Entstehung von Fluorchinolonresistenz bei Escherichia coli ... · Entstehung von...

Entstehung von Fluorchinolonresistenz bei

Escherichia coli in vivo

DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES

DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)

DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTÄT III

–BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN–

DER UNIVERSITÄT REGENSBURG

vorgelegt von

Anne Rößger

aus Regensburg

Januar 2008

Promotionsgesuch eingereicht am: 16.01.2008

Tag der mündlichen Prüfung: 02.04.2008

Die Arbeit wurde angeleitet von: PD Dr. med. Hans-Jörg Linde

Prüfungsausschuss: Vorsitz: Prof. Dr. rer. nat. Günther Hauska

1. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Michael Thomm

2. Prüfer: PD Dr. med. Hans-Jörg Linde

3. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Reinhard Wirth

Eidesstattliche Erklärung

Ich erkläre hiermit an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe des Literaturzitats gekennzeichnet. Bei der Auswahl und Auswertung folgenden Materials haben mir die nachstehend aufgeführten Personen in der jeweils beschriebenen Weise unentgeltlich geholfen: 1. PD Dr. Hans-Jörg Linde (als Betreuer dieser Arbeit, Arbeitsgruppenleiter) Weitere Personen waren an der inhaltlich-materiellen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe eines Promotionsberaters oder anderer Personen in Anspruch genommen. Niemand hat von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Anne Rößger Regensburg, 16.01.2008

Inhaltsverzeichnis 4

1 Zusammenfassung.............................................................................................10

2 Einleitung ...........................................................................................................14 2.1 Escherichia coli .................................................................................................... 15 2.2 Bakterielle Resistenzentwicklung gegen Fluorchinolone....................................... 17

2.2.1 Struktur der Fluorchinolone........................................................................... 17 2.2.2 Eigenschaften von Fluorchinolonen .............................................................. 17

2.2.2.1 Pharmakodynamik .................................................................................... 18 2.2.2.2 Wirkmechanismus der Fluorchinolone ...................................................... 18 2.2.2.3 Zielstruktur der Fluorchinolone.................................................................. 18 2.2.2.4 Veränderung der Genexpression durch Chinolone ................................... 19 2.2.2.5 Kinetik....................................................................................................... 20

2.3 Mechanismen der Fluorchinolonresistenz............................................................. 20 2.3.1 Topoisomerasemutationen ........................................................................... 21 2.3.2 Efflux und Influx ............................................................................................ 22 2.3.3 Plasmidvermittelte Resistenz........................................................................ 23 2.3.4 Chemische Modifizierung.............................................................................. 24 2.3.5 Induktoren von Effluxsystemen..................................................................... 24

2.4 In vitro-Selektion................................................................................................... 25 2.4.1 In vitro-Experimente...................................................................................... 26 2.4.2 Fitness.......................................................................................................... 26 2.4.3 Kompensatorische Mutationen...................................................................... 27

2.5 Vergleich von in vitro- zu in vivo-Mutanten ........................................................... 27 2.6 Fragestellung der Arbeit ....................................................................................... 29

3 Material und Methoden.......................................................................................32 3.1 Materialien............................................................................................................ 32

3.1.1 Organismen.................................................................................................. 32 3.1.2 Plasmide....................................................................................................... 32 3.1.3 Kits ............................................................................................................... 34 3.1.4 Chemikalien, Plastikwaren und sonstige Hilfsmittel....................................... 34 3.1.5 Enzyme ........................................................................................................ 34 3.1.6 Antibiotika..................................................................................................... 35 3.1.7 Lösungen...................................................................................................... 35 3.1.8 Nährmedien.................................................................................................. 36 3.1.9 Primer........................................................................................................... 37 3.1.10 Sequenzierung ............................................................................................. 41 3.1.11 Computerprogramme.................................................................................... 42 3.1.12 Geräte .......................................................................................................... 42

3.2 Methoden ............................................................................................................. 43 3.2.1 Molekularbiologische Methoden.................................................................... 43

3.2.1.1 DNA-Arbeitstechniken............................................................................... 43 3.2.1.1.1 Isolierung von DNA............................................................................. 43 3.2.1.1.2 Isolation von Plasmiden ...................................................................... 43 3.2.1.1.3 Restriktionsanalyse und -verdau......................................................... 43 3.2.1.1.4 Elektrophorese von DNA in Agarosegelen .......................................... 44 3.2.1.1.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ........................... 45 3.2.1.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR)................................................ 45

3.2.1.1.6.1 Standard-PCR.............................................................................. 45 3.2.1.1.6.2 RS-PCR (Restriction-Site-PCR) ................................................... 46 3.2.1.1.6.3 Inverse PCR................................................................................. 48 3.2.1.1.6.4 Rep-PCR ..................................................................................... 49 3.2.1.1.6.5 Fusions-PCR................................................................................ 50 3.2.1.1.6.6 PCR zur Bestimmung der phylogenetischen Gruppe ................... 51

3.2.1.1.7 Reinigung von PCR-Produkten ........................................................... 52 3.2.1.1.8 Klonierung von PCR-Produkten .......................................................... 52


3.2.1.1.9 Konzentrationsbestimmung von DNA ................................................. 52 3.2.1.1.10 Behandlung mit alkalischer Phosphatase (CIP) ................................ 52 3.2.1.1.11 Ligation ............................................................................................. 53

3.2.1.2 RNA-Arbeitstechniken............................................................................... 53 3.2.1.2.1 Isolierung von RNA............................................................................. 53 3.2.1.2.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung der RNA......................... 53 3.2.1.2.3 DNaseI-Verdau................................................................................... 54 3.2.1.2.4 Reverse Transkription......................................................................... 54 3.2.1.2.5 Quantitative Real-time PCR................................................................ 54

3.2.1.2.5.1 Quantifizierung von Real-time revers transkribierter RNA ............ 54 3.2.1.2.5.2 Prinzip des LightCycler®s ............................................................ 55 3.2.1.2.5.3 Durchführung der Real-Time-PCR ............................................... 56 3.2.1.2.5.4 Relative Quantifizierung von cDNA .............................................. 56

3.2.1.2.6 Microarray........................................................................................... 57 3.2.1.3 Herstellung kompetenter Zellen ................................................................ 58

3.2.1.3.1 Chemisch kompetente Zellen.............................................................. 58 3.2.1.3.2 Elektrokompetente Zellen ................................................................... 58

3.2.1.4 Transformation.......................................................................................... 59 3.2.1.5 Elektroporation.......................................................................................... 59 3.2.1.6 Konjugation............................................................................................... 60 3.2.1.7 Phagentransduktion .................................................................................. 60

3.2.1.7.1 Präparation des P1-Lysats.................................................................. 60 3.2.1.7.2 P1-Transduktion ................................................................................. 61

3.2.1.8 Phänotypische Charakterisierung ............................................................. 61 3.2.1.8.1 Resistenzbestimmung mittels Etest®.................................................. 61 3.2.1.8.2 Organic solvent tolerance (OST)......................................................... 61 3.2.1.8.3 Verwendung des API®20 E-Systems.................................................. 62 3.2.1.8.4 Prüfung der Kanamycin-Resistenz..................................................... 62 3.2.1.8.5 MHK-Bestimmung der Enterokokken .................................................. 62 3.2.1.8.6 SIM-Test ............................................................................................. 63 3.2.1.8.7 Citrat-Test........................................................................................... 63 3.2.1.8.8 MHK-Bestimmung mittels Mikrodilution............................................... 63 3.2.1.8.9 Untersuchung des aeroben und anaeroben Wachstumsverhaltens .... 64 3.2.1.8.10 Untersuchung des Wachstumsverhaltens in einer Mischkultur.......... 64

3.2.1.9 Induktionsversuche................................................................................... 64 3.2.1.9.1 Induktionsversuche für visuelles System............................................. 64 3.2.1.9.2 Induktion für RNA-Isolierung ............................................................... 65

3.2.1.10 Biochemische Methoden....................................................................... 65 3.2.1.10.1 Southern Blotting .............................................................................. 65

3.2.1.10.1.1 DNA-Isolierung........................................................................... 65 3.2.1.10.1.2 Verdau für Southern Blot............................................................ 66 3.2.1.10.1.3 Herstellung einer mit Digoxigenin-markierten Sonde.................. 66 3.2.1.10.1.4 Kapillarblot und Hybridisierung................................................... 66

3.2.1.10.2 HPLC (High Performance (Pressure) Liquid Chromatography) ......... 66 3.2.1.10.2.1 Vorbereitung der Proben............................................................ 67 3.2.1.10.2.2 Ablauf der Messungen mittels HPLC.......................................... 67 3.2.1.10.2.3 Auswertung der Chromatogramme ............................................ 68

3.3 Markierung mittels Reporterkonstrukt ................................................................... 68 3.3.1 Green fluorescent protein (Gfp) aus Aequorea victoria ................................. 68 3.3.2 Verwendung des araB-Promotors................................................................. 69

3.4 Zellkultur............................................................................................................... 70 3.4.1 Verwendete Zellen........................................................................................ 70 3.4.2 Verwendete Medien...................................................................................... 70 3.4.3 Anzucht der Zellen........................................................................................ 70


3.4.4 Splitten der Zellen......................................................................................... 70 3.4.5 Einfrieren der Zellen ..................................................................................... 71 3.4.6 Auftauen von Zellen...................................................................................... 71 3.4.7 Zelladhäsionsassay ...................................................................................... 71

3.4.7.1 Anzucht der HT-29-Zellen für den Adhäsionsassay .................................. 71 3.4.7.2 Anzucht der Keime für den Adhäsionsassay............................................. 71

3.5 Konfokale Lasermikroskopaufnahmen.................................................................. 72 3.5.1 Verwendete Medien und Puffer..................................................................... 72 3.5.2 Präparatherstellung und -fixierung ................................................................ 72

3.6 Tierversuch .......................................................................................................... 73 3.6.1 Verwendete Tiere ......................................................................................... 73 3.6.2 Tierhaltung und Tierpflege ............................................................................ 73 3.6.3 Ankunft und Eingewöhnungsphase............................................................... 73 3.6.4 Gewichtsbestimmung der Ratten .................................................................. 73 3.6.5 Überprüfung des Futters auf Arabinose ........................................................ 74 3.6.6 Kolonisation des Rattendarms mit dem markierten E. coli ............................ 74

3.6.6.1 Kolonisation mit Hilfe von Wasser............................................................. 74 3.6.6.2 Kolonisation mit Hilfe einer Sonde ............................................................ 74

3.7 Kontrolle der Stabilität der Kolonisation ................................................................ 74 3.7.1 Kotabnahme ................................................................................................. 74 3.7.2 Quantitative Verarbeitung von Kotproben ..................................................... 75

4 Ergebnisse .........................................................................................................76 4.1 Chromosomale Markierung von E. coli mit gfp...................................................... 76

4.1.1 Homologe Rekombination............................................................................. 76 4.1.1.1 Verwendung des suicide-Vektors pIVETsacB ........................................... 77 4.1.1.2 Verwendung von λ-Red-Systemen............................................................ 78

4.1.1.2.1 pUC-araBPr-gbx ................................................................................. 79 4.1.1.2.1.1 Klonierungsstrategie des Vektors pUC-araBPr-gbx...................... 79 4.1.1.2.1.2 Überprüfung der Klone................................................................. 79 4.1.1.2.1.3 Überprüfung der Gene gam, bet und exo auf ihre Funktionalität .. 79

4.1.1.2.2 pKD46-System.................................................................................... 80 4.1.1.2.3 Herstellung des von homologen Bereichen flankierten Reportergens . 80 4.1.1.2.4 Chromosomale Integration des gfp in E. coli ....................................... 82

4.1.1.3 Transduktion............................................................................................. 83 4.1.2 Transposonmutagenese ............................................................................... 83

4.1.2.1 Integration des gfp-Gens unter der Kontrolle des araB-Promotors in suicide-Vektor pLOF/Km........................................................................... 84 4.1.2.2 Konjugation mit pLOF/Km-araBPr-gfp....................................................... 84 4.1.2.3 Transformation von pLOF/Km-araBPr-gfp in E. coli-4 ............................... 84 4.1.2.4 Phänotypische Untersuchung der entstandenen Klone E. coli-32 und E. coli-57 im Vergleich zum Wildtyp E. coli-4 ............................................ 85

4.1.2.4.1 Wachstum von E. coli-32 und E. coli-57 unter aeroben und anaeroben Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp E. coli-4 ................................ 85 4.1.2.4.2 Wachstum der Klone 57 und 32 in einer Mischkultur mit E. coli-4 ....... 85 4.1.2.4.3 Antibiotikaresistenz............................................................................. 86 4.1.2.4.4 Organic Solvent Tolerance (OST)....................................................... 86 4.1.2.4.5 Prüfung der biochemischen Profile mittels API®20 E- und Phoenix®-System ............................................................................... 87 4.1.2.4.6 Untersuchung der Adhärenz mittels Zelladhäsionsassay .................... 87 4.1.2.4.7 Darstellung der Adhärenz mittels Konfokalen Lasermikroskops.......... 88

4.1.2.5 Genotypische Untersuchungen der E. coli-32 und E. coli-57 im Vergleich zum Wildtyp E. coli-4 ................................................................................ 89

4.1.2.5.1 Rep-PCR ............................................................................................ 89 4.1.2.5.2 Phylogenetische Gruppe..................................................................... 89


4.1.2.6 Nachweis der chromosomalen Integration des Fragments Km-araPr-gfp im Klon E. coli-57........................................................................................... 90

4.1.2.6.1 Plasmidisolierung................................................................................ 90 4.1.2.6.2 Southern Blot ...................................................................................... 91 4.1.2.6.3 Lokalisation der Integrationsstelle von pLOF/Km-araBPr-gfp .............. 91

4.1.2.6.3.1 RS-PCR....................................................................................... 91 4.1.2.6.3.2 Inverse PCR................................................................................. 92

4.2 Ratten-Selektionsmodell....................................................................................... 92 4.2.1 Eingewöhnungsphase .................................................................................. 92 4.2.2 Statusbestimmung der Darmflora ................................................................. 93

4.2.2.1 Phänotypische Charakterisierung ausgewählter Keime aus Rattenkot...... 93 4.2.2.1.1 Überprüfung auf Kanamycin-Resistenz............................................... 93 4.2.2.1.2 Untersuchung der Enterokokken auf Ampicillinresistenz..................... 93 4.2.2.1.3 Untersuchung Laktose-positiver Keime auf Schwefelbildung, Indolproduktion, Beweglichkeit und Citratverwertung.......................... 93 4.2.2.1.4 Organic solvent tolerance (OST)......................................................... 94 4.2.2.1.5 Rep-PCR der E. coli-Isolate der nativen Rattendarmflora ................... 94 4.2.2.1.6 Phylogenetische Gruppe der E. coli-Isolate aus dem Rattendarm....... 94 4.2.2.1.7 Plasmidisolierung bei E. coli-Isolaten aus der Normalflora der Ratte .. 95 4.2.2.1.8 MHK-Bestimmung der E. coli-Isolate aus der Normalflora der Ratte gegenüber Ciprofloxacin ..................................................................... 95 4.2.2.1.9 Identifizierung der Laktose-negativen Kolonien aus der Normalflora der Ratte................................................................................................... 95

4.2.3 Untersuchung des Rattenfutters auf Arabinose............................................. 95 4.2.4 Kolonisierung des Rattendarms mit E. coli-57............................................... 95

4.2.4.1 Ablauf der Kolonisierung........................................................................... 96 4.2.5 Bestimmung des Gewichts der Ratten .......................................................... 98 4.2.6 Gabe von Ciprofloxacin in unterschiedlichen Konzentrationen und verschiedenen Dosierungsschemata ............................................................ 98

4.2.6.1 Untersuchung der bei 160 µg/ml Ciprofloxacin isolierten Kanamycin-resistenten E. coli-4o1 und E. coli-4o2 ................................... 99 4.2.6.2 Bestimmung der Ciprofloxacinkonzentration mittels HPLC...................... 100

4.3 Wirkung humaner Pharmazeutika auf die Induktion von Efflux ........................... 101 4.3.1 High copy-Plasmid-System......................................................................... 101

4.3.1.1 Klonierung der Reportergen-Vektoren..................................................... 101 4.3.1.1.1 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des norE-Promotors....................... 101 4.3.1.1.2 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des mdtM-Promotors ..................... 102 4.3.1.1.3 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des rob-Promotors ......................... 102 4.3.1.1.4 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des soxS-Promotors ...................... 103 4.3.1.1.5 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des marRA-Promotors ................... 103 4.3.1.1.6 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrEF-Promotors..................... 103

4.3.1.2 Screening-System................................................................................... 104 4.3.1.3 Screening der Pharmazeutika................................................................. 105 4.3.1.4 Induktion spezifischer Promotoren von Fluorchinolon-Transportern oder regulatorischer Proteinen........................................................................ 106

4.3.2 Low copy-Plasmid-System.......................................................................... 106 4.3.2.1 Klonierung der Reportergen-Vektoren..................................................... 107

4.3.2.1.1 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrAB-Promotors..................... 107 4.3.2.1.2 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrEF-Promotors..................... 108 4.3.2.1.3 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrD-Promotors....................... 108 4.3.2.1.4 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des mdfA-Promotors ...................... 108 4.3.2.1.5 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des marRA-Promotors ................... 108 4.3.2.1.6 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des rob-Promotors ......................... 108


4.3.2.2 Überprüfung der Arabinose-abhängigen Transkription von pCC1_dB-Vektorgenen........................................................................... 108 4.3.2.3 Screening von Pharmazeutika ................................................................ 110

4.3.2.3.1 E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrABPr-gfp ......................................... 111 4.3.2.3.1.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrABPr-gfp 111 4.3.2.3.1.2 Untersuchung der gfp-Expression von pCC1-acrABPr-gfp......... 112

4.3.2.3.2 E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrDPr-gfp ........................................... 112 4.3.2.3.2.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrDPr-gfp 112 4.3.2.3.2.2 Untersuchung der gfp-Expression von pCC1-acrDPr-gfp ........... 113

4.3.2.3.3 E. coli TM EPI300 mit pCC1-marRAPr-Tgfp ..................................... 114 4.3.2.3.3.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit pCC1-marRAPr-Tgfp.................................................................. 114 4.3.2.3.3.2 Untersuchung der gfp-Expression von pCC1-marRAPr-Tgfp ..... 115

4.3.2.3.4 E. coli TM EPI300 mit pCC1-robPr-Tgfp ........................................... 116 4.3.2.3.4.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit ............................. pCC1-robPr-gfp.......................................................................... 116 4.3.2.3.4.2 Auswirkungen auf die gfp-Expression von pCC1-robPr-Tgfp...... 117

4.3.2.4 Überprüfung auf Veränderung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) bei Substanzzusatz................................................................................. 118

4.4 Untersuchung der Auswirkung von Salizylat auf Virulenz/Adhärenz der uropathogenen E. coli-Stämme 1173 und 1267.................................................. 121

4.4.1 Phänotypische Charakterisierung der E. coli-Isolate 1173 und 1267 .......... 121 4.4.1.1 Resistenzbestimmung mittels Etest®...................................................... 121 4.4.1.2 OST ........................................................................................................ 121

4.4.2 Genotypische Charakterisierung der E. coli-Isolate 1173 und 1267 ............ 122 4.4.2.1 Gentranskription bei E. coli 1173 und E. coli 1267 im Vergleich.............. 123

4.4.2.1.1 Untersuchung von Effluxgenen und deren Regulatoren .................... 123 4.4.2.1.2 Microarray......................................................................................... 123 4.4.2.1.3 Untersuchung der Expression von Genen in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration ....................................................................... 124

4.4.2.1.3.1 Untersuchung der acrB-Expression............................................ 124 4.4.2.1.3.2 Untersuchung der motB-Expression........................................... 125 4.4.2.1.3.3 Untersuchung der hlyE-Expression ............................................ 126 4.4.2.1.3.4 Untersuchung der sfaD/E-Expression ........................................ 128 4.4.2.1.3.5 Untersuchung der marA-Expression .......................................... 129

4.4.2.2 Adhärenzunterschiede der Isolate 1173 und 1267 in der Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration ....................................................................... 130

5 Diskussion........................................................................................................133 5.1 GFP als Fluoreszenzmarker ............................................................................... 133 5.2 Verwendung des araB-Promotors zur Steuerung der Gfp-Produktion................. 134 5.3 Chromosomale Markierung von E. coli mit gfp.................................................... 134

5.3.1 Unterschiedliche Methoden zur chromosomalen Markierung durch homologe Rekombination............................................................................................ 135

5.3.1.1 Suicide-Vektor-System ........................................................................... 135 5.3.1.2 λ-Red-System......................................................................................... 137 5.3.1.3 Generelle Transduktion........................................................................... 140

5.3.2 Chromosomale Markierung mit Transposonmutagenese............................ 142 5.3.2.1 Detektion der Integrationsstelle............................................................... 144

5.4 Phänotypische Eigenschaften von E. coli-57, E. coli-32 und dem Wildtyp E. coli-4 im Vergleich ....................................................................................................... 145

5.4.1 Biochemische Eigenschaften...................................................................... 145 5.4.2 Wachstum................................................................................................... 145


5.4.3 Antibiotikaresistenz..................................................................................... 146 5.4.4 Organic solvent tolerance ........................................................................... 146 5.4.5 Adhärenz .................................................................................................... 146

5.5 Tierversuch ........................................................................................................ 147 5.5.1 Auswirkungen der Kolonisation des Rattendarms mit E. coli-57 auf die Normalflora................................................................................................. 147 5.5.2 Stabilität von E. coli-57 innerhalb der Normalflora....................................... 148 5.5.3 Selektion von Ciprofloxacin-resistenten Keimen in vivo .............................. 149

5.5.3.1 Einfluss der Mutationsrate auf die Entstehung von Resistenz ................. 149 5.5.3.2 Erwerb von Antibiotikaresistenz über horizontalen Gentransfer .............. 151 5.5.3.3 Auswirkung der Antibiotikum-Konzentration auf die Entstehung von resistenten E. coli in vivo......................................................................... 151 5.5.3.4 Zeitraum bis zur Entdeckung von resistenten E. coli in vivo .................... 152

5.6 RT-PCR als Verfahren zu relativen Quantifizierung der Genexpression ............. 152 5.7 Auswirkungen von pharmazeutischen Substanzen auf den Efflux ...................... 153 5.8 Auswirkung von unterschiedlichen Salizylatkonzentrationen auf Virulenz und Adhärenz der E. coli-Stämme 1173 und 1267 .................................................... 155 5.9 Auswirkung von Pharmazeutika auf die MHK gegenüber Gentamicin, Norfloxacin und Ampicillin ..................................................................................................... 160

6 Ausblick............................................................................................................163

7 Verzeichnisse...................................................................................................164 7.1 Abkürzungsverzeichnis....................................................................................... 164 7.2 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 167

8 Anhang.............................................................................................................189 8.1 Microarraydaten ................................................................................................. 189

8.1.1 Effluxsysteme ............................................................................................. 189 8.1.2 Differentielle Transkription .......................................................................... 190

8.2 Gelbilder............................................................................................................. 191 8.3 HPLC-Daten....................................................................................................... 195

9 Danksagung.....................................................................................................196

Zusammenfassung 10

1 Zusammenfassung

Die bakterielle Resistenzentwicklung stellt in der Humanmedizin ein zunehmendes Problem

dar. In vivo-Modelle sind für die Untersuchung dieser Resistenzentwicklung von

Mikroorganismen notwendig, da hier die Situation in einem Patienten – mit dem komplexen

Zusammenspiel von Wirtsfaktoren, Normalflora und den interessierenden Organismen –

simuliert werden kann. Die Akkumulation von Fluorchinolonresistenz-Mutationen kann einen

Einfluss auf das Wachstumsverhalten haben. Unter der grob vereinfachenden Annahme,

dass die Größe einer Kolonie der Teilungsrate entspricht, die für Überleben in gemischten

Populationen bzw. der Auseinandersetzung mit dem Immunsystem des Wirts von

entscheidender Bedeutung ist, zeigte sich sowohl bei in vivo als auch bei in vitro erzeugten

Resistenz-Mutanten eine Veränderung der Fitness. Bei vergleichenden Untersuchungen von

in vivo und in vitro erzeugten Resistenz-Mutanten zeigte sich, dass in

vitro-Resistenz-Mutanten einen höheren Fitnessverlust aufweisen als in vivo erzeugte

Resistenz-Mutanten. In seiner normalen Umgebung wird es dem Keim somit ermöglicht mit

geringem oder ohne Fitnessverlust Resistenzen zu entwickeln.

Eine stabile phänotypische Markierung des in diesem Modell eingesetzten Keims ist nötig

um die Resistenzentwicklung genau beobachten und untersuchen zu können. Diese

Markierung erleichtert die spätere Identifizierung des eingesetzten Bakteriums innerhalb

einer Mischkultur mit anderen Bakterien.

In dieser Arbeit sollte zuerst der aus dem Kot einer Ratte isolierte Escherichia coli-Stamm

E. coli-4 chromosomal markiert werden. Ein Verlust oder der Transfer dieser Markierung auf

ein anderes Bakterium sollte aufgrund der Integration in das Genom nur mit geringer

Wahrscheinlichkeit stattfinden. Als Markergen wurde das green fluorescent protein (gfp)

gewählt, da es eine einfache Detektion durch UV-Bestrahlung unter der Normalflora

ermöglicht. Zur Vermeidung unerwünschter Effekte durch die konstitutive Expression des

Reporterproteins Gfp während der Passage durch den Intestinaltrakt der Ratte –

insbesondere für Gfp sind solche Phänomene beschrieben– wurde das gfp-Gen unter die

Kontrolle des induzierbaren Promotors araB gebracht. Neben dem Markergen gfp wurde

eine Kanamycin-Resistenzkassette in das Chromosom eingebracht. Die chromosomale

Markierung erfolgte mittels Transposonmutagenese. Der daraus hervorgegangene Klon

E. coli-57 zeigte im Vergleich zu seinem Wildtyp E. coli-4 kein verändertes biochemisches

Verhalten, keine Veränderung im Wachstum (in vitro) in aeroben und anaeroben Milieu und

keine Veränderung in der Adhärenz an humane Adenokarzinom-Zellen HT-29. Der

Integrationsort der Markierung in das Genom von E. coli-57 konnte nicht festgestellt werden.

Zusammenfassung 11

Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Resistenzentwicklung des gfp-markierten E. coli-57

gegen Fluorchinolone in vitro und in vivo vergleichend untersucht werden.

Der gfp-markierte E. coli-57 war im in vivo-Selektionsmodell „Ratte“ ohne Antibiose kulturell

über sechs Monate lang stabil nachweisbar. Die orale Gabe des Antibiotikums Ciprofloxacin

über drei Tage verursachte bei E. coli-57 einen Verlust des gfp-Gens. Das Bandenmuster

der Rep-PCR („fingerprint“-Methode) und die Ergebnisse des Southern Blot zeigten, dass es

sich bei den entstandenen Kanamycin-resistenten Klonen E. coli-4o1 und E. coli-4o2

ursprünglich um E. coli-57 handelt. Die Klone zeigten im Vergleich zu E. coli-57 keine

Veränderung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) gegen Ciprofloxacin.

Im dritten Teil der Arbeit sollte der induktive Einfluss von Substanzen auf die Expression von

MDR-Transportern untersucht werden. Humanpathogene Bakterien besitzen eine Vielzahl

solcher MDR-Transporter, deren differentielle Regulation eine Anpassung an die jeweilige

Umwelt des Keims gewährleistet. Bisher sind wenige Substanzen bekannt, die als so

genannte Induktoren eine Änderung der Expression von MDR-Transportsystemen

verursachen (z. B. Azetylsalizylsäure).

