DREIDIMENSIONALE STRUKTUR UND …€¦ · Aus der Universitätsklinik für Zahn-, Mund- und...

Aus der Universitätsklinik für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde

Abteilung Poliklinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.

(Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. E. Hellwig)

DREIDIMENSIONALE STRUKTUR- UND VITALITÄTSVERTEILUNG

ORALER BAKTERIELLER BIOFILME (DENTALER PLAQUE)

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg i. Br.

Vorgelegt 2003

von Nicole Hein

geboren in Dillingen/Donau

Dekan Prof. Dr. J. Zentner

1. Gutachter PD Dr. N. Arweiler

2. Gutachter Prof. Dr. Dr. N.-C. Gellrich

Jahr der Promotion 2004

GEWIDMET MEINEN ELTERN, JOSEFINE HEIN, GEB. BESTLE UND MICHAEL HEIN

1

INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 4

2 Literaturübersicht 6

2.1 Der Biofilm 6

2.1.1 Charakteristika von Biofilmen 6

2.1.2 Rolle der extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 8

2.1.3 Biofilme und Gesundheit 8

2.1.4 Die Entwicklung des dentalen Biofilms 10

2.1.4.1 Pellikelbildung 10

2.1.4.2 Bakterielle Besiedelung 11

2.1.4.3 Reifung der Plaque 11

2.1.5 Derzeitiges Biofilm-Modell 12

2.2 Untersuchung von Biofilmen 13

2.3 Vitalfluoreszenztechnik 14

2.4 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 15

3 Versuchsplanung 18

3.1 Vorversuch 18

3.2 Versuch 1: Abhängigkeit der Biofilmbildung von der Lokalisation 19

3.3 Versuch 2: Abhängigkeit der Biofilmbildung von der Zeit 20

4 Material und Methode 21

4.1 Vorversuch 21

4.1.1 Probeplättchen 21

4.1.2 Bakterienstämme 21

4.1.3 Versuchsablauf 21

4.1.4 Vitalfluoreszenzfärbung 22

4.1.5 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) 22

4.1.6 Ergebnisse des Vorversuchs 23

4.2 Versuch 1 24

INHALTSVERZEICHNIS 2

4.2.1 Probanden 24


4.2.3 Schienen 25

4.2.3.1 Materialien zur Herstellung der Schienen 25

4.2.3.2 Geräte zur Herstellung der Schienen 26

4.2.3.3 Herstellung der Schienen 26

4.2.3.4 Bestückung der Schienen 27

4.2.3.5 Desinfektion 27

4.2.4 Klinischer Ablauf 28

4.2.4.1 Verfahren/Zeitraum 28

4.2.4.2 Entnahme der Proben 29

4.2.5 Vitalfärbung der Proben 29


4.2.7 Auswertung der CLSM-Daten 29

4.2.8 Statistische Analyse 30

4.3 Versuch 2 30

4.3.1 Probanden 30


4.3.3 Schienen 32

4.3.3.1 Bestückung der Schienen 32

4.3.3.2 Desinfektion 32

4.3.4 Klinischer Ablauf 32

4.3.4.1 Verfahren/Zeitraum 32

4.3.4.2 Entnahme der Proben 33

4.3.5 Vitalfärbung der Proben 33


4.3.7 Auswertung der CLSM-Daten 33

4.3.8 Statistische Analyse 34

5 Ergebnisse 35

5.1 Versuch 1 35

5.1.1 Biofilmdicke (BD) 35

5.1.2 Vitalität (VF) 37

INHALTSVERZEICHNIS 3

5.2 Versuch 2 40

5.2.1 Biofilmdicke (BD) 40

5.2.2 Vitalität (VF) 40

6 Diskussion 43

6.1 Methodische Diskussion 43

6.1.1 Trägersysteme zur Plaquegewinnung 43

6.1.2 Glasplättchen als Trägermaterial 46

6.2 Biofilmdicke 47

6.3 Vitalfluoreszenz 50

7 Zusammenfassung 53

8 Literaturverzeichnis 54

9 Anhang 62

9.1 Probandeninformation 62

9.2 Vitalität nach 8 und 24 Stunden (in vitro) 63

9.3 Dicken der Biofilme in µm an den Tagen 1 bis 7 65

9.4 Mittelwerte ± Standardabweichungen der Vitalitäten an den Tagen 1-7 66

9.5 Vitalität der 8 Probanden nach 48 h im OK und UK 67

9.6 Übersicht der Vitalität nach Probanden geordnet (Tage 1 bis 7) 71

9.7 Übersicht der Vitalität aller Probanden nach Tagen geordnet 73

Danksagung 76

Lebenslauf 77

4

1 EINLEITUNG

Die dentale Plaque stellt eine dem Zahnarzt wohlbekannte Struktur dar. Sie wird

aus heutiger Sicht als bakterieller Biofilm charakterisiert.

Unter dem Begriff „Biofilm“ versteht man Strukturen, die aus Mikroorganismen und

deren metabolischen Produkten bestehen, diese sind in der Regel schleimartige,

klebrige Substanzen.

Biofilme entstehen jedoch nicht nur in der Mundhöhle, sondern sind ubiquitär.

Solche Strukturen beschäftigen die Wissenschaft und insbesondere die Medizin

schon seit langem. Die frühesten Beobachtungen von Biofilmen gehen auf Antonie

van Leeuwenhoek (1632-1723) zurück, der 1683 als Erster diesen weichen Belag

beschrieb, von dem damals angenommen wurde, dass er haupsächlich aus

Speiseresten besteht. Er veröffentlichte erstmalig Zeichnungen von Bakterien aus

menschlichen Zahnbelägen.

Biofilme sind nicht nur für 65 % aller vorkommenden Infektionserkrankungen in der

industrialisierten Welt verantwortlich, sondern verursachen Millionenschäden in

Industrie und Technik durch Besiedelung von Tanks und Leitungssystemen aller

Art. Aus hygienischer Sicht sind Biofilme als Infektionsquellen von Bedeutung, da

sie einen geschützten Lebensraum für Krankheitserreger darstellen, die sich dort

ansiedeln und vermehren können. Das Leben im Biofilm kann eine erhöhte

Unempfindlichkeit dieser Pathogene gegenüber Antibiotika, Desinfektionsmitteln

oder Immunabwehr des Wirtes bewirken.

Auch die dentale Plaque stellt einen medizinisch wichtigen Biofilm dar. Sie gilt als

ätiologischer Faktor für Karies, Gingivitis und Parodontitis. Daher besteht großer

Bedarf, Informationen über das natürliche Biofilmwachstum und seine

dreidimensionale Struktur zu erhalten, um das Entstehen und Fortschreiten dieser

Erkrankungen zu verhindern. Hierbei spielen auch die Dicke und die Verteilung

von lebenden und toten Bakterien (Vitalität) in den verschiedenen Biofilmschichten

eine entscheidende Rolle.

Die bakterielle Adhärenz auf oralen Oberflächen wurde bereits in In vitro-Studien

untersucht. Dabei wurde versucht, die Bedingungen in der Mundhöhle zu

imitieren. Die menschliche Mundhöhle ist jedoch wegen ihrer Vielzahl an

verschiedenen Mikroorganismen, Scherkräften und antibakteriellen Eigenschaften

EINLEITUNG 5

des Speichels nicht mit In vitro-Untersuchungsbedingungen zu vergleichen. Es ist

daher für eine genauere Untersuchung des Biofilms notwendig, In situ-Modelle zu

etablieren. Die Erforschung des unbeschädigten Biofilms wird durch das konfokale

Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) bzw. durch Kopplung mit der

Vitalfluoreszenztechnik ermöglicht.

Aufgrund der sehr aufwändigen Methode zur Biofilmgewinnung über intraorale

Schienen existieren bisher nur wenige Daten über Biofilmdicke und -vitalität.

Ziel dieser Studie war es somit, mittels der oben genannten Techniken, die Dicke

und Vitalitätsverteilung von in situ Biofilmen in Abhängigkeit von der Lokalisation

und der Zeit zu untersuchen.

6

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 DER BIOFILM

2.1.1 CHARAKTERISTIKA VON BIOFILMEN

Die klassische Mikrobiologie ging lange Zeit davon aus, dass Bakterien als

Einzellebewesen in einem flüssigen Medium leben, welches sie auch ernährt.

Biofilm-Forschungen haben aber gezeigt, dass unter den meisten natürlichen

Umweltbedingungen der Biofilm die vorherrschende Lebensform der Bakterien ist

(Watnick und Kolter 2000). Die Fähigkeit von Bakterien, strukturierte

Gemeinschaften zu bilden, bietet ihnen den Vorteil, Nährstoffe zu akkumulieren

und wiederzuverwerten, sich gegen äußere Einflüsse zu schützen, sowie leicht

Signale und Gene austauschen zu können. Biofilme lassen sich als erster Schritt

der Evolution zu vielzelligen Organismen verstehen (Flemming und Wingender

2001a).

Allen Biofilmen ist gemeinsam, dass die Mikroorganismen in eine Matrix aus

extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) eingebettet sind, die die Haftung an

Oberflächen ermöglicht und sie zusammenhält (Flemming und Wingender 2001a).

Biofilme entstehen prinzipiell an allen Grenzflächen zweier Phasen. Das bedeutet,

dass sie sich nicht nur an der Grenzfläche zwischen Wasser und festen Medien

entwickeln können, sondern auch zwischen Wasser und Luft sowie zwischen

Feststoff und Atmosphäre, wie z.B. an natürlichem Gestein oder an Mauern.

Gewisse Grundvoraussetzungen müssen für die Entstehung von Biofilmen aber

erfüllt sein: Das Vorhandensein von Grenzflächen, ausreichend Wasser, mikrobiell

verwertbare Nährstoffe und die Mikroorganismen selbst. Da diese Bedingungen

praktisch ubiquitär sind, sind Biofilme in der Natur, in technischen Systemen und

im medizinischen Bereich weit verbreitet (Costerton et al. 1987).

Auch die dentale Plaque wird aus heutiger Sicht zu den bakteriellen Biofilmen

gezählt (Caldwell et al. 1997; Netuschil et al. 1998).

Bakterienzellen im Verband des Biofilms verhalten sich völlig anders als dieselbe

Spezies in freibeweglicher (planktonischer) Form. Einige Autoren weisen darauf

hin, dass die Plaque in Form von Biofilmen untersucht werden muss und nicht als

LITERATURÜBERSICHT 7

Einzelbakterien, die in einer Lösung vorliegen („dispersed“ bzw. „planctonic“)

(Sissons et al. 1996; Wilson et al. 1996).

Der Metabolismus solcher Biofilm-Zellen untereinander ist sehr unterschiedlich

und hängt von der Lokalisation jeder einzelnen Zelle in verschiedenen

Zellschichten ab, die den Biofilm bilden (Costerton und Lewandowski 1995).

Zellen, die in den oberen Regionen des Biofilms angesiedelt sind, haben leichter

Zugang zu Nahrung und Sauerstoff und haben weniger Probleme ihre

Abfallprodukte zu beseitigen. Diese Zellen sind stoffwechselaktiv und besitzen

eine normale Größe. Zellen der Biofilmoberfläche scheinen sehr ähnliche

Eigenschaften zu haben wie planktonisch gewachsene Zellen. Im Gegensatz dazu

ist bei Zellen, die in eine Matrix aus extrazellulären Polysacchariden eingebettet

sind, der Stoffwechsel aufgrund eines geringeren Nahrungs- und

Sauerstoffangebots reduziert. Solche Biofilmzellen sind an ihre Umgebung, die

durch eine Ansammlung von metabolischen Abfallprodukten charakterisiert ist,

angepasst. Im Biofilm eingebettete Zellen befinden sich in einer ruhenden Phase

und sind kleiner als die Zellen der Biofilmoberfläche, die Zellteilungsrate ist

verringert (Anwar et al. 1992).

Dieses unterschiedliche Verhalten der Bakterienzelle in Abhängigkeit von der

Lokalisation spielt z.B. bei der Gabe von Antibiotika eine Rolle. Die Empfindlichkeit

einer im Biofilm eingebetteten Bakterienzelle gegenüber antibiotischen

Substanzen ist im Vergleich zu freibeweglichen oder an der Biofilmoberfläche

gelegenen Bakterien deutlich herabgesetzt. Ein sequenzieller Abbau dieser

Substanzen findet im Biofilm leichter statt, weil die Nutzung auch schwer

abbaubarer Substrate durch die Zusammenarbeit verschiedener Spezialisten im

Biofilm möglich ist. Die Antibiotika-Moleküle werden zum einen an die von den

Biofilmzellen gebildeten extrazellulären Polysaccharide gebunden und durch

spezielle Enzyme inaktiviert. Außerdem sind Biofilmzellen, die als langsam

wachsene Zellen gelten, generell weniger empfindlich gegenüber Antibiotika,

vermutlich weil die Membran dieser Zellen weniger durchlässig ist (Anwar et al.

1992). Insgesamt bietet der Biofilm den Mikroorganismen die Möglichkeit, auch

unter schwierigen Umgebungsbedingungen zu überleben.


2.1.2 ROLLE DER EXTRAZELLULÄREN POLYMEREN SUBSTANZEN (EPS)

Die extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) stellen die Schlüsselmoleküle für

die Vereinigung von Mikroorganismen zum Biofilm dar. Eigenschaften der EPS

sind von wesentlicher Bedeutung für die Zusammensetzung, Struktur und

Funktion der Biofilme. Allen Biofilmen ist gemeinsam, dass die EPS sie

zusammenhalten, ihnen Form verleihen und für die physikalischen Eigenschaften

des Biofilms verantwortlich sind (Anwar et al. 1992; Flemming und Wingender

2001a). Sie vermitteln auch die Bindung an Oberflächen (Anwar et al. 1992;

Flemming und Wingender 2001a). Die EPS bilden meistens eine hoch

hydratisierte heterogene Schleim-Matrix, die wie ein schwammähnliches Gel

aufgebaut ist und so die Mikroorganismen in ihrer dreidimensionalen Anordnung

fixiert. Die EPS bestehen überwiegend aus geladenen (meist anionischen) oder

neutralen Polysacchariden und Proteinen, es können jedoch auch Anteile von

Nucleinsäuren, Lipiden und anderen Makromolekülen enthalten sein (Flemming

und Wingender 2001b). Geladene Gruppen der Polymere (z.B. Carboxylgruppen

von Uronsäuren) sowie Substituenten (z.B. Acetylgruppen in Polysacchariden)

beeinflussen ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Festigkeit,

Viskosität und Wasserbindungskapatzität. Für polysaccharidhaltige Strukturen wie

Kapseln oder Schleime wurde der Begriff „Glykokalix“ eingeführt (Costerton et al.

1987). Zellteilungen innerhalb dieser Glykokalix-Matrix resultieren in der Bildung

von Mikrokolonien. Durch Ansteigen von Größe und Anzahl der anhaftenden

Mikrokolonien bilden sich etablierte Biofilme aus (Caldwell und Lawrence 1986;

Costerton et al. 1987).

2.1.3 BIOFILME UND GESUNDHEIT

Intakte Biofilme, wie sie auf der Haut, im Darm und in Schleimhäuten vorkommen,

sind von grundlegender Bedeutung für die menschliche Gesundheit. Geraten

diese Biofilme aus dem Gleichgewicht, können schwerwiegende Krankheiten

entstehen. Biofilme können auch als unerwünschte Biofilmbildung (sogenanntes

„Biofouling“) große Schwierigkeiten hervorrufen. Besonders problematisch sind sie


in medizinischen Geräten und auf Implantaten, wo sie Ursache für

lebensbedrohliche Infektionskrankheiten sein können (Costerton et al. 1987).

Patienten mit der Erbkrankheit der Mukoviszidose können sich mit

schleimbildenden Bakterien der Art Pseudomonas aeruginosa infizieren, die das

geschwächte Epithel in Form von Biofilmen besiedeln. Diese Biofilme können aber

durch die humoralen sowie zellulären Immunabwehrmechanismen nicht entfernt

werden. Auch in Biofilmen von Hausinstallationen können sich typische

Wasserbakterien mit pathogenem Potential (opportunistische Krankheitserreger)

ansiedeln, wie zum Beispiel Legionellen oder Pseudomonas aeruginosa

(Flemming und Wingender 2001a).

