EN VON WILL

XXVIII Congreso Nacional de la SETH. Simposios

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Avances en la enfermedad de von WillebrandCOORDINADORES: J.A. Aznar. Hospital Universitario La Fe. Valencia

J.F. Luca. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza


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Introduccin

La enfermedad de von Willebrand (EVW) es una enfermedad he-morrgica congnita caracterizada por defectos cuantitativos o cua-litativos del factor de von Willebrand (FVW). El FVW cumple dos funciones primordiales. En la hemostasia primaria es imprescindible para la unin entre las plaquetas con el subendotelio a travs de las formas multimricas de alto peso molecular de la protena. Es tam-bin el transportador del factor VIII (FVIII), al cual protege de la de-gradacin proteoltica en plasma(1). La EVW se maniesta como una ditesis hemorrgica con manifestaciones fundamentalmente muco-cutneas, junto con sangrado excesivo tras las intervenciones quirr-gicas(2). Desde 1994 y tras una actualizacin en 2006(3), se distinguen tres tipos basados en la deciencia cuantitativa parcial (tipo 1) o total de la protena (tipo 3) o en variantes disfuncionales o cualitativas del FVW (tipo 2). Esta clasicacin, que permite la unicacin de ter-minologa, no reeja la extrema diversidad de la enfermedad, objeti-vada en los ltimos aos por un mayor conocimiento de los defectos moleculares y los mecanismos siopatolgicos de esta entidad. Esta mayor compresin ha llevado a plantearse cmo el genotipo de cada caso de EVW inuye en los mecanismos siopatolgico de la enfer-medad y en la expresin fenotpica(4,5). Consecuentemente, este mejor

entendimiento se puede reejar en acciones teraputicas ms ecaces e individualizadas para cada paciente(6).

Sntesis y secrecin del FVW

La biosntesis del FVW se produce en los megacariocitos y en las clulas endoteliales, almacenndose en los grnulos de las plaque-tas y fundamentalmente en los cuerpos de Weibel-Palade hasta su liberacin en la circulacin. La protena completa del FVW consta de un pptido seal de 22 aminocidos, un propptido (FVWpp) de 741 aminocidos y la molcula de FVW madura de 2.050 amino-cidos. Tras la prdida del pptido seal, los monmeros del FVW forman dmeros en el retculo endoplsmico, mediante la unin de los extremos carboxiterminales a travs del dominio cysteine knot (CK). Posteriormente en el aparato de Golgi los dmeros se unen por los extremos aminoterminales creando grandes multmeros con ms de 100 monmeros. El dominio D3 de la molcula de FVW es fundamental en este proceso junto con los dominios D, que contie-nen unas secuencias especcas (CGLC) que posibilitan la correcta multimerizacin. En el post-Golgi el propptido se escinde por la accin de una furina pero se mantiene junto al FVW en los cuer-

Avances en la siopatologa de la EVW. Correlacin genotipo/fenotipo y su relevancia clnica y teraputica

A.R. Cid HaroUnidad de Hemostasia y Trombosis. Servicio de Hematologa. Hospital Universitario y Politcnico La Fe. Valencia

ABSTRACTVon Willebrand disease (VWD) is a bleeding disorder characterized by quantitative or qualitative defects in von Willebrand factor (VWF). VWF is a multimeric glycoprotein that takes part in the haemostatic process by promoting platelet adhesion at sites of vascular injury and serves a carrier of factor VIII. Deciency in VWF can result in mucocutaneous bleeding and excessive bleeding after trauma or surgery. Recent advances in the molecular and genetic events are improving our understanding of the pathophysiology and the clinical management of each patient with VWD.

RESUMENLa enfermedad de von Willebrand (EVW) es una enfermedad hemorrgica caracterizada por una deciencia cuantitativa o cualitativa del factor de von Willebrand (FVW). El FVW es una glicoprotena multimrica implicada en el proceso hemosttico posibilitando la adhesin de las plaquetas a las zonas de lesin vascular y adems acta como el transportador del factor VIII en la circulacin. La deciencia de este factor produce hemorragias fundamentalmente mucocutneas junto con sangrado tras traumatismos o cirugas. Los recientes avances en el conocimiento de los defectos moleculares han derivado en un mayor entendimiento de los mecanismos siopatolgicos de la enfermedad y un mejor manejo teraputico de cada paciente con EVW.


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pos de Weibel-Palade hasta su liberacin simultnea al plasma. Se le coneren al propptido funciones protectores para una correcta multimerizacin del FVW(1).

El resto de dominios funcionales de la molcula del FVW con-tienen los sitios de unin al colgeno (dominios A1 y A3), el lugar de actuacin de la proteasa que escinde el FVW (dominio A2), el lugar de unin a la glicoprotena (GP) Ib (dominio A1) y IIb/IIIa plaquetar (dominio C1) y la zona de unin al FVIII (dominio D)(1).

Protelisis y aclaramiento del FVW

Bien de una forma constitutiva o tras ciertos estmulos, el FVW ma-duro en forma de multmeros de muy alto peso molecular es liberado desde las clulas endoteliales a la circulacin sangunea junto con su propptido. Este FVW podra unirse espontneamente al complejo de la GP plaquetar Ib-IX-V y formar agregados plaquetas-FVW que ocluyeran la microcirculacin. En condiciones normales la proteasa ADAMTS13 escinde estos grandes multmeros en el dominio A2 ge-nerando molculas ms pequeas con menor actividad hemosttica. Para que ello tenga lugar el FVW que circula con una conformacin globular sufre un proceso de distensin en zonas de altas fuerzas de cizalladura pasando a una conformacin elongada, lo cual posibilita la exposicin de los lugares de corte(7).

El FVW maduro es liberado de los sitios de almacenamiento junto con su propptido en una proporcin 1:1, aunque posterior-mente la vida media de ambas molculas es diferente, siendo mucho mayor para el FVW maduro frente al propptido (12 h vs. 2h). Una forma fcil de determinar el aclaramiento de la molcula madura del FVW es a travs del cociente entre el propptido y el FVW (FVWpp/FVW:Ag), estando ste aumentado en los casos en que existe un aclaramiento acelerado del FVW(8). No es bien conocido qu receptores y clulas median este aclaramiento. Parece poco pro-bable que sea eliminado por va renal o que pase al compartimento extravascular dado su gran tamao. Por su estructura compleja pa-rece ms factible que pueda unirse a diferentes receptores y que su eliminacin siga un proceso mediado por receptores. La hiptesis actual es que macrfagos principalmente del hgado y tambin del bazo eliminen el FVW(9).

Los valores de FVW en sangre dependen de mltiples facto-res. De todos es conocido que las personas de grupo sanguneo O tienen un 25% menos de protena que los del resto de grupos sanguneos(10). El FVW contiene 10 sitios de O-glicosilacin y 12 sitios para N-glicosilacin. Estos ltimos contiene determinantes de grupos sanguneos ABO que estn ausentes en los sujetos del grupo O. Este hecho podra ser la causa de que las personas del grupo O tengan un FVW con una supervivencia disminuida y por lo tanto valores ms bajos de FVW. Hay evidencias de un aclara-miento acelerado en sujetos del grupo O determinado por un mayor cociente entre el propptido y el FVW(8,11), una menor vida media tras la administracin de desmopresina(11) y el hecho de que tras la administracin de FVIII en pacientes hemoflicos de grupo O ste desaparece ms rpidamente con respecto a los de otros grupos(9). Junto con un mayor aclaramiento tambin se ha demostrado que en los sujetos de grupo sanguneo O hay una protelisis del FVW por la ADAMTS13 ms rpida(12).

Alteraciones genticas y mecanismos siopatolgicos de la EVW

EVW de tipo 1

La EVW de tipo 1 es la forma ms frecuente de la enfermedad; sin embargo, hasta hace relativamente poco tiempo no se conocan ape-nas las alteraciones genticas que originaban esta variante. En los l-timos aos tres estudios sobre EVW realizados en Europa, Canad y Reino Unido han aportado importantes resultados(13-15). Los datos ms relevantes de estos tres estudios nos informan de que en un 65% de pacientes con EVW de tipo 1 se encuentra una mutacin responsable de la enfermedad, siendo en el 60% de los casos de cambio de sentido del triplete (missense) y presentando en el 15-20% de los pacientes ms de una mutacin candidata. Un aspecto importante es que la ma-yora de las mutaciones candidatas de EVW de tipo 1 se encuentran en pacientes con valores de FVW en plasma por debajo de 30 UI/dL. Este ltimo aspecto apoya el concepto de que algunas mutaciones responsables de la EVW de tipo 1 se encuentran en genes implicados en una correcta biosntesis y procesamiento del FVW, diferentes al gen que produce la molcula de FVW.

