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Die TumorzelleMolekularbiologie und Genetik

Kristian Müller, Sommersemester 2006

Zellen eines Hirntumors

Übersicht

• Einführung: Auftreten von Tumoren und Begriffe

• Die klonale Entwicklung eines Tumors

• Die Tumorentstehung: primäre Anomalien

• Die Tumorentstehung: Viren

• Die Tumorentstehung: chromosomale und sekundäre Veränderungen

• Veränderungen im zellulären Kontext

•• Wichtige Proteine im Detail

Altersstatistik Neuerkrankungen

Mittleres Alter 67 Jahre

Krebs in Deutschland 2002

Mittleres Alter 65 Jahre

Krebsstatistik nach Lokalisation

Neuerkrankungen: Männer n=200.018, Frauen n=194.662

Sterbefälle: Männer n=108.835, Frauen n=100.349

Arbeitsgemeinschaft BevölkerungsbezogenerKrebsregister in Deutschland. Daten 2000.

Krebs in Deutschland. 4. Ausgabe, 2004

Krebspatienten

Lance Armstrong, Radfahrer, Hodenkrebs, 1996

Heiko Herrlich, Stürmer Borussia Dortmund, Hirntumor, 2000

Nino de Angelo, Sänger, Lymphdrüsenkrebs, 1996

Sheryl Crow, Sängerin, Brustkrebs 2006

Anastacia, Sängerin, Brustkrebs, 2003

Kylie Minogue, Sängerin und Schauspielerin, Brustkrebs, 2005

http://www.ard.de/leben/themenwoche

Begriffsbestimmung

• Ein Tumor ist eine abnorme Vergrößerung eines Gewebes, er ensteht durch autonome,

progressive und überschießende Proliferation körpereigener Zellen. Tumor wird auch

Synomym mit Neoplasie (Neubildung) verwendet.

• Krebs ist eine maligner Tumor, der sich durch infiltratives und destruktives Wachstum

auszeichnet. Der Begriff „karkinos“ wurde vermutlich von Hippokrates (460- 375 v. Chr.)

eingeführt.

• Ein Karzinom ist ein Tumor der von Epithelien ausgeht z.B. Verdaungsorgane, Lunge, Haut,

Brust ProstataBrust, Prostata.

• Ein Sarkom ist Tumor der vom Bindegewebe, Muskelzellen oder den Blutgefäßen ausgeht.

• Leukämie und Lymphom sind Tumore, die vom hämatopoetischen System ausgehen

• Gliom und Retinoblastom sind Tumore, die vom Nervensystem und dem Auge ausgehen.

• Es gibt weitere Tumorarten. Die Namen sind teilweise historisch geprägt.

• Man unterscheidet auch solide Tumore, die im Zellverband wachsen, und nicht solide

Tumore.

• Ca. 90 % der malignen Tumore des Menschen sind Karzinome.

Begriffbestimmung: Onkologie

Onk- oder Onko: Wortteil mit der Bedeutung Geschwulst, von griechisch ογκοςUmfang, Größe

Onkogen: Dominant wirkendes Gen, das zur Transformation der Zelle beiträgt, wenn

es zum falschen Zeitpunkt oder im falschen Gewebe exprimiert oder überexprimiert

wird. Diese Gene können sehr unterschiedliche Proteine kodieren, z.B.

Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Proteinkinasen.

Virales Onkogen: Gene, die von Viren assimiliert wurden und die zur

Transformation von Zellen beitragen. Abkürzung: v-onc

Protoonkogen: Gene, die an der Kontrolle normaler Wachstums- und

Differenzierungsprozesse (Zellproliferation) beteiligt sind und die homolog zu

viralen Onkogenen sind. Abkürzung: c-onc. Da Onkogene heutzutage ohne Viren

gefunden werden, wird mittlerweile auf das „c-“ verzichtet.

Onkologie: Teilgebiet der Medizin, das sich mit der Entstehung und Behandlung von

Tumoren beschäftigt.