Multiresistenz, d. h. Bakterien sind gegen eine Vielzahl von antibakteriellen Substanzklassen

unempfindlich geworden, ist das Ergebnis des Zusammenwirkens von spezifischen

Mechanismen und Uptake-/Efflux-Vorgängen durch multi drug resistance

(MDR)-Transporter. Aufgrund dessen war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die systematische

Identifikation pharmakologischer Substanzen als Co-Medikation von Antibiotika, die

Expressionssteigerungen von spezifischen MDR-Transportern auslösen.

Am Beispiel von den bekannten Fluorchinolon-Transportern AcrAB, AcrEF, AcrD, NorE,

MdtH, MdtM und MdfA von Escherichia coli sollte in einem in Vorversuchen evaluierten

Gfp-Reportersystem das induktive Potential dieser Pharmazeutika analysiert werden. Bei

AcrAB handelt es sich um die am besten charakterisierte Effluxpumpe für Antibiotika in

E. coli. Sie vermittelt eine hohe Resistenz gegenüber Fluorchinolonen. Das mar-Operon ist

für die Regulation der Transkription von acrAB, acrEF, acrD und mdfA zuständig.

Für das Screening potentieller Induktoren wurden Reporterstämme generiert, die einen

Vektor mit dem gfp-Reportergen unter der Kontrolle von jeweils einem Promotor der sieben

bekannten Fluorchinolon-Pumpen tragen. Die in dem System ermittelte Gfp-Expression –ge-

messen als Fluoreszenz (visuelles Screening) oder als Transkription (Real-Time-PCR)–

spiegelte das induktive Potential einer getesteten Substanz wieder.

Neben Azetylsalizylsäure wurden Ibuprofen, Ketoprofen, Paracetamol und die jeweiligen

Lösungsmittel der Substanzen (100 %iger Ethanol oder 70 %iger Ethanol) auf induktive

Wirkung hin untersucht. Azetylsalizylsäure wurde als einzige Substanz in 70 %igem Ethanol

Zusammenfassung 12

gelöst. Für Ibuprofen, Ketoprofen und Paracetamol wurde 100 %iger Ethanol als

Lösungsmittel verwendet.

Azetylsalizylsäure zeigte, wie erwartet, einen induktiven Effekt sowohl auf die Transkription

von acrAB als auch auf die marRA-Transkription. Die Azetylsalizylatkonzentration von 5 mM

verursachte eine 5-fache Hochregulation der acrAB-Transkription. Eine Steigerung der

Expression von AcrAB um ein 2 bis 2,5-faches wurde durch 5mM Paracetamol und durch

5mM 70 %igen Ethanol verursacht. Bei 100 %igem Ethanol zeigte sich kein induktiver Effekt

auf die acrAB-Transkription.

Die Expression von MarA wurde durch 5 mM Azetylsalizylsäure 3-fach hochreguliert. 5 mM

Paracetamol verursachten eine 3,5-fache Hochregulation der marA-Transkription. Bei

Ketoprofen war eine 2-fache, bei Ibuprofen und 100 %igem Ethanol eine fast 7-fache

Hochregulation zu erkennen.

Eine Steigerung der Expression von acrD war bei allen fünf Substanzen zu beobachten.

Azetylsalizylsäure (5 mM) regulierte die Expression um ein 3,5-faches, Paracetamol (5 mM)

oder Ibuprofen (5 mM) um ein 4,5-faches und 70 %iger oder 100 %iger Ethanol um ein 3-

faches hoch.

Eine Induktion des acrEF-Promotors oder des norE-Promotors war bei keiner der genannten

Substanzen zu erkennen. Unter der Verwendung des Translationsenhancers von Cheng und

Patterson zeigte sich eine Verstärkung der Translation von norE bei allen fünf im visuellen

Screening-System ausgetesteten Substanzen.

Ibuprofen (5 mM) verursachte eine signifikante Erhöhung der minimalen Hemmkonzentration

(MHK) von E. coli gegenüber Gentamicin und Norfloxacin um vier bis fünf Titerstufen.

Durch Salizylat kann auch die Virulenz und Adhärenz von Keimen verändert werden. Um die

Auswirkungen von unterschiedlichen Salizylatkonzentrationen (5 mM–20 mM) auf E. coli zu

untersuchen sollte die Adhärenz in der Zellkultur untersucht werden. Außerdem sollten die

Expressionsänderungen von Adhärenz (sfaD/E, motB)- und Virulenzgenen (hlyE) mittels

Real-Time-PCR (RT-PCR) untersucht werden. Die bei dieser Untersuchung verwendeten

E. coli-Stämmen E. coli 1173 und E. coli 1267 zeigten bei einer Verwandtschaft

unterschiedliche MHK (4 mg/l versus (vs) 256 mg/l) gegenüber Ciprofloxacin. Die stark

erhöhte MHK von E. coli 1267 wird durch eine Deletion des C-Terminus des negativen

Regulators MarA verursacht. Eine Erhöhung der Salizylatkonzentration verursachte bei

E. coli 1267 keine Abnahme der Adhärenz. Bei E. coli 1173 zeigte sich im

Zelladhäsionsassay bei einer Zunahme der Salizylatkonzentration von 5 mM auf 20 mM eine

Abnahme der Adhärenz. Es konnte keine Veränderung in der Transkription der Gene hlyE

(Hämolysin), sfaD/E (S-Fimbrien) und motB (Motilität) in Abhängigkeit von der

Zusammenfassung 13

Salizylatkonzentration beobachtet werden. Es war bei 20 mM Salizylat eine Steigerung der

acrB-Transkription um den Faktor drei und eine 200-fache Steigerung der marA-Expression

zu beobachten.

Im nicht-induzierten Zustand zeigten die Gene hlyE, sfaD/E und motB bei E. coli 1173 und

E. coli 1267 im Vergleich keinen Expressionsunterschied.

Einleitung 14

2 Einleitung

Gegenstand der vorgelegten Dissertation ist die systematische vergleichende Untersuchung

zur Resistenzentwicklung von Escherichia coli (E. coli) gegen Fluorchinolone in vitro und in

vivo. Besonderes Augenmerk soll dabei erstens dem Einfluss der Induktion von Efflux durch

humane Pharmazeutika und zweitens dem Zusammenhang zwischen Resistenzentwicklung

und Pathogenität geschenkt werden.

Antibiotika werden in so verschiedenen Bereichen wie Humanmedizin, Tiermedizin,

Tierzucht sowie der pflanzlichen Lebensmittelproduktion verwendet. Jede Anwendung von

Antibiotika fördert die Selektion von resistenten Bakterien. Dies gilt insbesondere für die

Substanzgruppe der (Fluor-) Chinolone (engl. Fluor-Quinolones), deren breiter Einsatz in der

Humanmedizin wie der Lebensmittelproduktion zur Selektion von resistenten Mutanten und

damit zur Einschränkung ihrer Anwendung geführt hat.

Am besten ist die Resistenzentwicklung gegenüber Fluorchinolonen derzeit bei klinischen

Isolaten von Enterobacteriaceae dokumentiert. Nach nationalen Daten der

Paul-Ehrlich-Gesellschaft (www.p-e-g.de) stieg der Anteil von Ciprofloxacin-resistenten

E. coli in Deutschland in den Jahren von 1990 bis 2004 von 0,2 % auf 21,9 %. Im

europäischen Vergleich besteht für Fluorchinolon-resistente E. coli ein deutliches

Nord-Süd-Gefälle, bei dem im Süden von Europa ein Anteil von 25−50 % erreicht wird.

(http://www.rivm.nl/earss/)

Abb. 1: Anteil von invasiven Escherichia coli-Isolaten mit Fluorchinolon-Resistenz im Jahr 2005 Quelle: (http://www.rivm.nl/earss/Images/EARSS %202005_tcm61-34899.pdf)

Weil E. coli der häufigste Vertreter der Enterobacteriaceae im Darm des Menschen und

Ciprofloxacin das am häufigsten eingesetzte Fluorchinolon ist, werden beide in der

Einleitung 15

vorliegenden Arbeit als Stellvertreter der Enterobacteriaceae bzw. der Fluorchinolone

verwendet. Um die Resistenzentwicklung in vivo zu untersuchen, wurde ein

Kolonisationsmodell im Rattendarm etabliert.

2.1 Escherichia coli

E. coli gehört innerhalb der Proteobakterien zu der Familie der

Enterobacteriaceae und zählt zu den am intensivsten

untersuchten Mikroorganismen sowohl aus dem Blickwinkel

der humanpathogenen Bedeutung als auch der

molekularbiologischen Grundlagenforschung.

E. coli kommt bei Mensch und Tier als Kommensale in der

Normalflora des Gastrointestinaltrakts sowie der perianalen

Haut vor. Isolate mit dieser Herkunft werden als fakultativ

pathogen eingestuft, da sie bei Patienten mit Risikofaktoren zu

so genannten nosokomialen (= im Krankenhaus erworbenen)

Infektionen führen131,141,179. Daneben besteht auch in der Umwelt (temperierte Erde,

Süßwasserstrände) ein Reservoir von Vertretern von E. coli-Stämmen, die vermutlich nur

eine geringe humanpathogene Bedeutung besitzen. Stämme aus der Umwelt lassen sich

durch genotypische Merkmale von humanpathogenen Varianten abgrenzen 6.

Humanpathogene Stämme gehören meist zu den phylogenetischen Gruppen B2 und

D 41,66,124.

Tab. 1: Definition von Pathogenität, Virulenz, fakultativ pathogen und obligat pathogen Begriff Definition

Pathogenität Fähigkeit eines Erregers eine Krankheit

beim Wirt auszulösen

Virulenz Maß der Fähigkeit eines Krankheitserregers

einen Organismus zu infizieren

fakultativ pathogen Keim erzeugt fallweise Krankheiten

obligat pathogen Keim erzeugt immer eine Krankheit aus

Obligat pathogene Varianten von E. coli können bei Menschen und Tieren eine Reihe von

spezifischen Krankheitsbildern auslösen können. Obligat pathogene und fakultativ

pathogene E. coli-Stämme weisen eine unterschiedliche Anzahl und ein unterschiedliches

Spektrum von offenen Leserahmen (open reading frames, ORFs) und regulatorischen

Elementen auf66. Im Genom eines pathogenen Stammes können bis zu 10 % der für den

apathogenen Laborstamm E. coli K12 spezifischen ORFs nicht detektiert werden. Bei

Charakteristika E. coli

Gram-negative Stäbchen

peritrich begeißelt

fakultativ anaerob

Laktose-positiv

Mannit-positiv

Glukose-positiv

Oxidase-negativ

Citrat-negativ

H2S-Bildung-negativ

nicht-sporenbildend

Einleitung 16

diesem Vergleich sind 27,2 % der translatierbaren ORFs zwischen dem pathogenen und

dem kommensalen Stamm variabel und beinhalten das akzessorische Genom66. Die meisten

der variablen chromosomalen Regionen bilden neben hypothetischen, nicht-klassifizierten

und unbekannten ORFs auch ORFs, die an der Lipopolysaccharid-Biosynthese beteiligt sind.

Die konservierten E. coli-spezifischen Regionen des Genoms (= core genome) enthalten

mindestens 3.100 translatierbare offene Leserahmen des Stammes K12. Diese ORFs

enthalten 232 Gene von E. coli, die für essentiell gehalten werden 66.

Virulenzgene pathogener Bakterien befinden sich entweder auf mobilen genetischen

Elementen (Bakteriophagen, Plasmide, Integrons) oder auf so genannten

Pathogenitätsinseln. Die den Stämmen eigene Ausstattung an Pathogenitätsfaktoren und

deren Expressionsmuster ist verantwortlich und entscheidend für die Auslösung eines

bestimmten Krankheitsbildes 131,159,289.

Bei extraintestinalen Erkrankungen wird eine Adaption an die neue Umgebung meist durch

zusätzliche spezielle Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren wie Adhäsine, Siderophore,

Toxine, Invasine und eine Polysaccharid-Kapsel ermöglicht 125. Eine Übersicht zu putativen

Pathogenitätsfaktoren findet sich in Tabelle 2.

Tab. 2: Übersicht der putativen Pathogenitätsfaktoren von E. coli. Pathogenitätsfaktoren, die obligat zu einer klinisch manifesten Infektion führen, sind mit einem * gekennzeichnet. Die in dieser Arbeit untersuchten Faktoren sind mit einem + gekennzeichnet. Bezeichnung einer Gruppe von

Pathogenitäts- od. Virulenzfaktoren

Vertreter aus der jeweiligen Gruppe

Adhäsine CFAI/CFAII

Typ-1-Fimbrien

P-Fimbrien

S-Fimbrien+

Intimin (eae)

Invasine Hämolysin+

Siderophore

Shigella-ähnliches „Invasin“

Beweglichkeit, Chemotaxis Flagellen+

Toxine LT Toxin (Hitzelabiles Toxin)

ST Toxin (Hitzestabiles Toxin)

Shiga-ähnliches Toxin*

Zytotoxine

Endotoxin (LPS)

Einleitung 17

Bezeichnung einer Gruppe von

Pathogenitäts- od. Virulenzfaktoren

Vertreter aus der jeweiligen Gruppe

Antiphagocytic surface properties Kapsel

K-Antigene

LPS

Defense against serum bactericidal

reaction

LPS

K-Antigene

Abwehr der Immunantwort Kapsel

K-Antigene

LPS

Antigen-Varianten

Genetic attributes genetischer Austausch durch Transduktion u.

Konjugation

übertragbare Plasmide

Resistenzfaktoren u.

Antibiotika-Resistenz-Plasmide

Toxin- u. andere Virulenzplasmide

2.2 Bakterielle Resistenzentwicklung gegen Fluorchinolone

2.2.1 Struktur der Fluorchinolone

Fluorchinolone sind eine Gruppe synthetisch hergestellter antibakterieller Substanzen, die

als Grundstruktur ein bizyklisches aromatisches Ringsystem aufweisen. Ciprofloxacin ist der

wichtigste klinische Vertreter7.

2.2.2 Eigenschaften von Fluorchinolonen

Fluorchinolone besitzen folgende klinisch wichtige Eigenschaften:

• schnelle Bakterizidie, z. T. auch auf ruhende Keime

• breites Aktivitätsspektrum (Gram-positiv, Gram-negativ, intrazelluläre Erreger)

• hohe orale Bioverfügbarkeit (i. d. R. > 90 %)

• gute Penetration in Gewebe, hohe intrazelluläre Konzentration (Vielfaches der

Serumspiegel)

• günstiges Nebenwirkungsprofil

Einleitung 18

Diese Eigenschaften prädestinieren die Fluorchinolone zur Therapie von

Harnwegsinfektionen, Pneumonien, Infekten von Weichteilen, Knochen und Haut im

ambulanten und stationären Bereich.

2.2.2.1 Pharmakodynamik

Fluorchinolone ermöglichen ein schnelles Abtöten der Bakterien und sind somit bakterizid.

Unter „Bakterizidie“ versteht man die Fähigkeit eines Antibiotikums die Zahl der lebenden

Zellen um 3 log-Stufen innerhalb von 3 Stunden zu reduzieren112. Bei Fluorchinolonen lassen

sich drei unterschiedliche Mechanismen, die zur Abtötung der Zellen führen, unterscheiden.

Eine Typ-A-Bakterizidie zeigt sich bei Nalidixinsäure. Diese wirkt nur gegen sich teilende

Bakterien und benötigt RNA- und Proteinsynthese. Bei Inhibierung der Proteinbiosynthese

durch Zugabe von Rifampicin bzw. unter Wachstumsbedingungen ohne Zellteilung

(Zellsuspension in PBS) zeigt sich keine bakterizide Wirkung.

Fluorchinolone mit Typ-B-Bakterizidie benötigen weder RNA- noch Proteinsynthese um

einen bakteriziden Effekt aufzuweisen. Sie wirken auch gegenüber ruhenden Zellen. Für die

Typ-C-Bakterizidie wird RNA- und Proteinsynthese benötigt. Die Zellen müssen sich jedoch

nicht in Teilung befinden 112. Eine Zusammenfassung zu Typ-A-, Typ-B- und

Typ-C-Bakterizidie zeigt die folgende Tabelle 3112.

Tab. 3: Übersicht zu den unterschiedlichen Bakterizidie-Typen. „+" entspricht ist nötig, „—" entspricht nicht nötig Voraussetzungen für

Wirkung

Typ-A-Bakterizidie Typ-B-Bakterizidie Typ-C-Bakterizidie

RNA- und

Proteinsynthese

+ — +

Teilung der Zellen + — —

2.2.2.2 Wirkmechanismus der Fluorchinolone

Die Fluorchinolone blockieren die DNA-Replikation 62,228,268,303, die RNA-Synthese 185,307 und

das Zellwachstum 38,96 über eine Arretierung der Topoisomerasen II und IV an der DNA.

2.2.2.3 Zielstruktur der Fluorchinolone

Bei E. coli gelangen die Fluorchinolone durch passive Diffusion und durch die Porine OmpF

und OmpC in die Zelle und binden dann an ihre intrazellulären Zielstrukturen, die bakteriellen

Topoisomerasen (DNA-Gyrase = Topoisomerase II; Topoisomerase IV) 18.

Die Aufgabe der Gyrase besteht in der Einführung bzw. Aufhebung negativer

Überspiralisierung in die DNA-Helix. Hierbei schneidet sie in einer ATP-abhängigen Reaktion

Einleitung 19

beide Stränge eines DNA-Segmentes, führt ein zweites Segment durch die Lücke und

schließt diese wieder. Diese Überspiralisierung der DNA-Helix ermöglicht es erst das

DNA-Molekül in der Bakterienzelle unterzubringen 264,287.

Die Topoisomerase IV dekateniert ineinander greifende DNA-Moleküle (wie z. B. Plasmide,

Tochterchromosomen), die während des Replikationsprozesses entstehen. Auch diese

Reaktion verläuft unter Doppelstrangbruch und ATP-Verbrauch.

Das Enzym Gyrase ist ein Tetramer aus je zwei identischen Untereinheiten A und B, die von

den Genen gyrA und gyrB kodiert werden. Die Topoisomerase IV besteht entsprechend der

Gyrase aus den homologen Untereinheiten ParC und ParE 75. GyrA und analog dazu ParC

beinhalten das aktive Zentrum, welches den DNA-Doppelstrang schneidet und wieder ligiert,

während GyrB und ParE für die Bindung von ATP als Energielieferant zuständig sind.

Vergleicht man bei E. coli die DNA-Sequenzen von gyrA und parC, ergibt sich eine

Homologie von 35,9 %. Zwischen gyrB und parE besteht eine Homologie von 40,1 % 130.

Trotz ihrer großen Ähnlichkeit sind die beiden Topoisomerasen nicht austauschbar. Die

Funktion der DNA-Gyrase in der Bakterienzelle ist essentiell und kann durch kein anderes

Enzym ersetzt werden.

Nach einem Modell zum Wirkmechanismus der Chinolone erfolgt die Inhibition der

Nukleinsäure-Synthese durch Interaktion zwischen dem Fluorchinolon und einem aus DNA

und Topoisomerase (GyrA- bzw. ParC-Untereinheit) gebildeten ternären

Komplex 74,107,111,260,308,315. Die Bindung des Fluorchinolons erfolgt wahrscheinlich zwischen

der Helix-4-Struktur der GyrA- bzw. ParC-Untereinheit sowie Regionen in GyrB bzw. ParE

und der DNA 73. Durch Entfernung des Fluorchinolons und Zugabe von EDTA oder durch

milde Hitzebehandlung kann der ternäre Komplex aufgelöst und der Doppelstrangbruch

rückgängig gemacht werden. Diese Reversibilität deutet darauf hin, dass die entstandenen

Strangbrüche selbst nicht letal sind 73,183,228.

Die Hemmung der Gyrase und somit der Replikation erfolgt nach Zugabe von Fluorchinolon

innerhalb von Minuten 96,268. Diese schnelle Inhibierung ist reversibel 96 und ist vermutlich

nicht die Ursache für den Zelltod. Bei der Topoisomerase IV erfolgt die

Replikationshemmung in E. coli langsam, da die Topoisomerase IV hinter der

Replikationsgabel agiert. Daher ist mehr Zeit für die Dissoziation des Komplexes und die

Reparatur der Defekte 138.

2.2.2.4 Veränderung der Genexpression durch Chinolone

Das SOS-Regulon besteht aus mehr als 30 Genen und wird von LexA unter günstigen

Wachstumsbedingungen reprimiert. Die SOS-Antwort ist ein Reparaturmechanismus der

Zelle, der nach schädigenden Einflüssen auf die DNA der Bakterien einsetzt 179. Die

Einleitung 20

Expression des recA-Gens aus dem SOS-Regulon wird durch UV-Strahlung, Mitomycin und

Chinolone induziert 225. Die entstandenen DNA-Schäden induzieren die Proteasefunktion des

RecA-Proteins, was zu einer Inaktivierung des LexA-Repressors führt. Normalerweise ist das

RecA-Protein in Gegenwart von ATP für den Austausch von Komplementärsträngen bei der

homologen Rekombination verantwortlich 135,139,179.

Neben recA wird auch das Gen sfiA verstärkt abgelesen. Das SfiA-Protein inhibiert die

Zellteilung und führt bei E. coli zur Bildung von langen und filamentösen Strukturen. Dieses

sfiA-abhängige Wachstum der E. coli-Zellen ist eindeutig reversibel und hat daher

wahrscheinlich keine entscheidende Rolle im schnellen Zelltod durch Fluorchinolone 65,73,180.

Da Fluorchinolone gesteigerte bakterizide Wirkung gegen Mutanten mit defektem

SOS-Regulon zeigen160,225,300, scheint auch die Induktion der SOS-Antwort nur eine

Komponente in dem komplexen Prozess der Bakterizidie der Fluorchinolone zu sein 73,160,194,225,300.

Als nicht-spezifischer Faktor ist die Oberflächenhydrophobizität mitverantwortlich für die

bakterielle Adhäsion. Die hydrophoben Eigenschaften sind für die Biofilmbildung und die

Adhäsion an Epithelien verantwortlich. Unter subinhibitorischen Konzentrationen von

Ciprofloxacin sinkt die Adhäsion von E. coli an Epithelzellen 70,222,297,310. Allerdings zeigt sich

eine gesteigerte Adhärenz an Plastikmaterialien wie z. B. Katheter 15.

2.2.2.5 Kinetik

Aufgrund der raschen enteralen Resorption wird der maximale Plasmaspiegel im Menschen

bei oraler Gabe von Ciprofloxacin in der Regel nach 1,3 Stunden erreicht. Bei der Ratte ist

dies schon nach 0,33 Stunden der Fall.

Die Halbwertszeit T1/2 von Ciprofloxacin liegt beim Menschen zwischen 4 und 5 Stunden. In

der Ratte beträgt die Halbwertszeit 3 Stunden.

Die Ausscheidung der Fluorchinolone erfolgt nach vorheriger Metabolisierung in der Leber

über den Urin und den Stuhl. Es finden sich für die verschiedenen Vertreter der Chinolone

Unterschiede in der Ausscheidungsmenge über Stuhl und Urin. Nach oraler Gabe von

Ciprofloxacin werden 44,7 % der Gesamtmenge und 11 % als Metabolite über den Urin

ausgeschieden. Weitere 25 % der Gesamtmenge und 7,5 % als Metabolite werden über den

Stuhl abgegeben. Im Gegensatz hierzu scheidet die Ratte 81 % über den Kot und 8,2 %

über den Urin aus 7,58.

2.3 Mechanismen der Fluorchinolonresistenz

Die Resistenzmechanismen gegen Fluorchinolone gehen größtenteils auf (Punkt-)

Mutationen von chromosomalen Sequenzen zurück. Diese Mutationen verringern entweder

Einleitung 21

die Affinität der Zielstruktur (Untereinheiten GyrA/B der Topoisomerase II und ParC/E der

Topoisomerase IV) zum Fluorchinolon, oder die Konzentration des Antibiotikums in der Zelle.

Die Verringerung der Konzentration wird durch eine verminderte Permeabilität der

Membranen und/oder aktiven Efflux hervorgerufen. Die von den Wachstumsbedingungen

abhängige Mutationsrate wird von den Bakterien sehr genau kontrolliert. Die Mutationsrate in

vivo wird von ganz spezifischen Stress-Bedingungen wie z. B. Begleitflora, Immunabwehr

des Wirts, Antibiotika beeinflusst215. Da die MHK einer Ein-Schritt-Mutante weit unterhalb der

Serumkonzentrationen liegt, die über mehrere Stunden bei einer Fluorchinolon-Therapie

erreicht werden, kann eine klinisch relevante Resistenz (beträgt das 200-fache der

Wildtyp-Resistenz), in einem Schritt im Serum bzw. Gewebe nicht selektioniert werden 115.

Laut Lewis et al. beträgt die Mutationsrate für jede einzelne dieser Mutationen zumindest

10―7 161. Zur Überwindung des klinischen Grenzwertes in einem Schritt wären also

mindestens 1014 Koloniebildende Einheiten (KBE) nötig, eine Zellzahl die unter

physiologischen Bedingungen nicht auftritt 171.

2.3.1 Topoisomerasemutationen

Zielstrukturveränderungen durch Punktmutationen betreffen bei Gram-negativen Bakterien

die A-Untereinheit (gyrA) der DNA-Gyrase und die entsprechende Untereinheit (parC) der

Topoisomerase IV. Generell konzentrieren sich Punktmutationen innerhalb der Gene für die

Topoisomerase-Untereinheiten vorrangig auf die so genannte QRDR (quinolone resistance

determining region). Bei E. coli liegt diese Region zwischen AS 67 bzw. 51 und AS 106. Der

mutationsbedingte Austausch einzelner hochkonservierter Aminosäuren im Enzym führt zu

einer Konformationsänderung, die entweder die Affinität zwischen Antibiotikum und Enzym,

die Interaktion der Monomere oder die Affinität des Enzymkomplexes zum DNA-Strang

verringert 306,312,316.

Nahezu alle high-level Fluorchinolon-resistenten klinischen Isolate von E. coli besitzen eine

Kombination aus Gyrase- und Topoisomerase IV-Mutationen103. Keine der bekannten

Mutationen führt alleine zu einer klinisch relevanten Resistenz. Bis zu dem Erreichen einer

klinisch relevanten Resistenz sind bei E. coli neben GyrA-Doppel-Mutationen in den Codons

AS 83 und AS 87 auch Mutationen in der ParC-Untereinheit der Topoisomerase IV

notwendig. Bei E. coli sind besonders häufig Mutationen, die die Aminosäuren AS 80 und

AS 84 der ParC-Untereinheit betreffen, beteiligt 103. Die Mutationen innerhalb von GyrA und

ParC verringern die Affinität der Zielstrukturen (Untereinheiten GyrA/B der Topoisomerase II

und ParC/E der Topoisomerase IV) für Fluorchinolone.

Einleitung 22

2.3.2 Efflux und Influx

Im Hinblick auf die Resistenzentwicklung gegen Fluorchinolone kommt Efflux als

Mechanismus – in vielen Fällen im Synergismus mit einer verringerten

Membranpermeabilität – möglicherweise eine größere Bedeutung zu als bisher

angenommen wurde. Eine durch Efflux verursachte im Vergleich zur GyrA-Mutation eher

geringe MHK-Erhöhung scheint auf den ersten Blick eine untergeordnete Rolle zu spielen,

ermöglicht einer Subpopulation aber gegebenenfalls entsprechende

Antibiotikakonzentrationen zu überleben, bis der Erwerb von anderen Mechanismen zu einer

high-level Resistenz (Minimale Hemmkonzentration für Ciprofloxacin > 4 µg/ml) führt 103.

