Enantiomerentrennung und CE - uni-muenster.de · Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese...

Enantiomerentrennung und CE

Que

lle: w

ww

.qua

rks.

de

Praktikum „Arzneimittelanalytik, Drug Monitoring, Toxikologie und umweltrelevante Untersuchungen“- Pharmazie, 8. Semester -

Wahlmodul „Medizinische Chemie“- M.Sc. Chemie/Lebensmittelchemie/Wirtschaftschemie -

http://www.quarks.de

http://www.quarks.de

Enantiomerentrennung und CE WS 2010/2011

Enantiomerentrennung von Arzneistoffen

2

Bilderquellen: http://www.wikipedia.de http://www.kapillarelektrophorese.de/

Stereochemische Betrachtung von Arzneistoffen

1.1. Geschichte der Stereochemie

1.2. Nomenklatur von Isomeren

1.3. Eigenschaften von Enantiomeren

1.4. “enantiomeric excess”

1.5. Beispiele von chiralen Arzneistoffen

Trennung von Enantiomeren

2.1. Enantiomerenanalytik

2.2. Indirekte Enantiomerentrennung

2.3. Direkte Enantiomerentrennung

Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese (CE)

3.1. Wiederholung: Grundlagen der CE

3.2. Chirale Selektoren in der CE

3.3. Praktikumsaufgabe: Ofloxacin

http://www.kapillarelektrophorese.de

http://www.kapillarelektrophorese.de



3

1815 J.B. Biot

Rotation von linear polarisiertem Licht in α-Quarz

1848 L. Pasteur Trennung von Weinsäureenantiomeren

1874 Van`t Hoff / Le Bel Asymmetrisches C-Atom, Tetraedermodell

1938 E. Fischer Konfiguration der (+)-Glucose

1966 R.S. Cahn, C. Ingold, V. Prelog R/S Nomenklatur

Gil-Aviv

Gaschromatographische Trennung

1.1. Geschichte der Stereochemie

L. Pasteur

van‘t Hoff

Le Bel

E. Fischer

J.B. Biot

Bilderquelle: www.wikipedia.de



4

1.2. Nomenklatur von Isomeren

Konstitutionsisomere(optisch inaktiv)

Atropisomere meso-Verbindungen(optisch inaktiv)

Anomere(optisch aktiv)

Epimere(optisch aktiv)

Diastereomere

Stereoisomere

(Struktur-)Isomere

Enantiomere(optisch aktiv)



5

1.3. Eigenschaften von Isomeren

‣ Identische chemische und physikalische Eigenschaftengegenüber achiralen Medien - Schmelzpunkt - spektroskopische Eigenschaften (UV, IR, Fluoreszenz, NMR) - pKa/pKb-Werte, Redoxpotential, Nucleophilie...

‣ Unterschiedliche Eigenschaften gegenüber chiralen Medien - linear polarisiertes Licht (Drehwertbestimmung im Polarimeter) - chemische Umsetzungen mit chiralen Reagenzien - Wichtig für Arzneistoffe: Wechselwirkungen mit Proteinen



6

ee (%) = ----------------- x 100( E1 – E2 )

( E1 + E2 )

E1 = Konzentration des Enantiomers 1E2 = Konzentration des Enantiomers 2

Was sagt mir eine „ee“ – Angabe?

ee = 0% bedeutet: Es liegt ein Racemat (50:50) vor!

ee = 100% bedeutet: Die Substanz ist enantiomerenrein!

ee = 90% bedeutet: Es liegt ein 95:5 – Gemisch zweier Enantiomere vor!

1.4. Enantiomerenüberschuß (enantiomeric excess)



7

1.5.1. Chirale Arzneistoffe in Organismus

‣ Pharmakodynamische Unterschiede(Wechselwirkungen mit Enzymen, Rezeptoren, Ionenkanälen...)