Die dentale Plaque gilt als wichtigster ätiologischer Faktor für die Entstehung von

Karies, Gingivitis und Parodontitis (Löe et al. 1965; Theilade et al. 1966; Theilade

1989). Bei fehlender Mundhygiene und häufiger Saccharosezufuhr lassen sich

innerhalb von 23 Tagen erkennbare kariöse Veränderungen erzeugen. Diese

Frühveränderungen sind reversibel (Von der Fehr et al. 1970). Die Beziehung

zwischen Plaque und Gingivitis ist ebenfalls klar. Wenn bei gereinigten

Zahnoberflächen, die von gesunder Gingiva umgeben sind, jegliche Mundhygiene

eingestellt wird, so entwickelt sich innerhalb von drei Tagen eine subklinische

Gingivitis und innerhalb von 10-21 Tagen eine klinisch feststellbare Gingivitis (Löe

et al. 1965; Theilade et al. 1966; Löe et al. 1967; Jensen et al. 1968). Diese

Gingivitis ist reversibel, wenn die Plaque durch Zähneputzen oder durch

Anwendung einer antibakteriellen Spüllösung, wie z.B. Chlorhexidin, wieder

entfernt wird (Löe 1970).

Besonders die Parodontitis beeinflusst als orale Infektion den Verlauf und die

Pathogenität einer Reihe systemischer Erkrankungen. Die mikrobielle Besiedelung

der Mundhöhle gilt als primäre Ursache für Parodontitiden, die einen Nährboden

für die Vermehrung parodontalpathogener Keime darstellt. Ihre Ätiologie und

Pathogenese wird jedoch als multifakoriell angesehen und durch ein komplexes

Zusammenspiel angeborener, erworbener und verhaltensbedingter Faktoren

bestimmt (Dörfer 2002).


2.1.4 DIE ENTWICKLUNG DES DENTALEN BIOFILMS

2.1.4.1 PELLIKELBILDUNG

An der Phasengrenze zwischen Zahnoberfläche und Mundhöhle kommt es durch

die Adsorption von Proteinen und anderen Makromolekülen aus dem Speichel zur

Ausbildung einer Biopolymerschicht (Norde 1984), welche auch Pellikel oder

pellicula dentis genannt wird (Dawes et al. 1963; Zuhrt 1964).

Die Bildung dieser dünnen Schicht (0,1-1 µm) beruht auf der selektiven Adsorption

spezifischer Speichelproteine, wie sauren prolinreichen Proteinen, Glykoproteinen,

Serumproteinen, Enzymen und Immunglobulinen, welche aufgrund des

Speichelflusses in hoher Menge vorhanden sind (Hannig 1993; Hannig 1997).

Das Adsorptionsverhalten der Proteine wird in erster Linie über elektrostatische

Anziehungskräfte bestimmt, die aufgrund ihrer Eigenladungen an die

Kalziumionen und Phosphatgruppen des Apatits der Zahnhartsubstanzen binden

(Hay 1973; Rölla und Bowen 1978).

Es spielen aber auch andere Bindungsarten wie Wasserstoffbrückenbindungen,

van der Waal´s Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen eine Rolle (Pruitt 1977;

Glantz und Larsson 1981; Gorbunoff und Timasheff 1984).

Die Pellikel schützt als semipermeable Membran vor einem Verlust von Kalzium

und Phosphat, indem der Ionenfluss reduziert wird (Schüle 1961; Zahradnik et al.

1976). Außerdem verringert sie den Einfluss einwirkender Säuren. Sie bietet so

einen Schutz vor Demineralisation und damit auch vor Karies (Meckel 1965;

Weiss und Bibby 1966; Arends et al. 1986). Eine weitere Funktion ist die

Herabsetzung der Friktion antagonistischer Zahngruppen. So bietet die Pellikel

den Zähnen Schutz vor Abrasion und Attrition (Mayhall 1980; Nikiforuk 1985).

Neben diesen positiven Eigenschaften hat die Pellikel jedoch den Nachteil, dass

ihre Bildung eine Veränderung der physikalischen und chemischen Eigenschaften

der Schmelzoberfläche bewirkt, wodurch den Bakterien ein Anheften an die

pellikelbedeckte Oberfläche ermöglicht wird. (Pruitt et al. 1969; Van Pelt et al.

1983). Sie ist damit Ausgangspunkt der Biofilmbildung.


2.1.4.2 BAKTERIELLE BESIEDELUNG

Für zahlreiche Arten von Mikroorganismen stellt die Mundhöhle ein natürliches

Biotop dar. Die Fähigkeit oraler Mikroorganismen, an der Zahnoberfläche zu

adhärieren, ist von großer Bedeutung für die weitere bakterielle Akkumulation und

Proliferation und damit auch für die Pathogenität des Zahnbelages (Van Houte et

al. 1970; 1971; Gibbons und Van Houte 1975).

Der erste Schritt der bakteriellen Kolonisation besteht in der Anheftung der

Mikroorganismen an die pellikelbedeckte Schmelzoberfläche. Bei diesem Vorgang

ist es erforderlich, dass die Mikroorganismen unter den hydrodynamischen

Bedingungen des oralen Milieus irreversibel adhärieren und anschließend

proliferieren können (Marsh und Bradshaw 1995). Bei den anfänglich auf der

Zahnoberfläche anhaftenden Bakterien handelt es sich um verschiedene

Streptokokkenarten, vor allem S. sanguis und in geringerem Umfang S. mitis und

S. mutans (Van Houte et al. 1970; Rönström et al. 1977; Socranscy et al. 1977;

Theilade et al. 1982; Liljemark et al. 1986). Neben den verschiedenen

Streptokkokenspezies zählen auch grampositive Stäbchenbakterien zu den

„Erstbesiedlern“ (Socranscy et al. 1977; Nyvad und Kilian 1987). Zu den

vorherrschenden stäbchenförmigen Mikroorganismen der Initialplaque zählen die

Aktinomyzeten, wie A. naeslundii und A. viscosus (Rönström et al. 1977;

Socranscy et al. 1977; Theilade et al. 1982; Liljemark et al. 1986; Nyvad und Kilian

1987).

2.1.4.3 REIFUNG DER PLAQUE

Durch weitere Ansiedlung von Bakterien und durch Zellteilung kommt es zur

Bildung von Mikrokolonien. In dieser Phase der mikrobiellen Akkumulation wird die

Bildung der extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) ausgelöst (Costerton

und Lewandowski 1995). Die Bakterien reagieren, nachdem sie einen sessilen

Zustand eingenommen haben mit einer Änderung ihrer Genaktivität, was zu

Veränderungen der Stoffwechselaktivität und Zellstruktur führt (Davies et al. 1993;


Hoyle et al. 1993). Dies stellt ein deutliches Unterscheidungsmerkmal zu

„planktonischen“ Bakterien dar.

Biofilme erreichen aber keine unbegrenzte Dicke, sondern es stellt sich ein

Gleichgewicht zwischen Neubildung und Ablösung im Biofilm ein. Durch

Scherkräfte werden Biofilmmikroben passiv als einzelne Zellen abgelöst

(„Erosion“) oder es kommt zur Ablösung ganzer Biofilmfetzen. Dies bezeichnet

man als so genanntes „Sloughing“ (Flemming und Wingender 2001a). Es gibt

auch Hinweise, dass Bakterien befähigt sind, den Verband des Biofilms als

„Schwärmerzellen“ aktiv zu verlassen und an anderen Stellen neue Biofilme zu

bilden beginnen. Ein Mechanismus, der die Freisetzung solcher Zellen aus dem

Biofilm erlaubt, funktioniert folgendermaßen: Diese Bakterien scheiden Enzyme

aus, welche Strukturpolysaccharide im Bereich der Zelle abbauen und so eine

Loslösung des Bakteriums aus dem Biofilmverband ermöglichen (Allison et al.

1998) .

Im Lauf der Zeit verändert sich die Zusammensetzung der Plaque. Bis ungefähr

zum vierten Tag besteht die Plaque hauptsächlich aus grampositiven Kokken.

Nach und nach gesellen sich grampositive und gramnegative Stäbchen hinzu.

Zuletzt sind die Spirochäten als Besiedler zu nennen. Der Charakter der

Plaqueflora ändert sich von aerob zu anaerob (Löe et al. 1965).

Es ist ebenfalls bekannt, dass mikrobielle Populationen sich in verschiedenen

Zustandsstadien befinden können. Dies bedeutet, die Bakterien können sich in

einer schnellen oder langsamen Wachstumsphase befinden, schlafen oder auch

tot sein (Roszak und Colwell 1987a; Roszak und Colwell 1987b). Dies trifft auch

auf die Plaquebakterien zu (Netuschil et al. 1989; Sissons et al. 1991). Es gibt

jedoch nur wenige Daten, die den Vitalitätszustand unter Berücksichtigung der

dreidimensionalen Struktur intakter oraler Biofilme wiedergeben (Auschill et al.

2001; 2002; Zaura-Arite et al. 2001).

2.1.5 DERZEITIGES BIOFILM-MODELL

Die meisten Biofilme in aquatischen Systemen sind mehr oder weniger heterogen

aufgebaut. Bakterien lagern sich als Mikrokolonien übereinander und werden


durch die EPS zusammengehalten. Sie bilden dabei pilzähnliche Strukturen, die

von der Aufwuchsoberfläche in die umgebende Wasserphase reichen. Der Biofilm

ist von Poren und Kanälen durchzogen, welche den konvektiven Stofftransport im

Biofilm ermöglichen. So werden auch diejenigen Organismen mit Nährstoffen

versorgt, die in der Tiefe des Biofilms angesiedelt sind (Costerton und

Lewandowski 1995). Die Anzahl der interstitiellen Kanäle nimmt im Lauf der Zeit

wegen veränderter Fließeigenschaften und verminderter Austauschprozesse ab.

Die Gesamtstruktur des Biofilms ist letztendlich von der Fließgeschwindigkeit des

Systems abhängig. Es wird angenommen, dass die oberen Biofilmlagen

miteinander verbunden sind und brückenartige Strukturen bilden (Roberts et al.

1999).

Charakteristisch für Biofilme ist die relativ hohe Zelldichte im Vergleich zur

Umgebung. Biofilme an aquatischen Standorten können bis zu 1012 Zellen pro

Milliliter Biovolumen enthalten. Dies sind Konzentrationen, die um den Faktor 103

bis 104 höher liegen als in einer freien wässrigen Phase bzw. in einer Labor-

Flüssigkultur (Flemming und Wingender 2001a).

2.2 UNTERSUCHUNG VON BIOFILMEN

Die Erforschung des Biofilms wird von Robinson et al. (1997) als extrem schwierig

beschrieben, da die Biofilme sehr dünn sind. Des weiteren ist die Benutzung von

chemischen und radioaktiven Markern in der menschlichen Mundhöhle nicht

akzeptabel. Wird diese empfindliche Plaqueschicht zu Untersuchungszwecken

mechanisch von der Zahnoberfläche entfernt, so führt dies zum Zerreißen des

Biofilms (Sandig et al. 1988), der danach nicht mehr die gleiche Struktur und das

gleiche Verhalten wie der unverletzte Biofilm aufweist.

Für die Forschung ist es daher wichtig, auf in situ gebildete Biofilm-Proben

zurückgreifen zu können. Dies bedeutet, dass diese Biofilme direkt in der

Mundhöhle gebildet und unversehrt der weiteren Untersuchung zugeführt werden

sollten. Nur auf diesem Weg ist eine unverfälschte Aussage über die

Zusammensetzung und das Verhalten der Plaque möglich.


Um direkt gebildete Biofilm-Proben zu erhalten sind verschiedene Arten von

Trägersystemen beschrieben.

Die Methoden zur Plaquegewinnung in vivo gingen von der Extraktion der Zähne

(Mc Dougall 1963; Christ 1984) über das Aufkleben von MYLAR-Folien (Theilade

1964) oder eines Plast-Spray-Films auf Zähne (Brecx et al. 1981; 1983; 1987;

1994) bis hin zu herausnehmbaren Modellguss- oder Kunststoffschienen, die mit

kleinen Trägerplättchen bestückt waren (Baier und Glantz 1978; Macpherson et al.

1990; Hahn et al. 1992; Leonhardt et al. 1995; Thomson et al. 1996; Auschill et al.

2001; 2002).

Meyerowitz et al. (1991), Liljemark et al. (1993), Robinson et al. (1997) und Wood

et al. (2000) erhielten ihre in vivo gebildeten Plaqueproben mit Hilfe von

festsitzenden Apparaturen ähnlich dem Bracket–System aus der Kieferorthopädie.

Als Trägerplättchen zur Gewinnung eines in situ Biofilms eignen sich neben

Schmelzproben (Macpherson et al 1990; Thomson et al. 1996) ebenso

Glasplättchen. Wie Netuschil et al. (1998) feststellten, besteht kein wesentlicher

Unterschied im Plaquewachstum zwischen Glas und Schmelz. Da Schmelz jedoch

eine Eigenfluoreszenz besitzt (Netuschil et al. 1998), könnte sich dies in

Verbindung mit der Vitalfluoreszenztechnik, die in der vorliegenden Studie

verwendet wird, nachteilig auf die Untersuchung auswirken.

2.3 VITALFLUORESZENZTECHNIK

Die Vitalfluoreszenztechnik bietet die Möglichkeit tote von vitalen Bakterien zu

unterscheiden. Diese in den folgenden Versuchen verwendete Technik beruht auf

einem in der Zahnmedizin erstmals von Netuschil (1983) beschriebenen Prinzip:

Zellen werden mit Fluoresceindiacetat (FDA) angefärbt. FDA, ein sogenanntes

Fluorogen fluoresziert nicht selbst, sondern wird von der Zelle aufgenommen. Im

Stoffwechsel eukaryontischer Zellen wie auch von Bakterien wird es enzymatisch

zu einer grün fluoreszierenden Substanz, dem Fluorescein, abgebaut. Dieses

kann die Zelle jedoch nicht mehr verlassen, so dass es in ihr akkumuliert. Da die

Bildung von Fluorescein an den aktiven Stoffwechsel der Zelle gebunden ist,

werden nur lebende Zellen auf diese Weise grün angefärbt, die toten Zellen


fluoreszieren nicht. Um diese toten Zellen auch sichtbar erscheinen zu lassen,

erfolgt eine Gegenfärbung mit Ethidiumbromid (EB). Es gelangt nur in Zellen mit

nicht mehr vollständig intakter Zellmembran und bindet sich rot fluoreszierend an

die Nukleinsäuren.

Die Vitalfluoreszenztechnik wurde bereits in zahlreichen Studien verwendet

(Netuschil et al. 1989; Brecx et al. 1990; Rundegren et al. 1992; Arweiler et al.

2001a) und gilt als anerkannte Methode, um tote von lebenden Zellen zu

unterscheiden. In Kombination mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie

bietet die Vitalfluoreszenztechnik die Möglichkeit, intakte orale Biofilme, die auf

Trägermaterialien in der Mundhöhle gewachsen sind, zu untersuchen und

Aussagen über die Vitalitätsverteilung im Biofilm zu treffen (Netuschil et al. 1998;

Auschill et al. 2001, 2002; Zaura-Arite et al. 2001).

2.4 KONFOKALE LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE

Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist eine zerstörungsfreie

pseudo-dreidimensionale Technik der mikroskopischen Tomographie (Watson

1991). Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie gilt seit längerem als

Standardverfahren in der Zellforschung zur Detektion fluoreszenz-markierter

Areale. Seit kurzem wird dieses Verfahren auch in der Hartgewebsforschung zur

Untersuchung (unsektionierter Zähne ebenso wie von Zahnschliffen) genutzt

(Grötz et al. 1996; Duschner 2001). Diese Technik eignet sich zur Analyse

natürlich feuchter Proben und wird erst seit einigen Jahren verstärkt zur optischen

Untersuchung von Biofilmen eingesetzt (Watson 1991). Da das CLSM keine

Fixation oder sonstige Bearbeitung von Proben voraussieht, bietet es den großen

Vorteil, dass die Biofilmproben intakt und unzerstört bleiben (Lawrence et al. 1991;

Costerton und Lewandowski 1995). Mit der Technik der CLSM ist die Möglichkeit

gegeben, Präparate ohne vorherige Bearbeitung unzerstört darzustellen (Grötz et

al. 1995). Somit kann die Entstehung von physikalisch-chemischen Artefakten

(Gewebefixierung, Probenlagerung) und Präparationsartefakten (Herstellung von

Schnitten und Schliffen) vermieden werden (Grötz et al. 1996).