Von 37 putativen MDR-Transportern (multi drug resistance) des E. coli-Genoms sind

mindestens sieben (AcrAB, AcrEF, AcrD, MdfA, MdtK, MdtH und MdtM) am Efflux von

Fluorchinolonen beteiligt 210. Das am besten charakterisierte Effluxsystem bei den Entero-

bacteriaceae ist der zur RND-Familie (resistance, nodulation, cell division) der

MDR-Transporter zählende AcrAB-TolC-Transporter von E. coli 163,212,301. Neben dem

zytoplasmatischen eigentlichen Pumpprotein AcrB wird dieser trimere Komplex noch von

einem Membranfusionsprotein (AcrA) und dem Tunnelprotein TolC der äußeren Membran

gebildet. AcrAB besitzt ein sehr breites Substratspektrum, denn neben Fluorchinolonen

werden auch andere Antibiotika (u. a. Chloramphenicol, Tetrazyklin, Cefuroxim),

Desinfektionsmittel (Triclosan) und lipophile Substanzen aktiv aus der Zelle entfernt 78,176. Die

Expression von AcrAB und der Mehrheit induzierbarer bakterieller Effluxsysteme wird auf der

Ebene der Transkription durch spezifische oder globale Regulatoren kontrolliert. AcrAB wird

auf einem geringen Level konstitutiv exprimiert, Änderungen der Expression sind fast immer

Folge der Deregulation durch die Transkriptionsfaktoren AcrR, MarR/A, SoxS/R oder

Rob 97,208.

Eine gesteigerte Produktion der Untereinheiten des AcrAB-Effluxsystems in E. coli wird in

der Mehrheit der bisher untersuchten klinischen Isolate durch Mutationen im marRA-Operon

verursacht. Diese Mutationen führen zur Derepression des polycistronisch transkribierten

Gens marA 1. Als transkriptorischer Aktivator beeinflusst MarA neben den Genen des

AcrAB-TolC-Transporters eine ganze Reihe von Genen, die als mar-Regulon

zusammengefasst werden 1. Der mar-Locus besteht aus zwei Operons, die den Operator

marO flankieren. Das eine Operon kodiert für MarC, ein integrales Protein der

Zytoplasmamembran, das möglicherweise eine Rolle in der Fluorchinolonresistenz spielt 1.

Das andere Operon marRAB kodiert für den Repressor MarR sowie für MarA und MarB 45.

MarA ist ein Transkriptionsaktivator, der einerseits durch Aktivierung von micF die

Expression von ompF reprimiert 45, andererseits die Expression der AcrAB-Effluxpumpe

steigert 214. Normalerweise wird die Expression von marA durch den Repressor MarR

Einleitung 23

reprimiert, bei Mutationen in marR oder marO kann marA aber konstitutiv transkribiert

werden und es kommt zur Ausbildung des MAR-Phänotyps 45. Die Funktion des Genprodukts

von marB ist noch ungeklärt 1. Asako et al. konnten 1997 zeigen, dass Mutationen in marR,

die zu einer Überexpression von MarA und somit zur Ausprägung des MAR-Phänotyps

führen, auch für Lösungsmittel-Toleranz in E. coli verantwortlich sind 11.

Die intrazelluläre Menge an MarA wird neben MarR auch durch andere globale Regulatoren

wie SoxS und Rob (MarA-Homologe) gesteuert. Eine detaillierte Darstellung der

regulatorischen Kontrolle der Expression an AcrAB findet sich in Grikovic et al. 97.

Bei E. coli ist der verringerte Einstrom von Chinolonen hauptsächlich auf eine Reduktion der

Anzahl oder Veränderungen der OmpF-Porine in der äußeren Membran zurückzuführen 104.

Dies sind zum einen Mutationen in dem ompF-Gen selber, zum anderen können aber auch

Mutationen im mar-Operon zu einer Reprimierung der ompF-Expression führen, was eine

verminderte Fluorchinolon-Aufnahme zur Folge hat 45,114.

2.3.3 Plasmidvermittelte Resistenz

Die bisher beschriebenen Mechanismen der Fluorchinolonresistenz sind alle chromosomal

kodiert und können nicht horizontal auf andere Bakterien übertragen werden. 1998

berichteten Martinez-Martinez et al. über plasmidkodierte Fluorchinolon-Resistenz, die von

Klebsiella pneumoniae auf E. coli übertragbar ist 192. 2002 konnten Tran und Jacoby zeigen,

dass diese Resistenz von dem qnr-Gen vermittelt wird, das Teil eines plasmidkodierten

Integrons ist 285. Der Resistenz-Mechanismus scheint nach bisherigen Vorstellungen auf

einem Schutz der Gyrase (nicht aber der Topoisomerase IV) durch das Qnr-Protein zu

beruhen. Strukturanalysen eines Qnr-Proteins aus Enterococcus faecalis (E. faecalis)

zeigten, dass dieses Protein in Gestalt und Form der DNA ähnelt und elektrostatische

Ähnlichkeiten zur DNA aufweist. Bei dem Vergleich der DNA-Sequenzen von qnrE. faecalis und

qnrE. coli zeigte sich eine Homologie von 40 % 10. Diese Fähigkeit die DNA nachzuahmen

erklärt den inhibitorischen Effekt des Proteins auf die DNA-Gyrase und die

Fluorchinolonresistenz. Ein ähnlicher Mechanismus kann bei Qnr-Protein aus Klebsiella

pneumoniae erwartet werden 10.

Qnr selbst vermittelt nur eine geringe Erhöhung der MHK um 1 –2 Titerstufen, es erleichtert

aber die Selektion hochresistenter Mutanten und kann bereits bestehende Resistenz

verstärken, wodurch qnr klinisch relevant sein könnte 191,192.

In Japan wurde ein weiterer plasmid-vermittelter Mechanismus der Fluorchinolonresistenz

entdeckt. In einem E. coli-Stamm wurde das plasmidkodierte Resistenzgen qepA identifiziert,

Einleitung 24

welches vermutlich für eine Effluxpumpe kodiert 313. QepA zeigt deutliche Ähnlichkeit

gegenüber Membrantransportern aus Aktinomyceten (Gram-positive, filamentöse, GC-reiche

Bakterien). Eine geringe Sequenzhomologie von qepA (weniger als 38 %) wurde mit der

Effluxpumpe EmrB aus Gram-negativen Bakterien gefunden 313. Die Transformation eines

qepA-tragenden Plasmids in E. coli DH10B führt zu einem Anstieg der MHK gegenüber

Norfloxacin von < 0,008 µg/ml auf 0,25 µg/ml 313.

2.3.4 Chemische Modifizierung

Die chemische Modifizierung eines Antibiotikums durch eine Enzymaktivität kann die

Inaktivierung des Antibiotikums zur Folge habe. Bekanntestes Beispiel ist die

plasmidkodierte β-Lactamase, die β-Lactam-Antibiotika inaktiviert 34. Robiscek et al.

isolierten aus E. coli das plasmidkodierte Enzym aac(6')-Ib, welches über eine Azetylierung

die Aktivität von Aminoglykosiden und bestimmten Fluorchinolonen (Ciprofloxacin,

Norfloxacin) verringern kann 240.

2.3.5 Induktoren von Effluxsystemen

Nicht nur über chromosomale Veränderungen kann es zur Induktion von Efflux und somit zur

Resistenzentwicklung kommen, sondern auch über externe Faktoren wie z. B. Salizylat.

Salizylat induziert in therapeutisch genutzten Konzentrationen die Expression von MarA

durch eine Aufhebung der MarR-Repression 2,189, während beispielsweise Paraquat durch

die Oxidation des Repressors SoxR die Expression von SoxS fördert. Ethanol, „pine oil“,

Naphthochinone (Plumbagin) und Gallensalze verursachen (als mögliche Induktoren)

Efflux-Phänotypen 177,202,258,283 und rufen z. T. einen MAR-Phänotyp hervor.

Im Fall von Salizylat zeigte sich bei in vitro Untersuchungen zur Resistenzentwicklung in

E. coli, dass Salizylat die natürliche Empfindlichkeit durch Effluxinduktion um den Faktor 8–

10 verringert werden kann. Unter dem Einfluss von Salizylat (2 mM) konnten in 1010 KBE

Mutanten selektioniert werden, deren MHK mit 1 µg/ml vierfach über dem Wert einer

Einschritt-Mutante lag, während ohne Einfluss dieses Induktors keine resistenten Stämme

selektiert werden konnten 84.

Die molekulare Wirkungsweise von Salizylat als ein Induktor auf den Uptake/Efflux-Komplex

ist weitgehend aufgeklärt 47. Salizylat inaktiviert durch sterische Bindung den Repressor

MarR und verhindert die Dimerisierung und die Bindung an die Operator-Region des

marRAB-Operons. Infolge der dadurch gesteigerten Produktion des globalen Regulators

MarA kommt es zu einer Verringerung der Produktion von Porinen wie OmpF und

möglicherweise OmpC 245, sowie gleichzeitig zu einer gesteigerten Expression von AcrAB,

was synergistisch zu einer verringerten Akkumulation von Antibiotika in der Zelle führt 177.

Einleitung 25

Die Salizylat-induzierte Reduktion von OmpF wird durch die verstärkte Transkription der

antisense-RNA micF gesteuert, deren Interaktion mit der mRNA von ompF die Translation

verhindert 245. Neben Salizylat haben auch Gewürze (z. B. Paprika, Estragon, Zimt) und

Haushaltsprodukte (z. B. Senf, Haargel, Badeschaum, Chili-Knoblauch-Sauce) eine

induzierende Wirkung auf das mar-Operon und somit auf AcrAB-TolC 238.

Neben AcrAB-TolC wird zumindest die Transkription der Gene zweier weiterer

MDR-Efflux-Pumpen (EmrAB und ErmKY) in E. coli von Salizylat induziert. Tetrazyklin und

Chloramphenicol besitzen ebenfalls eine induzierende Wirkung auf diese

Effluxpumpen 170,279.

Neben Salizylat, Paraquat, Ethanol, Gallensalzen und Haushaltsprodukten sind bisher keine

weiteren Induktoren identifiziert worden. Im Hinblick auf eine Resistenzentwicklung gegen

Fluorchinolone verursachen Induktoren aber mit ihrer Wirkung auf den

Uptake/Efflux-Komplex eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Selektion von Mutanten. Viele

pharmakologische Substanzen (Medikamente bzw. deren Inhaltsstoffe), die während einer

Antibiotika-Therapie zusätzlich verabreicht werden (Co-Medikation), sind in dieser Hinsicht

noch nicht auf ihr Potential als Induktor untersucht worden. Besonders interessant sind dabei

oral applizierte Medikamente, weil sie im Darm hohe Spiegel erreichen und dort mit einer

großen E. coli-Population in Kontakt kommen. Da während einer Antibiotika-Therapie häufig

Schmerzmittel mit anti-entzündlicher Wirkung verabreicht werden, sind diese Substanzen als

potentielle Induktoren von Interesse.

2.4 In vitro-Selektion

Damit E. coli gegenüber Fluorchinolonen eine klinisch relevante Resistenz erreicht, müssen

mehrere Targetmutationen akkumulieren 103. Einzelne Mutationen führen zwar zu keiner

klinisch relevanten Resistenz, allerdings können sie dem Organismus unter einem

bestimmten Selektionsdruck einen entscheidenden Vorteil gegenüber Konkurrenten in der

Normalflora verschaffen 134,165,166. Das Muster Targetmutation/Steigerung des

Efflux/Targetmutation zeigt sich bei der in vitro-Selektion von resistenten Keimen auf

chinolonhaltigen Medien.

Bei der Selektion von resistenten Keimen in vitro zeigen sich veränderte

Wachstumseigenschaften mit kleineren Koloniedurchmessern und eine verminderte

Zellteilungsrate. Nach 200–300-maligem Passagieren dieser Selektanten zeigt sich wieder

ein normaler Phänotyp mit einem normalen Spiralisierungsgrad der DNA 253. Dieser

Entwicklung liegen wahrscheinlich kompensatorische Mutationen zu Grunde.

Einleitung 26

2.4.1 In vitro-Experimente

Um die Art und die Abfolge der Mutationen genauer zu untersuchen wurden in

vitro-Experimente mit E. coli-Stämmen durchgeführt. In diesen Versuchen wurde auf eine

ciprofloxacinhaltige LB-Platte (0,064 µg/ml) ein E. coli-Stamm mit einer MHK von 0,003 µg/ml

ausplattiert. Viele hieraus hervorgegangenen Selektanten zeigten danach veränderte

Wachstumseigenschaften mit kleineren Koloniedurchmessern und verminderter

Zellteilungsrate 104,165,298. Neben einer verlängerten Generationszeit kam es zur Abnahme

des negativen Superspiralisierungsgrads der DNA und zum Verlust der

Typ-1-Fimbrienexpression 13,14. Fimbrien vermitteln in einem ersten Schritt der Pathogenese

die Adhärenz des Bakteriums an eine Zelle des Wirts. Keime mit verminderter

Fimbrienexpression besitzen wahrscheinlich eine verminderte pathogene Potenz 13,19.

2.4.2 Fitness

Der Fortpflanzungserfolg und somit das Wachstumsverhalten von Bakterien kann als

„Fitness" bezeichnet werden 22,158,172,237. Es kann also ein Unterschied in der „Fitness“

angenommen werden, wenn sich Mutanten in der Koloniegröße und somit der Teilungsrate

unterscheiden. Diese Teilungsrate ist für das Überleben in gemischten Populationen bzw.

der Auseinandersetzung mit dem Immunsystem des Wirts von entscheidender Bedeutung 99.

Eine Veränderung der „Fitness“ kann sowohl bei in vitro als auch bei in vivo erzeugten

Resistenz-Mutanten beobachtet werden 22,158,237.

Da Antibiotika auf essentielle Genprodukte und Funktionen innerhalb der Zelle einwirken,

beeinflussen Mutationen innerhalb dieser Gene den bakteriellen Stoffwechsel und das

Wachstumsverhalten möglicherweise negativ. Bei Fluorchinolon-resistenten Campylobacter

konnte gezeigt werden, dass es mit hoher Wahrscheinlichkeit vom genetischen Hintergrund

abhängt, ob sich eine Mutation in GyrA positiv oder negativ auf die „Fitness“ auswirkt 175. Bei

E. coli (klinische Isolate), Salmonella typhimurium (in vitro-Mutanten) und Mycobacterium

tuberculosis (klinische Isolate) mit Mutationen in rpsL (kodiert für das 30S ribosomale Protein

S12) konnte keine messbare Reduktion der Wachstumsrate beobachtet werden 21,23,232,248.

Bei Streptococcus pneumoniae mit einer Mutation in GyrA oder ParC zeigte sich ein

Fitnessverlust von bis zu 8 %. Eine zweite Mutation verursachte bei Streptococcus

pneumoniae keine weitere Erhöhung des Fitnessverlustes 246.

In Bezug auf die Resistenz gegenüber Fluorchinolonen und deren Auswirkung auf die

biologische „Fitness“ von E. coli wurde gezeigt, dass die Akkumulierung von

Fluorchinolonresistenz-Mutationen eine starke Abnahme der „Fitness“ zur Folge hat. Diese

zeigte sich sowohl in vitro als auch in vivo 98,146.

Einleitung 27

Die Abnahme der Fimbrienexpression verschlechtert die Konkurrenzfähigkeit des Bakteriums

gegenüber der Normalflora (bei der Kolonisation) und gegen das Immunsystem des

Wirts 13,19.

2.4.3 Kompensatorische Mutationen

Resistente Bakterien haben gegenüber ihren Wildtypen bei einer Antibiotika-haltigen

Umgebung einen großen Selektionsvorteil, auch wenn sie im Vergleich zum Wildtyp einen

„Fitnessnachteil“ haben. Dieser Vorteil wird sofort zum Nachteil, sobald der Selektionsdruck

Antibiotikum wegfällt. Tritt dieser Fall ein, dann hat die resistente Mutante zwei Möglichkeiten

um wieder konkurrenzfähig zu dem Wildtyp zu werden. Entweder revertiert die resistente

Mutante die Mutation, die zur Antibiotika-Resistenz geführt hat und wird somit wieder

Antibiotika-sensibel, oder es kommt zu kompensatorischen Mutationen, die den

Fitnessverlust durch Resistenz-assoziierte Mutationen teilweise ausgleichen 22,237. Die

Wahrscheinlichkeit einer Revertierung der Mutation liegt zwischen 10―11–10―9 104 Es handelt

sich dabei um eine einzelne spezifische Nukleotidveränderung. Kompensatorische

Mutationen treten mit einer Wahrscheinlichkeit von 10―6 auf147. Es wird vermutet, dass die

Kompensation durch Mutation in einem unbekannten Gen (Deletion, Insertion,

Basenpaarsubstitution usw.) entsteht, was eine höhere Mutationsrate zur Folge hat 30,113,147.

Kompensatorische Mutationen tragen so vermutlich zur Stabilisierung der

Antibiotika-Resistenz in einer Bakterienpopulation 22,158.

Bei einem chromosomal vorhandenen Resistenz-Gen kann eine „Revertierung“ der

Resistenz über gene silencing erfolgen. In Anwesenheit des Selektionsdrucks „Antibiotikum“

wird das Resistenz-Gen abgelesen, in Abwesenheit wird es nicht exprimiert 80.

2.5 Vergleich von in vitro- zu in vivo-Mutanten

Grundsätzlich sind im Patienten (in vivo) Antibiotikakonzentrationen nicht so konstant wie

unter in vitro-Bedingungen. Sie unterliegen während einer Therapie komplexen Mustern und

schwanken im Zeitverlauf sowie gewebe- bzw. kompartimentabhängig. Insbesonders nach

der letzten Gabe wird der gesamte Konzentrationsbereich vom Spitzenspiegel bis zum

völligen Verschwinden der Substanz durchschritten. Diese notwendig auftretenden

subinhibitorischen Antibiotikakonzentrationen sind vermutlich die optimale Umgebung für die

Selektion von resistenten Mutanten innerhalb einer langsam wachsenden und ansonsten

empfindlichen Bakterienpopulation 55,71-73,81

Zur Abschätzung des Selektionspotentials eines Antibiotikums wurde zusätzlich zur MHK

(Minimale Hemmkonzentration) die MPC (mutant prevention concentration) eingeführt 71-73.

Der MPC-Wert definiert die niedrigste Antibiotikakonzentration, die das Wachstum von

Einleitung 28

Einschrittmutanten innerhalb einer Bakterienpopulation von 1010 KBE inhibiert 68. Um bei der

MPC wachsen zu können, brauchen Bakterien zwei oder mehr Mutationen, die zur Resistenz

führen. Die Wahrscheinlichkeit einer Mutation liegt unter 10—7 und das würde bedeuten, dass

eine Bakterienpopulation von mindestens 1014 Zellen für das gleichzeitige Vorliegen von zwei

unabhängigen Mutationen benötigt wird 171. Das Auftreten von 1014 Zellen bei einer Infektion

ist unwahrscheinlich 71. Im gesunden Darm befinden sich z. B. 104–106 KBE/g Stuhl von

Enterobacteriaceae 164.

Im Prinzip repräsentiert das Intervall zwischen der geringsten Antibiotikakonzentration, die

gerade noch das Wachstum einer sensiblen Wild-Typ-Population verhindert (MHK), und dem

MPC-Wert den Konzentrationsbereich (mutant selection window, MSW), in dem resistente

Mutanten selektiert werden können 72,76,317. Die untere Grenze des MSW bildet die

Antibiotikakonzentration, bei der noch ein Wachstumsvorteil eines resistenten Stammes

gegenüber einem Wildtyp besteht, die Obergrenze ist die MPC 71-73.

Oberhalb des MSW, also oberhalb der MPC, werden auch Einschritt-Mutanten inhibiert. Aus

dem MPC-Wert, der Spitzenkonzentration und der Halbwertszeit einer Substanz lässt sich

der Zeitraum (mutant selection period) prognostizieren, in dem resistente Keime entstehen

(siehe Abbildung 2).

Einleitung 29

Abb. 2: Darstellung von „mutant selection period“ und „mutant selective concentration“ Quelle: Linde, H.J. Mutant prevention concentration of nalidixic acid, ciprofloxacin, clinafloxacin, levofloxacin, norfloxacin, ofloxacin, sparfloxacin or trovafloxacin for Escherichia coli under different growth conditions 167 Daher sollte die Antibiotikakonzentration während einer Therapie nicht innerhalb des MSW

sein. Dies sollte nicht nur für den Infektionsort gelten sondern auch für den Darm, da hier

eine hohe Keimdichte (1012 Zellen/g Stuhl) herrscht und es zur Selektion von resistenten

Mutanten kommen kann.

Bei dem Vergleich von in vivo-erzeugten Mutanten mit in vitro-erzeugten Mutanten von

Salmonella typhimurium zeigt sich ein eindeutiger Unterschied in der MHK (2 µg/ml vs

16 µg/ml) 94. In vivo-Mutanten konnten den Resistenzlevel der in vitro-Mutanten (16 µg/ml)

gegenüber einem Fluorchinolon nicht erreichen. Des Weiteren wurden bei in vitro-erzeugten

Mutanten Mutationen entdeckt, die bei in vivo-Mutanten bisher nicht gefunden werden

konnten. Verschiedene Autoren diskutieren deswegen, ob der zu einem hohen

Resistenzlevel führende Mechanismus schädlich sein könnte 94,209.

Die Daten zur unterschiedlichen Resistenzentwicklung in vivo und in vitro zeigt, wie wichtig

es ist anhand von Tiermodellen die Resistenzentwicklung von Mikroorganismen zu

untersuchen. Diese in vivo-Modelle dienen zur Klärung der Fragen, die im Zusammenhang

mit kompensatorischen Mutationen, Fitnessverlust und Pathogenität des Keims gestellt

werden.

2.6 Fragestellung der Arbeit

Ziel der vorliegenden Dissertation war die systematische vergleichende Untersuchung zur

Resistenzentwicklung von E. coli gegen Fluorchinolone in vitro und in vivo. Besonderes

Augenmerk soll dabei auch dem Einfluss der Induktion von Efflux durch humane

Pharmazeutika geschenkt werden.

Einleitung 30

Dabei sollten folgende Fragen beantwortet werden:

- Unterscheiden sich resistenzvermittelnde und ggf. kompensatorische Mutationen

nach Selektion in vitro oder in vivo (bzgl. Häufigkeit)?

- Wie wirken sich verschiedene Dosierungsschemata quantitativ und qualitativ auf die

Selektion von resistenten Mutanten aus (bzgl. Art des selektiven

Resistenzmechanismus)?

- Welche Rolle spielt die Induktion von Efflux durch humane Pharmazeutika ohne

eigene antimikrobielle Wirkung?

Im ersten Teil der Dissertation sollte die Resistenzentstehung in einem Kolonisationsmodell

(Ratte) untersucht werden. Hierfür wurde der Darm der verwendeten Tiere mit

E. coli-Stämmen, die durch ein Reportergen (gfp) chromosomal markiert werden, kolonisiert.

Nach erfolgreicher Kolonisation des Darms mit dem jeweiligen gfp-markierten Stamm sollten

mit Chinolonen verschiedene in der Humanmedizin angewandte Dosierungsschemata

simuliert werden. Mutanten mit erhöhter minimaler Hemmkonzentration (MHK) wurden

mittels antibiotikahaltiger Screeningplatten und der Fluoreszenz aus der komplexen

Darmflora isoliert und hinsichtlich ihrer Veränderungen im Vergleich zum Ausgangsstamm

untersucht. Die Untersuchungen umfassten phänotypische und genotypische Methoden wie

MHK-Bestimmung, organic solvent tolerance, Adhäsion, quantitative mRNA-Untersuchungen

(RT-PCR).

Für die Markierung wurden Wildtypstämme von E. coli aus Rattenkot verwendet, um einen

Stamm zu verwenden, der an das Habitat Rattendarm angepasst ist. Die Markierung sollte

über homologe Rekombination an einer Stelle des Chromosoms erfolgen, an der eine

Integration keinen offenen Leserahmen bzw. bekannte regulatorische Sequenzen zerstört.

Die hierfür nötigen Konstrukte waren in Vorarbeiten bereits kloniert worden.

Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte eine systematische Identifikation pharmakologischer

Substanzen als Co-Medikation von Antibiotika, die Expressionssteigerungen von

spezifischen MDR-Transportern auslösen, durchgeführt werden. Da humanpathogene

Bakterien eine Vielzahl solcher Transporter besitzen, können sich die Keime durch die

differentielle Regulation dieser Transporter an die jeweilige Umwelt anpassen. Bisher sind

wenige Substanzen bekannt, die als so genannte Induktoren eine Änderung der Expression

von MDR-Transportsystemen verursachen (z. B. Azetylsalizylsäure).

Einleitung 31

Am Beispiel der sieben bekannten Fluorchinolon-Transporter von E. coli (oder ihrer

regulatorischen Proteine) sollte in einem in Vorversuchen evaluierten Gfp-Reportersystem

das induktive Potential dieser Pharmazeutika analysiert werden. Die hierfür notwendigen

Reporter-Stämme waren bereits in Vorarbeiten generiert worden. Zusätzlich zu den schon

vorhandenen Reporter-Stämmen sollten noch weitere Reporter-Varianten mit

Translationsverstärker generiert werden.

Die Wirkung potentieller Induktoren sollte anschließend mittels RT-PCR verifiziert und die

mutmaßliche Signaltransduktionskette untersucht werden. Zusätzlich sollte die Rolle der

identifizierten Induktoren in vivo anhand des vorher etablierten Tiermodells überprüft werden.

Die Ergebnisse dieser Arbeit bieten die Grundlage für eine verbesserte Dosierungsstrategie

zur Vermeidung von Resistenz. Außerdem können aufgrund der hier erhaltenen Ergebnisse

induktiv wirkende und resistenzfördernde Medikamente während einer Antibiotika-Therapie

vermieden werden. Derzeit wird von verschiedenen Arbeitsgruppen an der Entwicklung von

Efflux-Inhibitoren als Kombinationspartner von Chinolonen gearbeitet. Diese

Efflux-Inhibitoren können im vorliegenden Modell auf ihre Wirksamkeit zur Verhütung von

Resistenzentwicklung untersucht werden.

Material und Methoden 32

3 Material und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Organismen

Die E. coli-Stämme DH10B (RIMMH, Universität Regensburg), E. coli TM EPI 300

(EPICENTRE®, Madison, USA), One Shot® TOP10 (Invitrogen), E. coli-Stamm 2685 aus

der Ratte (RIMMH, Universität Regensburg), E. coli-Stamm 4 aus der Ratte

(RIMMH, Universität Regensburg) und E. coli S17λpir (RIMMH, Universität Regensburg)

wurden ÜN bei 37 °C in flüssigem Medium bei 200 U/min geschüttelt oder auf mit 1,5 % Agar

verfestigtem LB-Medium gezogen.

