Einfluss mütterlichen Rauchens während der Schwangerschaft ... · Enzym-Systeme sowie...

Aus der Frauenklinik

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. M. W. Beckmann

Einfluss mütterlichen Rauchens während der

Schwangerschaft auf den Oxidativen Status im

Fruchtwasser

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Annika Schibel

aus Darmstadt

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. rer. nat. med. habil. R. Dittrich Koreferent: Prof. Dr. med. M. W. Beckmann Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2012

1. ZUSAMMENFASSUNG - 1 -

1.1 Hintergrund und Ziele - 1 - 1.2 Methoden - 1 - 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen - 1 - 1.4 Praktische Schlussfolgerungen - 2 - 1.5 Abstract - 3 -

2. EINLEITUNG - 4 - 2.1 Rauchverhalten in Deutschland - 4 - 2.1.1 Auswirkungen auf Gesundheit und Gravidität - 5 - 2.2 Oxidativer Stress und seine Folgen - 7 - 2.2.1 Diagnostische Methoden - 8 - 2.2.2 Tabakrauch - Freie Radikale in der Schwangerschaft - 9 - 2.2.3 Antioxidative Schutzmechanismen -10- 2.3. Zielsetzung -11- 3. MATERIAL -12- 3.1 Untersuchungsmaterial -12- 3.2 Laborhilfsmittel, Spritzen und Kanülen -12- 3.3 Testlösungen und Chemikalien -13- 3.4 Lösungsmittel und Puffer -13- 3.5 Geräte -13-

4. METHODEN -15-

4.1 Theoretischer Teil -15- 4.1.1 Mechanismus der Lipidperoxidation -15- 4.1.2 Esterbauer-Verfahren: oxidative Modifikation von LDL in vitro -16-

4.2 Experimenteller Teil -18- 4.2.1 Plasmagewinnung -18- 4.2.2 Isolierung des LDL -18- 4.2.3 Reinigung des LDL -19- 4.2.4 Ermittlung der LDL-Konzentration im Eluat -19- 4.2.5 Verzögerung der LDL-Oxidation in vitro -20- 4.2.6 Herstellung der Pufferlösungen -20- 4.2.7 Fruchtwassergewinnung -21-

4.3. Statistik -21-

5. ERGEBNISSE -23- 5.1 Stichprobenbeschreibung -23- 5.1.1 Klassifizierung metrischer und nominaler Variablen -23- 5.1.2 Korrelation und Regressionsanalyse -24- 5.1.3 Indikationen für Sectiones -25- 5.2 Analyse des experimentellen Teils -27- 5.2.1 Graphische Ermittlung und Berechnung der Lag-Phasen -27- 5.2.2 Dauer der Lag-Phasen im Vergleich -29- 5.2.3 Signifikanztest -30- 5.3 Zusammenfassung der Ergebnisse -32- 6. DISKUSSION -33- 6.1 Interpretationen der Studien-Ergebnisse -33- 6.2 Review -36- 6.2.1 Antioxidantien im Plasma -36- 6.2.2 Antioxidantien-Gehalt der Muttermilch -37- 6.2.3 Antioxidative Schutzmechanismen der Plazenta -38- 6.3 Bezug der Studie zur aktuellen Forschung -39- 6.3.1 Antioxidantien im Fruchtwasser -39- 6.3.2 Länge der Lag-Phase als Parameter für den oxidativen Status -42- 7. LITERATURVERZEICHNIS -45-

8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS -55-

9. DANKSAGUNG -57-

10. LEBENSLAUF -58-

Dissertation A. Schibel -1-

1. Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

In Deutschland rauchen ungefähr 20% der Frauen. Selbst in der

Schwangerschaft schaffen es viele nicht, damit aufzuhören. In vielen

Studien werden die durch Zigarettenrauch entstehenden freien Radikale

als Ursache oxidativen Stresses bei Schwangeren und Feten gesehen.

Bei normal verlaufenden Schwangerschaften ist die menschliche Plazenta

jedoch in der Lage, die Lipid-Peroxidation durch antioxidativ-wirkende

Enzym-Systeme sowie Hormonproduktion zu regulieren.

Ziel dieser Arbeit war festzustellen, ob es möglich ist Antioxidantien im

Fruchtwasser mittels des Esterbauer-Verfahrens nachzuweisen und

herauszufinden, ob ein Unterschied bezüglich des oxidativen Status im

Fruchtwasser zwischen rauchenden und nicht-rauchenden Müttern

besteht.

1.2 Methoden

Als Messverfahren wurde die kupferkatalysierte Oxidation von low-

densitiy-Lipoproteinen (LDL) nach Esterbauer verwendet. Dabei handelt

es sich um eine in vitro Peroxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren

durch freie Sauerstoffradikale. Es entstehen Diene, die ein definiertes

Absorbtionsmaximum bei 234nm aufweisen, sodass sie

spektrophotometrisch erfasst werden können.

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

Die Messungen zeigten einen signifikanten Unterschied in der Dauer der

Lag-Phase zwischen rauchenden und nicht-rauchenden Müttern.

(81,61 min ± 23,72 min, n=20 vs. 65,06 min ± 15,14 min, n=67; p=0,007)


1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Die Bestimmung der Lag-Phase während der LDL-Oxidation ermöglicht

die Analyse pro-/ antioxidativ-wirkender Substanzen. Da die Lag-Phase

bei Rauchern signifikant länger war als bei Nicht-Rauchern ist

anzunehmen, dass sich im Fruchtwasser rauchender Mütter eine

Substanz mit antioxidativer Funktion befindet. Diese scheint die LDL-

Oxidation zu hemmen und als Radikalfänger zu dienen. Die Vermutung

liegt nahe, dass die feto-plazentare Einheit in der Lage ist, auf die

schädlichen Einflüsse des Rauchens protektiv zu reagieren.


1.5 Abstract

Objectives:

About 20% of women in Germany are smokers, and some are also unable

to stop smoking during pregnancy. As cigarette smoke generates free

radicals, it has been suggested that it may be one of the major sources of

oxidant stress in pregnant women and unborn fetuses. On the other hand,

the human placenta is known to be a major source of pro-oxidant agents,

antioxidant enzyme systems and hormones, and is able to keep lipid

peroxidation under control in normal pregnancy. The aims of the present

study were to determine whether it is possible to detect antioxidants in

amniotic fluid using the Esterbauer method and to analyze whether there

are any differences in the oxidant status of the amniotic fluid between

smoking and non-smoking mothers.

Study design and main outcome measures:

Differences in low-density lipoprotein (LDL) susceptibility to oxidation were

measured using the Esterbauer method in amniotic fluid from smoking and

non-smoking mothers.

The results showed that there was a significant difference in the duration

of susceptibility of LDL to oxidation.

(81,61 min ± 23,72 min, n=20 vs. 65,06 min ± 15,14 min, n=67; p = 0,007)

Conclusion:

Measuring the lag phase of LDL oxidation makes it possible to study

antioxidative effects. As the lag phase was significantly longer in smokers

than in non-smokers, it can be assumed that there must be a substance in

the amniotic fluid in smokers that has antioxidative power, inhibits LDL

oxidation, and intercepts radicals. It can be assumed that the fetoplacental

unit has mechanisms to react to tobacco smoke inhaled by mother.


2. EINLEITUNG

2.1 Rauchverhalten in Deutschland

133 Milliarden Zigaretten gehen pro Jahr in Deutschland in Rauch auf.

Derzeit raucht rund ein Drittel der Deutschen: Von den etwa 16 Millionen

Menschen greifen 25% regelmäßig zur Zigarette, weitere 4% bezeichnen

sich als Gelegenheitsraucher(55)(59)(60). Auffallend ist die

Geschlechterdifferenzierung: Analysen zufolge ist die Anzahl der

gerauchten Zigaretten pro Tag bei Männern höher als bei Frauen. Laut

dem Mikrozensus des statistischen Bundesamtes rauchten im Jahr 2008

35% der Männer und 22% der Frauen. Während die Quote der

nikotinkonsumierenden Männer in den letzten Jahren kontinuierlich sinkt,

liegt die der Frauen seit 1992 stabil über 20%. Waren qualmende Frauen

noch vor 50 Jahren eher selten, holen sie heute immer deutlicher auf, vor

allem unter Jugendlichen, bei denen Mädchen in allen Bildungsschichten

mehr rauchen als Jungen(56)(60)(65). Umfragen zufolge greift unter

Jugendlichen im Alter von 12 bis 17 Jahren fast jeder Fünfte zur Zigarette.

Im Alter von 20-25 Jahren ist der Anteil der Raucher mit 44,6%

bundesweit am höchsten. Studien zufolge konsumieren Raucher mehr

Tabak je älter sie werden: der Anteil der starken Raucher steigt mit

zunehmendem Alter, während die Anzahl der Gelegenheitsraucher

abnimmt(55)(60). Ebenfalls ist ein starkes Nord-Süd Gefälle erkennbar. In

Norddeutschland greifen mehr Menschen zur Zigarette als in den

südlichen Bundesländern. Über der Norm sind die Raucheranteile in den

Stadtstaaten Berlin und Bremen sowie in Mecklenburg-

Vorpommern(57)(65)(126). Überdurchschnittlich hohe Raucherraten

ergaben sich auch für Personen mit niedriger Schulbildung und niedrigem

beruflichem Status. Studienergebnisse belegen, dass die sozialen

Determinanten einen beträchtlichen Anteil der Varianz des

Rauchverhaltens erklären; so war die Rauch-Prävalenz in den sozial am

stärksten benachteiligten Bevölkerungsgruppen in den meisten

Altersgruppen um das vier- bis sechsfache höher als in den sozial

privilegierten Bevölkerungsgruppen(53).


Diese beschriebenen Tendenzen lassen sich auch auf das

Rauchverhalten von Schwangeren übertragen. Einer Studie der

Universität Greifswald zufolge gaben im Jahr 2003 61% der befragten

Frauen an, jemals in ihrem Leben geraucht zu haben. Vor der

Schwangerschaft rauchten 47%, im vierten Schwangerschaftsmonat noch

24%. 21% der werdenden Mütter gaben an, noch in den letzten vier

Wochen vor der Geburt geraucht zu haben(58). Bei einer Umfrage im Jahr

2009 war der Nikotinabusus zu Beginn der Gravidität auf 13% gesunken.

Dieser Effekt könnte auf die vermehrten Antirauchkampagnen und das

dadurch gesteigerte Gesundheitsbewusstsein zurückzuführen sein.

Jedoch gelang es nur einem Viertel der rauchenden Schwangeren bis zur

Entbindung ihres Kindes aufzuhören(56). Vor allem jüngere Frauen mit

niedriger Schulbildung sind nikotinsüchtig, bei den älteren Schwangeren

überwiegt die Tabakabstinenz. Studien belegen, dass bei den 24-Jährigen

nur 45% der Frauen das Rauchen vor der Geburt einstellten, bei den 25-

bis 30-Jährigen 65% und bei den über 30-Jährigen 77%. Frauen mit

weniger als zehn Jahren Schulbildung verzichteten nur zu 30% auf Nikotin

während der Schwangerschaft, diejenigen mit genau zehn Jahren

Schulbildung zu 59% und Schwangere mit mehr als zehn Jahren

Schulbildung zu 84%. Ebenso rauchten Frauen, die bereits Kinder hatten

deutlich seltener (50%vs.42%)(58). Bei einer Analyse des

Rauchverhaltens im Jahr 2005 konsumierten 37% der Schwangeren 11-20

Zigaretten pro Tag. 31% rauchten 1-5 Zigaretten pro Tag, 25% der

werdenden Mütter 6-10 Zigaretten pro Tag und 3% der Schwangeren

sogar über 20 Zigaretten pro Tag(64). Auch wenn Einige während der

Gravidität Nikotinabstinent bleiben, greifen dennoch die Meisten wieder

zur Zigarette sobald sie abgestillt haben.