Im Gegensatz dazu müssen Zellstrukturen für die Untersuchung unter dem

Elektronenmikroskop (TEM, REM) erst präpariert werden. Das heißt, sie werden

fixiert, bevor man die Zellen entwässert und dann für das Transmissions-

Elektronenmikroskop mit Kunststoffen (Epoxide oder Methacrylate) imprägniert

und ultradünne Schnitte anfertigt. Für das Raster-Elektronenmikroskop müssen

die Proben nach dem fixieren und entwässern nicht in Kunstharz eingebettet

werden, jedoch muss die Präparatoberfläche mit einer dünnen leitenden

Metallschicht belegt werden, um statische Aufladungsphänomene zu vermeiden

(Plattner und Hentschel 1997).

Im Gegensatz zu Standardverfahren der Auflichtmikroskopie beruht die

Bildentstehung bei der CLSM auf einem indirekten Verfahren. Ein fein fokussierter,

fast monochromatischer Laserstrahl rastert über die Probenoberfläche. Die aus

den erleuchteten Bereichen der Probe remittierte Strahlung gelangt über eine

kleine konfokale Blende auf einen Detektor und wird ihrer Intensität nach

gemessen. Die Lochblende, die zur Fokusebene konjugiert (konfokal) angeordnet

ist, sorgt dafür, dass sämtliches Licht, das nicht aus dieser Ebene stammt, auch

nicht vom Detektor erfasst werden kann.

Durch schrittweises Verfahren der Höhenposition des Objekttisches wird eine

tomographische Serie von Einzelbildern parallel zur Oberfläche erhalten (Grötz et

al. 1996). Mit Unterstützung eines Rechners entsteht durch Zusammensetzen

dieser Serienschnitte ein dreidimensionales Bild des Biofilms. Die Probe kann

ebenfalls als Seitschnitt durch den Biofilm (z-Achse) und als Bildergalerie

dargestellt werden.


Abbildung 2-1: Graphische Darstellung des konfokalen Prinzips

18

3 VERSUCHSPLANUNG

3.1 VORVERSUCH

Da die Penetrationsfähigkeit der Farbstoffe durch den Biofilm bisher noch nicht

explizit nachgewiesen wurde, sollte in einem Vorversuch die Färbetechnik der

Vitalfluoreszenzfärbung auf in situ Biofilmen etabliert werden. Dazu wurden

Bakterienstämme ausgewählt, die als Erstbesiedler initialer Plaque gelten.

Die Fragestellung war, ob vitale Biofilme auch als vital im CLSM erkannt werden,

das heißt ob der Farbstoff Fluoresceindiacetat (FDA) ausreichend durch den

Biofilm penetriert und insbesondere auch die tieferen Schichten erreicht.

Es wurden in vitro 8 und 24 Stunden alte Biofilme gezüchtet. Es wurde

vorausgesetzt, dass die 8 Stunden alten Biofilme weitestgehend vitale Bakterien

enthielten, da sie ausreichend mit Nährstoffen versorgt waren und sich zu diesem

Zeitpunkt in der exponentiellen Phase bezüglich ihrer Wachstumskurve befanden.

In den 24 Stunden alten Biofilmen haben die Bakterien die exponentielle Phase

bereits verlassen, so dass vermehrt abgestorbene Bakterien im Biofilm zu

erwarten waren.

Die Biofilme wurden zu vorgegebener Zeit mit Vitalfluoreszenzfärbung gefärbt und

direkt danach im CLSM untersucht.

VERSUCHSPLANUNG 19

3.2 VERSUCH 1: ABHÄNGIGKEIT DER BIOFILMBILDUNG VON DER

LOKALISATION

Ziel des ersten Versuchsabschnittes war es, zu ermitteln, in welchen

Kieferabschnitten am meisten Plaque gebildet wird und ob dies unter

standardisierten Bedingungen möglich ist. Es wurden für 8 Probanden

herausnehmbare Kunststoff-Draht-Schienen für Ober- und Unterkiefer angefertigt.

An den Bukkalflächen und auf einem Palatinalband wurden insgesamt 15

Glasplättchen als Trägermaterial befestigt. Die Schienen wurden im Ober- und

Unterkiefer gleichzeitig für 48 Stunden getragen. Während der Zahnreinigung und

den Mahlzeiten wurden die Schienen in physiologischer Kochsalzlösung gelagert.

Die Reinigung der Zähne war in dieser Zeit nur mit Zahnbürste und Wasser

erlaubt. Vor der Auswertung unter dem CLSM wurden die Probekörper einzeln

entnommen und sofort mittels der Vitalfluoreszenztechnik gefärbt. Mit dem CLSM

wurden digitale Bilder der einzelnen Biofilmschichten angefertigt, mit deren Hilfe

die Biofilmdicke und die Vitalität in den Biofilmschichten ermittelt werden konnte.

Fließschema der Methoden und Schritte im Versuch 1:

Einsatz

an verschiedenen

Lokalisationen

bei 8 Probanden

Entnahme

Ermittlung der

Probendicke

Ermittlung der Vitalität

Herstellung von in den Mundraum einsetzbaren

Schienen/Splints zur Plaque-Kollektion

Verbleib im Mundraum

für 48 h

Vitalfärbung der nativen

unzerstörten Plaque (ex

vivo), Untersuchung

unter CLSM

VERSUCHSPLANUNG 20

3.3 VERSUCH 2: ABHÄNGIGKEIT DER BIOFILMBILDUNG VON DER ZEIT

Ziel des zweiten Versuchsabschnittes war es, von 12 Probanden die gesammelte

Plaque nach unterschiedlich langer Tragezeit (1 bis 7 Tage) auf Vitalität und

Biofilmdicke hin zu untersuchen. Für diesen Versuchsabschnitt wurden nur noch

die Oberkieferschienen verwandt. Diese wurden so verändert, dass nun je

Schiene sechs bukkale Probeplättchen befestigt werden konnten. Die

Untersuchung der Biofilmbildung über die 7 Tage erfolgte in zwei Tragezyklen.

Im ersten Tragezyklus wurden die Schienen drei Tage getragen, wobei jeden Tag

jeweils zwei Probeplättchen (rechts und links) entnommen wurden. In einem

zweiten Tragezyklus mussten die Schienen 7 Tage getragen werden. Nach 4, 5,

und 7 Tagen wurden ebenfalls jeweils zwei Plättchen (rechts und links)

entnommen. Die Proben wurden analog Versuch 1 verarbeitet und untersucht.

Fließschema der Methoden und Schritte im 2. Versuch:

Einsatz

an den Bukkalflächen

des OK

bei 12 Probanden

Entnahme nach 1, 2, 3, 4, 5 und 7 Tagen

Ermittlung der

Probendicke

Ermittlung der Vitalität

Herstellung von in den Mundraum einsetzbaren

Schienen/Splints zur Plaque-Kollektion

Verbleib im Mundraum

für 1 bis 7 Tage

Vitalfärbung der nativen

unzerstörten Plaque (ex

vivo), Untersuchung

unter CLSM

21

4 MATERIAL UND METHODE

4.1 VORVERSUCH

4.1.1 PROBEPLÄTTCHEN

Als Probeplättchen wurden Glasscheiben mit einer Dicke von 4 mm und einem

Durchmesser von 10 mm verwendet. Die Oberflächen der Glasscheiben waren

alle auf die gleiche Weise poliert (4000 grid) (Roland Vetter Laborbedarf e. K.,

Ammerbuch, Deutschland).

4.1.2 BAKTERIENSTÄMME

Zur in vitro Biofilmzüchtung wurden folgende Bakterienstämme ausgewählt:

Streptococcus mutans

Streptococcus sanguis

Streptococcus mitis

Actinomyces naeslundii

sowie eine Mischung aller vier Bakterienstämme

4.1.3 VERSUCHSABLAUF

Zehn Rundbodenzentrifugenröhrchen wurden mit je einem Probeplättchen

bestückt und danach mit TSB (Trypticase-Soja-Boullion) gefüllt und 15 Minuten bei

121 °C autoklaviert.

Die Nährlösungen wurden mit je einem Bakterienstamm, bzw. der Mischung aus

allen vier Bakterienstämmen beimpft und bei 37 °C im Wärmeschrank deponiert.

Nach 8 bzw. 24 Stunden wurden die entstandenen Biofilme zur weiteren

Untersuchung entnommen.

MATERIAL UND METHODE 22

4.1.4 VITALFLUORESZENZFÄRBUNG

Zur Darstellung von vitalen und toten Bakterien im Biofilm musste zunächst eine

Färbelösung hergestellt werden. Aus zwei Stammlösungen (FDA:

Fluoresceindiacetat, Sigma Chemie, Taufkirchen: 5 mg/ml Aceton, -20°C und EB:

Ethidiumbromid, Sigma Chemie: 0,5 mg/ ml physiologische NaCl, 4°C) wurden je

5 µl in 1 ml vorgelegte physiologische Kochsalzlösung gegeben und sofort

gemischt. Von dieser Färbelösung wurden ca. 5 µl direkt auf die Plaqueprobe

gegeben und zwei Minuten gewartet, bis die Färbereaktion abgeschlossen war.

Danach wurde der so behandelte Biofilm vorsichtig in physiologischer

Kochsalzlösung abgewaschen und anschließend unter dem konfokalen Laser-

Scanning-Mikroskop untersucht.

4.1.5 KONFOKALES LASER-SCANNING-MIKROSKOP (CLSM)

Unmittelbar nach der Vitalfluoreszenzfärbung wurde die Untersuchung der

Biofilmproben unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) (LSM 410

invert, Zeiss, Deutschland) durchgeführt.

Abbildung 4-1: Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop

Die Biofilm-Proben wurden mit der Oberfläche nach unten in spezielle

Glaskammern (Lab-Tek II Chambered Coverglass # 1.5, Nalge Nunc International,


USA) gelegt und während der gesamten Untersuchung unter 100-prozentiger

Feuchtigkeit gehalten. Die Analyse erfolgte unter einem Mikroskop, das mit einem

Argon Laser (excitation 488 nm, emission 510-525 nm) und einem Helium-Neon

Laser (excitation 546 nm, emission 590-610 nm) ausgerüstet war. Konfokale

Laserfluoreszenz-Bilder wurden durch eine Wasserobjektiv-Linse (C-Apochromat

40x/1,2 W, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) erzeugt. Hierbei wurde das Objektiv

auf eine plaquebedeckte Stelle gerichtet. Der höchste und der tiefste Punkt der

Biofilmprobe, von dem kein Fluoreszenz-Signal mehr ausging, wurden bestimmt.

Von der äußersten Plaqueschicht bis zu der Glasoberfläche wurden alle 2 µm

optische Schnitte von 1 µm Dicke (Average 1) angefertigt (z-sectioning). Dieser

Abstand wurde gewählt, um Bakterienüberlappungen zu vermeiden.

4.1.6 ERGEBNISSE DES VORVERSUCHS

Bei der 8 Stunden alten Mischung der vier verschiedenen Bakterienstämme zeigte

sich nach Vitalfluoreszenzfärbung sehr viel grüner Farbstoff, was auf viele vitale

Bakterienzellen hinweist (siehe Abbildung 9-2). Dagegen gab es nur wenige rote

(tote) Zellen, die nur in den tieferen Schichten (nahe der Glasunterlage) zu finden

waren.

Nach 24 Stunden waren deutlich mehr rote Zellen im Biofilm erkennbar. Diese

waren wieder vornehmlich auf der Glasunterlage zu finden. Die weiter oben

gelegenen Schichten zeigten vermehrt grüne Bakterienzellen (siehe Abbildung

9-3).

Die Färbemethode hat sich zur Anfärbung von toten und lebenden Bakterien im

Biofilm als geeignet erwiesen und konnte für die beiden Hauptversuche verwandt

werden.


4.2 VERSUCH 1

4.2.1 PROBANDEN

Nach entsprechender Information stellten sich für den ersten Versuch acht

Probanden im Alter von 23 bis 30 Jahren zur Verfügung. Das Durchschnittsalter

betrug 26,5 Jahre. Die Allgemeinanamnese aller Probanden war unauffällig. Als

Ausschlusskriterien galten die Verwendung von antibakteriellen

Mundspüllösungen und Antibiotika im letzten halben Jahr, die sich möglicherweise

störend auf die Plaquebildung ausgewirkt hätten. Die Probanden durften

desweiteren nicht Teilnehmer anderer Studien innerhalb der letzten 30 Tage

gewesen sein.

Um das Kariesrisiko der Probanden zu bestimmen, wurde der „plaque formation

rate index“ (PFRI) nach Axelsson 1990 erhoben und das Vorkommen von

Streptococcus mutans und Laktobazillen mit Hilfe eines Bakterientests (CRT

bacteria, Vivadent, Ellwangen, Deutschland) ermittelt. Zur Bestimmung des

PFRI´s wurde bei jedem Probanden eine professionelle Zahnreinigung

durchgeführt. Danach wurden sie angehalten, jegliche Mundhygiene einzustellen.

Nach 24 Stunden wurde der PFRI (plaque formation rate index) nach Axelsson

(1990) erhoben und die Probanden entsprechend ihrer Plaquebildung eingestuft.

Wie in Tabelle 4-1 dargestellt, erreichten zwei Probanden nach der PFRI-

Einteilung den Wert IV, die restlichen sechs Probanden den Wert V.

Somit standen vier Probanden mit geringer Kariesaktivität und vier Probanden mit

hoher Kariesaktivität zur Verfügung.


Tabelle 4-1: Auflistung der Probanden aus Versuch 1 mit den ermittelten Werten des

Bakterientests und des PFRI und der sich daraus ergebenden Einstufung des Kariesrisikos.

Probanden SM-Wert PFRI Risiko-Einstufung Kariesrisiko

AD 0 IV a niedriges Kariesrisiko

NH 0 IV a „

SS 0 V a „

CD 0 V a „

OG 1 V c hohes Kariesrisiko

RS 1 V c „

NB 1 V c „

SR 3 V d „


Als Probeplättchen wurden Glasscheiben mit einer Dicke von 1,5 mm und einem

Durchmesser von 3 mm verwendet. Die Oberflächen der Glasscheiben waren alle

auf die gleiche Weise poliert (4000 grid) (Roland Vetter Laborbedarf e. K.,

Ammerbuch, Deutschland).

4.2.3 SCHIENEN

4.2.3.1 MATERIALIEN ZUR HERSTELLUNG DER SCHIENEN

• Alginat-Abformmasse (blend-a-print, Elast-Alginat; Dentsply De Tray

GmbH, Konstanz, Deutschland)

• Abformlöffel (Algilock, Hager & Werken, Duisburg, Deutschland)

• Superhartgips (Fujirock®; GC Europe, Leuven, Belgien)

• PMMA-Kaltpolymerist (Orthocryl® tansparent, Pulver und Flüssigkeit;

Dentaurum, Pforzheim, Deutschland)


• Rosa Zahnmodellierwachs (Associated Dental Products LTD, Purton,

Swindon, England)

• Draht 0,8 (Remanium® federhart; Dentaurum, Pforzheim, Deutschland)

• Draht 1,1 (Remanium® federhart; Dentaurum, Pforzheim, Deutschland)

• Drahtbügel 1,5 x 3,0 mm, hart (Renfert, Hilzingen, Deutschland)

• Klebewachs (Supradent-Wachs®, Chemisches Dentallabor Oppermann-

Schwedler, Bonn, Deutschland)

• Fräsen und übliche labortechnische Instrumente

4.2.3.2 GERÄTE ZUR HERSTELLUNG DER SCHIENEN

• Gips-Vakuumanrührgerät (Multivac®; Degussa)

• Gips-Rüttler (Vibrator®; Reco)

• Drucktopf (Polyclav®; Dentaurum)

4.2.3.3 HERSTELLUNG DER SCHIENEN

Von jedem Probanden wurde je ein Alginat-Abdruck von Ober- und Unterkiefer

genommen und mit Superhartgips ausgegossen.

Auf den Superhartgips-Modellen wurde jeweils eine Draht-Kunststoffschiene für

Ober- und Unterkiefer wie folgt hergestellt:

Zuerst wurden die bukkalen Approximalflächen der Seitenzähne (bei normaler

Verzahnung zwischen dem ersten und zweiten Prämolar, zwischen zweitem

Prämolar und erstem Molar und zwischen erstem und zweitem Molar) mit rosa

Zahnmodellierwachs auf einer Fläche von ca. 5 x 5 mm ausgeblockt.

Danach wurde ein 1,1 mm dicker federharter Draht entlang der Palatinal- bzw.