‣ Pharmakokinetische Unterschiede(Proteinbindung, Metabolisierung und Verteilung)

Eutomer

Distomer

z.B. Rezeptor

z.B. Rezeptor

‣ ca. 80 % der synthetischen chiralen Arzneistoffe sind als Racemat im Handel

‣ 98% der semisynthetischen oder natürlich vorkommenden AS sind enantiomerenrein im Handel

Enantiomerentrennung und CE WS 2010/2011 8


1.5.1. Chirale Arzneistoffe in Organismus

Pharmakokinetische Unterschiede bei der Metabolisierung von Warfarin

‣ das (S)-Eutomer unterliegt einer schnelleren Biotransformation‣ Fluconazol bindet am selben CYP-Enzym als Inhibitor

active sites. With the absence of basic residues in the active site ofCYP2C9, the selectivity of these proteins may lie elsewhere, suchas the substrate-access channel in which Lys 72 in CYP2C9 issubstituted with a glutamate in CYP2C19.CYP2C9 catalyses the 6- and 7-hydroyxlation of the active

enantiomer of warfarin, S-warfarin, to inactive metabolites16,17. Toexplore the molecular basis of drug binding we have determined thecrystal structure of CYP2C9 complexed with S-warfarin. S-warfarinlies in a predominantly hydrophobic pocket lined by residuesArg 97, Gly 98, Ile 99, Phe 100, Leu 102, Ala 103, Val 113, Phe 114,Asn 217, Thr 364, Ser 365, Leu 366, Pro 367 and Phe 476. Morespecifically, the phenyl group of S-warfarin packs against the sidechains of Phe 476 and Phe 100 and also contacts Pro 367 (Fig. 2).Although the binding of S-warfarin to CYP2C9 appears not toinduce major conformational changes within the protein, somelocal rearrangements are observed. For example, the presence ofthe compound has slightly displaced the loop containing residues474–478 by 0.5–1.5 A. The side chain of Phe 476, which showedconformational mobility in the substrate-free structure, forms api-pi stacking interaction with the S-warfarin phenyl group. Thebicyclic scaffold of S-warfarin alsomakes van derWaals contact withthe side chains of Ala 103, Phe 114 and Pro 367 (Fig. 2). Hydrogenbonding interactions are observed between carbonyl oxygen atomsof the warfarin and backbone amide nitrogen atoms of Phe 100 andAla 103 (Fig. 2). The position of the warfarin molecule places thepotential site of hydroxylation about 10 A from the haem iron(Fig. 3). This is consistent with spectroscopic analysis performed insolution, which detected only a small increase in the high spincontent of the oxidized protein when S-warfarin was added,indicating that the haem is unperturbed.Although many of the residues lining the warfarin-binding

pocket have been shown by mutagenesis to alter the catalyticproperties of CYP2C9 (refs 9, 18), this region had not beenpreviously identified as a ligand-binding site. The large active site(approximately 470 A3) and the lack of significant conformationalchange on compound binding raises the intriguing possibility foradditional small molecules to simultaneously bind within the activesite. When bound in this orientation and location, the S-warfarinmolecule is believed to be too distant for the hydroxylation to occur,suggesting that the compoundmoves from this primary recognitionsite towards the haem to facilitate catalysis. We speculate that sucha two-step conformational movement may be triggered by anelectron-transfer-driven conformational change within CYP2C9,perhaps on reduction of the haem iron or interaction with theelectron-transfer partner, cytochrome P450 reductase19,20. The

redox state of the iron is unknown; the starting material used forcrystallization was oxidized protein, but we cannot discount partialreduction of the haem iron by X-rays during data collection21. It isalso possible that some ligands that bind in the warfarin-bindingpocket are unable to move closer to the haem and could behaveas competitive inhibitors by occupying this binding site. WithS-warfarin bound in this position, there is space for a seconddrug molecule to bind at the haem—molecular modelling indicatesthat either another molecule of S-warfarin (Fig. 4a) or a differentmolecule, such as fluconazole (Fig. 4b), could simultaneously bind.