Una cuestin por resolver en la mayora de los casos es entender cmo la mutacin ocasiona los valores disminuidos de protena en sangre. Inicialmente las mutaciones asociadas a la EVW de tipo 1 producan una disminucin en la sntesis y secrecin del FVW. En los ltimos aos otros mecanismos intentan explicar esta variante de la enfermedad. La mutacin Y1584C es muy frecuente entre los pa-cientes con EVW de tipo 1 con grupo sanguneo O y se ha relacio-nado con una protelisis por la ADAMTS13 ms acelerada(16). Sin embargo, en muchas familias esta mutacin, tambin frecuente en la poblacin control, no segrega con el fenotipo de la enfermedad. El otro mecanismo responsable de la enfermedad reconocido claramen-te es la existencia de una aclaramiento acelerado de la molcula de FVW. Hay varias mutaciones responsables de este fenotipo, siendo la ms estudiada la mutacin R1205H en el dominio D3 (mutacin Vicenza)(17). Otras mutaciones asociadas a este mecanismo dentro del dominio D3 son las mutaciones R1250S/C y W1144G, las mutacio-nes S2179F y C2671Y en el dominio D4-CK y la mutacin I1416N en el dominio A1(5,18-20). El fenotipo de estas variantes con aclaramien-to acelerado se caracteriza por que el FVW presenta una vida media muy corta, como demuestra una buena respuesta al uso de desmopre-sina pero con un rpido descenso de los valores de FVW y un cocien-te FVWpp/FVW:Ag aumentado(4,5). Algunos autores proponen que estas variantes con aclaramiento acelerado sean denominadas como EVW de tipo 1C(4,8,9).

EVW de tipo 2

La caracterstica principal de la EVW de tipo 2A es la prdida de las formas multimricas de mayor peso molecular. Esto puede deberse a mutaciones que producen alteraciones en la sntesis de estos multmeros al afectar a los procesos de dimerizacin o multimerizacin (grupo 1) o a mutaciones que posibilitan una accin aumentada de la protelisis llevada a cabo por la ADAMTS13 (grupo 2). Adems de estos meca-


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nismos fundamentales, varias mutaciones que determinan un fenotipo de EVW de tipo 2A se han asociado a un aumento del aclaramiento del FVW como son C1130F/G/R y C1149R en el dominio D3(18,19).

En la EVW de tipo 2B la mayora de las mutaciones se han detec-tado en la regin de unin del FVW a la GP IB plaquetar en el domi-nio A1. Paradjicamente stas producen una ganancia de funcin del FVW pero un fenotipo hemorrgico. La unin espontnea del FVW a la plaqueta en la circulacin sangunea disminuye la concentracin de los multmeros de mayor tamao disponibles ante un evento hemost-tico, producindose incluso trombocitopenia. Adems, se permite una mayor exposicin de la molcula a la protelisis por la ADAMTS13(6). Algunas mutaciones, como P1266Q/L y R1308L, no se asocian a trombocitopenia y presentan un patrn multimrico normal.

Las mutaciones de la EVW de tipo 2M se producen en el mis-mo dominio que la de tipo 2B (dominio A1) pero el resultado es un fenotipo diferente, con una prdida de funcin en la unin del FVW a la GP Ib plaquetar. Se han comunicado adems tres mutaciones en el dominio A3 que afectan a la unin del FVW al colgeno (S1731T, W1745C y S1783A)(4).

La EVW de tipo 2N presenta un fenotipo similar al de la hemo-lia A leve. Su forma de herencia es autosmica recesiva y se debe a al-teraciones en la zona de unin de la molcula de FVW al FVIII. Segn las mutaciones responsables se han asociado unos valores de FVIII y una respuesta diferentes a la administracin de desmopresina(4).

EVW de tipo 3

La EVW de tipo 3 es la forma ms grave de la enfermedad producida por la ausencia prcticamente total de sntesis y secrecin de FVW. Hay descritas hoy en da ms de 100 mutaciones de diferentes ti-pos que pueden producir esta variante, pasando desde mutaciones de cambio de sentido del triplete hasta grandes deleciones. Sobre todo en los pacientes con mutaciones que producen una prdida importante de la molcula pueden desarrollar anticuerpos frente al FVW admi-nistrado de forma exgena(4).

Implicaciones teraputicas de la siopatologa de la EVW

Las dos opciones teraputicas principales en el tratamiento de los pro-blemas hemorrgicos de la EVW son el empleo de desmopresina, que libera los depsitos de FVW desde los sitios de almacenamiento, y los concentrados de FVIII con FVW, que constituyen un tratamiento sustitutivo y se utilizan en los pacientes que no responden a la primera opcin. En general la desmopresina es til en la mayora de pacientes con EVW de tipo 1 y en algunos con tipo 2. Siempre es recomendable monitorizar la respuesta que se produce tras el empleo de este frma-co y realizarlo al menos durante 4-6 horas, ya que la respuesta vara segn el tipo de EVW y segn la mutacin responsable de la enferme-dad. Esto es especialmente importante en las variantes de EVW que presentan una supervivencia acortada, en las que, con independencia de la respuesta inicial a la desmopresina, la vida media del FVW li-berado es muy corta y este frmaco puede resultar insuciente para tratar algunos de los problemas hemorrgicos(8).

En los pacientes con EVW de tipo 2 el uso de desmopresina pro-duce una liberacin de un FVW defectuoso que puede ser suciente para alcanzar hemostasia en caso de problemas hemorrgicos leves, pero insuciente para sangrados importantes o preparacin para la ciruga. Sin embargo, se ha comprobado que la respuesta a este pro-ducto no es uniforme y que en ciertas variantes de EVW de tipo 2A, como la originada por la mutacin R1315C, esta respuesta es adecua-da(6). En algunos pacientes con EVW de tipo 2B, en los que por de-nicin est contraindicado el uso de este frmaco por empeoramiento de la trombocitopenia, hay ciertas variantes que no se acompaan de descenso de plaquetas y en las que la desmopresina puede ser til, como las producidas por las mutaciones R1341Q, R1308L y P1266Q/L(4,6). Dentro de las mutaciones que producen EVW de tipo 2N, la mutacin R854Q suele presentar una buena respuesta al empleo de desmopresina(4).

Conclusiones

La correlacin entre el genotipo y el fenotipo de la EVW est mejo-rando nuestro conocimiento de la siopatologa de la enfermedad. Esto deriva en una mejora en el diagnstico y la clasicacin de esta entidad y tiene implicaciones en la bsqueda de la mejor opcin tera-putica para cada paciente de forma individualizada.

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Introduction

Quantitative and qualitative defects in von Willebrand factor (VWF) re-sult in von Willebrand disease (VWD). VWD is highly heterogeneous and associates with mucosal and/or trauma-related bleeding tendency in affected individuals. The current clinical classication of VWD is based on the underlying pathophysiological mechanisms that lead to the particular phenotypic features of patients suffering from VWD(1). A partial or complete quantitative deciency results in type 1 and type 3 VWD, respectively. The diagnosis and classication of VWD remains complex(2). From a practical point of view the diagnostic triad of a per-sonal history of excessive mucocutaneous bleeding, laboratory tests for VWF that are consistent with VWD, and a family history of the condi-tion remain the keystone to VWD identication(3-5).

Despite that during the last decade numerous studies have pro-vided us with overwhelming information and a better pathogenetic understanding of type 1 VWD, some aspects still remain unsolved, controversial or not well dened. It is necessary to keep in mind how the different actors inuence the fascinating and complex VWF pathophysiology scenery to understand that its denition and diag-nosis in many occasions are not easy tasks. Some of these actors in-volved are non-genetic factors of VWF levels and function, as well as genetic determinants, including non-VWF genetic loci involved in quantitative VWF alterations(4,5). The present work intends to review some of these aspects with special focus on type 1 VWD, as well as the challenges in its diagnosis. Finally, a brief summary of the current

proyect Clinical and Molecular Prole of VWD. Spanish Registry (PCM-EVW-ES) and its rationale will be addressed also.

Acquired determinants of plasma VWF levels(3-5). VWF is an acute phase reactant which increases approximately threefold in VWF plasma levels in subjects suffering from several infections. Physical activity, hormonal regulation, stress, concomitant diseases, pregnancy, and other circumstances may also aggravate or reduce the haemostatic abnormalities in VWD patients. Increase of VWF has been observed in normal subjects and in patients with type 1 VWD in whom an age-related rise in VWF results in the eventual resolution of the quantitative deciency state that characterizes this disorder.

Genetic factors involved in VWF levels and function(4). In con-trast to types 2 and 3 VWD, essentially monogenic traits, the genetic causation of type 1 disease has not been fully dened and in many cas-es appears to involve genetic determinants in addition to or instead of VWF(6). Type 1 VWD, the more common, appears to be incompletely penetrant and variably expressed(7). Important new information has been obtained with the development of new genomic methodologies such as genome-wide association studies (GWAS) and next genera-tion sequencing strategies. Recent evidence derived from GWAS and more focused genetic association studies in healthy subjects suggest that there may be many genetic variances that in combination deter-mine the plasma VWF level in healthy individuals (Table 1). These genetic variants may act as either modiers of the phenotype in VWD or alternatively, rare variants at the same loci may sometimes be the primary pathogenetic changes in VWD(4,8,9).