Lingualflächen der Zähne angepasst. Distal des letzten Molaren wurde der Draht

auf die Bukkalseite gebogen und als Retention auslaufend gestaltet. Dieses

Drahtgerüst diente als Verstärkung und durfte sowohl bei Okklusion als auch bei

Artikulation nicht stören. Als Retentionselemente wurden C-Klammern (federharter


Draht mit einer Stärke von 0,8 mm) an die jeweiligen ersten Prämolaren gebogen.

Als nächstes wurde transparentes Kaltpolymerisat (Orthocryl® transparent) auf

das Drahtgerüst aufgebracht und im Drucktopf ausgehärtet. Nach Ausarbeitung

und Politur diente der bukkale Schienenbereich der Aufnahme von je drei Proben

pro Seite. Die palatinale bzw. linguale „Kunststoffverkleidung“ diente der Retention

und dem Tragekomfort.

In die Oberkieferschiene wurde zusätzlich ein Palatinalband (Draht 1,5 x 3 mm,

hart) eingearbeitet. In die zum Gaumen gelegene Seite des Palatinalbandes

wurden drei Vertiefungen (ca. 0,5 mm) eingeschliffen, die zur Aufnahme der

Proben dienten.

Den Probanden wurden die Schienen einprobiert und auf Druckstellen kontrolliert.

4.2.3.4 BESTÜCKUNG DER SCHIENEN

In jede Vertiefung der Schiene wurde jeweils ein sterilisiertes Glas-Probeplättchen

mit Klebewachs (Supradent-Wachs®, Chemisches Dentallabor Oppermann-

Schwedler, Bonn, Deutschland) befestigt. Pro Schienenpaar (OK und UK) somit

insgesamt 15 Probeplättchen: drei Plättchen auf jeder Seite und drei Plättchen

palatinal. Es wurde genauestens darauf geachtet, dass kein Klebewachs die zur

Plaqueanlagerung bestimmte Oberfläche verunreinigte. Die zu untersuchende

Oberfläche war dem bukkalen Approximalraum der Seitenzähne und der

Gaumenschleimhaut zugewandt und im Abstand von ca. 1 mm zur Schleimhaut

frei umspülbar angeordnet (siehe Abbildungen 4-2 und 4-3). Eine Störung der

Biofilmbildung durch Zunge und Wange konnte durch diese Platzierung der

Glasplättchen ausgeschlossen werden.

4.2.3.5 DESINFEKTION

Alle Probenoberflächen wurden nach der Befestigung in den Schienen mit 96 %-

igem Alkohol desinfiziert.


4.2.4 KLINISCHER ABLAUF

4.2.4.1 VERFAHREN/ZEITRAUM

Abbildung 4-2: OK-Schiene in situ

Abbildung 4-3: UK-Schiene in situ

Abbildung 4-4: Seitenansicht der Schienen

Nach einer professionellen

Zahnreinigung wurden bei jedem

Teilnehmer die individuell

angefertigten Kunststoff-Draht-

Schienen in Ober- und Unterkiefer

eingesetzt. Beide Schienen mussten

für 48 Stunden kontinuierlich Tag und

Nacht getragen werden und durften

nur zu den Mahlzeiten und zum

Zähneputzen herausgenommen

werden.

Die Zwischenlagerung erfolgte in

physiologischer Kochsalzlösung. Zur

Mundhygiene waren nur Zahnbürste,

fluoridfreie Zahnseide und Wasser

erlaubt. Die Ober- und

Unterkieferschienen sind in situ in

den Abbildungen 4-2, 4-3 und 4-4

dargestellt.


4.2.4.2 ENTNAHME DER PROBEN

Nach 48stündigem Trageintervall wurden die mit Plaque bedeckten Glasplättchen

vorsichtig aus der Schiene gelöst und bis zur weiteren Aufarbeitung kurzzeitig in

physiologischer Kochsalzlösung (bei Raumtemperatur) zwischengelagert.

4.2.5 VITALFÄRBUNG DER PROBEN

Die Vitalfluoreszenzfärbung der Proben wurde analog zu 4.1.4 durchgeführt.


Unmittelbar nach der Vitalfluoreszenzfärbung wurde die Untersuchung der

Biofilmproben unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) wie unter

4.1.5 beschrieben durchgeführt.

Unser Versuchsparameter „Biofilmdicke“ (BD) ergab sich aus der Anzahl der

erhaltenen optischen Schnitte (ein Schnitt entpricht zwei µm Biofilmdicke).

Für die weitere Auswertung wurden alle gefertigten digitalen Bilder im TIF-Format

auf CD gebrannt.

4.2.7 AUSWERTUNG DER CLSM-DATEN

Um den Versuchsparameter „Vitalität der Biofilmbakterien“ (VF) zu erhalten,

wurden die auf CD gespeicherten Bilder und Bildserien zunächst am Computer

von TIF- in TGA-Format konvertiert (Adobe Photoshop 6.0). Die Bilder wurden

anschließend mittels eines automatisierten Bildanalyseprogrammes (FLOURO,

Fa.Medvis, Deutschland) auf die prozentuale Vitalität der Plaque hin untersucht.

Dieses Programm ist in der Lage, rote und grüne Pixel zu erkennen. Insgesamt

wird dann die Vitalität der Bakterien in % angegeben, dies entspricht dem Anteil

grüner Bakterien in der Gesamtprobe.


4.2.8 STATISTISCHE ANALYSE

Die statistische Analyse erfolgte mittels SPSS 11.0. Für jede der 15 Lokalisationen

(OA-OF, UA-UF, PA-PC) wurde die mittlere Biofilmdicke ermittelt. Mittels ANOVA

wurden die Datenreihen auf signifikante Unterschiede zwischen den

Lokalisationen innerhalb des Oberkiefers, des Unterkiefers und des

Palatinalbandes überprüft. Dann wurden die Daten des OK, UK und des

Palatinalbandes (Pal) zusammengefasst. Da diese Mittelwerte OK, UK, Pal

signifikante Unterschiede aufwiesen (p≤0.05 mittels ANOVA) und normalverteilt

waren (überprüft mittels Kolmogorow-Smirnow-Test) wurde der gepaarte t-Test

angewandt.

Bei der Datenauswertung der Vitalität wurden die palatinalen Flächen aufgrund zu

geringer Plaquedicken nicht berücksichtigt.

Zunächst wurde für die Probanden anhand der Vitalität der einzelnen Schnitte eine

mittlere Vitalität pro Lokalisation errechnet. Mittels ANOVA zeigten sich keine

signifikanten Unterschiede zwischen den Lokalisationen (p>0,05). Die

unterschiedlichen Vitalitäts-Verteilungsmuster eines jeden Probanden sind nur

beschreibend dargestellt.

Auf Bonferroni Korrekturen konnte verzichtet werden (Perneger 1998).

4.3 VERSUCH 2

4.3.1 PROBANDEN

Für den zweiten Versuch wurden zwölf Probanden rekrutiert. Es stellten sich

sechs Teilnehmer aus Versuch 1 zur Verfügung, sechs Teilnehmer kamen neu

hinzu. Für diese galten die gleichen Ein- und Ausschlusskriterien wie unter 4.2.1

beschrieben. Die Probanden waren zwischen 21 und 29 Jahren alt, das

Durchschnittsalter betrug diesmal 25 Jahre.

Für die sechs weiteren Teilnehmer wurde ebenfalls das Kariesrisiko mittels des

PFRI und Bakterientests bestimmt. Ein Proband erreichte nach Einteilung des

PFRI den Wert II, einer den Wert III, drei Probanden den Wert IV und sieben den


Wert V. Es standen somit sechs Probanden mit geringer Kariesaktivität und sechs

Probanden mit hoher Kariesaktivität zur Verfügung.

Tabelle 4-2: Auflistung der Probanden aus Versuch 2 mit den ermittelten Werten des Bakterientests und des PFRI und der sich daraus ergebenden Einstufung des Kariesrisikos.

Probanden SM-Wert PFRI Risiko-Einstufung Kariesrisiko

DR 0 II a niedriges Kariesrisiko

AD 0 IV a „

NH 0 IV a „

SS 0 V a „

CD 0 V a „

MM 0 V a „

MK 2 III c hohes Kariesrisiko

LH 1 IV c „

RS 1 V c „

NB 1 V c „

AL 2 V d „

SB 2 V d „


Es wurden dieselben Probeplättchen wie in Versuch 1 verwendet: 1,5 mm dicke

Glasscheiben mit einem Durchmesser von 3 mm und einer polierten Oberfläche

(4000 grid) (Roland Vetter Laborbedarf e. K., Ammerbuch, Deutschland).


4.3.3 SCHIENEN

Aufgrund der Ergebnisse in Versuch 1 sollten die Schienen im zweiten

Versuchsabschnitt nur im Oberkiefer getragen werden. Die palatinal platzierten

Probeplättchen wurden im zweiten Versuchsabschnitt nicht untersucht, so dass

die Palatinalbänder der bereits vorhandenen Oberkieferschienen vorher entfernt

wurden. Für die sechs neuen Probanden wurde auf die gleiche Weise, wie in den

Kapiteln 4.2.3.1 – 4.2.3.3 beschrieben, je eine Oberkieferschiene ohne

Palatinalband hergestellt.

4.3.3.1 BESTÜCKUNG DER SCHIENEN

In den Vertiefungen der Schiene wurde jeweils ein Glas-Probeplättchen mit

Klebewachs (Supradent-Wachs®, Chemisches Dentallabor Oppermann-

Schwedler), wie unter 4.2.3.4 beschrieben, befestigt.

4.3.3.2 DESINFEKTION

Alle Probenoberflächen wurden nach dem Befestigen mit 96%-igem Alkohol

desinfiziert.

4.3.4 KLINISCHER ABLAUF

4.3.4.1 VERFAHREN/ZEITRAUM

Die Schienen wurden den Teilnehmern im Oberkiefer eingesetzt. Diese wurden

über einen Zeitraum von drei Tagen getragen. Die Probanden mussten sich am 1.,

2. und 3. Tag dieses Tragezyklus zur selben Uhrzeit vorstellen, da jedes Mal ein

Probeplättchen auf jeder Seite entnommen und direkt im Anschluss ausgewertet

wurde.


Danach wurden die Teilnehmer veranlasst, die OK-Schiene sieben Tage am Stück

zu tragen. In diesem zweiten Tragezyklus mussten sich die Probanden am 4., 5.

und 7. Tag zu vorgeschriebener Zeit vorstellen, damit wieder je ein Probeplättchen

auf jeder Seite entnommen und der Auswertung zugeführt werden konnte.

Wie in Versuch 1 sollten die Schienen kontinuierlich für Tag und Nacht getragen

werden und durften nur zu den Mahlzeiten und zum Zähneputzen

herausgenommen werden. Die Zwischenlagerung erfolgte in physiologischer

Kochsalzlösung. Zur Mundhygiene waren nur Zahnbürste, Zahnseide und Wasser

erlaubt.

4.3.4.2 ENTNAHME DER PROBEN

Nach 1-, 2-, 3-, 4-, 5- und 7tägigem Trageintervall wurden die Glasplättchen

vorsichtig abgelöst und kurzzeitig in physiologischer Kochsalzlösung (bei

Raumtemperatur) zwischengelagert.

4.3.5 VITALFÄRBUNG DER PROBEN

Die Vitalfärbung der Proben erfolgte wie unter 4.1.4 beschrieben.


Nach Vitalfluoreszenzfärbung der Proben erfolgte die Untersuchung im konfokalen

Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) (siehe Kapitel 4.1.5).

4.3.7 AUSWERTUNG DER CLSM-DATEN

Die Auswertung der am CLSM erhaltenen Daten erfolgte wie in Kapitel 4.2.7

beschrieben.


4.3.8 STATISTISCHE ANALYSE

Die statistische Analyse erfolgte mittels SPSS 11.0. Für die Tage 1 bis 3 und 4 bis

7 wurden die mittleren Biofilmdicken aller Probanden ermittelt. Mittels ANOVA

wurden die Datenreihen auf signifikante Unterschiede zwischen den Tagen 1 bis 3

und 4 bis 7 überprüft. Da die Mittelwerte der Tage 1 bis 3 signifikannte

Unterschiede aufwiesen (p≤0.05 mittels ANOVA) und normalverteilt waren

(überprüft mittels Kolmogorow-Smirnow-Test) wurde der gepaarte t-Test

angewandt.

Die mittlere Vitalität je Tag (1 bis 3 und 4 bis 7) wurde für die Probanden anhand

der Vitalitäten der einzelnen Schnitte errechnet. Da sich mittels ANOVA ein

signifikanter Unterschied bei den Tagen 1 bis 3 bzw. 4 bis 7 zeigte (p≤0,05) und

die Datenreihen normal verteilt waren (überprüft mittels Kolmogorow-Smirnow-

Test) wurde ebenfalls der gepaarte t-Test angewandt.

Auf Bonferroni Korrekturen konnte verzichtet werden (Perneger 1998).

35

5 ERGEBNISSE

5.1 VERSUCH 1

5.1.1 BIOFILMDICKE (BD)

Alle 8 Probanden trugen in Versuch 1 die Ober- und Unterkieferschienen

zeitgleich für 48 Stunden.

Es ging kein Probeplättchen verloren, so dass bei allen Proben der 8 Probanden

die Biofilmdicke ausgewertet werden konnte.

Die Biofilme ergaben Dicken zwischen 14 und 150 µm, abhängig von der

Plaquebildung des jeweiligen Probanden und von der Lokalisation der

Probeplättchen. Die unterschiedlichen Lokalisationen und ihre Abkürzungen sind

in Abbildung 5-1 dargestellt. Die Daten der Biofilmdicken werden in Abbildung 5-2

und in Tabelle 5-1 gezeigt.

Aus den Einzeldaten wurden die mittleren Biofilmdicken der Ober- und Unterkiefer

und der Palatinalseiten ermittelt. An den Bukkalflächen des Oberkiefers bildete

sich eine durchschnittliche Dicke von 77,63 ± 29,10 µm, während der Unterkiefer

in der gleichen Zeit eine durchschnittliche Dicke von 71,92 ± 26,34 µm ausbildete.

Der Unterschied zwischen Ober- und Unterkiefer war nicht signifikant.

Auf der Palatinalseite bildete sich mit einer Höhe von nur 52,08 ± 26,23 µm

signifikant weniger Plaque als im Ober- und Unterkiefer (Abbildung 5-2).

Betrachtet man die unterschiedlichen Lokalisationen der Bukkalseiten von Ober-

und Unterkiefer, so zeigten sich bei der Dicke sehr ähnliche Werte (Tabelle 5-1).

Der Vergleich der aufgeführten Biofilmdicken der Bukkalseiten von Ober- und

Unterkiefer mit der einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) zeigte keine statistisch

signifikanten Unterschiede. Der Vergleich von rechter und linker Seite zeigte

ebenfalls keine statistisch signifikanten Unterschiede.

ERGEBNISSE 36

Abbildung 5-2: Durchschnittliche Biofilmdicken (BD in µm) nach 48 Stunden im Oberkiefer (OK, Bukkalflächen), Unterkiefer (UK, Bukkalflächen) und an den Palatinalflächen (PAL). n.s.: nicht signifikant; ***: p ≤ 0,001 (mittels gepaartem t-Test)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

OK UK Pal

n.s. ***

***BD (in µm)

OD

OE

OF

OA

OB

OC

PA PB PC

UD UA

UE

UF

UB

UC

Oberkiefer Unterkiefer

Abbildung 5-1: OK/UK- Schiene mit Lokalisationsangaben

ERGEBNISSE 37

Tabelle 5-1: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Biofilmdicken (µm) an den

unterschiedlichen Lokalisationen von Ober- (OA-OF), Unterkiefer (UA-UF) und den Palatinalflächen (PA-PC)

OA OB OC OD OE OF PA PB PC

75.25

± 21,84

76.00

± 36.82

79.00

± 26.17

78.25

± 26.62

84.75

± 36.92

72.50

± 26.21

56.25

± 29.62

54.00

± 26.53

46.00

± 22.61

77.00

± 19.80

70.75

± 28.69

73.00

± 27.42

62.25

± 23.59

73.00

± 30.27

76.00

± 28.27

UA UB UC UD UE UF

5.1.2 VITALITÄT (VF)

Die Vitalität wurde an den Flächen ausgewertet, die signifikant am meisten Plaque

bildeten, also die Bukkalflächen von Ober- und Unterkiefer.

