Differentielle Genexpression in der Insulinoma-Zelllinie...

Differentielle Genexpression in derInsulinoma-Zelllinie RINm5Fnach Stimulation mit Leptin

Von der Fakultat fur Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften derRheinisch-Westfalischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des

akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaftengenehmigte Dissertation

vorgelegt von

Diplom-Biologe Paul Hekermanaus Eupen (Belgien)

Berichter:Prof. Dr. Walter Becker

Univ.-Prof. Dr. Fritz Kreuzaler

Tag der mundlichen Prufung: 28. Mai 2004

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfugbar.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 11.1 Leptin - ein pleiotroper Regulator von Substratspeicherung und Energie-

haushalt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2 Die Signaltransduktion des Leptins: Der JAK/STAT-Weg . . . . . . . . . 41.3 Die Leptinwirkung in der Inselzelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.4 Leptin-regulierte Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.5 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2 Material und Methoden 112.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.1.1 Bakterienstamme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.1.2 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.1.3 Haufig verwendete Medien und Puffer . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.2 Molekularbiologische Grundtechniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.2.1 Sterilisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.2.2 Chemische Transformation von E. coli-Zellen und Isolierung von

Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.2.3 Agarosegelelektrophorese zur DNA-Analyse . . . . . . . . . . . . 192.2.4 Elution der DNA aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.2.5 Ligation von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.2.6 Agarosegelelektrophorese zur RNA-Analyse . . . . . . . . . . . . 202.2.7 Polymerasekettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.2.8 Sequenzierung von Plasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.2.9 Isolierung von Gesamt-RNA aus Saugerzellen . . . . . . . . . . . 222.2.10 Isolierung von poly-A+ mRNA mit oligo-dT beads . . . . . . . . . 23

2.3 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.3.1 Verzeichnis der zur Sondenherstellung verwendeten Plasmide . 23

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Inhaltsverzeichnis

2.3.2 Klonierung des pWZLneo-LepRb Konstruktes . . . . . . . . . . . 26

2.3.3 Klonierung der Tyrosinmutanten-pWZLneo-LepRb Konstrukte . 28

2.3.4 Klonierung des pcDNA 3.1-LepRb Konstruktes . . . . . . . . . . 28

2.4 Saugerzellen und ihre Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.4.1 Saugerzelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.4.2 Losungen fur die Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.4.3 Medien und allgemeine Kulturbedingungen . . . . . . . . . . . . 30

2.4.4 Subkultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.4.5 Kryokonservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.4.6 Mycoplasmentest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.4.7 Inkubation eukaryotischer Zellen mit Cytokinen . . . . . . . . . . 32

2.5 Verfahren zur Transfektion von Saugerzelllinien . . . . . . . . . . . . . . 33

2.5.1 Transiente Transfektion mit dem FuGENE 6 Transfection Reagent . 33

2.5.2 Stabile Transfektion mit transgenen Retroviren . . . . . . . . . . . 33

2.6 Isolation von Proteinen aus Saugerzelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.6.1 Kernextrakte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.6.2 Gesamtlysate (”Native Lyse“) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.7 Western-Blot und immunchemische Detektion spezifischer Proteine . . . 36

2.7.1 Western-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.7.2 Entfernen von spezifisch gebundenem Antikorper . . . . . . . . . 38

2.8 DNA-Retardierungsassay (EMSA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.9 Blot-und Hybridisierungstechniken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.9.1 Northern-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

2.9.2 Eigene Herstellung von cDNA-Arrays (Dot-Blots) . . . . . . . . . 41

2.9.3 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten mit 32P . . . . . 41

2.9.4 Radioaktive Markierung einer komplexen cDNA-Sonde mit 33P . 42

2.9.5 Hybridisierung von Northern-Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.9.6 Hybridisierung von Dot-Blots und cDNA-Macro-Arrays . . . . . . 43

2.9.7 Auswertung von Macro-Array-Hybridisierungen mit derAIDA™-Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3 Ergebnisse 46

3.1 Der JAK-STAT Signalweg nach Stimulation mit Cytokinen . . . . . . . . 46

3.1.1 Charakterisierung des Leptineffektes in verschiedenen Zelllinien 46

3.1.2 Aktivierung des JAK-STAT Weges in RINm5F-LepRb-Zellen . . . 48

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Inhaltsverzeichnis

3.1.3 Differentielle Aktivierung von STAT-Faktoren in RINm5F-LepRb-Zellen nach Stimulation mit Leptin, IL-6 und Wachstums-hormon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.1.4 RINm5F-LepRb-Zellen besitzen alle notwendigen Komponentenfur die Signaltransduktion von IL-1β . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3.2 Identifizierung von Leptin-regulierten Genen in RINm5F-LepRb-Zellen 533.2.1 Differentielle Hybridisierung von cDNA Filter-Arrays . . . . . . . 533.2.2 Etablierung des Dot-Blot Verfahrens zur Uberprufung Leptin-

regulierter Gene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593.2.3 Leptin induziert die Expression von immediate early genes, delayed

early genes und late genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623.2.4 Die Genexpression von RGS-4 und PAP1 in Abhangigkeit von

den LepRb-Tyrosinresten 985, 1077 und 1138 . . . . . . . . . . . . 66

4 Diskussion 684.1 In untransfizierten Zellen wurden keine Leptineffekte gefunden . . . . . 684.2 Die differentielle Aktivierung von STAT-Faktoren durch Leptin, IL-6 und

Wachstumshormon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 704.3 Das Dot-Blot-Verfahren zur Uberprufung Leptin-regulierter Gene . . . . 734.4 Leptin-regulierte Gene in RINm5F-LepRb-Zellen . . . . . . . . . . . . . . 74

4.4.1 Phosphatidat Phosphohydrolase Typ 2a (Ppap2a) . . . . . . . . . 754.4.2 Regulator of G-Protein signalling 4 (RGS-4) . . . . . . . . . . . . . 774.4.3 Lipocalin-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 804.4.4 Pancreatitis associated Protein (PAP1) . . . . . . . . . . . . . . . . 814.4.5 Zielgene des Leptins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

5 Zusammenfassung 86

Abkurzungsverzeichnis 88

Firmenverzeichnis 94

Literaturverzeichnis 96

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1 Einleitung

1.1 Leptin - ein pleiotroper Regulator von

Substratspeicherung und Energiehaushalt

Leptin (OB-Protein) ist ein im Fettgewebe synthetisiertes Hormon, dessen wichtigsteFunktion die Kontrolle des Korpergewichtes und des Energiehaushaltes ist. Leptin hatein Molekulargewicht von 16 kDa und weist eine hohe strukturelle Ahnlichkeit zuhamatopoetischen Cytokinen (z.B. IL-6, Erythropoietin) auf [Kline et al., 1997].

Leptin wurde 1994 als das fur die Fettleibigkeit des ob/ob-Mausstamms verantwortli-che Gen kloniert [Zhang et al., 1994]. Die ob-Mutation (”obese“) bei Mausen wurde be-reits 1950 beschrieben [Ingalls et al., 1950]; sie fuhrt bei Mausen durch den resultieren-den Leptinmangel u.a. zu vermehrter Nahrungsaufnahme (Hyperphagie), Adipositas[Lin et al., 1977], verringerter Korpertemperatur (Hypothermie) [Trayhurn et al., 1977],Insulinresistenz mit Hyperglykamie und Hyperinsulinamie [Bray et al., 1971] sowie In-fertilitat als Folge eines hypogonadotropen Hypogonadismus [Swerdloff et al., 1976].Weitere tierexperimentelle Arbeiten zeigten, dass die exogene Applikation von Leptinbei der ob/ob-Maus die Nahrungsaufnahme hemmt, die diabetische Stoffwechsellagenormalisiert und die Infertilitat aufhebt [Halaas et al., 1995], [Chehab et al., 1996].

Auch bei einigen –jedoch sehr wenigen– Menschen sind homozygote Mutationen desLeptingens beschrieben. Diese Patienten sind –analog zu den ob/ob-Mausen– extremadipos, hyperinsulinamisch und leiden an Hyperphagie [Montague et al., 1997]. Auchhier hebt die exogene Zufuhr von Leptin die Symptome auf und der Zustand normali-siert sich weitgehend [Farooqi et al., 1999], [Farooqi et al., 2002].

Die Leptin-induzierte Hemmung der Nahrungsaufnahme, also die anorexigene Wir-kung, wird uber den Hypothalamus vermittelt. Dort bindet Leptin an seinen Rezeptor,der vornehmlich im Nucleus arcuatus und Nucleus paraventricularis exprimiert wird[Mercer et al., 1996]. Dadurch kommt es in diesen Zellen u.a. zur Hemmung der Expres-

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1 Einleitung

sion von NPY, einem orexigenem Neuropeptid, und zur Forderung der Expression vonProopiomelanocortin (POMC), dem Precursor von α-MSH, einem potenten Anorexigen[Elias et al., 1999], [Schwartz et al., 1997].

Leptin wird vom Fettgewebe sezerniert. Dabei ist der Leptinserumspiegel nicht nur di-rekt mit der Korperfettmasse korreliert, sondern auch abhangig vom Speicherzustandder Fettzellen [Ahima et al., 1996]: Im Hungerzustand werden Fettreserven verbraucht,was zu einer Verringerung der Leptinsekretion fuhrt. Werden die Fettreserven dagegengerade gefullt, weil das Nahrungsangebot uppig ist, steigt die Leptinsekretion an. Soermoglicht es Leptin den Wirbeltieren, uber einen langeren Zeitraum die Große ihrerFettreserven zu kontrollieren, indem es dem Gehirn als Art ”Lipostat“ eine Informationuber das Ausmaß der Fettreserven vermittelt.

Eine klinische Anwendung des Leptins als Therapeutikum bei Fettsucht ware also imPrinzip naheliegend; tatsachlich liegt jedoch bei der uberwiegenden Anzahl der Fettlei-bigen eine Hyperleptinamie [Maffei et al., 1995], [Considine et al., 1996] mit gleichzeiti-ger Leptinresistenz [Frederich et al., 1995] vor. Klinische Studien belegen, dass in diesenFallen eine Behandlung mit Leptin die Fettleibigkeit nicht auf Dauer positiv beeinflusst[Heymsfield et al., 1999]. Anders verhalt es sich bei den außerst seltenen Fallen vonAdipositas, die auf einen genetisch bedingten Leptinmangel zuruckzufuhren sind. Dortfuhrt die Substitution mit Leptin zu beeindruckenden Ergebnissen [Farooqi et al., 1999],[Farooqi et al., 2002].

In seltenen Fallen von congenitaler Dystrophie des Fettgewebes, d.h. also einemgenetisch bedingten, selektiven Abbau von subkutanem und viszeralem Fettgewe-be, erwies sich jedoch Leptin als mogliches Therapeutikum. Die mit der Lipo-dystrophie einhergehende Insulinresistenz, Hyperglykamie und Hypertriglyceridamiekonnte durch die Verabreichung von rekombinantem Leptin vermindert werden[Shimomura et al., 1999], [Petersen et al., 2002]. Auch bei der medikamentos bedingtenLipodystrophie, wie sie bei der Behandlung von HIV-Patienten mit Proteaseinhibitorenauftritt, kann die Hyperglykamie und Hypertriglyceridamie mit Leptin behandelt wer-den [Riddle et al., 2003].

Nach der Entdeckung der Primarwirkung des Leptins auf die Nahrungsaufnahme undden Energiehaushalt zeigte sich alsbald, dass das Cytokin Leptin eine Vielzahl weite-rer Effekte (siehe Abb. 1.1) auslost. Dabei gibt es neben den zentralnervos-vermitteltenEffekten auch periphere Wirkungen des Leptins, wie z.B. die immunmodulatorischeWirkung und die Hemmung der Insulinsekretion (siehe unten).

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1 Einleitung

Abb. 1.1: Der Leptin-Regelkreis und seine Beziehung zur Insulinwirkung. Leptin wird vom Fett-gewebe ins Plasma ausgeschuttet und erreicht so seine Zielgewebe. Rezeptoren im Hypothalamus ver-mitteln die anorexigene Wirkung, d.h. die Nahrungsaufnahme wird verringert. Außerdem erhoht Leptinden Grundumsatz und die Thermogenese. Die GnRH-Sekretion wird verstarkt, dies ermoglicht Fertilitat.Uber das Zentrale Nervensystem aktiviert Leptin auch den Sympathikus und hemmt so die Knochen-bildung [Takeda et al., 2002]. Nach heutigem Wissensstand wirkt Leptin auch in der Peripherie: Es kannT-Lymphocyten aktivieren und zur Proliferation anregen. Daneben wirkt Leptin auch in den Langer-hans’schen Inseln des Pankreas, wo es die Insulinfreisetzung hemmt (siehe Text).

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1 Einleitung

Fur den Einfluss von Leptin auf die Aktivitat des Immunsystems gibt es zahlreiche Hin-weise. So wurde gezeigt, dass die Verabreichung von Leptin die bestehende Immun-suppression bei hungernden Mausen wieder normalisieren kann [Lord et al., 1998],[Howard et al., 1999]. Bei Menschen, die auf Grund einer Mutation im ob-Gen keineigenes Leptin bilden konnen, besteht u.a. eine verminderte T-Zellproliferation, unddie Anzahl der CD4+-T-Zellen ist verringert. Alle diese Parameter konnten durchLeptin-Gabe wieder normalisiert werden [Farooqi et al., 2002]. Leptin scheint auchbei der Progression von entzundlichen Erkrankungen und Autoimmunerkrankun-gen, wie Darmentzundungen [Siegmund et al., 2002], der Autoimmun-Encephalomyelitis[Matarese et al., 2001] oder der experimentellen Arthritis [Busso et al., 2002] eine Rollezu spielen.

1.2 Die Signaltransduktion des Leptins: Der

JAK/STAT-Weg

Neben der ob-Mutation, die als ob/ob-Genotyp bei der Maus zu extremer Adiposi-tas fuhrt, gibt es noch eine weitere rezessive Adipositas-verursachende Mutation:diabetes (db). Der Phanotyp des entsprechenden Mausstamms db/db entspricht weit-gehend dem der ob/ob-Maus [Bray et al., 1979], [Coleman et al., 1978]. Schon sehr fruhwurden zur Untersuchung dieser Mutationen Parabiose-Experimente1 durchgefuhrt.Die ob/ob-Maus zeigte im Parabiose-Experiment mit einem Wildtyp-Partner eine deut-lich geringere Gewichtszunahme als normal, da vermutlich aus dem normalgewichti-gen Parabionten der postulierte Sattigungsfaktor in die ob/ob-Maus ubertreten konn-te. Neben ob/ob wurde der Mausestamm db/db in Parabiose-Experimenten eingesetzt.Bei der Parabiose eines db/db-Tieres mit einem normalgewichtigen Partner schrank-te jedoch das gesunde Tier seine Futteraufnahme sehr stark ein und verhungerte[Coleman et al., 1969], [Coleman et al., 1973]. Hieraus wurde abgeleitet, daß die db/db-Maus im Gegensatz zur ob/ob-Maus vermutlich den Sattigungsfaktor in zu großen Men-gen produziert, da bei ihr ein Rezeptordefekt fur den Faktor vorliegt. Als schließlichim Jahre 1994 entdeckt wurde, dass es sich bei dem ob-Genprodukt um ein von Fett-zellen sezerniertes Protein handelte, lag die Vermutung nahe, es konne sich bei demdb-Gen um eine mutierte Variante des Rezeptors fur dieses Protein handeln. In der Tat

1Tierversuche, bei denen die Blutkreislaufe von zwei Mausen miteinander verbunden werden

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1 Einleitung

wurde der Leptinrezeptor im Jahre 1995 aus einer murinen cDNA-Bibliothek kloniert[Tartaglia et al., 1995].

Vom Leptinrezeptor LepR gibt es 6 Spleißvarianten: LepRa, LepRb, LepRc, LepRd,LepRe und LepRf [Lee et al., 1996]. Die langste Form (LepRb) besitzt 1162 Ami-nosauren und ist die einzige Variante, bei der eine Signaltransduktion sicher nach-gewiesen wurde. Die lange Form (LepRb) wird vorwiegend im Hypothalamus ex-primiert, und zwar in spezifischen Kernen, die die Nahrungsaufnahme regulie-ren [Mercer et al., 1996]. Alle anderen Spleißvarianten besitzen verkurzte cytosolischeDomanen [Zabeau et al., 2003]. LepRa wird ubiquitar exprimiert und besitzt eine kur-ze cytosolische Domane von 34 Aminosauren. LepRe stellt eine sezernierte Isoformdar [Ge et al., 2002]. Die Analyse der Aminosaure-Sequenz zeigte, dass die lange Iso-form eine hohe Ahnlichkeit mit der Klasse I-Cytokin-Rezeptor Familie aufweist. In-nerhalb dieser Familie ist die Sequenzahnlichkeit zu dem G-CSF-Rezeptor (colonystimulating factor) und gp130, dem Rezeptor fur IL-6 (Interleukin 6), am großten[Zabeau et al., 2003]. Die Signaltransduktion dieser Cytokine lauft uber den JAK/STAT-Signalweg (siehe Abb. 1.2), und auch fur Leptin wurde dieser Signalweg nachgewiesen[Baumann et al., 1996].

Die Bindung eines Leptinmolekuls fuhrt zunachst zur Dimerisierung von zwei LepRb-Monomeren. Daraufhin kommt es zur gegenseitigen Phosphorylierung der mit demRezeptor assoziierten Kinasen JAK2 (Trans-Autophosphorylierung). Die so aktivier-ten Kinasen phosphorylieren nun die intrazellularen Tyrosinreste des Rezeptors, dieals Phosphotyrosinreste innerhalb ihres Motives spezifische Bindungsstellen fur STAT-Faktoren (Signal Transducer and Activator of Transcription) darstellen. Die Bindung derSTAT-Faktoren an den Rezeptor erfolgt uber SH2-Domanen. Sind die STAT-Faktorengebunden, werden auch diese von JAK2 an einem Tyrosinrest phosphoryliert. Darauf-hin bilden jeweils zwei STAT-Faktoren uber ihre SH2-Domanen Dimere und wandernin den Zellkern, wo sie als aktivierte Transkriptionsfaktoren an Promotorelemente vonspezifischen Genen binden und so deren Genexpression aktivieren. Dabei haben dieunterschiedlichen STAT-Faktoren (STAT1, STAT3, STAT4, STAT5 und STAT6) jeweilseine unterschiedliche Affinitat zu unterschiedlichen Promotoren; d.h., die Palette deraktivierten STAT-Faktoren beeinflusst direkt das Profil der Genexpression. So fuhrt eineStimulation mit Prolaktin (Milchdrusen) vorwiegend zu einer Aktivierung von STAT5,wahrend IL-6 hauptsachlich STAT3 (z.B. in der Leber) aktiviert. STAT5 aktiviert dieGenexpression von β-Casein, wahrend STAT3 vorwiegend an Elemente in den Promo-toren von Akutphase-Genen bindet. Die unterschiedliche physiologische Wirkung von

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1 Einleitung

Abb. 1.2: Der JAK/STAT-Signalweg. Lep: Leptin, JAK: JAK-Kinase, SRE: STAT-responsive element, TATA:TATA-Box, ORF: open reading frame. Die Abbildung zeigt die Signaltransduktion des Leptins uber denJAK/STAT-Weg (siehe Text) und die Verknupfung zum ERK-Signalweg uber Tyr985. Zur Vereinfachungist hier nur die Aktivierung von STAT3 gezeigt.

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1 Einleitung

Cytokinen wird außerdem durch die unterschiedliche Gewebsverteilung ihrer Rezep-toren bestimmt.

Betrachtet man die verwandten Cytokine IL-6 und Leptin, so wird die physiolo-gische Hauptwirkung im Wesentlichen durch STAT3 vermittelt [Vaisse et al., 1996],[Heinrich et al., 1998]: in der Leber aktiviert IL-6 die Expression von Akutphase-proteinen, wahrend Leptin uber den Hypothalamus den Energiehaushalt kontrol-liert. Die Bedeutung der anderen STAT-Faktoren fur die Leptinwirkung ist noch un-klar [Wang et al., 1997], [Baumann et al., 1996]. Die Signaltransduktion des LepRb wirdmaßgeblich durch die Struktur der intrazellularen Domane beeinflusst: Zwei kon-servierte, membranproximal gelegene Motive aus jeweils acht Aminosauren (Box1und Box2) vermitteln im LepRb die nicht-kovalente Bindung der Tyrosinkinase JAK2.[Ghilardi et al., 1997], [Bahrenberg et al., 2002]. Weiter distal liegen die drei intrazel-lularen Tyrosinreste 985, 1077 und 1138 (Nummerierung bezieht sich auf Maus). Tyr985vermittelt einerseits die Bindung des feedback inhibitors SOCS-3 (suppressor of cytokinesignalling 3) [Bjørbæk et al., 2000] und ermoglicht andererseits uber die Bindung desAdaptorproteins SHP-2 die Aktivierung des ERK-Signalweges [Bjørbæk et al., 2001].Die Bedeutung von Tyr1077 ist noch nicht aufgeklart. Tyr1138 ist, zusammen mitdem umliegenden Motiv, der sog. Box3, fur die Bindung von STAT3 essentiell[Banks et al., 2000].

1.3 Die Leptinwirkung in der Inselzelle

Die Hauptwirkung des Leptins, d.h. die Regulation der Nahrungsaufnahme und desEnergieverbrauchs, wird durch das Zentrale Nervensystem vermittelt. Aber auch inperipheren Geweben wurde eine Leptinwirkung nachgewiesen. Als Beispiele sindhier Lymphocyten, Fettgewebe, Muskelzellen, die Leber [Liu et al., 1998] und dieLangerhans’schen Inseln des Pankreas zu nennen. Letztere sind deswegen beson-ders interessant, weil sie in ihren β-Zellen das Hormon Insulin produzieren, dasja –ahnlich wie Leptin– an der Regulation des Energiehaushaltes beteiligt ist (sieheAbb. 1.1). Daruberhinaus gibt es auf Grund mehrerer Arbeiten Hinweise auf das Zu-sammenspiel beider Hormone: So verstarkt Insulin die Leptinbildung in der Fettzel-le [Saladin et al., 1995] und [Kolaczynski et al., 1996], wahrend Leptin die Insulinsen-sitivitat in der Leber erhohen kann [Rossetti et al., 1997], [Liu et al., 1998]. Gleichzeitigscheint Leptin aber auch in Inselzellen die Freisetzung des Insulins zu vermindern[Seufert et al., 1999a], [Halaas et al., 1995].

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1 Einleitung

So konnte man sich einen Regelkreis vorstellen, bei dem ein erhohter Insulinspiegel dieBildung von Leptin im Fettgewebe fordert, und der nachfolgend erhohte Leptinspiegeldie Freisetzung des Insulins aus den Inseln hemmt (siehe Abb. 1.1). Physiologisch waredieser Regelkreis bei der Kontrolle der Fettreserven von Bedeutung: Insulin hemmt dieLipolyse, fordert die Bildung von Triglyceriden und vergroßert somit auch die Mengedes eingelagerten Fettes, was eine Erhohung des Leptinspiegels nach sich zieht. Sinktdagegen die Menge des eingelagerten Fettes (bei einer Hungerperiode), fallt auch derLeptinspiegel, was wiederum durch die verstarkte Insulin-Sekretion bei der nachstenNahrungsaufnahme die Fullung der Fettreserven erleichtert. Dieses Modell der Inter-aktion zwischen Leptin und Insulin wird auch als ”adipoinsulare Achse“ bezeichnet[Kieffer et al., 1996].

Ein Absinken des Insulinspiegels nach Applikation von Leptin wurde in ob/ob-Mausenvielfach gezeigt [Seufert et al., 1999b], [Halaas et al., 1995]. Aber auch in gesundenSprague-Dawley-Ratten konnte ein experimentell durch Glukoseinjektion ausgelosterAnstieg des Insulinspiegels durch Leptininjektionen nach 2 h drastisch vermindert wer-den [Cases et al., 2001]. Desweiteren wurde an isolierten, perfundierten Inseln der Rat-te gezeigt, dass die Glucose-induzierte Erhohung der Insulinfreisetzung durch Leptin(100 pM) nach 80 min um 53% gehemmt werden konnte [Kulkarni et al., 1997]. Die glei-che Arbeitsgruppe wies einen ahnlichen Effekt auf die Insulinsekretion auch in ver-schiedenen Insulinoma-Zelllinien nach [Kulkarni et al., 1997]. Einen ahnlichen Effektkonnten Poitout et al. (1998) zeigen.

Mehrere Arbeitsgruppen wiesen den Leptinrezeptor in pankreatischen β-Zellennach, und zwar sowohl in vivo als auch in Zelllinien [Kieffer et al., 1996],[Emilsson et al., 1997], [Islam et al., 1997]. Auch eine Aktivierung des JAK/STAT-Signalweges in β-Zellen nach Stimulation wurde schon gezeigt [Morton et al., 1999].Es gibt damit zahlreiche Hinweise auf eine direkte Wirkung des Leptins an der β-Zelleder Langerhans’schen Insel.

Insulin wird physiologisch uber folgenden Mechanismus freigesetzt: Glucose gelangtin die β-Zelle, wo sie metabolisiert wird und die intrazellulare ATP-Konzentrationerhoht. Dadurch werden ATP-sensitive Kaliumkanale (KATP) geschlossen, und eskommt zur Depolaristation der Zellmembran. Das wiederum fuhrt zu einer Offnungspannungsabhangiger Ca2+-Kanale. Ca2+ stromt in die Zelle ein, bindet an Calmodulinund aktiviert die Ca2+/Calmodulin-abhangige Proteinkinase (CaMK). NachfolgendePhosphorylierungsreaktionen fuhren schließlich zu einer Exocytose der Insulin-gefull-ten Vesikel. Die Insulinfreisetzung ist u.a. modulierbar durch Acetylcholin und GLP-1

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1 Einleitung

(glucagon-like peptide 1), welche an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren binden und diePLC bzw. die Adenylatcyclase aktivieren. In beiden Fallen kommt es letztendlich zueiner Erhohung des Ca2+-Spiegels bzw. einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA),was beides zu einer Verstarkung der Insulinfreisetzung fuhrt.

In diesen Prozess scheint nun Leptin hemmend eingreifen zu konnen. Wie Leptinjedoch die Freisetzung des Insulins im Einzelnen steuert, ist noch nicht vollstandiggeklart. So gibt es mehrere Arbeiten, die zeigen, dass Leptin (10 nM) in vitro ATP-sensitive Kaliumkanale (KATP) offnen kann und zu einer Hyperpolarisation fuhrt (etwa10-15 Minuten nach Applikation). Diese Offnung kann durch Applikation der Sulfonyl-harnstoffderivate Tolbutamid oder Glibenclamid wieder ruckgangig gemacht werden[Harvey et al., 1997], [Harvey et al., 2000], [Kieffer et al., 1997].

Andere Arbeiten zeigen auch eine Leptin-induzierte Hemmung der Expression des In-sulingens [Seufert et al., 1999b], [Seufert et al., 1999a]. Es ist daher anzunehmen, dassLeptin –zusatzlich zu dem schnellen Effekt auf die KATP-Kanale– vermutlich direktuber den JAK/STAT-Weg die Expression von Genen in der Insel beeinflussen kann.Moglicherweise fuhren diese neugebildeten Proteine in der β-Zelle langfristig zu einerHemmung der Insulinsekretion.

1.4 Leptin-regulierte Gene

Nach der Bindung von Leptin an seinen Rezeptor kommt es zur Aktivierung desJAK/STAT-Signalweges (s.o.). Die aktivierten STAT-Faktoren binden im Kern an spe-zifische Promotorelemente und aktivieren so die Transkription von spezifischen Ge-nen. Die physiologischen Wirkungen der Cytokine sind sehr unterschiedlich, undnicht nur durch die spezifische Gewebsverteilung ihrer Rezeptoren zu erklaren, son-dern auch dadurch, dass differentiell aktivierte STAT-Faktoren auch unterschiedli-che Genexpressionsmuster zur Folge haben konnen. Eine Untersuchung der Leptin-gesteuerten Genexpression wurde daher zu einem besseren Verstandnis der Leptinwir-kung beitragen.