Highlights in the diagnosis of type 1 von Willebrand disease

J. Batlle, A. Prez-Rodrguez, J. Costa Pinto, E. Lours Fraga, . Rodrguez Trillo, M.F. Lpez-Fernndez; on behalf of participant investigators of the Project PCM-EVW-ES. Spanish RegistryServicio de Hematologa y Hemoterapia. INIBIC Complexo Hospitalario Universitario A Corua. A Corua. Departamento de Medicina. Universidad de Santiago de Compostela (A Corua)

ABSTRACTThe diagnosis of type 1 von Willebrand disease (VWD) remains complex. From a practical point of view the diagnostic triad of a personal history of excessive mucocutaneous bleeding, laboratory tests for von Willebrand factor (VWF) that are consistent with VWD, and a family history of the condition remain the keystone to VWD identication. The diagnosis is often difcult because of incomplete penetrance (50% or lower), considerable variability of VWF levels, low specicity of bleeding symptoms, and low sensitivity of diagnostic tests being impossible to simplify. Non-genetic (acquired) factors inuencing of VWF levels and function, as well as genetic determinants, including non-VWF genetic loci involved in quantitative VWF alterations contribute to the complexity of this problem. In addition to the blood groups, and until recently unsuspected, many factors seem to contribute to the VWD phenotype, for instance platelet receptors or coagulation proteins may also contribute to variability of VWD phenotype. Distinction between types 1 and 2A VWD as well as between severe type 1 and type 3 VWD may be difcult in some patients. Based in all this complexity and difculties the Project Clinical and Molecular Prole of VWD. Spanish Registry (PCM-EVW-ES) was designed to get an assessment of the real diagnosis and therapeutic situation of VWD in Spain in normal clinical practice, and to achieve a uniform platform of recruited patients with the best possible characterization.

Keywords: VWD, VWF, type 1, VWD Spanish Registry, bleeding score, genetics.


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Non-VWF genetic loci involved in quantitative VWF trait determination(4,5). We have learned from the three major studies on type 1 VWD that the linkage observed is around 41-46% (Table 2), which indicates that loci other than VWF must be involved in VWF level regulation(6,7). ABO blood group is a major genetic modier of plasma VWF levels in humans, with lower levels associated with blood group O with an increased VWF clearance. However, this ac-counts only for ~30% of the genetic variation in VWF level, with the modier genes responsible for the remaining 70% still to be identi-ed(9). It has been recently demonstrated that different expression of the collagen receptor integrin 21 on platelets correlates with bleed-ing severity not only in type 1, but also in types 2B and 2A VWD. Also, polymorphisms of the ITGA2B gene that encodes for the b chain of the brinogen receptor b3, and of the GP6 gene that encodes for the platelet collagen receptor GPVI, have been associated with increased bleeding in VWD patients. In addition, several other genes that encode for platelet receptors or coagulation factors, such as FXI might also inuence the bleeding tendency in VWD patients(5).

Mild/moderate quantitative VWF mutations: type 1 VWD. The least well characterized, and easily most complex form of VWD is also the most common type 1 VWD(4,5,7). To further complicate the genetic characterization of type 1 disease, the condition shows in-complete penetrance and variable expressivity of some disease-caus-ing alleles. All of these issues have combined to generate signicant controversy about the denition of type 1 VWD. Putative causative variants can be identied in ~65% of cases when the VWF proximal promoter, exons, and splice boundaries are screened. There are sev-eral challenging aspects in regard to type 1 VWD(4): 1. The proportion of cases that demonstrate positive results increases as the type 1 phe-notype becomes more severe. 2. The disease demonstrates very sig-nicant allelic heterogeneity with > 100 different mutations already described in the rst four type 1 VWD genetic studies. 3. The most prevalent mutation type involves missense variants, although the pre-cise pathogenic mechanisms involved in these cases, with rare excep-tions, remain unresolved. In ~15% of index cases, more than a single candidate VWF variant is present. 4. As it occurs in many complex genetic traits, the distinction between pathogenic mutations and be-nign polymorphisms is often far from straightforward.

The Y1584C mutation has been identied in all type 1 VWD populations examined to date and appears to be a frequent recurrent cause of this phenotype. In the common heterozygous state, Y1584C is associated with a VWF level of ~40%, whereas in rare homozygous subjects the VWF levels have been signicantly lower at ~25%, sug-

gesting a codominant mode of inheritance(4). This mutation, like many mild type 1 VWD variants is often coinherited with blood group O. The phenotype associated with Y1584C is penetrant in ~70% of sub-jects who inherit the mutation. In terms of pathogenic mechanisms, in vitro analysis and evaluation of a mouse model of the mutation sug-gest that a combination of impaired biosynthesis and enhanced AD-AMTS13 proteolysis contribute to the phenotype, although the latter effect is insufcient to justify reclassication of this variant as type 2A VWD. In contrast to the Y1584C mutant, R1205H, another recur-rent missense mutation found in ~3% of type 1 populations, is fully penetrant and always associated with a fairly severe phenotype, with VWF levels of 10-15% in heterozygotes. Once again, the pathogenic mechanisms associated with this variant appear complex and involve evidence of accelerated clearance and, in some instances, an abnormal multimer prole that may be secondary to the rapid clearance of the protein. The typical type 2N mutation, R854Q, has been found repeat-edly in the heterozygous state in type 1 VWD populations, but in these type 1 patients it is associated with a quantitative VWF phenotype and not with disproportionately low FVIII levels. This nding remains un-explained.

Preliminary studies have already shown abnormal Weibel-Palade body formation and intrinsic VWF secretion in a few type 1 missense variants(4,5). These points out that additional non-VWF loci that play a role in vesicular trafcking and exocytosis may be important con-tributors to the type 1 VWF phenotype. Finally, evidence of an ac-celerated clearance phenotype has also now been demonstrated for ~15% of type 1 VWD cases a nding that again pertains to some of the newly identied non-VWF loci associated with VWF levels. While candidate mutations have not been found in ~35% of all type 1 VWD cases, of particular note, a few cases of relatively severe type 1 disease (with VWF levels < 25%) have demonstrated no mutations(4). In these cases, sequencing of the full VWF gene may identify caus-ative intronic variants or more distant regulatory sequence mutations. Finally, these cases may harbor mutations at alternative genetic loci that contribute to VWF synthesis, secretion, and clearance.

Diagnosis of type 1 VWD

It has been very extensively discussed in other recent reviews and con-sensus documents and has not changed appreciably in recent years(3-5). In summary, the diagnosis of this VWD type is often difcult because of incomplete penetrance (50% or lower), considerable variability of

Table 1. Novel non-VWF genetic loci associated with plasma VWF levels

Vesicular trafcking and exocitosis

Syntaxin binding protein 5 (STXBP %)Sytaxin 2 (STX2)

Clearance receptors

Scavenger receptor class A member 5 (SCARA5)Stabilin 2 (STAB2)C-type lectin domain family 4 member M (CLEC4M)

From Smith et al. CHARGE Genome-Wide Association Study(9)

Table 2. Linkage of VWF to VWF gene in type 1 VWD. The linkage observed in the three major studies on type 1 VWD

is remarkable similar

Canadian Study

European UnionMCMDM-1VWD

United Kingdom

Index cases 123 93* 32

+ Mutations 63% 55% 65%

+ Linked to VWF gene 41% 46% 41%

*Excluding 57 patients with abnormal multimers (adapted from Peake et al.[7]).


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VWF levels, low specicity of bleeding symptoms, and low sensitiv-ity of diagnostic tests being impossible to simplify.

Assessment of the clinical bleeding phenotype(4,10-12). Over the past 5-10 years there has been a progressive realization that objective, quantiable scoring systems for mucocutaneous bleeding may facili-tate the identication of clinical bleeders and also provide an estimate of the severity of the phenotype. Whether these bleeding assessment tools will have a signicant impact upon the diagnostic denition of VWD remains to be seen, but they may provide a more objective measure of a bleeding tendency that can facilitate the communication between health care professionals.

The issue of when to assign this diagnostic label was initially raised some years ago but a denitive resolution has not been uni-versally accepted(13). The progressive inuence of age on VWF levels (~1% increase per year) makes the diagnosis of type 1 VWD espe-cially challenging in children, in whom exposure to bleeding events may also limit the potential for evaluation of the bleeding phenotype. Recent guidelines have been proposed to facilitate the diagnosis but there will always be individuals in whom the diagnosis is tenuous and may change over time.

Laboratory tests in type 1 VWD(3,5). Its diagnosis requires a panel of standard and VWF specic coagulation tests. Measurement of VWF antigen and function continue to be the most important di-agnostic studies(3-5,14,15). The extreme allelic heterogeneity and lack of identiable candidate mutations in ~35% of type 1 VWD cases makes, in practice and for the moment, the incorporation of genetic testing to assist in making this diagnosis very difcult to justify.