Bei allen Proben der acht Probanden (je 12) konnte die Vitalität des Biofilms

ermittelt werden. Die Biofilme zeigten eine Dicke von 16 bis 150 µm, was bei der

Untersuchung am CLSM 8 bis 75 Schichten entsprach. Die unterschiedlichen

Lokalisationen wurden als OA, OB, OC etc. für den Oberkiefer und als UA, UB,

UC etc. für den Unterkiefer (siehe Abbildung 5-1) benannt.

Die Vitalitäts-Mittelwerte aller Schichten an den verschiedenen Lokalisationen aller

Probanden sind in Tabelle 5-2 dargestellt.

Tabelle 5-2: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Vitalitäten (%) an den

unterschiedlichen Lokalisationen der Bukkalflächen

OA OB OC OD OE OF 66.6 ± 19.9 64.4 ± 22.4 73.9 ± 18.7 66.6 ± 29.1 66.7 ± 24.5 72.9 ± 16.7

64.3 ± 15.0 71.9 ± 18.6 68.7 ± 16.5 73.2 ± 17.6 70.8 ± 21.1 76.8 ± 21.9 UA UB UC UD UE UF

Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (P>0.05) (ANOVA)

ERGEBNISSE 38

Die Anzahl der Plaqueschichten ebenso wie die Vitalitätswerte in den

verschiedenen Schichten variierten abhängig vom Probanden in größerem

Umfang. Zum Beispiel variierte die Vitalität der ersten Biofilmschicht bei den acht

Probanden von 0 bis 100%.

Bei jedem der Probanden war jedoch ein individuell charakteristisches

Vitalitätsmuster erkennbar, das nicht von der Lokalisation der Probe beeinflusst zu

sein scheint. Als Beispiel hierfür sind die Vitalitätsmuster von Probandin AD und

Proband NB in den Abbildungen 5-3 und 5-4 dargestellt.

Die Vitalitätsmuster aller acht Probanden in Abhängigkeit von den

unterschiedlichen Lokalisationen sind im Anhang aufgeführt.

Abbildung 5-3: Vitalität des Probanden AD nach 48 h im OK und UK

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73

Anzahl der Schichten

OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD

UE UF

ERGEBNISSE 39

Abbildung 5-4: Vitalität des Probanden NB nach 48 h im OK und UK

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73


OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD

UE UF

ERGEBNISSE 40

5.2 VERSUCH 2

5.2.1 Biofilmdicke (BD)

Es ging ebenfalls kein Probeplättchen verloren, so dass bei allen zwölf Probanden

die Biofilmdicken ausgewertet werden konnten.

Die Biofilme ergaben Dicken zwischen 26 und 190 µm, in Abhängigkeit von der

Plaquebildung des jeweiligen Probanden und von der Lokalisation der

Probeplättchen. Die Lokalisationen und ihre Abkürzungen sind in Abbildung 5-1

dargestellt. Die Daten der Biofilmdicken der Tage 1 bis 7 werden in Abbildung 5-5

und im Anhang in Tabelle 9-1 gezeigt.

Es bildete sich nach einem Tag eine durchschnittliche Dicke von 46,2 ± 12,8 µm,

nach zwei Tagen eine durchschnittliche Dicke von 93,3 ± 47,1 µm und nach drei

Tagen eine durchschnittliche Dicke von 123,7 ± 38,7 µm aus. Tag 1 und 2

verhielten sich zueinander hoch signifikant (p ≤ 0,01), Tag 1 und 3 höchst

signifikant (p ≤ 0,001). Zwischen Tag 2 und 3 konnte noch ein signifikannter

Unterschied (p ≤ 0,05) festgestellt werden.

Im zweiten Tragezyklus wurden die Tage 4 bis 7 ermittelt. Nach vier Tagen zeigte

sich auf den Probeplättchen eine durchschnittliche Dicke von 109,5 ± 31,1 µm,

nach fünf Tagen eine durchschnittliche Dicke von 134,3 ± 36,8 µm und nach

sieben Tagen eine durchschnittliche Dicke von 133,7 ± 27,8 µm. An den Tage 4

bis 7 zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede.

5.2.2 VITALITÄT (VF)

Bei allen Proben der zwölf Probanden (je 12) konnte die Vitalität des Biofilms

ermittelt werden. Die unterschiedlichen Lokalisationen der Oberkieferschiene

wurden mit OA-OF benannt (siehe Abbildung 5-1).

Die Vitalitäts-Mittelwerte der zwölf Probanden, die sich an den Tagen 1 bis 7

ergaben, sind in Abbildung 5-6 und im Anhang in Tabelle 9-2 dargestellt.

Im ersten Tragezyklus wurden die Vitalitäten der Tage 1 bis 3 bestimmt. Dabei

ergab sich nach dem ersten Tag eine durchschnittliche Vitalität von 60,9 ± 17,3 %,

nach dem zweiten Tag eine durchschnittliche Vitalität von 53,6 ± 14,3 % und nach

ERGEBNISSE 41

dem dritten Tag eine durchschnittliche Vitalität von 83,9 ± 4,9 %. Zwischen den

Vitalitäten von Tag 1 und 2 war kein signifikanter Unterschied feststellbar. Die

Vitalitäten der Tage 1 und 3 und der Tage 2 und 3 unterschieden sich höchst

signifikant (p ≤ 0,001) voneinander. Im zweiten Tragezyklus wurden die Vitalitäten

der Tage 4 bis 7 ermittelt. Nach dem vierten Tag wurde eine durchschnittliche

Vitalität von 49,0 ± 15,6 % erreicht, nach dem fünften Tag eine durchschnittliche

Vitalität von 65,9 ± 9,0 % und nach dem siebten Tag eine durchschnittliche

Vitalität von 57,8 ± 9,2 %. Dabei unterschieden sich die Vitalitäten der Tage 4 und

5 hoch signifikant (p ≤ 0,01) und die Vitalitäten der Tage 5 und 7 signifikant (p ≤

0,05) voneinander. Zwischen den Vitalitäten von Tag 4 und Tag 7 war kein

signifikanter Unterschied feststellbar.

Die Anzahl der Plaqueschichten ebenso wie die Vitalitätswerte in den

verschiedenen Schichten variierten abhängig vom Probanden und der Zeit in

größerem Umfang. Eine Übersicht der Vitalitäten der Tage 1 bis 7 nach

Probanden geordnet findet sich im Anhang, ebenso wie eine Übersicht, bei der die

Vitalitäten nach Tagen eingeteilt sind.

Ein individuell charakteristisches Vitalitätsmuster, wie es nach 48 Stunden bei den

einzelnen Probanden erkennbar war, ist über sieben Tage verteilt nicht zu

erkennen. Eine Ausnahme bildete Tag 3, an dem alle zwölf Probanden mit 83,9 %

die durchschnittlich höchste Vitalität, aber auch ein sehr ähnliches Vitalitätsmuster

aufwiesen.

ERGEBNISSE 42

Abbildung 5-5: Mittelwerte der Biofilmdicken (Dicke in µm) nach 1 bis 7 Tagen im Oberkiefer (Bukkalflächen) aller zwölf Probanden. n.s.: nicht signifikant; ***: p ≤ 0,001; **: p ≤ 0,01; *: p ≤ 0,05 (mittels gepaartem t-Test)

Abbildung 5-6: Mittelwerte der Vitalitäten (Prozent) nach 1 bis 7 Tagen im Oberkiefer (Bukkalflächen aller 12 Probanden). n.s.: nicht signifikant; ***: p ≤ 0,001; **: p ≤ 0,01; *: p ≤ 0,05 (mittels gepaartem t-Test)

0

20

40

60

80

100

120

140

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7

BD (µm)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Vitalität (%)

**

* *** n.s.

n.s.

n.s. *** ***

** *

43

6 DISKUSSION

6.1 METHODISCHE DISKUSSION

In der Literatur finden sich zahlreiche Studien, die sich mit der Plaquebildung

sowie der Vitalität der Plaquebakterien beschäftigen (Netuschil et al. 1989;

Arweiler et al. 2001a; 2001b). Um jedoch die Prozesse, die im Biofilm ablaufen,

verstehen zu können, ist es notwendig, eine Untersuchungsmethode zu wählen,

die den Biofilm nicht zerstört (McCoy et al. 1981). Zu jeglichen bakteriologischen

Untersuchungen musste in früheren Studien die Plaque vom Zahn mechanisch

entfernt werden (Arweiler et al. 2001a; 2001b), was jedoch die Zerstörung der

dreidimensionalen Struktur des Biofilms bedeutete. Verschiedene Arbeitsgruppen

verwendeten künstliche Modelle, sogenannte Biofilm-Reaktoren (Guggenheim et

al. 2001, Shapiro et al. 2002), um die Struktur des oralen Biofilms nachzuahmen.

Dabei wurden Biofilme untersucht, die unter Laborbedingungen von ausgewählten

Bakterienstämmen (Biofilme nur eines Bakterienstammes oder gemischte

Biofilme) gebildet wurden, aber nicht in der Mundhöhle natürlich gewachsenen

waren. Obgleich diese Methoden bereits die komplexe Struktur der Biofilme

aufgezeigt haben (Caldwell et al. 1992) und so eine Kontrolle und Untersuchung

unter standardisierten Bedingungen für verschiedene Einflussfaktoren, wie z.B.

Mundspüllösungen auf den Biofilm (Shapiro et al. 2002) erlaubten, konnten sie

jedoch die intraorale Situation nicht ausreichend wiedergeben. Ihre Aussagekraft

ist damit eingeschränkt. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, wurde die

Technik des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) mit der Verwendung

von intraoralen Schienensystemen kombiniert (Netuschil et al. 1998; Wood et al.

2000; Auschill et al. 2001; 2002; Zaura-Arite et al. 2001). Deshalb war es Ziel

dieser Studie ein in vivo Modell zu etablieren, bei dem nach ungestörter

Plaquebildung die räumliche Struktur des Biofilms untersucht werden kann.

6.1.1 TRÄGERSYSTEME ZUR PLAQUEGEWINNUNG

Das Design der Trägersysteme, die zur in vivo Biofilmgewinnung verwendet

wurden ist, wie bereits in Kapitel 2.2 beschrieben, sehr vielseitig.

DISKUSSION 44

Das gemeinsame Ziel aller Trägersysteme war es, die Plaque intraoral so zu

sammeln, dass eine Veränderung bzw. Zerstörung des Plaqueaufbaus und der

Plaquevitalität weitestgehend verhindert werden konnte.

Theilade (1964) verwendete dünne Kunststofffolien aus MYLAR, die an den

Schneidezähnen befestigt wurden, um diese nach einer vorgegebenen intraoralen

Verweildauer zu entfernen und die darauf befindliche Plaque auszuwerten. Brecx

et al. (1981, 1983, 1987, 1994) benutzten als Trägermaterial für ihre detaillierten

Untersuchungen der frühen Plaquebildung einen sogenannten Plast-Spray-Film,

der auf die Zähne aufgezogen wurde.

Diese Folien befinden sich jedoch relativ „ungeschützt“ in der Mundhöhle und sind

dort den Bewegungen von Zunge und Wange ausgeliefert, was zu einer Störung

der Biofilmbildung oder sogar zu einem Ablösen der Folien führen kann. Deshalb

wurde nach geeigneteren Systemen gesucht, die ein ungestörtes Wachsen der

Plaque ermöglichen sollen.

Man kann prinzipiell zwischen zwei verschiedenen Arten von Trägersystemen in

der Literatur unterscheiden. Einerseits können die Proben ähnlich wie bei

kieferorthopädischen Brackets direkt auf den Zähnen befestigt sein, andererseits

werden Schienensysteme bevorzugt eingesetzt.

Meyerowitz et al. (1991) klebten Metall-Vorrichtungen ähnlich einem

kieferorthopädischen Bracket mittels Säure-Ätz-Technik an die Bukkalflächen von

oberen Molaren. In die Vorrichtung wurden je eine normale und eine

demineralisierte Schmelzprobe so in Kaltpolymerisat eingelassen, dass nur die

äußerste Schmelzoberfläche dem Mundhöhlenmilieu ausgesetzt war. Um die

Plaqueakkumulation zu verbessern, wurden die Plättchen so positioniert, dass die

äußere Oberfläche ungefähr 1mm tiefer als die umgebende Haltevorrichtung lag.

Es wurde dann der Einfluss einer 0.05 %igen Natriumfluorid-Lösung auf

Demineralisation und Remineralisation der Schmelzproben untersucht.

Liljemark et al. (1993) befestigten Komposit-Kugeln (Visio-fil®, Espe, Deutschland)

ebenfalls mit Hilfe der Säure-Ätz-Technik an den Bukkalseiten der

Oberkieferzähne. Diese Komposit-Kugeln waren vor der Aushärtung mit

Schmelzplättchen versehen worden. Anhand der gebildeten Beläge wurde die

Actinomyceten-Verteilung auf Schmelzflächen bei parodontal gesunden und bei

parodontal erkrankten Probanden untersucht.

DISKUSSION 45

Robinson et al. (1997) und Wood et al. (2000) verwendeten für ihre

Untersuchungen von in vivo-Plaque die gleiche Vorrichtung. Ein 2 mm dicker

Nylonring (Innendurchmesser 2 mm) wurde mit Cyanoacrylat auf einen

Schmelzpartikel geklebt, dieser wurde dann, ähnlich wie ein Bracket, direkt auf die

Bukkalfläche eines oberen Molaren befestigt. Die auf diese Weise gewonnene

Plaque wurde dann im Labor aufgearbeitet und verschiedenen Analysen

zugeführt.

Baier und Glantz (1978) verwandten individuell angefertigte, herausnehmbare

Schienen zur Gewinnung von in vivo Biofilmen. Sie fertigten zur Untersuchung

ihrer Plaqueproben Unterkiefer-Kunststoffschienen an, welche in Regio 35/36 und

45/46 zur Aufnahme der Proben erweitert wurden. Die Schienen wurden für die

Versuchsreihe zwischen 2 Sekunden und 2 Stunden getragen.

Macpherson et al. (1990) untersuchten die Zusammensetzung der Mikroflora der

frühen Plaque auf menschlichen Schmelzflächen und eine daraus resultierende

Schmelzdemineralisation. Sie benutzten hierfür herausnehmbare Unterkiefer-

Schienen, die mit lingualen Kunststoffflächen zur Aufnahme der Schmelzproben

versehen waren.

Leonhardt et al. (1995) verwendeten in ihrer Studie zur initialen Plaquebildung auf

Titan-, Hydroxylapatit- und Amalgamflächen Cobalt-Chrom-Schienen die bis auf

einzelne Ausnahmen im Oberkiefer getragen wurden. Thomson et al. (1996)

benutzten ebenfalls Modellgussschienen, die im Unterkiefer getragen wurden. An

den Bukkalflächen befanden sich Nischen, die zur Aufnahme von

Rinderschmelzblöcken dienten. Mit Hilfe dieser Vorrichtung sollte die Kariogenität

von menschlicher Muttermilch und Kuhmilch untersucht werden. Die Verwendung

von Cobalt-Chrom-Schienensystemen bedeutet jedoch eine sehr aufwändige und

teure Methode in der Herstellung der Trägervorrichtungen.

In der vorliegenden Untersuchung wurde die Konstruktion der intraoralen

Schienen zur Sammlung eines in vivo Biofilms ähnlich gestaltet wie in früheren

Studien der gleichen Arbeitsgruppe (Netuschil et al. 1998; Auschill et al. 2001;

2002). Es wurden jedoch einige Änderungen im Schienendesign durchgeführt, mit

der Absicht, ein besseres und einfacheres Plaquewachstum und eine

standardisierte Biofilmbildung gleichzeitig in Ober- und Unterkiefer zu

gewährleisten. Erstmals wurden die Glasplättchen so befestigt, dass sie zu den

DISKUSSION 46

Zähnen gerichtet waren, um jegliche Störung durch Zunge oder Wange zu

vermeiden. Es war jedoch genug Raum vorhanden, um dem Biofilm eine

ernährende und feuchte Umgebung zu bieten. Diese Anordnung sollte eine

interproximale/approximale Plaque nachahmen, die größtenteils vor abscherenden

Kräften durch das Kauen geschützt war.

6.1.2 GLASPLÄTTCHEN ALS TRÄGERMATERIAL

Da bekannt ist, dass Schmelz eine Eigenfluoreszenz besitzt, welche zusammen

mit den Fluoreszenzfarbstoffen zu einer Störung führen kann (Netuschil et al.