Obwohl sich die Zahl der Studien uber Leptin-regulierte Gene gering ist, wurden dochbereits einige Gene gefunden. Im Hypothalamus von ob/ob-Mausen fuhrt die Verabrei-chung von Leptin zu einer Hochregulation von SOCS-3 mRNA [Bjørbæk et al., 1998].SOCS-3 ist ein negativer feedback inhibitor des JAK/STAT-Signalweges. Er drosseltuber die Bindung an JAK-Kinasen die Signaltransduktion [Yoshimura et al., 1995],

9

1 Einleitung

[Endo et al., 1997]. Neben Leptin induzieren auch andere Cytokine der IL-6 FamilieSOCS-3.

Im Hypothalamus werden noch weitere Gene reguliert, vor allem solche, bei derenGenprodukten eine Regulation der Nahrungsaufnahme nachgewiesen wurde. Hiermuss man Peptide, die die Nahrungsaufnahme fordern (Orexigene) von solchen, diedie Nahrungsaufnahme hemmen (Anorexigene) unterscheiden.

Es wurde gezeigt, dass die hypothalamische Expression von Proopiomelanocor-tin (POMC), dem Precursor des Anorexigens α-MSH, durch Leptin stimuliert wird[Thornton et al., 1997]. Das gleiche gilt fur das Anorexigen CART (cocaine and amphet-amine regulated transcript) [Kristensen et al., 1998]. Fur orexigene Peptide, wie NPY (neu-ropeptide Y) und AGRP (agouti-related protein) wurde dagegen eine Hemmung der Gen-expression nachgewiesen [Mizuno et al., 1999], [Schwartz et al., 1996].

Bisher sind jedoch nur wenig Gene bekannt, die in vivo in peripheren Zielorga-nen direkt durch Leptin reguliert werden. Als Beispiel sei hier die FAAH (fatty acidamide hydrolase) genannt, die in T-Lymphocyten durch Leptin hochreguliert wird[Maccarrone et al., 2003]. Welche Gene in anderen peripheren Geweben, wie z.B. derβ-Zelle der Langerhans’schen Insel, durch Leptin reguliert werden, ist bisher unbe-kannt.

1.5 Zielsetzung der Arbeit

Hauptziel dieser Arbeit war es, die durch Leptin veranderte Genexpression (in Zellender Langerhans’schen Insel) zu untersuchen und dabei die Unterschiede zu anderenCytokinen festzustellen.

Die Arbeit gliedert sich in drei Teilziele: Zunachst sollte nach Behandlung mit verschie-denen Cytokinen der JAK/STAT-Signalweg untersucht werden, dann sollten die diffe-rentiell exprimierten Gene identifiziert werden und schließlich diese Expressionsmus-ter mit anderen Cytokinen verglichen werden.

Letztlich soll diese Arbeit dazu beitragen, die Rolle des Leptins im Organismus besserzu verstehen.

10

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Bakterienst amme

E. coli DH5α:

F−, λ−, supE44, lacU169 (Φ80lacZ M15), hsdR17, endA−, gyrA96, thi-1, relA1[Hanahan, 1983]. In diesem Stamm (recA−) ist die Wahrscheinlichkeit der Rekombi-nation innerhalb der klonierten DNA sehr gering. Er wird daher routinemaßig fur dieTransformation von Plasmiden eingesetzt.

2.1.2 Chemikalien

• Acrylamid/Bis-Acrylamid 37.5:1 (2.6 % C), Electrophoresis Purity Reagent(Fa. Biorad)

• Acrylamid/Bis-Acyrlamid 19:1 [40 % w/v] (Fa. Amresco)• Agar, ”Select-Agar“ (Fa. Sigma Chemical)• Agarose (for gel electrophoresis of nucleic acids) ”Seakem LE“ (Fa. BMA)• Ammoniumpersulfat (APS) ultra pure, (Fa. Gibco BRL)• Ampicillin (Fa. Boehringer-Mannheim)• Aprotinin (Fa. Sigma Chemical)• Borsaure (zur Analyse) (Fa. Merck)• Bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V (Fa. Sigma Chemical)• Bovines Serumalbumin (BSA), acetylated, [10 mg/ml] (Fa. Promega)• Bromphenolblau (Fa. LKB Bromma)• Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 x 2 H2O) (Fa. Merck)• Coomassie Brilliantblau R250 fur die Elektrophorese (Fa. Biorad)• p-Cumarinsaure (4-Hydroxy-Zimtsaure) (Fa. Sigma Chemical)

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• 4’,6’-Diamin-2’-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) (Fa. Roche Diagnostics)• Diethylpyrocarbonat (DEPC) (Fa. Sigma Chemical)• Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Analyse (Fa. Merck)• Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2 H2O), zur Analyse

(Fa. Merck)• D,L-Dithiothreitol (DTT), electrophoresis grade (Fa. ICN Biomedicals)• DNA aus Hering-Sperma, molecular biology grade, 10 mg/ml (Fa. Roche Dia-

gnostics)• Ethylendiamintetraessigsaure, Dinatriumsalz (EDTA) (Fa. Sigma Chemical)• Essigsaure 96%, reinst (Fa. Merck)• Ethanol abs., zur Analyse, (Fa. Merck)• Ethidiumbromid, 100 mg Tablets (Fa. ICN Biomedicals)• Ficoll-400 (Fa. Sigma Chemical)• Formalin (Formaldehyd) ”Molecular Biology Grade“ (Fa. Calbiochem)• Formamid, ACS-Reagent (Fa. Sigma Chemical)• dNTP-Nukleotidmix [20 mM] (Amersham Pharmacia Biotech)• D-(+)-Glucose, wasserfrei, fur biochemische Zwecke (Fa. Merck)• 6x Gel loading Buffer (Fa. GenSura)• Glycin-Puffersubstanz fur die Elektrophorese (Fa. Merck)• Glycerin 87% (Fa. Merck)• Harnstoff, fur biochemische Zwecke (Fa. Merck)• Hefeextrakt, ”Yeast extract powder“ (Fa. ICN Biomedicals)• HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N’-[2-ethansulfonsaure]), 99.5% (Fa. Sig-

ma Chemical)• IGEPAL CA630 (entspricht NP-40) (Fa. ICN Biomedicals)• Kaliumacetat, reinst, (Fa. Merck)• Kaliumchlorid zur Analyse, (Fa. Merck)• Kalium-Dihydrogenphosphat (KH2PO4), zur Analyse (Fa. Merck)• Leupeptin (Fa. Sigma Chemical)• Luminol (5-Amino-2,3-Dihydro-1,4-Phthalazinedione; free acid) (Fa. Sigma Che-

mical)• Magermilchpulver, (Fa. Applichem)• Magnesiumacetat, z.A. (Fa. Merck)• Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 x 7 H2O) (Fa. Merck)• Magnesiumchlorid (MgCl2) zur Analyse (Fa. Merck)• Methanol zur Synthese (Fa. Merck)

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• 2-Mercaptoethanol, (Fa. Merck)• 4-Morpholinopropansulfonsaure (MOPS) 99.5% (Fa. Sigma Chemical)• Natriumacetat-Trihydrat, reinst, Lebensmittelqualitat (Fa. Merck)• Natriumazid (NaN3) (Fa. Merck)• Natriumchlorid (NaCl) zur Analyse (Fa. Merck)• Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (Fa. Merck)• Natriumdodecylsulfat (SDS) (Fa. ICN Biomedicals)• Neomycin ”Geneticin G-418 Sulphate“ (Fa. Gibco BRL)• One-Phor-All (OPA)-Puffer (Fa. Amersham Pharmacia Biotech)• Orange-G, Natriumsalz (Fa. Sigma Chemical)• Pepstatin A (Fa. Sigma Chemical)• Pepton, ”Select-Peptone 140“ (Fa. Gibco BRL)• Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) (Fa. Sigma Chemical)• polydIdC (Fa. Amersham Pharmacia Biotech)• Polybrene (Hexadimethrinbromid) (Fa. Sigma Chemical)• Polyvinylpyrrolidon (PVP) Wt 360 000 (Fa. Sigma Chemical)• Ponceau-S, Dinatriumsalz (Fa. Sigma Chemical)• Salzsaure, rauchend (Fa. Merck)• N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Fa. Biorad)• Triton X-100 for scintillation techniques, analytical Grade (Fa. ICN Biomedicals)• Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Base), ultra pure (Fa. ICN Biomedicals)• Tween20 R NF (Polyoxyethylensorbitan) (Fa. ICN Biomedicals)• Wasserstoffperoxid, 30%ige [w/v] Losung in Wasser (Fa. Sigma Chemical)• Tri-Natriumcitrat-Dihydrat (Fa. Merck)• Nukleotide (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) (Fa. Amersham Pharmacia Biotech)

2.1.3 Haufig verwendete Medien und Puffer

Array-Hybridisierungspuffer:

12x SSC pH 7.0; 10x Denhardt’s Losung; 0.1 mg/ml Heringssperma-DNA; 0.5 % SDS.

Bindungspuffer fur polyA-RNA-Isolierung:

20 mM Tris-HCl pH 8.0; 1 M NaCl; 2 mM EDTA.

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Blockingl osung:

3 % (w/v) BSA in TBST.

BPB/Glycerin:

0.1% (w/v) Bromphenolblau; 50 % Glycerin; in DEPC-behandeltem A. bidest.

Cumarins aure-Stamml osung:

90 mM p-Cumarinsaure in DMSO.

100x Denhardt’s L osung:

2 % (w/v) BSA; 2 % (w/v) Ficoll 400; 2 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon; in A. bidest.

DEPC-behandeltes Wasser:

0.1 % DEPC [v/v]; in A. bidest; 2-3 h schutteln und dann autoklavieren.

ECL-Substratkomponente I:

1 ml Tris-HCl pH 8.5 [1 M]; 12 µl H2O2 [30 % v/v]; ad 10 ml mit A. bidest.

ECL-Substratkomponente II:

1 ml Tris-HCl pH 8.5 [1 M]; 100 µl Luminol [250 mM]; 44 µl p-Cumarinsaure [90 mM];ad 10 ml mit A. bidest

1x Elektrodenpuffer:

25 mM Tris-Base; 250 mM Glycin fur die Elektrophorese; 0.1 % SDS; in A. bidest.

EMSA- Cocktail (Angaben fur 1 Probe):

4 µl 5x GSB; 0.1 µl DTT [1 M in A. bidest]; 1 µl PolydIdC [1 µg/µl in TE]; 2 µl BSA ”ace-tylated“ [10 mg/ml]; 2.33 µl A. bidest.; 0.2 µl PMSF [200 mM in Ethanol]

EMSA - Laufpuffer:

0.25x TBE

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EMSA - Fixierpuffer:

10 % Methanol; 10 % Essigsaure; in A. bidest.

5x first-strand buffer:

250 mM Tris-HCl pH 8.3; 375 mM KCl; 15 mM MgCl2; in A. bidest.

5x GSB (Gelshift-Buffer):

50 mM HEPES; 5 mM EDTA; 25 mM MgCl2; 50% (v/v) Glycerin; in A. bidest.;pH 7.8

2x HBS:

275 mM NaCl; 1.4 mM Na2HPO4 x 2 H2O; 10 mM KCl; 12 mM Glucose; 40 mM HEPES(pH 7.00 +/- 0.05); sterilfiltrieren

2x Hochsalz Puffer:

840 mM NaCl; 40 mM HEPES, pH 7.9; 2 mM EDTA; 2 mM EGTA; 20 % Glycerol; in A. bi-dest.

Hochsalz Puffer WS:

1x Hochsalz Puffer; 20 mM NaF; 1 mM Na3VO4; 1 mM Natriumpyrophosphat; 1 mMDTT; 0.5 mM PMSF; 1 µg/ml Aprotinin; 1 µg/ml Leupeptin; 1 µg/ml Pepstatin; inA. bidest.

2x Hypotonischer Puffer:

40 mM HEPES (pH 7.9); 2 mM EDTA; 2 mM EGTA; in A. bidest.

Hypotonischer Puffer WS:

1x Hypotonischer Puffer; 20 mM NaF; 1 mM Na3VO4; 1 mM Natriumpyrophosphat;1 mM DTT; 0.5 mM PMSF; 1 µg/ml Aprotinin; 1 µg/ml Leupeptin; 1 µg/ml Pepstatin;in A. bidest.

Hypotonischer Puffer WS + NP-40:

0.2 % (v/v) NP-40; in Hypotonischer Puffer WS

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LB-Medium:

10 g Pepton; 5 g Hefeextrakt; 10 g NaCl; ad 1000 ml A. bidest

2x Lammli-Sample-Buffer (LSB):

50% (w/v) Glycerin; 16% (w/v) SDS; 20 mM EDTA; 500 mM Tris-HCl (pH 6.8); ad 45 mlA. bidest.; 0.2% (w/v) Bromphenolblau; 0.4% (w/v) SDS

2x LSB/DTT:

60 mg DTT/ml 2x LSB

Ligationspuffer:

660 mM Tris pH 7.6; 100 mM MgCl2; 150 mM DTT; 10 mM Spermidin; in A. bidest.

Luminol-Stamml osung:

250 mM Luminol in DMSO

Lysepuffer fur Gesamtlysate:

50 mM HEPES pH 7.5; 150 mM NaCl; 25 mM NaF; 2 mM EDTA; 2 mM Natriumpyro-phosphat; 1 % NP-40; 1 mM PMSF; 1 mM Na3VO4; 1 µg/ml Pepstatin; 2 µg/ml Leupep-tin; 1.7 µg/ml Aprotinin

10x MOPS pH 7.2:

400 mM MOPS; 26 mM Natriumacetat-Trihydrat; 10 mM EDTA; pH 7.2

Northern-Blot -Hybridisierungspuffer:

50 % (v/v) Formamid; 5x SSPE pH 7.4; 5x Denhardt’s Losung; 0.5 % SDS; 0.1 mg/mlHeringssperma-DNA

Oberer Gelpuffer:

500 mM Tris; 0.4 % SDS; pH 6.8

10x OLBfATP:

500 mM Tris-HCl pH 6.9; 100 mM MgSO4; 1 mM DTT; 0.6 mM dCTP, dGTP, dTTP

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10x OLBfCTP:

500 mM Tris-HCL pH 6.9; 100 mM MgSO4; 1 mM DTT; 0.6 mM dATP, dGTP, dTTP

Orange-G-Gelloading Buffer:

60% (v/v) Glycerin; 0.25 % Orange G; 200 mM Tris-Acetat, pH 8.0; 5 mM EDTA

PAA-Gel (LI-COR):

18 g Harnstoff; 12.4 ml A. bidest; 3.74 ml 10x TBE; losen in 50 °C-Wasserbad; 4.2 mlAcrylamid/Bis 19:1 [40% w/v]; 1.86 ml APS [10 mg/ml]; 20 µl TEMED

PBS pH 7.4:

140 mM NaCl; 3 mM KCl; 8 mM Na2HPO4; 1.8 mM KH2PO4

PBS+V+F:

1 mM Na3VO4; 5 mM NaF; in PBS pH 7.4

RNA-Probenpuffer:

39 µl DEPC-behandeltes Wasser; 32 µl 10x MOPS; 200 µl Formamid; 56 µl Formaldehyd;80 µl BPB/Glycerin; 5 µl Ethidiumbromid

Sammelgel:

520 µl Oberer Gelpuffer; 260 µl 30% Acrylamid/Bis-Acrylamid; 1.22 ml A. bidest; 4 µlAPS-Losung [50% (w/v)]; 2 µl TEMED

20x SSC pH 7.0:

3 M NaCl; 300 mM Tri-Natriumcitrat-Dihydrat; pH 7.0

20x SSPE pH 7.4:

3 M NaCl; 200 mM NaH2PO4 x H2O; 20 mM EDTA; pH 7.4

1x TAE (pH 8.0):

40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA

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10x TBE:

890 mM Tris-HCl pH 7.5; 890 mM Borsaure; 25 mM EDTA

1x TBS pH 7.5:

50 mM Tris Base; 150 mM NaCl; pH 7.5

1x TBST pH 7.5:

0.1 % (v/v) Tween-20 in TBS

TE-Puffer pH 8.0:

10 mM Tris-Base; 1 mM EDTA; pH 8.0

Transferpuffer mit SDS:

25 mM Tris-HCl; 192 mM Glycin fur die Elektrophorese; 20 % (v/v) Methanol; 0.1 %(w/v) SDS

Trenngel (8 %ig):

1.56 ml Unterer Gelpuffer; 8 % Acrylamid/Bis-Acrylamid 37.5:1 (2.6 % C); 2.84 mlA. bidest.; 12 µl APS-Losung [50 % (w/v)]; 6 µl TEMED

Unterer Gelpuffer:

1.5 M Tris; 0.4% SDS; pH 8.8

Waschpuffer fur polyA-RNA-Isolierung:

10 mM Tris-HCl pH 8.0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA

2.2 Molekularbiologische Grundtechniken

Molekularbiologische Standardmethoden (Ethanolfallung, Restriktionsverdau,Auffullen uberhangender Enden, Phosphatasereaktion) wurden nach Molecularcloning: a laboratory manual [Sambrook, et al., 1989] durchgefuhrt. Nukleinsaurenwurden mit Restriktionsenzymen der Firmen New England Biolabs (Beverley, USA),

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Amersham Pharmacia Biotech, Promega (Madison, WI, USA) und MBI Fermentas(Vilnius, Litauen) nach Herstellerangaben verdaut. Beim diagnostischen Verdau vonPlasmid-DNA, die nach der rapid-boiling Methode [Holmes et al., 1981] isoliert wurde,wurden 133 ng RNase A pro µl Restriktionsansatz zugesetzt.

2.2.1 Sterilisierung

Kulturmedien, Puffer und Pipettenspitzen wurden –sofern es die chemische Zusam-mensetzung zuließ– durch Autoklavierung (20 min bei 121 °C) sterilisiert. Bei hitze-empfindlichen Substanzen wurde die Losung durch einen 0.2 µm-Filter sterilfiltriert.Glasgerate, wie Erlenmeyer-Kolben und Reagenzglaser wurden durch 5-stundige In-kubation in einem Heizschrank bei 200 °C von Keimen und storenden Enzymen befreit.

2.2.2 Chemische Transformation von E. coli -Zellen und Isolierung

von Plasmid-DNA

E. coli Zellen wurden kompetent gemacht [Hanahan, 1983]. 100 µl kompetenter Zellenwurden mit der Plasmid-DNA 30 min auf Eis inkubiert, einem 90-sekundigen Hitze-schock bei 42 °C ausgesetzt und mit 500 µl LB-Medium (ohne Ampicillin) versetzt.Diese Suspension wurde 40 min bei 37 °C inkubiert und auf LB-Amp-Platten (LB-Agarmit 100 µg/ml Ampicillin bzw. 25 µg/ml Tetracyclin) ausplattiert. Die Inkubation er-folgte bei 37 °C UN. Sollte die DNA spater mit der ABI-Methode sequenziert werden,wurde sie mit dem High Pure Plasmid Isolation Kit for small scale preparations (RocheDiagnostics GmbH, Mannheim) prapariert. Fur Experimente, bei denen großere Men-gen Plasmid-DNA (20-500 µg) benotigt wurden, erfolgte die Praparation mittels desMidi-oder Maxi-Praparationskits (Qiagen, Hilden). Zur Praparation von Plasmid-DNAwird beim endA−-Wirtsstamm DH5α auf die rapid boiling-Methode [Holmes et al., 1981]zuruckgegriffen. Die Konzentration der DNA wurde bei einer Wellenlange von 260 nmund 280 nm photometrisch bestimmt.

2.2.3 Agarosegelelektrophorese zur DNA-Analyse

Die Auftrennung von PCR-Produkten und durch Restriktion entstandenen DNA-Fragmenten erfolgte in Gelen mit 0.75 - 1.6 % (w/v) Agarose in 1x TAE-Puffer, denen

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0.5 µg/ml Ethidiumbromid zugesetzt wurden. Den Proben wurde das 0.2-fache Volu-men Orange-G-Gelloading Buffer zugesetzt und bei 8 V/cm aufgetrennt. Als Großen-standards dienten die Fragmente der 1 kb-Leiter bzw. der 100 bp-Leiter (Gibco BRL,Paisley, Scotland).

2.2.4 Elution der DNA aus Agarosegelen

Nach einer elektrophoretischen Auftrennung von DNA-Fragmenten uber Agarosegelewurden erwunschte Fragmente unter UV-Licht ausgeschnitten. Die DNA wurde dannmit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstel-lers eluiert. Zur Elution wurden ublicherweise 50 µl A. bidest. verwendet.

2.2.5 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte in einem Volumen von 10 µl, bestehend aus1 µl ATP [6 mM], 1 u T4-Ligase, 1 µl Ligationspuffer, ca. 0.1 pmol geschnittene Vektor-DNA und 0.3 pmol cDNA-Insert. Dieser Ansatz wurde fur 8-14 h bei 16 °C inkubiertund anschließend in kompetente E. coli-Zellen transformiert.

2.2.6 Agarosegelelektrophorese zur RNA-Analyse

Die Auftrennung der RNA erfolgte in einem Formaldehyd-Agarosegel (1 % (w/v) Aga-rose und 3 % (v/v) Formaldehyd). Fur 250 ml wurde die Agarose in 218 ml DEPC-behandeltem A. bidest aufgekocht, unter Ruhren auf 60 °C abgekuhlt und vor demGießen mit 25 ml 10x MOPS und 7.5 ml Formaldehyd (pH 4.0) versetzt. 11 bis 20 µgRNA wurden mit dem 2.5fachen Volumen Ethanol (97 %) und dem 0.1fachen Volumen3 M Natriumacetat bei pH 5.2 gefallt, in 20 µl RNA-Probenpuffer aufgenommen undfur 30 min bei 63 °C denaturiert. Die gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte fur3 h in einer Kammer mit den Abmessungen 30 cm x 16 cm bei 125 V und 1x MOPS alsLaufpuffer.

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2.2.7 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Methode der PCR wurde angewendet, um cDNA-Fragmente fur die Sondenher-stellung oder fur den Dot-Blot zu amplifizieren. Im Allgemeinen wurde folgenderAnsatz gewahlt: 25 pmol Primer, 20 ng Plasmid-DNA als template, 240 µM dNTP,1x PCR-Puffer mit Mg2+ (Roche, Basel) und 1 u Taq-Polymerase (Roche, Basel) ad50 µl mit A. bidest. Die Reaktionen wurden ublicherweise im Primus Thermocy-cler 96plus (MWG Biotech, Ebersberg) mit den folgenden Programmen und Primer-Kombinationen durchgefuhrt:

T3/T7 als Primer-Kombination (fur die Plasmide pT3T7-Pac und pBSII-SK(+))

1x 2 min 95 °C35 x [30 sec 95 °C - 30 sec 45 °C - 90 sec 72 °C]1x 10 min 72 °CT3 (Fw): 5’-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3’

T7 (Rv): 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’

M13+/- als Primer-Kombination (fur das Plasmid pCMV-SPORT6)

1x 2 min 95 °C35 x [30 sec 95 °C - 30 sec 55 °C - 90 sec 72 °C]1x 10 min 72 °CFw: 5’-AGG GTT TTC CCA GTC ACG ACG TT-3’

Rv: 5’-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA CC-3’

RATINS FW/RV als Primer-Kombination (fur den Klon ” Insulin II“)

1x 5 min 95 °C30 x [30 sec 95 °C - 2 min 54 °C - 50 sec 72 °C]Fw: 5’-CCT AGT TGC AGT AGT TCT CC-3’

Rv: 5’-TGG TTC TCA CTT GGT GGA AG-3’

322Pst FW/RV als Primer-Kombination (fur das Plasmid pBR322)

1x 2 min 95 °C35 x [30 sec 95 °C - 30 sec 52 °C - 90 sec 72 °C]10 min 72 °C

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Fw: 5’-GAG TAA GTA GTT CGC CAG TTA-3’

Rv: 5’-TGA AGC CAT ACC AAA CGA CGA-3’

2.2.8 Sequenzierung von Plasmid-DNA

Die Sequenzierung von Plasmid-DNA wurde nach der Didesoxynukleotid-Methode[Sanger et al., 1977] durchgefuhrt.

Sequenzierung mit IRD-markierten Primern (LI-COR-Methode)

Bei der LI-COR-Methode wurde das Thermosequenase-Cycle-Sequencing Kit (Amers-ham Pharmacia Biotech) verwendet. Die Auftrennung der Sequenzreaktion erfolgtein einem automatischen Sequenzierer (LI-COR DNA Sequencer Model 4000, Lincoln,NE, USA) uber ein PAA-Harnstoffgel. Als Laufpuffer wurde 0.5x TBE verwendet. DieSequenzreaktion erfolgte gemaß der Anleitung des Herstellers. Alle verwendeten Se-quenzierprimer waren an ihrem 5’-Ende mit dem Fluoreszenzmarker IRD800 markiert.

Sequenzierung mit Fluoreszenz-markierten Nukleotiden (ABI-Methode)

Hier wurde die Sequenzierung mit Hilfe des DNA Sequencing Kits (Applied Biosys-tems, Warrington, UK) durchgefuhrt. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte ubereine Kapillare im Sequenziergerat Abi Prism ”310 Genetic Analyzer“ (Applied Biosys-tems, Warrington, UK).

2.2.9 Isolierung von Gesamt-RNA aus S augerzellen

Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Saugerzellen wurde bei großeren Mengen Aus-gangsmaterial (zwei bis funf vereinigte Lysate von 85 mm-Petrischalen konfluenter Zel-len) das RNeasy Midi Kit (Qiagen, Hilden) benutzt. Sollte nur aus jeweils einer konflu-enten 85 mm-Petrischale RNA isoliert werden, wurde das RNeasy Mini Kit der glei-chen Firma verwendet. Die Konzentration der RNA wurde bei einer Wellenlange von260 nm und 280 nm photometrisch bestimmt.

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2.2.10 Isolierung von poly-A + mRNA mit oligo-dT beads

Zur Isolation von mRNA aus Gesamt-RNA wurden poly-dT-magnetic beads (M-PVAOdT) der Firma Chemagen, Baesweiler verwendet. Dabei handelt es sich um kleine(1 bis 8 µm) Polyvinylalkohol-Kugelchen mit einem Magnetitanteil von 50-60%, diemehrere oligo-Desoxythymidin-Ketten (Oligo(dT)30) tragen und so den polyA+-tailder mRNA binden konnen, wenn sie in der Gesamt-RNA-Losung suspendiert sind.Die magnetischen Eigenschaften der Kugelchen erlauben mit Hilfe eines magnetischenSeparators (Magnetic Particle Concentrator MPC-S, No. 120.20, Dynal, Hamburg) dieschnelle Trennung der polyA+-mRNA von der restlichen RNA.

Das Verfahren richtet sich weitgehend nach den Empfehlungen des Herstellers: 6.25 mgbeads wurden in 300 µl 65 °C-warmem Bindungspuffer suspendiert und mit 300 µl ei-ner wassrigen Losung von 300 µg Gesamt-RNA zunachst fur 2 min bei 65 °C und an-schließend fur 10 min bei RT inkubiert und gelegentlich mit der Pipette resuspendiert.Nach der magnetischen Separierung der beads wurden diese zweimal mit je 400 µlWaschpuffer bei RT gewaschen. Zuletzt wurde der Waschpuffer vollstandig entferntund die RNA mit 80 µl 65 °C-warmem DEPC-behandeltem A. bidest. von den beadseluiert. 5 µl des Eluats wurden zur photometrischen Bestimmung der Konzentrationeingesetzt. Der Rest wurde in einer Natriumacetat-Ethanolfallung prazipitiert und mitDEPC-behandeltem A. bidest. auf eine Konzentration von 0.5 µg/µl eingestellt.