The discovery of this new warfarin-binding site may haveimplications for understanding the complex mechanisms used bythe human CYP450 proteins during their function. There are manyreports that the human CYP450 proteins catalyse reactions exhibit-

Figure 2 Stereo view of the binding site of S-warfarin in CYP2C9. The initial sigma-

weighted F o 2 F c electron density map is shown in red at the 2.5 sigma level. The

hydrogen bonds between S-warfarin and the backbone nitrogen amide atoms of Phe 100

and Ala 103 are depicted as dashed lines. The pi–pi stacking interactions between the

phenyl group of S-warfarin and Phe 476 is shown, as is the van der Waals contact

between the bicyclic template of S-warfarin and residues Ala 103, Phe 114 and Pro 367.

An arrow indicates the site of the 7-hydroxylation of S-warfarin catalysed by CYP2C9.

Figure 3 The surface of the active site of CYP2C9. The haem is shown at the bottom, and

the S-warfarin molecule above and to the left. The active site of CYP2C9 is large and could

potentially accommodate either compounds larger than S-warfarin or multiple ligands of

comparable size to S-warfarin without substantial conformational movement. With

S-warfarin bound in this location the haem group remains available to metabolize

additional substrate molecules.

letters to nature

NATURE |VOL 424 | 24 JULY 2003 | www.nature.com/nature466 © 2003 Nature Publishing Group

ing atypical kinetics such as activation, auto-activation and sub-strate inhibition22.Most of the observations citing this cooperativityhave been made with CYP3A4, which routinely exhibits a capacityfor multiple ligand binding during its function23. The crystalstructure indicates that CYP2C9 may also have the capacity tobind multiple substrates/ligands simultaneously during its functionand is consistent with reports that implicate a ‘two-site model’ forCYP2C9 (refs 24, 25). The warfarin-binding site could be one ofthese sites which, when occupied, ‘activates’ CYP2C9 through anallosteric mechanism, as there is sufficient space for other substratemolecules to bind at the haem (Figs 3 and 4). This is consistent withdata that show that CYP2C9 can be activated by some com-pounds24,25 including S-warfarin, which increases the rate ofmetabolism of 7-methoxy-4-trifluoromethylcoumarin26. Howeverthe metabolism of S-warfarin itself by CYP2C9 follows Michaelis–Menten kinetics27, indicating that no auto-activation occurs.Furthermore, although the phenomenon of CYP450-mediateddrug–drug interactions is widely reported for many drugs, themolecular basis remains unclear. A drug molecule bound at thewarfarin-binding site would be ideally placed to make directmolecular interactions with another drug molecule interactingwith the haem group. Whether this binding site is a ‘primarybinding site’ for substrates, an ‘inhibitor-binding site’, or has arole in an allosteric mechanism and drug–drug interactions, will bethe focus of further investigation. A

MethodsProtein expression, purification and characterizationThe amino-terminal transmembrane domain of CYP2C9 (residues 1–29) was replaced bythe short charged, hydrophilic polypeptide MAKKTSSKGR, and a four-histidine tag wasintroduced at the carboxy terminus to facilitate solubilization and protein purification.Seven amino acid substitutions (Lys206Glu, Ile215Val, Cys216Tyr, Ser220Pro, Pro221Ala,Ile222Leu and Ile223Leu) based on CYP2C sequences were introduced in the F–G loopregion by site-directed and cassette mutagenesis to improve properties for crystallization.CYP2C9 was produced in Escherichia coli XL1 blue cells. The cells were collected 48 h afterinduction and disrupted in a high salt lysis buffer by passage twice through a cellhomogenizer at 10,000 pounds per square inch. CYP2C9 was purified by affinitychromatography in the presence of 0.3% detergent IGEPAL CA630 (v/v) using Ni-NTAresin (Qiagen), desalted and then directly applied to a cation exchange column in theabsence of detergent.

