DIPLOMARBEIT - univie.ac.at · Karl-Franzens-Universität Graz Institut für Pharmazeutische...

Karl-Franzens-Universität Graz

Institut für Pharmazeutische Wissenschaften

Bereich Pharmakognosie

DIPLOMARBEIT

Phytochemische Untersuchung von Drimys winteri

(Winteraceae) und Talauma gloriensis (Magnoliaceae),

sowie von Tilletia spp. (Zwergsteinbrand, Brandpilze)

Zur Erlangung des akademischen Grades einer Magistra der Pharmazie an der

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl-Franzens-Universität Graz

eingereicht bei Univ.-Prof. Dr. Rudolf Bauer

vorgelegt von

Gröblacher Barbara

Graz, Juni 2008

Die vorliegende Diplomarbeit entstand im Zeitraum von November 2007 bis Juni

2008 am Institut für pharmazeutische Wissenschaften der Karl-Franzens-Universität

Graz im Bereich Pharmakognosie unter der Leitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. Rudolf

Bauer, dem ich an dieser Stelle für die Diplomarbeitsstelle und die Betreuung meiner

Arbeit danken möchte.

Mein ganz besonderer Dank geht an Dr. Wolfgang Schühly, der mir stets mit guten

Ratschlägen und Anleitungen sowohl in der Theorie als auch im praktischen Bereich

hilfreich zur Seite stand.

Ebenso möchte ich Dr. Olaf Kunert aus dem Bereich der pharmazeutischen Chemie

für die Durchführung der NMR-Messungen sowie der Hilfe bei deren Auswertung

danken.

Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. Herbert Huss für die Anregung Tilletia zu

untersuchen sowie für die Bereitstellung des Drogenmaterials.

Weiters danke ich Dr. Sara Crockett und Dr. Wolfgang Schühly für das Sammeln von

Drimys und Talauma sowie für die Bereitstellung des Drogenmaterials. In ihrem

Namen möchte ich mich auch bei Mag. Eva Schembera, (Station La Gamba, Golfito,

in Costa Rica) für ihre Unterstützung beim Sammeln von Talauma im Urwald von

Costa Rica und bei Dr. Barry Hammel vom INBio (Instituto Nacional de

Biodiversidad) in Costa Rica für die logistische Hilfe bei der Planung der

Sammelexkursion sowie dem INBio selbst für die Benutzung von Herbarium und

Bibliothek bedanken. Die Herbarbelege von Drimys und Talauma sind ebenfalls im

INBio in Santo Domingo, Costa Rica, hinterlegt. Für das verwendete

Pflanzenmaterial liegt eine Sammel- und Exporterlaubnis vor.

Ein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden, die mich

während meines Studiums immer unterstützt haben.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ........................................................................................1

2. Allgemeiner Teil ..............................................................................2

2.1 Drimys winteri .............................................................................................2

2.1.1 Allgemeines ...........................................................................................2

2.1.2 Taxonomie.............................................................................................2

2.1.3 Familie der Winteraceae........................................................................2

2.1.4 Pharmakologische Wirkungen ...............................................................5

2.1.5 Anwendung............................................................................................6

2.2 Talauma gloriensis .....................................................................................7

2.2.1 Allgemeines ...........................................................................................7

2.2.2 Taxonomie.............................................................................................7

2.2.3 Familie der Magnoliaceae......................................................................8

2.2.4 Anwendung..........................................................................................10

2.3 Tilletia caries und Tilletia controversa....................................................11

2.3.1 Allgemeines .........................................................................................11

2.3.2 Taxonomie...........................................................................................11

2.3.3 Die Brandpilze .....................................................................................12

2.3.4 Pathogenese der Brandpilze ...............................................................12

2.3.5 Gattung Tilletia.....................................................................................13

3. Spezieller Teil mit Ergebnissen....................................................15

3.1 Strukturaufklärung der isolierten Substanzen .......................................15

3.2 Drimys winteri ...........................................................................................15

3.2.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes..........................................15

3.2.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktion........................................16

3.2.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen .......................17

3.2.3.1 Fraktion DWR_V1.........................................................................17

3.2.3.2 Fraktion DWR_V2.........................................................................19

3.2.3.3 Fraktion DWR_V10.......................................................................20

3.2.3.4 Fraktion DWR_V12_P1 ................................................................22

3.2.3.5 Fraktion DWR_V12_P2 ................................................................23

3.2.3.6 Fraktion DWR_V12_P3 ................................................................25

Inhaltsverzeichnis

II

3.2.3.7 Fraktion DWR_V12_P4 ................................................................26

3.2.3.8 Fraktion DWR_V17.......................................................................27

3.2.3.9 Fraktion DWR_V18_P3 ................................................................29

3.2.3.10 Fraktion DWR_V19_P6 ................................................................31

3.2.4 Diskussion und Schlussfolgerung........................................................33

3.3 Talauma gloriensis ...................................................................................34

3.3.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes..........................................34

3.3.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktionen des Extraktes .............34

3.3.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen .......................35

3.3.3.1 Fraktion TGB_S1..........................................................................35

3.3.3.2 Fraktion TGB_S2..........................................................................36

3.3.3.3 Fraktion TGB_S10_P2 .................................................................38

3.3.3.4 Fraktion TGB_S10_P3 .................................................................40

3.3.3.5 Fraktion TGB_S12_P1 .................................................................43

3.3.3.6 Fraktion TGB_S12_P2 .................................................................45

3.3.3.7 Fraktion TGB_S12_P3 .................................................................47

3.3.4 Vergleich von TGB_S10_P2 und TGB_S10_P3..................................49

3.3.5 Vergleich von TGB_S12_P1 und TGB_S12_P3..................................51



3.4.1 Extraktion.............................................................................................54

3.4.2 Tilletia caries........................................................................................54

3.4.2.1 Aufarbeitung der Extrakte.............................................................54

3.4.3 Tilletia controversa...............................................................................55

3.4.3.1 Aufarbeitung der Extrakte.............................................................55


4. Experimenteller Teil ......................................................................57

4.1 Material, Methoden und Geräte ...............................................................57

4.1.1 Dünnschichtchromatographie (DC)......................................................57

4.1.2 Präparative Dünnschichtchromatographie...........................................57

4.1.3 Klassische Säulenchromatographie (SC) ............................................57

4.1.4 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ....................................58

4.1.4.1 Analytische HPLC.........................................................................58

4.1.4.2 Präparative HPLC.........................................................................58

Inhaltsverzeichnis

III

4.1.4.3 Semipräparative HPLC.................................................................59

4.1.5 Reversed Phase (RP) - Festphasenextraktion (SPE®) ........................59

4.1.6 Fast Centrifugal Partition Chromatography - FCPC® ...........................59

4.1.7 LC-MS .................................................................................................60

4.1.8 GC-MS.................................................................................................60

4.1.9 NMR-Spektroskopie.............................................................................61

4.1.10 Circulardichroismus .............................................................................61

4.2 Drimys winteri ...........................................................................................61

4.2.1 Pflanzenmaterial ..................................................................................61

4.2.2 Extraktion.............................................................................................61

4.2.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes ...........................................61

4.2.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen ................................................63

4.3 Talauma gloriensis ...................................................................................65


4.3.2 Extraktion.............................................................................................65

4.3.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes ...........................................66

4.3.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen ................................................67



4.4.2 Extraktion.............................................................................................69

4.4.3 Tilletia caries........................................................................................70

4.4.3.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes....................................70

4.4.3.2 Aufarbeitung des Methanolextraktes ............................................70

4.4.3.3 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes........................................71

4.4.4 Tilletia controversa...............................................................................71

4.4.4.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes....................................71

4.4.4.2 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes........................................73

5. Zusammenfassung .......................................................................76

6. Literaturverzeichnis ......................................................................79

7. Abbildungsverzeichnis.................................................................83

8. Tabellenverzeichnis ......................................................................86

Einleitung

1

1. Einleitung

Tilletia caries und Tilletia controversa (Basidiomycota) werden unter dem

Organisationstyp der Brandpilze zusammengefasst, da die befallenen Pflanzenteile

wie durch Brand zerstört aussehen. Es wurde angenommen, dass Tilletia caries und

Tilletia controversa ebenso wie der Pilz Claviceps purpurea (Ascomycetes), der

vorwiegend im Roggen die Bildung von Sklerotien und somit des Mutterkorns, Secale

cornutum, bewirkt, die Produktion von Alkaloiden hervorrufen. Ziel war es, die

Alkaloidführung zu überprüfen und die Substanzen gegebenenfalls zu isolieren.

Weiters wurde die Rinde einer costaricensischen Pflanze namens Drimys winteri, die

in die Familie der Winteraceae eingeordnet wird, phytochemisch untersucht.

Besonders charakteristisch für diesen Baum, der auch als magellanischer Zimt

bezeichnet wird, sind die pfeffrig und würzig schmeckenden Rinden und Blätter, die

in der südamerikanischen Volksheilkunde Verwendung finden. Bevorzugt wird die

Rinde zur Behandlung verschiedenster Erkrankungen wie Magenbeschwerden,

Krebs, Schmerzen etc. eingesetzt. Von Interesse war es, die für die Wirkung

verantwortlichen Inhaltsstoffe herauszufinden. Das Ziel bestand darin, die zum Teil

schon bekannten Inhaltsstoffe sowie noch unbekannte Inhaltsstoffe zu isolieren und

in weiterer Folge auch zu identifizieren.

Zusätzlich sollten die Blätter einer aus Costa Rica stammenden

Tieflandregenwaldart, die den Namen Talauma gloriensis trägt und der Familie der

Magnoliaceae angehört, phytochemisch untersucht werden. Zahlreiche verwandte

Arten werden in der Volksmedizin z.B. in Mexiko und Brasilien als Arzneimittel

genutzt. Über die Inhaltsstoffe von Talauma gloriensis war allerdings bis heute nichts

bekannt. Ziel war es daher, diese unbekannten Verbindungen zu isolieren und im

Anschluss daran deren Struktur aufzuklären.

Allgemeiner Teil

2

2. Allgemeiner Teil

2.1 Drimys winteri

2.1.1 Allgemeines

Drimys winteri (L.f.) PITTIER ist auch unter den Synonymen Drimys granadensis L.f.

bzw. Drimys winteri var. granadensis (L.f.) PITTIER

bekannt.

Der botanische Gattungsname Drimys leitet sich

vom griechischen Wort drimys (δριµύς) ab und

bedeutet soviel wie stechend, scharf, herb, was

vermutlich auf den Geschmack der Blätter und

Rinden zurückzuführen ist.

Abb. 1 Drimys winteri

2.1.2 Taxonomie

Abteilung Spermatophyta

Unterabteilung Magnoliophytina (= Angiospermae)

Klasse Magnoliopsida

Unterklasse Magnoliidae

Ordnung Canellales

Familie Winteraceae

Gattung Drimys

Art Drimys winteri (L.f.) PITTIER

2.1.3 Familie der Winteraceae

Die Familie umfasst aromatische, immergrüne Bäume oder Sträucher, deren Hölzer

keine Gefäße aufweisen, sodass sie möglicherweise die ursprünglichsten aller

Blütenpflanzen darstellen.

Generell ist die Familie in den Bergen und eher kühl temperierten Regionen der

Tropen und Südtropen zu finden. In Amerika wird sie durch die Gattung Drimys

vertreten, die sich vom Süden Mexikos nach Guayana, Brasilien, Kap Horn bis auf

die Juan-Fernandez-Inseln erstreckt. Die übrigen Gattungen sind von Neuseeland

Allgemeiner Teil

3

und Tasmanien über Australien und Neukaledonien bis zu den Salomoninseln, auf

Borneo und den Phillipinen vertreten. Selbst auf Madagaskar wurde eine Art

entdeckt. Insgesamt werden der Familie rund 70 verschiedene Arten zugeordnet.

(Heywood et al., 2007)

Abb. 2 Verbreitungskarte der Winteraceae

Die wichtigsten Merkmale der Winteraceae sind der pfeffrige Geschmack der Rinden

und Blätter, das primitive und gefäßlose Holz und die meist zwittrigen Blüten mit

wenig differenzierten Staubblättern. Aber auch der monoporate Pollen, die freien

griffellosen Fruchtblätter mit zum Teil als Narben ausgebildeten Rändern und die

anatropen Samenanlagen stellen besondere Kennzeichen dieser Familie dar.

(Heywood u. Goaman, 1982) Charakteristisch ist auch der Kelch, der bei allen Arten

der Winteraceae eine tubuläre Haube (Calyptra) formt, die die Knospe, wenn auch

nur für eine kurze Zeit während der Entwicklung, gänzlich umschließt (Doust, 2000 u.

Nandi et al., 1998). Die Blätter sind einfach, immergrün, ledrig, ungeteilt, ganzrandig

und wechselständig angeordnet, wobei Nebenblätter gänzlich fehlen. An ihrer

Unterseite sind sie mit einer Wachsschicht überzogen, die zu einer Verstopfung der

Spaltöffnungen führt. Ein auffallendes Charakteristikum sind die aus zwei Zelltypen

bestehenden Markstrahlen, das langgestreckte Kambium sowie das gefäßlose Holz,

an dessen Stelle Spiraltracheiden stehen. Die zwittrigen, teils auch

eingeschlechtlichen Blüten stehen vorwiegend in Büscheln oder Zymen. Ihre Organe

sind hauptsächlich frei, spiralig angeordnet und von unbestimmter Anzahl. Einen

Unterschied zwischen den Kelch- und Kronblättern gibt es allerdings kaum. Die

kurzen und blattartigen Staubblätter tragen seitliche oder apikale Pollensäcke, die

Fruchtblätter sind frei, gestielt und besitzen längs der Öffnung zwei parallele

Narbensäume mit Papillen. Bei den Früchten handelt es sich vorwiegend um

Sammelfrüchte mit beerenartigen Teilfrüchten. (Heywood u. Goaman, 1982)

Allgemeiner Teil

4

Abb. 3 Drimys winteri a.) Habitus b.) Frucht

Folgende Inhaltsstoffgruppen konnten bereits aus den Blättern oder der Rinde isoliert

werden:

Sowohl in den Rinden als auch in den Blättern ist in größeren Mengen ätherisches

Öl, das aus Mono- und Sesquiterpenen besteht, und eine Reihe von bicyclischen

Sesquiterpenen mit Drimangerüst enthalten.

Sesquiterpene stellen die umfangreichste Gruppe der Terpene dar. Ihr

Kohlenstoffskelett besteht aus 15 C-Atomen, die sich in drei Isoprene zerlegen

lassen (regulär gebaute Sesquiterpene) und deren Grundstruktur als 2,6,10-

Trimethyl-n-dodecan bezeichnet wird. Vielfach aber lässt sich durch Wanderung von

Methylgruppen (Pseudoguajane) oder durch sekundäre Spaltung von Ringen

(Xanthane) kein regulärer Aufbau mehr erkennen (irregulär gebaute Sesquiterpene).

Es gibt auch die Möglichkeit, dass Zimtsäurederivate über ihre Carboxylgruppe mit

einem Sesquiterpenalkohol verestert sind. (Hänsel u. Sticher, 2007)

Das Vorkommen von Sesquiterpenen mit Drimangerüst ist eher selten und nur aus

den Familien der Winteraceae, der Canellaceae und der Polygonaceae bekannt

(Hegnauer, 1973).

Abb. 4 Drimangrundgerüst

Beispiele einiger Sesquiterpene mit Drimangerüst, die bereits aus Drimys-Arten

isoliert wurden:

Allgemeiner Teil

5

CH3

H3C

H

OHO

CH3

H

OH

CH3

H3C

H

OHO

CH3

H

H

Abb. 5 Warburganal Abb. 6 Polygodial

O

O CH3

H3C

H

OHO

CH3

H

H

H3CO

O

O CH3

H3C

H

OHO

CH3

H

H

HO

Abb. 7 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial Abb. 8 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial

In der Literatur sind noch weitere Inhaltsstoffe angeführt: So konnten in den Blättern

und Rinden saponinartige Stoffe nachgewiesen werden. Der Gehalt an

Gerbstoffen in den Rinden ist aber eher gering. Außerdem sind in den Blättern

Flavonoide zu finden, aber auch cyanogene Verbindungen, deren phytochemische

Untersuchung noch aussteht, sollen vorkommen. Weiters wird angenommnen, dass

vor allem in jungen Blättern Substanzen enthalten sind, die eine digitalisähnliche

Wirkung hervorrufen. (Hegnauer, 1973) Ein entsprechender Nachweis für die

digitalisähnliche Wirkung wurde jedoch von Jaretzky u. Lier bereits im Jahr 1938

widerlegt.