Übersicht








Zellzyklus (zur Erinnerung)

M RestriktionspunktG1 RestriktionspunktG2 Restriktionspunkt

Zellzyklus und Proliferation

Zu- und Abflüsse der ZellpopulationTypisches Wachstumsverhalten eines Tumors

am Beispiel des Brustkrebses

Die Entwicklung eines Tumors im Überblick

normale Zelle

DNA Schaden

somatische Mutation

Reperatur

Onkogen Aktivierung Suppressorgen Inaktivierunggestörte Apoptose

Überexpression,veränderte Genprodukte,

Verlust der Regulation

progressives Wachstum,autonomes Wachstum,

maligner Tumor

Klonale Evolution

Die klonale Evolution eines Tumors: Morphologie

Verlust derDifferenzierung

undifferenzierteProliferation

Invasion

Beispiel Cervix Karzinom

Gesund Differenzierung Proliferation

Gewebeschnitt

Pap (Papanicolaou) smear:Normal Dysplasie Karzinom

Die klonale Evolution eines Tumors:Der Chromosomen Satz

Durch Mutation entsteht aus einer Normalzelle ein Klon mit Wachstumsvorteil, der sich weiterverändert. Häufig gehen die Veränderungen mit einer Veränderung des Chromosomensatzes(Aneuploidie) einher.

Klonale Entwicklung des Kolorektal-Karzinoms

Ca. 75% der Patienten tragen APC Mutationen, K-Ras Mutationentreten bei ca. 30% und p53 Mutationen bei ca. 50% auf.

Bis heute ist die Ursache der vielen Mutationen nicht ganz geklärt .

Die klonale Evolution eines Tumors:Äußere Faktoren und Gene

Übersicht








Veränderungen der Zelle

• DNA Schaden

• Primäre Anomalien: Kausaler Zusammenhang mit der Tumorentstehung,

z.B. Chomosomenbrüche mit Translokation

• Sekundäre Anomalien: Veränderungen im Laufe des Tumorwachstums, kann d T ät li h W h t t il l ihdem Tumor zusätzliche Wachstumsvorteile verleihen

Spontane Mutation der DNA

Depurinierung durch spontane Hydrolyse ergibt „apurinicp g p y y g „ p(AP) sites“. Reperatur durch Endonukleasen.

Spontane Deaminierung von Cytosin zu Uracil kann durch DNA-Glykosylasen repariert werden. Bei 5-Methyl-Cytosin, das häufigin CpG Dinukleotiden vorkommt erfolgt jedoch eineUmwandlung in Thymin. Ist der sense Strang betroffen ergibtsich eine C-T Transition, ist der anti-sense Strang betroffenergibt sich eine G-A Transition. Dies sind die häufigstenMutationen in menschlichen Genen.

Mögliche Folgen einer Punkt-mutation in einer splice site (SS)

Spontane Deletionen

Deletionen entstehen, wenn sich repetitiveSequenzen während der Replikationgegeneinender verschieben. Hierbei könnensich Schleifen bilden, die durch dasReperatursystem entfernt werden.

Deletionen ergeben sich auch aushomologen ungleichen Rekombinationen(Austausch auf korrespondierenden Allelenan unterschiedlichen Positionen) oderillegitimen Rekombination.

Sauerstoffradikale

Sauerstoffradikale wie Superoxid-Anionen und Hydoxyl-Radikaleenstehen z.B. während des Stoffwechsels, sie werden beiEntzündungsreaktionen freigesetzt oder bilden sich durchRadiolyse.

Kanzerogene Substanzen der Umwelt

Metabolische Aktivierung undAddukt-Bildung des Aflatoxin-B1 aus Schimmelpilz

Schematische Darstellung der durch N-Methyl-Nitrosoharnstoff verursachten G:C zu A:T Transition.

Gifte im Tabak

BaP, benzo[a]pyrene

NNAL, 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol

NNK, 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone

NNN, N′-nitrosonornicotine

PAH, polycyclic aromatic hydrocarbons

Detoxifizierung und Aktivierung im Körper

glutathione-S-transferases (GST); UDP-glucuronosyl transferases (UGT); N-acetyl transferases (NAT)

Ames Test

Strahlung

UV-Strahlung bewirkt die kovalenteVerknüpfung von Pyrimidin Resten, z.B.Thymin-Dimer (Cyclobutan-Pyrimidin Dimer).