To establish the effect of the truncation and mutagenesis, a full comparison of theactivity and specificity of the CYP2C9 protein was performed. The selectivity obtained

when incubating the protein with the fluorescent probe 7-methoxy-4-trifluoromethylcoumarin against a panel of ligands was representative of the unmodifiedprotein, and the ability to metabolize the 4 0 hydroxylation of diclofenac and the 6 0 and 7 0

hydroxylation of S-warfarin remained unchanged by the mutations introduced (data notshown).

Structure determinationCrystals of CYP2C9 were obtained by the hanging-drop vapour diffusion method, using a1:1 ratio of protein at 40mgml21 in a solution of 10mM potassium phosphate, pH 7.4,0.5M potassium chloride, 20% (v/v) glycerol, 1mM EDTA, 2mM dithiothreitol against acrystallization well solution of 0.1M Tris, pH 8.4, 15–25% (v/v) PEG 400, 5–12.5% (w/v)PEG 8000, 10% (v/v) glycerol. Crystals formed over a period of 1–4 days at 25 8C, and werefrozen directly from the crystallization solution. X-ray data were collected at beam lineID14.2 at the ESRF, processed using MOSFLM28, scaled and further reduced using theCCP4 suite of programs (http://www.ccp4.ac.uk) (Supplementary Table S1). The CYP2C9substrate-free structure was solved by molecular replacement using the programAMORE29 and the CYP2C5 structure7 as a searchmodel. Model rebuilding was done usingO (http://xray.bmc.uu.se/alwyn) and refinement was performed using CNX (http://www.accelrys.com/products/cnx/index.html) and REFMAC30. There are two copies ofCYP2C9 in the asymmetric unit, resulting in a solvent content of 70%. The resultingsubstrate-free structure was used in the refinement of the S-warfarin complex structure(Supplementary Table S1). Co-crystals of CYP2C9 and S-warfarin were grown using wellsolution supplemented with 5mM S-warfarin. The S-warfarin complex was refined usingCNX (http://www.accelrys.com/products/cnx/index.html) and REFMAC30.

Received 16 April; accepted 18 June 2003; doi:10.1038/nature01862.Published online 13 July 2003.

1. Anzenbacher, P. & Anzenbacherova, E. Cytochromes P450 and metabolism of xenobiotics. Cell. Mol.

Life Sci. 58, 737–747 (2001).

2. Hodgson, J. ADMET–turning chemicals into drugs. Nature Biotechnol. 19, 722–726 (2001).

3. Li, H. & Poulos, T. L. conformational dynamics in cytochromeP450-substrate interactions. Biochimie

78, 695–699 (1996).

4. Li, H. & Poulos, T. L. The structure of the cytochrome P450BM-3 haem domain complexed with the

fatty acid substrate, palmitoleic acid. Nature Struct. Biol. 4, 140–146 (1997).

5. Schlichting, I., Jung, C. & Schulze, H. Crystal structure of cytochrome P-450cam complexed with the

(1S)-camphor enantiomer. FEBS Lett. 415, 253–257 (1997).

6. Podust, L. M., Poulos, T. L. & Waterman, M. R. Crystal structure of cytochrome P450 14a-sterol

demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors. Proc. Natl

Acad. Sci. USA 98, 3068–3073 (2001).

7. Williams, P. A., Cosme, J., Sridhar, V., Johnson, E. F. & McRee, D. E. Mammalian microsomal

cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional

diversity. Mol. Cell 5, 121–131 (2000).

8. Ibeanu, G. C. et al. Identification of residues 99, 220, and 221 of human cytochrome P450 2C19 as key

determinants of omeprazole activity. J. Biol. Chem. 271, 12496–12501 (1996).

9. Melet, A. et al. Substrate selectivity of human cytochrome P450 2C9: importance of residues 476, 365,

and 114 in recognition of diclofenac and sulfaphenazole and in mechanism-based inactivation by

tienilic acid. Arch. Biochem. Biophys. 409, 80–91 (2003).