2.1.4 Pharmakologische Wirkungen

In vorklinischen Studien zeigte ein wässrig-alkoholischer Extrakt von Drimys winteri

antiasthmatische, antiallergische, antiinflammatorische und auch antinoziceptive

Wirkungen (Filho et al., 1998). Für die Wirkung sind in erster Linie Sesquiterpene

vom Driman-Typ verantwortlich, die ein breites Wirkungsspektrum aufweisen. So

sollen sie antibakterielle, antifugale, insektizide, cytotoxische, moluscizide Wirkung

besitzen und auch an der Regulation des Pflanzenwachstums beteiligt sein.

(Rodrίguez et al., 2005) Zu diesen Verbindungen zählen u. a. das Warburganal,

Polygodial, 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial, und das 1-β-(p-Cumaroyloxy)-

polygodial.

Allgemeiner Teil

6

Polygodial und 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial führen bei Mäusen zur

Schmerzhemmung bei abdominalen Kontraktionen, die durch Essigsäure

hervorgerufen werden. Im Vergleich mit zwei allseits bekannten entzündungs- und

schmerzhemmenden Arzneimitteln wie Aspirin und Acetaminophen erzielten sie eine

größere Wirksamkeit. (Filho et al., 1998) In einer fortführenden Untersuchung wurde

bestätigt, dass Polygodial sowie 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial und 1-β-(p-

Cumaroyloxy)polygodial auch eine antifungale Wirkung gegen Epidermophyton

floccosum und Tricophyton rubrum ausüben (Malheiros et al., 2004). Polygodial

zeigte auch antibiotische Wirksamkeit gegen Candida albicans (McCallion et al.,

1982). Das bicylische Sesquiterpen Warburganal ist aufgrund seiner zytotoxischen,

antifungalen und antibiotischen Wirkungen bekannt. Es wirkt als Insektizid gegen

Spodoptera littoralis und Spodoptera exempta und soll auch in der Regulation des

Pflanzenwachstums eine Rolle spielen. (Kubo et al., 1977)

2.1.5 Anwendung

Die Rinde von Drimys winteri wird unter dem Namen Winterianae cortex (Synonyme:

Cortex Winteriani veri, Cortex Winteriani aromatici, Cortex Winterianae, Cortex

winteri, Cortex Magellanici, Cinnamonum magelannicum) medizinisch eingesetzt. Sie

wird außerdem als echte Wintersrinde (Synonyme: Magalhaesischer Zimt,

Magellanischer Zimt) bezeichnet. Zum Einsatz kommt die vom Stamm oder stärkeren

Ästen gewonnene, getrocknete Rinde. (Hiller u. Melzig, 1999) Diese wurde bereits im

16. Jahrhundert von Seefahrern zur Vorbeugung von Skorbut eingesetzt (Heywood

et al., 2007).

In der Volksmedizin wird sie zur Behandlung verschiedener Erkrankungen wie bei

Geschwüren, Krebs, Schmerzen, Anfälligkeiten im Bereich des Bronchialtraktes

sowie als Ersatz für Chinin bei Malaria angewendet (Filho et al., 1998). Des Weiteren

wird sie in der südamerikanischen Volksheilkunde bei Zahnschmerzen,

Magenbeschwerden und Dermatiden verwendet. Im Haushalt dient sie als Gewürz

und zum Aromatisieren von Likören. (Hiller u. Melzig, 1999)

Allgemeiner Teil

7

2.2 Talauma gloriensis

2.2.1 Allgemeines

Talauma gloriensis PITTIER wurde in neuerer Zeit aufgrund molekulargenetischer

Untersuchungen zu Magnolia gloriensis (PITTIER) GOVAERTS umbenannt (Frodin u.

Govaerts, 1996). In der aktuellen Ausgabe des „Manual de Plantas de Costa Rica“

jedoch wird mit Rücksicht auf die Fruchtmorphologie und den ökologischen Standort

(Talauma ist eine Tieflandregenwaldart) der Name Talauma gloriensis beibehalten

(Hammel et al., 2007).

Im Azthekischen lautet der Name für Talauma Yoloxochitl, das wörtlich übersetzt

Herzblume bedeutet und auf eine Anwendung der Pflanze in der mexikanischen

Volksheilkunde als Herzmittel schließen lässt (Jaretzky u. Lier, 1938).

Abb. 9 Talauma gloriensis a.) Blätter, b.) Knospe, c u. d.) Frucht

2.2.2 Taxonomie

Abteilung Spermatophyta

Unterabteilung Magnoliophyta

Klasse Magnoliopsida

Unterklasse Magnoliidae

Ordnung Magnoliales

Familie Magnoliaceae

Unterfamilie Magnolioideae

Gattung Talauma

Art Talauma gloriensis PITTIER

Allgemeiner Teil

8

2.2.3 Familie der Magnoliaceae

Die Familie der Magnoliaceae beinhaltet Bäume und Sträucher, die in Amerika und

Asien beheimatet und durch auffällige Blüten gekennzeichnet sind. Etwa 75% der

Gattungen der Familie sind im temperierten Osten und tropischen Südosten Asiens

verbreitet. Andere hingegen trifft man noch in Amerika und zwar im temperierten

Südosten Nordamerikas sowie im tropischen und subtropischen Südamerika an. Alle

amerikanischen Arten zählen zu den Gattungen Magnolia, Talauma und

Liriodendron. Die Gattung Talauma umfasst in etwa 50 Arten, die von einigen

Autoren auch in die Gattung Magnolia gestellt werden. (Heywood et al., 2007)

Abb. 10 Verbreitungskarte der Magnoliaceae

Morphologisch gesehen weist die Familie folgende Merkmale auf: Die Blätter sind

wechselständig, ungeteilt und gestielt mit hinfälligen Nebenblättern, die eine

ringförmige Narbe zurücklassen. Die einzelnen, gestielten Blüten sind zumeist

zwittrig, groß, prächtig und stehen am Ende der Zweige. Die Blütenhülle setzt sich

aus zwei oder mehreren Quirlen freier kronblattartiger Perigonblätter zusammen. Sie

kann aber ebenso in Kelch (oft dreizählig) und Krone (sechs-vielzählig) gegliedert

sein. Sowohl die zahlreichen freien Staubblätter als auch die freien oder teilweise

verwachsenen Fruchtblätter sind spiralig angeordnet. Die Sammelfrüchte bestehen

aus getrennten oder verwachsenen Fruchtblättern, die entweder geschlossen

bleiben, längs oder ringsum aufspringen. (Heywood et al., 2007) Darin liegt auch der

Unterschied der Gattung Talauma und Magnolia. Das Hauptmerkmal von Talauma

stellen die zahlreichen an der Basis verwachsenen Fruchtblätter dar, die sich zu

einer holzigen Sammelfrucht vereinigen, ringsum aufspringen und die aufrecht

stehenden Samen frei geben (Weber et al., 2001). Die Fruchtblätter der Gattung

Magnolia sind indessen frei, bilden genauso eine Sammelfrucht, öffnen sich aber

entlang der Bauch- oder Rückennaht. Die großen Samen weisen in beiden Fällen

Allgemeiner Teil

9

eine gefärbte Sarcotesta (fleischige Samenschale) auf, sind aber nicht mit den

Fruchtblättern verwachsen (Pennington et al., 2004).

Abb. 11 Talauma gloriensis Habitus und Frucht

Zahlreiche Inhaltsstoffe sind für die Familie der Magnoliaceae typisch:

So ist das Vorkommen von ätherischem Öl schon seit geraumer Zeit bekannt. Die

Zusammensetzung ist allerdings von der geographischen Herkunft der Pflanze und

vom verwendeten Pflanzenteil (z.B. Blätter, Blütenknospen, Stamm, etc) abhängig.

Die Stoffklasse der vorkommenden Lignane und Neolignane ist sehr komplex, da

die Variationen im Substitutionsmuster beträchtlich sind. Für viele dieser

Verbindungen existieren Trivialnamen, deren Grundstruktur sich vom Phenylpropan,

einem C6-C3 Körper, ableitet. Durch die unterschiedliche Verknüpfung zweier

Phenylpropanreste erhält man Lignane (Verknüpfung über das β-C Atom der C3

Seitenkette) und Neolignane (Verknüpfung über die Ringe (Biphenyle) oder über die

Kette und den Ring). (Hänsel u. Sticher, 2007)

Abb. 12 Lignangrundgerüst

Abb. 13 3,3'-Neolignan Abb. 14 8,3'-Neolignan

Allgemeiner Teil

10

Besonders charakteristisch sind Sesquiterpenlactone, die als wesentliches

Strukturmerkmal zumeist eine α-Methylen-γ-lacton-Gruppe, teilweise auch eine α,β-

ungesättigte Carbonyl- oder Epoxidgruppe aufweisen. Sie leiten sich von

verschiedenen Grundkörpern wie dem Germacren, Eudesman, Eleman, Guaian und

Pseudoguaian ab und werden daher in Germacranolid-, Eudesmanolid-, Elemanolid-,

Guaianolid- oder Pseudoguaianolidtypen unterteilt. (Hänsel u. Sticher, 2007)

O

O Abb. 15 Guaianolid

Aber auch Protoalkaloide und Alkaloide wie das Liriodendrin und das Magnoflorin

scheinen relativ häufig zu sein. Weitere Verbindungen, die nicht von allzu großer

Bedeutung sind, sind Flavonoide, cyanogene Verbindungen (eher selten) sowie

Lipide. Bei den Lipiden wurden häufig Phytosterine und Phytosteringlykoside isoliert,

Triterpene waren hingegen kaum zu finden. (Hegnauer, 1969)

2.2.4 Anwendung

Informationen über die Anwendung von Talauma gloriensis in der Medizin gibt es

derzeit nicht. Allerdings werden in der Gattung Talauma einige Arten therapeutisch

verwendet. So wird beispielsweise die Rinde von Talauma ovata bei niedrigem

Fieber und ein Tee der Blätter zur Behandlung von Diabetes eingesetzt.

Pharmakologische Studien konnten hingegen eine Normalisierung des

Blutzuckerspiegels nicht nachweisen und fanden zusätzlich heraus, dass auch

Vergiftungserscheinungen auftreten können, weshalb sie vom Gebrauch als

Arzneimittel abraten. (Mors et al., 2000)

Die Rinde, Blätter, Knospen und Blüten von Talauma plumieri werden als

Stomachikum, bei Hydrops und Gicht angewendet. Aus den Früchten wird ein

bitteres Harz gewonnen, das Schleimfluss entgegenwirken soll. Ähnliche Einsatz-

gebiete gibt es auch für Talauma candollii, Talauma rumphii und Talauma

fragrantissima. Die aromatische Rinde von Talauma elegans wird ebenso als

Allgemeiner Teil

11

Stomachikum, die Blätter aber als Antispasmodicum eingesetzt. (Dragendorff, 1967)

Die Abkochung der Rinde von Talauma mexicana (=Talauma macrocarpa) soll wie

Digitalis wirken und wurde deshalb in der mexikanischen Volksheilkunde als

Herzregulierungsmittel sowie als Digitalisersatz verwendet (Jaretzky u. Lier, 1938).

2.3 Tilletia caries und Tilletia controversa

2.3.1 Allgemeines

Tilletia caries (DC.) TUL. & C.TUL. sowie Tilletia controversa J.G. KÜHN gehören zu den

Brandpilzen, den wichtigsten Krankheitserregern unserer Kulturpflanzen, und

befallen überwiegend den Weizen. Für Tilletia caries ist auch das Synonym Tilletia

tritici in Verwendung. Im deutschsprachigen Raum wird er aber als Stein- oder

Stinkbrand, Tilletia controversa als Zwergsteinbrand bezeichnet.

Abb. 16 Tilletia caries und Tilletia controversa

2.3.2 Taxonomie

Abteilung Basidiomycota

Klasse Ustilaginomycetes

Unterklasse Exobasidiomycetidae

Ordnung Tilletiales

Familie Tilletiaceae

Gattung Tilletia

Art Tilletia caries (DC.) TUL. & C. TUL

Tilletia controversa J.G. KÜHN

Allgemeiner Teil

12

2.3.3 Die Brandpilze

Der Begriff Brandpilz wird im neueren Sinn nicht mehr als taxonomischer Begriff

aufgefasst, sondern er beschreibt einen Organisationstyp. Ihren Namen verdanken

die Brandpilze der Bildung schwarzer Sporenlager, wodurch die befallenen Pflanzen

wie durch Brand zerstört aussehen. Die Brandlager entstehen meist in noch

wachsendem Gewebe. Von den Antheren und Ovarien bis zu den Wurzeln können

nahezu alle Pflanzenorgane betroffen sein. Zu den Wirten der Brandpilze gehören

hauptsächlich Angiospermen, denn mit nur wenigen Ausnahmen werden vorwiegend

krautige Pflanzen bzw. Gräser befallen. (Zwetko u. Blanz, 2004)

2.3.4 Pathogenese der Brandpilze

Die wichtigste Sporenform der Brandpilze stellt die Brandspore, eine einzellige, meist

dickwandige Dauerspore (auch Chlamydospore genannt) dar. Ihre Sporenwand

besteht aus mehr oder weniger drei differenzierten Schichten (von innen nach

außen): dem durchsichtigen und dünnen Endospor, dem oft braunen und dicken

Epispor sowie dem daran anliegenden auffälligen und dunkel gefärbten Exospor.

(Blumer, 1963)

Die reife Brandspore enthält einen diploiden Kern und keimt in der Regel mit einem

kurzen Keimschlauch, der auch als Promyzel bezeichnet wird, aus. Das Promyzel

entspricht dabei einer Basidie, die ihren Charakter weitgehend verloren hat, da sie

nicht mehr zur Entwicklung und Abschnürung von Basidiosporen fähig ist.

(Mühle, 1958) An seiner Spitze bildet das Promyzel vier oder mehr sichelförmige

Sporidien, die auch als Kranzkörperchen bezeichnet werden (Blumer, 1963). Die

Sporiden sind den Sprosszellen der Hefepilze ähnlich, liegen einkernig und

gleichzeitig haploid vor. Sie nehmen die Tochterkerne der Reduktionsteilung auf, da

bereits im Keimschlauch oder in der Brandspore die Reduktionsteilung (Meiose)

stattgefunden hat. Vielfach sind sie in der Lage Sprosszellen zu bilden, wodurch

Kopulation eintreten kann. (Mühle, 1958) Aus den paarkernig gewordenen Sporidien

geht das Paarkernmycel hervor, das meist sichelförmige, paarkernige Konidien

abschnürt und die Bildung neuer Brandsporen anregt (Gäumann, 1964). Die junge

Brandspore ist meist noch paarkernig, erst in der reifen Brandspore findet die

Karyogamie der beiden Kerne statt, womit der Entwicklungszyklus abgeschlossen

wird (Mühle, 1958).

Allgemeiner Teil

13

Abb. 17 Pathogenese der Brandpilze

2.3.5 Gattung Tilletia

Als zwei bedeutende Vertreter der Gattung Tilletia sind Tilletia caries (Stein- oder

auch Stinkbrand) sowie Tilletia controversa (Zwergsteinbrand) zu nennen. Beide

Erreger weisen die gleichen Krankheitssymptome auf, die in erster Linie durch das

Ausbleiben der Kornbildung und durch Bildung einer so genannten Brandbutte,

einem dunklen und harten Gebilde, erkennbar sind (Schöber-Butin et al., 1999).

