontrollmaterial zur Verfügung.

2.5.5 Auswertung der gefärbten Präparate

2.5.5.1 Auswertung der Färbungen von Rad51 und Ki-67 Bei diesen beiden Antikörpern wurden die Präparate mit Hilfe eines

computergestützen Bildanalyseprogramms („PiClick Image Analysis“, Sven Opitz)

ausgewertet [Opitz, 2002]. Die Präparate wurden dazu mit Hilfe des

Bildanalysenmikroskops Axioskop 2 MOT Zeiss und der Kamera AxioCam Zeiss

(beide Fa. Carl Zeiss Microlmaging GmbH, Jena) digitalisiert.

Es erfolgte ein Auszählen der invasiven Tumorzellbereiche von mindestens 500

Tumorzellen in 200-facher Vergrößerung. Abhängig von der Intensität der

Kernfärbung jeder einzelnen Tumorzelle wurde eine Zelle als positiv oder negativ

bewertet. Die zytoplasmatische Färbung, sofern vorhanden, blieb

unberücksichtigt. Als Referenzbild siehe nachfolgende Teilabbildung 5A für Rad51

und Teilabbildung 5B für Ki-67. Das Verhältnis von positiv zu negativ ausgezählten

Tumorzellen wurde prozentual berechnet, auch als „positive stained cell index“

(PCI) bezeichnet, und diente der statistischen Analyse als Grundlage. Auch

andere Autoren haben unter anderem mit dem PCI als Auswertungsgrundlage

gearbeitet [Linder et al., 1997].


27

Abb. 5: Referenzabbildungen für die Färbungen mit Rad51 (Teilabbildung A) und Ki-67 (Teilabbildung B), gekennzeichnet sind als positiv zu wertende Zellen (schwarzer und weißer Pfeil)

und als negativ zu wertende Zellen (roter Pfeil); Vergrößerung 200-fach.

2.5.5.2 Auswertung der Färbungen von uPA und PAI-1 Diese beiden Antikörper wurden semiquantitativ in den Kategorien 0 bis III bei

200-facher Vergrößerung am Bildanalysenmikroskop Axioskop 2 MOT Zeiss (Fa

Carl Zeiss Microlmaging GmbH, Jena) ausgewertet. Die Erläuterung der

Kategorien 0-III findet sich in Tab. 7.


28

Kategorie

prozentual gefärbter

Zellanteil und Färbeintensität

repräsentative Abbildung bezüglich der Färbeintensität bei

uPA

repräsentative Abbildung bezüglich der Färbeintensität bei

PAI-1

0 < 5% positiv

I > 5% schwach

positiv

II

> 5%

mäßig/mittelgradig

positiv

III > 5% stark positiv

Tab. 7: Semiquantitative Kategorieeinteilung und repräsentative Abbildungsausschnitte von uPA und PAI-1, Vergrößerung 200-fach, digitale Bildgrößenanpassung.


29

2.5.5.3 Auswertung der Färbungen von HER-2 Bei nur wenigen Patientinnen war zum Diagnosezeitpunkt der HER-2-Status

bestimmt worden, so dass eine Nachbestimmung über das Routinelabor des

Institutes für Pathologie, UK-SH, Campus Lübeck erfolgte. Die Auswertung wurde

nach dem allgemein gültigen Standard durchgeführt, siehe Tab. 8. Der

aktualisierte Standard wurde zuletzt in der Hinsicht geändert, dass mehr als 30%

der Zellen gefärbt sein müssen, um eine positive Wertung aussprechen zu können

[Mayr et al., 2009].

Kategorie Definition 0 Keine Färbung bzw. membranständige Färbung von weniger

als 10% der Tumorzellen. Klinische Wertung: negativ.

1+ Partielle, schwache membranständige Färbung von mehr als 10% der Tumorzellen. Klinische Wertung: negativ.

2+ Schwache bis mäßige membranständige Färbung von mehr als 10% der Tumorzellen. Klinische Wertung: fraglich positiv, Klärung durch FISH-Untersuchung.

3+ Starke membranständige Färbung von mehr als 10 % der Tumorzellen. Klinische Wertung: positiv.

Tab. 8: Immunhistochemische Klassifikation der Her-2 Expression [Dendukuri et al., 2007; Hicks und Tubbs, 2005].


30

2.6 Statistische Analyse Als Grundlage der statistischen Analyse diente das SPSS®-Statistikprogramm

(SPSS, München, Version 13.0). Das Signifikanzniveau wurde jeweils mit p=0,05

festgelegt. Zur Darstellung des rezidivfreien Überlebens der Patientinnen dienten

Kaplan-Meier-Überlebenskurven, deren Vergleichsgruppen unter Verwendung des

log-rank Tests auf statische Signifikanz geprüft wurden. Im selben

Zusammenhang wurden auch Cox-Regressions-Analysen durchgeführt, sowohl

uni- als auch multivariat. Als beschreibende Parameter dieser Ergebnisse dienen

die Berechnung des relativen Risikos (RR), das 95%-Konfidenzintervall (95% KI)

und der p-Wert. Ausgangspunkt der multivariaten Analyse waren diejenigen

Parameter, die in der univariaten Analyse eine statistische Signifikanz gezeigt

haben. Zum direkten Vergleich der einzelnen Parameter diente der Chi-

Quadrattest nach Pearson. Die statistische Auswertung erfolgte in Kooperation mit

Prof. Dr. med. Krüger.

2.6.1 Festlegung der Schwellenwerte für Rad51 und Ki-67 Zur Darstellung von graphischen Überlebenskurven musste ein Schwellenwert für

die beiden Antikörper Rad51 und Ki-67 gefunden werden. Dazu wurde für jeden

prozentualen Wert als möglichem Schwellenwert sowohl für das rezidivfreie als

auch für das metastasenfreie Überleben eine Cox-Regressionsanalyse

durchgeführt. Derjenige Wert, bei dem die größte Signifikanz und das größte

relative Risiko vorlagen, wurde als Schwellenwert festgelegt. Bei Ki-67 ergab sich

somit ein Schwellenwert zur Unterscheidung von hoher und niedriger Expression

von < 25% und bei Rad51 ein Wert von < 31%. Es erfolgte auf dieser Grundlage

eine Unterteilung der ausgewerteten Fälle in zwei Kategorien, nämlich der hoher

Expression, wenn der prozentuale Anteil der gefärbten Kernbereiche oberhalb des

jeweiligen Schwellenwertes lag und der niedriger Expression, wenn sie unterhalb

des Schwellenwertes lag.

Ergebnisse

31

3. Ergebnisse

Rad51, ein wesentlicher Bestandteil der homologen Rekombination, wurde in

Bezug auf das Mammakarzinom zu seiner prognostischen Aussagefähigkeit auf

immunhistochemischer Basis ausgewertet. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser

Studie weitere mögliche prognostische bzw. prädiktive Parameter untersucht: Ki-

67, uPA und PAI-1.

3.1 Patientinnenkollektiv Die Erhebung der klinischen Daten der 143 Patientinnen erfolgte retrospektiv. Die

Erstdiagnose der Patientinnen wurde in den Jahren 1992-1998 gestellt (1992: 1

Patientin, 1993: 2 Patientinnen, 1994: 2 Patientinnen, 1995: 4 Patientinnen; 1996:

44 Patientinnen; 1997: 48 Patientinnen; 1998: 42 Patientinnen). Der Median des

Lebensalters bei Erstdiagnosestellung lag bei 63 Jahren (Spannweite: 32 - 91

Jahre). Die weitere Altersaufschlüsselung ist Abbildung 6 zu entnehmen. Zur

Gruppierung als Grundlage der statistischen Analyse dient der Median als

Grenzwert.

0

5

10

15

20

25

30

30

-34

35

-39

40

-44

45

-49

50

-54

55

-59

60

-64

65

-69

70

-74

75

-79

80

-84

85

-89

90

-94

Alter in Jahren

Häufigkeit (n)

Abb. 6: Altersverteilung des Studienkollektivs bei Diagnosestellung.

Bei 59 der 143 Patientinnen kam es innerhalb des Beobachtungszeitraumes zu

einer Fernmetastasierung. 40 Patientinnen erlitten im Verlauf ein Lokalrezidiv.

Ergebnisse

32

Der Beobachtungszeitraum erstreckt sich mit einer Spannweite von 116 Monaten

auf minimal vier bis maximal 120 Monate. Der Median der Beobachtungszeit

beträgt 62 Monate. Das ’25er-Quartil liegt bei 33 Monaten und das ’75er-Quartil

bei 72 Monaten. Die weitere Aufschlüsselung erfolgt in Abb. 7.

05

101520253035404550

0-12 13-24 25-36 37-48 49-60 61-72 73-84 85-96 97-108

109-120

Zeit in Monaten

Häufigkeit (n)

Abb. 7: Nachbeobachtungszeitraum des Gesamtkollektivs.

3.2 Klinische und histopathologische Parameter Die klinische und histopathologische Beschreibung beinhaltet folgende Punkte:

Die Größe des Primärtumors, die Anzahl der befallenen Lymphknoten, das

Vorliegen einer Fernmetastasierung. Diese drei Kriterien werden entsprechend der

TNM-Klassifikation dargelegt.

Zusätzlich wird die histologische Tumorentität, der Differenzierungsgrad sowie das

Expressionsverhalten der Hormonrezeptoren und des HER-2-Rezeptorstatus

aufgeführt. Zu einer der neueren Faktoren gehört die Angioinvasion [Gasparini,

2001] und Lymphgefäßinfiltration, welche im Zeitraum der Diagnosestellungen

nicht etabliert gewesen ist, sondern in Studien erprobt wurde, z. B. von Weidner

und Kollegen [Weidner et al., 1991].

3.2.1. Histologie Im vorliegenden Kollektiv fanden sich 19 lobuläre und 124 duktal invasiv

wachsende Mammakarzinome. Das Grading zeigte 26 Fälle hoher Differenzierung

(G1), 81 Fälle mittlerer Differenzierung (G2) und 36 Fälle geringer Differenzierung

Ergebnisse

33

(G3). Davon waren 15 der lobulären Fälle mittlerer Differenzierung (G2) und 4

Fälle geringer Differenzierung (G3). Bei den duktal invasiven Karzinomen waren

26 Fälle hoher Differenzierung (G1), 66 Fälle mittlerer Differenzierung (G2) und 32

Fälle geringer Differenzierung (G3).

3.2.2 Tumorgröße Bei 57 Patientinnen zeigte sich zum Diagnosezeitpunkt eine pT1-Situation.

Zusammengefasst wurden in dieser Kategorie die Tumorstadien pT1a (5

Patientinnen), pT1b (5 Patientinnen) und pT1c (47 Patientinnen). 59 Patientinnen

hatten einen Primärtumor des Tumorstadiums pT2, 5 Patientinnen ein

Tumorstadium pT3 und 22 Patientinnen ein Tumorstadium der Tumorgröße pT4.

Für die weitere statistische Auswertung erfolgte eine weitere Zusammenfassung

der Tumorgruppengröße pT3 und pT4 zu einer Kategorie.

3.2.3 Nodalstatus Der Nodalstatus war zum Diagnosezeitpunkt bei 140 Patientinnen bekannt

gewesen und wurde entsprechend der TNM-Klassifikation in die Klassen 0 – 3

unterklassifiziert. Nodalnegativ waren 81 der Patientinnen und 59 der Patientinnen

waren nodalpositiv. 32 von den nodalpositiven Patientinnen gehörten in die

Kategorie pN1, 18 in die Kategorie pN2 und 9 in die Kategorie pN3. Bei drei der

Patientinnen lag kein Lymphknotenstatus vor, weil sie entweder nicht operiert

wurden (2 Patientinnen) oder weil er aus den Unterlagen nicht ersichtlich gewesen

ist (eine Patientin).

3.2.4 Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus Bei Diagnosestellung war der Östrogenrezeptor- und der

Progesteronrezeptorstatus bestimmt worden. In 102 Fällen lag ein positiver

Östogenrezeptorstatus vor, in 100 Fällen ein positiver Progesteronrezeptorstatus.

Die Bestimmung des Rezeptorstatus erfolgte bei 28 Patientinnen mittels

immunhistochemischer Färbung. Die Ergebnisse wurden nach dem

immunreaktiven Score (IRS) nach Remmele und Stegner klassifiziert [Remmele

und Stegner, 1987]. Mittels biochemischer Bestimmung in Form des

Ergebnisse

34

Radioimmunassay (RIA) wurde bei 107 Patientinnen der Hormonrezeptorstatus

bestimmt. Dieses Verfahren dient dem Nachweis des löslichen Cytosolproteins. Im

Rahmen dieser Studie wurden Werte ab 21 fmol/mg (entspricht einem IRS > 2) als

positiv gewertet. Letzteres Verfahren ist heute obsolet, da es durch die

Immunhistochemie ersetzt wurde. In 5 Fällen wurde der Rezeptorstatus nicht

bestimmt, bei 3 Patientinnen war das Verfahren aus den Unterlagen nicht

ersichtlich.

Prozentsatz positiver Tumorzellkerne

x Färbeintensität = IRS

Positive Kerne Punkte Farbreaktion Punkte Gesamtpunkte keine < 10%

10-50% 51-80% > 80%

0 1 2 3 4

keine schwach massig stark

0 1 2 3

0-12 Punkte

Tab. 9: Immunreaktiver Score nach Remmele und Stegner [Sauer, 2005].

3.2.5 HER-2-Rezeptorstatus Es erfolgte eine Nachbestimmung des HER-2-Status bei 137 Patientinnen. Bei

nicht ausreichendem Tumormaterial konnte bei 6 Patientinnen keine Bestimmung

durchgeführt werden. Die Einteilung des HER-2-Status erfolgte in den Kategorien

0 bis 3+. Im Studienkollektiv zeigte sich folgender Rezeptorstatus: Kategorie 0 lag

bei 34 Patientinnen, Kategorie 1+ bei 58 Patientinnen, Kategorie 2+ bei 22

Patientinnen und Kategorie 3+ lag bei 22 Patientinnen vor. Als Grundlage für die

statistische Auswertung wurden die Kategorien 0, 1+ und 2+ zusammengefasst

und der Kategorie 3+ gegenübergestellt, da immunhistochemisch nur die

Kategorie 3+ als eindeutig positiv zu werten ist [Dendukuri et al., 2007].

Ergebnisse

35

2.3.6 Überblick der histopathologischen Parameter Die histopathologischen Parameter sind in der nachfolgenden Tabelle 10

zusammengefasst:

Parameter n Subklasse Häufigkeit Häufigkeit (%) Häufigkeit (%)

Histologie 143 lobulär 19 13,3

0% 50% 100%

duktal 124 86,7

Grading (G) 143 G1 26 18,2

G2 81 56,6

G3 36 25,2

Tumorgröße (pT) 143 pT1 57 39,9

pT2 59 41,3

pT3 5 3,5

pT4 22 15,4

Nodalstatus (pN) 140 pN0 81 56,6

pN1 32 22,4

pN2 18 12,6

pN3 9 6,3

ER 138 IRS < 2 36 25,2

IRS > 2 102 71,3

PR 138 IRS < 2 38 26,6

IRS > 2 100 69,9

HER-2-Status 136 0 34 23,8

1+ 58 40,6

2+ 22 15,4

3+ 22 15,4

Tab. 10: Übersicht über die histopathologischen Parameter des Studienkollektives.

Ergebnisse

36

3.3 Durchgeführte Therapien

3.3.1 Operative Therapie Bei 76 Patientinnen wurde eine BET, bei 65 Patientinnen eine Ablatio jeweils mit

Axilladissektion durchgeführt. Eine Patientin wurde nur abladiert. Bei 2

Patientinnen erfolgte wegen fortgeschrittenem Tumorleiden keine operative

Therapie, sondern nur eine Probeentnahme aus dem Tumorareal. Die derzeit bei

klinisch unauffälliger Axilla als Standard eingesetzte Wächterlymphknotentechnik

wurde im Untersuchungszeitraum nicht angewendet.

3.3.2 Radiatio im Zusammenhang mit operativer Therapie Bei 38 Patientinnen wurde keine Radiatio durchgeführt. Von diesen Patientinnen

sind 37 abladiert worden, eine dieser Patientinnen ist wegen progredientem

Tumorleiden nicht operiert worden. 106 Patientinnen wurden im Therapieverlauf

bestrahlt. Dazu zählten unter anderem alle brusterhaltend operierten Patientinnen

und 28 abladierte Patientinnen.

3.3.3 Endokrine Therapie Die Behandlung der Wahl im Untersuchungszeitraum bei positivem

Rezeptorstatus stellte Tamoxifen, ein selektiver Östrogenrezeptormodulator, dar,

welches 101 Patientinnen des Kollektivs erhielten. Die Standarddosis entspach

20mg/d für einen Zeitraum von 5 Jahren.

Fünf prämenopausalen Patientinnen wurde ein GnRH-Analogon in Kombination

mit Tamoxifen verabreicht, eine weitere prämenopausale Patientin bekam einen

Aromatasehemmer. 36 Patientinnen erhielten keine endokrine Therapie. Abb. 8

zeigt den Zusammenhang von endokriner Therapie mit dem

Östrogenrezeptorstatus. Gründe, warum bei negativem Rezeptorstatus eine

Therapie durchgeführt und z.T. bei positivem Rezeptorstatus keine Therapie

durchgeführt wurde, waren aus der Datenlage nicht ersichtlich. Es ist davon

auszugehen, dass angenommen wurde, dass auch rezeptornegative Patientinnen

von einer endokrinen Therapie profitieren würden.

Ergebnisse

37

5

82

20

22

14

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

keine Angabe zu ER-Status

ER-Status pos. / endokrine Therapie

ER-Status pos. / keine endokrine Therapie

ER-Status neg. / endokrine Therapie

ER-Status neg. / keine endokrine Therapie

Anzahl der Patientinnen (n)

Abb. 8: Die Abbildung zeigt den Zusammenhang von entsprechendem Hormonrezeptorstatus mit der endokrinen Therapie, die in diesem Zusammenhang nicht weiter aufgegliedert wurde (ER-Status =

Östrogenrezeptorstatus).

3.3.4 Chemotherapie 58 der Patientinnen erhielten im Verlauf eine zytostatische Therapie nach dem

therapeutischen Standard zum Zeitpunkt der Diagnosestellung (siehe Einleitung S.