3.1.2 Plasmide

Es folgt eine tabellarische Aufstellung der verwendeten Plasmide:

Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Plasmide

Plasmid Eigenschaften Bezugsquelle

pGEM-T Klonierungs-, Expressionsvektor, AmpR Promega, Mannheim

pCR4®-TOPO® Klonierungs-, Expressionsvektor,

AmpR, KmR

Invitrogen,

pUC19 AmpR NEB

pIVETsacB AmpR Dr. M. Arnold, RIMMH

pMASC CmR Dr. M. Arnold, RIMMH

pUC-gfpgen AmpR Dr. M. Arnold, RIMMH

pLOF/Km AmpR, KmR Dr. K. Timmis,

Braunschweig 61

pKD46 AmpR E. coli Genetic Stock Center

Die in dieser Arbeit hergestellten Plasmide sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Tab. 5: Übersicht über die in dieser Arbeit angefertigten Plasmide

Plasmid Organismus/

E. coli-Stamm

Beschreibung Resistenzen

pUC-araBPr-gbx TOP10 PCR-Pr. (1.899 bp) Lambda mit

1086+1128/ NdeI+XbaI (1.888 bp) in pUC-

araBPr/NdeI+XbaI (4.430 bp)

Amp


Plasmid Organismus/

E. coli-Stamm

Beschreibung Resistenzen

pUC-norEPrII-

Tgfp

DH10B Fusions-PCR-Pr. (1.002 bp) pUC-

norEPrII-gfp mit 1113+1133 und

1131+1051/BcII (999 bp) in pUC19/BamHI

(3.685 bp)

Amp

pUC-mdtMPrI-gfp TOP10 PCR-Prod. (1.005 bp) E. coli DH5α mit

1071+1072/AatII+BbsI (826) in pUC-

gfpgen/ AatII+BbsI (3.939 bp)

Amp

pUC-mdtMPrII-

gfp

TOP10 PCR-Prod. (826 bp) E. coli DH5α mit

1072+1073/AatII+BbsI (826) in pUC-

gfpgen/ AatII+BbsI (3.760 bp)

Amp

pUC-acrEFPr-

Tgfp

DH10B

Fusions-PCR-Pr. (1.232 bp) pUC-

acrEFPr-gfp mit 977+1134 und pUC-

acrABPr-Tgfp mit 1131+979/BglII

(1.182 bp) in pUC19/BamHI (3.868 bp)

Amp

pCC1-acrABPr-

gfp

TM EPI300 BglII-Fragment (950 bp) aus pUC-

acrABPr-gfp (3.153 bp) in

pCC1_dB/BamHI (9.077 bp)

Cm

pCC1-acrDPr-gfp TM EPI300 BglII-Fragment (1.752 bp) aus pUC-

acrDPr-gfp (3.955 bp) in pCC1_dB/BamHI

(9.879 bp)

Cm

pCC1-acrEFPr-

gfp

TM EPI300 BglII-Fragment (1.157 bp) aus pUC-

acrEFPr-gfp (3.360 bp) in


Cm

pCC1-mdfaPr-gfp TM EPI300 BglII-Fragment (1.738 bp) aus pUC-

mdfAPr-gfp (3.941 bp) in pCC1_dB/BamHI

(9.865 bp)

Cm

pCC1-marRAPr-

Tgfpa

TM EPI300 BglII-Fragment (994 bp) aus pCR4-

marRAPr-Tgfpa (4.968 bp) in


Cm

pCC1-robPr-

Tgfpa

TM EPI300 BglII-Fragment (994 bp) aus pCR4-robPr-

Tgfpa (4.968 bp) in pCC1_dB/BamHI

(9.121 bp)

Cm


3.1.3 Kits

Tab. 6: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Kits

Kit Verwendung Hersteller

Qiaprep® Spin Miniprep kit Plasmidisolierung QIAGEN, Hilden

NucleoSpin®Plasmid Quick

Pure

Plasmidisolierung MACHEREY-NAGEL

QiafilterTMPlasmid Midi Kit Plasmidisolierung QIAGEN

Qiaquick® PCR Purification kit Reinigung von PCR-

Produkten oder

Restriktionsverdauen

QIAGEN

Qiaquick® Gel Extraction kit DNA-Reinigung aus dem Gel QIAGEN

Rneasy Mini Kit Isolierung von RNA QIAGEN

Omniscript Reverse

Transcriptase

RT-PCR QIAGEN

First Strand cDNA Synthesis

Kit for RT-PCR (AMV)

RT-PCR Roche, Mannheim

LightCycler® FastStart DNA

Master SYBR Green I,

Light Cycler Roche

DNeasy® Tissue kit Isolierung genomischer DNA QIAGEN

TOPO® Cloning 5-minute

PCR Cloning kit

Klonierung von PCR-

Produkten

Invitrogen, Karlsruhe

pGEM®-T Easy Vector

System

Klonierung von PCR-

Produkten

PROMEGA, USA

3.1.4 Chemikalien, Plastikwaren und sonstige Hilfsmittel

Lösungsmittel und Feinchemikalien wurden von folgenden Firmen bezogen:

Merck, GibcoBRL, Roche, Sigma-Aldrich, J.T.Baker, Oxoid, Eppendorf, AppliChem, NEB,

USB Corporation und Roth. Alle Chemikalien, soweit nicht bereits vom Hersteller sterilisiert,

wurden vor Gebrauch entweder autoklaviert (121 °C und 2 bar Überdruck) oder steril-filtriert

(Porendurchmesser 0,45 µm, Roth, Karlsruhe).

Alle Plastikwaren und sonstige Hilfsmittel wurden von den Firmen Greiner Bio-One,

Eppendorf, Falcon/Becton Dickinson, Biozym, Roth und Sarstedt bezogen.

3.1.5 Enzyme

Alle eingesetzten Restriktionsenzyme wurden von NEB, Frankfurt/Main, bezogen.


3.1.6 Antibiotika

In der folgenden Tabelle sind alle in dieser Arbeit verwendeten Antibiotika

zusammengefasst.

Tab. 7: Verwendete Antibiotika

Substanz Hersteller Gebrauchsverdünnung

Ampicillin Sigma-Aldrich, Steinheim 100 µg/ml

Kanamycin Merck, Darmstadt 50 µg/ml

3.1.7 Lösungen

Alle Lösungen wurden, sofern sie für den Umgang mit RNA benötigt wurden, mit DEPC

behandeltem H2O dest. hergestellt.

Tab. 8: Verwendete Lösungen Lösung Zusammensetzung, Konzentration

Ethidiumbromid (Gebrauchslösung) 5 mg/ml

SDS (Stammlösung) 10 mg/ml

Lysozym (Stammlösung) 20 mg/ml; gelöst in DEPC-H2O

Loading dye 6 × Saccharose 40 %

Bromphenolblau 0,25 %

Xylencyanol 0,25 %

TBE (Stammlösung 10 ×)

TBE (Gebrauchslösung 0,5 ×)

Tris 128 g

Borsäure 55 g

0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 ml

Ad 1l mit H2O bidest, einstellen auf pH 8.3

Stammlösung 1:20 verdünnen

TE Tris·HCl (pH 8,0) 0,6 g

EDTA 0,185 g

Ad 50 ml mit H2O bidest, einstellen auf

pH 8.0

6 × Ladepuffer 60 mM EDTA

0,25 % Bromphenolblau

30 % Glycerin


Lösung Zusammensetzung, Konzentration

TBI (Angaben für 1 Liter Lösung)

RbCl 12 g

MnCl2×4H2 9,9 g

KaCl 30 ml (von 1M Stock pH 7.5)

CaCl2×2H2O 1,5 g

Glycerol 150 g

Mit Eisessig (0,2 M) auf pH 5.8 einstellen �

steril filtrieren

TBII (Angaben für 1 Liter Lösung) MOPS 20 ml (von 0,5 M Stock pH 6.8)

(Morpholinethan Sulfonsäure)

RbCl 1,2 g

CaCl2×2H2O 11 g

Glycerol 150 g

Mit NaOH den MOPS-Puffer auf pH 6.8

einstellen � steril filtrieren

3.1.8 Nährmedien

Die Herstellung der Nährmedien und der Puffer PBSmit /PBSohne erfolgte durch die

Nährbodenküche des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität

Regensburg

Folgende Nährmedien wurden verwendet:

1. Luria-Bertani-Medium (LB) mit oder ohne Antibiotika (Ampicillin 100 µg/ml;

Kanamycin 50 µg/ml)

2. Mueller-Hinton-Medium

3. M9-Minimalmedium mit oder ohne Kanamycin (50 µg/ml)

4. Kochblut-Agar

5. McConkey-Agar

6. MRS-Agar für Laktobazillen

7. Enterococcosel-Agar

8. Thioglykolat-Bouillon

9. Schädler-KV-Agar


3.1.9 Primer

Eine Liste aller verwendeten Primer befindet sich in Tabelle 9. Die Primer wurden mittels der

Sequenz von E. coli – Stamm K12 mit der Gene Bank Accession number U00096 erstellt.

Die Sequenzen für M13for und M13rev stammen vom Hersteller. Oligonukleotide wurden bis

auf M13 for/rev von der Firma Metabion, Martinsried, in einer Konzentration von 100 mM

hergestellt. Die Primer M13 for/rev wurden für die Sequenzierung durch die Firma GeneArt,

Regensburg, verwendet.


Tab. 9: Sequenzen der verwendeten Primer (Oligonukleotide). Die Erkennungssequenz der Restriktionsenzyme ist grau hervorgehoben

Nr. Referenz Sequenz 5’-3’ Tm (in °C) Schnitt-

stelle

M13

for

pCR4

GTAAAACGACGGCCAGT -

M13

rev

pCR4 AACAGCTATGACCATG -

129 gfp TGCATGCATTAATGCAGCTGGCAC 60,7 NsiI

130 gfp TGCATGCATAGTTGGTAATGGTAGGG

AC

65,1 NsiI

212 gfp CACCCTCTCCACTGACAG

213 gfp GTGACCACATGGTACCTTC 55,1

226 acrB TGCTGAACTGGCGAAGATGGAACC 63,1

263 REP_1 XXXGCGCCGXCATCAGGC 58,2

264 REP_2 ACGTCTTATCAGGCCTAC 53,7

381 gfp GAAGATCTCATTAATGCAGCTGGCAC 63,2 BglII

776 E. coli

2685

CGtAGATCTTTGCCTCGTCGTTGTTAT

TAACCATCGG

70,6 BglII

777 E. coli

2685

CGtAGATCTTGTAACAAGGGGCCGGT

TAGGTGAG

71,9 BglII

801 gfp TGACGGGAACTACAAGACG 57

802 gfp AATGGTTGTCTGGTAAAAGG 54

858 gapA CTGACATCGAGATCGTTGC 56,7

859 gapA GTTCTGGCAGTACTTTACC 54,5

861 acrB GACAGTACCATCGCGATACC 59,4

862 marA GATGTAAAAAGCGCGATTCGC 54,9

863 marA GTCCAGACGCAATACTGACG 60,5

950 acrB GGATCCTGGAAGTAAACGTCATTGG 63,0 BamHI

951 acrA GGATCCGCGGTCGTTCTGATGCTCTC 69,5 BamHI

977 acrSEF

GTGACGTCAGATCTGATTAATTATTCA

GGAAATAAATATATTCG

66,6 AatII, BglII

979 gfp

GTATCTAGATCTTGGTAATGGTAGGG

ACCG

66,8 BglII, XbaI

1049 norE

CAGACGTCTGATCAGCTCTGGCAGGT

CGTGTTCTCACG

75,9 AatII, BclI



stelle

1050 norE

GACATATGAACACCTTTTATTTGTAGT

TATATG

60,8 NdeI

1051 gfp

GTTCTAGATGATCATTGGTAATGGTA

GGGACCGGC

70,7 BclI, XbaI

1054 gfp

CGTCTAGAAGACATGAGTAAAGGAGA

AGAACTTTTCACTGG

70,5 XbaI, BbsI

1086 gam, bet,

exo

CTCATATGGATATTAATACTGAAACTG

AG

59,6 NdeI

1087 gam, bet,

exo

GAGGATCCTCATCGCCATTGCTCCCC

AAATAC

70,8 BamHI

1097 araBADPr

GTGACGTCAGCCATACTTTTCATACTC

CCACC

69,5 AatII

1098 araBADPr

GTCATATGTTCACTCCATCCAAAAAAA

CGGGTATGG

68,3 NdeI

1113 norEPr

CAGACGTCTGATCAACTTACAACTCC

TGAAATCAGTTAAG

69,5 AatII, BclI

1116 gfp CGATGCATTTATTTGTAGAGCTCATCC

ATGCC

66,9 NsiI

1117 araBADPr GTGAAGACTTACTCATCGTTTCACTCC

ATCCAAAAAAACGGGTATGG

72,9 BbsI

1118 araBADPr GTGACGTCATGCATAGCCATACTTTT

CATACTCCCACC

71,6 AatII, NsiI

1131 gfp

TTAACTTTATAAGGAGGAAAAACATAT

GAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC

68,6

1133 norEPr

ATGTTTTTCCTCCTTATAAAGTTAAAT

GAACACCTTTTATTTGTAGTTATATG

67,1

1134 acrEFPr

ATGTTTTTCCTCCTTATAAAGTTAATA

CTATTCCTCAAAAAACCAAAAGCGCG

70,2

1150 hspPr

CATCTAGAATGCATCAGGCTAATCGC

CAGGCTGG

71,9 XbaI, NsiI

1151 gfp GAAGATCTTAATGCAGCTGGCAC 60,6 BglII

1176 marRAPr

CAGACGTCAGATCTGGTGGTTGTTAT

CCTGTGTATCTGG

72,6 AatII, BglII



stelle

1177 marRAPr

ATGTTTTTCCTCCTTATAAAGTTAAATT

AGTTGCCCTGGCAAGTAATTAG

69,4

1178 robPr

CAGACGTCAGATCTATTGTTACCATTT

TTATCTATTACACG

67,4 AatII, BglII

1179 robPr

ATGTTTTTCCTCCTTATAAAGTTAAAA

AATATCCTCATCCTTTCAACAACG

68,6

1180 soxSPr

CAGACGTCAGATCTAAATCGCTTTAC

CTCAAGTTAACTTG

69,5 AatII, BglII

1181 soxSPr

ATGTTTTTCCTCCTTATAAAGTTAAAA

ATCTGCCTCTTTTCAGTGTTCAG

69,4

1182 pUC19

GGCCGCCTAGGCCTTTATCAGGGTTA

TTGTCTCAT

76,6

1183 gfp

GGCCGCCTAGGCCTTATTTGTAGAGC

TCATCCATGCC

80,0 SfiI

1187 eco CTACCTGCAGTATTGTTTGC 56,4

1188 mqo GAAAAAAGAGGACTGG 45,6

1191 eco

GATGGTGATTGCTGATGGTGATTTTG

CATGTGGCGTATGCTGATAAGACGCG 82,8

1192 mqo

GCAAATGCGCCGCTAACAAAAGAAGC

CATGCCGGATGTGGCACATC 83,4

1193 gfp

GCAAAATCACCATCAGCAATCACCAT

C 66,8

1194 neo CTTCTTTTGTTAGCGGCGCATTTGC 65,8

1195 mqo

GCAAATGCGCCGCTAACAAAAGAAGC

CATGCCGGATGTGGCACATCATTACA

ACGC 85,5

1223 pLOF GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG 58,9

1224 pLOF GGTTGCATTCGATTCCTGTTTG 58,4

1225 pLOF GCTCGAGGCCGCGATTAAATTC 62,1

1381 gfp CAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTT 62,7

1388 chuA GACGAACCAACGGTCAGGAT 59,4

1389 chuA TGCCGCCAGTACCAAAGACA 59,4

1390 yjaA TGAAGTGTCAGGAGACGCTG 59,4



stelle

1391 yjaA ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC 57,9

1392 tspE4C2 GAGTAATGTCGGGGCATTCA 57,3

1393 tspE4C2 CGCGCCAACAAAGTATTACG 57,3

1423 gfp AGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTA 71,9

1521 pLOF CTCAGTGGCCTGTTTTTAAGC 59,0

1523 pLOF CAAACAGGAATCGAATGCAACC 60,0

1527 parA GCATAAACGCTGGTCATGAAATGACG 66,0

1528 parA CGCGTACCAAACACATCACGCATATG 68,0

1529 redF TTCTCTGTTCCGGTCACACCACAT 65,0

1530 redF TTCAGCATCGCAACCGCATCAGA 65,0

1531 repE ATTGACCTCTGCGGAAGCCAGTAA 65,0

1532 repE AAACGCATGGCATACGGATTGGTG 65,0

1542 pLOF CATCGAGCATCAAATGAAACTGC 61,0

1554 RS-PstI NNNNNNNNNNCTGCAG 51,0

PstI

1556 sfaD/E GGAAAGGCAAATGGACAGGTATGG 51,0

1557 sfaD/E GCATGGAAAATAACGGAGGAG 65,0

1558 hlyE TCCCTGCTGGTAAGCTCACAAAGT 65,0

1559 hlyE ACGCCCGCAGCAATAGAATAGGAA 65,0

1560 motB TCTAAACATCGGGCGATTCTGGCT 65,0

1561 motB TGGTGATGTGGCTGATCTCCATCT 65,0

3.1.10 Sequenzierung

100 ng DNA (Plasmid oder PCR-Produkt) und 100 pg Primer wurden an die Firma GeneArt,

Regensburg, zur Sequenzierung gegeben. Die Primer M13 for und M13 rev wurden von der

Firma GeneArt vor der Sequenzierung zur Probe gegeben.

In der gesamten Arbeit wurden die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme über die Primer

eingefügt. Die am Primer angefügten Schnittstellen sind in der Primerliste (siehe Tab. 9) zu

finden.

Zur Bearbeitung von DNA-Sequenzen und Sequenzierdaten wurden die Programme

SeqManTM II (Dnastar, USA), EditSeqTM (Dnastar, USA) und Lynnon BioSoft DNAMan

Version 5.2.9 (Lynnon, Kanada) sowie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ verwendet.


3.1.11 Computerprogramme

Diese Arbeit wurde mit Hilfe von Windows Word 2000 angefertigt. Vektorkarten wurden in

Lynnon BioSoft DNAMan (Version 5.2.9) angefertigt und in Corel Draw (Version 11)

bearbeitet. Das Literaturverzeichnis wurde mit Einträgen aus dem ISI ResearchSoft

Reference Manager Version 10 erstellt. Die Literatur stammt aus der PubMed Datenbank

von NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/).

Wie unter „Sequenzierung“ erwähnt dienten die Programme DNAStar SeqManTM II,

EditSeqTM und Lynnon BioSoft DNAMan Version 5.2.9 der Bearbeitung von Sequenzen.

Für die Bearbeitung der Fluoreszenzaufnahmen wurde die Software von Carl Zeiss Image

Browser Version 4.0.0.157 und das Programm Microsoft PowerPoint 2000 verwendet.

LightCycler®-Daten wurden mit dem Programm LightCycler® Software 3.5 bzw.

LightCycler® Software 4.0 (Roche, Mannheim) ausgewertet. Statistische Erhebungen

wurden in dem Programm Excel 2000 (9.0.6926 SP3) unternommen, die graphische

Darstellung der erhaltenen Werte erfolgt unter Verwendung des Programms SigmaPlot 10.0.

3.1.12 Geräte

Zur spektrometrischen Messung stand ein Smart SpecTMPlus Spectrophotometer der Firma

BioRad, München, zur Verfügung.

Ein VITEK Colorimeter der Firma bioMeriêux Vitek, Hazelwood, USA wurde zur Herstellung

von Verdünnungen des Standards McFarland = 0,5 von Bakterien verwendet.

Zur Durchführung von PCR-Reaktionen wurde ein MJ Research PTC 200 Peltier

ThermalCycler benützt.

Mit einem Gene Pulser® Gerät und den Küvetten von BioRad, München, wurden alle

Elektroporationen durchgeführt.

Gelkammern zur Elektrophorese wurden von der Mechanischen Werkstatt der Universität

Regensburg bereitgestellt. Als Stromquelle diente der Microcomputer Electrophoresis Power

Supply E425 von Consort.

Agarosegele wurden bei UV-Licht der Wellenlänge λ = 312 nm (UV-Schirm von Bachofer,

Reutlingen) fotografiert und ausgedruckt auf SONY UPP-110HP Type II High Density

Printing Paper.

Des Weiteren standen ein Thermomixer comfort von Eppendorf, und die Zentrifugen

Centrifuge 5417 R von Eppendorf, Hamburg, Medifuge 15000 Heraeus Sepatech und eine

Hettich Universal 30 RF, Tuttlingen, zur Verfügung.

Für die konfokalen Lasermikroskopaufnahmen wurde das Mikroskop Axiovert 200M LSM510

META von Zeiss verwendet.


Als UV-Lampe diente ein Gerät der Firma Micro-Bio-Tech, Stockholm, die sowohl

langwelliges (365 nm) als auch kurzwelliges (254 nm) Licht ausstrahlt.

Zur Quantifizierung der cDNA diente ein LightCycler®-Gerät der Firma Roche, Mannheim.

3.2 Methoden

3.2.1 Molekularbiologische Methoden

3.2.1.1 DNA-Arbeitstechniken

3.2.1.1.1 Isolierung von DNA

Genomische DNA wurde mit Hilfe des Qiagen DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Hilden) unter

Verwendung des Hersteller-Protokolls für Gram-negative Bakterien isoliert.

3.2.1.1.2 Isolation von Plasmiden

Für eine schnelle Isolierung von Plasmid-DNA wurden Kits der Firmen QIAGEN und

Macherey-Nagel, die das Prinzip der alkalischen Lyse nutzen, nach den Angaben der

Hersteller verwendet.

3.2.1.1.3 Restriktionsanalyse und -verdau

Restriktionsanalyse:

Plasmid-DNA: 1–2 µl

Enzym: 1 µl (5–10Units)

Puffer: 1 µl

BSA (optional): 1 µl

H2O: X µl

Endvolumen 10 µl

Inkubationszeit 1 h

Restriktionsverdau:

Plasmid-DNA: 10–20 µl

Enzym: 1–3 µl (30–40Units)

Buffer: 1–3 µl

BSA (optional): 1–3 µl

H2O: X µl

Endvolumen 20–30 µl

Inkubationszeit: 1,5 h


Sowohl für die Restriktionsanalyse als auch für den Restriktionsverdau wurde bei der

Inkubationstemperatur, dem Puffer und der Zugabe von BSA den Herstellerangaben gefolgt.

Doppelverdau mit zwei Enzymen wurden nach Möglichkeit in einer Reaktion nach

Empfehlung von NEB durchgeführt. Anschließend wurden die Fragmente auf ein Agarosegel

aufgetragen.

3.2.1.1.4 Elektrophorese von DNA in Agarosegelen

Je nach Größe wurden DNA-Fragmente in 0,8 bis 2 %igen Agarosegelen (w/v Agarose in

0,5 × TBE mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid) aufgetrennt. DNA-Proben wurden mit

1 × Ladepuffer versetzt. In 50 ml 0,5 × TBE wurde die entsprechende Menge an Agarose

aufgekocht und mit 2,5 µl Ethidiumbromid versetzt. Dies wurde dann in eine Gelkammer

gegossen. Sobald das Gel auspolymerisiert war, wurde es mit 0,5 × TBE überschichtet. Die

mit „loading dye“ versetzten Proben und der jeweilige DNA-Längenstandard wurden

aufgetragen.

Der Gellauf erfolgte bei 60 bis 85 V (ca. 5 V/cm) in 0,5 × TBE bei RT. Fertig gelaufene Gele

wurden bei einer Wellenlänge von λ = 312 nm fotografiert.

Als DNA-Längenstandards und zur Quantifizierung der eingesetzten DNA-Proben wurde

spezifisch geschnittene DNA folgender Fragmentlängen (in bp) verwendet.

Standard II: Lambda-DNA/HindIII 125, 564, 2.027, 2.322, 4.361, 6.557,

9.416, 23.130

Standard VII: SPP1 DNA/ Eco RI 81, 359, 492, 710, 718, 992, 1.164, 1.482,

1.515, 1.882, 1.953, 2.799, 3.639, 4.899,

6.106, 7.427, 8.576

Standard VIII: Mischung aus mit HpaII bzw. DraI und HindIII geschnittener pUCBM21-DNA

9, 26, 34, 37, 67, 110, 124, 147, 190, 242, 320,

404, 489, 501, 692, 900, 1.114

1 kb DNA-Leiter: sechs verschiedene Plasmide wurden vollständig verdaut

250, 500, 750, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000,

3.500, 4.000, 5.000, 6.000, 8.000, 10.000

100 bp DNA-Leiter: 11 einzelne, chromatographisch aufgereinigte DNA-Fragmente

80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,

1.031

Marker 13: Lambda-DNA/Eco47I (AvaII) 308, 310, 345, 398, 433, 511, 513, 590,

597, 894, 974, 985, 1.284, 1.420, 1.611,

1.951, 2.005, 2.134, 2.555, 2.606, 3.676,

6.442, 6.555, 8.126


Die Standards II, VII und VIII stammen von der Firma Roche, die 1 kb DNA-Leiter und die

100 bp DNA-Leiter sind von PEQLAB. Der Marker 13 ist von der Firma Fermentas.

3.2.1.1.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Nach dem Ausschneiden der entsprechenden Bande unter langwelligem UV-Licht aus dem

Gel wurde zur Isolierung der DNA aus der Agarose der Qiaquick®Gel Extraktion kit der

Firma QIAGEN nach den Richtlinien des Herstellers angewendet.

3.2.1.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR)

3.2.1.1.6.1 Standard-PCR

PCR mit Mastermix

Wenn nicht anders angegeben, wurden alle PCR-Reaktionen mit dem 2,5 × PCR MasterMix

von Eppendorf durchgeführt.

PCR-Ansatz:

Plasmid-DNA oder gDNA X µl

MasterMix 20 µl

Primer forward (100 mM) 1 µl

Primer reverse (100 mM) 1 µl

H2O Y µl

Endvolumen 50 µl

Programm:

Denaturierung 94 °C (5 min)

30 Zyklen à

Denaturierung 94 °C (40 sec)

Annealing x °C (30 sec)

Elongation 72 °C (y min)

Letzte Elongation 72 °C (7 min)

Aufbewahrung 4 °C

Besitzen die Primer Schnittstellen, so wurde eine „annealing“-Temperatur zw. 52–54 °C

gewählt. Die Elongationszeit wird aus der Länge des zu replizierenden DNA-Stücks

berechnet. Pro 1 kb wird 1 Minute Elongationszeit benötigt.

Die siebenminütige Elongationszeit ist notwendig, um die A-Überhänge an den Enden des

PCR-Produktes durch die DNA-Polymerase aus Thermophilus aquaticus herzustellen. Diese


Überhänge sind in späteren Klonierungsschritten mit den Kits von Invitrogen und Promega

wichtig.

PCR-Reaktion mit TaqPlus®MaxxTMDNA Polymerase von Stratagene®

Lösungen:

10 × Reaktionspuffer für Taq-Polymerase: 20 mM TrisCl, pH 8,0

dATP: 10 mM

dCTP: 10 mM

dGTP: 10 mM

dTTP: 10 mM

TaqPlus®MaxxTMDNA Polymerase (Stratagene®): 5 U/µl

Ansatz:

Plasmid-DNA od. gDNA(100–200ng) X µl

10 × Reaktionspuffer 5 µl

10 mM-dNTP-Mischung 4 µl

Taq-Polymerase 0,5 µl

H2O Y µl

Endvolumen 50 µl

Es wurden insgesamt 30 Zyklen in einem DNA Thermal Cycler der Firma Perkin Elmer Cetus

mit den unter Programm beschriebenen Einstellungen durchgeführt:

3.2.1.1.6.2 RS-PCR (Restriction-Site-PCR)

Die RS-PCR 249 dient dazu die Umgebung einer bekannten Sequenz weiter zu sequenzieren.

In einen bekannten Bereich werden drei spezifische Primer gelegt (1, 2 und 3). Ein zweiter

Primer, ein so genannter RS-Primer, wird so erstellt, dass er an eine Enzymschnittstelle

bindet (a, b, c, d).

Spezifische Primer

3 2 1

RS-Primer mit Erkennungssequenz fürunterschiedl. Enzymschnittstellen

a b c d

unbekannter DNA-Bereich bekannter DNA-BereichgDNA

Abb. 3: Lage der Primer bei der RS-PCR


Tab. 10: verwendete RS-Primer Primer Enzym, dessen Schnittstelle erkannt

wird

1554 PstI

1555 PstI

236 SalI

238 SmaI

232 BglII

233 EagI

234 HindIII

235 SacI

164 EcoRI

165 BamHI

166 TaqalphaI

167 BglI

168 SphI

Ansatz:

gDNA X µl

MasterMix 20 µl

spez. Primer Nr. 1 (100 mM) 1 µl

RS-Primer (100 mM) 1 µl

H2O Y µl

Endvolumen 50 µl

Programm:

Denaturierung 94 °C

30 Zyklen à

Denaturierung 94 °C

Annealing 50 °C

Elongation 72 °C (3–4 min)

Letzte Elongation 72 °C

Diese PCR wurde nun mit dem zweiten spezifischem Primer und dem PCR-Produkt der

ersten PCR durchgeführt. Die PCR mit dem dritten Primer wurde mit dem PCR-Produkt der

zweiten PCR als Zielsequenz durchgeführt.