2.1.1 Auswirkungen auf Gesundheit und Gravidität

„Rauchen gefährdet die Gesundheit" - so steht es auf fast allen

Zigarettenpackungen in Deutschland. Unter den zehn wichtigsten

Risikofaktoren für die Krankheitslast in den westlichen Industrieländern

steht der Tabakkonsum vor Hypertonie, Alkoholkonsum, und

ernährungsabhängigen Risikofaktoren wie Hypercholesterinämie(36).


Rauchen verursacht mindestens 16 verschiedene Krebskrankheiten in

unterschiedlichen Organsystemen. 90% der Fälle von Lungenkrebs

werden heute dem Zigarettenrauchen zugerechnet, ca. 30% der

Todesfälle an Krebs werden durch das Rauchen begünstigt. Krankheiten

der Atemwege wie COPD oder Asthma, kardiovaskuläre Krankheiten wie

KHK, zerebrale Ischämie und pAVK sind Folgen des Nikotinkonsums.

Ebenso gibt es zahlreiche chronische Erkrankungen, die ganz oder

teilweise auf das Rauchen zurückzuführen sind. Dazu gehören Ulcus

ventriculi et duodeni, Katarakt, verminderte Fertilität und erektile

Dysfunktion sowie vorzeitige Hautalterung(75)(91). Bei vielen Krankheiten

ist eine Verschlechterung des Verlaufs durch Tabakkonsum festzustellen.

Weiterhin muss davon ausgegangen werden, dass 30-80% der Raucher

nikotinabhängig sind, sodass Rauchen zu den häufigsten seelischen

Störungen zählt(113). Auch sogenannte Passivraucher sind stark

gesundheitlich gefährdet. Der zu 85% aus Nebenstromrauch bestehende

Passivrauch entsteht bei niedrigeren Verbrennungstemperaturen und

enthält damit mehr toxische und krebserregende Stoffe als der

Hauptstromrauch(72)(75).

Während der letzten Jahrzehnte wurden die Einflüsse des Rauchens

während der Schwangerschaft und dessen Folgen für Neugeborene

erforscht. Antismokler behaupten provokant: Jede Zigarette, die die

werdende Mutter raucht, raucht das ungeborene Kind mit! Durch die

Nabelschnur wird das Kind mit lebenswichtigen Nährstoffen versorgt;

allerdings auch mit Giftstoffen, die im mütterlichen Körper existieren. Der

Rauch einer Zigarette enthält bis zu 4000 verschiedene Substanzen, die

toxisch auf die Gesundheit von Mutter und Kind wirken(62). Tabakkonsum

konnte nachweislich mit SGA- Babys, Frühgeburten und vorzeitigen

Plazentalösungen in Zusammenhang gebracht werden(27). Raucherinnen

haben ein bis zu 10fach erhöhtes Risiko für spontane Fehlgeburten in den

ersten drei Monaten(62)(63). Ebenso wurden niedrigere APGAR-Scores,

eine höhere Inzidenz von Atemnotsyndromen im Säuglingsalter (RDS),

Asthmaerkrankungen im Kindesalter, sowie ein achtfach erhöhtes Risiko

für plötzlichen Kindstod (SIDS) impliziert(68)(86). Motorische, sensorische

und kognitive Defizite bei Kindern rauchender Mütter konnten noch im


späteren Kindesalter nachgewiesen werden(116)(132). Diese

Schwangerschaftskomplikationen und Folgeschäden entstehen aufgrund

von Nikotin, Cotinin und Carbonmonoxid, einige der schädlichsten

Substanzen des Tabakrauchs, die die Planzentaschranke passieren, in

den kindlichen Kreislauf gelangen und in die Muttermilch übergehen(27).

2.2 Oxidativer Stress und seine Folgen

Oxidativer Stress beruht auf dem Missverhältnis zwischen oxidativen und

antioxidativen Faktoren. Zu ersteren gehören freie Radikale; Atome, die

ein oder mehrere ungepaarte Elektronen besitzen und dadurch instabile,

kurzlebige und hochreaktive Moleküle darstellen. Als reaktive

Sauerstoffspezies (ROS) werden auch reaktive Sauerstoffverbindungen

ohne Radikalcharakter, wie Wasserstoffperoxid, Singulettsauerstoff,

Lipidperoxide oder Ozon bezeichnet(123). ROS werden im normalen

aeroben Zellstoffwechsel durch biologische Enzyme und biochemische

Katalysatoren (Transitionsmetalle wie Eisen oder Kupfer) gebildet, die

ohne geeignete physiologische Steuerung toxisch wirken können(78).

Darüber hinaus entstehen freie Radikale auch aufgrund exogener

Ursachen; durch Umweltnoxen wie z.B. Schwermetalle oder Pestizide,

Genussmittel wie z.B. Alkohol oder Tabak sowie inadäquate körperliche

Belastung. Die Metabolisierung diverser Medikamente wie Zytostatika,

orale Kontrazeptiva o.ä. führt ebenfalls zu einer vermehrten

Radikalfreisetzung(123). Der menschliche Organismus ist täglich mit einer

Vielzahl an reaktiven Sauerstoffspezies konfrontiert. Von besonderer

Bedeutung für die Bekämpfung freier Radikale ist die antioxidative

Reserve des Körpers, d.h. unter physiologischen Bedingungen wird eine

übermäßige Bildung von ROS durch Antioxidantien, die die freien

Metallionen binden, abgefangen(78). Man unterscheidet zwischen

enzymatischen und nicht enzymatischen antioxidativen Abwehrsystemen.

Zu den Enzymatischen gehören vor allem die Superoxiddismutase, die

Glutathionperoxidase und die Katalase. Damit diese Enzyme arbeiten

können benötigen sie Spurenelement wie Zink, Selen, Kupfer und Eisen.

Bei den nicht enzymatischen Antioxidantien unterscheidet man zwischen

endogenen z.B. Glutathion und den exogenen Radikalfängern, die über


die Nahrung zugeführt werden müssen (Vitamin C, Vitamin E, Karotinoide,

Polyphenole uvm.)(123). Das Gleichgewicht zwischen antioxidativen und

prooxidativen Faktoren ist für die physiologische Zellfunktion von

entscheidender Bedeutung. Ein Mangel an Antioxidantien führt zu Zell-

und Gewebsschädigung, man spricht von oxidativem Stress(14)(78).

Durch die freie Zirkulation von ROS werden Pathomechanismen in Gang

gesetzt; über die Bildung von biologischen Radikalen kommt es zur

Lipidperoxidation, beispielsweise von ungesättigten Fettsäuren in

Zellmembranen und anderen Lipiden(78). Die schädigende Wirkung ist

ursächlich oder als Trigger-Faktor einer Vielzahl von Krankheiten

anzusehen; es bestehen Zusammenhänge bei der Entstehung von

Malignomen, Arteriosklerose mit Apoplex oder Myokardinfarkt in Folge,

chronischen Entzündungen, Strahlenschäden, Diabetes mellitus,

rheumatoider Arthritis uvm.(47). Durch ein Monitoring antioxidativer

Gesamtkapazität, antioxidativer Schutzsubstanzen, toxischer Reaktions-

produkte sowie Langzeit-Wirkungen oxidativer Aktivität kann das

krankmachende Potential von oxidativem Stress beurteilt werden. In

zahlreichen Studien wird oxidiertes LDL als Marker für oxidativen Stress in

vivo herangezogen(102)(105)(109).

2.2.1 Diagnostische Methoden

Freie Radikal besitzen eine kurze Lebensdauer und sind daher schwer im

Organismus zu bestimmen. Surrogatparameter können die durch

oxidativen Stress geschädigten Biomoleküle, die Konzentration der

Antioxidantien im Plasma oder die totale antioxidative Kapazität sein. Am

häufigsten werden Vitamin E und C, β-Karotin, Selen oder Zink als

Parameter für die Bestimmung der Antioxidantien im Plasma/Serum

herangezogen. Der Verlust an einem individuellen Antioxidans kann als

Index für oxidativen Stress gelten, es kann jedoch auch einfach bedeuten,

dass der Abwehrmechanismus seine normale Funktion erfüllt(123). Die

Messung von Malondialdehyd (MDA) als Abbauprodukt der

Lipidperoxidation stellt eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur

Bestimmung der oxidativen Schädigung von Biomolekülen dar. Bei dieser

Methode wird die biologische Probe mit Thiobarbitursäure inkubiert,


welche ein Addukt mit Malondialdehyd bildet und spektrophotometrisch

bestimmt werden kann(98)(123). Die Bestimmung von Antikörpern gegen

oxidiertes LDL ist eine relativ neue Methode. Diese Antikörper stellen

einen körpereigenen Schutz gegen oxidiertes LDL dar und verhindern

dessen Permeabilität durch die Gefäßwand. Eine Erhöhung der Antikörper

gegen oxidiertes LDL wird als Indikator für oxidativen Stress

gewertet(78)(112)(123). Für die Bestimmung der totalen antioxidativen

Kapazität in Körperflüssigkeiten stehen verschiedene Assays zur

Verfügung. Das Grundprinzip aller Methoden ist gleich: Die in der

biologischen Probe enthaltenen Antioxidantien schützen ein chromogenes

Substrat vor dem durch ein Radikal induzierten oxidativen Angriff. Die

Zeitspanne und das Ausmaß, mit der die Probe diese Oxidation

verhindert, kann bestimmt werden und wird meist mit Trolox

(wasserlösliches Vitamin E) oder Vitamin C als Standard verglichen. Je

länger es dauert, um ein Chromogen zu oxidieren, desto höher ist die

antioxidative Kapazität(123).

In vitro dient häufig die kupferkatalysierte Oxidation von LDL nach

Esterbauer der Bestimmung der antioxidativen Potenz einer Testsubstanz.

Auf dieses Verfahren wird im späteren Teil noch einmal ausführlich

eingegangen.

2.2.2 Tabakrauch - Freie Radikale in der Schwangerschaft

Tabakrauch ist das bei der Verbrennung von Tabak entstehende Aerosol.

Eine genauere Analyse des Tabakrauchs einer Durchschnittszigarette

ergab bis zu 12.000 verschiedene chemische Verbindungen in allen drei

Aggregatzuständen, von denen über 2.000 als Giftstoffe bekannt sind.

Diese Verbindungen lassen sich im Hinblick auf ihre physiologische

Wirkung in vier Schadstoffgruppen unterteilen: reizende Substanzen,

hämatotoxische Substanzen (Hämoglobinblocker), sowie neurotoxische

Substanzen und Kanzerogene. Schon wenige Sekunden nach der

Inhalation flutet Nikotin im Körper an. Etwa alle 2 Stunden wird die Hälfte

der aufgenommenen Nikotinmenge zu Metaboliten abgebaut(38).

Zudem werden pro Zigarettenzug ca. 1014 freie Sauerstoffradikale erzeugt.

Diese freien Radikale wurden als einer der Hauptgründe für oxidativen


Stress bei schwangeren Frauen angesehen(20)(76). Studien zeigen, dass

die Marker für oxidativen Stress auch bei Neonaten und Säuglingen, die

mütterlichem Tabakkonsum in Utero ausgesetzt waren, bis zu drei Monate

erhöht blieben(99).