Genetische Disposition

Genetische Disposition

Nach den Mendelschen Regelnvererbte Erkrankungen machen1-2% aller Krebserkrankungen aus.

Retinoblastom

Übersicht





• Die Tumorentstehung: Chromosomale und sekundäre Veränderungen



Beispiele für Viren

hepatozelluläres Karzinomeines Patienten mit Hepatitis B

chronisch akut transformierend

Integration eines Virus in den Wirt

Identifizierung von Onkogenen durch chronischtransformierende Retroviren: Beispiel MYC

Genom eines chronisch transformierendenRetrovirus

In die Wirtszelle integrierter Provirus

(R: repetitive Sequenz; U: unique 5´- , 3´Region; LTR: long terminal repeat;pol:Polymerase, gag:group specific antigens;env: envelope)

Aktivierung des MYC-Gens durch Integration desALV-Retrovirus. Bevorzugter Integrationsort undtypische Deletion führen zur Transkription durcheinen Promotor im 3´-LTR.

Onkogen und Supressorgen"krebskritische Gene"

Aktivierung eines Proto-Onkogens

Proto-Onkogen: Gen / Genprodukt, das durch Mutation zum Onkogen wird

Onkogene aus chronisch transformierenden Viren

Identifizierung von Onkogenen durch akuttransformierende Viren

Akut transformierende Virensind chronisch transformierendeViren, die zusätzliche Geneenthalten. Diese ersetzen in derRegel virale Sequenzen undwerden virale Onkogene v-oncgenannt.g

Viren können die Regulation der Zelle ausschalten und die Proliferation anschalten

• Papillomavirus bildet die Proteine E6 und E7 die Rb und p53 binden, blockieren und für derenAbbau sorgen

• SV40 bildet das "große T Antigen" mit beiden Funktionen

• Therapieansatz "Onkolytische Viren": vermehren sich nur in Zellen mit defektem Rb bzw. p53

Übersicht








Tumorentstehung: Gentransfer

Bestimmte murine Fibroblasten z.B. NIH3T3 lassen sich durch Aufnahmemenschlicher Tumor-DNA transformieren. Die Transformation gelingt auch mitnormaler humaner DNA, die Effizienz ist jedoch 100-fach geringer.

Hierdurch gelang erstmals der Nachweis transformierender Gene.

V t tli h fü di T f ti i t i 80% d Fäll di RVerantwortlich für die Transformation ist in ca. 80% der Fälle die RasGenfamilie (H-Ras, K-Ras).

Zelluläre Ras-Onkogene werden durch singuläre Punktmutationen aktiviert,die nur 3 Kodone betreffen.

Reperaturmechanismen

Ein Defekt, der an der Reperatur beteiligteProteine kann die Entstehung von Krebsbegünstigen.

Reperaturmechanismen

• base excision repair (BER)

• mismatch repair (MMR)

• nucleotide excision repair (NER)

- global genomic repair (GGR)

- transcription-coupled repair (TCR)

Tumorentstehung: Fehler bei der Fehlerkorrektur

Chromosomale Anomalien

Chromosomen eines Brust-Krebs dargestellt mit einer DNA-Färbungund mit Vielfarbenfluoreszenz in situ Hybridisierung (multi color FISH)

Replikation geschädigter DNA

• Spontan möglich vorallem aber infolge von defektem p53

führt zu:• Chromosomen Anomalien• Genamplifikation• Genverlust

Verlust von Tumorsupressor Genen:zahlreiche Möglichkeiten

Fehlerverteilung

Verlust von Tumorsupressor GenenExperimente

Entdeckung der „Tumorsuppressorgene“durch Zell-Zell Hybridisierung

Unterschiedliche Repeats in allelen Loci erlauben denVerlust der Heterozygotie nachzuweisen

Häufigkeit von Allelverlusten (weiß: q-Arme, schwarz:p-Arme) bei kolorektalem Karzinom

Chromosomen TranslokationPhiladelphia Chromosom

Leukämien und Lymphome besser Untersucht, da zytogenetisch besserzugänglich, mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) genauereAnalyse möglich.