1998), wurde in der vorliegenden Studie Glas als Trägermaterial verwendet. Wie

bereits früher gezeigt wurde, besteht kein wesentlicher Unterschied im

Plaquewachstum zwischen Glas und Schmelz als Trägermaterial (Netuschil et al.

1998). Darüber hinaus gibt es Beweise, dass das Plaquewachstum in hohem

Maße von der Oberflächenrauhigkeit und der freien Oberflächenenergie

beeinflusst ist (Marshall 1992). Dies ist ebenso das Ergebnis einer Studie, bei der

die unterschiedlichen Wachstumsmuster der Plaque an den verschiedenen

Zähnen mit Oberflächenirregularitäten erklärt wurden (Quirynen und van

Steenberghe 1989). Die Autoren schließen daraus, dass das Wachstumsmuster

der Plaque in 85% der Fälle auf der Basis der Oberflächenrauhigkeit vorhersagbar

ist. Diese Schlussfolgerung stimmt mit unseren Ergebnissen überein, da alle

Glasplättchen auf die selbe Weise poliert wurden (4000 grid) und die erhaltenen

Biofilmdicken sehr ähnlich waren. Unterschiede zwischen Zahngruppen und

Kiefern beziehungsweise unterschiedlichen Lokalisationen, wie es in einigen

Studien kontrovers diskutiert wurde (Quirynen und van Steenberghe 1989;

Furuichi et al. 1992; Ramberg et al. 1992), wurden nicht gefunden. In den zitierten

Studien ist die Plaque jedoch auf natürlichen Zähnen gewachsen und nicht auf

standardisierten Glasplättchen wie in der vorliegenden Studie. Dies könnte die

unterschiedlichen Plaquedicken an verschiedenen Zahngruppen und

Lokalisationen erklären.

Wie bereits erwähnt, wurden in unserem Modell an allen Lokalisationen

standardisierte Voraussetzungen, was die Oberfläche und die Reinigung betrifft,

DISKUSSION 47

geboten. Demzufolge ist unser Schienenmodell geeignet, unter standardisierten

Bedingungen in vivo/in situ Biofilmbildung zu ermöglichen.

Zaura-Arite et al. (2001) untersuchten in situ gewachsene Biofilme nach der

Behandlung mit CHX unter dem CLSM. In den Trägerplättchen waren Rinnen

eingebracht, in denen die Plaque gewonnen wurde. Dies bedeutet, dass diese

Biofilme einer „Fissurenplaque“ entsprechen, während in der vorliegenden Studie

die Biofilme auf planen Glasoberflächen aufwuchsen, was einer

„Glattflächenplaque“ entspricht. Die Trägerscheiben wurden ebenfallls in

Kunststoffschienen befestigt, die von Probanden bis zu 48 Stunden getragen

wurden. Um den Einfluss des CHX auf die Plaque festzustellen, sollte der gleiche

Biofilm einmal mit und einmal ohne CHX-Behandlung untersucht werden. Die

Trägerscheiben mit den gewonnenen Biofilmen wurden deswegen vor

Weiterbehandlung und Auswertung in der Mitte auseinander gebrochen. Es ist

jedoch fraglich, ob dieser Biofilm als unzerstört angesehen werden kann. Wir

entschieden uns daher in dieser Studie die Trägerplättchen im Ganzen zu

untersuchen, damit es zu keiner Verletzung des empfindlichen Biofilms kam.

6.2 BIOFILMDICKE

Dentale Plaque stellt eine Barriere für die Diffusion organischer Säuren dar,

jedoch ebenso für neutralisierende Agentien gegenüber der Schmelzoberfläche

(Mandel 1974; Saxton 1975). Bedenkt man die Wichtigkeit der Plaquedicke in

Stoffwechselprozessen, die bei dentalen Erkrankungen eine Rolle spielen, so

haben sich nur wenige Studien der Messung der intraoralen Plaquedicke

gewidmet. Folglich gibt es nur wenige Daten, mit denen unsere Ergebnisse

vergleichbar sind. Es gibt Methoden, bei denen die Plaquedicke

elektronenmikroskopisch (Main et al. 1984) oder mit einem Laser-Scanning-

Mikroskop (Yeganeh et al. 1999) untersucht wurde. In anderen Studien wurde die

Plaquedicke, wie auch in der vorliegenden Untersuchung, mit Hilfe des konfokalen

Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) untersucht (Netuschil et al. 1998; Wood et al.

2000; Auschill et al. 2001; Zaura-Arite et al. 2001).

DISKUSSION 48

Netuschil et al. (1998) fanden nach drei Tagen (72 Stunden) Biofilme mit einer

Dicke zwischen 6-45 µm, die auf Schmelz und Glasplättchen wuchsen, welche in

Kunststoffschienen eingebracht waren. Mit einem ähnlichen Schienendesign

zeigten sich bei Auschill et al. (2001) nach fünf Tagen (120 Stunden) Dicken

zwischen 15-31 µm auf Schmelzproben. Zwei Gründe können diese niedrigen

Werte im Vergleich zu den vorliegenden Ergebnissen erklären: In beiden Studien

wurden die Biofilme getrocknet und eingebettet, bevor sie unter dem CLSM

ausgewertet wurden. Die Dicken entsprechen ungefähr der Hälfte des

entsprechenden feuchten Biofilms. Zudem spiegelt die geringe Höhe die Tatsache

wider, dass die „Glattflächenplaque“, die in diesen Studien gesammelt wurde,

deutlich mehr der Umgebung des Speichels und der Wange ausgesetzt war, als

die Proben in der vorliegenden Untersuchung. Die Proben waren in Richtung der

Wange eingebracht und nicht in Richtung der Zähne und damit vor Wangenabrieb

geschützt, wie in unserer Studie.

Wood et al. (2000) klebte eine in situ-Vorrichtung, bestehend aus einem Nylonring,

der auf einem Schmelzplättchen befestigt wurde, auf die ersten oder zweiten

Molaren von acht Probanden. Nachdem die Vorrichtung für 96 Stunden getragen

wurde, fand man an der Schmelz/Ring-Verbindung Plaquetiefen zwischen 75-220

µm und im Zentrum der Vorrichtung Plaquetiefen zwischen 35-215 µm.

Nach 48 Stunden, also der Hälfte der Zeit, untersuchten Zaura-Arite et al. (2001)

Biofilme, die in Vertiefungen auf Rinderdentin wuchsen. Die erreichte Dicke betrug

durchschnittlich 34,3 µm. Obwohl die Probanden in „heavy“ und „light“

Plaquebildner unterschieden wurden, zeigte die 48 Stunden Kontrolle bei den drei

„heavy“ Plaquebildnern eine durchschnittliche Biofilmdicke von 28, 31 und 43 µm,

bei den drei „light“ Plaquebildnern 28, 32 und 37 µm. Die Beobachtung, dass

Probanden, die als „heavy“ Plaquebildner registriert wurden, in einer

vorgegebenen Zeit nicht unbedingt größere Biofilmdicken bildeten als „light“

Plaquebildner, deckt sich auch mit unseren Ergebnissen. Zum Beispiel bildeten

die Probanden DR (PFRI II) und MK (PFRI III) in Versuch 2 nach 48 Stunden mit

72 µm und 118 µm deutlich größere Plaquedicken, als die Probanden LH (26 µm)

und AD (38 µm) die beide mit einem PFRI von IV eingestuft waren. Es sollte

erwähnt werden, dass alle Autoren die großen Unterschiede in der Plaquedicke

zwischen den verschiedenen Probanden betonen. Dies stimmt mit der

DISKUSSION 49

vorliegenden Untersuchung überein, die relativ hohe Standardabweichungen

aufweist. Betrachtet man jedoch jeden einzelnen Probanden für sich, so ist ein

gleichmäßiges Muster mit ähnlichen Dicken in Ober- und Unterkiefer und deutlich

geringeren Werten an den Palatinalflächen an den verschiedenen Lokalisationen

verfolgbar.

Da diese Studie ähnliche Biofilmdicken an verschiedenen Lokalisationen in der

bukkalen Region von Ober- und Unterkiefer aufweist und palatinal gleichmäßig ein

geringeres Wachstum zeigt, lässt sich daraus folgern, dass das in der

vorliegenden Studie verwendete in vivo Biofilm-Modell ein sehr nützliches und

standardisiertes Hilfsmittel darstellt, um in vivo/in situ verschiedene

Einflussfaktoren auf das orale Biofilmwachstum testen zu können.

Der zweite Versuchsabschnitt zeigte eine stetige Zunahme der Biofilmdicken an

den Tagen 1 bis 3 (46,2 µm bis 123,7 µm). In einem weiteren Versuchsdurchlauf,

in dem die Tage 4 bis 7 untersucht wurden, zeigten sich Plaquedicken von 109,5

µm bis 134,3 µm. Quirynen und van Steenberghe (1989) untersuchten die frühe

Plaquebildung von 6 bis 96 Stunden und stellten fest, dass das Plaquewachstum

einer exponentiellen Kurve mit einer leichten Sättigung gegen 96 Stunden folgte.

In der vorliegenden Studie erreichte Tag 4 mit 109,5 µm eine geringere Dicke als

Tag 3 mit 123,7 µm. Dies kann jedoch damit erklärt werden, dass für die

Untersuchung an den Tagen 4 bis 7 ein neuer Versuchsdurchlauf gestartet wurde,

deshalb wirkten auf die einzelnen Biofilmproben unterschiedliche Einflussfaktoren

ein. An Tag 7 zeigt sich mit 133,7 µm eine etwas geringere Dicke als an Tag 5 mit

134.3 µm. Wie bereits in Kapitel 2.1.4.3 beschrieben, ist die Zunahme der

Biofilmdicke nicht unbegrenzt, sondern es stellt sich ein Gleichgewicht zwischen

Neubildung und Ablösung im Biofilm ein (Flemming und Wingender 2001a). Dies

spiegelt sich auch in unseren Ergebnissen wieder, da die Zunahme der Dicke an

den Tagen 4 bis 7 nicht mehr signifikant war, und Tag 7 sogar einen geringeren

Wert zeigte, als Tag 5.

DISKUSSION 50

6.3 VITALFLUORESZENZ

Es bieten sich verschiedene Möglichkeiten die Vitalität dentaler Plaque zu

bestimmen. Sowohl die Kultivierung von Plaque, als auch Vitalitätsbestimmungen

von Plaqueabstrichen mittels Vitalfluoreszenztechnik erforderten bisher die

mechanische Entfernung der Plaque, was automatisch eine Zerstörung des

empfindlichen dreidimensionalen Aufbaus zwischen Zellen und Biofilmmatrix

bedeutete (Arweiler et al. 2001a; 2001b). Um diese Schwierigkeiten zu umgehen,

wurden in vivo Trägervorrichtungen mit der Methode der konfokalen Laser-

Scanning-Mikroskopie kombiniert (Netuschil et al. 1998; Wood et al. 2000; Auschill

et al. 2001; 2002; Zaura-Arite et al. 2001).

Es wurden bisher wenige Studien publiziert, welche die Plaquebildung in

verschiedenen Bereichen der Bezahnung mit Hilfe von Plaqueindizes oder

planimetrischen Messungen der plaquebedeckten Flächen der Zähne beschreiben

(Quirynen und van Steenberghe 1989). Bis jetzt gibt es noch keine Studie, die die

Vitalität in den verschiedenen Biofilmschichten an unterschiedlichen

Lokalisationen systematisch ermittelte. Deswegen können Vergleiche, die die

Vitalitätsmittelwerte betreffen nur allgemein gehalten werden. Die gefundenen

Vitalitätswerte stimmen aber mit Ergebnissen anderer Untersuchungen überein

(Gordon et al. 1971; Manganiello et al. 1977).

Obwohl sich bei allen Probanden (interindividuell) deutliche Unterschiede in der

Anzahl der Biofilmschichten und der Vitalitätswerte zeigten, konnte nach 48

Stunden eine große Beständigkeit bezüglich des Vitalitätsmusters jedes einzelnen

Probanden (intraindividuell) festgestellt werden. Darüber hinaus zeigten einige

Probanden ganz charakteristische Strukturmuster, wie z.B. Plateaus oder Spitzen

auf, die an allen Lokalisationen aufzufinden waren. Trotz der großen Unterschiede

zwischen den Individuen, kann die Vitalitätsverteilung der Plaque der acht

Probanden aus Versuch 1 grob in drei Muster eingeteilt werden.

Bei einigen Probanden wurde eine hohe Anzahl an toten Bakterien (niedrige

Vitalitätswerte) in den ersten Biofilmschichten nahe der Glasoberfläche gefunden.

In höheren Schichten nahmen die Vitalitätswerte zu, während sie in niedrigen

Werten an der Biofilmoberfläche endeten. Diese Beobachtung, dass lebende

Plaquemikroorganismen auf einer dichten Schicht toter Bakterien angesiedelt sind,

DISKUSSION 51

wurde auch von Netuschil et. al. (1998) beschrieben. Eine Erklärung für diese

Beobachtung könnte sein, dass dünne Bakterienschichten, die sich noch nicht zu

einem komplexen Biofilm zusammengeschlossen haben, sehr empfänglich

gegenüber den antibakteriellen Bestandteilen des Speichels sind.

Andere Probanden zeigten ein prinzipiell ähnliches Muster, bei dem die Vitalität in

den obersten Biofilmschichten aber noch einmal anstieg. Die toten Bakterien

werden dann von neuen, vitalen Bakterien überlagert oder die Existenz einzelner

noch lebender Bakterien führt dazu, dass sich neue Schichten von vitalen

Bakterien durch Proliferation bilden. Sind diese neuen vitalen Biofilmschichten

länger dem „antibakteriellen“ Mundhöhlenmilieu ausgesetzt könnte dies wieder zu

niedrigeren Vitalitätswerten in den obersten Schichten führen. Diese Beobachtung

trifft jedoch nur für einige Probanden zu.

Als dritte Variante bildeten einige Probanden Biofilme, die sehr hohe

Vitalitätswerte in Nachbarschaft zur Aufwuchsoberfläche zeigten und deren

Vitalitätswerte zu den äußeren Lagen hin abnahmen. Es ist anzunehmen, dass

diese Probanden möglicherweise schlechtere antibakterielle Mechanismen

besitzen, eine kariogene Ernährungsweise haben oder die Bakterien des Biofilms

bessere Resistenzen aufweisen.

Das Kariesrisiko scheint jedoch keinen Einfluss auf die Werte zu haben. Diese

Beobachtung stimmt, wie bereits in Kapitel 6.2 beschrieben, mit einer

Untersuchung überein, bei der sich zwischen drei „heavy“- und drei „light“-

Plaquebildnern nach 48 Stunden kein Unterschied im Biofilm zeigte (Zaura-Arite et

al. 2001). Des weiteren wurden in dieser Studie keine allgemeinen Muster für die

Vitalitätsverteilung von verschiedenen Probanden gefunden, was auch mit

unseren Beobachtungen übereinstimmt. In der erwähnten Studie wurden die

Vitalitätswerte jedes Probanden als äußere, mittlere und innere Schichten

ermittlet, für die einzelnen Probanden wurden keine Vitalitätswerte aufgezeigt.

Unsere Daten nach 48 Stunden deuten auf ein konstantes ökologisches

Mundhöhlenmilieu jedes Probanden hin, was durch fördernde oder

einschränkende Einflüsse auf die Vitalität des Biofilms zu einem für jeden

Probanden typischen Identitätsmusters führte.

Es ist zu vermuten, dass diese Merkmale und diese für eine bestimmte Lebenszeit

gleichbleibenden Muster sich in jedem Menschen abhängig von genetischen

DISKUSSION 52

(Speichelzusammensetzung, Biofilmresistenz) und umweltbedingten Faktoren

(Ernährung) entwickeln und wahrscheinlich nur schwer zu beeinflussen sind.

Betrachtet man das Vitalitätsmuster eines jeden Probanden an verschiedenen

Tagen (1 bis 7), so zeigen sich deutliche Unterschiede in der Anzahl der

Biofilmschichten und auch der Vitalitätswerte. Charakteristische Strukturmerkmale

lassen sich über eins bis sieben Tage verteilt nicht eindeutig erkennen. Eine

Erklärung hierfür könnte sein, dass im Vergleich zu den nach 48 Stunden

erhaltenen Vitalitätsmustern die Probekörper unterschiedlich lange und zu

verschiedenen Zeitpunkten entfernt wurden. Daher ergaben sich auch

unterschiedliche Einflussfaktoren auf die einzelnen Biofilmproben.

