D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades

d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m

(Dr. rer. nat.)

im Fach Chemie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Biochem. M. Astrid Walter

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Prof. Stefan Hecht, Ph.D.

Gutachter: 1. Prof. Dr. Ulrich Panne

2. PD Dr. Michael G. Weller

Tag der mündlichen Prüfung: 30. Januar 2014

Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von November 2007 bis April 2011 im

Arbeitskreis von Prof. Dr. Ulrich Panne, Institut für Chemie, Humboldt-Universität

zu Berlin, durchgeführt.

“Meiner Beobachtung nach neigen die Leute dazu zurückzuschlagen, wenn man sie haut…”

Charlie Brown (Charles M. Schulz, Peanuts)

V

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung und Charakterisierung der ers-

ten Antikörper gegen Triacetontriperoxid (TATP), einem hoch empfindlichen und

unkonventionellen (nicht-kommerziellen) Initialsprengstoff. Entscheidend dafür

war die Synthese eines TATP-imitierenden Haptens, welches die typische nona-

gonale Struktur des TATP mit seinen drei Peroxid- und sechs Methylgruppen

nahezu perfekt nachbildet, aber den Vorzug einer zusätzlichen Carboxygruppe

zur kovalenten Kopplung an Proteine aufweist. Dadurch konnte das TATP-

Hapten an Rinderserumalbumin (BSA) gebunden werden, um ein immunogenes

Konjugat zu erzeugen, welches die erfolgreiche Immunisierung zweier Säuge-

tierarten, Maus und Kaninchen, ermöglichte.

Der Verlauf der In-vivo-Immunisierungen wurde durch die Analyse der Tier-

seren in regelmäßigen Abständen mittels enzymgekoppeltem Immunoassay

(ELISA) verfolgt. Die polyklonalen Antikörper beider Spezies waren ungewöhnlich

selektiv gegenüber TATP. Jedoch unterschied sich die Affinität der Antikörper der

zwei Spezies um das 5 000-fache, wobei die Kaninchenseren den Mausseren

überlegen waren. Entsprechend war auch die mit Kaninchenserum erreichbare

TATP-Nachweisgrenze von 0.01 µg L-1 deutlich besser im Vergleich zu 50 µg L-1,

die mit Mausserum erzielt wurden. Der Messbereich des TATP-ELISA mit Kanin-

chenserum deckte zudem mehr als vier Zehnerpotenzen ab, wie mittels Präzisi-

onsprofil bestimmt wurde.

Die erhaltenen TATP-Antikörper aus Kaninchen stehen damit Anwendungen in

Nachweissystemen für die sehr empfindliche Detektion von TATP zur Verfügung,

die u. a. in sicherheitsrelevanten Bereichen zum Einsatz kommen könnten. Als

erste Anwendung wurde ein TATP-ELISA realisiert, der im Rahmen dieser Arbeit

ausführlich optimiert wurde. Außerdem wurden erste Schritte zur Entwicklung

eines TATP-Schnelltests (LFA) unternommen. Weitere Biosensoren auf Grundla-

ge der neu entwickelten TATP-Antikörper sind denkbar.

VI

VII

The present work decribes the production and characterization of the first anti-

bodies against triacetone triperoxide (TATP), a highly sensitive and improvised

(non-commercial) primary explosive. Crucial to this work was the synthesis of a

TATP-related hapten that mimics almost perfectly the typical nonagonal structure

of TATP with its three peroxide and six methyl groups. Advantageously, it has an

additional carboxylic acid group, which provides a conjugation site for covalent

attachment to proteins. Thus, the TATP hapten could be linked to bovine serum

albumin (BSA) to produce an immunogenic conjugate, allowing the successful

immunization of two different mammalian species, mouse and rabbit.

The in vivo immunization progress was followed by periodically analyzing the

animals’ sera using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The polyclo-

nal antibodies of both species were remarkably selective to TATP. The affinity of

these TATP-antibodies was, however, different between the two species, with the

rabbit sera showing an affinity about 5 000-fold superior than the murine one.

Consequently, the TATP detection limit of 0.01 µg L-1 was considerably better

using the sera from rabbit in contrast to 50 µg L-1 when mouse serum was used.

The working range of the TATP-ELISA with rabbit sera covers more than four

decades, calculated from a precision profile.

The obtained TATP antibodies from rabbit are now available for applications in

highly sensitive detection systems for TATP, which could be employed, among

others, in security-relevant areas. The first application was the realization of a

TATP-ELISA, which was extensively optimized within the course of this work.

Furthermore, the first steps towards the development of a lateral flow assay

(LFA) targeting TATP were taken, making conceivable further biosensor plat-

forms based on the newly developed TATP antibodies.

VIII

IX

Diese Arbeit konnte nur durch die vielfältige Hilfe vieler Kolleginnen und Kollegen

und Freunde gelingen, wofür ich mich aufrichtig bei allen Beteiligten bedanke.

Neben viel Mühe und Zeit, die eine Promotion im Labor und am Schreibtisch er-

fordert, hatte ich viel Freude und Spaß und habe sehr gern in der Fachgruppe

Bioanalytik gearbeitet. Ein Dankeschön auch an alle nicht namentlich genannten

Kolleginnen und Kollegen für die gute Zusammenarbeit.

Mein Dank gilt an erster Stelle Dr. Michael G. Weller für das Vertrauen (beim

Überlassen des spannenden Themas) und die fachliche Unterstützung sowie die

Zeit und den immer währenden Zuspruch, die er stets für mich erübrigt hat. Ich

danke der BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung, insbesondere

Prof. Dr. Ulrich Panne, für die Möglichkeit, meine Doktorarbeit dort anzufertigen

und ihre Begutachtung zu übernehmen. Bei Dr. Rudolf J. Schneider bedanke ich

mich vor allem für die organisatorische Hilfe, insbesondere rund um die erste

Immunisierung der Mäuse, jedoch auch für jeglichen fachlichen Beistand seiner-

seits weit darüber hinaus.

Bei Karin Schultze bedanke ich mich herzlich für die sorgfältige Durchführung

und Auswertung der GC-MS-Versuche und bei Dr. Andreas Lehmann für die

Entwicklung der grundlegenden HPLC-Methode mittels HPLC-MS sowie für das

aufmerksame und kritische Hinterfragen meiner Vorhaben.

Ich danke Sabine Flemig für die MALDI-TOF-MS-Messungen, Kristin Petsch

für das Mitwirken und die Ausdauer bei den Untersuchungen der Hybridomzell-

kulturen und Nadine Scheel für die vielen Tage, die sie für mich an der HPLC

verbracht hat. Diesen dreien danke ich überdies besonders für die Erleichterung

und zuverlässige Hilfe im Laboralltag, die, neben dem Übernehmen von Bestel-

lungen von Chemikalien und Verbrauchsmaterialien, der Aufrechterhaltung der

Laborordnung und vielem mehr, auch gern mal spontan nötig und ermöglicht

wurde.

Für die Messung und Auswertung der NMR-Daten sowie für die äußerst gedul-

dige Erklärung dieser bin ich Dr. Dietmar Pfeifer sehr dankbar. Werner Kraus

danke ich für die Einkristallstrukturanalysen und der in diesem Zusammenhang

sehr angenehmen Zusammenarbeit mit Dr. Franziska Emmerling, deren Unter-

stützung bei meiner ersten Veröffentlichung unverzichtbar war. Für die Aufnahme

des hochaufgelösten Massenspektrums danke ich Dr. Michael von Löwis (Hum-

boldt-Universität zu Berlin).

Vielen Dank an meine Praktikanten und den Auszubildenden bzw. studenti-

schen Hilfskräften der Arbeitsgruppe Immunchemische Methoden, Steffen

Ramin, Susi Plötz, Anne Möller, Denise Thurmann, und André Grasnick für Ihr

Engagement und die endlosen ELISA, die ich allein nie geschafft hätte, sowie für

die wöchentliche Pufferherstellung und vielen weiteren Tätigkeiten, die sie mir

abgenommen haben.

X Danksagung

Nicht zu vergessen ist die Solidarität der Mit-Doktoranden, deren Kooperation

sich nicht nur auf den Schokoladen-Austausch begrenzte. Ich danke Dr. José

João Carvalho, Dr. Arnold Bahlmann, Dr. Charlotte Giesen, Dr. Julia Grandke,

Mandy Hecht, Steffen Ramin und Heike Pecher für eine schöne, gemeinsame

Zeit und illustre Mensa-Runden, denen auch Dr. Ana Descalzo López und

Dr. Knut Rurack angehörten. Das Mitteilen von Erfahrungen und Ratschlägen

sowie die Diskussion von Ideen und Ergebnissen sind ein entscheidender Vorteil

für die gegenseitige Motivation und das Vorankommen der Arbeit gewesen.

Ein Dankeschön geht ebenfalls an Anka Kohl für die immer schnelle IT-

Betreuung und technische Hilfe. Weiterhin danke ich den Sekretariatsdamen,

insbesondere Christin Heinrich und Juliane Schaefer, die stets gut gelaunt und

hilfsbereit für alle nicht wissenschaftlichen Probleme und Fragen ansprechbar

waren.

Meinen neuen Kollegen in der 2.3, vor allem Dr. Alexander von Oertzen danke

ich dafür, dass sie mir auf den letzten Metern zur Promotion verständnisvoll den

Rücken freigehalten haben.

Sehr dankbar bin ich außerdem allen, die diese Arbeit Korrektur gelesen ha-

ben, vor allem Dr. Michael G. Weller, meiner Mutter, Dr. Julia Grandke und ins-

besondere Dr. Malte Behrends.

Ich danke auch meinen Freunden außerhalb der BAM, darunter insbesondere

Heike, José, Julia, Nicole, Peter und Simone für ermutigende, verständnisvolle

Worte und erholsame Ablenkungsmanöver zum Teil schon seit der Studienzeit

und noch weit davor. Allen voran aber Tine, der besten Beste-Freundin, die man

sich vorstellen kann. Außerdem danke ich meinen Eltern und meiner Schwester

Annemarie, auf deren Rückhalt ich mich immer verlassen kann und die mich bei

allen Entscheidungen unterstützen, sowie meinem Großvater, der anhaltend Inte-

resse an meiner wissenschaftlichen Arbeit zeigt.

Vielen herzlichen Dank Ihnen/Euch allen!

Astrid

XI

Kurzzusammenfassung ....................................................................................... V

Abstract ............................................................................................................. VII

Danksagung ....................................................................................................... IX

Inhaltsverzeichnis ............................................................................................... XI

Abkürzungsverzeichnis und Glossar ................................................................. XIII

Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen ..................................................... XVII

1 Einleitung ........................................................................................................ 1

2 Grundlagen ..................................................................................................... 7

2.1 Triacetontriperoxid ................................................................................ 7

2.1.1 TATP – Ein Überblick ..................................................................... 7

2.1.2 TATP-Analytik .............................................................................. 14

2.2 Gewinnung von Antikörpern ................................................................ 18

2.2.1 Haptene ....................................................................................... 18

2.2.2 Antikörper .................................................................................... 19

2.2.3 Immunisierung ............................................................................. 21

2.2.4 Alternativen .................................................................................. 24

2.3 Antikörper-basierte Nachweissysteme (Immunoassays) ..................... 26

2.3.1 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA) ................................... 26

2.3.2 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA) ............................ 30

2.3.3 Biosensoren ................................................................................. 31

2.3.4 Möglichkeit des Nachweises aus der Gasphase .......................... 32

3 Experimenteller Teil ...................................................................................... 35

3.1 Materialien .......................................................................................... 35

3.1.1 Chemikalien ................................................................................. 35

3.1.2 Proteine ....................................................................................... 38

3.1.3 Puffer und Lösungen .................................................................... 39

3.1.4 Verbrauchsmaterial ...................................................................... 41

3.1.5 Geräte .......................................................................................... 43

3.1.6 Computerprogramme ................................................................... 45

3.2 Sicherheitshinweis .............................................................................. 46

3.3 Methoden ............................................................................................ 46

3.3.1 TATP-Synthese und weiterführende Untersuchungen ................. 46

3.3.2 Synthese des TATP-Haptens ....................................................... 50

XII Inhaltsverzeichnis

3.3.3 Herstellung von Immunogenen und anderen TATP-

Proteinkonjugaten ........................................................................ 51

3.3.4 Immunisierungen ......................................................................... 58

3.3.5 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA) ................................... 61

3.3.6 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA)............................. 70

4 Ergebnisse und Diskussion ........................................................................... 73

4.1 Untersuchungen zu Triacetontriperoxid (TATP) ................................... 73

4.2 TATP-Hapten ...................................................................................... 80

4.3 Immunogene und andere Proteinkonjugate ......................................... 84

4.4 Immunisierungsverlauf ........................................................................ 88

4.5 Untersuchung von Faeces ................................................................... 98

4.6 Analytische Kenndaten des TATP-ELISA .......................................... 101

4.7 BSA-Zusatz und andere Optimierungen ............................................ 114

4.8 Konformeren-ELISA .......................................................................... 126

4.9 Lateral Flow Assay (LFA) .................................................................. 128

5 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................. 135

6 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 139

Publikationen ........................................................................................................ i

Erklärungen ......................................................................................................... iii

XIII

ABTS 2,2′-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonat

ANFO Ammonium nitrate fuel oil (Gemisch aus porösem Ammoni-

umnitrat mit Diesel- oder Mineralöl)

APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Chemische Ionisa-

tion bei Atmosphärendruck)

ax axial

BALB/c Bagg Albino (spezielle Mäuse-Inzuchtlinie)

Boost Nachimmunisierung

BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

CAS Chemical Abstracts Service (Datenbankdienst, vergibt die

CAS-Nummern)

CCDC Cambridge Crystallographic Data Centre (Datenbank für Kris-

tallstruktur kleiner Moleküle)

CMC Critical micelle concentration (Kritische Mizellbildungskonzent-

ration)

COSY Correlation spectroscopy (Korrelationsspektroskopie), NMR

cycl zyklisch

D Deuterierungsgrad, NMR

DAD Diodenarraydetektor

DADP Diacetondiperoxid

DCC N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid

DMF N,N-Dimethylformamid

DMNB 2,3-Dimethyl-2,3-dinitrobutan

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)

DSC N,N′-Disuccinimidylcarbonat

EC Enzyme Commission numbers (EC-Nummern, numerisches

Klassifikationssystem für Enzyme nach der zu katalysierenden

Reaktion)

EGDN Ethylenglykoldinitrat (Nitroglykol, 1,2-Dinitroxyethan)

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (enzymgekoppelter Im-

munoassay)

EPA United States Environmental Protection Agency (Umwelt-

schutzbehörde der USA)

eq Equatorial (äquatorial)

XIV Abkürzungsverzeichnis und Glossar

ESEM Environmental scanning electron microscope (Variante des

Rasterelektronenmikroskops)

ESI Elektrospray-Ionisation

Fc oder F(c) Crystallizable (constant) fragment (kristallisierbarer Teil eines

Antikörpers, beinhaltet auch den Großteil der konstanten Do-

mänen der beiden schweren Polypeptidketten)

FT-ICR-MS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry

(Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-Massenspek-

trometrie)

GC-MS Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung

H&L Heavy & light chains (Bezeichnung der Polypeptidketten, von

denen je zwei schwere und zwei leichte die Antikörpergrund-

struktur bilden)

Hapten niedermolekulare Verbindung, < 1 500 – 5 000 Da, die ohne

Bindung an einen Trägermolekül selbst nicht immunogen wirkt

HAT Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin (im danach benannten

Selektionsmedium für Hybridomzellen enthalten)

hCG humanes Choriongonadotropin, ein Peptidhormon

HGPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Enzym im

DNA-Stoffwechsel)

HMBC Heteronuclear multiple bond coherence (heteronukleare Mehr-

fachbindungskohärenz), NMR

HME Homemade explosives (nicht-kommerzielle Explosivstoffe,

zumeist aus leicht zugänglichen Chemikalien ohne besondere

Ausrüstung oder Fachwissen herstellbar)

HMTD Hexamethylentriperoxiddiamin (1,6-Diaza-3,4,8,9,12,13-hexa-

oxabicyclo[4.4.4]tetradecan)

HMX High melting explosive/her Majesty's explosive/high-molecu-

lar-weight RDX (Oktogen, 1,3,5,7-Tetranitro-1,3,5,7-tetrazo-

can)

HPLC High performance liquid chromatography (Hochleistungsflüs-

sigkeitschromatographie)

HRP Horseradish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)

HSQC Heteronuclear single quantum coherence (heteronukleare

Einquantenkohärenz), NMR

IC50 Half maximal inhibitory concentration (mittlere inhibitorische

Konzentration)

IED Improvised explosive device (unkonventionelle Spreng- und

Brandvorrichtung)

Abkürzungsverzeichnis und Glossar XV

IgA Immunglobulin A, eine Klasse von Antikörpern, Hauptvertreter

auf Schleimhäuten, in Speichel sowie Tränen

IgG Immunglobulin G, eine Klasse von Antikörpern, die etwa 75%

aller Serumimmunglobuline ausmacht

IgM Immunglobulin M, eine Klasse von Antikörpern, die entschei-

dend bei der primären Immunantwort ist

IMS Ionen-Mobilitäts-Spektrometrie

K Kaninchen

KR Kreuzreaktivität

LFA Lateral flow assay (immunchromatographischer Schnelltest)

Lsg. Lösung

M Maus

MALDI-TOF-MS Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass

spectrometry (Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-

Flugzeitmassenspektrometrie)

MIP Molecularly imprinted polymer (molekular geprägtes Polymer)

NHS N-Hydroxysuccinimid

NIST National Institute of Standards and Technology (Bundesbe-

hörde der Vereinigten Staaten mit Sitz in Gaithersburg, MD,

USA, die u. a. eine Datenbank für Massenspektren unterhält)

NMR Nuclear magnetic resonance spectroscopy (Kernspinreso-

nanzspektroskopie)

OD Optical density (sinngemäß: Extinktion)

OVA Ovalbumin (aus Hühnereiweiß)

PBS Phosphate-buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)

PETN Pentaerythrityltetranitrat (auch Nitropenta oder Pentrit,

1,3-Bis(nitryloxy)-2,2-bis(nitryloxy-methyl)-propan)

Protein A Protein aus der Zellwand von Staphylococcus aureus, bindet

bevorzugt IgG

PTV Programmable temperature vaporizer (temperaturprogram-

mierbarer Verdampfer, Injektortyp bei der GC-MS)

q quartär

RDX Research department explosive/royal demolition explosive

(Hexogen, 1,3,5-Trinitro-1,3,5-triazin)

RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)

rpm Revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)

RPMI Roswell Park Memorial Institute (das danach benannte Zell-

kulturmedium wurde dort entwickelt)

XVI Abkürzungsverzeichnis und Glossar

RT Raumtemperatur

SAW Surface acoustic wave (akustische Oberflächenwelle)

scFv Single-chain variable fragment (monovalentes Antikörper-

fragment aus den kovalent verbundenen, variablen Domänen

einer schwere und einer leichten Polypeptidkette eines Anti-

körpers)

SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment

(Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle

Anreicherung)

SIM Selected ion monitoring (ausgewählte Massen, die bei der

GC-MS registriert werden, Einzelmassen-Registrierung)

SPME Solid phase microextraction (Festphasenmikroextraktion)

SPR Surface plasmon resonance (Oberflächenplasmonenreso-

nanz)

TATP Triacetontriperoxid (trimeres Acetonperoxid oder APEX, Ace-

tonperoxyd oder TCAP, Tricycloacetonperoxid, 3,3,6,6,9,9-

Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxonan)

TFA Trifluoroacetic acid (Trifluoressigsäure)

THF Tetrahydrofuran

Titer semiquantitatives Maß für die Konzentration einer Antikörper-

präparation (Maß für die spezifische Antikörperkonzentration)

TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin

TNT 2,4,6-Trinitrotoluol (2-Methyl-1,3,5-trinitrobenzol)

UV ultraviolette Strahlung

anti

-IgG sekundärer Antikörper: Antikörper gegen andere Antikörper

(Immunglobuline G)

XVII

Tabellen

Tabelle 2.1: Kenndaten und Eigenschaften von TNT und TATP. ......................... 8

Tabelle 2.2: Nachweisgrenzen von TATP. ......................................................... 14

Tabelle 3.1: Synthetisierte Proteinkonjugate. ..................................................... 52

Tabelle 3.2: Eingesetzte Mengen der Ausgangsstoffe zur Synthese der

Proteinkonjugate mit der NHS-Ester-Methode. ......................................... 54

Tabelle 3.3: Zeitplan der Mausimmunisierung. ................................................... 58

Tabelle 3.4: Zeitplan der Kaninchenimmunisierung. ........................................... 60

Tabelle 3.5: Herstellung der Stammlösungen zur Bestimmung der

Kreuzreaktivität. ........................................................................................ 67

Tabelle 4.1: Konzentration und Kopplungsdichte der TATP-Proteinkonjugate. .. 86

Tabelle 4.2: Affinitätsreifung von Maus 3. .......................................................... 90

Tabelle 4.3: Zahlen zur Fusion von Maus-2- und -3-Milzzellen (Schätzungen). . 92

Tabelle 4.4: Affinitätsreifung von Kaninchen 1. .................................................. 94

Tabelle 4.5: Affinitätsreifung von Kaninchen 2. .................................................. 96

Tabelle 4.6: Nachweisgrenzen des TATP-ELISA mit Kaninchen- und Maus-3-

Seren. ..................................................................................................... 101

Tabelle 4.7: Messbereich des TATP-ELISA mit Boost-11-Kaninchenseren. ..... 103

Tabelle 4.8: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber ausgewählten

Explosivstoffen. ...................................................................................... 106

Tabelle 4.9: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber Strukturanaloga,

bezogen auf TATP. ................................................................................. 107

Tabelle 4.10: Toleranz des TATP-ELISA gegenüber Lösungsmitteln und

Wasserstoffperoxid. ................................................................................ 111

Tabelle 4.11: Einfluss von Methanol in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-

ELISA. .................................................................................................... 112

Tabelle 4.12: Einfluss von BSA und Guardian-Stabilisator in HRP-Konjugat-1-

Verdünnungen auf den TATP-ELISA. ..................................................... 115

Tabelle 4.13: Einfluss der BSA-Menge in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf

den TATP-ELISA. ................................................................................... 116

Tabelle 4.14: Einfluss von BSA in Serum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen

auf den TATP-ELISA. ............................................................................. 116

Tabelle 4.15: Vergleich der hergestellten HRP-Konjugate im TATP-ELISA...... 119

Tabelle 4.16: Vergleich von frischer und konservierter Plattenbeschichtung für

den TATP-ELISA. ................................................................................... 123

XVIII Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen

Tabelle 4.17: Einfluss von Tween 20 in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-

ELISA. .................................................................................................... 125

Tabelle 4.18: Einfluss der Inkubationstemperatur des Kompetitionsschritts auf

den TATP-ELISA. ................................................................................... 126

Abbildungen

Abbildung 1.1: Kugel-Stab-Modell des TATP. ...................................................... 3

Abbildung 1.2: TATP (links) im Vergleich zu Haushaltszucker (Saccharose,

rechts). ....................................................................................................... 4

Abbildung 2.1: Reaktionsmechanismus der Darstellung von TATP und (in grau

gehalten) DADP (nach [85]). ..................................................................... 10

Abbildung 2.2: Die Konformere von TATP. ........................................................ 13

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung eines Antikörpers (IgG). .................... 19

Abbildung 2.4: Schema des direkten und indirekten TATP-ELISA. .................... 29

Abbildung 3.1: Schematische Darstellung der TATP-Synthese. ......................... 47

Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der TATP-Hapten-Synthese. ............ 51

Abbildung 3.3: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese

über die Gemischte-Anhydrid-Methode. .................................................... 53

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese

über die NHS-Ester-Methode. ................................................................... 55

Abbildung 3.5: Schematische Darstellung der HMTD-Synthese. ........................ 68

Abbildung 3.6: Schema des Aufbaus eines LFA-Teststreifens für TATP. ........... 70

Abbildung 4.1: TATP-Kristall. ............................................................................. 74

Abbildung 4.2: Kinetische Untersuchung der Umwandlung von C2- zu D3-TATP

mittels HPLC. ............................................................................................ 77

Abbildung 4.3: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens. ...................................... 80

Abbildung 4.4: Chromatogramm zur Reinigung des TATP-Haptens per HPLC

mittels binärem Gradienten aus Acetonitril/Methanol (10:1) und Wasser mit

0.1% (v/v) TFA aus dem bereits vorgereinigten Syntheseansatz. ............. 82

Abbildung 4.5: Überlagerung der röntgenkristallographisch bestimmten

Strukturen von TATP-Hapten (schwarz) und TATP (violett). ..................... 83

Abbildung 4.6: Reinigung der TATP-Proteinkonjugate über PD-10-Säulen mit

photometrischer Kontrolle der Fraktionen und anschließender

Proteinbestimmung (kleine Grafik) der vereinten Faktionen (violett) der am

Beispiel des Immunogens 3. ..................................................................... 85

Abbildung 4.7: MALDI-TOF-Massenspektren (Ausschnitte) ausgewählter TATP-

Proteinkonjugate. ...................................................................................... 87

Abbildung 4.8: Entwicklungsverlauf des Serums von Maus 3 im ELISA während

der Immunisierung. ................................................................................... 89

Verzeichnis der Tabellen und Abbildungen XIX

Abbildung 4.9: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 1 im ELISA

während der Immunisierung. .................................................................... 94

Abbildung 4.10: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 2 im ELISA

während der Immunisierung. .................................................................... 95

Abbildung 4.11: Nachweis von TATP-Antikörpern in Extraktionen von Maus-3-

Faeces. Obere Kurve: Boost-8-Serum; untere, parallel verlaufende Kurven:

Extraktionen.............................................................................................. 99

Abbildung 4.12: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit

dem Serum von Kaninchen 1 (Boost 11). ............................................... 102

Abbildung 4.13: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit

dem Serum von Kaninchen 2 (Boost 11). ............................................... 103

Abbildung 4.14: Bestimmung der Kreuzreaktivität im ELISA mit Kaninchen-2-

Boost-7-Serum (Auswahl). ...................................................................... 110

Abbildung 4.15: Einfluss von HRP und OVA auf den ELISA. ........................... 117

Abbildung 4.16: TATP-ELISA mit Kaninchenserum ohne -Kaninchen-IgG-

Beschichtung und mit Serumvorverdünnungen in unterschiedlichen

Medien. ................................................................................................... 122

Abbildung 4.17: TATP-Konformeren-ELISA im direkten Vergleich zum HPLC-

Chromatogramm. .................................................................................... 127

Abbildung 4.18: ESEM-Aufnahmen vor und nach Anwendung der LFA-

Komponenten. ........................................................................................ 129

Abbildung 4.19: LFA für TATP mit Komponenten von Whatman (A) und Millipore

(B). ......................................................................................................... 131

Abbildung 5.1: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens. .................................... 135

Abbildung 5.2: Vergleich der Kaninchen- und Mausserum-ELISA-Kurven. ...... 136

Einleitung 1

Viele große Entdeckungen und Erfindungen des Menschen haben zwei Seiten,

insbesondere die Explosivstoffe. Sie wurden zunächst zu rein militärischen Zwe-

cken entwickelt und verwendet [1] – ein Trend, der sich erst mit der Einführung

des Dynamits, einem hauptsächlich zivil genutzten Explosivstoff, änderte [2, 3].

Das 1866 von Alfred Nobel entwickelte Gemisch aus Nitroglycerin und ursprüng-

lich Kieselgur trieb den Berg- und Wegebau entscheidend voran. Durch diesen

indirekt konstruktiven Nutzen förderte es daneben die industrielle Revolution [2].

Inzwischen schützen und retten Explosivstoffe beispielsweise in Airbags und als

Medikamente, wie Nitroglycerin als Vasodilatator [4], viele Leben.

Das verbreitete Bedürfnis nach immer besseren Waffen führte ab

460-400 v. Chr. über antike Flammenwerfer und Brandmischungen, z. B. Grie-

chisches Feuer, etwa um 1300 zum ersten Explosivstoff, dem Schwarzpulver,

und letztlich auch zu den heute verwendeten Explosivstoffen [1]. Dieser Entwick-

lungsprozess ist nachvollziehbar, denn zum großen Teil basieren heutige Explo-

sivstoffe auf Verbrennungsvorgängen, die Sauerstoff, auch intramolekular, ver-

brauchen. Die Entstehung der gasförmigen Verbrennungsprodukte, hauptsäch-

lich Kohlenstoffdioxid, Wasserdampf, Kohlenstoffmonoxid, Stickstoff und Stick-

oxide, verläuft dabei jedoch schlagartig. Dadurch nehmen die entstandenen Ga-

se zunächst das Volumen des ursprünglichen Feststoffs ein, was in einem enor-

men Druckanstieg in diesem Bereich resultiert. Bei der dann folgenden Ausdeh-

nung leisten die Gase Volumenarbeit, welche den größten Teil des Zerstörungs-

potenzials dieser hochenergetischen Materialien ausmacht. Diese hohe Reakti-

onsgeschwindigkeit erhalten Explosivstoffe, weil der Sauerstoff nicht aus der um-

gebenden Luft benötigt wird, sondern größtenteils in ihrem Molekül gebunden

vorliegt. Chemisch sind konventionelle Explosivstoffe zumeist auf die Abkömm-

linge der Salpetersäure in Form von anorganischen Nitraten, die zugleich als

Dünger in großen Mengen eingesetzt werden, und von sogenannten Nitroverbin-

dungen (aliphatische und aromatische Verbindungen, Nitramine) und auf Ester

der Salpetersäure beschränkt [2, 3, 5]. Die meisten Explosivstoffe wurden zwi-

schen der Mitte des 19. bis zum Anfang des 20. Jahrhunderts entwickelt. Danach

wurden zumeist neue Formulierungen bekannter Explosivstoffe erprobt, die ver-

mehrt auch Sicherheitsaspekte berücksichtigten, in dem die Explosivstoffe Poly-

mer-gebunden und mit Plastifizierungsmitteln versetzt werden. So sind bis heute

Hexogen (RDX, 1920-1940), Oktogen (HMX, 1943), Nitropenta (PETN, 1894),

Ethylenglykoldinitrat (EGDN, 1870) und Trinitrotoluol (TNT, 1880) die meist ver-

wendeten, militärischen Explosivstoffe (in Klammer: Entwicklungsjahre) [3]. Fast

2 Einleitung

alle gewerblich genutzten Explosivstoffe sind Mischungen von Ammoniumnitrat

mit Brennstoffen (ANFO, ammonium nitrate fuel oil oder Emulsionen) [6].

Einhergehend mit dem Wettrüsten entstanden aber nicht nur neue Explosiv-

stoffe und Waffen, sondern zugleich erhielten viele Bereiche neue Impulse, viel-

leicht allen voran die Materialwissenschaften, die neue und bessere Materialien

z. B. für Panzerungen und den Schutz der Bevölkerung hervorbrachten [2]. In-

zwischen hat sich die Gefahrenlage verändert und aus Frontenkriegen sind heute

globale Bedrohungen geworden. Als Inbegriff hierfür wird oftmals der 11. Sep-

tember 2001 angesehen. Zusätzlich zu klassischer Abwehr oder Sanktionen für

einzelne Staaten oder Bündnisse steht daher heute viel mehr die Prävention zum

Schutz der Zivilbevölkerung im Vordergrund. Häufig geschieht dies durch die

Überwachung von öffentlichen Plätzen und Verkehrsmitteln, wie es sich beson-

ders an den Flughäfen weltweit bemerkbar macht. Dort wird gezielt nach explosi-

onsgefährlichem Material gesucht und das verstärkt schon seit dem Lockerbie-

Anschlag im Dezember 1988 [7, 8]. Infolgedessen wurde u. a. auch die Markie-

rung von plastifizierten Sprengstoffen mit z. B. 2,3-Dimethyl-2,3-dinitrobutan

(DMNB) [9] verpflichtend, was die Detektion der Explosivstoffe mit einem norma-

lerweise sehr geringem Dampfdruck erleichtern soll.

Selbstverständlich lassen sich derartige Vorschriften mit wenig krimineller

Energie umgehen. Zumal Terroristen bereit sind, Sprengstoffe zu benutzen, die

nicht ohne Grund nie für die zivile oder militärische Anwendung eingesetzt wur-

den, und immer neue unkonventionelle Sprengsätze (IED, improvised explosive

device) entwickeln und Verstecke finden [10-13]. Auf die Kreativität von Bomben-

bastlern zu reagieren und das Bauen von IED von vornherein zu verhindern, ist

schwierig, zumal sich entsprechende Gruppierungen global bewegen. Als Reak-

tion darauf werden vor allem Sicherheitskonzepte und –maßnahmen verbessert

und erweitert. Zwar nahmen auch die weltweiten Militärausgaben, die nach dem

Ende des Kalten Krieges Anfang der 1990er sanken, seit 2001 wieder zu [5],

aber die diffuse Angst vor Terrorismus führte daneben zu enormen Kosten bei

Transporten und Personenbeförderung durch die Umsetzung immer neuer

Sicherheitsanforderungen [14], was letztlich der eigentliche Schaden des Terrors

ist. Insbesondere kommen neue Technologien zur Detektion von Explosivstoffen,

von denen in den Medien vor allem die Körperscanner (basierend auf Terahertz-

strahlung) [15, 16] für Aufsehen sorgten, zum Einsatz. Ebenso wurden die För-

derprogramme für Forschung auf sicherheitsrelevanten Gebieten erweitert. So

stellt beispielsweise die Europäische Union allein in ihrem 7. Forschungsrah-

menprogramm insgesamt 1.4 Milliarden Euro verteilt über sieben Jahre für den

Themenbereich 10 „Sicherheitsforschung“ bereit [17].

Das Aufspüren und Identifizieren von konventionellen Explosivstoffen ist auch

in anderen Bereichen relevant, so zum Beispiel beim Umweltschutz, wo es zu-

meist um die Entsorgung von Altlasten geht [18]. Durch die freie Zugänglichkeit

von Informationen über das Internet probieren außerdem Laien Rezepturen zur

Herstellung von Explosivstoffen aus, was allein in Deutschland zu fünf bis zehn

Toten im Jahr führt [19]. Um diese häufig unkonventionellen Explosivstoffe, auch

homemade explosives (HME) genannt, ordnungsgemäß und vor allem sicher

Einleitung 3

vernichten zu können, ist hier eine vorherige Identifizierung notwendig. Einer der

populärsten HME ist Triacetontriperoxid (TATP, Abbildung 1.1), um dessen

Nachweis es in der vorliegenden Arbeit gehen soll. Es ist nicht nur aus leicht er-

hältlichen Haushaltschemikalien herstellbar, sondern seine Synthese ist zudem

sehr einfach. Bei Unachtsamkeit kann es sogar bei der Entsorgung von Abfällen

in einem Chemielabor entstehen, wie 2001 an der Universität Bonn geschehen,

wo dies zu einem Großaufgebot an Spezialeinheiten von Polizei und Feuerwehr

führte [20, 21]. Ferner wurde in Flaschen mit Diisopropylether, die über lange Zeit

lagerten und schließlich explodierten, die Bildung von TATP nachgewiesen [22].

Ein Schnelltest für TATP könnte einerseits durch regelmäßig durchgeführte Kon-

trollen der versehentlichen Entstehung größerer Mengen TATP vorbeugen und

andererseits die Arbeit der Einsatzkräfte und bei der Entsorgung erheblich er-

leichtern, wenn in Verdachtsfällen unverzüglich klar ist, ob es sich um TATP han-

delt.

Abbildung 1.1: Kugel-Stab-Modell des TATP.

TATP spielt, ebenso wie z. B. Hexamethylentriperoxiddiamin (HMTD) und andere

Peroxid-basierte Explosivstoffe, keine wirtschaftliche oder militärische Rolle (sie-

he auch Abschnitt 2.1.1). Es wurde fast ausschließlich als terroristischer Explo-

sivstoff, z. B. in IED und als Initialsprengstoff, bekannt [1, 23-25]. Offizielle Be-

richte über die Verwendung von TATP in Zusammenhang mit kriminellen Aktivitä-

ten gibt es erst seit den 1980er/Anfang der 1990er Jahre. Sie stammen aus dem

Westjordanland [26] und den USA [27, 28]. Besondere mediale Aufmerksamkeit

erlangte u. a. der als „Schuhbomber“ bezeichnete Richard Reid, der 2001 TATP

zum Zünden des PETN in seinem Schuh verwenden wollte [12, 23, 24, 29]. 2007

wurde die sogenannte „Sauerland-Gruppe“ verhaftet, deren große Mengen Was-

serstoffperoxid, mutmaßlich zur Herstellung von TATP, medienwirksam präsen-

tiert wurden [30, 31]. In Dänemark verletzte sich 2011 ein Attentäter beim Bau

einer Briefbombe mit TATP und Metallteilen selbst [32]. Vor allem sollen jedoch

die Anschläge vom 7. Juli 2005 in London, bei denen 56 Menschen starben, mit

TATP in großen Mengen begangen worden sein [23, 24, 33]. Ein Jahr später

konnten weitere Anschläge in London verhindert werden, bei welchen Flugzeuge

mittels Flüssigkeiten – über Flüssigsprengstoffe oder zur Vor-Ort-Synthese für

TATP wurde diskutiert [34, 35] – zum Absturz gebracht werden sollten. Daraufhin

wurde noch im selben Jahr das Mitführen von Flüssigkeiten im Handgepäck ein-

geschränkt [36], wie durch EU-Verordnung Nr. 185/2010 geregelt [37].

4 Einleitung

Die Beliebtheit von TATP bei seinen Verwendern ist nicht nur auf seine preis-

werte Produktion oder seine leichte Zündbarkeit zurückzuführen, sondern wohl

auch auf das Wissen um seine mit üblichen kommerziellen Verfahren schwierige

Detektion [24]. TATP ist, ähnlich Zucker, ein unauffälliger, farbloser Stoff, wie

Abbildung 1.2 veranschaulicht. Seine im Vergleich zu anderen Explosivstoffen

(siehe Tabelle 2.1) geringe Dichte machen es bei Untersuchungen durch

(Dichte-)Anomalie-Detektoren mittels Röntgenstrahlung oder Magnetresonanz

ähnlich unauffällig wie organische Materialien [29]. Durch seine Eigenschaften

als Initialsprengstoff sowie der Reib- und Schlagempfindlichkeit von TATP wird

außerdem kein Zünder benötigt [24], so dass auch Metalldetektoren versagen.

Vor allem aber das Fehlen von für Explosivstoffe typischen Nitrogruppen

(Abbildung 1.1) und seine Instabilität erweisen sich als schwierig für die gängigen

Nachweismethoden, selbst für Spürhunde [24, 38]. Am verbreitetsten sind gas-

chromatographische Methoden oder die Ionen-Mobilitäts-Spektrometrie (IMS).

Erstere werden jedoch aus Kostengründen zumeist ohne Massenspektrometrie-

Kopplung eingesetzt und sind damit für TATP ungeeignet. Letztere wird zur De-

tektion von Explosivstoffen sowie von Drogen gewöhnlich im negativen Modus

betrieben. TATP spricht jedoch nur im positiven Modus an [39].

Abbildung 1.2: TATP (links) im Vergleich zu Haushaltszucker (Saccharose, rechts).

Natürlich gibt es inzwischen zahlreiche weiterentwickelte und neue Methoden,

die einen Nachweis von TATP ermöglichen, wie Tabelle 2.2 in Abschnitt 2.1.2

zeigt. Viele sind bislang aber lediglich im Labor anwendbar oder zu aufwendig

und teuer. Gerade beim Nachweis von Explosivstoffen ist jedoch ein schneller

und zuverlässiger Vor-Ort-Nachweis angebracht, besonders im Falle von TATP,

welches aufgrund seiner Instabilität und Empfindlichkeit nicht transportiert wer-

den darf [40]. Die Anforderungen an ein derartiges Detektionssystem sind vielfäl-

tig: Neben Selektivität und Empfindlichkeit stehen eine leichte Handhabung und

wirtschaftliche Aspekte im Mittelpunkt [7]. Je nach Anwendungsgebiet muss

eventuell auch ein hoher Probendurchsatz möglich sein und dennoch gewährleis-

tet werden, dass es keine falsch-positiven oder falsch-negativen Resultate gibt.

Eine besondere Herausforderung dabei stellen Orte mit vielen Menschen dar,

insbesondere Flughäfen. Nicht nur die Berliner Flughäfen haben seit Jahren stets

steigende Passagierzahlen und zählten letztes Jahr über 25 Millionen Fluggäste

[41]. Der neue Flughafen Berlin Brandenburg BER soll einmal bis zu 45 Millionen

Passagiere abfertigen [42], d. h. es müssen derzeit mehr als ein Passagier pro

Sekunde samt Gepäck kontrolliert werden und später mehr als zwei in der glei-

chen Zeit. Hinzu kommen die unzähligen Substanzen, die in Lebensmitteln,

Einleitung 5

Kosmetika, Kleidung etc. mitgeführt werden und die keine Störfaktoren für die

Detektoren sein dürfen, wie es zuletzt bei den Körperscannern schon durch

Schweiß der Fall gewesen ist [16] oder auch bei harmlosen Produkten wie Honig

[43] beobachtet wurde.

Ziel der Arbeit

Ein neuer Ansatz zur Detektion von TATP wird in dieser Arbeit präsentiert, wobei

hier die einzigartige Struktur des TATP (Abbildung 1.1) ausgenutzt werden sollte.

Die Suche mit Hilfe von Superimposé 1.1 [44, 45] nach Verbindungen mit ähnli-

cher Struktur wie die des dreidimensionalen TATP-Moleküls (CCDC-Datenbank

HMHOCN01 [46]) ergab keine Treffer, so dass ein Nachweissystem, welches

direkt die Struktur des TATP erkennt, eine hohe Selektivität garantieren müsste.

Die Natur kennt solche Systeme, beispielsweise als Rezeptoren und Antikörper,

und erreicht dazu noch eine hohe Empfindlichkeit (durch Affinitätskonstanten von

> 1010 L mol-1 [47]). Eine bioanalytische Detektionsmethode, basierend auf Anti-

körpern, könnte also die Lösung für die Spurenanalytik von TATP sein. Zwar

wurden Immunoassays mit Antikörpern gegen die Explosivstoffe TNT [18, 48-57],

RDX [58, 59] und PETN [60, 61] mehrfach beschrieben, jedoch kam es trotz der

schon 1996 durch die Umweltschutzbehörde der USA (EPA) für TNT [62] und

RDX [63] herausgebenden Methoden bislang nicht zu einem breiten, kommerziel-

len Einsatz. Über die Herstellung und Anwendung von Antikörpern zur Detektion

von HME ist bisher nichts bekannt [64]. Zumal vor allem die Peroxid-basierten

Explosivstoffe instabil sind und daher der Ausgang einer Immunisierung unge-

wiss schien. Entscheidend für die Gewinnung von Antikörpern ist zunächst das

Hapten-Design, von dessen Güte der Nachbildung der TATP-Struktur und Stabili-

tät im immunisierten Organismus schließlich die Qualität der Antikörper bezüglich

der Erkennung des Analyten TATP abhängt. Ehe die TATP-Antikörper dann zur

Gestaltung einer geeigneten Biosensor-Plattform dienen können, müssen sie

hinsichtlich ihrer analytischen Eigenschaften, wie Nachweisgrenze und Kreuzre-

aktivität, charakterisiert werden. Das geschieht gemeinhin mittels enzymgekop-

peltem Immunoassay (ELISA), dessen Entwicklung die Grundlage für weitere

immunchemische Methoden bietet, selbst aber auch schon als Labormethode

zum Nachweis von TATP einsetzbar ist.

7

2.1 Triacetontriperoxid

2.1.1 TATP – Ein Überblick

Historisches

Der Berliner Chemiker Richard Wolffenstein entdeckte 1895 das von ihm Tri-

cycloacetonsuperoxyd genannte TATP eher zufällig und erkannte schnell sein

explosives Potenzial [65]. Dieses versuchte er sprengtechnisch zu nutzen und

meldete im selben Jahr unter der Patenschrift Nr. 84953 die Darstellung von

TATP beim Kaiserlichen Patentamt an [66], ließ das Patent aber schon zwei Jah-

re später wieder fallen [1]. 1925, also dreißig Jahre später, reichten G. Pyl und

die Sprengstoffwerke Dr. R. Nahnsen & Co. AG ein Reichspatent zur Nutzung

von TATP in Initialzündmitteln ein [67]. Im Jahr darauf wurde im Jahresbericht V

der Chemisch-Technischen Reichsanstalt erklärt, dass TATP wegen seiner

Flüchtigkeit, die bereits Wolffenstein auffiel [65], ungeeignet als Initialsprengstoff

ist [68]. Dennoch wurden die Initialsprengstoffeigenschaften des TATP weiter

untersucht [69, 70] und über seinen Einsatz als Zündbeschleuniger in Diesel-

kraftstoffen nachgedacht [71]. TATP kam jedoch aufgrund seiner Sublimationsei-

genschaften und Instabilität nie zur praktischen Verwendung im zivilen oder mili-

tärischen Bereich [1, 6, 72]. Daher unterliegen Acetonperoxide erst – seit 2002 –

durch den Feststellungsbescheid Nr. 413 dem Sprengstoffgesetz [73].

Eigenschaften

Die Gefahr, die von TATP ausgeht, ist nicht zu unterschätzen. Zum einen reagiert

es ähnlich wie Nitroglycerin (Schlagempfindlichkeit: 0.2 Nm [74], vgl. Tabelle 2.1)

äußerst empfindlich auf Schlag und bezüglich der Reibung sogar deutlich emp-

findlicher als Nitroglycerin, das bis zu einer Stiftbelastung von 360 N keine Reak-

tion zeigt [74]. Des Weiteren kann TATP jedoch auch durch statische Elektrizität,

Temperaturerhöhung oder gar spontan explodieren und selbst bei einem Feuch-

tigkeitsgehalt von bis zu 25% noch detonieren [75]. Zum anderen genügen 0.05 g

TATP, um PETN zu initiieren [72]. Seine Sprengkraft wird mit bis zu 88% der

Sprengkraft von TNT angegeben ([24, 25], das TNT-Äquivalent schwankt je nach

Autor und Methode) und liegt in Mischungen mit Ammoniumnitrat sogar leicht

darüber (107%, [76]). Das TNT-Äquivalent wird klassischerweise herangezogen,

8 Grundlagen

um Explosivstoffe bewerten zu können, indem ihre Eigenschaften im Vergleich

mit denen des TNT betrachtet werden (siehe Tabelle 2.1 für TATP).

Tabelle 2.1: Kenndaten und Eigenschaften von TNT und TATP.

TNT TATP

Sekundärsprengstoff Initialsprengstoff

Summenformel C7H5N3O6 C9H18O6

CAS-Nummer 118-96-7 17088-37-8

M 227.13 222.24

Schmelzpunkt 80.8 °C von 91 °C [72] bis 97 °C [65]

Verpuffung ab 300 °C 165°C [77]

Dichte

Kristall: 1.65 g cm-3 [78] geschmolzen: 1.47 g cm-3

1.2 g cm-3 [75, 78]

Dampfdruck

5 × 10-4 Pa (25 °C) [79]

7 Pa (25 °C) [79], Sublima-tion: 68,6 % in 14 Tagen [75], mit Wasserdampf oder Ether flüchtig [77]

Löslichkeit in Wasser

100.5 mg L-1 (25 °C, pH 6.8)

[80] 177 mg L-1 (22 °C) [diese Arbeit]

Gut löslich in

Benzol, Toluol, Aceton, Chloroform [78]

Aceton, Ether, Benzol [65], Tetrachlormethan, Pyridin, Chloroform [75], Ethylacetat, Hexan [77], Toluol [81]

Schwer löslich in

Ethanol, Tetrachlormethan [78]

Methanol, Isopropanol, Gly-cerol [75], Ethanol, Eisessig [77]

Sauerstoffbilanz -73.9% -151.2% [75]

Stickstoffgehalt 18.50% 0.00%

Bleiblockausbauchung 300 cm3/10 g 250 cm3/10 g [72]

Schlagempfindlichkeit 15 Nm 0.3 Nm [72]

Reibempfindlichkeit

keine Reaktion bis 353 N Stiftbelastung

Explosion bei 0.1 N Stiftbe-lastung

Detonationsgeschwin-digkeit

6900 m s-1 ( = 1.6 g cm-3)

5290 m s-1 ( = 1.2 g cm-3) [82]

Kristalle

farblos bis gelb, orthorhom-bisch oder monoklin [78]

farblos, monoklin [77]

Sonstiges

toxisch; krebserzeugendes Potenzial [83]

würziger Geruch [65]

Quelle, soweit nicht anders vermerkt: [84]

Grundlagen 9

Darstellung

Die Synthese von TATP, das auch als trimeres Acetonperoxid, APEX, Aceton-

peroxyd, TCAP, Tricycloacetonperoxid, 3,3,6,6,9,9-Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-

hexaoxonan oder 3,3,6,6,9,9-Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxacyclononan be-

zeichnet wird, ist sehr einfach aus Aceton, Wasserstoffperoxid und etwas Säure

mit ca. 65% Ausbeute [46] durchzuführen, wie der Reaktionsmechanismus in

Abbildung 2.1 veranschaulicht (schematische Darstellung: Abbildung 3.1). Wolf-

fenstein [65] beobachtete, dass die Verwendung von reinem Aceton und destil-

liertem Wasserstoffperoxid nicht zur Bildung von TATP-Kristallen führte, jedoch

nach mehrtägigem bis vierwöchigem Stehen einer Mischung aus Aceton und 10-

bis 50%iger Wasserstoffperoxidlösung bei Raumtemperatur TATP auch ohne

Säurezugabe in sehr geringer Menge kristallisierte. Offensichtlich sind die durch

die Autoprotolyse des Wassers entstehenden Protonen als Katalysator für die

Reaktion ausreichend. Bei Zugabe von Phosphorsäure zu den reinen Ausgangs-

stoffen konnte Wolffenstein [65] die Reaktion zu TATP sofort sehen.

10 Grundlagen

Abbildung 2.1: Reaktionsmechanismus der Darstellung von TATP und (in grau gehalten) DADP

(nach [85]).

Baeyer und Villiger [86, 87] fanden bei ihren Untersuchungen zur Einwirkung des

Caro’schen Reagenz auf Aceton ein dimeres Acetonperoxid (DADP). Sie stellten

weiterhin fest, dass bei der Zugabe von konzentrierten Säuren zu 50%iger Was-

serstoffperoxidlösung und Aceton ein breiiger Niederschlag entstand, der sich bei

der Verwendung von Salzsäure als TATP erwies und bei der Verwendung von

Schwefelsäure als eine Mischung aus dimeren und trimeren Acetonperoxiden.

Einen etwas anderen Weg TATP darzustellen, zeigten Criegee und Metz [88] auf.

Sie ließen ihr neu entdecktes, nicht-zyklisches Triperoxid (1,1‘-Bishydroperoxy-

diisopropylperoxyd) in Aceton mit wasserfreiem Kupfersulfat 14 Tage inkubieren

und fällten TATP anschließend durch die Zugabe von Wasser aus, wobei sie eine

Ausbeute von 80% erzielten. Die Studien über organische Peroxide von Milas

und Golubovic [89] ergaben, dass sich ohne die Anwesenheit einer Säure aus

Aceton und 50%iger Wasserstoffperoxidlösung innerhalb von vier Stunden bei

0 °C oder nach 24 Stunden bei Raumtemperatur (also deutlich kürzere Inkubati-

Grundlagen 11

onszeiten als bei Wolffenstein [65]) keine zyklischen Peroxide bilden, sondern

überwiegend ein bis dahin unbekanntes Diperoxid (2,2-Dihydroperoxypropan)

und in geringer Menge auch das Triperoxid, das ebenfalls von Criegee und Metz

beobachteten [88]. Wird einem Reaktionsansatz aus Aceton und 50%iger Was-

serstoffperoxidlösung jedoch konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, so entste-

hen vier verschiedene Peroxide, darunter auch die beiden bereits genannten (ein

weiteres bleibt unidentifiziert), aber vor allem – zu 90% – TATP.

Neuere Untersuchungen beschäftigten sich mit dem Einfluss der als Katalysa-

tor eingesetzten Säure auf die TATP-Synthese. So analysierten Matyas und

Pachman [90] die Abhängigkeit von Art und Konzentration der verwendeten Säu-

re auf die thermische Stabilität des ungereinigten TATP. Mit Salz- oder Salpeter-

säure beginnt die Zersetzung des Rohprodukts oberhalb von 145 °C, unabhängig

von der eingesetzten Menge. Wird hingegen Schwefel- oder Perchlorsäure bei

der Synthese benutzt, so bewirken dabei höhere Säurekonzentrationen, dass

TATP bereits während des Schmelzens oder schon davor zerfällt. Ab einem mo-

laren Verhältnis von Säure zu Aceton von 1 × 10-2 oder darunter entsteht ein

Produkt, welches die gleiche Stabilität wie mit den beiden ersten Säuren herge-

stelltes oder umkristallisiertes TATP aufweist. Einige Autoren (z. B. [81] und [91])

erwähnen, dass beim Einsatz von Schwefelsäure als Katalysator DADP als Ne-

benprodukt gebildet wird, dessen Entstehung bei der Verwendung von Salzsäure

ausbleibt, wie auch schon von Baeyer und Villiger [87] beschrieben. In vielen

Fällen, selbst bei strukturanalytischen Untersuchungen ohne Umkristallisation

[46], wurde dennoch Schwefelsäure als Katalysator bei der TATP-Synthese ein-

gesetzt, ohne dass die Autoren von der Entstehung des DADP berichteten. Sel-

tener wurde tetrameres Acetonperoxid beobachtet [91], welches nach Jiang et al.

[92] bei der Verwendung von Zinnchloriden (SnCl4·5H2O oder SnCl2·2H2O) ent-

steht. Peña et al. [93] hingegen erkannten einen Einfluss der Temperatur auf die

Bildung von Dimer und Tetramer, welche erst oberhalb von 10 °C neben dem

trimeren Acetonperoxid entstehen. Auch die Verwendung zu hoch konzertierter

Säuren hat ihrer Beobachtung nach diesen Effekt, wobei hier ebenfalls die Wär-

meentwicklung beim Mischen eine Rolle spielen könnte. Wird die Temperatur des

Syntheseansatzes unter 5 °C gehalten, so ist TATP das einzige Produkt.

Zersetzung/Zerfall

Beim Erwärmen oder längerer Einwirkung mit verdünnter Schwefelsäure zerfällt

TATP quantitativ wieder in seine Ausgangsstoffe Aceton und Wasserstoffperoxid

[65, 77], was daher auch eine gute Methode zur Entsorgung von kleineren Men-

gen TATP ist. Die Behandlung mit anderen Säuren wie Essig- (1 M) [94] oder

Salzsäure (37%) [95, 96] führt ebenfalls zum Zerfall von TATP. Armitt [96] schlug

für die Schwefelsäure- (35%) sowie die Salzsäure-katalysierte Zersetzung von

TATP außerdem zwei mögliche Mechanismen vor. Im Falle der Schwefelsäure

kann dabei in einem Zwischenschritt auch vorübergehende DADP gebildet wer-

den, ehe Aceton und Wasserstoffperoxid entstehen. Bei der Verwendung von

Salzsäure könnten zusätzlich chlorierte Aceton-Derivate resultieren. Allerdings ist

der Einsatz von Säuren, insbesondere konzentrierten, nur für Mengen von bis zu

12 Grundlagen

etwa einem Gramm TATP ratsam, da die Reaktion von Oxley et al. [97] als

exotherm eingeschätzt wurde und in größerem Maßstab zur Detonation des

TATP führen kann. Stattdessen zeigten sie, dass der Einsatz von ZnSO4 und

CuCl2 in Kombination mit Zink oder Kupfer und weiteren Salzen eine Vernichtung

von TATP-Lösungen bei Raumtemperatur innerhalb von 24 Stunden ermöglicht,

wobei ein Ansäuern der Lösung diesen Prozess beschleunigt. Ähnliches wurde

bereits zuvor von Bellamy [81] mit SnCl2·2H2O versucht, jedoch musste hier zu-

sätzlich die TATP-haltige Lösung (u. a. mit Toluol) auf 65 °C erwärmt werden.

Eine weitere, wenn auch weniger effiziente Möglichkeit, TATP zu zersetzen, ist

die UV-Bestrahlung [98-101]. Auch hierbei entsteht Wasserstoffperoxid, wenn-

gleich keine Angaben gemacht wurden, wie schnell oder vollständig die Reaktion

abläuft.

Andere Methoden wie das Abbrennen von TATP (gemeinsam mit brennbaren

Lösungsmitteln) sind zwar effizienter und schneller bei seiner Vernichtung, ber-

gen aber große Gefahren, da es zu unkalkulierbaren Detonationen kommt [81].

Auch eine vorsichtige thermische Zersetzung hat sich nicht durchgesetzt, da hier

selbst nach 12 Tagen unter Rückfluss in Toluol (111 °C) noch TATP-Reste vor-

handen waren [81]. Auch Oxley et al. [102] untersuchten die thermische Zerset-

zung von TATP bei 150-230 °C unter verschiedenen Bedingungen, wobei das

Hauptzersetzungsprodukt immer Aceton war. Während in protischen Lösungsmit-

teln und in der kondensierten Phase fast ausschließlich Aceton freigesetzt wurde,

entstanden in der Gasphase daneben Essigsäuremethylester bzw. bei höheren

Temperaturen Kohlenstoffdioxid. In geringem Umfang wurde auch Essigsäure

sowie Verbindungen aus der Reaktion mit Methylradikalen beobachtet. Explizit

wurde darauf hingewiesen, dass während des Zerfalls von TATP kein DADP ge-

funden wurde. Bei dieser Betrachtung nahmen die Autoren stets an, dass der

Zerfall von TATP durch die homolytische Spaltung einer der Peroxidgruppen be-

ginnt.