Current VWD diagnostics presents a challenge given the variability of the VWF assays required(5,16). Although the quantitative VWF anti-gen (VWF:Ag) measurements are straightforward, there is not always a clear relationship between VWF:Ag levels and clinical symptoms, par-ticularly with mild decreases in plasma levels. Furthermore, many fac-tors such as ABO blood group, gender, age, hormonal regulation, and inammatory states have been described to have an impact on VWF:Ag levels. The activity of VWF on the other hand is particularly susceptible to preanalytical factors. Altogether these factors signicantly compli-cate the diagnosis of VWD(5). The qualitative VWF ristocetin cofactor activity (VWF: RCo) has remained the standard method for measuring qualitative defects within VWF. Some studies have shown the abnormal VWF sensitivity to ristocetin in individuals with no signicant bleeding problems. In particular, the D1472H single nucleotide polymorphism within the VWF A1 domain associates with low VWF:RCo/VWF:Ag ratios. On the other hand, an overestimate of the VWF:RCo has been described in another P1467S VWF variant, although this also does not seem to have an impact on primary haemostasis in vivo(17).

Sometimes it is difcult to differentiate between type 3 and severe type 1. Considerable efforts have been made to overcome the dis-advantages of the currently available commercial assays(5). Another functional assay, the collagen binding assay (VWF:CB) determines the capacity of VWF to bind collagen(5,18). An optimized VWF:CB depends on the presence of the large molecular weight VWF multi-mers. VWF:CB cannot replace VWF:RCo in VWD diagnostics, but VWF:CB together with VWF:RCo better differentiates patients with VWD types 2A and 2B from 2M. Mutations within the VWF A3 do-main with isolated collagen binding defects contribute to the bleed-ing severity of some patients(5). In this regard VWF:CB is the only

assay to identify the patients with defective collagen binding, it is clear that omitting the VWF:CB assay would lead to missing the dis-ease as these patients present with normal VWF:RCo levels and the full range of VWF multimers. The majority of patients with defects at the collagen-binding site present with bleeding problems, which demonstrates again the importance of the VWF-collagen axis in vivo. A disadvantage of the VWF:CB is that the sensitivity depends on the type of collagen used and its source and the best type of collagen to be used in this method has not been agreed upon(14).

The VWF multimer analysis, ristocetin-induced platelet aggrega-tion (RIPA) and FVIII binding assay (VWF:FVIIIB) are additional VWF assays used for a correct diagnosis of patients with specic VWD types and their treatment(1-3,5,19). VWF multimer analysis is es-sential to distinguish types 2A and 2B from other qualitative VWD types and subtle changes in multimeric banding prole. However, it is time consuming, laborious assay performed only in highly special-ized coagulation laboratories. The differentiation between type 1 and certain forms (most often type 2A) of qualitative VWD variants is not easy in some cases(4,5,19). These distinctions have usually involved dem-onstration of subtly abnormal VWF multimer patterns that have been generated by expert laboratories, but are quite likely to be missed by most routine haemostasis laboratories. Interestingly, when evaluated for VWF mutations as a group, the rate of positivity in these cases is close to 100%. Whether the reclassication of these cases as type 2A variants is clinically useful is debatable, as in most cases, the therapeu-tic approach will still involve an initial trial of desmopressin.

Newer assays(5): In addition, the assay of the VWF propeptide (VWFpp) together with calculation of the VWFpp/VWF:Ag ratio can be used to detect VWD types characterized by altered VWF clearance levels, such as type 1 VWD Vicenza(20). Thrombin-generation capac-ity is also believed to predict the individual bleeding risk in VWD. Thrombin generation is seriously impaired in these patients and al-most absent in type 3 VWD. In addition to the FVIII predominant role in thrombin-generation capacity in VWD there must be other mecha-nisms, independent of FVIII, which explain the bleeding phenotype in this group of patients. Indeed, it has been shown that VWF binding to GPIb, b3, and perhaps v3 is important in the generation of microparticles and platelet-procoagulant activity(5).

FXIIIa has been reported to accentuate platelet recruitment by VWF and collagen. It is clear that reduced levels of these would en-hance the bleeding tendency; however, also enhanced platelet-proco-agulant activity, FXIII, and other proteins such as laminin, thrombo-spondin, FXI, and protein C as well as other thrombophilic markers may contribute to the variability in the clinical expression of VWD as this could, for example, explain the lack of bleeding in some of the type 3 VWD patients. Some factors of endothelial origin, such as nitric oxide and prostacyclin or plasminogen activator release from endothelial cells, participate at the site of vascular injury and may also contribute to variable VWD phenotypes(5).

Clinical and molecular prole of VWD in Spain. Spanish registry (PCM-EVW-ES Project)

As already exposed, a correct diagnosis and classication of von Willebrand disease (VWD) is difcult because of the variability of


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its clinical expression and limitations of laboratory methods, and it is important for therapy and genet-ic counselling. We carried out a survey to investi-gate the situation on VWD in Spain(21). The results showed that several laboratories did not performed some assays such as RIPA, VWF:FVIIIB or VWF multimer assessments. Additionally, the cutoffs used by laboratories to diagnose VWD varied con-siderably. The data obtained supported the develop-ment of a Spanish registry. In fact several European Countries already have their own registry. A main feature of the PCM-EVW-ES is that the analysis of the samples will be centralized in three laboratories that have the experience necessary to achieve a more uniform characterization.

Aim of the study. It is not intended as a preva-lence study nor as a quality assessment of the partici-pant laboratories. The main goals of the study are (i) an assessment of the real diagnosis and therapeutic situation of VWD in Spain in normal clinical prac-tice; (ii) the achievement of a platform of recruited patients with the best possible characterization; (iii) the development of a Spanish Working Group on VWD; (iv) participation in international projects on VWD (European Union VWD Group, Zimmerman Project, Type 3 von Willebrand disease and Interna-tional registries inhibitors prospective study (3WIN-TERS-IPS, Prof. Peyvandi and Prof. Federici); and (v) an elaboration of practical guidelines on diagno-sis and therapy of VWD in Spain.

Partial aims. 1. To ascertain the clinical pro-le of those patients diagnosed with VWD who had been referred to the Spanish centers and were in ac-tive follow-up in 2012. The bleeding score is used to establish the bleeding history. 2. To characterize the diagnosis of types and subtypes up to the most complete hierarchical level, based on the revised and updated classication of VWD. 3. To know the modality of therapy used. 4. To register and analyze any genetic abnormality. 5. To register patients with blood borne diseases, such as HIV, HBV and HCV infected patients, and those undergoing retroviral therapy. 6. Development of alloantibodies against VWF and to evaluate any corresponding treatments. 7. To record the history of major surgeries and types of treatment.

Design and methodology

Sponsor. This study has been partially funded by BAXTER; a national registry in the framework of the Spanish Society of Thrombosis and Haemostasis (SETH) will be created.

Participant centers. 42 centers have agreed to participate in this project (Table 3).