10. Haines, D. C., Tomchick, D. R.,Machius,M. &Peterson, J. A. Pivotal role of water in themechanism of

P450BM-3. Biochemistry 40, 13456–13465 (2001).

Figure 4 View of the region of the active site of CYP2C9 that remains available to

accommodate additional ligand(s) after S-warfarin. The bound S-warfarin molecule is

shown as in Fig. 3. a, A second molecule of S-warfarin has been modelled into the active

with the site of hydroxylation closest to the haem iron. b, A known haem binder

fluconazole has been modelled into the cavity in a similar conformation to that observed in

the complex of CYP51 with fluconazole (Protein Data Bank code 1EA1).

letters to nature

NATURE |VOL 424 | 24 JULY 2003 | www.nature.com/nature 467© 2003 Nature Publishing Group

Warfarin

Fluconazol

Quelle: Nature, Vol. 424, 24.July 2003



9

1.5.2. Eigenschaften von chiralen Arzneistoffen

Wirkstoff (R)-Enantiomer (S)-Enantiomer

Asparagin süß bitter

Adrenalin 30x aktiver als (S)

Chloramphenicol (R,R) antibakteriell (S,S) inaktiv

Thalidomid nicht (?) teratogen teratogen

Ethambutol (R,R) Erblindung (S,S) tuberkulostatisch

Dopa passive Diffusion aktive Diffusion

Ibuprofen (R) inaktiv, aber Inversion zu (S)(R) inaktiv, aber Inversion zu (S)

Tranylcypromin (+) MAO-Hemmer, (-) NA-Reuptakehemmer (antidepressiv)

(+) MAO-Hemmer, (-) NA-Reuptakehemmer (antidepressiv)



10

Exkurs : Chirale Zentren (außer vierbindiges C)

G. Subramanian (ed.): A Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography, VCH Weinheim (1994) p2



11

1.5.3. Arzneistoffe mit einem chiralen Zentrum

Als Racemat werden eingesetzt:

BisoprololCetirizinChloroquinCyclophosphamid (chiraler Phosphor)IbuprofenIfosfamid (chiraler Phosphor)Methadon Metoprolol Ofloxacin Omeprazol (chiraler Schwefel)Oxazepam Rosiglitazon Phenprocoumon SalbutamolPromethazin ThiopentalPropranolol VerapamilPyrantel Warfarin

Als reines Enantiomer werden eingesetzt:

Acetylcystein (R)Adrenalin (R)Cetirizin (R)Folsäure (S)Ibuprofen (S)Levodopa (S)Levofloxacin (S)Levomethadon (R)Methotrexat (S)Omeprazol (S)Pramipexol (S)



12

1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (I)

Ascorbinsäure (5R,1‘S) Chloramphenicol (1R,2R)

Captopril (2S,2‘S)

Pilocarpin (3S,4R)

Diltiazem (2S,3S)

‣ Nomenklatur nach CIPBestimmung der absoluten Konfiguration an vier-und sechsfach koordinierten Stereozentren



13

1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (II)

Ephedrin(1R,2S)

1R,2SL-(-)-Ephedrin

1S,2RD-(+)-Ephedrin

1R,2RL-(-)-Pseudoephedrin

1S,2SD-(+)-Pseudoephedrin

erythro-Reihe threo-Reihe

‣ Fischer-Rosanoff Konvention Arbeitskonvention, nach der (+)-Glyceraldehyd [(R)-2,3-Dihydroxypropanal] als

D-Glyceraldehyd bezeichnet wird

‣ erythro, threo relativer Stereodeskriptor für Diastereomere mit chiraler, acyclischer Partialstruktur mit

zwei benachbarten Stereozentren mit gleichem oder ähnlichen Substituenten



14

1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (III)

Tramadol(1S,2S + 1R,2R)