Auch bei der Einteilung nach Tagen ist kein eindeutiges Vitalitätsmuster

erkennbar. Eine Besonderheit stellte jedoch Tag drei dar. Die Vitalitätswerte aller

Probanden lagen in einem relativ engen Bereich zwischen 76,1 und 90,6 %. Diese

konstanten Werte sind jedoch auf keinen anderen Tag übertragbar. Eine Erklärung

hierfür könnte eine gewisse Etablierung des Biofilms und seiner metabolischen

Prozesse nach drei Tagen sein.

Während man annimmt, dass die Vielfalt der Plaque-Mikroflora vorrangig den

endogen aufgenommenen Nährstoffen des Wirts zuzuschreiben sind, als den

exogenen Ernährungsfaktoren (Roberts et al. 1999), so gibt es keinerlei

Informationen über Einflüsse auf den Vitalitätsgrad von Bakterien. Die

Untersuchung solcher Einflussfaktoren, wie zum Beispiel eine spezielle

Ernährungsweise oder der Gebrauch von antibakteriellen Wirkstoffen zu einem

bestimmten Zeitpunkt wird Gegenstand weiterer Studien sein.

53

7 ZUSAMMENFASSUNG

Ziel der vorliegenden Studie war es, ein reproduzierbares und standardisiertes

Verfahren zur Untersuchung von nativen Biofilmen zu entwickeln und die

Parameter „Vitalität“ und „Dicke“ der dentalen Plaque zu untersuchen. Hierfür

wurden die Methoden der Vitalfluoreszenztechnik und der konfokalen Laser-

Scanning-Mikroskopie (CLSM) kombiniert.

In einem Vorversuch wurde die Färbetechnik, die bei „abgekratzten“ Biofilmen

bereits etabliert war auf in situ Biofilme übertragen. Hierzu wurden 8 und 24

Stunden alte Biofilme in vitro gezüchtet, mit Vitalfluoreszenzfärbung gefärbt und

direkt danach unter dem CLSM untersucht.

Der Hauptversuch gliederte sich in zwei Versuchsabschnitte. Im ersten

Versuchsabschnitt trugen 8 Probanden Kunststoffschienen in Ober- und

Unterkiefer, die jeweils mit 15 Glasplättchen als Aufwuchsfläche für den Biofilm

bestückt waren. Nach 48 Stunden wurden die Probenplättchen entfernt und eine

Vitalfluoreszenzfärbung durchgeführt. Die Vitalitätsverteilung der verschiedenen

Schichten und die Biofilmdicke wurden unter dem CLSM untersucht. Die

durchschnittliche Plaquedicke nach 48 Stunden betrug an den Bukkalflächen des

Oberkiefers 77,63 ± 29.10 µm, an den Bukkalflächen des Unterkiefers 71,92 ±

26,34 µm. Palatinal bildete sich mit 52,08 ± 26,23 µm signifikant weniger Plaque

als an den anderen Lokalisationen. Die Vitalitätswerte in den verschiedenen

Schichten variierten abhängig vom Probanden in größerem Umfang. Die

Untersuchung ergab jedoch, dass bei jedem einzelnen Probanden ein individuell

charakteristisches Vitalitätsmuster erkennbar war, das nicht von der Lokalisation

der Probe beeinflusst zu sein schien.

Im zweiten Versuchsabschnitt wurden die Schienen von 12 Probanden im

Oberkiefer für 1 bis 3 Tage und für 4 bis 7 Tage getragen. Es zeigte sich, dass die

Biofilmdicke in den ersten drei Tagen kontinuierlich zunahm. An den Tagen 4 bis 7

konnte kein signifikannter Unterschied mehr festgestellt werden. Die

Vitalitätswerte der verschiedenen Probanden zeigten deutliche Unterschiede.

Charakteristische Strukturmerkmale ließen sich über eins bis sieben Tage verteilt

nicht eindeutig erkennen. Auch bei der Einteilung nach Tagen war kein

eindeutiges Vitalitätsmuster erkennbar.

54

8 LITERATURVERZEICHNIS

ALLISON, D.G., RUIZ, B., SANJOSE, C., JASPE, A., GILBERT, P. (1998): Extrazellular products as mediators of the formation and detachment of Pseudomonas fluorescens biofilms. FEMS Microbiol. Lett. 167: 179-184 ANWAR, H., STRAP, J.L., COSTERTON, J.W. (1992): Minireview: Establishment of aging biofilms: Possible mechanism of bacterial resistance to antimicrobial therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 36(7): 1347-1351 ARENDS, J., SCHUTHOF, J., CHRISTOFFERSEN, J. (1986): Inhibition of enamel demineralization by albumin in vitro. Caries Res 20: 337-340 ARWEILER, N.B., NETUSCHIL, L., REICH, E. (2001a): Alcohol-free mouthrinse solutions to reduce supragingival plaque regrowth and biofilm vitality. J Clin Periodontol 28: 168-174 ARWEILER, N.B., REICH, E., BRECX, M., DÖRNER, M., NETUSCHIL, L. (2001b): Influence of ethanol on the antibacterial and anti-plaque efficacy of an amine fluorid/stannous fluoride mouthrinse solution. J Parodontol Implantol Orale 20(4/01): 331-340 AUSCHILL, T.M., ARWEILER, N.B., NETUSCHIL, L., BRECX, M., REICH, E., SCULEAN, A. (2001): Spatial distribution of vital and dead microorganisms in dental biofilms. Arch Oral Biol 46: 471-476 AUSCHILL, T.M., ARWEILER, N.B., SCULEAN, A., BRECX, M., REICH, E., NETUSCHIL, L. (2002): The effect of dental restorative materials on dental biofilm. Eur J Oral Sci 110: 48-53 AXELSSON, P. (1990): Method for determing caries risk. Phillip J 7: 181-187 BAIER, R.E., GLANTZ, P. (1978): Characterisation of oral in vivo films formed on different types of solid surfaces. Acta Odontol Scand 36: 289-301 BRECX, M., NETUSCHIL, L., REICHERT, B., SCHREIL, G. (1990): Efficacy of Listerine, Meridol and chlorhexidine mouthrinses on plaque, gingivitis and plaque bacteria vitality. J Clin Periodontol 17: 292-297 BRECX, M., RÖNSTRÖM, A., THEILADE, J., ATTSRÖM, R. (1981): Early formation of dental plaque on plastic films. J Periodont Res 16: 213-227 BRECX, M., THEILADE, J., ATTSRÖM, R. (1983): An ultrastructural quantitative study of the significance of microbial multiplication during early dental plaque growth. J Periodont Res 18: 177-186

LITERATURVERZEICHNIS 55

BRECX, M., THEILADE, J., ATTSRÖM, R., GLANTZ, P. (1987): The effect of chlorhexidine and octapinol on early human plaque formation. A light and electron microscopy study. J Periodont Res 22: 290-295 BRECX, M., WINKLER, M., NETUSCHIL, L. (1994): Human dental plaque formation on plastic films. Periodontal Abstracts 42: 77-80 CALDWELL, D.E., ATUKU, E., WILKIE, D.C., WIVCHARUK, K.P., KARTHIKEYAN, S., KORBER, D.R., SCHMID, D.F., WOLFAARDT, G.M. (1997): Germ theory vs. community theory in understanding and controlling the proliferation of biofilms. Adv Dent Res 11(1): 4-13 CALDWELL, D.E., KORBER, D.R., LAWRENCE, J.R. (1992): Imaging of bacterial cells by fluorescence exclusion using scanning confocal laser microscopy. J Microbiol Meth 15: 249-261 CALDWELL, D.E., LAWRENCE, J.R. (1986): Growth kinetics of Pseudomonas fluorescens microcolonies within the hydrodynamic boundary layers of surface microenvironments. Microb. Ecol. 12: 299-312 CHRIST, A. (1984): Plaquestudien im Rasterelektronenmikroskop. Oralprophylaxe 6: 35-41 COSTERTON, J.W., CHENG, K.J., GEESY, G.G., LADD, T., NICKEL, J.C., DASGUPTA, M., MARIE, T.J. (1987): Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Mikrobiol 41: 435-464 COSTERTON, J.W., LEWANDOWSKI, Z. (1995): Microbial biofilms. Annu Rev Mikrobiol 49: 711-745 DAVIES, D.G., CHAKRABARTY, A.M., GEESEY, G.G. (1993): Exopolysaccharide production in biofilms: substratum activation of alginate gene expression by Pseudomonas aeruginosa. Appl. Environ. Microbiol. 59: 1181-1186 DAWES, C., JENKINS, G.N., TONGE, C.H. (1963): The nomenclature of the integuments of the enamel surface of teeth. Br Dent J 115: 65-68 DÖRFER, C. (2002): Parodont und Allgemeingesundheit. zm 9: 38-43 DUSCHNER, H. (2001): Die dreidimensionale Darstellung mikroskopischer Strukturen mit CLSM. zm 10: 24-27 FLEMMING, H.-C., WINGENDER, J. (2001a): Biofilme - die bevorzugte Lebensform der Mikroorganismen. Biologie in unserer Zeit 31: 2-13 FLEMMING, H.-C., WINGENDER, J. (2001b): Relvance of microbial extracellular polymeric substances (EPSs) - Part I: Structural and ecological aspects. Water Sci Technol 43(6): 1-8


FURUICHI, Y., LINDHE, J., RAMBERG, P., VOLPE, A.R. (1992): Patterns of de novo plaque formation in the human dentition. J Clin Periodontol 19: 423-433 GIBBONS, R.J., VAN HOUTE, J. (1975): Bacterial adherence in oral microbial ecology. Annu Rev Mikrobiol 29: 19-44 GLANTZ, P.-O., LARSSON, K. (1981). On surface charge and intraoral adhesion. London, IRL Press Ltd. GORBUNOFF, M.J., TIMASHEFF, S.N. (1984): The interaction of proteins with hydroxyapatite. III. Mechanism. Analyt Biochem 136: 440-445 GORDON, D.F., STUTMAN, M., LOESCHE, W.J. (1971): Improved isolation of anaerobic bacteria from the gingival crevice area of man. Appl Microbiol 21: 1046-1050 GRÖTZ, K.A., DUSCHNER, H., GÖTZ, H., WAGNER, W. (1996): Histotomographie gesunden, menschlichen Zahnschmelzes permanenter Zähne im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM). Acta Med Dent Helv 1: 259-263 GRÖTZ, K.A., DUSCHNER, H., WAGNER, W. (1995): Histomorphologie radiierter Zahnhartgewebe im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM). Dtsch Zahnärztl Z 50: 653-657 GUGGENHEIM, B., GIERTSEN, E., SCHUPBACH, P., SHAPIRO, S. (2001): Validation of an in vitro biofilm model of supragingival plaque. J Dent R 80(1): 363-370 HAHN, R., NETUSCHIL, L., LÖST, C. (1992): Initiale Plaquebesiedelung keramischer Restaurationsmaterialien. Dtsch Zahnärztl Z 47: 330-334 HANNIG, M. (1993): Elektronenmikroskopische Untersuchung der initialen Bioadhäsionsprozesse an Festkörperoberflächen in der Mundhöhle. Habilitationsschrift Med Fakultät Uni Kiel HANNIG, M. (1997): Transmission electron microscopy study of in vivo pellicle formation on dental restorative materials. Eur J Oral Sci 105: 422-433 HAY, D.I. (1973): The interaction of human parotid salivary proteins with hydroxyapatite. Arch Oral Biol 18: 1517-1529 HOYLE, B.D., WILLIAMS, L.J., COSTERTON, J.W. (1993): Production of mucoid exopolysaccharide during development of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Infect. Immun. 61: 777-780 JENSEN, S.B., LÖE, H., SCHIÖTT, C.R., THEILADE, E. (1968): Experimental gingivitis in man. 4. Vancomycin induced changes in bacterial plaque composition as related to development of gingival inflammation. J Periodontol Res 3(4): 284-293


LAWRENCE, J.R., KORBER, D.R., HOYLE, B.D., COSTERTON, J.W., CALDWELL, D.E. (1991): Optical sectioning of microbial biofilms. J Bacteriol 20: 6558-6567 LEONHARDT, A., OLSSON, J., DAHLEN, G. (1995): Bacterial colonization on titanium, hydroxyapatite and amalgam surfaces in vivo. J Dent Res 73: 1607-1612 LILJEMARK, W.F., BLOOMQUIST, C.G., BRANDT, C.L., PIHLSTROM, B.L., HINRICHS, J.E.,WOLFF, L.F. (1993): Comparison of the distribution of actinomyces in dental plaque on inserted enamel and natural tooth surfaces in periodontal health and disease. Oral Microbiol Immunol 8: 5-15 LILJEMARK, W.F., FENNER, L.J., BLOOMQUIST, C.G. (1986): In vivo colonisation of salivary pellicle by haemophilus, actinomyces and streptoccocus spezies. Caries Res 20: 481-497 LÖE, H. (1970): Disscussion of: methods and criteria in evaluation of gingival and periodontal response. Int Dent J 20(3): 502-504 LÖE, H., THEILADE, E., JENSEN, S.B. (1965): Experimental gingivitis in man,. J Periodontol 36: 177-187 LÖE, H., THEILADE, E., JENSEN, S.B., SCHIÖTT, C.R. (1967): Experimental gingivitis in man 3. Influence of antibiotics on gingival plaque development. J Peridontol Res 2(4): 282-289 MACPHERSON, L.M.D., MACFARLANE, T.W., STEPHEN, K.W. (1990): An intra-oral appliance study of the plaque microflora associated with early enamel demineralization. J Dent Res 69(11): 1712-1716 MAIN, C., GEDDES, D.A., MCNEE, S.G., COLLINS, W.J., SMITH, D.C., WEETMAN, D.A. (1984): Instrumentation for measurement of dental plaque thickness in situ. J Biomed Eng 6: 151-154 MANDEL, I.D. (1974): Relation of saliva and plaque to caries. J Dent Res 53: 246-266 MANGANIELLO, A.D., SOCRANSCY, S.S., SMITH, C., PROPAS, D., ORAM, V., DOGON, I.L. (1977): Attempts to increase viable count recovery of human supragingival dental plaque. J Periodontal Res 12: 107-119 MARSH, P., BRADSHAW, D.H. (1995): Dental plaque as a biofilm. J Industrial Microbiol 15: 169-175 MARSHALL, K.C. (1992): Biofilms: an overview of bacterial adhesion, activity and control at surfaces. Am Soc Microbiol News 58: 202-207


MAYHALL, C.W. (1980). Nonmineralized coverings of the enamel surface. Hagerstown, Harper and Row, Publisher Inc. MC DOUGALL, T. (1963): Studies on dental plaque II. The histology of the developing interproximal plaque. Aust Dent J 8: 398-407 MCCOY, J.C., BRYERS, J.D., ROBBINS, J., COSTERTON, J.W. (1981): Observations in fouling biofilm formation. Can J Microbiol 15: 263-276 MECKEL, A.H. (1965): The formation and properties of organic films on teeth. Arch Oral Biol 10: 585-597 MEYEROWITZ, C., FEATHERSTONE, J.D.B., BILLINGS, R.J., EISENBERG, A.D., FU, J., SHARIATI, M., ZERO, D.T. (1991): Use of an intra-oral model to evaluate 0.05% sodium fluoride mouthrinse in radiation induced hyposalivation. J Dent Res 70(5): 894-898 NETUSCHIL, L. (1983): Vitalfärbung von Plaque-Mikroorganismen mit Fluoresceindiacetat und Ethidiumbromid. Dtsch Zahnärztl Z 38: 914-917 NETUSCHIL, L., REICH, E., BRECX, M. (1989): Direct measurements of the bactericidal effect of chlorhexidine on human dental plaque. J Clin Periodontol 16: 484-488 NETUSCHIL, L., REICH, E., UNTEREGGER, G., SCULEAN, A., BRECX, M. (1998): A pilot study of confocal laser scanning microscopy for the assessment of undisturbed dental plaque vitality and topography. Arch Oral Biol 43(4): 277-285 NIKIFORUK, G. (1985): Understanding dental caries. Vol. 1. Etiology and mechanisms. Basic and clinical aspects. Basel, Karger. NORDE, W. (1984): Adsorption of biopolymers and its relevance for particle adhesion: a physico-chemical approach. Oxford, IRL Press Ltd. NYVAD, B., KILIAN, M. (1987): Microbiology of early colonisation of human enamel and root surfaces in vivo. Scand J Dent Res 95: 369-380 PERNEGER, T.V. (1998): What´s wrong with Bonferroni adjustment. Brit Med J 316: 1236-1238 PLATTNER, H., HENTSCHEL, J. (1997): Zelluläre Strukturen - Sichtbarmachung mit Hilfe mikroskopischer Techniken, Thieme, Stuttgart-NewYork. PRUITT, K.M. (1977): Macromolecular components of oral fluids at tooth surfaces. Swed Dent J 1: 225-240 PRUITT, K.M., CALDWELL, R.C., JAMIESON, A.D., TAYLOR, R.E. (1969): The interaction of salivary proteins with the tooth surface. J Dent Res 48: 818-823