Table 3. Participant centres and principal investigators

Centre City Principal investigator

C. H. U. A Corua A Corua Dr. Javier Batlle/Dra. M.F. Lpez

H. Universitario La Fe Valencia Dra. Ana Cid/Dra. Pilar Casaa

H. Vall dHebron Barcelona Dr. Rafael Parra/Dra. Carme Altisent

H. Virgen de la Macarena Sevilla Dr. Elisa Arbelo Granados

H. Univ. Central de Asturias Asturias Dra. ngeles Fernndez

H. Univ. de Guadalajara Guadalajara Dra. Sonia Herrero Martn

H. Clnico San Carlos Madrid Dra. Mara Paz Maluenda

H. Carlos Haya (Infantil) Mlaga Dra. ngeles Palomo/Dr. A. Contento

H. Ro Hortega Valladolid Dr. L.J. G. Frade/Dra. E. Fontecha

H. Univ. La Paz Madrid Dr. V. Jimnez-Yuste/Dr. J. Verbo

H. General Santa Brbara Soria Dr. Carlos Aguilar

Salud Castilla y Len Segovia Dra. Rosa Mara Fisac

Comunidad de Aragn Zaragoza Dr. Jos Flix Luca

H. Univ. 12 de Octubre Madrid Dra. M. Martn Mola

H. Univ. de Salamanca Salamanca Dr. J.R. Gonzlez Porras

H. Virgen de la Salud Toledo Dr. Jorge Cuesta Tovar

Fundacin Jimnez Daz Madrid Dra. Rosa Vidal

H. Gregorio Maran Madrid Dra. Ana Rodrguez Huerta

H. U. Fundacin de Alcorcn Madrid Dra. Karmele Arribalzaga

C. H. de Jan Jan Dra. M. del Mar Nieto

H. Dr. Negrn Las Palmas Dra. Ignacia Balda

H. Lucus Augusti Lugo Dra. Olga Arija

H. San Pedro de Alcntara Cceres Dra. Nuria Bermejo

H. Virgen del Roco Sevilla Dra. Rosario Prez Garrido

H. Virgen de la Arrixaca Murcia Dr. F. Garca Candel/Dr. M. Moreno

H. Nuestra Sra. de Sonsoles vila Dra. M. Paz Martnez Bads

H. Carlos Haya (Adultos) Mlaga Dra. Eva Mingot/Dr. A. Contento

H. Univ. Son Espases P. Mallorca Dr. Vicente Cortina/Dra. Canaro

H. Joan XXIII Tarragona Dra. Reyes Aguinaco

H. U. Marqus de Valdecilla Cantabria Dra. Carmen Sedano

H. de Jerez Cdiz Dra. Campos

H. Lozano Blesa Zaragoza Dra. Rosa Cornudella

H. Infanta Cristina Badajoz Dra. Nieves Alonso

H. Clnico Universitario S. de Compostela Dra. M.D. Vilario/Dra. S. Prez Crespo

H. Virgen del Camino Pamplona Dra. M. Jos Paloma Mora

H. St. Joan de Deu Barcelona Dra. M. Teresa Toll

H. de Cruces Vizcaya Dra. Gema Irun

H. G. Univers. de Alicante Alicante Dr. Pascual Marco

H. Royo Vilanova Zaragoza Dr. Luis Lpez

H. Barbastro Huesca Dr. Francisco Llinares

H. Severo Ochoa Madrid Dr. Ramn Rodrguez-Gonzlez

H. Ramn y Cajal Madrid Dr. Jess M. Csar


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Study cohort and methodology. Patients of any age previously diagnosed locally with VWD or referred from any hospital depart-ment or from family care that fulll one or more of the following inclusion criteria: 1. VWF:Ag, VWF:RCo and/or VWF collagen binding (VWF:CB) 30 UI/dL (%), observed on two or more oc-casions; 2. Detection of multimeric abnormalities; 3. In case of iso-lated FVIII deciency it will be necessary to provide demonstration of a decreased VWF:FVIIIB; 4. Presence of VWF gene mutations. 5. Presence of RIPA at a low ristocetin concentration. 6. Heterozygous relatives of patients with types 2N or 3 VWD. Exclusion criteria: 1. Presence of any data suggesting acquired von Willebrand syndrome (AVWS). 2. Not willing to sign the informed consent.

The denitive diagnosis is being performed centrally. The Unidad de Trombosis y Hemostasia, S. Haematologa, Hospital U. La Fe. Valen-cia, Spain, is performing the analyses for FVIII, VWF:Ag, VWF:RCo and VWF:CB, while the Servicio de Hematologa, C.H.U. A Corua, Spain, is responsible for the multimeric analysis of VWD using low and high resolution SDS gels and VWF:FVIIIB. Finally, the genetic study by using new generation sequencing methodology (massive se-quencing) of the VWF gene will be carried out in a close future in the Banc de Sang I Teixits, Barcelona, Spain. The deadline for recruitment of patients will be October 31, 2012. It is intended also to enhance the participation in the Type 3 von Willebrand disease and International registries inhibitors prospective study (3WINTERS-IPS).

An interesting challenge observed in this project is that a quite important number of centers do not make RIPA test. This makes dif-cult the distinction between types 2A and 2B, as well as potential pseudo-VWD. For that reason, and according to the suggestion of a multicenter clinical study in addition to the genetic study will be extended to the GPIb gene in such cases(22).

As far as type 1 VWD is concerned, and as expected, several pa-tients historically diagnosed as type 1 VWD, including cases recruited for international projects, such as the MCMDM-1VWD, at the time of recruitment for this registry have VWF levels over 30%. To avoid missing potential information of interest from such patients they are being recruited, but analyzed for the moment as a separate group.

Another interesting observation is related to the distinction be-tween type 1 severe and type 3 VWD. Classically has been accepted that the type 3 VWD phenotype is characterized by undetectable levels of VWF, and FVIII levels that are usually < 10%(4). In 3WIN-TERS-IPS Study currently underway the cut off for recruiting pa-tients is VWF:Ag < 5%. However, in the PCM-EVW-ES Project a VWD patient with VWF:Ag levels of 6% or even some higher, pres-ents a mutation causative for type 3 VWD. This shows that this cut-off between type 1 severe and type 3 is not as sharp as supposed previously. Indeed, the existence of other family members affected by VWD will help in orienting the patient to a type 1 severe. This distinction is important not only from an academic point of view but for genetic counseling.

Conclusions

A more detailed picture of the clinical and laboratory characteristics of VWD type 1 has been provided. However, the challenges for clini-cians to accurately diagnose VWD type 1 in patients with mild bleed-

ing and borderline VWF levels remains. One could argue that, regard-less of the diagnosis made, if the individual exhibits mild bleeding in the presence of low to borderline VWF levels, desmopressin could be of use and should be considered for mild to moderate bleeds. Labora-tories may also benet from future guidelines on test interpretation, and external evaluation of patients with VWD.

AcknowledgementsWe wish to thank to all the participant investigators. We are indebted to Julia

Carnero y Jos Luis Nez, from S. Hematologa del CHUAC, and to Ana Cid,

Pilar Casaa del H. U. Politcnico La Fe de Valencia. This work was supported

by the Fondo de Investigacin Sanitaria, F.I.S. Carlos III, Ministerio de Sanidad,

Spain (FIS PI# 07/0229). Consellera de Innovacin e Industria, Xunta de Gali-

cia (INCITE08ENA916109ES, INCITE09E1R916138ES, IN845B-2010/188).

We express our deep acknowledgement to Baxter Bioscience, Spain for the kind

support and help in the development of the PCM-EVW-ES project.

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Evolucin de las tecnologas de secuenciacin del DNA

Desde que en 1977 Maxam y Gilbert(1) y Sanger(2) desarrollaran sendos mtodos para secuenciar el DNA, la investigacin basada en estas me-todologas ha permitido un desarrollo acelerado de la gentica humana y del diagnstico molecular. El mtodo de Sanger, que nalmente se impuso por su mayor simplicidad, posibilidad de automatizacin y pre-cisin en la secuencia proporcionada, ha sido considerado durante aos como la tcnica de referencia para la deteccin de variantes y mutacio-nes en genes de inters clnico como los causantes de trastornos mo-nognicos, polignicos y multifactoriales. A mediados de los ochenta, del estudio de los genes se pas al estudio del genoma gracias a un am-bicioso proyecto internacional, conocido como Proyecto Genoma Hu-mano (PGH), cuyo objetivo era secuenciar y cartograar el genoma de nuestra especie. Fueron necesarios 13 aos y ms de 2.800 cientcos para completar semejante empresa. Sin embargo, desde el ao 2005 se ha producido una autntica revolucin en las tcnicas de secuenciacin con la aparicin de las plataformas de secuenciacin masiva o NGS (del trmino en ingls Next-Generation Sequencing). A partir de ese ao, empiezan a estar disponibles en el mercado una serie de platafor-mas NGS de diferentes fabricantes (Roche/454 Life Sciences, Illumina Genome Analyzer y SOLiD System de Life Technologies) cuyo ren-dimiento es muy superior al de la secuenciacin tradicional y a un coste

muy inferior. Estas tecnologas se fundamentan en diversas estrategias y dieren en aspectos como la longitud de lectura y el nmero de mo-lculas de DNA que son capaces de secuenciar en paralelo, represen-tando efectivamente una segunda generacin en la secuenciacin del DNA(3). Como ejemplo de ello, cabe sealar que la aplicacin en 2008 de una de estas plataformas a la secuenciacin de un genoma humano permiti obtener, en tan slo unos meses, resultados comparables a los alcanzados por el PGH(4). Irremisiblemente la aplicacin ms extendida de la NGS ha consistido en la secuenciacin de genomas con el obje-tivo de profundizar en el conocimiento acerca de cmo las diferencias genticas afectan a la salud y provocan la enfermedad. De hecho, gra-cias a estas y otras tecnologas de anlisis masivo, en los ltimos aos se han podido emprender grandes proyectos en genmica humana in-cluyendo el Proyecto 1000 Genomas (http://www.1000genomes.org), cuyo objetivo es establecer un catlogo exhaustivo de la variabilidad gentica humana a nivel poblacional. Pero esta revolucin tecnolgi-ca est lejos de haberse detenido y ello queda patente en la continua reduccin de los costes, la simplicacin en la metodologa de trabajo y el aumento en la capacidad y velocidad de secuenciacin. Todo ello pone de relieve su extraordinario potencial como tecnologa alternativa y/o complementaria a la secuenciacin tradicional en una de sus aplica-ciones ms prometedoras: el diagnstico de enfermedades hereditarias y la identicacin de los factores genticos de riesgo en enfermedades complejas.