Die Brandbutten enthalten eine dunkle schmierige nach Heringslake (Trimethylamin)

riechende Masse und sind als die Gesamtheit der gebildeten Brandsporen

(Brandsori) anzusehen. Bei beiden Arten sind die Brandsporen von einer mehr oder

weniger deutlichen Schleimhülle umgeben. (Blumer, 1963)

Abb. 18 Tilletia controversa Schleimhülle

Die unreifen Brandbutten bei T. caries sind weich, enthalten eine schmierige

unangenehm riechende Sporenmasse (Stink- oder Schmierbrand) und sind zur

Allgemeiner Teil

14

Körnerreife fest (Steinbrand). Der Befall einer Pflanze ist durch deren höhere

Bestockung und die etwas verkürzte Halmlänge gekennzeichnet. Die Pflanzen

bleiben länger grün und weisen ein kümmerliches Wachstum auf. Die Spelzen

befallener Ähren sind bläulichgrün gefärbt und spreizen im Gegensatz zu gesunden

oft auffällig ab, sodass die Ähren ein schütteres Aussehen bekommen. (Mühle, 1958)

Die Infektion erfolgt zur Zeit der Keimung des Samens (Keimlingsinfektion). Die aus

den Brandbutten beim Dreschen freiwerdenden Brandsporen gelangen auf die

gesunden, reifen Körner, wo sie äußerlich haften bleiben. Die eigentliche Infektion

findet erst im Boden statt, denn während der Keimung des Korns beginnt auch die

Keimung der Brandsporen. (Zogg, 1985)

Die Brandbutten von Tilletia controversa sind im Vergleich zu Tilletia caries

eingebuchtet, rundlicher und bedeutend kleiner. Als Hauptmerkmal ist eine mit einer

starken Bestockung verbundene, auffällige Halmverkürzung befallener Pflanzen zu

beobachten. Oft erreichen kranke Pflanzen nur ein Viertel bis ein Drittel der

Halmlänge gesunder Pflanzen (Zwergsteinbrand). Die Spindellänge der Ähren bleibt

normal, gelegentlich kann jedoch eine Gelbfärbung der Blätter auftreten. (Blumer,

1963) Die Infektion erfolgt beim Zwergsteinbrand nicht über das Saatgut, sondern

geht vom Boden aus (Keimlingsinfektion). Die Brandsporen keimen unter

Lichteinfluss bei tiefen Temperaturen, wodurch sich das Myzel im Boden ausbreiten

und die jungen Keimpflanzen infizieren kann. Für den Grad des Befalls scheint ein

ganzer Faktorenkomplex ausschlaggebend zu sein, insbesondere saure

Bodenreaktion, geringe Temperaturen, Niederschläge, längere Schneebedeckung

bei Wintergetreide, gute Krankheitsbereitschaft des Wirtes aber auch die Düngung

kann den Befall durch den Zwergsteinbrand wesentlich fördern. (Mühle, 1958)

Spezieller Teil

15

3. Spezieller Teil mit Ergebnissen

3.1 Strukturaufklärung der isolierten Substanzen

Die Identifizierung der einzelnen Verbindungen erfolgte durch Zuhilfenahme der

NMR-Spektroskopie. Dafür wurde von den isolierten Substanzen zunächst ein 1H-Spektrum angefertigt, das die chemische Verschiebung der Protonen zeigt.

Erwiesen sich die Substanzen als interessant und lagen sie mehr oder weniger rein

vor, so wurde zusätzlich ein 13C-Spektrum, mit welchem die Anzahl der

Kohlenstoffatome bestimmt wird, erstellt. Diese beiden Spektren waren zur genauen

Identifizierung bzw. Zuordnung der Molekülgruppen meist nicht ausreichend,

weswegen auch die zweidimensionalen Spektren wie HSQC, HMBC und COSY

vermessen wurden. Anhand des HSQC-Spektrums wird die Zuordnung der Protonen

zu den direkt an ihnen gebundenen Kohlenstoffatomen ermöglicht. Im HMBC werden

die Korrelationen von Protonen mit benachbarten Kohlenstoffatomen über mehr als

eine Bindung (bis zu vier Bindungen) hinweg angezeigt. Das H,H-COSY-Spektrum

gibt Auskunft über die Wasserstoff/Wasserstoff-Kopplungen zweier direkt

benachbarter Gruppen innerhalb einer Verbindung. (Kleinpeter, 1992)

Von allen Reinsubstanzen wurde ein HPLC-Chromatogramm erstellt und LC-MS

Analysen durchgeführt, erstens um ihre Reinheit zu überprüfen und zweitens um

Informationen bezüglich ihres Molekulargewichts zu erhalten.

3.2 Drimys winteri

3.2.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes

Zur Isolierung der Inhaltsstoffe wurde von der pulverisierten Rinde mittels Perkolation

ein Dichlormethanextrakt hergestellt. Dieser wurde mittels Vakuum-Liquid-

Chromatographie aufgearbeitet, indem er über Kieselgel mit einem n-Hexan-

Ethylacetat-Methanol Gradienten eluiert wurde.

Die daraus resultierenden Fraktionen wurden mittels DC-Analyse verglichen und

solche mit ähnlichen bzw. identischen Banden zu insgesamt 20 Fraktionen vereinigt.

Die vielversprechendsten Fraktionen wurden dann mit HPLC untersucht und einige

wurden mittels NMR-Spektroskopie und LC-MS näher betrachtet.

Spezieller Teil

16

3.2.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktion

Da es sich bei DWR_V1 und DWR_V2 um ätherisches Öl handelte, erfolgte die

Auftrennung der einzelnen Komponenten mit Hilfe der GC-MS Analyse.

Fraktion DWR_V10 war bereits eine Reinsubstanz und konnte mit der NMR-

Spektroskopie identifiziert werden.

Die Fraktion DWR_V12 wurde mittels präparativer HPLC aufgearbeitet, wobei ein

Gradient bestehend aus Acetonitril/Wasser eingesetzt wurde.

Auch Fraktion DWR_V17 lag als Reinsubstanz vor, wodurch sie mittels NMR-

Spektroskopie identifiziert werden konnte.

Fraktion DWR_V18 und DWR_V19 wurden durch Einsatz der präparativen HPLC

aufgetrennt. In beiden Fällen wurde ein Gradient aus Acetonitril/Wasser in

unterschiedlicher Zusammensetzung verwendet.

Die restlichen Fraktionen wurden wegen ihres HPLC-Profils nicht eingehender

untersucht, da sie keine Informationen über neue Verbindungen lieferten.

Daten über die verwendeten Geräte, Methoden und Fließmittelgemische finden sich

in Kapitel 4.

Abb. 19 Isolierschema von Drimys

Spezieller Teil

17

3.2.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen

3.2.3.1 Fraktion DWR_V1

17.00 17.50 18.00 18.50 19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

Zeit

Intensität

13

4

852 6

12

11

10

7

9

Abb. 20 GC-Chromatogramm von DWR_V1

Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Wahrscheinlichkeit der Peakidentifikation

unter Zuhilfenahme der Datenbanken Nistos und Wiley Aetherolea.

Peak 1: α-Cubeben, 98 % Peak 2: α-Copaen, Aglaien, 99 %

CH3

CH3H3C

CH3

HH

R

R

R

S

S

H

CH3

CH3

CH3

H3C

SS

S

S

R

Peak 3: β-Elemen, 99 % Peak 4: α-Bergamoten, 98 %

CH2

CH3

H3C CH2

H2CCH3

R

SS

H3C CH3CH3

CH3

Spezieller Teil

18

Peak 5: β-Caryophyllen, 99 % Peak 6: β-Cubeben, 95 %

CH3CH3

H3C

CH2

H

H

R

SE

CH3

CH3H3C

CH2

HH

R

R

R

S

S

Peak 7: β-Farnesen, 94 % Peak 8: γ-Muurolen, 99 %

H2C

CH2 CH3

CH3

CH3

E

CH3

CH2

H

H

H3C CH3

R

R

S

Peak 9: Germacren D, 98 % Peak 10: β-Bisabolen, 95 %

CH2

CH3

CH3

CH3E

E S

CH3

CH3CH2

H3C

S

Peak 11: γ-Cadinen, 97 % Peak 12: (-)-Calamenen, 96 %

S

CH3

CH2

H

H3C CH3

RS

H CH3

H3C CH3

CH3

S

S

Spezieller Teil

19


17.50 18.00 18.50 19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 23.00 23.50 24.00

5000

0

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

65000

70000

Intensität

Zeit

7

6

23

4

5

1

Abb. 21 GC-Chromatogramm von DWR_V2

Peak 1: 1-Methyl-2,4-di(prop-1-en-2-yl)-1-vinylcyclohexan, 91 %

CH3

CH2CH3H2C

CH3H2C

Peak 2: β-Farnesen, 93 %

H2C

CH3CH2

CH3

CH3

E

Peak 3: Germacren D, 98 % Peak 4: β-Elemen, 93 %

CH2

CH3

CH3

CH3E

E S

CH2

CH3

H3C CH2

H2CCH3

R

SS

Spezieller Teil

20

Peak 5: trans-9-Octadecen, 91 %

CH3H3C E

Peak 6: n-Hexadecan, 93 %

H3CCH3

Peak 7: Cadalin, 97 %

CH3

H3C CH3

CH3


Bei DWR_V10 und DWR_V12_P6 handelt es sich um Polygodial, dessen

Identifizierung auf dem Vergleich mit Literaturdaten (Rodrίguez et al., 2005) basierte.

Polygodial ist ein bicyclisches Sesquiterpen vom Drimantyp, das als Inhaltsstoff

bereits aus Polygonum hydropiper (Polygonaceae), Pseudowintera colorata

(Winteraceae) sowie aus Drimys winteri bekannt ist.

2

3 45

10

1

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11HO

CH314

H

H

Abb. 22 Polygodial Abb. 23 UV-Spektrum von Polygodial

Summenformel: C15H22O2

Masse: 234,16

Die Masse wurde mittels LC-MS bestätigt. [M+H]+= 235,0

Spezieller Teil

21

2

3 45

10

1

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11

HO

CH314

H

H

Abb. 24 1H-NMR-Spektrum von Polygodial (CDCl3, 298K, TMS)

Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm) δ 1H Lit. (ppm)

δ 13C Lit. (ppm)

C1 1,38 1,83

39,9 1,36 1,82

39,50

C2 1,52 1,52

18,3 1,47 1,52

17,96

C3 1,24 1,49

41,8 1,21 1,47

41,65

C4 - 33,0 - 33,07

C5 1,27 49,0 1,24 48,89

C6 2,50 2,30

25,4 2,49 2,20

25,17

C7 7,13 154,2 7,12 154,30

C8 - 138,2 - 138,19

C9 2,84 60,3 2,80 60,24

C10 - 36,8 - 36,80

C11 9,54 201,8 9,51 201,95

C12 9,45 193,3 9,44 193,23

C13 0,92 32,9 0,90 33,07

C14 0,94 22,0 0,94 21,89

C15 0,95 15,4 0,93 15,22

Tab. 1 NMR-Daten von Polygodial in CDCl3

Spezieller Teil

22

3.2.3.4 Fraktion DWR_V12_P1

Diese Substanz wurde als Allylsyringol identifiziert, das das typische Grundelement

der Lignane, den Phenylpropanrest, aufweist. Bereits das 1H-Spektrum ließ

vermuten, dass ein symmetrisch substituierter Aromat mit möglicherweise zwei

Methoxygruppen in Position 3 und 5 vorliegt. Letzteres wurde durch Integration des 1H-Spektrum auch bestätigt. Sein Vorkommen in Drimys wurde in der Literatur noch

nicht beschrieben.

6

54

3

2

OH

H3CO OCH3

1

7 8

9

Abb. 25 Allylsyringol Abb. 26 UV-Spektrum von Allylsyringol


Masse: 194,09

Die Bestätigung der Masse erfolgte mittels LC-MS. [M+H]+= 195,0

6

54

3

2

OH

H3CO OCH3

1

7 8

9

Abb. 27 1H-NMR-Spektrum von Allylsyringol (CDCl3, 298K, TMS)

Spezieller Teil

23

Position δ1H (ppm) δ

13C (ppm)

C1 - 131,1

C2, C6 6,42 105,1

C3, C5 - 147,0

C4 - 133,1

C7 3,33 40,4

C8 5,96 137,6

C9 5,09 trans 5,07 cis

115,9

OCH3 3,88 56,3

OCH3 3,88 56,3

OH 5,39 -

Tab. 2 NMR-Daten von Allylsyringol in CDCl3


Bei dieser Verbindung handelt es sich um Polygonal, ein Norsesquiterpen (eine C14-

Verbindung) vom Driman-Typ. Die Aldehydgruppe in Position 9 wurde abgespalten

und führte zur Verlagerung der Doppelbindung an die Positionen 8 und 9.

Gleichzeitig wurde an Position 7 eine Hydroxylgruppe angehängt. Erstmals wurde es

im Jahr 1984 erwähnt, als es aus Polygonum hydropiper (Polygonaceae) isoliert

wurde. Es gibt noch keinen Literaturnachweis für das Vorkommen in Drimys.

2

3 45

10

1

6

7

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

CH314

HOH

Abb. 28 Polygonal Abb. 29 UV-Spektrum von Polygonal


Masse: 222,16

Spezieller Teil

24

2

3 45

10

1

6

7

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

CH314

HOH

Abb. 30 1H-NMR-Spektrum von Polygonal (CDCl3, 298K, TMS)

Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)

C1 1,62 1,39

37,8

C2 1,75 1,58

18,7

C3 1,51 1,28

41,8

C4 - 33,1

C5 1,54 45,5

C6 1,91 1,66

26,8

C7 4,62 62,5

C8 - 138,7

C9 6,51 164,8

C10 - 37,4

C12 9,44 195,7

C13 0,90 21,3

C14 0,98 32,7

C15 1,02 18,6

OH 2,64 -

Tab. 3 NMR-Daten von Polygonal in CDCl3

Spezieller Teil

25


Durch den Vergleich mit Literaturdaten (Ayer u. Talamas, 1988) konnte festgestellt

werden, dass diese Verbindung unter dem Namen Warburganal bekannt ist.

Warburganal gehört zu den Drimansesquiterpenen und beide α-

Hydroxyaldehydgruppen sowie die Doppelbindung sitzen an ein und demselben

Ring. Es wurde zuvor schon aus Warburgia stuhlmannii, Warburgia ugandensis

(beide Canellaceae), Polygonum hydropiper und auch aus Drimys winteri isoliert.

2

3 45

10

1

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11HO

CH314

H

OH

Abb. 31 Warburganal Abb. 32 UV-Spektrum von Warburganal


Masse: 250,16

2

3 45

10

1

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11

HO

CH314

H

OH

Abb. 33 1H-NMR-Spektrum von Warburganal (CDCl3, 298K, TMS)

Spezieller Teil

26


δ 13C Lit. (ppm)

C1 1,69 1,04

31,1 1,22-1,75 31,2

C2 1,51 1,51

17,7 1,22-1,75 17,7

C3 1,45 1,27

41,3 1,22-1,75 41,3

C4 - 33,0 - 33,0

C5 1,91 41,7 1,9 41,7

C6 2,59 2,35

25,9 2,59 2,35

25,9

C7 7,28 157,5 7,28 157,2

C8 - 140,3 - 140,5

C9 - 77,7 - 77,1

C10 - 41,4 - 41,4

C11 9,74 202,2 9,76 202,0

C12 9,43 192,6 9,43 192,5

C13 0,95 33,0 0,95 33,0

C14 1,0 22,1 1,0 22,0

C15 1,1 17,1 1,1 17,0

OH 4,08 - 4,09 -

Tab. 4 NMR-Daten von Warburganal in CDCl3


Die Identifizierung des Lignans Sesamin beruhte auf dem Vergleich mit

Literaturdaten (Roy et al., 2002). Charakteristisch ist das Tetrahydrofurofurangerüst,

an dem zwei identische Piperonylreste sitzen. Durch seine Symmetrie wird auch die

geringe Anzahl an Signalen im 1H-Spektrum erklärt. Sein Vorkommen in Drimys ist

bereits bekannt.

15

6O

8

2O4

O

O

HHO

O

Abb. 34 Sesamin Abb. 35 UV-Spektrum von Sesamin

Spezieller Teil

27


Masse: 354,11

Durch eine LC-MS Analyse wurde die Masse bestätigt. [M+H]+= 355,0

15

6 O8

2O4

O

O

HHO

O

Abb. 36 1H-NMR-Spektrum von Sesamin (CDCl3, 298K, TMS)

Position δ 1H (ppm) δ 1H Lit. (ppm)

C1,C5 3,04 3,02-3,06

C2,C6 4,71 4,70

C4;C8 3,87 (ax) 3,86 (ax)

C4,C8 4,22 (eq) 4,23 (eq)

Aromat 6,76-6,86 6,75-6,85

OCH2O 5,93 5,92

Tab. 5 NMR-Daten von Sesamin in CDCl3


Sowohl DWR_V17 und DWR_V18_P11 konnten durch Literaturdaten (Della Monica

et al., 2007) als 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial identifiziert werden. Die

Verbindung besteht aus einer Zimtsäure, die in para-Position eine Methoxygruppe

enthält und über die Carboxylgruppe mit dem Drimangerüst verbunden ist. Ihr

Vorkommen in Drimys ist bekannt.