2.3 Plasmide

2.3.1 Verzeichnis der zur Sondenherstellung verwendeten

Plasmide

Folgende Plasmide wurden bei der Herstellung von Sonden fur Northern-Blots bzw beider Herstellung der cDNA-Dot-Blots eingesetzt. Zum uberwiegenden Teil wurden dieKlone als E. coli-Stichkulturen beim RZPD in Berlin bestellt (Tabelle 2.1). Ein Teil der be-nutzten Plasmide stand bereits in unserem Institut zur Verfugung und brauchte nichtbeim RZPD bestellt zu werden (Tabelle 2.2). Zur Isolation und Aufreinigung der einklo-nierten cDNA wurden die Plasmide entweder einer PCR zugefuhrt oder mit Restrikti-onsendonukleasen verdaut.

23


Tab. 2.1: Zur Sondenherstellung verwendete Plasmide, welche vom RZPD bezogen wurden. ”PCR“bedeutet Amplifikation uber PCR und anschließende Aufreinigung; ansonsten sind die Re-striktionsendonukleasen angegeben, die fur das Herausschneiden des Fragmentes benutztwurden.

Vektor GenBank a Name b Orga-nismus

Isolation

pT3T7-Pac AA957818 ferritin, heavy polypeptide 1 Ratte PCR

pT3T7-Pac AA818532 Tachykinin 1 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI029806 superoxide dismutase 2 Ratte PCR

pT3T7-Pac AA964070 mouse clone RP23-61O2 (83%) Ratte PCR

pT3T7-Pac AA875006 unbekannt Ratte PCR

pT3T7-Pac AI059441 Rn.103576 1 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI548836 unbekannt Ratte PCR

pT3T7-Pac AI454448 Grp58 2 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI555126 Ppap2a3 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI502324 RGS-44 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI137617 Lipocalin 2 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI511294 mouse Zak (93%) 5 Ratte PCR

pT3T7-Pac AA859040 mouse GADD45-gamma (94%) Ratte PCR

pT3T7-Pac AI060102 mouse clone RP24-505E24 (95%) Ratte EcoRI

HindIII

pT3T7-Pac AA859496 GTP-Cyclohydrolase I Ratte EcoRI

HindIII

pT3T7-Pac AA875008 plasminogen activator, tissue Ratte PCR

pT3T7-Pac AI709970 heat shock protein 60 Ratte EcoRI

HindIII

pT3T7-Pac AI548002 CL-6 (growth response protein) Ratte PCR

pT3T7-Pac AI059690 fibrinogen, beta polypeptide Ratte PCR

pT3T7-Pac AA858626 mouse RIKEN cDNA 2210401K01 (89%) Ratte PCR

aGenBank-Nummer des jeweiligen KlonsbName des Gens. Gab es zum Zeitpunkt der Niederschrift noch keinen genauen UniGene-Eintrag in der

rattus-Datenbank, wurde die UniGene-Nummer des nachst-ahnlichen Maus-Klons angegeben.1Rattus norvegicus similar to Adenylosuccinat Synthetase, non-muscle Isozyme2glucose regulated protein, 58 kDa (=ERp60)3Phosphatidate phosphohydrolase type 2a4regulator of G-protein signaling 45sterile-alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK

24


Vektor GenBank Name Orga-nismus

Isolation

pT3T7-Pac AA924473 mouse Sc4mol (88%) Ratte PCR

pT3T7-Pac AA963208 RAMP4 6 Ratte PCR

pT3T7-Pac AA957272 CD63 antigen Ratte PCR

pT3T7-Pac AI029638 serine/threonine kinase 2 Ratte EcoRI

HindIII

pT3T7-Pac AA965154 Ywhae 7 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI454367 ADP ribosylation factor 4 Ratte PCR

pT3T7-Pac AA858597 Rn.65492 8 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI549418 Coated vesicle membrane protein Ratte PCR

pT3T7-Pac AI454567 Vesicular inhibitory aa transporter Ratte EcoRI

HindIII

pT3T7-Pac AI070457 Eef1a1 9 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI045397 Purkinje cell protein 4 Ratte PCR

pT3T7-Pac AI501010 Ribosomal protein L4 Ratte PCR

pT3T7-Pac AA998280 pancreatitis-associated protein (PAP1) Ratte PCR

pT3T7-Pac AI113089 mouse Destrin (Dstn) (90%) Ratte PCR

pT3T7-Pac AA859174 RT1.A3(O) alpha chain Ratte PCR

pT3T7-Pac AA859695 Rn.92151 10 Ratte PCR

pT3T7-Pac AA964758 GSK3-β Ratte PCR

pT3T7-Pac AI044067 neuropeptide Y Ratte PCR

pT3T7-Pac AA859196 tropomyosin isoform 6 Ratte PCR

pCMV-SPORT6 AW762925 Cyclin D1 Maus PCR

pCMV-SPORT6 BC004076 Cyclin D3 Maus PCR

pCMV-SPORT6 BF235448 IL1-Rezeptor Maus PCR

pCMV-SPORT6 BC006652 Prolactin-Rezeptor Maus PCR

pME18S-FL3 AI956452 TNF-α-Rezeptor Maus XhoI

pT3T7-Pac BE628011 C/EBP-δ Maus PCR

pT3T7-Pac BE632748 SREBP1c Maus PCR

pT3T7-Pac AI430725 Hemopexin Maus PCR

6ribosome associated membrane protein 47tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide

(entspricht 14-3-3-ε)8ahnlich zu H. sapiens ”Actin-related protein 2/3 complex subunit 3“9eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1

10Rattus norvegicus retroviral-like ovarian specific transcript 30-1 mRNA

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Vektor GenBank Name Orga-nismus

Isolation

pT3T7-Pac AA817734 Thiostatin Ratte PCR

pT3T7-Pac AI029119 Insulin-II Ratte PCR

pT3T7-Pac AA756393 SOCS-1 Maus PCR

pT3T7-Pac RGS-2 PCR

pBSII-SK(+) Kanamycin-Resistenzgen E. coli PCR

Tab. 2.2: Zur Sondenherstellung verwendete Plasmide, die unserer Arbeitsgruppe zur Verfugungstanden.(Sie wurden nicht uber das RZPD bezogen.) ”PCR“ bedeutet Amplifikation uber PCR und an-schließende Aufreinigung; ansonsten sind die Restriktionsendonukleasen angegeben, die furdas Herausschneiden des Fragmentes benutzt wurden.

Vektor Name Organismus Isolation Herkunft

pGEX-2TK c-fos Ratte EcoRI Prof. Becker, Aachen

BamHI

pSVL STAT3 Maus XbaI Prof. Heinrich, Aachen

BamHI

pBR322 α-2-Macroglobulin Ratte PCR Prof. Heinrich, Aachen

pBS-SK(-) β-Actin PCR Prof. Becker, Aachen

pBR322 GAPDH Ratte PCR Prof. Becker, Aachen

pEF-FLAG-I SOCS-3 Maus XbaI Prof. Heinrich, Aachen

pMG2 CIS Mensch EcoRI Prof. Tavernier, Gent

NotI

2.3.2 Klonierung des pWZLneo-LepRb Konstruktes

Zur Erzeugung von Retroviren, die die cDNA der langen Spleißvariante des murinenLeptinrezeptors (LepRb, acc. No.: U46135) tragen, war die Klonierung dieser cDNAin den retroviralen Vektor pWZLneo11 erforderlich. Dazu wurde die cDNA nicht alsGanzes, sondern die vordere (LepRb-1) und hintere (LepRb-2) Halfte in zwei Schrittenin den Vektor eingebracht (siehe Abb. 2.1). Die cDNA des Leptinrezeptors stammte aus

11http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral systems/phx.html

26


Abb. 2.1: Ligation der LepRb cDNA in pWZLneo

dem Konstrukt pSVL-NON [Kluge et al., 2000], welches in unserer Arbeitsgruppe zurVerfugung stand.

Die Konstruktion von pWZLneo-LepRb-1

Die erste Halfte der LepRb-cDNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHIund XhoI aus pSVL-NON herausgeschnitten und uber die gleichen Schnittstellen inpWZLneo gerichtet kloniert.

Ligation der zweiten H alfte LepRb-2

Die zweite Halfte der LepRb-cDNA wurde uber XhoI und SacI aus pSVL-NON entferntund das uberhangende Ende des 3’-Endes aufgefullt. Das isolierte Fragment LepRb-2wurde schließlich uber XhoI und SnaBI in pWZLneo-LepRb-1 gerichtet kloniert.

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2.3.3 Klonierung der Tyrosinmutanten-pWZLneo-LepRb

Konstrukte

Um die Bedeutung der Tyrosinreste Y985, Y1077 und Y1138 im Leptinrezeptor besserzu verstehen, wurden diese jeweils zu Phenylalanin mutiert und in den Vektor pMET7kloniert. Die Mutanten wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. Jan Tavernier (Rijksu-niversiteit Gent, Belgien) hergestellt [Eyckerman et al., 1999] und uns freundlicherweisefur unsere Versuche zur Verfugung gestellt. Die mutierten Leptinrezeptor-cDNAs sindam 3’-Ende mit einem myc-tag aus den 11 Aminosauren GEQKLISEEDL fusioniert.

wt (YYY) Alle Aminosauren unverandert.

#179 (FFY) Mutation der Tyrosinreste Y985 und Y1077 zu Phenylalanin.

Y1138 bleibt unverandert.

#180 (FYF) Mutation der Tyrosinreste Y985 und Y1138 zu Phenylalanin.


#181 (YFF) Mutation der Tyrosinreste Y1077 und Y1138 zu Phenylalanin.


#182 (FFF) Mutation der Tyrosinreste Y985, Y1077 und Y1138 zu Phenylalanin.

Zur stabilen Transfektion von RINm5F Zellen mit den mutierten Leptinrezeptor cDNAswurden die Mutanten aus dem Vektor pMET7 herausgeschnitten und in den retrovira-len Vektor pWZLneo umkloniert. Dazu wurde durch Verdau der Konstrukte mit BstXI(5’) und HpaI (3’) zunachst ein Fragment aus dem 3’-Bereich der LepRb-cDNA isoliert,welches die Region mit den drei mutierten Tyrosinresten und dem myc-tag umfasste.Als backbone diente pWZLneo-LepRb, welcher durch Verdau mit BstXI (5’) und SalI(3’) von dem entsprechenden 3’-Ende des LepRb befreit wurde. Nach blunting der SalI-Schnittstelle konnte das BstXI/HpaI Fragment der pMET7-Mutanten in das backboneeingefugt werden. Die Klonierung wurde durch Julia Zeidler durchgefuhrt.

2.3.4 Klonierung des pcDNA 3.1-LepRb Konstruktes

Zur transienten Transfektion von HepG2-Zellen wurde dieses Konstrukt verwendet.Dazu wurde pSVL-NON [Kluge et al., 2000] am 3’-Ende mit SacI geschnitten und dasuberhangende Ende aufgefullt. Am 5’-Ende wurde mit XbaI geschnitten. Uber die Vek-torschnittstellen XbaI (5’) und EcoRV (3’) wurde die cDNA dann gerichtet in den VektorpcDNA 3.1 (-) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kloniert.

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2.4 Saugerzellen und ihre Kultivierung

2.4.1 Saugerzelllinien

GT1-7-Zellen [Wetsel et al., 1998] wurden freundlicherweise von Prof. Dr. H. Jarry(Klinische u. Experimentelle Endokrinologie Universitats-Frauenklinik Gottingen) zurVerfugung gestellt. Phoenix™ -und H4IIEC3-Zellen (kurz: H4) wurden mir freundli-cherweise von PD Dr. Andreas Barthel (Abteilung fur Endokrinologie, Heinrich-Heine-Universitat Dusseldorf) zur Verfugung gestellt. Die HIT-T15-Zellen (im folgenden mit

”HIT“ abgekurzt) erhielten wir von Prof. Dr. Annette Schurmann (Deutsches Insti-tut fur Ernahrungsforschung, Potsdam-Rehbrucke). Die HepG2-Zellen erhielten wirfreundlicherweise von Dr. Johannes Bode (Klinik fur Gastroenterologie, Hepatologieund Infektiologie, Medizinische Klinik der Heinrich-Heine Universitat, Dusseldorf),und die RINm5F-Zellen von Dr. Dagmar Meyer zu Heringdorf (Institut fur Pharma-kologie, Universitatsklinikum Essen) (Tabelle 2.3).

Tab. 2.3: Ubersicht uber die verschiedenen Zelllinien

Zelltyp Gewebe Organismus Herkunft

HepG2 Leber (Hepatom) Mensch Dr. Bode, Dusseldorf

H4IIEC3 Leber (Hepatom) Ratte Dr. Barthel, Dusseldorf

Phoenix 293T (embryonale Niere) Mensch Dr. Barthel, Dusseldorf

GT1-7 Hypothalamus Maus Prof. Jarry, Gottingen

HIT-T15 Insel (Insulinoma) Syrischer Goldhamster Dr. Schurmann, Potsdam

RINm5F Insel (Insulinoma) Ratte Dr. Meyer zu Heringdorf, Essen

2.4.2 Losungen fur die Zellkultur

• DMEM (1x) High Glucose With Sodium Pyruvate and L-Glutamine (PAA Labo-ratories)

• DMEM/NUT. MIX F12 With Glutamax-I (1:1) and Pyridoxine (PAA Laboratories)• RPMI 1640 (1x) with L-glutamine (PAA Laboratories)• Foetal Calf Serum (FCS) Virus screened (PAA Laboratories)• Horse Serum (PAA Laboratories)• Trypsin-EDTA Solution (10x) (Gibco BRL)• Penicillin/Streptomycin Solution (Invitrogen)

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2.4.3 Medien und allgemeine Kulturbedingungen

Die in dieser Arbeit beschriebenen adharent wachsenden Saugerzellen wurden in einerwasserdampfgesattigten Atmosphare mit einem Gasgemisch aus 5% CO2 und 95%Luft bei 37 °C kultiviert. Die Zellen wurden in 80 cm2 -Kulturflaschen (”Nunclon™∆-Surface“, Fa. Nunc, Roskilde/Danemark) mit 10 ml Kulturmedium gehalten. DasMedium wurde montags, mittwochs und freitags erneuert.

Kulturmedium fur H4IIEC3-Zellen, GT1-7 und Phoenix™ Zellen

Basismedium DMEM (1x) High Glucose With Sodium Pyruvate and L-Glutamine mit10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin.

Kulturmedium fur HepG2-Zellen

Basismedium DMEM/NUT. MIX F12 With Glutamax-I (1:1) and Pyridoxine mit 10%FCS und 1% Penicillin/Streptomycin.

Kulturmedium fur HIT-Zellen

Basismedium DMEM (1x) High Glucose With Sodium Pyruvate and L-Glutamine mit10% FCS, 5% Horse serum und 1% Penicillin/Streptomycin.

Kulturmedium fur RINm5F-Zellen

Basismedium RPMI 1640 (1x) with L-glutamine mit 10% FCS und 1% Penicil-lin/Streptomycin.

2.4.4 Subkultivierung

Die in Kultur befindlichen Zellen wurden vor Erreichen der Konfluenz passagiert, d.h.subkultiviert, um eine Kontaktinhibition zu vermeiden. Zur Passagierung wurden dieZellen zunachst mit 10 ml PBS gewaschen und pro 80 cm2-Kulturflasche mit 1 ml Tryp-sin/EDTA fur 5 bis 15 min bei 37 °C inkubiert. Die ausreichende Ablosung der Zellenund deren Vereinzelung wurde unter dem Mikroskop (Nikon TMS) bei 100-facher Ver-großerung kontrolliert. Die Trypsinierung wurde durch Zugabe von 10 ml Kulturmedi-um gestoppt, die Zellen grundlich resuspendiert und je nach gewunschter Verdunnungein Teil der Zellsuspension auf neue Kulturgefaße fur die fortlaufende Kultur oderzur Kryokonservierung verteilt. Sollten Versuche in Petrischalen stattfinden, wurde vor

30


der Kultivierung die Zellzahl eines Aliquots in einer Neubauer-Kammer (Engelbrecht,Edermunde) bestimmt.

2.4.5 Kryokonservierung

Einfrieren

Zur Aufrechterhaltung moglichst gleicher Versuchsbedingungen wurden Zellen nied-riger Passagenzahl eingefroren. In 80 cm2-Kulturflaschen wurde 24 h vor der Konser-vierung das Medium gewechselt. Nach Waschen mit 10 ml PBS wurden die Zellendurch 1 ml Trypsin/EDTA von der Oberflache abgelost und in 10 ml Kulturmediumresuspendiert. Nach Bestimmung der Zellzahl wurde die Zellsuspension in ein 15 ml-Rohrchen uberfuhrt und 5 min bei 1 300 rpm und RT in einer Zentrifuge pelletiert. DerUberstand wurde abgesaugt und das Zellpellet in 2 ml FCS mit 10 % (v/v) DMSO auf-genommen und resuspendiert. Je 1 ml der Zellsuspension wurde in ein Kryorohrchenohne Beruhrung des Gefaßrands pipettiert. Die Zellen wurden in einem mit Isopropa-nol gefullten Einfrierbehalter (Freezing Container, Nalgene, Rochester, NY) bei -80 °Ceiner Temperaturabnahme von 1 °C/min ausgesetzt und am nachsten Tag in flussigenStickstoff uberfuhrt.

Auftauen

Ein dem flussigen Stickstoff entnommenes Kryorohrchen wurde zum Schutz vor Kon-taminationen mit Parafilm umklebt und die Zellen unter leichtem Schwenken im 37 °C-Wasserbad aufgetaut. Anschließend wurden sie in ein 15 ml-Rohrchen uberfuhrt, in10 ml Kulturmedium aufgenommen und 5 min bei 1 300 rpm in einer Tischzentrifu-ge pelletiert. Die Zellen wurden in 10 ml frischem Kulturmedium in einer 80 cm2-Kulturflasche ausgesat.

2.4.6 Mycoplasmentest

Der Nachweis von Mycoplasmen in der Zellkultur erfolgte mit dem Fluoreszenzfarb-stoff 4’,6’-Diamin-2’-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) unter Abwandlung der Her-stellerangaben (Roche Diagnostics, Mannheim) wie folgt: Die zu untersuchenden Zel-len wurden vor Beginn des Mycoplasmentests mindestens 48 h in Antibiotika-freiemMedium gehalten, um das Wachstum eventuell vorhandener Mycoplasmen zu fordern

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und somit deren Nachweis zu erleichtern. Auf Objekttragern in Quadriperm™-Schalen(Heraeus, Hanau) wurden die zu untersuchenden Zellen dann in einer Dichte von500 000 Zellen/Cavitat ausgesat und 24 h wachsen gelassen. Dann wurde das Mediumabgenommen und mit 8 ml DAPI in Methanol [1 µg/ml] 2 min bei RT stehengelas-sen. Nach Abgießen dieser Losung wurde der Objekttrager mit 2 ml DAPI/Methanol[1 µg/ml] uberschichtet und 15 min bei 37 °C inkubiert. Der Objekttrager wurde an-schließend zweimal in PBS fur 5 min gewaschen. Die Zellen wurden bei 100facher Ver-großerung mit einem Olimmersionsobjektiv unter einem Fluoreszenzmikroskop mit340/380 nm Anregungsfilter (z.B. Leica DMRX) betrachtet. DAPI bindet selektiv anDNA und bildet stark fluoreszierende DNA-DAPI-Komplexe mit hoher Spezifitat (Ab-sorptionsmaximum λ=340 nm). Bei einer Mycoplasmen-Kontamination von Zellkultu-ren findet man neben der Kernfarbung einzelne fluoreszierende Punkte im Cytoplasmaund im interzellularen Raum, ahnlich einem ”Schneegestober“.

2.4.7 Inkubation eukaryotischer Zellen mit Cytokinen

Zur Untersuchung der Signaltransduktion wurden die Saugerzellen mit verschiedenenCytokinen stimuliert. Dazu wurden die Zellen in 85mm-Petrischalen (Cellstar™ Pe-trischalen 94 x 16 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen) ausgesat und bis zueiner Dichte von 80% wachsen gelassen. 20 h vor Beginn der Stimulation wurde dasKulturmedium durch Medium ohne FCS ersetzt. Bei RINm5F-Zellen wurde anstelledes FCS 0.02 % (w/v) BSA zugesetzt. Beim eigentlichen Stimulationsvorgang wurdedas jeweilige Cytokin zu den Zellen pipettiert und durch eine kreisformige Schwenk-bewegung verteilt. Die Isolierung von Zellprotein bzw. von RNA erfolgte nach der imKapitel ”Ergebnisse“ angegeben Zeitspanne. Mit dem entsprechenden Volumen des rei-nen Losungsmittels inkubierte Zellen dienten als Negativkontrolle.

• Leptin: Murines, rekombinantes Leptin wurde von der Firma PeproTech (Lon-don, England) bezogen. Es wurde in 10 mM Natriumcitrat pH 4.0 gelost und aufeine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt.

• IL-6: Rekombinantes humanes IL-6 wurde im Institut fur Biochemie der RWTHAachen prapariert [Arcone et al., 1991] und freundlicherweise von PD Dr. Ger-hard Muller-Newen zur Verfugung gestellt. Konzentration: 500 U/µl.

• sIL-6R: Loslicher humaner IL-6-Rezeptor wurde wie beschrieben prapariert[Weiergraber et al., 1995] und von

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PD Dr. Gerhard Muller-Newen feundlicherweise zur Verfugung gestellt. Konzen-tration: 1 µg/ml.

• GH: Humanes, rekombinantes Wachstumshormon wurde von der Firma BachemBiochemica (Heidelberg, Deutschland) bezogen. Das Lyophilisat wurde in auto-klaviertem A. bidest. gelost und auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt.

• IL-1β: Humanes, rekombinantes IL-1β wurde freundlicherweise von Herrn Dipl.-Biol. Xiangping Yang (Institut fur Biochemie der RWTH Aachen) zur Verfugunggestellt. Die Konzentration der Stammlosung betrug 50 U/µl.

2.5 Verfahren zur Transfektion von S augerzelllinien

2.5.1 Transiente Transfektion mit dem FuGENE 6 Transfection

Reagent

Etwa 1 h vor Beginn der Transfektion erhielten die Zellen 10 ml frisches Kulturme-dium. Zur transienten Transfektion von HIT-Zellen wurde ausschließlich das nicht-liposomale Transfektionsreagenz ”FuGENE 6 Transfection Reagent“ (Roche Diagnostics,Mannheim) benutzt. Dazu wurden 94.6 µl Serum-freies Medium in einem Eppendorf-Reaktionsgefaß vorgelegt, 5.4 µl FuGENE 6 Transfection Reagent zugesetzt und durchAnschnippen vorsichtig gemischt. Nach Zugabe von 2.7 µg DNA (in einem Maximal-volumen von 50 µl) und vorsichtigem Mischen wurde der FuGENE 6-DNA-Komplexfur 20 min bei RT inkubiert und anschließend direkt in das Kulturmedium der Petri-schale mit den Zellen getraufelt.

2.5.2 Stabile Transfektion mit transgenen Retroviren

Retroviren haben die Eigenschaft, ihre RNA nach der Infektion der Wirtszelle mit Hilfeihrer im Viruscapsid enthaltenen Reversen Transkriptase in DNA umzuschreiben unddiese dann ins Wirtsgenom zu integrieren. Retroviren stellen auf Grund dieser Eigen-schaft ein geeignetes System zur stabilen Transfektion von Zelllinien dar.

Im pWZL-System werden zur Virenherstellung sog. packaging-lines benutzt, die bereitseinen Teil der Virushullproteine synthetisieren. Nach Transfektion dieser Linien mit

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dem pWZLneo-Plasmidkonstrukt bilden diese die vollstandigen Virionen, die zusam-men mit dem Kulturmediumuberstand gewonnen werden konnen. Zur Kontrolle derTransfektionseffizienz wird das Plasmid pEGFP-N1 co-transfiziert. Dieser Vektor fuhrtzur Expression des green fluorescent protein. Dies ermoglicht eine Auszahlung der trans-fizierten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Mit dem virenhaltigen Uberstandsind Nager-Zielzellen transfizierbar. Die erfolgreich infizierten Wirtszellen konnen uberden enthaltenen Selektionsmarker Neomycin selektioniert werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die hypothalamische Maus-Zellinie GT1-7 und die bei-den Ratten-Zelllinien RINm5F (Insulinoma) und H4IIEC3 (Hepatoma) mit Retroviren,die die cDNA fur den murinen Leptinrezeptor enthalten, stabil transfiziert.

Transfektion der packaging-line Phoenix™ und Ernte der Viren

Die Transfektion der Phoenix-Zellen erfolgte nach der Calciumphosphat-Prazipita-tionsmethode [Graham et al., 1973]. Einen Tag vor der Transfektion wurden 3.5 x 105

Zellen in 85 mm-Kulturschalen (Cellstar™, Greiner Labortechnik, Frickenhausen) aus-gesat. Vier Stunden vor der Transfektion erfolgte ein erneuter Mediumwechsel. ProKulturschale wurden 25 µg pWZLneo und 100 ng pEGFP-N1 zur Kontrolle der Trans-fektionseffizienz eingesetzt. Die DNA wurde mit 183 µl CaCl2 [2 M] in einem 15 mlPolystyrolrohrchen gemischt und mit A. bidest. auf 1.5 ml aufgefullt. Zu dem DNA-CaCl2-Gemisch wurden 1.5 ml 2x HBS tropfenweise zugegeben, anschließend 25 Se-kunden mit Luft begast und zuletzt durch Pipettieren grundlich gemischt. Innerhalbvon 20 min bildete sich ein Prazipitat, das tropfenweise den Zellen zugesetzt wurde.

Nach 24 h erhielten die Zellen frisches Kulturmedium, und die Transfektionseffizi-enz wurde anhand der GFP-Expression kontrolliert. Da die Virionen bei 32 °C stabilersein sollen, wurde ab dem 2. Tag die weitere Inkubation bei dieser Temperatur durch-gefuhrt. Am dritten, funften und siebten Tag nach der Transfektion wurde jeweils der

virenhaltige Zellkulturuberstand abgenommen und bei -20 °C gelagert.

Infektion der Zielzellen und Selektion mit Neomycin

Die Zielzellen wurden in 6well-multidish-Platten so ausgesat, dass sie am Tag der In-fektion eine Flache von 30 % - 40 % bedeckten. Zur Infektion wurden 5 ml Normalme-dium (+1 % PenStrep + 10 % FCS) mit 15 µl Polybrene-Stammlosung [5 mg/ml] und10 ml Retrovirensuspension gemischt. Mit dieser Mischung wurden die Zellen in denwells Nr. 1-5 uberschichtet. Well Nr. 6 sollte als Negativkontrolle dienen und wurde mit3 ml Virus-freiem Kulturmedium bedeckt. Insgesamt wurden die Zellen dreimal infi-

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ziert, und zwar in einem Abstand von jeweils 24 h. Wahrend dieser Zeit wurden dieZellen mit den Virus-haltigen Uberstanden in der ublichen Kulturatmosphare, jedochbei 32 °C inkubiert. Zur Selektion der infizierten Zellen wurden die Zellen so langemit 1-2 mg/ml Neomycin behandelt, bis in dem well der Negativkontrolle mindestens1 Woche lang keine lebenden Zellen mehr zu sehen waren. Die nunmehr stabil transfi-zierten Zellen wurden subkultiviert und zur weiteren Lagerung in flussigem Stickstoffkryokonserviert.