Nuevas perspectivas en la gentica y el diagnstico molecular de la enfermedad de von Willebrand

F. Vidal Prez, I. Corrales InsaUnitat de Diagnstic i Terpia Molecular. Coagulopaties Congnites. Banc de Sang i Teixits. Barcelona

ABSTRACTNext Generation Sequencing (NGS) refers to technologies that do not rely on traditional Sanger dideoxy-nucleotide sequencing method. These new technologies have transformed genomic investigation by reducing the cost of sequencing and increasing the throughput. Nevertheless, current challenge for NGS technologies is their migration to the routine clinical use that will enable the identication of causative mutations for rare genetic disorders through targeted genome rese-quencing in a high-performance way, dramatically changing the scenario in molecular diagnosis of genetic diseases. The autosomal von Willebrand factor gene (VWF) is large and highly polymorphic, and there is a highly homologous (> 96%) partial pseudogene in chromosome 22. Because of these difculties, application of genetic analysis of VWD by VWF sequencing to the clinical routine has been considerably delayed and only in recent years a number of approaches based on traditional Sanger method have been developed. To take advantage of NGS technology for molecular diagnosis of VWD, we designed two strategies for VWF enrichment and multiplexing based on short- and long-range PCRs for fast, low-cost characterization of a large number of samples. Both approaches have been adapted and tested on an Illumina Genome Analyzer. A proof-of-concept study has resulted in high-performance molecular characterization and demonstrated the feasibility that candidate regions can be simultaneously sequenced in a large number of patients with VWD, establish-ing the basis for performing large-scale molecular studies in the affected population. More importantly, we found that by pooling patient genomic DNA before PCR enrichment, indexing samples with barcode tags, and re-sequencing on the NGS instrument, at least 350 VWD patients per run can be simultaneously analyzed in a fast, inexpensive manner. Moreover, innovative approaches such as microuidics technology and the new bench top NGS systems could improve the performance and capacity of our procedure and, therefore, are also explored by introducing slight modications to our current protocol. This approach takes on special meaning today since there is ongoing a national epidemiological study for VWD that can benet from reduced sequencing costs. Moreover, for this study, high-throughput molecular diagnosis will enable more intense investigation in the pathophysiological mechanisms of VWD in correlation with molecular defects. In conclusion, our experience shows that, even with the existing difculties, individual researchers can use NGS as a research tool with condence and ease. Certainly the molecular diagnosis by NGS of congenital coagulopathies linked to large genes (eg, VWD or hemophilia A) and other monogenic diseases could become a routine diagnostic reality in the near future.


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Aplicacin de la NGS al diagnstico molecular

La secuenciacin sistemtica de los genes implicados en enfermeda-des mendelianas es la estrategia habitualmente empleada para iden-ticar las mutaciones responsables en enfermedades monognicas o factores de riesgo en enfermedades complejas(5). Sin embargo, el coste de la secuenciacin tradicional, basada en el mtodo de Sanger, sigue siendo un grave obstculo para muchas aplicaciones diagnsticas, y el desarrollo y optimizacin de soluciones moleculares rentables para apoyar el diagnstico clnico siempre son bien acogidos. Con la introduccin de las nuevas plataformas de secuenciacin masiva, el horizonte en el diagnstico molecular ha cambiado radicalmente(3). Adems, a medida que evolucionen las tecnologas de NGS, el diag-nstico gentico se podr ampliar desde enfermedades monognicas simples a enfermedades ms complejas y heterogneas genticamen-te. Sin embargo, y a pesar de que la NGS es superior a la secuencia-cin tradicional de Sanger para muchas aplicaciones, todava existen pocos ejemplos de su uso efectivo en el diagnstico de rutina(6,7). Esto es debido en parte a que todas las plataformas fueron concebidas ori-ginalmente para secuenciar genomas y ste no suele ser el objetivo en aplicaciones de diagnstico molecular. Su capacidad para secuenciar genomas completos les otorga un potencial que an hoy resulta difcil de explotar para su aplicacin al diagnstico de rutina, pero cuando el objetivo se centra en el estudio de un gen, grupo de genes o regin genmica, el enriquecimiento de las regiones de inters permite su estudio en una gran cantidad de muestras simultneamente. Se han desarrollado y probado diversas estrategias de enriquecimiento(8), in-cluyendo PCR de largo alcance (LR-PCR), secuenciacin de ampli-cones, captura de genes mediante arrays (por ejemplo, Nimblegen), captura de genes en solucin (p. ej., Agilent SureSelect) y otros enfo-ques (p. ej., Raindance). Tras el enriquecimiento, uno de los desafos ms importantes en la aplicacin de las plataformas NGS al diagns-tico gentico de rutina es conseguir discriminar la informacin de un gran nmero de muestras de diferentes pacientes secuenciadas en pa-ralelo(11). Para abordar esta cuestin se pueden hacer divisiones fsicas sobre el soporte del secuenciador y/o indexar las diferentes muestras con un cdigo de barras molecular (secuencias cortas aadidas a los extremos de los fragmentos durante la PCR)(9). Una alternativa recientemente desarrollada, basada en la tecnologa de microuidos (FluidigmTM Access Array), se ha mostrado como una excelente he-rramienta para construir libreras de muestras individualizadas ya que permite aadir estas etiquetas moleculares durante el proceso de am-plicacin (48 muestras simultneamente) a un precio muy econmi-co(10). Esto es particularmente signicativo ya que la preparacin de la librera es uno de los pasos ms costosos en el procedimiento de preparacin de muestras para la NGS.

Otra aproximacin planteada como alternativa para el diagnstico molecular de rutina es la secuenciacin de exomas, es decir, la secuen-ciacin selectiva de los exones o regiones codicantes que constitu-yen alrededor del 1,5% del genoma completo. Este enfoque es muy adecuado, especialmente en el estudio de enfermedades de herencia mendeliana, ya que la mayora de las mutaciones responsables se en-cuentran en los exones. Sin embargo, existen dos importantes argu-mentos contra el uso de esta aproximacin en el diagnstico gentico. El primero es que la aplicacin de la NGS al exoma sigue siendo cara en comparacin con el anlisis mediante secuenciacin tradicional de

Sanger de una enfermedad con uno o pocos genes responsables. El segundo problema es una cuestin tica ya que la secuenciacin inte-gral de exomas no slo permite identicar la mutacin causante de la enfermedad, sino que tambin puede revelar mutaciones causantes de otras enfermedades monognicas o factores genticos de riesgo para enfermedades complejas. Una solucin a este problema podra ser descartar (no analizar) los datos de secuencia no necesarios para el diagnstico preciso de la enfermedad especicada.

Finalmente, es destacable que, desde la aparicin de las primeras plataformas de NGS, se han producido una serie de avances tecnol-gicos relacionados con mejoras en la qumica de secuenciacin y la introduccin de nuevas metodologas para la deteccin de las seales. Estas mejoras se han incorporado a las nuevas plataformas de NGS en el mercado a partir del ao 2010 (GS Jnior System, Ion Torrent PGM o MiSeq Personal Sequencer). Esta nueva generacin de secuenciadores de sobremesa, ms pequeos y econmicos, cuenta con protocolos ms sencillos y automatizados para la preparacin de las muestras y con un anlisis de datos simplicado(11). Por otra parte, en alguna de estas pla-taformas ya no se utiliza uorescencia o quimioluminiscencia en la lec-tura de la secuencia de DNA. ste es el caso de Ion Torrent PGM, capaz de detectar protones liberados tras la adicin secuencial de nucletidos no marcados. Todo lo anterior representa una disminucin signicativa de los costes que convierte a las nuevas plataformas en equipos ms apropiados para realizar un diagnstico molecular de bajo coste con un ujo de trabajo totalmente automatizable, lo que situara a la NGS en excelentes condiciones para su completa transicin a la clnica.

Diagnstico molecular de la enfermedad de von Willebrand

La enfermedad de von Willebrand (VWD) es la coagulopata congni-ta ms frecuente en la poblacin general(12). Se transmite con carcter autosmico dominante o, menos frecuentemente, recesivo, e impide la adhesin y la agregacin plaquetaria. El diagnstico molecular de la VWD se ha visto seriamente comprometido debido al gran tamao y complejidad del gen (52 exones distribuidos a lo largo de 178 kb), a que es muy polimrco y contiene una regin homloga en ms de un 96% a un pseudogn parcial situado en el cromosoma 22(13). Debido a estas dicultades, durante aos el estudio molecular de la VWD se ha limita-do a la investigacin bsica y su aplicacin en la prctica clnica habitual se ha retrasado signicativamente. Aunque en los ltimos aos han apa-recido algunos mtodos que permiten la determinacin de la secuencia del gen del VWF (VWF)(14,15), el coste de la secuenciacin tradicional basada en el mtodo de Sanger sigue siendo un serio obstculo para la generalizacin del diagnstico molecular. Con el objetivo de paliar estos inconvenientes, en los ltimos aos hemos diseado y desarrollado dos estrategias o aproximaciones para abordar de manera integral un diag-nstico molecular de la VWD de mxima calidad y alto rendimiento.