Spezieller Teil

28

6'

7'8'

9'

4'

5'3'

2' 1'

O

O

2

3 45

101

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11HO

CH314

H

H

H3CO

Abb. 37 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial Abb. 38 UV-Spektrum von 1-β-O-(p-

Methoxycinnamoyl)polygodial


Masse: 410,21

Die Masse wurde durch LC-MS bekräftigt. [M+H]+= 411,0

6'

7'8'

9'

4'

5'3'

2' 1'

O

O

2

3 45

101

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11HO

CH314

H

H

H3CO

Abb. 39 1H-NMR-Spektrum von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial (CDCl3, 298K, TMS)


δ 13C Lit. (ppm)

C1 4,88 81,5 4,87 81,5

C2 1,69 1,90

24,2 1,68 1,88

24,1

C3 1,54 1,57

39,3 1,47-1,60 39,3

C4 - 32,8 - 32,8

C5 1,44 48,9 1,42 48,9

Spezieller Teil

29

C6 2,46 2,43

24,5 2,35-2,51 24,5

C7 7,07 151,9 7,06 151,9

C8 - 140,5 - 140,4

C9 3,35 59,2 3,34 59,2

C10 - 42,4 - 42,3

C11 9,81 200,5 9,81 200,4

C12 9,34 192,3 9,33 192,3

C13 0,97 32,7 0,96 32,6

C14 1,02 22,2 1,01 22,2

C15 1,07 10,7 1,06 10,6

C1’ - 166,4 - 166,4

C2’ 6,27 115,3 6,26 115,2

C3’ 7,62 145,4 7,62 145,4

C4’ - 127,0 - 126,9

C5’ 7,49 130,0 7,48 130,0

C6’ 6,90 114,3 6,90 114,3

C7’ - 161,6 - 161,5

C8’ 6,90 114,3 6,90 114,3

C9’ 7,49 130,0 7,48 130,0

OCH3 3,84 55,4 3,84 55,4

Tab. 6 NMR-Daten von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial in CDCl3


Durch Literaturdaten (Evcim et al., 1986 u. Gözler et al., 1996) wurde

herausgefunden, dass es sich bei dieser Substanz um Haplomyrfolin, ein

Dibenzylbutyrolacton, handelt. Es gehört zur Klasse der Neolignane und wurde zum

ersten Mal 1986 in Haplophyllum myrtifolium (Rutaceae) gefunden. Aus Drimys

wurde bisher nur das ähnlich aufgebaute Cubebin, das im Gegensatz zum

Haplomyrfolin zwei Piperonylreste aufweist, isoliert.

Spezieller Teil

30

3'

4'

5'6'

1'2' 7'

8'

89

O

9'

7

16

54

3

2

OO

OHO

H3CO

H

H

Abb. 40 Haplomyrfolin Abb. 41 UV-Spektrum von Haplomyrfolin


Masse: 356,13

25][

Dα = -32° (CH2Cl2, c 0,125g/100ml), Lit.: 25

][D

α = -31,6° (CHCl3, c 0,11g/100ml)

Die Bestätigung der Masse wurde durch LC-MS durchgeführt. [M+H]+= 356,9

3'

4'

5'6'

1'2' 7'

8'

89

O

9'

7

16

5

4

3

2

O

O

OHO

H3CO

H

H

Abb. 42 1H-NMR-Spektrum von Haplomyrfolin (CDCl3, 298K, TMS)


δ 13C Lit. (ppm)

C1 - 131,6 - 131,33

C2 6,61 109,5 6,61 109,41

C3 - 147,9 - 147,78

C4 - 146,4 - 146,37

C5 6,73 108,1 6,72 108,12

Spezieller Teil

31

C6 6,58 122,2 6,59 122,19

C7 2,86 2,97

34,7 2,85 2,97

34,68

C8 2,56 46,4 2,57 46,37

C9 - 178,6 - 178,46

C1’ - 129,2 - 129,68

C2’ 6,47 110,9 6,47 110,98

C3’ - 146,5 - 146,54

C4’ - 144,5 - 144,37

C5’ 6,82 114,4 6,81 114,44

C6’ 6,52 121,2 6,52 121,22

C7’ 2,50 2,61

38,2 2,50 2,60

38,22

C8’ 2,49 41,3 2,47 41,23

C9’ 3,88 4,15

71,2 3,88 4,15

71,15

OCH2O 5,94 5,94

100,9 5,93 5,94

100,93

OCH3 3,85 55,7 3,85 55,75

Tab. 7 NMR-Daten von Haplomyrfolin in CDCl3


Die Verbindung wurde als 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial identifiziert. Der

Unterschied zu 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial besteht darin, dass anstelle

der Methoxygruppe an der para-Position der Zimtsäure eine Hydroxylgruppe

eingeführt ist. Ein Literaturnachweis für diese Verbindung wurde in Drimys

brasiliensis von Vichnewski et al., 1986 erbracht.

6'

7'8'

9'

4'

5'3'

2' 1'

O

O

2

3 45

101

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11HO

CH314

H

H

HO

Abb. 43 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial Abb. 44 UV-Spektrum von 1-β-(p-

Cumaroyloxy)polygodial

Spezieller Teil

32


Masse: 396,19

Die Masse wurde mittels LC-MS bekräftigt. [M+H]+= 396,8

6'

7'8'

9'

4'

5'3'

2' 1'

O

O

2

3 45

101

67

CH3

15

H3C13

8 12 H

O9

11HO

CH314

H

H

HO

Abb. 45 1H-NMR-Spektrum von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial (CDCl3, 298K, TMS)

Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)

C1 4,85 81,4

C2 1,85 1,69

24,2

C3 1,54 1,57

39,2

C4 - 32,8

C5 1,42 48,8

C6 2,44 2,42

24,6

C7 7,09 152,5

C8 - 140,2

C9 3,32 59,2

C10 - 42,4

C11 9,81 201,5

C12 9,35 192,5

C13 0,98 32,6

C14 1,01 22,2

Spezieller Teil

33

C15 1,07 10,6

C1’ - 166,4

C2’ 6,20 114,7

C3’ 7,56 145,8

C4’ - 126,5

C5’ 7,37 130,2

C6’ 6,79 115,9

C7’ - 158,5

C8’ 6,79 115,9

C9’ 7,37 130,2

OH 1,77 -

Tab. 8 NMR-Daten von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial in CDCl3

3.2.4 Diskussion und Schlussfolgerung

In der Rinde von Drimys winteri sind zahlreiche Substanzklassen vertreten. Darin

beinhaltet ist auch ätherisches Öl, das offenbar nur aus Sesquiterpenen besteht. In

erster Linie gehören die isolierten Verbindungen jedoch zur Klasse der

Sesquiterpene vom Driman-Typ (C15-Verbindungen), die sich aus drei

Isopreneinheiten zusammensetzen und ein Decalinsystem bilden. Sie zeichnen sich

durch eine Doppelbindung in Position 7 und zwei α-Aldehydgruppen in Position 8 und

9 aus, die im selben Ring enthalten sind. Über die Carboxylgruppe der Zimtsäure

findet häufig eine Verknüpfung mit einem derartigen Sesquiterpen statt. Zu diesen

Verbindungen zählen u. a. das Polygodial, 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial,

1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial und Warburganal, deren Vorkommen in Drimys in der

Literatur schon vielfach beschrieben wurde.

Neu ist die Anwesenheit eines Norsesquiterpens, einer C14-Verbindung, die zuvor

schon aus Polygonum hydropiper isoliert und Polygonal genannt wurde. Weiters

wurde neben dem bereits bekannten Sesamin und Cubebin auch das Vorkommen

eines bisher unbekannten Phenylpropans und Neolignans in Drimys belegt. Bei

diesen Verbindungen handelt es sich um das Allylsyringol und Haplomyrfolin, wobei

letzteres ein Dibenzylbutyrolacton ist und somit der Klasse der Neolignane angehört.

Aufgrund des eher seltenen Vorkommens von Lignanen und Neolignanen in Drimys

wurde erneut aufgezeigt, dass der Phenylpropanoid-Stoffwechselweg eine Rolle

spielt. Weiters wurde durch die Isolierung von Verbindungen, die der Klasse der

Spezieller Teil

34

Sesquiterpene vom Drimantyp angehören und zugleich Inhaltsstoffe der Canellaceae

und auch Polygonaceae sind, erneut die enge Verwandtschaft der Winteraceae und

Canellaceae unter Beweis gestellt.


3.3.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes

Die gemahlenen Blätter wurden durch Perkolation mit Dichlormethan zur

Extraktherstellung herangezogen. Der Dichlormethanextrakt wurde dann durch

klassische Säulenchromatographie über Kieselgel mit n-Hexan-Ethylacetat-Methanol

Mischungen in Grobfraktionen aufgetrennt.

Die dabei gewonnenen Grobfraktionen wurden dünnschichtchromatographisch

untersucht und anhand der Ähnlichkeit ihrer Banden zu insgesamt 16 Fraktionen

vereinigt. Alle interessanten Fraktionen wurden mittels HPLC und zum Teil auch

mittels NMR-Spektroskopie eingehender betrachtet. Von einigen Fraktionen wurden

auch LC-MS Analysen durchgeführt.

3.3.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktionen des Extraktes

Die Fraktionen TGB_S1 und TGB_S2 bestanden aus einem Gemisch aus

ätherischem Öl, dessen Hauptkomponenten mittels GC-MS identifiziert wurden.

Die Aufarbeitung der Fraktionen TGB_S7, TGB_S10 und TGB_S12 erfolgte durch

Verwendung der präparativen HPLC. Es wurden grundsätzlich Fließmittelgradienten

bestehend aus Acetonitril/Wasser in unterschiedlicher Zusammensetzung eingesetzt.

Die übrigen Fraktionen wurden mit Ausnahme eines HPLC-Profils nicht detaillierter

untersucht, da sie keinerlei Hinweise auf noch unbekannte und neuartige

Verbindungen ergaben.

Genaue Daten bezüglich der verwendeten Methoden, Gerätedaten und verwendeten

Fließmittelgemische befinden sich in Kapitel 4.

Spezieller Teil

35

Abb. 46 Isolierschema von Talauma

3.3.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen

3.3.3.1 Fraktion TGB_S1

19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 23.00 23.50 0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

900000

1000000

1100000 3

Zeit

Intensität

1 2

4

Abb. 47 GC-Chromatogramm von TGB_S1

Die Prozentangaben entsprechen der Wahrscheinlichkeit der Peakidentifizierung

durch Vergleich der Massenspektren mit denen der Datenbanken Nistos und Wiley

Aetherolea.

Spezieller Teil

36

Peak 1: β-Farnesen, 93 % Peak 2: α-Curcumen, 95 %

H2C

CH2 CH3

CH3

CH3

E

CH3

CH3CH3

H3C

Peak 3: β-Bisabolen, 95 % Peak 4: β-Sesquiphellandren, 94 %

CH3

CH3CH2

H3C

S

CH3

CH3CH3

H2C

H

R S

3.3.3.2 Fraktion TGB_S2

18.00 18.50 19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00

20000

0

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

240000

260000

280000

300000

320000

340000

360000

1

57

3 4

Zeit

Intensität

9

2

8

6

Abb. 48 GC-Chromatogramm von TGB_S2

Peak 1: α-Bergamoten, 97 % Peak 2: β-Caryophyllen, 99 %

CH3CH3

CH3

H3C

CH3CH3

H3C

CH2

H

H

R

SE

Spezieller Teil

37

Peak 3: γ-Muurolen, 99 % Peak 4: β-Farnesen, 96 %

CH3

CH2

H

H

H3C CH3

R

R

S

H2C

CH3CH2

CH3

CH3

E

Peak 5: α-Selinen, 99 %

CH3

CH3

HCH2

CH3

R

R R

Peak 6: (1R,4aR,8aS)-1-Isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,4a,5,6,8a-hexahydronaphthalen,

98 %

CH3

CH3

H

H

H3C CH3

R

R

S

Peak 7: δ-Guaien, 97 %

CH3

HCH3CH2

H3C R SS

Peak 8: 1-Isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,4a,5,6,8a-hexahydronaphthalen, 97 %

CH3

CH3

CH3H3C

Spezieller Teil

38

Peak 9: δ-Cadinen, 96 %

CH3

CH3

CH3

CH3H3C

SR

3.3.3.3 Fraktion TGB_S10_P2

Diese Verbindung ist ein Lignan vom Dibenzoylcyclooctadien-Typ. Bis jetzt gibt es

keinen Literaturnachweis für diese Verbindung, weshalb sie als Pyramidatin I

bezeichnet wurde.

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

O O

O

CH3

O

CH3

Abb. 49 Pyramidatin I Abb. 50 UV-Spektrum von Pyramidatin I


Masse: 398,14

25][

Dα = -73,21° (CH2Cl2; c 0,68g/100ml)

Die Masse wurde mittels LC-MS bestätigt. [M+H]+= 399,0

TGB_S10_P2_po s # 1572 R T: 21.87 AV: 1 NL: 2.9 5E9T: + c ESI Full ms [ 100.00-1200.00]

140 1 60 180 2 00 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 4 60 480m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

10 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nce

399

400

314

369

381351313 401341315300283269 382352338256241235212 40219 0161 431 460169150 491

Abb. 51 Massenspektrum von Pyramidatin I

Spezieller Teil

39

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

O O

O

CH3

O

CH3

Abb. 52 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin I (CDCl3, 298K, TMS)

Abb. 53 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin I (CDCl3, 298K, TMS)

Position δ 1H (ppm) J (Hz) δ 13C (ppm)

C1 - 136,1

C2 - 119,5

C3 - 140,9

C4 - 136,5

C5 - 148,5

C6 6,68 s 105,8

Spezieller Teil

40

C7 4,66 s 87,3

C8 2,30 qu 6,6 35,2

C9 0,94 d 6,6 19,3

C1’ - 132,6

C2’ - 121,4

C3’ - 141,9

C4’ - 135,0

C5’ - 148,8

C6’ 6,34 s 102,0

C7’ 2,73 2,45

dd dd

13,2; 9,0 13,2; 9,6

37,7

C8’ 1,97 trd 9,6; 4,2 46,3

C9’ 4,00 3,86

dd d

7,8; 4,2 7,8

74,3

OCH2O 5,94 5,97

m 101,2

OCH2O 5,94 5,97

m 100,9

OCH3 3,69 s 59,8

OCH3 3,88 s 59,7

Tab. 9 NMR-Daten von Pyramidatin I in CDCl3


Die Identifizierung der Substanz beruhte auf dem Vergleich der chemischen

Verschiebung (in ppm) mit Literaturdaten (Song et al., 2000). Dadurch wurde

festgestellt, dass es sich um Pyramidatin H, ein Lignan vom Dibenzoylcyclooctadien-

Typ handelt. Zum ersten Mal wurde es aus Magnolia pyramidata isoliert und erhielt

daher seinen Namen.

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3O

O

OO

O

O

CH3 CH3

Abb. 54 Pyramidatin H Abb. 55 UV-Spektrum von Pyramidatin H

Spezieller Teil

41


Masse: 398,14

24][

Dα = 166,67° (CH2Cl2; c 0,6g/100ml)

Die Bestätigung der Masse erfolgte durch LC-MS. [M+H]+= 399,0

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3O

O

OO

O

O

CH3 CH3

Abb. 56 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin H (CDCl3, 298K, TMS)

Abb. 57 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin H (CDCl3, 298K, TMS)

Spezieller Teil

42

Position δ 1H (ppm)

J (Hz) δ 13C (ppm)

δ 1H Lit. (ppm)

δ 13C Lit. (ppm)

C1 - 137,4 - 137,38

C2 - 118,3 - 118,31

C3 - 142,2 - 142,16

C4 - 135,6 - 135,40

C5 - 148,6 - 148,57

C6 6,36 s 100,5 6,36 100,45

C7 4,72 s 88,9 4,71 88,89

C8 2,02 m 51,2 2,03 51,17

C9 1,17 d 20,3 1,17 20,36

C1’ - 131,7 - 131,65

C2’ - 122,9 - 122,87

C3’ - 141,4 - 141,36

C4’ - 135,4 - 135,59

C5’ - 147,2 - 147,18

C6’ 6,41 s 105,1 6,41 105,08

C7’ 2,84 2,27

t d

13,2 13,2

38,7 2,85 2,48

38,70

C8’ 2,04 m 41,8 2,03 41,77

C9’ 3,62 3,33

dd d

9,0; 4,2 9,0

70,7 3,62 3,33

70,64

OCH2O 5,94 m 100,8 5,96 100,77

OCH2O 5,96 m 101,1 5,96 101,01

OCH3 3,75 s 59,8 3,75 59,65

OCH3 3,75 s 59,7 3,65 59,80

Tab. 10 NMR-Daten von Pyramidatin H in CDCl3

Spezieller Teil

43


Diese Substanz ist ebenfalls ein so genanntes Dibenzoylcylooctadien-Lignan, das in

der Literatur bislang noch nicht beschrieben wurde und infolgedessen den Namen

Pyramidatin K erhielt.