2.6 Isolation von Proteinen aus S augerzelllinien

2.6.1 Kernextrakte

Die Kernextraktion aus Saugerzelllinien wurde weitgehend wie in der Primarliteraturbeschrieben [Sadowski et al., 1989] durchgefuhrt. Dazu wurden konfluent gewachseneZellen nach folgendem Schema gewaschen: 1x mit PBS, 1x mit PBS+V+F, und 1x mitHypotonischem Puffer WS.

Die Zellen wurden dann in 500 µl Hypotonischem Puffer WS + NP40 abgerubbertund in Mikroreagenzgefaße uberfuhrt. Die Uberstande mit Membranen und Cytosolwurden nach Zentrifugation (20 sec, 14 000 rpm, +4 °C, Eppendorf-Tischzentrifuge5417R) abgenommen, bei -80 °C gelagert; das Pellet mit Zellkernen wurde in 100 µlHochsalz-Puffer WS resuspendiert und 30 min bei +4 °C im Uberkopfrotator ”Reax2“(Heidolph, Schwabach) inkubiert. Durch den Hochsalz-Puffer wurden die Kerne aufge-schlossen und die Kernproteine in Losung gebracht. Die unerwunschten Zellfragmen-te wurden anschließend durch Zentrifugation (20 min, 14 000 rpm, +4 °C, Eppendorf-Tischzentrifuge 5417R) entfernt. Zuletzt wurde der Uberstand (Kernextrakt) abgenom-men, aliquotiert und bei -80 °C aufbewahrt.

2.6.2 Gesamtlysate ( ”Native Lyse“)

Dazu wurden Saugerzellen in 85 mm - Petrischalen herangezogen und zum gewunsch-ten Zeitpunkt nach folgendem Schema lysiert: Das Medium wurde abgesaugt, die Zel-len 1x mit PBS gewaschen und schließlich in 500 µl Lysepuffer abgerubbert. Die Zell-suspension wurde in Mikroreagenzgefaße uberfuhrt und 2x fur jeweils 30 sec mit Ultra-

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schall behandelt. Zelltrummer wurden durch eine Zentrifugation (5 min bei 14 000 rpmund +4 °C) abgetrennt. Der Uberstand wurde abgenommen und bei -80 °C gelagert.

2.7 Western-Blot und immunchemische Detektion

spezifischer Proteine

2.7.1 Western-Blot

Die zu untersuchenden Proteine wurden zunachst in einer SDS-Polyacrylamidgel-elektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Das SDS-Polyacrylamid-Gel setzt sich aus ei-nem Trenngel (pH 8.8) und einem daruberliegenden Sammelgel (pH 6.8) zusammenund wird von zwei parallelen Glasplatten in Form gehalten. Die Proben wurden inGegenwart von 0.5x LSB/DTT 7 min bei 95 °C denaturiert, auf Eis abgekuhlt und an-schließend in die Geltaschen pipettiert. Der Gellauf erfolgte in 1x Elektrodenpuffer bei10 mA (Sammelgel) bzw. 20 mA (Trenngel) bis zum Herauslaufen der blau gefarbtenFront.

Der Transfer aufgetrennter Proteine aus dem SDS-Polyacrylamid-Gel auf eineNitrocellulose-Membran (Protran, Schleicher & Schuell, Dassel) erfolgte im Tankblot-Verfahren (Tankblot TE 22 Mighty Small™ Transphor, Hoefer Scientific Instruments,San Francisco, USA). Die Nitrocellulose wurde in Transferpuffer fur 3 min aquilibriert.Die Transfereinheit (von Kathode zu Anode) wurde wie folgt zusammengebaut: einmit Transferpuffer gesattigtes Filterpapier (Nr. 382461, Schleicher & Schuell, Dassel),das Gel, die blasenfrei aufgelegte Membran und ein weiteres Filterpapier. Geblottetwurde in der mit Transferpuffer gefullten Apparatur unter Wasserkuhlung bei 200 mAfur 2 h. Die transferierten Proteine wurden fur 3 min in Ponceau-S-Losung angefarbtund die Laufhohe der Standardproteine mit einem Kugelschreiber angezeichnet. DerNachweis spezifischer Proteine in den Zelllysaten oder Kernextrakten wurde mittelsPeroxidase-vermittelter Chemilumineszenz gefuhrt.

Der Nachweis spezifischer, phosphorylierter Proteine erfolgte durch den Einsatzvon Phospho-Tyrosin- bzw. Phospho-Serin-spezifischen Antikorpern als ”primare An-tikorper“ (siehe Tab. 2.4). Außer dem Antikorper gegen den murinen LepRb (R&D Sys-tems, Minneapolis, MN, USA) und dem Antikorper gegen STAT5B (Upstate Biotech-nology, Lake Placid, NY, USA) wurden alle Antikorper von der Firma Cell Signaling

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Technology (Beverly, MA, USA) bezogen. Die Antikorper wurden in TBST, welches 5 %BSA (w/v) und 0.02 % (w/v) Natriumazid enthielt, verdunnt und bei +4 °C gelagert.

Tab. 2.4: Liste der benutzten Antik orper

Antik orper Verdunnung Organismus

STAT3 (gesamt) 1:1000 Kaninchen

PY705-STAT3 1:1000 Kaninchen

PS727-STAT3 1:700 Kaninchen

STAT5B (gesamt) 1:2000 Kaninchen




Phospho-p42/p44 ERK 1:1000 Kaninchen

Maus-LepR 1:200 Ziege

Die in Ponceau S-gefarbte Nitrocellulosemembran wurde durch 10 minutiges Schuttelnin TBST entfarbt. Zum Absattigen unspezifischer AK-Bindungsstellen wurde die Mem-bran fur 1 h bei RT in Blockinglosung geschuttelt. Anschließend erfolgte die Inkubati-on mit dem primaren Antikorper in der oben angegebenen Verdunnung in TBST + 5 %BSA und 0.02 % Azid UN bei +4 °C auf dem Schuttler. Zur Entfernung uberschussi-gen Antiserums wurde die Membran dreimal je 15 min bei RT in TBST auf demSchuttler gewaschen. Nun folgte fur 1 h auf dem Schuttler bei RT die Inkubation mitdem sekundaren Antikorper Anti-IgG-POD ”ImmunoPure®Antibody Goat anti-Rabbit IgG(Fc)“ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) bzw. POD-conjugated Affinity Pure Rab-bit Anti-Goat IgG (H+L) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) in einerVerdunnung von 1:5000 in 5 % (w/v) Magermilchpulver in TBST. Uber die durch diePOD-Aktivitat ausgeloste Chemilumineszenz wurden die Signale durch Exposition aufeinen Rontgenfilm (Hyperfilm™ MP, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) darge-stellt. Eine Inkubation von 60 sec in der Detektionslosung (eine frisch hergestellte Mi-schung aus den ECL-Substratkomponenten I und II) startete die Chemilumineszenz-Reaktion, und die Membran wurde je nach Intensitat des Signals uber einen Zeitraumvon einigen Sekunden bis zu mehreren Minuten exponiert.

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2.7.2 Entfernen von spezifisch gebundenem Antik orper

Im Anschluss an einen Western-Blot-Immun-Nachweis mit Peroxidase-vermittelterChemilumineszenz konnte die Bindung zwischen Protein und Antikorper gelost wer-den, indem die Membran 30 min lang unter leichtem Schutteln im Wasserbad bei 50 °Cin TBS mit 100 mM β-Mercaptoethanol und 2% SDS inkubiert wurde. Anschließendwurde die Mebran zweimal fur je 15 min in TBST-Puffer bei RT gewaschen und zuletztfur 1 h bei RT in TBST mit 3 % BSA geblockt.

2.8 DNA-Retardierungsassay (EMSA)

Viele Transkriptionsfaktoren binden nur dann an den Promotor, wenn sie durch einzellulares Signal aktiviert wurden. So erhalten STAT-Faktoren ihre Bindungsfahigkeiterst als Dimere, die wiederum nur nach Phosphorylierung entstehen.

Zur Untersuchung der Bindungsfahigkeit von Transkriptionsfaktoren an spezifischeDNA-Sequenzen wurden DNA-Retardierungsassays durchgefuhrt. Dazu wurden ausstimulierten bzw. unstimulierten Zellen Kernextrakte isoliert (siehe Abschnitt 2.6.1).Die Kernextrakte wurden dann mit 32P-markierten DNA-Oligonukleotiden, die spe-zifische Bindungsstellen fur Transkriptionsfaktoren enthalten, inkubiert und anschlie-ßend auf ein PAA-Gel aufgetragen. Im elektrischen Feld wandern die markierten DNA-Oligonukleotide zur Anode; ihre Laufgeschwindigkeit ist jedoch verzogert (retardiert),wenn Transkriptionsfaktoren gebunden sind, was auf dem Autoradiogramm zu er-kennbaren Banden fuhrt.

Fur die in dieser Arbeit beschriebenen EMSA-Versuche wurde fur den Nachweis derSTAT5-Aktivierung ein DNA-Oligonukleotid aus dem β-Casein-Promotor (im folgen-den als ”β-CAS“ bezeichnet), fur die STAT3- und STAT1-Aktivierung ein Sequenzab-schnitt aus dem c-fos-Promotor (im folgenden als ”m67SIE“ bezeichnet) und fur dieNF-κB Bindung eine Sequenz benutzt, die aus dem Promotor des Gens fur die Igκ-Ketteabgeleitet wurde. Die Oligonukleotide β-CAS und m67SIE standen in unserer Arbeits-gruppe zur Verfugung. Das NF-κB Oligonukleotid wurde uns freundlicherweise vonHerrn Xiangping Yang (Institut fur Biochemie, Aachen) zur Verfugung gestellt.

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m67SIE:

5’-GAT CCG GGA GGG ATT TAC GGG AAA TGC TG-3’

3’-GC CCT CCC TAA ATG CCC TTT ACG ACT TAA-5’

β-CAS:

5’-TTA GAT TTC TAG GAA TTC-3’

3’-T CTA AAG ATC CTT AAG TTA G- 5’

NF-κB:

5’-GAT CCA TGG GGA ATT CCC-3’

3’-GT ACC CCT TAA GGG GTA C-5’

Oligonukleotide fur einen EMSA wurden nach der end-labeling-Methode markiert. Siesind so konstruiert, dass sie zu Doppelstrangen hybridisieren und dabei 5’-Uberhangeentstehen. Vor dem eigentlichen Retardierungsversuch wurden die einzelstrangigenDNA-Oligonukleotide zunachst untereinander hybridisiert und radioaktiv markiert.Dazu wurden je 30 µl einer wassrigen 2 pmol/µl-Verdunnung gemischt und fur 1 minin einem Heizblock bei 95 °C inkubiert. Nach Abschalten des Heizblocks wurden dieOligonukleotide noch weitere 45 min bei einer somit kontinuierlich abnehmenden Tem-peratur inkubiert. Die Hybridisierung der beiden Einzelstrange konnte in einer PAA-Gelelektrophorese (12% PAA; 1x TAE; Lauf in 1x TAE als Laufpuffer) durch das re-tardierte Laufverhalten der Doppelstrange verglichen zu den Einzelstrangen kontrol-liert werden. Bei der Markierung wurden die uberhangenden Enden mit radioaktivenNukleotiden aufgefullt: Ca. 3 pmol dieser DNA wurden in einem Endvolumen von40 µl 1x OLBfTTP bzw. 1x OLBfATP, 40 µCi [α32P]-dATP (bei β-CAS) bzw. [α32P]-dTTP(bei m76SIE) und 10 u Klenow-Fragment fur 3 h bei RT inkubiert. Die Aufreinigungder markierten Fragmente erfolgt mit dem Nucleotide Removal Kit (Fa. Qiagen, Hilden);eluiert wurde jeweils in 50 µl A. bidest.

Das 4.5 % EMSA-PAA Gel (6.75 ml Acrylamid/Bis-Acrylamid[40 %; 19:1], 1.50 ml 10xTBE, 49.25 ml H2O, 2 ml Glycerin [87 % v/v], 40 µl TEMED, 400 µl APS [10 % w/v])

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wurde bei 180 V fur 30 min einem Vorlauf unterzogen, um das ungebundene APS her-auslaufen zu lassen. Zur Bindung der Faktoren wurden 9.5 µl Kernextrakt [1 µg/ml]mit 9.5 µl EMSA-Cocktail versetzt und 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 1 µl(40 000 Cpm) radioaktiver Oligonukleotid-DNA wurde das Gemisch nochmals 15 minbei RT inkubiert und dann auf ein 4.5%iges PAA/Glycerin-Gel aufgetragen. Nach demGellauf (3.5 h bei 10 V/cm in 0.25 x TBE) wurde das Gel fur 20 min bei RT in Fixierpuf-fer inkubiert und anschließend fur 90 min bei 60 °C auf einem Geltrockner getrocknet.Die Auswertung der Daten erfolgte durch Exposition eines Phosphor Storage Screens(Fa. Packard, Meriden/USA).

2.9 Blot-und Hybridisierungstechniken

2.9.1 Northern-Blot

Beim Northern-Blot wird RNA, die zuvor in einer Agarosegelelektrophorese aufgetrenntwurde, auf eine Nylonmembran transferiert und dort fixiert. Mit einer radioaktiv mar-kierten cDNA-Sonde laßt sich so das Vorhandensein einer bestimmten mRNA nach-weisen. Die Starke des Signals gibt dabei Auskunft uber die Menge der vorhandenenmRNA.

Die zu untersuchende Gesamt-RNA wurde in einem denaturierenden Agarosegel (sie-he Abschnitt 2.2.6) aufgetrennt. Die Ubertragung der RNA auf Nylon N+-Filter (Amers-ham Pharmacia Biotech) erfolgte durch Kapillar-Blot-Technik mit 10x SSC als Blotting-Puffer. Nach dem Transfer uber Nacht wurde die Nylonmembran fur 5 min in 2xSSC geschwenkt, an der Luft angetrocknet und die RNA mittels UV-Licht (0.4 J/cm2,λ=312 nm) kovalent und irreversibel an die Membran gebunden. Anschließend wur-den die restlichen Salze durch 5 minutiges Schutteln in A. bidest. entfernt. Die durchEthidiumbromid angefarbten 18S- und 28S- rRNA (bei der Ratte 1874 bp bzw. 4718 bp)wurden als Großenmarker mit einem Kugelschreiber gekennzeichnet. Zuletzt wurdedie Membran an der Luft getrocknet und bis zur weiteren Verwendung trocken undlichtgeschutzt aufbewahrt.

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2.9.2 Eigene Herstellung von cDNA- Arrays (Dot-Blots )

Zur Untersuchung der differentiellen Regulation von cDNA-Transkripten wurden mitden gelosten cDNAs dot blots erstellt, die spater mit 32P-markierten komplexen cDNA-Sonden hybridisiert wurden. Dazu wurden die zu untersuchenden cDNAs entwederuber PCR amplifiziert oder aus einem Vektor ausgeschnitten, gelost und mit Hilfe ei-ner dot blot-Apparatur unter Berucksichtigung eines festgelegten Koordinatensystemspunktformig auf eine Nylonmembran aufgetragen. Von jeder cDNA wurden 5 ng proPunkt aufgetragen. Dazu wurde im Einzelnen wie folgt verfahren:

Zur Vorbereitung der Probe wurde 1 µl (5 ng) DNA mit 3 µl Bromphenolblaulosung[0.1%] und 46 µl 2x SSC versetzt und fur 10 min bei 60 °C denaturiert.

Eine Nylonmembran mit den Abmessungen 115 mm x 75 mm (Nylon N+, AmershamPharmacia Biotech, Freiburg) wurde fur 2 min bei RT in 2x SSC hydratisiert und ineine dot blot-Apparatur ”The Convertible™, Filtration Manifold System“(Gibco BRL,Gaithesburg, USA) eingespannt. Uber eine Wasserstrahlpumpe wurde die Apparaturan ein Vakuum angeschlossen, und die cDNA Probe (50 µl) wurde aufgetragen. Nachdem Auftragen aller Proben wurde jedes well nochmals mit 200 µl 2x SSC nachgespultund das Vakuum fur weitere 10 min appliziert. Die Membran wurde aus der Apparaturentnommen und 4 min lang zwecks Denaturierung der DNA in 100 ml NaOH [500 mM]bei RT auf dem Schuttler inkubiert. Nach kurzem zweimaligen Spulen in A. bidest.erfolgte die Neutralisation durch 10-minutige Inkubation in 500 mM Tris pH 7.5 beiRT. Uberschussige Salze wurden schließlich durch 2-maliges Waschen (je 5 min) in je100 ml A. bidest. bei RT entfernt. Der Filter wurde luftgetrocknet, und die cDNA mitUV-Licht (0.4 J/cm2, λ=312 nm) auf der Membran fixiert. Bis zur weiteren Verarbeitungwurde die Membran trocken und lichtgeschutzt aufbewahrt.

2.9.3 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten mit 32P

Die Markierung von cDNA-Fragmenten mit [α32P]-dCTP erfolgte nach dem Verfahrendes random-primed-labeling [Feinberg et al., 1983]. 50-500 ng DNA wurden mit 1-1.5 µgHexanukleotid-Primer (Amersham Pharmacia Biotech) vermischt und die DNA fur10 min bei 97 °C denaturiert. Nach Zugabe von 20 µCi [α32P]-dCTP (3 000 Ci/mmol,Hartmann Analytics, Braunschweig), 5 u Klenow-Fragment (MBI Fermentas, Vilnius,Litauen) und 1x OLBfCTP erfolgte die Synthese eines neuen Stranges fur 1 h bei 37 °C.Anschließend wurde die markierte DNA mit Hilfe des Nuleotide Removal Kit (Qiagen,

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Hilden) aufgereinigt und in zwei Elutionsschritten mit jeweils 100 µl EB-Puffer (oderA. bidest.) von der Saule eluiert. In dem Gesamtvolumen von 200 µl wurde die Markie-rungseffizienz durch Messung eines 1 µl-Aliquots im Beta-Counter (Model LS6000SC,Beckman, Fullerton, CA/USA) bestimmt.

2.9.4 Radioaktive Markierung einer komplexen cDNA-Sonde mit33P

Zur Hybridisierung von Macro Arrays und dot blots wurde eine radioaktiv markiertekomplexe cDNA-Sonde benotigt. Dabei handelt es sich um poly-A+-mRNA aus stimu-lierten bzw. unstimulierten Zellen, die mit dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNAtranskribiert und dabei gleichzeitig mit 33P markiert wird. Dazu wurde zunachst ineinem Gesamtvolumen von 8 µl 500 ng polyA+-mRNA in Gegenwart von 1.2 µg desPrimers T7T14VN

5’-TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GTT TTT TTT TTT TTT (AGC) (AGCT)- 3’

10 min bei 70 °C inkubiert und anschließend 10 min auf Eis gekuhlt. Nach Zugabevon 20 u RNasin (Promega, Madison, WI, USA), 1x first-strand-Buffer, 6.25 mM DTT,0.4 mM dGTP, dATP, dTTP, 200 µCi [α33P]-dCTP (3 000 Ci/mmol, Hartmann Analytics,Braunschweig) und 300 u Superscript-II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) als ReverseTranskriptase wurde der Ansatz fur 2 h bei 37 °C inkubiert. Zur Hydrolyse der RNA-Matrize erfolgte nun in der Gegenwart von 16 mM EDTA pH 8.0, 0.3% SDS und 290 mMNaOH eine Inkubation bei 68 °C fur 30 min. Die Neutralisation der NaOH wurde durchInkubation mit 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 120 mM HCl in einem Gesamtvolumen von80 µl durchgefuhrt.

Die komplexe cDNA-Sonde wurde mit Hilfe des Nucleotide Removal Kit (Qiagen, Hil-den) aufgereinigt. Die Markierungseffizienz wurde bestimmt, indem die Radioaktivitatdes gesamten Nukleotid-Sondengemisches vor der Aufreinigung mit der Radioakti-vitat des Eluates verglichen wurde. Die Messung der Aliquots erfolgte jeweils im Beta-Counter (Model LS6000SC, Beckman, Fullerton, CA/USA).

2.9.5 Hybridisierung von Northern-Blots

Die zu hybridisierenden Filter wurden in eine Hybridisierungsrohre (Durchmesser:35 mm) uberfuhrt und je nach Große der verwendeten Rohre 7-15 ml Northern-Blot-

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Hybridisierungspuffer zugegeben. Die Prahybridisierung zur Absattigung unspezifi-scher Bindungsstellen auf der Membran erfolgte in einem Drehofen (Biometra, Gottin-gen) fur mindestens 90 min bei 42 °C. Anschließend wurde die Sonde zugesetzt und UNbei 42 °C hybridisiert. Die Anzahl der Waschschritte richtete sich nach der Starke desSignals. Bei schwacheren Signalen wurde die Membran wie folgt gewaschen: einmalfur 15 min mit 2x SSC/0.1% SDS bei 42 °C im Drehofen und einmal fur 10 min mit 0.8xSSC/0.1% SDS bei 55 °C im Wasserbad. Bei starken Signalen schlossen sich dem erstenWaschschritt bei 42 °C folgende Schritte an: einmal fur 15 min mit 1 x SSC/0.1% SDS bei55 °C und einmal fur 5 min mit 0.3x SSC/0.1% SDS bei 55 °C im Wasserbad. Der Filterwurde fur 1-3 Tage auf einem Phosphor Storage Screen (Fa. Packard, Meriden/USA) beiRT exponiert und mit dem Phosphoimager STORM 820 (Molecular Dynamics, Sunnyva-le, CA/USA) ausgewertet.

2.9.6 Hybridisierung von Dot-Blots und cDNA- Macro-Arrays

cDNA-Macro-Arrays und Dot-Blots wurden nach folgendem Verfahren hybridisiert:Der zu hybridisierende Filter wurde in eine Hybridisierungsrohre uberfuhrt, und 15-25 ml Array-Hybridisierungspuffer wurden zugegeben. Bei Dot-Blots wurden Hybri-disierungsrohren mit einem Durchmesser von 35 mm benutzt, bei cDNA-Macro-Arrays gelangten 70 mm-Rohren (”HB-OV-BXL“, Thermo-Hybaid, Needham Heights,MA/USA) zum Einsatz. Die Prahybridisierung erfolgte in einem Drehofen (”Shake ’n’Stack“, Thermo Hybaid) fur 5 h bei 65 °C. Anschließend wurde die vollstandige Sondezugesetzt und fur 20 h bei 65 °C hybridisiert. Bei cDNA-Macro Arrays wurden außer-dem jeweils 750 000 Cpm 33P-markierter ”guide dot“-cDNA zugegeben. Dabei handeltes sich um ein Fragment aus dem bakteriellen Kanamycin-Resistenzgen, welches –inden Vektor pBluescript kloniert– vom RZPD in Berlin zur Verfugung gestellt wurde.Diese guide dot-cDNA hybridisiert mit den entsprechenden cDNA dots, die vom RZPDin regelmaßigen Abstanden auf dem cDNA-Macro-Array angebracht wurden und beider elektronischen Auswertung als Orientierungshilfe dienten.

Die Membran wurde wie folgt gewaschen: 1x fur 20 min mit 1x SSC/0.1% SDS bei 65 °Cim Drehofen, 2x fur jeweils 10 min mit 0.3x SSC/0.1% SDS bei 65 °C im Wasserbad undzuletzt 1x fur 10 min mit 0.1x SSC/0.1% SDS bei 65 °C im Wasserbad. Der Filter wurde3 Tage lang auf einem Phosphor Storage Screen (Fujifilm Imaging Plate BAS-MS2325, FujiPhoto Film, Japan) bei RT exponiert und mit dem Phosphoimager STORM 820 (MolecularDynamics, Sunnyvale, CA/USA) ausgewertet.

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2.9.7 Auswertung von Macro-Array -Hybridisierungen mit der

AIDA™-Software

Zum Auffinden Leptin-regulierter Gene wurde ein cDNA-Filter-Array mit einer kom-plexen cDNA Sonde aus Leptin-stimulierten bzw. unstimulierten RINm5F-LepRb-Zellen hybridisiert. Bei dem Macro-Array handelte es sich um eine Nylonmembran mitden Abmessungen 222 mm x 222 mm, auf die mit Hilfe einer automatisierten Anla-ge 57 600 cDNA-dots (Punkte) aufgetragen wurden. Diese cDNA dots sind auf 2 304einzelne Blocke aufgeteilt, wobei jeder Block 25 einzelne dots enthalt. Von den 25 dotseines Blocks dient 1 dot als Orientierungshilfe (guide dot) bei der elektronischen Aus-wertung der Hybridisierung. Dieser dot enthalt die cDNA des bakteriellen Kanamycin-Resistenzgens. Wird der komplexen cDNA-Sonde die radioaktiv markierte cDNA desKanamycin-Resistenzgens zugesetzt, fuhrt dies zu einem regelmaßigen Punktemusterauf dem Autoradiogramm.

Jeder cDNA-Klon ist innerhalb eines Blocks entsprechend eines festgelegten Musters1

doppelt aufgetragen, um Fehler bei der Auswertung zu vermeiden (siehe Abb. 2.2).Somit enthalt der Macro Array 27 648 verschiedene cDNA Klone. Die Arrays wurdenvom RZPD in Berlin bezogen.

Die elektronische Auswertung der differentiellen array-Hybridisierungen wurde mitHilfe der AIDA™-Software der Firma Raytest (Straubenhardt) durchgefuhrt. Dabeiwurde zunachst die Signalstarke jedes dots uber die Flache integriert. Dann erfolgteeine Normalisierung durch Division durch die Signalstarke des Referenz-dots β-Actin(Koordinaten: x, y: 24, 192). Schließlich wurde von diesem Wert der Hintergrundwert(die ”Intensitat“ der dot-Zwischenraume) subtrahiert. Die so normalisierten Werte bei-der Arrays wurden nun untereinander dividiert, und so wurde die ”ratio“, also dasSignalverhaltnis beider differentiell hybridisierter Arrays fur einen bestimmten Klonerrechnet:

RATIO =Normalisierte Intensitat - Hintergrund [Leptin]

Normalisierte Intensitat - Hintergrund [Ø]

Neben dem Filter und der Software stand uns eine digitale Liste der cDNA-dots mit dendazugehorigen Koordinaten, Gen-Namen und gene bank accession numbers im Excel™-Format zur Verfugung. So konnte mit Hilfe der AIDA-Software™ beim Vergleich von

1http://www.rzpd.de

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zwei Arrays eine Liste der hoch- bzw. runterregulierten Gene erstellt werden. Zur Be-grenzung der Anzahl falsch-positiver Effekte wurden nur Effekte mit einer ratio ≥ 2.5und absolute Signalstarken ≥ 1.0 gewertet.

Abb. 2.2: Verteilung der doppelt aufgetragenen Klone (schematische Darstellung). Jedes Klon-Paar ist als Buchstaben-Paar dargestellt, um das Auftragungsmuster zu verdeutlichen. Der dunkelgraugefarbte Punkt in der Mitte des Blocks stellt den guide dot dar (siehe Text). Jedem Klon ist ein x,y-Koordinatenpaar zugeordnet.