6). Zwei Patientinnen wurden neoadjuvant behandelt, vier kombiniert neoadjuvant

und adjuvant. Die übrigen Patientinnen erhielten eine adjuvante Therapie. Zu den

verabreichten Therapieschemata siehe Abb. 9.

8 4

3 2

1 3

1 3

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

k e ine C hem othe rap ie

C M F

E C

C M F , E C

Anzah l d er P a tien tinnen (n )

Abb.9: Dargestellt sind die angewendeten adjuvanten Chemotherapieschemata.

Ergebnisse

38

3.4 Immunhistochemische Färbungen der Parameter Die Auswertungen der immunhistochemischen Färbungen sollen im Folgenden

anhand repräsentativer Abbildungen gezeigt werden. Als Kontrolle dienten

Negativkontrollen und zur Verfahrensetablierung bei Rad51 ein bekanntes

Blasenkarzinom mit bekannter Rad51 Expression. Normalgewebe wurde nicht

gesondert ausgewertet, da es fraglich ist, ob tumornahes Normalgewebe

entsprechend repräsentativ ist.

3.4.1 Rad51 141 der 143 Tumorschnitte konnten in Bezug auf den Antikörper zum Nachweis

von Rad51 ausgewertet werden, zwei der gefärbten Präparate waren aufgrund der

Färbeartefakte nicht auswertbar. Repräsentative Abbildungen sind in den

nachfolgenden Abbildungen 10 und 11 dargestellt. Die positiv gefärbten Areale

zeigen sich als bräunliche Anfärbungen des Nukleus. Auffällig war bei der Färbung

mit Rad51 in einigen Tumoren eine zusätzlich zur nukleären Färbung noch

intensivere Färbung des Nukleolus. Weiterhin stellte sich auch in vielen

Präparaten eine Braunfärbung des Zytoplasmas, vor allem bei stärker

exprimierenden Tumoren, dar. Die Kernfärbung war von höherer Intensität als die

zytoplasmatische Färbung und stellte in Form des PCI-Index die Grundlage der

statistischen Auswertung für die 141 ausgewerteten Fälle. Es zeigen sich für

Rad51 folgendes Wertespektrum: Der Median der mit Rad51 gefärbten Tumore

lag bei 18,9% (Spannweite: 0,2% - 56,7%). Die Rad51 Expression im

Studienkollektiv ist Abb. 12 zu entnehmen. Für weitere statistische Berechnungen

wurde ein Schwellenwert von < 31% bestimmt. Die Auswahl dieses Wertes ist auf

die Cox-Regressionsanalyse kumulativer p-Werte des metastasen- und

rezidivfreien Überlebens möglicher Cutoff-Werte von 6% - 38% zurückzuführen

(siehe dazu Abb. 13). Diese Wahl des Schwellenwertes führte zu einer

Unterteilung innerhalb des Kollektivs zu 108 Tumoren niedriger Expression und zu

33 Tumoren hoher Expression.

Ergebnisse

39

Abb. 10: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit niedriger Rad51 Expression, nachgewiesen mittels Diaminobenzidin, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale

Bildgrößenanpassung.

Abb. 11: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches mit höherer Rad51 Expression, gefärbt mit Diaminobenzidin, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale Bildgrößenanpassung.

Ergebnisse

40

0

5

10

15

20

25

30

35

0-5

5-1

0

10-1

5

15-2

0

20-2

5

25-3

0

30-3

5

35-4

0

40-4

5

45-5

0

50-5

5

55-6

0

Rad51 (PCI in %)

Häufigkeit (n)

Abb. 12: Rad51 Expression im Studienkollektiv: Die Abbildung zeigt die Verteilung der Rad51-PCI-Werte bei 141 ausgewerteten Tumoren.

0 0,5 1 1,5 2

6.0

9.0

12.0

15.0

18.0

21.0

24.0

27.0

30.0

33.0

36.0

Cutoff des Rad51-Index

kumulativer p -W ert

Abb. 13: Graphische Darstellung zur Festlegung des Schwellenwertes von Rad51: Hellgrau ist der p-Wert des rezidivfreien Überlebens und dunkelgrau der p-Wert des metastasenfreien Überlebens

dargestellt.

Ergebnisse

41

3.4.2 Ki-67 Auswertbar in Bezug auf Ki-67 erwiesen sich 142 der 143 Präparate.

Repräsentative Abbildungen zeigen Abb. 14 und 15. Ki-67 wird in der Regel nur im

Zellkern angefärbt. Die Auszählung der positiv gefärbten Nuklei im Verhältnis zu

den insgesamt pro Tumorschnitt ausgewerteten Zellkernen ergab einen Median

von 16,8% (Spannweite: 0,7% bis 88,1%). Der klassifizierende Schwellenwert liegt

bei < 25%. Dieser ergibt sich aus der Cox-Regressionsanalyse verschiedener

möglicher Cutoff-Werte von 4,0% bis 46,0%. Für diesen Wert ergibt sich die

höchste statistische Signifikanz mit einem jeweils hochsignifikanten p-Wert (p =

0,0001) für das metastasen- und rezidivfreie Überleben (siehe auch Abb. 17). Das

Kollektiv unterteilt sich somit in 95 Fälle niedriger Ki-67 Expression und 47 Fälle

hoher Ki-67 Expression. Die weitere Aufschlüsselung der Ki-67 Expression im

Studienkollektiv ist Abb. 16 zu entnehmen.

Abb.14: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches, nachgewiesen mittels DAB wurde Ki-67 in niedriger Expression, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale Bildgrößenanpassung.

Ergebnisse

42

Abb. 15: Repräsentativer Ausschnitt eines Tumorbereiches, nachgewiesen mit DAB wurde ebenfalls Ki-67, in höherer Expression, Fotographie in 200-facher Vergrößerung, digitale Bildgrößenanpassung.

0

5

10

15

20

25

30

0-5

5-1

0

10

-15

15

-20

20

-25

25

-30

30

-35

35

-40

40

-45

45

-50

50

-55

55

-60

60

-65

65

-70

70

-75

75

-80

80

-85

85

-90

Ki-67 (PCI in %)

Häufigkeit (n)

Abb. 16: Ki-67 Expression im Studienkollektiv. Die Graphik zeigt die Verteilung der ausgewerteten Ki-67-PCI-Werte von 142 ausgewerteten Tumoren.

Ergebnisse

43

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1

5.0

9.0

13.0

17.0

21.0

25.0

29.0

33.0

37.0

41.0

45.0

Cutoff des Ki-67 Index

kumulativer p-Wert

Abb. 17: Kumulative p-Werte der Cox-Regressionsanalyse zur Schwellenwertbestimmung bei Ki-67: Hellgrau sind die p-Werte des rezidivfreien und dunkelgrau die p-Werte des metastasenfreien

Überlebens dargestellt.

3.4.3 Uroplasminogenaktivator (uPA) Ausgewertet wurden 141 Tumorschnitte des Gesamtkollektivs, die zuvor

immunhistochemisch gefärbt wurden. Die Einteilung der Kategorien nach

Färbeintensität ist in Tabelle 7 repräsentativ dargestellt. Im Studienkollektiv zeigte

sich folgende Verteilung der Tumore: 2 mal Kategorie 0, 23 mal Kategorie I, 80

Tumore wurden in Kategorie II, und 36 in Kategorie III eingestuft.

3.4.4 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) Bei 140 Patientinnen konnte PAI-1 ausgewertet werden, die Zuordnung in vier

Kategorien basiert auf der immunhistochemischen Färbung. Bezeichnet wurden

diese Kategorien mit 0 – 3. Für die Tumore des Kollektivs zeigte sich folgende

Verteilung: 11 wurden in Kategorie 0 eingeordnet, 36 innerhalb Kategorie I

eingestuft, 65 Tumore zu Kategorie II und 28 der Kategorie III zugeordnet. Die

genaue Definition der einzelnen Kategorien ist ebenfalls Tab. 7 zu entnehmen, in

der entsprechend repräsentative Abbildungen dargestellt sind.

Ergebnisse

44

3.5 Rezidiv- und metastasenfreies Überleben Die zuvor beschriebenen Parameter wurden statistisch in Bezug auf das

rezidivfreie und metastasenfreie Überleben analysiert. Die Darstellung erfolgt mit

Kaplan-Meier-Kurven, basierend auf dem log-rank-Test zur Überprüfung der

statistischen Signifikanz der Vergleichsgruppen. Cox-Regressionsanalysen,

sowohl uni- als auch multivariat wurden ebenfalls durchgeführt. Beschreibend

dienen in diesem Zusammenhang folgende Parameter: das relative Risiko (RR),

das 95%-Konfidenzintervall (95% KI) und der p-Wert. Das Signifikanzniveau

wurde mit p < 0,05 festgelegt. Da in der Literatur eine prognostische

Aussagefähigkeit für uPA und PAI-1 für die nodalnegativen Fälle beschrieben wird

[Jänicke et al., 2001], wurde dieses explizit mit den der anderen Analysen

entsprechenden Tests für uPA, PAI-1 und auch für die übrigen Parameter

untersucht. Abschließend erfolgte für die vier Parameter Rad51, Ki-67, uPA und

PAI-1 zum direkten Vergleich die Analyse mittels Chi-Quadrattest nach Pearson.

3.5.1 Rezidivfreies Überleben im Gesamtkollektiv Bei dieser Analyse wurden folgende Parameter univariat in Bezug auf das

rezidivfreie Überleben ausgewertet: Alter, histologischer Tumortyp,

Primärtumorgröße (pT-Status), Nodalstatus (pN-Status), Grading,

Östrogenrezeptorstatus (ER-Status), Progesteronrezeptorstatus (PR-Status),

HER-2-Status, Rad51 Index, Ki-67 Index, PAI-1- und uPA-Status. Bei acht der

zwölf betrachteten Parameter zeigt sich eine statistische Signifikanz, bei den vier

weiteren Parametern keine Korrelation mit dem rezidivfreien Überleben.

Hochsignifikant mit einem p-Wert < 0,0001 im log-rank-Test ist der Ki-67 Index,

der Her-2-, der Progesteron- und der Östrogenrezeptorstatus. Die

Primärtumorgröße (p=0,01), der Nodalstatus (p=0,023), das histologische Grading

(p=0,003) sowie Rad51 (p= 0,028) zeigen eine signifikante Korrelation mit dem

rezidivfreien Überleben. Keine Signifikanz stellt sich beim Alter, beim uPA-Status,

beim PAI-1-Status und beim histologischen Tumortyp heraus. Die obig im Text

erwähnten p-Werte entstammen dem log-rank-Test. Die übrigen p-Werte des log-

rank-Testes und die entsprechenden Werte der Cox-Regression sind Tabelle 11

zu entnehmen.

Ergebnisse

45

Parameter Fallzahl p1-Wert P2-Wert RR 95% KI

Histologischer Typ 19;124 0,293 0,303 1,855 0,572-6,019

PAI-1-Status 11;36;66;27 0,287 0,379 1,191 0,807-1,758

Alter 71;72 0,221 0,226 0,677 0,359-1,274

uPA-Status 2;23;80;36 0,165 0,495 0,854 0,543-1,343

Rad51 Index 108;33 0,024 0,028 2,107 1,084-4,094

pN-Status 81;32;18;9 0,023 0,012 1,495 1,092-2,046

pT-Status 57;59;27 0,01 0,006 1,789 1,182-2,708

Grading 26;81;36 0,003 0,003 2,116 1,300-3,443

HER-2-Status 114;22 0,0001 0,001 3,438 1,687-7,008

PR-Status 38:100 0,0001 0,0001 0,227 0,119-0,435

ER-Status 36;102 0,0001 0,0001 0,243 0,127-0,467

Ki-67 Index 95;47 0,0001 0,0001 5,69 2,973-10,889

Tab. 11: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter, sortiert nach dem p1-Wert, bezogen auf das rezidivfreie Überleben (p1=p-Wert des log-rank-Tests, p2=p-Wert des Cox-

Regressions-Tests, RR= relatives Risiko des Cox-Regressionstest, 95% KI= 95%-Konfidenzintervall der Cox Regression).

Ergebnisse

46

Ergebnisse

47

Abb. 18: Dargestellt sind die Kaplan-Meier-Kurven der sich als signifikant abzeichnenden Parameter beim rezidivfreien Überleben. Es handelt sich dabei um die Primärtumorgröße (A), den Nodalstatus

(B), das Grading (C), den Her-2- (D), den Östrogen- (E) und den Progesteronrezeptorstatus (F), Rad51 Index (G) und Ki-67 Index (H). Zusätzlich gezeigt ist der jeweilige p-Wert des log-rank-Testes.

Ergebnisse

48

Die multivariate Analyse bestimmt die unabhängigen Parameter unter den

signifikant abhängigen Parametern der univariaten Analyse. Das Ergebnis der

multivariaten Cox-Regressionsanalyse stellte drei unabhängige Parameter in

Bezug auf das rezidivfreie Überleben heraus: den Ki-67 Index (p=0,0001), den

Progesteronrezeptorstatus (p=0,001) und die Primärtumorgröße (p=0,031). Rad51

stellte sich nicht als unabhängiger Parameter dar. Die Analyseergebnisse sind in

der nachfolgenden Tabelle 12 dargestellt.

Parameter p-Wert Multivariat-Analyse

(univariat) p RR 95% KI

Rad51 Index 0,028 0,859 0,927 0,401-2,140

pN-Status 0,012 0,781 0,944 0,627-1,420

Grading 0,003 0,676 0,873 0,463-1,649

Östrogen-Status 0,0001 0,347 0,638 0,251-1,627

HER-2-Status 0,001 0,112 1,842 0,849-3,999

pT-Status 0,006 0,031 1,737 1,051-2,870

Progesteron-Status 0,0001 0,001 0,305 0,149-0,623

Ki-67 Index 0,0001 0,0001 4,677 2,233-9,798

Tab. 12: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das rezidivfreie Überleben, gezeigt sind die p-Werte der uni-und multivariaten Cox-Regression sowie das relative

Risiko (RR) und das 95%-Konfidenzintervall (95% KI) der multivariaten Analyse. Die Parameter sind nach der Signifikanz des p-Wertes der multivariaten Analyse sortiert.

Ergebnisse

49

3.5.2 Metastasenfreies Überleben im Gesamtkollektiv Die zur Analyse herangezogenen Parameter entsprechen der univariaten Analyse

im Rahmen des rezidivfreien Überlebens (siehe 3.5.1). Beim metastasenfreien

Überleben zeigen ebenfalls acht der zwölf Parameter eine Signifikanz. Vier

Parameter stellen sich als hochsignifikant (log-rank-Test, p=0,0001) heraus: der

Ki-67 Index, die Primärtumorgröße, der Nodalstatus und der

Progesteronrezeptorstatus. Die weiteren signifikanten Parameter sind folgende:

Rad51 (p=0,033), histologisches Grading (p=0,031), HER-2- (p= 0,008) und der

Östrogenrezeptorstatus (p=0,001). Keine Signifikanz zeigen der uPA-Status, der

PAI-1-Status, der histologische Tumortyp und das Alter mit dem metastasenfreien

Überleben des Gesamtkollektivs. Die weiteren p-Werte des log-rank-Testes und

die Werte der Cox-Regressions-Analyse sind der nachfolgenden Tabelle 13 zu

entnehmen.

Parameter Fallzahl p1-Wert P2-Wert RR 95% KI

uPA-Status 2;23;80;36 0,903 0,723 0,933 0,635-1,371

Alter 71;72 0,433 0,436 0,815 0,487-1,364

histologischer Typ 19;124 0,427 0,431 0,76 0,384-1,505

PAI-1-Status 11;36;66;27 0,424 0,223 0,828 0,611-1,221

Rad51 Index 108;33 0,033 0,037 1,806 1,036-3,148

Grading 26;81;36 0,031 0,009 1,674 1,135-2,470

HER-2-Status 114;22 0,008 0,01 2,345 1,227-4,480

ER-Status 36;102 0,001 0,002 0,416 0,240-0,721

PR-Status 38:100 0,0001 0,001 0,388 0,223-0,676

pN-Status 81;32;18;9 0,0001 0,0001 1,904 1,471-2,464

pT-Status 57;59;27 0,0001 0,0001 2,337 1,639-3,331

Ki-67 Index 95;47 0,0001 0,0001 2,665 1,569-4,527

Tab. 13: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das metastasenfreie Überleben (p1=p-Wert des log-rank-Tests, p2=p-Wert der Cox-Regressions-Analyse, RR= relatives Risiko und 95%-KI= 95%-Konfidenzintervall, jeweils der Cox-Regressions-Analyse). Die Parameter

sind nach der statistischen Signifikanz der p-Werte geordnet.

Ergebnisse

50

Ergebnisse

51

Abb. 19: Dargestellt sind die Kaplan-Meier-Kurven der sich als signifikant abzeichnenden Parameter in Bezug auf das metastasenfreie Überleben. Es handelt sich dabei um die Primärtumorgröße (A), den

Nodalstatus (B), das Grading (C), den HER-2- (D), den Östrogen- (E) und den Progesteronrezeptorstatus (F), Rad51 Index(G) und Ki-67 Index(H). Zusätzlich ist der jeweilige p-

Wert des log-rank-Testes gezeigt.

In der multivariaten Analyse der acht univariat signifikanten Parameter wurden drei

unabhängige Variablen ermittelt. Es handelt sich dabei um den

Östrogenrezeptorstatus (p=0,0001), den Nodalstatus (p=0,004) und den

Primärtumorstatus (p=0,044). Rad51 zeigt sich auch für das metastasenfreie

Überleben nicht als unabhängiger Parameter. Weitere Analyseergebnisse sind der

nachfolgenden Tabelle 14 zu entnehmen.

Parameter p-Wert Multivariat-Analyse

(univariat) p RR 95% KI

Grading 0,009 0,787 0,927 0,536-1,603

Rad51 Index 0,037 0,594 0,811 0,376-1,751

HER-2-Status 0,01 0,471 1,345 0,601-3,014

Progesteron-Status 0,001 0,381 0,693 0,305-1,575

Ki-67 Index 0,0001 0,173 1,6 0,814-3,146

pT-Status 0,0001 0,044 1,527 1,011-2,305

pN-Status 0,0001 0,004 1,587 1,160-2,170

Östrogen-Status 0,002 0,0001 0,361 0,2-0,652

Tab. 14: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das metastasenfreie Überleben, gezeigt sind die p-Werte der uni-und multivariaten Cox-Regression sowie

das relative Risiko (RR) und das 95%-Konfidenzintervall (95% KI) der multivariaten Analyse.