Dubnikova et al. [46] untersuchten den wohl interessantesten Aspekt der Zer-

setzung von TATP – seine Explosion. Sie postulierten, dass die Explosion von

TATP eher eine Zerfallsreaktion als ein Oxidationsvorgang ist und nicht wie bei

anderen Explosivstoffen ein Großteil der Energie durch exotherme Reaktionen

freigesetzt wird. Dabei bilden sich aus einem TATP-Molekül vier gasförmige Mo-

leküle, ein Ozon- und drei Aceton-Moleküle, was mit einer enormen Volumen-

ausdehnung einhergeht und die Zunahme der Entropie des gasförmigen gegen-

über dem festen Zustand bewirkt.

Struktur

TATP besteht aus drei ringförmig angeordneten Peroxidgruppen, welche jeweils

durch ein Kohlenstoffatom voneinander getrennt sind. Zusammen bilden sie ein

Nonagon. An den drei ringständigen Kohlenstoffatomen sind jeweils zwei Methyl-

gruppen lokalisiert (Abbildung 1.1 und Abbildung 2.2). Diese Struktur wurde be-

reits von Wolffenstein 1895 gezeichnet [65]. Die erste Kristallstrukturanalyse er-

folgte 1969 durch Groth [103] (CCDC-Datenbank: HMHOCN) und wurde 2005

Grundlagen 13

durch Dubnikova et al. [46] (CCDC-Datenbank: HMHOCN01 oder CCDC-

241973) bestätigt. Den monoklinen Kristallen wurde die Raumgruppe P21/c zu-

geordnet und sie enthalten vier Moleküle je Elementarzelle ohne Einschluss von

Lösungsmittel. Die Konformation des TATP-Moleküls, welches die Symmetrie

eines regelmäßigen Dreiecks (D3) aufweist, wurde als Twist-Wannen-Sessel be-

schrieben (Abbildung 2.2).

Das Vorhandensein eines weiteren, bei Raumtemperatur stabilen TATP-

Konformers wurde erst 2002 bei Widmer et al. [104] deutlich. Dort wurden zu-

nächst noch unbekannterweise mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

(HPLC) zwei TATP-Konformere voneinander getrennt. Die im Anschluss an die

Fraktionierung erfolgte Untersuchung per Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)

erbrachte nur wenig Aufschluss über die Identität des zweiten Signals im HPLC-

Chromatogramm einer reinen TATP-Lösungen, da die Trennung scheinbar nicht

vollständig war. Weitere HPLC-Untersuchungen zeigten den Grund: Zwischen

dem ersten, größeren Signal und dem nachfolgenden, kleineren stellte sich trotz

der Trennung immer wieder ein Verhältnis von 15:1 ein. Die Autoren schlossen

daraus, dass es sich um ein weiteres Konformer des TATP handeln muss, zumal

ein Jahr zuvor halbempirische Betrachtungen von Yavari et al. [105] auf die Exis-

tenz eines Twist-Sessel-Sessel-Konformers von TATP (Abbildung 2.2) hinwie-

sen. Dieses besitzt eine C2-Symmetrie, die einer Punktspiegelung entspricht, und

eine nach den Berechnungen in [105] um 3.4 kJ mol-1 höhere Bildungsenthalpie

als das D3-Konformer.

Abbildung 2.2: Die Konformere von TATP.

14 Grundlagen

Mit den energetischen Unterschieden zwischen D3- und C2-TATP beschäftigten

sich auch Denekamp et al. [106]. Ihre theoretisch ermittelte Energiedifferenz von

1.85 kcal mol-1 (7.7 kJ mol-1) ist gut doppelt so hoch wie die von Yavari et al.

[105] und zeigt ebenfalls, dass das D3-TATP mit dem geringeren Energiegehalt

das stabilere Konformer von beiden ist. Außerdem postulierten Denekamp et al.

[106] einen eventuellen Flip-Flop-Mechanismus für die Umwandlung der TATP-

Konformere ineinander und berechneten die Aktivierungsenergie zum Überwin-

den der Umwandlungsbarriere in der Gasphase auf E = 26.3 kcal mol-1

(110 kJ mol-1).

2.1.2 TATP-Analytik

Die Identifizierung und Quantifizierung von Explosivstoffen kann über jede nur

denkbare Methode erfolgen, von klassischen chromatographischen und massen-

spektrometrischen über optische, elektrochemische sowie nanotechnologische

zu bioanalytischen und weiteren Anwendungen. Übersichtsartikel und Bücher

[107-114] darüber sind in großer Zahl erschienen und dennoch gibt es weiterhin

Bedarf für Messsysteme, die insbesondere den Ansprüchen der Sicherheits-

überwachung bezüglich Schnelligkeit, Zuverlässigkeit sowie der möglichst berüh-

rungslosen Detektion von Explosivstoffen genügen [115] und die auch unkonven-

tionelle Explosivstoffe mit einschließen [116]. Viele Entwicklungen beziehen sich

zunächst auf TNT, das häufig auch als Vergleichsgröße für andere Explosivstoffe

(Abschnitt 2.1.1) herangezogen und dementsprechend in späteren Kapiteln stets

als Beispiel dienen wird.

Einleitend wurden bereits die Schwierigkeiten erwähnt, die die üblichen, z. B.

auf Nitrogruppen ausgerichteten, Detektionsverfahren für Explosivstoffe mit

TATP haben [114]. In den letzten zehn Jahren hat jedoch die Anzahl der Metho-

den zum Nachweis von TATP in erheblichem Maße zugenommen, wie die Über-

sichtsartikel von Schulte-Ladbeck et al. [117] und Burks und Hage [118, 119]

zeigen. Auch das National Institute of Standards and Technology (NIST) brachte

erst vor Kurzem ein Referenzmaterial SRM 2907 Trace Terrorist Explosives Si-

mulants zur Prüfung von Methoden zur Spurenanalyse von TATP heraus [120].

Nachstehende Tabelle 2.2 ist in Anlehnung an die von Burks und Hage [118,

119] erstellte Auflistung von Nachweisverfahren für die Peroxid-basierten Explo-

sivstoffe HMTD und TATP entstanden und soll als Erweiterung (ohne Anspruch

auf Vollständigkeit) für TATP angesehen werden.

Tabelle 2.2: Nachweisgrenzen von TATP.

Nachweisgrenze Methode Quelle

10 µg L-1

GC-MS, Elektronenstoßionisation/Ionenfalle, nur m/z 43

[121]

670 pg

GC-MS, Multiphotonenionisation (Femtosekunden-laser)/Flugzeit, m/z 15, 43 und 222

[122]

Grundlagen 15

Nachweisgrenze Methode Quelle

< 1 ng

Headspace-GC-MS Elektronenstoßionisati-on/Ionenfalle, m/z 43, 59, 75 und 221

[123]

0.05 ng

GC-MS, Elektronenstoßionisation/Quadrupol, m/z 43, 59, 75

[124]

6.4 ng

GC-MS mit SPME, Elektronenstoßionisati-on/Ionenfalle, m/z 20-250

[125]

62.5 ng (12.5 mg L-1)

MS, ESI, positiver Modus mit Na+/Quadrupol, m/z 50-800,

[126]

1-50 ng von Ober-flächen

MS, Desorptions-Elektrospray-Ionisation, positiver Modus mit Na+/Quadrupol, m/z 45

[127]

~ 70 pg (30 ppb)

MS, APCI, positiver Modus mit NH4+/Flugzeit,

m/z 240 [128]

222 mg L-1 HPLC mit Fourier-Transform-Infrarot-Detektor [129]

0.8 ng

LC-MS/MS, APCI, positiver Modus mit NH4

+/Quadrupol, m/z 240, 240/223, 240/74 [130]

100 µg L-1

LC-MS, APCI, positiver Modus mit NH4+/Quadrupol,

m/z 89 [104]

wenige mg

Headspace-IMS, positiver Modus, mit planarer SPME

[131]

wenige µg L-1 Luftg

Tragbares Aspirations-IMS, positiver und negativer Modus, Anreicherung: 3.5 min mit 4 L min-1

[132]

187 mg L-1 IMS, positiver Modus [133]

< 100 µgs

Infrarot-Laser-photoakustische Spektroskopie, CO2-Laser, 9-11 µm

[134, 135]

0.5 mg L-1

Differentielle Absorption-Lidar-System, CO2-Laser,

online = 10.632 µm, offline = 10.220 µm

[136]

10 mgs

Stand-off-Raman-Spektroskopie, Distanz: 7 m, Ar-Laser

[137]

~ 0.02 mg L-1g

Oberflächenverstärkte Raman-Streuung, Diodenla-ser, (Signal bei 553 cm-1)

[138]

31 ppbg

Quarzkristall-Mikrowaage, Beschichtung: Dendri-mere aus Polyphenylenen

[139]

ppb-Bereichg Chemiresistor, ZnO-beschichtete Silica-Nanofedern [140, 141]

(~105 ppbv, <5 mg)g

Elektrochemischer Gassensor, Zn+ auf TiO2-Nanoröhren

[142]

2.9 ppb (0.5 mg)g

Elektrochemischer Gassensor, In2O3-Nanopartikel (bei 270 °C)

[143]

ppm-Bereichg

Thermodynamischer Gassensor, Mikroheizung mit Nickeloberfläche beschichtet mit Metalloxiden

[144]

100 ppbg

Elektrochemischer Gassensor, Halbleiter mit Mo-nolayer aus organischen Verbindungen

[145]

1.9 mg L-1 Chronoamperometrie mit Br - (bei 55 °C) [146]

Angaben, wenn möglich in g L-1

umgerechnet g

aus Gasphase s Feststoff

16 Grundlagen

Die Tabelle 2.2 zeigt viele interessante, klassische und neuere, Möglichkeiten zur

TATP-Detektion, deren Nachweisgrenzen zum Teil erheblich variieren. Massen-

spektrometrische Methoden sind mit Abstand am verbreitetsten. Mit ihnen wer-

den auch die besten Nachweisgrenzen erreicht. Bei vielen anderen Verfahren,

insbesondere jenen, die TATP über Metalloxidoberflächen erkennen, fehlen An-

gaben über die Selektivität dieser Beschichtungen. Die Methoden mit den

schlechtesten Nachweisgrenzen haben aber einen Vorteil gegenüber den Mas-

senspektrometern: Sie sind mobil und teilweise sind sie außerdem schneller.

Erwähnenswert sind in diesem Zusammenhang auch Entwicklungen im Bereich

der Sicherheitsüberwachung, die z. B. die hohe Empfindlichkeit der APCI-MS in

einer Durchlaufschleuse mit Ansaugsystem zur Probenanreicherung und den

hohen Dampfdruck von TATP ausnutzen [147, 148]. Ein Feldversuch zeigte,

dass in 2 bis 3 s TATP auf Personen oder Gepäckstücken (1200 je Stunde)

nachgewiesen werden kann. Allerdings gab es zum einen mit Aceton falsch-

positive Signale und zum anderen eignet sich dieses Verfahren kaum für andere

Explosivstoffe, also nicht für Substanzen mit (sehr) geringem Dampfdruck. Dane-

ben gelang es Chen et al. [149] mittels neutraler Desorption unter Verwendung

von Stickstoff als Trägergas zur Probenahme und angeschlossener extraktiver

ESI-MS/MS die Analyten TNT, RDX, HMX, Nitroglycerin sowie TATP direkt von

der Haut ohne weitere Probenaufbereitung im Bereich ab 0.5 bis 10 pg nachzu-

weisen.

Nicht wenige beschriebene Verfahren weisen TATP indirekt über Wasserstoff-

peroxid nach, wie die Beispiele im folgenden Absatz ausführlich zeigen. Diese

Verfahren nutzten dabei aus, dass TATP durch Einwirkung von Säure und UV-

Strahlung in seine Ausgangsstoffe zerfällt (Abschnitt 2.1.1). Obwohl diese Me-

thoden zum Teil gute Empfindlichkeiten erzielen, so bleibt doch zu bedenken,

dass sie letztendlich nicht zwischen TATP und Wasserstoffperoxid unterscheiden

können und damit ein hohes Risiko für falsch-positive Signale gegeben ist, vor

allem da Wasserstoffperoxid in viele Alltagsprodukten (Waschmitteln, Kosmetika,

Desinfektionsmitteln) vorkommen kann.

Mit dem Einmal-Schnelltest ACRO-P.E.T. [24, 150] ließen sich geringe Mengen

TATP (1 bis 2 mg, keine Nachweisgrenzen angegeben) in wenigen Minuten

nachweisen, wobei nach dem Kontakt mit starken Säuren H2O2 entstand, wel-

ches nach der Neutralisierung der Probenlösung eine enzymkatalysierte Farbre-

aktion unter Verwendung des chromogenen Substrats 2,2′-Azino-di(3-ethylbenz-

thiazolin)-6-sulfonat (ABTS) auslöste. Verwendet wurde dazu die aus immun-

chemischen Methoden (wie ELISA, Abschnitt 2.3.1) bekannte und weitverbreitete

Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase). Sehr ähnliche Prinzipien

wurden von Schulte-Ladbeck et al. [98] und Girotti et al. [95] vorgestellt. Erstere

benutzten ebenfalls ABTS und HRP um die Entstehung von H2O2 zu detektieren,

jedoch nach UV-Bestrahlung des TATP, und konnten 8 µmol L-1 (2 mg L-1) TATP

noch nachweisen. Mit dem Subtrat 3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure konnte

durch fluorimetrische Messung die Nachweisgrenze auf 0.8 µmol L-1 (0.2 mg L-1)

verbessert werden. Girotti et al. [95] verwendeten als Substrat Luminol und konn-

ten durch die Detektion der eintretenden Chemilumineszenz 40 µg L-1 TATP im

Grundlagen 17

Mikrotiterplattenformat bzw. 50 µg L-1 TATP mit einem tragbaren Detektor nach-

weisen. Ebenfalls nach der Behandlung einer TATP-Probe mit Säure wurde aus

einem fluorogenen Substrat durch oxidative Wirkung des freigesetzten H2O2 ein

Fluoreszenzsignal gemessen und eine Nachweisgrenze von unter 10 nmol L-1

(2 µg L-1) sowohl für H2O2 als auch für TATP angegeben [94]. Mit einer Zerset-

zung des TATP durch UV-Licht gelang die Detektion der Fluoreszenz bis in den

Bereich von 100 nmol L-1 (22 µg L-1) [100]. Die Oxidation eines Farbstoffs durch

H2O2 nach dem Zerfall von TATP wurde auch von Lin und Suslick [151] ausge-

nutzt. Ihr colorimetrischer Sensor detektierte TATP semiquantitativ im Bereich

von 50 bis 10 000 ppb aus der Gasphase, wobei die untere Grenze etwa 0.02%

des Sättigungsdampfdrucks entspricht. Mit elektrochemischen Methoden, z. B.

über ein Redoxsystem aus Fe(II/III)-Ethylendiamintetraacetat und H2O2, konnte

eine Nachweisgrenze von 0.89 µmol L-1 (0.2 mg L-1) TATP [152] oder mit Ei-

sen(III)-hexacyanoferrat(II/III) (Preußisch oder Berliner Blau) eine Nachweisgren-

ze von 55 nmol L-1 (12 µg L-1) TATP [153] erreicht werden. Fast identisch ist eine

Methode, bei der TATP photochemisch zersetzt wurde [154], wobei unter Ver-

wendung einer UV-Lampe für 5 min ein TATP-Nachweis bis 0.25 µmol L-1

(0.1 mg L-1) und mit der Bestrahlung durch einen Laser für 15 s bis 50 nmol L-1

(11 µg L-1) möglich war. Auch gekoppelt an eine HPLC kann die Behandlung von

TATP mit UV-Strahlung zur anschließenden elektrochemischen Detektion ge-

nutzt werden [101]. Mit diesem Verfahren, das später zum Nachweis von TATP

aus der Luft diente, wurde eine Nachweisgrenze von 3 µmol L-1 (1 mg L-1) TATP

erreicht. Damit konnten nach 20-minütiger Anreicherung von TATP aus der Gas-

phase mittels Waschflaschen 550 ng TATP pro Liter Luft ermittelt werden, wobei

jedoch durch den enzymatischen Nachweis des Degradationsprodukts H2O2 (mit

HRP mit ABTS als Substrat) bis 190 ng TATP pro Liter Luft nachgewiesen wer-

den konnten [99]. Eine ausgefallene, wenngleich nicht sehr empfindliche Detekti-

onsmethode für TATP wurde von Chen et al. [155] beschrieben. Sie gaben TATP

in ein Gemisch aus Cysteinmethylester und p-Toluolsulfonsäure, in dem das

durch die Säure freiwerdende H2O2 als Oxidationsmittel die Ausbildung von

Disulfidbrücken bewirkte. Das Signal für die Anwesenheit von 1.5 bis 20 mg

TATP ist die Beobachtung des Gelierens des Gemischs (0.4 bis 4 mL) innerhalb

von 2 bis 30 min.

Zur viel in den Medien diskutierten Terahertzspektroskopie als zerstörungsfreie

und berührungslose Methode zur Detektion von Explosivstoffen [15, 16] ist keine

Aussage zur Anwendbarkeit der nicht-spurenanalytischen Methode für TATP

unter realen Bedingungen zu treffen. Es wurde nur ein einziges Spektrum von

0.3 bis 18 THz mit ersten Absorptionssignalen ab ca. 4 THz veröffentlicht [156],

ohne jegliche Vergleichsspektren anderer Substanzen, die die TATP-Signale

überdecken könnten. Der Vergleich mit Spektren anderer Explosivstoffe (TNT,

RDX, HMX und PETN) ist kaum möglich, da deren Terahertzspektren nur von 0.2

bis maximal 6 THz gemessen wurden [157, 158]. Sie zeigten jedoch in diesem

unteren Bereich jeweils typische Muster, was bei dem TATP-Spektrum in diesem

Bereich durch die ungünstige Skalierung nicht erkennbar war.

18 Grundlagen

Immunchemische Methoden zum Nachweis von TATP wurden bisher nicht be-

schrieben, da keine entsprechenden Antikörper existierten [64]. Es gibt jedoch

ein „biologisches System“, das TATP aus der Gasphase anzeigen kann: Honig-

bienen, die mittels Anreiz durch Zuckerwasser auf mit TATP angereicherte Luft

trainiert wurden [159]. Sicherlich (und hoffentlich) wird sich dieses Verfahren

nicht durchsetzen, da die immobilisierten Tiere nach ca. 48 h sterben. Dennoch

ist dies ein Beispiel für die enormen Fähigkeiten, die die Natur zu bieten hat. Ne-

ben Antiköpern werden auch Enzyme (siehe vorheriger Absatz: HRP) und sogar

ganze Organismen, die gentechnisch verändert wurden, wie Bakterien, Algen,

Hefen sowie Pflanzen (Arabidopsis thaliana) zur Detektion von Explosivstoffen

genutzt [160, 161]. Ratten und Schweine werden zum Aufspüren von Landminen

eingesetzt, deren olfaktorisches System noch empfindlicher als das von Hunden

ist [161]. Doch vor allem Spürhunde spielen bei Sicherheitskontrollen nach wie

vor eine große Rolle. Wenngleich ihre Ausbildung zeit- und kostenintensiv und

mit ihnen keine quantitative Aussage möglich ist, so fehlt es noch immer an bes-

seren Gasphasen-Sensoren, die sie ablösen könnten [24, 108, 109, 161].

2.2 Gewinnung von Antikörpern

2.2.1 Haptene

Niedermolekulare Verbindungen mit einer Molekülmasse von unter 1 500 Da

[162] - 5 000 Da [163], wie TATP mit 222 Da, sind zu klein, um selbst immunogen

zu wirken. Sie müssen als Haptene an Trägermoleküle gekoppelt werden, um

eine Immunreaktion auszulösen. Diese Carrier sind meist Proteine (Albumine wie

z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin (OVA) oder Schlitzschnecken-

Hämocyanin). Es können aber auch Polyaminosäuren, Polysaccharide (wie z. B.

Agarose oder Sepharose), Mikropartikel oder Membranen sein [164].

Da TATP keine geeigneten funktionellen Gruppen zur Kopplung besitzt, muss

ein kopplungsfähiges, strukturelles Analogon gefunden oder synthetisiert werden.

Üblicherweise werden Carboxygruppen bevorzugt, da sie schonende Methoden

unter milden Bedingungen – ohne extreme Temperaturen, pH-Werte oder hohe

Lösungsmittelkonzentrationen – für die kovalente Kopplung des Haptens an Pro-

teine gestatten [47]. Verbreitet sind dazu Methoden über NHS (N-Hydroxy-

succinimid)-Ester [165, 166] sowie über gemischte Anhydride [167, 168].

Entscheidend für die spätere Antikörperspezifität ist, dass die Struktur des

Haptens mit der des Analyten die größtmögliche Übereinstimmung in Größe,

Geometrie und Ladung aufweist [169, 170]. Daneben gibt es weitere Empfehlun-

gen, die beim Hapten-Design nicht unbeachtet bleiben sollten. Vor allem ein Ab-

standhalter (sogenannter Spacer oder Linker) zwischen Trägerprotein und der

Erkennungsstruktur des Analyten sollte in das Hapten integriert sein. Dieser soll

sterische Hinderungen verringern und so die Struktur des eigentlichen Analyten

Grundlagen 19

dem Immunsystem besser zugänglich machen [47]. Newsome et al. [171] erhiel-

ten bei der Immunisierung mit einem Konjugat aus Tetrahydrophthalimid und

menschlichem Serumprotein die empfindlichsten Antikörper, als sie eine Alkylket-

te mit fünf Kohlenstoffatomen als Abstandhalter verwendeten. Bei Untersuchun-

gen anhand von Steroid-Immunogenen, u. a. bezüglich der Kettenlänge und -art

des Abstandshalters zwischen einem Steroid und einem BSA-Molekül, ergaben

vier bis sechs linear angeordnete Kohlenstoffatome die höchste Antikörperspezi-

fität [172, 173]. Längere Ketten führten zu keiner weiteren Verbesserung bei der

Herstellung von Steroid-Antikörpern. Außerdem sollten die Abstandhalter weder

sperrig noch geladen sein, also z. B. nicht aromatisch oder polar, um selbst keine

Immunreaktion auszulösen [169, 170]. Daneben kann auch die Position ihrer

Anbindung an die Erkennungsstruktur des Analyten einen Einfluss auf die Affini-

tät des resultierenden Antikörpers haben [174].

2.2.2 Antikörper

Struktur

Antikörper sind globuläre Glykoproteine, die als Teil des Immunsystems, genauer

der humoralen Immunantwort, Antigene erkennen und binden. Etwa 75% der

Antikörper im Serum (ca. 10 mg mL-1) sind Immunglobuline der Klasse G (IgG)

[175, 176], so dass meist IgG gemeint sind, wenn von Antikörpern gesprochen

wird. Der prinzipielle Aufbau eines IgG ist in Abbildung 2.3 dargestellt. Es handelt

sich um ein formal achsensymmetrisches Heterotetramer aus jeweils zwei mole-

kular identischen schweren (~ 50 kDa) und leichten (~ 22 kDa) Polypeptidketten.

Diese sind durch Disulfidbrücken kovalent sowie durch weitere nicht-kovalente

Bindungen verbunden und bilden die typische Y-förmige Quartärstruktur [175,

177].

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung eines Antikörpers (IgG).

20 Grundlagen

Antikörper werden in konstante und variable Regionen eingeteilt. Die konstanten

Domänen der schweren und leichten Ketten (in Abbildung 2.3 dunkel dargestellt)

werden bei immunchemischen Methoden ausgenutzt, um Spezies-spezifische

Antikörper durch sekundäre Antikörper (-IgG) zu binden. Dazu wird nicht selten

auch nur der untere Abschnitt (hin zum Carboxy-Terminus) der konstanten Regi-

on verwendet, der aus dem kristallisierbaren Teil (Fc oder F(c)) der konstanten

Domänen der beiden schweren Polypeptidketten besteht. Anhand der konstanten

Abschnitte der fünf Typen schwerer Ketten – , , , und – werden außerdem

die fünf Klassen von Immunglobulinen charakterisiert, die die meisten Vertebra-

ten besitzen und die sich in Struktur und Auftreten voneinander unterscheiden.

Während die Immunglobuline E und D strukturell dem IgG ähneln, kann Immun-

globulin A (IgA) auch als Dimer und Immunglobulin M (IgM) als Penta- oder

Hexamer auftreten [175, 177]. Das ubiquitär auftretende IgG ist als einzige Im-

munglobulinklasse plazentagängig und außer im Blutserum auch in der Extrazel-

lulärflüssigkeit und den Epithelien [175], vor allem des Gastrointestinaltrakts [178-

180], zu finden. IgA tritt vor allem in Körperflüssigkeiten wie Speichel, Tränen

oder Muttermilch sowie auf den Schleimhäuten der Atemwege, des Verdauungs-

trakts und des Genitaltrakts auf, wohingegen IgM im frühen Stadium der primären

Immunantwort eine Rolle spielt und fast ausschließlich im Blut gelöst oder mem-

brangebunden auf der Oberfläche von B-Lymphozyten vorkommt. Die leichten

Polypeptidketten der Antikörper treten in zwei Typen – und – in allen Immun-

globulinklassen auf [175, 177].

Der für Immunoassays und natürlich auch für die Immunabwehr entscheidende

Teil, die Antigenbindungsstelle, wird im Bereich der Amino-Termini der variablen

Domänen (in Abbildung 2.3 heller dargestellt) einer schweren und einer leichten

Kette gebildet. Aus dem funktionell symmetrischen Aufbau der Antikörper resul-

tiert daher eine Bivalenz, über die die Antikörper verfügen, d. h. sie besitzen zwei

identische Antigenbindungsstellen mit derselben Bindungsspezifität. Für Säuge-

tiere wird angenommen, dass sie durch Rekombination der Gene der

(hyper-)variablen Region und alternatives Spleißen der Gentranskripte mindes-

tens 106 bis 107 verschiedene Antikörperspezifitäten hervorbringen könnten [175,

181].

Monoklonale und polyklonale Antikörper

Die Antigen-Antikörper-Bindung beruht ausschließlich auf nicht-kovalenten Bin-

dungen, also ionischen, hydrophoben, Wasserstoffbrücken- sowie van-der-

Waals-Wechselwirkungen und erreicht eine außerordentliche Bindungsaffinität

von bis zu K = 1010 L mol-1 oder sogar darüber, was einer Bindungsenergie von

ca. 65 kJ mol-1 entspricht [182]. Zusammen mit ihrer hohen Spezifität, die sie

selbst zwischen Konformeren und Stereoisomeren unterscheiden lässt, sind sie

zu einem wertvollen analytischen Werkzeug geworden. Außer ihrer natürlichen

Funktion bei der Immunabwehr in Organismen werden Antikörper verbreitet in

Medizin, Forschung und (Umwelt-)Analytik eingesetzt, wobei der Schwerpunkt

deutlich auf der klinischen Diagnostik und bei therapeutischen Anwendungen

Grundlagen 21

liegt [47, 183]. Für viele Zwecke können monoklonale und polyklonale Antikörper

in gleicher Weise verwendet werden. Beide haben aber Vorzüge und Nachteile.

Monoklonale Antikörper stammen aus einer Zelllinie, also aus Zellen, die auf

nur einen einzigen B-Lymphozyten zurückgeführt werden können. Polyklonale

Antikörper werden hingegen aus einer Mischpopulation von Zellen gebildet, so

wie sie natürlicherweise im Blut vorliegen, weswegen sie oft auch als (polyklona-

les) Antiserum bezeichnet werden. Tatsächlich ist die schnelle Gewinnung der

Antikörper durch das direkte Arbeiten mit dem Serum immunisierter Tiere der

Hauptvorteil, zeitlich und finanziell, gegenüber monoklonalen Antikörpern, wie im

nachfolgenden Abschnitt 2.2.3 genauer beschrieben wird. Gleichzeitig resultiert

daraus auch ein entscheidender Nachteil, denn ihre Verfügbarkeit ist endlich und

abhängig von der Verfassung des Versuchstieres. Genau diese Sterblichkeit wird

bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern umgangen und eine quasi

unbegrenzte Menge sowie gleichbleibende Qualität garantiert, die beispielsweise

auch der Reproduzierbarkeit von Tests dient [164].

Ein entscheidender Unterschied zwischen monoklonalen und polyklonalen An-

tikörpern kann auch ihre Epitopspezifität sein. Monoklonale Antikörper erkennen

nur ein einziges Epitop eines Antigens (oder Analyten), so dass auch die Zahl

etwaiger Kreuzreaktivitäten und unspezifischer Bindungen begrenzt sein sollte.

Polyklonale Antikörper sind zwar, ebenso wie monoklonale Antikörper, Antigen-

spezifisch, können aber durchaus gegen unterschiedliche Epitope dieses Anti-

gens gerichtet sein. Daraus kann ein vermehrtes Auftreten von Kreuzreaktionen

resultieren oder es können ebensolche unspezifischen Bindungen kompensiert

werden. Außerdem wird insbesondere bei veränderten Analyten die Wahrschein-

lichkeit einer Antigen-Antikörper-Bindung erhöht und damit auch das zu erwar-

tende Signal in einem Assay, ein Umstand, den monoklonale Antikörper kaum

ausgleichen können [164]. Für TATP ist zu vermuten, dass es aufgrund seiner

geringen Größe und dazu seiner Symmetrie nur ein Epitop aufweist, so dass

diesbezüglich weder polyklonale noch monoklonale Antikörper einen Vorteil ha-

ben.

2.2.3 Immunisierung

Allgemeiner Ablauf

Die Immunisierung von Vertebraten, zumeist Säugetieren, darf nur im Rahmen

des Tierschutzgesetzes erfolgen [184]. Die Gabe des möglichst reinen Antigens

bzw. Immunogens (z. B. einem Hapten-Protein-Konjugat) dazu erfolgt in aller

Regel durch Injektion. Vor allem bei der Erstimmunisierung erfolgt dies gemein-

sam mit einem Adjuvans, das die Immunogenität erhöhen und dadurch die Im-

munantwort verstärken soll, indem das beispielsweise enthaltene Mineralöl eine

Entzündungsreaktion forciert [164]. Im Rahmen der primären Immunantwort nach

dem ersten Kontakt mit dem Immunogen wird zunächst überwiegend IgM gebil-

det [47, 175, 177]. Erst später und vor allem nach wiederholter Applikation des

22 Grundlagen

Immunogens steigt nach einem Klassenwechsel der Titer der gewünschten IgG

an, welche bis zu 10% der Antikörperpopulation im Serum ausmachen können

[164]. Bei den Nachimmunisierungen, auch Boosts genannt, kommt es durch die

bei der Erstimmunisierung gebildeten Gedächtniszellen auch schneller zur Bil-

dung der IgG (sekundäre Immunantwort). Dabei steigt neben der Menge auch die

Qualität der Antikörper, da hauptsächlich somatische Hypermutationen

(Punktmutationen) der Gene des hypervaribalen Bereichs der Antikörper eine

Affinitätsreifung ermöglichen [175, 185].

Sowohl für die Herstellung polyklonaler als auch monoklonaler Antikörper sind

diese Vorgänge entscheidend. Die polyklonalen Antikörper können direkt als Se-

rum oder nach Isolierung der IgG daraus verwendet werden [164]. Die Boosts

dienen nach Abschluss der Affinitätsreifung dem Erhalt des Antikkörpertiters im

Blut, wo IgG eine Halbwertszeit von drei Wochen aufweisen [175]. Bei der Ge-

winnung monoklonaler Antikörper spielen die Antikörper im Blut nur eine unter-

geordnete Rolle und werden lediglich zur Verfolgung des Immunisierungsverlaufs

verwendet. Wichtig ist hier die Stimulation der Zellen, welche die gewünschten

Antikörper produzieren. Da die Proliferation der B-Lymphozyten in den Organen

des lymphatischen Systems erfolgt, wird zur Isolierung der Zellen zumeist die

Milz entnommen, seltener die Lymphknoten [47, 186]. Die gewonnenen

B-Lymphozyten werden mit Myelomzellen zu Hybridomzellen fusioniert und an-

schließend vereinzelt – ein Verfahren, dass sich seit der Entwicklung durch Köh-

ler und Milstein [187] 1975 nur wenig verändert hat.

Bei der klassischen, chemischen Fusionsmethode wird Polyethylenglykol zur

Destabilisierung der Zellmembranen verwendet. Neuere Verfahren setzen auch

elektrische Pulse oder eine Kombination aus chemischer und Elektrofusion ein,

selten wird auch eine durch Viren vermittelte Fusion angewandt [164]. Die Fusion

erfolgt ungerichtet. Die Fusionswahrscheinlichkeit ist mit 0.001-0.4% (je nach

Methode) [188-190] sehr gering und Hybridomzellen sind aufgrund der erhöhten

Chromosomenzahl zudem oftmals nicht stabil, so dass die wenigen Antikörper-

sezernierenden und zugleich immortalisierten Hybridomzellen durch z. B. eine

HAT-Selektion identifiziert werden müssen. Üblicherweise werden Myelomzell-

linien verwendet, die einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-

transferase (HGPRT) aufweisen. In einem HAT-Medium mit Hypoxanthin, Ami-

nopterin und Thymidin können Myelomzellen oder reine Myelomzell-Hybride auf-

grund von Einschränkungen im DNA-Stoffwechsel nicht überleben, da Aminopte-

rin die De-novo-Biosynthese von Guanosintriphosphat und Thymidintriphosphat

inhibiert. Der alternative Syntheseweg (salvage pathway), um Guanosintriphos-

phat aus Hypoxanthin zu synthetisieren, entfällt durch das Fehlen der HGPRT-

Aktivität. Thymidintriphosphat wird durch das zugesetzte Thymidin weiterhin ge-

bildet. Die B-Lymphozyten besitzen zwar HGPRT, sind aber nicht kultivierbar, so

dass nicht-fusionierte B-Lymphozyten oder Hybride aus diesen in vitro innerhalb

von 14 Tagen sterben. Nur Hybridomzellen, die die Eigenschaften sowohl der

Myelomzellen als auch der B-Lymphozyten tragen, wachsen schließlich in der

Kultur und werden durch limitierende Verdünnung streng vereinzelt. Die Zell-

kulturüberstände der reklonierten Hybridomzellen werden im Allgemeinen mittels

Grundlagen 23

ELISA, inzwischen auch durch Durchflusszytometrie, untersucht, um diejenigen

Klone zu identifizieren und zu kultivieren, die die gewünschten monoklonalen

Antikörper produziert [47, 164, 175].

Besonderheiten von Mäusen und Kaninchen

Bei der Herstellung von Antikörpern ist auch die Wahl der zu immunisierenden

Spezies zu beachten, wobei ein Einfluss auf das komplexe biologische System

Tier sehr begrenzt ist. So kann es Spezies-spezifisch (wie z. B. bei Ziege und

Kaninchen [191] oder bei Maus und Kaninchen [192]) oder bei einem einzelnen

Individuum zu einer unzureichenden Antikörperbildung bis hin zum Ausbleiben

der Immunantwort kommen. Die Ursachen dafür können zum einen Immuntole-

ranzen sein [164], die vor allem bei zu jungen Tieren auftreten, und zum anderen

der Schutzmechanismus vor Autoantikörpern, wenn das Immunogen körpereige-

nen Strukturen zu ähnlich ist [175, 193]. Aus (u. a.) Schaf, Ziegen, Pferd, Kameli-

den und Hühnerei lassen sich größere Vorräte polyklonaler Antikörper gewinnen.

Steht hingegen nur eine geringe Menge Immunogen zur Verfügung, sind Maus,

Ratte, Meerschweinchen und Kaninchen geeignetere Kandidaten. Bei der Her-

stellung monoklonaler Antikörper sind die Möglichkeiten deutlich eingeschränkter,

da nur wenige fusionsfähige Myelomzelllinien zur Verfügung stehen, wobei häu-

fig nicht nur auf die gemeine Herkunft mit den B-Lymphozyten aus einer Spezies,

sondern oft auch desselben Stammes geachtet werden muss [47, 164]. Die

Hybridomtechnik wird daher seit langem fast ausschließlich mit etablierten Nage-

tier-Myelomzelllinien von Mäusen [187, 194-196] und Ratten [197-199] ange-

wandt. Wegen der therapeutischen Relevanz [200] wurden auch schon recht früh

humane, monoklonale Antikörper auf diese Weise hergestellt [201]. Neuer hinge-

gen sind monoklonale Antikörper aus Kaninchen, da die einzig stabile Kanin-

chen-Myelomzelllinie von Knight und ihren Kollegen unter Patentschutz steht

[202] und erst seit Mitte/Ende der 2000er von Epitomics [203] kommerziell einge-

setzt wird.

Am häufigsten werden Mäuse zur Herstellung monoklonaler Antikörper heran-

gezogen und Kaninchen, um polyklonale Seren zu gewinnen. Direkte Vergleiche

beider, vor allem bezüglich ihrer Affinität, sind in der Literatur kaum zu finden, da

dazu die Immunisierungen mit identischen oder zumindest sehr ähnlichen Immu-

nogenen erfolgt sein sollten. Jedoch wird mit der nun zunehmenden Zahl mono-

klonaler Antikörper aus Kaninchen deutlich, dass die Antikörper aus Kaninchen

denen aus Mäusen oft überlegen sind. Zumindest zeigten in der Immunhisto-

chemie monoklonale Antikörper aus Kaninchen höhere Empfindlichkeit bei

gleichbleibender Selektivität, erwiesen sich als robuster und ermöglichen höhere

Verdünnungen (positiv für den Kostenfaktor) als die gegen die gleichen Antigene

erzeugten, monoklonalen Antikörper aus Mäusen [204-206]. Saito et al. [205]

bezogen in ihre Untersuchungen an einem Tumormarker auch entsprechende

polyklonale Antikörper aus Kaninchen ein. Sie konnten trotz ihrer anfänglichen

und allgemeinen Vermutung, dass polyklonale Seren zwar empfindlicher, aber

dafür weniger spezifisch als monoklonale Antikörper aus Mäusen sind, keinen

Nachteil gegenüber den monoklonalen Antikörpern aus Kaninchen finden. Erklärt

24 Grundlagen

wird der Unterschied zwischen den Antikörpern aus Kaninchen und Mäusen

durch die Besonderheiten des Immunsystems der Kaninchen [185]. Im Gegen-

satz zu z. B. Maus und Mensch besitzen Kaninchen kein IgD und ihr IgG hat im

Bereich der Amino-Termini der variablen Domänen weniger Aminosäuren und

mehr Disulfidbrücken und weist außerdem keine Subklassen auf. Auch der zu

90-95% in Kaninchen auftretende -Typ der leichten Polypeptidketten bildet eine

weitere Disulfidbrücke aus. Es wird vermutet, dass diese zusätzlichen Disulfid-

brücken mit verantwortlich für die besserer Stabilität und Haltbarkeit der Antikör-

per aus Kaninchen sind. Entscheidend für die erhöhte Affinität ist jedoch die Ent-

stehung der größeren Antikörpervielfalt. Sie setzen dabei weniger auf die Re-

kombination der Antikörpergene, sondern mehr auf Genkonversion durch Inserti-

on und Deletion von Codons sowie Clusterverschiebung von Nukleotiden. Diese

Vorgänge laufen in den ersten Lebenswochen vorwiegend im Darm-assoziierten

lymphatischen Gewebe ab und bauen das primäre Antikörper-Repertoire auf,

weswegen sehr junge Tiere noch immuninkompetent sind. In adulten Kaninchen

erfolgen Genkonversion und somatische Hypermutation auch in den sekundären

lymphatischen Organen wie Milz und Lymphknoten, wo die abschließende Anti-

körperreifung während der sekundären Immunantwort erfolgt [185, 207]. Antikör-

per aus Kaninchen sollen so Affinitäten bis KD = 10-12 M erreichen können, wäh-

rend monoklonale Antikörper aus Mäusen meist Affinitäten im nano- bis subna-

nomolaren Bereich (KD = 10-9 bis 10-10 M) aufweisen. Nicht zuletzt erhöht die hö-

here Zahl an verschiedenen Antikörpern auch die Wahrscheinlichkeit einer (bes-

seren) Erkennung von Epitopen, die dem Immunsystem der Mäuse verborgen

bleiben oder eine nur schwache Immunantwort auslösen. Daneben enthält die

Kaninchenmilz auch 50-mal mehr Lymphozyten als die einer Maus, was die Er-

folgsquote bei der Herstellung von Hybridomzellen merklich steigert [185].

2.2.4 Alternativen

Antikörper erkennen außerordentlich empfindlich und selektiv die dreidimensio-

nale Struktur von Molekülen und sind hervorragend zur qualitativen und quantita-

tiven Analyse in einer Vielzahl von Methoden einsetzbar. Daher ist es nahelie-

gend, dieses biologische Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion zu imitieren.

Dadurch können vor allem auch Tierversuche umgangen werden. Gleichzeitig

werden Kosten- und Zeitersparnis sowie eine bessere Einflussnahme in den Pro-

duktionsprozess (z. B. durch Konzepte wie rationales Design [208]) erhofft.

In-vitro-Methoden können synthetische oder teilsynthetische Alternativen wie

rekombinante Antikörper, Peptide, Aptamere (einzelsträngige DNA- oder RNA-

Oligonukleotide) oder MIP (molekular geprägte Polymere) bieten [209, 210].

Zur Erzeugung hochaffiner rekombinanter Antikörper oder Antikörperfragmen-

te, Peptide und Aptamere werden Bibliotheken mit entsprechenden Genen, DNA-

oder RNA-Sequenzen benötigt, von deren Vielfalt, wie schon bei den Antikörpern

(Abschnitt 2.2.3), maßgeblich die erfolgreiche Selektion gegen die gewünschte

Zielstruktur abhängt. Als bewährtes Selektionsverfahren für Proteine und Peptide

Grundlagen 25

hat sich dabei das Phage display [211] erwiesen, wobei die in den Bakteriopha-

gen exprimierten Proteine oder Peptide auf der Oberfläche der Phagen dem zu

erkennenden Molekül präsentiert werden [47, 212]. Mit der sehr ähnlichen Me-

thode des Yeast display, bei der die Oberflächenexpression auf Hefen erfolgt,

welche auch die Glykosylierung der Proteine durchführen, konnten Boder et al.

[213] eine Affinität von KD = 4.8 × 10-14 M für Fluorescein erreichen. Das ist die

wahrscheinlich höchste Antikörperaffinität, die bislang bekannt ist [208]. Sie

nahmen die variable Domäne je einer schweren und leichten Polypeptidkette

eines bereits vorhandenen Antikörpers und fügten der entsprechenden DNA,

u. a. durch die Verwendung einer fehleranfälligen DNA-Polymerase, randomisier-

te Mutationen ein, so dass eine Bibliothek mit 105 bis 107 Varianten entstand, und

erhielten einen monovalenten scFv-Antikörper [213]. Diese und ähnliche Techni-

ken ermöglichen also auch eine nachträgliche Affinitätsreifung von Antikörpern

in vitro, wobei meist nur der Abschnitt rund um die Antigenbindungsstelle modifi-

ziert wird und in der Regel eine Immunisierung vorausgeht [47, 208]. Für den

Analyten TNT wurden rekombinante Antikörper aus einem scFv-Fragment, ge-

bunden an den konstanten Teil eines humanen Antikörpers, entwickelt, mit de-

nen eine Nachweisgrenze von 1 µg L-1 erreicht wurde [214]. Sie binden ähnlich

gut wie einige monoklonale TNT-Antikörper, die Nachweisgrenzen zwischen 1.5

und 6.1 µg L-1 [51, 54, 55] in verschiedenen Assayformaten zeigten, schon mit

den besseren monoklonalen Antikörpern, mit Nachweisgrenzen von 0.008 bis

0.11 µg L-1 [50-52, 56] jedoch nicht mehr. Die besten polyklonalen Antikörper aus

Kaninchen, mit denen Nachweisgrenzen von 0.002 µg L-1 [52] bzw. 0.0006 µg L-1

[57] erlangt wurden, sind deutlich besser als die rekombinanten TNT-Antikörper,

zumal letztere starke Kreuzreaktivitäten aufweisen [214]. Goldman et al. [215]

hatten im Jahr zuvor bereits mit der Phage-display-Technik Peptide gewonnen,

die selektiv TNT binden. Mit dieser (noch an den Phagen gebundenen) Kette aus

nur zwölf Aminosäuren konnten sie mittels ELISA immerhin 10 mg L-1 TNT detek-

tieren. Auch Cerruti et al. [216] generierten so ein Peptid aus zwölf Aminosäuren,

das selektiv TNT aus einer 100 mg L-1-Lösung erkannte, aber nicht auf Dinitroto-

luol in gleicher Konzentration reagierte.

Oligonukleotide, die aufgrund ihrer räumlichen Sekundärstruktur in der Lage

sind, spezifisch andere Moleküle zu binden, werden Aptamere genannt [217].

Aus einer Bibliothek mit zufälligen RNA- oder DNA-Sequenzen wird in einem

SELEX genannten Verfahren [218, 219], ähnlich dem Phage display, über eine

immobilisierte Zielstruktur das am stärksten bindende Aptamer selektiert. Eh-

rentreich-Förster et al. [220] entwickelten ein TNT-Aptamer. Diese RNA-Sequenz

aus 86 Nukleotiden wurde mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und in einem

dem indirekten, kompetitiven Immunoassay ähnlichen Format eingesetzt. Die

Arbeitsgruppe konnte damit Messungen bis in den pM-Bereich vornehmen und

sie stellten keine Kreuzreaktivitäten fest, was vergleichbar mit den Ergebnissen

der polyklonalen TNT-Antikörper von Ramin et al. [57] ist. Ebenso erreichten Ho

et al. [221] mit ihrem DNA-Aptamer aus 100 Nukleotiden einen erstaunlichen

Detektionsbereich, den sie mit 10-14 bis 10-3 M für das Sandwich-Assay angeben.

26 Grundlagen

Auch MIP wurden schon zur Detektion von Explosivstoffen eingesetzt. Sie wer-

den durch Vernetzung eines Polymers um eine dem Analyten möglichst ähnliche

Schablone (template) herum hergestellt. Nach dem Auswaschen der Schablone

steht eine für den Analyten selektive Bindungsstelle zur Verfügung [210]. Murray

und Arnold [222] nutzten beispielsweise ein polymerisierbares Porphyrin-Derivat

und den Analyten selbst als Schablone [223], um ein für TNT selektives MIP zu

erhalten und ließen sich das Verfahren patentieren. Sowohl mit Acrylamid als

auch mit Methacrylsäure als Monomere und TNT jeweils als Schablone gelang

Bunte et al. [224] die Herstellung TNT selektiver MIP, die Dinitrotoluol nicht ban-

den. Das Polyacrylamid-MIP erreichte die höchste Empfindlichkeit und ermöglich-

te auf einer Quarzkristall-Mikrowaage die Anreicherung von 150 pg je

Mikrogramm MIP pro Stunde aus der Gasphase. Für den elektrochemischen

TNT-Sensor von Alizadeh et al. [225] wurde ein Polymer aus Methacrylsäure

synthetisiert. Das erhaltene MIP diente der selektiven Anreichung von TNT und

befähigte das Sensorsystem so zu einer Nachweisgrenze von 1.5 × 10−9 mol L−1

(= 0.3 µg L-1).

Mit den beschriebenen Alternativen können in Assays teilweise ähnliche Emp-

findlichkeiten wie mit Antikörpern erreicht werden. Neben der Reproduzierbarkeit

in der Herstellung ist insbesondere die Toleranz der Aptamere gegenüber orga-

nischen Lösungsmitteln [220] und vor allem der MIP gegenüber chemischen,

thermischen und enzymatischen Einflüssen von Vorteil [209, 210]. Dennoch ha-

ben sie die Antikörper als selektives und empfindliches Mittel in der Analytik bis-

her nicht abgelöst. Obwohl die Methoden zu Generierung hochaffiner rekombi-

nanter Antikörper(-fragmente), Peptide, Aptamere und MIP zum Teil schon seit

langem bekannt sind (z. B. Phage display seit den 1980er Jahren [211]), sind

diese Verbindungen nicht kommerziell erhältlich [210]. Anhand des Beispiels TNT

konnte zudem gezeigt werden, dass diese Alternativen – mit Ausnahme der Ap-

tamere – dem Vergleich mit Antikörpern aus immunisierten Tieren nicht standhal-

ten können.

2.3 Antikörper-basierte Nachweissysteme (Immunoassays)

2.3.1 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA)

Allgemeines

Es gibt zahllose Methoden, die auf der Antigen-Antikörper-Bindung beruhen. Als

erster Immunoassay gilt der von Yalow und Berson [226] beschriebene Radio-

immunoassay. Daraus wurden viele verschiedene Arten von quantitativen Immu-

noassays abgeleitet, die meisten zunächst mit einem medizinischen Hintergrund

[227]. Der wahrscheinlich prominenteste Vertreter unter den Immunoassays ist

der enzymgekoppelte Immnoassay (ELISA, enzyme-linked immunosorbent as-

Grundlagen 27

say). Er spielt nicht nur bei klinischen und biochemischen Untersuchungen eine

Rolle, wie bei der oben bereits geschilderten Gewinnung von Antikörpern (Ab-

schnitt 2.2.3) [228], sondern hat als schnelle und kostengünstige Methode auch

Einzug in die Umweltanalytik gefunden (z. B. [170, 229-231]).

ELISA haben gegenüber den Radioimmunoassays den Vorteil, dass hier an-

stelle von radioaktiven Isotopen (meist 125I oder 3H [232]) Enzyme zur Markierung

des Analyten oder des (sekundären) Antikörpers verwendet werden. Daneben

führt der Einsatz von Enzymen durch Ausnutzen der von ihnen katalysierten Re-

aktion zu einer Amplifikation des Signals, was die Grundlage für die hohe Emp-

findlichkeit des ELISA ist. Immunoassays können theoretisch eine Empfindlich-

keit von bis zu 10-15 bis 10-16 mol L-1 bzw. in der kompetitiven Variante bis zu

10-14 mol L-1 erreichen [233]. Die ersten ELISA sind parallel etwa 1971 entstan-

den. Engvall und Perlmann [234] setzten Alkalische Phosphatase und als chro-

mogenes Substrat p-Nitrophenylphosphat für ihren Assay ein. Avrameas und

Guilbert [235] verwendeten Meerrettich-Peroxidase (HRP) mit H2O2/o-Dianisidin

(3,3′-Dimethoxybenzidin) als chromogenes Substrat. Diese beiden Enzyme sind

bis heute üblich als Marker, seltener werden -Galactosidase, Glucoseoxidase

und andere eingesetzt. Daneben stehen diverse Chromogene, wie z. B. das be-

reits in Abschnitt 2.1.2 erwähnte ABTS, zur Verfügung, wobei die höchste Emp-

findlichkeit mit H2O2/3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) für HRP erreicht wird

[232, 233], das auch in dieser Arbeit verwendet wird [236]. Mit fluorimetrisch

nachweisbaren Substraten wie H2O2/3-(4-Hydroxyphenyl)propionsäure für HRP

oder 4-Methylumbelliferylphosphat lässt sich die Testempfindlichkeit um das

Zwei- bis Zehnfache erhöhen [232, 233].

In dieser Arbeit verwendete ELISA-Formate

In der vorliegenden Arbeit werden zwei Formate des heterogenen, kompetitiven

ELISA angewandt: der direkte und der indirekte. Der Ablauf beider ist in Abbil-

dung 2.4 dargestellt, wobei die Größenverhältnisse nicht der Realität entspre-

chen. Nach allen Schritten (außer dem Entwicklungsschritt) folgen Waschschritte.

Die hier gewählte Bezeichnung des direkten und indirekten Immunoassays ist

keineswegs allgemeingültig. Nicht selten werden Immunoassays über die Art und

Weise der Detektion mittels der Antikörper definiert [176, 232].

ELISA sind Festphasenassays und werden in Mikrotiterplatten aus Polystyrol

durchgeführt, welches eine hohe Bindekapazität für Proteine hat. Die Adsorption

der Proteine beruht hauptsächlich auf hydrophoben Wechselwirkungen [232]. Im

direkten Fall werden die Analyt-spezifischen Antikörper, vermittelt durch sekun-

däre Antikörper (-IgG), auf dem Träger immobilisiert (Beschichtung und Serum-

inkubation). Es wird außerdem ein Enzym-markierter Analyt, auch Tracer ge-

nannt, benötigt. Dieses HRP-Konjugat wird, ebenso wie das für den indirekten

ELISA notwendige Analyt-Protein-Konjugat (hier: OVA), durch kovalente Kopp-

lung des entsprechenden Haptens an die Proteine analog zur Synthese des Im-

munogens (Abschnitt 2.2.1) hergestellt. Das Analyt-OVA-Konjugat wird beim indi-

rekten Assay als erstes in der Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach dieser Be-

28 Grundlagen

schichtung folgt ein Blockierungsschritt mit preisgünstigen und gut verfügbaren

Proteinen wie Casein, durch welche unspezifische Bindungen der Antikörper an

noch freie Stellen der Plattenoberfläche in den nachfolgenden Schritten verhin-

dert werden.

Wegen dieses zusätzlichen Schritts dauert die Durchführung des indirekten

ELISA auch länger als die des direkten. Ein Vorteil des indirekten Assays kann

aber sein, dass die Probe nicht in Kontakt mit dem empfindlichen Enzym kommt.

Während beim direkten ELISA der Analyt markiert ist, wird im indirekten der se-

kundäre Antikörper (-IgG-HRP) markiert. Das bedeutet, dass im entscheiden-

den Kompetitionsschritt im direkten Testformat der freie Analyt aus der Probe mit

dem HRP-Konjugat um die begrenzte Zahl der selektiven Bindungsstellen der

immobilisierten Antikörper konkurriert. Das gebundene HRP-Konjugat dient

schließlich der Detektion. Im indirekten ELISA erfolgt die Konkurrenzreaktion

zwischen dem freien Analyten und dem immobilisierten OVA-Konjugat um die

Antigenbindungsstellen der ebenfalls frei in Lösung befindlichen Antikörper aus

der Serumverdünnung. Detektiert wird dann der an das OVA-Konjugat gebunde-

ne Antikörper mit Hilfe des -IgG-HRP.

Der letzte Schritt, die Entwicklung des Assays, sowie seine Auswertung sind

für beide ELISA-Formate identisch. Die photometrische Endpunktbestimmung

des gebildeten gelben Farbstoffs erfolgt nach Absenkung des pH-Wertes,

wodurch einerseits die Enzymreaktion gestoppt wird und andererseits der in An-

wesenheit von HRP und Wasserstoffperoxid aus TMB entstandene, zunächst

blaue Farbkomplex zerfällt [237]. Hohe Extinktionen entsprechen in den kompeti-

tiven Assays niedrigen Analytkonzentrationen und geringere Extinktionswerte

höheren Konzentrationen des Analyten. Die Auswertung über eine

4-Parametergleichung (Gleichung 4, Abschnitt 3.3.5) [238], die einen sigmoidalen

Kurvenverlauf beschreibt, gilt schon lange als allgemein anerkannt [239]. Sie ist

vergleichbar mit Dosis-Wirkungs-Kurven aus der Pharmakologie [47], weswegen

die Konzentration im Wendepunkt der Kurve (Parameter C oder C-Wert in Glei-

chung 4), auch als mittlere inhibitorische Konzentration (IC50) angegeben werden

kann. Dieser Testmittelpunkt kann direkt zur Abschätzung der Affinität der Anti-

körper (Gleichung 5) [240, 241] sowie zur Bestimmung der Kreuzreaktivität (Glei-

chung 7) [242] herangezogen werden. Die Werte der 4-Parametergleichung hel-

fen außerdem bei der Beurteilung des Messbereichs durch die Erstellung eines

Präzisionsprofils nach Ekins (Gleichung 6) [243], da durch den sigmoidalen Kur-

venverlauf die Werte mit den höchsten Steigungen (um den Testmittelpunkt her-

um) die höchste Genauigkeit aufweisen und die Messunsicherheit zu höheren

und niedrigeren Konzentration hin teils drastisch zunimmt. Zur Bestimmung der

Nachweisgrenze der ELISA wird verbreitet das Signal des Nullwerts (blank), das

auch dem A-Wert der 4-Parametergleichung gleichgesetzt werden kann, abzüg-

lich seiner dreifachen Standardabweichung betrachtet [244, 245].

Grundlagen 29

direkt indirekt

Beschichtung 18-25 h

Blockierung 1 h —

Seruminkubation 1 h

—

Kompetition 30 min

-IgG-HRP 30 min

—

Entwicklung bis zur Blaufär-bung, dann Stop-pen

Mikrotiterplattenoberfläche

-IgG

TATP-OVA-Konjugat Blockpuffer

polyklonale TATP-Antikörper

TATP-HRP-Konjugat

-IgG-HRP

TATP Entwicklung

Abbildung 2.4: Schema des direkten und indirekten TATP-ELISA.

30 Grundlagen

2.3.2 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA)

Ein immunchromatographischer Schnelltest (LFA, lateral flow assay, auch

Dipstick-Test) wäre ein anwenderfreundlicher Ansatz zum Nachweis von TATP,

der nicht nur einfach und schnell, sondern auch kostengünstig und mobil ist.

Während zur Durchführung eines ELISA (und vieler anderer Methoden) geschul-

tes Fachpersonal benötigt wird, kann ein LFA jedermann handhaben. Dafür er-

möglichen sie häufig aber nur semiquantitative Aussagen [246]. Der wohl mit

Abstand bekannteste LFA ist der seit Mitte der 1980er Jahren eingesetzte Nach-

weis des humanen Choriongonadotropin (hCG) – ein Teststreifen zur Schwan-

gerschaftsfrüherkennung, der inzwischen sogar digital erhältlich ist [246, 247].