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3 Ergebnisse

3.1 Der JAK-STAT Signalweg nach Stimulation mit

Cytokinen

3.1.1 Charakterisierung des Leptineffektes in verschiedenen

Zelllinien

Ziel dieser Arbeit war das Auffinden Leptin-regulierter Gene. Dazu wurden zunachstausgewahlte Zelllinien aus Geweben, in denen physiologische Leptineffekte gezeigtwerden konnten, auf endogene Expression des Leptinrezeptors untersucht. Dabei rich-tete ich mich nach den Angaben der Literatur, die die endogene Expression der langenSpleißvariante des Leptinrezeptors (LepRb) in verschiedenen Geweben beschreibt. Inder vorliegenden Arbeit wurden die hypothalamische Linie GT1-7 (Maus), die Hepa-toma Linien H4IIEC3 (Ratte) und HepG2 (Mensch), und die Insulinoma-Linien HIT-T15 (syrischer Goldhamster), INS-1 (Ratte) und RINm5F (Ratte) auf die Expressiondes LepRb untersucht. Dabei wurde der Nachweis des LepRb indirekt funktionellgefuhrt, d.h. die durch Leptin hervorgerufene Aktivierung des Signalweges wurdemittels Western-Blot (phospho-Tyr705-STAT3-Antikorper) bzw. Northern-Blot (SOCS-3-mRNA) nachgewiesen. In keiner der untersuchten Linien konnte nach 15 minutigerBehandlung mit Leptin (100 ng/ml) eine Phosphorylierung von STAT3 nachgewiesenwerden (Abb. 3.1, Teil A), so dass man nicht von einer endogenen Expression des LepRbin diesen Zellen ausgehen kann. Auch in INS-1, einer weiteren Insulinoma-Linie derRatte, konnte die endogene Expression des LepRb nicht nachgewiesen werden (Datennicht gezeigt). Zur weiteren Untersuchung des Leptin-Signalweges in diesen Zellenwar also eine Transfektion mit der cDNA der langen Spleißvariante des Leptinrezep-tors notig.

Die Linien HIT und HepG2 wurden transient transfiziert, die Linien H4IIEC3 (im fol-genden als H4 abgekurzt), GT1-7 und RINm5F jedoch wurden mit Hilfe eines retro-

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3 Ergebnisse

Abb. 3.1: STAT3-Phosphorylierung nach Leptinstimulation in verschiedenen Zelllinien. Verschie-dene Zelllinien wurden fur 15 min mit Leptin [100 ng/ml] stimuliert, lysiert und im Western-Blot mitphosphospezifischen Antikorpern untersucht. (A) Untransfizierte Zellen; (B) Zellen wurden transient(HepG2, HIT) oder stabil (RINm5F, GT1-7, H4) mit dem Leptinrezeptor transfiziert. Die Bande des phos-phorylierten Tyr705-STAT3 ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.

viralen Systems stabil transfiziert (siehe Methodenteil, Abschnitt 2.5.2). Dabei wird diecDNA in das Genom der Wirtszelle integriert und das Protein folglich konstitutiv expri-miert. Die Verwendung einer stabil transfizierten Linie wurde gewahlt, weil die Hand-habung solcher Linien im Vergleich zu transient transfizierten Zellen einfacher ist, undTransfektions-bedingte Variabilitat im ersten Fall wegfallt. In allen transfizierten Zellli-nien fuhrte die Stimulation mit Leptin zu einer deutlichen Tyr705-Phosphorylierungvon STAT3 (siehe Abb. 3.1, B). Besonders starke Effekte waren bei H4, GT1-7 undRINm5F-Zellen zu beobachten.

Zunachst sollten Leptin-regulierte Gene in der stabil transfizierten Hepatoma-Linie H4untersucht werden; die Zellen wurden mit Leptin stimuliert und die Gesamt-cDNAals Sonde zur Hybridisierung eines UniGene cDNA-Koloniefilters mit 26 000 verschie-denen cDNAs eingesetzt. In diesem Versuch wurden 50 mutmaßlich Leptin-reguliertecDNAs gefunden, konnten jedoch in den folgenden Northern-Blot Experimenten nichtbestatigt werden. Die ebenfalls stabil mit dem Leptinrezeptor transfizierte hypotha-

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3 Ergebnisse

Abb. 3.2: Induktion von SOCS-3-mRNA nach Leptinstimulation in verschiedenen Zelllinien. Ver-schiedene Zelllinien wurden stabil (H4, RIN) bzw. transient (HIT) mit dem Leptinrezeptor transfiziertund 15 min mit Leptin [100 ng/ml] stimuliert. Gesamt-RNA wurde isoliert und im Northern-Blot miteiner SOCS-3-cDNA-Sonde hybridisiert.

lamische Linie GT1-7 zeigte zwar eine deutliche STAT3-Phosphorylierung nach Sti-mulation mit Leptin; fur Experimente zur Expression Leptin-regulierter Gene wurdesie jedoch nicht verwendet. Schließlich wurden alle folgenden Versuche mit der sta-bil transfizierten Insulinoma-Zelllinie RINm5F durchgefuhrt. Diese wird im folgendenRINm5F-LepRb abgekurzt werden.

Als Kontrollgen fur die Hochregulation Leptin-regulierter Gene wurde SOCS-3 ver-wendet. SOCS-3 ist ein negative feedback inhibitor, dessen Expression uber STAT3 hoch-reguliert wird [Bjørbæk et al., 1998]. Zur Charakterisierung der Leptin-regulierten Gen-expression wurde in den transfizierten Linien H4, HIT und RINm5F die Menge derSOCS-3-mRNA durch Northern-Blot untersucht (siehe Abb. 3.2). Dabei wurde deutlich,dass der Anstieg der SOCS-3-mRNA in den stabil transfizierten RINm5F-Zellen amgroßten war.

3.1.2 Aktivierung des JAK-STAT Weges in RINm5F-LepRb-Zellen

Zur Bestimmung der Konzentration, die zur Stimulation von RINm5F-LepRb-Zellenam besten ist, wurde fur die STAT3-Aktivierung eine Dosis-Wirkungsbeziehung ermit-telt. Dazu wurden die stabil transfizierten RINm5F-Zellen fur je 15 Minuten mit aufstei-genden Leptin-Konzentrationen behandelt (0 bis 15 ng/ml), Kernextrakte isoliert undim Western-Blot mit einem Tyr705-STAT3-phosphospezifischen Antikorper untersucht.Dabei wurde deutlich, dass bereits Leptinkonzentrationen zwischen 0.5 und 1.5 ng/mleine STAT3-Phosphorylierung hervorrufen (siehe Abb. 3.3, A). Als Grundlage fur ver-

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3 Ergebnisse

Abb. 3.3: Dosis-Wirkungsbeziehung mit Leptin und Wachstumshormon. RINm5F-LepRb-Zellenwurden 15 min mit Leptin bzw. Wachstumshormon in den angegebenen Konzentrationen stimuliert.Kernextrakte wurden im Western-Blot mit phosphospezifischen Antikorpern untersucht.

Abb. 3.4: Induktion von SOCS-3 mRNA nach Leptinstimulation in RINm5F-LepRb-Zellen. RINm5F-Zellen wurden stabil mit dem LepRb transfiziert, fur die oben angegebene Dauer mit Leptin stimuliert[100 ng/ml] und Gesamt-RNA isoliert. Der Nachweis der SOCS-3 mRNA erfolgte im Northern-Blot.

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3 Ergebnisse

gleichende Untersuchungen von Cytokinen wurde auch die Aktivierung von STAT5durch Wachstumshormon untersucht. Deshalb wurde auch fur Wachstumshormon ei-ne Dosis-Wirkungsbeziehung erstellt (siehe Abb. 3.3, B). Die Phosphorylierung vonSTAT5 (an Tyr694) beginnt hier bei einer Konzentration von 62.5 ng/ml und erreichtbei 125 ng/ml ihr Maximum.

Als Kontrollgen fur die Hochregulation Leptin-regulierter Gene wurde SOCS-3 ver-wendet. In RINm5F-LepRb-Zellen fuhrt die Behandlung mit Leptin nach 1 h zu einerstarken Zunahme der SOCS-3 mRNA (Abb. 3.4). Nach 6 h kommt es zu einer deutli-chen Abnahme, jedoch bleibt bis 24 h nach Beginn der Stimulation mit Leptin ein hohesSOCS-3 mRNA Niveau erhalten.

3.1.3 Differentielle Aktivierung von STAT-Faktoren in

RINm5F-LepRb-Zellen nach Stimulation mit Leptin, IL-6 und

Wachstumshormon

Fur das Verstandnis der differentiellen Genregulation ist es bedeutsam zu wissen, in-wiefern die hier untersuchten Cytokine STAT-Faktoren differentiell aktivieren. Daherwurde untersucht, welche STAT-Faktoren durch Leptin, IL-6 und Wachstumshormonaktiviert werden. Auch die Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1 und ERK2 wurdeuntersucht. Dazu wurden RINm5F-LepRb Zellen mit den angegeben Substanzen sti-muliert und Kernextrakte isoliert. Mit phosphospezifischen Antikorpern wurde diePhosphorylierung der ERK-Kinasen und STAT-Faktoren im Western-Blot sichtbar ge-macht (Abb. 3.5). Außerdem wurde in den Kernextrakten die Affinitat aktivierter STAT-Faktoren zu Promotorelementen untersucht (EMSA-Experiment, siehe Abb. 3.6).

Die Konzentrationen von IL-6 und Leptin wurden so gewahlt, dass die Tyrosinphos-phorylierung von STAT3 bei beiden Cytokinen gleich stark war. Eine zu hohe Si-gnalstarke des Leptins im Vergleich zu IL-6 auf Grund der Uberexpression des Lep-tinrezeptors sollte somit ausgeschlossen werden. In RINm5F-LepRb-Zellen stimulierteLeptin sehr stark die Tyrosinphosphorylierung von STAT1, STAT3, STAT5 und STAT6.An STAT3 wurde auch die Phosphorylierung von Ser727 durch Leptin induziert. DieMAP-Kinasen ERK1 und ERK2 wurden ebenfalls durch Leptin stimuliert (Abb. 3.5).

IL-6 alleine aktivierte hingegen vorwiegend STAT3. STAT1 wurde nur in sehr geringemAusmaß aktiviert. Noch geringer ist die Aktivierung von ERK1 und ERK2 durch IL-6.Gleichzeitige Stimulation durch IL-6 und den loslichen IL-6-Rezeptor verstarkte das

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3 Ergebnisse

Abb. 3.5: Aktivierung von STAT-Faktoren nach Leptinstimulation in RINm5F-LepRb-Zellen.RINm5F-LepRb-Zellen wurden 15 min mit IL-6 [200 U/ml], IL-6 + loslichem IL-6-Rezeptor (sIL-6R)[1 µg/ml], Leptin [50 bzw. 100 ng/ml] bzw. Wachstumshormon (GH) [250 ng/ml] stimuliert. Kernex-trakte wurden im Western-Blot mit phosphospezifischen Antikorpern analysiert (5 A/B: PY694-STAT5A/B; 6: PY641-STAT6).

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3 Ergebnisse

IL-6-Signal: Die Phosphorylierung von STAT1 und STAT3 nahm zu. Die Behandlungmit Wachstumshormon fuhrte zu einer Phosphorylierung von STAT5.

Im EMSA-Experiment (Abb. 3.6) wurde die DNA-Bindungsaffinitat aktivierter STAT-Faktoren untersucht. Dabei wurde einerseits ein Sequenz-Element aus dem β-CaseinPromotor als ”Sonde“ fur STAT5 und andererseits ein Teil aus dem c-fos-Promotorals ”Sonde“ fur STAT1 und STAT3 benutzt (siehe auch Methodenteil, Abschnitt2.8). IL-6 verursachte eine deutliche Aktivierung der STAT3-Promotorbindung, diedurch den loslichen IL-6 Rezeptor noch verstarkt wird. Die Bildung des STAT5-Promotorkomplexes wurde durch IL-6 außerst schwach gefordert. Leptin verursachtedagegen –bei 50 und 100 ng/ml– eine deutliche Retardierung bei der β-Casein Son-de, was auf eine STAT5-Aktivierung schließen lasst. Die Aktivierung von STAT1 undSTAT3 ist bei IL-6 und Leptin offensichtlich ahnlich ausgepragt.

Abb. 3.6: Aktivierung von STAT-Faktoren nach Leptinstimulation in RINm5F-LepRb-Zellen.RINm5F-LepRb-Zellen wurden 15 min mit Leptin [100 ng/ml], IL-6 [200 U/ml] bzw. IL-6 + loslichem IL-6-Rezeptor [1 µg/ml] stimuliert. Kernextrakte wurden in einem Gelshift-Experiment (EMSA) mit m67SIEund β-Casein als Sonden analysiert. Mit den Pfeilen sind die STAT-Homo- bzw. Heterodimere gekenn-zeichnet.

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3 Ergebnisse

Abb. 3.7: Aktivierung von NF- κB durch IL-1 β in RINm5F-LepRb-Zellen. RINm5F-LepRb-Zellen wur-den fur 20 min mit IL-1β in den angegebenen Konzentrationen [u/ml] behandelt. Kernextrakte wurdenisoliert und in einem EMSA-Experiment auf NF-κB-Aktivierung untersucht.

3.1.4 RINm5F-LepRb-Zellen besitzen alle notwendigen

Komponenten fur die Signaltransduktion von IL-1 β

Bei den RINm5F-LepRb-Zellen wurde auch die IL-1β Signaltransduktion untersucht,um die spater gefundenen STAT-Faktor-spezifischen Genexpressionseffekte von ande-ren Effekten (wie dem NF-κB) abzugrenzen (siehe dazu auch Abb. 3.12). Zur Unter-suchung der NF-κB-Aktivierung wurden RINm5F-LepRb-Zellen mit IL-1β stimuliert,Kernextrakte isoliert und in einem EMSA Experiment untersucht (Abb. 3.7). In demgezeigten Versuch fuhrte IL-1β schon bei einer Konzentration von 50 u/ml zu einerstarken Aktivierung von NF-κB.

3.2 Identifizierung von Leptin-regulierten Genen in

RINm5F-LepRb-Zellen

3.2.1 Differentielle Hybridisierung von cDNA Filter- Arrays

Zum Auffinden Leptin-regulierter Gene wurde ein cDNA Filter-Array mit einer kom-plexen cDNA Sonde aus Leptin-stimulierten bzw. unstimulierten RINm5F-LepRb-Zellen hybridisiert. Dazu wurden RINm5F-LepRb-Zellen fur 1h und 16h mit Leptinbzw. fur 16h mit Leptin-Losungspuffer behandelt (die Kontrolle wurde nicht stimu-liert) und anschließend Gesamt-RNA isoliert. Aus der Gesamt-RNA wurde poly-A+-mRNA aufgereinigt und in Gegenwart von [α33P]-dCTP revers transkribiert, so dass

53

3 Ergebnisse

eine komplexe Mischung von radioaktiv markierten cDNAs (eine ”komplexe cDNASonde“) entstand.

Bei dem Filter-Array handelte es sich um eine Nylonmembran mit den Abmessungen222 mm x 222 mm, auf die 27 648 verschiedene, durch PCR amplifizierte Inserts aus denKlonen einer UniGene-cDNA-Bibliothek der Ratte aufgetragen wurden. Jedes Insert istinnerhalb eines Blocks entsprechend eines festgelegten Musters doppelt aufgetragen,um Fehler bei der Auswertung zu vermeiden (siehe Methodenteil, Abb. 2.2). Zur au-tomatisierten Auftragung der cDNAs wurde die Flache des Filter-Arrays in 6 Felderaufgeteilt. In unserem Falle fuhrte diese Aufteilung offensichtlich zu Hybridisierungs-artefakten: Beim Vergleich der 16 h Leptin- und 16h Ø-Hybridisierungen fanden sich inFeld 1 vor allem hochregulierte Gene und in Feld 6 vor allem herunterregulierte Gene(siehe Abb. 3.8). Diese cDNAs wurden mit Hilfe der Software erkannt und gingen nichtin die Auswertung ein.

Abb. 3.8: Aufteilung des Filter- Arrays in 6 Feldern, und die Hybridisierungsartefakte, die m ogli-cherweise darauf zuruckzufuhren sind. Beim Vergleich der 16h Leptin- und 16h Ø-Hybridisierungenfanden sich in Feld 1 vor allem hochregulierte Gene (hier hellgrau dargestellt) und in Feld 6 vor allemherunterregulierte Gene (hier dunkelgrau dargestellt).

Insgesamt wurden Hybridisierungen mit 3 komplexen cDNA-Sonden durchgefuhrt:1 h Leptinstimulation, 16 h Leptinstimulation und 16 h Behandlung mit Leptin-Losungspuffer als Negativkontrolle. Das Verfahren der Bildauswertung ist im Metho-denteil beschrieben (siehe Abschnitt 2.9.7). Die Ergebnisse dieser Filter-Array Hybridi-sierungen wurden in 4 Gruppen aufgeteilt (hoch- bzw. runterregulierte cDNAs nach1 h bzw. 16 h) und sind in Tabelle 3.1 zusammengestellt. Um falsch-positive Ergebnisseweitgehend auszuschließen, wurden nur solche cDNAs aufgelistet, deren Regulations-faktor (ratio)≥ 2.5 betrug. Daruber hinaus sollten beim Vergleich zweier Hybridisierun-gen die absoluten Signalstarken mindestens 1.0 betragen. Abb. 3.9 zeigt am Beispiel der

54

3 Ergebnisse

Phosphatidat Phosphohydrolase 2a, die nach 16 h Leptinstimulation ein 8.9-fach starkeresSignal ergab, wie sich die Signale visuell auf dem Filter-Array unterscheiden.

Nach der 16-stundigen Leptinstimulation wurden 35 und nach der 1-stundigen Lep-tinstimulation 21 verschiedene, hochregulierte Transkripte gefunden. Bei den herun-terregulierten Genen war die Anzahl der gefundenen Transkripte sehr umfangreich;deshalb wurden in Tab. 3.1 beispielhaft 10 (Gruppe III) bzw. 1 (Gruppe IV) ausgewahltund dargestellt.

Abb. 3.9: Identifizierung der Phosphatidat-Phosphohydrolase 2a als Leptin-reguliertes Transkript.Die kleinen Kreise zeigen jeweils die Signale der Phosphatidat Phosphohydrolase 2a (Ppap2a) auf demAutoradiogramm (siehe Methodenteil, Abschnitte 2.9.6 und 2.9.7).

55

3 Ergebnisse

Tab. 3.1: Differentiell regulierte Gene nach Stimulation mit Leptin. Die Auswertung erfolgte wie imMethodenteil beschrieben (siehe Abschnitt 2.9.7). Die ratio wird bei herunterregulierten Genenals negativer Kehrwert dargestellt. Mit Unterstreichungen sind die Gene hervorgehoben, derenRegulation spater im Northern-Blot (siehe Abb. 3.11) uberpruft wurde.

GenBank a Name UniGene b Signal Signal ratio db c

Ø Leptin

Gruppe I Hochreguliert nach 16 h

AI555126 Ppap2a 1 Rn.1944 0.3 2.4 8.9 B1

AI501010 Ribosomal protein L4 Rn.1133 1.4 9.4 6.9 D2

AI549418 Coated vesicle membrane protein Rn.1022 1.5 9.2 6.3 C10

AI502324 RGS-4 2 Rn.11065 3.2 16.9 5.2 B2

AI454367 ADP ribosylation factor 4 Rn.35935 0.5 2.7 5.0 C8

AA859174 RT1 class Ib gene (Aw2) Rn.39743 2.0 8.8 4.5 D6

AA818532 Tachykinin 1 Rn.1920 44.6 188.2 4.2 A5

AI070457 Eef1a1 3 Rn.965 2.9 11.9 4.2 C12

AI059690 fibrinogen, beta polypeptide (Fgb) 4 Rn.11416 3.0 11.4 3.8 C1

AI556900 mouse RIKEN cDNA C130022K22 (94%) Mm.234879 2.9 10.9 3.7

AA964070 mouse clone RP23-61O2 (83%) 1.2 4.4 3.7 A7

AI709970 heat shock protein 60 (liver) Rn.44658 2.0 7.1 3.6 B11

AA859196 tropomyosin isoform 6 Rn.24727 4.1 14.0 3.4 D10

AA875008 plasminogen activator, tissue Rn.1002 2.3 7.7 3.3 B10

AA964758 GSK3-β Rn.10426 0.5 1.5 3.3 D8

AI059441 Rn.103576 5 Rn.103576 0.6 1.9 3.2 A9

AI137617 Lipocalin 2 Rn.11303 2.7 8.7 3.2 B4

AA965154 Ywhae (=14-3-3-ε) 6 Rn.4225 7.2 21.1 2.9 C7

aGenBank-Nummer des jeweiligen KlonsbUniGene-URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unigene

Gab es zum Zeitpunkt der Niederschrift noch keinen genauen UniGene-Eintrag in der Ratten-Datenbank, wurde die UniGene-Nummer des nachst-ahnlichen Maus-Klons angegeben.

cKoordinaten der entsprechenden Signale im dot blot1Phosphatidate phosphohydrolase type 2a2Von RGS-4 (regulator of G-protein signaling 4) wurden nach 16 h Leptinstimulation insgesamt vier

hochregulierte Klone gefunden (ratios 5.2, 2.9, 2.8 und 2.4) und nach 1 h Leptinstimulation zwei (ratios4.7 und 4.5).

3eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 14Von Fibrinogen wurden nach 16 h Leptinstimulation insgesamt zwei hochregulierte Klone gefunden

(ratios 3.8 und 2.8) und nach 1 h einer (ratio 6.1)5Rattus norvegicus similar to Adenylosuccinat Synthetase, non-muscle Isozyme6tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide

56

3 Ergebnisse

GenBank Name UniGene Signal Signal ratio db

Ø Leptin

AI045008 mouse RIKEN cDNA 1300013G12 (91%) Mm.22397 2.4 7.0 2.9

AI060102 mouse clone RP24-505E24 (95%) 0.7 2.1 2.9 B7

AA957818 ferritin, heavy polypeptide 1 Rn.54447 6.9 19.7 2.9 A4

AA998280 pancreatitis-associated protein (PAP1) Rn.9727 1.9 5.5 2.9 D3

AA859496 GTP cyclohydrolase 1 Rn.28195 0.6 1.8 2.8 B9

AI029806 superoxide dismutase 2 Rn.10488 17.1 48.3 2.8 A6

AI113089 mouse Destrin (Dstn) (90%) Mm.28919 5.5 15.6 2.8 D4

AA875006 bisher kein Gen-Name Rn.32200 2.1 5.7 2.7 A8

AA858597 Rn.65492 7 Rn.65492 1.2 3.2 2.7 C9

AA859695 Rn.92151 8 Rn.92151 4.9 12.9 2.6 D7

AI029638 serine/threonine kinase 2 Rn.33275 0.7 1.7 2.6 C6

AI454448 Grp58 9 Rn.74076 1.7 4.4 2.6 A11

AI043642 bisher kein Gen-Name Rn.81044 1.2 3.0 2.6

AA963208 RAMP4 10 Rn.2119 2.7 6.8 2.6 C4

AA858626 mouse RIKEN cDNA 2210401K01 (89%) Mm.220932 8.1 20.9 2.6 C2

AA899086 unbekannt 1.5 3.5 2.3 B8

AI044067 neuropeptide Y Rn.9714 5.9 13.1 2.2 D9

Gruppe II Hochreguliert nach 1 h

AI059690 fibrinogen, beta polypeptide Rn.11416 3.0 18.5 6.1 C1

AA819369 mouse Sfrs2 (95%) 11 Mm.21841 1.0 5.2 5.5

AI137590 RGS-4 Rn.11065 5.0 23.2 4.7 B2


AA859491 Growth response protein (CL-6) 12 Rn.772 3.0 13.6 4.5 B12

AI059511 mouse Pcsk9 (87%) 13 Mm.133268 0.5 2.2 4.3

AA817982 mouse RIKEN cDNA G431004K08 (89%) Mm.45024 0.2 1.0 4.3

AA859424 bisher kein Gen-Name Rn.18012 0.6 2.5 4.1

AA924473 mouse Sc4mol (88%) 14 Mm.30119 5.8 22.2 3.8 C3

7ahnlich zu H. sapiens ”Actin-related protein 2/3 complex subunit 3“8Rattus norvegicus retroviral-like ovarian specific transcript 30-1 mRNA9glucose regulated protein, 58 kDa (=ERp60)

10ribosome associated membrane protein 411splicing factor, arginine/serine-rich 2 (SC-35)12Von CL-6 wurden nach 1 h Leptinstimulation insgesamt drei hochregulierte Klone gefunden (ratios

4.5, 3.0 und 1.9)13proprotein convertase subtilisin/kexin type 914sterol-C4-methyl oxidase-like

57

3 Ergebnisse

GenBank Name UniGene Signal Signal ratio db

Ø Leptin


AI548346 unbekannt 1.4 4.3 3.1

AA866429 mouse RIKEN cDNA 5330431N24 (87%) Mm.110818 0.8 2.5 3.0

AI072680 unbekannt 1.2 3.4 2.9

AA859385 Vimentin Rn.2710 1.1 3.1 2.9

AI549140 mouse SOCS-3 (94%) Mm.3468 1.4 4.1 2.9

AA819498 mouse Acat2 (83%) 15 Mm.196520 1.1 3.1 2.9

AA924952 mouse T2bp (87%) 16 Mm.30532 12.3 34.7 2.8

AA859040 mouse GADD45-gamma (94%) Mm.9653 8.4 23.0 2.7 B6

AA924152 mouse Gmppa (94%) 17 Mm.23951 1.2 3.3 2.7

AA858994 Parathymosin Rn.3609 5.3 14.1 2.7

AI045397 Purkinje cell protein 4 (Pcp4) Rn.9736 6.7 17.5 2.6 D1

Gruppe III Runterreguliert nach 16 h

AI045402 unbekannt 2.9 0.5 -5.0

AI548836 unbekannt 4.0 0.6 -5.0

AI500847 unbekannt 33.3 5.3 -5.0

AI454909 bisher kein Gen-Name Rn.35511 25.4 4.1 -5.0

AI511294 mouse Zak (93%) 18 Mm.33127 9.6 1.7 -5.0

AI555398 unbekannt 11.8 2.0 -5.0

AI145562 Rn.28537 19 4.1 0.7 -5.0

AI145124 unbekannt 15.2 2.7 -5.0

AI454567 Viaat 20 Rn.10846 13.2 2.4 -5.0 C11

AA817955 mouse cDNA clone MGC:60742 (90%) 23.3 4.2 -5.0

...

Gruppe IV Runterreguliert nach 1 h

AA957272 CD63 antigen Rn.11068 27.0 3.2 -10.0 C5

...

15acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 216Traf2 binding protein17GDP-mannose pyrophosphorylase A18sterile-alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK19Rattus norvegicus hypothetical LOC289530 mRNA20vesicular inhibitory amino acid transporter

58

3 Ergebnisse

3.2.2 Etablierung des Dot-Blot Verfahrens zur Uberprufung

Leptin-regulierter Gene

Zur Bestatigung der im Array-Screening gefundenen Daten wurden Dot-Blots erstellt(siehe auch 2.9.2) und mit 32P-markierten komplexen cDNA Sonden aus Leptin-stimulierten bzw. unstimulierten RINm5F-LepRb Zellen hybridisiert. Zur Herstellungder Dot-Blots wurden insgesamt 40 cDNA Klone beim RZPD bestellt und auf die Dot-Blot-Membran aufgetragen. Davon stammten 32 aus Gruppe I, 6 aus Gruppe II undjeweils 1 aus Gruppe III und IV (siehe Tab. 3.1). Zusatzlich wurden 19 weitere cDNAsaufgetragen, die zwar nicht im ersten Screening gefunden wurden, aber hier als be-kannte Cytokin-regulierte Gene untersucht wurden, wie z.B. Akutphase-Gene (Hemo-pexin, Thiostatin, α2-Macroglobulin) als bekannte STAT3-induzierte Gene, oder aberGene, die von anderen Arbeitsgruppen als IL-6-induzierte Gene gefunden wurden. Indiese letzte Gruppe gehoren der Prolactin-Rezeptor, der TNF-α-Rezeptor II, der IL-1-Rezeptor, c-fos, STAT3, Cyclin D1 und Cyclin D3 [Li et al., 2001]. SOCS-1 wurde als Genmit Bedeutung fur den JAK-STAT-Signalweg aufgetragen.

Tab. 3.2: Dot-Blot cDNAs, die nicht im ersten Screening gefunden wurden.