Ergebnisse

52

3.5.3 Subgruppenanalyse der nodalnegativen Patientinnen Durchgeführt wurde die univariate Analyse mit denselben Parametern (außer des

Nodalstatus) wie die univariate Analyse des Gesamtkollektivs (siehe 3.5.1). Vier

Parameter erweisen sich in diesem Zusammenhang als statistisch signifikant (log-

rank-Test): der Ki-67 Index (p=0,0001), der uPA-Status (p=0,0001), der

Östrogenrezeptorstatus (p=0,012) und der Progesteronrezeptorstatus (p=0,007).

In der Cox-Regressionsanalyse lässt sich die Signifikanz für uPA nicht

nachweisen (p-Wert = 0,078). Für PAI-1 konnte keine Signifikanz nachgewiesen

werden.

Die entsprechenden Ergebnisse der Cox-Regressionsanalyse finden sich in der

nachfolgenden Tabelle 15.

Parameter Fallzahl p1-Wert p2-Wert RR 95% KI

PAI-1-Status 6;20;36;16 0,518 0,189 1,511 0,816-2,798

HER-2-Status 68;10 0,304 0,314 1,908 0,542-6,711

Grading 18;46;17 0,296 0,146 1,673 0,836-3,349

pT-Status 45;31;5 0,259 0,217 1,558 0,770-3,152

Alter 37;44 0,191 0,201 0,522 0,193-1,413

Rad51 Index 68;11 0,176 0,188 2,126 0,692-6,526


ER-Status 19;61 0,012 0,017 0,308 0,0116-0,813

PR-Status 14;66 0,007 0,012 0,279 0,103-0,757

uPA-Status 1;12;46;21 0,0001 0,078 0,529 0,26-1,075

Ki-67 Index 61;20 0,0001 0,0001 6,891 2,540-18,697

Tab. 15: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das rezidivfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen (p1=p-Wert des log-rank-Tests, p2=p-Wert der Cox-

Regressions-Analyse, RR= relatives Risiko und 95%-KI= 95%-Konfidenzintervall (jeweils der Cox-Regressions-Analyse). Die Parameter sind nach dem p1-Wert sortiert.

Die Analyse des metastasenfreien Überlebens wurde ebenfalls mit denselben

Parametern wie die univariate Analyse des Gesamtkollektivs durchgeführt (außer

des Nodalstatus). Es zeigte sich bei drei Parametern eine statistische Signifikanz:

der Ki-67 Index (p=0,0001), die Primärtumorgröße (p=0,0046) und das

histologische Grading (p=0,0165). Bei den zuvor genannten p-Werten handelt es

sich um die Werte des log-rank-Tests. Die weiteren Werte des log-rank-Testes

und die Werte der Cox-Regressionsanalyse sind in Tabelle 16 dargestellt. Die

Ergebnisse

53

Parameter uPA und PAI-1 zeigen in diesem Zusammenhang keine statistische

Relevanz.

Parameter Fallzahl p1-Wert p2-Wert RR 95% KI

Alter 37;44 0,974 0,975 0,986 0,427-2,280


HER-2-Status 68;10 0,727 0,728 0,772 0,179-3,320

uPA-Status 1;12;46;21 0,712 0,291 0,714 0,382-1,335

Rad51 Index 68;11 0,467 0,471 1,491 0,503-4,418

PR-Status 14;66 0,35 0,356 0,597 0,199-1,787

PAI-1-Status 6;20;36;16 0,242 0,1 0,677 0,426-1,078

Grading 18;46;17 0,239 0,11 1,631 0,896-2,970

pT-Status 45;31;5 0,014 0,015 2,136 1,162-3,927

ER-Status 19;61 0,013 0,018 0,35 0,147-0,834

Ki-67 Index 61;20 0,001 0,002 4,133 1,688-10,115

Tab. 16: Statistische Analyse (univariat) der betrachteten Parameter, sortiert nach der Signifikanz, bezogen auf das metastasenfreie Überleben der nodalnegativen Patientinnen (p1=p-Wert des log-rank

Tests, p2=p-Wert der Cox-Regressions-Analyse, RR= relatives Risiko und 95%-KI= 95%-Konfidenzintervall, jeweils der Cox-Regressions-Analyse).

Bei der multivariaten Analyse der Subgruppe der nodalnegativen Patientinnen, in

die die signifikanten Parameter der univariaten Analyse einbezogen wurden,

zeigen sich der Ki-67 Index und der Östrogenrezeptorstatus für das rezidiv- und

metastasenfreie Überleben unabhängig (rezidivfreies Überleben: Ki-67

(p=0,0001), Östrogenrezeptorstatus (p=0,034); metastasenfreies Überleben: Ki-67

(p=0,005), Östrogenrezeptorstatus (p=0,017)). Die weiteren Ergebnisse der

multivariaten Analyse sind der nachfolgenden Tabelle 17 zu entnehmen.

Ergebnisse

54

Parameter rezidivfreies Überleben metastasenfreies Überleben

p-Wert Multivariat-Analyse p-Wert Multivariat-Analyse

(univariat) p RR 95% KI (univariat) p RR 95% KI

uPA-Status 0,078 0,16 0,569 0,259-

1,250 0,291 * * *

PR-Status 0,012 0,448 0,611 0,171-

2,184 0,356 * * *

pT-Status 0,217 * * * 0,015 0,228 1,562 0,757-

3,226

ER-Status 0,017 0,034 0,346 0,130-

0,921 0,018 0,017 0,345

0,144-

0,827

Ki-67 Index 0,0001 0,0001 6,471 2,376-

17,622 0,002 0,005 3,84

1,497-

Tab. 17: Statistische Analyse (multivariat) der betrachteten Parameter bezogen auf das rezidiv- und metastasenfreie Überleben der nur nodalnegativen Patientinnen, gezeigt sind die p-Werte der uni- und multivariaten Cox-Regression sowie das relative Risiko (RR) und das 95%-Konfidenzintervall (95%

KI) der jeweils multivariaten Analyse [* in diesen Fällen wurden die Parameter wegen der univariaten Ergebnisse (p-Wert > 0,2) von der multivariaten Analyse ausgeschlossen].

3.5.4 Chi-Quadrattest nach Pearson für die Parameter Rad51, Ki-67, uPA und PAI-1 Unabhängig vom metastasen- und rezidivfreien Überleben wurden die einzelnen

Parameter mit dem Chi-Quadrattest nach Pearson miteinander in Beziehung

gesetzt. Durchgeführt wurde diese Analyse mit allen vier gefärbten Parametern

dieser Arbeit.

3.5.4.1 Rad51 Rad51 zeigt mit fünf Parametern eine Signifikanz, hoch signifikant stellt sich ein

Zusammenhang mit Ki-67 (p=0,0001) heraus.

Eine weitere Korrelationen stellt sich mit dem Alter der Tumorpatientinnen dar:

Ältere Patientinnen exprimieren Rad51 weniger als jüngere Patientinnen

(p=0,011). Beim Progesteronrezeptorstatus zeigt sich bei hoher

Progesteronexpression häufiger eine niedrige Rad51 Expression (p=0,006). Mit

zunehmendem Nodalstatus nimmt der prozentuale Anteil der Tumore hoher

Rad51 Expression zu (p=0,027). Der prozentuale Anteil der Rad51

exprimierenden Tumoren innerhalb einer Grading-Subklasse ist umso geringer, je

Ergebnisse

55

differenzierter die der Gruppe zugeordneten Tumore sind (p=0,033). Die

nachfolgende Tabelle 18 zeigt zusätzlich zu den signifikanten Ergebnissen auch

solche, die sich als nicht signifikant herausgestellt haben.

Parameter Gesamtgruppe

(n)

niedriger Rad51 Index

(Angaben in %)

hoher Rad51 Index (Angaben in %)

statistische Signifikanz

PAI-1 0,627 Index=0 11 81,8 18,2 Index=1 35 82,9 17,1 Index=2 65 73,8 26,2 Index=3 27 70,4 29,6

uPA 0,559 Index=0 2 100 0 Index=1 23 73,9 26,1 Index=2 78 79,5 20,5 Index=3 36 69,4 30,6

Typ 0,47 lobulär 18 83,3 16,7 duktal 123 75,6 24,4

pT-Status 0,278 PT1a-pT1c 55 83,6 16,4

pT2 59 72,9 27,1 pT3 & pT4 27 70,4 29,6

HER-2-Status 0,133 0,1,2 112 78,6 21,4

3 22 63,6 36,4 ER-Status 0,115

niedrig 36 69,4 30,6 hoch 100 82 18

Grading 0,033 G1 26 92,3 7,7 G2 79 77,2 22,8 G3 36 63,9 36,1

pN-Status 0,027 0 79 86,1 13,9 1 32 71,9 28,1 2 18 61,1 38,9 3 9 55,6 44,4

Alter 0,011 < 63 71 67,6 32,4 > 63 70 85,7 14,3

PR-Status 0,006 niedrig 38 63,2 36,8 hoch 98 84,7 15,3

Ki-67 0,0001 < 25% 93 86 14 >25% 47 57,4 42,6

Tab. 18: Chi-Quadrattest nach Pearson: Rad51 im Zusammenhang mit den das Kollektiv beschreibenden Parametern und den anderen untersuchten Parametern.

Ergebnisse

56

3.5.4.2 Ki-67 Bei der Betrachtung von Ki-67 stellt sich mit sechs Parametern eine statistisch

signifikante Korrelation dar, bei fünf ist diese hochsignifikant: Rad51, Östrogen-,

Progesteron-, Her-2-Rezeptorstatus und das histologische Grading. Der

Zusammenhang zwischen Rad51 und Ki-67 ist bereits im vorigen Absatz

beschrieben (siehe 3.5.4.1). Je höher die Ki-67 Expression, desto höher ist die

Rad51 Expression, desto undifferenzierter ist das Grading, umso wahrscheinlicher

ist ein niedriger Progesteron- oder Östrogenrezeptorstatus und ein höherer HER-2

-Rezeptorstatus. Die zunehmende Primärtumorgröße zeichnet sich mit

zunehmender Ki-67 Expression als signifikant ab (p=0,015), der Nodalstatus zeigt

einen Trend, dass der prozentuale Anteil von hoher Ki-67 Expression bei

Patientinnen größer ist, die einen ausgeprägten Lymphknotentumorbefall

vorweisen (p=0,06). Die anderen untersuchten Parameter, uPA, PAI-1, der

histologische Tumortyp und das Alter der Patientinnen zeigen keine signifikante

Korrelation. Weitere Angaben sind der Tabelle 19 zu entnehmen.

Ergebnisse

57

Parameter Gesamtgruppe

(n)

niedriger Ki-67 Index

(Angabe in %)

hoher Ki-67 Index (Angabe in %)

statistische Signifikanz

uPA 0,86 Index=0 2 50 50 Index=1 23 60,9 39,1 Index=2 80 68,8 31,3 Index=3 36 66,7 33,3

Alter 0,858 < 63 71 66,2 33,8 > 63 71 67,6 32,4

Typ 0,294 lobulär 18 77,8 22,2 duktal 124 65,3 34,7

PAI-1 0,105 Index=0 11 90,9 9,1 Index=1 36 72,2 27,8 Index=2 65 67,7 32,3 Index=3 27 51,9 48,1

pN-Status 0,06 0 81 75,3 24,7 1 32 53,1 46,9 2 17 64,7 35,3 3 9 44,4 55,6

pT-Status 0,015 pT1a-pT1c 57 80,7 19,3

pT2 59 55,9 44,1 pT3 & pT4 26 61,5 38,5

Grading 0,0001 G1 26 100 0 G2 81 72,8 27,2

G3 35 28,6 71,4 HER-2-Status 0,0001

0,1,2 113 74,3 25,7 3 22 31,8 68,2

PR-Status 0,0001 niedrig 38 36,8 63,2 hoch 99 80,8 19,2

ER-Status 0,0001 niedrig 36 41,7 58,3 hoch 101 78,2 21,8

Rad51 0,0001 < 31% 107 74,8 25,2 > 31% 33 39,4 60,6

Tab. 19: Chi-Quadrattest nach Pearson: Ki-67 im Zusammenhang mit den das Kollektiv beschreibenden Parametern und den anderen untersuchten Parametern.

Ergebnisse

58

3.5.4.3 uPA und PAI-1 Die Untersuchung mit uPA und PAI-1 im Chi-Quadrattest nach Pearson zeigt eine

signifikante Korrelation zwischen uPA und PAI-1 (p=0,006). Es zeigt sich, dass bei

einem Tumor die Wahrscheinlichkeit größer ist, bei hoher uPA Expression

ebenfalls eine hohe PAI-1 Expression vorzuweisen. Alle weiteren Parameter

erweisen mit diesen beiden Parametern keine signifikante Korrelation und sind

daher nicht weiter dargelegt. Tabelle 20 zeigt die Expression von PAI-1 und uPA.

uPA

0 (2) 1 (22) 2 (79) 3 (35)

PAI-1

0 (11) 9,1% 18,2% 63,6% 9,1%

1 (36) 0% 22,2% 63,9% 13,9%

2 (64) 1,6% 14,1% 62,5% 21,9%

3 (27) 0% 11,1% 33,3% 55,6%

Tab. 20: Kreuztabelle von uPA mit PAI-1. Bei den Angaben in Klammern handelt es sich um die jeweilige Fallzahl n.

Ergebnisse

59

3.6 Die Therapien der einzelnen Untergruppen für Rad51 und Ki-67 Wenn in einem Kollektiv Untergruppen gebildet werden, ist es wichtig zu wissen,

ob sich diese Untergruppen in der verabreichten Therapie unterscheiden.

Wünschenswert wäre eine Gleichbehandlung der Kollektivuntergruppen, um die

gleiche Basis für die statistische Analyse zu gewährleisten. Für die sich als

signifikant herausgestellten Färbungen Rad51 und Ki-67 wird dieses entsprechend

überprüft. In den Tabellen 21 und 22 ist der prozentuale Anteil der in den

Untergruppen verabreichten Therapieformen dargestellt. Ebenfalls aufgeführt ist

das Gesamtkollektiv.

Therapiemöglichkeit Fallzahl (n) Rad51 (< 31%) Rad51 (>31%) Gesamtkollektiv

(Angabe in %) (n) (%)

Chemotherapie keine 82 82,9 17,1 84 58,7

erhalten 58 67,2 32,8 58 40,6

Radiatio keine 36 75 25 37 25,9

erhalten 105 77,1 22,9 106 74,1

Endokrine

Therapie

keine 36 63,9 36,1 36 25,2

erhalten 105 81 19 107 74,8

Tab. 21: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Rad51 Subklassen und im Gesamtkollektiv.

Therapiemöglichkeit Fallzahl (n) Ki-67 (< 25%) Ki-67(> 25%) Gesamtkollektiv

(Angabe in %) (n) (%)

Chemotherapie keine 84 70,2 29,8 84 58,7

erhalten 57 61,4 38,6 58 40,6

Radiatio keine 36 61,1 38,9 37 25,9

erhalten 106 68,9 31,1 106 74,1

Endokrine

Therapie

keine 35 65,7 34,3 36 25,2

erhalten 107 67,3 32,7 107 74,8

Tab. 22: Prozentualer Anteil der verabreichten Therapieformen in den Ki-67-Subklassen und im Gesamtkollektiv.

Diskussion

60

4. Diskussion

In dieser Studie wurden erstmals gemeinsam die Expression des

Rekombinationsfaktors Rad51, des Proliferationsmarkers Ki-67 und die

Expression des Uroplasminogenaktivatorsystems mit dem

Uroplasminogenaktivator uPA und dem Inhibitor PAI-1 im Mammakarzinom in

Bezug auf ihre prognostische Aussagefähigkeit untersucht. Es wurde ein

Verfahren verwendet, das von vornherein eine Umsetzbarkeit für die Routine

gewährleisten und bei der Beurteilung eine möglichst große diagnostische

Sicherheit geben sollte - die Immunhistochemie.

4.1 Patientinnenkollektiv

4.1.1 Das Alter der Patientinnen Der Altersmedian liegt in unserem Kollektiv bei 63 Jahren und entspricht somit

dem in der Literatur angegebenen mit einem Altersgipfel von 50-70 Jahren

[Schmidt-Matthiesen et al., 2002]. Im Tumorregister München findet sich für das

mittlere Erkrankungsalter mit 61,4 Jahren ein vergleichbarer Wert [Sauer, 2005].

4.1.2 Histologischer Typ Histologisch sind 86,7% der invasiven Karzinome dieser Studie duktal und 13,3%

lobulär. Literaturquellen beziffern den invasiv duktalen Typ mit 40-75% und den

invasiv lobulären Tumortyp mit 5-15% [Sauer 2005]. Das untersuchte Kollektiv ist

somit repräsentativ, der höhere Anteil des duktalen Anteils erklärt sich durch das

Nichtbetrachten weiterer histologischer Entitäten im Rahmen dieser Studie. In

anderen Untersuchungen werden differente histologische Formen in bis zu 17%

beobachtet [Minisini et al., 2007; Offersen et al., 2007].

4.1.3 Primärtumorgröße Die Primärtumorgröße unterteilt sich nach der TNM-Klassifikation

folgendermaßen: 39,9% entsprechen einer Primärtumorgröße pT1, 41,3% einem

pT2-Status, 3,5% einer pT3-Größe und weitere 15,4% sind pT4-Karzinome. Die

hohe Anzahl der primären T4-Tumore ist wahrscheinlich einerseits auf späte

Diskussion

61

Diagnosestellungen bei einem eher ländlichen Patientinnenkollektiv und

andererseits auf einen potentiellen Bias in der Patientenauswahl zurückzuführen.

Da nur Patientinnen aufgenommen wurden, bei denen ein Follow-up vorlag,

welches häufiger bei Patientinnnen größerer Tumorstadien der Fall ist, werden

dadurch mehr Patientinnen der fortgeschrittenen Tumorgrößen erfasst, da diese

sich im Verlauf in der Regel häufiger in der Klinik vorstellen. Dieses muss

entsprechend kritisch betrachtet werden, da sich dadurch im Kollektiv ein Bias

ergibt. Verglichen mit der Feldstudienkohorte (n=3210) des Münchener

Tumorregisters [Sauer, 2005] unterscheidet sich das vorliegende Kollektiv im

prozentualen Anteil der größeren Primärtumore auf Kosten der kleineren T1-

Tumore (Tumorregister München: T1 51,3%; T2 33,4%; T3 4,9%; T4 5,0%). Eine

Auswertung amerikanischer Tumordaten der Jahre 1988-2003 zeigt einen noch

größeren Anteil von kleineren Tumoren (T1-Tumore: 64,8%, T2-Status: 30,9% und

T3/T4-Tumore: 4,3%) [Mc Bride et al., 2007].