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

O

O

O

O

CH3 CH3 CH3

CH3

Abb. 58 Pyramidatin K Abb. 59 UV-Spektrum von Pyramidatin K


Masse: 414,17

25][

Dα = -42,12° (CH2Cl2; c 0,52g/100ml)

Die Masse wurde durch LC-MS bekräftigt. [M+H]+= 415,0

TGB_S12P1_pos #1 132 RT: 18.21 AV: 1 NL: 2 .54 E9T: + c ESI Full ms [ 150.00-2000.00]

1 80 200 220 24 0 2 60 280 300 32 0 3 40 360 380 400 4 20 440 460 480m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

10 0

Re

lati

ve

Ab

un

da

nce

415

416

330

41 7299257 38 5 397285255 366278 315 335 342241 398226 367219 386213 45 4195181 429165 460 474 483446

Abb. 60 Massenspektrum von Pyramidatin K

Spezieller Teil

44

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

O

O

O

O

CH3 CH3 CH3

CH3

Abb. 61 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin K (CDCl3, 298K, TMS)

Abb. 62 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin K (CDCl3, 298K, TMS)


C1 - 135,6

C2 - 119,5

C3 - 140,9

C4 - 136,6

C5 - 148,6

C6 6,68 s 105,6

Spezieller Teil

45

C7 4,68 s 87,4

C8 2,29 qu 7,2 35,3

C9 0,95 d 6,8 19,5

C1’ - 134,0

C2’ - 122,6

C3’ - 152,3

C4’ - 140,2

C5’ - 153,0

C6’ 6,42 s 106,1

C7’ 2,50 2,77

dd dd

13,2; 10,0 13,2; 8,4

37,8

C8’ 2,00 trd 9,2; 4,4 46,3

C9’ 4,01 3,89

dd

7,6; 4,4

74,4

OCH2O 5,94 5,97

d 10,0 101,2

OCH3 3,71 s 59,8

OCH3 3,59 s 60,6

OCH3 3,88 s 61,1

OCH3 3,88 s 55,8

Tab. 11 NMR-Daten von Pyramidatin K in CDCl3


Auch in diesem Fall handelt es sich um ein Dibenzoylcyclooctadien-Lignan. Die

Verbindung ist bis jetzt in der Literatur nicht erwähnt und wurde Pyramidatin L

genannt.

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3O

O

OO

O

CH3CH3

O

CH3

H3C

Abb. 63 Pyramidatin L Abb. 64 UV-Spektrum von Pyramidatin L

Spezieller Teil

46


Masse: 414,17

Die Bestätigung der Masse wurde mittels LC-MS durchgeführt. [M+H]+= 415,1

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3O

O

OO

O

CH3CH3

O

CH3

H3C

Abb. 65 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin L (CDCl3, 298K, TMS)


C1 - 137,0

C2 - 120,2

C3 - 151,8

C4 - 141,4

C5 - 152,2

C6 6,74 s 109,9

C7 4,72 s 87,6

C8 2,39 35,1

C9 0,96 d 6,6 19,3

C1’ - 132,4

C2’ - 121,8

C3’ - 141,8

C4’ - 135,2

C5’ - 148,8

Spezieller Teil

47

C6’ 6,34 s 101,9

C7’ 2,75 2,49

dd dd

13,8; 9,4 13,8; 10,2

37,6

C8’ 2,00 m 46,4

C9’ 4,02 3,89

m 74,3

OCH2O 5,97 d 6,6 100,9

OCH3 3,38 s 60,6

OCH3 3,88 s 61,0

OCH3 3,88 s 55,6

OCH3 3,88 s 59,7

Tab. 12 NMR-Daten von Pyramidatin L in CDCl3


Diese Verbindung ist ebenfalls ein Lignan vom Dibenzoylcyclooctadien-Typ. In der

Literatur wurde es bislang nicht erwähnt und daher mit Pyramidatin J bezeichnet.

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

OO

CH3

CH3

O

CH3

O

CH3

Abb. 66 Pyramidatin J Abb. 67 UV-Spektrum von Pyramidatin J


Masse: 414,17

24][

Dα = -17,97° (CH2Cl2; c 0,61g/100ml)

Die Masse wurde durch LC-MS bestätigt. [M+H]+= 415,0

Spezieller Teil

48

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

OO

CH3

CH3

O

CH3

O

CH3

Abb. 68 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin J (CDCl3, 298K, TMS)

Abb. 69 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin J (CDCl3, 298K, TMS)


C1 - 137,0

C2 - 118,5

C3 - 142,2

C4 - 135,8

C5 - 148,6

C6 6,37 s 100,4

C7 4,71 s 89,1

Spezieller Teil

49

C8 2,06 m 51,3

C9 1,18 d 6,6 20,5

C1’ - 133,2

C2’ - 123,8

C3’ - 151,7

C4’ - 140,3

C5’ - 151,2

C6’ 6,48 s 109,5

C7’ 2,89 2,36

dd d

13,8 10,8

39,0

C8’ 2,08 m 41,8

C9’ 3,62 3,27

dd d

8,4; 4,2 8,4

70,7

OCH2O 5,96 s 101,1

OCH3 3,76 s 59,8

OCH3 3,50 s 60,4

OCH3 3,91 s 61,2

OCH3 3,88 s 55,9

Tab. 13 NMR-Daten von Pyramidatin J in CDCl3

3.3.4 Vergleich von TGB_S10_P2 und TGB_S10_P3

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

O O

O

CH3

O

CH3

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3O

O

OO

O

O

CH3 CH3

Abb. 70 Pyramidatin I Abb. 71 Pyramidatin H

Bei den Verbindungen Pyramidatin I (TGB_S10_P2) und Pyramidatin H

(TGB_S10_P3) handelt es sich stereochemisch gesehen um so genannte

Diasteromere. Sie gehören zur Klasse der Stereoisomere, deren Atome in gleicher

Weise verknüpft, aber räumlich unterschiedlich angeordnet sind. Diastereomere sind

nicht spiegelbildlich zueinander, haben an einem oder mehreren Stereozentrum

dieselbe Konfiguration, unterscheiden sich jedoch durch die Konfiguration der

Spezieller Teil

50

übrigen Stereozentren. (Hart et al., 2002) Isomere, die sich durch die Verdrehung

von Biphenylsystemen ergeben, werden auch als Atropisomere bezeichnet. Im

obigen Fall sind diese Atropisomere durch die Verbindungsachse 2-2’ festgelegt. Zur

Ermittlung der absoluten Konfiguration dieser zwei Stereozentren wurde der

Circulardichroismus gemessen. Anhand der aufgezeichneten Kurve ist ersichtlich, ob

die Verbindung die R- bzw. S-Konfiguration einnimmt. Geht die Kurve im hinteren

Abschnitt des Diagramms nach unten, so ergibt sich daraus die R-Konfiguration.

Steigt sie jedoch nach oben an, erhält man die S-Konfiguration. Dadurch konnte

festgestellt werden, dass Pyramidatin I (TGB_S10_P2) die S-Konfiguration und

Pyramidatin H (TGB_S10_P3) die R-Konfiguration zu zuordnen ist. Die Zuordnung

der CD-Spektren zur absoluten Konfiguration wurde erstmals am Schizandrin, einem

sehr ähnlich aufgebauten Dibenzoylcyclooctadien, von Ikeya im Jahr 1979 und 1991

durchgeführt.

Abb. 72 CD-Spektrum von Pyramidatin I Abb. 73 CD-Spektrum von Pyramidatin H

Die Auswirkung der Konfiguration dieser Achse kann man auch an den

Verschiebungswerten der NMR-Spektren (1H und vor allem 13C) erkennen. Betroffen

von dieser Verschiebung ist die Position 8 im Cyclooctanring. Herrscht im

Biphenylsystem die S-Konfiguration vor, so kommt es zur geringeren Verschiebung

der ppm Werte an Position 8 im 13C-Spektrum (35,2 ppm). Weist sie hingegen eine

höhere Verschiebung in Position 8 auf (51,2 ppm), ist die R-Konfiguration im

Biphenylsystem vorhanden. Besonders gut erkennbar ist der Unterschied der

absoluten Konfiguration im dargestellten HSQC-Ausschnitt.

Spezieller Teil

51

Abb. 74 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin I Abb. 75 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin H

Auch dürfte es sich in diesem Fall um Konformationsisomere handeln, die durch

Einwirken von hoher Energie durch Rotation einer Einfachbindung theoretisch

ineinander überführbar sind (Hart et al., 2002).

3.3.5 Vergleich von TGB_S12_P1 und TGB_S12_P3

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

O

O

O

O

CH3 CH3 CH3

CH3

5

4

2

6 12'

7 88'

7'

1'

3' 4'

5'

6'9'O

HH

H

H CH39 H

3OO

OO

CH3

CH3

O

CH3

O

CH3

Abb. 76 Pyramidatin K Abb. 77 Pyramidatin J

Hier verhält es sich wie im bereits oben beschriebenen Fall. Pyramidatin K

(TGB_S12_P1) und Pyramidatin J (TGB_S12_P3) sind Diastereomere, Atropisomere

und vermutlich auch Konformationsisomere. Ihr einziger Unterschied zu den

Pyramidatinen der Fraktion 10 liegt im Substitutionsmuster, denn anstelle einer

zweiten Methylendioxogruppe sind zwei Methoxygruppen eingeführt. Die absolute

Konfiguration ist wiederum durch die 2-2’ Achse der Biphenyle festgesetzt und wurde

durch Messung des Circulardichroismus bestimmt. Daraus ergab sich für

Spezieller Teil

52

Pyramidatin K (TGB_S12_P1) die S-Konfiguration und Pyramidatin J (TGB_S12_P3)

die R-Konfiguration.

Abb. 78 CD-Spektrum Pyramidatin K Abb. 79 CD-Spektrum Pyramidatin J

Die absolute Konfiguration der Biphenyle wirkt sich entscheidend auf die chemische

Verschiebung im 1H- und 13C-Spektrum aus, wovon letztendlich die Position 8 im

Cyclooctanring betroffen ist. Bei der R-Konfiguration findet eine höhere Verschiebung

der ppm Werte statt, bei der S-Konfiguration eine niedrigere Verschiebung. Ganz

gleich ob nun der entsprechenden Verbindung die R oder S-Konfiguration zu

zuordnen ist, die Werte der Pyramidatine der Fraktion 10 liegen mit denen aus

Fraktion 12 um nur 0,1 ppm auseinander. Deutlich zu erkennen ist der Unterschied

der absoluten Konfiguration im unten gezeigten HSQC-Ausschnitt.

Abb. 80 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin K Abb. 81 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin J

Spezieller Teil

53


Neben dem ätherischen Öl, das sich ausschließlich aus Sesquiterpenen

zusammensetzt, und einem Sterolgemisch konnten aus Talauma gloriensis noch fünf

Reinsubstanzen isoliert werden, wovon vier in der Literatur noch nicht beschrieben

waren.

Die Reinsubstanzen gehören zur Klasse der Neolignane und werden als

Dibenzoylcyclooctadiene bezeichnet. Die Benennung erfolgte analog zu den aus

Magnolia pyramidata isolierten Pyramidatinen A-H und wurde für die neu gefundenen

Verbindungen mit Pyramidatin I-L fortgeführt.

Stereochemisch sind diese Verbindungen Diastereomere, Atropisomere und

Konformationsisomere. Jeweils zwei der Verbindungen Pyramidatin H und I sowie

Pyramidatin J und K bilden Diastereomerenpaare. Die Atome eines Diastereomeren-

paares sind auf dieselbe Weise verknüpft und unterscheiden sich nur durch ihre

räumliche Anordnung voneinander. Sie weisen abgesehen von der 2-2’ Verknüpfung

der Biphenyle an allen Stereozentren dieselbe Konfiguration auf. Die absolute

Konfiguration wird durch Messung des Circulardichroismus bestimmt. Je nachdem,

ob die R oder S Konfiguration entlang der 2-2’ Achse vorliegt, wirkt sich das

dementsprechend auf die chemische Verschiebung (in ppm) im 1H- und

insbesondere im 13C-Spektrum aus. Erkennbar ist dieser Unterschied an der Position

8 im Cyclooctanring. Liegt im Biphenylsystem die S-Konfiguration vor, tritt eine

niedrige Verschiebung bei rund 35 ppm ein. Herrscht die R-Konfiguration vor, ist mit

einer höheren Verschiebung im Bereich von 51 ppm zu rechnen. Dadurch wurde

festgestellt, dass Pyramidatin H und J die R-Konfiguration, Pyramidatin I, K und L die

S-Konfiguration einnehmen. Auch Pyramidatin L ist ein Atropisomer, aber sein

atropisomeres Gegenstück (Diastereomer) konnte nicht isoliert werden. Für die Art

der Stereoisomerie, wie sie bei Biphenylderivaten auftritt, trifft auch die Bezeichnung

Atropisomerie zu. Beide Ringe liegen in verschiedenen Ebenen und die Drehbarkeit

um die Einfachbindung ist stark eingeschränkt, infolgedessen eine Trennung erst

möglich gemacht wird. Atropisomere können somit bei Raumtemperatur isoliert

werden, da ihre Stabilität von der Höhe der Rotationsbarriere abhängt. (Hauptmann

u. Mann, 1996) Bei den Bedingungen der Aufarbeitung (40-45 ° C) ist nicht damit zu

rechnen, dass die Atropisomere ineinander übergeführt werden können. Ein

dynamischer Prozess hätte sich in den NMR-Spektren durch Linienverbreiterung

oder durch das Vorhandensein eines 2. Signalsatzes erkennbar machen müssen.

Spezieller Teil

54


3.4.1 Extraktion

In beiden Fällen wurden vom gemahlenen Drogenmaterial auf analoge Weise mittels

Ultraschallextraktion ein Dichlormethan-, ein Methanolextrakt und ein alkalischer

Extrakt (mit 15%igen Ammoniak befeuchten und mit Chloroform versetzen)

hergestellt. Auf die Herstellung eines sauren Extraktes (mit 10%iger Salzsäure

ansäuern und Chloroform zugeben) wurde verzichtet, da mehrere Vorversuche im

Gegensatz zu den anderen drei Extrakten kaum Hinweise auf Verbindungen zeigten.

3.4.2 Tilletia caries

3.4.2.1 Aufarbeitung der Extrakte

Der Dichlormethanextrakt und der Methanolextrakt wurden durch Verwendung der

FCPC® aufgearbeitet. Als Fließmittel wurde n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-Wasser

im Verhältnis 9:1:9:1 bzw. 7:3:5:5 eingesetzt. Leider konnte lediglich die Anwesenheit

von Triglyceriden und Fettsäuren nachgewiesen werden.

Die Auftrennung des alkalischen Exraktes erfolgte durch die präparative HPLC mit

einem Fließmittelgradienten aus Acetonitril/Wasser. Hierbei kam nur eine mehrfach

ungesättigte Fettsäure zum Vorschein, da die Ausbeuten der übrigen Fraktionen so

gering waren, dass keine Identifizierung der Substanzen möglich war.

Abb. 82 Isolierschema von Tilletia caries

Spezieller Teil

55

3.4.3 Tilletia controversa

3.4.3.1 Aufarbeitung der Extrakte

Die Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes und des alkalischen Extraktes erfolgte

mit der FCPC®. Die Fließmittel setzten sich in beiden Fällen aus Petrolether-

Diethylether-Ethanol-Wasser im Verhältnis 4:0,5:5:1 zusammen.

Der Dichlormethanextrakt wurde mit verschiedensten chromatographischen

Methoden (präparative DC, präparative und semipräparative HPLC) bearbeitet,

brachte aber wiederum nur Fettsäuren und Sterole als Ergebnisse hervor.

Der alkalische Extrakt wurde ebenfalls mittels päparativer DC und semipräparativer

HPLC bearbeitet. Er enthielt jedoch eine gelb gefärbte Verbindung mit auffälligem

UV-Spektrum. Letztendlich war es aber wegen der geringen Menge unmöglich, die

chemische Struktur dieser Verbindung durch NMR-Spektroskopie aufzuklären. Auch

von den restlichen isolierten Substanzen konnte aufgrund der geringen Menge die

Struktur nicht aufgeklärt werden.

Abb. 83 UV-Spektrum der gelb gefärbten Verbindung in T. controversa

Der Methanolextrakt wurde abgesehen von einem HPLC-Profil nicht untersucht, da

er keine Informationen hinsichtlich neuer Verbindungen enthielt.

Spezieller Teil

56

Abb. 84 Isolierschema von Tilletia controversa

Informationen hinsichtlich der verwendeten Methoden, Geräte und Fließmittel finden

sich in Kapitel 4.


Sowohl aus Tilletia caries als auch aus Tilletia controversa wurden ausschließlich

Fettsäuren und Triglyceride isoliert. Tilletia controversa beinhaltete jedoch eine

Substanz mit interessantem UV-Spektrum, deren Menge nicht ausreichte, um die

Struktur zu ermitteln. Es besteht allerdings die Möglichkeit, dass diese Substanz aus

dem noch anhaftenden Grasmaterial (Spelzen) stammen könnte. Die chemische

Zusammensetzung der isolierten Fettsäuren und Triglyceride wurde nicht weiter

untersucht, da darüber bereits eine Arbeit vorliegt (Beattie et al., 1993).