9

Translokation t(9,22)(q34;q11) bei chronischermyeloischer Leukämie (CML) führt zur Entstehung desPhiladelphia-Chromosoms Ph1, das in 85-90% der Fällenachweisbar ist.

(Bezeichnung: Chromosom-Nr / p kurzer q langer Arm / Banden-Nr.Subbandet Translokation, del Deletion, inv Inversion)

Chromosomen Translokation - MYC-Gen

• Burkitt-Lymphom: Tumor von Lymphozyten der B-Zellinie

• Bruchstelle auf Chromosom 8 translociert mit Immunglobulin Regionen

• Endemische Form vergesellschaftet mit Epstein-Barr-Virus (vorallem Afrika)

Bruchstelle in der J-Region (frühe B-Zell Entwicklung)

• Sporadische Form

Bruchstelle in der S-Region (späte B-Zell Entwicklung)

• Große Variabilität der Translokation, aber immer mit Immunglobulin Loci und

Dysregulation

Mechanismen der MYC-Aktivierung durch Burkitt-Lymphom-assoziierteTranslokation von MYC bzw. Immunglobulin Genen

Liste Chromosomaler Anomalien I

Kind mit Burkitt-Lymphom

Junge mit Leukämie, 3d vor Exitus

Liste Chromosomaler Anomalien II

Amplifikationen können in Metaphasen Chromosomenanalysen alshomogen gefärbte Regionen (Homogenously Stained Regions,HSR) erscheinen.

Amplifikationen können:- den malignen Phänotyp beeinflussen- die Therapie erschweren (DHFR Amplifikation bei

Methotrexat Therapie)- als Marker für eine gerichtete Therapie dienen

(Her2/neu für den Antikörper „Herceptin“)

Amplifikationen von Proteinen können auch durch veränderteExpression eines einzelnen Gens erfolgen.

Kolorektales Karzinom

Übersicht








Kleiner Ausschnitt der Signalverschaltung

Zellzyklus, Tumor und Akürzungen• Cycline (Cyclin A, B, D, E)

• CDK cyclin dependent kinase (CDK 1, 2, 3, 4, 5, 6)

• CAK CDK activating kinase (Hefe)

• CKI cyclin dependent kinase inhibitor

• CIP (=KIP, =WAF) CDK interacting protein (p21CIP oder nur p21, p27)

• INK4 (=CDKN) polypeptide INhibitors of CDK4, 6 (p16INK4a, p15ink4b, p18ink4c, p19ink4d)

• ARF Alternate Reading Frame des p16ink4a, =p14ARF , (=p19ARF in Maus)

• PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen, Untereinheit der Polymerase δ• HDAC1 Histon-Deacetylase 1

• DNA-PK DNA dependent Protein Kinase

• ATM Krankheitsgen der Ataxia teleangiectasia

• ATR ATM-related• ATR ATM related

• GADD45 Growth Arrest and Damage Dependent,

• E2F Transkriptionsfaktor (E2F1, 2, 3, 4, 5, 6)

•Ubiquitin Ligasen

• MDM2 Murine Double Minute chromosome-2, bindet p53, eine E3 Ligase

• SCF Abbau von CKI

• APC Annaphase Promoting Complex, Abbau von M-Cyclin

• Achtung auch: APC Adenomatous Polyposis Coli, Tumorsuppressor bindet ß-Catenin

Nomenklatur im „Alberts“CYCLIN–CDK VERTEBRATES BUDDING YEASTCOMPLEX CYCLIN CDK PARTNER CYCLIN CDK PARTNERG1-Cdk cyclin D* Cdk4, Cdk6 Cln3 Cdk1**G1/S-Cdk cyclin E Cdk2 Cln1, 2 Cdk1S-Cdk cyclin A Cdk2 Clb5, 6 Cdk1M-Cdk cyclin B Cdk1** Clb1, 2, 3, 4 Cdk1* There are three D cyclins in mammals (cyclins D1, D2, and D3).** The original name of Cdk1 was Cdc2 in both vertebrates and fission yeast, and Cdc28 inbudding yeast.