2.2.3 Antioxidative Schutzmechanismen

Antioxidative Schutzmechanismen, die Proteine, DNA und Lipide vor dem

Angriff freier Radikale bewahren sind komplexe enzymatische und nicht

enzymatische Systeme(39)(49). In mehreren Studien wurde

nachgewiesen, dass Raucher einen höheren Bedarf an Antioxidantien in

Form von Vitamin-C und Vitamin-E zur Aufrechterhaltung der oxidativen

Balance benötigen(30)(31). Während regulär verlaufenden

Schwangerschaften werden größere Mengen an Lipidperoxiden durch

höhere mütterliche Vitamin-E Spiegel im Blut kompensiert(127). Allerdings

wurden bei mütterlichem Rauchen in der Gravidität verringerte

Serumwerte an Vitamin-C und niedrigere Thiol-Konzentrationen

gemessen, eventuell aufgrund gesteigerten Verbrauchs(6). Daten

belegen, dass Selen eine wichtige Rolle im mütterlichen Abwehrsystem

gegen toxische Umwelteinflüsse wie Tabakrauch übernimmt(70). In

regulär verlaufenden Schwangerschaften gelingt es der Plazenta als

Quelle pro-oxidativer Substanzen und Ursprungsort antioxidativer Enzym-

Systeme sowie Bildungsort von Hormonen, die Lipid-Peroxidation zu

regulieren(95). Die geringere Inzidenz der Präeklampsie bei Rauchern

aufgrund der Up-regulation Antioxidativer Systeme wie z.B. der

Superoxiddismutase, Glutathionperoxidase und Katalase führt zu einem

Anstieg der Häm-Oxygenase Aktivität in der plazentaren

Basalplatte(9)(118). Ob LDL von Rauchern anfälliger gegenüber Oxidation

ist als LDL von Nicht-Rauchern wird kontrovers diskutiert. Einige Studien

haben gezeigt, dass Rauchen die Oxidation von LDL-Cholesterol

ansteigen lässt; ebenso wurde eine vermehrte Autoantikörper Bildung im

Plasma gegen oxLDL bei Tabakkonsum nachgewiesen(4)(85).


2.3. Zielsetzung

Antioxidantien sowie oxidativer Stress wurden schon oft in

Zusammenhang mit der Geburtshilfe gebracht. Etliche Effekte des

Rauchens auf die fetalen und maternalen antioxidativen-Serumparameter

sowie auf die Plazenta wurden bereits erforscht. Über die Auswirkungen

des Tabakkonsums auf Fruchtwasser ist bisher jedoch noch wenig

bekannt.

Die Annahme, dass Fruchtwasser antioxidative Eigenschaften aufweist,

soll hier experimentell erforscht werden. Dafür wurde Fruchtwasser

rauchender und nicht-rauchender Mütter hinsichtlich des Einflusses auf die

in vitro Oxidation von LDL untersucht. Ziel der Studie war es festzustellen,

ob es möglich ist, Antioxidantien im Fruchtwasser nachzuweisen. Dabei

bot sich die Methode der kupferkatalysierten Oxidation von LDL nach

Esterbauer an. Hierbei wird der zeitliche Verlauf der LDL-Oxidation

gemessen, sodass eine eventuelle Verzögerung der Oxidation anhand der

Dauer der Lag-Phase erfasst werden kann. Die Lag-Phase wird durch

Zugabe pro- oder antioxidativer Substanzen beeinflusst, d.h. sie ist

äquivalent zur Menge der Antioxidantien der untersuchten Substanz.

Aufgrund dieser Tatsache lässt sich mit dem Oxidations-Verfahren nach

Esterbauer herausfinden, ob ein Unterschied bezüglich des oxidativen-

Status im Fruchtwasser zwischen rauchenden und nicht-rauchenden

Müttern besteht.


3. Material

3.1. Untersuchungsmaterial

Als Untersuchungsmaterial diente Fruchtwasser von freiwillig spendenden

Müttern, die ihr Kind nach komplikationsloser Schwangerschaft in der

Frauenklinik der Universität Erlangen-Nürnberg per Sectio zur Welt

brachten. Insgesamt wurden Proben von 20 rauchenden und 67 nicht-

rauchenden Müttern untersucht, die entsprechend ihrer

Rauchergewohnheiten in zwei Gruppen (Raucher und Nichtraucher)

unterteilt wurden. Als Einschlusskriterium für Raucherinnen galt, dass sie

mindestens 5 Zigaretten pro Tag während der gesamten Schwangerschaft

konsumierten; Nicht-Raucherinnen waren keinem Tabakrauch ausgesetzt.

Für die Kontrollreihe wurde präpariertes LDL aus dem Plasma einer nicht

rauchenden, nicht schwangeren Frau, die sich ohne spezielle Diät oder

Medikamente ausgewogen ernährte, gewonnen. BMI sowie Plasma-

Cholesterin-Spiegel lagen im Normbereich.

3.2. Laborhilfsmittel, Spritzen und Kanülen

Einmalspritze 5 ml Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Einmalspritze 10 ml Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Einmalkanüle (1 x 60 mm) Fa. Erhardt- Söhne GmbH, Gelslingen

Eppendorf-Cups Fa. Eppendorf, Hamburg

3,2 ml Monovette® KE Fa. Sarstedt, Nümbrecht

Monovetten®-Kanüle Nr. 2

(0,8 x 38mm)

Fa. Sarstedt, Nümbrecht

PP-Test tubes 10 ml Fa. Greiner Bio-One GmbH,

Frickenhausen


3.3. Testlösungen und Chemikalien

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Fa. Sigma, Deisenhofen

KBr Fa. Sigma, Deisenhofen

Natriumhydroxid Fa. Sigma, Deisenhofen

NaCl Fa. Sigma, Deisenhofen

O2 Fa. Linde Gas, München

3.4. Lösungsmittel und Puffer

Aqua dest. Zentrallaboratorium der Universitätskliniken

Erlangen

CuSO4-Lösung Endokrinologisches Labor der Frauenklinik Erl-

Nürnberg

PBS-Puffer Endokrinologisches Labor der Frauenklinik Erl-

Nürnberg

Zentrifugationspuffer Endokrinologisches Labor der Frauenklinik Erl-

Nürnberg

3.5. Geräte

Drucker für UV/VIS-

Spektrometer: Epson LQ 200

Fa. Epson, Epson France

Gelbettsäulen, Econo-Pac 10

DG

Fa. BIO RAD GmbH, München

Heat Sink Fa. Beckmann Instruments, München

Kühlschrank: Liebherr Premium Fa. Liebherr, Ochsenhausen

Modell Optima LE-80 K Fa. Beckmann Instruments, München

Multipipetten Fa. Renner, Dannstadt

Quarzküvetten Fa. Sigma, Deisenhofen

Quick-Seal® Tubes Fa. Beckmann Instruments, München

Rotor: Ti 75 Beckmann® Fa. Beckmann Instruments, München

Spektrometer: Perkin-Elmer Fa. Perkin-Elmer, Überlingen


Lambda 2

Tube TopperTM Fa. Beckmann Instruments, München

Ultrazentrifuge: Beckmann® Fa. Beckmann Instruments, München

Wasserbad Fa. Colora, München

Zentrifuge: Hettich Universal

30F

Fa. Hettich, Tuttlingen


4. Methoden

4.1 Theoretischer Teil

4.1.1 Mechanismus der Lipidperoxidation

Im Folgenden werden die molekularen Grundlagen des

Esterbauerverfahrens erläutert. Bei der LDL-Oxidation handelt es sich um

eine unspezifische Peroxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren durch

freie Sauerstoffradikale(24)(83)(131). Freie Radikale greifen an den

Doppelbindungen mehrfach ungesättigter Fettsäuren an und lösen eine

Kettenreaktion aus(54). Insbesondere handelt es sich dabei um die

langkettigen Fettsäuren Linolensäure (18:2) und Arachidonsäure (20:4),

deren Konzentration innerhalb des LDL-Moleküls während der Oxidation

deutlich abnimmt(33). Durch die Abspaltung eines Wasserstoffatoms

entstehen konjugierte Doppelbindungen, die bei 234 nm photometrisch

erfasst werden können(34)(54). Es kommt zur Anlagerung von Sauerstoff

unter Bildung eines Peroxylradikals, das wiederum in der Lage ist, einer

benachbarten Fettsäure ein Wasserstoffatom zu entziehen. Beim Zerfall

der Hydroperoxide entstehen Aldehyde wie z.B. Malondialdehyd (MDA)

und 4-Hydroxynonenal (4-HNE)(48), worauf die entstehenden

thiobarbitursäurereaktiven Substanzen hinweisen(103).

Die in vitro Modifikation von LDL kann auf verschiedene Weise erfolgen. In

vielen Studien erfolgte die Inkubation von LDL mit Makrophagen, glatten

Muskelzellen, Fibroblasten oder Endothelzellen(35)(50)(69)(92)(104).

Teilweise ist hierzu direkter Zellkontakt notwendig. Zellfrei kann die

Oxidation von LDL durch Inkubation mit Metallionen wie Kupfer oder Eisen

erfolgen(54)(81)(82)(87)(93)(110)(117)(120). Zwei Faktoren scheinen bei

der Oxidation in zellulären Medien von Bedeutung zu sein. Zum einen

führte eine Hemmung der zellulären Lipoxygenase zur Inhibition der

zellvermittelten LDL-Oxidation, nicht aber der kupfervermittelten(54). Die

Superoxiddismutase, ein Peroxidradikale abfangendes Enzym, unterband

dagegen die LDL-Oxidation in beiden Medien, wenn auch in deutlich

stärkerem Ausmaß im kupferkatalysierten Ansatz(104). Dies erklärt sich


durch die Möglichkeit der Regeneration von Superoxidanionen durch

zelluläre Oxidasen (NADPH-Oxidase) oder Lipoxygenasen in Anwesenheit

geeigneter Kosubstrate (NADH). Für die kupfervermittelte Oxidation

scheint die Anwesenheit von Superoxiden unwesentlich zu sein,

wohingegen diese im Versuch mit anderen Metallionen wie Eisen

unverzichtbar sind(54)(87). Metallionen hingegen sind auch bei den

zellulären Oxidationssystemen zur oxidativen Modifikation von LDL

notwendig(54)(77).

Bild 1: Lipidperoxidationsreaktion

4.1.2 Esterbauer-Verfahren: oxidative Modifikation von LDL in vitro

Bei der Cu2+ katalysierten LDL-Oxidation nach Esterbauer entstehen

Lipidhydroperoxide die die gleiche Löslichkeit besitzen wie LDL und ein

Absorptionsmaximum bei 234 nm aufweisen, wodurch sie im wässrigen

Milieu photometrisch erfasst werden können(34). Die entstehenden

Lipidhydroperoxide haben die Strukturformel: -CH=CH-CH=CH-COOH-.

Beim Esterbauer-Verfahren unterscheidet man üblicherweise drei Phasen:


- Lag-Phase: Während der Lag-Phase findet noch keine chemische

Reaktion statt, d.h. die Dien-Bildung stagniert auf relativ konstantem

Niveau. Die ungesättigten Fettsäuren sind noch durch natürliche

Antioxidantien geschützt. Zugabe weiterer Antioxidantien in dieser

Phase verzögert die Lipidperoxidation, die Lag-Phase kann damit

verlängert werden.

- Propagations-Phase: In dieser zweiten Phase ist der Schutz durch

Antioxidantien aufgebraucht, sodass der Angriff durch freie Radikale

erfolgt. Der schnelle Anstieg der Absorption spiegelt die

Kettenreaktion der Lipidperoxidation wieder. Die ungesättigten

Fettsäuren werden schnell in konjugierte Lipidhydroperoxide

umgewandelt.

- Dekompositions-Phase: Die letzte Phase ist durch den Rückgang

der Absorption gekennzeichnet, da die instabilen Produkte wieder

zerfallen. Die Lipidperoxidationsprodukte können jedoch zu

weiteren komplexen Verbindungen reagieren, die ebenfalls eine

Absorption bei 234 nm aufweisen. Ein erneutes leichtes Ansteigen

der Absorption ist daher möglich(24)(28)(34)(54).

Entscheidend ist somit die Dauer der Lag-Phase, da diese äquivalent zur

Menge der Antioxidantien der untersuchten Substanz ist.

min

Extinktion 234nm

lag propagation dekomposition

Max. Extinktions-differenz

Maximale Extinktion

Bild 2: Graphische Darstellung der drei Phasen der LDL-Oxidation. Es entstehen konjugierte Doppelbindungen, die durch kontinuierliche Messung der Absorption bei 234 nm photometrisch erfasste werden. Abszisse: Zeit t in min Ordinate: Extinktion λ bei 234 nm


Die Länge der Lag-Phase ergibt sich durch den Schnittpunkt zwischen der

Tangente des Graphen in der Propagations-Phase und einer Parallelen

zur x-Achse in Höhe des Ausgangswertes der Kurve. Die Dauer der Lag-

Phase wird durch Zugabe pro- oder antioxidativer Substanzen

beeinflusst(54).