Die Funktionsweise eines LFA-Teststreifens beruht auf den Kapillarkräften,

durch die die flüssige Probe durch eine poröse Membran aus Nitrozellulose, Po-

lyester oder Viskose transportiert wird. Auf der Membran sind entweder Analyt-

spezifische Antikörper oder Analyt- bzw. Antigen-Protein-Konjugate, ähnlich den

zuvor beschriebenen direkten oder indirekten ELISA, immobilisiert. Verbreiteter

ist allerdings ein Sandwich-Format, für das zwei Antikörper benötigt werden, die

zwei unterschiedliche Epitope des gleichen Analyten erkennen. Nach Zugabe der

Probe bindet der im Probenauftragsbereich befindliche markierte Antikörper den

Analyten. Beide wandern als Komplex durch die Membran bis der Analyt von

dem zweiten, an der Membran immobilisierten Antikörper festgehalten wird. So

konzentrieren sich an dieser Stelle nur die Analyt-gebundenen markierten Anti-

körper auf und die zunehmende Färbung zeigt einen positiven Nachweis an. Zur

Detektion werden meist sichtbare Markierungen mit kolloidalem Gold oder ge-

färbten Kunststoffpartikeln eingesetzt, die einen Nachweis von bis zu 10-9 M bis

10-12 M gestatten [246]. Da TATP nur ein Epitop hat, muss in dieser Arbeit ein auf

dem indirekten, kompetitiven ELISA beruhender Aufbau (Abschnitt 3.3.6, Abbil-

dung 3.6) gewählt werden, wie er auch für Schnelltests zum Nachweis von

Saxitoxin [248] oder Aflatoxin [249] gezeigt wurde.

Die Tatsache, dass in der medizinischen Diagnostik, wofür die LFA ursprüng-

lich konzipiert waren, der Nachweis von Krankheitserregern oder anderen Fakto-

ren direkt aus einer geringen Menge (1 mL und deutlich darunter) Blut, Speichel

oder Urin erfolgt, zeigt, wie robust die LFA gegenüber komplexen Matrizes sind.

Das macht sie vermehrt auch für die Umwelt- und Lebensmittelanalytik interes-

sant [246, 249]. Inzwischen auch recht gebräuchlich sind immunchromatographi-

sche Nachweisverfahren für Drogen, die u. a. von Polizei und Zoll als Speichel-

oder Wischtests eingesetzt werden [250]. Für die Detektion von Explosivstoffen

sind kommerzielle LFA nicht bekannt, wurden aber z. B. von Girotti et al. [251] für

TNT durchaus entwickelt. Ihr Testsystem mit einem monoklonalen TNT-

Antikörper basiert ebenfalls auf dem indirekten ELISA-Format und kolloidalem

Gold als sichtbarem Marker und erreicht eine Nachweisgrenze von 1 mg L-1. Mit

dem aus denselben Immunreagenzien aufgebauten indirekten ELISA (mit

-IgG-HRP und Luminophoren) betrug die Nachweisgrenze < 1 mg L-1. Die Um-

stellung des TNT-LFA auf enzymkatalysierte Chemilumineszenz-Detektion ergab

Grundlagen 31

eine verbesserte Nachweisgrenze von 0.2 mg L-1, machte aber ein entsprechen-

des Messgerät erforderlich [252].

Obwohl die immunchromatographischen Schnelltests im Spurenbereich nicht

an die Empfindlichkeit klassischer Immunoassays heranreichen, so lassen sie

dennoch sehr schnell, innerhalb von Minuten, eine Aussage darüber treffen, ob

eine potenziell gefährliche Substanz vorliegt. Jedoch können die kommerziellen

Teststreifen zum Teil noch recht ungenau sein [247, 250], insbesondere durch

verschiedene Interpretationen von positiven und negativen Resultaten durch das

menschliche Auge [247]. Doch die Entwicklung der LFA geht schnell voran, vor

allem bezüglich der Reduzierung der Messunsicherheit. Mit elektronischen Ele-

menten, die sie langsam zu Biosensoren machen werden, lassen sich die Tests

digitalisieren sowie quantifizieren. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit bis in den

fM-Bereich kann z. B. die Detektion von Lumineszenzfarbstoffen ermöglicht wer-

den. Außerdem macht die relativ leichte Umsetzung des Nachweises mehrerer

Analyten (multiplexing) auf einem Teststreifen die LFA für viele Anwendungen

attraktiv [246].

2.3.3 Biosensoren

An dieser Stelle sollen nur einige Beispiele Antikörper-basierter Biosensoren,

sogenannter Immunosensoren, zur Detektion von Explosivstoffen vorgestellt

werden. Aufgrund nur weniger verfügbarer bzw. fehlender Antikörper für andere

Explosivstoffe sind bisherige Immunosensoren fast ausschließlich für den Nach-

weis von TNT entwickelt worden. Smith et al. [160] geben dazu einen guten Ein-

blick, der jedoch auch Methoden wie ELISA und LFA mit einbezieht, die ohne

Signalwandler und angegliederte Datenausgabe keine Biosensoren im eigentli-

chen Sinn darstellen. Eine Vielzahl an Systemen für Immunosensoren stellen

Conroy et al. [253] vor. Die selektive und hochaffine Bindung eines Analyten an

den entsprechenden Antikörper, wobei entweder ein Antigen-Konjugat oder der

Antikörper immobilisiert an der Sensoroberfläche vorliegen, wird durch elektro-

chemische, piezoelektrische und optische Systeme in ein quantifizierbares Signal

übersetzt.

Die meisten TNT-Immunosensoren nutzen die Oberflächenplasmonenreso-

nanzspektroskopie (SPR, surface plasmon resonance) [254], um die Analyt-

Antikörper-Wechselwirkung ohne die Notwenigkeit einer Enzym- oder Farbstoff-

markierung optisch zu detektieren. Ein (Protein-)Konjugat des Analyten oder ei-

nes Analogons wird dennoch benötigt, welches bei der häufig angewendeten

indirekten, kompetitiven Variante des Sensoraufbaus auf dessen Oberfläche im-

mobilisiert wird. Mit diesen SPR-Immunosensoren konnten Nachweisgrenzen für

TNT zwischen 2 und 8 ng L-1 erzielt werden, bei einer Zyklusdauer von 2 bis

13 min und mindestens 20 bis über 100 möglichen Zyklen durch die Regenerati-

on des Sensors mit einer Pepsinlösung [52, 255, 256]. Mit einem ähnlichen Sen-

sor, jedoch auf der Basis eines Displacement-(Verdrängungs)-Immunoassays,

32 Grundlagen

konnten Onodera et al. [257] zwar nur etwas unter 1 µg L-1 TNT detektieren, das

aber in 12 s und einer Regeneration mit Natriumhydroxidlösung in 3 s.

Andere Sensoren beruhen auf der Detektion von Fluoreszenz-markierten Ana-

lyten. Diese werden z. B. infolge der Verdrängung durch den Analyten von den,

auf einer Membran oder einem Säulenmaterial immobilisierten, Antikörpern frei-

gesetzt und von einem Detektor registriert. Mit dieser Anordnung in einem Con-

tinuous-flow-Immunosensor konnten TNT und RDX im ppb-Bereich [258] bzw. in

einem mikrofluidischen System TNT im ppb (µg L-1)-Bereich [259] bis 0.01 µg L-1

[260] und RDX bis in den unteren µg L-1-Bereich [261] nachgewiesen werden. Mit

kommerziellen Biosensor-Plattformen, die nach ähnlichen Prinzipien funktionie-

ren, und jeweils monoklonalen Antikörpern konnten 0.05 µg L-1 TNT in < 10 min

mit dem KinExA Inline-Biosensor [53, 262] und 10 µg L-1 TNT und RDX in etwa

5 min mit dem FAST 2000-Biosensor [263] bestimmt werden.

Ein Bespiel für ein nicht-optisches Detektionsverfahren ist der auf Kohlenstoff-

nanoröhren aufgebaute Displacement-Immunosensor von Park et al. [264]. Hier

erfolgte durch die Freisetzung des an ein immobilisiertes TNT-Analogon gebun-

denen Antikörpers bei der Zugabe von TNT eine Veränderung der Leitfähigkeit,

die gemessen wurde und so einen Messbereich von 0.5 bis 5000 µg L-1 TNT er-

möglichte. Larsson et al. [265] beschrieben eine indirekt, kompetitiv arbeitende

Sensorplattform, die sie sowohl mit optischen (SPR) als piezoelektrischen

(Quarzkristallmikrowaage) Signalwandlern testeten. Für beide Verfahrensweisen

konnten sie eine Nachweisgrenze von < 10 µg L-1 bestimmen. Allerdings dauerte

das Wiedererreichen der Basislinie mit der Mikrowaage fast eine halbe Stunde

und damit etwa achtmal so lang wie mit der SPR-Methode.

Da viele der vorgestellten TNT-Immunosensoren nicht die Empfindlichkeit des

ELISA erreichen und die Antikörper zunächst per ELISA (siehe auch Abschnitt

2.2.4, zwischen 1 und 0.002 µg L-1) charakterisiert werden, soll abschließend

noch die Entwicklung eines tragbaren TNT-Chemilumineszenz-ELISA erwähnt

werden. Ciumasu et al. [266] verwendeten einen für TNT spezifizierten Einmal-

chip, auf dessen Goldoberfläche der TNT-Antikörper immobilisiert wurde und der

außerdem auch das HRP-Konjugat und ein Probenreservoir enthält. Der Rest der

Apparatur blieb universell und könnte auch für andere Analyten mit dem entspre-

chenden Chip benutzt werden. Für TNT wurde damit eine Nachweisgrenze von

0.1 µg L−1 erreicht. Inzwischen lassen sich derartige Systeme noch weiter zu

einem ELISA-on-a-chip miniaturisieren – eine Möglichkeit, die sich, aufgrund der

relativ einfachen Umsetzung aus einem klassischen ELISA, der kurzen Entwick-

lungszeit von 30 s und der mit 0.027 µg L-1 hohen Empfindlichkeit (für kardiales

Troponin gezeigt) [267], vielleicht längerfristig durchsetzen kann [268].

2.3.4 Möglichkeit des Nachweises aus der Gasphase

Alle bis hierhin betrachteten Antikörper-basierten Methoden operieren in wässri-

ger Phase. Eine besondere Herausforderung, und vor allem für die Detektion von

Grundlagen 33

Explosivstoffen interessant, ist der möglichst direkte Nachweise aus der Umge-

bungsluft. Insbesondere für TATP mit seinem hohen Dampfdruck von 7 Pa bei

25 °C (vgl. TNT: 5 × 10-4 Pa (25 °C)) [79] bietet sich ein derartiges Verfahren an.

Jedoch sind Antikörper bzw. generell Proteine auf physiologische Bedingungen

angewiesen und ein Austrocknen führt aufgrund fehlender Wechselwirkungen

hauptsächlich mit Wassermolekülen zur Veränderung ihrer dreidimensionalen

Struktur (Denaturierung) und dadurch zu Einbußen in ihrer Funktion [269]. Daher

sind Gasphasen-Immunoassays selten.

Dennoch unternahmen Bowen et al. [48] einen Versuch, den sie fast identisch

zuvor zum Patent anmeldeten [270], und bauten zur Detektion von TNT aus der

Gasphase einen Antikörper-basierten SPR-Biosensor. Auf dessen Oberfläche

wurden monoklonale TNT-Antikörper kovalent an einen Monolayer gebunden,

der seinerseits an einem dünnen Goldfilm auf einem Trägerglas immobilisiert

war, was bedeutet, dass die Antikörper dann trocken lagen. Es konnte immerhin

gezeigt werden, dass TNT in gesättigter Gasphase, die sie bei 40 °C mit einer

Konzentration von 73 ppb angaben, nachgewiesen werden kann. Es kam jedoch

auch zu Kreuzreaktionen, u. a. mit Dinitrotoluol und Toluol, die jedoch nicht wie

TNT irreversibel an die Sensoroberfläche banden.

Eine Möglichkeit der Stabilisierung von Biomolekülen für die Anwendung in der

Gasphase demonstrierten Jaworski et al. [271]. Aus einer Phagen-Bibliothek

(Abschnitt 2.2.4) wurde zunächst ein Dinitrotoluol-bindendes Peptid aus zwölf

Aminosäuren selektiert, welches dann über ein Oligoethylenglykol auf einer

Goldoberfläche immobilisiert wurde. Das hygroskopische Oligoethylenglykol soll

als Hydrogel bewirken, dass das Peptid auch an der Luft nicht austrocknet. Lei-

der wurden auch hier nur wieder Tests in einem mit DNT gesättigtem Gasraum

(angegeben mit 18 ppm bei 60 °C) durchgeführt. Die Arbeitsgruppe konnte so

zwar zeigen, dass die Bindung von DNT an die selektive Oberfläche erfolgte. Es

trat zugleich aber eine Kreuzreaktion mit TNT ein, das trotz des deutlich niedrige-

ren Dampfdrucks [6] ein Viertel der Signalintensität von DNT erreichte. Dennoch

könnten Hydrogele helfen, Antikörper für den Einsatz in der Gasphase zu stabili-

sieren. Für den Nachweis von Kokain (bzw. Benzoylecgonin) aus der Luft mit

einem SAW (akustische Oberflächenwelle)-Immunosensor wurden Hydrogele

zuvor schon erfolgreich verwendet und dabei die auf der Sensoroberfläche über

Protein A immobilisierten Antikörper mit einem Hydrogelfilm überzogen [272].

Eine Nachweisgrenze wurde nicht angegeben (wieder in gesättigter Gasphase

getestet), aber es ist davon auszugehen, dass die Analyt-Antikörper-Bindung

durch den Einsatz des Hydrogels geschwächt wird [273], was sich negativ auf

Affinität und Selektivität auswirkt.

Generell kann ein Analyt auch aus der Gasphase angereicht und anschließend

aus flüssigem Medium untersucht werden. Durch die Kombination eines Con-

tinuous-flow-Immunosensors und einem Gerät zur Probenanreicherungen aus

der Luft (Zyklonabscheider) entwickelten Whelan et al. [54] ein schnelles

(< 10 min) Verfahren zum Nachweis von TNT aus der Gasphase. So wiesen sie

zwar TNT nicht direkt aus der Luft nach, konnten aber weiterhin in wässriger Lö-

34 Grundlagen

sung mit den monoklonalen TNT-Antikörpern arbeiten und noch 2.5 µg L-1 (11 nM

oder 2.5 ppb) TNT detektieren.

35

3.1 Materialien

3.1.1 Chemikalien

Sämtliche Chemikalien wurden in der angegebenen, zumeist höchsten erhältli-

chen Qualität verwendet und von AccuStandard (AccuStandard, Inc., New Ha-

ven, CT, USA), AppliChem (AppliChem GmbH, Darmstadt), Artimmun Analytik

(Artimmun Analytk GmbH, Kelkheim), J.T.Baker (Mallinckrodt Baker, inzwischen

Avantor, Griesheim), LGC Standards (LGC Standards GmbH, Wesel), Merck

(Merck KGaA, Darmstadt), SERVA (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg),

Protea Biosciences (Proteabio Europe S.A.S., Nîmes, Frankreich) und Sigma-

Aldrich (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München) bezogen. Sigma-Aldrich um-

fasst die Marken Aldrich, Fluka, Riedel-de Haën und Sigma.

Substanz Reinheit

Hersteller, Bestellnummer Lotnummer

Aceton picograde

LGC Standards, SO-1142-B #603905 und #810903

Acetonitril Baker HPLC analyzed

J.T.Baker, 9012 #0726217021

Ammoniumnitrat ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 09890 #1376281

Aprotinin from bovine lung, solid, 3-7 TIU mg-1

Sigma-Aldrich, A4529 #058K7018

2-Butanon ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 04380 #BCBB1352

Chloroform LiChrosolv

Merck, 102444 #K37538744

Chloroform-D1 99.8 atom % D

Sigma-Aldrich, 151823 #MKAA4173

Dichlormethan Baker, min. 99%

J.T.Baker, 7153 #0716302005

N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) ≥ 99%

Sigma-Aldrich, D80002 #S08931-183

Dikaliumhydrogenphosphat ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 60354 #1408936 und #1438965

36 Experimenteller Teil

N,N-Dimethylacetamid ≥ 99.5%, over molecular sieve

Sigma-Aldrich, 38839 #1355816, #1390787 und #1437715

N,N-Dimethylformamid (DMF) ≥ 99.5%, over molecular sieve

Sigma-Aldrich, 40228 #1345724 und #BCBB4151

Dimethylsulfoxid (DMSO) ≥ 99.5%, over molecular sieve

Sigma-Aldrich, 41648 #BCBB4817

Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 71644 und 71643 #1278485 bzw. #BCBC4956

Dinatriumtetraborat wasserfrei zur Analyse

Merck, 106306 #A886806749

N,N′-Disuccinimidylcarbonat (DSC) ≥ 95.0%

Sigma-Aldrich, 43720 #1360733

Ethylenglykol ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 03750 #1447265

Glycerol wasserfrei reinst

Merck, 104093 #306K19201793

Haushaltszucker (Saccharose) Diamant (Pfeifer & Langen, Köln)

Hexamethylentetramin ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 33233 #SZE90680

n-Hexan picograde

LGC Standards, SO-1244-B #702401 und #812122

Isobutylchloroformiat 98%

Sigma-Aldrich, 177989 #1322957

Kaliumdihydrogencitrat ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 60214 #1382178

Kaliumdihydrogenphosphat ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 60219 #1182467 und #1158643

Kaliumsorbat ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 85520 #1209745 und #1254877

[12]Krone-4 98%

Sigma-Aldrich, 194905 #MKBB0225G9

[18]Krone-6 ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 274984 #1311427

Leupeptin-Hydrochlorid > 90%, microbial

Sigma-Aldrich, L9783 #089K8629

Methanol ≥ 99.8%, Baker HPLC analyzed

J.T.Baker, 8402 #0735216002, #0816316003 und #0908300015

Methanol-D4 min. 99.8% D

Merck, 106028

4-Methylmorpholin ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 67869 #1242607

Methylsulfonsäure ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 64280 #1381742

Molekularsieb mit Farbindikator, 3 Å

Sigma-Aldrich, 69839 #1353770

Experimenteller Teil 37

N-Hydroxysuccinimid (NHS) zur Synthese, ≥ 99%

Merck, 804518 #S35137248

Natriumazid ≥ 99%

Sigma-Aldrich, 13412 #50170

Natriumchlorid ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 71378 und 71376 #1266100 und #1317413 bzw. #1429188

Natriumcarbonat ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 71345 #1202847

Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 71502 #1138615

Natriumhydrogencarbonat ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 71627 #1136674

Natriumhydroxid zur Analyse, max. 0.02% K

Merck, 106469 #B601169609

Natriumsulfat wasserfrei

Merck, 106639 #A637539537

Nitroguanidin contains 25% water

Sigma-Aldrich, N17351 #S31452

7-Oxooktansäure 98%

Sigma-Aldrich, 343625 #09017CE

Pefabloc SC AEBSF Function tested, homogeneous in TLC

Roche, 11429868001

Pepstatin A min. 98%

AppliChem, A2205 #9M005031

2-Pentanon ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 68950 #1399841

3-Pentanon ≥ 99%

Sigma-Aldrich, 345121 #S78959-489

Phosphorsäure ≥ 85%

Sigma-Aldrich, 215104 #S01276-022

Polyvinylalkohol Mw 9 000-10 000, 80% hydrolyzed

Sigma-Aldrich, 360627 #03630EH

Salzsäure 32%, Baker analyzed

J.T.Baker, 6070 #0627901007

Schwefelsäure 95-97%, Baker analyzed

J.T.Baker, 6057 #0511210002

Sinapinsäure ultrapure, MALDI Matrix

Protea Biosciences, CMS-101 #0313092

Tetrabutylammoniumborhydrid ≥ 97.0%

Sigma-Aldrich, 86855 #422555/1 und #07420KA

Tetrahydrofuran (THF) ≥ 99.5%, over molecular sieve

Sigma-Aldrich, 87371 #1358908

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) research grade

SERVA, 35926 #080550 und #090248

38 Experimenteller Teil

Titan(IV)oxidsulfat schwefelsaure Lösung, 27-31% H2SO4

Sigma-Aldrich, 89532 #433555/1

p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat 98.5%

Sigma-Aldrich, T35920 #1356227

Trehalose-Dihydrat 97%

Artimmun Analytik #2007-1130

Triacetontriperoxid-Standard 0.1 mg mL-1 in Acetonitril

AccuStandard, M-8330-ADD-24 #B7090089

Trifluoressigsäure (TFA) 99%

Sigma-Aldrich, T6508 #096K152 (für HPLC)

Trifluoressigsäure (TFA) zur Proteinsequenzierung

Merck, 108178 #S4841878 825 (für MALDI-TOF-MS)

Tributylamin ≥ 99.0%

Sigma-Aldrich, 90780 #1281528

Tween 20 pure

SERVA, 37470 #090135 und #100541

Wasserstoffperoxid 30% (w/w)

Sigma-Aldrich, H1009 #S45604-507 (für Synthesen)

Wasserstoffperoxid ≥ 30%

Sigma-Aldrich, 95321 #1344721 (für ELISA)

Zitronensäure ≥ 99.5%

Sigma-Aldrich, 27488 #1436796

Diacetondiperoxid (DADP), Hexamethylentriperoxiddiamin (HMTD), Triacetontri-

peroxid (TATP) sowie die anderen Triperoxide (Tributanontriperoxid, Tri-2-

pentanontriperoxid und Tri-3-pentanontriperoxid) wurden aus den angegeben

Chemikalien selbst hergestellt.

Hexogen (RDX), Nitropenta (PETN, Pentrit), Oktogen (HMX) und 2,4,6-

Trinitrotoluol (TNT) wurden von der BAM, Fachgruppe 2.3, zur Verfügung ge-

stellt.

3.1.2 Proteine

Zur Synthese des Immunogens wurde Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum

albumin), Fraction V receptor grade, lyophilized von SERVA Electrophoresis

GmbH, Heidelberg, Bestellnummer 11924, eingesetzt. Für die Immunogene 1

und 2 (Mausimmunisierung) wurde BSA mit der Lotnummer #14084 und für das

Immunogen 3 (Kaninchenimmunisierung) der Lotnummer #080026 verwendet.

Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase, EC 1.11.1.7), EIA gra-

de, Bestellnummer 10814393001 wurde von Roche Applied Science (Roche Di-

agnostics Deutschland GmbH, Mannheim) bezogen. Vier der HRP-Konjugate

(1-4) wurden mit HRP der Lotnummer #14265740 und das fünfte mit der Lot-

nummer #13074735 hergestellt. Diese Konjugate wurden in Guardian Peroxidase

Conjugate Stabilizier/Diluent von Pierce/Thermo Scientific (Thermo Fisher Scien-

Experimenteller Teil 39

tific BV & Co KG, Bonn) verdünnt und gelagert (Bestellnummer 37548, Lotnum-

mern #JC121597 und #JK128522).

Ovalbumin (OVA), MS grade zur Herstellung von OVA-Konjugaten wurde von

Protea Biosciences (Proteabio Europe S.A.S., Nîmes, Frankreich, Bestellnummer

PS-125, Lotnummer #0904081) erworben.

Die verwendeten sekundären Antikörper (-IgG) stammen von Acris Antibodies

GmbH, Herford. Für die Immunoassays mit Kaninchenserum wurde

-Kaninchen-IgG (Polyclonal Antibody to Rabbit IgG [H&L] - Purified, Bestell-

nummer R1364P, Lotnummer #19406) benutzt. Die Konzentration des aus Ziege

gewonnenen polyklonalen Antikörpers wurde mit 2.23 mg mL-1 angegeben.

ELISA mit Mausserum wurden zumeist mit -Maus-IgG (Polyclonal Antibody to

Mouse IgG [H&L] – Purified, Bestellnummer R1256P, Lotnummer #20243) aus

Schaf durchgeführt, wofür eine Konzentration von 2.17 mg mL-1 benannt wird.

Seltener wurde ein zweiter -Maus-IgG (Polyclonal Antibody to Mouse IgG F(c) –

Purified, Bestellnummer R1612P, Lotnummer #20185) verwendet, welcher in

Ziege erzeugt wurde, nur den Fc-Teil eines Maus-Antikörpers erkennt und eine

Konzentration von 2.05 mg mL-1 hat.

Des Weiteren wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München, -IgG-

Peroxidase-Konjugate (-IgG-HRP) gekauft: -Maus-IgG-HRP (Anti-Mouse IgG

(whole molecule)–Peroxidase antibody produced in goat, 0.8 mg mL-1, Bestell-

nummer A4416, Lotnummer #067K6010) für Immunoassays mit Mausserum und

-Kaninchen-IgG-HRP (Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Peroxidase antibody

produced in goat, 0.9 mg mL-1, Bestellnummer A6154, Lotnummer #028K6035)

für Immunoassays mit Kaninchenserum. Gold-konjugierte -Kaninchen-IgG

(Dressed Gold, 40 nm, 50 OD, goat anti-rabbit IgG [H&L]) für immunchromato-

graphische Schnelltests wurden von BioAssay Works, L.L.C., Ijamsville, MD,

USA (Bestellnummer DGRGL-B001, Lotnummer #I07J-05) bezogen.

Als Pufferzusätze wurden BSA, ≥ 98%, lyophilized powder (Bestellnummer

A7906, Lotnummer #078K0729) und Casein, sodium salt from bovine milk (Be-

stellnummer C8654, Lotnummer #045K0159) verwendet. Außerdem wurde Pfer-

deserum, donor herd, USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture, suitable

for hybridoma (Bestellnummer H1270, Lotnummer #078K0375) bei einigen Tests

eingesetzt. Diese drei Komponenten wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

München erhalten.

3.1.3 Puffer und Lösungen

Die nachstehenden Puffer und Lösungen wurden, sofern nicht anders angege-

ben, mit Reinstwasser angesetzt, welches zur Demineralisierung mittels Ionen-

austauscher und weiterer Reinigung durch ein Milli-Q-Wasserreinigungssystem

geleitet wurde.

40 Experimenteller Teil

Laufmittel A (HPLC) Wasser mit 0.1% (v/v) TFA

Laufmittel B (HPLC) Acetonitril/Methanol (10:1) mit 0.1% (v/v) TFA

PBS 10 mM Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat

70 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat

145 mM Natriumchlorid

pH 7.6

Natriumhydrogencarbonatpuffer 130 mM Natriumhydrogencarbonat

pH ~ 8

Waschpuffer, 60 × 45 mM Kaliumdihydrogenphosphat

375 mM Dikaliumhydrogenphosphat

1.5 mM Kaliumsorbat

3% (v/v) Tween 20

pH 7.6

(vor Verwendung 1:60 mit Wasser verdünnen)

0.1% BSA/PBS 0.1% (w/v) BSA

in PBS

(2-3 Tage bei 4 °C haltbar)

0.005% BSA/PBS 1:20 in PBS verdünntes 0.1% BSA/PBS

(2-3 Tage bei 4 °C haltbar)

Blockpuffer 1% (w/v) Casein

in PBS

(täglich frisch ansetzen)

Citratpuffer 220 mM Kaliumhydrogencitrat

0.5 mM Kaliumsorbat

pH 4.0

TMB-Lösung (nach [236]) 8.0 mM Tetrabutylammoniumborhydrid

40 mM 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)

in N,N-Dimethylacetamid

(unter N2- oder Ar-Schutzatmosphäre herstellen)

Substratlösung 21.6 mL Citratpuffer

8,34 µL Wasserstoffperoxid

540 µL TMB-Lösung

(für eine Mikrotiterplatte, stets frisch ansetzen)

Protease-Inhibitor-Mix, 100 × 0.1% (w/v) Pepstatin A in Methanol

0.1% (w/v) Aprotinin in Wasser

0.1% (w/v) Leupeptin-Hydrochlorid in Wasser

12.5% (w/v) Pefabloc SC AEBSF in Wasser

zu gleichen Teilen mit weiterem Teil Wasser

mischen, Lagerung bei -20 °C

Experimenteller Teil 41

Faecesextraktionspuffer 1% (w/v) BSA oder 0.1% (v/v) Tween 20

1% (w/v) Natriumazid

1% (v/v) Protease-Inhibitoren-Mix, 100 ×

in PBS

(täglich frisch ansetzen)

Konservierungslösung 0.5% (w/v) BSA

0.5% (w/v) Polyvinylalkohol

0.5% (w/v) Trehalose-Dihydrat

in PBS

(täglich frisch ansetzen)

LFA-Vorbehandlungslösung 4-5% (w/v) Saccharose (Haushaltszucker)

0.5-0.6% (w/v) BSA

0.3-0.4% (v/v) Tween 20

in PBS

Die pH-Werte der in braunen Flaschen verwahrten Puffer wurden mit verdünnter

Salzsäure bzw. Natriumhydroxidlösung eingestellt. Citratpuffer und TMB-Lösung

wurden bei 4 °C und dunkel gelagert. Der 100 × Protease-Inhibitor-Mix lagerte

bei -20 °C. Die Lagerung der anderen Lösungen erfolgte bei Raumtemperatur.

Die Lösungen wurden maximal drei Wochen verwendet, ausgenommen die Sub-

stratlösung sowie alle proteinhaltigen Lösungen.

Die Herstellung von Stamm- und Kalibrierlösungen ist in späteren Abschnitten

beschrieben, etwa bei den Synthesen entsprechender Substanzen oder ihrer

Verwendung.

3.1.4 Verbrauchsmaterial

Beschreibung Hersteller

Dispensierspitzen, 1 und 2.5 mL Combitips plus

Eppendorf, Hamburg

Entsalzungssäule PD-10 Desalting Columns with Sephadex G-25 Medium

GE Healthcare Europe GmbH, München

GC-Säule DB-XLB, fused silica capillary column, 20 m × 0.25 mm ID × 0.25 µm

Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Wald-bronn

GC-Vorsäule deactivated fused silica capillary precol-umn, 2 m × 0.25 mm ID

Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Wald-bronn

Filtermembran Nucleopore Polycarbonate Track-Etch Membranes, 25 mm Ø, 0.6 µm

Whatman GmbH, Dassel (GE Healthcare)

42 Experimenteller Teil

HPLC-Säule UltraSep ES, Phen1, C18, Reversed pha-se, 260 mm × 3 mm, 5 μm

SEPSERV (Separation Service Berlin), Berlin

HPLC-Säule, monolithisch Onyx, Monolithic C18, 50 mm × 2.0 mm

Phenomenex Ltd., Aschaffenburg

Mikro-Entsalzungssäule Zeba Micro Desalt Spin Columns

Pierce/Thermo Fisher Scientific BV & Co KG, Bonn

Mikrotiterplatten, transparent, stark bindend Immuno 96 MicroWell Solid Plates, Ma-xiSorp, C96

Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)

Mikrotiterplatten, transparent, unbehandelt 96 MicroWell Plates, Non-treated, Flat

Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)

Mikrotiterplatten, UV-transparent UV-Star 96 Microplate, 96 Well

Greiner Bio-One, Frickenhausen

Mikrotiterplatte mit Glaseinsätzen 96er Ausführung, Volumen 1200 µL

Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt

Verschlussfolie Parafilm

Pechiney Plastic Packaging Com-pany, Chicago, IL, USA

Pipettenspitzen, diverse Größen epT.I.P.S.

Eppendorf, Hamburg

Pipettenspitzen, für Liquidator96 LTS Tips, LQR-200

RAININ Deutschland/Mettler-Toledo GmbH, Giessen

pH-Indikatorpapier Universalindikator pH 1-14

Merck KGaA, Darmstadt

Schraubdeckelglasfläschchen, 2 mL Screw cap vials

Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co.KG, Wald-bronn

Waschbehälter für Zapfenplatten TSP Washing Tray

Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)

Zapfenplatten, stark bindend Immuno TSP, MaxiSorp

Nunc GmbH & Co. KG, Langen-selbold (Thermo Scientific)

Mikroreaktionsgefäße in diversen Größen und Ausführungen wurden meist von

Eppendorf, Hamburg bezogen oder die Eigenmarke von neoLab Migge Laborbe-

darf-Vertriebs GmbH, Heidelberg benutzt. Außerdem standen verschiedenste

klare und braune Flaschen mit einem Volumen von 15 mL bis einem Liter und

andere Glasgeräte zur Verfügung, u. a. von SCHOTT AG, Mainz und BRAND

GmbH + CO KG, Wertheim. Einmalspritzen und -kanülen in unterschiedlichen

Größen wurden von Becton Dickinson GmbH, Heidelberg (BD Plastipak und BD

Mircolance) bzw. Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen (Norm-Ject) erworben.

Für den Aufbau eines immunchromatographischen Schnelltests (LFA) wurden

Produkte von Millipore (Millipore GmbH, Schwalbach/Ts.) und Whatman (What-

man GmbH, Dassel, zugehörig zu GE Healthcare) als Muster dankend erhalten.

Zusätzlich wurde von BioAssay Works, L.L.C., Ijamsville, MD, USA ein mit Gold-

konjugiertem Protein A getränktes Band Proben- und Konjugatauftragsvlies (Pro-

tein A Tell-Tale Gold ribbon, 0.25 OD cm-2, Bestellnummer TTGA-S001, Lot-

nummer I07J-06) beschafft.

Experimenteller Teil 43

Bezeichnung Beschreibung

Hersteller, Bestellnum-mer, Lotnummer

diagnostische Membran

Hi-Flow Plus HF120 Nitrocellulose, 120 s 4-1 cm-1

Millipore, HF12002XSS, #R9PN61120

Hi-Flow Plus HF135 Nitrocellulose, 1350 s 4-1 cm-1

Millipore, HF13502XSS, #R0BA96904

Immunopore RP Nitrocellulose, 85-115 s 4-1 cm-1

Whatman, 78356403, #D107720

Proben- und Konjugatauftragsvlies*

Hi-Flow G041 Glasfaser

Millipore, GFCP203000, #0585475

Rapid 24 Glasfaser, Absorptionsvermögen: 55 mg cm-2

Whatman, 8131-6621

Rapid 27 Glasfaser, Absorptionsvermögen: 40 mg cm-2

Whatman, 8132-6621, #880935

Standard 14 Glasfaser, Absorptionsvermögen: 55 mg cm-2

Whatman, S8133-6621, #680620

Absorptionsvlies*

Hi-Flow C083 Cellulosefaser

Millipore, CFSP223000, #88000702

CF3 Cellulosefaser, Wasseraufnahme: 31 mg cm-2

Whatman, 8113-6621, #900072

CF4 Cellulosefaser, Wasseraufnahme: 46 mg cm-2

Whatman, 8114-6621

CF6 Cellulose-Glasfaser, Wasseraufnahme: 128 mg cm-2

Whatman, 8116-6621, #755403

(*Verwendung in dieser Arbeit, Hersteller gibt mitunter mehrere Möglichkeiten an)

3.1.5 Geräte

Gerät Hersteller

Analysenwaage R 180 D-*D1

Sartorius AG, Göttingen

Einkanal-Pipetten, diverse Größen Research und Reference (variabel)

Eppendorf, Hamburg

ESEM Tabletop Microscope Hitachi TM-1000

Hitachi High-Technologie Corpora-tion, Tokyo, Japan

Evaporationsgerät SLS 02 Evaporator "Sweet Little Sixteen"

SLS Färber-Skutlarek GbR, Bad Münstereifel

44 Experimenteller Teil

GC-MS Trace DSQ mit CTC CombiPal (Probengeber)

Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen CTC Analytics, Zwingen, Schweiz

Handdispenser, manuell Multipette plus

Eppendorf, Hamburg

HPLC mit DAD Model 480 mit UVD 160S/320S

Gynkotek, inzwischen Dionex GmbH, Idstein

HPLC mit DAD Serie 1200

Agilent Technologies Sales & Ser-vices GmbH & Co.KG, Waldbronn

HPLC-MS Serie 1100 (HPLC) mit API 4000 (MS)

Agilent Technologies Sales & Ser-vices GmbH & Co.KG, Waldbronn (LC) und Applied Biosystems, Deutschland GmbH, Darmstadt

Hochauflösendes FT-ICR-MS LTQ FT

Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen

Magnetrührer, mehrfach Multipoint 15

H+P Labortechnik AG, Ober-schleißheim (Thermo Scientific)

MALDI-TOF-MS Reflex III

Bruker Daltonik GmbH, Bremen

Mehrkanal-Pipetten (8/12), elektronisch Research pro

Eppendorf, Hamburg

Mikrotiterplatten-96-Kanal-Pipette Liquidator96

Steinbrenner Laborsysteme GmbH, Wiesenbach (Mettler-Toledo, Gies-sen)

Mikrotiterplatten-Schüttler Titramax 101

Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach

Mikrotiterplatten-Spektrophotometer SpectraMax Plus384

Molecular Devices GmbH, Isma-ning

Mikrotiterplatten-Waschautomat ELx405 Select

BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall

Mikrozentrifuge (mit Kühlung) 5417 R mit Festwinkelrotor: FA-45-24-11 (rmax = 8.3 cm)

Eppendorf, Hamburg

NMR-Spektrometer, 400 MHz DMX 400

Bruker BioSpin GmbH, Rheinstet-ten

NMR-Spektrometer, 600 MHz Avance 600

Bruker BioSpin GmbH, Rheinstet-ten

Oberschalenwaage LP 1200 S(-OCE)

Sartorius AG, Göttingen

pH-Meter (pH/mV/°C) pH 211 Microprocessor

HANNA Instruments Deutschland GmbH, Kehl am Rhein

Röntgendiffraktometer SMART APEX II

Bruker AXS GmbH, Karlsruhe

Schüttler „Vortex“ MS 3 basic

IKA Werke GmbH & Co. KG, Stau-fen

Experimenteller Teil 45

Thermomixer, 1.5- und 2 mL-Adapter comfort

Eppendorf, Hamburg

Ultraschallbad Transsonic T 460

Elma GmbH & Co KG, Singen

Wasserreinigungssystem Milli-Q Synthesis A 10

Millipore GmbH, Schwalbach/Ts.

Das pH-Meter wurde mindestens einmal wöchentlich mit pH-Pufferlösungen von

Mettler-Toledo AG, Analytical, Schwerzenbach, Schweiz (Bestellnummern

51302069, pH 4.01; 51302047, pH 7.00 und 51302070, pH 9.21) kalibriert.

3.1.6 Computerprogramme

Für die Darstellung und Aufarbeitung der Ergebnisse wurden vorwiegend Micro-

soft Office 2003- und 2010-Produkte (Microsoft Corporation, Redmond, WA,

USA) sowie Origin 8G und 8.5G (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)

verwendet. Die chemischen Strukturen und die Vorhersage der NMR-Spektren

wurden mit ChemDraw Ultra 8.0 (CambridgeSoft Corporation, Cambridge, MA,

USA) erstellt. ArgusLab 4.0.1 (Mark A. Thompson Planaria Software LLC, Seatt-

le, WA, USA) wurde zum Zeichnen der Kugel-Stab-Modelle benutzt. Digitalkame-

ra- und ESEM-Aufnahmen wurden mit Corel PHOTO-PAINT X4 (Corel Corpora-

tion, Ottawa, CDN) nachbearbeitet.

Die Steuerung der einzelnen Geräte und zum Teil auch die Auswertung der

Ergebnisse erfolgte im Falle des Mikrotiterplatten-Spektrophotometers mit Soft-

max Pro 5.3 (Molecular Devices GmbH, Ismaning), für die HPLC von Gynkotek

über GynkoSoft 4.22 (Softron, inzwischen Dionex Softron GmbH, Germering) und

für die HPLC Serie 1200 von Agilent über ChemStation B.04.01 (Agilent Techno-

logies Sales & Services GmbH & Co.KG, Waldbronn), am GC-MS mit

Xcalibur 1.4 (Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen) sowie für die HPLC-MS

mittels Analyst 1.4.1 (Applied Biosystems/MDS SCIEX, Foster City, CA, USA).

Die Aufnahme und Prozessierung der NMR-Spektren erfolgte über Topspin 2.1

(Bruker BioSpin GmbH, Reinstetten). Die Daten zur Einkristallstrukturanalyse

wurden mit AXS SAINT 1.22 und SADABS 2.01 (Bruker AXS GmbH, Karlsruhe)

verarbeitet und die Strukturverfeinerung mit SHELXS 2008/1 und SHELXL

2008/4 [274] sowie die grafische Darstellung mit Mercury 2.4 (Cambridge

Crystallographic Data Centre, Cambridge, UK) vorgenommen.

46 Experimenteller Teil

3.2 Sicherheitshinweis

Das Arbeiten mit TATP erfordert äußerste Vorsicht: TATP neigt insbesondere im

trockenen Zustand dazu, unter Schlag, Reibung, statischer Elektrizität und Tem-

peraturerhöhung – aber auch spontan – zu explodieren. Außerdem sollte seine

Fähigkeit zur Sublimation berücksichtigt werden. Folglich sollte nur entsprechend

geschulten Personen der Umgang mit TATP unter Einhaltung angemessener

Schutzmaßnahmen gestattet sein. Zur Sicherheit wurden stets geringe Mengen

von maximal 100 mg synthetisiert und verarbeitet. Auch mit anderen Peroxid-

basierten Explosivstoffen ist so zu verfahren. Unter Einwirkung von schwefelsau-

rer Titan(IV)oxidsulfatlösung wurde TATP entsorgt.

3.3 Methoden

3.3.1 TATP-Synthese und weiterführende Untersuchungen

Synthese und Verarbeitung von TATP

Die Synthese und Reinigung durch Umkristallisation von TATP (3,3,6,6,9,9-

Hexamethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxonan) erfolgte auf Grundlage der Originalschrift

von Richard Wolffenstein [65] sowie den Arbeiten von Milas und Golubovic [89],

Matyas und Pachman [90] und Dubnikova et al. [46]. Dazu wurden 221 µL Ace-

ton (3 mmol) und 153 µL Wasserstoffperoxid (1.5 mmol, 30%) gemischt und auf

0 °C gekühlt, bevor 7.5 µL Schwefelsäure (0.015 mmol, 2 M) als Katalysator hin-

zugefügt wurden (Abbildung 3.1, Mechanismus siehe Abbildung 2.1). Der Ansatz

wurde anschließend bei Raumtemperatur ca. 24-48 h stehen gelassen. Die ent-

standenen TATP-Kristalle wurden abfiltriert und dreimal aus heißem Methanol

umkristallisiert.

Das gereinigte TATP wurde über Nacht im Exsikkator getrocknet, um dann per

NMR untersucht zu werden und vor allem der gravimetrischen Herstellung von

methanolischen Stammlösungen (1-15 g L-1) zu dienen. Aus diesen wurden Ka-

librierlösungen mit Reinstwasser volumetrisch angesetzt (Verdünnungsreihen im

Bereich von 0.8 ng L-1 bis 150 mg L-1), die hauptsächlich im ELISA verwendet,

die höheren Konzentrationen aber auch bei Untersuchungen mittels HPLC ein-

gesetzt wurden. Bei der HPLC wurden zusätzlich auch direkt die Stammlösungen

verwendet oder weitere methanolhaltige, nur wenig verdünnte Lösungen ange-

setzt sowie die Mutterlauge vom Umkristallisieren (gesättigte Lösung) benutzt.

Außerdem wurde eine gesättigte, wässrige Lösung mit ungelösten Kristallen da-

rin hergestellt, die zunächst mehrere Tage bei Raumtemperatur vor Sonnenlicht

geschützt geschüttelt und dann im Kühlschrank verwahrt wurde. Jeweils vor Ab-

nahme des Überstandes zu Messungen wurde diese Lösung am Tag zuvor unter

Schütteln wieder auf Raumtemperatur gebracht. Für GC-MS-Analysen wurden

Experimenteller Teil 47

Kalibrierlösungen in n-Hexan gravimetrisch hergestellt. Zusätzlich wurden kleins-

te TATP-Kristalle und unterschiedlich konzentrierte, wässrige TATP-Lösungen (je

50 µL) in gasdichte Schraubdeckelglasfläschchen mit Septen gegeben und meh-

rere Tage bei Raumtemperatur gründlich (horizontal und vertikal im Wechsel)

geschüttelt, um den Gasraum darüber zu sättigen und zu untersuchen. Die Kris-

talle zur Röntgenstrukturanalyse verblieben bis zur Untersuchung in ihrer Mutter-

lauge, da sie an der Luft zur Trübung neigten. TATP wurde stets dunkel gelagert,

wobei sich Feststoff, Mutterlauge und Kristalle in Mutterlauge bei Raumtempera-

tur und alle anderen Lösungen bei 4 °C befanden.

Abbildung 3.1: Schematische Darstellung der TATP-Synthese.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC und HPLC-MS)

Für verschiedenste Untersuchungen per HPLC mit Diodenarraydetektor (225 nm)

wurde ein binärer Gradient aus Laufmittel A (Wasser mit 0.1% (v/v) TFA) und

Laufmittel B (Acetonitril/Methanol (10:1) mit 0.1% (v/v) TFA) bei konstanter Fluss-

rate von 0.45 mL min-1 benutzt. Bei der Verwendung der UltraSep ES, Phen1-

Säule wurde zunächst mit einem dreiminütigen isokratischen Verlauf von 40%

Laufmittel B gestartet, welches dann innerhalb von 17 min auf 95% erhöht wurde.

Dieses Niveau wurde 10 min gehalten, ehe binnen 1 min die Ausgangsbedin-

gungen wieder eingestellt und damit die Säule für den nächsten Lauf 8 min äqui-

libriert wurde. Die Temperatur des Säulenofens betrug 30 °C.

Das HPLC-Programm wurde mittels HPLC (Serie 1100) mit Triple-Quadrupol-

Massenspektrometer-Kopplung (API 4000) und der UltraSep ES, Phen1-Säule

entwickelt und war ursprünglich zur Aufreinigung des TATP-Haptens (Abschnitt

3.3.2) vorgesehen. Da TATP und auch das Hapten nur sehr niedrige UV-Signale

liefern, mussten die Retentionszeiten mithilfe des Massenspektrums ermittelt

werden. Aufgrund des schwachen UV-Signals wurde auch die Verwendung von

Acetonitril als Laufmittel (niedrigere Basislinie) notwendig, wobei ohne einen Rest

Methanol (10% in Laufmittel B) TATP wiederum nicht im Massenspektrum zu

sehen war. TATP war nur mittels chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck im

positiven Ionen-Modus (APCI+) ionisierbar und das Hapten durch Elektrospray-

Ionisation im Negativmodus (ESI-). Der Einsatz von TFA ist für Untersuchungen

von TATP nicht erforderlich, bei der Hapten-Aufreinigung verbessert es jedoch

die Auflösung.

Untersuchungen zur Synthese von TATP sowie Konzentrationsbestimmungen

wie die Bestimmung der Wasserlöslichkeit von TATP erfolgten an der HPLC Mo-

del 480 mit UVD 160S/320S mit der UltraSep ES, Phen1-Säule. Die Trennung

der beiden Konformere, D3- und C2-TATP, sowie die Untersuchung der Kinetik

48 Experimenteller Teil

deren gegenseitiger Umwandlung wurden mit dem Gerät der Serie 1200 durch-

geführt, welches auch eine Kühlung des Probensammlers ermöglichte. Es wurde

hierbei vor allem die monolithische Onyx-Säule verwendet (ebenfalls Umkehr-

phasen-Säule). Für diese kleinere, monolithische Säule musste auch das HPLC-

Programm verkürzt werden (Ofentemperatur und Flussrate blieben): Der isokrati-

sche Verlauf mit 40% Laufmittel B zu Beginn dauerte 0.5 min, ging anschließend

in 8.5 min auf 95% Laufmittel B über und wurde so dann 3 min gehalten. Nach

weiteren 0.5 min wurden die Ausgangsbedingungen wieder erreicht und verblie-

ben für 3.5 min vor dem nächsten Lauf.

Bestimmung der Wasserlöslichkeit von TATP

Die gesättigte, wässrige Lösung wurde fünf Tage bei Raumtemperatur geschüt-

telt, anschließend der Überstand (60-80 µL, n = 3) in die HPLC injiziert und mit

dem oben beschriebenen HPLC-Programm (mit TFA) analysiert. Durch Einsprit-

zen (n = 2) verschiedener Volumina (20 µL, 30 µL, 40 µL 50 µL und 60 µL einer

0.5 g L-1 TATP-Lösung, entsprechend 10–30 µg) einer 1:2 volumetrisch in Was-

ser verdünnten 1 g L-1 methanolischen TATP-Stammlösungen wurde auf die glei-

che Weise eine lineare Kalibriergerade über die Absorption erhalten. Die Retenti-

onszeit von TATP betrug 16.9 min. Die Wasserlöslichkeit von TATP wurde bei

22 °C bestimmt, da alle Abläufe bei dieser Raumtemperatur erfolgten.

Die so ermittelte Konzentration für die gesättigte TATP-Lösung wurde später

auch im ELISA mit Mausserum (Abschnitt 3.3.5) verifiziert. Dazu wurde eine

1:10-Verdünnungsreihe des Überstandes angefertigt, welche zur Erstellung einer

ELISA-Kalibrierkurve diente, die mit der Kalibrierkurve einer Verdünnungsreihe

mit bekannter Konzentration verglichen wurde (jeweils 8-Punkt-Kurven, n = 4, auf

gleicher Platte).

Kinetische Untersuchungen der Umwandlung zwischen D3- und C2-TATP

Wie schon Widmer et al. [104] zeigten, lassen sich die beiden TATP-Konformere

per HPLC voneinander trennen und anschließend die Geschwindigkeit ihrer Um-

wandlung beobachten. Dazu wurde die monolithische Säule wegen der deutlich

kürzeren Analysezeiten (Programm oben beschrieben) benutzt und ohne TFA-

Zugabe gearbeitet. Es wurden 7 µL der am höchsten erhältlichen TATP-Lösung

(methanolische Mutterlauge, extrapoliert: ~ 40 g L-1, Literaturwert [81]: 38 g L-1) in

das System eingebracht. Nach 2.5 min kam das Haupt-TATP-Signal des

D3-TATP-Konformers und nach 3.0 min das kleinere Signal des C2-TATP-

Konformers. Letzteres wurde in ein gekühltes Fläschchen aufgefangen und die

erhaltenen 150 µL mit 350 µL Wasser verdünnt. Dadurch stellte sich die Tempe-

ratur der Lösung schnell wieder auf Raumtemperatur (23 °C) ein und 50 µL der

verdünnten C2-TATP-Fraktion konnten alle 16 min reinjiziert werden. Gleiches

wurde wiederholt, nur dass die verdünnte C2-TATP-Fraktion bei 37 °C (mittels

Thermomixer) gehalten wurde und 90 µL reinjiziert werden konnten. Die Abnah-

me des Signals des C2-Konformers bei gleichzeitiger Entstehung des

D3-Konformers wurde bis zur Einstellung des Gleichgewichts im Chromatogramm

Experimenteller Teil 49

beobachtet. Aus den Messpunkten ließen sich die Halbwertszeiten der Umwand-

lung zwischen den TATP-Konformeren bei 23 °C und 37 °C über eine Exponenti-

alfunktion (ohne Berücksichtigung der Rückreaktion) bestimmen. Daraus konnte

die Umwandlungskonstante (Zerfallskonstante) k und mit ihr wiederum die Akti-

vierungsenergie EA mit

zumindest näherungsweise ermittelt werden, wobei R die allgemeine Gaskon-

stante und T die Temperatur in Kelvin ist. Außerdem konnte aus dem Verhält-

nis K der beiden Konformere im Gleichgewichtszustand die Energiedifferenz E

zwischen den beiden Konformeren in der Gasphase mit

berechnet werden (R und T wie zuvor).

Gaschromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung (GC-MS)

TATP, insbesondere sein Verhalten in der Gasphase, wurde auch gaschromato-

graphisch mit gekoppeltem MS (Trace DSQ) untersucht. Dazu wurde die Analy-

senmethode unter Aufnahme des kompletten Massenspektrums von m/z 30-400

mit Helium als Trägergas optimiert (mit Einflüssen aus [123-125]), die auch als

Referenzmethode dienen kann. Der Heliumfluss durch die DB-XLB-Säule mit

Vorsäule betrug stets 1.0 mL min-1. Die Starttemperatur des Säulenofens lag bei

60 °C für 2 min und es wurde dann mit 10 °C je Minute auf 150 °C hochgeheizt,

die wiederum 2 min gehalten wurden. Die Ausgangstemperatur des PTV-

Injektors wurde für 0.2 min bei 50 °C gehalten, ehe dieser mit 12 °C je Sekunde

auf 150 °C erhitzt wurde und 1 min bei dieser Temperatur verblieb. Die optimier-

ten Temperaturen der Transferleitung sowie der Ionenquelle betrugen 150 °C.

Die Quadrupol-Massenspektren wurden mit Elektronenstoßionisation bei 70 eV

im SIM-Modus mit m/z 59, 75 und 222 aufgenommen. Die Injektionen erfolgten

splitlos (1 min) und mit einer gasdichten 10 µL-Spritze des Probengebers, wobei

von den TATP-Lösungen in n-Hexan jeweils 1 µL injiziert wurde. Für die Gaspro-

ben erwies sich eine Dosierung von 6 µL am geeignetsten. Die Retentionszeit für

TATP betrug 8.4 min. Die Auswertung der Daten erfolgte manuell über die Sig-

nalflächen der Chromatogramme und es wurden lineare Kalibriergeraden (10

Messpunkte, n = 3) mit einem Korrelationskoeffizienten von jeweils > 0.99 erhal-

ten.

Bestimmung von TATP in der Gasphase

Zunächst wurde mittels GC-MS (siehe oben) die Konzentration von TATP in ge-

sättigter Gasphase bei 25 °C (Raumtemperatur) bestimmt. Dazu wurden jeweils

6 µL (n = 3-6) des Gasraums ausgiebig geschüttelter, gasdichter Schraubdeckel-

dT

kdRTEA

ln 2

(Gleichung 1)

K ln RTE2

3

C

D K mit (Gleichung 2)

50 Experimenteller Teil

glasfläschchen (n = 4), die kleine TATP-Kristalle enthielten, über Septen ent-

nommen und injiziert. Der TATP-Gehalt wurde anhand einer Kalibriergeraden mit

einem Korrelationskoeffizienten von 0.9993 bestimmt.

Des Weiteren wurde der Gasraum von auf gleiche Weise behandelten

Schraubdeckelglasfläschchen (n = 2), in denen sich jeweils 50 µL einer wässri-

gen TATP-Lösung der Konzentrationen 0.5, 50 bzw. 150 mg L-1 befanden, analy-

siert (n = 2). Dadurch sollte die Menge an TATP ermittelt werden, welches aus

der flüssigen Phase in die Gasphase übergeht. Das Volumen der verwendeten

Glasfläschchen wurde durch Auswiegen mit Wasser bestimmt und betrug durch-

schnittlich 2 080 µL. Die Probenvorbereitung und Messungen erfolgten bei 22 °C.

Einkristallstrukturanalysen

Die Einkristallstrukturanalysen wurden an einem Röntgendiffraktometer SMART

APEX II durchgeführt. Die dabei verwendete Strahlung war mit einem Graphit-

kristall monochromatisierte MoK-Strahlung ( = 0.71073 Å). Aufgrund des hohen

Dampfdrucks von TATP wurden diese Messungen bei -80 °C durchgeführt, die

restlichen Messungen jeweils bei Raumtemperatur (spätere Abschnitte). Die Da-

tenreduktion erfolgte mit den Programmen AXS SAINT und SADABS (Absorpti-

onskorrektur). Die anschließende Strukturlösung wurde mit Hilfe direkter Metho-

den und die Strukturverfeinerung (full-matrix least-squares on F2) mittels

SHELXS und SHELXL [274] durchgeführt. Dabei wurden die anisotropen Tempe-

raturfaktoren aller Nicht-Wasserstoffatome bestimmt. Die Wasserstoffatome wur-

den als isotrop angenommen mit einem Wert von Uiso = 1.2-mal dem Äquivalent

des Mutteratoms. Im Falle von Methylengruppen betrug dieser Wert 1.5.

Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)

1H- und 13C-NMR-Spektren wurden bei 25 °C unter Standardbedingungen zur

Kontrolle von Synthesen, insbesondere wenn aus diesen keine Kristalle resultier-

ten, aufgenommen. Die Strukturverifikation erfolgte über H,H-COSY- sowie H,C-

HMBC- und H,C-HSQC-Korrelationsspektren. Die Messungen entstanden am

600 MHz-Spektrometer (Avance 600) mit 600.20 MHz für 1H- und 150.94 MHz für 13C-Spektren oder am 400 MHz-Spektrometer (DMX 400) mit 400.14 MHz für 1H-

und 100.62 MHz für 13C-Spektren. TATP und andere zu untersuchende Substan-

zen wurden, wenn nicht anders erwähnt, in deuteriertem Methanol gelöst und auf

dessen Verschiebung gegen Tetramethylsilan = 3.31 ppm (CHD2OD) bzw.

= 49.15 ppm (CHD2OD) bezogen.

3.3.2 Synthese des TATP-Haptens

In abgewandelter Form der Synthese von TATP (Abbildung 3.1) konnte durch die

Zugabe von 7-Oxooktansäure ein carboxyliertes TATP, 6-(3,6,6,9,9-Pentamethyl-

1,2,3,5,7,8-hexaoxonan-3-yl)hexansäure (C14H26O8, M = 322.35 g mol-1), erzeugt

Experimenteller Teil 51

werden. Dieses TATP-Hapten wurde aus einer äquimolaren Mischung von je

0.5 mmol Aceton (37 µL), Wasserstoffperoxid (51 µL, 30%) und 7-Oxooktansäure

(79 mg, 98%) synthetisiert, der nach Kühlung auf 0 °C noch 2.5 µL Schwefelsäu-

re (0.005 mmol, 2 M) zugefügt wurde (Abbildung 3.2). Der Ansatz wurde für min-

destens 24 h bis hin zu mehreren Tagen bei Raumtemperatur inkubiert.

Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der TATP-Hapten-Synthese.

Vor der Aufreinigung des TATP-Haptens mittels HPLC wurde 1 mL Wasser zu

dem Reaktionsansatz gegeben und dieser dann 10 min bei maximaler Ge-

schwindigkeit (16 400 rpm) zentrifugiert. Es entstanden zwei Phasen, von denen

die obere, wässrige verworfen und die untere, etwas zähflüssig-trübe in 500 µL

40% Laufmittel B (Ausgangsbedingung bei der HPLC) aufgenommen wurde.

Durch diesen Schritt konnte bereits ein Großteil der wasserlöslichen Verunreini-

gungen, wie auch Wasserstoffperoxid und die 7-Oxooktansäure, entfernt werden.

Das auf diese Weise vorgereinigte Produkt wurde anschließend per HPLC mit

der unter Abschnitt 3.3.1 aufgeführten Methode (mit TFA) von Ausgangsstoffe

und Nebenprodukten isoliert. Eine Trennung mit der monolithischen Säule gelang

nicht, während das Hapten von der UltraSep ES, Phen1-Säule 15.8 min (Model

480 mit UVD 160S/320S) bzw. 16.4 min (Serie 1200) eluierte. Das bei dieser

Reaktion ebenfalls entstandene TATP folgte bei Minute 17.3 bzw. 17.4. Die ge-

sammelte TATP-Hapten-Fraktion wurde unter einem Stickstoffstrom (SLS 02

Evaporator "Sweet Little Sixteen") eingedampft und über Nacht im Exsikkator

getrocknet. Die erhaltenen Kristalle wurden mittels Röntgenstrukturanalyse und

NMR (siehe Abschnitt 3.3.1) untersucht und mit der Struktur des TATP vergli-

chen. An einem Fouriertransformations-Ionenzyklotronresonanz-MS (ESI--FT-

ICR-MS) wurde außerdem ein hochaufgelöstes Massenspektrum aufgenommen.

3.3.3 Herstellung von Immunogenen und anderen TATP-Proteinkonjugaten

Kopplung des TATP-Haptens an Proteine

Der eigentliche Zweck der Synthese des TATP-Haptens war, ein kopplungsfähi-

ges TATP-Derivat zur Herstellung von TATP-Immunogenen und anderen TATP-

Proteinkonjugaten zu bekommen. Wie in Tabelle 3.1 aufgelistet, erfolgten zahl-

reiche Kopplungen nach verschiedenen Methoden und für unterschiedliche Ver-

wendungen. Die Konjugation erfolgt vorwiegend über die -Aminogruppen der

Lysinreste der Proteine. Theoretisch ist jedoch ebenso die Kopplung an selten

frei vorliegende Thiolgruppen der Cysteine sowie an Kohlenhydrate im Falle von

Glykoproteinen, zu denen auch OVA [275] zählt, möglich [276]. Für die stöchio-

52 Experimenteller Teil

metrischen Berechnungen der Reaktionsansätze wurde von Massen von 66 kDa

für BSA, 44 kDa für HRP und 43 kDa für OVA ausgegangen. Die Immunogene

(TATP-BSA-Konjugate) wurden den Versuchstieren zur Antikörperbildung injiziert

(Abschnitt 3.3.4), HRP-Konjugate dienten im direkten ELISA und OVA-Konjugate

im indirekten ELISA als Reagenzien (Abschnitt 3.3.5).

Tabelle 3.1: Synthetisierte Proteinkonjugate.

TATP-Proteinkonjugat

Methode Hapten:Protein

(Syntheseansatz) Bemerkung

Immunogen 1

gemischtes Anhydrid

22:1

insolubilisiert, zur Mausimmunisierung

Immunogen 2 NHS-Ester, THF 50:1 zur Mausimmunisierung

Immunogen 3

NHS-Ester, THF

38:1

zur Kaninchenimmuni-sierung

Immunogen 4 NHS-Ester, THF 13:1 nicht verwendet

HRP-Konjugat 1 NHS-Ester, DMF 21:1 hauptsächlich verwendet

HRP-Konjugat 2 NHS-Ester, DMF 36:1

HRP-Konjugat 3 NHS-Ester, THF 41:1

HRP-Konjugat 4 NHS-Ester, THF 49:1 kein MALDI-TOF-MS

HRP-Konjugat 5 gemischtes Anhydrid 41:1

OVA-Konjugat 1

NHS-Ester, DMF

07:1

häufig für Tests mit Mausserum verwendet

OVA-Konjugat 2 NHS-Ester, THF 24:1 nicht verwendet

OVA-Konjugat 3 NHS-Ester, THF 20:1 hauptsächlich verwendet

Das Immunogen 1 wurde nach der Gemischten-Anhydrid-Methode der Vorschrift

von Aslam und Dent [167] folgend, wie Abbildung 3.3 schematisch zeigt, herge-

stellt. Um bis zur Kopplung wasserfreie Bedingungen zu schaffen bzw. zu erhal-

ten, wurde Tetrahydrofuran (THF) 24 h über frisch regeneriertem Molekularsieb

nachgetrocknet und die Syntheseschritte unter Schutzgas (Argon oder Stickstoff)

durchgeführt. Es wurden 0.55 mg gereinigtes, trockenes TATP-Hapten (1.7 µmol)

in 74 µL THF gelöst und 13.5 µL einer 1:30 vorverdünnten Tributylamin-THF-

Lösung (1.9 µmol Tributylamin entsprechend) hinzugegeben. Nach kurzem Mi-

schen wurde der Ansatz auf 0 °C gekühlt und mit 12.4 µL einer 1:50 vorverdünn-

ten, gekühlten Isobutylchloroformiat-THF-Lösung (1.9 µmol Isobutylchloroformiat

entsprechend) versetzt. Das Reaktionsgemisch, welches schließlich TATP-

Hapten, Tributylamin und Isobutylchloroformiat im Verhältnis 10:11:11 enthielt,

wurde weitere 20 min bei ca. 0 °C leicht geschüttelt. Währenddessen wurden

6.17 mg BSA in 1.2 mL PBS (phosphate buffered saline, phosphatgepufferte

Salzlösung) gelöst (pH ~ 7-8) und ebenfalls gekühlt. Der Syntheseansatz mit

dem nun durch die Bildung eines reaktiven Anhydrids aktivierten TATP-Hapten

wurde vollständig in 1 mL der Proteinlösung (0.08 µmol BSA entsprechend) ge-

geben. Es ist bei diesem Schritt zu beachten, dass nicht mehr als 10% Lösungs-

mittel (100 µL THF) in die Proteinlösung (1 mL) gelangen, da Proteine sonst zu

denaturieren drohen. Zudem wurde nach dem Vermischen der pH-Wert erneut

geprüft und blieb unverändert. TATP-Hapten und Protein wurden letztlich im mo-

Experimenteller Teil 53

laren Verhältnis 22:1 zusammengebracht und der Immunogen-Ansatz wurde

nach 1 h schütteln bei ca. 2 °C aufgearbeitet und charakterisiert (siehe unten).

Abbildung 3.3: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese über die Gemisch-

te-Anhydrid-Methode.

Ähnlich dem Prinzip der Synthese des Immunogens 1 wurde auch ein HRP-

Konjugat (5) über die Aktivierung des TATP-Haptens als gemischtes Anhydrid

erzeugt. Jedoch wurde sich dabei nach Munro und Stabenfeldt [168] gerichtet,

die 4-Methylmorpholin als Base in der Reaktion anstelle von Tributylamin benutz-

ten. Außerdem wurde mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und bei -20 °C gearbei-

tet, aber weiterhin unter wasserfreien Bedingungen mit Schutzgas. Es wurden

60 µL DMF mit 0.48 µL 4-Methylmorpholin (4.3 µmol) vermengt und zum Lösen

von 0.97 mg trockenem TATP-Hapten (3.0 µmol) verwendet. Anschließend wur-

den 0.48 µL Isobutylchloroformiat (3.6 µmol) hinzugegeben, so dass Hapten,

4-Methylmorpholin und Isobutylchloroformiat in einem molaren Verhältnis von

5:7:6 vorlagen. Die Mischung wurde weiter bei -20 °C für 30 min auf einem Mag-

netrührer leicht gerührt. Währenddessen wurden 200 µL Wasser mit 120 µL DMF

vermischt und in 48 µL dieser Lösung 3.19 mg HRP aufgelöst und auf -20 °C

abgekühlt. Anschließend wurde unter Rühren langsam die Lösung mit dem

TATP-Hapten-Anhydrid zu der Proteinlösung pipettiert, so dass Hapten und Pro-

tein im Verhältnis 41:1 vorlagen. Der Ansatz wurde zunächst 1 h bei -20 °C und

dann weitere 2 h bei etwa 0 °C gerührt, ehe er aufgearbeitet und charakterisiert

(siehe unten) wurde.

Für die Herstellung der meisten Proteinkonjugate (Tabelle 3.1) wurde das

TATP-Hapten jedoch über die Bildung eines NHS-Esters zur Kopplung aktiviert,

wie in Abbildung 3.4 schematisch dargestellt. Dabei wurde sich an Tatake et al.

[166] und Franek et al. [165] orientiert. Auch bei dieser Methode ist es wichtig, bis

zur Kopplung an das Protein auf wasserfreie Bedingungen zu achten, so dass

wieder Lösungsmittel nachgetrocknet und unter Schutzgas gearbeitet wurde. Die

gesamte Durchführung erfolgte bei Raumtemperatur. Die eingesetzten Mengen

der Ausgangsstoffe zur Synthese des jeweiligen TATP-Proteinkonjugats sind in

54 Experimenteller Teil

Tabelle 3.2 aufgeführt. Wegen der geringen benötigten Mengen an N-Hydroxy-

succinimid (NHS, 97%) und N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 99%) wurden

zunächst Lösungen von beiden in wasserfreiem THF bzw. DMF hergestellt, de-

ren Konzentration so gewählt wurde, dass den Reaktionsansätzen jeweils zwi-

schen 10 und 20 µL davon hinzugesetzt werden musste. Nach dem Lösen des

trockenen TATP-Haptens in THF bzw. DMF wurde zuerst die entsprechende

Menge NHS-Lösung hinzupipettiert und der Ansatz mittels Thermomixer oder

Magnetrührer gemischt. Wurde mit THF gearbeitet, wurde an dieser Stelle au-

ßerdem etwas N,N′-Disuccinimidylcarbonat (DSC) [277] hinzugefügt, um die

wasserfreien Bedingungen zu garantieren. Anschließend wurde die benötigte

Menge DCC-Lösung dazugeben und der Reaktionsansatz über Nacht vor Licht

geschützt gerührt oder geschüttelt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag (vor

allem aus Dicyclohexylharnstoff bestehend), der durch Zentrifugation (16

400 rpm, 10 min, 15 °C) entfernt wurde. BSA, HRP bzw. OVA wurden in 130 mM

Natriumhydrogencarbonatpuffer gelöst und unverzüglich der Überstand mit dem

aktivierten TATP-Hapten-NHS-Ester tropfenweise und unter stetigem Rühren

dazupipettiert. Zum Teil wurde ein Überstand auf zwei Proteinlösungen aufgeteilt

(in Tabelle 3.2 gekennzeichnet). Währenddessen sollte der pH-Wert der Lösung

bei ~ 8 bleiben und es wurde darauf geachtet, dass der Lösungsmittelanteil ma-

ximal 10% betrug. Der Konjugat-Ansatz wurde weitere 3-5 h gerührt, danach auf-

gearbeitet und charakterisiert (siehe unten). Falls die Aufarbeitung nicht sofort

geschieht, kann die Lösung auch über Nacht bei 4 °C gelagert werden.

Tabelle 3.2: Eingesetzte Mengen der Ausgangsstoffe zur Synthese der Proteinkonjugate mit der

NHS-Ester-Methode.

TATP-Proteinkonjugat

Lösungs-mittel

TATP-Hapten [µmol]

[mg]

NHS [µmol]

[mg]

DCC [µmol]

[mg]

Hapten: NHS:DCC

(molar)

Protein [µmol]

[mg]

Immunogen 2▲ THF 1.7 0.54

2.5 0.30

2.5 0.52

2:3:3 0.033 2.2

Immunogen 3◊ THF 6.8

2.2

8.2 0.97

8.2 1.7

5:6:6 0.18 12

Immunogen 4◊ THF 1.6

0.50 1.9 0.22

1.9 0.39

5:6:6 0.12 8.0

HRP-Konjugat 1● DMF 1.9

0.61 3.8 0.45

3.8 0.79

1:2:2 0.089 3.9

HRP-Konjugat 2● DMF 1.6

0.53 3.3 0.39

3.3 0.68

1:2:2 0.045 2.0

HRP-Konjugat 3□ THF 2.9

0.95 4.4 0.52

4.4 0.92

2:3:3 0.072 3.2

HRP-Konjugat 4▲ THF 1.3 0.43

2.0 0.24

2.0 0.42

2:3:3 0.027 1.2

OVA-Konjugat 1● DMF 0.4

0.14 0.9 0.10

0.9 0.18

1:2:2 0.058 2.5

OVA-Konjugat 2□ THF 1.2

0.37 1.7 0.21

1.7 0.36

2:3:3 0.048 2.1

OVA-Konjugat 3 THF 6.5 2.1

7.8 0.93

7.8 1.6

5:6:6 0.33 14

gleiche Zeichen (▲◊●□) = aus einem Überstand mit aktivierten TATP-Hapten-NHS-Ester; HRP-Konjugat 4 wurde erst neun Tage später gekoppelt. Der TATP-Hapten-NHS-Ester-Ansatz stand bis dahin luftdicht verschlossen bei 4 °C.

Experimenteller Teil 55

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der TATP-Proteinkonjugat-Synthese über die NHS-

Ester-Methode.

Reinigung der Konjugate und Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Reinigung der Proteinkonjugat-Ansätze erfolgte in der Regel am Tag der

Kopplung. Falls dies nicht möglich war, wurden die Ansätze bei 4 °C gelagert und

tags darauf aufgearbeitet. Durchgeführt wurde diese Reinigung mittels PD-10-

Säulen (bestehend aus Sephadex G-25, 5 mL Säulenvolumen), die zum Entsal-

zen von Proteinlösungen dienen und auf dem Prinzip der Gelfiltration (Größen-

ausschlusschromatographie) beruhen. Mit ihrer Ausschlussgröße von Molekülen

> 5 000 Da (= g mol-1) trennen sie die Konjugate von Ausgangs- und Nebenpro-

dukten der oben beschriebenen Synthesen ab. Die Trennleistung ist nicht ausrei-

chend, um ungekoppelte Proteine von gekoppelten zu separieren.

Neue PD-10-Säulen wurden mit 25 mL, bereits benutzte (nur mit gleichem

Konjugat wiederverwendet) mit 50 mL kaltem, 1:10-verdünntem PBS konditio-

niert. Vor dem Auftragen auf die Säulen wurden die Proteinkonjugat-Ansätze

10 min bei 4 °C und 16 400 rpm zentrifugiert, da häufig auch leichte Trübungen

erkennbar waren. Die gesamte Proteinlösung wurde dann mittig, möglichst ohne

den Säulenrand zu berühren, auf die Säulenoberfläche getropft und einlaufen

gelassen. Anschließend wurden 5 mL kaltes (~ 4 °C), 1:10-verdünntes PBS auf-

gegeben und das Eluat in UV-transparenten Mikrotiterplatten mit drei Tropfen pro

Kavität manuell aufgefangen. Die PD-10-Säule wurde mit 50 mL kaltem, 1:10-

verdünntem PBS vor dem nächsten Probenauftrag nachgespült oder mit 100 mL

kaltem, 1:10-verdünntem PBS oder Wasser gespült und bis zur nächsten Ver-

wendung maximal drei Monate bei 4 °C aufbewahrt. Die Platte mit den gesam-

melten Eluaten wurde im Mikrotiterplatten-Spektrophotometer (Spectra-

Max Plus384) bei 280 nm ausgelesen und die Fraktionen mit dem Proteinkonjugat

vereint, bei BSA- und OVA-Konjugaten komplett, bei HRP-Konjugaten als Haupt-

fraktion (Fraktionen mit den höchsten Signalen) und Nebenfraktion (Flanken der

Elutionskurve), um die Konzentration der Hauptfraktion möglichst hoch zu halten.

56 Experimenteller Teil

Die Konzentration der TATP-Proteinkonjugate in 1:10-verdünntem PBS wurden

photometrisch (280 nm) über eine Kalibriergerade des jeweiligen Proteins be-

stimmt. Dies erfolgte per Mikrotiterplatten-Spektrophotometer in UV-

transparenten Platten, in deren Kavitäten auf das gleiche Volumen der Lösungen

einer Kalibrierreihe und der zu bestimmenden Probe geachtet wurde. Der Aus-

gleich der Füllhöhen durch das Photometer „PathCheck“ funktioniert nicht adä-

quat. Zumeist wurden die restlichen Protein-Pufferlösungen von der Kopplungs-

reaktion (etwas mehr als nötig dabei angesetzt) verwendet oder frische Protein-

lösungen in 1:10-verdünntem PBS hergestellt, die dann 1:2 in 1:10-verdünntem

PBS verdünnt wurden. Aufgenommen wurden vier bis sieben Messpunkte im

Bereich von ca. 0.03 bis 1 mg mL-1 (n = 1). Die zu messenden Proben (n = 1-4)

mussten in der Regel 1:10 verdünnt werden, um Extinktionen < 1 und Werte im

Bereich der Kalibrierung zu erhalten. Die Konzentration der HRP-Konjugate wur-

de außerdem über den molaren Extinktionskoeffizienten der HRP,

= 102 L mmol-1 cm-1 ( = 402 nm) [278, 279], ermittelt und in die Mittelwertbil-

dung mit einbezogen, wenn die Kalibriergerade nicht mit HRP erstellt wurde.

Bestimmung der Kopplungsdichten

Nach der Reinigung der TATP-Proteinkonjugate wurden mittels Matrix-

unterstützter Laser-Desorption/Ionisation-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-

TOF-MS) die Kopplungsdichten bestimmt. Das Gerät (Reflex III) arbeitet bei einer

Beschleunigungsspannung von 20 kV und mit einem Stickstofflaser, der mit einer

Pulsdauer von 3 ns die Proben im Hochvakuum desorbiert und ionisiert. Als

Matrix diente Sinapinsäure, die in einer Konzentration von 10 g L-1 in wässriger

Lösung mit 50% (v/v) Acetonitril und 0.05% (v/v) TFA immer frisch angesetzt

wurde. Auf den Probenteller wurden als erstes 0.5 µL dieser Matrixlösung aufge-

tragen und 10-20 min an der Luft trocknen gelassen. Die Proben, Lösungen ge-

koppelter und ungekoppelter Proteine, wurden entsalzt, indem 10 µL auf eine

zuvor äquilibrierte Mikro-Entsalzungssäule (Zeba Micro Desalt Spin Columns)

aufgegeben und 90 s bei 10 000 rpm zentrifugiert wurden. Mit 10 µL Wasser

wurden die Proteine anschließend wieder von der Säule durch zweiminütige

Zentrifugation bei 10 000 rpm eluiert und 50 µL Matrixlösung dazugegeben. Von

diesem Protein-Matrix-Gemisch wurden ebenfalls 0.5 µL auf den Probenteller mit

der getrockneten Matrix gegeben und vor der Messung für 1-2 h bei Raumtempe-

ratur an der Luft getrocknet.

Zur Auswertung und Darstellung der Spektren (mit Origin) wurden sie zunächst

auf eine gemeinsame Basislinie gebracht, in dem der Mittelwert eines Bereiches

(m/z 10 000) mit Hintergrundrauschen von allen Werten abgezogen wurde. Au-

ßerdem wurden sie mit einem gleitenden Durchschnitt von 300 Punkten geglättet.

Die daraus resultierenden Maxima des TATP-Proteinkonjugats und des unge-

koppelten Proteins wurden als Molekülmassen zur Berechnung der mittleren

Kopplungsdichten benutzt, wobei die Massenzunahme des Proteins nach der

Konjugation gegenüber dem (ungekoppelten) Protein beobachtet wurde:

Experimenteller Teil 57

Aufgrund der fehlenden Massenkalibrierung des MALDI-TOF-MS mussten

grundsätzlich die ungekoppelten Proteine immer wieder mitbestimmt werden In

den Grafiken (Abschnitt 4.3, Abbildung 4.7) wird daher nur die Differenz der bei-

den Maxima (TATP-Proteinkonjugat – Protein, m/z) angegeben. Die Signale der

mehrfach geladenen Proteine und Konjugate wurden nicht zur Auswertung her-

angezogen.

Lagerung

Die Langzeitlagerung sämtlicher TATP-Proteinkonjugate erfolgte bei 4 °C. Auch

während aller Arbeiten wurde darauf geachtet, dass die Proteinlösungen mög-

lichst auf ~ 4 °C gehalten wurden (ausgenommen Synthese). Ebenfalls zum

Schutz der Proteine (vor Verunreinigungen wie Bakterien-/Pilzbefall oder generell

Proteasen) wurden größere Mengen in kleine Aliquote aufgeteilt.

Die HRP-Konjugate wurden mit gleichem Volumen Guardian versetzt und ali-

quotiert. Guardian wurde speziell zum Stabilisieren der HRP entwickelt, welche

als Enzym empfindlicher ist, als nicht-katalytisch wirkende Proteine wie die glo-

bulären Albumine. Ein Verlust ihrer enzymatischen Aktivität hätte negative Aus-

wirkungen auf den ELISA, weswegen auch kein Natriumazid eingesetzt werden

darf, welches üblicherweise zur Konservierung von Proteinlösungen verwendet

wird. Natriumazid ist ein (nahezu irreversibler) Inhibitor der HRP [280, 281]. Da

jedoch die genaue Zusammensetzung von Guardian unbekannt ist und mit gro-

ßer Wahrscheinlichkeit Proteine wie BSA enthalten sind, müssen alle Charakteri-

sierungen vor der Guardian-Zugabe erfolgen. Daher wurden auch 100 µL jedes

synthetisierten HRP-Konjugats ohne Guardian zurückgestellt. Auch die OVA-

Konjugate wurden aliquotiert, wobei die Hälfte der Lösungen unbehandelt blieb

und die anderen Aliquote mit 0.5% Natriumazid aus einer 10%igen (w/v) Lösung

versetzt wurden.

Die TATP-BSA-Konjugate verblieben in 1:10-verdünntem PBS und konnten

ebenfalls nicht mit Natriumazid versetzt werden, da sie als Immunogene in die

Tiere injiziert wurden (Abschnitt 3.3.4). Es wurden Aliquote, die von 50 µg Immu-

nogen je Tier und Impfung ausgingen, an die jeweiligen Firmen gekühlt (in Styro-

porboxen mit Kühlakkus) versendet. Von Immunogen 1 und 2 wurden für die Im-

munisierung dreier Mäuse 150 µg, entsprechend der Proteinkonzentration also

100 bzw. 90 µL (aufgerundet) pro Aliquot abgefüllt und für die Immunisierung der

beiden Kaninchen 100 µg von Immunogen 3, was 13 µL (aufgerundet) entspricht.

Immunogen 1 wurde als einziges zudem noch insolubilisiert, indem den Aliquoten

1 mL Acetonitril zugeben wurde und die Proteine so ausgefällt wurden. Nach

24 h bei Raumtemperatur wurden die Ansätze bei 4 °C und 16 400 rpm für

10 min zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Überstandes und Eintrocknen des

Rests wurde erneut jeweils 1 mL Acetonitril auf die Niederschläge gegeben, die

sich auch nach 30 s im Ultraschallbad bereits nicht mehr lösten. Nach 3 h bei

WasserHapten-TATP

ProteinjugatProteinkon-TATP

M M

M M ichteKopplungsd

(Gleichung 3)

58 Experimenteller Teil

4 °C wurde erneut zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Präzipitate

über Nacht im Exsikkator getrocknet. Die Reste der Immunogenlösungen sowie

die komplette Immunogen-4-Lösung wurde unaliquotiert bei 4 °C aufbewahrt.

3.3.4 Immunisierungen

Immunisierung dreier Mäuse

Tabelle 3.3: Zeitplan der Mausimmunisierung.

Injektion Tag Serumentnahme (Tag)

● Erstimmunisierung 50 µg 000 0 (präimmun)

● Boost 1 50 µg 042 048

● Boost 2 50 µg 084 091

● Boost 3 50 µg 126 133

● Boost 4 50 µg 154 166

● Boost 5 10 µg 182 189

● Boost 6 10 µg 210 217

● Boost 7 10 µg 252 259

● Boost 8 10 µg 294 301

● Boost 9 (final) 50 µg 320 (322, Milzentnahme)

Bis Boost 2 wurde insolubilisiertes Immunogen 1 verwendet, danach Immuno-gen 2.

Die unter Abschnitt 3.3.3 synthetisierten TATP-BSA-Konjugate wurden zur Er-

zeugung von TATP-Antikörpern in Versuchstieren benötigt. Dazu wurden drei

weibliche, ca. acht Wochen alte BALB/c-Mäuse zunächst mit dem insolubilisier-

ten Immunogen 1 erstimmunisiert. Dieses Immunogen mit einer niedrig gewähl-

ten Kopplungsdichte wurde auch für zwei Nachimmunisierungen (Boost) verwen-

det, ehe ab Boost 3 das höher-gekoppelte und lösliche Immunogen 2 injiziert

wurde. Die genaue zeitliche Abfolge und die injizierte Menge an Immunogen sind

in Tabelle 3.3 abzulesen. Alle Immunogengaben erfolgten intraperitoneal und mit

inkomplettem Freund-Adjuvans versetzt. Lediglich für die Erstimmunisierung

wurde das komplette Freund-Adjuvans verwendet und der finale Boost 9 wurde

ohne Adjuvans gesetzt. Diese letzte Nachimmunisierung wurde nur bei Maus 2

und 3 vorgenommen und diente als Vorbereitung auf die Milzentnahme und da-

mit die Herstellung der Hybridomzellen. Die Auswahl der Mäuse erfolgte durch

die Überwachung des Immunisierungsverlaufs per ELISA (Abschnitt 3.3.5) mit

(TATP-)Antikörper enthaltenden Serum-Proben, die allen Tieren in der Regel

sieben Tage nach erfolgter Injektion abgenommen wurden. Maximal 100 µL Se-

rum konnten dabei pro Maus gewonnen werden, welche nach Erhalt mit 0.5%

Natriumazid aus einer 10%igen (w/v) Lösung versetzt und bei 4 °C gelagert wur-

den. Sie standen für zahlreiche, weitere Untersuchungen mittels ELISA zur Ver-

fügung. An Tag 313 der Immunisierung wurden außerdem Kotproben der einzel-

Experimenteller Teil 59

nen Mäuse beim Einstreuwechsel (nach mehreren Tagen) zu Testzwecken ge-

sammelt.

Mit der Immunisierung, inklusive Tierhaltung, Serum- und Kotentnahme wurde

die Charles River Laboratories Research Models and Services Germany GmbH,

Kisslegg, beauftragt, die zu entsprechenden Tierversuchen berechtigt ist. Die

Immunogene wurden der Firma zugesandt und die einzusetzenden Mengen so-

wie der zeitliche Verlauf vorgegeben. Auf andere, dort übliche Verfahrensweisen

wurde kein Einfluss genommen und das dort verwendete Equipment daher unter

3.1 auch nicht aufgeführt. Nach Boost 9 wurden die Mäuse 2 und 3 lebend von

Kisslegg nach Marl zur Squarix biotechnology GmbH überführt, wo die Herstel-

lung der Hybridomzellen erfolgte.

Herstellung der Hybridomzellen

Die folgende Beschreibung der Herstellung der Hybridomzellen für die Produktion

monoklonaler Antikörper nach Köhler und Milstein [187] beruht auf dem Bericht

der Squarix biotechnology GmbH, Marl, die mit der Durchführung betraut wurde.

Auch die hierzu benötigte Ausstattung ist in dieser Arbeit nicht aufgeführt. In die

Vorgehensweise wurde nicht eingegriffen, jedoch wurden die Zellkulturüberstän-

de der Hybridomzellkulturen dort nicht untersucht. Diese wurden nach dem Ex-

pressversand (gekühlt, in Styroporboxen mit Kühlakkus) selbst mittels ELISA auf

das Vorhandensein von TATP-Antikörper getestet.

Die Mäuse 2 und 3 wurden zwei Tage nach dem letzten Boost getötet und ihre

Milzen unter sterilen Bedingungen entnommen. Die Milzzellen wurden desinte-

griert, indem die Milz durch ein spezielles Sieb gepresst wurde. Die Zellzahlen

wurden dann mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Milz und andere

Organe von Maus 2 wiesen makroskopisch keine pathologischen Veränderungen

auf. Die Zahl der Milzzellen betrug 8.2 × 107, von denen nur etwa 10% stimuliert

waren. Auch Maus 3 zeigte keine organischen Auffälligkeiten und es wurden

1.9 × 108 Milzzellen gezählt, von denen immerhin 20% stimuliert waren. Mit einer

Trypanblau-Färbung wurde die Vitalität der Zellen getestet, um die geeignete

Menge (lebender) Milzzellen für die Fusion mit HGPRT-defizienten Maus-

Myelomzellen (Linie P3-X63-Ag8.653) zu bestimmen. Bei der chemischen Fusion

mit Polyethylenglykol (M ~ 1 500 g mol-1) wurden Milzzellen und Myelomzellen im

gleichen Verhältnis zueinander eingesetzt. Anschließend wurden die Zellen in

HAT-Medium, welches zusätzlich 20% fetales Rinderserum enthielt, auf

96-Kavitäten-Zellkulturplatten verteilt, woraus fünf Platten für die Zellen von

Maus 2 und 12 Platten für die von Maus 3 resultierten. Zur Selektion wurden die

Hybridomzellen 14 Tage in dem Selektionsmedium gezüchtet, ehe zunächst

Aminopterin und sieben Tage später auch Hypoxanthin und Thymidin abgesetzt

wurden. Die noch verbliebenen Zellen wurden anschließend in RPMI 1640-L-

Glutamin-Medium mit 10% fetalem Rinderserum kultiviert.

Vierzehn Tage nach der Fusion wurden mikroskopisch etwa 500 Zellklone re-

gistriert. Hatten diese eine ausreichende Zelldichte erreicht, wurden alle Zell-

kulturüberstände einer Platte zum Testen erhalten, was wegen des unterschied-

60 Experimenteller Teil

lich schnellen Wachstums und der Wiederholungsmessungen mehrmals erfolgte.

Die ersten 68 Zellkulturüberstände wurden an Tag 18 nach der Fusion abge-

nommen und versandt. Weitere Abnahmen sämtlicher Überstände der 17 Platten

erfolgte an den Tagen 24, 32 und 53. Jeweils an den darauffolgenden zwei Ta-

gen wurden sie per ELISA untersucht. Die Klone zunächst positiv getesteter Zell-

kulturüberstände wurden in 24-Kavitäten-Zellkulturplatten überführt und zu weite-

ren Tests hochgezüchtet.

Immunisierung zweier Kaninchen

Tabelle 3.4: Zeitplan der Kaninchenimmunisierung.

Injektion Tag Serumentnahme (Tag)

● Erstimmunisierung 100 µg 000 0 (präimmun)

● Boost 1 100 µg 007 0—

● Boost 2 100 µg 010 014

● Boost 3 100 µg 018 021

● Boost 4 050 µg 042 049

● Boost 5 050 µg 056 063

● Boost 6 050 µg 084 091

● Boost 7 050 µg 112 119

● Boost 8 050 µg 140 147

● Boost 9 050 µg 168 175

● Boost 10 050 µg 196 203

● Boost 11 (final) 050 µg 224 231

Immunogen 3 wurde zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt, welche durch

Eurogentec S.A., Seraing, Belgien, durchgeführt wurde. Ähnlich wie schon für die

Mäuse wurde der Firma das TATP-BSA-Konjugat übergeben und die zu injizie-

renden Mengen sowie der zeitliche Verlauf bestimmt, wobei Details der dortigen

Abläufe und verwendeten Materialien (zum Teil auch Firmeninterna) unbekannt

blieben. Es wurden zwei, 9-12 Wochen alte, 2-2.5 kg schwere Kaninchen sub-

kutan immunisiert. Für den Beginn der Immunisierung wurde das Speedy 28-day

protocol [282] gewählt, welches vier Injektionen à 100 µg Immunogen in kurzer

zeitlicher Abfolge vorsieht (Tabelle 3.4, bis Boost 3). Laut Eurogentec S.A. hat

dieses Vorgehen keine Nachteile gegenüber einem üblichen, längeren Immuni-

sierungsverlauf, da ein firmeneigenes Nicht-Freund-Adjuvans eingesetzt wird. Ab

Boost 4 wurde die Immunisierung mit einem individuellen Zeitplan fortgesetzt und

den Tieren nur noch 50 µg Immunogen mit inkomplettem Freund-Adjuvans inji-

ziert (Tabelle 3.4). Die Blutabnahme erfolgte dann immer sieben Tage nach dem

letzten Boost. Nach der Untersuchung der Seren im ELISA (Abschnitt 3.3.5) wur-

de über den nächsten Boost entschieden, bis keine Verbesserung der TATP-

Antikörper, sowohl qualitativ als auch quantitativ, mehr festgestellt wurde. Ab

Boost 4 wurden jeweils 15-20 mL Serum pro Kaninchen erhalten, nach dem letz-

ten Boost sogar ~ 60 mL (ausgeblutet). Die Seren wurden zur Hälfte mit 0.1%

Experimenteller Teil 61

Natriumazid (aus 10%iger (w/v) Lösung) und der Rest mit 1% (aus 40%iger (w/v)

Lösung) konserviert, zu 1 mL-Aliquoten abgefüllt und bei 4 °C gelagert.

3.3.5 Enzymgekoppelter Immunoassay (ELISA)

Allgemeiner Ablauf und Auswertung der ELISA

Enzymgekoppelte Immunoassays (ELISA) wurden in transparenten, hochbinden-

den Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten bei Raumtemperatur durchgeführt. Wäh-

rend der Inkubationszeiten wurden die Platten mit Parafilm abgedeckt und auf

einen Schüttler (Titramax 101) bei 750 rpm gestellt. Die Waschschritte, drei im

direkten, vier im indirekten ELISA, erfolgten mit Waschpuffer (1 ×) in einem

Waschautomaten (ELx405 Select) zwischen den Inkubationen. Bei jedem

Waschschritt wurden gleichzeitig alle 96 Kavitäten dreimal hintereinander ge-

spült. Die stets auf 4 °C gehaltenen Seren wurden täglich frisch verdünnt und

zuvor 10 min bei 4 °C und 16 400 rpm zentrifugiert. Von den in Guardian gelager-

ten HRP-Konjugaten wurden 1:100-Vorverdünnungen in Guardian hergestellt, die

wenige Wochen verwendet wurden. Sämtliche im Folgenden angegeben HRP-

Konjugatverdünnungen beziehen diese Vorverdünnungen mit ein. Die vermerk-

ten Endkonzentrationen berücksichtigen zudem die Guardian-Zugabe bei der

Lagerung.

Zur Veranschaulichung der nachfolgend beschriebenen Schritte hilft Abbildung

2.4: Prinzipiell begann jeder ELISA mit einem Beschichtungsschritt, bei dem über

Nacht (ca. 18-25 h, selten auch mehrere Tage bei 4 °C) jede Kavität mit 200 µL

einer Verdünnung in PBS, je nach Format, entweder eines sekundären Antikör-

pers, -IgG (direkt) oder eines OVA-Konjugats (indirekt) inkubiert wurde. Im indi-

rekten ELISA wurde die Beschichtung durch einen anschließenden Blockie-

rungsschritt (~ 1 h) mit 200 µL Blockpuffer ergänzt. Bei direkten ELISA folgte die

Inkubation von 200 µL einer Serumverdünnung in BSA/PBS für 1 h. Dann

schloss sich bei beiden Assay-Varianten der Kompetitionsschritt an, wobei zu-

nächst eine Kalibrierreihe aus acht (bedingt durch die 8 × 12-Aufteilung der Plat-

te) TATP-Lösungen ausgewählter Konzentrationen, einschließlich Wasser als

Nullwert, à 200 µL in jeweils drei Kavitäten (n = 3) eingefüllt wurden. An dieser

Stelle wurden auch Proben oder Vergleichssubstanzen im gleichen Volumen

aufgetragen. Unmittelbar darauf wurden 50 µL Serumverdünnung in BSA/PBS

(indirekt) oder HRP-Konjugat-1-Verdünnung in 0.1% BSA/PBS (direkt) in jede

Kavität hinzugegeben und gemeinsam mit den Kalibrierlösungen eine halbe

Stunde inkubiert. Für den indirekten ELISA wurde noch ein 30-minütiger Enzym-

Inkubationsschritt mit 200 µL in 0.1% BSA/PBS verdünnter -IgG-HRP-Lösung

angehängt.

Die Detektion lief bei sämtlichen ELISA gleich ab. Zunächst wurden 200 µL der

frisch angesetzten Substratlösung in alle Kavitäten pipettiert. Das farblose

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) wurde durch Einwirken des Enzyms HRP in

Gegenwart von Wasserstoffperoxid zu einem blauen Farbkomplex umgesetzt.

62 Experimenteller Teil

Abhängig von der Farbentwicklung, idealerweise nach 30 min bei maximalen

Extinktionen um 1, wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 µL 1 M Schwefel-

säure und der damit einhergehenden Inaktivierung der HRP gestoppt. Dabei zer-

fiel durch das Abfallen des pH-Wertes auch der Farbkomplex und u. a. wurde ein

stabiler, gelber Farbstoff gebildet [237]. Die gesamte Mikrotiterplatte wurde dann

in einem Mikrotiterplatten-Spektrophotometer (SpectraMax Plus384) bei 450 nm

ausgelesen, mit 620 nm als abzuziehende Extinktion bei der Referenzwellenlän-

ge. Über die Steuerungssoftware Softmax Pro 5.3 oder mit Origin wurden die

gemessenen Extinktionen über die TATP (Analyt)-Konzentrationen halblogarith-

misch aufgetragen, so dass eine sigmoidale Kalibrierkurve (n = 3, wenn nicht

anders angegeben) entstand, die über eine 4-Parametergleichung [238] ange-

passt wurde:

Parameter A (oder A-Wert) beschreibt die obere Asymptote, die als höchstes

Signal etwa dem Nullwert (blank) entspricht und auch zum Vergleich der Antikör-

pertiter herangezogen wurde. Die untere Asymptote wird durch Parameter D be-

schrieben und zeigt den Untergrund der Messwerte und höchste Analytkonzent-

rationen (vollständige Verdrängung der HRP-Konjuagte durch Sättigung aller

Antigenbindungsstellen der Antikörper mit den Analyten) an. Parameter B ist die

Steigung in Parameter C, der die Konzentration im Wendepunkt der Kurve an-

zeigt und auch als Testmittelpunkt, C-Wert oder IC50 bezeichnet wird. Je kleiner

der Testmittelpunkt ist, desto empfindlicher ist der Antikörper, respektive der

ELISA. Die Konzentrationen der acht Kalibrierlösungen wurden so gewählt, dass

sie um den Testmittelpunkt herum angeordnet waren, wobei je eine im (begin-

nenden) Bereich des Parameter A (Nullwert) und des Parameter D (hohe Kon-

zentration) als „Anker“-Konzentrationen lag.

Bis auf die Detektion und Auswertung der ELISA wurden bei Optimierungsver-

suchen sowie zur Klärung verschiedener Fragestellungen zahlreiche Abweichun-

gen vom allgemeinen Ablauf des Immunoassays vorgenommen. Diese können

hier nicht einzeln und im Detail beschrieben werden, sind aber dann bei den ent-

sprechenden Ergebnissen vermerkt. Diese Veränderungen betreffen z. B. den

BSA- und Tween-20-Anteil in Verdünnungen, die Temperatur, die Verwendung

der sekundären Antikörper, Seren sowie HRP-Konjugate, die eingesetzten Volu-

mina und vieles mehr. Einige sehr spezielle Vorgehensweisen werden nachfol-

gend in diesem Abschnitt dargestellt.

ELISA mit Mausserum

Mit dem Serum der drei Mäuse wurden neben der Überwachung des Immunisie-

rungsverlaufs und der Vorbereitung auf die Untersuchung der Zellkulturüberstän-

de der Hybridomzellkulturen nur ausgewählte Versuche durchgeführt. Aufgrund

des Mangels an Mausserum war auch nur eine begrenzte Optimierung des Tests

D

C

c 1

D -A Extinktion

TATP

B

(Gleichung 4)

Experimenteller Teil 63

möglich. Die meisten weiterführenden Untersuchungen wurden mit Serum von

Maus 3 nach Boost 8 vorgenommen, wie die Bestimmung der Kreuzreaktivität.

Die Seren der anderen beiden Mäuse waren weitaus weniger affin und lieferten

nur im indirekten ELISA brauchbare Ergebnisse.

Für den direkten ELISA wurden die Mikrotiterplatten mit 1:2 000 in PBS ver-

dünnten -Maus-IgG beschichtet (1.1 mg L-1). In Verdünnung von 1:10 000 in

0.1% BSA/PBS wurden die Seren und das HRP-Konjugat 1 (0.2 mg L-1) einge-

setzt. Platten für den indirekten ELISA wurden mit 1:2 500 verdünnten OVA-

Konjugat 1 (1.2 mg L-1) beschichtet. Die Seren wurden 1:10 000 in 0.1%

BSA/PBS verdünnt verwendet und -Maus-IgG-HRP in PBS 1:5 000 (0.2 mg L-1)

verdünnt. TATP-Kalibrierlösungen wurden zunächst in einer 1:10-Verdünnungs-

reihe von 0.0001 bis 100 mg L-1 zuzüglich des Nullwerts hergestellt. Später wur-

de der Kalibrierbereich genauer eingegrenzt und TATP-Lösungen in den Kon-

zentrationen 0, 0.05, 0.3, 1, 3, 10, 30 und 100 mg L-1 verwendet.

Anders als oben im allgemeinen ELISA-Ablauf beschrieben, wurden der Kom-

petitionsschritt der meisten Mausserum-Assays mit 100 µL Kalibrierlösung und

entsprechend 100 µL HRP-Konjugat-1- bzw. Serumverdünnung durchgeführt.

Eine Ausnahme davon bildeten (hauptsächlich) die Untersuchungen zur Kreuz-

reaktivität, die parallel zu den Kaninchenserum-Tests durchgeführt wurden. Da-

bei wurden im Kompetitonsschritt 200 µL Kalibrierlösung je Kavität eingesetzt

und somit von der HRP-Konjugat-1- (direkt) bzw. Serumverdünnung (indirekt) nur

noch 50 µL verwendet. Aufgrund des halbierten Volumens wurden beide demzu-

folge nur 1:5 000 verdünnt. Im indirekten ELISA wurde zusätzlich auch das OVA-

Konjugat 3 mit einer Verdünnung von 1:20 000 (0.3 mg L-1) verwendet.

Eine weitere Besonderheit trat durch die Verwendung von Zapfenplatten bei

einigen Untersuchungen der Zellkulturüberstände der Hybridomzellkulturen auf.

Der Ablauf war weitestgehend identisch, jedoch wurden unbehandelte Mikrotiter-

platten als Reservoirs für die Lösungen der einzelnen Schritte (vom Beschichten

bis zur Substratinkubation) zum Eintauchen der 96 Zapfen benötigt. Der Vorteil

dabei lag darin, dass die Zellkulturüberstände nicht beim Waschschritt verloren

gingen und mehrmals untersucht werden konnten. So konnten die Überstände,

von denen nur je 200 µL zur Verfügung standen, entweder direkt und indirekt

oder auch auf Inhibitionsvermögen getestet werden. Nach der Beschichtung der

Zapfenplatten mit -Maus-IgG bzw. mit OVA-Konjugat 3 (1:15 000, 0.4 mg L-1,

mit anschließendem Blockierungsschritt) wurden die Zapfen 2 h in die gelieferten

Zellkulturüberstände gehängt. Anschließend wurden sie für 60 min in HRP-

Konjugat-1- bzw. -Maus-IgG-HRP-Verdünnungen inkubiert. Zuletzt wurden die

Zapfenplatten 45 min in Substratlösung gehalten. Die Bildung des löslichen

Farbstoffes und der Farbumschlag durch Zugabe der Schwefelsäure erfolgten in

den dabei zunächst als Reservoir dienenden Mikrotiterplatten, welche im Spek-

trophotometer ausgelesen wurden. Als Positivkontrolle wurde Maus-3-Serum,

Boost 8 in 1:7 700- und 1:77 000-Verdünnungen in Kavitäten mitgeführt, die vor-

her als frei von Zellen gemeldet wurden oder auf eine 18. Platte überführt wur-

den. Die Zapfenplatten wurden manuell in speziellen Behältnissen gewaschen

64 Experimenteller Teil

und wegen der schlechteren Durchmischung und geringeren Oberfläche bei

900 rpm geschüttelt. Bei positiven Ergebnissen wurden Inhibitionstests, als direk-

te und/oder indirekte ELISA in Mikrotiterplatten, mit unterschiedlich in PBS ver-

dünnten Zellkulturüberständen durchgeführt. Je nach Menge der Überstände

wurde entweder der Extinktionsabfall bei der Kompetition mit einer 0 mg L-1 zu

einer 100 mg L-1 TATP-Lösung beobachtet oder eine verkürzte Kalibrierreihe

inklusive Nullwert mit TATP-Konzentrationen zwischen ca. 0.1 und 177 mg L-1

(gesättigte Lösung, ohne jegliches Methanol) aufgenommen.

Faeces

Nicht nur die Seren sondern auch der Kot der Mäuse wurde mittels ELISA unter-

sucht, wobei auch hier vorwiegend Maus 3 im Fokus lag. Die Faeces wurden an

Tag 313 gesammelt, was zeitlich etwa der Serumentnahme nach Boost 8 ent-

spricht. Um TATP-Antikörper darin nachweisen zu können, mussten diese zu-

nächst durch Extraktion aufgeschlossen werden. Dazu wurden 0.5 g luftgetrock-

neter Kot in 7.5 mL Faecesextraktionspuffer (der entweder BSA oder Tween 20

enthielt) 23 h gründlich geschüttelt. Anschließend wurden die Extrakte zweimal

bei Raumtemperatur und 16 400 rpm für 10 min zentrifugiert, um Schwebteilchen

komplett zu entfernen. Die unverdünnten Extrakte der Faeces wurden neben

einer 1:30 000-Verdünnung in 0.1% BSA/PBS von Maus-3-Serum, Boost 8 im

direkten ELISA getestet. Das HRP-Konjugat (100 µL) wurde 1:10 000 in 0.1%

BSA/PBS verdünnt den Kalibrierlösungen (100 µL) zugesetzt. Die auf diese Wei-

se erzeugten TATP-ELISA-Kurven (n = 3) wurden dann bezüglich ihrer Testmit-

telpunkte miteinander verglichen.

ELISA mit Kaninchenserum

Seren zweier Kaninchen wurden ausgiebigen Untersuchungen unterzogen.

Hauptsächlich wurde dazu der direkte ELISA benutzt und die Mikrotiterplatten mit

einer 1:2 500-Verdünnung in PBS des -Kaninchen-IgG (0.9 mg L-1) beschichtet.

Die Seren wurden in 0.005% BSA/PBS 1:5 000 bis 1:600 000 je nach Boost und

Testzweck verdünnt. Zumeist wurden die Seren nach Boost 7 1:80 000 verdünnt

und nach Boost 11 in einer 1:100 000-Verdünnung eingesetzt. Ähnlich variabel

verhielt es sich mit den Verdünnungen des HRP-Konjugats 1 in 0.1% BSA/PBS,

die zwischen 1:20 000 (0.1 mg L-1) und 1:600 000 (0.004 mg L-1) lagen, meist für

ELISA mit Boost-7-Seren bei 1:100 000 (0.02 mg L-1) und mit Boost-11-Seren bei

1:300 000 (0.007 mg L-1). Die TATP-Kalibrierlösungen hatten Konzentrationen

von 0, 0.001, 0.05, 0.3, 1, 5, 50 und 500 µg L-1.

Der indirekte ELISA wurde mit Kaninchenserum selten und fast ausschließlich

mit Boost-7-Serum durchgeführt. Das OVA-Konjugat 3 zur Beschichtung der Plat-

te wurde 1:20 000 in PBS (0.3 mg L-1) verdünnt. Nach der Inkubation des Block-

puffers wurden zu den 200 µL Kalibrierlösung 50 µL der 1:40 000 Serumverdün-

nung in 0.005% BSA/PBS gegeben. Danach folgte die Einwirkung des 1:60 000

in 0.1% BSA/PBS verdünnten -Kaninchen-IgG-HRP (0.02 mg L-1).

Experimenteller Teil 65

Im Gegensatz zu der Untersuchung des Immunisierungsverlaufs der Mäuse

(Maus 3) konnten für die Kaninchenseren aufgrund der größeren Antikörpertiter-

unterschiede keine einheitlichen Verdünnungen verwendet werden. Die Darstel-

lung der Immunisierungsverläufe (Abbildung 4.9 und Abbildung 4.10) wurde nur

durch die Kombination von Kurven möglich, wozu die Durchführung von direkten

ELISA auf insgesamt vier Platten notwendig war. Auf der ersten Platte wurden

das Präimmunserum und die Seren nach Boost 2-4 mit einer Verdünnung von

1:10 000 aufgetragen und das HRP-Konjugat 1 1:20 000 verdünnt verwendet.

Platte 2 enthielt die 1:80 000 verdünnten Seren nach Boost 4-7 und die Verdün-

nung des HRP-Konjugats 1 betrug 1:100 000. Die Seren nach Boost 7-10 wurden

auf eine dritte Platte und die nach Boost 8-11 auf die vierte pipettiert. Beide Male

wurden die Seren 1:100 000 und das HRP-Konjugat 1 1:200 000 verdünnt. Die

Platte 1 wurde über die Kurven des Boost-4-Serums an die zweite Platte ange-

passt und sämtliche Kurven der ersten Platte aufgrund der A-Wert-Differenz von

Boost 4 entsprechend verschoben. Gleiches erfolgte mit den Kurven des

Boost-7-Serums (Platte 3 zu Platte 2) und des Boost-8-Serums (Platte 4 zu Platte

3).

Außerdem wurde der ELISA bezüglich des Testmittelpunkts mit jedem einzel-

nen Kaninchenserum optimiert, um die Entwicklung der Affinitätsreifung genau

verfolgen zu können. Dies geschah durch die zweidimensionale Verdünnung

jedes Serums zu dem HRP-Konjugat 1, bis bei einem bestimmten Verhältnis der

kleinstmögliche IC50 erhalten wurde. Häufig waren bei weiterer Verdünnung kaum

Veränderungen zu beobachten. Teilweise konnte aber nicht festgestellt werden,

ob die Optimierung abgeschlossen war, da trotz der Verlängerung der Inkubati-

onszeit der Substratlösung (1 h) die Extinktionen zu schwach wurden. Diese IC50

einer ELISA-Kurve (Parameter C der Gleichung 4) wurden dennoch zur Abschät-

zung der Affinität der Antikörper in den Seren herangezogen, wobei angenom-

men werden muss, dass die Konzentrationen von Antikörper und HRP-Konjugat

gegen null gehen [240, 241]:

Der IC50, also der C-Wert der ELISA-Kurve muss hier zunächst auf die tatsächli-

che Konzentration (Kalibrierlösungen sind mit HRP-Konjugat-1-Lösungen ver-

dünnt) gebracht und in mol L-1 angegeben werden.

Messbereich

Der Messbereich des TATP-Immunoassays wurde mit Seren beider Kaninchen

(Boost 11, 1:100 000, HRP-Konjugat 1 1:300 000) durch die Aufnahme eines

Präzisionsprofils nach Ekins [243] bestimmt. Dazu wurden 32 statt der üblicher-

weise acht Kalibrierlösungen zur Erstellung einer ELISA-Kurve (n = 3) benutzt,

deren Konzentrationen sich über den Bereich von 0.0008 - 2700 µg L-1 (zuzüglich

Nullwert) gleichmäßig etwa mit dem Faktor 1.7 verteilten. Anschließend wurden

50IC

1 Affinität (Gleichung 5)

66 Experimenteller Teil

die relativen Fehler der Konzentration jedes Messwertes unter Zuhilfenahme der

Parameter aus Gleichung 4 berechnet und gegen die Konzentration aufgetragen.

Die Nachweisgrenze der ELISA wurde aus den regulären 8-Punkt-Kurven (n = 3)

ermittelt, wobei auch mehrere Kurven verschiedener Platten berücksichtigt wer-

den konnten, so dass vor allem die Seren von Maus 3, Boost 8, sowie die

Boosts 7 und 11 der Kaninchen betrachtet wurden. Angewandt wurde die soge-

nannte 3s-Methode [244, 245], bei welcher die dreifache Standardabweichung

des aus der ELISA-Kurve erhaltenen A-Werts von eben diesem abgezogen wur-

de. Die entsprechende Konzentration wurde als Nachweisgrenze festgelegt.

Kreuzreaktivität

Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität (KR) wurden die Wendepunktkonzentratio-

nen einer Kalibrierkurve (C-Wert, Gleichung 4, auch IC50) von TATP und einer zu

testenden Substanz (Kreuzreaktand) zueinander in Relation gesetzt [242]:

Für die molare Kreuzreaktivität wurden die Massenkonzentrationen zuvor in

Stoffmengenkonzentration umgerechnet. Die Kreuzreaktivität zeigt in Prozent die

Empfindlichkeit des TATP-Immunoassays (und damit des Antikörpers) gegen-

über anderen Substanzen an. Dazu wurden, wie oben beschrieben, ELISA-

Kurven der als interessant erachteten Stoffe mit acht Kalibrierlösungen inklusive

einem Nullwert (Wasser) auf einer einzelnen Mikrotiterplatte direkt mit einer

TATP-Kurve verglichen. Nur die Kreuzreaktivität des TATP-Haptens wurde auf

drei verschiedenen Platten zur Feststellung der Unsicherheit bestimmt (n = 3), da

alle anderen Substanzen keine oder nur schwache Kreuzreaktivitäten aufwiesen.

In letzteren Fällen wurde der Parameter D der 4-Parameteranpassung auf das

Niveau der TATP-Kurve gesetzt, um einen sigmoidalen Kurvenverlauf zu erzwin-

gen und eine Schätzung der Kreuzreaktivität zu ermöglichen. Sämtliche Kreuzre-

aktivitäten wurden mit den Seren beider Kaninchen nach Boost 7 (1:80 000,

HRP-Konjugat 1 1:100 000, selten indirekt: 1:40 000, -Kaninchen-IgG-HRP 1:60

000) und vereinzelt auch mit Maus-3-Serum nach Boost 8 (1:10 000, HRP-

Konjugat 1 1:5 000, indirekt: 1:5 000, -Maus-IgG-HRP 1:10 000) ermittelt.

Es wurden andere Explosivstoffe, strukturelle Analoga sowie die Ausgangsstof-

fe der TATP-Synthese ausgewählt, um die Seren auf Kreuzreaktivität gegenüber

diesen zu testen. Einige der Kreuzreaktanden mussten zunächst synthetisiert

werden, weil sie kommerziell nicht erhältlich sind. Von allen zu untersuchenden

Stoffen wurden Stammlösungen hergestellt, die dann in Wasser verdünnt wurden

[%] ionKonzentrat der Fehler relativer

B

TATP

B

TATPC

c 2

c

C

A)- (D B

Extinktion der weichungStandardab 100-

(Gleichung 6)

001 C

C KR

andKreuzreakt

TATP (Gleichung 7)

Experimenteller Teil 67

(Tabelle 3.5). Während die ersten Verdünnungen unterschiedlich waren (teils

bedingt durch die Löslichkeit in Wasser), folgten daraus jeweils sechs weitere

Kalibrierlösungen durch (meist) 1:10-Verdünnungsreihen. Als erste der insge-

samt acht Kalibrierlösungen für die Bestimmung der Kreuzreaktivität im ELISA

wurde stets reines Wasser verwendet (wie oben).

Tabelle 3.5: Herstellung der Stammlösungen zur Bestimmung der Kreuzreaktivität.