4.1.4 Nodalstatus Der Anteil der nodalnegativen Patientinnen (n=140) beträgt im vorliegenden

Kollektiv 56,6 %. Dieser prozentuale Anteil entspricht trotz des hohen Anteils an

initialen T4-Tumoren den Angaben der Literatur (Tab. 23). Den Erwartungen hätte

ein im Vergleich höherer Anteil an nodalpositiven Patientinnen entsprochen.

Verglichen mit der Feldstudienkohorte aus München von 1996-98 trifft dieses auch

zu. Von anderen Untersuchungsergebnissen abweichend stellt sich in der Analyse

des rezidivfreien Überlebens heraus, dass Patientinnen mit Nodalstatus N2 ein

besseres Überleben haben als Patientinnen, die in die Subklasse N1 eingeteilt

sind. Entsprechend vorheriger Analysen zeigt sich für das metastasenfreie

Überleben ein längeres Überleben, umso weniger Lymphknoten befallen sind.

Studie nodalnegative Patientinnen

Zeitraum n Land

eigenes Kollektiv 56,6% 1992-1998 143 Deutschland Jansen et al., 1998 53,7% 1982-1987 341 Maastricht, Niederlande Mc Bride et al., 2007 66,5% 1988-2003 256174 USA Look et al., 2002 56% 1978-1995 8377 Europa Harbeck et al., 2002 51% 1987-1999 3424 Europa Sauer 2005 63,4% 1996-1998 3210 Deutschland Offersen et al., 2007 48% 1990-1994 438 Dänemark Göhring et al., 1996 46% 1983-1989 296 Deutschland

Tab. 23: Anteil nodalnegativer Patientinnen im Vergleich mit weiteren Studien zum Mammakarzinom (n=Fallzahl).

Diskussion

62

4.1.5 Histologisches Grading Das histologische Grading unserer Studie zeigt eine Verteilung von 18% G1-, 57%

G2- und 25% G3-Tumore. Dies ist repräsentativ, allerdings findet sich in anderen

Studien ein etwas höherer Anteil an Tumoren mit einer schlechteren

Differenzierung. Interessant wäre in diesem Zusammenhang aufgrund der Größe

der Fallzahl die Unterteilung der Differenzierung G1 und G2 bei Mc Bride et al., die

jedoch nicht vorgenommen wurde. Der Differenzierungsgrad von

Vergleichskollektiven ist Tabelle 24 zu entnehmen.

Studie G1 G2 G3 n Gesamtkollektiv Land eigenes Kollektiv 18% 57% 25% 143 143 Deutschland Göhring et al., 1996 15% 54% 30% 311 311 Deutschland Gonzalez et al., 1999 21% 42% 37% 127 127 Spanien Look et al., 2002* 7% 27% 33% 5606 8377 Europa Engel et al., 2003 7% 56% 37% 12432 12432 Deutschland Offersen et al., 2007 19% 34% 31% 370 438 Dänemark Mc Bride et al., 2007 51,5% 33,1% 216637 256174 USA

Tab. 24: Histologisches Grading in verschiedenen Mammakarzinomkollektiven (n = Studienumfang/Fallzahl, * = In dieser Metaanalyse war das Grading bei einem Drittel der Patienten

unbekannt.).

4.1.6 Hormonrezeptorstatus Die Hormonrezeptoren zeigen für dieses Kollektiv folgende Verteilung: 71,3% der

Tumore sind östrogenrezeptorpositiv und 69,9% haben einen positiven

Progesteronrezeptorstatus. Wertet man den Hormonrezeptorstatus gesamt als

positiv, sobald einer der beiden Rezeptoren positiv ist, dann sind in diesem

Kollektiv 81,9% der Tumore positiv. Diese Werte sind vergleichbar mit Angaben

anderer Studien (siehe Tab. 25). Der vergleichsweise niedrige Wert bei Mc Bride

et al. von 64% ist möglicherweise dadurch erklärbar, dass in diesem Kollektiv bei

20% der Rezeptorstatus unbekannt war.

Studie PR + ER + ER oder PR +

n Gesamtkollektiv Land

eigenes Kollektiv 69,9% 71,3% 81,9% 138 143 Deutschland Friedrichs et al., 1993 60% 69% 156 156 Deutschland Göhring et al., 1996 69% 301 311 Deutschland Gonzalez et al., 1999 53,5% 69,3% 127 127 Spanien Look et al., 2002 80% 8377 8377 Europa Yousef et al., 2002 51,7% 60% 170*/169** 178 Italien Mc Bride et al., 2007 64,3% 204853 256174 USA Offersen et al., 2007 71,9% 438 438 Dänemark

Tab. 25: Prozentualer Anteil hormonrezeptorpositiver Tumore (n= Studienumfang/Fallzahl, *bezieht sich auf den Progesteronrezeptorstatus, **bezieht sich auf den Östrogenrezeptorstatus).

Diskussion

63

4.1.7 Tumorprogredienz Bei einer medianen Nachbeobachtungszeit von 62 Monaten (Spannweite 4 - 120

Monate) erlitten 28% der Patientinnen unseres Kollektivs ein Lokalrezidiv. Dies ist

zunächst weniger als in der Literatur angegeben, allerdings muss angemerkt

werden, dass diese Erhebungen im Median auch eine längere

Nachbeobachtungszeit haben, was diesen Unterschied erklärt. Die

Metastasierungsereignisse scheinen in dieser Studie mit 41% recht hoch. Offersen

et al. zeigen über einen fast doppelt so langen Nachbeobachtungszeitraum fast

die gleiche prozentuale Rate an Metastasierungen und weniger Rezidive. Da

Yousef et al. nicht zwischen Metastase und Rezidiv differenzieren, bleibt die

Frage, inwiefern, man diese Studie zum Vergleich heranziehen kann. Es bleibt

jedoch zu bedenken, dass es sich um zwei Studien relativ kleiner Fallzahlen

handelt (siehe Tab. 26). Potentielle Erklärungsmöglichkeit für den hohen Anteil an

Metastasierungsereignissen ist der bereits bei Diagnosestellung hohe Anteil

großer Tumore (pT4-Tumore: 15,4%), welcher gegebenenfalls durch den bereits

oben erwähnten Bias beim Patienteneinschluss bedingt ist (siehe dazu auch

4.1.3).

Viele Autoren betrachten den Todesfall als wesentliches Ereignis zur

Beschreibung eines Patientenkollektivs. Im Rahmen dieser Studie lagen dazu

jedoch nicht hinreichend Daten vor.

Studie medianes Follow-up [in Monaten]

Metastasierungs-ereignis [in %]

Rezidivereignis [in %]

n Land

eigenes Kollektiv 62 (4-120) 41 % 28% 143 Deutschland Göhring et al., 1996 62 34% 301 Deutschland Look et al., 2002 79 (46-120*) 35% 8377 Europa Offersen et al., 2007 123 (0-174) 39% 8% 438 Dänemark Yousef et al., 2002 76 36%’’ 164 Italien Harbeck et al., 2002 83 (1-183) 38,5% 3424 Europa

Tab. 26: Anteil der Patientinnen mit Rezidiv oder Fernmetastasierung im medianen Nachbeobachtungszeitraum (n= Studienumfang/Fallzahl, *Median der 18 betrachteten Kollektive und Medianspannweite, ’’ keine Differenzierung innerhalb der Studie zwischen Metastase und Rezidiv).

Diskussion

64

4.2 Färbeverfahren Die Färbemethodik wurde in Anlehnung an ein in der Arbeitsgruppe etabliertes

Verfahren (Protokoll I) und ein in der Laborroutine angewandtes Verfahren

(Protokoll II) mit entsprechenden Qualitätskontrollen, Negativ- wie

Positivkontrollen, durchgeführt. Die Immunhistochemie gilt als eine einfache und

gut reproduzierbare Methode, hat jedoch den Nachteil, dass die Ergebnisse

dadurch, dass sie vom Untersucher ausgewertet werden, mit einer gewissen

Subjektivität behaftet sind. Diesen Fehler könnte man durch eine möglichst große

Anzahl von Untersuchern mit gemittelten Untersuchungsergebnissen minimieren.

Bei dieser Studie wurde die Auswertung von nur einem erfahrenen Untersucher in

Unkenntnis der histologischen Tumordaten (Primärtumorgröße, Nodalstatus,

Grading, Hormonrezeptorstatus) durchgeführt.

Für uPA und PAI-1 gibt es kein standardisiertes etabliertes

immunhistochemisches Verfahren. Es wurden zwar bisher immunhistochemische

Färbungen mit Antikörpern zum Nachweis von uPA und PAI-1 durchgeführt

[Dublin et al., 2000; Ferrier et al., 1999; Constantini et al., 1996; Jankun et al.,

1993], allerdings wurden bisherige Untersuchungen mit dem Ziel der

prognostischen und prädiktiven Aussagefähigkeit dieser Marker hauptsächlich an

Frischgewebe mittels ELISA vorgenommen [Pedersen et al., 2003; Harbeck et al.,

2002; Jänicke et al., 2001]. Vergleiche beider Verfahren zeigten inzwischen, dass

die Ergebnisse nicht zwangsläufig miteinander korrelieren und ihre Wertigkeit für

die klinische Aussagefähigkeit unterschiedlich ist [Ferrier et al., 1999]. Bisher gilt

daher die Untersuchung mittels ELISA als Standard. Nur diese Methodik ist bisher

in den Leitlinien der American Society of Clinical Oncology (ASCO) sowie der

Arbeitsgemeinschaft für Gynäkologische Onkologie anerkannt [AGO, 2010].

Da es sich beim Untersuchungsgut dieser retrospektiven Studie ausschließlich um

Paraffinmaterial handelt, steht in diesem Fall für die Untersuchung von uPA und

PAI-1 nur die Immunhistochemie als Untersuchungsmethode zur Verfügung. Bei

Planung dieser Arbeit war die Dominanz durch die bessere

Standardisierungsmöglichkeit der ELISA-Technik noch nicht abzusehen, so dass

es zu diesem Zeitpunkt als sinnvoll erachtet wurde, diese beiden Marker ebenfalls

immunhistochemisch zu färben. Diese Methodik gibt zwar gute Informationen über

Diskussion

65

die Verteilung der Marker in den einzelnen Gewebszellen, ist jedoch weniger

sensitiv als der ELISA. Problematisch ist ebenfalls, dass es eine semiquantitative

Methode ist, die bisher kein einheitliches Auswertungsverfahren hat. Sie wurde

noch nicht standardisiert und stellt somit im Vergleich zum ELISA für diese Marker

die schlechtere Methodik dar. Diese beiden Methoden kann man demzufolge auch

nicht als austauschbar, sondern nur als ergänzend ansehen.

Diskussion

66

4.3 Analyse der Studienergebnisse Das primäre Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von Rad51 hinsichtlich seiner

Bedeutung als Prognoseparameter für das Mammakarzinom.

Tabelle 27 zeigt die Qualitätskriterien für prognostische Parameter nach den

aktuellen Qualitätskriterien der AGO-Empfehlungen [AGO, 2010].

Biologische Hypothese

Einfache und qualitätsgesicherte Bestimmungsmethode

Prospektive statistische Evaluierung

Validierung der klinischen Bedeutung nach Evidenzniveau

Klinische Relevanz für Therapieentscheidungen

Tab. 27: Qualitätskriterien für Prognoseparameter [AGO, 2010].

In den letzten Jahren zeigt sich eine Erweiterung der klassischen

histopathologischen Prognoseparameter durch die Hinzunahme tumorbiologischer

Faktoren, u. a. auf der Ebene der Molekularbiologie. Zu Parametern wie Protein-

und Methylierungs- und Genprofilen liegen bislang noch wenige Daten vor, sie

sind jedoch erstmalig im vergangenen Jahr in die Leitlinien aufgenommen worden.

Die aktuellen prognostischen Parameter sind mit entsprechendem Evidenzniveau

in Tab. 28 aufgeführt.

Diskussion

67

Prognostischer Faktor Evidenzniveau Tumorgröße 1a Nodalstatus 1a Metastasierung 1a Histologischer Tumortyp 2b Grading (Elston-Ellis) 2a Alter 2a Peritumorale Lymphgefäß- und Gefäßinvasion 2b Östrogen-/Progesteronrezeptorstatus 2a uPA/PAI-1 (ELISA) 1a Triple-negative/ basal cell-like tumor 2b HER-2 (IHC, FISH) 2b Tumorzellen im Knochenmark 1a Proliferationsmarker:

Thymidin-labeling Index S-phase fraction Ploidy Ki-67

2b 1b 2b 2b 2b

seit kurzem erhältliche Gen- Methylierungs- oder Proteinprofile

2b

Computer gesteuerte Entscheidungshilfen 2b Lebensstil 2ba BMI > 25 kg/m2 2ba

Tab. 28: Überblick der prognostischen Faktoren des Mammakarzinoms mit entsprechendem Evidenzniveau [AGO, 2010].

Weitere mögliche prognostische Marker sind Parameter der DNA-

Reparaturmechanismen der Zelle, die die Integrität der Erbinformation wahren

sollen. Exogene Einfüsse, wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung oder

chemische Noxen als auch endogene Einflüsse wie DNA-schädigende

Stoffwechselmetabolite und Hypoxie stellen hohe Anforderungen an die DNA-

Integrität jeder Zelle. Die Funktionsfähigkeit des DNA-Reparaturprozesses führt

optimalerweise entweder zu integerer Zell-DNA oder bei Irreparabilität langfristig

zur Apoptose.

Tritt dieser Idealfall nicht ein, so resultieren nicht integere DNA bzw.

überlebensfähige Vorstufen zur Apoptose, die an Tochterzellen weitergegeben

werden.

Die Funktionalität und auch das Aktivitätsmaß des Reparaturmechanismus einer

Zelle könnte ein Zugangsweg sein, den Ist-Zustand dieses veränderten

Zellzustandes zu erfassen. Je exakter dieses gelingt, umso wahrscheinlicher kann

daraus eine prognostische Aussagefähigkeit abgeleitet werden.

Diskussion

68

4.3.1 DNA-Reparatur Es werden zwei wesentliche Reparatursystemgruppen unterschieden: diejenigen,

die auf Doppelstrangbruchreparatur spezialisiert sind und alle weiteren

Reparatursysteme.

Zu letzteren gehört das Mismatchreparatursystem (MMR), welches für die

Korrektur falsch eingebauter Nukleotide und für die Korrektur von Mismatches in

Heteroduplexbereichen verantwortlich ist [Knippers, 2001]. Beispielhaft für die

Relevanz der Intaktheit dieser Reparatursysteme sei das hereditäre nicht-

polypöse Kolonkarzinom (HNPCC) genannt, welches als Folge von Mutationen

dieser Enzymsysteme oder durch Mikrosatelliteninstabilität entstehen kann [Sheng

et al., 2009; Rustgi, 2007].

Weitere wichtige Reparatursysteme dieser Art sind die Basen-Exzisions-

Reparatur, vor allem für endogene DNA-Schäden durch Hydrolyse,

Hydroxylradikale und Methylierungen, und die Nukleotid-Exzisions-Reparatur,

eingesetzt bei DNA-Schäden durch polycyclische Kohlenwasserstoffe und

ultraviolettes Licht [Knippers, 2001]. Xeroderma pigmentosum ist beispielsweise

auf eine defekte Nukleotid-Exzisions-Reparatur zurückzuführen.

Zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen steht das „non-homologous-end-joining“

(NHEJ), die Verbindung nicht homologer DNA-Enden und die homologe

Rekombination (HR), ein potentiell fehlerfreier Reparaturmechanismus, zur

Verfügung.

Der im Zusammenhang mit Rad51 wichtigste Reparaturprozeß der Zelle ist die

homologe Rekombination zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen. Es

werden verschiedene Abläufe unterschieden: dobble-strand break repair (DSBR),

das synthesis-dependent-strand-annaeling (SDSA), single-strand annealing (SSA)

und die break-induced replication (BIR) [Sung und Klein, 2006]. DSBR und SDSA

sind abhängig vom „strand-invasion process“, somit abhängig von Rad51. SSA

verläuft unabhängig von Rad51 [Pohl und Nickoloff, 2008; Storici et al., 2006;

Ivanov et al., 1996; Malkova et al., 1996] und BIR wird als von Rad51 abhängig

beschrieben, kann jedoch auch bei Abwesenheit von Rad51 stattfinden [Malkova

et al. 2005; Davis und Symington, 2004; Malkova et al., 1996].

Diskussion

69

4.3.2 Das biologische Modell von Rad51 Rad51, das Äquivalent zum prokaryotischen RecA Protein, ist ein zentraler Faktor

der homologen Rekombination. Es ist eine Rekombinase, die die Möglichkeit hat,

ATP zu binden und zu hydrolysieren [Sung und Klein, 2006; Sung et al., 1994].

Ungebunden liegt Rad51 als Proteinring vor. Es besteht aus 6 bis 7 Monomeren.

Nach Einzelstrangbindung wird über eine hochstrukturierte rechtsgedrehte

Polymerstruktur das sogenannte „presynaptic filament“ gebildet [Sung und Klein,

2006; Yu et al., 2001]. Auf diese Weise wird das Paaren der homologen DNA

Sequenzen ermöglicht, was auch essentiell für den „strand-invading Prozess“ der

homologen Rekombination ist [Turner et al., 2004]. Rad51 ist als zentrales Protein

in ein komplexes Reparaturenzymsystem, die Rad52 epistasis group,

eingebunden.

Die homologe Rekombination verläuft in mehreren Schritten. Voraussetzung ist

zunächst die DNA-Schädigung mit der Folge eines DNA-Doppelstrangbruchs

durch exogene Einflüsse oder durch endogene Prozesse wie beispielsweise das

Abreißen der Replikationsgabel während versuchter Replikation über einem

Einzelstrangbruch [Henning und Stürzbecher, 2003]. Dieser Prozess beginnt

zunächst mit regulierter 5’-3’ Einzelstrangresektion durch den MRX-Komplex

(bestehend aus Mre11, Rad50, Xrs2) und Bindung der Einzelstrang-DNA durch

das Replication Protein A (RPA) [Pohl und Nickoloff, 2008]. RPA wird

anschließend durch Rad51 ersetzt, um das präsynaptische Filament zu bilden. Auf

diese Weise entsteht das katalytische Zentrum für die HR, das die örtliche Nähe

des Einzelstrangs mit dem zu rekombinierenden Doppelstrang bildet.