4.2 Experimenteller Teil

4.2.1 Plasmagewinnung

Für die Plasmagewinnung wurden einer gesunden, nicht rauchenden,

nicht schwangeren Frau zehn 3,2ml fassende Monovettenröhrchen

(Zusatz: 1,6ml EDTA/ml Blut) venöses Blut entnommen. Voraussetzungen

waren eine letzte Nahrungsaufnahme mindestens 12 Stunden vor

Entnahme sowie Ausschluss von Infektionszeichen. Das Plasma wurde

anschließend durch Zentrifugation bei 3000 U/min für 10 Minuten

separiert, abpipettiert und bis zur weiteren Verarbeitung am selben Tag

bei 4°C gekühlt gelagert.

4.2.2 Isolierung des LDL

Die LDL-Separation mittels Gradienten-Ultrazentrifugation erfolgte im

Anschluss an die Plasmagewinnung. Zuerst wurde die Dichte des

Plasmas durch Zugabe von 0,2g KBr/ml Plasma auf 1,21g/ml

eingestellt(1). Anschließend wurden 2ml des mit KBr versetzten Plasmas

auf den Boden von 12ml Quick-Seal® Tubes geschichtet, die mit 9ml

NaCl-Lösung mit einer Dichte von 1,006g/ml und 0,01% EDTA (PBS-

Puffer) gefüllt waren. Die Quick-Seal® Tubes wurden mit PBS-Puffer

luftfrei aufgefüllt und mittels Tube TopperTM und mit Hilfe von Seal Guide,

Seal Former und Heat Sink luftdicht verschlossen(15)(28). Im Folgenden

wurden die Röhrchen bei 65000 U/min über einen Zeitraum von 6 Stunden

bei 4°C in einem Ti 75 Rotor und einer Beckman Ultrazentrifuge Modell

Optima Typ LE-80 K zentrifugiert. Nach Abschluss der Zentrifugation war

das LDL im Röhrchen als gelbe Bande deutlich abgrenzbar. Der

Unterdruck im Röhrchen wurde durch Anstechen im oberen Bereich

beseitigt und die LDL-Bande mit Hilfe von Spritze und Kanüle durch die


Röhrchenwand abgezogen. Gekühlt bei 4°C konnte das isolierte LDL

gelagert werden.

4.2.3 Reinigung des LDL

Vor Ansatz der Oxidation musste das gewonnene LDL von dem in den

Monovettenröhrchen als Oxidationsschutz enthaltenen EDTA und von den

für die Zentrifugation nötigen Salzen (KBr) gereinigt werden. Dies gelang

mit Hilfe der Gelfiltration. Vor Beginn jeder Filtration sowie danach wurden

die Gelbettsäulen zwei Mal mit PBS-Puffer gespült, wodurch sie mehrmals

benutzt werden konnten. Zur Reinigung des isolierten LDL wurden

maximal 1,6ml LDL auf die Säule pipettiert. Sobald das LDL zwischen den

Gelpartikeln aufgenommen war wurden die Säulen mit PBS-Puffer

aufgefüllt. Die durch ihre gelbe Farbe deutlich abgrenzbaren LDL-Tropfen

wurden mit einer Glasküvette abgefangen und bis zur Konzentrations-

bestimmung in luftdicht verschlossenen Glasröhrchen und somit vor

Oxidation geschützt aufbewahrt(21)(28).

4.2.4 Ermittlung der LDL-Konzentration im Eluat

Vor jedem Oxidationsansatz wurde die LDL Cholesterin Konzentration des

isolierten LDLs im Zentrallaboratorium des Universitätsklinikums Erlangen

bestimmt. Durch Zentrifugation und Gelfiltration entstandene

Schwankungen der LDL Cholesterin Konzentration im isolierten LDL

ließen sich durch Zugabe an Eluat ausgleichen. Durch die Berechnung

des Volumens der jeweiligen Eluat-Zugabe konnte gewährleistet werden,

dass bei jedem Oxidationsansatz die gleiche Menge LDL eingesetzt

wurde.

Berechnung des LDL-Cholesteringehalts des Eluats:

c(Probe) = c(Standard) E(Probe) E(Standard)

c = Konzentration; E = Extinktion

Berechnung der einzusetztenden Menge des Eluats (V):

c(Probe) x X ml = 80 mg/dl x 0,1 ml

Die einzusetzende Zielmenge an LDL-Cholesterin waren 0,08mg, das

entsprach bei 1ml Reaktionsvolumen einer Endkonzentration von

0,08mg/ml.


4.2.5 Verzögerung der LDL-Oxidation in vitro

Bei der Cu2+ katalysierten LDL-Oxidation entstehen Diene, die ein

definiertes Absorptionsmaximum bei 234 nm aufweisen, sodass sie

photometrisch erfasst und gemessen werden können(33)(34).

Das Reaktionsvolumen von 1ml pro Küvette setzt sich folgendermaßen

zusammen:

O2 gesättigter PBS-Puffer 978 µl – x µl Eluat

Eluat x µl

CuSO4- Lösung (0,68 mmol/L) 17 µl

Fruchtwasser 5 µl

Das Oxidationsmilieu wurde in festgelegter Reihenfolge in 8 Eppendorf-

Cups angemischt. Zu dem O2 gesättigten PBS-Puffer mit einem pH-Wert

von 7,4 wurde zunächst die errechnete Menge Eluat zugegeben. Es folgte

die Zugabe von 5µl Fruchtwasser in einer Verdünnung 1:10. Abschließend

leitete die katalytisch wirkende CuSO4- Lösung die Oxidation ein. Vor dem

luftfreien Pipettieren in die Quarzküvetten wurden die Ansätze mittels

eines Rotors gründlich gemischt. Von den gleichzeitig maximal 8

Reaktionsansätzen dienten jeweils zwei als Kontrolle, enthielten also kein

Fruchtwasser. In den übrigen sechs Küvetten befanden sich jeweils in

zweifacher Ausführung Zusätze der zu testenden Fruchtwasserproben.

Pro Oxidationsansatz konnte also maximal Fruchtwasser von 3

Patientinnen getestet werden.

In einem Zeitraum von 6-8 Stunden bei einer Temperatur von 37°C

erfolgte in fünfminütigen Abständen die photometrische Messung der

Absorption bei 234 nm, bis kein weiterer Anstieg der konjugierten Diene

mehr messbar war(28).

4.2.6 Herstellung der Pufferlösungen

Puffer zur Zentrifugation:

Der zur Zentrifugation benötigte Puffer wurde durch Zugabe von 6g NaCl

und 1g EDTA zu 1l H2O (dest.) im Endokrinologischen Labor der

Frauenklinik hergestellt. Bei einem erwünschten pH von 7,4 sind alle

Teilchen in Lösung, sodass eine klare Flüssigkeit vorliegt.


PBS-Puffer zur Oxidation:

Der zur Oxidation benötigte Puffer wurde durch Zugabe von 0,7g

NaH2PO4, 0,7g Na2HPO4 sowie 8,7g NaCl zu 1l H2O (dest.) erstellt. Die bei

einem pH von 7,4 klare Flüssigkeit wurde zur vollständigen Lösung in ein

Wasserbad von 37°C gestellt.

Kupfersulfatlösung zur Oxidation

Die bei der Oxidation als Katalysator benötigte Kupfersulfatlösung Nr.2

wurde durch Verdünnung der Kupfersulfatlösung Nr. 1 hergestellt.

Lösung 1: 68mM 1,71 g CuSO4/100 ml Aqua dest.

Lösung 2: 0,68mM 1,1 ml Lösung1/99 ml H2O

4.2.7 Fruchtwassergewinnung

Die Fruchtwasserproben von 20 rauchenden und 67 nicht-rauchenden

Müttern wurden während Sectio-Eingriffen gewonnen. Die Mindestmenge

von 5ml Fruchtwasser wurde in einem PP-Zentrifugen-Röhrchen

aufgefangen und anschließend bei 2000 U/min für 6 min zentrifugiert. Bis

zur weiteren Verwendung wurden die Proben bei -80°C gefroren

aufbewahrt.

4.3 Statistik

Die zu den Fruchtwasserproben erhobenen Daten wurden mittels SPSS

(Statistical Package for the Social Sciences, Version 18 für Windows;

SPSS, Inc., Chicago, Illinois, USA) analysiert. Nach der Testung auf

Normalverteilung mittels des Kolmogorov-Smirnov Tests wurden die

metrischen Variablen in Abhängigkeit der Normalverteilung entweder

anhand des Pearson- oder Spearman- Tests korreliert, die Nominalen

mittels des Chi2-Tests. Korrelationen zwischen metrischen und nominalen

Variablen wurden mit dem Eta-Test berechnet. Durch eine Regressions-

Analyse wurden signifikante Einflüsse des Rauchens auf die Variablen

ermittelt.

Anhand der photometrisch gemessenen Werte erfolgte die graphische

Umsetzung und Auswertung mittels Excel (Microsoft). Die Dauer der Lag-


Phase wurde wie zuvor beschrieben nach Esterbauer bestimmt. Die

Prolongationsfaktoren wurden ermittelt und Mittelwert sowie Standard-

abweichung für die jeweilige Gruppe (Kontrolle, Raucher, Nicht-Raucher)

errechnet. Mit Hilfe des Student t-Tests wurde die Signifikanz der

Ergebnisse beurteilt, die sich durch den so genannten p-Level definiert.

Bei einem p-Level < 0,05 gelten die Ergebnisse als signifikant (s+), bei

einem p-Level <0,01 als hochsignifikant (s++). Bei Werten > 0,05 spricht

man von einem nicht signifikanten Ergebnis (s-).


5. ERGEBNISSE

5.1 Stichprobenbeschreibung

5.1.1 Klassifizierung metrischer und nominaler Variablen

Insgesamt erklärten sich 87 Gebärende an der Frauenklinik der Universität

Erlangen-Nürnberg im Studienzeitraum bereit, Fruchtwasser zu spenden.

Die Probandinnen wurden aufgrund ihres Nikotinkonsums zwei Gruppen

zugewiesen. In der Nicht-Raucher Gruppe befanden sich 67 Frauen, die

während der gesamten Schwangerschaft keinem Zigarettenrauch

ausgesetzt waren. Als Einschlusskriterium für die Raucher galt, dass sie

mindestens 5 Zigaretten pro Tag während der gesamten Gravidität

konsumierten, worunter die restlichen 20 Frauen fielen. Zur Validierung

wurden die Angaben zum Nikotinkonsum aller Probandinnen mit den

entsprechenden Anästhesie-Protokollen der Sectio-OPs abgestimmt.

Durch Vergabe von Probandennummern konnte Anonymität gewährleistet

werden.

Zu jedem Mutter-Kind Paar wurden folgende Daten erhoben: Das Alter der

Mutter, Gravida/Para, Schwangerschaftsdauer, Gewicht und Länge des

Kindes sowie pH und BE (Base excess) bei Geburt. Zu den nominalen

bzw. dichotomen Daten zählten das Rauchverhalten, die Wehentätigkeit,

Primäre/Sekundäre Sectio, Fruchtwasserfarbe und Geschlecht des

Kindes. Ergänzend wurden APGAR-Werte, Verlegung des Neugeborenen,

mütterliche Infektionen sowie Sectioindikationen erfragt. Mittelwerte und

Häufigkeiten der gesammelten Daten wurden zum Vergleich beider

Gruppen berechnet.

Die Ergebnisse zeigten, dass Kinder rauchender Mütter kleiner und

leichter waren als die der Nicht-Rauchenden. Frauen, die während der

Schwangerschaft rauchten, bekamen ihre Kinder in jüngerem Alter und

hatten eine höhere Parität. Mit einer mittleren Schwangerschaftsdauer von

268 Tagen war kein zeitlicher Unterschied zwischen beiden Gruppen

erkennbar. Bei den pH- und BE- Werten die unmittelbar nach Geburt im

Nabelschnurblut gemessen wurden ließ sich keine Differenz eruieren.