Bei diesem PCR-Verfahren handelte es sich um eine nested-PCR.

Wenn das Fragment von der Größe her in den 2 nested-PCRs immer kleiner wurde handelt

es sich um ein spezifisches PCR-Produkt handeln.

3.2.1.1.6.3 Inverse PCR

Ziel der inversen PCR 286 ist es von einer bekannten Sequenz ausgehend ein unbekanntes

Teilstück an DNA zu analysieren. Hierfür wurde die genomische DNA zuerst mit einem

Enzym, das mehrere Schnittstellen in der gewünschten Sequenz hat, verdaut.

Für den Verdau gilt folgender Ansatz:

DNA 2 µg

Enzym 2 µl

Puffer 2 µl

BSA (optional) 2 µl

Wasser X µl

Endvolumen 20 µl

Der Ansatz wurde dann bei 37 °C für 1,5 h inkubiert.

Danach wurde der Ansatz über den PCR-Purification-Kit von QIAGEN gereinigt. Nach der

Reinigung folgte die Ligation.

Für die Ligation wurden einmal 12,5 µl des Verdaus, einmal 12,5 µl einer 1:10-Verdünnung

und einmal 12,5 µl einer 1:20-Verdünnung in den Ligationsansatz gegeben. Zu dem Ansatz

wurden jeweils 1,5 µl Ligase-Buffer und 1 µl T4-Ligase gegeben. Der Ansatz wurde dann

über Nacht bei 16 °C oder für 1–2 h bei Raumtemperatur inkubiert.

Um Einzelstränge zu erhalten, erhitzte man die fertige Ligation für 5 min auf 95 °C.

Für die Inverse PCR gilt folgender Ansatz:

Ligation 1 µl

Primer 1 1 µl

Primer 2 1 µl

Mastermix 20 µl

H2O 27 µl

Endvolumen 50 µl


Primer 1 und 2 Primer 3 und 4

gDNA

1. -Verdau der gDNA2. Ligation

BglII

Primer 1 und 2Primer 3 und 4

Inverse PCR

Umgebung der Primer 1 und 2 bzw. 3 und 4 bis zur nächsten II-Schnittstelle werden amplifiziertBgl

Bekannte Sequenz

BglIIBglII

BglII

BglII BglII BglII

Abb. 4: Übersicht zu dem Ablauf der Inversen PCR

3.2.1.1.6.4 Rep-PCR

Bei der Rep-PCR 124,294 handelt es sich um eine Form der sog. „fingerprint“-Methode, die

wegen vergleichsweise geringem Aufwand zur Bearbeitung großer Isolatezahlen geeignet

ist. Der benutzte Primer bindet spezifisch an repetitive Sequenzen (repetitive extragenic

palindromic elements), die in unterschiedlichen Abständen voneinander im Genom von

E. coli lokalisiert sind. Somit ergibt sich bei der Auftrennung der amplifizierten Fragmente

mittels Gelelektrophorese ein für den jeweiligen Stamm charakteristisches Bandenmuster.


Sind die Bandenmuster von mehreren Stämmen identisch, so handelt es sich um Keime mit

einer Verwandtschaft.

Zuerst wurde eine Kolonie pro Keim in 25 µl Wasser gegeben. Danach wurde die

Keimsuspension für 10 min bei 95 °C inkubiert. Nach dem Inkubationsschritt wird für 30 sec

bei 13.000 x g zentrifugiert.

Ansatz:

gDNA 5 µl

MasterMix 10 µl

Rep-Primer 1 1 µl

Rep-Primer 2 1 µl

H2O 8 µl

Endvolumen 25 µl

Programm:


30 Zyklen à


Annealing 40 °C (1 min)

Elongation 65 °C (8 min)

Letzte Elongation 65 °C (16 min)

3.2.1.1.6.5 Fusions-PCR

Bei der Fusions-PCR handelt es sich um eine zweistufige Methode zur basenpaargenauen in

vitro Fusion beliebiger DNA-Fragmente (http://www.protocol-online.org). Zunächst

amplifiziert man die beiden zu fusionierenden Fragmente mit Hilfe der Primerpaare A und B

bzw. C und D in zwei getrennten Standard-PCR-Reaktionen. Dabei werden die Primer B und

C so gewählt, dass die Enden für 12 Basen komplementär zueinander sind; durch diese

beiden Primer wird auch der Fusionspunkt festgelegt, während die Primer A und D

5´-Überhänge besitzen können, die eine spätere Klonierung erleichtern (siehe Abb. 5). Die

beiden so erhaltenen PCR-Fragmente mussten über ein Agarosegel aufgereinigt werden, um

die Primer aus der ersten Reaktion quantitativ von den Amplifikaten zu trennen. Im zweiten

Schritt wurden die PCR-Produkte, ohne Zusatz jeglicher Primer, in eine Standard-PCR

Reaktion mit 10 Zyklen und einer Annealingtemperatur von 50 °C eingesetzt. Durch die

Komplementarität zwischen den beiden Primern B und C kommt es bei den Annealing

Schritten zur dargestellten Basenpaarung (siehe Abb. 5). Die beiden Fragmente dienen sich


dabei gegenseitig als Primer. Während der Elongationsschritte wird der jeweils

komplementäre Strang synthetisiert. Nach diesen 10 Zyklen werden die Primer A und D zum

Reaktions-Mix gegeben und weitere 30 Zyklen durchgeführt, was zur Amplifikation des

Fusionsproduktes führte (siehe Abb. 5).

Abb. 5: Die Fusions-PCR ist schematisch dargestellt. Primer sind durch Pfeile, ihre nicht bindenden 5´-Überhänge durch einen Knick symbolisiert. Basenpaarungen, die währende der Annealing Phase entstehen können, sind durch senkrechte Striche angedeutet.

3.2.1.1.6.6 PCR zur Bestimmung der phylogenetischen Gruppe

Diese Methode wurde nach Clermont et al. (2000) durchgeführt. Es handelt sich um eine

Triplex-PCR, bei der die Gene chuA (279 bp), yjaA (211 bp) und tspE4C2 (152 bp)

nachgewiesen werden. Für chuA wurden zur Amplifikation die Primer #1388 und #1389, für

yjaA die Primer #1390 und 1391, für tspE4C2 das Primerpaar #1392 und #1393 verwendet.

Im Genom des E. coli-Stammes CFT073 (#AE014075) ist das chuA-Gen im Bereich von

4.086.073 bp bis 4.088.019 bp zu finden. Es ist 279 bp lang. Mit den Primern #1388 und

#1389 wurde versucht das Gen aus dem jeweiligen E. coli-Isolat zu amplifizieren. Die

Zuordnung zu den Gruppen A, B1, B2 oder D erfolgte über den Bestimmungsbaum (siehe

Abb. 6).

A

B

C

D

A

D


Abb. 6: Baum zur Bestimmung der phylogenetischen Gruppe nach Clermont

3.2.1.1.7 Reinigung von PCR-Produkten

Für Restriktionsverdau, Sequenzierung und Klonierungen wurden PCR-Produkte mit dem

Qiaquick® PCR Purification kit von QIAGEN nach Herstellerangaben gereinigt.

3.2.1.1.8 Klonierung von PCR-Produkten

Das pGEM®-T Easy Vector System der Firma Promega und das TOPO TA Cloning® for

Sequencing System der Firma Invitrogen wurden jeweils nach Herstellerangaben zur

Klonierung von PCR-Produkten verwendet.

3.2.1.1.9 Konzentrationsbestimmung von DNA

Mit Hilfe des Spektrometers der Firma Helma wurde bei den Wellenlängen von λ = 260 nm

und λ = 280 nm die Konzentration der DNA bestimmt. Die Messung erfolgte in einer

Quarzküvette (Schichtdicke 10 mm). Das Verhältnis beider Werte lag bei allen Messungen

zwischen 1,8 und 2,0.

Eine OD260 = 1 entspricht 50 µg DNA pro µl.

3.2.1.1.10 Behandlung mit alkalischer Phosphatase (CIP)

Um eine Selbstligation von Klonierungsvektoren in Ligationsreaktionen zu verhindern,

wurden bei dieser Reaktion die 5’-Phosphatgruppen mit Hilfe der alkalischen Phosphatase

(CIP) abgespalten.

chuA

+ B2 oder D

yjaA

- B1 oder A TSPE4.C2

+ B1

- A

+ B2

- D


Ansatz:

DNA 30 µl

Reaktionspuffer(NEB3) 3 µl

CIP 1–4 µl

H2O X µl

Endvolumen 40 µl

Nach 1 h Inkubation bei 37 °C wurde die so behandelte DNA über die Säulen des Qiaquick®

PCR Purification kit von QIAGEN gereinigt.

3.2.1.1.11 Ligation

In den Standardligationsansatz wurden folgende Mengen an Vektor, Insert, Enzym und

Puffer eingesetzt:

Vektor x µl

Insert y µl

T4-DNA-Ligase 1 µl

T4-DNA-Ligase-Puffer 1,5 µl

Endvolumen 15 µl

Idealerweise betrug das molare Verhältnis zwischen Vektor und Insert für die Ligation

überstehender Enden 1:1 und bei glatten Enden 1:3. Die Ligationen wurden ÜN bei einer

Temperatur von 16 °C oder für 1–2 h bei RT inkubiert. Um die Ligation zu stoppen, wurde

der Ansatz für 10 min bei 70 °C inkubiert.

3.2.1.2 RNA-Arbeitstechniken

3.2.1.2.1 Isolierung von RNA

Die Isolation von RNA wurde aus 1 ml einer Kultur der OD580 = 1,0 mit Hilfe des RNeasy®

Kits der Firma QIAGEN nach Herstellerangaben durchgeführt.

3.2.1.2.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung der RNA

Die Konzentration und Reinheit der präparierten RNA wurde photometrisch mit Hilfe des

SpecTMPlus Spectrophotometer in Quarzküvetten bestimmt. Dazu wurde zunächst ein Aliquot

der jeweiligen RNA-Probe 1:50 mit RNase-freiem Wasser verdünnt. Anschließend wurde ein

UV-Absorptionsspektrum im Wellenlängenbereich von 260 nm und 280 nm aufgenommen.

Über den Extinktionswert bei 260 nm kann nach dem Lambert-Beerschen Gesetz die

RNA-Konzentration bestimmt werden (1 A260 = 40 µg ssRNA/ml). Über das Verhältnis


A260/A280 läßt sich die Reinheit bestimmen (reine RNA: A260/A280 ≥ 2) (RNeasy® Mini

Handbook, QIAGEN).

3.2.1.2.3 DNaseI-Verdau

Um in den aufgereinigten RNA-Proben enthaltene DNA-Kontaminationen zu entfernen, wird

die vermessene RNA einem DNaseI-Verdau unterzogen. In den DNaseI-Verdau wird 20 µg

isolierte RNA eingesetzt und mit 40 Units DNaseI (Gesamtvolumen mit H20 auf 50 µl erhöht)

1 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird die RNA entsprechend dem RNA Cleanup

Protokoll aus dem RNeasy® Kit nach Herstellerangaben gereinigt. Zur Detektion

verbliebener DNA-Kontaminationen dient eine PCR mit spezifischen Primern unter

Standardbedingungen (siehe 3.2.1.1.6.1), wobei 500 ng der DNase-verdauten RNA bzw. 500

ng genomische DNA (als Positivkontrolle) als Matrize eingesetzt wird. Werden in der PCR

Banden detektiert, so erfolgt nach Aufreinigung der RNA ein neuerlicher DNaseI-Verdau. Bei

Abwesenheit spezifischer Banden wird die Reinheit und Konzentration der RNA erneut

spektrophotometrisch bestimmt und die RNA für eine Reverse Transkription verwendet.

3.2.1.2.4 Reverse Transkription

Die Umschreibung der erhaltenen DNA-freien RNA in cDNA erfolgte unter Verwendung des

1st strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV+) von Roche (Mannheim) mit „random

primers“ (Hexanukleotide). In die Reaktion wurden 500 ng RNA eingesetzt. Während des

ersten Inkubationsschrittes (25 °C, 10 min) findet das Binden der Startermoleküle statt, im

nachfolgenden Schritt (42 °C, 1 h) wurde die RNA sukzessive revers transkribiert, was in der

Synthese einzelsträngiger cDNA resultiert. Abschließend erfolgt eine Enzyminaktivierung bei

99 °C für 5 min, die gewonnene cDNA wird bei —20 °C gelagert. Als Kontrollen wurden in

der Reversen Transkription jeweils Ansätze ohne AMV Reverse Transcriptase bzw. ohne

cDNA als Matrize mitgeführt.

3.2.1.2.5 Quantitative Real-time PCR

3.2.1.2.5.1 Quantifizierung von Real-time revers transkribierter RNA

Für die Durchführung der realtime PCR-Analysen wurden ausschließlich Geräte und

Reagenzien der Firma Roche (Mannheim) verwendet. Die Quantifizierung revers

transkribierter genomischer RNA via Real-Time PCR erfolgte mit den Geräten

LightCycler®TM und LightCycler®480 unter Verwendung des LightCycler® FastStart DNA

Master SYBR Green I kits.


3.2.1.2.5.2 Prinzip des LightCycler®s

Die LightCycler®-Systeme der Firma Roche ermöglichen eine relative und „absolute“

Quantifizierung transgenspezifischer Transkripte 79. Dabei erfolgt die Quantifizierung über die

Detektion von Fluoreszenzsignalen mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes SYBR Green I, der

sich in die kleine Grube der DNA einlagert. Der dsDNA-bindende Farbstoff ist hoch sensitiv,

kann schon wenige Kopien/Reaktion detektieren 86, und liefert ein stärkeres Signal als

Ethidiumbromid. In ungebundenem Zustand weist der Farbstoff nur eine schwache

vernachlässigbare Fluoreszenz auf, während er gebunden an DNA eine starke Fluoreszenz

einer Wellenlänge von 530 nm zeigt (http://www.roche-applied-science.com). Sobald die

DNA-Menge während der Real-Time-PCR (RT-PCR) ansteigt, erhöht sich proportional auch

die Fluoreszenz. Der LightCycler® misst nach jedem Zyklus die Fluoreszenz der in den

Kapillaren befindlichen Proben, wobei die Fluoreszenzdaten sich am Monitor verfolgen

lassen. Die Software des LightCycler® errechnet crossing points (cps) als Maß für die

template-Konzentration. Diese Punkte sind der Schnittpunkt einer Geraden durch die

X-Achse mit einer Geraden gelegt durch den Punkt der größten Zunahme der Fluoreszenz.

Der Graph entsteht aus dem Logarithmus der Fluoreszenz auf der Y-Achse und der

Zyklenzahl auf der X-Achse. Die cps können als Maß für die Menge an template in der

Reaktion gelten. Mehr Ausgangsmaterial an DNA führt in der Reaktion zu einem früheren

Anstieg der Fluoreszenz und damit einem niedrigeren crossing point 108.

Die PCR-Produkte im LightCycler®-System besitzen idealerweise eine Länge von ca.

500 bp, da längere Fragmente nicht mehr zuverlässig vom LightCycler®-System amplifiziert

werden 234. Für jeden Ansatz mit einem Primerpaar wurde auch eine negative Kontrolle ohne

cDNA-template mitgeführt.

Da SYBER Green I auch an unspezifische Produkte wie Oligonukleotiddimere bindet, muss

zusätzlich die spezifische Schmelztemperatur der einzelnen PCR-Produkte untersucht

werden. Dazu wird am Ende jedes Laufs die Temperatur in der Kammer von 38° C bis 99 °C

in Schritten von 0,1° C angehoben und die Fluoreszenz in den einzelnen Kapillaren

kontinuierlich gemessen. Sobald die dsDNA mit ansteigender Temperatur zu denaturieren

beginnt, wird SYBR Green I freigesetzt, was in einer plötzlichen Abnahme der Fluoreszenz

resultiert. Die Schmelztemperatur wird dann aus der ersten Ableitung dieser Daten

gewonnen. Da jedes dsDNA-Produkt seinen spezifischen Schmelzpunkt besitzt, können

durch die Schmelzpunktanalyse spezifische und unspezifische PCR-Produkte, wie z. B.

Primer-Dimere unterschieden werden.


3.2.1.2.5.3 Durchführung der Real-Time-PCR

Als Matrize wurde jeweils 1 µl einer cDNA Präparation verwendet, soweit nicht anders

angegeben. Es wurde für jeden Ansatz pro Primerpaar ein Mastermix hergestellt:

H2O 12,6 µl

MgCl2 2,4 µl

LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green I 2 µl

Primer forward (10 µM) 1 µl

Primer reverse (10 µM) 1 µl

template 1 µl

Gesamtvolumen 20 µl

Programm:


50 Zyklen à

Denaturierung 95 °C (10 sec)

Annealing 55 °C (20 sec)

Elongation 72 °C (30 sec)

Schmelzkurve 40 °C – 99 °C

Der erste Denaturierungsschritt dient zur Aktivierung des Enzyms, das mit einem Protein

gegen Denaturierung bei niedrigen Temperaturen geschützt ist.

3.2.1.2.5.4 Relative Quantifizierung von cDNA

Theoretisch erfolgt in der logarithmisch-linearen Phase der PCR in jedem Zyklus eine

Verdopplung der DNA-Kopienzahl. Eine PCR-Effizienz von zwei wird jedoch nur im Idealfall

erreicht. Um verschiedene cDNA-Proben gleicher bp-Länge mittels RT-PCR hinsichtlich ihrer

Kopienzahl vergleichen zu können, muss zunächst die für jedes PCR-Produkt spezifische

Effizienz berechnet werden. Dazu wurden verschiedene Verdünnungen (1:5, 1:10 und 1:50)

der zu untersuchenden cDNA-Probe hergestellt und in Lightcycler-Analysen eingesetzt. Die

errechneten crossing points werden nach dem Lauf logarithmisch gegen die

Verdünnungsstufen aufgetragen. Aus der sich ergebenden Regressionsgerade ermittelt sich

der so genannte slope, die negative Steigung der Geraden. Unter Verwendung der negativen

Steigung errechnet sich die PCR-Effizienz E wie folgt:

E = 10—1/slope


Bei der relativen Quantifizierung wird die Expression der Zielgene mit der eines nicht

regulierten housekeeping-Gens (HK) normalisiert. Dies reduziert die Varianz der

Expressionsergebnisse, da unterschiedliche RNA-Extraktionseffizienzen sowie Fehler bei

der RT-PCR innerhalb einer experimentellen Probe gleichermaßen das Zielgen und das HK

betreffen. In den hier durchgeführten Experimenten wurde gapA, welches für die

Glycerin-Aldehyd-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, als HK verwendet.

Die Berechnung des Expressionsunterschiede (ratio) erfolgt über folgende Formel 224:

Ratio = (EZielgen)∆CP

Zielgen(Kontrolle—Behandlung) / (EHK)∆CP

HK(Kontrolle—Behandlung)

Idealerweise ist das Referenzgen (HK) nicht reguliert und sowohl in der Behandlung als auch

in der Kontrolle sind die CPs identisch, d. h. die CPs heben sich in der Berechnungsformel

im Nenner auf. Dadurch ist die berechnete ratio nur von den Expressionsunterschieden des

Zielgens abhängig. Ist kein Expressionsunterschied vorhanden, so beträgt der Quotient 1. Ist

der Quotient < 1 bedeutet dies, dass das untersuchte Gen in seiner Expression

herunterreguliert wird. Eine Ratio > 1 bedeutet dementsprechend höhere Genexpression.

3.2.1.2.6 Microarray

Es wurde der kommerziell verfügbare Microarray GeneChip® E. coli Antisense Genome

Array der Firma Affymetrix, Santa Clara, USA verwendet.

Die Hybridisierung der Microarrays wurde vom Kompetenzzentrum für Fluoreszente

Bioanalytik, Regensburg, durchgeführt.

Die RNA wurde im RIMMH isoliert und auf Trockeneis in das Kompetenzzentrum für

Fluoreszente Bioanalytik gebracht.

Die Hybridisierung und Datenauswertung orientiert sich an den Arbeitsanleitungen der Firma

Affymetrix (http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/ecoli_antisense.affx) und an

den MIAME (Minimum Information about a microarray experiment)-Standards 16,29. Zur

Hybridisierung wird zunächst Gesamt-RNA isoliert und in cDNA revers transkribiert. Die

entstandene cDNA wird anschließend mit DNaseI fragmentiert und mit einer Terminalen

Transferase am 3’-Ende mit einem Biotin-markierten ddUTP markiert.

Im Durchschnitt ist jedes Gen von E. coli auf dem Affymetrix-Chip durch 15 Sonden

repräsentiert. Für jedes Gen gibt es zusätzlich ein Set von Sonden, die unspezifische

Hybridisierung identifizieren sollen. Das Signal der Sonden wird zum Signal des

Hintergrunds und zum Signal von Sonden für gapA abgeglichen. Das housekeeping-Gen

gapA dient dabei als interne Kontrolle zur Überprüfung der Qualität der RNA-Präparation.

Zusätzlich enthält der Chip Sonden für die Gene bioB, bioC, bioD und cre. Die cDNA für


diese Sonden wird vor der Hybridisierung der Reaktion in bestimmten Konzentrationen

zugegeben, um die Hybridisierungseffizienz überprüfen zu können.

Die Sonden besitzen alle in etwa die gleiche Länge, um eine konstante

Hybridisierungswahrscheinlichkeit zu gewährleisten. Vergleiche der relativen Genexpression

zwischen einzelnen Genen sind nicht ohne Vorbehalt vorzunehmen, da die Effizienz der

Reversen Transkription vor der Hybridisierung unterschiedlich ist 17.

Nach der Hybridisierung wird die Fluoreszenz bei λ = 570 nm gemessen.

Auf der Grundlage der empfohlenen Standards für die Auswertung eines Microarrays wurden

bei der Auswertung der Signale die von Affymetrix empfohlenen cut-offs für Signaldetektion

und Datenauswertung verwendet 102.

Dabei werden bestimmte cut-offs für die Signaldetektion gesetzt. Bei der Auswertung der

Signale ergibt sich ein p-Wert als Maß der Zuverlässigkeit der Detektion. Liegt der p-Wert

des Signals berechnet über alle Sonden für ein Gen unter p = 0,04, vergibt die Software die

Wertung P (Present). Liegt der Wert dagegen über p = 0,06, wird das Signal als A (Absent)

beurteilt. Es sind auch Vergleiche der relativen Genexpression zwischen zwei Stämmen

möglich. Bei einem Vergleich des Signals jeder Sonde mit ihrem Äquivalent in einem

anderen Stamm werden Change p-Werte errechnet. Als I (Increase) gelten Change p-Werte

< 0,0025, als D (Decrease) Change p-Werte > 0,0075.

3.2.1.3 Herstellung kompetenter Zellen

3.2.1.3.1 Chemisch kompetente Zellen

Puffer:

eisgekühlter TBI und TBII (siehe Materialien und Methoden 3.1.7)

Durchführung:

In 2 ml LB-Medium ließ man über Nacht E. coli anwachsen. Am nächsten Tag wurden 0,5 ml

der Übernachtkultur auf 50 ml LB-Medium gegeben und schüttelte die Kultur bei 37 °C

schütteln, bis eine OD578 von 0,3–0,5 erreicht war. Nach Erreichen dieser OD578 wurde die

Zellkultur für 5 min bei 4.500 U/min im GSA-Rotor pelletiert. Das Pellet wurde in 16 ml kaltem

TBI resuspendiert. Der Resuspension folgte ein 15 minütige Inkubation auf Eis. Nach dieser

Zeit wurden die Zellen bei 4.500 U/min im GSA-Rotor abzentrifugiert, um ein Pellet zu

erhalten. Dieses wurde dann in 4 ml kaltem TBII resuspendiert. Von dieser Zellsuspension

wurden dann jeweils 200 µl in ein Cup gegeben und bei —80 °C eingefroren.

3.2.1.3.2 Elektrokompetente Zellen

Lösungen:

10 % Glycerin (steril)


H2O

beides eisgekühlt

Durchführung:

a) Herstellung im großen Maßstab 69

Hierfür wurden 100 ml LB-Medium mit 1 ml aus einer frischen Übernachtkultur von E. coli

angeimpft und dann bei 37 °C geschüttelt, bis eine OD578 von 0,5–1 erreicht war. Danach

wurden die Zellen für 20 min auf Eis inkubiert und bei 4 °C für 15 min bei 4.500 U/min

abzentrifugiert. Das Pellet wurde mit 100 ml kaltem H2O (4 °C) gewaschen und dann wie

zuvor zentrifugiert. Der zweite Waschschritt erfolgte mit 50 ml kaltem H2O (4 °C) und darauf

folgte eine Zentrifugation bei 4 °C für 15 min bei 4.500 U/min. Der dritte und letzte

Waschschritt erfolgte mit 2 ml 10 %igem, sterilem und kaltem Glycerin (4 °C). Nach einem

weiteren Zentrifugationsschritt wurde das Pellet in 250 µl 10%igem sterilem, kaltem Glycerin

aufgenommen und in Aliquots von je 40 µl in flüssigem Stickstoff gefroren und bei —80 °C

aufbewahrt.

b) Herstellung im kleinen Maßstab

Mit einer Übernachtkultur von E. coli wurden 100 ml LB-Medium angeimpft und bis zu einer

OD578 von 0,5 bei 37 °C geschüttelt. Sobald diese OD erreicht war wurden die Zellen für

20 min auf Eis inkubiert. In 2 ml Cups wurden drei Mal hintereinander je 2 ml Zellkultur bei

4.500 U/min für 3 min abzentrifugiert. Das aus dann insgesamt 6 ml erhaltene Pellet wurde je

zweimal mit 2 ml kaltem H2O und einmal mit 1 ml 10 %igem Glycerin gewaschen. Nach

jedem Waschschritt wurde kurz abzentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgenommen.

Zu jedem Pellet wurden 40 µl 10 %iges kaltes Glycerin gegeben und das Eppendorf-Gefäß

bei —80 °C eingefroren.

3.2.1.4 Transformation

Chemisch kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut und mit 2 µl des Ligationsansatzes

oder der Plasmid-Miniprep versetzt. Nach einer Inkubation auf Eis von 30 min, einem

Hitzeschock bei 42 °C für 30 sec und der anschließenden Zugabe von 1 ml LB-Medium ohne

Antibiotika wurden die behandelten Zellen für 1 h bei 37 °C geschüttelt. Transformanten

wurden durch Ausplattieren auf antibiotikahaltigem Medium selektioniert.

3.2.1.5 Elektroporation

Die tiefgefrorenen kompetenten Zellen wurden zuerst auf Eis aufgetaut. Währenddessen

wird der GenePulser auf 2,5 V eingestellt. Danach gab man 40 µl von den Zellen zusammen


mit 1–2 µl Ligationsansatz oder Plasmid-Miniprep in eine eisgekühlte Küvette (Schichtdicke

0,2 cm). Es ist darauf zu achten, dass die Küvette von außen trocken ist, bevor man sie in

die Apparatur stellte. Mit Hilfe elektrischer Spannung (2.5 Volt) wurde die Transformation

induziert.

Anschließend wurden die Zellen in 1 ml LB-Medium aufgenommen und für ca. 1 h bei 37 °C

geschüttelt. Die Selektion der Transformanten erfolgte durch Ausplattieren auf

antibiotikahaltigem Agar. Die erhaltenen Klone wurden nach einer Miniprep mittels

Restriktionsanalyse überprüft.

Um die Kompetenz der Zellen zu überprüfen, wurde parallel eine Transformation mit 1 ng

eines pUC18 (Invitrogen, Karlsruhe) durchgeführt.