Warum KEIN Tumor entsteht

NATURE REVIEWS CANCER VOLUME 4 AUGUST 2004 592

DNA Schaden führt zum Stop in G1

Normalerweise führt zuviel Myc zur p53 Kontrolle

Vom Mitogen zum Zellzyklus

Tumorigene Transformation humaner Zellen im Labor

TRENDS in Molecular Medicine Vol.10 No.11 November 2004

Übersicht








Rezeptor Tyrosinkinasen (RTKs)

Eine Auswahl an Rezeptor Tyrosin Kinasen, denen eine Bedeutungfür Entstehung oder Progression maligner Tumoren beigemessenwird.

TyrosinkinaseDomäne

Die EGF-R (erbB) Familie

ExtracellularCysteine-richReceptor domain

EGFTGF-α

Amphiregulinβ-cellulinHB-EGF

Epiregulin

Ligands No specific ligands -

often acts as dimer partner Heregulins

NRG2NRG3

Heregulinsβ-cellulin

Membrane

Intracellular

p

KTyrosine kinasedomain

erbB4HER4

erbB3HER3

erbB1HER1EGFR

erbB2HER2neu

K K K

Bild adaptiert Astra-Zeneca, urpsr. J. Wells

EGFR Signaltransduktion

PI3-K

EGFR

Ligand

PTEN AKT

STAT3

EGFR-TKKK

pYpY

RAS RAFSOS

GRB2pY

Survival(anti-apoptosis)

PTEN AKT

MEK

Gene transcriptionCell cycle progression

DNA Myc

Myc Cyclin D1JunFos

P P

MAPK

Proliferation /maturation

Chemotherapy /radiotherapyresistance

AngiogenesisMetastasis

Cyclin D1

GRB2: Growth factor Receptor-Bound protein 2SOS: Son Of Sevenless

Pathologische Aktivierung einer RTK (EGF-R)

S

S

RK

2Ligand / autocrine loop

RK

R R

K K K K

R

K K S

1

S

R R

K K K K

R

K K S

1

S

R R

K K K K

R

K K S

1

S

S

S

5

Mutant EGFR

S

S

RK

2

RK

RK

2

RK

2

RK

Increased expressionof EGFR protein

S

TGF-α

R

R

K

K

K

K

K

EGF

SS

4 decreasedPhosphatase

KK

S

S

R

K

R

K

R

K

RRR

KKK

3 Heterodimerizationand cross-talk

S

S

Mitogenicsignals

Mitogenicsignals

Mitogenicsignals

SEGFR S R

R

K

K

K

K

K

SSR

R

K

K

K

K

K

SSR

R

K

K

K

K

K

SS

4

KK

S

S

4

KK

S

S

R

K

R

K

R

K

RRR

KKK

3

S

S

R

K

R

K

R

K

R

K

R

K

R

K

RRR

KKK

3

S

S

RRR

KKK

3

S

S

R

RR

RAS – Zentrale Schaltstelle der Signalübertragung

RAS-Gene urspünglich durch Transfektion von NIH3T3-Fibroblasten entdeckt

Zwei RAS-Gene zu retroviralen Onkogenen homolog, daher Bezeichnungentsprechend der viralen Onkogene: H(arvey)-RAS, K(irsten)-RASweiteres RAS-Gen in Neuroblastom gefunden: N-RAS.

RAS-Gene gehören zu den am häufigsten in Tumoren mutierten Genen.

RAS Mutationen werden bereits in frühren Tumorstadien gefunden.

Mit Karzinogenen können gezielt Punktmutationen hervorgerufen werdenMit Karzinogenen können gezielt Punktmutationen hervorgerufen werden.

Das RAS-Genprodukt wird als p21RAS oder nur als RAS bezeichnet.

RAS gehört zu den kleinen GTP-bindenden Proteinen.

Die gefundenen Mutationen liegen im Bereich der GTP/GDP Bindung.