Acc. No. Name Position im Dot-Blot

/ β-Actin A1, D5, F12

/ GAPDH F1, A12

/ SOCS-3 21 A2

AA756393 SOCS-1 A3

/ RGS-2 B3

AW762925 Cyclin D1 D11

BC004076 Cyclin D3 D12

BF235448 IL-1 Rezeptor E1

BC006652 Prolactin-Rezeptor E2

AI956452 TNF-α-Rezeptor E3

/ c-fos E4

/ STAT3 E5

BE628011 C/EBP-δ E6

BE632748 SREBP1c E7

AI430725 Hemopexin E8

21SOCS-3 wurde auch im ersten Screening gefunden; fur den Dot-Blot wurde jedoch nicht der ursprung-liche Klon benutzt, sondern eine cDNA, die in unserer Arbeitsgruppe bereits zur Verfugung stand.

59

3 Ergebnisse

Acc. No. Name Position im Dot-Blot

AA817734 Thiostatin E9

AI029119 Insulin-II E10

/ α2-Macroglobulin E11

/ Kanamycin-Resistenz F8, F9

Tab. 3.3: Ergebnisse der Dot-Blot Hybridisierung ( ratio nach 16h Leptin). Siehe auch Abb. 3.10

Acc. No. Name ratio Position im Dot-Blot

AA998280 pancreatitis-associated protein (PAP1) 1617.6 D3

AI059690 Fibrinogen, beta polypeptide 12.9 C1

AI137617 Lipocalin 2 10.3 B4

AA875008 plasminogen activator, tissue 5.2 B10

AI502324 RGS-4 5.2 B2

AI029806 superoxide dismutase 2 4.0 A6

AA957272 CD63 antigen 3.3 C5

AA818532 Tachykinin 1 3.2 A5

AA858597 Rn.65492 22 2.9 C9

Die Genexpression des Insulins soll durch Leptin gehemmt werden[Seufert et al., 1999b], und daher wurde auch diese cDNA auf den Dot-Blot aufge-tragen. Der Transkriptionsfaktor C/EBP-δ wird durch IL-6 und somit durch STAT3reguliert [Ramji et al., 1993]. SREBP1c spielt als Transkriptionsfaktor eine bedeutendeRolle in der Regulation der Adipogenese und soll durch Leptin negativ reguliertwerden [Kakuma et al., 2000].

Konstitutiv exprimierte cDNAs dienten als Negativkontrolle (β-Actin, GAPDH)(Tab. 3.2). β-Actin wurde an 3 Positionen (A1, D5 und F12) aufgetragen und GAPDHan 2 (F1 und A12). Als weitere Kontrolle wurde die cDNA des bakteriellen Kanamycin-resistenzgens auf F8 und F9 aufgetragen. Als Hintergrund-Kontrolle wurde an 8 StellenPuffer ohne cDNA aufgetragen (F2, F3, F4, F5, F6, F7, F10 und F11). Insgesamt waren72 Positionen belegt, und 60 verschiedene cDNAs wurden aufgetragen.

Die Hybridisierung der Dot-Blots mit der komplexen cDNA-Sonde aus Leptin-stimulierten bzw. unstimulierten RINm5F-LepRb-Zellen (jeweils 16 h; siehe Abb. 3.10)

22ahnlich zu H. sapiens ”Actin-related protein 2/3 complex subunit 3“

60

3 Ergebnisse

Abb. 3.10: Hybridisierung von Dot-Blots mit cDNA aus Leptin-stimulierten (Le) bzw.-unstimulierten (Ø) Zellen. Als Beispiele sind die cDNA-dots von PAP1, Fibrinogen (Fgb) und GAPDHmarkiert. Zur Belegung der einzelnen Positionen siehe Tab. 3.1 und Tab. 3.2. Eine Liste der cDNAs, dienachweisbare Signalunterschiede aufwiesen, ist in Tab. 3.3 aufgelistet.

61

3 Ergebnisse

machte von 60 verschiedenen cDNAs 43 dots als Signal erkennbar. Bei den nicht-regulierten cDNAs war Insulin-II (E10) am starksten exprimiert. Nach der elektroni-schen Quantifizierung der dots und Abzug des Hintergrundwertes blieben jedoch nur9 Signale ubrig, die quantitativ auswertbar waren. Diese wurden in der Tabelle 3.3 auf-gelistet. Dabei handelt es sich ausschließlich um cDNAs, die nach 16 Stunden Stimula-tion mit Leptin hochreguliert wurden. Von diesen 9 cDNAs wurden bereits 8 im erstenScreening der Filter-Arrays als Leptin-regulierte Gene identifiziert: Das ”CD63 antigen“wurde zunachst als ein durch Leptin reprimiertes Gen identifiziert und in Gruppe IVeingetragen (siehe Tab. 3.1).

Im Gegensatz zu den den spater durchgefuhrten Northern-Blot-Experimenten gelangder Nachweis einiger cDNAs im Dot-Blot-Experiment nicht; im Vergleich zur Methodedes Northern-Blotting ist das hier beschriebene Verfahren der Dot-Blot Analyse also we-niger sensitiv. Daher wurde die Untersuchung der Leptin-regulierten Gene mit Hilfevon Northern-Blots fortgefuhrt.

3.2.3 Leptin induziert die Expression von immediate early genes ,

delayed early genes und late genes

Ein Teil der cDNAs, die durch die differentielle Hybridisierung der Filter-Arrays ge-funden wurden, wurde auch als Sonde in Northern-Blot-Versuchen zur Analyse derCytokin-gesteuerten Genexpression eingesetzt. Hierbei sollten die beim Screening derFilter-Arrays und der Dot-Blots gefundenen Leptin-induzierten Gene in ihrem Regula-tionsmuster bestatigt werden und zusatzlich von STAT5-spezifischen Effekten (Wachs-tumshormon) und IL-1β-Effekten abgegrenzt werden.

Bei diesen Versuchen wurden RINm5F-LepRb-Zellen fur 1, 3, 7 und 16 h mit Pufferals Negativkontrolle, Leptin bzw. Wachstumshormon stimuliert. Gesamt-RNA wurdeisoliert, in einem Northern-Blot-Experiment verwendet und die Membranen mit denentsprechenden radioaktiv markierten Sonden-cDNAs hybridisiert (siehe Abb. 3.11und 3.12). Dabei wurden zusatzlich auch folgende cDNAs eingesetzt, die nicht im Scree-ning der Filter-Arrays gefunden wurden: CISH (cytokine inducible SH2-containing pro-tein), Insulin-II, β-Actin und iNOS (inducible nitric oxide synthase). Dabei zeigte sich,dass von den hier untersuchten cDNAs nur eine durch Wachstumshormon indu-ziert wird: CISH. CIS, das Genprodukt des Gens CISH, ist ein negativer Feedback-Regulator des JAK/STAT-Signalweges. Er wird bekanntermaßen uber STAT5 hochre-

62

3 Ergebnisse

SOCS-3 CISH

PAP1

Fibri-nogen β RGS-4

SOD-2

Ppap2atPA

Lipo-calin 2

1 16731 16731 1673

GH LeptinØ GH LeptinØ

[h]

A

B

C

1 16731 16731 1673

Tachy-kinin

63

3 Ergebnisse

Insulin-II

1 16731 16731 1673

GH LeptinØ

Pcp4

iNOS-Actin

1 16731 16731 1673

GH LeptinØ

[h]

Abb. 3.11: Zeitverlauf der Genexpression nach Stimulation mit Wachstumshormon [250 ng/ml]und Leptin [100 ng/ml]. (Erster Teil der Abbildung siehe vorherige Seite). RINm5F-LepRb Zellenwurden fur 1, 3, 7 und 16 h mit Leptinlosungspuffer (Ø), Wachstumshormon (GH) bzw. Leptin stimuliert.Gesamt-RNA wurde isoliert und im Northern-Blot mit den angegebenen cDNAs hybridisiert. Je nachZeitverlauf der Expression wurden die Gene in immediate early genes (A), delayed early genes (B) und lategenes (C) aufgeteilt. Zu den Abkurzungen (Gen-Namen) siehe Tab. 3.1.

guliert [Karlsson et al., 1999]. In unserem Falle fuhrte auch die Stimulation mit Leptinzu einer Induktion von CISH.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Expressionsmuster der Leptin-regulierten Gene unter-schiedlichen Zeitverlaufen unterliegen. Bei SOCS-3, CISH, Fibrinogen-β und RGS-4 er-reicht die mRNA-Menge bereits 1 h nach Leptinstimulation ein Maximum. Diese Genewerden daher in Anlehnung an Waelput et al. (2000) im Folgenden als ”immediate earlygenes“ bezeichnet. In die Gruppe der ”delayed early genes“ wird dagegen PAP1 (pan-creatitis associated protein) eingeordnet, weil dessen mRNA erst nach 7 h das Maximumerreicht. Die cDNAs tPA, Ppap2a, SOD-2, Lipocalin 2 und Tachykinin erreichen erstnach 16 h ihr Maximum. Sie werden daher in die Gruppe der ”late genes“ eingeordnet.

iNOS spielt eine Rolle bei entzundlichen Vorgangen im Pankreas [Kwon et al., 1995],und Pcp4 wurde im ersten Screening der Filter-Arrays als cDNA gefunden, die nach 1 hLeptin-Stimulation hochreguliert wird. In dem hier gezeigten Northern-Blot-Experiment(siehe Abb. 3.11) konnte jedoch weder bei Pcp4 noch bei iNOS eine Regulation durchLeptin oder Wachstumshormon nachgewiesen werden. Die Genexpression des Insulinssoll durch Leptin gehemmt werden [Seufert et al., 1999b], und daher wurde auch diesecDNA im Northern-Blot untersucht. Auch beim Insulin ist keine Regulation durch Lep-

64

3 Ergebnisse

Abb. 3.12: Zeitverlauf der Genexpression nach Stimulation mit IL-1 β. RINm5F-LepRb Zellen wurdenfur 1, 3, 7 und 16 h mit Losungspuffer (Ø) bzw. IL-1β [50 u/ml] stimuliert. Gesamt-RNA wurde isoliertund im Northern-Blot mit den angegebenen cDNAs hybridisiert. Zu den Abkurzungen (Gen-Namen) sie-he Tab. 3.1. Die Sonde fur PAP1 war intakt, denn sie hat auf dem gleichen Blot bei den Leptin-stimuliertenZellen zu einem sichtbaren Signal gefuhrt (nicht gezeigt).

tin oder Wachstumshormon nachweisbar. Die Hybridisierung mit β-Actin wurde alsKontrolle fur die gleichmaßige Beladung der Spuren gezeigt.

Zur Abgrenzung von anderen Cytokin-Effekten wurde bei einigen cDNAs (RGS-4,Lipocalin 2, PAP1, CISH und Ppap2a) auch der Einfluss von IL-1β auf die Genexpres-sion untersucht (siehe Abb. 3.12). Dabei zeigte sich, dass die Expression von Lipoca-lin 2, RGS-4 und Ppap2a (nicht jedoch PAP1) einer deutlichen Regulation durch IL-1β

unterliegt.

65

3 Ergebnisse

3.2.4 Die Genexpression von RGS-4 und PAP1 in Abh angigkeit von

den LepRb-Tyrosinresten 985, 1077 und 1138

Es ist bekannt, dass die einzelnen intrazellularen Tyrosin-Reste eine unterschiedli-che Spezifitat fur STAT-Faktoren vermitteln und somit auch die Expression von Ge-nen unterschiedlich beeinflussen konnen [Eyckerman et al., 1999]. Um die Bedeutungder intrazellularen Tyrosinreste im LepRb fur die Leptin-gesteuerte Expression vonRGS-4 und PAP1 aufzuklaren, wurden RINm5F-Zellen mit Tyrosinmutanten-cDNAsdes LepRb, die jeweils nur noch ein einziges der intrazellularen Tyrosine enthalten (sie-he Methodenteil, 2.3.3), stabil transfiziert:

YYY Alle Aminosauren unverandert.

FFY Mutation der Tyrosinreste Y985 und Y1077 zu Phenylalanin.


FYF Mutation der Tyrosinreste Y985 und Y1138 zu Phenylalanin.


YFF Mutation der Tyrosinreste Y1077 und Y1138 zu Phenylalanin.


FFF Mutation der Tyrosinreste Y985, Y1077 und Y1138 zu Phenylalanin.

Die stabil transfizierten Zellen wurden fur 16 h mit Leptin stimuliert, Gesamt-RNAwurde isoliert und in einem Northern-Blot-Experiment mit cDNA-Sonden fur RGS-4und PAP1 hybridisiert (siehe Abb. 3.13). Eine 16 h-Leptinstimulation von Zellen, diemit der Wildtyp-LepRb cDNA transfiziert wurden, fuhrte –wie bereits vorher gezeigt(Abb. 3.11)– zu einer Hochregulation von RGS-4 und PAP1. Enthielt der LepRb nurnoch Tyr1138, war die Induktion von PAP1 und RGS-4 sogar deutlich starker als beimWildtyp. Der Tyrosinrest 1077 fuhrte im Vergleich zu Tyr1138 bei RGS-4 und PAP1 nurzu einer geringer ausgepragten mRNA-Induktion, die etwa so stark war wie die Induk-tion bei der Dreifachmutante.

War nur noch Tyr985 vorhanden, wurde die RGS-4-mRNA etwas schwacher induziertals bei der Dreifachmutante. Bei PAP1 fiel die Induktion vollstandig aus, wenn nurTyr985 vorhanden war. Beide cDNAs wurden auch dann noch schwach induziert, wennder Leptinrezeptor gar keine intrazellularen Tyrosinreste mehr enthielt (Dreifachmu-tante).

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3 Ergebnisse

RGS-4

PAP1

L L

YYY

FFY

FYF

YFF

FFF

Ø Ø Ø ØØ LL L

- Y 985- Y 1077

- Y 1138

JAK

Y -Y -

Y -

JAK

Abb. 3.13: Expression von RGS4 und PAP1 in Abh angigkeit verschiedener LepRb-Tyrosinreste.RINm5F-Zellen wurden mit den LepRb-Mutanten Y985F, Y1077F und Y1138F (siehe Methodenteil 2.3.3)stabil transfiziert und fur 16 h mit Leptin [100 ng/ml] stimuliert. Gesamt-RNA wurde isoliert und imNorthern-Blot mit den cDNAs fur PAP1 und RGS-4 hybridisiert.

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4 Diskussion

4.1 In untransfizierten Zellen wurden keine

Leptineffekte gefunden

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Genen, deren Expression durch Leptinreguliert wird. Dazu wurden zunachst Zelllinien aus verschiedenen Geweben durchMessung der STAT3-Tyrosinphosphorylierung auf ihre Leptin-Responsivitat unter-sucht: Die Hypothalamus-Linie GT1-7 (Maus), die beiden Hepatoma-Linien HepG2(Mensch) und H4 (Ratte), sowie die beiden Insulinoma-Linien HIT-T15 (Goldhams-ter) und RINm5F (Ratte). Dabei wurde das in vitro-System der Zelllinien der in vivo-Untersuchung vorgezogen, da die individuellen Schwankungen, die naturlicherwei-se bei Tieren vorkommen, die Auswertung des Versuchergebnisses zu sehr erschwe-ren konnten. Bei der Untersuchung der STAT3-Tyrosinphosphorylierung im Western-Blot stellte sich dann heraus, dass keine der untersuchten Linien mit einer STAT3-Phosphorylierung auf die Leptinstimulation reagierte (100 ng/ml, entspr. etwa 6 nM).Erst nach Transfektion mit der cDNA des Leptinrezeptors wurden die Zelllinien Leptin-responsiv und zeigten nach 15 min eine deutliche STAT3-Phosphorylierung (sieheAbb. 3.1). Der gesamte ubrige Apparat der Signaltransduktion ist jedoch vorhanden,wie die Induktion von c-fos und SOCS-3 zeigt. Es ist also anzunehmen, dass der Lep-tinrezeptor in den untersuchten Zelllinien nicht endogen exprimiert wird, oder aberseine Expression so gering ist, dass sie fur eine nachweisbare STAT3-Aktivierung nichtausreicht.

Im Gegensatz dazu stehen mehrere Arbeiten, die in den oben beschriebenen Liniendurchaus endogene Leptineffekte nachweisen konnten. So wurde in der immortali-sierten Hypothalamus-Linie GT1-7 die mRNA der langen Form des Leptinrezeptorsmittels RT-PCR nachgewiesen und nach 30-minutiger Stimulation mit 10 nM Leptineine signifikante Erhohung der GnRH-Freisetzung beschrieben [Magni et al., 1999]. Beiden GT1-7-Zellen handelt es sich um murine GnRH- (Gonadotropine-Releasing Hormone)-

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4 Diskussion

sezernierende Hypothalamus-Zellen, die durch das große SV40-T-Antigen transfor-miert und immortalisiert wurden [Wetsel et al., 1998]. Da der LepRb bereits in verschie-denen hypothalamischen Kernen [Mercer et al., 1996] nachgewiesen wurde, lag die Un-tersuchung dieser Zelllinien nahe.

Bezuglich des hepatischen Glucose- und Fettstoffwechsels haben mehrere Arbeiten ei-ne deutliche Interaktion von Insulin und Leptin festgestellt. So wurde u.a. nachgewie-sen, dass intravenos verabreichtes Leptin die Insulin-vermittelte Hemmung der he-patischen Glucosefreisetzung unterstutzt [Rossetti et al., 1997], [Liu et al., 1998]. In deruntransfizierten Hepatomalinie Fao fuhrt die Stimulation mit Leptin (60 nM) zu einerHochregulation der c-fos mRNA und zu einer verstarkten Phosphorylierung von Aktund GSK3 [Szanto et al., 2000]. In untransfizierten HepG2-Zellen verursacht eine Lep-tinstimulation (60 nM) eine Reduktion der Insulin-induzierten Phosphorylierung vonIRS-1 [Cohen et al., 1996]. Zu beachten ist hierbei zunachst, dass die hier beschriebenenArbeiten eine 10fach hohere Leptinkonzentration (60 nM) anwendeten als ich selbst(100 ng/ml; entspr. in etwa 6 nM) und desweiteren, dass der physiologische Leptinspie-gel beim Menschen durchschnittlich 7.5 ng/ml bei Normalgewichtigen und 31 ng/mlbei Ubergewichtigen betragt [Considine et al., 1996]. Eine Aktivierung des JAK-STAT-Signalweges, wie z.B. eine STAT3-Phosphorylierung, wurde in den oben beschriebenenFallen nicht untersucht. Man muss jedoch annehmen, dass die Signaltransduktion desCytokins Leptin obligat zu einer Aktivierung von STAT3 fuhrt, die in einem EMSA-Experiment oder in einem Western-Blot mit einem phospho-spezifischen Antikorpernachweisbar sein sollte. In der hier vorliegenden Arbeit konnte schon bei einer Lep-tinkonzentration von 5 ng/ml eine deutliche STAT3-Phosphorylierung in transfiziertenRINm5F-Zellen gezeigt werden (siehe Abb. 3.3). Diese und weitere Arbeiten legten dieVermutung nahe, dass Hepatocyten selbst eine aktive Form des Leptinrezeptors expri-mieren konnten und so in vivo direkt durch Leptin stimuliert werden konnten. Jedochzeigten Cohen et al. (2001), dass eine Leber-spezifische Deletion der langen Form desLeptinrezeptors nicht zu einer erhohten Triglycerideinlagerung in der Leber fuhrt, sowie es bei der db/db-Maus der Fall ist [Cohen et al., 2001]. Dieses Ergebnis stellt die Be-deutung der hepatischen LepRb-Expression fur die Vermittlung der Leptinwirkung indiesem Organ in Frage.

Auch an der Langerhans’schen Insel wurde die Wirkung des Leptins untersucht. Hierwidersprechen sich viele Ergebnisse, aber die meisten Arbeiten finden eine Hem-mung der Insulinfreisetzung durch Leptin (siehe Einleitung), so dass auch bei isolier-ten Inselzellen oder Insulinomalinien Leptineffekte zu erwarten waren. Eine Aktivie-rung des JAK-STAT-Signalweges durch Leptin (100 nM) wurde in der untransfizier-

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4 Diskussion

ten Insulinoma-Linie RINm5F nachgewiesen, und zwar als STAT3-Phosphorylierungund im EMSA [Morton et al., 1999]. Eine Erhohung der Genexpression von c-fos wur-de ebenfalls in untransfizierten RINm5F-Zellen nach Stimulation mit Leptin (100 nM)beschrieben [Islam et al., 1997]. Ich selbst konnte in untransfizierten RINm5F-Zellen–auch bei einer Leptinkonzentration von 1 600 ng/ml (entspricht 96 nM)– keineLeptin-induzierte STAT3-Phosphorylierung nachweisen (Daten nicht gezeigt). Es waredenkbar, dass die von Morton et al.gefundene STAT3-Aktivierung auf eine Verunreini-gung des rekombinanten Leptins mit anderen Cytokinen oder mit Lipopolysaccharidenzuruckzufuhren ist, welche besonders bei den verwendeten hohen Leptinkonzentratio-nen von 100 nM die tatsachliche Leptinwirkung uberlagert hatten.

4.2 Die differentielle Aktivierung von STAT-Faktoren

durch Leptin, IL-6 und Wachstumshormon

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Leptin in der stabil transfizierten Insulinoma-Zelllinie RINm5F (RINm5F-LepRb) ein wesentlich breiteres Spektrum an STAT-Faktoren (STAT1, STAT3, STAT5 und STAT6) aktiviert als IL-6 (STAT1, STAT3) oderWachstumshormon (STAT5). In RINm5F-LepRb-Zellen verursacht Leptin im Gegen-satz zu IL-6 und Wachstumshormon auch eine starke STAT3-Phosphorylierung anSer727. Bei IL-6 ist die Phosphorylierung von Ser727 kaum nachweisbar. Die MAP-Kinasen ERK1 und ERK2 werden jeweils durch IL-6 und Leptin aktiviert, wobei dieAktivierung nach Stimulation mit Leptin deutlich starker ausfallt als nach der Stimu-lation mit IL-6. Bei diesen Untersuchungen zur Phosphorylierung von STAT-Faktorenund ERK-Kinasen wurde nur der Leptinrezeptor uberexprimiert, und nicht noch an-dere Komponenten des Signalweges, wie z.B. STAT-Faktoren oder JAK-Kinase. DieAktivierung der STAT-Faktoren nach Stimulation mit IL-6 bzw. Wachstumshormon istdaher ausschließlich auf endogen vorhandene Komponenten des Signalweges zuruck-zufuhren. So kann auch das breite Spektrum Leptin-aktivierter STAT-Faktoren nichtauf eine unspezifische Aktivierung auf Grund der Uberexpression des LepRb zuruck-zufuhren sein, da die Leptin-induzierte Phosphorylierung von STAT3 in diesem Ver-such etwa gleich stark war wie die IL-6-induzierte.

Die Aktivierung von STAT-Faktoren durch Leptin wurde bereits in anderen Syste-men untersucht: In COS-7 Zellen, die transient STAT1, STAT3, STAT5, STAT6 und denLepRb uberexprimieren, fuhrt die in vitro-Stimulation mit Leptin (200 nM) zur Akti-

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4 Diskussion

vierung (hier: DNA-Bindung) von STAT3, STAT5 und STAT6 [Ghilardi et al., 1996]. Ei-ne andere Arbeitsgruppe findet in COS-7 Zellen, die LepRb und die STAT-FaktorenSTAT1, STAT3, STAT5B und STAT6 uberexprimieren, bei 100 ng/ml Leptin eine Ak-tivierung von STAT1, STAT3 und STAT5B [Baumann et al., 1996]. Auch in stabil mitdem LepRb transfizierten Hepatomalinien (H-35 und HepG2) wurde nach Leptinsti-mulation (100 ng/ml) eine Aktivierung von STAT1, STAT3 und STAT5 nachgewiesen[Wang et al., 1997]. In dieser Arbeit [Wang et al., 1997] wurden die untersuchten STAT-Faktoren nicht uberexprimiert.

Zur Aktivierung von STAT-Faktoren durch Leptin gibt es auch Untersuchungen: Beider Ratte fuhrt die intravenose Injektion eines Leptin-Bolus (1 µg/g Korpergewicht)nach 5-30 min zu einer Phosphorylierung von STAT3, aber nicht von STAT1 oderSTAT5 im Hypothalamus [McCowen et al., 1998]. Auch andere Arbeitsgruppen fin-den nach in vivo-Stimulation im Hypothalamus nur eine Aktivierung von STAT3,nicht aber von anderen STAT-Faktoren [El-Haschimi et al., 2000], [Rizk et al., 2001] und[Vaisse et al., 1996]. Die bisher verfugbaren Daten bezuglich der selektiven Aktivierungvon STAT-Faktoren durch Leptin zeigen also, dass STAT3 in vivo der durch Leptin amstarksten aktivierte STAT-Faktor zu sein scheint. Denkbar ware aber auch, dass die Ak-tivierung der anderen Faktoren, d.h. STAT1, STAT5 und STAT6 zwar auch in vivo statt-findet, jedoch in so geringem Ausmaße, dass sie dort auch schwieriger nachzuweisenist. Die hier beschriebenen Arbeiten uber die STAT-Aktivierung in vivo betreffen außer-dem nur den Hypothalamus. Differentielle Analysen aus anderen Geweben, und vor al-lem der Insel, liegen bisher nicht vor. Einen weiteren Hinweis auf eine Bedeutung wei-terer STAT-Faktoren lieferten Untersuchungen an Mausen, bei denen das fur die STAT3-Rekrutierung essentiell wichtige Tyr1138 zu Serin mutiert wurde [Bates et al., 2003].Im Gegensatz zu db/db-Mausen, die keinen funktionellen Leptinrezeptor exprimierenund kleinwuchsig, infertil und diabetisch sind, sind die oben beschriebenen knock-in-Mutanten normalwuchsig, fertil und weniger hyperglykamisch. Beide Mutanten sindadipos; jedoch sind die Tyr1138Ser-Mutanten um 10 % (Mannchen) bzw. 20 % leich-ter (Weibchen) als die jeweiligen Pendants der db/db Mause [Bates et al., 2003]. Daskonnte ein Hinweis darauf sein, dass bestimmte Leptineffekte unabhangig von einerSTAT3-Aktivierung vermittelt werden. Dabei ist z.B. an die Aktivierung von STAT5oder des ERK-Signalweges zu denken, wie sie ja hier von mir bei RINm5F-Zellen ge-zeigt wurde.

Fur die Aktivierung von STAT3 ist die Dimerisierung, die durch die Phosphorylie-rung von Tyr705 induziert wird, essentiell. Diese wird durch die Rezeptor-assoziierteTyrosinkinase JAK2 vermittelt. Die Bedeutung der Phosphorylierung des Serinres-

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4 Diskussion

tes 727 im STAT3-Molekul liegt dagegen in der Forderung der transaktivierendenFunktion von STAT3 bei der Regulation der Transkription von spezifischen Genen.Die Identitat der Kinase, die diesen Serinrest phosphoryliert, ist jedoch noch unklar.Viele Berichte weisen eine Beteiligung von ERK-Kinasen nach [Kuroki et al., 1999],[O’Rourke et al., 2002]. Andere Berichte zeigen die mogliche Rolle anderer Kinasen auf,wie DYRK1 [Wiechmann et al., 2003], [Matsuo et al., 2001] oder PKC [Abe et al., 2001].Bezuglich der Rolle von ERKs wurde gezeigt, dass der ERK-Inhibitor PD98059die Leptin-induzierte Ser727-Phosphorylierung in der untransfizierten murinen Ma-crophagenlinie J774.2 hemmt, aber die Tyr705-Phosphorylierung unbeeinflusst laßt[O’Rourke et al., 2002]. Gleichzeitig kommt es bei Behandlung mit PD98059 zu einerverminderten Bindung von aktiviertem STAT3 an DNA [O’Rourke et al., 2002]. Ichselbst konnte eine deutliche Induktion der Ser727-Phosphorylierung durch Leptinnachweisen, die weit starker ist als nach Stimulation mit IL-6. Auch ERK1 und ERK2werden in RINm5F-LepRb-Zellen durch Leptin aktiviert; eine Verknupfung beider Er-eignisse habe ich jedoch nicht untersucht. Die in der hier vorliegenden Arbeit nachge-wiesene Phosphorylierung von Ser727 nach Stimulation mit Leptin stellt einen weiterenUnterschied zur Signaltransduktion des IL-6 dar.