3.2.1.6 Konjugation

Die Konjugation wurde zwischen dem E. coli-2685 und dem das Endkonstrukt beinhaltenden

E. coli S17λpir durchgeführt. 100–500 µl des Donor- und des Akzeptorstammes wurden

zusammen für 3 min bei 5.000 U/min zentrifugiert. 150 µl des Überstandes verblieben

zusammen mit dem Pellet im Cup. Der Rest wurde abgenommen. Nach 4–6 h

Inkubationszeit bei 37 °C ohne Erschütterung wurde das Pellet in 50-100 µl NaCl (0,85 %)

aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. Diese Suspension wurde dann in 2 ml NaCl

gegeben, um aus ihr eine Verdünnungsreihe von 1:10 – 1:10.000 herzustellen. 100 µl der

jeweiligen Verdünnungen wurden auf das Minimalmedium M9 mit 50 µg/ml Kanamycin

ausplattiert und für 15–17 h bei 37 °C inkubiert.

3.2.1.7 Phagentransduktion

3.2.1.7.1 Präparation des P1-Lysats

200 µl aus der Übernachtkultur des Donorstammes (Stamm mit knock-out Plasmid) wurden

auf 200 µl oder 400 µl des P1-Lysats in einen 50 ml Erlenmeyerkolben gegeben und bei

Raumtemperatur für 25 min ohne Schütteln inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit

wurden 18,5 ml LB-Medium, 0,5 ml 40 %ige Glukose und 1 ml 0,1 M CaCl2-Lösung

zugegeben. Diese Mischung wurde dann mit guter Aeration über Nacht bei 37°C geschüttelt.

Danach folgte die Zugabe von 2 ml Chloroform um die Bakterien zu zerstören. Diesem

Schritt folgte das Vortexen und dann eine Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten.

Die entstandene Mischung wurde dann in Eppendorf-Gefäßen aliquotiert und für 5–10

Minuten bei 13.000 rpm zentrifugiert. Die Überstände (Phagen) wurden abgenommen und

gepoolt. Aufbewahrt wurde das Phagen-Lysat bei 4 °C.


3.2.1.7.2 P1-Transduktion

200 µl wurden aus einer frischen Übernachtkultur des Rezipienten auf 200 µl des

Phagen-Lysates gegeben. Nach einer 20minütigen Inkubation bei 37 °C ohne Schütteln

wurden 400 µl Natrium-Citrat zugegeben, um die Infektion zu stoppen. Der Ansatz wurde

dann in 3 ml TA7-Medium gegeben, gemischt und auf LB-Platten mit dem entsprechenden

Antibiotikum gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C bebrütet.

3.2.1.8 Phänotypische Charakterisierung

3.2.1.8.1 Resistenzbestimmung mittels Etest®

Um die Antibiotikaresistenz zu bestimmen, wurden ÜN-Kulturen der zu untersuchenden

Stämme in 0,85 %igem NaCl auf den Standard McFarland = 0,5 verdünnt. Um auf

Mueller-Hinton-Agarplatten einen dichten Bakterienrasen zu erhalten, wurden die Platten

vollständig mit einem Tupfer beimpft. Zusammen mit einem Etest®-Streifen erfolgte bei

37 °C die Inkubation ÜN. Die Schnittstelle des Hemmhofes mit dem Streifen gibt anhand der

Skala des Streifens die MHK an.

Tab. 11: verwendete Etest®-Streifen Chloramphenicol AB BIODISK, Solna, Schweden

Ciprofloxacin AB BIODISK

Doxycyclin AB BIODISK

Imipenem AB BIODISK

Levofloxacin AB BIODISK

Moxifloxacin AB BIODISK

Nalidixinsäure AB BIODISK

3.2.1.8.2 Organic solvent tolerance (OST)

Zur Bestimmung des Wachstums in Gegenwart verschiedener Lösungsmittel wurden je 10 µl

einer ÜN-Kultur der drei Stämme, verdünnt in 0,85 % NaCl auf den Standard

McFarland = 0,5 auf LB Platten geimpft. Die Platten wurden nach Antrocknen der Kulturen

mit dem jeweiligen Lösungsmittel vollständig überschichtet und mit Parafilm gegen

Verdunstung des Lösungsmittels abgedichtet. Nach 3 Tagen Inkubation bei Raumtemperatur

wurde das Wachstum protokolliert.


3.2.1.8.3 Verwendung des API®20 E-Systems

API Systeme bestehen aus Mikroröhrchen, die dehydrierte Substrate enthalten. Durch

Zugabe der zu untersuchenden Bakteriensuspension werden die verschiedenen Substrate

gelöst. Nach einer Inkubation von 18–24 bzw. 48 h (je nach Testsystem) bei genau

definierter Temperatur wird das Reaktionsmuster abgelesen und durch Zuordnung von

Zahlenwerten ein Profil erstellt. Das System ermöglicht die Durchführung von festgelegten

biochemischen Untersuchungen, die anhand von Farbumschlägen entweder spontan oder

nach Zugabe von Reagenzien abgelesen werden können und dann zur Auswertung in

Tripletts zusammengefaßt werden. Bei positivem Ausfall einer Reaktion wird dem ersten

Test einer Dreiergruppe eine 1, dem zweiten Test eine 2 und dem dritten Test eine 4

zugeordnet. Bei negativen Ergebnissen wird eine Null notiert. Die 3 Ergebniszahlen der

Tripletts werden addiert und ergeben hintereinander gereiht die Profilnummer, welche

entweder in Tabellen abgelesen werden kann oder mit Computerprogrammen ausgewertet

wird. API 20E wird für Enterobakterien und andere Gramnegative Stäbchen mittels 23

standardisierter Reaktionen. (Enterobacteriaceae sind „Oxidase-negativ“, „Gram-negativ“,

„Glucose-positiv“) verwendet.

Die Konzentration der Impflösung ist standardisiert und sollte eine Dichte nach dem

McFarland Standard 0,5 aufweisen.

In 5 ml physiologische NaCl-Lösung 0,85 % wird ca. 1 Kolonie eingerührt, bis

McFarland = 0,5 erreicht ist. Diese Impflösung wird blasenfrei in alle 23 Röhrchen eingefüllt;

bei solchen mit einem Bechersymbol werden sowohl die Röhrchen als auch die Becherchen

gefüllt. Ist eine Reaktion unterstrichene, so wird das jeweilige Röhrchen mit Mineralöl

überschichtet. Die Bebrütung erfolgt bei 37 °C für 18–24 Stunden.

3.2.1.8.4 Prüfung der Kanamycin-Resistenz

Eine Tupfer voll Rattenkot wurde in 2 ml NaCl 0,85 % eingerührt. Aus dieser Suspension

wurden 100 µl auf eine kanamycinhaltige (50 µg/ml) LB-Agarplatte ausplattiert.

3.2.1.8.5 MHK-Bestimmung der Enterokokken

Das zu testende Isolat wird in 3 ml einer 0,45 %igen Kochsalzlösung bis zu einem McFarland

von 0,5 eingerührt. Diese Suspension wird dann zum Rehydrieren der Karte im

VITEK-2-Gerät verwendet werden. Im Gerät wird die Suspension wird dann nochmals

automatisch verdünnt und es folgt die Befüllung und Versiegelung der Karte automatisch.

Dann wird die Karte in das VITEK-2-Inkubatorkarrusell transportiert. Das VITEK-2-Gerät

misst das Wachstum in den einzelnen Kammern der Karte über einen definierten Zeitraum.

Am Ende der Inkubationszeit wird der MHK-Wert für Ampicillin ermittelt.


3.2.1.8.6 SIM-Test

Dieser „Sulphide Indole Motility“-Agar dient der Differenzierung von Enterobacteriaceae

aufgrund ihrer H2S-Bildung, Indolproduktion und Beweglichkeit. Die H2S-Bildung wird durch

eine schwarze Eisensulfid-Fällung angezeigt.

Die Inokulation erfolgt als Stich in die SIM-Agar-Hochschicht. Bei E. coli zeigt sich keine

Schwärzung des Mediums, d. h. es kommt zu keiner H2S-Bildung. Es kommt bei E. coli zu

einer roten Ringbildung nach Zugabe von Kovac’s Reagenz, d. h. E. coli ist „Indol-positiv“

und ist somit in der Lage Tryptophan zu Indol umzuwandeln.

Kommt es zu einer Trübung des Agars, die sich über das gesamte Röhrchen erstreckt,

handelt es sich um einen beweglichen Keim. Unbewegliche Enterobacteriaceae wachsen

hingegen nur entlang des Stichkanals.

3.2.1.8.7 Citrat-Test

Der Citrat-Agar dient der Identifizierung von Enterobacteriaceae. Einige Keime der

Enterobacteriaceae können Citrat als einzige Kohlenstoffquelle zur Energiegewinnung

verstoffwechseln. Bei der Verwertung von Citrat entstehen alkalische Produkte. Die

Alkalisierung verursacht einen Farbumschlag des im Citrat-Agar enthaltenen Indikators von

grün nach blau.

Die Inokulation erfolgt per Stich in den Citratagar (Röhrchen). Bei E. coli zeigt sich keine

Citrat-Verwertung.

3.2.1.8.8 MHK-Bestimmung mittels Mikrodilution

Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration werden die Bakterien abgestuften

Konzentrationen des Antibiotikums ausgesetzt.

Herstellung der Keimeinsaat:

Eine Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase wurde auf den McFarland-Standard 0,5

eingestellt. Von dieser Suspension wurden dann 4 µl auf 2 ml 2-fach Mueller-Hinton-Medium

gegeben.

Jeweils 100 µl Medium-Keim-Suspension wurde in die Wells einer 96-Well-Platte gegeben.

Herstellung der Antibiotikumverdünnungsreihe:

In einer externen Antibiotikumverdünnungsreihe wurden die gewünschten

Antibiotikakonzentrationen, in diesem Fall Ciprofloxacin von 128 µg/ml bis 0,008µg/ml,

hergestellt.


Da es in jedem Well zu einer 1:2-Verdünnung kommt wurde aus der Antibiotikastocklösung

mit der doppelten Konzentration der Endkonzentration 100 µl herausgenommen und auf die

100 µl Medium-Keim-Suspension gegeben.

Als Negativkontrolle wurde ein Well nur mit Medium befüllt, in ein anderes Well wurde nur die

Medium-Keim-Suspension als Wachstumskontrolle gegeben.

Um z. B. eine Konzentration von 64 µg/ml im Well zu erhalten wurden 100 µl der

128 µg/ml-haltigen Ciprofloxacinstocklösung zugegeben.

3.2.1.8.9 Untersuchung des aeroben und anaeroben Wachstumsverhaltens

Eine frische ÜN-Kultur wurde in NaCl (0,85 %) auf den Standard McFarland 0,5 verdünnt.

Dieser Ansatz wurde nochmals 1:100 mit NaCl (0,85 %) verdünnt, d. h. es wurden 70 µl auf

7 ml 0,85 %iges NaCl gegeben. Aus dieser Verdünnung wurden 7 µl auf 70 µl Thioglykolat-

Bouillon gegeben. Dieser Ansatz wurde dreimal durchgeführt. Als Referenz wurde in ein Well

nur das Medium Thioglykolat vorgelegt.

Um das anaerobe Wachstumsverhalten zu untersuchen wurde auf den aeroben Ansatz

vorsichtig 70 µl Paraffin pipettiert. Hier wurde als Negativkontrolle und Referenz Thioglykolat-

Bouillon mit Paraffin verwendet.

3.2.1.8.10 Untersuchung des Wachstumsverhaltens in einer Mischkultur

In 0,85 % NaCl wurde der mit gfp markierte Klon, entweder E. coli-32 oder E. coli-57, auf den

Standard McFarland 0,5 verdünnt. Auch der Wildtypstamm (E. coli-4) wurde auf McFarland

0,5 eingestellt. Von beiden Suspensionen wurde eine 1:1-Verdünnung hergestellt. Mit dieser

Mischung wurde eine Verdünnungsreihe von 10—1 bis 10—4 durchgeführt. Von den einzelnen

Verdünnungen wurden jeweils 100 µl auf je eine LB-Platte mit 0,1 % Arabinose ausplattiert.

Nach Inkubation über Nacht bei 37°C konnte unter UV-Bestrahlung der jeweilige markierte

Klon von dem Wildtypstamm unterschieden werden.

3.2.1.9 Induktionsversuche

3.2.1.9.1 Induktionsversuche für visuelles System

200 µl einer ÜN-Kultur von dem das Reportergen-Konstrukt tragenden Stammes wurden in

4 ml LB-Medium gegeben, welches die Induktionslösung in einer Konzentration von 5 mM

enthielt. Nachdem diese Suspension über Nacht bei 37° C schüttelnd (200 U/min) inkubiert

wurde, wurden jeweils 200 µl der Flüssigkultur in ein Well einer 96-Well-Platte gegeben und

bei 3.000 U/min für 5 min herunterzentrifugiert. Nach Abnahme der Überstände wurde die


96-Well-Platte unter einer UV-Lampe betrachtet. Die Beurteilung erfolgte über die Stärke der

Fluoreszenz.

3.2.1.9.2 Induktion für RNA-Isolierung

400 µl einer 250 mM Induktionslösung wurden zusammen mit 1 ml einer Übernachtkultur des

jeweiligen Keims mit LB-Medium auf ein Volumen von 20 ml gebracht. Diese Suspension

wurde dann solange bei 37° C bei 220 U/min geschüttelt, bis eine OD600 von 1 erreicht war.

Dann folgte die RNA-Isolierung wie unter 3.2.1.2.1 beschrieben.

3.2.1.10 Biochemische Methoden

3.2.1.10.1 Southern Blotting

3.2.1.10.1.1 DNA-Isolierung

Die hierfür notwendigen Puffer und Säulen stammten aus dem DNeasy® Tissue kit und dem

QiafilterTMPlasmid Midi Kit. Um genügend gDNA für einen Southern Blot zu isolieren, wurde

folgendermaßen vorgegangen:

Zum Puffer B1 wurde RNAseA zugegeben (Endkonzentration 200 µg/ml). 3–6 ml einer

Bakteriensuspension wurden für 5–10 min bei 4 °C bei 5.000 U/min zentrifugiert. Der

Überstand wurde abgekippt und das Bakterienpellet in 3,5 ml präpariertem B1-Puffer

resuspendiert. Nach Zugabe von 80 µl Lysozym (100 mg/ml) und 100 µl ProteaseK

(20 mg/ml) wurde der Ansatz für mindestens 30 min bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss

wurden 4 ml vom Puffer B2 zugegeben und durch vortexen gemischt. Das Lysat wurde für

30 min oder länger bei 50 °C inkubiert. Sobald das Lysat klar war, wurde es nach kurzem

vortexen auf die vorher mit 4 ml QBT-Puffer äquilibrierte Säule gegeben. Anschließend

wurde die Säule zwei Mal mit 7,5 ml QC-Puffer gewaschen. Die Eluierung der genomischen

DNA erfolgte mit 5 ml QF-Puffer. Die eluierte DNA wurde dann mit 3,5 ml Isopropanol gefällt

und für 30 min auf 4 °C bei mehr als 15.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig

abgenommen. Das entstandene Pellet wurde mit 2 ml kaltem 70 %igem Ethanol gewaschen

und unter dem Flow getrocknet. Mit 0,1–2 ml TE-Puffer wurde die DNA über Nacht bei RT

oder bei 55 °C für 1–2 h gelöst. Die Konzentration wurde dann wie unter 3.2.1.1.9

beschrieben gemessen.


3.2.1.10.1.2 Verdau für Southern Blot

Ansatz:

DNA 1–2 µg gDNA

Enzym 5 µl

Puffer 5 µl

BSA (optional) 5 µl

H2O X µl

Endvolumen 50 µl

Der Verdau wurde über Nacht bei der von dem Enzym benötigten Temperatur inkubiert.

3.2.1.10.1.3 Herstellung einer mit Digoxigenin-markierten Sonde

Die Herstellung von einer Digoxigenin-markierten Sonde erfolgte nach Angaben von Roche

Digoxigenin-11-2’-desoxy-uridin-5’phosphat, Alkali-stabil.

3.2.1.10.1.4 Kapillarblot und Hybridisierung

Die Durchführung des Kapillarblots und der Hybridisierung erfolgte nach den Angaben im

DIG Application Manual for Filter Hybridization von Roche Molecular Biochemicals.

3.2.1.10.2 HPLC (High Performance (Pressure) Liquid Chromatography)

HPLC ist eine Sonderform der Säulenchromatographie, bei der Druck angewandt wird.

HPLC dient der qualitativen und quantitativen Analyse von Substanzgemischen. Sie ist

vielen analytischen Trennmethoden in Bezug auf Trennleistung, Schnelligkeit und Aufwand

überlegen und hat auch gegenüber der Gaschromatographie durch die großen

Variationsmöglichkeiten bei stationärer und mobiler Phase viele Vorteile. Der limitierende

Faktor ist die Unlöslichkeit der Probe im Fließmittel.

Die verwendete HPLC-Apparatur bestand aus folgenden Komponenten:

Pumpe LC 10 AS

Autosampler SIL-10A

Steuer-/Integrationssoftware Class-LC10 der Firma Shimadzu, Duisburg

Säulenofen ERC 125 der Firma ERC, Riermling

Detektor Shimadzu RF10AXL (280/445 nm) der Firma Shimadzu, Duisburg

Säule Synergi Polar RP 4 µm (150x4.6 mm) der Firma Phenomenex, Aschaffenburg

Der benutzte Eluent bestand aus folgenden Komponenten:

H2O 840 ml

Tetrabutylammonium×HSO4 1.680 mg


85 %H3PO4 840 µl

Acetonitril 160 ml

Der Eluent wurde vor Benutzung gefiltert.

Die für den externen und internen Standard benötigten Substanzen waren Gatifloxacin

(Grünenthal, Aachen) und Ciprofloxacin (Firma Bayer, Leverkusen).

3.2.1.10.2.1 Vorbereitung der Proben

1. Aufbereitung des Kots der Ratten

Der von Ratten isolierte Kot wurde für 15 Minuten in einer Vakuumzentrifuge ohne

zentrifugieren getrocknet. Danach wurde der getrocknete Kot mit 1 ml 5 mg/l

Gatifloxacin-Extraktionslösung (5 ml Gatifloxacin 100 µg/ml, 40 ml H2O, 1 ml HClO4,

100 µl H3PO4) gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Gatifloxacin wurde

hierbei als interner Standard benutzt. Am nächsten Tag wurde die Suspension für 10

Minuten bei 4 °C 13.000 U/min zentrifugiert. Jeweils 150 µl der Probe wurden in ein Mini-Vial

gegeben.

2. Aufbereitung der Wasserproben:

Aufgrund der unterschiedlichen Ciprofloxacinkonzentrationen im Wasser wurden 200 µl der

Proben mit 0,8 µg/ml, 1,6 µg/ml, 3,2 µg/ml und 6,4 µg/ml Ciprofloxacin auf jeweils 2ml

internen Standard gegeben. Bei den Konzentrationen 12,8 µg/ml, 25,6 µg/ml und 36 µg/ml

wurden jeweils 100 µl der Wasserprobe auf 2 ml internen Standard gegeben.

Als interner Standard wurde Gatifloxacin (2 µg/ml) verwendet. Um die Konzentration von

2 µg/ml zu erreichen wurden 2 ml der Gatifloxacin-Stocklösung (100 µg/ml) auf 100ml Eluent

gegeben.

Als externer Standard wurde eine Kombination von 0,5 µg/ml Ciprofloxacin und 2 µg/ml

Gatifloxacin verwendet.

3.2.1.10.2.2 Ablauf der Messungen mittels HPLC

Die zu analysierende Probe wird durch das Probeneinlaßsystem eingegeben und durch das

Fließmittel auf die Trennsäule transportiert. Der Fluss beträgt 1,0 ml/min. Innerhalb der

Trennsäule findet der chromatographische Prozess bzw. die Auftrennung des

Probengemisches statt. Die einzelnen Bestandteile der Probe wandern nacheinander in den

Detektor und erzeugen ein Signal, das durch einen Schreiber in ein Chromatogramm

(Elutionskurve) überführt wird. Ein Integrator übernimmt dann die Auswertung des

Chromatogramms. Auf der Höhe von 4,4 Minuten war der Peak von Ciprofloxacin zu sehen.

Der Peak des internen Standards Gatifloxacin bildete sich bei 5,9 Minuten ab. Die


Elutionskurve stellt die Abhängigkeit für die Konzentration der eluierten Substanzen von der

Zeit dar.

3.2.1.10.2.3 Auswertung der Chromatogramme

Um die in der Probe enthaltene Konzentration zu bestimmen wurden folgende Formeln

verwendet:

(PeakflächeCip—Probe × cCip—externer Standard × PeakflächeGati—externer Standard)

CCip.Probe(µg/ml)= _____________________________________________________________________________

(PeakflächeCip—externer Standard × PeakflächeGati—interner Standard)

Aufgenommene Ciprofloxacinkonzentration in µg:

CCip-aufgenommen(µg)= Trinkmenge (ml) × cCip im Trinkwasser(µg/ml)

Ausscheidung in (%):

Ausscheidung (%) = (PeakflächeCip-Probe × 100) / cCip-aufgenommen

3.3 Markierung mittels Reporterkonstrukt

3.3.1 Green fluorescent protein (Gfp) aus Aequorea victoria

Bei gfp handelt es sich um ein für ein autofluoreszierendes Protein kodierendes Gen. Es

wurde bei der Tiefseequalle Aequorea victoria gefunden. In vivo kommt es durch eine

kalziumabhängige Oxidation von Coelenterazin zu der Biolumineszenz des Photoproteins

Aequorin. Bei dieser Reaktion wird die freiwerdende Energie in Form von blauem Licht

abgegeben. Dieses blaue Licht (509 nm) stimuliert Gfp zur Emission von grünem

Licht 116,117,276. Die Biolumineszenz von Aequorea victoria hängt also von Coelenterazin,

Aequorin, Ca2+ und dem Gfp ab, wobei Aequorin und Gfp eng miteinander assoziiert sind 117.

Das Absorptionsspektrum von Gfp hat einen deutlichen Gipfel bei 395 nm sowie einen

kleineren bei 470 nm. Die Amplituden dieser beiden Maxima von nativem Gfp sind stark von

Temperatur, Ionenstärke, der Proteinkonzentration und dem pH-Wert abhängig 35,121,122.

Die Primärstruktur des Gfp besteht aus 238 Aminosäuren mit einer Molekülmasse von

26,8 kDa.


Gfp kann sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten exprimiert werden, da es außer

Sauerstoff keinerlei exogene Faktoren, Kofaktoren oder Enzyme benötigt 121,122,157.

Für die Klonierung wurde das von Stratagene stammende gfp-Gen (optimiert nach Crameri

et al.) verwendet53.

3.3.2 Verwendung des araB-Promotors

Der araB-Promotor ist dem araBAD-Operon vorgeschaltet. Für die Induktion der Expression

des araBAD-Operons ist das araC-Genprodukt wichtig. Bei AraC handelt es sich um ein

Protein mit zwei Funktionen. In der Abwesenheit von Arabinose bindet AraC die „regulatory

sites“ I1 und O1 und unterdrückt somit die AraBAD-Operon-Transkription aufgrund von

DNA-Schleifenbildung. Der AraC-Spiegel wird autoreguliert durch die Bindung des

überschüssigen AraC an O1. Bindet Arabinose an AraC, so bindet dieses an I1 und I2, aber

nicht mehr an O1. AraC kontaktiert dann die RNA-Polymerase und hilft dieser bei der

Bindung an den schwachen Arabinose-Operon Promotor (siehe Abbildung 7) 251.

Abb. 7: Regulation der Transkription des Arabinose-Operons in Escherichia coli Quelle: Schleif,R.: AraC protein: a love-hate relationship 251 Die Genexpression kann somit effizient abgeschaltet bzw. inhibiert werden solange

L-Arabinose-freie Medien verwendet werden und indem die AraC-Antagonisten D-Arabinose

oder D-Fructose zugegeben werden 100. Aufgrund dieser engen Kontrolle können schädliche

oder unerwünschte Effekte infolge der gfp-Expression verhindert werden 100. Dies ist wichtig,


da keine Expression des gfp-Gens während der Darmpassage stattfinden soll um einen

Verlust in der Konkurrenzfähigkeit aufgrund von Protein- und Energieverlust zu vermeiden.

3.4 Zellkultur

3.4.1 Verwendete Zellen

Bei HT-29-Zellen handelt es sich um humane Adenokarzinom-Zellen (DSMZ ACC 299). Die

adhärente Zellen wachsen in Monolayern und bilden große Kolonien.

(http://www.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines/info.php?dsmz_nr=299&from=cell_line_i

ndex&select=H&term=&preselect=human;hamster;mouse;rat;insect;other&firstload=0).

3.4.2 Verwendete Medien

McCoy`s+10 %FCS: 500 ml McCoy`s

50–55 ml FCS

Einfriermedium: 500 µl DMSO

1 ml FCS

3,5 ml McCoy`s

Trypsin (0,5 %)/EDTA (0,2 %)

Waschlösung: PBS

3.4.3 Anzucht der Zellen

Die Anzüchtung der Zellen erfolgte in Flaschen von BD FalconTM mit den Größen von

175 cm3, 75 cm3 oder 50 cm3. Auf 1ml Zellsuspension wurde das entsprechende Volumen an

Medium gegeben, bis der Flaschenboden bedeckt war.

3.4.4 Splitten der Zellen

Zuerst wurde das verbrauchte McCoy`s Medium abgekippt. Darauf folgten zwei

Waschschritte mit ~10 ml PBS (zugeben, schwenken und abkippen). Anschließend wurden

2 ml Trypsin/EDTA zugegeben. Die Flaschen wurden dann für 5–10 min im Brutschrank bei

37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Klopfen vom Flaschenboden

gelöst. Die Zellen wurden dann in 9 ml McCoy`s Medium resuspendiert. In eine neue

Zellkulturflasche wurde 1 ml der Zellsuspension auf z. B. 10 ml Medium gegeben. Diese

neue Flasche wurde dann bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Feuchtigkeit inkubiert, bis ein

Zellrasen ohne Löcher auf dem Flaschenboden zu erkennen war.


3.4.5 Einfrieren der Zellen

Als Vorbereitung wurde das Einfriermedium (siehe 3.4.2) auf Eis gestellt, ein Cryo-Cup

beschriftet und die Zentrifuge auf 4 °C eingestellt. Zuerst wurde das gebrauchte McCoy`s

Medium von den Zellen abgekippt und die Zellen mit ~10 ml PBS gewaschen. Danach

wurden 2 ml Tryspin/EDTA zugegeben und die Kultur für 5–10 min in den Brutschrank bei

37 °C gestellt. Die Zellen wurden dann durch Klopfen vom Flaschenboden gelöst. Nachdem

die Zellen in 9 ml Medium gut resuspendiert wurden, ist die Zellsuspension in ein Bluecap

überführt worden und bei 4°C, 300 x g für 5 min zentrifugiert worden. Der Überstand wurde

abgesaugt, die Zellen in 1 ml Einfriermedium resuspendiert und in ein Cryo-Cup überführt.

Das Cup wurde sofort auf Eis gestellt und bei —100 °C gelagert.

3.4.6 Auftauen von Zellen

Die tiefgefrorenen Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut. Sobald die Zellen aufgetaut

waren, wurden sie sofort in eine 25 cm3-Zellkulturflasche mit McCoy`s Medium überführt, da

es sich bei DMSO um ein Zellgift handelt. Diese Flasche wurde über Nacht bei 37 °C,

5 % CO2 und 95 % Feuchtigkeit inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen in eine

75 cm3-Zellkulturflasche überführt.