Die Vermutung, dass Tilletia caries und Tilletia controversa ebenfalls wie Claviceps

purpurea die Produktion von Alkaloiden bewirken, konnte somit nicht bestätigt

werden.

Experimenteller Teil

57

4. Experimenteller Teil

4.1 Material, Methoden und Geräte

4.1.1 Dünnschichtchromatographie (DC)

Stationäre Phase: DC-Alufolie 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254; Fa. Merck

Mobile Phase: es wurden verschiedene Fließmittelgemische verwendet, n-Hexan-

Ethylacetat im Verhältnis 95:5, 75:5, 50:50 sowie Chloroform-Methanol-Wasser im

Verhältnis 80:20:2 erwiesen sich jedoch als die besten.

Detektion: erfolgte im Vis als auch im UV durch Fluoreszenzminderung bei 254 nm

und Eigenfluoreszenz bei 366 nm. Weiters wurde mit Vanillin-H2SO4-Reagens

besprüht and anschließend im Trockenschrank für wenige Minuten bei 100 ° C

erhitzt. Die weitere Auswertung wurde dann im Vis durchgeführt. Die Dünnschicht-

chromatogramme von Tilletia wurden zur Prüfung auf Alkaloide mit Dragendorff-

Reagens besprüht und abschließend im Vis ausgewertet.

4.1.2 Präparative Dünnschichtchromatographie

Stationäre Phase: PSC-Platten 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254 + 366; 2 mm, Fa. Merck

Mobile Phase:

Tcon_D_B6: n-Hexan-Ethylacetat 60:40, Zusatz von 1 % Methanol

Tcon_A_A2: Chloroform-Methanol-Wasser 75:25:2, Zusatz von 1 % Ameisensäure

Die Proben wurden in Methanol gelöst, strichförmig auf die Platte aufgetragen und im

UV bei 366 nm detektiert. Die Banden wurden abgekratzt und mit Dichlormethan/

Methanol extrahiert.

4.1.3 Klassische Säulenchromatographie (SC)

Stationäre Phase: Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm) Fa. Merck

Mobile Phase: verschiedene Fließmittelgradienten bestehend aus n-Hexan-

Ethylacetat-Methanol wurden eingesetzt.

Das Kieselgel wurde mit der entsprechenden Menge an Hexan aufgeschlemmt, auf

das Ultraschallbad gegeben und möglichst blasenfrei in die Säule gegossen. Den

jeweiligen Extrakten wurde Kieselgel (Korngröße: 0,063-0,200 mm) zugegeben, um

sie in trockener Form auf die Säule aufzubringen.


58

4.1.4 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

4.1.4.1 Analytische HPLC

Gerät: Agilent 1100 Series

Stationäre Phase: Agilent, Zorbax SB - C18; 3,5 µm; 2,1 x 150 mm

Mobile Phase: Acetonitril/Wasser

Probenvorbereitung: in Methanol lösen

Verwendeter Fließmittelgradient (Standardmethode):

Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)

0 10 90

25 90 10

30 100 0

45 100 0

46 10 90

Tab. 14 HPLC-Standardmethode (Gradient)

Fließgeschwindigkeit: 0,3 ml/min

Detektion: erfolgte durch einen Dioden-Array-Detektor (DAD). Mit diesem Detektor ist

es möglich, bei mehreren Wellenlängen gleichzeitig zu messen. Es wurden stets

Chromatogramme bei 205, 220, 254 und 280 nm aufgenommen.

4.1.4.2 Präparative HPLC

Gerät: Varian R PrepStar Model SD-1

Dynamax R Solvent Delivery System Model SD-1

Dynamax R Absorbance Detector Model UV-1

Stationäre Phase: Varian Dynamax 250 x 21,4 mm (L*ID)

S/N 3106 Microsorb 100-5 C18

Mobile Phase: Acetonitril/Wasser-Mischungen

Probenvorbereitung: in Methanol lösen (c = 40 mg/ml) und zur Vorreinigung über

eine RP-18-Säule eluieren

Fließgeschwindigkeit: 14 ml/min

Einspritzmenge: 100 - 500 µl

Detektion: bei einer Wellenlänge von 205, 210, 218, 220 oder 280 nm


59

4.1.4.3 Semipräparative HPLC

Gerät: Agilent 1100 Series

Stationäre Phase: LiChroCart 250-10

HPLC-Kartusche Lichrosorb RP-18 (7 µm); Fa. Merck

Mobile Phase: Acetonitril/Wasser in unterschiedlichen Mischungen


Probenvorbereitung: entsprechende Probenmenge in Methanol in Lösung bringen

(c = 40 mg/ml) und mittels SPE über eine RP-18-Säule vorreinigen

Einspritzmenge: 10 - 80 µl

Detektion: mittels Dioden-Array-Detektor (DAD) bei Wellenlängen von 205, 220, 254

und 280 nm

4.1.5 Reversed Phase (RP) - Festphasenextraktion (SPE®)

Säule: ISOLUTE TM SPE COLUMNS

100 mg C18 (EC) 3 ml oder 1 g C18 (EC) 6 ml

Fa. IST (International Sorbent Technology)

Elutionsmittel: Methanol oder Methanol/Wasser-Gemische

4.1.6 Fast Centrifugal Partition Chromatography - FCPC®

Die Auftrennung der einzelnen Verbindungen erfolgt hierbei auf dem Prinzip der so

genannten Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie. Sie dient vor allem zur

Aufreinigung von wenigen mg bis zu 5 g Probe je Injektion.

Gerät: Kromaton 201

Fließmittel: in unterschiedlichen Zusammensetzungen wurden eingesetzt

Stationäre Phase Mobile Phase Verhältnis

Methanol Wasser n-Hexan Ethylacetat 9 : 1 : 9 : 1

Methanol Wasser n-Hexan Ethylacetat 5 : 5 : 7 : 3

Petrolether Diethylether Ethanol Wasser 4 : 0,5 : 5 : 1

Tab. 15 FCPC-Fließmittelsysteme

Probenvorbreitung: die Extrakte immer in 10 ml des verwendeten Fließmittels lösen

Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min

Druck: 20 - 26 bar; 800 oder 1000 Umdrehungen/Minute


60

Detektion: UV/Vis Detektor bei einer Wellenlänge von 220 nm

4.1.7 LC-MS

Gerät: Thermo Finnigan Surveyor Liquid Chromatograph LCQ DECA XP

Finnigan LCQ DECA XP plus Massendetektor im ESI Modus

ThermoFinnigan: Autosampler Surveyor

ThermoQuest: MS-Pump Surveyor

ThermoQuest: PDA Detector Surveyor

Stationäre Phase: Agilent, Zorbax SB - C18; 3,5 µm; 2,1 x 150 mm

Mobile Phase: Acetonitril/Wasser mit Zusatz von 0,1 % Ameisensäure

Probenvorbereitung: in Methanol lösen

Fließmittelgradient: entspricht der analytischen HPLC


Einspritzvolumen: 10 µl

4.1.8 GC-MS

Gerät: Agilent Technologies 7890A GC-System

Agilent Technologies 7683B Series Injector

Agilent Technologies 5975C VL MSD

Stationäre Phase: Agilent 19091S-433: 325° C: 30 m x 250 µm x 0,25 µm

HP-5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane: 208. 58019

Mobile Phase: Helium

Temperaturprogramm: zu Beginn 45 ° C für 2,25 min, dann mit 6 ° C/min auf 250 ° C

Injektionsvolumen: 1 µl

Injektortemperatur: 240 ° C

Druck: 0,8145 bar

Modus: Split

Split Ratio: 50:1

Probenvorbereitung: etwas Probe in 500 µl Hexan lösen


61

4.1.9 NMR-Spektroskopie

Gerät: Varian Unitylnova 600 MHz Spectrometer

Messfrequenz: 599 MHz

Verwendete Lösungsmittel: d1 - Chloroform

d5 - Pyridin

Interner Standard: Tetramethylsilan (TMS)

4.1.10 Circulardichroismus

Gerät: Jasco Spektropolarimeter J - 175

Methode: Standardanalyse Jasco

Wellenlänge: 300 - 350 nm

Verwendetes Lösungsmittel: Methanol

Probenvorbereitung: 1 - 1,5 g Probe in Methanol lösen und Verdünnungsschritte

durchführen

4.2 Drimys winteri

4.2.1 Pflanzenmaterial

Das entsprechende Pflanzenmaterial wurde von Dr. Wolfgang Schühly und Dr. Sara

Crockett im Jahr 2007 bei Ojo de Agua, einem Bergnebelwald, in Costa Rica

gesammelt und auch identifiziert. Die Herbarbelege befinden sich im INBio (Instituto

Nacional de Biodiversidad) in Santo Domingo, Costa Rica.

4.2.2 Extraktion

Aus 450 g gemahlener Rinde wurde durch Perkolation bei Raumtemperatur ein

Dichlormethanextrakt hergestellt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum

wurden 11,3 g Extrakt erhalten.

4.2.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes

Die Auftrennung des Extrakts in einzelne Grobfraktionen erfolgte durch Vakuum-

Liquid-Chromatographie (VLC). Der Extrakt wurde zum Trocknen mit 23 g Kieselgel

(Korngröße: 0,063-0,200 mm) versetzt und auf eine mit 149 g Kieselgel (Korngröße:


62

0,040-0,063 mm) gefüllte Säule (h = 12 cm, d = 7,5 cm) aufgebracht. Zur Eluierung

wurde ein Fließmittelgradient bestehend aus n-Hexan, Ethylacetat und Methanol

verwendet.

Menge (ml)

n-Hexan (%)

Ethylacetat (%)

Methanol (%)

Fraktionsgröße (ml)

300 100 0 0 250

300 98 2 0 250

300 96 4 0 25

300 94 6 0 25

300 90 10 0 25

300 87 13 0 25

300 81 19 0 25

300 71 29 0 25

300 50 50 0 25

300 41 57 2 25

300 33 63 4 25

300 25 69 6 25

300 9 81 10 25

300 0 80 20 200

300 0 60 40 300

Tab. 16 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Drimys

Die einzelnen Grobfraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie untersucht

und jene mit ähnlichen Banden zu insgesamt 20 Fraktionen vereinigt.

Fraktion Vereinigte Fraktionen Ausbeute (g)

DWR_V1 1’, 2’, 1-5 0,631

DWR_V2 6-24 0,039

DWR_V3 25-28 0,357

DWR_V4 29-31 0,188

DWR_V5 32-35 0,117

DWR_V6 36-40 0,129

DWR_V7 41-44 0,383

DWR_V8 45-52 0,588

DWR_V9 53-59 1,649

DWR_V10 60-63 1,520

DWR_V11 64-69 0,931


63

DWR_V12 70-75 0,649

DWR_V13 76-78 0,150

DWR_V14 79-81 0,197

DWR_V15 82-84 0,184

DWR_V16 85-91 0,668

DWR_V17 92-97 1,276

DWR_V18 98-100 0,204

DWR_V19 101-111 0,645

DWR_V20 112-137 0,979

Tab. 17 Fraktionen des DCM-Extraktes von Drimys

Von allen vereinigten Grobfraktionen wurde vorerst zur Übersicht ein

Dünnschichtchromatogramm erstellt und jene Fraktionen, die als interessant

erschienen, wurden mittels HPLC eingehender betrachtet.

4.2.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen

Fraktion DWR_V1 und DWR_V2 (631 bzw. 39 mg):

In beiden Fällen bestanden diese Fraktionen aus einer klaren, etwas zähflüssigen

aber aromatisch riechenden Flüssigkeit. Deswegen wurde angenommen, dass es

sich dabei um ein Gemisch aus ätherischem Öl handelt. Eine GC-MS Analyse wurde

vorgenommen und die einzelnen Komponenten an Hand ihrer Massenspektren mit

denen von Datenbanken (Nistos, Wiley Aetherolea) verglichen. Dadurch war es

möglich die Verbindungen mit einer Wahrscheinlichkeit von über 90 % als

Bestandteile des ätherischen Öls zu ermitteln.

Fraktion DWR_V10 und DWR_V17 (1,5 bzw.1,3 g):

Diese zwei Fraktionen erschienen nach der VLC am HPLC-Chromatogramm bereits

als rein und wurden mit der NMR-Spektroskopie identifiziert.

Zur Aufarbeitung der Fraktionen DWR_V12, DWR_V18 und DWR_V19 kam

ausschließlich die präparative HPLC zum Einsatz. Die Proben wurden jeweils in

Methanol gelöst und mittels Festphasenextraktion über eine RP-18-Säule

vorgereinigt, um möglich enthaltene Schwebstoffe zu entfernen. Es wurden immer

Fließmittelgradienten bestehend aus Acetonitril/Wasser in unterschiedlicher

Zusammensetzung eingesetzt.


64

Fraktion DWR_V12 (649 mg):

Der Gradient enthielt folgende Prozente an Acetonitril und Wasser:


0 58 42

25 58 42

35 80 20

36 100 0

40 100 0

Tab. 18 präp. HPLC-Methode von DWR_V12

Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 210 nm. Die damit isolierten

Substanzen konnten mittels NMR-Spektroskopie identifiziert werden.


Da diese Fraktion eine nicht eluierbare, wasserunlösliche Substanz beinhaltete,

wurde vor der Festphasenextraktion über eine RP-18-Säule 10 % Wasser

zugegeben, um diese auszufällen. Jedoch war es in weiterer Folge nicht möglich,

diese Substanz zu isolieren und auch zu identifizieren. Der Überstand wurde mit

einem Gradienten aus Acetonitril/Wasser in den angegebenen Verhältnissen

aufgetrennt:


0 53 47

25 53 47

35 80 20

40 100 0

50 100 0


Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 205 nm. Die Identifizierung der isolierten

Substanzen wurde mittels NMR durchgeführt.


Dieses Substanzgemisch wurde mit folgendem Fließmittelgradienten aufgearbeitet:


65


0 58 42

25 80 20

30 100 0

40 100 0


Die Wellenlänge, bei der detektiert wurde, lag bei 220 nm. Von den isolierten

Verbindungen wurden zwei Fraktionen nochmals aufgereinigt, da sie

Verunreinigungen enthielten. Betroffen war die Fraktion DWR_V19_P1, die mittels

semipräparativer HPLC weiter aufgereinigt wurde, wobei isokratisch vorgegangen

und Acetotnitril/Wasser im Verhältnis 50:50 für 15 Minuten eingesetzt wurde.

Auch die Fraktion DWR_V19_P6 wurde nochmals über semipräparative HPLC

aufgetrennt. Allerdings wurde ein Acetonitril/Wasser-Gradient mit zu Beginn 58 %

Acetonitril für 15 Minuten und 100 % Acetonitril ab der 20. Minute verwendet. Auch in

diesen Fällen erfolgte die Strukturaufklärung mit der NMR-Spektroskopie.

Die restlichen Grobfraktionen wurden nicht weiter bearbeitet, da ihre Komponenten

zum Teil bereits aus den aufgearbeiteten Fraktionen isoliert und auch identifiziert

werden konnten bzw. sie laut HPLC-Profil keinen Hinweis auf neuartige

Verbindungen lieferten.



Das Pflanzenmaterial wurde gemeinsam von Dr. Wolfgang Schühly, Dr. Sara

Crockett und Mag. Eva Schembera im Frühjahr 2007 im Esquinas Regenwald von

Costa Rica gesammelt, wobei die Identifizierung durch Mag. Eva Schembera

erfolgte. Die Herbarbelege sind auch in Santo Domingo, Costa Rica, im INBio

(Instituto Nacional de Biodiversidad) hinterlegt.

4.3.2 Extraktion

Der aus 150 g pulverisiertem Drogenmaterial gewonnene Dichlormethanextrakt

wurde durch Perkolation bei Raumtemperatur hergestellt. Nach Entfernen des

Lösungsmittels am Rotavapor wurde eine Extraktmenge von 3,7 g erhalten.


66

4.3.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes

Der Extrakt wurde mit 8 g Kieselgel (Korngröße: 0,060-0,200 mm) vermengt und

durch klassische Säulenchromatographie SC (h = 10 cm, d = 4,5 cm) über 61 g

Kieselgel (Korngröße: 0,043-0,060 mm) durch einen Fließmittelgradienten bestehend

aus n-Hexan, Ethylacetat und Methanol aufgetrennt.