Wie Abb. 3.5 zeigt, kam es in RINm5F-LepRb-Zellen nach Stimulation mit IL-6 zueiner deutlichen Aktivierung von STAT3, die in etwa so stark war wie die Leptin-induzierte. Auch STAT1 wurde durch IL-6 aktiviert, jedoch in wesentlich gerin-gerem Ausmaß als STAT3. Eine STAT5-Aktivierung war bei IL-6 uberhaupt nichtnachzuweisen. Diese Befunde stehen im Einklang mit alteren Arbeiten, die fur IL-6 hauptsachlich eine Aktivierung von STAT3 und STAT1 zeigen [Zhong et al., 1994],[Schumann et al., 1999], [Wang et al., 1997]. Die Aktivierung der ERK-Kinasen durchIL-6 wurde ebenfalls in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt. Sie wird vermutlichuber die Protein-Tyrosinphosphatase SHP-2 vermittelt, die uber ihre SH2-Domane andas Membran-proximale Tyrosin bindet [Kim et al., 1999]. Auch fur den Leptinrezeptorwurde ein analoger Mechanismus fur die ERK-Aktivierung gezeigt [Banks et al., 2000],[Bjørbæk et al., 2001].

In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Insulinomazellen neben Leptin auchmit Wachstumshormon stimuliert. Wachstumshormon ist bekanntermaßen ein Ak-tivator von STAT5 [Silva et al., 1996]. STAT5 liegt jedoch in zwei Isoformen vor[Ripperger et al., 1995], die von zwei verschiedenen Genen codiert werden: STAT5A(sw:Q62771, 793 AS, 90.82 kDa) und STAT5B (sw:P52632, 786 AS, 90.22 kDa) (Datengelten fur Rattus norvegicus). Beide Isoformen werden in vitro durch Wachstumshormonaktiviert, wobei das aktivierte STAT5A im Western-Blot langsamer wandert als STAT5B

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4 Diskussion

[Smit et al., 1997]. Auch in der hier vorliegenden Arbeit konnten nach der Leptinstimu-lation im Western-Blot mit einem Phospho-STAT5-spezifischen Antikorper zwei distink-te Banden gezeigt werden. Nach der Stimulation mit Wachstumshormon wurde jedochnur die obere, langsamer migrierende Bande als Signal sichtbar (siehe Abb. 3.5). Ei-ne Deutung dieser Ergebnisse ist schwierig, denn eine Differenz im Molekulargewichtvon 0.6 kDa wurde nicht zu einem so großen Unterschied im Laufverhalten fuhren, sodass man die Banden nicht zwangslaufig als STAT5A und STAT5B identifizieren kann.Wahrscheinlicher als Grund fur die Divergenz im Laufverhalten ist ein unterschiedli-cher Phosphorylierungsstatus von STAT5A bzw. STAT5B.

Die hier erzielten Ergebnisse konnten in unserem Labor an einer weiteren Insulinoma-Zelllinie (HIT-T15) bestatigt werden (Bamberg-Lemper, pers. Mitteilung). Es ist also an-zunehmen, dass auch in vivo in den β-Zellen des Pankreas nach Stimulation mit Leptineine Phosphorylierung von STAT1, STAT3, STAT5 und STAT6 nachweisbar sein konnte.In nicht gezeigten Experimenten habe ich versucht, in frisch isolierten Inseln des Pan-kreas nach Stimulation mit Leptin (200 ng/ml) eine STAT3-Phosphorylierung an Tyr705nachzuweisen, was jedoch nicht gelang. Eine mogliche Erklarung fur dieses Ergebniskonnte sein, dass der Anteil der Leptin-sensitiven β-Zellen an der Gesamtheit aller In-selzellen zu gering ist, um eine deutliche STAT3-Phosphorylierung nachzuweisen.

In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Male die Leptin-induzierte Aktivierungvon STAT1, STAT3, STAT5 und STAT6 in Inselzellen nachgewiesen. Da sich die einzel-nen STAT-Faktoren deutlich in ihrer Spezifitat fur Genpromotoren unterscheiden, warzu erwarten, dass die Cytokine IL-6, Wachstumshormon bzw. Leptin die Expressionunterschiedlicher Zielgene aktivieren.

4.3 Das Dot-Blot -Verfahren zur Uberprufung

Leptin-regulierter Gene

Zum Auffinden Leptin-regulierter Gene wurde ein cDNA-Filter-Array aus 27 648 ver-schiedenen cDNAs mit einer komplexen cDNA-Sonde aus Leptin-stimulierten bzw.unstimulierten RINm5F-LepRb-Zellen hybridisiert. Dabei wurden –nach Anwendungstringenter Auswahlkriterien– nach der 16-stundigen Leptinstimulation 35 und nachder 1-stundigen Leptinstimulation 21 verschiedene, hochregulierte Transkripte gefun-den. Mit einem Teil der als Leptin-regulierte Transkripte identifizierten cDNAs wurdenDot-Blots hergestellt

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4 Diskussion

und erneut mit der komplexen cDNA-Sonde hybridisiert. Von insgesamt 60 Klonen(Plasmiden) wurden jeweils 5 ng Insert-DNA auf die Dot-Blot-Membran aufgetragen.Von den 60 Klonen waren nach den Hybridisierungen 43 als Signal visuell erkennbar.Nach Quantifizierung und Abzug des Hintergrundwertes blieben nur 9 Signale ubrig,deren Signalstarke fur die Auswertung ausreichte. Mit Hilfe des Dot-Blot-Verfahrenskonnten einige Transkripte also nicht nachgewiesen werden; bei den spater durch-gefuhrten Northern-Blot-Experimenten gelang dagegen der Nachweis dieser cDNAs.Offensichtlich war die Empfindlichkeit der hier getesteteten Nachweismethode desDot-Blots im Vergleich zu der des Northern-Blots zu gering, so dass nur stark expri-mierte mRNAs, wie Insulin, PAP1 usw. zu einem auswertbaren Signal fuhrten (sie-he Abb. 3.10). Eine plausible Erklarung dafur konnte sein, dass die DNA-Menge von5 ng/spot beim RZPD-Array auf eine Flache von ca. 1 mm2 verteilt wurde, beim selbstangefertigten Dot-Blot jedoch auf eine Flache von ca. 20 mm2. Nimmt man eine gleicheAnzahl gebundener radioaktiver Sondenmolekule an, so ist die Signaldichte eines dotsauf dem Dot-Blot geringer als auf dem RZPD-Array. Somit fiel das Signal der schwacherexprimierten mRNAs beim Dot-Blot in vielen Fallen unter die Nachweisgrenze. Bei ei-ner der Flache des dots proportional angepassten DNA-Menge waren einige schwa-che mRNAs, wie SOCS-3 oder Cyclin D3 vermutlich nachweisbar gewesen. So musstedie Untersuchung der Leptin-regulierten Transkripte mit Hilfe von Northern-Blots fort-gefuhrt werden.

Trotz der mangelnden Empfindlichkeit fur schwacher exprimierte Transkripte konntenmit Hilfe des Dot-Blot-Verfahrens 8 cDNAs aus dem UniGene-Filter-Screening als Leptin-regulierte Transkripte bestatigt werden. Somit stellt das Dot-Blot-Verfahren eine guteund preiswerte Moglichkeit dar, die Expression einer begrenzten Anzahl von cDNAsunter verschiedenen Bedingungen parallel zu untersuchen.

4.4 Leptin-regulierte Gene in RINm5F-LepRb-Zellen

In dieser Arbeit wurden durch das Screening eines Filter-Arrays Gene gefunden, derenExpression durch Leptin reguliert wird. Durch Dot-Blots und Northern-Blots wurde einTeil der gefundenen Gene weiter untersucht und in ihrer Regulation bestatigt. Dabeiwurden die Gene nach ihren Expressions-Zeitverlaufen in drei Gruppen aufgeteilt: ”im-mediate early genes“, die nach 1 h Leptinstimulation ihr Maximum erreichen, ”delayed ear-ly genes“, die nach 7 h ihr Maximum erreichen und schließlich die ”late genes“, die nach16 h ihr Maximum erreichen. In die erste Gruppe wurden SOCS-3 (supressor of cytokine

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4 Diskussion

signaling 3), CISH (cytokine-inducible SH2-containing protein), Fibrinogen-β und RGS-4(regulator of G-protein signalling 4) eingeordnet, in die zweite PAP1 und in die dritte tPA,Ppap2a, SOD-2, Lipocalin 2 und Tachykinin. In den Northern-Blot-Experimenten wur-de mit CISH auch ein Leptin-reguliertes Gen identifiziert, welches zunachst nicht imScreening der Filter-Arrays bzw. Dot-Blots gefunden wurde. Unter den hier gefundenenGenen sind viele, die fur sezernierte Proteine codieren (tPA, Fibrinogen-β, PAP1, Lipo-calin 2, Tachykinin). Man kann die gefundenen Gene aber auch nach ihrer Funktion imOrganismus einordnen: So gibt es Entzundungs-relevante Gene (PAP1, Tachykinin, Li-pocalin 2 und Fibrinogen-β) und Gene mit einer Funktion in der zellularen Signaltrans-duktion (SOCS-3, Ppap2a, RGS-4, GSK3-β, 14-3-3-ε, serine/threonine kinase 2 und ADPribosylation factor 4). Auf vier dieser durch Leptin regulierten Gene (2 Entzundungs-relevante Gene und 2 Gene aus dem Bereich ”Signaltransduktion“) wird in dieser Dis-kussion weiter eingegangen.

4.4.1 Phosphatidat Phosphohydrolase Typ 2a (Ppap2a)

Ppap2a/LPP1 ist wie Ppap2b und Ppap2c eine Phosphatidat-Phosphohydrolase vomTyp2. In dieser Arbeit wurde Ppap2a als Leptin-reguliertes Transkript gefunden. DieLeptin-induzierte Hochregulation begann nach 3 h und erreichte nach 16 h ein Maxi-mum, weshalb Ppap2a in die Gruppe der ”late genes“ eingeordnet wurde. Die Stimula-tion mit Wachstumshormon hatte keinen Effekt auf die Genexpression, jedoch wurdesie durch IL-1β reguliert. Auch nach der Stimulation mit IL-1β beginnt die Hochregu-lation bereits nach 3 Stunden; die Expression andert sich dann jedoch nicht mehr undbleibt bis zum Ende der Messung (16 Stunden) auf dem gleichen Niveau. Die Expres-sion kann also offensichtlich uber verschiedene Wege reguliert werden.

Phosphatidat-Phosphohydrolasen katalysieren die Dephosphorylierung von Phos-phatidylsaure (PA, (phosphatidic acid)) bzw. Lysophosphatidylsaure (LPA, (lysophos-phatidic acid)) zu Diacylglycerol. PA bzw LPA wiederum entstehen durch die Ein-wirkung von Phospholipase D (PLD) auf Phospholipide, oder aber durch das Zu-sammenspiel von Phospholipase C (PLC) und DAG-Kinase [Exton JH, 1994] (sieheAbb. 4.1). LPA hat verschiedenste Signalwirkungen auf Zellen, und die Abspal-tung der Phosphatgruppe fuhrt in der Regel zu einer Inaktivierung des entsprechen-den Botenmolekuls [Sciorra et al., 2002]. Die mitogene Wirkung von LPA auf ruhen-de Fibroblasten wurde schon 1989 gezeigt [van Corven et al., 1989]. Daruberhinauswurde die Beteiligung von LPA an der Vermittlung der Thrombocytenaggregation

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4 Diskussion

Abb. 4.1: Substratspezifit at der Phospholipasen und der Phosphatidat-Phosphohydrolase. PLD:Phospholipase D, PLA1: Phospholipase A1, PLA2: Phospholipase A2, PLC: Phospholipase C, Ppap2:Phosphatidat-Phosphohydrolase. Die Abbildung zeigt die verschiedenen Phospholipasen und ihreSpezifitat. Phosphatidat-Phosphohydrolasen katalysieren die Dephosphorylierung von Lysophospha-tidylsaure oder Phosphatidylsaure (LPA bzw PA, siehe Text) zu Diacylglycerol. LPA bzw PA ensteht,wenn Phospholipase D die Esterbindung zwischen dem phosphorylierten Glycerinkorper und dem po-laren Rest spaltet.

[Schumacher et al., 1979], Tumorzellinvasion [Imamura et al., 1993] und Apoptosehem-mung gezeigt [Weiner et al., 1999]. Intrazellular kann LPA u.a. die Freisetzung von Ca2+

fordern [Jalink et al., 1995], ERK aktivieren [Wang et al., 2003] und die EGF-vermittelteAktivierung von STAT1 hemmen [Suzuki et al., 1997].

Offensichtlich spielt LPA die Rolle eines parakrin wirkenden Signalvermittlers mitHormon- und Wachstumsfaktor-ahnlichen Eigenschaften.

Rezeptoren fur LPA wurden bereits identifiziert: Es handelt sich um G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren; und ihre Genfamilie wurde als EDG (endothelial dif-ferentiation gene) bezeichnet [Hla et al., 1990]. Bis heute sind acht Miglieder (EDG1 bisEDG8) dieser Genfamilie identifiziert [Im et al., 2000], [Hobson et al., 2001].

Ppap2a, b und c sind monomere Proteine, die uber 6 TM-Helices in der Plasmamem-bran verankert sind [Barila et al., 1996]. Die Einteilung dieser Enzymfamilie in 2 Klas-sen (Typ 1 und Typ 2) betrifft die Abhangigkeit ihrer katalytischen Aktivitat vonMg2+ Ionen und dem Alkylierungsreagenz NEM (N-ethyl Maleimid): Phosphatidat-Phosphohydrolasen vom Typ1 sind Mg2+ abhangig und hemmbar durch NEM,wahrend die vom Typ2 unabhangig von Mg2+ und unempfindlich gegenuber NEMsind [Sciorra et al., 2002].

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4 Diskussion

Alle 3 Isoformen wirken als Ectophosphatasen, indem sie extrazellulares LPA hydro-lysieren [Jasinska et al., 1999], so dass man fur Phosphatidat-Phosphohydrolasen eineRolle im ”Pra-Rezeptormetabolismus“ von LPA postulieren kann, bei dem LPA durchPhosphatidat-Phosphohydrolasen inaktiviert wird, bevor es an einen EDG-Rezeptorbinden kann. Es ware denkbar, dass Leptin in der Inselzelle durch eine Hochregula-tion von Ppap2a die Wirkungen von LPA modulieren kann. So konnte Leptin uberdie Modulation der LPA-Spiegel einen Wachstums-regulierenden Effekt auf die Inselvermitteln und so zusammen mit PAP1 eine Rolle bei der Pankreas-Regeneration beiEntzundung, Diabetes, aber auch eine modulierende Wirkung bei malignen Verande-rungen vermitteln.

Zu der Regulation der Genexpression von Ppap2a gibt es nur wenige Arbeiten. Kaiet al. (1997) zeigen, dass Ppap2b durch H2O2 und EGF hochreguliert wird, Ppap2a je-doch von diesen Stimuli unbeeinflusst bleibt. Androgene scheinen Ppap2a jedoch zu re-gulieren: so konnten Ulrix et al. (1998) nach 16-stundiger Stimulation mit dem syntheti-schen Androgen R1881 in der Prostata-Adenomzelllinie LNCaP eine 4-fache Erhohungder Ppap2a mRNA Menge nachweisen [Ulrix et al., 1998]. Ich konnte in dieser Arbeitfur die Phosphatidat-Phosphohydrolase Ppap2a zum ersten Mal eine Regulation uberden JAK/STAT-Weg nachweisen. Es bleibt zu klaren, ob auch andere STAT-Faktor-aktivierende Cytokine die Expression von Ppap2a regulieren konnen.

4.4.2 Regulator of G-Protein signalling 4 (RGS-4)

Nach Stimulation von RINm5F-LepRb-Zellen mit Leptin konnte auch eine Hochregu-lation von RGS-4 nachweisen werden. Bereits 1 h nach Beginn der Leptinstimulationstieg die Menge der RGS-4-mRNA an. Zwischen 1 h und 7 h blieb der Expressionslevelin etwa gleich; nach 16 h kam es jedoch nochmals zu einem kleinen Anstieg. Wegender schnellen Hochregulation wurde RGS-4 in die Gruppe der ”immediate early genes“eingeordnet. Wachstumshormon beeinflusste die Expressionslevel nicht, IL-1β konnteRGS-4 jedoch hochregulieren (Maximum nach 3 h).

Heterotrimere G-Proteine werden durch heptahelikale Rezeptoren aktiviert, indem die-se die Dissoziation von gebundenem GDP fordern und somit die Bindung von GTPermoglichen. Die Abschaltung des Signals erfolgt durch Hydrolyse des gebundenenGTP zu GDP. Dieser letzte Schritt wird durch die intrinsische GTPase-Aktivitat derGα-Untereinheit katalysiert. Es ist diese GTPase-Aktivitat, die durch sog. GAP (GTPaseactivating proteins) noch verstarkt werden kann. GAPs wurden ursprunglich als Modu-

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4 Diskussion

lator fur p21 Ras gefunden [Adari et al., 1988]. RGS-4 (regulator of G-protein signalling4 [Druey et al., 1996], [Berman et al., 1996]) scheint vornehmlich die Aktivitat von Gαi

und Gαq herabzusetzen [Huang et al., 1997], [Yan et al., 1997], [Berman et al., 1996].

RGS-Proteine stellen funktionell GAPs dar und fordern also durch die Aktivierung derGTPase-Aktivitat die Bildung der inaktiven, GDP-gebundenen Form der heterotrime-ren G-Proteine [Druey et al., 1996]. Sie sind mit dem Sst2-Gen der Backerhefe verwandt[Druey et al., 1996], welches die Desensitisierung der Pheromon-Responsivitat vermit-telt [Dohlman et al., 1996]. Die Aktivitat der RGS-Proteine wird hauptsachlich uber ihreeigene Genexpression reguliert, d.h. die Menge der RGS-4-Molekule in der Zelle beein-flusst direkt das Ausmaß der GTPase-Aktivitat eines bestimmten G-Proteins.

In der Insel wird die Freisetzung von Insulin durch verschiedene Faktoren be-einflusst. Neben der bekannten Wirkung eines erhohten Glucosespiegels steuertauch Acetylcholin als parasympathischer Neurotransmitter die Freisetzung von In-sulin [Strubbe et al., 1993]. Acetylcholin vermittelt uber muscarinische Rezeptorenvom M1-und M3-Typ eine Verstarkung der Insulinfreisetzung, indem uber Gαq diePhospholipase C aktiviert und intrazellulares Ca2+ freigesetzt wird [Li et al., 1996],[Iismaa et al., 2000]. RGS-4 verstarkt in der Zelllinie Sf9 die durch den M2-AgonistenCarbachol induzierte GTPase-Aktivitat 6fach [Cladman et al., 2002]. Gleichzeitig gibtes viele Hinweise fur den hemmenden Einfluss von Leptin auf die Acetylcholin-vermittelte Freisetzung des Insulins [Benomar et al., 2003] (siehe auch Einleitung). Einevermehrte Expression von RGS-4 durch Leptin, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde,konnte somit die stimulierende Wirkung des Acetylcholins auf die Insulinfreisetzungmaßgeblich hemmen. Somit konnte RGS-4 eine zentrale Rolle bei der Vermittlung derdurch Leptin gehemmten Insulinfreisetzung spielen (siehe Abb. 4.2).

Die Untersuchung uber die Bedeutung der intrazellularen Tyrosinreste des LepRb zeig-te, dass die RGS-4-Expression ahnlich wie PAP1 (s.u.) vornehmlich von Tyr1138, undsomit vermutlich von STAT3 abhangig ist (siehe Abb. 3.13). Genau wie bei PAP1 siehtman auch bei RGS-4 eine verstarkte Expression, wenn Tyr985 und Tyr1077 fehlen. Da-her kann auch fur RGS-4 eine Regulierbarkeit uber feedback-Inhibitoren angenommenwerden, die an Tyr985 oder Tyr1077 binden.

Dass die Expression von RGS-4 jedoch nicht ausschließlich durch STAT3 reguliert wird,zeigte der Versuch mit IL-1β, in dem gezeigt wurde, dass die RGS-4-Expression nach3-stundiger Stimulation mit IL-1β leicht erhoht wurde. Das bestatigt die Daten von Rie-neck et al. (2000), die nach 2 h eine Hochregulation von RGS-4 durch IL-1β in RINm5F-Zellen fanden.

78

4 Diskussion

Abb. 4.2: Modell uber die funktionelle Verknupfung von Leptin, RGS-4 und gehemmter Insulinfrei-setzung in einer pankreatischen β-Zelle. Bei einer Parasympathikus-Aktivierung bindet Acetylcholinin der β-Zelle der Insel an muscarinische Rezeptoren von Typ M1 oder M3. Das assoziierte G-Protein Gq

wird durch GTP-Bindung aktiviert und leitet das Signal zur Phospholipase C (hier nicht dargestellt) wei-ter, die uber den IP3-Weg intrazellulares Ca2+ freisetzt und somit die Insulinfreisetzung reguliert. Leptinerhoht die Expression von RGS-4 . RGS-4 fordert die GTPase-Aktivitat von Gq und verringert somit dieuber den IP3-Ca2+-Weg vermittelte Insulinfreisetzung.

In der bisherigen Literatur gibt es keine deutlichen Hinweise auf eine Regulierbar-keit von RGS-4 durch den JAK/STAT-Signalweg. RGS-4 wurde bisher vornehmlichin neuronalem Gewebe untersucht. Dabei gibt es interessanterweise viele Daten, dieeine Herunterregulation von RGS-4-mRNA zeigen. Es gibt eine Arbeit, die nach Be-handlung mit Corticosteron eine Runterregulation von RGS-4 im Nucleus paraven-tricularis des Hypothalamus von adulten Ratten zeigt [Ni et al., 1999]. Die gleicheArbeitsgruppe zeigt außerdem bei in vitro-Versuchen, dass RGS-4 in der Hirnstamm-Tumorlinie CATH.a durch Dexamethason hochreguliert wird, wahrend die glei-che Substanz in der Hypophysen-Linie AtT20 zu einer Verminderung der RGS-4-mRNA fuhrt [Ni et al., 1999]. Eine andere Arbeitsgruppe beschreibt die hemmende Wir-kung des nerve growth factor (NGF) auf die endogene Expression von RGS-4 in derPhaeochromocytom-Zelllinie PC12M [Krumins et al., 2004]. Hier sei erwahnt, dass derWachstumsfaktor NGF seine Wirkung uber einen Rezeptor mit intrinsischer Tyrosin-kinaseaktivitat, und nicht uber den JAK/STAT-Weg vermittelt.

79

4 Diskussion

Aber auch Opioide konnen offensichtlich die Expression von RGS-4 verandern: so wur-de in mit Opioidrezeptoren-transfizierten PC12-Zellen gezeigt, wie die entsprechendenAgonisten RGS-4-mRNA hochregulieren [Nakagawa et al., 2001].

Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass fur RGS-4 in dieser Arbeit erstmaligeine Regulation durch den JAK/STAT-Signalweg gezeigt wurde. Daruber hinaus waremoglich, dass die Leptin-induzierte Hemmung der Insulinsekretion in der Inselzelleuber RGS-4 vermittelt wird.

4.4.3 Lipocalin-2

Die Leptin-induzierte Hochregulation der Expression von Lipocalin-2 erreichte erstnach 16 h ihren Hohepunkt. Deshalb wurde das Transkript in die Gruppe der ”lategenes“ eingeordnet. IL-1β fuhrte nach 3-7 h zu einer deutlichen Hochregulation, Wachs-tumshormon jedoch nicht. Bei der Stimulation durch IL-1β war der Zeitverlauf der Ex-pression anders: Die Hochregulation begann bereits nach 3 h und erreichte nach 7 h ihrMaximum, das auch nach 16 h noch weiter bestand. Die basale Lipocalin-2-Expressionwar zu Beginn des Versuchs sehr niedrig, stieg jedoch auch ohne Cytokinstimulationim Laufe der 16-stundigen serumfreien Inkubation deutlich an (siehe Abb. 3.11).

Lipocalin-2 (LCN2) ist auch unter den Bezeichnungen NGAL (neutrophil gelatinase as-sociated lipocalin) [Kjeldsen et al., 1993] und 24p3 bekannt [Flower et al., 1991]. Es hatein Molekulargewicht von 25 kDa. Die Lipocaline, eine Gruppe extrazellularer Pro-teine, wurden erstmalig als Proteine beschrieben, die lipophile Substanzen durch Ein-schluss binden konnen [Pervaiz et al., 1987]. Zu den Lipocalinen gehoren auf Grundihrer strukturellen Ahnlichkeit neben dem hier beschriebenen Lipocalin-2 u.a. nochdas tear albumin protein aus der Tranenflussigkeit [Redl et al., 1992], das retinol bindingprotein [Pervaiz et al., 1985], das odorant binding protein [Lacazette et al., 2000], das beta-lactoglobulin [Julkunen et al., 1988], das urinary alpha-2-globulin der Ratte, und Lipocalin-1 (VEG-Protein) [Blaker et al., 1993].

Lipocalin-2 wird in vielen Geweben exprimiert, so im Knochenmark, Uterus,Prostata, Speicheldruse, Magen, Appendix, Colon, Luftrohre und in der Lunge[Cowland et al., 1997].

In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die mRNA fur Lipocalin-2 in RINm5F-LepRb-Zellen nach Stimulation mit Leptin bzw. IL-1β hochreguliert wird. Man kann daraus

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4 Diskussion

schließen, dass die Regulation der Genexpression –im Gegensatz zu PAP1– nicht aus-schließlich uber den JAK-STAT-Signalweg geschieht.

Die Regulierbarkeit durch IL-1β wurde schon in fruheren Arbeiten gezeigt: In dermenschlichen Lungenepithel-Zelllinie A549 verursacht IL-1β, nicht aber LPS, IL-6oder TNF-α, eine 10fache Hochregulation von Lipocalin-2. Gleichzeitig konnte nachIL-1β-Stimulation im EMSA eine Bindung von NF-κB an ein NF-κB-Promotorelementaus dem NGAL-Promotor gezeigt werden [Cowland et al., 2003]. Im Gegenatz dazufinden Orabona et al. (2001) neben einer Induzierbarkeit durch IL-1 auch eine eineInduzierbarkeit durch IL-9 bzw. IL-6, diesmal jedoch in T-Zell-Lymphomazelllinien[Orabona et al., 2001]. Dies wurde wiederum darauf hinweisen, dass in manchen Zellli-nien doch eine Hochregulation uber den Jak/STAT-Weg, insbesondere uber STAT1 undSTAT3, moglich ist. Hier sei erwahnt, dass IL-9 vornehmlich STAT1, STAT3 und STAT5aktiviert [Bauer et al., 1998].

Neben diesen Versuchen auf zellularer Ebene gibt es auch verschiedene in vivo-Untersuchungen, bei denen die Hochregulation von Lipocalin-2 gefunden wurde. Inpankreatischen Adenokarzinomen wird Lipocalin-2 als hochreguliertes Transkript ge-funden [Argani et al., 2001], [Terris et al., 2002], aber auch in Acinuszellen bei einer ex-perimentell induzierten Pankreatitis [Ji et al., 2003]. Letzterer Befund stellt einen inter-essanten Bezug zu PAP1 her, welches ebenfalls bei einer Pankreatitis in Acinuszellenhochreguliert wird. Beide Transkripte, PAP1 und Lipocalin-2, werden in der hier vor-liegenden Arbeit als Leptin-regulierte Transkripte identifiziert. Daruber hinaus wurdedie bereits durch andere Autoren beschriebene Regulierbarkeit durch IL-1β und durchden JAK/STAT-Signalweg bestatigt.