Diagnstico molecular basado en secuenciacin tradicional

Partiendo de la experiencia previa del laboratorio en el diagnstico de las hemolias A y B, se dise e implement un procedimiento rpido


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y sencillo que nos permitiera identicar las mutaciones responsables de la VWD mediante secuenciacin directa del VWF(16). Para ello, se seleccionaron oligonucletidos especcos capaces de amplicar los 52 exones del gen y las regiones intrnicas anqueantes bajo las mis-mas condiciones de termociclado, evitando al mismo tiempo la am-plicacin del pseudogn homlogo. Los productos de amplicacin son posteriormente puricados y secuenciados mediante secuenciacin tradicional en un procedimiento altamente optimizado y automatizado. Con la aplicacin de esta tcnica hemos podido estudiar un signicati-vo nmero de familias y se han identicado las mutaciones responsa-bles en un elevado porcentaje de los casos. Muchas de ellas no se ha-ban descrito previamente en la literatura. La evolucin de los estudios moleculares realizados y los resultados obtenidos se puede consultar a travs del registro VWFdb@Hemobase (http://www.vwf.hemobase.com)(17). Se trata de un procedimiento validado para su aplicacin a la rutina del laboratorio de diagnstico molecular e idneo para la carac-terizacin de mutaciones en el VWF de manera individualizada(16).

Secuenciacin masiva

Por otro lado, con el objetivo de aprovechar el potencial de las pla-taformas de NGS para el diagnstico molecular de la VWD, hemos diseado y desarrollado un procedimiento que permite el estudio de un gran nmero de muestras de pacientes y familiares de forma rpida y econmica. Para examinar la viabilidad del proyecto planteado ini-ciamos un estudio piloto para evaluar dos estrategias que parten del enriquecimiento de la regin de inters mediante: a) la amplicacin del 70% del total del locus del VWF mediante un nuevo protocolo de 14 LR-PCRs (Long Range-PCR) con tamaos de entre 5 y 9,5 kb; b) la amplicacin mediante PCRs cortas de los exones y las regiones intrnicas anqueantes del VWF segn la metodologa previamente desarrollada en nuestro laboratorio(16) y detallada en el apartado ante-rior. Tras la secuenciacin en la plataforma Illumina Genome Analy-zer, los resultados obtenidos indican que ambas estrategias ofrecen una buena cobertura de las regiones amplicadas y que permiten identicar tanto las mutaciones como los polimorsmos presentes en las muestras utilizadas como controles. Mediante la amplicacin por LR-PCR se identicaron, adems, entre 20 y 30 nuevas variaciones en regiones intrnicas que no se haban descrito previamente como polimorsmos. Por otro lado, la estrategia basada en LR-PCRs im-plica ciertas dicultades tcnicas durante la amplicacin y norma-lizacin, y la informacin adicional que proporciona todava resulta difcil de interpretar con el conocimiento que tenemos actualmente sobre la siopatologa de la enfermedad. Por estos motivos, se opt por la estrategia de PCRs cortas a la hora de llevar a cabo una prueba de concepto para el anlisis simultneo de 40 pacientes con VWD. Todos los pacientes fueron previamente clasicados en los diferentes tipos de VWD de acuerdo con sus caractersticas clnicas y siguiendo los criterios de clasicacin actualmente vigentes(18).

En todas las plataformas de NGS, una vez normalizados y fragmen-tados los productos de amplicacin, es necesario un paso previo a la secuenciacin, que es tambin uno de los ms costosos en el proceso ge-neral de la NGS: la elaboracin de las libreras. Este proceso consiste en la unin de adaptadores a los extremos de los fragmentos analizados para su posterior jacin, amplicacin y secuenciacin. As, cuando el estu-

dio fue concebido y con el objetivo de minimizar los costes, ideamos una estrategia para reducir el nmero de libreras necesarias: se mezclaron, a concentraciones equimolares, los DNAs genmicos de 5 pacientes y se realiz la amplicacin del VWF por PCR convencional a partir de cada mezcla de DNAs. El resultado, despus de la normalizacin de las PCRs resultantes, fue la obtencin de 8 tubos, cada uno de ellos representando el VWF de 5 pacientes. Asimismo, durante la construccin de las libreras se aadi una etiqueta molecular diferente para cada mezcla de PCRs con el objetivo de poder secuenciar todas las muestras en una misma divisin del soporte del secuenciador y poder discriminarlas posterior-mente en el anlisis bioinformtico. De este modo, se secuenci el VWF de 40 pacientes de forma simultnea utilizando 1/8 de la capacidad del secuenciador y reduciendo los costes de forma signicativa. El anlisis de las secuencias obtenidas para cada mezcla de 5 pacientes permiti la identicacin de un nmero variable de potenciales mutaciones que fue-ron validadas y asignadas a cada paciente por secuenciacin tradicional del exn correspondiente en todos los pacientes incluidos en el mismo tubo(19). Los resultados obtenidos y las mutaciones identicadas se pue-den consultar asimismo en el registro VWFdb@Hemobase. Como ya se ha comentado, en el diseo fue prioritario minimizar el nmero de libre-ras construidas para reducir el coste nal del proceso. Con el abordaje descrito, slo es necesaria una librera para cada 5 pacientes, ya que estas muestras experimentan una amplicacin simultnea. Ahora bien, esta solucin tiene el inconveniente de que la agrupacin de DNA genmico antes de la amplicacin resulta en una prdida de la informacin de los polimorsmos presentes en el VWF de cada paciente. Sin embargo, innovadores enfoques ahora disponibles, como la mencionada tecnologa de microuidos, permiten obtener esta informacin ya que posibilitan la construccin de libreras individualizadas aadiendo una etiqueta mole-cular a cada muestra(10). Esta alternativa tambin ha sido explorada en nuestro laboratorio a travs de la introduccin de ligeras modicaciones en el protocolo descrito para PCRs cortas, y los resultados estn siendo evaluados en la actualidad.

Balance de los resultados: secuenciacin tradicional vs. NGS

De nuestro trabajo se desprende que la NGS puede ayudarnos a superar las limitaciones de los procedimientos de secuenciacin tradicional para el estudio de genes grandes y complejos como el VWF en un gran nmero de muestras de forma simultnea. Desarrollar este tipo de estudio por secuen-ciacin tradicional con similar nmero de muestras habra signicado una tarea formidable en cuanto a volumen de trabajo, tiempo y dinero. Bajo nuestro punto de vista, ambas tecnologas (tradicional y masiva) pueden tener su espacio en el diagnstico molecular de la VWD ya que permiten ofrecer diferentes respuestas segn las necesidades. Por un lado, la se-cuenciacin tradicional ofrece un diagnstico rpido y de elevada calidad, mientras que la NGS permite el estudio de un gran nmero de pacientes de forma simultnea y a un coste muy reducido. Esto es especialmente relevante a la hora de plantear estudios epidemiolgicos poblacionales. En este sentido, es destacable la existencia del proyecto Perl clnico y molecular de pacientes con EVW: registro espaol, cuyo objetivo es establecer un registro nacional para la VWD en Espaa. La mayora de los hospitales espaoles participan en la recogida de datos, diagnstico y seleccin de los pacientes. La lgica evolucin del proyecto pasa por la


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realizacin del estudio gentico de gran nmero de estos pacientes y fami-liares, y la secuenciacin del VWF mediante plataformas NGS facilitar en gran medida la consecucin de los objetivos del registro nacional.

Finalmente, es necesario sealar que los resultados derivados de la NGS requieren del uso de un potente software analtico(20,21), esen-cial para procesar la gran cantidad de datos generados, identicar va-riaciones en el VWF y realizar estudios de poblacin para determinar si las diferencias genticas particulares podran ser responsables del sndrome hemorrgico. Los estudios realizados hasta la fecha nos han permitido establecer la mejor estrategia para el anlisis de la secuen-cia de un gran nmero de muestras en paralelo. Sin embargo, uno de los mayores desafos de la NGS sigue siendo la simplicacin del proceso de identicacin de la mutacin a partir de la enorme canti-dad de datos generados y su aplicacin en el laboratorio de rutina por personas sin una formacin bioinformtica excepcional.

Conclusiones

Los estudios realizados en nuestro laboratorio mediante tecnologas de NGS demuestran la potencialidad de estas herramientas en la caracteriza-cin molecular de alto rendimiento de pacientes y familiares con VWD. Ello sienta las bases para realizar estudios epidemiolgicos multicntricos en VWD que ayudarn a establecer la contribucin real a la enfermedad de cada variacin gentica, dilucidar los mecanismos que intervienen en el curso clnico y proporcionar resultados interesantes para la mejor comprensin de la base gentica de esta afeccin. Las correlaciones en-tre genotipo y fenotipo incrementarn la informacin de utilidad para el tratamiento y el consejo gentico de los pacientes. Adems, ofrecern la posibilidad de profundizar en el estudio de mutaciones concretas que brin-den informacin acerca de algunos de los mecanismos bsicos implicados en la siopatologa de la VWD. Todo ello teniendo siempre en cuenta que la complejidad de la VWD requiere, para su correcta administracin y diagnstico preciso, de una exhaustiva evaluacin fenotpica y genotpica llevada a cabo por profesionales con amplia experiencia clnica y de labo-ratorio(22). Finalmente, hay que sealar que, incluso con las limitaciones existentes, el diagnstico molecular mediante NGS de las coagulopatas congnitas causadas por mutaciones en genes grandes (como la hemolia A o la VWD), al igual que para otras enfermedades monognicas, ser una realidad en el diagnstico de rutina en un futuro cercano.