Aufgrund der größeren Anzahl an Nicht-Rauchern mussten die


Häufigkeitsangaben zur Gegenüberstellung in Prozent umgerechnet

werden. Raucherinnen gebaren vermehrt männliche Neugeborene, Nicht-

Raucherinnen Weibliche. Die Mehrheit beider Gruppen hatte klares

Fruchtwasser sowie eine primäre Sectio ohne vorausgehende

Wehentätigkeit. Die Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle

zusammengefasst.

Raucher Nicht-Raucher

Alter der Mutter (Jahre) 28,81 ± 6,9 33,24 ± 4,8 Gravida/Para 2,19 ± 1,0 1,85 ± 0,8 Schwangerschaftsdauer (Tage)

268,62 ± 12,7 268,66 ± 15,0

Gewicht des Kindes (g) 3024,05 ± 533,7 3265,29 ± 625,7 Größe des Kindes (cm) 49,02 ± 3,3 50,43 ± 3,1 pH Kind 7,31 ± 0,0 7,33 ± 0,0 BE Kind –2,25 ± 2,4 –2,01 ± 2,7 Wehentätigkeit (%)

Ja 41 22,5 Nein 59 77,5

Sectio (%) Primär 57,2 67,9 Sekundär 42,8 32,1

Fruchtwasser (%) Klar 95,3 92,2 Nicht klar 4,7 7,8

Geschlecht (%) Männlich 66,2 48,4 Weiblich 33,8 51,6

Tabelle 1: Mittelwerte und Häufigkeiten (%) der gesammelten Daten bei Rauchern und Nicht-Rauchern

5.1.2 Korrelation und Regressionsanalyse

Bei der Korrelation der metrischen Variablen nach Pearson zeigte sich ein

Zusammenhang zwischen dem Alter der Mutter und der Parität, zwischen

dem Gewicht des Neugeborenen und dessen Körperlange, sowie den

Körpermaßen des Kindes und der Graviditätsdauer (p = 0,01). Die Statistik

ergab außerdem einen Zusammenhang zwischen der Köperlänge des

Kindes und dem Alter der Mutter (p = 0,05).


Durch den Chi2-Test mit Kreuztabellen für die dichotomen Variablen,

Fruchtwasserfarbe, Geschlecht, prim./sek. Sectio und Wehentätigkeit,

sowie durch den Eta-Test für Zusammenhänge zwischen metrischen und

kategorialen Variablen konnten keine signifikanten Zusammenhänge

nachgewiesen werden.

Die Regressionsanalyse diente zur Ermittlung der Korrelation des

Rauchens als abhängige Variable mit den übrigen Variablen: Alter der

Mutter, Gravida/Para, Schwangerschaftsdauer, Gewicht, Größe, pH und

BE des Kindes sowie Wehentätigkeit, prim./sek. Sectio, Fruchtwasserfarbe

und Geschlecht. Die Analyse zeigte eine starke Korrelation des

Tabakkonsums mit dem mütterlichen Alter (p = 0,01), wobei Raucherinnen

früher Kinder gebaren. Ein signifikanter Zusammenhang zwischen

Rauchen und der Kinderanzahl (p = 0,040) konnte ebenfalls

nachgewiesen werden. Des Weiteren war eine Korrelation des

Tabakkonsums mit dem Geschlecht des Kindes (p = 0,026) erkennbar.

Die untenstehende Tabelle zeigt den Einfluss des Nikotins auf die

Variablen; Werte p ≤ 0,05 gelten hierbei als signifikant.

Variable Signifikanz

Alter der Mutter 0,001 Gravida/Para 0,040 Schwangerschaftsdauer 0,061 Gewicht des Kindes 0,120 Größe des Kindes 0,473 pH Kind 0,260 BE Kind 0,527 Wehentätigkeit 0,686 Sectio 0,904 Fruchtwasser 0,362 Geschlecht 0,026

Tabelle 2: Signifikanzwerte der Regressionsanalyse

5.1.3 Indikationen für Sectiones

Alle werdenden Mütter die sich bereit erklärten Fruchtwasser zu spenden,

brachten ihr Kind per Sectio zur Welt.


Als die drei häufigsten Indikationen sind Re-Sectiones sowie kindliche und

mütterliche Risikofaktoren zu nennen. Mit ca. 24% war der Z. n. Sectio die

häufigste Indikation, aufgrund kindlicher Risikofaktoren, wie z.B.

Lageanomalien wurden ca. 23% der Kinder auf die Welt geholt. 16%

kamen wegen mütterlichen Risikofaktoren wie z.B. Gestationsdiabetes per

elektiver Sectio zur Welt. Die untenstehende Grafik und folgende Tabelle

veranschaulichen die prozentualen Häufigkeiten.

Bild 3: Kreisdiagramm mit prozentualen Häufigkeiten zur Indikation der Sectiones

Geburtsstillstand Austreibungsphase (5), Eröffnungsphase (2), Wehenschwäche (1), frustrane Einleitung (1),

Kindliche Risikofaktoren Lageanomolie (23)*, Makrosomie (9), V.a. Fehlbildung (9)**, CTG pathologisch (1), fetale Thrombozytopenie (1),

Mütterliche Risikofaktoren Gestationsdiabetes insulinpflichtig (7), Mütterliche Infektion (5)***, Skelettanomalie (5)****, HELLP (2), mütterliche Epilepsie (2), Zervixmyom (1), Z.n. DR III° (1), Z.n. Forceps (1), PAPIVb (1), Mutter Faktor V Leiden (1), SS-Cholestase (1), SS-Hypertonus (1), vaginale Blutung (1),

Placenta-Problematik Placenta praevia (3), vorz. Placentalösung (3), Oligohydramnion (2), Placenta Insuffizienz (1),

Uterus-Problematik Uterus myomatosus (4), Uterusnarbe (1), Uterus duplex (1),


*Lageanomalie: Beckenendlage (20), Querlage (2), Stirnlage (1), **V.a. Fehlbildung: relative Missverhältnisse (1), fetale Meningomyelocele (1), fetaler

Herzfehler (1), zystische Raumforderung (1), VATER-Assoziation (1), Vitium cordis (1), Gastroschisis (1), fetale Retardierung (1), ZNS- Fehlbildung (1),

***Mütterliche Infektion: positiver Antikörper-Suchtest (2), Parvovirus B 19 (1), ß-Streptokokken (1), Toxoplasmose (1);

****Skelettanomalie: Skoliose (2), M. Bechterew (1), Arthritis (1), Hüftdysplasie- Symphysenlockerung (1),

Tabelle 3: Tabellarische Zusammenfassung der einzelnen Kategorien

5.2 Analyse des experimentellen Teils

5.2.1 Graphische Ermittlung und Berechnung der Lag-Phasen

Alle Oxidationsansätze wurden in doppelter Ausführung angefertigt, der

Gehalt an Antioxidantien im Fruchtwasser jeder Probandin somit zweifach

bestimmt.

Die vom Photometer gemessenen Werte des Absorptionsanstiegs wurden

tabellarisch zusammengefasst und mit Hilfe von Excel in Diagramme

konvertiert. Die Dauer der Lag-Phase wurde wie zuvor geschildert nach

Esterbauer berechnet.

Im folgenden Diagramm sind die Oxidationskurven zweier Nicht-

Raucherinnen, einer Raucherin sowie der Kontrolle exemplarisch für die

gesamte Probandengruppe dargestellt. Anhand der Schnittpunkte der

Tangenten der Graphen mit der Parallele zur Abszisse durch den

Ausgangswert (=0,5) sind die Zeiträume der Lag-Phasen ablesbar. Eine

Parallel-Verschiebung der Tangenten der einzelnen Probandinnen ist

deutlich erkennbar, woraus sich eine differenzierte Dauer der Lag Phasen

ableiten lässt. Bei allen durchgeführten Ansätzen oxidierte die Kontrolle

zuerst, in diesem Fall nach 66min. Die antioxidativ wirkenden Stoffe im

Fruchtwasser der beiden Nicht-Raucherinnen waren nach 80min bzw.

nach 86min aufgebraucht. Der Absorptionsanstieg der Fruchtwasser-

Probe der Raucherin war erst nach 102min zu verzeichnen. Die Dauer der

Lag-Phase ist entscheiden, da diese äquivalent zur Menge der

Antioxidantien in der untersuchten Substanz ist.


In der folgenden Graphik ist der Verlauf der Absorption durch die bei der

LDL-Oxidation entstehenden Diene dargestellt.

Bild 4: Exemplarische Darstellung der LDL-Oxidation: eine Verlängerung der Lag- Phase bei Rauchern im Vergleich zu Nicht-Rauchern ist erkennbar

Da die Gebärenden aufgrund ihres Nikotinkonsums zwei Gruppen

zugewiesen wurden, konnten die erhobenen Daten sowohl untereinander

als auch mit der Kontrolle verglichen werden.

In Bezug auf die Dauer der Lag-Phase wurden bei der Stichprobengröße

n(Kontrolle) = 31, n(Nicht-Raucher) = 67 und n(Raucher) = 20 folgende

Werte für die drei Gruppen mittels Excel berechnet: Summe, Mittelwert,

Varianz und Standardabweichung. (Angabe aller Daten in Minuten (min)).

Die Dauer der Lag-Phase war in der Gruppe der Raucherinnen im Mittel

mit 82min am höchsten, der Mittelwert der Nicht-Raucherinnen lag bei

65min. Im Gegensatz dazu dauerte es bis zum Anstieg der Absorption in

der Kontrollprobe im Mittel nur 55min. Die Varianz als Streuungsmaß

sowie die Standardabweichung waren bei der Kontrolle am kleinsten, die

höchsten Werte wiesen die Raucher auf. Die schlechten Werte beider

Datenreihen lassen sich durch einzelne Ausreißer begründen.

Die Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle zusammengefasst.

Abs. 234nm

0

0,5

1

1,5

2

5 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375

Ab

s 2

34

nm

min

Kontrolle

Nicht-Raucher

Nicht-Raucher

Raucher


Kontrolle Nicht-Raucher Raucher

Summe 1702,15 4359,65 1632,20 Mittelwert 54,90 65,07 81,61 Varianz 140,20 229,47 562,95 Standardabweichung 11,84 15,14 23,73 Tabelle 4: Analyse der Lag-Phase; n(Kontrolle) = 31, n(Nicht-Raucher) = 67, n(Raucher) = 20 alle Angaben in min

5.2.2 Dauer der Lag-Phasen im Vergleich

Die Mittelwerte der Dauer der Lag-Phase beider Gruppen sowie der nicht

schwangeren nicht rauchenden Kontrollperson wurden analysiert. Das

arithmetische Mittel der Kontrollgruppe lag bei 55 ± 12 min, entsprechend

dem schnellsten Absorptionsanstieg und der kürzesten Lag-Phase. In der

Gruppe der Nicht-Raucherinnen (n = 67) betrug die Dauer der Lag-Phase

im Mittel 65 ± 15 min, was einer Zunahme um 18% im Vergleich zur

Kontrollgruppe entspricht. Die gemittelte Dauer der Lag-Phase der

Raucherinnen (n = 20) lag bei 82 ± 24 min. Somit betrug die Zunahme der

Lag-Phase gemessen im Fruchtwasser der rauchenden Mütter im

Vergleich zur Kontrolle 49%, zu den Nicht-Raucherinnen 25%. Die

Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle zusammengefasst.


Dauer der Lag-Phase 54,90 65,07 81,61 Zunahme der Lag-Phase 1 1,18 1,49 Tabelle 5: Zunahme der Lag-Phase

Eine Korrelation zwischen Anzahl gerauchter Zigaretten pro Tag und

Verlängerung der Lag-Phase konnte aufgrund der geringen

Studienteilnehmer in der Gruppe der Raucherinnen nicht nachgewiesen

werden.

Die Zunahme der Lag-Phase der Raucher ist in der folgenden Graphik

dargestellt.