3.4.7 Zelladhäsionsassay

3.4.7.1 Anzucht der HT-29-Zellen für den Adhäsionsassay

Nachdem die Zellen vom Flaschenboden gelöst worden sind wurden diese für 5 Minuten bei

4 °C und 300 U/min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in 5–

10 ml Medium aufgenommen. Von dieser Zellsuspension wurden 10 µl auf 90 µl Medium

gegeben. Dieser Ansatz wurde auf die Zählkammer „Neubauer improved“ (0,100 mm Tiefe

Depth, Profondeur, 0,0025 mm2) von LaborOPTIK aufgetragen. Danach wurde die Zellzahl pro

Milliliter bestimmt und das benötigte Volumen für die gewünschte Zellzahl berechnet. Für

den Zelladhäsionsassay wurden immer 2×106 Zellen pro Well ausgesät. Die benötigte

Menge der Zellsuspension wurde dann in jedes Well einer 24-Well-Platte gegeben und auf

ein Gesamtvolumen von 1 ml mit McCoy`s Medium gebracht. Die Platte wurde dann für 24 h

im Zellkulturinkubator aufbewahrt, um ein Absetzen und Adhärieren der Zellen an den

Well-Boden zu erreichen.

3.4.7.2 Anzucht der Keime für den Adhäsionsassay

Neben den zu untersuchenden Keimen wurde als Positiv-Kontrolle ein Citrobacter-Stamm

(Citrobacter freundii 3009, Würzburg) und als Negativ-Kontrolle ein Escherichia coli HB101

mit ausgetestet. 2 ml LB-Medium wurden mit einer geeigneten Menge Übernachtkultur


angeimpft, sodass die Kultur nach 2 h eine OD600 von 0,4–0,6 erreicht hatte. Danach wurden

die Kulturen auf eine OD600 von 0,1 verdünnt. Pro Well wurden dann 25 µl der verdünnten

Kultur zugesetzt, gemischt und für 2–4 h in einem CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Danach

wurde der infizierte HT-29-Zellrasen mit PBSMIT acht Mal gewaschen. Danach folgte die Lyse

der Epithelzellen mit je 1 ml 0,1 %igem Triton®X-100 für 10 Minuten auf einem Schüttler. Die

Anzahl der epithelzellassoziierten Bakterien wurde dann durch Ausplattieren geeigneter

Verdünnungen des Lysats bestimmt.

3.5 Konfokale Lasermikroskopaufnahmen

3.5.1 Verwendete Medien und Puffer

PBSOHNE

Paraformaldehyd

Triton®X-100

Sytox Green (Invitrogen)

Eindeckmedium: 10 g Mowiol 4.88 (Hoechst)

40 ml PBS (w/o Ca2+/Mg2+)

� 24 h rühren

20 ml Glycerol zugeben

� 24 h rühren bei 4 °C

� 20 min bei 15.000 x g zentrifugieren

� Überstand portionieren

1 mg/ml DABCO (Sigma) in fertigem Mowiol lösen

� Lagerung bei 4 °C

3.5.2 Präparatherstellung und -fixierung

200 µl der HT-29-Zellen (ca. 1×104-1×105Zellen) wurden in ein Chamber SlideTMSystem

Lab-Tek®II von Nalge Nunc International gegeben und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2

inkubiert. Am nächsten Tag wurde der mit Arabinose induzierte Klon E. coli-57 mit einer MOI

(Multiplicity of Infection; Bakterienzahl pro Eukaryonten-Zelle) zwischen 1 und 10 auf die

HT-29-Zellen gegeben. Danach wurden die Chamber Slides für zwei Stunden bei 37 °C und

5 % CO2 inkubiert. Darauf folgten drei vorsichtige Waschschritte mit jeweils 500 µl PBSOHNE.

Auf die gewaschenen Zellen wurden jetzt jeweils 800 µl 4% iges Paraformaldehyd gegeben

und bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubationszeit folgten wieder zwei

vorsichtige Waschschritte mit PBSOHNE, wobei der Waschpuffer für fünf Minuten auf den

Zellen blieb. Nach den beiden Waschschritten folgte eine 15minütige Inkubation mit

0,1 %igem Triton®X-100 bei 37 °C. Danach wurden wieder zwei 5minütige Waschschritte mit


PBSOHNE durchgeführt. Hierauf folgte die Zugabe von 250 µl 1:10.000 verdünntem Sytox

Green (500 nM). Der Farbstoff wurde für 30 min bei Raumtemperatur auf den Zellen

gelassen. Nach der Inkubationszeit folgten drei 5 minütige vorsichtige Waschschritte.

Danach wurde der Waschpuffer sehr gut abgesaugt und mit einem Heber die Kammern

entfernt. Der Objektträger wurde kurz in Milipore-Wasser getaucht und im Dunkeln

getrocknet. Sobald der Objektträger trocken war, wurde 100 µl Eindeckmedium auf das

Deckglas gegeben und mit einer Spitze verstrichen. Das Deckglas wurde dann auf den

Objektträger gelegt und die Luftblasen entfernt. Das Präparat wurde dann über Nacht in

Alufolie gewickelt im Kühlschrank fixiert.

3.6 Tierversuch

3.6.1 Verwendete Tiere

Bei den verwendeten Tieren handelt es sich um zehn weibliche spezifisch pathogen freie

F-344 Fischer Ratten im Alter von 30–35 Tagen von Charles River.

3.6.2 Tierhaltung und Tierpflege

Die Ratten wurden jeweils im Paar in einem Käfig mit Filterdeckel gehalten. Trinkwasser

wurde nach Kontrolle und Notierung der Trinkmenge drei Mal pro Woche gewechselt. Es

wurde Trinkwasser verwendet, das vor dem ersten Gebrauch auf Pseudomonas aeruginosa

getestet wurde. Die Wasserflaschen wurden nach vierwöchigem Gebrauch gereinigt und

autoklaviert. Den Ratten wurde von sniff das arabinosefreie Alleinfutter V 1535-000

Ratten/Mäuse ad libitum gegeben. Der Käfig wurde einmal pro Woche oder alle zehn Tage

gewechselt. Die Streu wurde zum Autoklavieren gegeben. Auch der gesamte Käfig wurde

nach grober Reinigung und Säuberung mit 70 %igem Ethanol zum Autoklavieren gegeben.

In einen neuen Käfig wurden circa zwei Zentimeter Streu eingebracht und dann die Tiere

umgesetzt.

3.6.3 Ankunft und Eingewöhnungsphase

Die Ratten wurden gleich nach ihrer Ankunft in zweier-Gruppen eingeteilt und an den Ohren

markiert. In der Eingewöhnungsphase wurden die Tiere mehrmals täglich besucht, um sie an

die versuchsdurchführende Person zu gewöhnen. Hierbei wurde mit ihnen geredet und sie

wurden sowohl am Bauch als auch am Rücken berührt.

3.6.4 Gewichtsbestimmung der Ratten

Um das Gewicht der Ratten zu bestimmen wurde eine Kiste, die auf einer Waage stand, mit

jeder Ratte einzeln besetzt. Die Gewichtsbestimmung wurde alle 2 Wochen durchgeführt.


3.6.5 Überprüfung des Futters auf Arabinose

Der E. coli-57 wurde in gelöstem Rattenfutter mit LB-Medium über Nacht inkubiert.

3.6.6 Kolonisation des Rattendarms mit dem markierten E. coli

Der erste Kolonisationsversuch des Rattendarms erfolgte, als die Ratten 65 Tage alt waren.

Der zweite Kolonisationsversuch wurde im Alter von 85 Tagen durchgeführt.

3.6.6.1 Kolonisation mit Hilfe von Wasser

Die Zellen einer frischen Übernachtkultur des E. coli-57 wurden bei 4 °C und 4.500 U/min

abzentrifugiert und mehrmals mit PBS gewaschen. Nach den Waschschritten wurden die

Zellen in PBS resuspendiert und die OD600 bestimmt. Die OD600 betrug ungefähr 3. Von

dieser Suspension wurden 103 µl auf 300 ml Leitungswasser gegeben. Dies entsprach einer

Keimmenge von 106 Zellen/ml. Dieses mit E. coli-57 versetzte Wasser wurde den Ratten

zum Trinken gegeben. Der Kolonisationsversuch mit Wasser wurde an drei

aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt.

3.6.6.2 Kolonisation mit Hilfe einer Sonde

Die Zellen einer frischen Übernachtkultur des E. coli-57 wurden bei 4°C und 4.500 U/min

abzentrifugiert und mehrmals mit PBS gewaschen. Nach den Waschschritten wurden die

Zellen in PBS resuspendiert und die OD600 bestimmt. Die OD600 betrug ungefähr 3. Von

dieser Suspension wurden 300 µl den Ratten per Feeding Needle 18 Gauge/50 mm Long

von der Firma Fine Science Tools verabreicht. Dies entsprach einer Keimmenge von

9×108 Zellen. Dieser Kolonisationsschritt wurde an drei aufeinander folgenden Tagen

wiederholt. Um dem markierten Stamm E. coli-57 einmalig einen Selektionsvorteil zu

verschaffen, wurde sieben Tage nach der letzten Kolonisation den Ratten für 24 h 100 ml mit

160 µg Kanamycin versetztes Wasser verabreicht.

3.7 Kontrolle der Stabilität der Kolonisation

Über drei Monate wurde Kot abgenommen und auf Kanamycinhaltige LB-Agarplatte verimpft

um das Vorhandensein des E. coli-57 zu überprüfen.

3.7.1 Kotabnahme

Zur Kotabnahme wurden die Ratten aus dem Käfig genommen und jeweils einzeln in einen

anderen Käfig ohne Streu gesetzt. Die Ratten gaben nach etwas Bewegung ohne Probleme

ihren Kot ab. Der verwendete Käfig wurde nach jeder einzelnen Kotabnahme mit 70 %igem

Ethanol gesäubert.


3.7.2 Quantitative Verarbeitung von Kotproben

Zur Bestimmung der Keimzahl in den Kotproben der Ratten wurden folgende

Untersuchungen durchgeführt.

Um den Feuchtigkeitsgehalt der Probe zu bestimmen, wurde ein Aliquot vor und nach der

Trocknung gewogen. Ein weiteres Aliquot, dessen Gewicht auch bestimmt wurde, wurde in

1 ml NaCl (0,85 %) suspendiert und es wurde eine Verdünnungsreihe angefertigt. Die

einzelnen Verdünnungen wurden auf Selektivagarplatten (CSB-Agar, McConkey-Agar,

Enterococcosel-Agar, Schädler-KV-Agar, MRS-Agar, Sabouraud-Agar) ausplattiert. Das

restliche Aliquot wurde 1:2 mit 70 %igem Ethanol versetzt und für eine Stunde bei

Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationsphase wurde eine Verdünnungsreihe

angelegt, die auf CSB ausplattiert wurde.

Ergebnisse 76

4 Ergebnisse

4.1 Chromosomale Markierung von E. coli mit gfp

Es gibt unterschiedliche Techniken der chromosomalen Markierung. Zum einen kann das

Markergen, in dieser Arbeit das green fluorescent protein (gfp), transposon-vermittelt in das

Genom eingebracht werden. Hier kann der Integrationsort nicht vorhergesagt oder

vorherbestimmt werden. Dies ist ein Nachteil, da durch die Insertion an einen unbekannten

Ort die Funktionsfähigkeit eines Gens gestört werden kann. Ist dies ein für die Zelle

essentielles Gen so hat die Integration für die Zelle unbekannte Konsequenzen. Die

Integration kann störend oder im schlimmsten Fall letal für die Zelle sein 31,105,227. Die

Reversibilität der Integration und der womöglich entstehende Gendefekt sind die Nachteile

dieser Art der Integration.

Über einen λ-Phagen besteht eine weitere Möglichkeit der chromosomalen Markierung.

Diese Art der Integration ist nur im lysogenen Status stabil. Häufig sind Helferphagen oder

Plasmide notwendig, um die Lysogenie des rekombinanten λ-Vektors zu erzeugen. Daher ist

dieses System für eine reversible Integration von DNA ins Genom geeignet 105,227. Der

Nachteil dieser Art der Integration liegt darin, dass es über einen λ-Phagen nicht möglich ist,

das Reportergen irreversibel zu integrieren.

Die homologe Rekombination bietet die Möglichkeit der gezielten Integration an einer Stelle,

die – soweit durch Genomanalyse abschätzbar – sowohl keinen Gendefekt erzeugt als auch

langfristig stabil ist. Durch die homologen Bereiche wird das Ziel der Integration

festgelegt 128,257.

4.1.1 Homologe Rekombination

Als Genort zur homologen Rekombination wurde der Bereich von 1.619.393 bp–

1.620.806 bp (1.413 bp) aus dem E. coli-K12-Genom gewählt, da dieser in keinem offenen

Leserahmen liegt und keine weitere Funktion dieses Genabschnittes bekannt ist. Die

Überprüfung auf offene Leserahmen wurde mit Hilfe des Programms EditSeqTM durchgeführt.

Die Homologie zwischen den beiden Bereichen von E. coli-K12 und E. coli-2685 beträgt

97 %. Aufgrund der Homologie der beiden Bereiche wurde angenommen, dass auch bei

E. coli-2685 kein offener Leserahmen von der Integration betroffen ist.

Um das zu rekombinierende Fragment – bestehend aus den beiden flankierenden

Rekombinations-bereichen, der Kanamycin-Resistenzkassette und dem unter der Kontrolle

eines Promotors stehenden Reportergen gfp – in den zu markierenden E. coli aus der Ratte

chromosomal einzubringen wurden folgende Methoden angewendet.

Ergebnisse 77

4.1.1.1 Verwendung des suicide-Vektors pIVETsacB

Bei suicide-Vektoren handelt es sich um konditionale Replikationssysteme, die entweder auf

der An- oder Abwesenheit eines Replikationsproteins, wie beispielsweise dem durch pir

kodierten Protein Pir 196 oder auf einem Temperatur-sensitiven Replikationsprotein, wie

beispielsweise dem RepA16 Protein 181, beruhen.

Der in dieser Arbeit verwendete Vektor pIVETsacB besitzt den oriV R6K, der für eine

autonome Replikation das Pir-Protein des Phagen λ benötigt wird. Daher kann der Vektor

nur in Stämmen wie E. coli S17λpir replizieren, in denen das Pir-Protein exprimiert wird. Ist

dieses Protein nicht vorhanden, so kann der Vektor nicht replizieren, so dass durch

Selektionsdruck mit einem Antibiotikum auf die homologe Rekombination der

Rekombinationsbereiche inklusive der Resistenzkassette und dem Reportergenkonstrukt

selektiert werden kann 182,233. Die Anwesenheit von λ-Phagen im Genom des E. coli-2685

und somit des pir-Gens konnte über eine PCR mit λ-Phagen-spezifischen Primern und

genomischer DNA von E. coli-2685 als template ausgeschlossen werden.

Neben dem oriV R6K ist das aus Bacillus subtilis stammende, für Gram-negative Bakterien

konditional letale Markergen sacB im Vektor enthalten. Die Expression dieses Gens, welches

für das sekretorische Enzym Levansucrase kodiert, ist in Anwesenheit von 5–10 %

Saccharose letal für Gram-negative Bakterien 274. Mit dem Gen sacB lassen sich

single-Rekombinanten, die den gesamten Vektor integriert haben, von

Doppel-Rekombinanten, die den suicide-Vektor verloren haben, durch Wachstum auf

Agarplatten mit 10 % Saccharose und 50 µg/ml Kanamycin unterscheiden.

Außerdem enthält der Vektor pIVETsacB die für die Konjugation wichtigen mob-Gene. Diese

sind für die Mobilisierung des Plasmids zuständig 182, was neben der Transformation auch

die Konjugation der der suicide-Vektoren in E. coli-2685 ermöglicht.

In Vorversuchen mit den pIVETsacB-Reportergen-Konstrukten pMA360-lacPr-gfp und

pMA363-hspPr-gfp (siehe Abb. 8) entstanden weder bei der Transformation noch bei der

Konjugation geeigneten Rekombinanten.

Ergebnisse 78

upstream neo gfp downstream sacB mob bla

neo gfp sacBPr Pr Pr oriV

776 777 719130

1116

11151091

1114 1090

129

720

BglII BglII Primer vorwärts Primer rückwärts Fragmentgröße (bp) Quelle Plasmid

1.090 Pr 1.091 451 gDNA2685 pMA363-hspPr-gfp

129 l Pr 130 988 pCR-gfpI pMA260-lacPr-gfp ac

hsp

Abb. 8: Schema zu dem Aufbau der suicide-Vektoren pMA360-lacPr-gfp und pMA363-hspPr-gfp

Um das sacB-Gen auf seine Funktionalität zu testen wurden die beiden

pIVETsacB-Reportergen-Konstrukte in den Laborstamm E. coli S17λpir transformiert und auf

LB-Platten, die neben Kanamycin (50 µg/ml) auch 10 % Saccharose enthielt, ausplattiert. Ist

das sacB-Gen intakt, dürfen auf der jeweiligen Platte keine Kolonien entstehen. Nach der

Transformation zeigte sich auf der saccharosehaltigen Platte Koloniebildung und nach

Induktion Fluoreszenz. Auf einer nur Kanamycin enthaltenden Platte zeigte der jeweilige

Stamm auch gutes Wachstum und Fluoreszenz. Dies lässt darauf schließen, dass das

sacB-Gen nicht funktionsfähig war. Die Sequenzierung des sacB-Gens der

pIVETsacB-Reportergenkonstrukte ergab keine Hinweise auf einen Gendefekt.

Der oriV und die mob-Gene zeigten bei der Sequenzierung keinen Defekt und können somit

nicht der Grund für das Missglücken der homologen Rekombination sein.

Auf einem Standardgel war in der Plasmidisolierung der entstandenen Klone eine Bande zu

erkennen. Die entstandenen Klone bei der Transformation des isolierten Plasmids zeigten

Kanamycin-Resistenz und nach Induktion Fluoreszenz. Dieses Ergebnis deutet darauf hin,

dass das pIVETsacB-Reportergenkonstrukt für die Resistenz und Fluoreszenz der

entstandenen Keime verantwortlich ist.

4.1.1.2 Verwendung von λ-Red-Systemen

Die homologe Rekombination unter Verwendung von λ-Red-Systemen basiert auf den

Proteinen Gam, Bet und Exo. Die Gene gam, bet und exo stammen aus dem λ-Phagen,

wobei bet und exo für die red-Rekombination zuständig sind. Die beiden Genprodukte von

bet und exo leiten die Rekombination zwischen eingebrachter linearer DNA und der

Wirts-DNA ein, nachdem Gam die RecBCD-Exonuklease V inhibiert. Diese Gene befinden

sich sowohl auf dem high copy-Vektor pUC-araBPr-gbx als auch auf dem low copy-Vektor

pKD46. Beide Vektoren wurden zur homologen Rekombination eingesetzt, da high

copy-Vektoren wie z. B. pUC-araBPr-gbx als kompetitive Inhibitoren die homologe

Rekombination beeinträchtigen könnten.

Ergebnisse 79

Um ungewollte Rekombinationsereignisse unter nicht-induzierten Bedingungen zu

verhindern befinden sich bei beiden Vektoren die Gene gam, bet und exo unter der Kontrolle

des araB-Promotors (siehe 3.3.2).

Bei der Untersuchung des biochemischen Profils von 6 E. coli-Isolaten mit Hilfe des

API E 20-Systems zeigte sich, dass alle Isolate in der Lage waren Arabinose als

Kohlenstoffquelle zu nutzen.

In Vorversuchen wurden die E. coli-Stämme 2685 und 4 im Hinblick auf ihre

Arabinoseverstoffwechselung hin untersucht. Hierfür wurde das Plasmid pUC-araBPr-gfp in

E. coli-2685, E. coli-4, als Positiv-Kontrolle in E. coli TM EPI300 und als Negativ-Kontrolle in

E. coli TOP10 transformiert und mit 0,01 %iger Arabinoselösung induziert. Außer bei der

Negativ-Kontrolle war bei den restlichen Klonen unter UV-Bestrahlung (Wellenlänge 365 nm)

eine grüne Fluoreszenz zu erkennen. Eine Induktion des Vektors pUC-araBPr-gfp im

Laborstamm E. coli TOP10 ist nicht möglich, da diesem Stamm das araC-Gen fehlt.

4.1.1.2.1 pUC-araBPr-gbx

4.1.1.2.1.1 Klonierungsstrategie des Vektors pUC-araBPr-gbx

Zur Konstruktion des Plasmids pUC-araBPr-gbx wurde zunächst der araB-Promotor (357 bp)

aus dem E. coli TM EPI300-Genom mit den Primern #1097 und #1098 vervielfältigt. In E. coli

K12 (#U00096) ist der homologe Bereich von 70.392 bp bis 70.046 bp zu finden. Dieser

Promotor wurde nach einem Doppelverdau mit AatII und NdeI in den AatII- und

NdeI-geschnittenen pUC19 kloniert. Der entstandene Vektor pUC-araBPr (2.781 bp) wurde

mit den Enzymen NdeI und XbaI geschnitten. In diese Schnittstellen wurde die gbx-Kassette

(gam, bet, exo) ligiert, nachdem sie über PCR mit den Primern #1086 und #1087 aus dem

Phagengenom Lambda vervielfältigt (1.899 bp) und mit denselben Enzymen geschnitten

(1.888 bp) wurde. Der resultierende Vektor wurde als pUC-araBPr-gbx bezeichnet und ist

4.430 bp groß. Dieses Plasmid wurde in die E. coli-Stämme 2685 und 4 transformiert.

4.1.1.2.1.2 Überprüfung der Klone

Die Richtigkeit der Plasmide wurde über eine Restriktionsanalyse und durch eine

Sequenzierung des insertierten Fragments überprüft.

4.1.1.2.1.3 Überprüfung der Gene gam, bet und exo auf ihre Funktionalität

Um die Gene gam, bet und exo des Plasmids pUC-araPr-gbx auf Funktionsfähigkeit zu

testen, wurde versucht das Gen acrB über Integration einer Kanamycinkassette zu

deletieren. Hierfür wurde aus dem Vektor pCR4-acrAB-neo (6.863 bp) das

acrAB-neo-Fragment (2.879 bp) über PCR mit den Primern #950 und #951 vervielfältigt.

Ergebnisse 80

Das PCR-Produkt wurde über Transformation in den das Plasmid pUC-araBPr-gbx

enthaltenden E. coli-2685 eingebracht. Die hierbei entstandenen Klone zeigten phänotypisch

eine Kanamycin- und Ampicillinresistenz. Um zu überprüfen, ob sich die erwartete Insertion

innerhalb von acrB befindet, wurde der entsprechende Abschnitt sequenziert. Die

Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass die Kanamycinkassette an der gewünschten Stelle

in das Genom des E. coli-2685 integriert ist. Dieser Klon wurde als E. coli-2685-acrAB::km

bezeichnet (vgl. Abb. 9).

Abb. 9: genomische Integration der neo-Kassette in E. coli-2685

In einem weiteren Versuch sollte die Kanamycinkassette in die Gene acrEF integrieren.

Hierfür wurde aus dem Vektor pUT8 (8.723 bp) das acrEF-neo-Fragment (2.858 bp) über

PCR mit den Primern #952 und #953 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den das

Plasmid pUC-araBPr-gbx enthaltenden E. coli-2685 transformiert. Dabei entstanden keine

Klone.

Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Gene gam, bet und exo im pUC-araBPr-

gbx funktionsfähig sind und der Ort der Integration für die homologe Rekombination eine

Rolle spielt.

4.1.1.2.2 pKD46-System

In dem Vektor pKD46 56 sind, wie auch im pUC-araPr-gbx, neben der

Ampicillin-Resistenzkassette auch die λ-Red Rekombinasegene gam, bet und exo unter der

Kontrolle des Arabinose-Promotors vorhanden. Ein Vorteil dieses Systems ist, dass nach

einer erfolgreichen homologen Rekombination das Plasmid pKD46 aufgrund dessen

hitzeempfindlichen oriR101 über einen Hitzeschritt ausselektioniert werden kann.

Das Plasmid pKD46 wurde in E. coli-4 transformiert.

4.1.1.2.3 Herstellung des von homologen Bereichen flankierten Reportergens

Als homologer Bereich wurde ein nicht-kodierender Bereich im Genom des aus der Ratte

isolierten E. coli-2685 verwendet. Dieser Bereich ist 1.429 bp lang und liegt downstream von

marCRAB. Das Fragment entspricht im Genom von E. coli-K12 mit der Gene Bank

Accession number #U00096 dem Bereich von 1.619.393 bp bis 1.620.806 bp und ist zu

acrS acrA neoPr neo acrB

gDNA -E. coli-2685

Ergebnisse 81

diesem zu 70 % homolog. Mit den Primern #776 und #777 wurde dieses Stück amplifiziert

und in Vorarbeiten die Plasmiden pMA364-araBPr-gfp (7.610 bp), pMA359-lacPr-gfp

(7.542 bp) und pMA362-hspPr-gfp (7.692 bp) kloniert. Eine Übersicht zu den entstandenen

Plasmiden ist in der folgenden Abbildung 10 zu finden.

Abb. 10: Übersicht zur Integration des gfp-Gens

Aus den jeweiligen Plasmiden wurde dann das für die Transformation DNA-Fragment mittels

PCR gewonnen. Die Größe der jeweiligen PCR-Produkte geht aus folgender Tabelle hervor:

Promotoren Vektor Größe (bp)

lacPr pMA359-lacPr-gfp 7.526

hspPr pMA362-hspPr-gfp 7.677

araBPr pMA364-araBPr-gfp 7.605

neo Pr

neo

homologer Bereich

homologer Bereich

Bgl II

NsiI

BglII

pMA358 6538 bp

BglII

homologer Bereich

neo Pr

neo

homologer BereichBglII

gfpPrgfp

Integration von unter der Kontrolle verschiedener Promotoren

gfp

Ergebnisse 82

Tab. 12: Übersicht der zu transformierenden Fragmente mit Angabe des Ausgangsplasmids, der Fragmentgröße und des enthaltenen Promotors Ausgangsplasmid Primerkombination Fragmentgröße

[bp]

Promotor

pMA364-araBPr-gfp 776+777 3.655 induzierbar d.

Arabinose

pMA359-lacPr-gfp 776+777 3.579 konstitutiv

pMA362-hspPr-gfp 776+777 3.729 induzierbar durch Hitze

pMA368-lacPr-dsred 776+777 3.573 konstitutiv

4.1.1.2.4 Chromosomale Integration des gfp in E. coli

Das jeweilige PCR-Produkt wurde in kompetente E. coli, die entweder das Plasmid

pUC-araBPr-gbx oder pKD46 enthielten, transformiert. Bei der ersten Transformation in

pUC-araBPr-gbx enthaltende E. coli-Stämme entstanden bei allen Konstrukten

Kanamycin-resistente Klone, die nach Induktion keine Fluoreszenz zeigten. Die Überprüfung

durch PCR zeigte entweder keine Integration an der gewünschten Stelle oder nur eine

Integration der Resistenzkassette. Die zweite Transformation von PCR-Produkten aus den

Vektoren pMA359-lacPr-gfp und pMA364-araBPr-gfp führte zu Klonen, bei denen nach

Induktion eine Fluoreszenz zu erkennen war. Eine PCR zeigte, dass keine Integration

zwischen den homologen Bereichen stattgefunden hatte. Um auszuschließen, dass sich das

Reportergen gfp noch auf einem replikationsfähigen Plasmid befand, wurde eine

Plasmidisolierung durchgeführt. Die entstandenen Klone bei der Transformation des aus

E. coli-2685-pMA359-lacPr-gfp und des aus E. coli-2685-pMA364-araPr-gfp isolierten

Plasmids zeigten Wachstum auf Kanamycin-haltigen Agarplatten und nach Bestrahlung mit

langwelligem UV-Licht (Wellenlänge 365 nm) eine grüne Fluoreszenz. Dieses Ergebnis legt

nahe, dass die homologe Rekombination des Reportergenfragments mit einem Plasmid

ablief und sich das Reportergen gfp und die Resistenzkassette daher auf einem Plasmid

befinden und somit übertragbar sind. Da bei einer Plasmidpräparation aus den

E. coli-Wildtyp-Stämmen, die der Transformation des Plasmids pUC-araBPr-gbx vorausging,

keine Plasmide isoliert werden konnten, ist es wahrscheinlich, dass die homologe

Rekombination des Reportergenfragments mit dem eingebrachten pUC-araBPr-gbx ablief.