Menge (ml)

n-Hexan (%)

Ethylacetat (%)

Methanol (%)

Fraktionsgröße (ml)

150 100 0 0 100

150 98 2 0 100

150 96 4 0 15

150 94 6 0 15

150 90 10 0 15

150 83 17 0 15

150 70 30 0 15

150 60 40 0 15

150 50 50 0 15

150 38 60 2 15

150 26 70 4 15

150 12 80 8 15

150 0 84 16 15

150 0 76 24 15

150 0 68 32 15

150 0 60 40 150

150 0 20 80 150

Tab. 21 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Talauma

Die daraus resultierenden Grobfraktionen wurden nach dünnschicht-

chromatographischer Untersuchung an Hand der Ähnlichkeit ihrer Banden zu

insgesamt 16 Fraktionen vereinigt.

Fraktion Vereinigte Fraktion Ausbeute (g)

TGB_S1 1’, 2’, 1-11 0,129

TGB_S2 12-22 0,018

TGB_S3 23-26 0,337

TGB_S4 27-30 0,067

TGB_S5 31-38 0,170


67

TGB_S6 39-42 0,223

TGB_S7 43-45 0,190

TGB_S8 46-49 0,274

TGB_S9 50-53 0,190

TGB_S10 54-56 0,198

TGB_S11 57-61 0,147

TGB_S12 62-66 0,385

TGB_S13 67-70 0,105

TGB_S14 71-87 0,386

TGB_S15 88-95 0,453

TGB_S16 96-98 0,096

Tab. 22 Fraktionen des DCM-Extraktes von Talauma

Vorab wurde ein Übersichts-DC der vereinigten Fraktionen erstellt, worauf die viel-

versprechendsten Fraktionen mittels analytischer HPLC und NMR ausführlicher

untersucht wurden.

4.3.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen

TGB_S1 und TGB_S2 (129 bzw. 18 mg):

Bei diesen zwei Fraktionen handelte es sich um eine farblose und intensiv riechende

Flüssigkeit. Diese wurde mit GC-MS Analyse untersucht, wobei die Identifizierung

der Komponenten durch Vergleich ihrer Massenspektren mit Hilfe von Datenbanken

(Nistos und Aetherolea) stattfand.

Die Aufarbeitung der Fraktionen TGB_S7, TGB_S10 und TGB_S12 erfolgte hierbei

mittels präparativer HPLC. Zuvor wurden die Proben in einem Gemisch aus

Methanol/Wasser im Verhältnis 9:1 gelöst (c = 40 mg/ml) und im Anschluss daran

eine Festphasenextraktion (SPE) durchgeführt, um etwaigen Verunreinigungen der

Säule vorzubeugen.

Fraktion TGB_S7 (190 mg):

Ein Fließmittelgradient aus Acetonitril und Wasser wurde zur Auftrennung der

einzelnen Verbindungen verwendet:


68


0 68 32

20 68 32

30 80 20

40 100 0

50 100 0

Tab. 23 präp. HPLC-Methode von TGB_S7

Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 220 nm. Wegen der geringen Ausbeuten

konnte die chemische Struktur der isolierten Verbindungen nicht ermittelt werden.


Zur Auftrennung der Komponenten wurde ein Gradient aus Acetonitril und Wasser in

folgender Zusammensetzung verwendet:


0 75 25

15 75 25

16 100 0

30 100 0


Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 205 nm und die dadurch erhaltenen

Fraktionen wurden durch NMR-Spektroskopie identifiziert.


Wiederum wurde ein Fließmittelgradient aus Acetonitril und Wasser eingesetzt. Die

Zusammensetzung war folgendermaßen:


0 75 25

15 75 25

16 100 0

20 100 0


Detektiert wurde hier bei 280 nm. Alle isolierten Substanzen wurden mittels NMR-

Spektroskopie analysiert.


69

Bei den übrigen Grobfraktionen wurde auf Grund des erstellten HPLC-Profils nicht

detaillierter auf ihr Inhaltsstoffspektrum eingegangen, da kein Grund zur Annahme

bestand, dass noch unbekannte, nicht identifizierte Verbindungen in ausreichender

Menge enthalten sind.



Der gewöhnliche Steinbrand (Tilletia caries) stammt von einer künstlichen Infektion

auf Winterweizen und wurde im Sommer 2006 an der Versuchstation in Grabenegg

in NÖ gesammelt. Der Zwergsteinbrand (Tilletia controversa) stammt ebenfalls von

künstlich infiziertem Weizen von der Versuchsstation Lambach/Stadl-Paura in ÖÖ.

Die Auslese wurde von Mitarbeitern von Dr. Herbert Huss, Bundesanstalt für

alpenländische Landwirtschaft (Gumpenstein), durchgeführt.

4.4.2 Extraktion

Zur Ermittlung eines geeigneten Extraktionsmittels wurde vorerst 0,5 g Droge mit 10

ml des jeweiligen Lösungsmittels versetzt und am Ultraschall extrahiert, um

Referenzlösungen zu erhalten. Als Lösungsmittel wurden Dichlormethan, Methanol,

Chloroform (zuvor mit 15%igen Ammoniak befeuchten - alkalischer Extrakt) und

abermals Chloroform (vorher aber mit 10%iger Salzsäure anfeuchten - sauerer

Extrakt) verwendet. Mit den Referenzlösungen wurden Dünnschichtchromatogramme

in unterschiedlichen Fließmittelgemischen angefertigt. Die Direktauswertung wurde

im UV bei 366 nm durchgeführt. Zur Prüfung auf Alkaloide wurde noch mit dem

Dragendorff-Reagens besprüht und anschließend im Vis ausgewertet. Es stellte sich

heraus, dass anhand der DC-Banden der Dichlormethan-, der Methanolextrakt und

der alkalische Extrakt die bestmöglichen Ausbeuten erzielten.

140 g gemahlenes Drogenmaterial von Tilletia caries und 190 g von Tilletia

controversa wurden mit je 300 bzw. 350 ml des entsprechenden Lösungsmittels

versetzt und für 20 Minuten mittels Ultraschall extrahiert. Der Drogenrückstand wurde

dann getrocknet und zur weiteren Extraktion herangezogen. Von beiden wurden je

ein Dichlormethan-, ein Methanol- und ein alkalischer Extrakt (in dieser Reihenfolge)

auf analoge Weise hergestellt. Zur Entfernung von Schwebstoffen wurden sie


70

zusätzlich über Celite 545 filtriert und das jeweilige Lösungsmittel dann unter

Vakuum abrotiert.

4.4.3 Tilletia caries

4.4.3.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes

Für die Aufarbeitung von 4,5 g Extrakt kam die FCPC® zum Einsatz. Als

Fließmittelgemisch wurde n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-Wasser im Verhältnis

9:1:9:1 eingesetzt, wobei n-Hexan-Ethylacetat die mobile Phase und Methanol-

Wasser die stationäre Phase bildete. Fraktionen zu je 4 ml wurden gesammelt, im

Anschluss daran dünnschichtchromatographisch untersucht und solche Fraktionen

mit ähnlichen oder identischen Banden wurden vereinigt.

Fraktion Vereinigte Fraktion Ausbeute (mg)

Tcar_D_A1 19-21 361,5

Tcar_D_A2 22-27 58,6

Tcar_D_A3 28-33 40,9

Tcar_D_A4 34-42 68,2

Tcar_D_A5 43-51 14,2

Tcar_D_B1 2-5 38,5

Tcar_D_B2 6-11 40,7

Tcar_D_B3 12-21 17,5

Tab. 26 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia caries

Von allen vereinigten Fraktionen wurde ein HPLC-Chromatogramm angefertigt und

die Fraktionen Tcar_A2 und A4 sowie Tcar_B1 und B2 wurden durch NMR-

Spektroskopie untersucht. Als Ergebnisse erhielt man nur Fettsäuren und Glyceride,

weswegen dieser Extrakt nicht weiter aufgearbeitet wurde.

4.4.3.2 Aufarbeitung des Methanolextraktes

Die Ausbeute des Extraktes betrug nur 1,1 g, wodurch die Aufarbeitung mittels

FCPC® nahe lag. Der Extrakt enthielt eine Komponente, die im angegebenen

Fließmittelgemisch jedoch unlöslich war. Durch Zugabe von Diethylether wurde sie

ausgefällt und der restliche Extrakt zur Auftrennung verwendet. Es war aber nicht

möglich, diese Substanz mit Hilfe der NMR-Spektroskopie aufzuklären. Das


71

Fließmittelgemisch bestand wie bereits zuvor aus n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-

Wasser im Verhältnis 7:3:5:5. Abermals wurden Fraktionen zu 4 ml aufgefangen, mit

Dünnschichtchromatographie untersucht und vereinigt.


Tcar_M_A1 19-23 149,8

Tcar_M_A2 24-45 16,3

Tcar_M_B1 3-6 180,3

Tcar_M_B2 7-17 10,1

Tab. 27 Fraktionen des MeOH-Extraktes von Tilleta caries

Die Fraktionen wurden mittels HPLC überprüft, enthielten laut UV-Spektrum nur

Fettsäuren und wurden deswegen nicht weiter bearbeitet.

4.4.3.3 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes

Zur Auftrennung der einzelnen Komponenten wurde die präparative HPLC

verwendet. Die Probe (275 mg) wurde in 2 ml Methanol gelöst und über eine RP-18-

Säule (SPE) vorgereinigt. Als Fließmittelgradient wurde Acetonitril/Wasser in

folgenden Konzentrationen verwendet:


0 40 60

15 40 60

35 100 0

40 100 0

Tab. 28 präp. HPLC-Methode des alkalischen Extraktes von Tilletia caries

Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 205 nm. Da die Mengen der

isolierten Verbindungen zu gering waren, konnte nur Tcar_A8 mittels NMR als

mehrfach ungesättigte Fettsäure identifiziert werden.

4.4.4 Tilletia controversa

4.4.4.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes

Die insgesamt 2,1 g Extrakt wurden mittels FCPC® aufgearbeitet. Ein Fließmittel

bestehend aus 4 Teilen Petrolether, 0,5 Teilen Diethylether, 5 Teilen Ethanol und 1


72

Teil Wasser wurde zusammengemischt. Die stationäre Phase nahm dabei das

Petrolether-Diethylether-Gemisch, die mobile Phase die Ethanol-Wasser

Komponente ein. Fraktionen zu je 4 ml wurden erfasst, per DC hinsichtlich der

Ähnlichkeit ihrer Banden überprüft und dann vereint.


Tcon_D_A1 21-25 39,0

Tcon_D_A2 26,27 11,4

Tcon_D_A3 28-38 35,7

Tcon_D_A4 39-41 3,9

Tcon_D_A5 42-54 13,1

Tcon_D_B1 2-4 259,2

Tcon_D_B2 5 39,4

Tcon_D_B3 6-8 80,0

Tcon_D_B4 9-11 33,1

Tcon_D_B5 12-13 14,7

Tcon_D_B6 14-19 95,3

Tcon_D_B7 20,21 70,2

Tcon_D_B8 22-28 155,5

Tcon_D_B9 29-33 51,7

Tab. 29 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia controversa

Ein HPLC-Profil aller vereinigten Fraktionen wurde erstellt und anschließend wurden

die interessantesten weiter bearbeitet.

Fraktion Tcon_D_B6 (95 mg):

Die Auftrennung dieser Fraktion wurde mit präparativer Dünnschichtchromatographie

vorgenommen. Die Probe wurden in 1,2 ml Methanol gelöst und als Fließmittel wurde

n-Hexan-Ethylacetat (60:40) mit Zusatz von 1 % Methanol eingesetzt. Die drei bei

366 nm fluoreszierenden Banden wurden abgekratzt und mit einem Dichlormethan-

Methanol Gemisch eluiert. Mit Hilfe vom NMR fand man heraus, dass es sich bei

jeder Fraktion um ein Gemisch aus Fettsäuren und Sterolen handelte, deren genaue

chemische Zusammensetzung jedoch nicht ermittelt wurde.


73

Fraktion Tcon_D_B7 (70 mg):

Zur Isolierung der einzelnen Substanzen dieser Fraktion wurde die präparative HPLC

eingesetzt. Die Probe wurde in 1,2 ml Methanol gelöst und über eine RP-18-Säule

vorgereinigt. Ein Fließmittel bestehend aus Acetonitril und Wasser ermöglichte die

Auftrennung in ihre Komponenten.


0 75 25

15 75 25

16 100 0

20 100 0

Tab. 30 präp. HPLC-Methode von Tcon_D_B7

Es wurde bei 218 nm detektiert und die erhaltenen Substanzen wurden per NMR

analysiert, wobei Tcon_D_B7-3 und Tcon_D_B7-4 ebenfalls als Fettsäuren

identifiziert wurden.

4.4.4.2 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes

Zur Isolierung der Inhaltsstoffe in 1,4 g Extrakt wurde erneut die FCPC verwendet.

Als Fließmittel fungierte dabei Petrolether-Diethylether-Ethanol-Wasser im Verhältnis

4:0,5:5:1. Fraktionen zu 4 ml wurden aufgefangen, mit DC untersucht und

anschließend wurden die Fraktionen, die einander ähnlich oder sogar identisch

waren, vereinigt.


Tcon_A_A1 35,36 83,1

Tcon_A_A2 37-40 125,2

Tcon_A_A3 41-44 18,4

Tcon_A_A4 45-57 20,2

Tcon_A_B1 8 739,9

Tcon_A_B2 9 16,5

Tcon_A_B3 10-14 51,9

Tcon_A_B4 15-17 16,5

Tcon_A_B5 18-20 14,5

Tcon_A_B6 21,22 24,3

Tcon_A_B7 23-28 55,1


74

Tcon_A_B8 29-41 60,3

Tcon_A_B9 46 0,6

Tab. 31 Fraktionen des alkalischen Extraktes von Tilletia controversa

Von den vereinigten Fraktionen wurde ein HPLC-Chromatogramm gemacht und die

interessantesten unter ihnen wurden weiter bearbeitet.

Fraktion Tcon_A_A2 (125 mg):

Ein Teil (62,5 mg) dieser Fraktion wurde mittels präparativer Dünnschicht-

chromatographie aufgetrennt. Das Fließmittel bestand aus Chloroform-Methanol-

Wasser (75:25:2), wobei 1 % Ameisensäure zugegeben wurde. Die Extraktion

erfolgte mit einer Mischung aus Methanol und Dichlormethan. Mit der daraus

gewonnenen Fraktion Tcon_A_A2-1 wurde eine semipräparative HPLC durchgeführt.

Diese führte zu keinen Ergebnissen, da die Mengen für ein NMR nicht ausreichend

waren.

Auf Grund dessen wurde der Rest der Fraktion Tcon_A_A2 (62,7 mg) auch auf der

semipräparativen HPLC aufgearbeitet. Der verwendete Gradient setzte sich aus

Acetonitril/Wasser in den unten angegebenen Konzentrationen zusammen:


0 68 32

20 68 32

21 100 0

25 100 0

Tab. 32 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A2 Detektiert wurde mit dem Dioden-Array-Detektor. Von den isolierten Substanzen

konnte wegen der zu geringen Mengen keine identifiziert werden.

Fraktion Tcon_A_A3 und Tcon_A_A4 (39 mg):

Die beiden Fraktionen waren laut HPLC identisch und wurden somit vereinigt. Zur

Vorreinigung wurde die in 1 ml Methanol gelöste Probe über eine RP-18-Säule (SPE)

eluiert. Danach wurde eine semipräparative HPLC mit Acetonitril/Wasser als

Fließmittel durchgeführt.


75


0 55 45

15 55 45

20 80 20

25 80 20

26 100 0

30 100 0

Tab. 33 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A3 u. A4

Für die Detektion wurde ein Dioden-Array-Detektor verwendet. Auch in diesem Fall

waren die Mengen, die für ein NMR-Spektrum benötigt werden, zu gering.

Fraktion Tcon_A_B8 (60 mg):

Diese Fraktion wurde in 1,5 ml Methanol gelöst und mit einer Festphasenextraktion

über eine RP-18-Säule vorgereinigt. Im Anschluss daran wurde sie mit

semipräparativer HPLC durch einen Acetonitril/Wasser Gradienten aufgetrennt.


0 68 32

15 68 32

18 80 20

23 80 20

24 100 0

30 100 0

Tab. 34 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_B8

Die Detektion wurde mit einem Dioden-Array-Detektor durchgeführt. Die damit

gewonnenen Substanzen waren in zu geringen Mengen vorhanden als dass sie

näher untersucht werden konnten.

Der Methanolextrakt (303 mg) wurde nach Erstellung eines HPLC-Profils nicht auf

seine Inhaltsstoffe untersucht, da es keine Hinweise auf neue Verbindungen gab.

Zusammenfassung

76

5. Zusammenfassung

Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden die Brandbutten von Tilletia caries und Tilletia

controversa, sowie die Rinde von Drimys winteri und die Blätter von Talauma

gloriensis phytochemisch untersucht.