54,9

65,06

81,61

0

20

40

60

80

100

120


min

Bild 5: Mittelwerte der Lag-Phase in Minuten (min)

5.2.3 Signifikanztest

Vor der Durchführung des Signifikanztests wurde die Dauer der Lag-

Phase in allen drei Gruppen mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov Tests auf

Normalverteilung geprüft. Bei einem Signifikanzniveau von p = 0,829 der

Kontrolle, p = 0,875 der Nicht-Raucher sowie p = 0,499 der Raucher

konnten die Nullhypothesen beibehalten werden, da bei p ≥ 0,05 die Werte

der getesteten Variablen als hinreichend normalverteilt gelten.

Bild 6: Kolmogorov-Smirnov Test der Kontrollreihe; Ordinate = Häufigkeiten, Abszisse = Dauer der Lag-Phase in Minuten; p = 0,829


Bild 7: Kolmogorov-Smirnov Test der Gruppe der Nicht-Raucher; Ordinate = Häufigkeiten, Abszisse = Dauer der Lag-Phase in Minuten; p = 0,875

Bild 8: Kolmogorov-Smirnov Test der Gruppe der Raucher; Ordinate = Häufigkeiten, Abszisse = Dauer der Lag-Phase in Minuten; p = 0,499

Aufgrund der Normalverteilung in allen drei Gruppen war die

Voraussetzung zur Anwendung des Student t-Test zur Prüfung auf

Signifikanz erfüllt. Mit Hilfe von Excel wurde ein zweiseitiger t-Test zweier

Stichproben ungleicher Varianz durchgeführt.

Jede der drei Kombinationen war signifikant. Am aussagekräftigsten ist

der Vergleich der Dauer der Lag-Phase der Nicht-Raucherinnen mit den

Raucherinnen. Errechnet wurde ein p-Level von 0,007 das statistisch als

hoch signifikant zu werten ist (p ≤ 0,01). Somit wurden im Fruchtwasser

der Frauen, die während der Schwangerschaft rauchten, signifikant mehr


Antioxidantien nachgewiesen als im Fruchtwasser Nikotin-abstinenter

Mütter.

Die Ergebnisse des Student t-Test sind in der untenstehenden Tabelle

aufgeführt.

Student t-Test p-Level Signifikanz

Kontrolle vs. Nicht-Raucher 0,000566582 s++ Kontrolle vs. Raucher 0,000085856 s++ Nicht-Raucher vs. Raucher 0,007128637 s++

Tabelle 6: Student t-Test

5.3. Zusammenfassung der Ergebnisse

Die Messungen zeigten einen signifikanten Unterschied in der Dauer der

Lag-Phase zwischen Rauchenden und Nicht-Rauchenden Müttern (81,61

min ± 23,72 min, n=20 vs. 65,06 min ± 15,14 min, n=67). Eine Zunahme

der Dauer der Lag-Phase um 25% zwischen Tabakkonsumierenden und

nikotinfrei lebenden Schwangeren wurde nachgewiesen. Der im Student t-

Test errechnete p-Level von 0,007 ist statistisch als hoch signifikant zu

werten (p ≤ 0,01).


6. Diskussion

Komplikationen während der Gravidität sind nicht selten auf Tabakkonsum

zurückzuführen, da Nikotin, Cotinin und Karbonmonoxid -als schädlichste

Substanzen des Tabakrauches- die Plazentaschranke ungehindert

passieren und in die Muttermilch gelangen können(101). Zusätzlich

werden die durch den Zigarettenrauch generierten freien Radikale als

einer der Hauptgründe für Oxidativen Stress bei schwangeren Frauen und

Kindern in Utero gesehen(99). Oxidativer Stress ist der Zustand, bei dem

die im menschlichen Körper anfallenden freien Radikale nicht mehr

ausreichend durch Antioxidantien abgefangen werden können, er ist als

Dysbalance oxidativer Last und antioxidativer Kapazität definiert.

6.1 Interpretationen der Studien-Ergebnisse

Die Folgen mütterlichen Rauchens während der Schwangerschaft auf den

Fötus sowie das Neugeborene wurden in den letzten Jahren umfangreich

erforscht.

Die Ergebnisse unserer Analyse der Mutter-Kind-Paare stimmten mit

bereits veröffentlichten Datenreihen überein. Bei der Korrelation der

Variablen zeigte sich wie erwartet ein Zusammenhang zwischen dem Alter

der Mutter und der Parität, zwischen dem Gewicht des Neugeborenen und

dessen Körperlänge, sowie den Körpermaßen des Kindes und der

Graviditätsdauer (p = 0,01). Wie mehrfach belegt führt Tabakkonsum

während der Schwangerschaft zu intrauterinen Wachstumsretardierungen

(IUGR) und Neugeborenen, die klein bezogen auf das Reifealter (SGA)

zur Welt kommen(89)(106)(121)(125). Auch in unserer Studie waren

Kinder rauchender Mütter kleiner und leichter als die Nicht-Rauchender.

Die statistische Auswertung ergab eine starke Korrelation des

Tabakkonsums mit dem mütterlichen Alter (p = 0,01), sowie einen

signifikanten Zusammenhang zwischen Rauchen und Kinderzahl (p =

0,040). Frauen, die während der Schwangerschaft rauchten, bekamen ihre

Kinder in jüngerem Alter und hatten eine höhere Parität. Unsere

Vermutung, dass dies auf den sozialen Status zurückzuführen ist, konnten

wir durch den Vergleich mit Studien zur Analyse des Rauchverhaltens


bestätigen. Bereits im Jahre 1980 wurde erstmals ein direkter

Zusammenhang zwischen niedrigem sozialen Status und Nikotinabusus in

Deutschland empirisch belegt. In den folgenden Jahren bestätigten

bundesweite Datenerhebungen des Robert Koch Institutes eine

Konnexion zwischen sozialem Status und Vitalität sowie

gesundheitsbewusstem Verhalten: Bei den jungen Erwachsenen und

denen mittleren Alters rauchten in den Jahren 2002-2003 mehr als die

Hälfte der Männer und Frauen mit niedrigem Prestige, verglichen mit ca.

einem Drittel derer, die in der Gesellschaft hoch anerkannt waren (n =

8318; Odds Ratiomen (OR) = 1,89; ORwomen = 1,63). Frauen jüngeren

Alters, mit niedrigerem sozialen Status und einer größeren Kinderanzahl

konsumierten unabhängig vom Rauchverhalten des Partners häufiger

Zigaretten(80)(114)(115).

Dass Rauchen die weibliche und männliche Fertilität beeinträchtigt, ist

hinreichend belegt. Eine im Jahr 2008 publizierte Studie impliziert im

Zusammenhang von Nikotin und Kinderwunsch, dass die Menge des

Nikotinkonsums während der Gravidität das Geschlecht des Kindes

beeinflusst. In den Jahren 1993-2002 wurden 2108 Einlingsschwanger-

schaften untersucht (nRaucher = 665, nNichtraucher = 1443). Betrachtete man

alle Schwangerschaften, so kamen auf 100 Mädchen 109 Jungen (Ratio:

1,09). Diese Ratio betrug bei Raucherinnen 1,26 und Nichtraucherinnen

1,03. Bei Nikotinkonsum der Mutter kamen somit 126 Jungen auf 100

Mädchen, was einen signifikanten Unterschied zu den Nichtraucherinnen

darstellt(16). Die Analyse unsere Kohorte ergab trotz der geringen

Teilnehmerzahl ebenfalls, dass Raucherinnen vermehrt männliche

Neugeborene zur Welt bringen; Nicht-Raucherinnen Weibliche. Eine

Korrelation des Tabakkonsums mit dem Geschlecht des Kindes war

erkennbar (p = 0,026).

Die Hypothese, dass es möglich ist, Antioxidantien mit Hilfe des

Esterbauer-Verfahrens im Fruchtwasser nachzuweisen wurde bewiesen.

In vivo verwendete Methoden zur Bestimmung des oxidativen Stresses

sind die Messung der Konzentration verschiedener Antioxidantien im

Plasma/Serum, sowie die Ermittlung der totalen antioxidativen Kapazität

mit Hilfe verschiedener Assays. In vitro wurde bisher häufig das


Esterbauer-Verfahren zur Bestimmung antioxidativer Kapazitäten im

Plasma verwendet. In unserer Studie konnten wir erstmals nachweisen,

dass die Methode der Oxidation von LDL nach Esterbauer auch im

Fruchtwasser funktioniert. Durch Zugabe einer Substanz -in unsrem Falle

Fruchtwasser- zum Oxidationsansatz mit LDL kann der

Oxidationszeitpunkt der Lipoproteine in Abhängigkeit von der oxidativen

Wirkung des zugegebenen Stoffes bestimmt werden. Da die Dauer der

Lag-Phase Rückschlüsse auf die pro- bzw. antioxidativen Eigenschaften

der zugegebenen Substanz ermöglicht, können sowohl verschiedene

Substanzen als auch, wie in unserer Studie, die gleiche Substanz

unterschiedlicher Gruppen -Fruchtwasser von rauchenden und nicht-

rauchenden Müttern- miteinander verglichen werden. Aufgrund der

Verlängerung der Lag-Phase bei der Messung im Photometer konnten

Antioxidantien im Fruchtwasser mittels des Esterbauer-Verfahrens

nachgewiesen werden.

Die Frage, ob ein Unterschied bezüglich des oxidativen Status im

Fruchtwasser rauchender und nicht-rauchender Mütter besteht, kann

aufgrund eines signifikanten Unterschiedes in der Dauer der lag-Phase mit

ja beantwortet werden. (81,61 min. ± 23,72 min., nRaucher = 20 vs. 65,06

min. ± 15,14 min., nNicht-Raucher = 67). Eine Zunahme der Dauer der Lag-

Phase um 25 % zwischen Tabak-konsumierenden und Nikotinfrei-

lebenden Schwangeren wurde nachgewiesen. Das im Student t-Test

errechnete p-Level von 0,007 ist statistisch als hoch signifikant zu werten

(p ≤ 0,01).

Die Bestimmung der Lag-Phase während der LDL-Oxidation ermöglicht

die Analyse pro- oder antioxidativ wirkender Stoffe. Aufgrund der

verlängerten lag-Phase der Raucherinnen nehmen wir an, dass eine

Substanz mit antioxidativer Wirkung im Fruchtwasser von rauchenden

Müttern existiert, die die LDL Oxidation hemmt und als Radikalfänger

dient. Dieses unerwartete Ergebnis wirft die Frage auf, ob der mütterliche

Körper doch besser in der Lage ist, das Kind in utero vor den negativen

Einflüssen der durch Tabakrauch generierten freien Radikale zu schützen,

als bisher angenommen. Die Vermutung liegt nahe, dass die feto-


plazentare Einheit in der Lage ist, auf die schädlichen Einflüsse des

Rauchens protektiv zu reagieren.

6.2 Review

Prä- und postnataler mütterlicher Tabakkonsum sowie Passivrauch

beeinflussen den pro-/ antioxidativen Status des Neugeborenen in den

ersten Lebenswochen(99). Mütterliche antioxidative Schutzmechanismen

die durch Nikotinabusus getriggert werden sind komplex und betreffen

verschiedene Organsysteme. Effekte des Rauchens sowie der Gravidität

auf die Konzentration von Antioxidantien im Plasma sowie der Muttermilch

sind bereits belegt. Auch der Zusammenhang zwischen mütterlichem

Rauchen, plazentarem oxidativem Stress sowie fetaler Schädigung

aufgrund der Übertragung toxischer Tabakprodukte ist teilweise erforscht.

6.2.1 Antioxidantien im Plasma

Raucher bedürfen einer größeren Menge an Antioxidantien, um normale

Blutspiegel zu erreichen(31). Sowohl α-Tocopherol (Form des Vitamin E)

als auch Vitamin C spielen eine entscheidende Rolle im Antioxidativen

System des Plasmas. α-Tocopherol ist als lipidlösliches Antioxidans in der

Lage, mehrfach ungesättigte Fettsäuren in Membranlipiden, Lipoproteinen

und Depotfett vor einer Zerstörung durch Oxidation zu schützen(18).

Vitamin C ist das potenteste wasserlösliche Antioxidans im menschlichen

Plasma; da Ascorbinsäure leicht oxidierbar ist, wirkt sie als Redukton(40).