‣ cis, trans relative Beziehung zwischen zwei Liganden an separaten Atomen, die durch eine

Doppelbindung oder in einem Ring benachbart sind‣ E, Z Stereodeskriptor für stereoisomere Alkene, Cumulene und verwandte Systeme

Retinol



15

1.5.4. Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (IV)

stereochemische Nomenklatur in bicyclischen SystemenDeskriptoren für die relative Orientierung von Gruppen an nicht-Brückenkopfatomen

‣ endo, exo Exo-ständig sind diejenigen Substituenten, die zur kürzesten Brücke stehen; endo-Substituenten

sind der kürzesten Brücke abgewandt.‣ syn, anti Gruppen, die an der kürzesten Brücke substituiert sind, stehen syn, wenn sie zur ersten Brücke

stehen. Falls nicht, ist die Gruppe anti-ständig.

N-Butylscopolaminiumbromid



16

‣ hohe Empfindlichkeit (Nachweisgrenze << 1%)

‣ gute Reproduzierbarkeit

‣ kostengünstig (Geräte, Durchführung der Messung)

‣ geringer Substanzbedarf

‣ geringer Zeitaufwand

‣ Messung ohne aufwändige Probenvorbereitung

‣ keine Artefaktbildung (v.a. keine Racemisierung)

2.1.1. Anforderungen an die Enantiomerenanalytik


präparativ:

‣ Isolierung des enantiomerenreinen Arzneistoffes nach der Synthese

analytisch:

‣ Bestimmung der Enantiomerenreinheit während der Produktion

‣ Untersuchungen zur Pharmakokinetik und zum Metabolismus (in-vitro und in-vivo)

2.1.2. Anwendung von Enantiomerentrennung in Industrie und Forschung



Indirekte Trennung(naßchemisch)

chirale Trennung von Enantiomeren

Direkte Trennung(chromatographisch)

‣ Trennung durch Kristallisation‣ Derivatisierung zu Enantiomeren

‣ chromatographische Trennung mit Hilfe chiraler Selektoren

Beide Verfahren basieren auf der (kurzzeitigen oder dauerhaften) Bildung von Diastereomeren

2.1.3. Verfahren in der Enantiomerenanalytik



2.2.1. Trennung von Enantiomeren mittels Kristalisation als Diastereomerensalze

Prinzip: Zum Racemat (R+S) wird ein enantiomerenreines (R oder S) Fällungsreagenz gegeben

für Basen: Äpfelsäure, Mandelsäure, Weinsäure und -derivate, Camphersulfonsäure

Base (R,S) + Säure (R) diastereomere Salze ( Kation (R), Anion (R) und Kation (S), Anion (R) )

für Säuren: Ephedrin, Brucin, Chinin, 1-(Phenyl-)ethylamin

Nachteile: zeitaufwändig, nicht für analytische Anwendungen geeignet



‣ Trennung als Diastereomere nach Derivatisierung mit (S)-1-Phenylethylisocyanat (PEIC) für Aminosäuren

‣ Trennung bspw. an RP-18 möglich‣ Nachteile: quantitative Umsetzung notwendig Reagenz muss sehr rein sein zeitaufwändig, nur für analytische Anwendungen

S

R

S

S

S

R

S

S

S-Phenylalanin

R-Phenylalanin

2.2.2. Derivatisierung von Enantiomeren (I)

Diastereomere

+

+



Diastereomere

Mit Mosher-Reagenz derivatisierte Enantiomere

können mit Hilfe von 19F-NMR auf ihre Reinheit

(% ee) überprüft werden

Derivatisierung von

- Alkoholen mit Säure zum Ester

- Aminen mit Säurechlorid zum Amid

‣ Trennung als Diastereomere nach Derivatisierung mit enantiomerenreiner/m Mosher-Säure/-Chlorid

2.2.2. Derivatisierung von Enantiomeren (II)

+

+(R)

(R)

(S)

(S)

(S)

(S)

(R)-Mosher

(R)-Mosher-Chlorid

(R)-Mosher-Chlorid

(R)-Mosher-Chlorid

A-/E-Rkt.



