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Einführungin die

Durchflußzytometrie

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WasWas ist Durchfluist Durchflußßzytometriezytometrie??

Suspendierte Einzelzellen werden durch einen Lichtstrahl (Laser) geführt. Dabei senden dieZellen in Abhängigkeit vom Zelltyp und der Probenvorbereitung charakteristische Lichtsignale aus, die mittels geeigneter Detektoren nachgewiesen werden.

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Was Was leistet ein Durchfluleistet ein Durchflußßzytometerzytometer??Die Durchflußzytometrie quantifiziert im

Vergleich zur Mikroskopie simultan mehrere optische Eigenschaften (Parameter) kompletter Zellen mit hoher Durchsatzrate. Die Mikroskopie mit der räumlichen Auflösung der Zellen wird jedoch nicht ersetzt.Die Meßgeschwindigkeit beträgt maximal 4000Zellen pro Sekunde (BD FACSCalibur™).

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Wie funktioniert Wie funktioniert die die DurchfluDurchflußßzytometriezytometrie??Durch die Trägerflüssigkeit wird eine laminare Strömung erzeugt (Hüllstrom).Durch die Querschnittsverringerung in der Meßküvette wird sowohl der laminare Proben- als auch der Hüllstrom beschleunigt und dadurch verjüngt (hydrodynamische Fokussierung). Beide Strömungen vermischen sich dabei nicht!Der Abstand zwischen direkt aufein-anderfolgenden Zellen wird vergrößert, so daß die Zellen jeweils einzeln den Laserstrahl passieren und damit als einzelne Zelle gemessen werden. Verklebte Zellen werden nicht vereinzelt!Trägerflüssigkeit

Probe

Laserstrahl

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Fluorescence Activated Cell SorterFluorescence Activated Cell Sorter

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Die Die Merkmale Merkmale des FSC und des SSCdes FSC und des SSC

Vorwärtsstreulicht (FSC) - Lichtbeugungproportional zur Zelloberfläche (Zellgröße)gemessen entlang der Achse des einfallenden Lichtes

Seitwärtsstreulicht (SSC) - Lichtbrechung und Reflexionproportional zur Zellkomplexität oder -granularitätgemessen in einem 90o Winkel zum einfallenden Licht

Seitwärtsstreulicht (488 nm):Zellkomplexität/-granularität

Vorwärtsstreulicht (488 nm):Zellgröße

Lichtquelle(488 nm)

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Welche Welche Parameter lassenParameter lassen sich sich von von diesen Partikeln messen diesen Partikeln messen ??

Chromosomen Blutzellen Protozoen

Ihre relative Größe (Vorwärtsstreulicht - FSC)Ihre relative Granularität oder ihre interne Komplexität (Seitwärtsstreulicht - SSC)Ihre spezifische Fluoreszenz (FL1, FL2, FL3, FL4…)und die entsprechende relative Fluoreszenzintensität

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Beispiel Beispiel ffüür FSC/SSC:r FSC/SSC:Lysiertes VollblutLysiertes Vollblut

Debris

NeutrophileGranulozyten

LymphozytenSeitw

ärts

stre

ulic

ht (S

SC)

Vorwärtsstreulicht (FSC)

0 200 400 600 800 1000

020

040

060

080

010

00

Monozyten

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Wie werden Wie werden die die Fluoreszenzen Fluoreszenzen gemessengemessen??

abhängig vom Gerätetyp3-4 Fluoreszenzen (1-2 Laser): BD FACSCalibur™3-6 Fluoreszenzen (1-3 Laser): BD LSRabhängig von der Probenvorbereitungdie Wellenlänge ist vom jeweils eingesetztenFluorochrom abhängigFluoreszenzen werden im 90o Winkel zumeinfallenden Licht gemessen

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Wie entsteht Fluoreszenzlicht Wie entsteht Fluoreszenzlicht ??

Das Fluorochrom absorbiert die Energie des LaserlichtesDas Fluorochrom gibt die absorbierte Energie wieder frei:

Schwingungsenergie und WärmeEmission eines Photons mit einer größeren Wellenlänge (= geringere Energie)Die Wellenlängendifferenz zwischen Absorption und Emission wird Stoke´s- Shift bezeichnet.

λ = 488 nm (blau)

Energie des emittierten Fluoreszenzlichtes

Antikörper

Energie des einfallenden

Lichtes FluoresceinMolekül

λ ≅ 519 nm (grün)HO

CO2H

O

C

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Absorptionsspektren Absorptionsspektren gebrgebrääuchlicher Fluorochromeuchlicher Fluorochrome

R-PE APCFITCPerCP

Wellenlänge (nm)

PI

400 450 500 550 600 650 700

1000

800

600

400

200

0

Roter Laser 635 nmBlauer Laser 488 nm

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Emissionsspektren Emissionsspektren (= (= FluoreszenzspektrenFluoreszenzspektren))

gebrgebrääuchlicher Fluorochromeuchlicher Fluorochrome

Wellenlänge (nm)

700400 450 500 550 600 650

1000

800

600

400

200

0

R-PE APCFITC PerCPPI

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FluoreszenzintensitFluoreszenzintensitäättDas emittierte Fluoreszenzlicht ist proportional zur Zahl der

gebundenen Fluorochrommoleküle

Relative Fluoreszenzintensität

Zahl

der

Ere

igni

sse

FITC

FITC

FITC

100 101 102 103 104

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

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Darstellung Darstellung von von ZellanalysenZellanalysen

CD

19 P

E

CD3 FITC

10 0

10 0

101

102

103

104

10 1 10 2 10 3 10 4

M1M2

HäufigkeitsverteilungHistogramm

Punktwolken-DarstellungDot Plot

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Anwendungen der DurchfluAnwendungen der Durchflußßzytometrie zytometrie imim klinischen klinischen LaborLabor

HIV-Immunophänotypisierung (z.B. BD SimulSET™)CD4 Absolutzahlen (z.B. BD MultiSET™)Leukämien- und Lymphom- Immunophänotypisierung (BD CellQuest™, BD CellQuest Pro™)Zellzyklus und Analyse von Tumoren (Modfit LT™)Retikulozytenzählung (BD Retic-COUNT™)Cross-Match-Analytik (Organtransplantationen)Messung CD34-positiver hämatopoetischer Stamm- undProgenitorzellen (BD ProCOUNT™)Bestimmung von Restleukozyten (rWBC) in Thrombozyten- oder Erythrozytenkonzentraten (BD LeucoCOUNT™)

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Anwendungen der DurchfluAnwendungen der Durchflußßzytometriezytometriein in ForschungslaborenForschungslaboren

Immunfunktions- StudienHämatopoese der StammzellenMulti-drug resistance Studien (Krebs)Kinetische Studien (Zellfunktion)Plättchenanalyse (Herzkranzgefäßverengung)Messung von Mikroorganismen (Bakterien, Protozoen, Hefen)Umweltanalysen z.B. des Wassers(Giardia, Cryptosporidium)FISH und Flow