Einfluss kurzkettiger Fettsäuren und mikrobieller opus.uni- ... Einfluss kurzkettiger...

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  • Einfluss kurzkettiger Fettsäuren und mikrobieller Fermenta-

    tionsprodukte neuartiger Oligosaccharide auf Cytotoxizität,

    Proliferation und Apoptose von humanen Coloncarcinom-

    Zelllinien

    Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades

    der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

    Fakultät Naturwissenschaften

    Universität Hohenheim

    Institut für Biologische Chemie und Ernährungswissenschaft

    Universität Hohenheim

    und

    Institut für Ernährungsphysiologie

    Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel, Karlsruhe

    vorgelegt von

    Silvia Andrea Roser

    aus Pforzheim

    2005

  • Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Heinz Breer

    1. berichtende Person: Prof. Dr. rer. nat. Gerhard Rechkemmer

    2. berichtende Person: Prof. Dr. med. Hans Konrad Biesalski

    Eingereicht am: 30.06.2005

    Mündliche Prüfung am: 09.01.2006

    Die vorliegende Arbeit wurde am 23.11.2005 von der Fakultät Naturwissenschaften der

    Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwis-

    senschaften“ angenommen.

  • Erklärung

    Hiermit erkläre ich, dass die vorliegende Arbeit von mir selbst und nur mit den angege-

    benen Hilfsmitteln und unter Verwendung der angegebenen Quellen erstellt wurde.

    Pforzheim, den 29.06.2005

  • I Inhaltsverzeichnis I

    I Inhaltsverzeichnis

    I INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................. III

    II ABBILDUNGSVERZEICHNIS............................................................................ V

    III TABELLENVERZEICHNIS.............................................................................. VII

    IV ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ......................................................................VIII

    1 ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY ................................................................ 1

    2 EINLEITUNG.......................................................................................................... 5

    2.1 Mikrobielle Fermentation im Dickdarm ................................................................................... 5 2.1.1 Mikrobielle Besiedelung des Gastrointestinaltrakts.................................................................. 5 2.1.2 Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) als Endprodukte bakterieller Fermentationsprozesse ............. 7

    2.1.2.1 Definition SCFA ............................................................................................................. 7 2.1.2.2 Bildung und Konzentrationen der SCFA ........................................................................ 7 2.1.2.3 Absorption und Stoffwechsel der SCFA ......................................................................... 9 2.1.2.4 Rolle der SCFA bei Dickdarmkrebs.............................................................................. 11

    2.2 Darmkrebs ................................................................................................................................. 12 2.2.1 Epidemiologische Daten ......................................................................................................... 12 2.2.2 Beteiligte Gene ....................................................................................................................... 13 2.2.3 Einflussfaktoren...................................................................................................................... 14 2.2.4 Entstehung .............................................................................................................................. 15

    2.2.4.1 Adenom-Carcinom-Sequenz ......................................................................................... 15 2.2.4.2 APC-Gen, Familiäre Adenomatöse Polyposis (FAP).................................................... 15

    2.2.5 Apoptose................................................................................................................................. 16 2.2.6 Caspasen ................................................................................................................................. 17

    2.2.6.1 Apoptose im Gastrointestinaltrakt................................................................................. 17 2.2.7 Zellzyklus ............................................................................................................................... 19

    2.3 Ballaststoffe................................................................................................................................ 20 2.3.1 Funktionelle Kohlenhydrate ................................................................................................... 22

  • I Inhaltsverzeichnis II

    2.4 Zielsetzung ................................................................................................................................. 25

    3 MATERIAL UND METHODEN......................................................................... 27

    3.1 Material ...................................................................................................................................... 27 3.1.1 Geräte...................................................................................................................................... 27 3.1.2 Software.................................................................................................................................. 28 3.1.3 Chemikalien, Zellkulturmedien und –zusätze......................................................................... 28 3.1.4 Verbrauchsmaterial................................................................................................................. 30 3.1.5 Zelllinien................................................................................................................................. 31 3.1.6 Oligosaccharide ...................................................................................................................... 31 3.1.7 Lösungen ................................................................................................................................ 32

    3.2 Methoden.................................................................................................................................... 35 3.2.1 Gewinnung der Fermentationsüberstände............................................................................... 35 3.2.2 Analyse der Fermentationsüberstände .................................................................................... 36 3.2.3 Herstellen der WST-1-Gebrauchslösung ................................................................................ 36 3.2.4 Routine-Zellkultur .................................................................................................................. 36 3.2.5 Zellzählungen und Vitalitätsbestimmungen............................................................................ 37 3.2.6 Cytotoxizität ........................................................................................................................... 38 3.2.7 Proliferation ............................................................................................................................ 39 3.2.8 Apoptose................................................................................................................................. 40

    3.2.8.1 Annexin V ..................................................................................................................... 40 3.2.8.2 Caspase-3 ...................................................................................................................... 41

    3.2.9 Zellzyklus ............................................................................................................................... 42 3.2.10 Messung am Durchflusscytometer ..................................................................................... 42 3.2.11 Elektrophysiologische Untersuchungen in vertikalen Diffusionskammern (Ussing-

    Kammern) .......................................................................................................................... 44 3.2.12 Statistik .............................................................................................................................. 46

    4 ERGEBNISSE........................................................................................................ 47

    4.1 SCFA-Konzentrationen der FÜ................................................................................................ 47

    4.2 Cytotoxizität............................................................................................................................... 49 4.2.1 HT29....................................................................................................................................... 49

    4.2.1.1 Originalsubstanzen........................................................................................................ 49 4.2.1.2 Fermentationsüberstände und SCFA-Gemische............................................................ 50

    4.2.2 HT29 Clon 19A ...................................................................................................................... 52 4.2.2.1 Fermentationsüberstände und SCFA-Gemische............................................................ 52

  • I Inhaltsverzeichnis III

    4.2.3 T84..................................................................