Der erste Teil der Arbeit beinhaltete die phytochemische Untersuchung von Tilletia

caries und Tilletia controversa, zwei Arten der Gattung Tilletia. Sie zählen zu den

Brandpilzen, die sich über Brandsporen durch Keimlingsinfektion vermehren und

vorzugsweise krautige Pflanzen und Gräser befallen. In unseren Regionen ist davon

vermehrt der Weizen betroffen, wodurch es vielfach zu einem hohen wirtschaftlichen

Schaden sowie zu Ertragseinbußen kommt. Da der Pilz Claviceps purpurea im

Roggen die Entwicklung des Mutterkorns, Secale cornutum, und damit einhergehend

die Produktion von Alkaloiden hervorruft, lag es nahe Tilletia caries und Tilletia

controversa auf das Vorhandensein von Alkaloiden zu untersuchen.

Zur Untersuchung wurden mittels Ultraschallextraktion je ein Dichlormethan-, ein

Methanolextrakt und ein alkalischer Extrakt in derselben Weise hergestellt. Die

Aufarbeitung der einzelnen Extrakte erfolgte durch chromatographische Methoden

wie der FCPC® und der präparativen HPLC. Die daraus erhaltenen Fraktionen

wurden durch Verwendung derselben Verfahren (präparative DC, präparative und

semipräparative HPLC) weiter bearbeitet. Da mit Ausnahme von Fettsäuren und

Triglyceriden keine weiteren Verbindungen isoliert und auch identifiziert wurden,

konnte die Vermutung, dass möglicherweise Alkaloide enthalten sind, demnach nicht

bestätigt werden. Die Identifizierung der einzelnen Fettsäuren und Triglyceride

mittels HPLC und GC wurde nicht vorgenommen, da dies bereits vor Jahren erfolgte.

(Beattie et al., 1993)

Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rinde von Drimys winteri, die in die Familie der

Winteraceae einzuordnen ist, auf ihre Inhaltsstoffe untersucht. Die bedeutendsten

Charakteristika der Familie sind der pfeffrige Geschmack der Rinden und Blätter, das

gefäßlose Holz sowie die primitiv ausgebildeten Narben, weshalb sie möglicherweise

auch die ursprünglichsten aller Blütenpflanzen darstellen.

Für die Untersuchung der Rinde wurde durch Perkolation ein Dichlormethanextrakt

hergestellt, der über Vakuum-Liquid-Chromatographie (VLC) mit Kieselgel als

Zusammenfassung

77

stationärer Phase und n-Hexan-Ethylacetat-Methanolmischungen als mobiler Phase

aufgetrennt wurde. Die interessantesten Fraktionen wurden über Festphasen-

extraktion vorgereinigt, mit präparativer HPLC über eine RP-18-Säule mit

Acetonitril/Wasser Gradienten aufgearbeitet und gegebenenfalls noch über eine

semipräparative HPLC gereinigt. Die Strukturaufklärung der Reinsubstanzen fand

durch die NMR-Spektroskopie (1H, 13C, HMBC, HSQC, COSY) und LC-MS Analysen

statt.

Aus Drimys wurden die verschiedensten Substanzklassen isoliert, worunter

ätherisches Öl, Sesquiterpene vom Driman-Typ, Norsesquiterpene sowie ein

einfaches Phenylpropan und Neolignane zu finden waren. Im ätherischen Öl sind

Sesquiterpene wie das Germacren D, β-Farnesen, Calamenen und β-Elemen

vorherrschend. Nahezu alle isolierten Verbindungen enthielten jedoch die typische

Struktur der Sesquiterpene mit Drimangerüst. Dazu gehören das Polygodial,

Warburganal, 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial und 1-β-(p-Cumaroyloxy)-

polygodial.

Erstmals aus Drimys wurde das Norsesquiterpen Polygonal isoliert, dessen

Vorkommen bislang nur aus Polygonum hydropiper bekannt war. Neben dem Lignan

Sesamin wurde auch die Anwesenheit von einem Phenylpropan und einem

Neolignan nachgewiesen. Eine dieser Verbindungen ist das Allylsyringol, die andere

ein Dibenzylbutyrolacton namens Haplomyrfolin, das dasselbe Grundgerüst wie das

aus Drimys bekannte Cubebin besitzt, und in Haplophyllum myrtifolium (Rutaceae)

enthalten ist.

Interessanterweise wurden in kleinen Mengen Lignane und Neolignane gefunden,

die einen Hinweis liefern, dass auch der Phenylpropanoid-Stoffwechsel in Drimys

eine Rolle spielt. Außerdem konnte durch die Isolierung der Sesquiterpene vom

Drimantyp, die besonders charakteristisch für die Familie der Canellaceae und auch

der Polygonaceae sind, neuerlich das enge Verwandtschaftsverhältnis zwischen den

Winteraceae und Canellaceae aufgezeigt werden.

Im dritten Teil der Arbeit wurden die Blätter von Talauma gloriensis, einer

Tieflandregenwaldart, die der Familie der Magnoliaceae angehört, phytochemisch

untersucht. Zur Analyse der Blätter wurde durch Perkolation ein

Dichlormethanextrakt hergestellt, der durch klassische Säulenchromatographie (SC)

über Kieselgel und einem n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-Gradienten aufgearbeitet

Zusammenfassung

78

wurde. Die vielversprechendsten Fraktionen wurden über Festphasenextraktion

(SPE) vorgereinigt und mit präparativer HPLC über eine RP-18-Säule mit

Acetonitril/Wasser Gradienten aufgetrennt. Die vollständige Strukturaufklärung der

Reinsubstanzen erfolgte durch die NMR-Spektroskopie (1H, 13C, HMBC, HSQC,

COSY) und LC-MS Analysen sowie die Bestimmung der absoluten Konfiguration

durch Messen des Circulardichroismus.

Abgesehen von ätherischem Öl, das Sesquiterpene enthielt, und einem Gemisch aus

mehreren Sterolen konnten fünf Reinsubstanzen isoliert werden. Bei diesen

Verbindungen handelt es sich um Neolignane, die über die Ringe miteinander

verknüpft (Biphenyle) sind, einen 8-Ring bilden und als Dibenzoylcyclooctadiene

bezeichnet werden. Die Benennung mit Trivialnamen erfolgte in Anlehnung an die

aus Magnolia pyramidata isolierten Pyramidatine A-H und wurde für die vier

unbekannten Verbindungen mit Pyramidatin I-L fortgesetzt.

Stereochemisch betrachtet sind diese Verbindungen Diastereomere, Atropisomere

und sehr wahrscheinlich auch Konformationsisomere. Die Feststellung der absoluten

Konfiguration, die in diesem Fall durch die 2-2’ Verbindungsachse des

Biphenylsystems festgelegt ist, erfolgte durch Messung des Circulardichroismus. Aus

dem Verlauf der Kurve kann man auf die absolute Konfiguration der Verbindung

schließen. Die Auswirkungen der Konfiguration entlang der 2-2’ Achse ist in der

Änderung der chemischen Verschiebung im 1H- und besonders im 13C-Spektrum

erkennbar. Denn je nach R- oder S-Konfiguration kommt es zur höheren oder

niedrigeren Verschiebung der ppm-Werte an der Position 8 im Cyclooctanring.

Dadurch wurde festgestellt, dass Pyramidatin H und J die R-Konfiguration und

Pyramidatin I, K und L die S-Konfiguration einnehmen. Die jeweils erhaltenen Sätze

an NMR-Messwerten stimmen mit dem Kurvenverlauf des Circulardichroismus

überein, womit die absolute Konfiguration der Verbindungen bestätigt werden konnte.

Insgesamt ist die Stoffklasse der vorkommenden Dibenzoylcyclooctadiene eher

selten anzutreffen und ausschließlich aus den Gattungen Schizandra und Magnolia

bekannt.

Literaturverzeichnis

79

6. Literaturverzeichnis

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Abbildungsverzeichnis

83

7. Abbildungsverzeichnis

Abb 1. Drimys winteri ..................................................................................................2

Abb. 2 Verbreitungskarte der Winteraceae ..................................................................

(Quelle:http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/orders/canellalesweb.ht

m#Winteraceae)...................................................................................................3

Abb. 3 Drimys winteri a.) Habitus b.) Frucht (Quelle: Pennington et al., 2004) ...........4

Abb. 4 Drimangrundgerüst ..........................................................................................4

Abb. 5 Warburganal ....................................................................................................5

Abb. 6 Polygodial ........................................................................................................5

Abb. 7 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial ...........................................................5

Abb. 8 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial........................................................................5

Abb. 9 Talauma gloriensis a.) Blätter, b.) Knospe, c u. d.) Frucht ................................

(Quelle:http://www.sura.ots.ac.cr/lokal/florula3/en/fr_galeria.php u. Foto Schühly,

2008)....................................................................................................................7

Abb. 10 Verbreitungskarte der Magnoliaceae ..............................................................

(Quelle:http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/orders/magnolialesweb.

htm#Magnoliaceae) .............................................................................................8

Abb. 11 Talauma gloriensis Habitus und Frucht (Quelle: Hammel et al., 2007)..........9

Abb. 12 Lignangrundgerüst .........................................................................................9

Abb. 13 3,3'-Neolignan................................................................................................9

Abb. 14 8,3'-Neolignan................................................................................................9

Abb. 15 Guaianolid....................................................................................................10

Abb. 16 Tilletia caries und Tilletia controversa (Quelle: Schöber-Butin et al., 1999 u.

Foto Huss, 2005) ...............................................................................................11

Abb. 17 Pathogenese der Brandpilze............................................................................

(Quelle:www.dapp.boku.at/fileadmin/_/H950-Pflanzen/H953-bilder/pdf-lehre/

953303-Teil02.pdf).............................................................................................13

Abb. 18 Tilletia controversa Schleimhülle (Quelle: Foto Huss, 2007)........................13

Abb. 19 Isolierschema von Drimys ............................................................................16

Abb. 20 GC-Chromatogramm von DWR_V1.............................................................17

Abb. 21 GC-Chromatogramm von DWR_V2.............................................................19

Abb. 22 Polygodial (DWR_V10) ................................................................................20

Abb. 23 UV-Spektrum von Polygodial .......................................................................20

Abb. 24 1H-NMR-Spektrum von Polygodial...............................................................21

Abb. 25 Allylsyringol (DWR_V12_P1) .......................................................................22


84

Abb. 26 UV-Spektrum von Allylsyringol.....................................................................22

Abb. 27 1H-NMR-Spektrum von Allylsyringol ............................................................22

Abb. 28 Polygonal (DWR_V12_P2) ..........................................................................23

Abb. 29 UV-Spektrum von Polygonal........................................................................23

Abb. 30 1H-NMR-Spektrum von Polygonal................................................................24

Abb. 31 Warburganal (DWR_V12_P3)......................................................................25

Abb. 32 UV-Spektrum von Warburganal ...................................................................25

Abb. 33 1H-NMR-Spektrum von Warburganal...........................................................25

Abb. 34 Sesamin (DWR_V12_P4) ............................................................................26

Abb. 35 UV-Spektrum von Sesamin..........................................................................26

Abb. 36 1H-NMR-Spektrum von Sesamin .................................................................27

Abb. 37 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial (DWR_V17)...................................28

Abb. 38 UV-Spektrum von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial ..........................28

Abb. 39 1H-NMR-Spektrum von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial..................28

Abb. 40 Haplomyrfolin (DWR_V18_P3) ....................................................................30

Abb. 41 UV-Spektrum von Haplomyrfolin..................................................................30

Abb. 42 1H-NMR-Spektrum von Haplomyrfolin .........................................................30

Abb. 43 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial (DWR_V19_P6) .........................................31

Abb. 44 UV-Spektrum von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial.......................................31

Abb. 45 1H-NMR-Spektrum von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial ..............................32

Abb. 46 Isolierschema von Talauma .........................................................................35

Abb. 47 GC-Chromatogramm von TGB_S1..............................................................35

Abb. 48 GC-Chromatogramm von TGB_S2..............................................................36

Abb. 49 Pyramidatin I (TGB_S10_P2) ......................................................................38

Abb. 50 UV-Spektrum von Pyramidatin I...................................................................38

Abb. 51 Massenspektrum von Pyramidatin I .............................................................38

Abb. 52 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin I ..........................................................39

Abb. 53 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin I .........................................................39

Abb. 54 Pyramidatin H (TGB_S10_P3).....................................................................40

Abb. 55 UV-Spektrum von Pyramidatin H .................................................................40

Abb. 56 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin H.........................................................41

Abb. 57 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin H .......................................................41

Abb. 58 Pyramidatin K (TGB_S12_P1) .....................................................................43

Abb. 59 UV-Spektrum von Pyramidatin K .................................................................43

Abb. 60 Massenspektrum von Pyramidatin K............................................................43

Abb. 61 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin K .........................................................44

Abb. 62 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin K........................................................44


85

Abb. 63 Pyramidatin L (TGB_S12_P2) .....................................................................45

Abb. 64 UV-Spektrum von Pyramidatin L..................................................................45

Abb. 65 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin L .........................................................46

Abb. 66 Pyramidatin J (TGB_S12_P3)......................................................................47

Abb. 67 UV-Spektrum von Pyramidatin J..................................................................47

Abb. 68 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin J..........................................................48

Abb. 69 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin J ........................................................48

Abb. 70 Pyramidatin I................................................................................................49

Abb. 71 Pyramidatin H ..............................................................................................49

Abb. 72 CD-Spektrum von Pyramidatin I ..................................................................50

Abb. 73 CD-Spektrum von Pyramidatin H.................................................................50

Abb. 74 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin I...................................................................51

Abb. 75 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin H .................................................................51

Abb. 76 Pyramidatin K ..............................................................................................51

Abb. 77 Pyramidatin J ...............................................................................................51

Abb. 78 CD-Spektrum Pyramidatin K........................................................................52

Abb. 79 CD-Spektrum Pyramidatin J ........................................................................52

Abb. 80 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin K .................................................................52

Abb. 81 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin J ..................................................................52

Abb. 82 Isolierschema von Tilletia caries ..................................................................54

Abb. 83 UV-Spektrum der gelb gefärbten Verbindung in T. controversa ..................55

Abb. 84 Isolierschema von Tilletia controversa .........................................................56

Tabellenverzeichnis

86

8. Tabellenverzeichnis

Tab. 1 NMR-Daten von Polygodial in CDCl3 .............................................................21

Tab. 2 NMR-Daten von Allylsyringol in CDCl3...........................................................23

Tab. 3 NMR-Daten von Polygonal in CDCl3 ..............................................................24

Tab. 4 NMR-Daten von Warburganal in CDCl3 .........................................................26

Tab. 5 NMR-Daten von Sesamin in CDCl3................................................................27

Tab. 6 NMR-Daten von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial in CDCl3 ................29

Tab. 7 NMR-Daten von Haplomyrfolin in CDCl3........................................................31

Tab. 8 NMR-Daten von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial in CDCl3.............................33

Tab. 9 NMR-Daten von Pyramidatin I in CDCl3.........................................................40

Tab. 10 NMR-Daten von Pyramidatin H in CDCl3 .....................................................42

Tab. 11 NMR-Daten von Pyramidatin K in CDCl3 .....................................................45

Tab. 12 NMR-Daten von Pyramidatin L in CDCl3 ......................................................47

Tab. 13 NMR-Daten von Pyramidatin J in CDCl3 ......................................................49

Tab. 14 HPLC-Standardmethode (Gradient).............................................................58

Tab. 15 FCPC-Fließmittelsysteme ............................................................................59

Tab. 16 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Drimys ...........................................62

Tab. 17 Fraktionen des DCM-Extraktes von Drimys .................................................63

Tab. 18 präp. HPLC-Methode von DWR_V12...........................................................64



Tab. 21 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Talauma ........................................66

Tab. 22 Fraktionen des DCM-Extraktes von Talauma ..............................................67

Tab. 23 präp. HPLC-Methode von TGB_S7..............................................................68

Tab. 24 präp. HPLC-Methode von TGB_S10............................................................68

Tab. 25 präp. HPLC-Methode von TGB_S12............................................................68

Tab. 26 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia caries .......................................70

Tab. 27 Fraktionen des MeOH-Extraktes von Tilleta caries ......................................71

Tab. 28 präp. HPLC-Methode des alkalischen Extraktes von Tilletia caries .............71

Tab. 29 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia controversa ..............................72

Tab. 30 präp. HPLC-Methode von Tcon_D_B7.........................................................73

Tab. 31 Fraktionen des alkalischen Extraktes von Tilletia controversa .....................74

Tab. 32 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A2 .................................................74

Tab. 33 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A3 u. A4........................................75

Tab. 34 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_B8 .................................................75

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