Ebenso ist Harnsäure bei der Hemmung der Lipid-Peroxidation von

Bedeutung(2). Liu et al. zeigten in ihrer Studie, dass sowohl α-Tocopherol

als auch Harnsäure Konzentrationen bei Nicht-Rauchern im Gegensatz zu

Rauchern signifikant erhöht waren. Das Plasma von Rauchern dagegen

wies Autoantikörper gegen oxidiertes LDL auf; anti-ox-LDL Immunglobulin

G (IgG) das durch Nikotinkonsum angereichert wurde. Aufgrund der

negativen Korrelation zwischen anti-ox-LDL IgG und α-Tocopherol wurde

nachgewiesen, dass α-Tocopherol LDL effektiv vor oxidativen Schäden

schützt(85). Nach Munro ist es unklar, ob die niedrigeren α-Tocopherol

Plasmawerte bei Rauchern auf einen gesteigerten Verbrauch (Clearance)

oder verminderte Resorption von Vitaminen zurückzuführen sind. Der


gesteigerte Verbrauch könnte durch die Nutzung der Antioxidantien zur

Inhibition der Lipid Peroxidation begründet werden(96).

In der Analyse der Serumparameter während der Gravidität in Bezug auf

antioxidative Schutzmechanismen konnte bisher gezeigt werden, dass

normal verlaufende Schwangerschaften mit erhöhten mütterlichen

Blutspiegeln von Vitamin E einhergehen. Ein Anstieg im Verlauf der

Schwangerschaft sowie eine positive Korrelation zwischen Vitamin E

Plasmaspiegeln und der Wiederstands-Zunahme des LDL gegenüber

Oxidation konnte nachgewiesen werden(26). Mütterliches Rauchen jedoch

ist mit einer Abnahme von Antioxidantien im Serum wie z.B. Vitamin C

sowie niedrigeren Werten der Messungen der totalen antioxidativen

Kapazität während der Gravidität assoziiert(6). Erhöhte

Plasmakonzentration von F2-Isoprostan, Abbauprodukt der Lipid-

Peroxidation, bei Rauchern im Vergleich zu Nicht-Rauchern konnte auch

bei Kindern rauchender Mütter nachgewiesen werden(67)(99). Die

Veränderungen der Antioxidativen Parameter bei rauchenden Müttern in

der Schwangerschaft und ihren Kindern könnten laut Fayol et al. durch

Anpassung an oxidativen Stress begründet sein(39).

6.2.2 Antioxidantien-Gehalt der Muttermilch

Die Mehrheit der Gynäkologen hält das Stillen des Neugeborenen für

wichtig, da die Muttermilch auf den Bedarf des Säuglings abgestimmte

Mengen an Vitaminen, Mineralstoffen und Immunglobulinen enthält. Direkt

nach der Geburt produziert die weibliche Mamma eine Art Vormilch, das

sogenannte Kolostrum. Dieses enthält einen etwa 10-fach höheren Anteil

an β-Karotin als die übliche Muttermilch. β-Karotin und Vitamin E schützen

den Säugling während des ersten Lebensabschnittes vor

oxidationsbedingten Schäden, da dessen Organismus häufig noch nicht

genügend Antioxidantien zum Abfang freier Radikale bereitstellen

kann(13)(66). Es ist bekannt, dass Nikotin nicht nur die Plazentaschranke

überquert, sondern auch postnatal in die Muttermilch gelangt(27). Wie

Orhon at al. bewiesen, führt Rauchen während der Schwangerschaft zu

verminderten Vitamin E Konzentrationen in der Muttermilch, aufgrund der

gesteigerten Verwendung des Antioxidans als Inhibitor der Lipid


Peroxidation. Tabakkonsum limitiert zusätzlich den Transfer lipophiler

Antioxidantien wie z.B. Retinol oder β-Karotin vom Blut in die

Muttermilch(101). Dieser Mangel an Antioxidantien könnte ebenfalls als

Auslöser oxidativen Stresses bei Neugeborenen rauchender Mütter

angesehen werden.

6.2.3 Antioxidative Schutzmechanismen der Plazenta

Durch signifikant niedrigere TAC (total antioxidant capacity), sowie höhere

TOS (total oxidant status) und OSI (oxidativ stress index) Werte im

plazentarem Gewebe von Raucherinnen im Vergleich zu Nicht-

Raucherinnen konnte eine direkte Auswirkung des oxidativen Stresses auf

die Plazenta nachgewiesen werden(7). Aufgrund der hohen

metabolischen Nachfrage produziert die Plazenta während der Gravidität

mehr ROS. In normal verlaufenden Schwangerschaften ist die Plazenta

als Entstehungsort pro-oxidativ wirkender Substanzen, antioxidativer

Enzymsysteme sowie Hormone in der Lage, die Lipidperoxidation unter

Kontrolle zu halten(45). Estriol zum Beispiel, Stoffwechselprodukt von

Estradiol mit schwacher estrogener Wirkung, ist ein in der Plazenta

gebildetes Hormon mit antioxidativer Wirkung dessen Serumkonzentration

während der späten Schwangerschaft stark ansteigt und der Limitierung

oxidativer Schäden dient(95).

Rauchen während der Schwangerschaft führt jedoch zu einer geringeren

Aromatse-P450- Aktivität in der Plazenta und einer damit verbundenen

Verminderung der Estrogenproduktion(73). Niedrigere Estrogenwerte

wurden mehrfach mit Schwangerschaftskomplikationen assoziiert. Obwohl

akuter oxidativer Stress zu Gewebsschäden führt, kann der menschliche

Körper auf chronischen oxidativen Stress, dem er z.B. durch

Zigarettenrauch ausgesetzt ist, mit einer Upregulation antioxidativer

Mechanismen reagieren. Ein Beispiel ist der protektive Effekt des

Rauchens und eine damit verbundene sinkende Inzidenz der

Präeklampsie, die mit 32% bei rauchenden Müttern paradoxerweise

niedriger ist als bei Nikotinabstinenten(22)(130). Eine Kombination aus

sich im Plasma anreicherndem Karbonmonoxid, welches vasodilatatorisch

wirkt und die Apoptoserate senkt(10)(11), sowie die gesteigerte Aktivität


der plazentaren Hämoxygenase (HO-1) und eine dadurch vermehrte

Produktion der Antioxidantien Bilirubin und Biliverdin in der plazentaren

Basalplatte von Raucherinnen wurde belegt(118). Auch Selen und Zink

spielen eine aktive Rolle im mütterlichen Abwehrsystem gegen toxische

Substanzen. Nikotinabusus korrelierte mit höheren plazentaren Werten

beider Spurenelemente, die Enzyme der Superoxiddissmutase bzw. der

Glutathionperoxidase sind. Niedrigere Selenkonzentrationen im Plasma

Schwangerer im Vergleich zum Nabelschnurrblut wiesen auf einen aktiven

Transport von Mutter zu Kind hin(70). Potentielle therapeutische Effekte

durch Substitution von Vitamin C und E auf die endotheliale Dysfunktion

der Plazenta aufgrund oxidativer Schädigung durch Tabakkonsum

konnten in vitro bereits belegt werden(42).

6.3 Bezug der Studie zur aktuellen Forschung

Antioxidantien und deren Regulation, ihre Funktion in der Gravidität sowie

die Übertragung von Mutter zu Kind waren und sind Gegenstand aktueller

Forschung. Etliche Effekte des Rauchens auf mütterliche und fetale

Serumparameter, die Muttermilch sowie die Plazenta wurden entdeckt.

Über die Rolle des Fruchtwassers in diesem komplexen Zusammenspiel

sowie die Auswirkungen des Rauchens auf die Amnionflüssigkeit ist bisher

jedoch kaum etwas bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde der

Antioxidantien Gehalt des Fruchtwassers rauchender und nicht-

rauchender Mütter verglichen, um daraus Rückschlüsse auf den

oxidativen Status zu ziehen.

6.3.1 Antioxidantien im Fruchtwasser

Das Fruchtwasser befindet sich in der Amnionhöhle und umgibt den

Embryo ab der 4. Schwangerschaftswoche vollständig. Die

Amnionflüssigkeit ermöglicht dem Ungeborenem Bewegungsfreiheit und

stellt eine Art Stosspuffer dar. Als klare, wässrige Flüssigkeit wird sie aus

dem mütterlichen Blut sezerniert. Die Zusammensetzung des

Fruchtwassers ist komplex, mit mütterlichen und kindlichen Anteilen. Zu

99% besteht die Amnionflüssigkeit aus Wasser und Elektrolyten, ebenfalls

enthalten sind Glucose, Lipide sowie bakterizid wirkende Proteine. Die


Menge des Fruchtwassers verändert sich im Laufe der Schwangerschaft

(20ml in der 7. Woche, 600ml in der 25. Woche, 1000ml in der 30. - 34.

Woche und 800ml bei Geburt)(61). Coulson et al. belegten, dass

mütterliches Rauchen in der Gravidität keinen Einfluss auf die Menge des

Fruchtwassers hat(23). Bei Analysen der Fruchtwasserzusammensetzung

konnten Metabolite des Nikotins bei allen rauchenden Müttern, in 80% der

Fälle Nikotin selbst im Fruchtwasser nachgewiesen werden. Die Menge an

schädlichen Substanzen war in der Amnionflüssigkeit jedoch signifikant

niedriger als im Mekonium sowie im mütterlichen und neonatalen Urin(74).

In unserer Studie konnten wir erstmals einen gesteigerten Antioxidantien-

Gehalt im Fruchtwasser rauchender Mütter mit Hilfe des Esterbauer-

Verfahrens nachweisen. Ob dies auf die vermehrte plazentare

Übertragung von mütterlichen Antioxidantien, ein antioxidatives

Enzymsystem im Fruchtwasser o.ä. zurückzuführen ist, ist derzeit nicht

bekannt.

Eine der wenigen bisherigen Studien ergab, dass mütterlicher

Tabakkonsum die antioxidativ wirkende Ascorbinsäure im Serum der

Schwangeren sowie im Nabelschnurblut reduziert(3). Ascorbinsäure

Konzentrationen im Fruchtwasser spiegeln dies wieder: Amnionflüssigkeit

von Raucherinnen enthielt mit 77μm/l weniger als 50% der Ascorbinsäure

Konzentration von Nichtraucherinnen (138,9μm/l)(12). Barett et al.

begründeten den signifikant größeren Abfall der Ascorbinsäure im

Fruchtwasser rauchender Mütter mit einem gesteigerten Verbrauch des

Antioxidans durch den Feten zum Schutz vor oxidativen Schäden. Die

Rolle des Vitamin C im Fruchtwasser wird jedoch kontrovers diskutiert.

Einige Studien wiesen wesentlich höhere Konzentrationen von Vitamin C

im Fruchtwasser als im Serum um den Zeitpunkt der Geburt nach, und

deuteten dies als Kompensationsmechanismus zum Schutz vor erhöhtem

oxidativen Stress während der Austreibungsperiode(129). All unsere

Messungen fanden zum Zeitpunkt der Geburt statt. Da Kinder rauchender

Mütter höherem oxidativem Stress ausgesetzt sind, könnte dies die

Zunahme der Lag-Phase im Fruchtwasser rauchender Mütter im Vergleich

zu Nicht-Rauchenden und den damit verbundenen höheren Gehalt an

Antioxidantien erläutern. Untersuchungen an Meerschweinchen ergaben


sinkende Vitamin C Konzentrationen im Verlauf der Schwangerschaft(25).

Hingegen wurden beim Menschen steigende Konzentrationen(107) sowie

ein direkter Zusammenhang zwischen totaler antioxidativer Kapazität und

Gestationsalter beschrieben(17).

Eine normal verlaufende Schwangerschaft geht mit höherem oxidativen

Stress für Mutter und Kind einher(97). Studien belegen, dass dies in einer

posttranslationale Protein-Modifikation mit beeinträchtigter Proteinfunktion

resultieren kann(41). Anhand von Albumin, dem am häufigsten

vorkommendem Protein im Fruchtwasser, konnten bereits etliche

Modifikationen aufgrund oxidativen Stresses gezeigt werden(43)(44)(100).