QUIRYNEN, M., VAN STEENBERGHE, D. (1989): Is early plaque growth rate constant with time? J Clin Periodontol 16: 278-283 RAMBERG, P., FURUICHI, Y., LINDHE, J., GAFFAR, A. (1992): A model for studying the effects of mouthrinses on de novo plaque formation. J Clin Periodontol 19: 509-520 ROBERTS, S.K., BASS, C., BRADING, M., LAPPIN-SCOTT, H., STOODLEY, P. (1999): Biofilm formation and structure: What´s new? In: Newman, H.N. and Wilson, M. dental plaque revisited - oral biofilms in health and disease, BioLine, Cardiff 1999: 15-35 ROBINSON, C., KIRKHAM, J., PERCIVAL, R., SHORE, R., BONASS, W., BROOKES, S., KUSA, L. (1997): A method for the quantitative site-specific study of the biochemistry within dental plaque biofilms formed in vivo. Caries Res 31: 194-200 RÖLLA, G., BOWEN, W.H. (1978): Surface adsorption of fluoride and ionic exchange reactions on hydroxyapatite. Acta Odontol Scand 36: 219-224 RÖNSTRÖM, A., EDWARDSSON, S., ATTSRÖM, R. (1977): Streptococcus sanguis and streptococcus salivarius in early plaque formation on plastic films. J Periodontol Res 12: 331-339 ROSZAK, D.B., COLWELL, R.R. (1987a): Metabolic activity of bacterial cell enumerated by direct viable count. Appl Environ Microbiol 53: 2889-2893 ROSZAK, D.B., COLWELL, R.R. (1987b): Survival strategies of bacteria in the natural environment. Microbiol Rev 51: 365-379 RUNDEGREN, J., HVID, E.B., JOHANSSON, M., ASTROM, M. (1992): Effect of 4 days of mouth rinsing with delmopinol or chlorhexidine on the vitality of plaque bacteria. J Clin Periodontol 19: 322-325 SANDIG, H., PFISTER, W., LIESEGANG, K. (1988): Untersuchung zur mikrobiellen Zusammensetzung der Plaque in Abhängigkeit von abnehmbaren Teilprothesen. Zahn-, Mund-, Kieferheilkd. 76: 717-720 SAXTON, C.A. (1975): Determination by electron microscope autoradiography of the distribution in plaque of organisms that synthesize intracellular polysaccharide in situ. Caries Res 9: 418-437 SCHÜLE, H. (1961): Chemische Zusammensetzung und physikalische Eigenschaften des Schmelzoberhäutchens. Arch Oral Biol 4: 40-49 SHAPIRO, S., GIERTSEN, E., GUGGENHEIM, B. (2002): An in vitro oral biofilm model for comparing the efficacy of antimicrobial mouthrinses. Caries Res 36: 93-100


SISSONS, C.H., CUTRESS, T.W., HOFFMANN, M.P., WAKEFIELD, J.S.J. (1991): A multi-station dental plaque microcosm (artificial mouth) for the study of plaque growth, metabolism, pH and mineralization. J Dent Res 70: 1409-1416 SISSONS, C.H., WONG, L., CUTRESS, T.W. (1996): Inhibition by ethanol of the growth of biofilm and dispersed microcosm dental plaque. Arch Oral Biol 41: 27-34 SOCRANSCY, S.S., MANGANIELLO, A.D., PROPAS, D., ORAM, V., VAN HOUTE, J. (1977): Bacteriological studies of developing supragingival dental plaque. J Peridontol Res 12: 90-106 THEILADE, E., THEILADE, J., MIKKELSEN, L. (1982): Microbiological studies on early dento-gingival plaque on teeth and mylar strips in humans. J Peridontol Res 17: 12-25 THEILADE, E., WRIGHT, W.H., JENSEN, S.B., LÖE, H. (1966): Experimental gingivitis in man. II. A longitudinal, clinical and bacteriological investigation. J Periodont Res 1: 1-13 THEILADE, J. (1964): Elektron microscopy study of calculus attachment to smooth surfaces. Acta Odontol Scand 22: 379-387 THEILADE, J. (1989): Dental plaque and dental calculus. In: Textbook of clinical periodontlogy 2nd edition (ed Lindhe, J.): 92-128 THOMSON, M., THOMSON, C., CHANDLER, N. (1996): In vitro and intra-oral investigations into the cariogenic potential of human milk. Caries Res 30: 434-438 VAN HOUTE, J., GIBBONS, R.J., BANGHART, S.B. (1970): Adherence as a determinant of the presence of streptococcus salivarius and streptococcus sanguis on the tooth surface. Arch Oral Biol 15: 1025-1034 VAN HOUTE, J., GIBBONS, R.J., PULKKINEN, A.J. (1971): Adherence as an ecological determinant for streptococci in the human mouth. Arch Oral Biol 16: 1131-1141 VAN PELT, A.W.J., DE JONG, H.P., BUSSCHER, H.J., ARENDS, J. (1983): Dispersion and polar surface free energies of human enamel. J Biomed Mat Res 17: 637-641 VON DER FEHR, F.R., LÖE, H., THEILADE, E. (1970): Experimental caries in man. Caries Res 4(2): 131-148 WATNICK, P., KOLTER, R. (2000): Biofilms, city of microbes. J Bacteriol 182: 2675-2679 WATSON, T.F. (1991): Application of confocal scanning optical microscopy to dentistry. Br Dent J 9: 287-291


WEISS, M.E., BIBBY, B.G. (1966): Some protein effects on enamel solubility. Arch Oral Biol 11: 59-63 WILSON, M., PATEL, H., FLETCHER, J. (1996): Susceptibility of biofilms of Streptococcus sanguis to chlorhexidine gluconate and cetylpyridinium chloride. Oral Microbiol Immunol 11: 188-192 WOOD, S.R., KIRKHAM, J., MARSH, P.D., SHORE, R., NATTRESS, B., ROBINSON, C. (2000): Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy. J Dent Res 79(1): 21-27 YEGANEH, S., LYNCH, E., JOVANOVSKI, V., ZOU, L. (1999): Quantification of root surface plaque using a new 3-D laser scanning method. J Clin Periodontol 26: 692-697 ZAHRADNIK, R.T., MORENO, E.C., BURKE, E.J. (1976): Effect of salivary pellicle on enamel subsurface demineralisation in vitro. J Dent Res 55: 664-670 ZAURA-ARITE, E., VAN MARLE, J., TEN CATE, J.M. (2001): Confocal microscopy study of undisturbed and chlorhexidine-treated dental biofilm. J Dent Res 80: 1436-1440 ZUHRT, R. (1964): Nomenklatur und Schmelzoberhäutchen. Dtsch Stomatol 14: 775-779

62

9 ANHANG

9.1 PROBANDENINFORMATION

STUDIE ZUR UNTERSUCHUNG DER BIOFILMBILDUNG IM MUND

Sehr geehrte Testteilnehmerin,

sehr geehrter Testteilnehmer,

Sie haben sich bereit erklärt, an einer Studie zur Untersuchung der Biofilmbildung im Mund

teilzunehmen.

Zur Vorbereitung des Tests wir zunächst Ihre Plaquebildung ermittelt. Dazu dürfen Sie nach

einer professionellen Zahnreinigung für die nächsten 24 Stunden die Zähne nicht putzen.

Nach Ablauf dieser 24 Stunden wird die Prüfärztin Frau Hein Ihren Plaque Index erfassen.

Danach werden Abdrücke von Ihrem Gebiss genommen zur Herstellung einer speziellen

Zahnschiene.

Im Rahmen der weiterer Untersuchungen müssen Sie diese Schienen in der ersten Testphase

für zwei Tage gleichzeitig im Oberkiefer und im Unterkiefer tragen. Über die genaue

Vorgehensweise wird Sie ZÄ Nicole Hein aufklären.

In der zweiten Testphase werden Sie nur eine Schiene für 3 Tage und dann für 7 Tage tragen,

wobei Ihnen regelmäßig ein Testplättchen zur Untersuchung entnommen wird.

Sollten Sie in den Wochen des Versuchsablaufs Antibiotika nehmen müssen, so bitten wir Sie,

uns dies sofort mitzuteilen. Das Zähneputzen ist nur mit einer Zahnbürste und Wasser (nicht

mit Zahnpaste) erlaubt. Dazu und während der Mahlzeiten muss die Schiene entnommen und

in einem Glas mit Kochsalzlösung gelagert werden.

Es steht Ihnen völlig frei, an dieser klinischen Studie teilzunehmen. Auch nach Einwilligung in

die Studie können Sie diese Einwilligung ohne Angabe von Gründen jederzeit zurückziehen.

Falls Sie bereit sind, an dieser Studie teilzunehmen, müssen Sie die Anweisungen von Frau

Hein genau befolgen. Wenn Sie die Behandlung beenden möchten oder unvorhergesehene

Ereignisse auftreten, sollten Sie Frau Hein sofort benachrichtigen.

Für alle weiteren Fragen steht Ihnen Frau Hein zur Verfügung

ZÄ Nicole Hein Dr. N. Arweiler

Abbildung 9-1: Merkblatt zur Probandeninformation

ANHANG 63

9.2 VITALITÄT NACH 8 UND 24 STUNDEN (IN VITRO)

Abbildung 9-2: Biofilm nach 8 Stunden in vitro

ANHANG 64

Abbildung 9-3: Biofilm nach 24 Stunden in vitro

ANHANG 65

9.3 DICKEN DER BIOFILME IN µM AN DEN TAGEN 1 BIS 7

Tabelle 9-1: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Biofilmdicken (µm) an den Tagen 1-7

Dicke (µm)

Probanden Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7

AD 42 38 84 150 66 138

AL 42 48 72 162 110 134

CD 56 72 138 102 162 134

DR 38 72 162 118 176 184

LH 32 26 60 66 84 90

MK 50 118 118 94 142 84

MM 44 190 140 80 108 146

NB 34 96 102 64 128 140

NH 38 68 98 132 114 124

RS 36 158 172 144 178 136

SB 70 108 178 110 168 118

SS 72 126 160 92 176 176

Mittelwerte 46,2 93,3 123,7 109,5 134,3 133,7

Standard-abweichungen ± 12,8 ± 47,1 ± 38,7 ± 31,1 ± 36,8 ± 27,8

vorne mitte hinten vorne mitte hinten

ANHANG 66

9.4 MITTELWERTE ± STANDARDABWEICHUNGEN DER VITALITÄTEN AN

DEN TAGEN 1 BIS 7

Tabelle 9-2: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Vitalitäten (%) an den Tagen 1-7

Vitalität (%)

Probanden Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7

AD 69,1 31,5 80,8 68,5 69,5 65,4

AL 66,0 54,6 76,1 46,2 45,6 63,8

CD 68,0 36,5 85,1 50,4 67,3 58,7

DR 78,9 49,6 78,0 37,6 69,9 70,8

LH 22,6 36,3 76,4 12,5 64,4 49,5

MK 69,7 70,4 88,1 55,4 73,2 50,0

MM 70,7 73,7 90,6 33,2 69,2 69,8

NB 31,8 51,0 82,7 60,3 53,8 38,3

NH 49,0 58,1 87,3 63,8 76,9 62,0

RS 61,8 78,4 88,1 58,1 70,7 58,4

SB 59,8 54,4 89,7 38,2 55,5 48,4

SS 82,7 49,0 83,3 64,1 74,4 58,7

Mittelwerte 60,9 53,6 83,9 49,0 65,9 57,8

Standard-abweichungen ± 17,3 ± 14,3 ± 4,9 ± 15,6 ± 9,0 ± 9,2

vorne mitte hinten vorne mitte hinten

ANHANG 67

9.5 VITALITÄT DER 8 PROBANDEN NACH 48 H IM OK UND UK

Abbildung 9-4: Vitalität des Probanden AD nach 48 H im OK und UK

Abbildung 9-5: Vitalität des Probanden NH nach 48 H im OK und UK

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73


OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73


VF (%

)


ANHANG 68

Abbildung 9-6: Vitalität des Probanden SS nach 48 h im OK und UK

Abbildung 9-7: Vitalität des Probanden CD nach 48 h im OK und UK

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73


VF (%

)


0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73



ANHANG 69

Abbildung: 9-8: Vitalität des Probanden OG nach 48 h im OK und UK

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73



Abbildung 9-9: Vitalität des Probanden RS nach 48 h im OK und UK

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73



ANHANG 70

Abbildung 9-10: Vitalität des Probanden SR nach 48 h im OK und UK

Abbildung 9-11: Vitalität des Probanden NB nach 48 h im OK und UK

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73



0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73



ANHANG 71

9.6 ÜBERSICHT DER VITALITÄT NACH PROBANDEN GEORDNET (TAGE 1

BIS 7)

AD

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


DR

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


CD

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


LH

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


AL

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


MK

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


ANHANG 72

MM

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


RS

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


NB

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


SB

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


NH

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


SS

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Schichten


Abbildungen 9-12 bis 9-23: Vitalität nach Probanden geordnet (Tage 1 bis 7)

ANHANG 73

9.7 ÜBERSICHT DER VITALITÄT ALLER PROBANDEN NACH TAGEN

GEORDNET

1. Tag

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94


AD AL CD DR LH MK MM NB NH RS SB SS

Abbildung 9-24: Vitalität der 12 Probanden am Tag 1

2. Tag

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94




ANHANG 74

3. Tag

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94




4. Tag

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94




ANHANG 75

5. Tag

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94




7. Tag

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

100,00

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94




76

DANKSAGUNG

Frau Privatdozentin Dr. Nicole Arweiler möchte ich für die Überlassung des

Themas, die hervorragende Betreuung sowie die Unterstützung bei der Erstellung

dieser Arbeit herzlich danken.

Herrn Prof. Dr. Dr. N.-C. Gellrich danke ich für die Übernahme des

Zweitgutachtens.

Frau Marie Follo, Ph. D., möchte ich für die Auswertungen am konfokalen Laser-

Scanning-Mikroskop und die wertvollen Hinweise danken.

Mein Dank gilt auch Herrn Dr. Marc Metzger für seine Hilfe bei der Formatierung.

Dr. Thorsten Auschill danke ich für die Beratung und das Korrekturlesen dieser

Arbeit.

Den Probanden, die sich freundlicherweise zur Verfügung gestellt haben danke

ich herzlich sowie all denen, die auf verschiedenen Wegen zum Gelingen dieser

Arbeit beigetragen haben.

77

LEBENSLAUF

Name: Nicole Hein Geburtsdatum: 17.01.1973

Geburtsort: Dillingen a. d. Donau

Vater: Michael Hein, Zahntechnikermeister

Mutter: Josefine Hein, geb. Bestle, Fachwirtin für

kaufmännische Betriebsführung

SCHULAUSBILDUNG: 1979 – 1983 Grundschule in Sonthofen

1983 – 1992 Gymnasium in Sonthofen

Juli 1992 Abitur

BERUFSAUSBILDUNG: 1992 – 1995 Ausbildung als Zahntechnikerin

bei Dental-Labor Herbert Wetzstein in

Oberstdorf-Schöllang

Oktober 1995 Gesellenprüfung

STUDIUM: Oktober 1995 – Juli 2000 Studium der Zahnmedizin an der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg i. Br.

Oktober 1996 Naturwissenschaftliche Vorprüfung

April 1998 Zahnärztliche Vorprüfung

14. Dezember 2000 Abschluss der Zahnärztlichen Prüfung

10. Januar 2001 Approbation als Zahnärztin

BERUFLICHE TÄTIGKEIT: Seit April 2001 Assistenzzahnärztin in der Abteilung Poliklinik für

Zahnerhaltung und Parodontologie,

Universitätsklinik Freiburg i.Br.

Direktor: Prof. Dr. E. Hellwig

DREIDIMENSIONALE STRUKTUR UND …€¦ · Aus der Universitätsklinik für Zahn-, Mund- und...

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