Unterstützende und stabilisierende Wirkung bei der presynaptic filament-Bildung

haben Rad52, Rad55 und Rad57 [Symington, 2002]. Rad54 interagiert ebenfalls

mit Rad51 und verbessert nach erfolgreicher präsynatischer Filamentbildung

möglicherweise durch Minimierung von Inhibitoren den Reparaturprozess

[Henning und Stürzbecher, 2003]. Nach erfolgter „strand-invasion“ und DNA-

Synthese kann es bei der Doppelstrangbruchreparatur über zwei

Holidaystrukturen, nach DNA-Lückenschluss, zu einer Komplexauflösung mit oder

ohne Crossover kommen. Verläuft der Reparaturprozess über den SDSA-Weg,

kommt es im Verlauf nicht zum Crossover [Sung und Klein, 2006].

Diskussion

70

Rad51 kann als Bestandteil des katalytischen Zentrums der homologen

Rekombination möglicherweise als Marker für das Maß der DNA-Schädigung

dienen. Damit gibt es potentiell eine Möglichkeit, über den Aktivitätszustand der

homologen Rekombination Rückschlüsse auf das Maß der Zellschädigung zu

schließen.

4.3.3 Rad51 – seine übergeordnete Regulation Inwieweit Rad51 als Maß der DNA-Schädigung dienen kann, hängt unter anderem

von übergeordneten regulativen Prozessen ab, die die Funktion von Rad51

beeinflussen können.

Die Frage, welche Faktoren wesentlich dafür sind, welcher Reparaturprozeß bei

DNA-Doppelstrangbrüchen erfolgt, ist nicht endgültig geklärt. Abhängig vom

Zellzyklus kommen einzelne Reparaturmechanismen stärker zum tragen: In der

G1 Phase findet sich hauptsächlich NHEJ und wenig HR, während in der S- und

G2 Phase schwerpunktmäßig die HR stattfindet [Turner et al., 2004; Henning und

Stürzbecher, 2003]. Maligne Zellverbände haben im Gegensatz zu benignem

Gewebe einen höheren Anteil von Zellen, die sich in der S- und G2-Phase des

Zellzyklus befinden [Choudhury et al. 2006].

Es gibt Hinweise in der Literatur, dass Reparaturprozesse um Doppelstrangbrüche

konkurrieren, so zum Beispiel NHEJ und HR [Henning und Stürzbecher, 2003].

Nach erfolgter Sättigung des NHEJ-Prozesses kommt es zur vermehrten HR

[Saintigny et al., 2001].

Das Tumorsuppressorgen p53 scheint in diesem Zusammenhang eine große

Rolle zu spielen: Einerseits steuert es den Zellzyklus und die Apoptose über seine

Transkriptionsaktivität. Andererseits beeinflusst es die HR in Früh- und

Spätphasen dieses Prozesses über Interaktion mit Intermediärstrukturen wie auch

über Interaktion mit an der HR beteiligten Proteine, so auch durch Interaktion mit

Rad51 [Bertrand et al., 2004]. Im Zusammenhang mit dem Arrest der

Replikationsgabel wird ein Einfluss von p53 auf die Regulation der HR in diesem

Rahmen angenommen [Saintigny und Lopez, 2002].

Es kommt über p53 zu einer Verminderung der HR mit dem Ziel, die genomische

Integrität durch ein zu hohes Maß an Rekombination zu wahren. p53 agiert nach

durch DNA-Strukturveränderung bedingtem Recruitment der ATM- und ATR-

Diskussion

71

Kinasen, welche Zielproteine der Zellykluskontrolle phosphorylieren, wozu auch

p53 gehört [Choudhory et al., 2006].

Die Brustkrebssuszeptibilitätsgene BRCA I und BRCA II stehen ebenfalls im

Zusammenhang mit Rad51. Bei BRCA I handelt es sich um ein hauptsächlich

nukleär lokalisiertes Protein mit Tumorsuppressorfunktion. Es übernimmt

einerseits Aufgaben im Transkriptionsprozess [Chapman und Verma, 1996], im

Zellzykluswechsel [Larson et al., 1997], aber auch im Rahmen der DNA-Reparatur

[Scully et al., 1997]. Maximale Expression findet sich in der S-Phase des

Zellzyklus [Ruffner und Verma, 1997]. Es konnte gezeigt werden, dass in

genetisch veränderten BRCA I defizienten Zellen im Vergleich zu den paternalen

Zellen weniger homologe und vermehrt nicht homologe Rekombination stattfindet

[Snouwaert et al., 1999]. Eine direkte Interaktion von Rad51 mit BRCA I im

Reparaturprozess ist relativ unwahrscheinlich [Venkitaraman 2002], angenommen

wird ein indirektes Interagieren bei nachgewiesener Interaktion von Rad51 mit

BRCA II [Venkitaraman 2002; Chen et al., 1998; Marmorstein et al., 1998]. Beide

Proteine sind notwendig für eine effiziente HR, wobei der genaue Mechanismus

weiter unklar ist [Venkitaraman, 2002]. Es wurde gezeigt, dass BRCA II über seine

BRC Wiederholungssequenzen im Exon 11 direkt mit Rad51 interagiert [Chen et

al., 1998] und so eine regulative Funktion über Rad51 ausübt [Wong et al., 1997].

Wahrscheinlich ist, dass BRCA II Einfluss auf die Aktivität und Verfügbarkeit von

Rad51 hat [Venkitaraman, 2002]. Bei Patientinnen mit einer Mutation von BRCA I

und/oder BRCA II ist somit mit einer Veränderung der Rad51 Aktivität wie

Verfügbarkeit und folglich mit einer abweichenden Reparaturenzymaktivität der

Zelle zu rechnen. Die genetische Belastung der Patientinnen ist bei diesem

Kollektiv jedoch nicht bekannt.

4.3.4 Rad51 als Prognoseparameter Die Hypothese dieser Arbeit ist, dass eine hohe Rad51 Expression mit einer

kürzeren Überlebensrate korreliert.

Dafür spricht, dass im Tumorgewebe im Vergleich zu Normalgewebe eine

Verlagerung des Zellzyklus zur S- und G2-Phase stattfindet, in denen die

Reparatur nicht schwerpunktmäßig durch NHEJ, sondern durch die HR

Diskussion

72

durchgeführt wird. Es müssten also vermehrt Enzyme der HR nachgewiesen

werden können, so auch Rad51.

Im Mammakarzinomgewebe konnte im Vergleich zu benignem Mammagewebe

eine höhere Rad51 Expression nachgewiesen werden [Opitz, 2001; Hebenbrock,

2009].

Rad51 wurde bereits als unabhängiger prognostischer Parameter im

Zusammenhang mit dem kleinzelligen Bronchialkarzinom detektiert [Qiao et al.,

2005]. Höhere Rad51 Expressionen konnten im Zusammenhang mit dem

Pankreaskarzinom [Han et al., 2002; Maacke et al., 2000a] und dem

Mammakarzinom [Maacke et al., 2000b] nachgewiesen werden. Die Expression

des Mammakarzinoms korrelierte mit etablierten prognostischen Parametern wie

dem Grading [Maacke et al., 2000b].

Andererseits zeigen andere Arbeiten abweichende Ergebnisse: Søderlund et al.

fanden bei prämenopausalen Patientinnen mit einem früh erkannten

Mammakarzinom eine Korrelation zwischen einer niedrigen Expression des

BRCAI/BRCAII/Rad51-Komplex, wie auch von Rad51 mit einem hohen Grading

[Søderlund et al., 2007]. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine BRCA-Mutation

vorliegt, war allerdings aufgrund des Alters der Frauen höher als in unserem

Kollektiv, auch wenn explizit bei den untersuchten Patientinnen kein Hinweis für

eine familiäre Genese vorlag. Bei Patientinnen mit einer Mutation im BRCA-Gen

wäre eine verminderte BRCAI/BRCAII/Rad51-Komplex Expression dadurch

erklärbar, dass in BRCA I defizienten Zellen weniger homologe und vermehrt nicht

homologe Rekombination stattfindet [Snouwaert et al., 1999]. Damit wäre auch

eine niedrigere Rad51 Expression zu erwarten.

Würde sich dieses bestätigen, so hätte Rad51 im Zusammenhang mit BRCA I und

BRCA II eine inverse prognostische Aussagefähigkeit für Rad51. Selbiges würde

bei diesen Patientinnen auch für Rad51 und das Grading gelten.

Yoshikawa et al. zeigen ein reduziertes Rad51-Niveau bei 30% der in ihrem

Kollektiv untersuchten Brustkrebstumore [Yoshikawa et al., 2000]. Dieses Kollektiv

zeigt einen hohen Anteil an hereditären Karzinomen von fast 37% und der Anteil

der sporadischen Karzinome zeigt zu 67% eine abnormale BRCA I Expression, so

dass hier ggf. die reduzierte Rad51 Expression auf Veränderungen im BRCA-

Proteinstoffwechsel zurückzuführen ist.

Diskussion

73

4.3.5 Rad51 – Ergebnisse der Arbeitsgruppe im Vergleich Die Spannweite der Rad51-PCI-Werte unseres Kollektivs zeigt sich mit 0,2% bis

56,7% vergleichbar mit bisherigen Ergebnissen der Arbeitsgruppe: Hier lagen die

Werte von 0% bis 68% [Opitz, 2001], bzw. 0,5% bis 88% [Hebenbrock, 2009]. Der

Median von 16,5% [Opitz, 2001] ist ebenfalls mit dem Median dieser Studie von

18,9% vergleichbar.

Auf die Untersuchung von benignem Gewebe wurde verzichtet, weil unsere

Arbeitsgruppe bereits mehrfach hier eine niedrigere Expression von Rad51

verglichen mit Tumorgewebe nachweisen konnte [Opitz, 2001; Hebenbrock 2009].

Es finden sich weitere Angaben zu einer vermehrten Rad51-Foci-Expression in

menschlichen Tumorzelllinien, unter anderem in CML-, AML-, Cervixkarzinom-,

Mammakarzinom-, Adenokarzinomzelllinien des Kolons und Rektums wie auch bei

Melanom- und Glioblastomzelllinien [Klein, 2008].

Rad51 wurde im Hinblick auf seine prognostische Aussagefähigkeit untersucht:

Rad51 stellt sich als abhängiger Parameter für das rezidiv- und metastasenfreie

Überleben heraus, dabei korrelierte es im Rahmen dieser Studie jedoch mit Ki-67,

dem Alter, dem Progesteronrezeptorstatus, dem Nodalstatus und dem Grading.

Es wurde eine positive Korrelation zwischen Rad51 und Ki-67 bzw. dem Grading

nachgewiesen, wie auch eine negative Korrelation mit dem

Progesteronrezeptorstatus. Dies deckt sich mit den Ergebnissen voriger Studien

[Opitz, 2001]. Der Nodalstatus korreliert in dieser Studie ebenfalls mit Rad51,

ebenso zeigt sich eine signifikant vermehrte Expression bei jüngeren Patientinnen.

Diese beiden Abhängigkeiten konnten in vorherigen Studien nicht gefunden

werden.

Zu unseren Ergebnissen kontrovers konnten Søderlund et al. Rad51 wie auch den

BRCAI/BRCAII/Rad51-Komplex als unabhängigen Parameter nachweisen. Dies

wurde für das Lokalrezidiv, nicht aber für die Fernmetastasierung gefunden. Eine

niedrige Rad51 Expression wird mit einer schlechten Prognose in Verbindung

gebracht [Søderlund et al., 2007]. Unter 4.3.4 wurde jedoch bereits auf das

unterschiedliche Patientinnenkollektiv zu dieser Studie hingewiesen, so dass keine

direkte Vergleichbarkeit gegeben ist. Für eine zum Teil verminderte Expression

Diskussion

74

von Rad51 beim Mammakarzinom sprechen auch die Ergebnisse von Yoshikawa

und Kollegen [Yoshikawa et al., 2000].

Dem eigenen Ergebnis kontrovers zeigt sich weiter eine negative Korrelation im

Grading anderer Autoren [Søderlund et al., 2007; Hebenbrock, 2009]. Da

Søderlund et al. eine niedrigere Expression mit einer schlechteren Prognose in

Verbindung gebracht haben, entspricht diese Korrelation mit dem Grading den

Erwartungen dieser Studie, die jedoch kontrovers zu unserer Hypothese sind.

Eine positive Korrelation mit Ki-67, dem Nodalstatus, dem Grading sowie eine

negative Korrelation mit dem Östrogenrezeptorstatus kann das biologische Modell

von Rad51 als potentiell prognostischen Parameter unterstreichen.

4.3.6 Rad51 und Ki-67 - prognostische Aussagekraft Ki-67 hat sich im Rahmen vieler Studien am Mammakarzinom als unabhängiger

prognostischer Parameter herausgestellt [Colozza et al., 2005; Trihia et al., 2003;

Scholzen und Gerdes, 2000; Jansen et al., 1998; Railo et al., 1997; Brown et al.,

1996; Domagala et al., 1996; Querzoli et al., 1996; Seshadri et al., 1996; Pinder et

al., 1995; Gaglia et al., 1993; Railo et al., 1993]. Auch in unserem Kollektiv

korrelierte Ki-67 in der univariaten Analyse hochsignifikant mit einem schlechteren

rezidiv- und metastasenfreien Überleben (p-Wert: 0,0001, log-rank Test). In der

multivariaten Analyse zeigte sich Ki-67 als unabhängiger prognostischer

Parameter in Bezug auf das rezidivfreie Überleben, nicht jedoch in Bezug auf das

metastasenfreie Überleben. Betrachtet man jedoch nur die nodalnegativen

Patientinnen dieses Kollektivs, stellt sich Ki-67 sowohl für das rezidiv-(p-Wert:

0,0001) als auch für das metastasenfreie Überleben (p-Wert: 0,005) als ein

unabhängiger Parameter dar.

Interessant scheint die Expression von Ki-67 und Rad51 im direkten Vergleich. Im

Chi-Quadrattest nach Pearson zeigt sich mit einer Signifikanz von 0,0001 bei

hohem Ki-67 Index eine entsprechend große Wahrscheinlichkeit, auch eine hohe

Rad51 Expression aufzuweisen. Damit würde Rad51 ebenfalls als

Prognoseparameter dienen, bisher jedoch nur in Abhängigkeit.

Zur weiteren Validierung des Proliferationsmarkers Ki-67 müssten randomisierte,

prospektive Studien durchgeführt werden, außerdem ein allgemein optimierter

Diskussion

75

einheitlicher Cut-off-Wert gefunden werden. Verschiedene Cut-off-Werte einzelner

Arbeiten können Tabelle 29 entnommen werden und liegen zwischen 7 und 34%.

Auch eine Standardisierung des verwendeten Antikörpers könnte zu einer

besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse führen. Bisherige Ergebnisse im

Rahmen einer Metaanalyse zeigten für Ki-67 eine signifikante Assoziation mit dem

Rezidivrisiko wie auch dem Gesamtüberleben [de Azambuja et al., 2007].

Insgesamt gilt Ki-67 noch nicht hinreichend validiert.

Studie Cut-off-Wert

n Signifikanz univariat Signifikanz multivariat rez. met. OS rez. met. OS

vorliegende Studie < 25 % 142 0,0001 0,0001 0,0001 0,173 Railo et al., 1997 < 10 % 212 0,008* 0,008*

Seshadri et al., 1996

< 10 % 740 0,0001 0,0001 0,0002 0,0001

Pinder et al., 1995 <17 %/ >34 %

177 0,003 s

Jansen et al., 1998 < 7 % 341 <0,0001*,

0,05 0,004*;

0,598 Callagy et al., 2006 25% 646 < 0,0001 ns

Tab. 29: Beispielhaft ausgewählte Studien verschiedener Autoren zur prognostischen Aussagefähigkeit des Proliferationsmarkers Ki-67, dargestellt ist die Signifikanz des rezidiv- [rez.], des metastasenfreien

[met.] Überlebens sowie das Gesamtüberleben [OS] des jeweils untersuchten Kollektivs. Weiterhin findet sich der für jede Studie gewählte Cut-off-Wert zur Unterteilung zwischen niedriger und hoher Expression von Ki-67. Bei kursiv gedruckten Werten mit * handelt es sich um das krankheitsfreie und

nicht um das Gesamtüberleben. ns = nicht signifikant, s = signifikant.

4.3.7 PAI-1, uPA und Rad51 - prognostische Aussagekraft Stellvertretend für das Enzymsystem der Serinproteasen wurde der

Uroplasminogenaktivator (uPA) und einer seiner Inhibitoren PAI-1 untersucht.

Ausgehend von der Annahme, dass der Aktivitätszustand als Maß für die

Metastasierungsbereitschaft eines Tumorgewebes gesehen werden kann [Han et

al., 2005], wurde erwartet, bei Tumoren mit hoher uPA und PAI-1 Expression auch

eine hohe Rad51 Expression zu finden. Diese Hypothese wurde jedoch in unserer

Arbeit nicht bestätigt. Im Chi-Quadrattest nach Pearson zeigte sich keine relevante

Korrelation zwischen diesen Parametern mit Rad51. Auch in den durchgeführten

univariaten Analysen des Gesamtkollektivs sowie bei Subgruppenanalysen des

Gesamtkollektivs zeigt sich keine annähernd vergleichbare Signifikanz wie in

anderen Studien. Auf der Basis immunhistochemischer Analysen konnten somit

keine signifikanten Korrelationen mit uPA und PAI-1 gefunden werden.

Diskussion

76

4.3.8 PAI-1 und uPA im Zusammenhang mit dem nodalnegativen Kollektiv Andere Autoren haben herausgearbeitet, dass nodalnegative Patientinnen mit

niedriger Expression von uPA und PAI-1 eine sehr gute Prognose haben und eine

adjuvante Chemotherapie somit nicht indiziert scheint [Jänicke et al., 2001]. Aus

diesem Grund haben wir die nodalnegativen Patientinnen gesondert ausgewertet.