Insbesondere der Zusammenhang zwischen Rauchen in der

Schwangerschaft und vorzeitigem Blasensprung wird in vielen

Publikationen thematisiert: Mütterlicher Tabakkonsum zählt ebenso wie

niedrige Vitamin C Konzentrationen zu den Risikofaktoren(124). Pressman

et al. stellten die Hypothese auf, dass die totale antioxidative Kapazität der

Amnionflüssigkeit mit dem Vitamin C, α-Fetoprotein und Albumin Gehalt

korreliert. α-Fetoprotein zeigte 75% der belegten antioxidativen Kapazität

von Albumin in vitro. Durch ihre Funktion als Antioxidantien könnten

Vitamin C und α-Fetoprotein im Fruchtwasser sowohl vor vorzeitigem

Blasensprung als auch vor oxidativen Schäden durch reaktive

Sauerstoffspezies schützen(107).

Antioxidative Schutzmechanismen, wie z.B. die Glutathionperoxidase im

mütterlichen Serum, konnten im Fruchtwasser bisher nicht nachgewiesen

werden(84). Bei einer Proteom-Analyse des Fruchtwassers wurden jedoch

Thioredoxine entdeckt(19). Diese reagieren in reduzierter Form

enzymatisch als Oxidoreduktase. Studien an Ratten ergaben Hinweise auf

eine Rolle als Antioxidans und Regulator biomechanischer

Signaltransduktion(94). Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen

Hinweise auf das Vorkommen einer Substanz im Fruchtwasser mit

antioxidativer Wirkung, stimmen mit diesen Erkenntnissen überein. Zur

Identifizierung und Klassifizierung der Substanz oder des antioxidativen

Systems bedarf es weiterer Forschung.


6.3.2 Die Länge Lag- Phase als Parameter für den oxidativen Status

Als Marker für oxidativen Stress in vivo wird in zahlreichen Studien oxLDL

herangezogen. Das Wissen um die Beteiligung von oxLDL an der

Entstehung zahlreicher Erkrankungen führte zu intensiven

Forschungsbemühungen, Substanzen zu identifizieren, die die Oxidation

von LDL hemmen bzw. verzögern können. So scheint OxLDL bei der

Pathogenese der Präeklampsie durch die Schädigung des Endothels

mitverantwortlich zu sein. Ebenso konnte ein Rückgang der Inzidenz der

Präeklampsie bei rauchenden Müttern beobachtet werden(22)(130). In

diesem Zusammenhang wurden wir auf den oxidativen Status bei

Rauchern in der Schwangerschaft aufmerksam.

Bisher konnte belegt werden, dass Nikotin die Serumkonzentrationen von

HDL und LDL sowie die des Gesamt-Cholesterins durch eine gesteigerte

Synthese und Sekretion von Lipoproteinen erhöht(52). Ebenso konnte

gezeigt werden, dass Zigarettenrauch die Plasmakonzentration von

Autoantikörpern gegenüber oxidiertem LDL erhöht(52). Es wird kontrovers

diskutiert, ob LDL von Rauchern anfälliger gegenüber Oxidation ist, als

das von Nichtrauchern(4)(51)(108).

In vitro wurde der direkte Nikotineinfluss auf die LDL Anfälligkeit bereits

anhand der Cu2+-induzierten LDL-Oxidation untersucht: Nikotin und

Cotinin wirkten inhibitorisch. Die Anlaufphase vor Entstehung der Diene

wurde sowohl durch Zugabe von Nikotin als auch Cotinin zum

Oxidationsansatz signifikant verlängert. Die Verlängerung der Lag-Phase

war dosisabhängig. Obwohl sie aufgrund ihrer chemischen Struktur

antioxidativ wirken müssten, da sowohl Nikotin als auch Cotinin die LDL

Oxidation hemmen, scheint das Gegenteil in vivo der Fall zu sein(4). Wir

nehmen jedoch an, dass die Verlängerung im Fruchtwasser rauchender

Mütter nicht allein auf die inhibitorische Wirkung des im Fruchtwasser

befindlichen Nikotins zurückzuführen ist. In diesem Falle wäre eine

Korrelation zwischen Anzahl gerauchter Zigaretten pro Tag und

Verlängerung der Lag-Phase wahrscheinlich. Asgary et al. stellten die

Hypothese auf, dass ein Unterschied im in vivo und in vitro Effekt des

Nikotinkonsums bestehe und andere Substanzen im Tabakrauch ebenfalls

die LDL Oxidation steigern könnten(4). Die Formation konjugierter Diene,


Hydroperoxide und TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances) wurde

ebenfalls untersucht. Zigarettenrauch begünstigte die Anfälligkeit von LDL

gegenüber der Peroxidation; Nikotin verringerte in steigenden

Konzentrationen die Produktion von Hydroperoxiden und steigerte die

sekundärer Oxidationsprodukte wie Aldehyde und TBARS(46).

Das dritte Trimester der Gravidität ist von Hyperlipidämie gekennzeichnet,

Gesamtcholsterin, Cholestrol und LDL erreichen dort

Maximalwerte(37)(119)(128). Anhand der Cu2+-induzierten LDL-Oxidation

konnte gezeigt werden, dass die Länge der Lag-Phase im Verlauf der

Schwangerschaft zunimmt. De Vriese et al. belegten außerdem den damit

verbundenen steigenden Oxidationswiderstand im Verlauf der Gravidität.

Eine Verlängerung der Lag-Phase im dritten Trimester um 129 % im

Vergleich zur 18ten Schwangerschaftswoche wurde gemessen. Vitamin E

Plasmawerte korrelierten ebenfalls positiv mit der Dauer der Lag-Phase,

steigende Konzentrationen führten zu höherem Oxidationswiderstand des

LDLs(26).

Das antioxidative Potential von Estrogenen ist am Beispiel des drastischen

Anstiegs der Atherosklerose bei Frauen in der Menopause erkennbar, der

Mechanismus ist jedoch unbekannt. Estrogene inhibieren die oxidative

Modifikation von LDL in vitro(8)(90)(122) und in vivo(111). Ihre Schutzrolle

als Radikalfänger konnte bereits 1994 nachgewiesen werden(71)(79). 17-

β-Estradiol verlangsamt die oxidative Modifikation von LDL(88)(90).

Ebenso gelang der Nachweis antioxidativer Potenz für 17-α-Estradiol,

Probucol sowie Estiol anhand der Verlängerung der Lag-Phase bei der

Cu2+-induzierten LDL-Oxidation in vitro(28). Da die Oxidationsprozesse in

der Schwangerschaft zunehmen, wäre eine Verkürzung der Lag-Phase zu

erwarten. Estriol als Antioxidans ist jedoch in der Lage, LDL vor Oxidation

zu schützen. Anhand der Cu2+-induzierten LDL-Oxidation nach Esterbauer

konnte eine Verlängerung der Lag-Phase in vitro aufgrund von Estriol

nachgewiesen werden(95). Ein starker Anstieg der Estriolkonzentration

zum Ende der Gravidität ist bekannt. Diese hohen Werte könnten Teil des

Selbstschutzes zur Limitation oxidativer Schäden sein.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Länge der Lag-

Phase als Parameter für den oxidativen Status im Fruchtwasser


herangezogen werden kann. Interessanterweise zeigten sich im

Fruchtwasser rauchender Mütter signifikant längere Lag-Phasen, die auf

eine höhere antioxidative Potenz hinweisen. Dieses Ergebnis stimmt mit

weiteren Untersuchungen überein. Studien zur Messung von

Malondialdehyd (MDA) im Fruchtwasser ergaben höhere Konzentrationen

bei rauchenden Müttern als bei Nichtrauchenden; die Messung von MDA

als Abbauprodukt der Lipidperoxidation stellt eine der am häufigsten

verwendeten Methoden zur Bestimmung des oxidativen Status

dar(29)(98). Dies bestärkt die Vermutung, dass die feto-plazentare Einheit

in der Lage ist, auf die schädlichen Einflüsse des Rauchens protektiv zu

reagieren. Hinsichtlich des genauen Mechanismus bedarf es weiterer

Untersuchungen. Unsere guten Ergebnisse machen den Weg frei für

Studien mit größerer Probandenzahl.


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8. Abkürzungsverzeichnis

APGAR-Scores Punkteschema, mit dem sich der klinische Zustand von Neugeborenen standardisiert beurteilen lässt

BE Base excess BMI Body Mass Index °C Grad Celsius c Konzentration ca. Circa cm Zentimeter COPD Chronisch obstruktive Lungenerkrankung CTG Kardiotokogramm Cu2+ Kupfer CuSO4 Kupfersulfat dest. Destilliert d.h. das heißt dl Deziliter DNA Desoxyribonukleinsäure E Extinktion EDTA Ethylendiamintetraacetat Erl. Erlangen Fa. Firma g Gramm H2O Wasser HDL High density Lipoprotein HELLP Hypertensive

Schwangerschaftserkrankung; Haemolysis, Elevated Liver enzyme levels, Low Platelet count

IgG Immunglobulin G IUGR Intrauterine growth restriction KHK Koronare Herzkrankheit KBr Kalium Bromid LDL Low-density Lipoprotein MDA Malondialdehyd mg Milligramm min Minuten ml Milliliter mm Millimeter µl Mikroliter nm Nanometer n Anzahl NaCl Natriumchlorid NADH Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid NADPH-Oxidase Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat

Oxidase Nbg. Nürnberg


O2 Sauerstoff o.ä. oder ähnliches oxLDL Oxidiertes LDL OR Odds Ratio OSI Oxidative stress index p Wahrscheinlichkeit pAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit PBS-Puffer Phosphate buffered saline RDS Respiratory Distress Syndrome ROS Reaktive Sauerstoffspezies SGA-Babys Small for Gestational Age-Kinder SIDS Sudden Infant Death Syndrome SS Schwangerschaft SSW Schwangerschaftswoche Std. Abw. Standardabweichung t Zeit TAC Total antioxidant capacity TBARS Thiobarbituric acid-reactive substances TOS Total oxidant status U/min Umdrehungen pro Minute uvm. und vieles mehr VATER-Assoziation angeborener Komplex multipler,

schwerer Fehlbildungen mit variabler Kombination; Vertebraldefekte , Analatresie, Tracheoösophagealfistel, Esophagusatresie, Renaledysplasie

vorz. Vorzeitig vs. Versus z.B. zum Beispiel Z.n. Zustand nach ZNS Zentrales Nervensystem 4-HNE 4-Hydroxynonenal


9. Danksagung

Die vorliegende Dissertationsarbeit wurde von Oktober 2009 bis Juni 2012

an der Frauenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

durchgeführt.

Ich danke Herrn Prof. Dr. M. W. Beckmann, Direktor der Frauenklinik der

Universität Erlangen, dass ich die Arbeit an seinem Haus anfertigen durfte.

Prof. Dr. R. Dittrich möchte ich für die Überlassung des interessanten

Themas danken. Sein kompetenter Rat hat mich während der

Durchführung der Versuche und Anfertigung der Arbeit stets begleitet und

trug maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit bei.

Frau Dr. S. Cupisti danke ich herzlichst für die Gewinnung und

Bereitstellung der Fruchtwasserproben sowie für ihre Hilfe in fachlichen

Fragen.

Ganz besonders bedanken möchte ich mich bei Frau I. Hoffmann,

Medizinisch Technischer Assistentin des Endokrinologischen Labors der

Frauenklinik, die immer Zeit und ein offenes Ohr für mich hatte.

Für die Korrektur der Arbeit, Hilfe bei Formatierungsfragen und Motivation

danke ich Markus, Niklas und Christian.

Der größte Dank jedoch geht an meine Eltern, die mir das Studium der

Humanmedizin ermöglichten und mir auch während der Anfertigung der

Doktorarbeit immerzu unterstützend und liebevoll zur Seite standen.

Einfluss mütterlichen Rauchens während der Schwangerschaft ... · Enzym-Systeme sowie...

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