Substanz cStammlsg. [g L-1]

Lösungsmittel 1. Ver-

dünnung cKalibrierlsg. [mg L-1]

Lösungs-mittelrest

TNT1 5 CH3OH/DMSO 1:50 100 2%

RDX1 5 CH3OH/DMSO 1:50 100 2%

PETN1 5 CH3OH/DMSO 1:100 50 1%

HMX1 5 CH3OH/DMSO 1:500 10 0.2%

HMTD2 1 DMSO 1:10 100 10%

Nitroguanidin3 10 DMSO 1:100 100 1%

Ammoniumnitrat 10 Wasser 1:100 100 —

TATP-Hapten2,

4 ~ 1 CH3OH 1:100 8.88 1%

Tributanontriperoxid2,

4 — CH3OH 1:200 — 0.5%

Tri-3-pentanontriperoxid2,

4 — CH3OH 1:200 — 0.5%

Tri-2-pentanontriperoxid2,

4 — CH3OH 1:200 — 0.5%

DADP2 10 CH3OH 1:100 100 1%

[18]Krone-6 1 Wasser 1:10 100 —

[12]Krone-4 10 Wasser 1:100 100 —

7-Oxooktansäure 10 Wasser — 10 000 —

Aceton 10 Wasser — 10 000 —

Wasserstoffperoxid 10 Wasser — 10 000 —

1wegen der schlechten Löslichkeit in reinem Methanol in einem Gemisch aus gleichen Teilen

Methanol und Dimethylsulfoxid (DMSO) angesetzt; 2Details im Text unter dieser Tabelle;

3Wasseranteil von ~ 25% berücksichtigt, somit nur ungefähre Konzentrationsangabe möglich;

4nicht gravimetrisch hergestellt

Die TATP-Hapten-Stammlösung in Methanol wurde grob auf 1 g L-1 eingestellt

und dann 1:100 in Wasser verdünnt (und als höchst konzentrierte der acht Kalib-

rierlösungen eingesetzt). Die Konzentration der ca. 10 mg L-1 Lösung wurde mit-

tels HPLC (Abschnitt 3.3.1) mit einer 10 mg L-1 TATP-Stammlösung über die

Signalflächen verglichen und auf 8.88 mg L-1 berichtigt.

Tributanontriperoxid, Tri-3-pentanontriperoxid und Tri-2-pentanontriperoxid

wurden analog zur Synthese von TATP dargestellt. Wie oben beschrieben wur-

den 3 mmol des jeweiligen Ketons (267 µL Butanon, 319 µL 3- oder 2-Pentanon

anstelle von Aceton) mit 153 µL Wasserstoffperoxid (1.5 mmol, 30%) unter Ein-

wirkung von 7.5 µL Schwefelsäure (0.015 mmol, 2 M) zur Reaktion gebracht.

Nach 48-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reaktionsansätze

vollständig in 10 mL Methanol aufgenommen und dienten so als Stammlösun-

68 Experimenteller Teil

gen. Ein in gleicher Weise behandelter TATP-Syntheseansatz wurde zur Ab-

schätzung der Syntheseausbeute und damit der Konzentrationen der Lösungen

anhand einer TATP-ELISA-Kalibrierkurve verwendet. Dabei wurde angenommen,

dass die Ausbeute der drei anderen Triperoxide der des TATP entspricht. Auf-

grund der Schwierigkeiten mit der Reinigung der Triperoxide, insbesondere in

Ermangelung der Kristallbildung, konnten mittels per NMR Indizien für erfolgrei-

che Synthesen gewonnen werden (Abschnitt 3.3.1).

Diacetondiperoxid (DADP) wurde entsprechend der Vorschrift in Dubnikova et

al. [46] aus TATP hergestellt. In 500 µL einer über Molekularsieb getrockneten

Lösung von p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat in Chloroform (~ 0.002 mmol,

< 5 g L-1) wurde 105 mg gewaschenes und gründlich getrocknetes TATP

(0.47 mmol) gelöst. Nach zweiwöchiger Inkubation unter Lichtausschluss bei

Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom verdampft

und das Produkt zweimal aus heißem Methanol umkristallisiert. Um eine mögli-

che Zersetzung des DADP zu verhindern, wurde es in Mutterlauge aufbewahrt.

Die gravimetrische Herstellung der 10 g L-1 DADP-Stammlösung in Methanol war

daher ungenau, weil Methanolreste mitgewogen wurden. Die Kontrolle der Syn-

these erfolgte mittels GC-MS, NMR und Einkristallstrukturanalyse (Abschnitt

3.3.1). Eine ebenfalls beschriebene Methode zur direkten Synthese von DADP

aus Aceton und Wasserstoffperoxid in Dichlormethan mit Methylsulfonsäure als

Katalysator war weniger effizient und verlief deutlich langsamer.

Abbildung 3.5: Schematische Darstellung der HMTD-Synthese.

Hexamethylentriperoxiddiamin (HMTD) wurde in Anlehnung an Wierzbicki und

Cioffi [283] synthetisiert. Dazu wurden 105 mg Hexamethylentetramin

(0.75 mmol) in 944 µL Wasserstoffperoxidlösung (9.24 mmol, 30%) gelöst und

nach dem Abkühlen auf 0 °C vorsichtig mit 177 mg kristalliner Zitronensäure

(0.72 mmol) versetzt (Abbildung 3.5). Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf

Raumtemperatur gebracht und nach spätestens fünf Tagen hatten sich HMTD-

Kristalle gebildet. Diese wurden erst ausgiebig mit Wasser, dann mit eiskaltem

Methanol gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Wegen der schlechten Lös-

lichkeit von HMTD in diversen Lösungsmitteln wurde die 1 g L-1 Stammlösung in

DMSO gravimetrisch hergestellt. Der Erfolg der Synthese wurde durch NMR und

Einkristallstrukturanalyse (Abschnitt 3.3.1) überprüft.

Ähnlich der Bestimmung der Kreuzreaktivitäten wurde auch die Toleranz der

ELISA (direkt und auch indirekt) gegenüber Lösungsmitteln untersucht. Dabei

wurde die Auswirkung von Aceton, Methanol, DMSO, Glycerol und Ethylenglykol

im Bereich von 0.5-50% (v/v) in Wasser, die anstelle der Kalibrierlösungen ein-

gesetzt wurden, beobachtet. Ebenso wurde beim Einsatz Wasserstoffperoxid

(0.1-15%, (v/v)) in hohen Konzentrationen geprüft, wann das Signal gegenüber

Experimenteller Teil 69

reinem Wasser abfiel. Vergleichbar war auch die Untersuchung der Effekte, die

HRP- (0.01-100 000 µg L-1) und OVA-Verdünnungsreihen (0.1-1 000 000 µg L-1)

im ELISA auslösten. Außerdem wurde der Einfluss von 2, 5 und 10% (v/v) Me-

thanol und 0.1, 0.2 und 0.5% (v/v) Tween 20 direkt in den Kalibrierlösungen ana-

lysiert.

Konformeren-ELISA

Da sich, wie in Abschnitt 3.3.1 beschrieben, die beiden TATP-Konformere D3 und

C2 per HPLC trennen lassen, sollten diese auch im ELISA unabhängig voneinan-

der untersucht werden. Dafür wurde 1 µL einer 10 g L-1 methanolischen TATP-

Lösung (= 10 µg TATP) chromatographisch (ohne TFA) getrennt. Im

0.05-Minutentakt wurden Fraktionen von jeweils ca. 18.5 µL (genaue Volumina

bekannt) in einer Mikrotiterplatte mit Glaseinsätzen bei 4 °C aufgefangen. Da ein

Eindampfen der Fraktionen nicht möglich war, weil TATP selbst dabei sublimie-

ren würde, wurde zu jeder Fraktion 1 mL Wasser geben, u. a. um den Anteil des

Lösungsmittels (~ 95% Acetonitril/Methanol) für den ELISA zu reduzieren. Die

verdünnten Fraktionen wurden ein weiteres Mal 1:10 verdünnt und anschließend

je 200 µL beider Verdünnungsstufen auf eine bereits mit Kaninchen-1-Serum

(Boost 11, 1:100 000) behandelte Platte geben. Aufgrund der kurzen Halbwerts-

zeit der Umwandlung der beiden TATP-Konformere ineinander, musste die ge-

samte Durchführung sehr schnell erfolgen. Daher wurde zum einen die monoli-

thische Säule mit dem nur 16-minütigen HPLC-Programm verwendet und zum

anderen die HRP-Konjugat-1-Konzentrantion sechsfach erhöht (1:50 000,

0.04 mg L-1). Dadurch konnte der Kompetitionsschritt nach 5 min beendet werden

und es vergingen nur 33 min vom Fraktionieren bis zum Ende des Kompetitions-

schritts. Die Auswertung erfolgte über die parallel auf der ELISA-Platte angefer-

tigten TATP-Kalibrierreihe, in dem die Konzentration der einzelnen verdünnten

Fraktionen bestimmt wurde und so auch das HPLC-Chromatogramm nachgebil-

det werden konnte. Die weniger stark verdünnten Fraktionen lagen dabei außer-

halb des Kalibrierbereichs und konnten nicht zur Auswertung herangezogen wer-

den.

Plattenkonservierung

Die Konservierung von ELISA-Platten dient nicht nur der Zeitersparnis sondern

vereinfacht auch die Kommerzialisierung von Tests. Es wurde ein durch Bahl-

mann et al. [284] für den Carbamazepin-ELISA mit monoklonalen Antikörpern

optimiertes Protokoll auf der Grundlage von Kolosova et al. [285] benutzt. Dabei

verliefen die ersten beiden Schritte des Immunoassays (Beschichtung mit

-Kaninchen-IgG und Inkubation mit Kaninchen 1, Boost-11-Serum) sowohl von

den Zeiten als auch den Konzentrationen wie oben beschrieben. Nach dem Wa-

schen und damit dem Entfernen der Serumverdünnung wurden jedoch in jede

Kavität 200 µL der Konservierungslösung pipettiert und diese 1 h einwirken ge-

lassen. Danach wurde die Lösung aus der Platte geschüttelt und diese einmal

vorsichtig auf einem Tuch ausgeklopft, so dass Tropfen entfernt wurden und nur

ein dünner Flüssigkeitsfilm auf der Kunststoffoberfläche verblieb. Die Platte wur-

70 Experimenteller Teil

de nun für 90 min bei 40 °C getrocknet, anschließend mit Parafilm gut verschlos-

sen und luftdicht (mit Trockenmittel) bei 4 °C gelagert. Die konservierten Platten

wurden direkt durch das Beginnen mit dem Kompetitionsschritt reaktiviert, was an

den Tagen 8 und 24 nach der Konservierung geschah. Zum Einschätzen der

Qualitätsverluste der konservierten Platten wurden jeweils frisch angefertigte

Platten parallel bearbeitet und die Signalhöhen sowie Testmittelpunkte (A- und C-

Werte, Gleichung 4) verglichen.

3.3.6 Immunchromatographischer Schnelltest (LFA)

Die nachstehenden Beschreibungen zu Aufbau und Durchführung eines immun-

chromatographischen Schnelltests (LFA, lateral flow assay) für TATP sind bis-

lang nur erste Schritte hin zu einem funktionsfähigen Test. Anhand der Produktin-

formationen der Hersteller der verwendeten Materialien Millipore GmbH und

Whatman GmbH (GE Healthcare) [286] sowie einer Dissertation zum Thema der

quantitativen LFA-Entwicklung [287] wurde eine erste Machbarkeitsstudie durch-

geführt.

Probenauftrag diagnostische Membran Absorption

Millipore

Hi-FlowG041

HF120 HF135

Hi-Flow C083

Whatman

Rapid 24 Rapid 27

Standard 14

Immunopore RP

CF3 CF4 CF6

1.5-2.0 cm 4.0-5.5 cm 1.5-2.0 cm

0.5 cm

TATP-OVA-Konjugat -Kaninchen-IgG

Abbildung 3.6: Schema des Aufbaus eines LFA-Teststreifens für TATP.

Ein LFA-Teststreifen wurde aus einem Proben- und Konjugatauftragsvlies, einer

diagnostischen Membran und einem Absorptionsvlies, in diversen Kombinationen

aller erhaltenen Mustermaterialien, zusammengesetzt (Abbildung 3.6). Diese

Bestandteile wurden im A4-Format geliefert und zunächst in 0.5 cm breite Strei-

fen geschnitten, wobei stets Handschuhe getragen wurden, um die Oberflächen,

insbesondere der Membranen, nicht zu berühren. Die drei einzelnen Komponen-

ten wurden dann auf einen umgedrehten Streifen transparenten Klebebands

fixiert, wobei mit der mittig liegenden Membran begonnen wurde. Ein 4-5.5 cm

langes Stück davon wurde anschließend auf der einen Seite von 1.5-2 cm des

Proben- und Konjugatauftragsvlies und auf der anderen von einem Stück Ab-

sorptionsvlies gleicher Länge mit jeweils ca. 2 mm Überlappung flankiert. Wäh-

rend bei der Membran auf die korrekte Ausrichtung von Ober- und Unterseite

geachtet werden musste (rückseitig ist ein dünner Plastikträger), spielte dies bei

den Vliesen keine Rolle. Sämtliche Materialien können ohne Vorbehandlung

verwendet werden. Dennoch wurde getestet, ob das Laufverhalten der Proben

durch das Einlegen der Proben- und Konjugatauftragsvliese in LFA-Vorbehand-

Experimenteller Teil 71

lungslösung (mit leicht variierender Zusammensetzung, in Anlehnung an die

Arbeiten von Klewitz [287, 288]) verbessert. Nach mindestens 3 h Schütteln in

dieser Lösung wurden die Vliese luftgetrocknet und konnten bei Raumtemperatur

länger aufbewahrt werden.

Noch vor dem Zusammensetzen der Teststreifen wurde auf die diagnostischen

Membranen in ca. 2 cm Abstand von der Probenauftragsseite eine senkrechte

Linie mit TATP-OVA-Konjugat 3 (6.3 mg mL-1) aufgebracht, um ein Testsystem

ähnlich dem indirekten ELISA zu erzeugen. Etwa 1 cm daneben wurde eine zwei-

te Linie mit -Kaninchen-IgG (2.23 mg mL-1) als Kontrolle aufgetragen (Abbildung

3.6). Beide Proteinlösungen wurden unverdünnt durch Beträufeln von 3 × 0.2 µL

mit der Einkanal-Pipette (Volumenbereich: 0.1-2.5 µL) aufgetragen. Die Membra-

nen wurden nun mindestens 4 h bei Raumtemperatur an Luft getrocknet und an-

schließend vor Staub geschützt gelagert, auch über mehrere Tage. Einige der

Membranen wurden noch mit Blockpuffer nachbehandelt. Dazu wurden sie zu-

nächst 10 min in dem Blockpuffer und nach einem Lösungswechsel nochmals für

mindestens 40 min vorsichtig geschüttelt. Anschließend wurden sie mehrere

Stunden in PBS mit 0.1% (v/v) Tween 20 gewaschen, wobei die Lösung viermal

erneuert wurde. Abschließend wurde die Membran mit PBS gespült, um sie vom

Tween 20 zu befreien, und konnte nach dem Trocknen verwendet werden.

Zur Probenvorbereitung wurden in PBS (häufig auch mit bis zu 2% (v/v) Casein

oder 0.1% (v/v) BSA versetzt) 1% (v/v) (1:100) Gold-konjugierte -Kaninchen-

IgG-Lösung und Kaninchenserum (Kaninchen 1, Boost 11) vorsichtig durch

Schwenken und Schütteln des Mikroreaktionsgefäßes vermischt. Das Kanin-

chenserum wurde dabei in Verdünnungen von 1:500-1:100 000 eingesetzt, meist

mit 0.1% (v/v) (1:1 000). Es folgte eine gemeinsame Inkubation für mindestens

4 h bei 4 °C, damit sich ein Komplex aus den enthaltenen Antikörpern bilden

konnte. Kurz vor dem Auftragen auf den Teststreifen wurde fast immer 0.1% (v/v)

Tween 20 (über eine 1:10-Vorverdünnung) zugegeben, um das Laufverhalten zu

verbessern. Bei Kompetitionsversuchen wurden davor noch 100 mg L-1 TATP

oder Wasser in gleichen Teilen zu dem Antikörper-Konjugationsmix hinzugefügt.

Es wurden Volumina von 20-100 µL aufgetragen, die zugleich den Lauf des LFA

starteten und seltener zuvor auf dem Proben- und Konjugatauftragsvlies einge-

trocknet wurden. Etwas PBS (meist mit 0.1% (v/v) Tween 20) wurde zusätzlich

zur Aufrechterhaltung (oder zum Auslösen) des Flusses hinterher pipettiert. Die

Laufzeit eines Tests betrug 5-10 min. Die Begutachtung der Testergebnisse er-

folgte visuell.

Alternativ wurde als Proben- und Konjugatauftragsvlies ein vorgefertigtes, mit

Gold-konjugiertem Protein A getränktes Vlies (Protein A Tell-Tale Gold ribbon)

verwendet. Hierbei erfolgte die Probenvorbereitung ohne Gold-konjugiertes

-Kaninchen-IgG. Außerdem wurden verschiedene Negativkontrollen durchge-

führt, wie Proben ohne Gold-konjugiertes -Kaninchen-IgG, ohne Serum oder mit

Kaninchenserum einer anderen Immunisierung (für TNT-Antikörper [289]).

Die unbehandelten sowie die LFA-Materialien nach einem durchlaufenen As-

say wurden rasterelektronenmikroskopisch (ESEM, environmental scanning

72 Experimenteller Teil

electron microscope, Tabletop Microscope Hitachi TM-1000) betrachtet, um Ver-

änderungen der Oberfläche feststellen zu können.

73

4.1 Untersuchungen zu Triacetontriperoxid (TATP)

Beobachtungen zur TATP-Synthese

Zu Beginn dieser Arbeit stand zunächst noch nicht der Nachweis von TATP im

Mittelpunkt, sondern der Analyt selbst. Durch seine Synthese sowie weiterfüh-

rende Untersuchungen konnte mehr über seine Eigenschaften erfahren werden,

wobei der vorsichtige Umgang mit TATP stets vorrangig war. Dass die Synthese

dieses brisanten Stoffes auch ohne jegliche Kenntnis der einschlägigen Fachlite-

ratur nur durch simple Internetsuchanfragen hätte erfolgen können, ist erschre-

ckend. Diese Tatsache macht nochmals sehr eindrücklich deutlich, welche po-

tenzielle Gefahr von diesem Explosivstoff, der sich aus einfachen Haushaltsche-

mikalien – Aceton, Wasserstoffperoxid und Säure – herstellen lässt, ausgeht und

dass effektive und schnelle Nachweisverfahren notwendig sind.

Unter Berücksichtigung der in Abschnitt 3.3.1 genannten Literatur konnte ohne

weitere Optimierung TATP mit einer Ausbeute von ~ 60-70% [46] synthetisiert

werden. Obwohl bei den meisten Vorschriften mit Schwefelsäure gearbeitet wur-

de (z. B. [46, 89, 102]), gibt es Hinweise darauf, dass bei der Verwendung von

Salzsäure als Katalysator reineres TATP und weniger DADP als Nebenprodukt

entsteht [81, 87, 91]. Dies konnte im Vergleich zweier nahezu identischer HPLC-

DAD-Chromatogramme (225 nm) entsprechender Syntheseansätze mit gleichen

Molaritäten nicht bestätigt werden und würde nach Reinigung durch Umkristalli-

sation auch keine Rolle mehr spielen. Selbst in ungereinigten Syntheseansätzen

mit Schwefelsäure, die vor dem Einspritzen in die GC-MS einfach in n-Hexan

stark verdünnt wurden, konnte kein DADP nachgewiesen werden. Des Weiteren

wird zur Darstellung von stabilem TATP eine niedrige Säurekonzentration emp-

fohlen, wozu von Matyas und Pachman [90] ausführliche Untersuchungen veröf-

fentlicht wurden. Insbesondere für Schwefel- und Perchlorsäure wurde dort ein

molares Verhältnis von Säure zu Aceton von < 1 × 10-2 als günstig ermittelt und

in dieser Arbeit mit 5 × 10-3 angewendet (da molar doppelt so viel Aceton wie

Wasserstoffperoxid eingesetzt wurde). Eine sehr hohe Schwefelsäurekonzentra-

tion (Säure/Aceton ~ 3), wie von Cerna et al. [290] zur Synthese von 3,3,6,6,9,9-

Hexaethyl-1,2,4,5,7,8-hexaoxonan mit 3-Pentanon anstelle des Acetons ange-

wendet, führte zur sofortigen Bildung eines weißen, breiigen Niederschlags. Per

ELISA wurde festgestellt, dass die Ausbeute an TATP unter 1% lag. Eine Analy-

se des Niederschlags wurde nicht vorgenommen, aber Beayer und Villinger [86,

87] beschrieben für eine fast identisch verlaufende Synthese ähnliches und wie-

74 Ergebnisse und Diskussion

sen darauf hin, dass ihr (wahrscheinlich polymeres) „Acetonsuperoxyd“ sich von

Wolffensteins unterscheidet.

Die erste Bestätigung des Syntheseerfolgs wurde mittels HPLC-MS gewonnen,

wobei das einzig kommerziell erhältliche TATP in Form eines 0.1 mg mL-1 Stan-

dards in Acetonitril (AccuStandard) als Vergleich diente. Der käuflich erworbene

Standard wies jedoch in der HPLC-Analyse mehr Verunreinigungen als der ledig-

lich in Wasser verdünnte Reaktionsansatz auf. Daher wurde die Herstellung ei-

gener TATP-Lösungen aus gereinigtem TATP nötig, welches durch dreimaliges

Umkristallisieren des Rohprodukts aus Methanol gewonnen wurde. Das umkris-

tallisierte TATP wurde durch Einkristallstrukturanalysen und NMR (siehe unten)

untersucht und bestätigt.

Einkristallstrukturanalysen

Für das synthetisierte und umkristallisierte TATP (wie

Abbildung 4.1) wurden mittels Röntgendiffraktometrie

die Gitterkonstanten a = 13.8407 Å, b = 10.7018 Å,

c = 7.9113 Å, = 90°, = 91.701°, = 90° ermittelt.

Damit war eine eindeutige Zuordnung von TATP

durch die Übereinstimmung mit zwei Einträgen in der

CCDC-Datenbank, HMHOCN und HMHOCN01,

möglich. Die erste Messung von Groth [103] mit

a = 13.925(5) Å, b = 10.790(4) Å, c = 7.970(4) Å,

= 90°, = 91.64(5)°, = 90° stammt bereits aus

dem Jahr 1969. Der zweite Eintrag (HMHOCN01

oder CCDC-241973) von Dubnikova et al. [46] hat

mit a = 13.788(6) Å, b = 10.664(5) Å, c = 7.894(4) Å,

= 90°, = 91.77(5)°, = 90° noch ähnlichere, fast

identische Werte. In beiden Arbeiten wurde außerdem erwähnt, dass es sich bei

den Kristallstrukturen um das D3-Konformer des TATP handelt, worauf später in

diesem Abschnitt noch eingegangen wird.

Während TATP-Kristalle bislang nur ohne eingeschlossene Lösungsmittelmo-

leküle und mit der Raumgruppe P21/c (monoklin) bekannt waren, wurden in eini-

gen Proben erstmals TATP-Kristalle gefunden, welche Methanol im molaren Ver-

hältnis 1:1 im Kristallgitter (C9H18O6 • CH3OH) enthielten. Bemerkenswert dabei

ist, dass alle TATP-Kristalle bis zur Messung in Methanol gelagert wurden und

dennoch die meisten kein Methanol aufwiesen. Außerdem war der Methanolein-

schluss weder dauerhaft noch äußerlich erkennbar. Er führte jedoch zu einer

leicht veränderten, hexagonalen TATP-Kristallstruktur der Raumgruppe R3 c mit

den Gitterkonstanten a = 11.8111(7) Å, c = 16.8071(13) Å. Ausführliche Daten

zur durchgeführten Strukturverfeinerung (R1 = 0.0549) wurden bereits von Walter

et al. [291] veröffentlicht oder können in der Datenbank unter der Nummer

CCDC-769685 eingesehen werden.

Abbildung 4.1: TATP-Kristall.

Ergebnisse und Diskussion 75

Wasserlöslichkeit von TATP

Mittels HPLC wurde durch die Untersuchung einer gesättigten, wässrigen TATP-

Lösung die Wasserlöslichkeit bestimmt. Diese wurde bislang in der Fachliteratur

mit „unlöslich“ angegeben. Anhand variierter Injektionsvolumina einer wässrigen

TATP-Lösung (mit 50% (v/v) Methanol) wurde eine lineare Kalibriergerade (n = 2)

erhalten, aus der die

Wasserlöslichkeit von TATP (22 °C) =

177 ± 2 mg L-1

mit n = 3 ermittelt wurde. Dieser Wert wurde im direkten ELISA mit Serum von

Maus 3, Boost 8 (1:10 000, HRP-Konjugat 1 1:10 000) mittels graphische Aus-

wertung bestätigt. Hierbei ergaben eine 1:10-Verdünnungsreihe des Überstandes

der gesättigten Lösung und eine TATP-Kalibrierreihe der in dieser Arbeit verwen-

deten TATP-Kalibrierlösungen zwei deckungsgleiche, sigmoidale Kurvenverläufe

(jeweils n = 4).

TATP in der Gasphase

Die GC-MS sollte ursprünglich als Referenzmethode zu den immunchemischen

Nachweismethoden für TATP dienen, kam aber in Ermangelung von Realproben

nicht zum Einsatz. Es wurde aber eine Analysenmethode optimiert, welche eine

Bestimmungsgrenze von ca. 70 µg L-1 (oder 70 pg) TATP in n-Hexan im SIM-

Modus besitzt. Dabei wurden in Übereinstimmung mit der Literatur die Fragmente

m/z 43 [C2H3O]+, 59 [C3H7O]+ und 75 [C3H7O2]+ detektiert. Das Molekülion

(m/z 222) war jedoch erst ab einer Konzentration von 1 000 µg L-1 (1 ng) detek-

tierbar. Die Empfindlichkeit der Methode entspricht damit den Nachweisgrenzen

in den auch zur Methodenentwicklung herangezogenen Artikeln (ohne vorge-

schaltete SPME): Sigman et al. [124] geben ihre Nachweisgrenze für TATP mit

0.05 ng (m/z 43, 59, 75, Quadrupol) und Stambouli et al. [123] mit < 1 ng (m/z 43,

59, 75 und 221 [M-1], Ionenfalle) an. Die Empfindlichkeit konnte durch das Aus-

schließen von m/z 43 auch noch etwas verbessert werden, wohingegen sie bei

der Aufnahme des kompletten Massenspektrums um eine Zehnerpotenz schlech-

ter war als im SIM-Modus.

Die optimierte GC-MS-Methode wurde für zwei Versuche zur Bestimmung von

TATP aus der Gasphase benutzt. Da TATP flüchtig ist, bietet sich ein Nachweis

aus der Luft an, so dass zunächst der TATP-gesättigte Gasraum eines Glas-

fläschchens, mit einem kleinen TATP-Kristall darin, betrachtet wurde. Anfängliche

Bedenken bezüglich der Genauigkeit und Machbarkeit eines Vergleichs von Ka-

libriergeraden, die aus TATP-Lösungen in n-Hexan erstellt wurden, mit gasförmi-

gen Proben scheinen unbegründet. Während von den flüssigen Proben jeweils

1 µL-Injektionen ausreichten (Korrelationskoeffizienten der Geraden > 0.99), war

dieses Volumen nicht optimal für gasförmige Injektionen und führte zu extremen

Schwankungen der Werte (Signalflächen der Chromatogramme). Bei 6 µL-

Injektionsvolumen mit einer 10 µL Dosierspritze wurden reproduzierbare Resulta-

te erzielt. So wurde die

76 Ergebnisse und Diskussion

Sättigungskonzentration von TATP in der Gasphase (Luft, 25 °C) =

1.08 ± 0.05 mg L-1

mit n = 18 und einer Kalibriergeraden (n = 3) mit einem Korrelationskoeffizienten

von 0.9993 bestimmt. Dieses Ergebnis ist in derselben Größenordnung wie die

von Oxley et al. [79] ebenfalls bei 25 °C ermittelten 0.62 (± 0.04) mg L-1. Auch

dort wurden flüssige TATP-Kalibrierlösungen (in Acetonitril) verwendet und mit

Gasproben verglichen. Zusätzlich untersuchten sie TNT und fanden eine Kon-

zentration in der Gasphase von nur 0.05 µg L-1. In molaren Dimensionen bedeu-

tet das, dass TATP-Moleküle in 13 000-fach größerer Anzahl als TNT-Moleküle in

der jeweils gesättigten Gasphase auftreten. Natürlich sind diese Unterschiede

bedingt durch die Dampfdrücke, der bei TNT mit 5 × 10-4 Pa und bei TATP mit

7 Pa bei 25 °C angegeben wurde. Schon 3 °C weniger und der TATP-

Dampfdruck beträgt nur noch rund 1.5 Pa. Bei 22 °C fanden Oxley et al. [79] nur

noch 0.13 mg L-1 und 0.17 mg L-1 TATP in der Luft und hier wurden 0.85 mg L-1

und 0.89 mg L-1 gemessen. Diese (nicht systematischen) Wiederholungsmes-

sungen zur Bestimmung der Sättigungskonzentration von TATP in der Gasphase

sind nicht sehr aussagekräftig (n = 2) und wurden zunächst nicht beachtet. Den-

noch zeigten sie gemeinsam im Vergleich mit den Daten aus [79], dass die Kon-

zentrationen deutlich mit fallender Temperatur abnehmen und die Werte durch-

aus vertrauenswürdig sind. Oxley et al. [79] entwickelten aus weiteren Werten

zusätzlich eine Gesetzmäßigkeit zur Abhängigkeit des Dampfdrucks von TATP

von der Temperatur und zeigten, dass im Bereich von 12-58 °C der TATP-Gehalt

in der Luft von ca. 0.09-50 mg L-1 variiert.

Ein ähnlich gearteter Versuch wurde mit 50 µL wässriger TATP-Lösungen an-

stelle eines TATP-Kristalls in den Glasfläschchen (2 080 µL Gesamtvolumen)

durchgeführt, in dem auch hier die Konzentration des Analyten in dem Gasraum

darüber bestimmt wurde. Dabei konnte TATP nicht in der Gasphase über einer

0.5 mg L-1 TATP-Lösung nachgewiesen werden. In den Glasfläschchen mit den

höher konzentrierten Lösungen, 50 und 150 mg L-1, wurden hingegen

0.055 ± 0.041 mg L-1 bzw. 0.302 ± 0.022 mg L-1 TATP in der Gasphase mit der

GC-MS (n = 4) analysiert. Das entspricht einer absoluten Menge von 0.1 bzw.

0.6 µg TATP im Gasraum bei einem Volumen der Fläschchen von 2 080 µL.

Dementsprechend sind unter allgemeinen Laborbedingungen bei 22 °C ca. 4%

des TATP in 50 µL TATP-Lösung (50 mg L-1) und 8% der 50 µL Lösung

(150 mg L-1) aus der wässrigen Phase in die Gasphase übergegangen. Für das

analytische Arbeiten mit TATP-Lösungen ist das ein bedenkliches Ergebnis, weil

unkontrolliert Verluste von TATP in die Gasphase auftreten können.

Kinetik der Umwandlung zwischen D3- und C2-TATP

Beim Umgang mit TATP ergaben sich am Rande des Themas dieser Arbeit auch

einige interessante Einsichten in die kinetischen Aspekte bei der gegenseitigen

Umwandlung der TATP-Konformere. Im 1H-NMR-Spektrum (CD3OD,

600.20 MHz) wurde mit = 1.39 (s, 18H, 6 × CH3) sowohl das D3-Konformer mit

einer Twist-Wannen-Sessel-Konformation als auch mit = 1.23 (s, 9H,

Ergebnisse und Diskussion 77

3 × CH3(ax)), 1.71 (s, 9H, 3 × CH3(eq)) das C2-Konformer mit einer Twist-Sessel-

Sessel-Konformation gesehen. Ähnliche chemische Verschiebungen sind auch

bei Widmer et al. [104] (andere Versuchsbedingungen) angegeben. Hieraus wur-

de außerdem die Trennung der beiden Konformere mittels HPLC übernommen.

Ein vergleichbares Chromatogramm ist im Abschnitt 4.8 beim Konformeren-

ELISA dargestellt (Abbildung 4.17), wo D3- und C2-TATP noch einmal betrachtet

werden. Nach der Isolation des C2-TATP-Konformers über die monolithische

Säule mit dem kürzeren 16-minütigen HPLC-Programm wurde die verdünnte

C2-TATP-Fraktion mehrfach reinjiziert. Dabei wurde die Abnahme des C2-TATP-

Signals (bei gleichzeitiger Zunahme des D3-TATP-Signals) beobachtet und das

Verhältnis C2-TATP zum Gesamt (C2- + D3-)-TATP über die Zeit aufgetragen, wie

Abbildung 4.2 zeigt. Es konnten sieben Messpunkte bei 23 °C und fünf bei 37 °C

aufgenommen werden. Während sich bei der auf 37 °C gehaltenen, verdünnten

C2-TATP-Fraktion das Gleichgewicht einstellte, war dies bei der bei 23 °C gehal-

tenen Fraktion noch nicht ganz der Fall.

Abbildung 4.2: Kinetische Untersuchung der Umwandlung von C2- zu D3-TATP mittels HPLC.

In Origin wurden die Daten über eine Exponentialfunktion angepasst, woraus

sich (unter Vernachlässigung der Rückreaktion) die Halbwertszeiten T1/2 zur ge-

genseitigen Umwandlung der beiden TATP-Konformere ableiten ließen:

T1/2 (296 K) = 33 ± 2.8 min

T1/2 (310 K) = 8.0 ± 0.31 min

Es wurden weitere Experimente durchgeführt, die zu ähnlichen Ergebnissen führ-

ten. Beispielsweise wurde mit der UltraSep ES, Phen1-Säule bei gleichem Vor-

gehen T1/2 (296 K) = 33 ± 0.25 min erhalten. Der Nachteil dieser Säule war, be-

dingt durch das 40 min dauernde HPLC-Programm, dass die Messung nicht bei

37 °C für die sehr kurze Halbwertszeit erfolgen konnte. Außerdem wurde auch

versucht, die D3-TATP-Fraktion zu sammeln und dann die Zunahme des

0 20 40 60 80 1000

10

20

30

40

50

60

Raumtemperatur (23 °C)

37 °C

C2-T

AT

P/G

esa

mt-

TA

TP

[%

]

[min]

78 Ergebnisse und Diskussion

C2-TATP-Signals zu verfolgen. Dabei konnte mit der UltraSep ES, Phen1-Säule

T1/2 (296 K) = 30 ± 1.5 min und mit der monolithischen Säule T1/2 (296 K) =

20 ± 2.1 min sowie T1/2 (310 K) = 8.0 ± 0.021 min ermittelt werden. Die Halb-

wertszeit bei 23 °C, welche über die monolithische Säule bestimmt wurde,

scheint ein Ausreißer zu sein, da alle anderen sehr gut übereinstimmen.

Aus den Messresultaten (bzw. den Halbwertszeiten) konnte zum einen nach

Gleichung 1 mit

EA = 77.5 kJ mol-1

die Aktivierungsenergie für die Umwandlung der TATP-Konformere abgeschätzt

werden, wobei beide Temperaturen zum gleichen Wert führen. Denekamp et al.

[106] berechneten für die Umwandlungsbarriere in der Gasphase E =

110 kJ mol-1 (umgerechnet). Zu berücksichtigen ist, dass der in dieser Arbeit er-

mittelte Wert in wässriger Lösung mit ca. 30% Acetonitrilanteil (und etwas Me-

thanol) und nicht in der Gasphase bestimmt wurde. Des Weiteren konnte die

Energiedifferenz zwischen dem D3- und dem C2-Konformer in der Gasphase

E = 6.4 kJ mol-1

aus dem Verhältnis der beiden Konformere im Gleichgewichtszustand anhand

von Gleichung 2 ermittelt werden. Dieser Wert ist ebenfalls mit einem bei Dene-

kamp et al. [106] theoretisch berechneten (7.7 kJ mol-1, umgerechnet) vergleich-

bar und liegt ebenfalls leicht unter den dortigen Angaben. Ältere, halbempirische

Berechnungen von Yavari et al. [105] ergaben eine Energiedifferenz von

3.4 kJ mol-1. Das stabile D3-TATP mit dem geringeren Energiegehalt kommt im

Gleichgewicht entsprechend weitaus häufiger vor als das C2-TATP, wobei das

Verhältnis der beiden Konformere zueinander vom Lösungsmittel abhängig ist:

D3/C2 = 15:1 in Methanol (± 0.80, 5%, n = 7 × 3)

D3/C2 = 32:1 in Wasser (± 2.0, 6%, n = 4 × 3)

Ein Verhältnis von 15:1 wurde auch von Widmer et al. [104] bei HPLC-

Experimenten mit Lösungen in Methanol oder Acetonitril beobachtet. Ein Litera-

turwert zum Vergleich des Verhältnisses in wässrigen Lösungen existiert nicht.

Alternativ zur Bestimmung der Halbwertszeit per HPLC wurde auch eine NMR-

Messung vorgenommen. Es traten dabei einige Schwierigkeiten auf, dennoch soll

das Prinzip hier kurz vorgestellt werden. Mittels HPLC und durch die notwendi-

gen Messvorbereitungen am NMR-Spektrometer konnte C2-TATP nicht schnell

genug und in ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden, was auch in

einer zwischenzeitlich veröffentlichten, parallel entstandenen Arbeit von Haroune

et al. [292] zu Problemen bei einer direkten LC-NMR-Kopplung führte. Daher

wurde ausgenutzt, dass die TATP-Kristalle nur aus dem D3-Konformer bestehen.

Ein einzelner Kristall wurde unmittelbar vor Messbeginn in deuteriertem Methanol

aufgenommen. Allerdings gab es auch hier einen undefinierbaren Zeitraum zwi-

schen dem Lösen, dem Temperieren, den Messvorbereitungen (ca. 2 min) und

Ergebnisse und Diskussion 79

der eigentlichen Messung. Auch Lösungseffekte können nicht ausgeschlossen

werden. Es gelang trotzdem, die Entstehung des C2-Konformers und die Abnah-

me des D3-Konformers zu beobachten, auch wenn die Änderungen hier, wie

oben beschrieben, nur sehr gering ausfallen. Die Halbwertszeit wurde so bei

37 °C auf T1/2 (310 K) = 41 ± 1.1 min ermittelt und ist damit fünfmal länger als die

mittels HPLC bestimmte. Das D3/C2-Verhältnis im NMR-Spektrum betrug im

Gleichgewicht ca. 20:1. Bei einer Optimierung der Methode sind sicherlich noch

einige Verbesserungen möglich oder die Unsicherheit dieses Werts kann abge-

schätzt werden. Jedoch blieben die unkalkulierbaren Effekte beim Lösen des

TATP-Kristalls: Es ist nicht zu erkennen, wann der Lösungsvorgang abgeschlos-

sen ist. Falls er andauert und immer neues D3-TATP hinzukommt, würde das

eine scheinbare Verlängerung der Halbwertszeit erklären. Auch das Arbeiten in

100% (deuteriertem) Methanol unterscheidet die NMR-Methode von der HPLC-

Variante, bei der hauptsächlich Wasser (und ~ 30% Acetonitril) in Kontakt mit

dem TATP kommt. Insbesondere das Wasser könnte, wie bei den D3/C2-

Verhältnissen oben gezeigt, eine entscheidende Rolle bei der Umwandlung von

einem TATP-Konformer zum anderen einnehmen. In der bereits erwähnten Ver-

öffentlichung [292] wurde per LC-NMR unter Beobachtung der Fraktion des

C2-TATP in einem Gemisch aus 65% Methanol in Wasser eine Halbwertszeit der

Umwandlung der beiden Konformere von T1/2 (295 K) ≈ 2.5 h bestimmt. Die

Halbwertszeit bei 22 °C ist damit etwa fünfmal länger als die in dieser Arbeit per

HPLC bei fast gleicher Temperatur von 23 °C ermittelten 33 min. Das ist erstaun-

lich, da wieder ein Unterschied um den Faktor fünf zwischen HPLC- und NMR-

Messungen für die Halbwertszeiten erhalten wurde. Das untermauert den Ver-

dacht, dass der Einfluss des Lösungsmittels auf die Umwandlungsgeschwindig-

keit und das Gleichgewicht der Konformere nicht vernachlässigt werden darf. Die

gewählte analytische Methode an sich sollte dabei keine Rolle spielen. Bei 12 °C

wurde außerdem in [292] eine Halbwertszeit von T1/2 (285 K) > 17 h abgeschätzt,

was auch in Einklang mit der hier festgestellten starken Zunahme der Umwand-

lung der Konformere ineinander bei steigender Temperatur steht.

Viele der in diesem Abschnitt dargestellten Ergebnisse wurden bereits 2010 in

Langmuir von Walter et al. veröffentlicht [291]. Im Vordergrund dieser Experimen-

te stand die Untersuchung der Flexibilität der TATP-Struktur. Insbesondere war

dabei das Verhalten bei 37 °C interessant, da bei dieser Temperatur Immunisie-

rungen in den Tieren erfolgen, wohingegen die Arbeiten mit den gewonnenen

Antikörpern im Labor bei Raumtemperatur (22-23 °C) durchgeführt werden. Es

wurde angenommen, dass das TATP-Hapten, das im nächsten Abschnitt behan-

delt wird, sich als strukturelles Analogon ähnlich verhält wie TATP. Eine ebenso

ausführliche Untersuchung des Haptens wäre daher auch angebracht gewesen,

war aber aufgrund der geringen Probenmenge unmöglich. Es bestand der Ver-

dacht, dass sich eine flexible Struktur ungünstig auf die Immunisierung, vor allem

auf die Affinität der resultierenden Antikörper, auswirkt. Andererseits wäre auch

ein zu abweichendes Verhalten des Haptens von TATP ebenso nicht förderlich,

da Antikörper durchaus in der Lage sein können, Konformere zu unterscheiden.

80 Ergebnisse und Diskussion

4.2 TATP-Hapten

Abbildung 4.3: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens.

Ein entscheidender Teil dieser Arbeit konnte mit der erfolgreichen Synthese ei-

nes kopplungsfähigen TATP-Analogons, dem TATP-Hapten (Abbildung 4.3), er-

reicht werden. Die Synthese (Abbildung 3.2) wurde direkt von der Herstellung

des TATP abgeleitet und der Mischung aus Aceton, Wasserstoffperoxid und

Schwefelsäure lediglich 7-Oxooktansäure zugefügt. Diese erfüllt gleich mehrere

Ansprüche: Durch die Carbonylgruppe am Kohlenstoffatom (C-7) der Oktansäure

kann wie bei Aceton eine Methylgruppe am Triperoxidring entstehen, so dass

tatsächlich nur eine der sechs Methylgruppen des TATP ausgetauscht wird. Der

aliphatische Teil dient als Abstandhalter (auch Spacer oder Linker) zwischen dem

Zielanalyten und dem Protein, an das das Hapten gekoppelt ist. Die Kette aus

fünf Kohlenstoffatomen entspricht der dazu empfohlenen Länge [169, 171-173].

Schließlich ermöglicht die endständige Carboxygruppe nach Aktivierung (Ab-

schnitte 3.3.3 und 4.3) die kovalente Kopplung des Moleküls an Proteine.

Die Synthese des Haptens verlief jedoch nicht so unproblematisch wie die

TATP-Synthese, insbesondere hinsichtlich der Ausbeute und der Reinigung des

Produkts. Nach ersten Hinweisen für eine erfolgreiche Synthese und Bestim-

mung der Retentionszeiten mittels HPLC-MS wurden Optimierungsversuche mit

dem HPLC-DAD-Signal verfolgt und ausgewertet (via Signalflächen). Dabei wur-

de davon ausgegangen, dass TATP und sein Hapten in ähnlicher Weise bei

225 nm absorbieren und so die Konzentration des Haptens über TATP-

Kalibrierlösungen abgeschätzt werden kann. Bei ersten Versuchen lag die Syn-

theseausbeute des TATP-Haptens noch unter 1% und konnte durch Variation der

eingesetzten Ausgangsstoffkonzentrationen verbessert werden. Schließlich ge-

lang es mit einer äquimolaren Mischung der drei Ausgangsstoffe die Ausbeute

auf etwa 5% zu steigern. Entscheidend dafür war, dass die Menge an

7-Oxooktansäure gegenüber der Menge an Aceton erhöht wurde. Eine weitere

Erhöhung war jedoch kaum möglich, da ~ 80 mg der 7-Oxooktansäure in nur ca.

90 µL Aceton/Wasserstoffperoxid gelöst wurden und die Durchmischung er-

schwert war. Zudem bedeutete zusätzliches Aceton auch mehr TATP als Neben-

produkt. Im äquimolaren Verhältnis von Aceton zu 7-Oxooktansäure wurde mehr

als doppelt so viel TATP-Hapten wie TATP erhalten, doch schon bei einem zwei-

fachen Überschuss Aceton gegenüber der 7-Oxooktansäure war das Verhältnis

Ergebnisse und Diskussion 81

genau umgekehrt. Mit einer Veränderung der eingesetzten Menge Wasserstoff-

peroxid konnte die Ausbeute des TATP-Haptens nicht weiter gesteigert werden,

anders als bei der Wahl der katalytischen Säure und deren Konzentration. Die

von der TATP-Synthese übernommene Menge an Schwefelsäure brachte dabei

die besten Resultate. Sowohl eine Erhöhung als auch eine Verringerung der

Säurekonzentration verschlechterte die Bilanz. Bei der 100-fachen Säuremenge

entstand nicht einmal TATP und bei dem Einsatz eines Zehntels der Säurekon-

zentration wurde nicht nur weniger TATP erhalten, sondern auch das Verhältnis

TATP-Hapten zu TATP ungünstig beeinflusst. Offensichtlich reicht die Säurestär-

ke der 7-Oxooktansäure (pKa von Oktansäure: 4.89 [293]) nicht aus, um selbst

für die Reaktion als Katalysator zu wirken, was zunächst in Betracht gezogen

wurde. Auch die Verwendung von Salzsäure brachte keine Verbesserung. Zwar

blieb die TATP-Hapten-Ausbeute nahezu unverändert, jedoch verschob sich das

Verhältnis von TATP-Hapten und TATP zu Gunsten des TATP. Generell war das

bei der Hapten-Synthese in erheblichen Mengen entstandene TATP auch der

aus Sicherheitsaspekten limitierende Faktor bei der Wahl der Ansatzgröße.

Die Isolierung des reinen TATP-Haptens aus den Synthese-Ansätzen erwies

sich als schwierig: Es wurden etliche Versuche mit diversen Lösungsmitteln

durchgeführt, um das Hapten durch Ausschütteln vom TATP, der restlichen

7-Oxooktansäure sowie allen anderen Nebenprodukten abzutrennen. Auch das

Neutralisieren des Reaktionsansatzes oder das Abdampfen des Lösungsmittels

führten nicht zum Erfolg, so dass eine chromatographische Trennung (Abschnitte

3.3.1 und 3.3.2) erfolgte. Ein Teil des TATP konnte vorher entfernt werden, da es

ausgefallen war. Die restliche Reaktionslösung wurde mit 1 mL Wasser versetzt

und zentrifugiert. Auf diese Weise konnte ein Großteil der wasserlöslichen Kom-

ponenten wie 7-Oxooktansäure und Wasserstoffperoxid entfernt werden. Dabei

gingen ca. 20% des TATP-Haptens verloren, aber aufgrund der niedrigen Kosten

der Ausgangsstoffe und vor allem der Möglichkeit, dadurch letztlich größere

Mengen TATP-Hapten zu injizieren (ohne die eigentlich analytische Säule zu

überladen), war dies vertretbar.

Das Chromatogramm bzw. der vergrößerte Ausschnitt daraus in Abbildung 4.4

zeigt die klare Basislinientrennung von TATP (17.3 min) und dem Hapten

(16.4 min), aber bei beiden jeweils auch ein kleines Folgesignal (18.0 bzw.

16.8 min). Diese entsprechen den jeweiligen C2-Konformeren, welche auch im

NMR-Spektrum identifiziert wurden (siehe unten). Die vier Signale vor dem

TATP-Hapten (15-16 min) wurden nur grob mittels HPLC-MS untersucht und

nicht genauer identifiziert. Wahrscheinlich handelt es sich dabei um verschiedene

7-Oxooktansäure-Acetonperoxid-Verbindungen, denn es wurden u. a. m/z 421

und 521 (ESI-) registriert, die von Aceton-di-7-oxooktansäuretriperoxid und Tri-7-

oxooktansäuretriperoxid stammen könnten. Da die Trennung zwischen dem letz-

ten dieser Signale und dem TATP-Hapten-Signal nicht Basislinien-getrennt ist

und sehr sauberes Hapten für die weiteren Synthesen benötigt wurde, begann

das Sammeln der TATP-Hapten-Fraktion erst spät. Nach dem Abdampfen des

Laufmittels und Trocknen im Exsikkator wurde durch Auswiegen eine Ausbeute

von ca. 1% an hochreinem TATP-Hapten bestimmt. Meist wurden dabei kleine

82 Ergebnisse und Diskussion

TATP-Hapten-Kristalle oder Pulver erhalten, seltener bleib eine ölige Flüssigkeit

zurück, die aber sowohl bei Analyse mittels HPLC oder im NMR-Spektrum als

auch in ihrer Funktionsweise bei den nachfolgenden Synthesen in keiner Weise

Unterschiede zu dem festen Hapten aufwies.

Abbildung 4.4: Chromatogramm zur Reinigung des TATP-Haptens per HPLC mittels binärem

Gradienten aus Acetonitril/Methanol (10:1) und Wasser mit 0.1% (v/v) TFA aus dem bereits vorge-reinigten Syntheseansatz.

Mit dem TATP-Hapten, 6-(3,6,6,9,9-Pentamethyl-1,2,3,5,7,8-hexaoxonan-3-yl)-

hexansäure, wurde eine neue Verbindung hergestellt, deren Struktur genauer

untersucht und die zum Patent angemeldet [294-296] wurde. Das hochaufgelöste

Massenspektrum (ESI--FT-ICR-MS) des gereinigten TATP-Haptens wies eine

Masse von m/z 321.1552 [C14H26O8 - H]+ auf, die nur 0.0001% (-0.25 mmu) von

der berechneten exakten Masse m/z 321.1555 (Berechnung: ChemDraw) ab-

weicht. Auch ein Cl--TATP-Derivat-Komplex mit der Masse m/z 357.1320 konnte

mit nur 0.0001% (-0,18 mmu) Unterschied zur theoretischen Masse von

m/z 357.1322 detektiert werden. Des Weiteren konnte die Existenz des beschrie-

benen carboxylierten TATP auch durch NMR-Untersuchungen bestätigt werden,

wobei die Zuordnung der Signale über Korrelationsspektren erfolgte. Im Folgen-

den sind die chemischen Verschiebungen des D3-Konformers angegeben:

1H-NMR [ppm] (CD3OD, 600.2 MHz): = 1.37 (m, 2H, Ccycl-(CH2)2-CH2), 1.39 (s,

15H, 5 × CH3), 1.48 (m, 2H, Ccycl-CH2-CH2), 1.62 (m, 2H, Ccycl-(CH2)3-CH2), 1.81

(m, 2H, Ccycl-CH2), 2.29 (t, 2H, J = 7.6 Hz, CH2-CO2H).

13C-NMR [ppm] (CD3OD, 150.94 MHz): = 21.7 (5 × CH3), 24.8 (Ccycl-CH2-CH2),

26.1 (Ccycl-(CH2)3-CH2), 30.4 (Ccycl-(CH2)2-CH2), 34.7 (Ccycl-CH2), 35.0 (CH2-

CO2H), 108.5 (Cq), 177.8 (CO2H).

Die chemischen Verschiebungen für die Methylgruppen von 1.39 ppm (CH3) und

21.7 ppm (CH3) sowie des quartären Kohlenstoffatoms von 108.5 ppm (Cq) sind

14 15 16 17 18

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

TATP

Re

lative

Ab

sorp

tio

n ( =

225

nm

)

[min]

TATP-Hapten

0 5 10 15 20 25 30 35

0

250

500

Ergebnisse und Diskussion 83

identisch mit denen des D3-TATP-Konformers. Ebenso konnten Überein-

stimmungen der chemischen Verschiebungen mit dem C2-Konformer sowohl im 1H-NMR- als auch im 13C-NMR-Spektrum sowie zu den Daten für D3- und

C2-TATP von Haroune et al. [292] beobachtet werden. Das C2-TATP-Hapten lag

nur in Spuren vor und trat auch in den HPLC-Chromatogrammen (Abbildung 4.4)

in Erscheinung. Durch die Möglichkeit der axialen oder äquatorialen Anordnung

des Kettenrests der 7-Oxooktansäure wurden für die Methylgruppe am quartären

Kohlenstoffatom, für dieses selbst sowie für die beiden folgenden

Methylengruppen der Kette jeweils zwei chemische Verschiebungen beobachtet.

Die hier angegebenen Signale stammen von der äquatorialen Anordnung. Die

Daten für die axiale Ausrichtung sowie für das C2-TATP-Hapten sind in Walter et

al. [291] angegeben.

Abbildung 4.5: Überlagerung der röntgenkristallographisch bestimmten Strukturen von TATP-

Hapten (schwarz) und TATP (violett).

Die NMR-Messungen belegten schon die hohe strukturelle Übereinstimmung von

TATP und dem TATP-Hapten. Diese ließ sich ebenfalls durch die Kristallstruktur-

analyse zeigen. Für das TATP-Hapten wurden die Gitterkonstanten

a = 5.951(5) Å, b = 11.882(7) Å, c = 12.470(9) Å, = 97.56(3)°, = 93.92(2)°,

= 98.934(16)° eines triklinen Kristalls der Raumgruppe mit 1 bestimmt. Die

gelungene TATP-Hapten-Synthese konnte damit auch durch die Strukturlösung

und -verfeinerung (R1 = 0.0549) verifiziert werden. Ausführliche Daten und kris-

tallographische Informationen sind in Walter et al. [291] sowie unter dem Daten-

bankeintrag CCDC-769686 im Cambridge Crystallographic Data Centre [297]

abrufbar. Interessanter für diese Arbeit ist die Möglichkeit, die röntgenkristallo-

graphisch bestimmte Struktur des TATP-Haptens mit einer bereits in der CCDC-

Datenbank vorhandenen TATP-Struktur (CCDC-241973, HMHOCN01, [46]) zu

überlagern (nur D3-Konformere). In Abbildung 4.5 wird so deutlich, dass die Tri-

peroxidringe mit vier der unveränderten Methylgruppen von TATP und dem Hap-

ten weitgehend identisch sind. Ferner weisen die fünfte Methylgruppe in Nähe zu

der aliphatischen Kette und selbst die erste Methylengruppe der Kette in der

TATP-Haptenstruktur nur minimale Abweichungen gegenüber der Anordnung der

Methylgruppen des TATP auf. Damit ist das Ziel der TATP-Hapten-Synthese er-

reicht: Das Hapten stimmt nahezu hundertprozentig mit der Struktur des Analyten

84 Ergebnisse und Diskussion

überein, so dass die Produktion eines selektiven TATP-Antikörpers ermöglicht

werden kann. Als Zwischenschritt dahin musste das Hapten jedoch an Proteine

gekoppelt werden, was mit Hilfe seiner Carboxygruppe erfolgte.

Abschließend soll noch erwähnt werden, dass sich das TATP-Hapten aufgrund

der veränderten Seitenkette im Vergleich zu TATP als sehr stabil erwiesen hat.

Vor allem konnte festgestellt werden, dass das TATP-Hapten nicht flüchtig ist,

denn es ließ sich hervorragend durch Abdampfen von Lösungsmitteln gewinnen

und konnte so auch von TATP getrennt werden. Des Weiteren konnte kein Ab-

bau des gereinigten Produkts, getrocknet oder in Lösung, über einen Zeitraum

von 12-18 Monaten bei 4 °C beobachtet werden. Eine Aussage über die Fähig-

keit zur Explosion oder Sprengkraft des TATP-Haptens lässt sich nicht treffen. Da

aber der Triperoxidring wie beim TATP vorhanden ist, sollte auch hier Vorsicht

geboten sein. Leider war es nicht möglich, weiterführende Charakterisierungen

(z. B. zu den D3-/C2-Konformere) mit dem TATP-Hapten vorzunehmen. Es wur-

den nur ca. 15 mg TATP-Hapten gewonnen und fast vollständig zur Synthese

von Proteinkonjugaten oder der Strukturanalyse verbraucht.

4.3 Immunogene und andere Proteinkonjugate

Das synthetisierte TATP-Hapten erfüllt seine Aufgaben nur, wenn es kovalent an

ein Protein gebunden ist. Wie in Abschnitt 3.3.3 ausführlich geschildert, wurde

das carboxylierte TATP zu BSA-, HRP- und OVA-Konjugaten verarbeitet und

fungierte so als Immunogen oder markierter Analyt. Sowohl die Kopplung über

die Aktivierung des Haptens zum NHS-Ester als auch über die Gemischte-

Anhydrid-Methode führten zu brauchbaren TATP-Proteinkonjugaten, wenngleich

die NHS-Ester-Methode verbreiteter ist. Ein Grund dafür wird die einfachere

Handhabbarkeit (vor allem durch das Arbeiten bei Raumtemperatur) sein, wes-

wegen sie auch in dieser Arbeit bevorzugt wurde. Es hätte auch die Möglichkeit

bestanden, die TATP-Hapten-NHS-Ester chromatographisch zu reinigen, denn

sie sind zumindest über einen kurzen Zeitraum in mäßig saurem Milieu stabil

[298]. Da jedoch schon die Reinigung des Haptens mit großem Aufwand erfolgte

und weitere Verluste wegen der nur begrenzt vorhandenen Menge unbedingt

vermieden werden sollten, wurde darauf verzichtet. Damit wurde riskiert, auch

Antikörper gegen Nebenprodukte zu produzieren, was auch bei den gemischten

Anhydriden nicht verhindert werden konnte. Da letztere noch hydrolyseempfind-

licher sind, bot sich die chromatographische Trennung hier nicht an.