Weder in der uni- noch multivariaten Analyse zeigten sich für PAI-1 signifikante

Ergebnisse. uPA jedoch stellt sich bezüglich des rezidivfreien Überlebens univariat

als signifikant im log-rank Test heraus (p-Wert: 0,0001), in der univariaten Cox-

Regressionsanalyse jedoch nicht als signifikant dar (p-Wert: 0,078). Die erwartete

klare Aussagefähigkeit der Serinproteasen bezüglich der nodalnegativen

Patientinnen findet sich in dieser Studie somit nicht.

uPA und PAI-1 finden sich in den aktuellen Empfehlungen der AGO als

Prognoseparameter, allerdings mit dem Hinweis, dass die Bestimmung mittels

ELISA erfolgt. Eine Übersichtsarbeit von Duffy stellt bereits das Potential dieser

beiden Faktoren besonders für nodalnegative Patientinnen heraus: Die

Serinproteasen könnten helfen, nodalnegative Patientinnen mit niedrigem Risiko

zu identifizieren, für die eine adjuvante Chemotherapie nicht notwendig ist [Duffy,

2002]. Die klinische Validierung dieser Parameter ist mit Studien der

Evidenzklasse 1a belegt [Jänicke et al., 2001; Look et al., 2000], ebenso wie auch

eine Validierung der Methodik mittels ELISA bereits erfolgt ist [Sweep et al., 1998].

Problematisch bei den Ergebnissen unserer Studie ist die angewandte Methodik

der Immunhistochemie. Offen bleibt, wie die Ergebnisse mittels ELISA ausgefallen

wären, da kein Frischgewebe zur Verfügung stand.

4.4 Ausblick Rad51 könnte langfristig einen Prädiktivparameter darstellen und damit eine

Entscheidungshilfe sein, ob eine Chemotherapie notwendig ist. Ein

Zusammenhang mit der Strahlensensitivität und Pharmakoresistenz ist

beschrieben: eine geringe Expression von Rad51 wird mit erhöhter

Strahlensensitivität in Verbindung gebracht [Søderlund et al., 2007; Collis et al.,

2001; Ohnishi et al., 1998; Vispé et al., 1998], im Zusammenhang mit

Diskussion

77

alkylierenden Chemotherapeutika wird eine Rad51 Induktion und somit

zunehmende Resistenz beschrieben [Christodoulopoulos et al., 1999]. Rad51 wird

dadurch für das „molecular targeting“ interessant: Tumorzellen könnten, indem

Rad51 gezielt blockiert wird, für Rad51 bedingte Resistenzmechanismen wieder

sensibilisiert werden und für neue Therapiestrategien zugänglich werden.

Aktuelle Forschungsergebnisse zeigen bei BRCA-defizienten Zellen und Zellen mit

defizienten HR-Reparaturenzymen eine erhöhte Sensitivität für Poly-ADP-Ribose-

Polymeraseinhibitoren (PARP-Inhibitoren) [Rottenberg et al., 2008; McCabe et al.,

2006; Bryant et al., 2005; Farmer et al., 2005]. Hieraus können sich langfristig

erfolgreiche Therapieansätze ergeben: Durch selektive PARP-Inhibition kommt es

zu ineffizienter Einzelstrangreparatur und letztlich persistierenden

Einzelstrangbrüchen. Potentielle Folge sind letzlich vermehrte

Doppelstrangbrüche [Farmer et al., 2005]. Bei defekter homologer Rekombination

bedingt durch BRCA-Mutationen oder gegebenenfalls durch Mutation von Rad51

mit resultierender Fehlfunktion kann dieses bei Akkumulation zu einem letalen

Zellschaden führen. Es konnte auch gezeigt werden, dass Zellen ohne

entsprechende Mutation nicht in gleicher Weise von der PARP-Inhibition betroffen

sind [Bryant et al., 2005]. Dieses könnte in Zukunft ein selektiver Therapieansatz

für ausgewählte Mammakarzinompatientinnen sein und zu einer weiteren

Therapieindividualisierung führen.

Zusammenfassung

78

5. Zusammenfassung

Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung der Frau in Deutschland

– jede 9. Frau ist in ihrem Leben betroffen. Verbesserte Früherkennungsmethoden

und Therapiemöglichkeiten haben zu einer erhöhten Heilungsrate geführt. Durch

verbesserte Kenntnis der Tumorbiologie könnte eine weitere Senkung der

Mortalität durch eine individualisierte Therapie erreicht werden. Neue

Ansatzpunkte in der Therapie bilden Veränderungen der Reparaturenzymsysteme,

wie beispielsweise das der homologen Rekombination, als deren wesentlicher

Bestandteil Rad51 gilt.

In verschiedenen Tumorentitäten konnte eine erhöhte Expression von Rad51

nachgewiesen werden. Für das nicht kleinzellige Bronchialkarzinom wurde Rad51

als unabhängiger prognostischer Marker gefunden [Qiao et al., 2005]. Am

Mammakarzinom wurde eine Korrelation der Rad51 Expression mit dem Grading

detektiert [Maacke et al., 2000b]. Hauptfragestellung dieser retrospektiven Studie

ist die prognostische Bedeutung von Rad51 für das Mammakarzinom. Rad51 wird

dafür mit 3 weiteren Parametern (Ki-67, uPA und PAI-1) hinsichtlich seiner

Aussagekraft in Bezug auf Fernmetastasierung und Lokalrezidive überprüft.

Zusätzlich werden bewährte Prognoseparameter wie der Nodalstatus am Kollektiv

überprüft. Dafür werden 143 Paraffinschnitte von Mammakarzinompatientinnen

immunhistochemisch gefärbt und ausgewertet. Die Rad51 Expression lag

zwischen 0,2% und 56,7% (Median: 18,9%). Ein Schwellenwert von < 31%

unterteilte das Patientinnenkollektiv in 108 Karzinome niedriger und 33 Karzinome

hoher Rad51 Expression (ohne zwei nicht auswertbare Fälle). Rad51 zeigte sich

in dieser Studie als abhängiger prognostischer Parameter, eine unabhängige

prognostische Aussagefähigkeit konnte nur für Ki-67 nachgewiesen werden. uPA

und PAI-1 zeigten keine prognostische Aussagekraft, was vermutlich darauf

zurückzuführen ist, dass die Immunhistochemie nicht die geeignete Methode

darstellt.

Die in der vorliegenden Studie gefundenen Ergebnisse erfordern weitere

Untersuchungen zu Rad51 und dem Mammakarzinom. Vor allem prospektive

Studien, auch unter dem Aspekt der prädiktiven Aussagefähigkeit von Rad51 im

Zusammenfassung

79

Zusammenhang mit BRCA I und BRCA II, könnten langfristig weitreichende

Erkenntnisse zur Chemotherapie und Strahlensensitivität, wie auch zum

„molecular targeting“ und somit zur Therapieindividualisierung geben.

Literaturverzeichnis

80

6. Literaturverzeichnis

• Aaltomaa S, Lipponen P, Vesalainen S, Ala-Opas M, Eskelinen M, Syrjänen K

(1997): Value of Ki-67 immunolabeling as a prognostic factor in prostate

cancer. Eur Urol 32, 410-415.

• Adam L, Vadlamudi R, Kondapaka SB, Chernoff J, Mendelsohn J, Kumar R

(1998): Heregulin regulates cytoskeletal reorganization and cell

migration through the p21-activated kinase-1 via phosphatidylinositol-3

kinase. J Biol Chem 273, 28238-28246.

• AGO Arbeitsgemeinschaft für Gynäkologische Onkologie (2010): Leitlinien der

Organkommission Mamma. URL:http://www.ago-online.de, abgerufen

03/2010.

• Andreasen PA, Kjøller L, Christensen L, Duffy MJ (1997): The urokinase-type

plasminogen activator system in cancer metastasis: a review. Int J

Cancer 72, 1-22.

• Behrendt N (2004): The urokinase receptor (uPAR) and the uPAT-

associated protein (uPARAP/Endo180): membrane proteins engaged in

matrix turnover during tissue remodeling. Biol Chem 385, 103-136.

• Bertrand P, Saintigny Y, Lopez BS (2004): p53’s double life: transactivation-

independent repression of homologous recombination. Trends Genet

20, 235-243.

• Bleyer A, O’ Leary M, Barr R, Ries LAG (2006): Cancer Epidemiology in older

Adolescent and Young Adults 15 to 29 Years of Age, Including SEER

Incidence and Survival: 1975-2000. Chapter 9, National Cancer Institute,

NIH Pub No. 06-5767 Bethesda,

URL:http://seer.cancer.gov/publications/aya/9_breast.pdf, abgerufen 09/07.

• Boccardo F, Rubagotti A, Guglielmini P, Fini A, Paladini G, Mesiti M, Rinaldini

M, Scali S, Porpiglia M, Benedetto C, Restuccia N, Buzzi F, Franchi R,

Massidda B, Distante V, Amadori D, Sismondi P (2006): Switching to

anastrozole versus continued tamoxifen treatment of early breast

cancer. Updated results of the Italian tamoxifen anastrozole (ITA) trial.

Ann Oncol 17, 10-14.


81

• Borre M, Bentzen SM, Nerstrøm B, Overgaard J (1998): Tumor cell

proliferation and survival in patients with prostate cancer followed

expectantly. J Urol 159, 1609-1614.

• Boyd D (1996): Invasion and metastasis. Cancer Metastasis Rev 15, 77-89.

• Brown RW, Allred CD, Clark GM, Osborne CK, Hilsenbeck SG (1996):

Prognostic value of Ki-67 compared to S-phase fraction in axillary node-

negative breast cancer. Clin Cancer Res 2, 585-592.

• Bryant HE, Schultz N, Thomas HD, Parker KM, Flower D, Lopez E, Kyle S,

Meuth M, Curtin NJ, Helleday T (2005): Specific killing of BRCA2-deficient

tumours with inhibitors of poly (ADP-ribose) polymerase. Nature 434,

913-917.

• Buchhop S, Donzelmann B, Nastainczyk W, Stürzbecher HW (1996): Isolation

and chracterization of six monoclonal antibodies raised against human

RAD51 recombinant protein. Hybridoma 15, 205-210.

• Bullwinkel J, Baron-Lühr B, Lüdemann A, Wohlenberg C, Gerdes J, Scholzen T

(2006): Ki-67 protein is associated with ribosomal RNA transcription in

quiescent and proliferating cells. J Cell Physiol 206, 624-635.

• Callagy GM, Pharoah PD, Pinder SE, Hsu FD, Nielsen TO, Ragaz J, Ellis IO,

Huntsman D, Caldas C (2006): Bcl-2 is a prognostic marker in breast

cancer independently of the Nottingham Prognostic Index. Clin Cancer

Res 12 (8), 2468-2475.

• Chapman MS und Verma IM (1996): Transcriptional activation by BRCA1.

Nature 382, 678-679.

• Chen PL, Chen CF, Chen Y, Xiao J, Sharp ZD, Lee WH (1998): The BRC

repeats in BRCA2 are critical for Rad51 binding and resistance to

methyl methanesulfonate treatment. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 5287-

5292.

• Choudhury A, Cuddihy a, Bristow RG (2006): Radiation and new molecular

agents part I: targeting ATM-ATR checkpoints, DNA repair, and the

proteasome. Semin Radiat Oncol 16, 51-58.

• Christodoulopoulos G, Malapetsa A, Schipper H, Golub E, Radding C, Panasci

LC (1999): Chlorambucil induction of HSRad51 in B-cell chronic

lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res 5, 2178-2184.


82

• Clarke M, Collins R, Darby S, Davies C, Elphinstone P, Evans E, Godwin J,

Gray R, Hicks C, James S, MacKinnon E, McGale P, McHugh T, Peto R,

Taylor C, Wang Y; Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group

[EBCTCG] (2005): Effects of radiotherapy and of differences in the

extent of surgery for early breast cancer on local recurrence and 15-

year survival: an overview of randomised trials. Lancet 366, 2087-2106.

• Colleoni M, Viale G, Zahrieh D, Pruneri G, Gentilini O, Veronesi P, Gelber RD,

Curigliano G, Torrisi R, Luini A, Intra M, Galimberti V, Renne G, Nolè F,

Peruzzotti G, Goldhirsch A (2004): Chemotherapy is more effective in

patients with breast cancer not expressing steroid hormone receptors:

a study of preoperative treatment. Clin Cancer Res 10, 6622-6628.

• Collis SJ, Tighe A, Scott SD, Roberts SA, Hendry JH, Margison GP (2001):

Ribozyme minigene-mediated RAD51 down-regulation increases

radiosensitivity of human prostate cancer cells. Nucleic Acids Res 29,

1534-1538.

• Colozza M, Azambuja E, Cardoso F, Sotiriou C, Larsimont D, Piccart MJ (2005):

Proliferative markers as prognostic and predictive tools in early breast

cancer: where are we now? Ann Oncol 1723-1739.

• Constantini V, Sidoni A, Deveglia R, Cazzato OA, Bellezza G, Ferri I, Bucciarelli

E, Nenci GG (1996): Combined overexpression of urokinase, urokinase

receptor, and plasminogen activator inhibitor-1 is associated with

breast cancer progression: an immunhistochemical comparison of

normal, benign, and malignant breast tissues. Cancer 77, 1079-1088.

• Coombes RC, Hall E, Gibson LJ, Paridaens R, Jassem J, Delozier T, Jones SE,

Alvarez I, Bertelli G, Ortmann O, Coates AS, Bajetta E, Dodwell D, Coleman

RE, Fallowfield LJ, Mickiewicz E, Andersen J, Lønning PE, Cocconi G,

Stewart A, Stuart N, Snowdon CF, Carpentieri M, Massimini G, Bliss JM, van

de Velde C, Intergroup Exemestane Study (2004): A randomized trial of

exemestane after two to three years of tamoxifen therapy in

postmenopausal women with primary breast cancer. N Engl J Med 350,

1081-1092.


83

• Crowe JP Jr, Gordon NH, Hubay CA, Shenk RR, Zollinger RM, Brumberg DJ,

McGuire WL, Shuck JM (1991): Estrogen receptor determination and long

term survival of patients with carcinoma of the breast. Surg Gynecol

Obstet 173, 273-278 [abstract].

• Danø K, Behrendt N, Høyer-Hansen G, Johnsen M, Lund LR, Ploug M, Rømer

J (2005): Plasminogen activation and cancer. Thromb Haemost 93, 676-

681.

• Davis AP und Symington LS (2004): Rad51-dependant break-induced

replication in yeast. Mol Cell Biol 24, 2344-2351.

• de Azambuja E, Cardoso F, de Castro G Jr , Colozza M, Mano MS, Durbecq V,

Sotiriou C, Larsimont D, Piccart-Gebhart MJ, Paesmans M (2007): Ki-67 as

prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published

studies involving 12 155 patients. Br J Cancer 96, 1504-1513.

• Dendukuri N, Khetani K, McIsaac M, Brophy J (2007): Testing for HER2-

positive breast cancer: a systemic review and cost-effectiveness

analysis. CMAJ 176, 1429-1434.

• Domagala W, Markiewski M, Harezga B, Dukowicz A, Osborn M (1996):

Prognostic significance of tumor cell proliferation rate as determined by

the MIB-1 antibody in breast carcinoma: its relationship with vimentin

and p53 protein. Clin Cancer Res 2, 147-154.

• Dowsett M (2001): Overexpression of HER-2 as a resistance mechanism to

hormonal therapy for breast cancer. Endocr Relat Cancer 8,191-195.

• Dublin E, Hanby A, Patel NK, Liebman R, Barnes D (2000):

Immunohistochemical expression of uPA, uPAR, and PAI-1 in breast

carcinoma. Fibroblastic expression has strong associations with

tumour pathology. Am J Pathol 157, 1219-1227.

• Duffy MJ (1996): Proteases as Prognostic Markers in Cancer. Clin Cancer

Res 2, 613-618.

• Duffy MJ (2002): Urokinase plasminogen activator and its inhibitor PAI-1,

as prognostic markers in breast cancer: from pilot to level 1 evidence

studies. Clin Chem 48, 1194-1197.


84

• Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group [EBCTCG] (2000):

Favourable and unfavourable effects on long-term survival of

radiotherapy for early breast cancer: an overview of the randomised

trials. Lancet 355, 1757-1770.

• Ellis MJ, Coop A, Singh B, Mauriac L, Llombert-Cussac A, Jänicke F, Miller WR,

Evans DB, Dugan M, Brady C, Quebe-Fehling E, Borgs M (2001): Letrozole

is more effective neoadjuvant endocrine therapy than tamoxifen for

ErbB-1- and/or ErbB-2-positive, estrogen receptor-positive primary

breast cancer: evidence from a phase III randomized trial. J Clin Oncol

19, 3808-3816.

• Ellsworth RE, Ellsworth DL, Patney HL, Deyamin B, Love B, Hooke JA, Shriver

CD (2008): Amplification of HER2 is a marker for global genomic

instability. BMC Cancer 8, 297.

• Elston CW und Ellis IO (1991): Pathological prognostic factors in breast

cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience

from a large study with long-term follow-up. Histopathology 19, 403-410

(abstract).

• Engel J, Eckel R, Kerr J, Schmitt M, Fürstenberger G, Richter R, Sauer H, Senn

HJ, Hölzel D (2003): The process of metastasiation in breast cancer. Eur

J Cancer 39, 1794-1806.

• Esteva FJ und Hortobagyi GN (2004): Prognostic molecular markers in early

breast cancer. Breast Cancer Res 6, 109-118.

• Farmer H, McCabe N, Lord CJ, Tutt AN, Johnson DA, Richardson TB,

Santarosa M, Dillon KJ, Hickson I, Knights C, Martin NM, Jackson SP, Smith

GC, Ashworth A (2005): Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant

cells as a therapeutic strategy. Nature 434, 917-921.

• Ferrier CM, de Witte HH, Straatman H, van Tienhoven DH, van Geloof WL,

Rietveld FJ, Sweep CG, Ruiter DJ, van Muijen GN (1999): Comparison of

immunohistochemistry with immunoassay (ELISA) for the detection of

components of the plasminogen activation system in human tumour

tissue. Br J Cancer 79, 1534-1541.


85

• Fisher B, Anderson S, Bryant J, Margolese RG, Deutsch M, Fisher ER, Jeong

JH, Wolmark N (2002): Twenty-year follow-up of a randomized trial

comparing total mastectomy, lumpectomy, and lumpectomy plus

irradiation for the treatment of invasive breast cancer. N Engl. J Med

347, 1233-1241.