‣ Trennung an chiralen (pseudo-)stationären Phasen

Methoden: HPLC, GC, CE

Prinzip: Unterschiedlich starke Wechselwirkungen (WW) der Enantiomere in einer chiralen Umgebung

(π-π-, ionisch-, Wasserstoffbrücken-, Dipol-WW)

Vorteil: analytisch (HPLC, GC, CE) und präparativ (nur HPLC) nutzbar

2.3.1. Direkte Trennung von Enantiomeren



2.3.2. Chirale stationäre Phasen (CSP‘s) für die HPLC



Mobile Phase: n-Hexan / 2-Propanol 80/20 (V/V)Flussrate: 1 ml/min Detection: UV 254 nm Probe: Oxazepam (0.5mg/ml)

Chiraler Selektor:R(-(-)-N-(3,5-Dinitrobenzoyl)phenylglycin)(DNBPG)

2.3.3. Beispiele für Pirkle-Säulen zur direkten Enantiomerentrennung



Kapillar-

elektrophorese

3.1. Wiederholung: Grundlagen der CE

Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese


3.1.1. Instrumenteller Aufbau



ANNAHME: Die Kapillarwand hat keinen Einfluß

Wanderungsrichtung und Wanderungsgeschwindigkeit der Analyten sindnur von der Ladung und der elektrophoretischen Mobilität abhängig

6πηrz.eveff =

z.e eff. Ladung E Feldstärkeη Viskositätr Ionenradius

+ -- N+

E

3.1.2. Die Elektrophoretische Mobiliät (EM)



S O S OHH-

+

i i

E Feldstärkeζ Zeta-Potentialη Viskositätε Dielektrizitätskonstante LM

a b

-

-------

-

++

+++++

+

+

+

-

+

+

+

+

-

++Q

uarz

a starre Grenzschichtb diffuse Grenzschicht

pH-Abhängigkeit des EOF Deprotonierung der Silanolgruppen

ε ζ

4πηvEOF= E

3.1.3. Der Elektroosmotische Fluss (EOF)



Definition:Durch Dissoziation der Silanolgruppen der inneren Oberfläche der Quarzkapillare wird die Kapillarwand negativ aufgeladen und die Pufferlösung im Inneren der Kapillare erhält einen Überschuß an positiven Ladungsträgern (Kationen). Durch elektrostatische Anziehung lagern sich die Kationen der Pufferlösung an die Kapillarwand an, und zwar zum einen in Form einer starren (unbeweglichen) Grenzschicht direkt an der Kapillaroberfläche und zum anderen in einer diffusen (beweglichen) Grenzschicht in weiterem Abstand zur Kapillarwand.Bei Anlegen einer Spannung beginnen sich die Kationen der diffusen Grenzschicht in Richtung Kathode zu bewegen. Infolge eines osmotischen Effektes bewegt sich auch das sie umgebende Lösungsmittel mit und es kommt zu einem Nettostrom der Pufferlösung in Richtung der Kathode. Diesen Effekt bezeichnet man als elektroosmotischen Fluss (EOF).

3.1.3. Der Elektroosmotische Fluss (EOF)




3.1.4. EM und EOF

+ --

+N-

Zeit [min]

tM

v = vEOF + vEFF

Stempelförmiges Flussprofil

pH-Abhängigkeit von vEOF und vEFF

Deprotonierung der Silanolgruppen Protonierungsgrad der Analyten

N

N +

+

++++++

-

--

--

-

-


Veränderung des Trennsystems Auswirkungen auf den EOF

pH-Wert des Puffers EOF wenn pH

Pufferkonzentration EOF wenn Pufferkonz.