Die Aufarbeitung der TATP-Proteinkonjugate nach der Kopplung lief bei allen

Experimenten gleich ab. Am Beispiel des Immunogens 3 ist in Abbildung 4.6 die

Reinigung und Bestimmung der Proteinkonzentration der TATP-Proteinkonjugate

dargestellt. Die Elution der Proteinkonjugate von der PD-10-Säule in die UV-

durchlässigen Mikrotiterplatten wurde bei 280 nm verfolgt. Die in Abbildung 4.6

farblich hervorgehobenen Immunogen-3-Fraktionen 16-30 (15 Kavitäten) wurden

vereinigt. Auch die anderen Konjugate eluierten in diesem Bereich, bei den HRP-

Ergebnisse und Diskussion 85

Konjugaten wurden jedoch die Fraktionen mit den höchsten Signalen (etwa die

Hälfte der Kavitäten mit dem Protein) getrennt von denen, die die Flanken der

Elutionskurve bilden, gesammelt. Der beginnende Anstieg der Extinktion der letz-

ten Fraktionen war ebenfalls stets zu beobachten. Er rührt von den Ausgangs-

und Nebenprodukten der Synthesen her, die bei dieser Größenausschlusschro-

matographie (> 5 000 Da) zuletzt von der Entsalzungssäule kommen. Anhand

des erhaltenen Volumens und der bestimmten Proteinkonzentration der Protein-

konjugate wurde eine Wiederfindung von ca. 80-90% der eingesetzten Protein-

menge festgestellt. Unter Berücksichtigung der Verluste beim Pipettieren, Zentri-

fugieren und vor allem beim Vereinen nur der Fraktionen, die deutlich aus dem

Untergrund hervortreten, entspricht das ungefähr der Angabe des Herstellers, der

eine Wiederfindung von 95% für Proteine verspricht [299].

Abbildung 4.6: Reinigung der TATP-Proteinkonjugate über PD-10-Säulen mit photometrischer

Kontrolle der Fraktionen und anschließender Proteinbestimmung (kleine Grafik) der vereinten Fak-tionen (violett) der am Beispiel des Immunogens 3.

Daneben wurden auch die Konzentrationen der TATP-Proteinkonjugat-Lösungen

photometrisch bei 280 nm bestimmt. In Abbildung 4.6 (kleines Bild) ist exempla-

risch eine BSA-Kalibriergerade dazu gezeigt, die ähnlich auch für OVA und HRP

aufgenommen wurde. Die damit ermittelten Konjugatkonzentrationen sind in Ta-

belle 4.1 zusammengestellt (für HRP-Konjugate: nur Hauptfraktionen und ohne

Guardian-Zusatz). Die Bestimmung der Proteinkonzentration ist keine sehr exak-

te Methode, weswegen die erhaltenen Werte eher als Richt- und Vergleichswerte

angesehen werden sollten. Auch die Verwendung des molaren Extinktionskoeffi-

zienten der HRP bei 402 nm erwies sich dabei als nicht ideal. Auch hier traten

zum Teil erhebliche Schwankungen und Abweichungen gegenüber den mittels

Kalibriergeraden bestimmten Konzentrationen auf. Egal ob die Kalibriergerade

mit HRP oder OVA erstellt wurde, die Vergleichsmessung per molaren Extinkti-

onskoeffizienten ergab kleinere Werte für die HRP-Konjugatkonzentration. Ent-

scheidend ist außerdem, dass TATP bei diesen Wellenlängen nicht absorbiert

und so keinen Einfluss auf die Messwerte der Konjugate hatte. Allerdings lässt

sich daher auch nicht zwischen gekoppelten und ungekoppelten Proteinen unter-

scheiden, die durch die Reinigung mit den PD-10-Säulen nicht voneinander

0 5 10 15 20 25 30 35 40

0

1

2

3

4

5

6

7

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.2

0.4

0.6

Extin

ktio

n ( =

28

0 n

m)

Fraktion

Extin

ktio

n ( =

28

0 n

m)

BSA [mg mL-1]

R2 = 0.9995

86 Ergebnisse und Diskussion

trennbar waren. Aufschluss über die erfolgreiche Kopplung konnten dann erst die

MALDI-TOF-MS-Messungen geben.

Tabelle 4.1: Konzentration und Kopplungsdichte der TATP-Proteinkonjugate.

TATP-Proteinkonjugat

TATP-Hapten:Protein (Syntheseansatz)

Proteinkonzentration [mg mL-1]

Kopplungsdichte (MALDI-TOF-MS)

Immunogen 1 (BSA) 22:1 1.5 1< 5:1

Immunogen 2 (BSA) 50:1 1.7 < 11:1

Immunogen 3 (BSA) 38:1 7.8 < 14:1

Immunogen 4 (BSA) 13:1 6.6 1< 4:1

HRP-Konjugat 1 21:1 4.2 1< 1:1

HRP-Konjugat 2 36:1 2.1 1< 1:1

HRP-Konjugat 3 41:1 2.0 1< 2:1

HRP-Konjugat 4 49:1 1.3 1< —

HRP-Konjugat 5 41:1 2.8 1< 1:1

OVA-Konjugat 1 07:1 2.9 1< 2:1

OVA-Konjugat 2 24:1 2.1 1< 3:1

OVA-Konjugat 3 20:1 6.3 1< 4:1

Die Kopplungsdichten geben Auskunft über die Anzahl der TATP-Hapten-

Moleküle, die an ein Molekül des jeweiligen Proteins gebunden werden konnten.

Sie liegen deutlich unter den Verhältnissen im Syntheseansatz, wie Tabelle 4.1

zeigt. Besonders auffällig ist, dass vor allem die HRP-Konjugate nur maximal 1-2

gekoppelte Hapten-Moleküle aufweisen. Gleiches wurde auch in verschiedenen

Veröffentlichungen berichtet [276, 300], wo ebenfalls nur zwei der sechs zugäng-

lichen-Aminogruppen von Lysinresten unter den milden Bedingungen der NHS-

Ester-Methode eine Verknüpfung eingingen. Der Angriff an die vier anderen Ly-

sinreste sollten über aggressivere Methoden, z. B. durch den Einsatz von Anhyd-

riden [276], erreicht werden. Die erfolgreiche Bindung an die weiteren Lysinreste

kann anhand der Kopplungsdichte von HRP-Konjugat 5 jedoch nicht bestätigt

werden. Auch für die Herstellung des Immunogens 1 wurde das Hapten in einem

gemischten Anhydrid verwendet und auch hier zeigte dieses keine stärkere Re-

aktion als die NHS-Ester. Stattdessen ist tendenziell eher eine Abhängigkeit der

Kopplungsdichte von der eingesetzten Menge TATP-Hapten zu erkennen. Von

den 59 Lysinen in BSA stehen etwa 30-35 zur Kopplung zur Verfügung [301],

auch wenn im Mittel nur eine Kopplungsdichte von 11-14 Haptenmolekülen pro

Molekül BSA erlangt wurde. Die sehr breiten Verteilungen der Massen im MALDI-

TOF-Massenspektrum (Abbildung 4.7) von Immunogen 2 und 3 machen aber

auch deutlich, dass durchaus einige BSA-Moleküle die maximale Kopplungsdich-

te erreichten und andere unverändert aus dem Syntheseansatz hervorgingen.

Der Versuch, die mittlere Kopplungsdichte durch den 100-fachen Überschuss an

aktiviertem TATP-Hapten während der Kopplungsreaktion zu erhöhen, scheiterte.

Für die Acetylierung und Succinylierung der 20 verfügbaren -Aminogruppen von

Lysinresten des OVA mittels Anhydriden gibt es Untersuchungen von Batra et al.

[302], die erst durch den Einsatz von > 1 000 aktivierten Reaktanden pro OVA

Ergebnisse und Diskussion 87

eine vollständige Kopplung erzielten. Bei einem Verhältnis von unter 30 Anhydri-

den auf ein Molekül OVA wurden Aminogruppen im einstelligen Bereich modifi-

ziert (Acetylierung: 3-7, Succinylierung: 5). Mit der milderen NHS-Ester-Methode

wurden in dieser Arbeit TATP-OVA-Konjugate ähnlicher Kopplungsdichte erhal-

ten (Tabelle 4.1).

Abbildung 4.7: MALDI-TOF-Massenspektren (Ausschnitte) ausgewählter TATP-Proteinkonjugate.

Die Bestimmung der Kopplungsdichte erfolgte anhand von MALDI-TOF-Massen-

spektren, wie sie in Abbildung 4.7 für ausgewählte TATP-Proteinkonjugate zu

sehen sind (die meist verwendeten HRP- und OVA-Konjugate sowie alle Immu-

nogene, inklusive des nicht eingesetzten Immunogens 4). Die Spektren und das

Vergleichsspektrum eines ungekoppelten Proteins wurden auf eine gemeinsame

Basislinie gezogen, geglättet und die Differenz aus den Maxima der Kurven ge-

bildet. Diese wird nach Gleichung 3 durch die molare Masse des TATP-Haptens

65000 70000 75000

0

5000

10000

15000

20000

65000 70000 75000

0

10000

20000

30000

40000

50000

65000 70000 75000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

65000 70000 75000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

40000 45000 50000

0

5000

10000

15000

40000 45000 50000

0

5000

10000

15000

Inte

nsität

m/z

BSA

Immunogen 1

1475

Inte

nsität

m/z

BSA

Immunogen 2

3240

Inte

nsität

m/z

BSA

Immunogen 3

4178 1198

Inte

nsität

m/z

BSA

Immunogen 4

Inte

nsität

m/z

HRP

HRP-Konjugat 1

344

Inte

nsität

m/z

OVA

OVA-Konjugat 3

1120

88 Ergebnisse und Diskussion

abzüglich des im Verlauf der Reaktion (netto) abgespaltenen Wassers

(304.33 g mol-1) geteilt und ergibt die mittlere Kopplungsdichte.

Es ist zu beachten, dass die berechneten Kopplungsdichten zwar starke Indi-

zien für die erfolgreiche Kopplung des TATP-Haptens an ein Protein liefern, aber

letztlich nur eine Massenverschiebung anzeigen. Erst nach dem Gelingen der

ersten Immunisierung und der ELISA-Experimente stand der Erfolg endgültig

fest. Tatsächlich ist nicht die Kopplungsdichte für die Güte eines Konjugats ent-

scheidend, sondern seine Funktionalität im ELISA bzw. bei der Immunisierung.

Daher wurde von HRP-Konjugat 4 auch kein MALDI-TOF-Massenspektrum auf-

genommen, schließlich führte sein Einsatz im ELISA mit Mausserum zu keinem

Signal. Offensichtlich blieb der TATP-Hapten-NHS-Ester nicht über mehrere Ta-

ge (bei 4 °C, luftdicht verschlossen) stabil, denn frisch verwendet für die Immu-

nogen-2-Synthese lieferte er ein hervorragendes Konjugat. Für Enzymkonjugate

ist zudem entscheidend, dass ihre Aktivität nicht durch die Synthesevorgänge

beeinträchtigt wird. Für die markierten Analyten wird oftmals ein Hapten/HRP-

Verhältnis (oder Hapten/OVA) von 1:1 in kompetitiven Assays als ideal angege-

ben. In den nachfolgenden Abschnitten wird noch auf den Verwendungszweck

und die Leistungsfähigkeit der einzelnen TATP-Proteinkonjugate genauer einge-

gangen.

4.4 Immunisierungsverlauf

Mausimmunisierung

Zur Immunisierung dreier Mäuse (Abschnitt 3.3.4, Tabelle 3.3) wurde zunächst

das insolubilisierte und niedrig gekoppelte Immunogen 1 verwendet. Die Idee

war, zum einen durch die schlechte Löslichkeit das Immunsystem der Mäuse

stärker zu stimulieren und zum anderen der unausweichlichen Bildung von Anti-

körpern gegen Synthese-Nebenprodukte zumindest bei der ELISA-Durchführung

entgegen zu wirken. Immunogen 1 wurde über die Methode der gemischten An-

hydride hergestellt (Abschnitt 3.3.3), so dass beispielsweise auch Isobutylreste

gekoppelt sein und entsprechende Antikörper ebenfalls auftreten könnten. Da bei

der Herstellung des HRP-Konjugats 1 oder der OVA-Konjugate 1 und 3 mittels

der NHS-Ester-Aktivierung des TATP-Haptens nicht die gleichen Nebenprodukte

entstehen (vor allem durch das hochreaktive N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid und

seine Abkömmlinge), können Kreuzreaktionen diesbezüglich im ELISA ausge-

schlossen werden. Außerdem zeigte bereits die Untersuchung des Maus-3-

Serums nach Boost 2 Kompetition gegenüber TATP (Abbildung 4.8, Tabelle 4.2),

wenn auch die Antikörperkonzentration im Blut des Tieres noch recht gering war.

Zu diesem Zeitpunkt war bei Maus 1 und 2 noch keine Antikörperbildung zu be-

obachten. Um den Prozess zu beschleunigen, wurde den Tieren ab Boost 3 das

höher gekoppelte Immunogen 2 in löslicher Form injiziert. Zwar war dieses Im-

munogen ebenso wie die markierten Analyten über die NHS-Ester-Methode an-

gefertigt worden, aber die Kompetitionsfähigkeit des Tests lässt sich eindeutig

Ergebnisse und Diskussion 89

TATP-Antikörpern zuordnen und ermöglicht ihre Charakterisierung sowie Ver-

wendung. Ein Einfluss von möglicherweise gebildeten Antikörpern gegen Syn-

thesenebenprodukte lässt sich nicht erkennen, da der Testhintergrund (D-Wert,

Gleichung 4) während der gesamten Immunisierung auf dem Niveau des

Präimmunserums blieb und keine störenden Signale auftraten, wie aus Abbildung

4.8 hervorgeht. Die Durchführung verschiedener Synthesemethoden für die un-

terschiedlich eingesetzten TATP-Proteinkonjugate ist damit vermutlich unnötig.

Der Immunisierungsverlauf von Maus 3 ist in Abbildung 4.8 (die maximale Ex-

tinktion der Kurve des Boost-8-Serums wurde auf A = 1, Gleichung 4 normiert)

und Tabelle 4.2 ausführlich dargestellt. Zwischen dem Präimmunserum und dem

Serum nach dem ersten Boost lässt sich kein Unterschied erkennen. Erst ab Se-

rum des 2. Boosts zeigt sich die Entwicklung von TATP-Antikörpern. Obwohl be-

reits Boost 3 mit dem höher gekoppelten Immunogen 2 erfolgte, steigt der TATP-

Antikörpertiter erst nach Boost 4 sprunghaft an. Danach scheint die Antikör-

perentwicklung nahezu zu stagnieren. Obwohl die Immunogengabe um ein Fünf-

tel reduziert wurde, hätte weiterhin eine Affinitätsreifung erfolgen können. Statt-

dessen schwankten die Resultate von Boost zu Boost, insbesondere der Testmit-

telpunkt (IC50) pendelte sich um 2.5 mg L-1 bzw. die Antikörperaffinität von

0.17 × 106 L mol-1 (Gleichung 8) ein. Diese Schwankungen entsprechen denen,

die auch bei Boost-8-Serum im Laufe der Untersuchungen auf verschiedenen

Platten und an verschiedenen Tagen auftraten.

Abbildung 4.8: Entwicklungsverlauf des Serums von Maus 3 im ELISA während der Immunisie-

rung.

Für die Seren von Maus 1 und 2 konnten keine Kurven im direkten ELISA erhal-

ten werden, weswegen auf ihre Untersuchung hier nicht genauer eingegangen

wird und sich die Darstellungen auf Maus 3 beschränken. Es sei jedoch erwähnt,

dass beide im indirekten ELISA Signale ab dem dritten Boost lieferten. Mit dem

Serum von Maus 1 konnte zum Ende der Immunisierung hin ein ähnlicher Anti-

0.0009 0.1 1 10 100

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0

Extinktion ( =

450 n

m)

(norm

iert

)

TATP [mg L-1]

präimmun

Boost 1

Boost 2

Boost 3

Boost 4

Boost 5

Boost 6

Boost 7

Boost 8

90 Ergebnisse und Diskussion

körpertiter wie der von Maus 3 festgestellt werden, wohingegen das Maus-2-

Serum deutlich schwächere Signale bei gleicher Verdünnung (1:10 000) hervor-

rief. Insgesamt funktionierte der indirekte ELISA für die Mausseren besser. So

konnte bei Maus-3-Serum ein etwas besserer Testmittelpunkt von 1-1.5 mg L-1

gemessen werden. An den Beobachtungen zur Antikörperreifung, die nahezu

ausblieb (vergleichbar mit Tabelle 4.2), änderte sich jedoch nichts. Während der

IC50 von Maus-1-Serum zwei- bis dreimal schlechter im Vergleich zu Maus-3-

Seren war, wurde für Maus-2-Serum ein Testmittelpunkt von 0.2-0.3 mg L-1 erhal-

ten. Da das Maus-2-Serum somit eine etwa fünfmal bessere Antikörperaffinität

als das Maus-3-Serum aufwies, wurde auch diese Maus zur Herstellung von

Hybridomzellen eingesetzt.

Tabelle 4.2: Affinitätsreifung von Maus 3.

Verdünnung IC50 Affinität

Boost Serum HRP-Konjugat [mg L-1] [L mol-1]

● 2 1:10 000 1:10 000 4.25 ± 1.48 0.105 ± 0.037 × 106

● 3 1:10 000 1:10 000 2.89 ± 0.57 0.154 ± 0.030 × 106

● 4 1:10 000 1:10 000 2.96 ± 0.12 0.150 ± 0.006 × 106

● 5 1:10 000 1:10 000 2.26 ± 0.22 0.197 ± 0.019 × 106

● 6 1:10 000 1:10 000 2.29 ± 0.11 0.194 ± 0.010 × 106

● 7 1:10 000 1:10 000 2.83 ± 0.30 0.157 ± 0.017 × 106

● 8 1:10 000 1:10 000 2.75 ± 0.16 0.162 ± 0.009 × 106

Untersuchung der Hybridomzellkulturen

Nach Boost 8 wurden Maus 2 und 3 für die Fusion ihrer Milzzellen mit Myelom-

zellen ausgewählt. Zur Vorbereitung darauf mussten die Tiere zwei Tage vor der

Milzentnahme ein letztes Mal immunisiert werden. Nach diesem neunten Boost

war für ausführliche Tests nicht genügend Serum vorhanden. Der einzig mögli-

che ELISA offenbarte aber fast identische Werte wie mit Boost-8-Serum. Rück-

blickend lässt sich aus den Ergebnissen in Abbildung 4.8 und Tabelle 4.2 sagen,

dass der finale Boost nicht erst an Tag 320 nach der Erstimmunisierung der

Mäuse hätte erfolgen können sondern deutlich eher. Während der Tests zwi-

schen den einzelnen Nachimmunisierungen war jedoch jegliche Schwankung mit

der Hoffnung auf weitere Verbesserung verknüpft. Die Fusion von Milz- und

Myelomzellen sollte zu TATP-Antikörper-sekretierenden und zugleich immortali-

sierten Hybridomzellen führen. Mittels ELISA wurden die Zellkulturüberstände auf

das Vorhandensein von TATP-Antikörpern geprüft. Das Ergebnis dieser Untersu-

chungen war trotz des enormen Aufwands und funktionierenden Positiv- und Ne-

gativkontrollen ernüchternd: Es konnte kein positiver Zellklon identifiziert werden,

so dass auch keine monoklonalen TATP-Antikörper produziert werden können.

Im direkten ELISA mit den ersten 68 Zellkulturüberständen von Tag 18 nach

der Fusion sowie mit sämtlichen Überständen von 17 Mikrotiterplatten nach 24

und 32 Tagen wurde kein positives Ergebnis erhalten. Für Hybridomzellen, die

Ergebnisse und Diskussion 91

aus Zellen von Maus 2 erzeugt wurden (fünf Platten), war das nicht auszuschlie-

ßen, da schon das Serum keine Kurven im direkten ELISA hervorbrachte. Für

Maus-3-Fusionszellen (zwölf Platten) wurde aber ein anderes Ergebnis erwartet.

Mit denselben Überständen, jedoch ohne die von Tag 24, dafür zusätzliche vom

53. Tag nach der Fusion, wurden auch indirekte Tests vorgenommen. Diese

ergaben zunächst sogar einige positive Signale, welche sich dann aber als nicht

relevant herausstellten. Einige waren falsch-positiv und manche davon kamen

von Überständen aus Kavitäten, die gar keine Zellen enthielten. Solche Resultate

waren nicht reproduzierbar und ihre Ursache konnte nicht geklärt werden. Ein

Einfluss des Kulturmediums auf den ELISA konnte durch Tests ausgeschlossen

werden. Andere positive Signale traten zwar wiederholt auf und die Zellen der

entsprechenden Kavitäten konnten auch vermehrt werden, so dass genügend

Zellkulturüberstand für weitere Untersuchungen vorhanden war. Jedoch wies

keine dieser Hybridomzellkulturen die Fähigkeit zur Bildung von TATP-

Antikörpern auf, da keine Inhibition im kompetitiven ELISA (indirekt oder direkt)

durch Zugabe von TATP-Lösungen beobachtet werden konnte. Diese positiven

Signale könnten durch andere entstandene Antikörper ausgelöst worden sein,

die entweder ganz unspezifisch an die Mikrotiterplatte oder ihre Beschichtung

binden oder sich vor allem gegen BSA, eventuell aber auch gegen Nebenproduk-

te der NHS-Ester-Synthese (wie oben beschrieben), richten. Die OVA-

Konjugate 1 und 3 wurden auf die gleiche Weise wie das Immunogen 2 herge-

stellt und könnten somit die gleichen Strukturen tragen. Entsprechend entstan-

dene Antikörper könnten so an die OVA-Konjugat-Beschichtung einer Mikrotiter-

platte binden, wobei BSA-Antikörper aufgrund struktureller Ähnlichkeiten von

OVA zu BSA direkt an das OVA binden würden. Mit derartigen Antikörpern kann

TATP nicht kompetitiv wechselwirken und durch den Einsatz von -Maus-IgG-

HRP werden sie nicht selektiv detektiert. Das tatsächliche Vorhandensein von

Antikörpern gegen Synthesenebenprodukte (z. B. gegen N′-Dicyclohexyl-

harnstoffderivate u. ä.) wurde nicht geprüft. Lediglich BSA-Antikörper wurden mit

Mausserum im indirekten ELISA untersucht. In Kavitäten mit BSA-Beschichtung

wurden dabei extrem hohe Extinktionen erzielt, was für die Bildung größerer

Mengen BSA-Antikörper spricht, und auch Kavitäten mit einer Beschichtung aus

ungekoppeltem OVA riefen Signale hervor.

Die Ursachen für den Misserfolg bei der Herstellung TATP-Antikörper-

produzierender Hybridomzellen können vielfältig sein. Die Squarix biotechnology

GmbH ist eine Firma mit langjähriger Erfahrung und der in dieser Arbeit entwi-

ckelte TATP-ELISA funktionierte zuverlässig, auch unter den angepassten Be-

dingungen für die Verwendung von Zapfenplatten, wie die mitgeführten Kontrol-

len bestätigen. Fehler bei der Durchführung können daher nahezu ausgeschlos-

sen werden. Seit der Einführung der Hybridomtechnik von Köhler und Milstein

1975 [187] wurden zahlreiche Versuche, vor allem in den 1980er und 1990er

Jahren, unternommen, die Methode zur Gewinnung monoklonaler Antikörper zu

verbessern, doch vom Prinzip her blieb sie stets gleich. Die bekannte Schwach-

stelle ist die eigentliche Fusion von Milz- mit Myelomzellen, wie Tabelle 4.3 für

die praktische Durchführung in dieser Arbeit andeuten soll.

92 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 4.3: Zahlen zur Fusion von Maus-2- und -3-Milzzellen (Schätzungen).

Maus 2 Maus 3

Milzzellen (unabhängig von ihrer Vitalität) 82 000 000 190 000 000

davon stimuliert 10% 20%

fusionierte Zellen bei einer maximalen Fusionswahrscheinlichkeit von 0.01%

8 200 19 000

Anzahl der Kavitäten, auf die Zellen verteilt wurden

480 1 152

mikroskopisch sichtbare Zellklone 14 Tage nach der Fusion

500

Es gibt (auch aus Tierschutzgründen [184]) kaum statistisch abgesicherte Stu-

dien zur Einflussnahme auf die Fusionseffizienz zur Bildung von Hybridomzellen.

Meist handelt es sich um wenige oder gar einzelne durchgeführte Immunisierun-

gen, die veröffentlicht werden. Auch die gewählten Bedingungen, wie Tiermodell,

Zelllinie, Fusionsrezept, Zeitspannen etc. weichen häufig voneinander ab. Letzt-

lich ist selbst der Einfluss des gewählten Immunogens, das stets variiert, weitge-

hend unbekannt und eventuelle Effekte sind nicht auszuschließen, so dass Ver-

gleiche verschiedener Immunisierungen schwierig sind. So ist es nicht verwun-

derlich, dass zum einen wenige Boosts [303, 304] empfohlen werden und zum

anderen vor allem bei schwachen Immunogenen Immunisierungsverläufe bis zu

einem Jahr [47] kein Problem darstellen, um eine erfolgreiche Fusion zu erzielen.

Die in dieser Arbeit recht lange Immunisierungszeit von 320 Tagen muss also

nicht als entscheidendes Kriterium angesehen werden. Ein Grund könnte der

relativ geringe TATP-Antikörpertiter sein. Die Mausseren ließen sich kaum weiter

verdünnen als 1:10 000 (nur in Ausnahmefällen 1:77 000, wie als Positivkontrolle

ohne die Aufnahme einer ELISA-Kompetitionskurve). Im Vergleich zu ähnlich

verlaufenden Immunisierungen im gleichen Labor ist der Titer 10 bis 100-fach

schlechter [305, 306]. Zwar gibt es in der Literatur Hinweise, dass eine 1:10 000-

Verdünnung als Titer ausreichend ist [47, 188], aber nach Angaben von Squarix

biotechnology GmbH war dieser Wert schon an der unteren Grenze für eine er-

folgreiche Fusion. Ihrer Erfahrung nach waren außerdem die beiden Milzen der

immunisierten Mäuse kaum vergrößert (normal sind ~ 108 Zellen [47]) und insbe-

sondere bei Maus 2 fiel die Anzahl der stimulierten Zellen relativ gering aus. Ho-

he Zellzahlen sind wünschenswert, da die Wahrscheinlichkeit der Verschmelzung

von Milzzellen mit Myelomzellen bei der chemischen Fusion mit Polyethylengly-

kol nur 0.001-0.1% beträgt [188-190]. Dabei ist noch nicht sicher, ob auch die

richtige Hybridomzelle, mit der Fähigkeit den gewünschten Antikörper zu produ-

zieren, entstanden ist und sie stabil bleibt. Tabelle 4.3 macht deutlich, dass von

knapp 300 Millionen Milzzellen zweier Mäuse schließlich nur 500 Zellklone resul-

tierten (< 0.0002%). Darunter befinden sich auch die Hybridomzellen nicht stimu-

lierter Milzzellen (80-90%) und solche, die nicht TATP-Antikörper sondern bei-

spielsweise BSA-Antikörper oder Antikörper natürlichen Ursprungs sekretieren.

Des Weiteren kommt es vor, dass Hybridomzellen unter Stress ihre erworbenen

Eigenschaften auch wieder verlieren [47]. Insgesamt ist die Chance, die ge-

Ergebnisse und Diskussion 93

wünschten Antikörper-sekretierenden Zellen zu erzeugen und damit monoklonale

Antikörper produzieren zu können, recht gering.

Sowohl die Immunisierung (bis auf die Wahl der exakten Haptenstruktur) als

auch die Herstellung der Hybridomzellen für die Produktion monoklonaler Anti-

körper sind weitgehend empirische Methoden, die weder vorhersehbar noch ge-

nau steuerbar sind. Selbst neuere Forschungsarbeiten zur Verbesserung der

Zellfusion, bei denen sich oftmals die Elektrofusion durchgesetzt hat, erreichen

mit 0.4% eine kaum höhere Fusionseffizienz [190]. Es sind leider keine Daten

von etablierten Firmen bekannt, die einen Hinweis auf die Erfolgsquote für die

Herstellung stabiler Zelllinen zur Produktion monoklonaler Antikörper geben. Ein-

zig folgender Kommentar aus einer Patentschrift [307] gibt Auskunft: „Bei einer

typischen, von PEG vermittelten Verschmelzung von 100 Millionen Milzzellen und

10 Millionen Myelomzellen betrug die Ausbeute an verschmolzenen Zellen weni-

ger als 1 000, wovon vier oder fünf geklonte Zellen, jedoch häufig keine, einen

Antikörper mit der gewünschten Spezifizität bilden. Das führt in der Praxis dazu,

daß 5 bis 10 Fusionsverfahren gleichzeitig durchgeführt werden, was zu einer

aufwendigen nachfolgenden Behandlung führt, um das geeignete Hybridom her-

auszufinden.“ Ein wenig hoffnungsvoller Satz, der aber die hier bei der Durchfüh-

rung gemachten Erfahrungen bestätigt.

Kaninchenimmunisierung

Das Scheitern der Herstellung von monoklonalen TATP-Antikörpern machte eine

neue Strategie zur Produktion von TATP-Antikörpern notwendig. Da die Immuni-

sierung der Mäuse prinzipiell funktionierte, aber nur geringe Mengen polyklonaler

TATP-Antikörper in Form ihrer Seren (≤ 100 µL) verfügbar waren, wurden zur

Gewinnung größere Mengen polyklonaler TATP-Antikörper zwei Kaninchen im-

munisiert. Pro Blutung konnten dabei jedem Kaninchen bis zu 20 mL Serum ent-

nommen werden, zum Abschluss der Immunisierung sogar knapp 60 mL. Mit den

Erfahrungen von der ersten Immunisierung wurde von Anfang an lösliches Im-

munogen 3 mit einer hohen Kopplungsdichte injiziert, das nahezu identisch dem

bei der Mausimmunisierung eingesetzten Immunogen 2 war (Abschnitt 3.3.3 so-

wie Tabelle 4.1 und Abbildung 4.7). Zunächst wurden bis einschließlich zum drit-

ten Boost jedem Tier 100 µg Immunogen dem Speedy 28-day protocol von Euro-

gentec S.A. [282] folgend verabreicht (Tabelle 3.4). Bereits in dem Serum nach

Boost 2 ließen sich TATP-Antikörper nachweisen, doch Boost 3 brachte noch-

mals beachtliche qualitative und quantitative Verbesserungen des Serums beider

Kaninchen, so dass eine Fortsetzung der Immunisierung über das ursprünglich

gebuchte Programm hinaus sinnvoll erschien.

Ab Boost 4 wurden beiden Kaninchen dann 50 µg Immunogen 3 gespritzt und

ab Boost 5 erfolgte die Immunogengabe in regelmäßigem Abstand von vier Wo-

chen (Tabelle 3.4). Die positive Entwicklung der Antikörper setzte sich auch nach

Boost 3 weiter fort und verlief für beide Kaninchen fast parallel. Die Affinitätsrei-

fung der Seren macht besonders zwischen Boost 2 und Boost 6 stetige Entwick-

lungen erkennbar, wie Tabelle 4.4 für Kaninchen 1 und Tabelle 4.5 für Kanin-

94 Ergebnisse und Diskussion

chen 2 zeigt. Schließlich werden die Veränderungen immer kleiner, so dass ab

Boost 8 keine signifikante Besserung auftritt. Interessanterweise ist die Zunahme

des Titers der TATP-Antikörper, wie aus Abbildung 4.9 (Kaninchen 1) und Abbil-

dung 4.10 (Kaninchen 2) abzulesen ist, durch regelrechte Schübe nach Boost 2

sowie nach Boost 6 und Boost 7 geprägt. Danach treten Schwankungen des Ti-

ters auf und um nicht zu riskieren, dass der Titer eventuell einbricht (Hyposensi-

bilisierung), wurde die Immunisierung mit Boost 11 beendet.

Abbildung 4.9: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 1 im ELISA während der Immuni-

sierung.

Tabelle 4.4: Affinitätsreifung von Kaninchen 1.

Verdünnung IC50 Affinität

Boost Serum HRP-Konjugat [µg L-1] [L mol-1]

Immunisierung nach Speedy 28-day protocol von Eurogentec S.A.

● 2 1:5 000 1:20 000 140 ± 450 0.002 ± 0.001 × 109

● 3 1:20 000 1:40 000 37.8 ± 13.7 0.007 ± 0.003 × 109

verlängerte Immunisierung nach individuellem Protokoll

● 4 1:120 000 1:30 000 3.59 ± 1.36 0.077 ± 0.029 × 109

● 5 1:120 000 1:30 000 1.50 ± 0.21 0.185 ± 0.026 × 109

● 6 1:40 000 1:180 000 0.859 ± 0.170 0.323 ± 0.064 × 109

● 7 1:200 000 1:100 000 0.608 ± 0.364 0.457 ± 0.273 × 109

● 8 1:500 000 1:600 000 0.225 ± 0.026 1.234 ± 0.143 × 109

● 9 1:300 000 1:600 000 0.297 ± 0.064 0.934 ± 0.200 × 109

● 10 1:300 000 1:600 000 0.274 ± 0.108 1.015 ± 0.402 × 109

● 11 1:300 000 1:600 000 0.268 ± 0.074 1.037 ± 0.286 × 109

3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 präimmun

Boost 2

Boost 3

Boost 4

Boost 5

Boost 6

Boost 7

Boost 8

Boost 9

Boost 10

Boost 11

Extinktion ( =

450 n

m)

(norm

iert

)

TATP [µg L-1]

0

Ergebnisse und Diskussion 95

Die in Abbildung 4.9 und Abbildung 4.10 angegebenen Extinktionen stellen keine

gemessenen Werte dar, sondern sind das Resultat von über die A-Werte (Glei-

chung 4) aneinander gereihten Kurven. Daher rührt auch der Eindruck, dass der

TATP-Antikörpertiter von Kaninchen 1 geringer ist als von Kaninchen 2. Tatsäch-

lich sind bei den Seren der letzten Boosts beide Titer aber sehr ähnlich und der

Titer von Kaninchen 1 liegt nur geringfügig über dem von Kaninchen 2. Ebenso

verhält es sich mit den Affinitäten, die aus den gründlich, durch die zweidimensi-

onale Verdünnung jedes Serums zu dem HRP-Konjugat 1, optimierten Testmit-

telpunkten in Tabelle 4.4 und Tabelle 4.5 nach Gleichung 8 ([240, 241]) ermittelt

wurden. Der für Kaninchen 1 durch die Affinitätsreifung erreichte Endwert unter-

scheidet sich mit rund 1 × 109 L mol-1 nicht signifikant von den knapp

0.7 × 109 L mol-1 von Kaninchen 2. Spätestens nach Boost 8 liegen demnach

Seren zweier Kaninchen vor (Boost-7-Seren sind nicht viel schlechter), die nahe-

zu identisch sind. Daher hätte die Immunisierung bei beiden Kaninchen nach

Boost 8 beendet werden können, aber durch drei weitere Boosts pro Kaninchen

konnten insgesamt mehr als 2 × 100 mL fast gleichwertiger polyklonaler TATP-

Antikörperlösung erhalten werden.

Abbildung 4.10: Entwicklungsverlauf des Serums von Kaninchen 2 im ELISA während der Immu-

nisierung.

Der Immunisierungsverlauf der zwei Kaninchen widerspricht den Zusicherungen

von Eurogentec S.A. [282], dass die Affinitätsreifung und die Titerentwicklung mit

dem Speedy 28-day protocol ausreicht, um vergleichbare polyklonale Seren wie

durch längere Immunisierungen mit weiteren Injektionen zu erlangen. Wäre die

Immunisierung nach Boost 3 mit einer Serumentnahme an Tag 28 beendet wor-

den, so wären nicht nur hohe quantitative Einbußen durch den deutlich geringe-

ren Titer und weniger Serumentnahme die Folge gewesen. Vor allem hätte auch

nicht die Qualität der Seren erreicht werden können, wie sie nach acht Boosts

vorlag. Die Affinitäten wären etwa 50- (Kaninchen 2) bis 150-mal (Kaninchen 1)

3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 präimmun

Boost 2

Boost 3

Boost 4

Boost 5

Boost 6

Boost 7

Boost 8

Boost 9

Boost 10

Boost 11

Extinktion ( =

450 n

m)

(norm

iert

)

TATP [µg L-1]

0

96 Ergebnisse und Diskussion

schlechter gewesen, was sich negativ auf die Empfindlichkeit des ELISA und

anderer Testformate ausgewirkt hätte.

Tabelle 4.5: Affinitätsreifung von Kaninchen 2.

Verdünnung IC50 Affinität

Boost Serum HRP-Konjugat [µg L-1] [L mol-1]

Immunisierung nach Speedy 28-day protocol von Eurogentec S.A.

● 2 1:15 000 1:40 000 78.6 ± 21.2 0.004 ± 0.001 × 109

● 3 1:40 000 1:30 000 16.8 ± 2.70 0.017 ± 0.003 × 109

verlängerte Immunisierung nach individuellem Protokoll

● 4 1:120 000 1:30 000 1.91 ± 0.63 0.146 ± 0.048 × 109

● 5 1:120 000 1:30 000 1.25 ± 0.09 0.222 ± 0.015 × 109

● 6 1:120 000 1:30 000 0.850 ± 0.130 0.327 ± 0.050 × 109

● 7 1:100 000 1:300 000 0.535 ± 0.167 0.519 ± 0.162 × 109

● 8 1:200 000 1:600 000 0.400 ± 0.061 0.694 ± 0.105 × 109

● 9 1:600 000 1:600 000 0.426 ± 0.050 0.653 ± 0.076 × 109

● 10 1:600 000 1:600 000 0.447 ± 0.084 0.621 ± 0.116 × 109

● 11 1:300 000 1:600 000 0.407 ± 0.072 0.683 ± 0.121 × 109

Vergleich von Maus- und Kaninchenimmunisierung

Zunächst sei erwähnt, dass die Immunisierungen der drei Mäuse (mit Einschrän-

kungen bei Maus 1 und 2) und der zwei Kaninchen erfolgreich waren und somit

auch nochmals die passende Struktur des TATP-Haptens und die gelungenen

Proteinkonjugatsynthesen bestätigt wurden. Obwohl die beiden Immunisierungen

nicht identisch durchgeführt wurden, konnten außerdem doch einige interessante

Beobachtungen und Schlüsse aus einem Vergleich ihrer Verläufe gezogen wer-

den. Vor allem der Anfang der beiden Immunisierungsschemen (Abschnitt 3.3.4

und Tabelle 3.4) wich voneinander ab: Ausführende Firma, Kopplungsdichte,

Löslichkeit sowie Menge des Immunogens und die zeitlichen Abstände der Injek-

tionen. Erst ab Boost 3 bzw. 4 wurden ähnliche Immunogene und regelmäßige

4-6-wöchige Intervalle für die Boosts gewählt, die bei beiden zu einer recht lan-

gen Immunisierungszeit führten (Maus: 320 Tage, Kaninchen: 224 Tage).

Die erste Auffälligkeit ist, dass beide Immunisierungsverläufe trotz erwähnter

unterschiedlichster Ausgangsbedingungen ähnlich beginnen. Zwar gibt es von

den Kaninchen kein Serum nach Boost 1, das bei Maus 3 noch keine erkennbare

Immunreaktion zeigte, aber Boost-2-Serum zeigte bei beiden Tierarten lediglich

eine recht schwache Reaktion. Erst mit dem Serum nach Boost 3 sind deutliche

Verbesserungen und insbesondere ein Anstieg des TATP-Antikörpertiters zu

verfolgen. Hier lassen sich die zuerst einsetzende primäre Immunantwort, bei der

zunächst überwiegend die in geringen Mengen vorliegenden, pentameren IgM

agieren, und der Übergang zur sekundären Immunantwort erkennen. Erst durch

den wiederholten Kontakt mit demselben Antigen setzt letztere ein und führt zur

Produktion vieler IgG und ihrer Affinitätsreifung [175, 185]. Auch wenn die Kanin-

Ergebnisse und Diskussion 97

chenseren eine viel deutlichere Entwicklung aufweisen, so setzt doch bei beiden

Immunisierungen nach rund 150 Tagen eine Stagnation ein, wobei die Kanin-

chen in diesem Zeitraum doppelt so oft nachimmunisiert wurden wie die Mäuse

(Maus: Boost 4, Tag 154, Kaninchen: Boost 8, Tag 140). Bemerkenswert ist in

diesem Zusammengang auch, dass bei beiden Spezies die Antigenmenge nach

dem dritten (Maus: von 50 auf 10 µg) bzw. vierten Boost (Kaninchen: von 100 auf

50 µg) reduziert wurde und der Titer davon unbeirrt weiter anstieg. Es ist davon

auszugehen, dass die von den Firmen geforderte Immunogenmenge zur Sicher-

heit ein Überschuss dessen darstellt, was eigentlich zur Auslösung der Immun-

antwort ausreichen würde.

Relevanter für diese Arbeit aber ist, dass sich die polyklonalen Seren sehr er-

heblich in TATP-Antikörperaffinität und -konzentration unterschieden. Nach Ab-

schluss der Antikörperreifung, die bei den Mäusen nur sehr schwach ausfiel,

konnten für Maus-3-Serum eine TATP-Antikörperaffinität von knapp

0.2 × 106 L mol-1 und für die Kaninchen zwischen ca. 0.7 und 1 × 109 L mol-1 er-

mittelt werden. Die polyklonalen Antikörper beider Spezies liegen damit in dem

erwarteten Affinitätsbereich, der auch oft über die reziproken Dissoziations-

konstanten der Antigen-Antikörper-Bindung mit etwa 10-6 bis 10-11 M angegeben

wird [175]. Dennoch unterscheiden sich die Affinitäten um den Faktor 5 000 zu

Gunsten der Kaninchen. Ebenso ist die Antikörperkonzentration in den Kanin-

chenseren ungleich höher als in denen der Mäuse. Zwar liefern die beschriebe-

nen Titer nur relative Werte, die allenfalls Anhaltspunkte für die TATP-Antikörper-

konzentration sein können, aber da hier ähnliche Versuchsbedingungen für

ELISA mit Maus- und Kaninchenserum vorlagen, ist ein Vergleich möglich. Wäh-

rend die Mausseren gerade einmal 1:10 000 verdünnt werden konnten, war bei

den Kaninchenseren eine Verdünnung bis 1:300 000 möglich. Anders ausge-

drückt lassen sich mit den 100 µL Serum, die Maus 3 nach Boost 8 entnommen

werden konnten, ELISA auf 45 Mikrotiterplatten durchführen, wohingegen mit

dem Boost-11-Serum eines Kaninchens (60 mL) mindestens 600 000 Platten

bearbeitet werden können, was ca. 58 Mio. Tests entspricht.

Lehrbücher und (ältere) Publikationen (z. B. [164] und [191, 192]) erklären als

allgemein bekannt, dass verschiedene Spezies oder sogar verschiedene Vertre-

ter der gleichen Art sehr unterschiedlich auf ein und dasselbe Antigen reagieren.

Lediglich auf die Vermeidung von speziesübergreifenden Ähnlichkeiten von Pro-

teinstrukturen, auch bei der Auswahl von Trägerproteinen für Haptene, wird we-

gen der Verminderung bis hin zum Ausbleiben einer Immunantwort auf körperei-

gene Strukturen hingewiesen. Das Erkennen eines Antigens durch das Immun-

system einer Spezies sowie der gesamte Immunisierungsverlauf in den Tieren

und damit auch der positive Ausgang einer Immunisierung werden häufig auch

als abhängig von Zufall und Glück bezeichnet. Das kann (und sollte) sicherlich

auch nicht ausgeschlossen werden, zumal das Arbeiten in biologischen Syste-

men nicht selten von Schwankungen geprägt und nur bedingt steuerbar ist.

Durch die jüngsten Entwicklungen bei der Herstellung monoklonaler Antikörper

aus Kaninchen mehren sich jedoch neuerlich konkrete Hinweise, dass Kaninchen

besser zur Immunisierung geeignet sind als Mäuse, was schon länger vermutet

98 Ergebnisse und Diskussion

wurde. Bei Vergleichen von monoklonalen Antikörpern von Mäusen und von Ka-

ninchen konnte anhand immunhistochemischer Methoden gezeigt werden, dass

die Kaninchen-Antikörper höhere Affinitäten aufweisen [204-206]. Das geht kon-

form mit den Beobachtungen der in dieser Arbeit produzierten polyklonalen Se-

ren aus Maus und Kaninchen. Sowohl während des gesamten Verlaufs der Im-

munisierung als auch wegen des TATP-Antikörpertiters und vor allem ihrer Affini-

tät sind die Kaninchenseren denen der Mäuse weit überlegen. Die Begründung

dafür scheint in den Unterschieden der Immunsysteme der beiden Spezies (siehe

Abschnitt 2.2.3) gefunden, das sich bei den Kaninchen durch eine höhere Anti-

körpervielfalt auszeichnet. Deswegen dauert auch die Antikörperreifung über

mehr Nachimmunisierungen an als bei den Mäusen [185].

Aus Mäusen konnten mit dem TATP-Hapten und Immunogen nur mäßig erfolg-

reich TATP-Antikörper produziert werden. Mit dem gleichen Hapten und Immu-

nogen wurden jedoch aus Kaninchen polyklonale TATP-Antikörper erhalten, die

mehr als 1 000-mal besser bezüglich ihrer Affinität sowie Quantität sind. Werden

die wirtschaftlichen Aspekte betrachtet, so ist auch hier der polyklonale Antikör-

per mit deutlich günstigeren knapp 2 000 € im Vorteil gegenüber dem 12 000 €

teuren Versuch, monoklonale TATP-Antikörper aus Mäusen zu gewinnen. Den-

noch werden monoklonale Antikörper wegen ihrer besser reproduzierbaren Her-

stellung sicherlich das analytische Werkzeug der Wahl bleiben.

4.5 Untersuchung von Faeces

Antikörper sind für viele Anwendungen heutzutage unerlässlich und es ist nicht

absehbar, wie lange zu ihrer Herstellung die Immunisierung von Tieren noch als

wichtigstes Mittel notwendig sein wird. Aus tierschutzrechtlichen [184] sowie ethi-

schen Gründen sollten Hersteller und Forscher nach Alternativen suchen, um

Tierversuche zu umgehen oder, wenn diese unvermeidbar sind, Schmerzen und

Leiden der Tiere so gering wie möglich zu halten. Vor allem für kleine Tiere wie

Mäuse können bereits Injektionen und besonders Blutabnahmen unangenehme

Folgen haben. Daher ist es erfreulich, dass parallel zu zwei weiteren Immunisie-

rungen [305, 306] hier der Nachweis von Hapten-spezifischen Antikörpern aus

den Faeces der Mäuse gelang.

Nach Boost 8 wurde den Mäusen nicht nur Serum entnommen, sondern auch

der Kot der kurzfristig getrennt gehaltenen Tiere eingesammelt. Mit den wässri-

gen Faecesextrakten (Abschnitt 3.3.5) konnten TATP-Kompetitionskurven erhal-

ten werden, wie für Maus 3 in Abbildung 4.11 im Vergleich zu der Kurve mit

Boost-8-Serum im direkten ELISA gezeigt. Die unterschiedlich hohen A-Werte

der Kurvenverläufe, trotz einer dreifach stärkeren Verdünnung des Serums als

üblich (und daher längerer Entwicklungszeit), weisen auf den niedrigen TATP-

Antikörpergehalt in den unverdünnt eingesetzten Extrakten hin. Entweder verlief

die Extraktion nicht ideal, der Kot enthält von vornherein weniger Antikörper oder

diese wurden teils durch Proteasen (z. B. von Bakterien) zersetzt. Wie bereits im

Ergebnisse und Diskussion 99

vorangegangen Abschnitt erwähnt, scheint der Titer der TATP-Antikörper im

Mausserum im Vergleich zu den anderen Immunisierungen schwächer zu sein,

aber dennoch reichte selbst dieser aus, um den Nachweis auch aus den Faeces

zu ermöglichen. Interessanter für die Verfolgung der Affinitätsreifung während

einer Immunisierung ist der Vergleich der Testmittelpunkte und dabei stehen die

Kotextrakte den Seren nicht nach. Der IC50 des Extrakts mit 0.1% Tween-20-

Anteil betrug 2.5 ± 0.3 mg L-1 und der dessen mit 1% BSA-Anteil 2.8 ± 0.5 mg L-1,

was dem Testmittelpunkt von 2.8 ± 0.1 mg L-1 des Boost-8-Serums entspricht.

Ähnliche Beobachtungen konnten auch mit Serum und Faeces von Maus 1 und 2

gemacht werden (nicht gezeigt). Auch hier waren die Titer der Kotextrakte deut-

lich niedriger als die der Seren, aber ausreichend, die Testmittelpunkte jeweils

vergleichbar und der TATP-ELISA funktionierte nur im indirekten Format.

Abbildung 4.11: Nachweis von TATP-Antikörpern in Extraktionen von Maus-3-Faeces. Obere

Kurve: Boost-8-Serum; untere, parallel verlaufende Kurven: Extraktionen.

Die durchgeführten Tests erfolgten, direkt wie indirekt, mit -Maus-IgG als se-

kundäre Antikörper oder als HRP-Konjugate (Abschnitt 3.1.2), die durch Immuni-

sierung von Tieren mit vollständigen Maus-IgG als Immunogen hergestellt wur-

den. Diese polyklonalen Antikörper erkennen daher Bereiche der konstanten

Domänen sowohl der schweren als auch der leichten Polypeptidketten der Anti-

körperstruktur ([H&L]) oder nur Teile davon und sind wenig spezifisch. Da vor

allem die leichten Ketten ( und ) der Immunglobulinklassen einer Spezies na-

hezu identisch sind, treten Kreuzreaktionen zu all diesen auf, worauf viele Her-

steller hinweisen [308-310]. Die überwiegende Klasse von Antikörpern im Darm

und somit im Kot sind IgA [175], aber auch IgG sind dort vertreten [178-180].

Folglich bleibt unklar, welche Klasse von Immunglobulinen in den Faecesextrak-

tionen nachgewiesen wurden. Carvalho [305] präsentiert ausführlichere Untersu-

chungen dazu. Durch den Einsatz von -Maus-IgA als Sekundärantikörper konn-

te er per ELISA zeigen, dass IgA in der Überzahl zu IgG vorliegen, wobei aber

Boost 8-Serum

Extraktion mit 1% BSA

Extraktion mit 0.1% Tween 20

0.0009 0.1 1 10 100

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Extinktion ( =

450 n

m)

TATP [mg L-1]

0

100 Ergebnisse und Diskussion

eine erkennbare Kompetition der IgA ausblieb. Mit -Maus-IgG F(c) als sekundä-

rem Antikörper, der gegen einen Großteil der konstanten Domänen der beiden

schweren Polypeptidketten der Maus-IgG gerichtet ist und daher Klassen-

spezifischer Immunglobuline bindet, hatte er konträr zu Serumtests deutlich nied-

rigere Signale gemessen als mit dem -Maus-IgG [H&L]. Da diese beiden Er-

gebnisse gegenläufig scheinen, ist es am wahrscheinlichsten, dass eine Mi-

schung aus IgG und IgA in den Faecesextraktionen mit dem wenig Immunglobu-

linklassen-spezifischen -Maus-IgG [H&L] detektiert wurde.

Obwohl sämtliche Extraktionen zu positiven Ergebnissen führten, wurden ver-

schiedene Methoden ausprobiert. Wie in Abschnitt 3.3.5 (bzw. 3.1.3) beschrie-

ben, wurden in dieser Arbeit Faeces-Extraktionspuffer mit Tween 20 oder BSA (in

PBS mit Proteaseinhibitoren) variiert. Wie aus Abbildung 4.11 deutlich wird, las-

sen sich die beiden so erhaltenen Extrakte kaum unterscheiden. Ebenso zeigten

Extraktionen der Antikörper aus den Faeces ohne Proteaseinhibitoren oder in

reinem Wasser im ELISA keine Veränderung [305]. Eine Erhöhung der Einwaa-

gen von Mäusekot in Extraktionspuffer ist kaum mehr möglich, da die bereits

verwendeten Mengen zu dickflüssigen Rohextrakten führten, von deren Volumen

nach der Zentrifugation nur die Hälfte für den ELISA-Auftrag übrig blieb. Diese

unverdünnt eingesetzten Extrakte waren tief braun und kaum noch durchsichtig,

dennoch zeigten sich die durchgeführten TATP-ELISA unbeeindruckt von dieser

schwierigen Matrix und der Signaluntergrund blieb auf dem Niveau der TATP-

Kalibrierreihe mit Reinstwasser (Abbildung 4.11). Es konnte also bislang keine

Optimierung des Extraktionsverfahrens der Antikörper aus den Faeces erreicht

werden, die vielleicht die Antikörperkonzentration in den Extrakten erhöht hätte.

Dies könnte hilfreich bei der noch offenen Frage sein, ob auch die Titerentwick-

lung während der Immunisierung über die Kotproben zu verfolgen ist. Ein Zu-

sammenhang mit der IgG-Konzentration im Serum und dem sekretorischen IgA

im Darm ist zumindest bekannt [311] und es scheint keinen logischen Grund zu

geben, warum IgG im Darm sich abweichend davon verhalten sollte. Daneben

besteht insbesondere Optimierungsbedarf bezüglich der Extraktionsdauer, die

bisher stets über Nacht geschah.

Drei unabhängige Mausimmunisierungen mit den chemisch so unterschiedli-

chen Haptenen Isolithocholsäure [305], Ochratoxin A [306] und TATP (diese Ar-

beit) und voneinander abweichenden Extraktionsmethoden ergaben eine ge-

meinsame Erkenntnis, die veröffentlicht wurde [312]: Der Nachweis von Hapten-

spezifischen Antikörpern in Faeces gelang. Da die Affinität dieser Antikörper aus

den wässrigen Kotextrakten mit der Affinität der Antikörper aus den jeweiligen

Seren übereinstimmte, ermöglicht dies die Überwachung des Immunisierungsver-

laufs über die Faeces. Ein Nachweis über den Urin [180] ist ebenso denkbar und

wäre für den Experimentator eleganter, aber die Probensammlung stellt sich

weitaus schwieriger dar. Kotproben können täglich genommen werden, ohne die

Mäuse oder andere Versuchstiere unnötig zu stressen, so dass der Immunisie-

rungshergang zeitlich sogar noch enger kontrolliert werden könnte. Die wichtigste

Errungenschaft ist jedoch, dass mit dieser nicht-invasiven Methode den Tieren

Ergebnisse und Diskussion 101

weniger Schmerz und Leid zugefügt wird. Dafür wäre auch der erhöhte (sicher

noch optimierbare) Arbeitsaufwand durch die Faecesextraktion vertretbar.

4.6 Analytische Kenndaten des TATP-ELISA

Nachweisgrenze und Messbereich

Zur Verfolgung von Immunisierungsverläufen sowie der Untersuchung der

Hybridomzellkulturüberstände werden standardmäßig ELISA (wie in Abschnitt 4.4

beschrieben) angewandt [47]. Auch die Charakterisierung der Antikörper erfolgt

meist per ELISA, bevor dieses Format für analytische Zwecke weiterverwendet

wird oder die Antikörper in anderen Systemen zum Einsatz kommen. Der entwi-

ckelte TATP-ELISA ist also nur eine Variante, die hergestellten TATP-Antikörper

zu nutzen. Er eignet sich aber hervorragend, um deren Potenzial zu zeigen. Ana-

lytisch relevant sind besonders Nachweisgrenzen von Analyseverfahren, wie sie

in Tabelle 4.6 für den TATP-ELISA für verschiedene Seren angegeben werden.

Für den TATP-ELISA mit den Kaninchenseren (ab Boost 7) konnte eine Nach-

weisgrenze von etwa 10 ng L-1 ermittelt werden. Das entspricht bei einem Pro-

benvolumen von 200 µL je Kavität 2 pg TATP. Damit ist der TATP-ELISA eine

der empfindlichsten, vielleicht sogar die empfindlichste, Nachweismethoden für

TATP, wie ein Blick auf die Werte in Tabelle 2.2 (Abschnitt 2.1.2) verdeutlicht.

Selbst per GC-MS konnte mit 70 µg L-1 (oder 70 pg) TATP diese Grenze nicht

erreicht werden (Abschnitt 4.1).

Tabelle 4.6: Nachweisgrenzen des TATP-ELISA mit Kaninchen- und Maus-3-Seren.

Boost 7 Boost 11

Kaninchen 1 06 ± 8 ng L-1 09 ± 7 ng L-1

Kaninchen 2 11 ± 8 ng L-1 11 ± 5 ng L-1

Boost 8

direkt indirekt

Maus 3 45 000 ± 20 000 ng L-1 52 000 ± 25 000 ng L-1

Die Nachweisgrenzen wurden aus je fünf ELISA-Kompetitionskurven von jeweils

unterschiedlichen Mikrotiterplatten (und Versuchstagen) und mit jeweils drei

Messwerten (Kavitäten) pro TATP-Kalibrierlösung über die 3s-Methode bestimmt.

Bis auf die für Boost-11-Seren der Kaninchen miteinbezogenen Werte aus den

Kurven zum Erstellen der Präzisionsprofile in Abbildung 4.12 und Abbildung 4.13

mit 32 TATP-Kalibrierlösungen, wurden die üblichen 8-Punkt-Kurven betrachtet.

Diese machen nicht nur den Vergleich mit den ELISA mit Maus-3-Serum möglich

und lassen die Einbeziehung vieler Kurven zu, sondern entsprechen vor allem

den tatsächlichen Messbedingungen. Es konnte kein signifikanter Unterschied

zwischen den 32- und 8-Punkt-Kurven mit den Kaninchenseren (Boost 11) fest-

gestellt werden, sowohl bezüglich des IC50 als auch der Nachweisgrenze.