• Friedrichs K, Gluba S, Eidtmann H, Jonat W (1993): Overexpression of p53

and Prognosis in Breast Cancer. Cancer 72, 3641-3647.

• Gaglia P, Bernardi A, Venesio T, Caldarola B, Lauro D, Cappa AP, Calderini P,

Liscia DS (1993): Cell proliferation of breast cancer evaluated by anti-

BrdU and anti-Ki-67 antibodies: its prognostic value on short-term

recurrences. Eur J Cancer 29A, 1509-1513.

• Gasparini G (2001): Clinical significance of determination of surrogate

markers of angiogenesis and breast cancer. Crit Rev Oncol Haematol 37,

97-114.

• Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker HH, Schwab U, Stein H (1984): Cell

cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen

defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 133, 1710-1715.

• Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H (1983): Production of a mouse

monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated

with cell proliferation. Int J Cancer 31, 13-20.

• German Breast Group (2006): NNBC-3 Studie, eine gemeinsame Studie der

AGO Mamma, EORTC Receptor und Biomarker Group und der German

Breast Group (GBG), Prüfplan – Amendment 1 (Version 9, 23.05.2006) –

Deutsche Zusammenfassung. URL:

http://www.germanbreastgroup.de/studien/adjuvant/nnbc-3/einfuehrung.html,

abgerufen 04/09.

• Gianni L (2002): The future of targeted therapy: combining novel agents.

Oncology 63, 47-56.

• Giersiepen K, Heitmann C, Jahnsen K, Lange, C (2005): Brustkrebs.

Gesundheitsberichterstattung des Bundes, Robert Koch-Institut, Heft 25, 7-

11.

• Glück S (2005): Adjuvant chemotherapy for early breast cancer: optimal

use of epirubicin. Oncologist 10, 780-791.


86

• Göhring UJ, Scharl A, Ahr A (1996): Der Stellenwert der

immunhistochemischen Bestimmung von Rezeptoren,

Gewebsproteasen, Tumorsuppressorproteinen und

Proliferationsmarkern als Prognoseindikatoren beim primären

Mammakarzinom. Geburtshilfe Frauenheilkd. 46, 177-183.

• Gonzalez R, Silva JM, Dominguez G, Garcia JM, Martinez G, Vargas J,

Provencio M, Espaňa P, Bonilla F (1999): Detection of loss of

heterozygosity at RAD51, RAD52, RAD54 and BRCA1 and BRCA2 loci in

breast cancer: pathological correlations. Br J Cancer 81 (3), 503-509.

• Gown AM, Goldstein LC, Barry TS, Kussick SJ, Kandalaft PL, Kim PM, Tse CC

(2008): High concordance between immunohistochemistry and

fluorescence in situ hybridisation testing for HER2 status in breast

cancer requieres a normalized IHC scoring system. Mod Pathol. 21,

1272-1277.

• Green MC and Hortobagyi GN (2002): Adjuvant chemotherapy for breast

cancer. Langenbeck’s Arch Surg 387, 109-116.

• Han B, Nakamura M, Mori I, Nakamura Y, Kakudo K (2005): Urokinase-type

plasminogen activator system and breast cancer (Review). Oncol Rep

14, 105-112.

• Han H, Bearss DJ, Browne LW, Calaluce R, Nagle RB, Von Hoff DD (2002):

Identification of differentially expressed genes in pancreatic cancer

cells using cDNA microarray. Cancer Res 62. 2890-2896.

• Harbeck N, Kates RE, Schmitt M (2002): Clinical relevance of invasion

factors urokinase-type plasminogen activator and plasminogen

activator inhibitor type 1 for individualized therapy decisions in primary

breast cancer is greatest when used in combination. J Clin Oncol 20,

1000-1007.

• Harris LN, Yang L, Liotcheva V, Pauli S, Iglehart JD, Colvin OM, Hsieh TS

(2001): Induction of topoisomerase II activity after ErbB2 activation is

associated with a differential response to breast cancer chemotherapy.

Clin Cancer Res 7, 1497-1504.

• Hayaschi S und Yamaguchi Y (2005): Estrogen signaling and prediction of

endocrine therapy. Cancer Chemother Pharmacol 56 (1), 27-31.


87

• Hebenbrock B (2009): Expression der mRNA und des Proteins des

Rekombinationsfaktors Rad51 beim Mammakarzinom. Med. Diss.

Lübeck.

• Henning W und Stürzbecher (2003): Homologous recombination and cell

cycle checkpoints: Rad51 in tumour progression and therapy

resistance. Toxicology 15, 91-109.

• Hicks DG und Tubbs RR (2005): Assessment of the HER Status in breast

cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with

interpretive guidelines. Hum Pathol 36 (3), 250-61.

• Ignatoski KM, Maehama T, Markwart SM, Dixon JE, Livant DL, Ethier SP

(2000): ERBB-2 overexpression confers PI 3’ kinase dependent invasion

capacity on human mammary epithelial cells. Br J Cancer 82, 666-674.

• Ivanov EL, Sugawara N, Fishman-Lobell J, Haber JE (1996): Genetic

requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand

break repair in Saccharomyces cerevisae. Genetics 142, 693-704.

• Jakesz R, Jonat W, Gnant M, Mittlboeck M, Greil R, Tausch C, Hilfrich J,

Kwasny W. Menzel C Samonigg H, Seifert M, Gademann G, Kaufmann M, on

behalf of the ABCSG and the GABG (2005): Switching of postmenopausal

women with endocrine-responsive early breast cancer to anastrozole

after 2 years’ adjuvant tamoxifen: combined results of ABCSG trial 8

and ARNO 95 trial. Lancet 366, 455-462.

• Jänicke F, Prechtl A, Thomssen, Harbeck N, Meisner C, Untch M, Sweep CG,

Selbmann HK, Graeff H, Schmitt M (2001): Randomized adjuvant

chemotherapy trial in high-risk lymph node-negative breast cancer

patients identified by urokinase-type plasminogen activator and

plasminogen activator inhibitor type 1. J Natl Cancer Inst 93, 913-920.

• Jankun J, Merrick HW, Goldblatt PJ (1993): Expression and localization of

elements of the plasminogen activation system in benign breast

disease and breast cancers. J Cell Biochem 53, 135-144.

• Jansen RL, Hupperets PS, Arends JW, Joosten-Achjanie Sr, Volovics A,

Schouten HC, Hillen HF (1998): MIB-1 labelling index is an independent

prognostic marker in primary breast cancer. Br J Cancer 78, 460-465.


88

• Kapp U, Fürstenberger G, Thürlimann B (2007): Primärbehandlung des

frühen Mammakarzinoms. Onkologie 4, 6-10.

• Kim R, Tanabe K, Uchida Y Osaki A, Toge T (2002): The role of HER-2

oncoprotein in drug sensitivity in breast cancer. Oncol Rep 9, 3-9

(abstract).

• Klein HL (2008): The consequences of Rad51 overexpression for normal

and tumor cells. DNA Repair 7, 686-693.

• Knippers (2001): Molekulare Genetik. 8. Aufl., 209-225; 245-283, Georg

Thieme Verlag, Stuttgart.

• Lal P, Salazar PA, Hudis CA, Ladanyi M, Chen B (2004): HER-2 testing in

breast cancer using immunohistochemical analysis and fluorescence in

situ hybridisation: a single-institution experience of 2,279 caes and

comparison of dual-color and single-color scoring. Am J Clin Pathol.

121, 631-636.

• Larson JS, Tonkinson JL, Lai MT (1997): A BRCA1 mutant alters G2-M cell

cycle control in human mammary epithelial cells. Cancer Res 57, 3351-

3355.

• Linder S, Parrado C, Falkmer UG, Blåsjö M, Sundelin P, Rosen von, A (1997):

Prognostic significance of Ki-67 antigen and p53 protein expression in

pancreatic duct carcinoma: a study of the monoclonal antibodies MIB-1

and DO-7 in formalin-fixed paraffin-embedded tumour material. Br J

Cancer 76, 54-59.

• Look MP, van Putten WLJ, Duffy MJ, Harbeck N, Christensen IJ, Thomssen C,

Kates R, Spyratos F, Fernö M, Eppenberger-Castori S, Sweep CG, Ulm K,

Peyrat JP, Martin PM, Magdelenat H, Brünner N, Duggan C, Lisboa BW,

Bendahl PO, Quillien V, Daver A, Ricolleau G, Meijer-van Gelder ME,

Manders P, Fiets WE, Blankenstein MA, Broët P, Romain S, Daxenbichler G,

Windbichler G, Cufer T, Borstnar S, Kueng W, Beex LV, Klijn JG, O’Higgins

N, Eppenberger U, Jänicke F, Schmitt M, Foekens JA (2002): Pooled

Analysis of Prognostic Impact of Urokinase-Type Plasminogen activator

and its inhibitor PAI-1 in 8377 breast cancer patients. J Nat Cancer Inst

94, 116-128.


89

• Maacke H, Jost K, Opitz S, Miska S, Yuan Y, Hasselbach L, Lüttges J, Kalthoff

H, Stürzbecher HW (2000a): DNA repair and recombination factor Rad51

is over-expressed in human pancreatic adenocarcinoma. Oncogene 19,

2791-2795.

• Maacke H, Opitz S, Jost K, Hamdorf W, Henning W, Krüger S, Feller AC,

Lopens A, Diedrich K, Schwinger E, Stürzbecher HW (2000b): Over-

expression of wild-type Rad51 correlates with histological grading of

invasive ductal breast cancer. Int J Cancer 88, 907-913.

• Malkova A, Ivanov EL, Haber JE (1996): Double-strand break repair in the

absence of RAD51 in yeast: A possible role for break-induced DNA

replication. Proc Natl Acad Sci U U A 93, 7131-7136.

• Malkova A, Naylor ML, Yamaguchi M, Ira G, Haber EJ (2005): Rad51-

dependant break-induced replication differs in kinetics and checkpoint

responses from RAD51-mediated gene conversion. Mol Cell Biol 25, 933-

944.

• Marmorstein LY, Ouchi T, Aaronson SA (1998): The BRCA2 gene product

functionally interacts with p53 and Rad51. Proc Natl Acad Sci U S A 95,

13869-13874.

• Mayr D, Sotlar K, Högel B, Permanetter W, Nährig J (2009): Tumorzentrum

München Projektgruppe Mammakarzinome, Empfehlungen zur

Diagnostik, Therapie und Nachsorge Symposium 10.10.2009, Pathologie

des Mammakarzinoms. URL: http://tumorzentrum-

muenchen.de/fileadmin/dateien_allgemein/Vortraege/Mayr_manual_oktober0

9.pdf, abgerufen 04/10.

• Mazouni C, Kau SW, Frye D, Andre F, Kuerer HM, Buchholz TA, Symmans WF,

Anderson K, Hess KR, Gonzalez-Angulo AM, Hortobagyi GN, Buzdar AU,

Pusztai L (2007): Inclusion of taxanes, particularly weekly paclitaxel, in

preoperative chemotherapy improves pathologic complete response

rate in estrogen receptor-positive breast cancers. Ann Oncol 18, 874-

880.

• Mc Bride R, Hershman D, Tsai WY, Jacobson JS, Grann V, Neugut AI (2007):

Within-stage racial differences in tumor size and number of positive

lymph nodes in women with breast cancer. Cancer 110, 1201-1208.


90

• McCabe N, Turner NC, Lord CJ, Kluzek K, Białkowska A, Swift S, Giavara S,

O’Connor MJ, Tutt AN, Zdzienicka MZ, Smith GCM, Ashworth A (2006):

Deficiency in the repair of DNA damage by homologous recombination

and sensitivity to poly(ADP-ribose) polymerase inhibition. Cancer Res

66 (16), 8109-8115.

• Michaelson JS, Silverstein M, Wyatt J, Weber G, Moore R, Halpern E, Kopans

DB, Hughes K (2002): Predicting the survival of patients with breast

carcinoma using tumor size. Cancer 95, 713-723.

• Minisini AM, Fabbro D, Di Loreto C, Pestrin M, Russo S, Cardellino GG,

Andreetta C, Damante G, Puglisi F (2007): Markers of the uPA System and

common prognostic factors in breast cancer. Am J Clin Pathol 128, 112-

117.

• Müllerleile U, Alberti W, Becker K, Blank S, Braumann D, Drescher S Heilmann

P, Hossfeld DK, Jänicke F, Kleeberg UR, Kröger N, Leffern I v., Lietz H,

Lindner C, Maass H, Pauli H, Scheidel P, Schmidt-Rhode P (2002):

Mammakarzinom Leitlinien zur primären Therapie des

Mammakarzinoms 1998 unter Berücksichtigung der Empfehlungen der

Konsensus-Konferenz St. Gallen 1998. Tumorzentrum Hamburg e. V.,

URL: http:// www.tumorzentrumhh.de/Leitlinien/mamma.html, abgerufen

05/2007.

• Muss HB, Thor AD, Berry DA, Kute T, Liu ET, Koerner F, Cirrincione CT,

Budman DR, Wood WC, Barcos M, Henderson IC (1994): c-erbB-2

expression and response to adjuvant therapy in women with node-

positive early breast cancer. New Eng J Med 330, 1260-1266.

• Ohnishi T, Taki T, Hiraga S, Arita N, Morita T (1998): In vitro and in vivo

potentiation of radiosensitivity of malignant gliomas by antisense

inhibition of the Rad51 gene. Biochem Biophys Res Commun 245, 319-

324.

• Offersen BV, Riisbro R, Knoop A, Brünner N, Overgaard J; Danish Breast

Cancer Cooperative Group (DBCG) Tumor Biology Committee (2007): Lack

of association between level of Plasminogen Activator Inhibitor-1 and

estimates of tumor angiogenesis in early breast cancer. Acta Oncologica

46, 782-791.


91

• Opitz S (2002): Der Rekombinationsfaktor Rad51 in invasiv duktalen

Mammakarzinomen: eine Immunhistochemische Studie. Med. Diss.

Lübeck.

• Owens MA, Horten BC, Da Silva MM (2004): HER2 amplification ratios by

fluorescence in situ hybridisation and correlation with

immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin

Breast Cancer. 5, 63-69.

• Pedersen AN, Mouridsen HT, Tenney DY, Brünner N (2003): Immunoassay of

urokinase (uPA) and its type-1 inhibitor (PAI-1) in detergent extracts of

breast cancer tissue. Eur J Cancer 39, 899-908.

• Pinder SE, Wencyk P, Sibbering DM, Bell JA, Elston CW, Nicholson R,

Robertson JF, Blamey RW, Ellis IO (1995): Assessment of the new

proliferation marker MIB1 in breast carcinoma using image analysis:

associations with other prognostic factors and survival. Br J Cancer 71,

146-149.

• Pohl TJ, Nickoloff JA (2008): Rad51-independent interchromosomal double-

strand break repair by gene conversion requires Rad52 but not Rad55,

Rad57, or Dmc1. Mol Cell Biol 28, 897-906.

• Qiao GB, Wu YL, Yang XN, Zhong WZ, Xie D, Guan XY, Fischer D, Kolberg

HC, Kruger S, Stuerzbecher HW (2005): High-level expression of Rad51 is

an idependant prognostic marker of survival in non-small-cell lung

cancer patients. Br J Cancer 93, 137-143.

• Querzoli P, Albonico G, Ferretti S, Rinaldi R, Magri E, Indelli M, Nenci I (1996):

MIB-1 proliferative activity in invasive breast cancer measured by image

analysis. J Clin Pathol 49, 926-930.

• Raderschall E, Stout K, Freier S, Suckow V, Schweiger S Haaf T (2002):

Elevated levels of Rad51 recombination protein in tumour cells. Cancer

Res 62, 219-225.

• Railo M, Lundin J, Haglund C, Smitten K v., Boguslawsky K v., Nordling S

(1997): Ki-67, p53, Er-receptors, ploidy and S-phase as prognostic

factors in T1 node negative breast cancer. Acta Oncol 36, 369-374.


92

• Railo M, Nordling S, von Bugoslawsky K, Leivonen M, Kyllönen L, Smitten K v.

(1993): Prognostic value of Ki-67 immunolabeling in primary operable

breast cancer. Br J Cancer 68, 579- 583.

• Remmele W (Hrsg.) (1997): Pathologie 4. 2. Aufl., 237-338, Springer Verlag,

Berlin.

• Remmele W und Stegner HE (1987): Recommendation for uniform definition

of an immunoreactive score (IRS) for immunohistochemical estrogen

receptor detection (ER-ICA) in breast cancer tissue. Pathologe 8, 138-

140.

• Ross JS, Fletcher JA, Linette GP, Stec J, Clark E, Ayers M, Symmans WF,

Pusztai L, Bloom KJ (2003): The HER-2/neu gene and protein in breast

cancer 2003: biomarker and target of therapy. Oncologist 8, 307-325.

• Rottenberg S, Jaspers JE, Kersbergen A, van der Burg E, Nygren AOH, Zander

SAL, Derksen PWB, de Bruin M, Zevenhoven J, Lau A, Boulter R, Cranston

A, O’Connor MJ, Martin NMB, Borst Pjonkers J (2008): High sensitivity of

BRCA1-deficient mammary tumors to the PARP inhibitor AZD2281

alone and in combination with platinum drugs. Proc Natl Acad Sci U S A

105 (44), 17079–17084.

• Ruffner H und Verma IM (1997): BRCA1 is a cell cycle-regulated nuclear

phosphoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7138-7143.

• Rustgi AK (2007): The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev 21,

2525-2538.

• Saintigny Y, Delacôte F, Varès G, Petitot F, Lambert S, Averbeck D, Lopez BS

(2001): Characterization of homologous recombination induced by

replication inhibition in mammalian cells. EMBO J 20, 3861-3870.

• Saintigny Y und Lopez BS (2002): Homologous recombination induced by

replication inhibition, is stimulated by expression of mutant p53.

Oncogene 21, 488-492.

• Sauer H (Hrsg.) (2005): Manual Mammakarzinome: Empfehlungen zur

Diagnostik, Therapie und Nachsorge. 10. Auflage, W. Zuckschwerdt

Verlag, München.

• Schmidt-Matthießen H, Bastert G, Wallwiener D (2002): Gynäkologische

Onkologie. 7. Aufl., 109- 155 und 234-242, Schattauer Verlag, Stuttgart.