Temperatur Viskositätsveränderung, evtl. auch Selektivitätsänderung

Org. Lösungsmittel Komplexe Veränderungen,(ACN, MeOH...) meist Änderung der Selektivität

Chem. Veränderung der Reduzierung / Umkehr des EOFKapillarwand(lin. Polyacrylamid, Methylcellulose)


3.1.5. Möglichkeiten zur Beeinflussung des EOF



3.2.1. Chirale Selektoren für die CE

Cyclodextrine native (α-, β-, γ-CD) substituierte CD nichtionische (Methyl-, Hydroxypropyl-, Hydroxyethyl-.....) anionische (Carboxymethyl-, Sulfobutyl-, Sulfoethyl-.....) kationische (Trimethylammoniumhydroxypropyl-.....)Chirale Kronenether

Chirale Mizellbildner (SDS-Digitonin, Gallensäuren,.....)Glykopeptide (Vancomycin, Rifamycin)Proteine (HSA, BSA, AGP)



3.2.2. Native Cyclodextrine als chirale Selektoren

α - Cyclodextrin => 6 α-D-Glucose-Einheiten

β - Cyclodextrin => 7 α-D-Glucose-Einheiten

γ - Cyclodextrin => 8 α-D-Glucose-Einheiten

c

ba

CD

αβγ

Dimension a b c5.7 13.7 7.87.8 15.3 7.89.5 16.9 7.8

Kavitäts -volumen 174

262 427

Å3

‣ 62% aller Enantiomerentrennungen in der CE mit Cyclodextrinen als chirale Selektoren

Durch die chirale Information in der Strukturder Zucker wird im Cyclodextrin eine chiraleUmgebung erzeugt!


Formel:

Chemische Eigenschaften: - Zwitterion (saure Carboxylfunktion, basischer Stickstoff am Piperazinring); IEP = 7,4 - ein Chiralitätszentrum (Das S-(-)-Enantiomer ist je nach Keimart 8-128 mal stärker wirksam als das R-(+)-Enantiomer)Handelsnamen: - Tarivid®: R,S-(±)-Ofloxacin (1984) - Tavanic®: S-(-)-Ofloxacin (Levofloxacin, 1998)

3.3.1. Ofloxacin




3.3.2. Praktikumsaufgabe

Qualitative Bestimmung von Ofloxacin-Enantiomeren in Humanurin mit Hilfe der Kapillarelektrophorese

Elektrophoretische Bedingungen:Laufpuffer : 100mM H3PO4 mit Triethylamin auf pH 2,0 eingestelltChiraler Selektor : 45mM Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (D.S. = 0,8)Kapillare : fused silica; 20/27 cm 50 µm I.D. x 375 µm O.D.Spannung : 20kVInjektion : hydrodynamisch; 5 sec (Urinproben) bzw. 10 sec (wässrige Standardlösung) bei 0,5 psiDetektion : UV-Detektion, 280 nm

λmax= 280 nm


Stereochemie: - B. Testa: Grundlagen der Organischen Stereochemie - IUPAC: http://goldbook.iupac.org/src_PAC1996682193.html

Kapillarelektrophorese: - H. Engelhardt: Kapillarelektrophorese - F. Tagliaro, G. Manetto, F. Crivellente, F.P. Smith: „A brief introduction to capillary electrophoresis“, Forensic Science International, 92 (1998), 75-88 - H. Wätzig: „Grundlagen der Kapillarelektrophorese“, PZ Prisma, 3 (1996), 126-136

Chirale Trennungen: - S. Fanali, Z. Aturki, C. Desiderio: „New strategies for chiral analysis of drugs by capillary electrophoresis“, Forensic Science International, 92 (1998), 137-155

Quellenverzeichnis

Literaturhinweise

Enantiomerentrennung und CE - uni-muenster.de · Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese...

Documents

Transcript of Enantiomerentrennung und CE - uni-muenster.de · Direkte Trennung mit der Kapillarelektrophorese...