102 Ergebnisse und Diskussion

Um die Gegenüberstellung der Nachweisgrenzen der ELISA mit Kaninchen- und

Mausseren unter möglichst ähnlichen Voraussetzungen durchzuführen, wurden

der direkte und indirekte ELISA mit Boost-8-Serum von Maus 3 zunächst ver-

sucht zu optimieren und 200 µL TATP-Kalibrierlösung verwendet. Der Testmittel-

punkt des indirekten Assays änderte sich nicht und der des direkten passte sich

ihm mit ~ 1.5 mg L-1 an. Durch die neuen Volumina von Kalibrierlösung und HRP-

Konjugat 1 verbesserte sich die Antikörperaffinität (Abschnitt 4.4) jedoch nicht, so

dass der ELISA auch vor der versuchten Optimierung gut eingestellt war und die

Konzentrationen nur den veränderten Volumina angepasst wurden (Abschnitt

3.3.5). Bei einem vorangegangenen Versuch, Maus-3-Serum nach Boost 4 zu

optimieren, wurde das Gleiche beobachtet und es konnte ebenfalls keine Ver-

besserung erzielt werden. Die unter diesen nun angepassten Bedingungen erhal-

tenen Werte für die Nachweisgrenzen der TATP-ELISA mit den verschiedenen

polyklonalen Antikörpern untermauern zwei Aussagen aus Abschnitt 4.4: Zum

einen unterscheiden sich die Seren der Kaninchen 1 und 2 nicht (oder nur mini-

mal) und bereits Boost 7 kann mit den höheren Boosts mithalten (bis auf den

Titer). Zum anderen sind, wie schon die Antikörperaffinitäten, die Nachweisgren-

zen der ELISA mit Kaninchenseren 5 000-mal besser als mit Mausserum im di-

rekten oder indirekten ELISA. Daran ist auch gut zu erkennen, dass der Testmit-

telpunkt (IC50) der ELISA-Kurven einen sehr guten Anhaltspunkt für die Empfind-

lichkeit eines ELISA liefert und sich vor allem für direkte Vergleiche eignet.

Abbildung 4.12: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit dem Serum von

Kaninchen 1 (Boost 11).

Entscheidend für den zuverlässigen Nachweis eines Analyten ist nicht nur die

Nachweisgrenze sondern auch der Messbereich. Für ELISA bietet sich dabei ein

Präzisionsprofil nach Ekins [243] an, wie für Boost 11 beider Kaninchen gesche-

hen (Abschnitt 3.3.5). Abbildung 4.12 und Abbildung 4.13 zeigen kompetitive

ELISA-Kurven aus 32 TATP-Kalibrierlösungen in jeweils dreifacher Ausführung

(schwarz; grau/offen = ausgenommen Wert bei 2 µg L-1 von Kaninchen 2, bei

3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Extin

ktio

n ( =

450

nm

)

TATP [µg L-1]

Re

lative

r F

eh

ler

der

Ko

nze

ntr

atio

n [

%]

Kaninchen 1

0

Ergebnisse und Diskussion 103

dem ein Ausreißer nicht berücksichtigt wurde). Daraus wurden nach Gleichung 6

die jeweiligen Präzisionsprofile erstellt, welche ebenfalls in die beiden Abbildun-

gen (violett) integriert wurden. Tabelle 4.7 bietet dazu einen Überblick über aus-

gewählte relative Fehler der Konzentration der Messwerte, unterhalb derer als

Toleranzgrenze sich entsprechende Messbereiche der TATP-ELISA mit

Boost-11-Seren beider Kaninchen ausmachen lassen.

Abbildung 4.13: Präzisionsprofil (violett) aus einer ELISA-Kurve (schwarz) mit dem Serum von

Kaninchen 2 (Boost 11).

Tabelle 4.7: Messbereich des TATP-ELISA mit Boost-11-Kaninchenseren.

tolerierter Fehler

Kaninchen 1 [µg L-1]

Kaninchen 2 [µg L-1]

30% 0.200 bis < 0300 0.05 bis < 1100

40% 0.030 bis < 0350 0.04 bis < 1400

50% 0.025 bis < 2700 0.03 bis < 2700

60% 0.025 bis < 2700 0.03 bis < 2700

Der Messbereich gibt Auskunft über die Präzision der Messwerte und ermöglicht

dem Anwender zu entscheiden, in welchem Bereich für ihn noch tolerierbare Ab-

weichungen liegen. Sind beispielsweise 40% akzeptabel, so erstreckt sich der

auswertbare Bereich des TATP-ELISA für Kaninchen-1-Serum über vier Zehner-

potenzen und für Kaninchen-2-Serum sogar noch darüber hinaus (Tabelle 4.7).

Doch schon mit bloßem Auge ist sichtbar, dass beide ELISA-Kurven (Abbildung

4.12 und Abbildung 4.13) große Unsicherheiten hauptsächlich im Bereich der

niedrig konzentrierten TATP-Kalibrierlösungen aufweisen, wohingegen beson-

ders die Werte oberhalb der Testmittelpunkte (Kaninchen 1: 0.50 µg L-1, Kanin-

chen 2: 0.35 µg L-1) sich trotz kleiner werdender Extinktionen durch ihre hohe

Reproduzierbarkeit auszeichnen. Es wurden einige Anstrengungen unternom-

3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

50

100

150

200

250

300

350Kaninchen 2

Extinktion ( =

450 n

m)

TATP [µg L-1]

0

Rela

tiver

Fehle

r der

Konzentr

ation [

%]

104 Ergebnisse und Diskussion

men, um das Vertrauen in den ELISA auch für kleinere Konzentrationen zu erhö-

hen. Der Einsatz einer 96-Kanal-Pipette (Liquidator96), schnelles Arbeiten, ver-

schiedene Durchführende oder der Versuch, die Kalibrierlösungen durch Metha-

nolzugabe zu stabilisieren, führten zu keiner Verbesserung. Da besonders der

Bereich der kleineren Konzentrationen betroffen ist, wirkt sich das deutlich auf die

Nachweisgrenze aus. Auch wenn diese theoretisch bei rund 10 ng L-1 liegt, so ist

praktisch ein belastbarer und vertrauenswürdiger TATP-Nachweis erst oberhalb

von 40 ng L-1 oder sogar darüber empfehlenswert.

Ein Großteil der Daten zu den Kaninchenseren im ELISA (inklusive Immunisie-

rungsverlauf) wurde zusammen mit den folgenden Untersuchungen zur Kreuzre-

aktivität veröffentlicht [313].

Kreuzreaktivität

Synthese zu untersuchender Kreuzreaktanden

Einige der potenziellen Kreuzreaktanden mussten, wie in Abschnitt 3.3.5 ausge-

führt, selbst hergestellt werden, da sie kommerziell nicht verfügbar sind. Der Er-

folg dieser Synthesen wurde mittels NMR und/oder Einkristallstrukturanalyse

(Abschnitt 3.3.1) kontrolliert.

Für DADP (C6H12O4) wurden die Gitterkonstanten a = 5.9109 Å, b = 5.9213 Å,

c = 10.5816 Å, = 90°, = 94.222°, = 90° durch Messung am Röntgendiffrak-

tometer erhalten. In der CCDC-Datenbank fanden sich drei übereinstimmende

Einträge (AROZEM [314], AROZEM01 [46], AROZEM02 [315]), die eine eindeu-

tige Identifizierung von DADP zuließen. Auch die NMR-Untersuchungen bestätig-

ten die Struktur von DADP. Im 1H-NMR-Spektrum (CD3OD, 400.14 Mhz) wurden

Signale bei = 1.30 (s, 6H, 2×CH3) und 1.74 ppm (s, 6H, 2×CH3) sowie im 13C-

NMR-Spektrum (CD3OD, 100.62 Mhz) bei = 20.9 (2×CH3(ax)), 22.6 (2×CH3(eq))

und 108.7 ppm (Cq) registriert. Zusätzlich konnte das dimere Acetonperoxid auch

per GC-MS über die NIST-Massenspektrenbibliothek nachgewiesen werden (vgl.

Abschnitt 3.3.1). Im Rahmen der Kreuzreaktivitätsuntersuchungen wurde des

Weiteren zunächst per ELISA festgestellt, dass das aus TATP (unter Verwen-

dung von p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat als Katalysator [46]) entstandene

DADP im getrockneten Zustand in wenigen Monaten bei 4 °C wieder vollständig

zu TATP zurückreagiert (Mechanismus unklar). Auch bei der anschließenden

Untersuchung des entsprechenden Ansatzes mittels HPLC-MS konnte nur TATP

nachgewiesen werden. Bei der Lagerung des umkristallisierten DADP in metha-

nolischer Mutterlauge, also ohne Kontakt der Kristalle zu Luft, konnte dies nicht

beobachtet werden.

HMTD (C6H12N2O6) konnte nach der Bestimmung der Gitterkonstanten mittels

Einkristallstrukturanalyse auf a = 10.4697 Å, b = 10.4697 Å, c = 6.9808 Å,

= 90°, = 90°, = 120° durch den Abgleich mit der CCDC-Datenbank klar über

den Eintrag CUXWIB02 [316] zugeordnet werden. Die Synthese von HMTD

konnte daneben ebenso über die chemischen Verschiebungen im NMR

abgesichert werden. Nur ein Signal wurde dazu im13C-NMR-Spektrum (CDCl3,

Ergebnisse und Diskussion 105

100.62 Mhz) mit = 90.4 ppm (CH2) erhalten. Im 1H-NMR-Spektrum (CDCl3,

400.14 Mhz) trat ein Hauptsignal bei = 4.77 ppm (s, 12H, 6×CH2) auf und

weitere Signale im Protonenbereich rührten von diversen, nicht weiter

untersuchten Rotameren her.

Der Syntheseerfolg von Tributanontriperoxid, Tri-3-pentanontriperoxid und Tri-

2-pentanontriperoxid ließ sich kaum belegen, da eine Kristallbildung ausblieb und

die Syntheseansätze ohne Reinigung untersucht wurden. Lediglich dem symmet-

rischen Tri-3-pentanontriperoxid (C15H30O6), das auch schon in Veröffentlichun-

gen beschrieben wurde [290], konnten NMR-spektroskopisch chemische Ver-

schiebungen zugewiesen werden. Dabei wurden zwei Konformere erfasst, die

etwa im Verhältnis 4:1 vorlagen. Daher sind sowohl im 1H-NMR-Spektrum

(CD3OD, 400.14 Mhz) mit = 0.94 bzw. 0.92 ppm (t, 18H, 6×CH3) und 1.71 bzw.

1.65 ppm (q, 12H, 6×CH2) als auch im 13C-NMR-Spektrum (CD3OD, 100.62 Mhz)

mit = 8.3 (CH3), 23.3 bzw. 22.9 ppm (CH2) und 114.6 bzw. 114.7 ppm (Cq)

jeweils zwei dicht beieinander liegende Signale verzeichnet worden, von denen

das ersterwähnte dem häufigeren Konformer entspricht. Bei Tributanontriperoxid

und Tri-2-pentanontriperoxid sind mehr Konformere (oder andere Isomere) zu

erwarten, so dass eine Vielzahl von chemischen Verschiebungen in den NMR-

Spektren erschienen. Die beiden gewünschten Substanzen ließen sich nicht ein-

deutig aus den Produktgemischen identifizieren und lediglich einige Indizien deu-

ten auf ihre Entstehung hin.

Untersuchung der Kreuzreaktivität

Den nachfolgenden Tabellen ist zu entnehmen, dass weder andere Explosivstof-

fe (Tabelle 4.8) noch strukturell zu TATP ähnliche Moleküle und Ausgangsstoffe

seiner Synthese (Tabelle 4.9) relevante Kreuzreaktivität in den Immunoassays

mit den polyklonalen TATP-Antikörpern aus den beiden Kaninchen (K1 und K2,

Boost 7) oder Maus 3 (M3, Boost 8) hervorrufen. Aufgrund der sehr kleinen Wer-

te, die für die Kreuzreaktivität von DADP und Nitroguanidin erhalten wurden, sind

die Unzulänglichkeiten bei der Herstellung ihrer Stammlösungen vernachlässig-

bar. Methanolreste mussten bei der Einwaage von DADP akzeptiert werden, um

die Rückreaktion zu TATP zu verhindern (siehe oben). Nitroguanidin enthielt

nach Herstellerangaben ungefähr 25% Wasser, so dass eine exakte Berücksich-

tigung des Wassergehalts bei Ansetzen der Stammlösung unmöglich war.

Beide immunisierten Spezies, Maus und Kaninchen, brachten sehr selektive

polyklonale TATP-Antikörper hervor. Lediglich gegenüber dem TATP-Hapten ist

der ELISA mit den Seren der beiden Kaninchen fünfmal empfindlicher als gegen-

über TATP. Da nicht TATP sondern das Hapten („derivatisiertes TATP“) gekop-

pelt an BSA als Immunogen zur Tierimmunisierung eingesetzt wurde, ist das Er-

gebnis eine logische Konsequenz und trat entsprechend auch mit Maus-3-Serum

auf. Somit reagierte der direkte ELISA dreimal empfindlicher auf das TATP-

Hapten als auf TATP selbst, im indirekten Format sogar zehnmal empfindlicher.

Der indirekte Assay mit Mausserum schien erneut empfindlicher und wies höhere

Intensitäten auf als der direkte. Insgesamt ist der Unterschied im Vergleich zu

den Tests mit Kaninchenserum aber nicht groß. Da das TATP-Hapten im Rah-

106 Ergebnisse und Diskussion

men der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal synthetisiert, beschrieben und zum

Patent angemeldet wurde und es nicht kommerziell hergestellt wird oder in der

Natur vorkommt, geht von ihm keine Gefahr falsch-positiver Signale unter realen

Messbedingungen aus.

Tabelle 4.8: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber ausgewählten Explosivstoffen.

Verbindung M

[g mol-1] molare KR

[%]

TATP

222.24

100.0M K1

100.0M K2

100.0M M3

TNT

227.13

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

RDX

222.12

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.07 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

PETN

316.14

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

HMX

296.16

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

HMTD

208.17

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

Nitroguanidin

104.07

< 0.01 K1

< 0.01 K2

— M3

Ammoniumnitrat NH4NO3 80.04

< 0.01 K1

< 0.01 K2

— M3

— nicht getestet

NO2O2N

NO2

N

N N

NO2

O2N NO2

O

O

O

ONO2

O2N

O2N

NO2

NN

N N

NO2O2N

NO2O2N

O

O

O

O

N

N

OO

NNO2

NH2H2N

Ergebnisse und Diskussion 107

Tabelle 4.9: Kreuzreaktivität des TATP-ELISA gegenüber Strukturanaloga, bezogen auf TATP.

Verbindung M

[g mol-1] molare KR

[%]

TATP-Hapten

322.35

000490 ± 100 K1

00470 ± 10 K2

309.000 1085.0000

M3, direkt M3, indirekt

Tributanontriperoxid

264.32

< 4.00 K1

< 3.00 K2

< 9.00 < 4.00

M3, direkt M3, indirekt

Tri-3-pentanontriperoxid

306.40

< 0.02 K1

< 0.01 K2

< 0.30 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

Tri-2-pentanontriperoxid

306.40

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

Diacetondiperoxid (DADP)

148.16

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

[18]Krone-6

264.32

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

[12]Krone-4

176.21

< 0.01 K1

< 0.01 K2

— M3

7-Oxooktansäure

158.19

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

Aceton

58.08

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

Wasserstoffperoxid H2O2 34.01

< 0.01 K1

< 0.01 K2

< 0.01 < 0.01

M3, direkt M3, indirekt

— nicht getestet

O

OO

O

O

O

O

OO

O

O O

OO

OH

O O

O

108 Ergebnisse und Diskussion

Interessanter für spätere Anwender im Sicherheitsbereich ist die Frage, ob

TATP-Antikörper-basierte Nachweismethoden auch andere Explosivstoffe, mit

und ohne Peroxidgruppen, detektieren. Wie Tabelle 4.8 demonstrieren soll, wür-

de in solchen Tests spezifisch TATP angezeigt, was insbesondere bei der Ent-

sorgung (z. B. für Kampfmittelräumdienste) überaus hilfreich ist. Immunchemi-

kern stellt sich diese Frage nicht. Da die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung auf

der reinen, sehr spezifischen Strukturerkennung beruht, sind Moleküle mit struk-

turellen Ähnlichkeiten, wie Ausgangs-, Neben- und Abbauprodukte der Synthese

des Analyten und strukturelle Analoga am ehesten Kreuzreaktanden (Tabelle

4.9) in Immunoassays [284]. Da TATP aus so alltäglichen Chemikalien herge-

stellt wird, wäre ein Antikörper, der auf Aceton oder Wasserstoffperoxid reagiert,

weitgehend unbrauchbar. Falsch-positive Signale mit daraus eventuell resultie-

renden Fehlalarmen wären unausweichlich. Dies ist auch ein schwerwiegender

Nachteil von zahlreichen Verfahren (siehe Abschnitt 2.1.2), die TATP nach Zerfall

durch Einwirkung von Säure [94, 95, 150, 151] oder UV-Strahlung [98-101] über

Wasserstoffperoxid nachweisen sollen. Die in dieser Arbeit erzeugten TATP-

Antikörper beider Spezies sprechen nicht auf die Ausgangsstoffe, die zugleich

auch die Zerfallsprodukte sind, oder DADP als mögliches Nebenprodukt der

TATP-Synthese an. Selbst die 7-Oxooktansäure aus der Hapten-Synthese, die

nicht nur die Kopplungen ermöglicht, sondern auch als Abstandhalter fungiert,

löst keine messbare Kreuzreaktion aus. Aus anderen Arbeiten ist bekannt, dass

durchaus Antikörper diese Abstandhalter miterkennen, vor allem wenn diese, wie

Triglycin [306], komplexer als eine simple aliphatische Kette sind.

Als einzig kommerziell erhältliche und wenigstens ansatzweise ähnliche Struk-

turen aufweisende, potenzielle Kreuzreaktanden wurden zwei Kronenether ge-

testet. Weil die Ähnlichkeit bei [18]Krone-6 nur durch sechs Sauerstoffatomen in

einem sonst aus Kohlenstoffatomen aufgebauten Ring besteht, der von vornhe-

rein schon aufgrund seiner Größe nicht der geeignetste Kandidat schien, wurde

zusätzlich auch [12]Krone-4 mit dem kleinen Moleküldurchmesser, aber nur vier

Sauerstoffatomen, ausgewählt. Interessant wurden beide jedoch vor allem durch

ihre strukturbedingte Eigenschaft, Kationen komplexieren zu können – ebenso

wie TATP. [18]Krone-6 bindet selektiv K+ und [12]Krone-4 bindet bevorzugt Li+.

Für TATP sind Komplexe mit diversen ein- bis dreiwertigen Metallionen beschrie-

ben, darunter Na+, NH4+, Li+, K+, [117, 127, 317], Zn2+ [142] sowie Cu+,Cd2+, In3+,

Sb3+, Sc3+ und Ti4+ (zum Teil nur theoretisch berechnet und destabilisierend auf

die TATP-Struktur wirkend) [318]. Trotz dieser Analogien ließ sich keine erkenn-

bare Kreuzreaktivität mit den Kronenethern im TATP-ELISA feststellen. Der

Grund dafür liegt wahrscheinlich in den Moleküldurchmessern, welche unter Zu-

hilfenahme von Mercury 2.4 mit Strukturdaten aus der CCDC-Datenbank (jeweils

3-5 Einträge) über das Zentrum der Strukturen abgeschätzt wurden. Dabei fiel

auf, dass TATP mit einem Durchmesser von ~ 3.5 Å (zum Vergleich: DADP hat

~ 2.7 Å) bedeutend kleiner als [18]Krone-6 mit ~ 6.7 Å und auch [12]Krone-4 mit

~ 4.6 Å ist. Mit diesem Größenunterschied können die Kronenether, selbst bei

günstigster Anordnung der Sauerstoffatome, nicht an die auf TATP optimierten

Antigenbindungsstellen der Antikörper passen.

Ergebnisse und Diskussion 109

Die Untersuchung der Kreuzreaktivität (Tabelle 4.9) der polyklonalen TATP-

Antikörper gegenüber Tributanontriperoxid, Tri-3-pentanontriperoxid und Tri-2-

pentanontriperoxid kann aufgrund unzureichender Reinheit und Identifizierung

sowie Konzentrationsbestimmung über die Ausbeute der TATP-Synthese glei-

cher Molaritäten nur eine grobe Abschätzung sein. Daher wurde auch auf eine

Unsicherheitsbetrachtung verzichtet. Dennoch lässt sich eine Tendenz dieser

schwachen Kreuzreaktivitäten erkennen, die auch den Erwartungen entspricht:

Unter Beibehaltung des Triperoxidrings nimmt die Kreuzreaktivität mit zuneh-

mender Kettenlänge der ursprünglichen Methylgruppen in TATP ab. Bei Tribu-

tanontriperoxid entstanden durch die Verwendung von Butanon zur Synthese

anstelle dreier Methylreste drei Ethylreste und für alle untersuchten Seren konn-

ten dafür Kreuzreaktivitäten im einstelligen Prozentbereich festgestellt werden.

Schon durch den Austausch aller Methylreste zu Ethylresten, wie in Tri-3-

pentanontriperoxid, war die Kreuzreaktivität noch stärker vermindert und beim

Tri-2-pentanontriperoxid mit drei Propylresten war sie fast nicht mehr bestimm-

bar. Diese Messergebnisse beweisen durch die Abhängigkeit der hervorgerufe-

nen Kreuzreaktivität von der Ähnlichkeit des Kreuzreaktanden zur Molekülstruktur

des Analyten, dass bereits kleine Strukturänderungen die Antikörpererkennung

erheblich stören und sehr selektive TATP-Antikörper vorliegen. Außerdem wird

klar, dass nicht allein die Peroxidgruppen und ihre Anordnung im Ring, sondern

auch die Methylgruppen mit den Antikörpern bei der Bindung entscheidend

wechselwirken. Daher gibt es auch keine Kreuzreaktion zu Wasserstoffperoxid

oder HMTD. Doch auch wenn die drei Triperoxide die „idealen“ Kreuzreaktanden

darstellen, wobei nur Tributanontriperoxid maßgeblich zu Kreuzreaktionen führte,

so sind diese Substanzen doch im Normalfall kaum zu erwarten. Falls doch, so

ist des Weiteren davon auszugehen, dass auch sie wahrscheinlich explosiv sind

und eine Detektion somit aus sicherheitsrelevanter Sicht kein Fehlalarm wäre.

Für die hergestellten polyklonalen TATP-Antikörper, selbst die aus der Maus,

konnten keinen beachtenswerten Kreuzreaktanden identifiziert werden. Sie sind

also extrem selektiv. Dies zeigt, dass polyklonale Antikörper durchaus eine sehr

hohe Spezifität gegenüber einem Analyten erreichen können. Insbesondere

durch kombiniert wirkende Antikörper in sogenannten Sandwich-Assays kann

diese Spezifität manchmal sogar besser sein als die von vergleichbaren mono-

klonalen Antikörpern [47]. Im Fall des sehr kleinen Analyten TATP ist jedoch an-

zunehmen, dass dieser Vorteil hier nicht zum Tragen kommt, weil es den Anti-

körpern nur ein Epitop - sich selbst als Ganzes oder als Teil seiner trimeren

Struktur - als Bindungsregion anbietet. Die spezifische Erkennung nur eines

Epitops ist eigentlich ein Vorteil monoklonaler Antikörper, die aus diesem Grund

im Allgemeinen als selektiver gelten, weil so auch Kreuzreaktionen minimiert

werden. Die besondere Struktur des TATP und ihre Einzigartigkeit begünstigt

also die Selektivität der Antikörper. So ergab ein dreidimensionaler Strukturver-

gleich mit den Strukturdaten für TATP aus der CCDC-Datenbank (HMHOCN01

[46]) mittels Superimposé 1.1 [44, 45] keine Übereinstimmungen mit bekannten

Verbindungen (vor allem Pharmaka).

110 Ergebnisse und Diskussion

Lösungsmitteltoleranz

Schon während der Bestimmung der Kreuzreaktivität wurde der Einfluss von Lö-

sungsmitteln auf den TATP-ELISA wahrgenommen. So zeigt Abbildung 4.14 bei-

spielhaft die Kurven dreier auf ihre Kreuzreaktion im ELISA hin untersuchter Stof-

fe im Vergleich zu einer TATP-Kurve.

Abbildung 4.14: Bestimmung der Kreuzreaktivität im ELISA mit Kaninchen-2-Boost-7-Serum

(Auswahl).

Zur besseren Veranschaulichung wurden Kurven von unterschiedlichen Mikroti-

terplatten ausgewählt und auf eine maximale Extinktion (Parameter A) von eins

normiert. Zu den Berechnungen der Kreuzreaktivitäten (Tabelle 4.8 und Tabelle

4.9) wurde jedoch immer eine TATP-Kurve auf derselben Mikrotiterplatte als Be-

zug verwendet (Abschnitt 3.3.5). HMTD, RDX und [18]Krone-6 wiesen keine oder

nur sehr schwache Kreuzreaktivitäten auf. Um diese Kreuzreaktivität durch das

Verhältnis der Wendepunktekonzentrationen einer TATP-Kalibrierkurve zu der

Kurve einer jeweiligen Testsubstanz ermitteln zu können ([242], Gleichung 7),

musste bei letzterer der Parameter D der 4-Parameteranpassung (Gleichung 4)

auf das Niveau der TATP-Kurve gesetzt werden, damit ein sigmoidaler Kurven-

verlauf erhalten wurde. Die resultierenden Graphen sahen alle ähnlich aus: Nach

einem geradlinigen Verlauf fielen die Extinktionen bei einer Konzentration von

1 × 105 µg L-1 (100 mg L-1) ab, wie für [18]Krone-6 (grüne Kurve) zu sehen. An-

scheinend führt eine hohe Konzentration, unabhängig von der Art des Stoffes zu

einer unspezifischen, schwachen Hemmung im ELISA. Ebenso wie [18]Krone-6

verhielten sich die meisten untersuchten Substanzen, deren erste Kalibrierlö-

sungsverdünnung nur reines Wasser oder einen niedrigen Lösungsmittelgehalt,

z. B. 1% Methanol (Tabelle 3.5) aufwies. Bei HMTD (orange Kurve), RDX (violet-

te Kurve) und TNT, bei denen sich wegen ihrer schlechten Löslichkeit nicht nur

mehr Lösungsmittel sondern vor allem DMSO in der ersten Verdünnung befand,

ist ein Abfallen der Extinktion bereits bei Konzentrationen von ca. 1 × 104 µg L-1

3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4 1E5

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

[18]Krone-6

RDX

HMTD

TATPExktinktion ( =

450 n

m)

(norm

iert

)

[µg L-1]

0

Ergebnisse und Diskussion 111

festzustellen. Während dies auf die Kreuzreaktivitätsuntersuchungen im ELISA

mit Kaninchenseren keine Auswirkungen hatte, wurde das Ergebnis des direkten

ELISA mit Maus-3-Serum davon beeinflusst und zeigte eine schwache Kreuzre-

aktivität an. Der indirekte Mausserum-ELISA zeichnete sich dabei hingegen er-

neut als robuster aus und wies keine Kreuzreaktivität auf.

Beobachtungen wie in Abbildung 4.14 gaben Anlass zu genaueren Untersu-

chungen der Toleranz der ELISA gegenüber ausgewählten Lösungsmitteln. Ähn-

lich der Kreuzreaktivitätstests wurden ELISA mit Serum der Kaninchen (Boost 7)

und Maus 3 (Boost 8) angefertigt und die Ergebnisse in Tabelle 4.10 aus den

erhaltenen Kurven ermittelt (Abschätzung). Auffällig ist, dass die Lösungsmittelto-

leranz der ELISA mit Kaninchenseren nicht besonders groß ist und dass die

ELISA mit Mausserum sowie der indirekte ELISA im Allgemeinen widerstandsfä-

higer erscheinen. Vor allem Aceton und DMSO störten bereits ab Konzentratio-

nen von > 0.1% bzw. > 0.3% und führten schon im unteren einstelligen, prozen-

tualen Konzentrationsbereich zu einem Signalverlust (Parameter A, Gleichung 4)

von 50% („IC50“) gegenüber reinem Wasser. Dass gerade das stets als biokom-

patibel angepriesene DMSO so unverträglich ist, verwundert. Es bestätigt aber

die Erkenntnisse aus (u. a.) Abbildung 4.14. Die höchste Verträglichkeit wiesen

ELISA mit Kaninchenserum gegenüber Methanol und Glycerol auf. Hier verur-

sachten Lösungsmittelkonzentrationen von 3-4% keine Verringerung auf die ma-

ximale Extinktion. Ethylenglykol scheint auf den ersten Blick zwar eine ähnliche

Wirkung auf den ELISA zu haben, führte aber zu unerklärlichen, starken

Schwankungen der Messwerte.

Tabelle 4.10: Toleranz des TATP-ELISA gegenüber Lösungsmitteln und Wasserstoffperoxid.

Lösungsmittel ELISA-Format

% Lösungsmittelkonzentra-tion ohne Signalverlust

% Lösungsmittelkonzentra-tion 50% Signalverlust

K1 K2 M3 K1 K2 M3

Aceton direkt 0.07 0.1 4 0.7 1 17

indirekt 0.4 0.1 1 8 13 8

Methanol direkt 3 3 2 13 13 19

indirekt 15 5 100* 100* 100* 100*

Wasserstoff-peroxid

direkt 0.001 0.001 1 0.06 0.05 4

indirekt 0.03 0.01 100* 7 2 100*

DMSO direkt 0.3 0.2 — 3 2 —

Glycerol direkt 4 3 — 17 13 —

Ethylenglykol▲ direkt 4 0.5 — 14 7 —

Die (zum Teil extrapolierten) Werte wurden den erhaltenen Kurven (4-Parametergleichungen) entnommen, bei denen der Parameter D auf das Niveau der TATP-Kurve gesetzt wurde. * bei 100% Lösungsmittel ist der Wert noch nicht erreicht; ▲

verursacht starkes Schwanken der Messwerte

In Tabelle 4.10 sind auch die Lösungsmittelkonzentrationen angegeben, bei de-

nen ein Signalverlust von 50% gegenüber reinem Wasser erreicht wurde. Es liegt

letztlich am Experimentator, wie viel Signaleinbuße oder mehr Reagenzienein-

112 Ergebnisse und Diskussion

satz akzeptabel sind. Für Methanol zeigte sich dabei, dass im indirekten ELISA

mit Kaninchenserum bei 100% Methanol die maximale Extinktion noch nicht ein-

mal um die Hälfte abfiel und schon 5-15% Methanol ohne erkennbaren Signalver-

lust gegenüber reinem Wasser tolerabel sind. Da Methanol als verträglichstes

Lösungsmittel im ELISA mit allen Seren deutlich hervortrat und auch eines der

gebräuchlichsten ist, wurden mit Kaninchenserum weiterführende Untersuchun-

gen dazu angestellt. Wie schon zum Präzisionsprofil angemerkt, wurden TATP-

Kalibrierlösungen mit 2, 5 und 10% (v/v) Methanol in Wasser angesetzt. Damit

wurden ELISA-Kurven im direkten ELISA mit den Seren beider Kaninchen aufge-

nommen, weil dies das bevorzugte Format ist. Im Vergleich zu methanolfreien

TATP-Kalibrierkurven sind in Tabelle 4.11 die Werte für die maximale Extinktion

und den Testmittelpunkt (Parameter A und C aus Gleichung 4) angegeben. Mit

steigender Methanolkonzentration in den TATP-Kalibrierlösungen nahmen zwar

die Signalintensität und die Testempfindlichkeit (IC50-Zunahme) ab, aber je nach

Messanwendung wären die Kurven durchaus brauchbar. Mit 10% Methanol in

den Lösungen war der ELISA gut fünfmal unempfindlicher, was für die Spuren-

analytik problematisch werden könnte. Zwar konnte durch die Methanolzugabe

nicht erreicht werden, dass die Werte der niedrig konzentrierteren TATP-

Lösungen (siehe Abbildung 4.12 und Abbildung 4.13 zum Präzisionsprofil) stabi-

lisiert und weniger anfällig für Schwankungen werden, aber sie würde u. a. die

Anreicherung oder Probenahme (z. B. Abwischen von eventuell kontaminierten

Oberflächen) von TATP in Methanol ermöglichen, wenn der Empfindlichkeitsver-

lust vertretbar ist.

Tabelle 4.11: Einfluss von Methanol in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-ELISA.

% (v/v) Methanol in TATP-Kalibrier-lösungen

Kaninchen 1 Kaninchen 2

Parameter A IC50

[µg L-1] Parameter A

IC50

[µg L-1]

0 0.001 ± 0.041 0.55 ± 0.24 0.001 ± 0.040 0.61 ± 0.20

2 0.947 ± 0.027 1.3 ± 0.3 0.980 ± 0.028 1.1 ± 0.2

5 0.892 ± 0.034 1.6 ± 0.6 0.901 ± 0.017 1.5 ± 0.2

10 0.629 ± 0.024 3.2 ± 1.2 0.634 ± 0.018 3.2 ± 0.8

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve ohne Methanol auf eins ge-setzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.

Parallel zu den Untersuchungen der Toleranz der ELISA gegenüber Lösungsmit-

teln wurde auch der Einfluss von Wasserstoffperoxid auf den Assay betrachtet

(Tabelle 4.10). Wasserstoffperoxid ist für den TATP-ELISA in zweifacher Hinsicht

von Bedeutung. Es ist nicht nur als Substrat für die Enzymreaktion der HRP uner-

lässlich, sondern auch als Ausgangsstoff der TATP-Synthese sowie als dessen

Zerfallsprodukt stets als potenzielle Verunreinigung gegenwärtig. Durch letzteres

können daher auch höhere Konzentrationen in Proben vorkommen, deren Aus-

wirkung auf die TATP-ELISA geprüft wurde. Im direkten ELISA mit Kaninchense-

rum wurde eine Abnahme der maximalen Extinktion im Vergleich zu reinem

Wasser ab Konzentrationen von 0.001% Wasserstoffperoxid (~ 0.1 × 105 µg L-1,

~ 0.3 mmol L-1) beobachtet. Bei 0.05% Wasserstoffperoxid (~ 5 × 105 µg L-1,

Ergebnisse und Diskussion 113

~ 15 mmol L-1) betrug der Signalverlust bereits 50%. Dieser Wert stimmt mit den

Angaben in Tabelle 4.9 überein, denn auch wenn die Kreuzreaktivität des Was-

serstoffperoxids im ELISA unter 0.01% blieb, so wurde doch auch hierbei ein

Wert von IC50 ~ 5 × 105 µg L-1 (ca. 0.05% H2O2) ermittelt und entsprechend bei

kleineren Konzentrationen ab ~ 0.1 × 105 µg L-1 schon die Abnahme der Extinkti-

on beobachtet. Die Inaktivierung der HRP durch ihr eigenes Substrat ist schon

länger [319] bekannt, wobei die angegebenen Wasserstoffperoxid-

Konzentrationen, ab denen ein Aktivitätsverlust eintrat, von 0.001 mmol L-1 (ab

1 mmol L-1 irreversibel) [320] bis 0.4 mmol L-1 [321] variieren. Die mehrfach im

direkten ELISA beobachtete Extinktionsabnahme ab einer Wasserstoffperoxid-

Konzentration von ~ 0.3 mmol L-1 (0.001%) liegt im oberen Bereich der Werte

aus der Literatur und könnte demnach auf inhibitorische Effekte des Wasserstoff-

peroxids auf die HRP zurückzuführen sein. Der indirekte TATP-ELISA reagierte

zwar deutlich unempfindlicher auf Wasserstoffperoxid und vertrug 10- bis 30-fach

höhere Konzentrationen als der direkte Assay, aber auch er war im Vergleich zu

den untersuchten Lösungsmitteln am wenigsten tolerant gegenüber Wasserstoff-

peroxid. Da im indirekten Format das Wasserstoffperoxid (als Analyt) nicht in

direkten Kontakt mit der HRP kommt, könnte seine Wirkung als starkes Oxidati-

onsmittel eine Rolle spielen. Proteine können durch Oxidation ihre Struktur (z. B.

durch Methioninoxidation) und damit einhergehend auch ihre Funktion verlieren,

was auch das Erkennungs- und Bindungsvermögen der Antikörper negativ beein-

flussen kann. Bemerkenswert ist daher die dennoch höhere Resistenz des ELISA

mit Mausserum gegenüber Wasserstoffperoxid im Vergleich zum Kaninchense-

rum, aber auch hier ist diese schlechter als gegenüber den getesteten Lösungs-

mitteln.

Wasserstoffperoxid übt also einen ernstzunehmenden Einfluss auf den TATP-

ELISA aus, wobei die ausgeprägten Unterschiede zwischen direktem und indirek-

tem Format primär durch die negative Einwirkung auf das Enzym und nicht auf

die TATP-Antikörper zurückzuführen sind. Im direkten ELISA werden Analyt oder

Proben, wie Wasserstoffperoxid, gemeinsam mit dem HRP-Konjugat inkubiert,

während bei der indirekten Assay-Variante ein Waschschritt dazwischen liegt.

Dazu wurden auch Versuche mit Lösungsmitteln durchgeführt. Diese wurden

nach dem Inkubationsschritt mit Kaninchenserum im direkten ELISA eine Stunde

in der Mikrotiterplatte belassen. Anschließend folgten ein Waschschritt und erst

danach die Zugabe des HRP-Konjugats. Obwohl das direkte Waschen vor dem

Auftragen des HRP-Konjugats bei realen Analysen wegen der ausbleibenden,

notwendigen Konkurrenzreaktion zwischen Analyt (im Lösungsmittel) und HRP-

Konjugat nicht praktikabel ist, wurde dabei erst bei einer Methanol- oder Aceton-

konzentration von 50% ein deutlicher Signalverlust gegenüber reinem Wasser

festgestellt. Das zeigt erneut, dass weniger die Antikörper von den Lösungsmit-

teln beeinträchtigt werden als vielmehr die Aktivität des empfindlicheren Enzyms

geschwächt wird. Auch mit DMSO und Wasserstoffperoxid konnte dieser Effekt

beobachtet werden. Zwar war der Signalverlust stärker bzw. trat bei geringeren

Konzentrationen auf, aber dennoch liegt die Toleranzschwelle (zweistelliger pro-

zentualer Bereich) weit über der des indirekten ELISA ohne zwischengeschalte-

tem Waschschritt (Tabelle 4.10). Tatsächlich sind also die TATP-Antikörper we-

114 Ergebnisse und Diskussion

niger anfällig als vermutet, so dass in HRP- oder allgemein enzymunabhängigen,

auf Antikörpern basierenden Nachweissystemen mit höherem Lösungsmittelge-

halt gearbeitet werden könnte. Da ein Verdampfen von Lösungsmitteln aus

TATP-Lösungen auf Grund dessen Flüchtigkeit quasi unmöglich ist, könnte das

für TATP-Analysen durchaus ein entscheidender Faktor sein.

Alle durchgeführten Messungen wurden mit Reinstwasser angefertigt. Der Ein-

fluss der Lösungsmittel sowie die unspezifischen, wenn auch schwachen Hem-

mungen im ELISA bei hohen Konzentrationen (unabhängig von der Art des Stof-

fes), werfen Fragen bezüglich der Leistungsstärke des TATP-ELISA unter Real-

bedingungen auf. Tests dazu, ob die Kreuzreaktionen in Probenmischungen oder

Realproben auch so gering ausfallen, stehen noch aus. Die Seren beider Kanin-

chen reagierten sowohl bei der Untersuchung der Kreuzreaktivität als auch der

Toleranz gegenüber Lösungsmitteln und Wasserstoffperoxid, wie schon beim

Immunisierungsverlauf und der Nachweisgrenze, erneut gleich. Obwohl die

Nachweisgrenzen dieser polyklonalen TATP-Antikörper 5 000-mal besser als die

Nachweisgrenzen mit Mausserum sind, erscheinen die Antikörper aus der Maus

widerstandsfähiger gegenüber Lösungsmitteln und Wasserstoffperoxid. Diese

Eigenschaften würden sie bei ausreichend zur Verfügung stehender Menge ideal

für affinitätschromatographische Anwendungen machen, da die geringere Affini-

tät reversible Bindungen und die Resistenz gegenüber Lösungsmitteln ausrei-

chend stringente Elutionsbedingungen begünstigen. Die TATP-Antikörper aus

den Kaninchen eignen sich hingegen ausgezeichnet für spurenanalytische Me-

thoden, z. B. für die Applikation in Biosensoren.

4.7 BSA-Zusatz und andere Optimierungen

Verwendung von BSA

Die Optimierung der TATP-ELISA beschränkte sich vor allem auf die verwende-

ten Proteine wie BSA als Pufferzusatz oder die Auswahl der in Abschnitt 3.3.3

synthetisierten TATP-Proteinkonjugate. Als Puffer für die Proteinlösungen diente

stets PBS, der verbreitetste und wahrscheinlich meist verwandte Puffer bei bio-

chemischen Methoden. Schon in vorangegangenen Abschnitten, wie in Abschnitt

4.4 bei der Verfolgung der Immunisierungsverläufe durch Optimierung der Se-

rum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen oder bei der Betrachtung des Einflus-

ses von Lösungsmitteln in Abschnitt 4.6, standen die Parameter A und C der

4-Parameteranpassung (Gleichung 4) im Mittelpunkt. Auch nachfolgend wurden

diese zur Bewertung der Signalintensität (maximale Extinktion) und der Test-

empfindlichkeit anhand des Testmittelpunkts herangezogen. Dazu wurden fast

ausschließlich direkte ELISA mit Kaninchenserum durchgeführt.

Zunächst wurde der Einfluss von BSA in Verdünnungen des HRP-Konjugat 1

auf den ELISA untersucht. Da die HRP-Konjugate üblicherweise in Guardian ge-

lagert (und 1:100 vorverdünnt) wurden und dieser HRP-Stabilisator sehr wahr-

Ergebnisse und Diskussion 115

scheinlich auch BSA oder andere Proteine enthält, wurde die Guardian-freie

Rückstellprobe verwendet (Abschnitt 3.3.3), um auch die Auswirkung komplett

ohne zusätzliche Proteine zu sehen. Tabelle 4.12 zeigt für die Seren beider Ka-

ninchen (Boost 7) ähnliche Resultate und macht deutlich, dass schon ein gerin-

ger Proteinanteil aus dem Guardian in PBS (ein Tausendstel aus der 1:100-

Vorverdünnung; HRP-Konjugat-1-Endkonzentration: 1:100 000) zu einer signifi-

kanten Signalerhöhung (Parameter A) führt. Mit 0.1% (w/v) BSA in den HRP-

Konjugat-1-Verdünnungen wurden die höchsten Signalintensitäten erreicht, wo-

bei sie ohne die Lagerung und Vorverdünnung des Konjugats in Guardian noch

etwas höher lagen. Ein Grund dafür kann nicht angegeben werden. Da aber der

größte Teil der hergestellten HRP-Konjugate in Guardian gelagert wurde und der

Unterschied nicht sehr groß ist, wurde dennoch weiterhin damit gearbeitet. Es ist

jedoch fraglich, wie sinnvoll der Einsatz von Guardian ist, dessen Zusammenset-

zung nicht bekannt ist. Offensichtlich scheint die Stabilität der sowohl mit als

auch ohne Guardian aufbewahrten HRP-Konjugate seit über zwei Jahren ge-

währleistet. Ein Effekt auf den Testmittelpunkt (IC50) konnte hier nicht festgestellt

werden.

Tabelle 4.12: Einfluss von BSA und Guardian-Stabilisator in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf

den TATP-ELISA.

Lagerung des HRP-Konjugat 1

HRP-Konjugat-1-Verdünnung in

Parameter A IC50

[µg L-1]

Kaninchen 1

ohne Guardian PBS 0.563 ± 0.009 0.47 ± 0.07

Guardian PBS 0.758 ± 0.003 0.53 ± 0.02

ohne Guardian 0.1% BSA/PBS 1.178 ± 0.029 0.58 ± 0.13

Guardian 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.012 0.55 ± 0.06

Kaninchen 2

ohne Guardian PBS 0.629 ± 0.019 0.43 ± 0.11

Guardian PBS 0.707 ± 0.015 0.48 ± 0.08

ohne Guardian 0.1% BSA/PBS 1.057 ± 0.021 0.36 ± 0.06

Guardian 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.034 0.41 ± 0.11

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.1% BSA/PBS verdünntem und ohne Guardian gelagertem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.

Da eine BSA-Zugabe den TATP-ELISA bezüglich der Signalhöhe erheblich ver-

besserte, sollte nun auch geprüft werden, welchen Einfluss die Menge des zu der

HRP-Konjugat-1-Verdünnung (mit Guardian aus Lagerung und 1:100-

Vorverdünnung) zugegebenen BSA hat. Anhand von Tests mit Kaninchen 2,

Boost-7-Serum konnte mit zunehmender BSA-Konzentration in den HRP-

Konjugat-1-Verdünnungen ein Anstieg der Signalintensität gemessen werden.

Außerdem zeigt Tabelle 4.13 eine leichte Verbesserung des IC50, was in den

obigen Ergebnissen aus Tabelle 4.12 nicht beobachtet werden konnte.

116 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 4.13: Einfluss der BSA-Menge in HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf den TATP-ELISA.

% BSA/PBS zur HRP-Konjugat-1-Verdünnung

Parameter A IC50

[µg L-1]

0 0.634 ± 0.012 0.81 ± 0.12

0.001 0.793 ± 0.016 0.78 ± 0.12

0.01 0.881 ± 0.021 0.70 ± 0.13

0.1 0.001 ± 0.026 0.56 ± 0.10

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.1% BSA/PBS verdünntem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die ande-ren Werte entsprechend angepasst wurden.

Kaum anders verhält es sich mit BSA in den Serumverdünnungen, präsentiert für

Boost-7-Serum von Kaninchen 1 in Tabelle 4.14. Während der IC50 wenig darauf

reagierte, konnte die Signalintensität durch nur 0.005% (w/v) BSA in der Serum-

verdünnung nahezu verdoppelt werden. Der Einfluss des BSA in der Serumver-

dünnung ist so beträchtlich, dass der Effekt des BSA in der HRP-Konjugat-1-

Verdünnung nicht hervortritt. In den vorangegangenen Versuchen enthielten die

Serumverdünnungen bereits 0.005% (w/v) BSA.

Aus unbekannten Gründen führte BSA in den Verdünnungen, sowohl in denen

für die Seren als auch für das HRP-Konjugat 1, zu einer beachtlichen Zunahme

der Signalintensität und damit Verbesserung des TATP-ELISA. Auch wenn der

Einfluss auf die Testempfindlichkeit, wenn überhaupt vorhanden, eher marginal

ist, so lohnt sich der Einsatz von BSA dennoch. Es ermöglicht, dass die wertvol-

len Seren stärker verdünnt werden können, u. a. auch, weil es die Antikörper vor

dem Aggregieren schützt [322], was auch aus wirtschaftlichen Gründen günstig

ist.

Tabelle 4.14: Einfluss von BSA in Serum- und HRP-Konjugat-1-Verdünnungen auf den TATP-

ELISA.

Serum-Verdünnung in

HRP-Konjugat-1-Verdünnung in

Parameter A IC50

[µg L-1]

PBS PBS 0.579 ± 0.008 0.56 ± 0.07

PBS 0.1% BSA/PBS 0.551 ± 0.011 0.57 ± 0.11

0.005% BSA/PBS PBS 1.049 ± 0.017 0.48 ± 0.07

0.005% BSA/PBS 0.1% BSA/PBS 0.001 ± 0.020 0.44 ± 0.08

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit in 0.005% BSA/PBS verdünntem Serum und in 0.1% BSA/PBS verdünntem HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.

Es zeigte sich, dass BSA sich stabilisierend auf den TATP-ELISA insgesamt

auswirkte. Für den Assay mit Mausserum sowie im indirekten Format mit Seren

beider Spezies wurden ebenfalls dieselben Verbesserungen beim Einsatz von

BSA in den Verdünnungen von Serum und HRP-Konjugat 1 bzw. -IgG-HRP

festgestellt. Generell ist es nicht selbstverständlich, dass BSA sich positiv auf

einen Assay auswirkt, wie u. a. bei Baermann [306] zum Ochratoxin-A-ELISA zu

lesen. Dort wurde festgestellt, dass BSA in den HRP-Verdünnungen den Kompe-

Ergebnisse und Diskussion 117

titionsschritt empfindlich stört, da BSA zwei hochaffine Bindungsstellen für

Ochratoxin A besitzt. Aufgrund der Untersuchungsergebnisse kann hier davon

ausgegangen werden, dass TATP nicht signifikant von BSA gebunden wird.

Dennoch wurde auf eine weitere Erhöhung des BSA-Gehalts über die ausgewie-

senen BSA-Anteile in Lösungen hinaus verzichtet, denn wegen der starken

Schaumbildung schon bei geringen BSA-Gehalten wird das Pipettieren der Lö-

sungen schwer kontrollierbar. Bei einem Füllvolumen von 200 µL für die Serum-

verdünnungen waren nicht über 0.005% (w/v) BSA handhabbar. Aufgrund des

kleineren Pipettiervolumens von 50 µL für die HRP-Konjugat-1-Verdünnungen

konnten trotz der Schaumbildung 0.1% (w/v) BSA eingesetzt werden, ohne nega-

tive Folgen für den TATP-ELISA durch Pipettierfehler zu provozieren.

HRP-Konjugate

Ähnlich den Versuchen zur Kreuzreaktivität und Lösungsmitteltoleranz wurden

auch die ungekoppelten Proteine HRP und OVA auf etwaige Beeinflussung des

ELISA untersucht (Abschnitt 3.3.5). Die Ergebnisse (n = 4) der Tests mit Kanin-

chen-1-Serum (Boost 11) sind in Abbildung 4.15 grafisch dargestellt, wobei die

Kurven von TATP und OVA schon vor der Normierung auf eins auf demselben

Niveau verliefen und nur die von HRP diesbezüglich angepasst wurde, weil hier

bereits nach 3 min (statt nach 20 min) die Entwicklungsreaktion gestoppt werden

musste.

Abbildung 4.15: Einfluss von HRP und OVA auf den ELISA.

Für die Verdünnungsreihe mit OVA anstelle mit TATP konnte dabei kaum ein

Effekt beobachtet werden. Erst bei 1 000 000 µg L-1 fiel die ansonsten horizontal

verlaufende Extinktion im Vergleich zu reinem Wasser bzw. dem Wert des Para-

meter A einer TATP-Kurve (in der Abbildung 4.15 stark gestaucht) leicht ab. HRP

verursachte hingegen ab 1 000 µg L-1 eine starke Signalerhöhung mit einer dem

3E-5 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4

0

2

4

6

8

10

HRP

OVA

TATP

Extinktion ( =

450 n

m)

(norm

iert

)

[µg L-1]

0

118 Ergebnisse und Diskussion

TATP gegenläufigen, sigmoidalen Kurve, begünstigt durch seine eigentliche

Funktion als Signal-verstärkendes Element des Assays. Da dieser Anstieg erst

bei höheren HRP-Konzentrationen auftrat, kann davon ausgegangen werden,

dass HRP nicht direkt an die Mikrotiterplattenoberfläche bindet, die ohnehin

durch die Beschichtung mit -Kaninchen-IgG und der Inkubation der Serumver-

dünnung mit BSA-Anteil blockiert sein sollte. Vielmehr wird HRP mit den bereits

an der Platte gebundenen Proteinen unspezifisch interagiert haben. Negative

Auswirkungen auf den TATP-ELISA sind dennoch nicht zu erwarten, wenn die

maximale HRP-Konzentration von 1 000 µg L-1 bei der Verwendung der HRP-

Konjugate unterschritten bleibt. Selbst bei den Tests mit Mausserum, bei denen

das HRP-Konjugat 1 lediglich 1:10 000 verdünnt werden konnte, wurde mit

210 µg L-1 nur ein Fünftel dieser Konzentration benötigt. Bei TATP-ELISA mit

Kaninchenseren (Boost 11: 1:300 000, Boost 7: 1:100 000) wurden nur

7-21 µg L-1 HRP-Konjugat 1 benötigt, was bis zu 150-mal unterhalb der maxima-

len HRP-Konzentration liegt. Zwar wurde nur der direkte ELISA untersucht, aber

es ist zu vermuten, dass es sich im indirekten ähnlich verhält, da auch hier HRP

als Markierung von -IgG zur Detektion eingesetzt wurde und eine Überlagerung

des Signals von unspezifisch gebundenen HRP kritisch wäre.

Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit fünf HRP-Konjugate für den

TATP-ELISA hergestellt (Abschnitt 3.3.3). Bis auf HRP-Konjugat 5, welches mit-

tels der Methode der gemischten Anhydride [168] entstand, wurden alle Konjuga-

te über die Aktivierung des Haptens als NHS-Ester [165, 166] synthetisiert

(Tabelle 3.1). Schon in den per MALDI-TOF-MS bestimmten Kopplungsdichten

des TATP-Haptens an HRP (Tabelle 4.1) spiegelten sich nicht die in den Reakti-

onen eingesetzten Verhältnisse (Tabelle 3.2) wieder und sie ließen vor allem

auch keine Aussage über die tatsächliche Qualität eines Konjugats für den

ELISA zu (Abschnitt 4.3). Daher wurden alle HRP-Konjugate, auch HRP-

Konjugat 4, welches im ELISA mit Mausserum versagte, entsprechend ihrer er-

mittelten Konzentration (Tabelle 4.1) auf das Niveau von 1:200 000 verdünntem

HRP-Konjugat 1 (10.5 µg L-1) gebracht und im ELISA mit Kaninchen-1-Serum

(Boost 11) verglichen. Tabelle 4.15 zeigt die Ergebnisse des HRP-Konjugat-

Vergleichs anhand des Parameter A und des IC50 (Gleichung 4). Wie auch erste

einfache Tests mit Mausserum ergaben, wurden mit dem deshalb später aus-

schließlich verwendeten HRP-Konjugat 1 die besten Ergebnisse erzielt, sowohl

was die Signalhöhe als auch die Empfindlichkeit des Immunoassays betraf. HRP-

Konjugat 2 war nur wenig schlechter bezüglich der Signalintensität und wurde

außerdem aus demselben NHS-Ester-Reaktionsansatz angefertigt. Obwohl diese

beiden Konjugate nur jeweils ein Hapten pro HRP aufwiesen, war ihre Leistungs-

fähigkeit im ELISA besser als die des HRP-Konjugat 3 mit zwei TATP-Haptenen

je HRP. Die geringste Extinktion erreichte HRP-Konjugat 4, was auch erklärt,

warum es im schlechter funktionierenden ELISA mit Mausserum gar kein Signal

hervorbrachte. Daher wurde es auch nicht mittels MALDI-TOF-MS vermessen.

Trotz einer zu HRP-Konjugat 2 identischen Signalhöhe schnitt HRP-Konjugat 5

hinsichtlich der Testempfindlichkeit am schlechtesten ab. Aufgrund der für Prote-

ine drastischen Reaktionsbedingungen mit einem etwa 2.5-fachen Überschuss

an DMF gegenüber Wasser während der Synthese wäre auch ein Einbruch der

Ergebnisse und Diskussion 119

Signalintensität durch einen (Teil-)Verlust der Enzymaktivität oder wegen der

geringen Kopplungsdichte (< 1) nicht auszuschließen gewesen.

Tabelle 4.15: Vergleich der hergestellten HRP-Konjugate im TATP-ELISA.

TATP-Proteinkonjugat Protein:TATP-Hapten

(Kopplungsdichte) Parameter A

IC50

[µg L-1]

HRP-Konjugat 1 < 1:1 0.001 ± 0.017 0.47 ± 0.06

HRP-Konjugat 2 < 1:1 0.886 ± 0.019 0.36 ± 0.06

HRP-Konjugat 3 < 2:1 0.557 ± 0.008 0.81 ± 0.10

HRP-Konjugat 4 < — 0.287 ± 0.004 0.96 ± 0.10

HRP-Konjugat 5 < 1:1 0.882 ± 0.012 01.1 ± 0.10

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve mit HRP-Konjugat 1 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.

Prinzipiell ließen sich mit allen fünf HRP-Konjugaten ELISA mit Kaninchenserum

durchführen, wenn auch die Konjugate 3-5 nur etwa halb so empfindliche ELISA

ermöglichten wie die Konjugate 1 und 2. Insbesondere HRP-Konjugat 4 schnitt

bei dieser Untersuchung schlecht ab und es soll noch einmal betont werden,

dass das Verarbeiten der aktivierten NHS-Ester möglichst kurzfristig nach ihrer

Herstellung erfolgen sollte und nicht erst Tage später. Obwohl die HRP-

Konjugate 1 und 2 mit einem Hapten/HRP-Kopplungsverhältnis von 1:1 am effizi-

entesten im TATP-ELISA arbeiteten, lässt sich aus den wenigen Daten hier keine

generelle Schlussfolgerung ziehen, zumal die Kopplungsdichten allesamt mit

< 1-2 recht niedrig waren. Des Weiteren wäre zusätzlich auch eine vergleichende

Betrachtung der Enzymaktivitäten der HRP-Konjugate zur umfassenden Beurtei-

lung dienlich, auf die hier verzichtet wurde.

Auch die drei OVA-Konjugate (Abschnitte 3.3.3. und 4.3) können kurz anhand

der Erfahrungen, die während des praktischen Arbeitens gewonnen wurden, ver-

glichen werden. Genauer untersucht wurden sie jedoch nicht, da der indirekte

ELISA in dieser Arbeit nur eine untergeordnete Rolle spielte. Zwischen OVA-

Konjugat 1 und 2 konnte dabei kein Unterschied in der Signalintensität oder Test-

empfindlichkeit festgestellt werden, wobei OVA-Konjugat 2 sehr selten benutzt

wurde. OVA-Konjugat 3 unterscheidet sich durch die mehr als doppelt so hohe

Proteinkonzentration sowie der Kopplungsdichte erheblich von OVA-Konjugat 1.