AgradecimientosEste proyecto ha sido nanciado en parte por el Fondo de Investigaciones Sa-

nitarias (PI080385) del Ministerio de Ciencia e Innovacin y por el Programa

Nacional de Proyectos de Investigacin Aplicada (IAP-580000-2008-20) del

Ministerio de Industria, Turismo y Comercio. Asimismo, agradecemos a la

Fundaci Privada Catalana de lHemoflia la nanciacin de este proyecto.

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Introduccin

El tratamiento de la enfermedad de von Willebrand (EvW) tiene dos objetivos. El primero es corregir el defecto en la adhesin y agrega-cin plaquetaria consecuencia de los niveles bajos o la disfuncin del factor von Willebrand (FvW). El segundo es normalizar el trastor-no de la hemostasia que la disminucin en los niveles de factor VIII (FVIII) induce en estos pacientes.

El tratamiento gira en torno al uso de frmacos antibrinolticos, desmopresina (DDAVP) y concentrados de FvW/FVIII derivados del plasma. El arsenal de frmacos se completa con el uso de estrgenos/progestgenos o incluso la transfusin de plaquetas segn la situacin clnica del paciente.

En las prximas lneas revisaremos las caractersticas de los fr-macos capaces de elevar los niveles de FvW, desmopresina y los con-

centrados de factor disponibles en el mercado. Posteriormente anali-zaremos la evidencia existente con respecto a esquemas concretos de tratamiento segn las diversas situaciones clnicas

Desmopresina y concentrados de factor

Desmopresina

Caractersticas generales

La desmopresina (DDAVP) es un agente hemosttico efectivo en la mayora de los pacientes con EvW, hemolia A leve o trombopatas. Se trata de un anlogo sinttico de la vasopresina endgena. Su es-tructura qumica, 1-desamino-8-D-arginina vasopresina resulta de la

Manejo y tratamiento del paciente con enfermedad de von Willebrand

M.E. Mingot Castellano Servicio de Hematologa. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Mlaga

RESUMENEl objetivo del tratamiento en la EvW es el control o prevencin de episodios hemorrgicos. Los pilares bsicos del tratamiento de la enfermedad de von Willebrand (EvW) son los frmacos antibrinolticos, la desmopresina y los concentrados de factor von Willebrand/factor VIII (FvW/FVIII). Estos frmacos logran el efecto hemos-ttico deseado por dos vas. La primera es corregir el defecto en la adhesin y agregacin plaquetaria consecuencia de los niveles bajos o la disfuncin del factor von Willebrand (FvW). La segunda es normalizar el trastorno de la hemostasia ocasionado por la disminucin en los niveles de factor VIII (FVIII) en estos pacientes. Otras medidas teraputicas son la transfusin de plaquetas en sangrados severos no controlados y el uso de terapia hormonal en mujeres con EvW y metrorragia.En el caso de los frmacos antibrinolticos y la desmopresina no existen estudios aleatorizados y prospectivos que analicen su ecacia Su efectividad viene avalada por la experiencia clnica de largos aos. La desmopresina es el tratamiento de eleccin en los pacientes con EvW de tipo1. Previo al uso de desmopresina se recomienda la realizacin de un test de prueba. Puede ser utilizada en mujeres embarazadas y nios mayores de 3 meses. No est clara su ecacia en caso de menorragia. Los concentrados de FvW/FVIII han demostrado una ecacia en tratamientos a demanda cercana al 80%. Se recomienda su uso en sujetos con EvW no respondedores a desmopresina o en aquellos casos en los que existe contraindicacin del uso de la misma o una respuesta inadecuada (taquilaxia). En general los pacientes con EvW reciben tratamiento a demanda o en prolaxis ante cirugas. Existe escasa experiencia en el uso de esquemas de prolaxis en estos pacientes. Los resultados son alentadores en caso de sujetos con sangrados digestivos, epistaxis, menorragia y hemartros severos.

ABSTRACTThe aim of treatment in von Willebrand disease (VWD) is to control and to prevent bleeding episodes. Antibrinolytic drugs, desmopressin (DDAVP) and von Wil-lebrand factor/factor VIII (VWF/FVIII) concentrates are the most important tools to get this objective. These drugs achieve the haemostatic effect by the correction of platelet adhesion and aggregation defect due to low levels or dysfunction of von Willebrand factor (vWF). In the case of DDAVP and VWF/FVIII concentrates, there is one more mechanism. They normalize the coagulopathy of these patients caused by the decrease in factor VIII (FVIII) plasma levels. Other therapeutic options are platelet transfusion in severe uncontrolled bleedings and the use of hormone therapy in women with VWD who suffer from menorrhagia.In the case of antibrinolytics and desmopressin there are no prospective randomized studies to analyze their effectiveness. Their use is supported by the clinical experience throughout the years. Desmopressin is the choice of treatment in patients with type 1 VWD. Prior to the use of DDAVP it is recommended a trial test. Desmopressin can be used in pregnant women and children over 3 months old. Its effectiveness is unclear in menorrhagia. Concentrates of VWF/FVIII have dem-onstrated an efcacy round 80% on demand scheme of treatment and surgery. They are recommended in patients with VWD who do not respond to DDAVP, or where it is contraindicated, or an inadequate response is obtained (tachyphylaxis).There is little experience on prophylaxis scheme of treatment in these patients. Results are encouraging in patients with gastrointestinal bleedings, epistaxis, menorrhagia and severe haemarthrosis.


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sustitucin en posicin 8 de una L-arginina por una D-arginina y de la sustitucin de una homocistena por cido -mercaptopropinico. Estos cambios aumentan su actividad antidiurtica y disminuyen la vasopresora. Por tanto, uno de los primeros conceptos a recordar es que el uso de DDAVP no genera vasoconstriccin, ni contraccin ute-rina o de la musculatura lisa del tubo digestivo.

La metabolizacin de la desmopresina es ms lenta que la de la vasopresina y tiene lugar a nivel renal y heptico(1). No existen datos que justiquen el ajuste de dosis en pacientes con insuciencia de estos rganos. Se excretan mnimas cantidades en leche materna, pero no es viable la absorcin oral, por lo que no supondra un riesgo para el neonato(2). Pese a ello, en la cha tcnica se desaconseja su uso en mujeres durante la lactancia y en nios menores de 3 meses.

Mecanismo de accin

La desmopresina induce un rpido incremento en los niveles de FvW y FVIII. El incremento de los niveles de FvW se produce por un au-mento en la secrecin de FvW endgeno, ya que no se incrementa la sntesis. La sntesis de FvW tiene lugar en distintos tipos de clu-las. Entre ellas destacan los megacariocitos y las clulas endoteliales, siendo estas ltimas la principal fuente de FvW plasmtico(3). En las clulas endoteliales los multmeros de alto peso molecular (HMWM, high molecular weight multimer) del FvW son almacenados en los cuerpos de Weibel-Palade junto con la molcula de propptido de FvW (FvWpp, FvW propeptide). Desde all se secretan en presencia de trombina, brina o histamina. A da de hoy, no existe una explica-cin clara para el incremento de los niveles de FVIII(4).

Existen dos clases de receptores de la vasopresina: V1 (RV1) y V2 (RV2). Los RV1 intervienen en la contraccin de la bras musculares lisas de la circulacin perifrica y el metabolismo de la glucosa de los hepatocitos. Los RV2 regulan la absorcin de agua a nivel renal. La desmopresina es un potente agonista de los RV2 y carece de efecto sobre RV1. Por este motivo la retencin hdrica y la hiponatremia son efectos adversos a prevenir durante el uso de DDAVP.

La desmopresina ejerce un efecto vasodilatador que induce una rubefaccin y leve hipotensin tras su uso, as como cefaleas. Este efecto se produce como consecuencia de un aumento en la sntesis de xido ntrico mediada por RV2.

La desmopresina aumenta la adhesin plaquetaria. Este fenmeno no parece ser consecuencia directa del aumento de FvW plasmtico sino del plaquetar. Est mediado por glicoprotenas (GP) de membra-na como la GP IIb/IIIa(5).

La desmopresina aumenta la liberacin de activador tisular del plasmingeno (t-PA, tisular plasminogen activator), pero la mayora de la plasmina generada se une a -2-antiplasmina, no siendo necesa-ria la administracin de antibrinolticos concomitante a DDAVP(6).

Administracin y dosicacin

Podemos administrar la desmopresina va intravenosa, subcutnea o inhalada. Las dosis y los tiempos de respuesta ser reejan en la Tab-la 1. No se recomienda ms all de 3 das de tratamiento. En caso de ser necesario alargar el periodo de administrar DDAVP,

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