4.4.4 Pancreatitis associated Protein (PAP1)

Die starkste Leptin-induzierte Hochregulation wurde bei PAP1 beobachtet. Ohne Sti-mulation war das Transkript nicht nachweisbar, d.h. die basale Expression war entwe-der extrem niedrig oder gar nicht vorhanden. Eine Stimulation mit Leptin fuhrte je-doch nach 7 h zu einer maximalen Induktion. Im Dot-Blot-Experiment konnte ein etwa1 600-facher Anstieg gemessen werden. Durch Wachstumshormon oder IL-1β wurdedie Genexpression nicht beeinflusst.

Bei PAP1 handelt es sich um ein sezerniertes Protein, das bei Entzundungen derBauchspeicheldruse (Pankreatitis) eine Rolle spielt. In der Akutphase einer Pankrea-titis ist die Sekretion der meisten pankreatischen Proteine verringert, wahrend die

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4 Diskussion

Bildung des sog. pancreatitis associated protein 1 (PAP1/Reg-2), einem basischen Pro-tein von 16 kDa, in den exokrinen Acini stark zunimmt [Iovanna et al., 1991]. Ne-ben PAP1 gibt es in der Ratte noch zwei weitere zu PAP1 homologe Gene, namlichPAP2 [Frigerio et al., 1993] und PAP3 [Dusetti et al., 1995a], die ebenfalls bei Pankreati-tis hochreguliert werden. Daneben gibt es in der Ratte noch Regenerating islet-derived-1(Reg-1), das auf Aminosaure-Ebene jedoch nur eine 49%ige Ahnlichkeit zu den PAP-Proteinen aufweist [Miyashita et al., 1995]. Zusammen gehoren sie zur Reg-Genfamilie[Okamoto H., 1999].

Die Funktion der PAP-Proteine ist bisher unklar. Insgesamt scheinen die PAP/Reg-Proteine eine Rolle bei der Organregeneration bzw. dem Schutz vor Zelltod zu spie-len. So wurde die wachstumsfordernde Wirkung von Reg-Proteinen bereits untersucht.In regenerierenden Pankreata der Ratte konnte die verstarkte Expression von Reg-1nachgewiesen werden [Terazono et al., 1990]. Aber auch auf die Langerhans’schen In-seln selbst hat Reg einen Effekt: In isolierten Inseln der Ratte, die mit rekombinan-tem Reg-Protein behandelt wurden, wurde ein erhohter [3H]Thymidin Einbau gezeigt[Watanabe et al., 1994]. Fur PAP1 wurde gezeigt, dass eine TNF-α-vermittelte Apop-tose in der Acinus-Zelllinie AR4-2J durch PAP1 gehemmt werden kann, und dassgleichzeitig die Expression von PAP1 durch TNF-α in diesen Zellen induziert wird[Malka et al., 2000]. In einer anderen Arbeit wird gezeigt, dass PAP1/Reg-2 in sensori-schen und motorischen Neuronen Cytokin-abhangig exprimiert wird und bei Ratten insich regenerierenden, motorischen Neuronen hochreguliert wird [Livesey et al., 1997].Viele Arbeiten weisen auch darauf hin, dass die Expression von PAP1 durch IL-6-ahnli-che Cytokine reguliert wird: So wurde bereits die Regulation durch CNTF, CT-1 und LIFin Motoneuronen [Nishimune et al., 2000], und durch eine Co-Stimulation von IL-6 undDexamethason in einer pankreatischen Acinuszelllinie gezeigt [Dusetti et al., 1995b].Auch in der Insulinomalinie RINm5F konnte die Regulation der Genexpression vonReg-1 durch eine Co-Stimulation von IL-6 und Dexamethason nachgewiesen werden.Die Stimulation mit IL-6 alleine fuhrte jedoch nicht zu einer Hochregulation von Reg-1[Akiyama et al., 2001].

Es gibt also viele Hinweise auf eine Regulation der PAP1-Expression durch Cytokinevom IL-6-Typ. Die Regulation durch Leptin wurde bereits in der Phaeochromocytom-Linie PC12 gezeigt. Waelput et al. (2000) transfizierten PC12-Zellen stabil mit dem Lep-tinrezeptor und untersuchten die Wirkung von Leptin. Auch hier verursacht Leptinalleine nur eine sehr geringe, schwer nachweisbare Hochregulation von PAP1; eineCo-Stimulation mit Forskolin, einem Aktivator der Adenylatcyclase, verstarkte den

82

4 Diskussion

Effekt jedoch um ein Vielfaches [Broekaert et al., 2002]. Das Maximum der mRNA-Hochregulation trat 22 Stunden nach Stimulation auf [Waelput et al., 2000].

Ich selbst konnte in der stabil transfizierten Insulinoma-Zelllinie RINm5F auch oh-ne Co-Stimulation mit Forskolin oder anderen Cytokinen, d.h. ohne eine Erhohungdes cAMP-Spiegels oder Aktivierung anderer Signalwege, eine starke PAP1-Induktionnachweisen. Bereits nach 7 Stunden Leptinstimulation konnte ein Maximum der PAP1-Induktion nachgewiesen werden. Das konnte vielleicht ein Hinweis darauf sein, dassβ-Zellen –von denen sich die RINm5F-Zellen ableiten– auch in vivo direkte Zielzellenfur Leptin darstellen und deshalb nicht die zusatzliche Stimulation mit Forskolin oderDexamethason benotigen.

IL-1β fuhrte bei meinen Versuchen nicht zu einer Veranderung der Genexpressionvon PAP1. Dies steht im Einklang mit den Daten von Akiyama et al. (2001), die inRINm5F-Zellen weder mit IL-1β alleine, noch in Co-Stimulation mit Dexamethasoneine Hochregulation des PAP1-verwandten Reg-1 nachweisen konnten. Auch in derAcinus-Zelllinie AR-42J konnte durch Stimulation mit IL-1β keine Veranderung derGenexpression von PAP1 herbeigefuhrt werden [Dusetti et al., 1995b].

Bezuglich der Bedeutung der intrazellularen Tyrosinreste des Leptinrezeptors konn-te in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein gleichzeitiges Fehlen der Reste Tyr985und Tyr1077 zu einer verstarkten Expression von PAP1 fuhrt. Die Mutation vonTyr1077 und Tyr1138 fuhrte die Leptinstimulierbarkeit von PAP1 dagegen auf Nullzuruck. Fehlten alle intrazellularen Tyrosinreste, war die Stimulation mit Leptinmoglich, fiel jedoch sehr schwach aus (siehe Abb. 3.13). Diese Daten stehen im Ein-klang mit den Ergebnissen von Eyckerman et al. (1999), die die Aktivitat des PAP1-Promotors in PC12-Zellen mit Hilfe eines Luziferasesystems untersuchten. Auch dortwar die Leptin/Forskolin-induzierte PAP1-Expression am starksten, wenn Tyr985 undTyr1077 fehlten. Ebenso war sie am niedrigsten, wenn Tyr1077 und Tyr1138 mu-tiert waren [Eyckerman et al., 1999]. Die Mutation von Tyr1138 alleine fuhrte auchzu einer starken Reduktion der Leptin-Stimulierbarkeit, im Gegensatz zu den Ein-zelmutationen von Tyr985 bzw. Tyr1077 [Eyckerman et al., 1999]. Die essentielle Be-deutung des Tyr1138-Restes fur die Bindung und Phosphorylierung von STAT3 istbekannt ([Stahl et al., 1995], [Banks et al., 2000] und [White et al., 1997]); und so kannman annehmen, dass die Regulation des PAP1 Genes vornehmlich uber STAT3 re-guliert wird. Dafur sprechen auch die IL-6-responsiven Elemente, die im Promotorvon PAP1 gefunden wurden [Dusetti et al., 1995b]. Die verstarkte Expression beimgleichzeitigen Fehlen von Tyr985 und Tyr1077 konnte durch einen negativen Regu-

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4 Diskussion

lationsweg durch SOCS-3, CIS oder SHP-2 erklarbar sein. Diese Faktoren hemmenden JAK-STAT-Signalweg durch Bindung an intrazellulare Motive des LepRb. Die Bin-dung von SOCS-3 an Tyr985 und Tyr1077 wurde bereits gezeigt [Bjørbæk et al., 2000],[Eyckerman et al., 2000]. Eine Mutation dieser Reste wurde diese feedback-Schleife un-terbinden, was eine verstarkte PAP1-Expression erklaren wurde.

Insgesamt ergeben die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Daten uber die Regulationvon PAP1 durch Leptin in RINm5F-Zellen zusammen mit den oben beschriebenen Da-ten ein gemeinsames Bild. Es ist zu vermuten, dass Leptin auch in vivo in der Insel eineIL-6-ahnliche Rolle ubernehmen kann, und durch die Hochregulation von PAP1 mogli-cherweise auch eine Art Schutzfunktion gegen Apoptose oder Pankreasdegenerationvermittelt. Denkbar ware auch eine Leptin-vermittelte Sekretion von PAP1, welches alseine Art Wachstumsfaktor auto- oder parakrin in der Insel oder dem umliegenden Ge-webe eine mitogene Wirkung –so wie es bereits fur Reg-1 [Watanabe et al., 1994] gezeigtwurde– vermitteln konnte.

4.4.5 Zielgene des Leptins

Die Leptin-regulierte Genexpression ist –trotz der großen physiologischen Bedeutungdes Leptins– ein erstaunlicherweise kaum untersuchtes Feld. Die Zahl der Veroffentli-chungen, die sich mit diesem Thema beschaftigen, ist daher verhaltnismaßig klein.

In Zelllinien wurde Leptin-gesteuerte Genexpression bereits untersucht, so in der im-mortalisierten Hypothalamuslinie GT1-7. Nach Transfektion mit dem Leptinrezeptorkonnte in diesen Zellen mit Hilfe eines subtraktiven Hybridisierungsverfahrens nachStimulation mit Leptin 53 hochregulierte Gene gefunden werden [White et al., 2000].Als Positivkontrolle fur Leptin-induzierte Gene wurde c-fos benutzt. In dieserVeroffentlichung wurden aus den 53 Leptin-regulierten Transkripten 4 Gene heraus-gestellt und naher charakterisiert: LRG-47, T-GTP (beides GTP-bindende Proteine),RC10-11 (eine Proteosomen-Untereinheit) und Stra-13 (ein Transkriptionsfaktor).

Waelput et al. (2000) untersuchten die Leptin-gesteuerte Genexpression in der Phaeo-chromozytomlinie PC12, einer weiteren neuronalen Zelllinie. Nach Transfektion mitder langen Variante des Leptinrezeptors wurden in dieser Linie nach 1-6 h Leptin-stimulation Metallothionein II, modulator recognition factor 1, SOCS-3, fibroblast growthfactor inducible kinase und STAT3 als immediate early genes identifiziert und nach 22-96 hPAP1, Uridindiphosphat Glucuronyltransferase, Annexin VIII und Squalene Epoxidaseals late target genes [Waelput et al., 2000]. Auch in vivo ist bereits eine SOCS-3-Induktion

84

4 Diskussion

nachgewiesen worden: Im Hypothalamus von ob/ob-Mausen fuhrte die Verabreichungvon Leptin zu einer Hochregulation von SOCS-3 mRNA [Bjørbæk et al., 1998].

Von den von Waelput et al. (2000) gefundenen Transkripten konnten nur SOCS-3 undPAP1 in ihrer Regulation durch Leptin von mir bestatigt werden. Allerdings war eineCo-Stimulation mit Forskolin, wie sie bei Waelput et al. (2000) fur die Induktion vonPAP1 notig war, in dem von mir untersuchten RINm5F-System nicht notwendig.

Auch von den von White et al. (2000) gefundenen Leptin-regulierten Transkripten wur-de keines –außer c-fos (Daten nicht gezeigt), welches von White et al. (2000) als Po-sitivkontrolle benutzt wurde– von mir in RINm5F-Zellen bestatigt. Die Gewebe, vondenen sich GT1-7-Zellen (Hypothalamus) bzw. RINm5F-Zellen (Langerhans’sche In-sel) ableiten, sind jedoch sehr unterschiedlich, so dass das unterschiedliche Spektruman induzierten Genen nicht verwundert.

In dieser Arbeit wurden eine Reihe neuer, potentiell wichtiger Zielgene gefunden, diedie Grundlage fur weiterfuhrende Untersuchungen bilden konnen. Insbesondere dieSignaltransduktions-Proteine eroffnen die Moglichkeit, die Bedeutung ihrer Leptin-induzierten Hochregulation fur die Weiterleitung zellularer Signale zu erforschen.

85

5 Zusammenfassung

Leptin ist ein im weißen Fettgewebe gebildetes Peptidhormon, das seine Wirkunghauptsachlich in spezialisierten Neuronen des Hypothalamus entfaltet. In Saugetierenermoglicht es durch Verringerung der Nahrungsaufnahme eine langfristige Kontrolledes Korpergewichtes und des Energiehaushaltes. Neben den zentralen Effekten wirktLeptin auch an peripheren Zielgeweben, wie z.B. der Langerhans’schen Insel, wo esdie Insulinsekretion hemmt. Die Bindung von Leptin an seinen Rezeptor fuhrt –wiebei den verwandten Cytokinen IL-6 und Wachstumshormon– zu einer Aktivierung desJAK/STAT-Signalweges und zu einer Phosphorylierung von STAT (Signal Transducerand Activator of Transcription)-Faktoren, die anschließend in den Zellkern wandern unddort die Transkription von spezifischen Zielgenen regulieren.

Ziel dieser Arbeit war es einerseits, in peripheren Leptin-Zielorganen die Signaltrans-duktion des Leptins mit der des Il-6 und des Wachstumshormons zu vergleichen, undandererseits, Leptin-regulierte Gene zu identifizieren. Zunachst wurden verschiede-ne Zelllinien mit Leptin behandelt und anschließend die Aktivierung von STAT3 un-tersucht. Dabei konnte ohne Transfektion mit der langen Spleißvariante des Leptinre-zeptors (LepRb) in keiner Linie eine endogene Leptin-Signaltransduktion nachgewie-sen werden. Die starkste Leptin-Stimulierbarkeit wurde bei der Insulinoma-ZelllinieRINm5F nachgewiesen, nachdem diese uber ein retrovirales Expressionssystem stabilmit der cDNA fur LepRb transfiziert wurde. Daher wurden die folgenden Versuchemit dieser Linie (RINm5F-LepRb) durchgefuhrt. Der Nachweis der STAT-Aktivierungerfolgte im Western-Blot mit phospho-spezifischen Antikorpern.

Wahrend IL-6 in RINm5F-LepRb-Zellen lediglich eine Aktivierung von STAT1 undSTAT3 induzierte, fuhrte Leptin zu einer deutlichen Aktivierung von STAT1, STAT3,STAT5 und STAT6. Außerdem konnte nach Behandlung mit Leptin eine Phosphorylie-rung des Serinrestes 727 in STAT3 nachgewiesen werden.

Zum Auffinden Leptin-regulierter Gene wurde ein cDNA-Filter-Array, auf den 27 648verschiedene cDNA-Klone aufgetragen worden waren, mit einer komplexen cDNA-Sonde aus Leptin-stimulierten bzw. unstimulierten RINm5F-LepRb-Zellen hybridisiert.

86

5 Zusammenfassung

Nach einer 16-stundigen Leptin-Stimulation wurden 35 und nach einer 1-stundigenLeptin-Stimulation 21 verschiedene, hochregulierte Transkripte gefunden. Mit diesencDNAs wurden eigene cDNA-Dot-Blots erstellt und zur Bestatigung der Ergebnisse er-neut differentiell hybridisiert. Dabei konnten trotz einer mangelnden Empfindlichkeitfur schwacher exprimierte Trankripte 8 cDNAs aus dem Screening des UniGene-Filter-Arrays als Leptin-regulierte Transkripte bestatigt werden.

Mit Northern-Blots wurde die Regulation einzelner Gene genauer charakterisiert. An-hand der Ergebnisse wurden die Gene nach ihren Expressions-Zeitverlaufen in dreiGruppen aufgeteilt: ”immediate early genes“, die nach 1 h Leptin-Stimulation ihr Maxi-mum erreichen, ”delayed early genes“, die nach 7 h ihr Maximum erreichen und schließ-lich die ”late genes“, die nach 16 h ihr Maximum erreichen. In die erste Gruppe wurdenSOCS-3 (supressor of cytokine signaling 3), CISH (cytokine-inducible SH2-containing pro-tein), Fibrinogen-β und RGS-4 (regulator of G-protein signalling 4) eingeordnet, in diezweite PAP1 (pancreatitis associated protein 1) und in die dritte tPA (tissue plasminogen ac-tivator), Ppap2a (phosphatidate phosphohydrolase type 2a), SOD-2 (superoxide dismutase 2),Lipocalin-2 und Tachykinin. Es war auffallig, dass viele der Gene fur Proteine codierten,die bei Enzundungsreaktionen sezerniert werden (Fibrinogen-β, PAP1, Lipocalin-2 undTachykinin). Desweiteren wurden Gene mit einer Funktion in der zellularen Signal-transduktion gefunden (SOCS-3, CISH, RGS-4 und Ppap2a).

Die Expression von RGS-4 und PAP1 wurde auch in Abhangigkeit von den intrazel-lularen LepRb-Tyrosinresten 985, 1077 und 1138 untersucht. Dazu wurden durch sta-bile Transfektion RINm5F-Zellen erzeugt, die mutierte Leptinrezeptoren mit nur einemintrazellularen Tyrosinrest exprimieren. Dabei stellte sich heraus, dass die Leptin-vermittelte Regulation dieser beiden Transkripte uber Tyr1138, die bekannte Bindungs-stelle fur STAT3, erfolgt.

87

Abkurzungsverzeichnis

A Adenin

aa amino acid

Abb. Abbildung

A. bidest. Aqua bidestillata

Ac Acetat

ACh Acetylcholin

Acc. No Accession Number

ADP Adenosin-5’-Diphosphat

AGRP agouti related protein

Amp Ampicillin

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosaure

ATP Adenosin-5’-triphosphat

bp Basen(paare)

BSA bovines Serumalbumin

C Cytosin

°C Grad Celsius

cAMP 3’-5’-cyclisches Adenosinmonophosphat

CART cocaine- and amphetamine-regulated transcript

CD Cluster of Differentiation

cDNA komplementare DNA

C/EBP CCAAT/Enhancer Binding Protein

Ci Curie

CISH cytokine-inducible SH2-containing protein

88


CNTF ciliary neurotropic factor

COS CV1 Origin SV40

Cpm Counts per minute

d Tage

DAG Diacylglycerol

db diabetic

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsaure

dNTP 2’-Desoxynukleosid-5’-triphosphat

DTT D,L-Dithiothreitol

E. coli Escherichia coli

ECL Enhanced Chemiluminescence

EDG endothelial differentiation gene

EDTA Ethylendiamintetraessigsaure

Eef1a1 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1

EGF Epidermal Growth Factor

EMBL European Molecular Biology Laboratory

EMSA Electrophoretic shift mobility assay

ERK Extracellular signal related kinase

EST Expressed Sequence Tag

Fa. Firma

FCS Foetal Calf Serum (Fotales Kalberserum)

G Guanin

GADD Growth Arrest- and DNA damage inducible Gene

GAP GTPase-activating protein

GAPDH Glycerinaldehyd-3’-Phosphat-Dehydrogenase

G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor

GFP Green Fluorescent Protein

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GH growth hormone (Wachstumshormon)

Gmppa GDP-mannose pyrophosphorylase A

GnRH gonadotropine releasing hormone

gp Glycoprotein

Grp58 Glucose-regulated protein

GSK Glykogen Synthase Kinase

GTP Guanosin-5’-triphosphat

h Stunde(n)

HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N’-[2-ethansulfonsaure]

IL-1β Interleukin-1 β

IL-6 Interleukin-6

IRS-1 insulin receptor substrate 1

Jak/JAK Janus-Kinase

kb Kilobasen(paare)

kDa Kilodalton

LB Nahrmedium nach Luria Bertani

LepR Leptin-Rezeptor

LIF leukemia inhibitory factor

LPA lysophosphatidic acid (Lysophosphatidylsaure)

LPS Lipopolysaccharid

LSB Laemmli Sample Buffer

M molar

mA Milliampere

MEK MAP/ERK-Kinase

min Minute(n)

MOPS 4-Morpholinpropansulfonsaure

NGAL neutrophil gelatinase-associated Lipocalin

mRNA messenger RNA

nm Nanometer

α-MSH α-melanocyte stimulating hormone

90


NP-40 Nonidet-P40

NPY Neuropeptide Y

ob obese

OPA One phor all buffer

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PAP Pancreatitis Associated Protein

PBS Phosphate Buffered Saline

Pcp4 Purkinje cell protein 4

Pcsk9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9

PCR Polymerase Chain Reaction

PEPCK Phosphoenolpyruvate carboxykinase

PKA Proteinkinase A

PKC Proteinkinase C

PLC Phospholipase C

PMSF Phenylmethansulfonylfluorid

Ppap2a phosphatidic acid phosphatase type 2A

POD Peroxidase

POMC Proopiomelanocortin

RAMP4 ribosome associated membrane protein 4

RGS-4 regulator of G-protein signaling 4

RNA Ribonukleinsaure

RNase Ribonuklease

rpm rotations per minute (Umdrehungen pro Minute)

rRNA ribosomale RNA

RT Raumtemperatur

RZPD Ressourcenzentrum - Primare Datenbank

Sc4mol sterol-C4-methyl oxidase-like

SDS Natriumdodecylsulfat

sec Sekunden

91


Ser Serin

SH src homology

SOCS Suppressor of Cytokine Signaling

SOD Superoxiddismutase

SOS son of sevenless

SREBP1c Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c

STAT Signal Transducer and Activator of Transcription

SV40 Simian Virus 40

T Thymin

Tab. Tabelle

T2bp Traf2 binding protein

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBE Tris-Borat-EDTA

TBS Tris Buffered Saline

TBST Tris Buffered Saline with Tween 20

TCA Trichloressigsaure

TE Tris-EDTA

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

TNF Tumor Nekrose Faktor

tPA tissue-type plasminogen activator

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Tyr Tyrosin

u unit(s)

U Uracil

UN Uber Nacht

UTR Untranslated Region (Nicht-translatierte Region)

UV Ultraviolett

UZF Ultrazentrifugation

V Volt

v/v volume per volume (Volumen/Volumen)

92


Viaat vesicular inhibitory amino acid transporter

Vol. Volumenanteil(e)

wt Wildtyp

w/v weight per volume (Gewicht/Volumen)

Ywhae tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase

activation protein, epsilon polypeptide

Zak sterile alpha motif and leucine zipper containing kinase AZK

ZNS Zentrales Nervensystem

93

Firmenverzeichnis

Amersham Pharmacia Biotech Freiburg

Amresco Solon, Ohio, USA

Applichem Darmstadt, Deutschland

Applied Biosystems Warrington, UK

Bachem Biochemica Heidelberg, Deutschland

Beckman Fullerton, Kalifornien, USA

Biometra Gottingen, Deutschland

Biorad Hercules, Kalifornien, USA

BMA Rockland, Maine, USA

Boehringer-Mannheim Mannheim, Deutschland

Calbiochem La Jolla, Kalifornien, USA

Cell Signaling Technology Beverly, MA, USA

Chemagen Baesweiler, Deutschland

Dynal Hamburg, Deutschland

Engelbrecht Medizin- und Labortechnik Edermunde

GenSura San Diego, Kalifornien, USA

Gibco BRL Paisley, Schottland

Greiner Labortechnik Frickenhausen, Deutschland

Hartmann Analytics Braunschweig, Deutschland

Heidolph Schwabach, Deutschland

Heraeus Hanau, Deutschland

Hoefer Scientific Instruments San Francisco, USA

ICN Biomedicals Aurora, Ohio, USA

Invitrogen Carlsbad, Kalifornien, USA

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Firmenverzeichnis

Jackson Immuno Research West Grove, Pennsylvania, USA

LKB Bromma Bromma, Schweden

MBI Fermentas Vilnius, Litauen

Merck Darmstadt, Deutschland

Molecular Dynamics Sunnyvale, Kalifornien, USA

MWG Biotech Ebersberg, Deutschland

Nalgene Rochester, New York, USA

New England Biolabs Beverley, USA

Nunc Roskilde, Danemark

PAA Laboratories Linz, Osterreich

Packard Meriden, USA

PeproTech London, UK

Pierce Biotechnology Rockford, IL, USA

Promega Madison, Wisconsin, USA

Qiagen Hilden, Deutschland

R & D Systems Minneapolis, MN, USA

Raytest Straubenhardt, Deutschland

Roche Diagnostics Basel, Schweiz

Schleicher & Schuell Dassel, Deutschland

Sigma Chemical St Louis, Missouri, USA

Thermo Hybaid Needham Heights, MA, USA

Upstate Biotechnology Lake Placid, New York, USA

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Danksagung

Herrn Prof. Dr. Walter Becker danke ich herzlich fur die Uberlassung des Themas, dieausgezeichneten Arbeitsbedingungen im Labor und die mir gewahrte Unterstutzungbei der Durchfuhrung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Fritz Kreuzaler gilt mein Dank fur die Ubernahme des Korreferates.

Vielen herzlichen Dank an alle Mitarbeiter des Instituts fur Pharmakologie der Univer-sitat Gottingen, insbesondere Frau Dr. Elke Oetjen fur ihre Unterstutzung beim Erler-nen der Isolation von pankreatischen Inseln.

Bei allen Mitarbeitern der Aachener Pharmakologie bedanke ich mich fur die angeneh-me Arbeitsatmosphare im Labor. Besonders mochte ich hier Andrea Scheepers, BarbaraManz, Birgit Feulner, Cristina Niculescu, Gregor Bahrenberg, Hanna Czajkowska,Heiner Erven, Holger Doege, Holger Knobelspies, Julia Zeidler, Karl-Heinz Breidbach,Katrin DeGraaf, Klaus-Dieter Kruger, Leona Plum, Oliver Spelten, Sandra Gendreau,Simone Bamberg-Lemper, Stephan Jacobs, Susanne Leder, Viktor Schippmann undWalter Becker nennen.

Herrn Dipl.-Ing. Yves Jager danke ich fur die Einfuhrung in LATEX 2ε und fur seine tat-kraftige Unterstutzung in Fragen der Typographie und der elektronischen Datenverar-beitung.

Ganz besonderer Dank gilt auch meinen Eltern.

Last but not least mochte ich hier meine Freunde aus dem Chor DACAPO und dema capella-Ensemble OHRENSCHMAUS dankend erwahnen.

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Lebenslauf

Personliche Daten:

Name: Paul Johann Jozef Hekerman

Geburtsdatum: 27. April 1974

Geburtsort: Eupen (Belgien)

Staatsangehorigkeit: Belgier

Familienstand: ledig

Schulausbildung:

1980-1986 Gemeindeschule Kelmis (Belgien)

1986-1992 Sekundarschule: College Patronne Eupen (Belgien)

Hochschulausbildung:

Oktober 1992 Beginn des Studiums der Biologie an der RWTH Aachen

April 1995 Vordiplom

1998-1999 Diplomarbeit am Institut fur Pharmakologie und Toxikologie

der RWTH Aachen unter Leitung von Prof. Dr. H.-G. Joost.

Thema: ”Funktionelle Charakterisierung von Proteinkinasen

der DYRK-Familie“

September 1999 Diplom

Ab Dezember 1999 Promotion am Institut fur Pharmakologie und Toxikologie

der RWTH Aachen

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Differentielle Genexpression in der Insulinoma-Zelllinie...

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