RAS besitzt zudem einen Effektor Bereich und ein CAAX-Motiv, daspostranslatorisch modifiziert wird.

genetische Organisation der RAS-Gene

Mutationen in RAS-Genen

Signaltransduktion und Signalwege zu RAS

Aktivierung über RTKsDer GTPase Zyklus von p21RAS

Alternative Wege der AktivierungGTP

GAP s: GTPase activating proteinsGEF s: guanine nucleotide exchange factors z.B. SOS

Signalwege von RAS

P53, Wächter des Genoms

P53 gehört mit zu den am häufigsten mutierten Genen.

P53 wurde als zelluläres Bindeprotein des SV40 Virus entdeckt.

DNA Schäden durch externe Faktoren führen zur Induktion vonP53.

In vielen Tumoren geht ein Allel verloren, das verbleibende Allel istin der Regel mutiert.

Keimbahnmutationen im p53-Gen sind die Grundlage für das Li-Fraumeni Syndrom einer genetischen Disposition für TumoreFraumeni Syndrom, einer genetischen Disposition für Tumore.Dies führt zu genomischer Instabilität (Aneuplodie).

In kolorektalen Karzinomen überwiegen G:C zu A:T Transitionen,die überwiegend in CpG-Dinukleotide betreffen, d.h. spontanerfolgen.

In Lungentumoren überwiegen G:C zu T:A Transversionen, dietypischerweise durch Kanzerogene hervorgerufen werden. „Hot-spots“ der Mutation sind die Codone 157, 248 und 273.

Das wichtigste Kanzerogen des Tabakrauchs ist Benzo(a)pyren,das zu einem Epoxid metabolisiert wird. Werden menschlicheZellen mit diesem Kanzerogen behandelt, können Addukte derChemikalie mit den Guaninresten in den Codonen 157, 248 und273 nachgewiesen werden.

p53 im Überblick

p53 in Aktion

einfache Darstellung

komplexe Darstellung

Aufbau und Mutationen im p53 Gen

Struktur, funktionelle Domänen, Proteinbindungsstellen und Position mutierter Aminosäuren von P53. DiePosition der vertikalen Linien markiert die Position von Mutationen in menschlichen Tumoren, die Höhe derLinien entspricht der relativen Mutationshäufigkeit. ATM, Mitglied der Familie von DNA-Proteinkinasen; CKIund II, Caseinkinasen I und II; CDK, Cyclin-abhängige Kinase; PKC, Proteinkinase C; RPA, „replicationprotein A“ (nach Ko & Prives, 1996).

p53 posttranslationale Modifikationen

Problem 1994 bereits beschrieben

zum Trost: es gibt vermutlich weniger als 25000 Proteine, und nicht alle Proteine haben Spleißvarianten

Das Retinoblastom Protein (Rb)

Retinoblastom Tasche (As 380-785) mit Peptid des Transkriptionsfaktors E2F2 (As 410-427) PDB 1N4M

Rb und Eintritt S-Phase

Mögliche Inaktivierungen des Rb

= INK4a

Inactivation of Rb or p16 / Ink4a by mutation encourages cell division (tumor suppressor)

overactivity of Cdk4 or cyclin D1 encourages cell division (proto-oncogene).

Telomerase

The RNA subunit (purple) has the template sequence ofTetrahymena telomerase. Proteins include the catalyticsubunit, TERT (yellow), and additional less-conservedproteins (orange).

Zusammenfassung

Literatur

http://www.molbiotech.uni-freiburg.de/km/lehre

Pelengaris, Khan et al., The Molecular Biology of Cancer, Blackwell Publishing

Alberts et al., Molekularbiologie der Zelle, 4. Auflage 2004, Wiley-VCH Verlag

Karp Cell and Molecular Biology 4th Ed 2005 WileyKarp, Cell and Molecular Biology, 4th Ed. 2005, Wiley

Wagener, Molekulare Onkologie, 2. Auflage 1999, Thieme (nicht mehr im Handel)

Watson et al., Molecular biology of the gene, 5th Ed. 2003, Benjamin Cummings

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