93

• Scholzen T und Gerdes J (2000): The Ki-67 Protein: From the known and the

unknown. J Cell Physiol 182, 311-322.

• Scholzen T, Endl E, Wohlenberg C, van der Sar S, Cowell IG, Gerdes J, Singh

PB (2002): The Ki-67 protein interacts with members of the

heterochromatin protein I (HP I) familiy: a potential role in the regulation

of higher-order chromatin structure. J Pathol 196, 135-144.

• Schwarting R (1993): Little missed markers and Ki-67. Lab Invest 68, 597-

599.

• Scully R, Chen J, Ochs RL, Keegan K, Hoekstra M, Feunteun J, Livingston DM

(1997): Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and

phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell 90, 425-435.

• Seshadri R, Leong AS, McCaul K, Firgaira FA, Settlur V, Horsfall DJ (1996):

Relationship between p53 gene abnormalities and other tumour

characteristics in breast-cancer prognosis. Int J Cancer 69, 135-141.

• Sheng JQ, Zhang H, Ji M, Fu L, Mu H, Zhang MZ, Huang JS, Han M, Li AQ,

Wei Z, Sun ZQ, Wu ZT, Xia CH, Li SR (2009): Genetic diagnosis strategy

of hereditary non-polyposis colorectal cancer. World J Gastroenterol 28

15 (8), 983-989.

• Silverstein MJ, Lewinsky BS, Waisman JR, Gierson ED, Colburn WJ, Senofsky

GM, Gamagami P (1994): Infiltrating lobular carcinoma. Is it different

from infiltrating duct carcinoma? Cancer 73,1673-1677.

• Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A,

Fleming T, Eiermann W, Wolter J, Pegram M, Baselga J, Norton L (2001):

Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for

metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 344,

783-792.

• Snouwaert JN, Gowen LC, Latour AM, Mohn AR, Xiao A, DiBiase L, Koller BH

(1999): BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased

homologous recombination frequency and an increased frequency of

non-homologous recombination that is corrected by expression of

brca1 transgene. Oncogene 18, 7900-7907.


94

• Søderlund K, Skoog L, Fornander T, Askmalm MS (2007): The

BRCA1/BRCA2/Rad51 complex is a prognostic and predictive factor in

early breast cancer. Radiother Oncol 84 (3), 245-251.

• Statistisches Bundesamt Wiesbaden (2005): Sterbefälle nach

Todesursachen, Einzelnachweis ausführliche vierstellige ICD10-

Klassifikation, 2004. URL:https://www-

ec.destatis.de/csp/shop/sfg/bpm.html.cms.cBroker.cls?

Cmspath=struktur,vollanzeige.csp&ID=1023516, abgerufen 09/09.

• Statistisches Bundesamt Wiesbaden (2007): Sterbefälle nach

Todesursachen, Einzelnachweis ausführliche vierstellige ICD10-

Klassifikation, 2006. URL:https://www-

ec.destatis.de/csp/shop/sfg/bpm.html.cms.cBroker.cls?

Cmspath=struktur,vollanzeige.csp&ID=1023518, abgerufen 09/09.

• Stemmler HJ, Kahlert S, Siekiera W, Untch M, Heinrich B, Heinemann V (2005):

Prolonged survival of patients receiving trastzuzumab beyond disease

progression for HER2 overexpressing metastatic breast cancer (MBC).

Onkologie 28, 582-586.

• Storici F, Snipe JR, Chan GK, Gordenin DA, Resnick MA (2006): Conservative

repair of chromosomal double-strand break by single-strand DNA

through two steps of annealing. Mol Cell Biol 26, 7645-7657.

• Sung P (1994): Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and

strand exchange by yeast RAD51 protein. Science 265, 1241-1243.

• Sung P und Klein H (2006): Mechanism of homologous recombination:

mediators and helicases take on regulatory functions. Nat Rev Mol Cell

Biol 7, 739-750.

• Sweep CG, Geurts-Moespot J, Grebenschikov N, De Witte JH, Heuvel JJ,

Schmitt M, Duff MJ, Jänicke F, Kramer MD, Foekens JA, Brünner N, Brugal

G, Pedersen AN, Benraad TJ (1998): External qualitiy assessment of

trans-European multicenter amtogen determination (enzyme linked

immunosorbent assay) of urokinase plasminogen activator (uPA) and

its type-1 inhibitor (PAI-1) in human breast cancer extracts. Br J Cancer

78, 1434-1441.


95

• Symington LS (2002): Role of RAD52 epistasis group genes in homologous

recombination and double strand break repair. Microbol Mol Biol Rev 66,

630-670.

• Thurlimann BJ, Keshaviah A, Coates AS, Mouridsen H, Mauriac L, Forbes JF,

Paridaens R, Castiglione-Gertsch M, Gelber RD, Rabaglio M, Smith I, Wardly

A for the Breast International Group (BIG) 1-98 Collaborative Group (2005):

A comparison of letrozole and tamoxifen in postmenopausal women

with early breast cancer. N Engl J Med 353, 2747-2757.

• Tordai A, Wang J, Andre F, Liedtke C, Yan K, Sotiriou C, Hortobagyi GN,

Symmans WF, Pusztai L (2008): Evaluation of biological pathways

involved in chemotherapy response in breast cancer. Breast Cancer Res

10, R37.

• Trihia H, Murray S, Price K, Gelber RD, Golouh R, Goldhirsch A, Coates AS,

Collins J, Costiglione-Gertsch M, Gusterson BA (2003): Ki-67 expression in

breast carcinoma: its association with grading systems, clinical

parameters and other prognostic factors – a surrogate marker? Cancer

97, 1321-1331.

• Toikkanen S, Pylkkänen L, Joensuu H (1997): Invasive lobular carcinoma of

the breast has better short- and long- term survival than invasive ductal

carcinoma. Br J Cancer 76, 1234-40.

• Turner N, Tutt A und Ashworth A (2004): Hallmarks of ‘BRCAness’ in

sporadic cancers. Nat Rev Cancer 4, 814-819.

• Venkitaraman AR (2001): Functions of BRCA1 and BRCA2 in the biological

response to DNA damage. J Cell Sci 114, 3591-3598.

• Venkitaraman AR (2002): Cancer susceptibility and the functions of BRCA1

and BRCA2. Cell 108, 171-182.

• Veronesi U, Casinelli N, Mariani L, Greco M, Saccozzi R, Luini A, Aguilar M,

Marubini E (2002): Twenty year follow-up of a randomized study

comparing breast-conserving surgery with radical mastectomy for early

breast cancer. N Engl J Med 347, 1227-1232.


96

• Vispé S, Cazaux C, Lesca C, Defais M (1998): Overexpression of Rad51

protein stimulates homologous recombination and increases resistance

of mammalian cells to ionizing radiation. Nucleic Acids Res 26, 2859-

2864.

• Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkmann J (1991): Tumor angiogenesis

and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med

324, 1-8.

• Wittekind C und Bertolini J (2010): Änderung in der neuen 7. Auflage der

TNM-Klassifikation maligner Tumore. Onkologe, 16, 175-180.

• Wong AKC, Pero R, Ormonde PA, Tavtigian SV, Bartel PL (1997): Rad51

interacts with the evolutionary conserved BRC motifs in the human

breast cancer susceptibility gene brca2. J Biol Chem 272, 31941-31944.

• Xu FJ, Stack S, Boyer C, O’Briant K, Whitaker R, Mills GB, Yu YH, Bast RC Jr

(1997): Heregulin and agonistic anti-p185(c-erbB2) antibodies inhibit

proliferation but increase invasiveness of breast cancer cells that

overexpress p185(c-erbB2): increased invasiveness may contribute to

poor prognosis. Clin Cancer Res 3, 1629-1634.

• Yaziji H, Goldstein LC, Barry TS, Werling R, Hwang H, Ellis GK, Gralow JR,

Livingston RB, Gown AM (2004): HER-2 testing in breast cancer using

parallel tissue-based methods. JAMA 28, 1972-1977.

• Yoshikawa K, Ogawa T, Baer R, Hemmi H, Honda K, Yamauchi A, Inamoto T,

Ko K, Yazumi S, Motoda H, Kodama H, Noguchi S, Gazdar AF, Yamaoka Y,

Takahashi R (2000): Abnormal expression of BRCA1 and BRCA1-

interactive DNA-repair proteins in breast carcinomas. Int J Cancer 88,

28-36.

• Yousef GM, Borgoňo CA, Scorilas A, Ponzone R, Biglia N, Iskander L,

Polymeris M-E, Roagna R, Sismondi P, Diamandis EP (2002): Quantitative

analysis of human kallikrein gene 14 expression in breast tumours

indicates association with poor prognosis. Br J Cancer 87, 1287-1293.

• Yu X, Jacobs SA, West SC, Ogawa T, Egelman EH (2001): Domain structure

and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on

DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 8419-8424.

Anhang

97

7. Anhang

7.1 TNM Klassifikation pT-Primärtumor pTX Primärtumor kann nicht beurteilt werden pT0 Kein Anhalt für Primärtumor pTis Carcinoma in situ: intraduktales Karzinom oder lobuläres Carcinoma oder Morbus

Paget der Mamille ohne nachweisbaren Tumor pT1 Tumor max. Durchmesser < 2,0 cm

a.) max. Durchmesser < 0,5 cm b.) max. Durchmesser < 0,5 bis 1 cm c.) max. Durchmesser < 1 bis 2 cm

pT2 Tumor max. Durchmesser > 2,0 bis 5 cm pT3 Tumor max. Durchmesser > 5 cm pT4 Tumor jeder Größe mit direkter Ausdehnung auf Brustwand und Haut

a.) mit Ausdehnung auf die Brustwand b.) mit Ödem (einschließlich Apfelsinenhaut), Ulzerationen der Brusthaut oder

Satellitenmetastasen der Haut der gleichen Brust c.) Kriterien T4a und T4b d.) Entzündliches Karzinom

pN-Regionäre Lymphknoten pNX Keine Lymphknotenbeurteilung möglich pN0 Keine regionären Lymphknotenmetastasen pN1 Metastasen in beweglichen ipsilateralen axillären Lymphknoten

a.) nur Mikrometastasen (< 0.2 cm) b.) Metastasen in Lymphknoten, zumindest eine > 0,2 cm,

• bi) Metastasen in 1-3 Lymphknoten, > 0,2 bis < 2 cm • bii) Metastasen in > 4 Lymphknoten, > 0,2 bis < 2 cm • biii) Ausdehnung der Metastasen über die Lymphknotenkapsel hinaus,

max. Durchmesser < 2 cm • biv) Metastasen in Lymphknoten, max. Durchmesser > 2 cm

pN2 Metastasen in ipsilateralen axillären Lymphknoten, untereinander oder an andere Strukturen fixiert

pN3 Metastasen in Lymphknoten entlang der A. mammaria interna pM-Fernmetastasen pMX Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden PM0 Keine Fernmetastasen PM1 Fernmetastasen

Tab. 30: pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms, aus Remmele [Remmele, 1997], entspricht der bei Diagnosestellungen gültigen pTNM Klassifikation.

Anhang

98

T-Primärtumor TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 kein Anhalt für Primärtumor Tis Tis (DCIS) Tis (LCIS) Tis (Paget)

Carcinoma in situ duktales Carcinoma in situ lobuläres Carcinoma in situ Paget-Erkrankung der Brustwarze ohne nachweisbaren Tumor

T1 T1 mic T1a T1b T1c

Tumor 2 cm oder weniger in größter Ausdehnung Mikroinvasion von 0,1 cm oder weniger in größter Ausdehnung mehr als 0,1 cm, aber nicht mehr als 0,5 cm in größter Ausdehnung mehr als 0,5 cm, aber nicht mehr als 1 cm in größter Ausdehnung mehr als 1 cm, aber nicht mehr als 2 cm in größter Ausdehnung

T2 Tumor mehr als 2 cm, aber nicht mehr als 5 cm in größter Ausdehnung T3 Tumor mehr als 5 cm in größter Ausdehnung T4 T4a T4b T4c T4d

Tumor jeder Größe mit direkter Ausdehnung auf Brustwand oder Haut mit Ausdehnung auf die Brustwand mit Ödem (einschließlich Apfelsinenhaut), Ulzerationen der Brusthaut oder Satellitenmetastasen der Haut der gleichen Brust Kriterien T4a und T4b gemeinsam Entzündliches (inflammatorisches) Karzinom

N-Regionäre Lymphknoten NX Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden N0 keine regionären Lymphknotenmetastasen N1 Metastase(n) in beweglichen ipsilateralen axillären Lymphknoten der Level I und II N2 N2a N2b

Metastase(n) in ipsilateralen axillären Lymphknoten, untereinander oder an andere Strukturen fixiert Metastase(n) in klinisch erkennbaren ipsilateralen Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna in Abwesenheit klinisch erkennbarer axillärer Lymphknotenmetastasen

N3 N3a N3b N3c

Metastase(n) in ipsilateralen infraklavikulären Lymphknoten Klinisch erkennbare Metastase(n) in ipsilateralen Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna in Anwesenheit axillärer Lymphknotenmetastasen Metastase(n) in ipsilateralen supraklavikulären Lymphknoten

pN-Regionäre Lymphknoten pNx regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden (z. B. bioptisch entfernt) pNx (sn) Schildwächterlymphknoten (Sentinel node) kann histologisch nicht beurteilt werden pN0 keine regionären Lymphknotenmetastasen pN0 (sn) histologisch keine Metastase(n) im Schildwächterlymphknoten pN0(i-) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n) und kein morphologischer Nachweis

von isolierten Tumorzellen pN0(i+) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n), aber morphologischer Nachweis von

isolierten Tumorzellen pN0(mol-) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n) und kein nichtmorphologischer

Nachweis von isolierten Tumorzellen pN0(mol+) histologisch keine Lymphknotenmetastase(n), aber nichtmorphologischer Nachweis

von isolierten Tumorzellen pN1mi Mikrometastase(n) (> 0,2 mm (und/oder mehr als 200 Tumorzellen) und < 0,2 cm) pN1 pN1a pN1b pN1c

Metastase(n) in 1-3 ipsilateralen axillären Lymphknoten, mindestens eine > 0,2 cm Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna mit mikroskopischer(n) Metastase(n), nachgewiesen durch Untersuchung des Schildwächterlymphknotens, aber nicht klinisch erkennbar pN1a und pN1b

pN2 pN2a pN2b

Metastase(n) in 4-9 axillären Lymphknoten, mindestens eine > 0,2 cm Klinisch erkennbare Metastase(n) in Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna ohne axilläre Lymphknotenmetastasen

Anhang

99

pN3 pN3a pN3b pN3c

Metastase(n) in 10 oder mehr ipsilateralen axillären, mindestens eine > 0,2 cm, oder in ipsilateralen infraklavikulären Lymphknoten Metastase(n) in klinisch erkennbaren Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna mit mindestens einer axillären Lymphknotenmetastase oder Lymphknotenmetastasen im mehr als 3 axillären Lymphknoten und in Lymphknoten entlang der Arteria mammaria interna, nachgewiesen durch Untersuchung des/der Schildwächterlymphknoten(s), aber nicht klinisch erkennbar Metastase(n) in ipsilateralen supraklavikulären Lymphknoten

M-Fernmetastasen MX Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen

Tab. 31: pTNM-Klassifikation des Mammakarzinoms, 7. Auflage UICC, 2010 [Wittekind und Bertolini, 2010; Sauer 2005]. Die wesentliche Neuerung besteht in der Entwicklung und vermehrten

Anwendung der Sentinel Lymph Node Technologie.

Danksagung

100

8. Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. Stürzbecher für die Vergabe des Dissertationsthemas

und die Betreuung über den gesamten Zeitraum dieser Studie. Ebenso danke ich

Frau PD Dr. Fischer für die Betreuung der Arbeit von gynäkologischer Seite, die

sie nach abgeschlossener Methodikplanung übernommen hat. Mein Dank für die

Unterstützung von pathologischer Seite gilt Herrn Dr. Jarutat sowie Prof. Dr.

Krüger, dem ich auch für die Unterstützung bei der statistischen Bearbeitung

danke. Für die wissenschaftlichen Denkanstöße und die tatkräftige Betreuung in

allen Bereichen möchte ich Frau Boutou danken.

Besonderer Dank gilt Frau Dr. Peters, Chefärztin des Institutes für Pathologie des

Städtischen Klinikums Lüneburg, sowie Herrn Prof. Dr. Gille, Chefarzt a. D. der

gynäkologischen Abteilung des Städtischen Klinikums Lüneburg, für die

Bereitstellung des Untersuchungsgutes und für die Möglichkeit zur Erhebung von

Krankheitsdaten.

Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Feller und Herrn Prof. Dr.

Diedrich für die Möglichkeit bedanken, die Räumlichkeiten und Materialien ihrer

Institute für meine Arbeit zu nutzen. Besonderer Dank gilt auch der Unterstützung

duch das gesamte Personal, insbesondere im Rahmen der Methodik gilt mein

Dank den MTAs Frau Thode, Frau Gräff, Frau Nehls sowie Frau Schliephake und

ihrem ganzen Laborteam.

Danken möchte ich ebenfalls meinen Mitdoktorandinnen Frau Dr. Ola und Frau Dr.

Hebenbrock.

Dank gilt meinem beruflichen als auch meinem privaten Umfeld, insbesondere

meinen Eltern.

Lebenslauf

101

9. Lebenslauf

Name: Stefanie Schierholz

Geburtsdatum: 08.06.1982

Geburtsort: Lüneburg

Schulbildung:

1988 -1992 Grundschule Adendorf, Landkreis Lüneburg

1992 –1994 Orientierungsstufe Adendorf, Landkreis Lüneburg

1994 – 2001 Bernhard-Riemann-Gymnasium, Scharnebeck,

Landkreis Lüneburg

06/2001 Abitur

Studium:

2001 - 2007 Medizinstudium an der Universität zu Lübeck

09/2003 Ärztliche Vorprüfung

2005 - 2006 experimenteller Teil dieser Studie

11/2007 Approbation

Beruf:

seit 01/2008 Assistenzärztin in der Klinik für Chirurgie,

Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus

Lübeck

Die prognostische Aussagefähigkeit von Rad51, Ki-67, uPA und PAI … · 2015-05-11 · KI...

Documents

Transcript of Die prognostische Aussagefähigkeit von Rad51, Ki-67, uPA und PAI … · 2015-05-11 · KI...