Durch verschieden starke Verdünnungen wurden im ELISA Konzentrationen von

ca. 1.2 mg L-1 des zweifach mit Hapten gekoppelten OVA-Konjugat 1 und etwa

0.3 mg L-1 des vierfach gekoppelten OVA-Konjugat 3 eingesetzt, so dass unter

Berücksichtigung der unterschiedlichen Kopplungsdichten scheinbar fast ein

Ausgleich zu Stande kam und auch keine Veränderungen des IC50 bei der Ver-

wendung der OVA-Konjugate bemerkt werden konnten.

Haltbarkeit der Arbeitslösungen

Bereits oben im Abschnitt zur Verwendung von BSA wurde erwähnt, dass die

synthetisierten HRP-Konjugate bei 4 °C mindestens zwei Jahre stabil bleiben,

unabhängig davon, ob sie in Guardian–Stabilisator oder ohne aufbewahrt wur-

120 Ergebnisse und Diskussion

den. Wegen der hohen Endverdünnungen wurden zusätzlich 1:100-

Vorverdünnungen in Guardian notwendig (Abschnitt 3.3.5), die anfangs wöchent-

lich erneuert wurden. Diese HRP-Konjugat-1-Vorverdünnungen erwiesen sich

ebenfalls als haltbar und zeigten über einen Untersuchungszeitraum von

4.5 Monaten nicht die geringsten Veränderungen beim Einsatz im ELISA mit Ka-

ninchen-2-Serum (Boost 11), weder in Bezug auf die Signalintensität noch den

Testmittelpunkt (Daten nicht gezeigt).

Auch mit Kaninchenseren, die an sich wie die meisten konzentrierten Antikör-

perlösungen lange (mit Natriumazid) stabil sind, wurden Versuche mit Vorver-

dünnungen von Boost-5-Serum von Kaninchen 1 und 1:30 000 verdünntem HRP-

Konjugat 1 unternommen. Die 1:1 000-Serumvorverdünnungen wurden in 0.1%

BSA/PBS, PBS, Reinstwasser und Pferdeserum angefertigt und an den jeweili-

gen Versuchstagen weiter auf eine 1:40 000-Endverdünnung in PBS gebracht.

ELISA mit in 0.1% BSA/PBS vorverdünntem Serum ergaben die höchsten Werte

für Parameter A und die (tendenziell) niedrigsten IC50. Wie oben beschrieben

wirkt sich BSA sehr günstig auf den ELISA-Verlauf aus, so dass die Immunoas-

says mit Serumvorverdünnungen in PBS und Reinstwasser, die sich nahezu

identisch verhielten, geringfügig schlechtere Ergebnisse als die mit BSA ergaben.

Der Einsatz von Pferdeserum, einer trüben, undefinierten Lösung, führte zu einer

Verringerung des Wertes von Parameter A um ca. 40%, dafür blieb der IC50 fast

unverändert im Vergleich zu in 0.1% BSA/PBS vorverdünntem Serum. Trotz die-

ser Auswirkungen der zu Serumvorverdünnungen verwendeten Medien auf den

ELISA traten über einen Zeitraum von drei Monaten weder Empfindlichkeits-

noch Signalverluste bei der Gegenüberstellung mit dem Ergebnis des ersten Ta-

ges des jeweils benutzten Vorverdünnungsmediums auf. Obwohl diese Ergeb-

nisse vielversprechend waren, wurde jedoch nie eine Vorverdünnung für die Se-

ren angewendet. Zum einen wechselten die Seren zunächst von Boost zu Boost,

zum anderen waren die benötigten Mengen für eine komplette ELISA-Platte groß

genug, um nicht zwangsläufig vorverdünnen zu müssen. Für andere Anwendun-

gen, routinemäßige oder solche mit kleineren Mengen, kann die Möglichkeit einer

Vorverdünnung oder Lagerung der Seren in diversen Medien jedoch durchaus

interessant werden. Im nächsten Abschnitt über die Plattenbeschichtung

und -konservierung wird auf diesen Versuch unter einem anderen Aspekt

(Abbildung 4.16) nochmals eingegangen.

Eine dritte Gruppe von Lösungen, deren Langzeitstabilität für den TATP-ELISA

von Bedeutung ist, stellen die Stamm- und Kalibrierlösungen von TATP dar. Bei

methanolischen Stammlösungen konnten selbst nach mehr als 1.5 Jahren und

bei wässrigen Kalibrierlösungen nach über sieben Monaten kein Unterschied zu

frisch hergestellten TATP-Lösungen im ELISA, egal ob mit Maus- oder Kanin-

chenserum, entdeckt werden. Die aufgenommenen Kurven verliefen so parallel,

dass sie vollständig übereinander lagen und fast nicht unterscheidbar waren (oh-

ne Abbildung). Die Stabilität von TATP-Lösungen wird auch von Pachman und

Matyas [323] per HPLC bestätigt, wenn die Lösungen mit umkristallisiertem

TATP angefertigt und dunkel gelagert wurden. Entscheidend ist, dass die Be-

fürchtungen aus Abschnitt 4.1 nicht eingetroffen sind. Obwohl dort eindeutig be-

Ergebnisse und Diskussion 121

wiesen werden konnte, dass TATP aus dem Gasraum über wässrigen TATP-

Lösungen per GC-MS nachweisbar ist und somit aus den Lösungen entweicht,

scheint das keine merklichen Folgen für die Konzentrationen der TATP-Lösung

und den ELISA zu haben. Plausible Gründe dafür gibt es einige: Zunächst wur-

den die TATP-Lösungen weitestgehend bei 4 °C gehalten, was den Dampfdruck

erheblich senkt (schon bei 12 °C auf etwa ein Siebentel des Wertes von 25 °C

[79]). Außerdem war der Gasraum über den Stamm- und Kalibrierlösungen er-

heblich kleiner (im ungünstigsten Fall ~ 75%, eher ~ 50%) als in den Gaspha-

senexperimenten (98%), so dass auch weniger TATP entweichen konnte. Insbe-

sondere wurden meist sehr viel kleinere Konzentrationen für die wässrigen Kalib-

rierlösungen verwendet als für die GC-MS-Untersuchungen nötig waren. Schon

über der 0.5 mg L-1 TATP-Lösung konnte in der Gasphase kein TATP mehr

nachgewiesen werden.

Alle Reagenzien, die speziell für den TATP-ELISA (und eventuelle andere Im-

munoassayformate) notwendig sind, also die TATP-HRP-Konjugate, die polyklo-

nalen TATP-Antikörper sowie die TATP-Lösungen, sind auch in Verdünnungen

über viele Monate bis Jahre halt- und verwendbar. Insbesondere für eine etwaige

kommerzielle Nutzung ist dies ein maßgebliches Kriterium bei der Vermarktung

eines Assays, wobei Untersuchungen zur Stabilität der Komponenten bei Raum-

temperatur dabei auch interessant wären. Tests dazu stehen noch aus, sind aber

bei Immunoassays auch nicht gebräuchlich, da Proteine, vor allem in Lösung,

generell kalt gelagert werden.

Plattenbeschichtung und -konservierung

Viele Festphasenimmunoassays bedienen sich einer Beschichtung mit polyklona-

len, Spezies-spezifischen -IgG (sekundären Antikörpern). Diese ermöglichen

wiederum aus einer Vielzahl von Proteinen in einem Serum oder anderen Pro-

teingemischen nur den Antikörpern (IgG) die Bindung an den mit -IgG beschich-

teten Oberflächen. Dadurch können mehr der gewünschten, durch die Immuni-

sierung gebildeten Antikörper binden. Abbildung 4.16 präsentiert ELISA-Kurven,

die ohne die erste Beschichtung der Platte mit -Kaninchen-IgG und stattdessen

nur mit Kaninchen-1-Serum (Boost 5) aus den (14 Tage alten) Vorverdünnungen

des vorangegangen Abschnitts erzeugt wurden. Ausgehend von diesen 1:1 000-

Vorverdünnungen wurden durch eine 1:40-Verdünnung in PBS die 1:40 000-

Endverdünnungen der Seren erreicht, so dass beim Aufgeben in die Platte zwei

der Serumverdünnungen noch 0.0025% BSA (25 mg L-1) bzw. 2.5% Pferdeserum

enthielten. Mit diesen brachen die Kurven des normalerweise gut funktionieren-

den TATP-ELISA ein, da die sonst durch die -Kaninchen-IgG vorgenommene

Antikörper-Selektion ausblieb und so alle Proteine an die Platte binden konnten.

Die Proteine (BSA oder andere Serumproteine) lagen außerdem im Verhältnis zu

den Antikörpern in hohem Überschuss vor, dass letztere fast vollständig von die-

sen bei der Bindung an der Mikrotiterplattenoberfläche „verdrängt“ wurden und

somit die Extinktionen sehr klein blieben. Die IC50 waren aber noch bestimmbar

und kaum verändert gegenüber den Kurven mit Sekundärantikörper-

122 Ergebnisse und Diskussion

Beschichtung und tendenziell auch immer noch etwas besser als die Kurven, die

aus Serumvorverdünnungen in PBS oder Reinstwasser entstanden.

Abbildung 4.16: TATP-ELISA mit Kaninchenserum ohne -Kaninchen-IgG-Beschichtung und mit

Serumvorverdünnungen in unterschiedlichen Medien.

Auch die Kurven mit Serumvorverdünnungen in Reinstwasser und PBS wiesen

ohne vorherige Beschichtung der Platten mit -Kaninchen-IgG kaum einen Un-

terschied der Testempfindlichkeit im Vergleich zu Messungen mit beschichteten

Platten auf. Jedoch nahm auch hier die Signalintensität merklich, allerdings bei

weitem nicht so drastisch, ab. Die durchgeführten Versuche reichen nicht aus,

um die Beobachtungen zu quantifizieren, aber mit einer Verdopplung der Zeit für

die Substratentwicklung konnten fast die Signalhöhen der Versuche mit Sekun-

därantikörper-Beschichtung erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass

die Beschichtung der Mikrotiterplatten mit -Kaninchen-IgG für den ELISA mit

polyklonalen TATP-Antikörpern aus Kaninchen nicht erforderlich ist, wenn auf

eine Zugabe von Proteinen zu den Serumverdünnungen verzichtet wird. Für den

optimalen Verlauf des TATP-ELISA ist jedoch eine -IgG-Beschichtung zur se-

lektiven Bindung von Kaninchen-Antikörpern zu empfehlen, da die Zugabe von

BSA zu besseren Resultaten führt, wie oben bereits ausführlich erläutert wurde.

Bereits in Abschnitt 4.5 wurde auf die Unterschiede der sekundären Antikörper

eingegangen. Üblicherweise wurden -IgG [H&L] verwendet, doch mit Maus-3-

Serum (Boost 5) wurde zum Vergleich auch -Maus-IgG F(c) getestet. Trotz der

etwas geringeren Konzentration des -Maus-IgG F(c) (2.05 mg mL-1) war Para-

meter A bei Beschichtung der Platte mit diesem Antikörper um 22% (n = 3 × 2

Kurven) höher als mit dem -Maus-IgG [H&L] (2.2 mg mL-1) bei gleichbleibender

Verdünnung von 1:2 000. Die Testmittelpunkte wichen dagegen nicht signifikant

voneinander ab. Die Tatsache, dass die [H&L]-Antikörper weniger spezifisch

sind, könnte dazu geführt haben, dass beispielsweise auch mehr Antikörperfrag-

mente an sie binden konnten und so weniger Bindungsstellen für intakte

0.0003 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

PBS

Wasser

0.1% BSA/PBS

Pferdeserum

Extinktion ( =

450 n

m)

TATP [µg L-1]

0

Ergebnisse und Diskussion 123

(TATP-)Antikörper zur Verfügung standen. Diese intakten Antikörper werden

durch den -Maus-IgG F(c), der häufig beim Arbeiten mit monoklonalen Antikör-

pern verwendet wird und spezifisch einen Teil der konstanten Domänen der bei-

den schweren Polypeptidketten der Maus-IgG erkennt, bevorzugt gebunden.

Dennoch wurde weiterhin mit [H&L]-Antikörpern gearbeitet, auch um die Ver-

gleichbarkeit mit vorangegangenen Versuchen aufrecht zu erhalten, zumal ein

Signalverlust vertretbar ist, solange die Testempfindlichkeit nicht betroffen ist.

Außerdem stellte sich der -Maus-IgG [H&L] bei den Faeces-Untersuchungen

(Abschnitt 4.5) als vorteilhaft heraus, weil er verschiedene Immunglobulinklassen

erfasst; eine Eigenschaft, die auch zu Beginn einer Immunisierung nützlich ist,

wenn zunächst Hapten-spezifische IgM gebildet werden.

Eine andere Vorgehensweise bei der Beschichtung einer ELISA-Platte, vor al-

lem im Hinblick auf einen kommerziellen Einsatz, ist die Plattenkonservierung,

die in Abschnitt 3.3.5 beschrieben wurde. Nach der üblichen Inkubation des Se-

rums von Kaninchen 1 (Boost 11) in bereits mit -Kaninchen-IgG beschichteten

Mikrotiterplatten wurde durch das Einwirken einer Konservierungslösung und

dem anschließenden Trocknen die Lagerung der Platten über einen längeren

Zeitraum bei 4 °C möglich. Nach 8 bzw. 24 Tagen wurden die konservierten Plat-

ten mit einer wie üblich frisch angesetzten Platte verglichen (n = 6-12). Aus Ta-

belle 4.16 geht hervor, dass die konservierten Platten nur knapp 30% des Wertes

von Parameter A einer frischen Platte erreichten und über viermal weniger emp-

findlich waren. Die Dauer der Lagerung hatte dabei, zumindest in dem recht kur-

zen Untersuchungszeitraum, keinen Einfluss auf die Ergebnisse.

Tabelle 4.16: Vergleich von frischer und konservierter Plattenbeschichtung für den TATP-ELISA.

frisch konserviert % (konserviert/frisch)

Parameter A

Tag 8 1 ± 0.038 0.282 ± 0.003 28

Tag 24 1 ± 0.017 0.290 ± 0.002 29

IC50

[µg L-1]

Tag 8 0.47 ± 0.14 2.0 ± 0.2 430

Tag 24 0.40 ± 0.05 1.9 ± 0.1 470

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve einer frisch angefer-tigten Platte auf eins gesetzt und der andere Wert entsprechend angepasst wurde.

Die Abnahme der Signalintensität ließe sich wahrscheinlich leicht durch eine Er-

höhung der Serum- oder HRP-Konjugat-1-Konzentration ausgleichen. Durch Op-

timierung des ursprünglich für monoklonale Antikörper entwickelten Konservie-

rungsprotokolls könnte ebenfalls versucht werden, die Einbuße an Empfindlich-

keit zu verringern. Doch selbst wenn die Qualitätsverluste durch die Konservie-

rung der Platten, wie in dieser kleinen Machbarkeitsstudie, unvermeidbar blieben,

könnte sich die Methode durchsetzen. Beim TATP-ELISA werden alle Platten

eines Kaninchenserums desselben Boosts bis zu dessen Inkubation gleich be-

handelt, so dass viele Platten gleichzeitig vorbereitet werden können, was

124 Ergebnisse und Diskussion

schließlich nicht nur am Versuchstag durch den direkten Beginn mit dem Kompe-

titionsschritt Zeit spart, sondern auch die Reproduzierbarkeit der Tests erhöhen

könnte und die Möglichkeit des einfachen Versands eröffnet. Selbstverständlich

sollten dazu die konservierten Platten mindestens über sechs Monate, besser

noch ein Jahr, stabil bleiben. Dann könnte dieses Prinzip der Immobilisierung und

Konservierung der TATP-Antikörper auf andere (Kunststoff-)Oberflächen, z. B.

Sensoroberflächen oder Membranen, übertragen werden.

Sonstige Optimierungsansätze

Tween 20

Neben den verschiedenen Proteinen (in Puffern) und den Kalibrierlösungen spielt

abgesehen von den Puffersalzen noch das Detergens Tween 20 bei der Durch-

führung des TATP-ELISA eine Rolle. Es war mit 0.05% (v/v) ein Bestandteil des

Waschpuffers, wird aber auch als Benetzungsmittel oder Bestandteil bei Proben-

aufarbeitungen auch in späteren Anwendungen und Formaten verwendet. Ana-

log zu den Versuchen mit Methanol (Abschnitt 4.6, Tabelle 4.11) wurden den

TATP-Kalibrierlösungen verschiedene Mengen Tween 20 zugegeben und im

ELISA mit den Kaninchenseren (Boost 7) eingesetzt. In Tabelle 4.17 ist der Ein-

fluss des Tween 20 auf den TATP-ELISA wieder anhand der Parameter A und

der IC50 aus der 4-Parameter-Anpassung (Gleichung 4) dargestellt. Die Auswir-

kungen waren deutlich: Schon 0.005% (v/v) führten zu einem Einbruch der Sig-

nalhöhe um bis zu 50% und die Testempfindlichkeit nahm um mehr als die Hälfte

ab. Dies entsprach nur einem Zehntel der Tween-20-Konzentration im Waschpuf-

fer, der zwar aus den Kavitäten entfernt wurde, aber dennoch blieben stets Reste

davon an der Oberfläche zurück. Ein Verzicht auf Tween 20 beim Waschen war

nicht möglich, da nicht nur die Signalintensität dabei einbrach, sondern vor allem

die Messwerte kaum auswertbar waren, weil sie um bis zu 40% streuten (normal

maximal um ~ 5%). Tween 20 ist offensichtlich notwendig, um die Ober-/Grenz-

flächenspannung für den Waschprozess in den Kavitäten herabzusetzten und

anschließend auch die Antikörper und HRP-Konjugate an der Oberflächen der

Mikrotiterplatte vor Austrocknung zu schützen.

Insbesondere die bereits erwähnten Schwankungen der Messwerte im Bereich

der sehr gering konzentrierten Kalibrierlösungen veranlassten diese Untersu-

chungen. Da TATP unpolar ist, wurden auch Interaktionen mit Kunststoffoberflä-

chen wie dem Polystyrol der Mikrotiterplatten vermutet, welche aber nicht nach-

gewiesen werden konnten. Mit der Mizellenbildung des Tween 20 (CMC =

8.04 × 10-5 M ≈ 0.01% (w/v) bei 21 °C [324]) unter Einschluss von TATP scheint

mit diesen Untersuchungsergebnissen hingegen ein plausibler Grund gefunden.

Eine Beeinträchtigung der Antikörper kann nahezu ausgeschlossen werden, da

alle ELISA im gleichen Labor mit demselben Waschprogramm behandelt werden

und viele andere immunchemische Methoden ebenfalls mit Tween 20 arbeiten.

Das manuelle Nachspülen der Kavitäten mit PBS nach dem Waschschritt direkt

vor dem Kompetitionsschritt, um den Kontakt von TATP mit Tween 20 zu verhin-

dern oder zumindest zu minimieren, rief jedoch keine Verbesserung gegenüber

Ergebnisse und Diskussion 125

dem normalen Waschvorgang mit 0.05% (v/v) Tween 20 am Waschautomaten

hervor.

Tabelle 4.17: Einfluss von Tween 20 in TATP-Kalibrierlösungen auf den TATP-ELISA.

% (v/v) Tween 20 in TATP-Kalibrier-lösungen

Kaninchen 1 Kaninchen 2

Parameter A IC50

[µg L-1] Parameter A

IC50

[µg L-1]

0 0.001 ± 0.036 0.63 ± 0.21 0.001 ± 0.033 0.54 ± 0.14

0.005 0.360 ± 0.005 02.1 ± 0.29 0.545 ± 0.003 ml1.2 ± 0.043

0.01 0.280 ± 0.007 02.7 ± 0.74 0.443 ± 0.010 01.5 ± 0.27

0.05 0.130 ± 0.003 5.6 ± 2.0 0.204 ± 0.004 02.5 ± 0.44

0.1 0.127 ± 0.003 .6.7 ± 2.3 0.199 ± 0.001 05.2 ± 0.22

0.2 0.100 ± 0.002 .7.7 ± 2.1 0.159 ± 0.003 06.6 ± 1.60

0.5 0.072 ± 0.002 135 ± 4.3 0.135 ± 0.003 07.8 ± 1.90

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve ohne Tween 20 auf eins gesetzt und die anderen Werte entsprechend angepasst wurden.

Temperaturabhängigkeit des Kompetitionsschritts

Da die Kompetition zwischen TATP und dem HRP-Konjugat 1 den sensibelsten

Teil des TATP-ELISA darstellt und TATP zudem auch noch in Abhängigkeit von

der Temperatur flüchtig ist (siehe auch oben: Haltbarkeit der Arbeitslösungen

sowie Abschnitt 4.1), lag eine Überprüfung des Einflusses der Temperatur auf

diesen Schritt nahe. Alle vier Parameter der sigmoidalen TATP-Kalibrierkurve

(Gleichung 4) eines wie üblich bei Raumtemperatur durchgeführten ELISA mit

Kaninchen-1-Serum (Boost 11) wurden in Tabelle 4.18 mit den Parametern eines

ELISA verglichen, der sich lediglich durch die Inkubationstemperatur von 4 °C

während des 30-minütigen Kompetitionsschritts unterschied. Aus den Daten von

zwei Versuchstagen (jeweils n = 12) geht hervor, dass Parameter D (Untergrund)

und Parameter B (Steigung der Kurve im Wendepunkt) sich nicht signifikant ver-

änderten. Der IC50 erreichte bei 4 °C zwar nur ~ 75% des Wertes bei Raumtem-

peratur, aber diese Empfindlichkeitsverbesserung war nur an einem der Ver-

suchstage signifikant, so dass der Einfluss der Temperatur, wenn überhaupt, nur

sehr gering ausfiel. Anders hingegen verhält sich die Signalintensität (Parame-

ter A), die bei niedrigerer Temperatur um ca. 50% verringert war. Dabei ist jedoch

davon auszugehen, dass hier kein direkter Einfluss auf den TATP-ELISA vorlag,

sondern ganz allgemein die Geschwindigkeit der Bindung des Analyten sowie

des HRP-Konjugats an die Antikörper durch die Temperaturdifferenz von über

15 K herabgesetzt war. Ebenso könnte der Temperaturunterschied auf die Um-

setzung des Substrats TMB durch das Enzym HRP nachgewirkt haben. Dieser

Entwicklungsschritt wurde zwar bei Raumtemperatur durchgeführt, jedoch wird

es eine Weile gedauert haben, ehe sich die Mikrotiterplatte von 4 °C auf Raum-

temperatur anpasste, weswegen die Reaktionsgeschwindigkeit zunächst ver-

langsamt war. Hier greift näherungsweise die einfache Reaktionsgeschwindig-

keit-Temperatur-Regel [325].

126 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 4.18: Einfluss der Inkubationstemperatur des Kompetitionsschritts auf den TATP-ELISA.

Messung RT 4 °C % (4 °C/RT) RT 4 °C

Parameter A Parameter D

1 1 ± 0.007 0.547 ± 0.015 55 0.012 ± 0.007 0.019 ± 0.012

2 1 ± 0.034 0.385 ± 0.015 39 0.038 ± 0.047 0.038 ± 0.019

IC50

[µg L-1] Parameter B

1 0.39 ± 0.02 0.29 ± 0.06 74 0.612 ± 0.021 0.707 ± 0.094

2 0.41 ± 0.11 0.32 ± 0.10 76 0.633 ± 0.108 0.636 ± 0.125

Parameter A wurde normiert, indem der Wert aus der Kalibrierkurve einer frisch angefertigten Platte auf eins gesetzt und der andere Wert entsprechend angepasst wurde.

Die Durchführung eines ELISA, auch nur teilweise, bei 4 °C ist umständlich zu

bewerkstelligen. So ist es auch aus praktikabler Sicht sehr positiv zu werten,

dass keine große Anhängigkeit des Kompetitionsschritts im TATP-ELISA von der

Temperatur festgestellt werden konnte. Entscheidend dabei ist vor allem die Er-

kenntnis, dass TATP offensichtlich nicht in ausschlaggebendem Umfang bei

Raumtemperatur aus den wässrigen Kalibrierlösungen in den Kavitäten ent-

weicht, wie nach den GC-MS-Untersuchungen (Abschnitt 4.1) zu vermuten war,

sonst hätte aufgrund des Dampfdruckunterschieds zu 4 °C ein erheblicher Emp-

findlichkeitsverlust des ELISA beobachtet werden können. Gleiches war bereits

oben bei den Untersuchungen zur Haltbarkeit der Arbeitslösungen diskutiert wor-

den.

4.8 Konformeren-ELISA

In Abschnitt 4.1 wurde ausführlich von den beiden Konformeren des TATP und

den vorgenommenen Untersuchungen durch die Trennung von D3- und C2-TATP

per HPLC (Abschnitt 3.3.1) berichtet. Das Chromatogramm dieser Trennung ließ

sich per ELISA mit Kaninchen 1 Serum (Boost 11) nachbilden, indem die in re-

gelmäßigen Abständen (0.05 min) gesammelten Fraktionen anhand einer TATP-

Kalibriergeraden ausgewertet wurden, wie in Abbildung 4.17 für den Bereich der

Retentionszeiten etwa zwischen Minute 2 und 3.6 präsentiert. Diese direkte Ge-

genüberstellung zeigt, dass mit dem Konformeren-ELISA das große Signal des

D3-TATP-Konformers in den Fraktionen, die etwa bei 2.5 min gesammelt wurden,

sowie das kleinere Signal des C2-TATP-Konformers in den Fraktionen, die etwa

bei 3.0 min aufgefangen wurden, hervorragend mit dem Elutionsprofil des HPLC-

Chromatogramms übereinstimmen.

Es gibt jedoch auch Diskrepanzen zwischen den beiden Methoden. So wurden

von den 10 µg TATP, die aus einer methanolischen Lösung in die HPLC injiziert

wurden, in den neun dem D3-TATP zugeordneten Fraktionen (2.31-2.71 min)

11.7 µg und in den sechs C2-TATP-Fraktionen (2.86-3.11 min) 0.3 µg TATP im

ELISA ermittelt. Die Abweichungen der Werte können vielfältige Gründe haben.

Ergebnisse und Diskussion 127

Ein Faktor könnte die Größe der Fraktionen sein, die durchschnittlich 18.5 µL

betrug. Die genauen Volumina jeder einzelnen Fraktion, mit denen auch gerech-

net wurde, betrugen zwischen 17.16 und 19.50 µL und wurden vom HPLC-

Programm ausgegeben. Die Richtigkeit dieser Angaben wurde jedoch nicht

überprüft. Nicht auszuschließen ist außerdem der Einfluss des Restlösungsmit-

tels (überwiegend Acetonitril) in den verdünnten Fraktionen. Ein Entfernen der

Lösungsmittel durch Eindampfen der Fraktionen ist aufgrund der Flüchtigkeit von

TATP nicht möglich, so dass durch eine 1:55-Verdünnung (18.5 µL + 1 000 µL

Wasser), gefolgt von einer zweiten 1:10-Verdünnung, der Lösungsmittelgehalt

auf knapp 0.2% reduziert werden musste. Der erste Verdünnungsschritt reichte

außerdem nicht aus, um Werte innerhalb des Kalibrierbereichs zu erhalten und

auszuwerten. Zwar wurde in Abschnitt 4.6 nicht explizit die Lösungsmitteltoleranz

des TATP-ELISA gegenüber Acetonitril untersucht, jedoch zeigt die Tabelle 4.10,

dass einige Lösungsmittel sich auch schon bei geringen Konzentrationen von

unter 1% negativ auf den TATP-ELISA auswirken können.

Abbildung 4.17: TATP-Konformeren-ELISA im direkten Vergleich zum HPLC-Chromatogramm.

Ein weitaus interessanterer Unterschied zwischen den Ergebnissen von HPLC

und ELISA ist das abweichende Verhältnis der beiden Konformere zueinander.

Im HPLC-Chromatogramm betrug das D3/C2-Verhältnis 22:1, wobei wieder ange-

nommen wurde, dass beide Konformere ein gleiches oder zumindest ähnliches

UV-Absorptionsverhalten bei 225 nm aufweisen. Damit liegt dieses etwas höher

als das üblicherweise in Methanol beobachtete 15:1-Verhältnis (Abschnitt 4.1).

Aus den Ergebnissen des Konformeren-ELISA wurde ein Verhältnis zwischen

D3- und C2-TATP von 39:1 ermittelt. Es zeigt sich also, dass das C2-Konformer

von den polyklonalen TATP-Antikörpern deutlich schlechter erkannt wird als das

D3-TATP. Die unterschiedlichen Konformeren-Verhältnisse deuten auf eine

Kreuzreaktivität der Antikörper gegenüber C2-TATP von etwa 50% hin. Dabei ist

davon auszugehen, dass die tatsächliche Kreuzreaktivität nochmals mindestens

2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50

0

20

40

60

80

0

100

200

300

400 HPLC-Chromatogramm

Rela

tive A

bsorp

tion

( =

225 n

m)

C2-TATP

[min]

D3-TATP

TA

TP

[µ

g L

-1]

cTATP

via ELISA

128 Ergebnisse und Diskussion

um die Hälfte darunter liegt, vielleicht sogar gegen Null geht, da trotz des ver-

kürzten ELISA-Ablaufs bereits eine volle Halbwertszeit für die gegenseitige Um-

wandlung der beiden Konformere (33 min) von der Fraktionierung bis zum Ende

des Kompetitionsschritts verstrichen und somit schon mindestens die Hälfte des

C2-TATP in D3-TATP übergegangen war.

Obwohl aufgrund der Erkenntnisse in Abschnitt 4.2 in Spuren auch C2-TATP-

Hapten und damit auch ein entsprechendes Immunogen vorlag, scheinen sich

die daher theoretisch in dem polyklonalen Serum vorhandenen C2-TATP-

Antikörper nicht durchgesetzt zu haben bzw. liegen in einer zu geringen

Konzentration gegenüber den D3-TATP-Antikörpern vor, um einen

ausgleichenden Einfluss auf diese Messung auszuüben. Nach mehreren

Halbwertszeiten hätte hingegen bald zu identischen Verhältnissen zwischen den

beiden Signalen im Chromatogramm und den per ELISA ermittelten Mengen an

TATP in den entsprechenden Fraktionen geführt, da dann den polyklonalen

Antikörpern das D3-TATP in allen Fraktionen gleichermaßen zur Verfügung steht.

Durch die kaum reversible Antigen-Antikörper-Bindung wird sich außerdem das

Gleichgewicht zwischen den Konformeren verschieben und sich zu Gunsten des

D3-TATP in Lösung immer wieder neu einstellen müssen.

Das Ziel des Konformeren-ELISA war es, die beiden TATP-Konformere nach

der chromatographischen Trennung unabhängig voneinander untersuchen zu

können. Dabei konnte ein Unterschied in der Antikörpererkennung zwischen dem

D3- und C2-TATP registriert werden. Auch wenn bereits etwa die Hälfte des

C2-TATP in den Fraktionen des kleineren Signals zu D3-TATP umgewandelt war,

konnte dennoch das Prinzip der unabhängigen Untersuchung von Konformeren

eines Analyten im ELISA unter Zuhilfenahme einer HPLC-Trennung präsentiert

werden, wenngleich sich dafür Substanzen mit längeren Halbwertszeiten für ge-

genseitige Umwandlung der Konformere besser eignen würden als TATP.

4.9 Lateral Flow Assay (LFA)

Zum Abschluss dieser Arbeit sollen erste Experimente für eine weitere Anwen-

dung der hergestellten TATP-Antikörper vorgestellt werden. In Abschnitt 3.3.6

wurden der allgemeine Aufbau und verschiedene Maßnahmen zur Entwicklung

eines LFA (lateral flow assay, immunchromatographischer Schnelltest) für TATP

ausführlich geschildert. Schon in kurzer Zeit konnten erste Resultate erzielt wer-

den, wenn auch kein zuverlässiger TATP-LFA entstand. Nachstehende Informa-

tionen sind daher eher als prinzipieller Ansatz der Realisierbarkeit eines LFA für

TATP zu verstehen.

Das Zusammensetzen von Proben- und Konjugatauftragsvlies, diagnostischer

Membran und Absorptionsvlies (Abbildung 3.6) ließ sich mit einfachsten Mitteln

bewerkstelligen. Dabei sollten die Materialien verschiedener Hersteller nicht

kombiniert und nur gemäß ihrer vorgegebenen Bestimmung eingesetzt werden

Ergebnisse und Diskussion 129

(z. B. nicht das Absorptionsvlies zum Probenauftrag verwenden), da sonst

schlecht oder nicht funktionierende LFA die Folge waren. Obwohl Whatman und

Millipore angaben, dass die unter Abschnitt 3.1.4 aufgeführten LFA-Materialien

direkt einsetzbar sind, wurde versucht, Proben- und Konjugatauftragsvliese mit

verschiedenen Zusammensetzungen einer Saccharose-, BSA- und Tween-20-

haltiger Pufferlösung (Abschnitt 3.1.3, aus [287, 288]) vorzubehandeln. Dies er-

wies sich nicht als vorteilhaft. Statt das Laufverhalten zu verbessern und zu stabi-

lisieren, kam es dadurch auf der Membran zu unregelmäßigen Lauffronten und

Trocknungseffekten, die die zum Teil sehr schwach vom kolloidalen Gold gefärb-

ten Linien überlagerten und schwer erkennbar machten. Das Blocken nach dem

Auftragen der TATP-OVA-Konjugat-3- und -Kaninchen-IgG-Linie (Test- und

Kontrolllinie) der noch freien Bindungsstellen auf der Membran mit Blockpuffer,

wie bei anderen Verfahren häufig notwendig, wirkte sich hingegen nicht nachtei-

lig auf das Endergebnis des LFA aus, jedoch verlangsamte sich die Geschwin-

digkeit der Lauffront merklich.

Probenauftragsvlies

Rapid27 (Whatman) (400 × vergrößert)

diagnostische Membran Immunopore RP (Whatman)

(3 000 × vergrößert)

Absorptionsvlies CF6 (Whatman)

(600 × vergrößert)

unb

en

utz

t

ben

utz

t

Abbildung 4.18: ESEM-Aufnahmen vor und nach Anwendung der LFA-Komponenten.

Während das Proben- und Konjugatauftragsvlies nach einer Befeuchtung mit

anschließender Lufttrocknung zusammengefallen war, konnte eine Veränderung

der Struktur einer bereits benutzen (oder vorbehandelten) Membran makrosko-

pisch nicht festgestellt werden. Deshalb wurden ESEM-Aufnahmen (Abbildung

4.18, Tonkurve zur Kontrastverbesserung automatisch angepasst) der drei LFA-

Komponenten vor (unbenutzt) und nach (benutzt) einem Testdurchlauf angefer-

tigt, wobei das Absorptionsvlies eine untergeordnete Rolle spielte und nur der

Vollständigkeit halber mit betrachtet wurde. Abgebildet ist nur eine Auswahl des

Materials von Whatman, aber Materialien gleichen Verwendungszweckes, auch

130 Ergebnisse und Diskussion

denen von Millipore, waren strukturell jeweils sehr ähnlich aufgebaut und verhiel-

ten sich ebenso, auch in der praktischen Anwendung. Die Porengrößen werden

für die Immunopore-RP-Nitrozellulosemembran mit 8 µm und für das Rapid27-

Proben- und Konjugatauftragsvlies mit 22 µm von Whatman [286] angegeben.

Zum Vergleich: Eine klassische Immunblot-Nitrozellulosemembran (zum Wes-

tern Blot) hat nur 0.45 µm große Poren und zeigte selbst bei 10 000 × Vergröße-

rung keine erkennbare Struktur. Mikroskopisch ist zwischen unbenutztem und

benutztem Proben- und Konjugatauftragsvlies sowie Absorptionsvlies kaum eine

Veränderung zu sehen, wohingegen die Poren der diagnostischen Membran

nach Benutzung geweitet erscheinen. Da die Benutzung bzw. Befeuchtung der

LFA-Materialien sichtbare oder im Laufverhalten wahrnehmbare Veränderungen

hervorriefen und die Vorbehandlung eher zur Verschlechterung des Assays als

zu seiner Verbesserung beitrug, wurde bei nachfolgenden Versuchen darauf ver-

zichtet. Dadurch wird außerdem bei der Durchführung, insbesondere der Vorbe-

reitung der Teststreifen, nicht nur Zeit, sondern auch Verbrauchsmaterial für Puf-

fer gespart.

Problematischer war das Auftragen der TATP-OVA-Konjugat-3- und -Kanin-

chen-IgG-Linien. Beide Proteinlösungen mussten mindestens eine Konzentration

von 0.5 mg mL-1 aufweisen, um im Verlauf des Tests zumindest ein schwach

sichtbares Signal durch die Bindung der Gold-konjugierten Antikörper hervorzu-

bringen. Daher wurden sie unverdünnt mit 6.3 mg mL-1 (OVA-Konjugat 3) bzw.

2.23 mg mL-1 (-Kaninchen-IgG) auf die Membran aufgebracht. Es wurden ver-

schiedene Methoden getestet, doch weder mit einer Glaskapillare (zerstört Ober-

fläche der Membran), noch mit einem Pinsel (dem bei Berührung mit der Memb-

ran sofort sämtliche Flüssigkeit ausgesogen wird) oder durch Aufträufeln mit ei-

ner Pipette konnten gleichmäßige Linien mit den Proteinlösungen gezogen wer-

den. Am geeignetsten erwies sich das Auftragen mit der Pipette, insbesondere

weil es ohne direkten Kontakt und damit einhergehender Verletzung der Mem-

branoberfläche auskam. Außerdem was es am besten zu dosieren und deshalb

(mit Einschränkungen) am reproduzierbarsten. Die unregelmäßigen Linien, die

nach dem Durchlauf des Assays sichtbar wurden, geben zum Teil sogar das

Tropfenmuster wieder. Als Beispiele solcher abgeschlossener TATP-LFA ist in

Abbildung 4.19 je ein Streifen aus Whatman- und einer aus Millipore-

Komponenten dargestellt. Die weinrote Färbung durch das kolloidale Gold muss-

te für den Druck durch eine automatische Bildanpassung, einen Weißabgleich

sowie eine Veränderung des Kontrasts um -50% hervorgehoben werden.

Nach dem Trocknen hafteten TATP-OVA-Konjugat 3 und -Kaninchen-IgG ir-

reversibel an der diagnostischen Membran, woraufhin der eigentliche Test begin-

nen konnte. Gold-konjugierte -Kaninchen-IgG wurden mit Kaninchen-1-Serum

(Boost 11) vorinkubiert, um indirekt über den sich bildenden Komplex den sicht-

baren Nachweis für die Bindung der Antikörper aus Kaninchen an den beiden

Testlinien zu ermöglichen. Vor dem Probenauftrag wurde der Lösung bei Kompe-

titionsversuchen noch TATP und für ein besseres Laufverhalten Tween 20 zuge-

setzt. Aufgrund des Aufbaus auf Klebeband war es nicht möglich, die Teststreifen

direkt in die Probenlösung zu tauchen, bis sich das Proben- und Konjugatauf-

Ergebnisse und Diskussion 131

tragsvlies vollgesogen hatte. Stattdessen wurden die Proben und anschließend

etwas PBS vorsichtig im Waagerechten auf das Proben- und Konjugatauf-

tragsvlies pipettiert, wobei darauf geachtet werden musste, dass der Flüssigkeits-

film nicht über die Membran läuft, sondern durch die Kapillarkräfte von selbst

wandert. Nach 5-10 min erreichte die Lauffront das Absorptionsvlies und auf der

Membran waren die beiden Proteinlinien angefärbt.

A

Probenauftrag diagnostische Membran Absorption

Whatman Rapid 27 Immunopore RP CF6

0.5 cm

TATP-OVA-Konjugat -Kaninchen-IgG

B

Millipore Hi-FlowG041 HF120 Hi-Flow C083

0.5 cm

TATP-OVA-Konjugat -Kaninchen-IgG

Abbildung 4.19: LFA für TATP mit Komponenten von Whatman (A) und Millipore (B).

Das Eintrocknen der Probenlösung (ohne den Analyten) auf dem Proben- und

Konjugatauftragsvlies, wie es bei solchen Test üblich ist, ging mit einem Verlust

der Farbintensität der Testlinien einher, ließ aber die Lagerung der Membranen

bei Raumtemperatur zu. Zum Ausgleich könnten die Probelösungen jedoch kon-

zentrierter eingesetzt werden, da beispielsweise – deutlich sichtbar durch die zart

rote Färbung des Proben- und Konjugatauftragsvlies – viele Antikörper dort zu-

rück blieben. Ähnliches wurde auch mit dem vorgefertigten, Gold-konjugierten

Protein-A-getränkten Vlies (Protein A Tell-Tale Gold ribbon) beobachtet, das ei-

nen Teil seiner Färbung nach dem Testdurchlauf behielt. Das Protein A trat an

die Stelle des Gold-markierten -Kaninchen-IgG und sollte ganz ähnlich wie die-

ses die Antikörper aus Kaninchen binden, jedoch blieb hier die Färbung der

TATP-OVA-Konjugat-3-Linie auf der Membran aus. Es ist nicht auszuschließen,

dass die Komplexbildung zwischen dem Gold-konjugierten Protein A und den

Antikörpern aus dem Serum mehr Zeit gebraucht hätte, wie von Klewitz [287] für

den Komplex aus einem monoklonalen Botulinum-Neurotoxin-Antikörper, Gold-

konjugiertem -IgG und Botulinum-Neurotoxin beschrieben. Die Färbung der

-Kaninchen-IgG-Linie kann unspezifisch durch die direkte Bindung des Gold-

konjugierten Protein A an den sekundären Antikörper erfolgt sein.

Das Testsystem des LFA ist ähnlich dem indirekten TATP-ELISA aufgebaut,

wobei das -Kaninchen-IgG zusätzlich als Kontrolle diente, an der nicht nur

TATP-Antikörper sondern sämtliche Antikörper aus dem Kaninchenserum bin-

den. Als Negativkontrolle wurde zum einen nur Gold-konjugiertes -Kaninchen-

IgG ohne Kaninchenserum aufgetragen, welches keine Färbung der Proteinlinien

auf der Membran auslöste und bis in das Absorptionsvlies gelangte. Dieses er-

hielt dadurch eine schwache Rotfärbung. Als zweite Negativkontrolle wurden

polyklonale TNT-Antikörper aus Kaninchen [289] statt der TATP-Antikörper ver-

wendet, mit denen die Färbung der TATP-OVA-Konjugat-3-Linie ausblieb, aber

132 Ergebnisse und Diskussion

die Linie mit -Kaninchen-IgG sichtbar wurde. Obwohl weder die Gold-markierten

IgG noch andere Antikörper als solche gegen TATP oder weitere Bestandteile

der Kaninchenseren unspezifische Bindungen auf der Membran verursachten,

konnte bislang selbst mit 50 mg L-1 TATP in dem Antikörper-Konjugationsmix der

Probenlösung keine Kompetition beobachtet werden. Dazu trugen zwei Faktoren

ausschlaggebend bei: Die unregelmäßigen Proteinlinien und das indirekte Test-

format. Gleichmäßige Linien, insbesondere des TATP-OVA-Konjugat 3 sind un-

entbehrlich, selbst wenn der Teststeifen elektronisch über ein LFA-Kolorimeter

ausgewertet wird. Das manuelle Auftragen der Linien führte allein schon zu In-

tensitätsschwankungen, die die Identifizierung einer eventuellen Kompetition

nicht erlaubten. Hinzu kommt, dass das indirekte Testformat, wenn überhaupt,

nur bei sehr hohen TATP-Konzentrationen die Färbung der TATP-OVA-

Konjugat-3-Linie vollständig unterdrückt und dass geringe Konzentrationen nur

eine sehr geringe Erniedrigung des Signals bewirken. Des Weiteren könnte auch

die Tatsache, dass mit unaufgereinigtem Serum gearbeitet wurde, einen negati-

ven Einfluss auf den Testverlauf, vor allem auf die insgesamt relativ schwache

Färbung der Linien ausgeübt haben. Die TATP-Antikörperkonzentration könnte

zu gering sein und müsste durch eine selektive Aufreinigung verbessert werden.

Die gleichen Gründe lassen auch keine Aussage über den Einfluss von

Tween 20 und BSA bzw. Casein auf den Assay zu, denn Unterschiede mit diesen

Zusätzen oder ohne sie konnten nicht eindeutig festgestellt werden.

Auch wenn abschließend noch kein funktionsfähiger TATP-LFA präsentiert

werden kann, so konnten doch innerhalb von nur wenigen Wochen einige Er-

kenntnisse erlangt und erste vielversprechende Tests durchgeführt werden. Das

vorgestellte Konzept des LFA für TATP scheint realisierbar, doch ehe weitere

Optimierungen folgen können, muss die reproduzierbare Auftragung der TATP-

OVA-Konjugat-3- und -Kaninchen-IgG-Linie gewährleistet werden. Dazu wird

ein automatisches Dosiersystem notwendig sein, das ähnlich einem Tintenstrahl-

drucker die Proteinlösungen aufsprüht, so dass berührungslos gleichmäßige Li-

nien entstehen. Die Membranen und Vliese der verschiedenen Hersteller sind

derart ausgereift, dass kein Blocken oder sonstige Vorbehandlung notwendig ist.

Es werden stets größere Proteinmengen als z. B. für einen ELISA erforderlich

sein, da die Auswertung der Tests typischerweise ohne signalverstärkende Effek-

te (durch beispielsweise Enzyme) und rein visuell erfolgt. Dafür ist ein LFA sehr

schnell (5-10 min) in der Durchführung, einfach zu handhaben und das Ergebnis

in der Regel auch ohne ein spezielles Auslesegerät (zumindest qualitativ) ables-

bar. Für den hier entworfenen TATP-LFA würde sich jedoch ein Messinstrument

zur Auswertung anbieten, um mit Hilfe einer (abgespeicherten) TATP-

Kalibriergeraden auch eine quantitative Aussage des kompetitiven Assays zu

erhalten. Insbesondere unerfahrene Anwender verwirrt zudem das umgekehrt zur

TATP-Konzentration proportionale Signal, welches dann benutzerfreundlich in

eine elektronische Anzeige umgewandelt werden kann. Ein klassischer, soge-

nannter Sandwich-Assay, der nicht kompetitiv arbeitet und nur zwischen positiv

und negativ entscheiden muss, wie bei einem handelsüblichen Schwanger-

schaftstest, ist für TATP nicht möglich. Denn im Gegensatz zu der in Abschnitt

4.6 bei den Untersuchungen zur Kreuzreaktivität als vorteilhaft beschriebenen

Ergebnisse und Diskussion 133

Eigenschaft von TATP, dass es Antikörpern nur ein Epitop zur Verfügung stellt,

verhindert genau diese Eigenschaft nun den Aufbau eine Sandwich-Formats.

Dafür wäre ein zweiter Antikörper notwendig, der ein anderes Epitop als der erste

bindet.

135

Das primäre Ziel dieser Arbeit konnte mit der erfolgreichen Herstellung der ersten

Antikörper gegen Triacetontriperoxid (TATP) erreicht werden. Dieses Ergebnis

lässt sich auch grafisch in Abbildung 5.2 für die Immunisierung der beiden Spe-

zies, Maus und Kaninchen, zusammenfassen. Ausgehend von der gelungenen

Synthese eines carboxylierten Derivats des TATP – dem TATP-Hapten

(Abbildung 5.1) – das eine durch NMR- und Einkristallstrukturanalysen verifizier-

te, nahezu identische Ringstruktur zu TATP aufweist, konnten TATP-

Immunogene erzeugt werden. Mit diesen TATP-BSA-Konjugaten wurden Mäuse

und Kaninchen immunisiert. Die auf diese Weise erhaltenen polyklonalen TATP-

Antikörper wurden insbesondere auf ihre analytischen Kenndaten hin charakteri-

siert, wobei sich herausstellte, dass das Potenzial der Antikörper aus Kaninchen

weit über denen aus Mäusen lag.

Abbildung 5.1: Kugel-Stab-Modell des TATP-Haptens.

Mittels ELISA wurden die Immunisierungsverläufe verfolgt. Beispielkurven für die

Seren von Kaninchen 1 (Boost 11) und Maus 3 (Boost 8) sind in Abbildung 5.2

gegeben und machen auch die enormen Unterscheide zwischen den zwei Säu-

getierarten erkenntlich. Am Ende der Immunisierungen wurden für die Seren der

beiden Kaninchen Affinitäten von etwa 1 × 109 L mol-1 ermittelt, wohingegen

Maus-3-Serum nur eine Affinität von knapp 0.2 × 106 L mol-1 erlangte. Dieser

Unterschied um den Faktor 5 000 wirkte sich auch direkt auf die Nachweisgrenze

aus, die mit Kaninchenserum ca. 0.01 µg L-1 betrug, während mit Serum von

Maus 3 lediglich 50 µg L-1 erreicht werden konnten. Trotz ihrer großen Differen-

zen bezüglich der Empfindlichkeit erwiesen sich die polyklonalen Antikörper bei-

136 Zusammenfassung und Ausblick

der Spezies als hoch selektiv gegenüber TATP, da keine relevante Kreuzreaktion

festgestellt wurde.

Abbildung 5.2: Vergleich der Kaninchen- und Mausserum-ELISA-Kurven.

Die Antikörper aus der Maus stünden – wenn sie in ausreichender Menge vorlä-

gen - zur Anwendungen im Bereich der Affinitätsreinigung zur Verfügung, da ihre

geringere Affinität eine schnellere Reversibilität der Antikörperbindung zulässt.

Die TATP-Antikörper, die aus den Kaninchen gewonnen wurden, sind hingegen

hervorragend zur Spurenanalytik einsetzbar, wie mittels ELISA gezeigt wurde.

Analysen von Realproben stehen jedoch noch aus. Zwar wurde z. B. der Einfluss

von etwaigen Kreuzreaktanden sowie von BSA und Tween 20 untersucht, aber

Effekte komplexer Matrizes können nicht gänzlich ausgeschlossen werden, zu-

mal die Toleranz der TATP-ELISA gegenüber Lösungsmitteln eher gering war.

Wenngleich mit den polyklonalen Antikörpern aus Kaninchen überzeugende Re-

sultate erzielt wurden und sich die Affinität und Kreuzreaktivität zwischen po-

lyklonalen und monoklonalen Antikörpern nicht wesentlich unterscheiden sollten,

so werden auf lange Sicht sicherlich monoklonale Antikörper wegen ihrer besse-

ren Reproduzierbarkeit und Vermarktungsmöglichkeiten das analytische Werk-

zeug der Wahl bleiben. Es wird jedoch erst seit wenigen Jahren auch vermehrt

(kommerziell) die Herstellung monoklonaler Antikörper von Kaninchen über die

Hybridomtechnik angeboten, was momentan ein noch kostspieligeres Verfahren

als mit dem verbreiteten Weg über die Immunisierung von Mäusen ist.

Obwohl der TATP-ELISA ausgezeichnet funktioniert, ist seine Anwendung auf

entsprechend ausgerüstete Labore mit Fachpersonal beschränkt. Außerdem sind

ELISA eine schnelle Methode bei Hochdurchsatzuntersuchungen, jedoch bei

Einzelproben verhältnismäßig zeitaufwendig. Der hier noch in den Anfängen ste-

ckende TATP-LFA mit kolloidalem Gold als visuelle Anzeige ist schon ein erster

Ansatz zu einem praxistauglichen Schnelltest, der ohne bioanalytische Kenntnis-

se etwa von der Polizei oder Kontrolleuren am Flughafen als Wischtest ange-

0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1E4 1E5

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Kaninchen

Maus

Extinktion ( =

450 n

m)

TATP [µg L-1]

0

Zusammenfassung und Ausblick 137

wandt werden könnte. Wird der LFA weiterentwickelt, so ließe sich TATP damit

sogar quantitativ nachweisen und das Ergebnis könnte von einem Digitaldisplay

abgelesen werden. Mittlerweile konnten Climent et al. [326] mit den in dieser Ar-

beit hergestellten polyklonalen TATP-Antikörpern sehr erfolgreich ein LFA basie-

rend auf der Antikörper-kontrollierten Farbstofffreisetzung aus mesoporösen

Komposit-Nanopartikeln aufbauen. Die Durchführung dieses Tests nimmt nur

zwei bis zehn Minuten in Anspruch, jedoch ist seine Empfindlichkeit etwa

1 000-fach schlechter als die des ELISA mit den gleichen Antikörpern. Daneben

stehen die TATP-Antikörper aber auch zum Einsatz in anderen schnellen und

tragbaren Nachweissystemen bereit. Es gibt inzwischen ein weites Feld an Bio-

sensoren, deren Selektivität und Empfindlichkeit auf Antikörpern beruhen, die

beispielsweise an den Sensoroberflächen gebunden wurden. Außerdem sind

Multi-Analyt-Systeme denkbar, bei denen z. B. durch die Markierung von Antikör-

pern gegen verschiedene Explosivstoffe mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstof-

fen gleich mehrere Explosivstoffe parallel identifiziert oder ausgeschlossen wer-

den können (Multiplexing), was für die Beurteilung von Gefahrenlagen sowie Ent-

sorgungsstrategien entscheidend ist.

Die beiden in dieser Arbeit beschriebenen TATP-Assays erfordern zwingend

ein Arbeiten in wässrigen Lösungen. Interessanter wäre jedoch ein Nachweis

direkt aus der Luft. Da TATP einen so hohen Dampfdruck hat, wodurch auch ein

Eindampfen zur Aufkonzentrierung von Lösungen nicht möglich ist, sollte das

enorme Potenzial der Gasphasenanalytik bei TATP auch ausgenutzt werden.

Dies mit Antikörpern, die ein wässriges Milieu unter physiologischen Bedingun-

gen benötigen, ohne oder nur mit geringen Qualitätsverlusten zu bewerkstelligen,

wird eine Aufgabe für die Zukunft sein.

139

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i

Aus der vorliegenden Arbeit ging eine Patentanmeldung beim Deutschen Patent-

und Markenamt hervor:

DE 10 2009 002 652 A1. Triacetontriperoxid und Diacetondiperoxid-Derivat

Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung. Walter A, Schneider R,

Weller MG. Patentanmeldung: 27. April 2009, Offenlegung: 28. Oktober 2010.

Daraus folgten Nachmeldungen beim europäischen Patentamt sowie beim US-

amerikanischen Patent- und Markenamt:

EP 2 246 342 A2. Triacetontriperoxid und Diacetondiperoxid-Derivat, Verfahren

zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung/Triacetone triperoxide and diace-

tone diperoxide derivative, method for their manufacture and their applicati-

on/Dérivés de tri-péroxyde de tri-acétone et de di-péroxyde de di-acétone, pro-

cédé destiné à leur fabrication et leur utilisation. Walter A, Schneider R, Weller

MG. Patentanmeldung: 16. April 2010, Offenlegung: 3. November 2010.

US 2010/0273193 A1. Triacetone triperoxide and diacetone diperoxide deriva-

tives, Method for the preparation and use thereof. Walter A, Schneider RJ,

Weller MG. Patentanmeldung: 26. April 2010, Offenlegung: 28. Oktober 2010.

Des Weiteren wurden im Rahmen der Promotion nachstehende Zeitschriftenarti-

kel veröffentlicht:

Walter MA, Pfeifer D, Kraus W, Emmerling F, Schneider RJ, Panne U, Weller

MG. Triacetone triperoxide (TATP): Hapten design and development of anti-

bodies. Langmuir. 2010;26(19):15418-23.

Walter MA, Panne U, Weller MG. A novel immunoreagent for the specific and

sensitive detection of the explosive triacetone triperoxide (TATP). Biosensors.

2011;1(3):93-106.

Carvalho JJ, Walter MA, Baermann-Stapel Y, Weller MG, Panne U, Schenk JA,

Schneider RJ. Non-invasive monitoring of immunization progress in mice via

IgG from feces. In Vivo. 2012;26(1):63-9.

Climent E, Gröninger D, Hecht M, Walter MA, Martínez-Máñez R, Weller MG,

Sancenón F, Amorós P, Rurack K. Selective, sensitive, and rapid analysis with

lateral-flow assays based on antibody-gated dye-delivery systems: The

example of triacetone triperoxide. Chemistry - A European Journal.

2013;19(13):4117-22.

ii Publikationen

Daneben folgten Beiträge zu Vorträgen:

Rurack K, Biyikal M, Walter MA, Ramin S, Weller MG. Biological and biomimet-

ic approaches toward the Ddetection of nitro- and peroxide-based explosives.

International Workshop on Explosives Detection 2010. Valencia, Spanien, 2010

Nov 25.

Weller MG, Walter MA, Ramin S. Detection of explosives by bioanalytical tech-

niques. Potsdam Days on Bioanalysis. Potsdam, 2011 Nov 9-10.

sowie Poster:

Kraus W, Walter MA, Emmerling F, Schneider RJ, Weller MG, Panne U. Tri-

acetone triperoxide hapten structure for the development of antibodies.

Crystals, Minerals, and Materials. Salzburg, Österreich, 2011 Sep 20-24.

Berlin, 21. November 2013

iii

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter

Verwendung der angegebenen Quellen, Hilfen und Hilfsmittel angefertigt habe.

Ich erkläre, dass ich mich nicht bereits anderwärts um einen Doktorgrad bewor-

ben habe bzw. einen entsprechenden Doktorgrad besitze und diese Arbeit in

dieser oder anderer Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt wur-

de. Der Inhalt der dem angestrebten Verfahren zugrunde liegenden Promotions-

ordnung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-

Universität zu Berlin vom 01. September 2005 ist mir bekannt.

Astrid Walter

Berlin, 21. November 2013