Die Transformation der Rekombinationsfragmente in pKD46 enthaltendene E. coli-4 ergab

keine Klone.

In einem neuen Versuchsansatz wurde für die homologe Rekombination eine andere Stelle

im Genom von E. coli gewählt. Aus dem Genom des E. coli-2685 wurde mit den Primern

#1187 und #1188 ein Bereich amplifiziert, der keinen ORF enthält und dessen Funktion

Ergebnisse 83

unbekannt ist. Das amplifizierte Stück war 1.058 bp lang und befindet sich im Genom von

E. coli- K12 mit der Gene Bank Accession number #U00096 im Bereich von 2.301.973 bp bis

2.303.513 bp. Über Fusions-PCR mit den Primern #1187, #1188, #1191, #1192, #1193,

#1194 und #1195 wurde die Reportergen-Resistenzkassette aus den Vektoren pMA359-

lacPr-gfp und pMA362-hspPr-gfp mit den neuen homologen Bereichen ligiert.

Das jeweilige PCR-Produkt wurde in kompetente E. coli-2685, die das Plasmid pUC-araBPr-

gbx enthielten, transformiert. Aus der Transformation entstanden bei allen PCR-Produkten

keine Klone. Als Positivkontrolle wurde das Gen acrAB mit Hilfe der Kanamycinkassette

erfolgreich deletiert.

Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass entweder die Bereiche für die homologe

Rekombination ungeeignet sind und/oder die Integration von gfp für den Keim einen Nachteil

bringt.

4.1.1.3 Transduktion

Unter Transduktion versteht man den Transfer von genetischem Material über eine

Virusinfektion. In dieser Arbeit wurde eine generalisierte Transduktion durchgeführt. Bei

dieser Art der Transduktion entstehen die transduzierenden Partikel durch lytisches

Wachstum. Diese enthalten nur chromosomale DNA des Wirtes. Nach der Infektion und

Übertragung des Partikelinhaltes kommt es zum Austausch der homologen Rezipienten-DNA

durch die transduzierte DNA. Hierfür wird das rec-System benötigt 198.

Als Donorstamm diente der E. coli-2685-Stamm, der den Vektor pMA364-araBPr-gfp

enthielt. Als Rezipient wurde der Wildtypstamm E. coli-2685 verwendet. Die Transduktion

wurde wie in Materialien und Methoden (siehe 3.2.1.7) beschrieben durchgeführt. Die hierbei

entstandenen Klone zeigten phänotypisch eine Resistenz gegenüber Kanamycin, aber keine

Fluoreszenz nach promotorspezifischer Induktion mit 0,1 % Arabinose. Die PCR mit den

Primern #1118 und #1116 bestätigte, dass das eingebrachte Fragment araBPr-gfp in den

Selektanten nicht vorhanden war.

4.1.2 Transposonmutagenese

Das Plasmid pLOF/Km ist ein auf dem Transposon Tn10 basierender Transposon-Vektor,

der Gene übertragen kann. Das Transpositionssystem besteht aus einer

IS10R-Transposase, die sich außerhalb des mini-Tn10-Elements befindet und von einem

tac-Promotor reguliert wird, sowie aus einer Sequenz von

MluI-SfiI-NotI-MluI-Restriktionsschnittstellen zwischen den inverted repeats des

übertragbaren Elements Tn10. Die inverted repeats sind bei Tn10 in entgegengesetzter

Richtung angeordnet. Die SfiI-Schnittstelle wurde für die Integration von Fremd-DNA benützt.

In die NotI-Schnittstelle wurde die Kanamycin-Resistenzkassette kloniert. Das Plasmid

Ergebnisse 84

pLOF/Km beinhaltet außerdem den RP4 conjugal transfer origin (oriT), der notwendig ist für

den Transfer in verschiedene Gram-negative Bakterien. Der Vektor kann sich in Bakterien,

die das R6K-spezifische Pir-Protein nicht besitzen, nicht replizieren. Bei dem für

Transformationen verwendeten Stamm handelt es sich um E. coli S17λpir. Dieser Stamm

enthält die für die Replikation des Vektors notwendigen pir-Gene. Neben der

Kanamycin-Resistenz befindet sich eine Ampicillin-Resistenz auf dem Vektor

(http://www.belspo.be/bssm/db/plasmid_details2.asp?NM=pLOF/Km) 105.

4.1.2.1 Integration des gfp-Gens unter der Kontrolle des araB-Promotors in

suicide-Vektor pLOF/Km

Das gfp-Gen wurde zusammen mit dem araB-Promotor mittels PCR mit den Primern #1182

und #1183 aus dem Vektor pUC-araBPr-gfp gewonnnen. Nach einem SfiI-Verdau wurde das

1.192 bp große Fragment in die SfiI-Schnittstelle des Vektors pLOF/Km ligiert. Dieses

Plasmid wurde als pLOF/Km-araBPr-gfp bezeichnet und ist 11.092 bp groß.

Das Ligationsprodukt wurde dann in E. coli S17λpir transformiert. Über einen

Restriktionsverdau mit SfiI und mittels Sequenzierung von araBPr-gfp wurden die

entstandenen Plasmide auf Richtigkeit kontrolliert.

4.1.2.2 Konjugation mit pLOF/Km-araBPr-gfp

Der Versuch, den Vektor pLOF/Km-araBPr-gfp durch Konjugation von E. coli S17λpir auf die

Stämme E. coli-2685 oder E. coli-4 zu transferieren, brachte keine Klone mit der

gewünschten Insertion. Sowohl bei dem ersten als auch bei dem zweiten Versuch war nach

48 h bei 37 °C Koloniebildung zu erkennen. Ein Teil dieser Klone zeigte nach Subkultur auf

Kanamycin-haltigen LB-Platte (50 µg/ml) kein Wachstum. Bei fünf Klonen war deutliches

Wachstum auf einer LB-Platte mit Kanamycin (50 µg/ml) zu erkennen. Nach Induktion der

Reportergenexpression mit 0,1 % Arabinose zeigte sich bei diesen Klonen jedoch keine

Fluoreszenz.

4.1.2.3 Transformation von pLOF/Km-araBPr-gfp in E. coli-4

Bei dem ersten und zweiten Versuch der Transformation des pLOF/Km-araPr-gfp in

kompetente E. coli-4 entstanden insgesamt 57 Klone. Diese Klone zeigten nach Induktion

mit 0,1 %iger Arabinose die erwartete Fluoreszenz. Aufgrund der Stärke der Fluoreszenz

wurden aus den 57 Klonen Klon Nummer 32 (E. coli-32) und Klon Nummer 57 (E. coli-57)

ausgewählt.

Ergebnisse 85

4.1.2.4 Phänotypische Untersuchung der entstandenen Klone E. coli-32 und E. coli-57

im Vergleich zum Wildtyp E. coli-4

4.1.2.4.1 Wachstum von E. coli-32 und E. coli-57 unter aeroben und anaeroben

Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp E. coli-4

Als Maß für das Wachstum wurde in dieser Arbeit die Zu- oder Abnahme der Zellzahl

gemessen in OD betrachtet.

Das Wachstumsverhalten unter nicht-induzierenden Bedingungen von den beiden Klonen

E. coli-32 und E. coli-57 unter aeroben und anaeroben Bedingungen zeigte gegenüber dem

Wildtyp E. coli-4 einen nicht signifikanten Unterschied.

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10

OD

580

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

anaerobes Wachstum E. coli-4anaerobes Wachstum E. coli-57 anaerobes Wachstum E. coli-32 aerobes Wachstum E. coli-4aerobes Wachstum E. coli-57aerobes Wachstum E. coli-32

Abb. 11: Aerobes und anaerobes Wachstum von E. coli-4, E. coli-57 und E. coli-32 im Vergleich.

4.1.2.4.2 Wachstum der Klone 57 und 32 in einer Mischkultur mit E. coli-4

Die Mischkulturen bestanden aus dem Wildtyp E. coli-4 und einem der beiden Klone.

Der Versuch wurde wie in Materialien und Methoden (siehe 3.2.8.10) durchgeführt.

Das Keimwachstum unter induzierten Bedingungen (0,1 % Arabinose) entsprach sowohl

zwischen Wildtyp E. coli-4 und E. coli-32 als auch zwischen Wildtyp E. coli-4 und E. coli-57

Ergebnisse 86

einem Verhältnis von 1:1. Das bedeutet, dass die Klone E. coli-32 und E. coli-57 in vitro in

der Anwesenheit von E. coli-4 unter induzierenden Bedingungen keinen Wachstumsnachteil

durch die Integration des gfp-Gens haben.

4.1.2.4.3 Antibiotikaresistenz

Sowohl das Wildtyp-Isolat E. coli-4 als auch die Klone E. coli-32 und E. coli-57 wurden

mittels Etest® auf ihre Empfindlichkeit gegenüber einer Reihe von Antibiotika überprüft. Es

zeigte sich kein Unterschied der Minimalen Hemmkonzentrationen zwischen den einzelnen

Stämmen.

Tab. 13: Minimale Hemmkonzentration (mg/l) von E. coli-32 und E. coli-57 im Vergleich zu E. coli-4 MHK (mg/l)

Antibiotika E. coli-4 E. coli-32 E. coli-57

Ciprofloxacin 0,008 0,008 0,008

Moxifloxacin 0,016 0,016 0,016

Chloramphenicol 2 2 2

Doxycyclin 3 3 3

4.1.2.4.4 Organic Solvent Tolerance (OST)

Zwischen den Klonen E. coli-32, E. coli-57 und dem Wildtypstamm E. coli-4 zeigte sich in

Bezug auf die organic solvent tolerance kein Unterschied.

Sobald Cyclohexan zugegeben wurde, zeigte sich bei allen drei Keimen kein Wachstum.

Tab. 14: Wachstum der Stämme E. coli-4 sowie der Klone E. coli-32 und E. coli-57 in Gegenwart verschiedener Lösungsmittel. „+“ entspricht Wachstum und „—“ kein Wachstum. Wachstum

Lösungsmittel E. coli-4 E. coli-32 E. coli-57

100 % Oktan + + +

75 % Oktan, 25 % Hexan + + +

75 % Oktan, 25 % Cyclohexan + + +

50 % Oktan, 50 % Hexan + + +

25 % Oktan, 75 % Hexan + + +

100 % Hexan — — —

75 % Hexan, 25 % Cyclohexan — — —

25 % Oktan 75 % Cyclohexan — — —


Ergebnisse 87

Wachstum

Lösungsmittel E. coli-4 E. coli-32 E. coli-57


100 % Cyclohexan — — —

4.1.2.4.5 Prüfung der biochemischen Profile mittels API®20 E- und Phoenix®-System

Bei der Auswertung der Ergebnisse ergaben sich keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp

E. coli-4 und den Klonen E. coli-32 und E. coli-57. Dies deutet darauf hin, dass die

Integration des Transposons keine Deletion der Gene verursacht hat, die für die

Verstoffwechselung der 21 getesteten Substrate benötigt werden. Die drei Keime zeigten im

API®20 E-System alle das Profil 5-1-4-4-5-7-2. Alle drei Stämme konnten Arabinose

verstoffwechseln, was eine wichtige Voraussetzung für die Induktion des unter der Kontrolle

des araB-Promotor stehenden gfp-Gens ist.

4.1.2.4.6 Untersuchung der Adhärenz mittels Zelladhäsionsassay

Mittels sechs unabhängig voneinander durchgeführten Zelladhäsionsassays wurden die drei

Stämme E. coli-4, E. coli-32 und E. coli-57 in Bezug auf ihre Adhärenzfähigkeit an die

menschlichen Kolonkarzinomzellen HT-29 untersucht. Hierbei wurde eine gering verbesserte

Adhärenz bei E. coli-32 festgestellt, die in Abbildung 12 dargestellt ist. Da der Klon E. coli-57

dem Wildtyp E. coli-4 ähnlicher ist, wurde für die weiteren Versuche der Klon E. coli-57

verwendet.

Ergebnisse 88

CitrobacterEscherichia coli HB101

E.coli-4E.coli-57

E.coli-32

0

500

1000

1500

Citrobacter

E.coli HB101E. coli-4

E. coli-57E. coli-32

Kol

onie

anz

ahl /

Wel

l / 2

x

HT-

29-Z

elle

n 10

6

Abb. 12:Adhärenz der Keime an HT-29-Zellen; Citrobacter wurde als Positiv-Kontrolle und E. coli HB101 als Negativ-Kontrolle verwendet. Die schwarze Linie in den Boxen gibt den Mittelwert der Kolonieanzahl an. Die Boxen geben die Steuung der Kolonieanzahl an. Die Angaben beziehen sich auf sechs voneinander unabhängige Versuche.

4.1.2.4.7 Darstellung der Adhärenz mittels Konfokalen Lasermikroskops

Die Aufnahmen mit dem konfokalen Lasermikroskop bestätigten die Adhärenz des Klons

E. coli-57 an HT-29-Zellen (siehe Abb. 13).

A B

Abb. 13: Adhärenz von mit Arabinose induzierten E. coli-57 an HT-29. Die Anfärbung der Zellkerne von HT-29 erfolgte mit Sytox-Green. Die Aufnahmen wurden mit dem Lasermikroskop-System Axiovert 200M LSM510 META von Carl Zeiss gemacht. C-Apochromat 40x/1.2W corr wurde als Objektiv eingesetzt. Öl wurde als Immersionsmedium verwendet.

Ergebnisse 89

4.1.2.5 Genotypische Untersuchungen der E. coli-32 und E. coli-57 im Vergleich zum

Wildtyp E. coli-4

4.1.2.5.1 Rep-PCR

Die Rep-PCR wurde mit E. coli-4, E. coli-32 und E. coli-57 wie in Materialien und Methoden

(siehe 3.2.1.1.6.4) beschrieben durchgeführt. Die Klone E. coli-32 und E. coli-57

unterscheiden sich in ihrem Rep-PCR-Muster nicht von E. coli-4.

9921164

14821515

19531882

27993639

8576742761064899

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Spur

1031900800700600500

400

710

Abb. 14: Gelbild der Rep-PCR. Spur 1: Standard VII (Roche); Spuren 2–5: E. coli-Isolate aus dem Rattenkot; Spur 6: E. coli-4; Spur 7: E. coli-32; Spur 8: E. coli-57; Spur 9: Positivkontrolle genomische DNA von E. coli-2685 mit #776+#777; Spur 10: Standard VIII (Roche)

4.1.2.5.2 Phylogenetische Gruppe

Der Wildtyp E. coli-4 konnte aufgrund seines Bandenmusters bei der PCR mit den Primern

#1388, #1389, #1390, #1391, #1392 und #1393 der phylogenetischen Gruppe B2

zugeordnet werden. Die Klone E. coli-32 und E. coli-57 zeigten dasselbe Bandenmuster wie

E. coli-4 und wurden auch der Gruppe B2 zugeordnet (siehe 3.2.1.1.6).

Ergebnisse 90

chuA (279 bp)yjaA (211 bp)TSPE4.1 (152 bp)

1031900800700600500400300

200

Spur 1 2 3 4

Abb. 15: Gelbild zur Bestimmung der phylogenetischen Gruppe; Spur 1: Standard VIII (Roche); Spur 2: E. coli-4; Spur 3: E. coli-32; Spur 4: E. coli-57

Aufgrund der bisher erhaltenen Ergebnisse wurde der Klon E. coli-57 für die weiteren

Versuche ausgewählt.

4.1.2.6 Nachweis der chromosomalen Integration des Fragments Km-araPr-gfp im

Klon E. coli-57

4.1.2.6.1 Plasmidisolierung

Um auszuschließen, dass sich das Reportergen gfp und die Kanamycin-Resistenzkassette

bei dem Klon E. coli-57 auf einem Plasmid befindet, wurde eine Plasmidisolierung

durchgeführt. Auf einem Standardgel (siehe Anhang 8.2, Abb. 39) waren mehrere Banden

auf unterschiedlicher Höhe (bei ca. 10.000 bp, bei ca. 8.000 bp und bei ca. 4.000 bp) zu

erkennen. Die Plasmidisolierung aus dem Wildtypstamm E. coli-4 lieferte auf einem Gel auch

mehrere Banden, die sich in ihrer Größe von denen bei E. coli-57 unterschieden (ca.

7.400 bp, ca. 5.000 bp; ca. 3.300 bp). Die Plasmidpräparation (QiafilterTMPlasmid Midi Kit)

aus dem Klon 57 wurde in chemisch kompetente E. coli TM EPI300 transformiert. Die

hieraus entstandenen Klone zeigten keine Kanamycin-Resistenz und Fluoreszenz nach

Induktion durch Arabinose. Dieses Ergebnis legt nahe, dass sich das Reportergen gfp und

die Resistenzkassette nicht auf einem Plasmid befindet.

Ergebnisse 91

4.1.2.6.2 Southern Blot

Zum Nachweis der chromosomalen Integration des gfp wurde ein Southern Blot mit einer

Sonde für gfp durchgeführt. Die Herstellung einer mit

Digoxigenin-11-2`-desoxy-uridin-5`-phosphat markierten Sonde für das gfp-Gen mit den

Primern #1116 und #1381 (409 bp) oder mit der Primerkombination #1116 und #1423

(471 bp) funktionierte auch nach Veränderung einzelner PCR-Parameter nicht. Daher wurde

eine Primerkombination innerhalb der Kanamycinkassette des pLOF/Km-araBPr-gfp gewählt.

Mittels PCR und den Primern #1224 und #1542 (417 bp) wurde eine Digoxigenin-markierte

Sonde hergestellt. Mit dieser Sonde wurde dann ein Southern Blot durchgeführt. Als Enzym

für den Verdau der DNA des Klons E. coli-57 wurde PstI verwendet. Die Detektion der

Sondengensequenz war erfolgreich. Nach der Entwicklung des Films war eine eindeutige

Bande bei ca. 8.000 bp zu erkennen. Dieses Ergebnis konnte dreimal reproduziert werden.

Das Ergebnis legt nahe, dass sich die Kanamycinkassette innerhalb des Genoms befindet.

Da sich sowohl das Gen neo als auch das gfp-Gen zwischen den inverted repeats des

Transposons befanden, ist es sehr wahrscheinlich, dass auch das Fragment araBPr-gfp

innerhalb des Genoms lokalisiert ist.

4.1.2.6.3 Lokalisation der Integrationsstelle von pLOF/Km-araBPr-gfp

4.1.2.6.3.1 RS-PCR

Zur Lokalisation der Integrationsstelle wurde mit einem der 12 restriction-site-Primer

(RS-Primer) #164-#168, #232–238, #1554 und den spezifischen Primern #1225, #1224 und

#1223 eine RS-PCR mit der genomischen DNA des Klones E. coli-57 wie in Materialien und

Methoden (siehe 3.2.1.1.6.2) beschrieben durchgeführt. Die Primer #1225, #1224 und #1223

sind für die Kanamycin-Resistenzkassette spezifisch. Die für das Reportergen gfp unter der

Kontrolle des araB-Promotors verwendeten spezifischen Primer waren #1116, #212 und

#1117. Die bei der RS-PCR entstandenen Produkte wurden nach Subklonierung

sequenziert. Die Sequenzierungen der jeweiligen Produkte ergaben die Sequenz des

Mini-Tn10-Transposons aus pLOF/Km-araPr-gfp. Die Sequenz nach der

Transposonsequenz war zwischen 100 bp und 200 bp und unterschied sich bei den

entstandenen RS-PCR-Produkten. Bei der Sequenzanalyse zeigte NCBI Blast keine

signifikanten Ähnlichkeiten zu Genen aus E. coli an. Bei einer Verlängerung der

Elongationszeit von 3 auf 4 min in der PCR entstanden keine längeren Produkte. Daher ist

wahrscheinlich die Primerbindungsstelle für die Länge der Produkte die Ursache.

Diese Ergebnisse zeigten, dass sich die Erkennungsstellen der 12 RS-Primer zu nahe an der

Integrationsstelle des Resistenz- und Reportergens befinden.

Ergebnisse 92

4.1.2.6.3.2 Inverse PCR

Die genomische DNA von E. coli-57 wurde jeweils mit einem der Enzyme BspEI, BstXI, NcoI,

BbsI, AatII, SalI, SapI, BlnI, NotI, BglI, PstI, BglII, KpnI oder SphI über Nacht verdaut. Diese

Enzyme wurden aufgrund ihrer Schnittstelle innerhalb des Transposons ausgewählt.

Danach folgte die Ligation bei 16 °C über Nacht. Die darauf folgende PCR wurde mit den auf

die Schnittstelle abgestimmten Primern (siehe Tab. 15) durchgeführt. Dabei ergaben sich

keine PCR-Produkte.

Tab. 15: Zusammenfassung der Schnittstellen und der verwendeten Primerkombinationen für die inverse PCR Schnittstelle Primerkombination 1 Primerkombination 2

BspEI #1223 + #802

#1223 + #1116

#1223 + #1183

#1117 + #1054

#1117 + #381

#1117 + #1151

#1117 + #129

BstXI #1223 + #1117

NcoI #1223 + #802

#1223 + #1116

#1223 + #1183

#1117 + #1054

#1117 + #381

#1117 + #1151

#1117 + #129

BbsI #1223 + #1117 #1117 + #213

AatII #1223 + #1117

SalI #1223 + #1117

SapI #1223 + #1117

BlnI #1223 + #1117

NotI #1117 + #213

BglI #1117 + #213

PstI #1223 + #1117

BglII #1223 + #1117

SphI #1223 + #1117

MfeI #1223 + #1117

BamHI #1223 + #1117

4.2 Ratten-Selektionsmodell

4.2.1 Eingewöhnungsphase

Nach Ankunft der 10 weiblichen, 30–35 Tage alten, spezifisch pathogen freien

Fischer-Ratten F-344 wurde eine zweiwöchige Eingewöhnungsphase durchgeführt.

Ergebnisse 93

4.2.2 Statusbestimmung der Darmflora

Die Statusbestimmung der Darmflora wurde bei allen 10 Ratten sowohl vor als auch nach

der Kolonisation des Rattendarms mit dem Klon E. coli-57 durchgeführt. Insgesamt wurde 8

Mal vor der Kolonisation und 11 Mal nach der Kolonisation die Statusbestimmung der

Darmflora durchgeführt. Den Hauptanteil der Darmflora sowohl vor als auch nach der

Kolonisierung bestimmten die Lactobacillus spp. . Danach folgten Enterokokken,

Gram-negative Keime und obligat anaerobe Keime. Sporenbildner wurden im Kot der Ratte

weder vor noch nach der Kolonisation mit dem Klon 57 nachgewiesen.

Tab. 16: Mediane der Keimzahl auf eingesetztes Gewicht (in mg) mit Korrekturfaktor vor und nach der Kolonisation Keim Keimzahl vor Kolonisation Keimzahl nach Kolonisation

Gram-negative 2,49x104 3,06x104

Enterokokken 6,38x104 3,98x104

Laktobazillen 1,57x107 1,52x106

obligat anaerob

Keime

3x103 2,68x103

4.2.2.1 Phänotypische Charakterisierung ausgewählter Keime aus Rattenkot

4.2.2.1.1 Überprüfung auf Kanamycin-Resistenz

Vor der Kolonisation wurde der Rattenkot auf Kanamycin-resistente Keime untersucht. Außer

Enterokokken zeigten keine Keime Wachstum auf Kanamycin-haltigen Agarplatten

(50 µg/ml). Enterokokken besitzen eine natürliche Resistenz gegenüber Kanamycin und

zeigten daher Wachstum.

4.2.2.1.2 Untersuchung der Enterokokken auf Ampicillinresistenz

Alle 87 Enterokokken-Isolate (pro Ratte zwischen 5 und 10 Isolaten) waren

Ampicillin-sensibel und wurden daher als Enterococcus faecalis identifiziert.

4.2.2.1.3 Untersuchung Laktose-positiver Keime auf Schwefelbildung,

Indolproduktion, Beweglichkeit und Citratverwertung

Alle 85 Laktose-positiven Keime isoliert aus Kot der 10 Ratten (pro Ratte zwischen 4 und 9

Isolate) zeigten Wachstum im gesamten SIM-Medium. Dieses Ergebnis legte nahe, dass es

sich um bewegliche Keime handelte.

Ergebnisse 94

Es war keine Citratverwertung oder Schwefelbildung zu erkennen (siehe 3.2.1.8.6 und

3.2.1.8.7). Dies deutete darauf hin, dass es sich um E. coli handelt.

4.2.2.1.4 Organic solvent tolerance (OST)

Bei 56 E. coli-Isolaten kam es zu folgenden Ergebnissen:

Tab. 17: Wachstum der 56 E. coli-Isolate in Gegenwart verschiedener Lösungsmittel. „+“ entspricht Wachstum und „—“ kein Wachstum Lösungsmittel Wachstum

100 % Oktan +

100 % Hexan + (bei 4 Isolaten); — (bei 52 Isolaten)

100 % Cyclohexan —

50 % Oktan, 50 % Hexan +

50 % Oktan, 50 % Cyclohexan —

50 % Hexan, 50 % Cyclohexan —


25 % Oktan, 75 % Cyclohexan —



75 % Oktan, 25 % Cyclohexan +


4.2.2.1.5 Rep-PCR der E. coli-Isolate der nativen Rattendarmflora

Mit den Primern #263 und #264 erfolgte eine PCR mit jeweils 1 µl genomischer DNA als

template. Aus den 56 Rep-PCR-Ergebnissen ließen sich sechs verschiedene Bandenmuster

erkennen (siehe Anhang 8.2, Abb. 40–45).

4.2.2.1.6 Phylogenetische Gruppe der E. coli-Isolate aus dem Rattendarm

Zur Charakterisierung der E. coli-Isolate aus der Normalflora der Ratten wurde ihre

phylogenetische Gruppe bestimmt (siehe Materialien und Methoden 3.2.1.1.6.6).

Mit den Primern #1388 und #1389 wurde das Gen chuA aus dem jeweiligen E. coli-Isolat

amplifiziert. Bei 46 Isolaten war die PCR positiv. Diese Isolate gehören somit entweder zur

Gruppe B2 oder D. Ist die Amplifikation des Gens yjaA mit den Primern #1390 und #1391

positiv, so gehören die Isolate der Gruppe B2 an. 46 von 56 getesteten E. coli gehörten der

phylogenetischen Gruppe B2 an. Bei den restlichen 18 % handelte es sich um Isolate der

phylogenetischen Gruppe B1.

Ergebnisse 95

chuA

46 Isolate

B2 oder DyjaA

B1 oder ATSPE4.C2

+B1 A

+B2

-D

10 Isolate

46 Isolate

kein Isolat

10 Isolate

kein Isolat -

+ +

Abb. 16: phylogenetischer Stammbaum mit Gruppeneinteilung der Isolate

4.2.2.1.7 Plasmidisolierung bei E. coli-Isolaten aus der Normalflora der Ratte

Bei allen 56 Isolaten waren Plasmide mit jeweils unterschiedlicher Größe von ca. 3.000 bp

bis 8.000 bp auf einem Standardgel zu erkennen.

4.2.2.1.8 MHK-Bestimmung der E. coli-Isolate aus der Normalflora der Ratte

gegenüber Ciprofloxacin

Die MHK gegenüber Ciprofloxacin war bei 8 E. coli-Isolate 0,004 mg/l. Bei 48 Isolaten betrug

die MHK von 0,008 mg/ml.

4.2.2.1.9 Identifizierung der Laktose-negativen Kolonien aus der Normalflora der Ratte

Der Indolnachweis der auf McConkey-Platten als Laktose-negativ identifizierten Kolonien war

positiv. Bei diesen Keimen handelte es sich um den Keim Proteus mirabilis.

4.2.3 Untersuchung des Rattenfutters auf Arabinose

Um sicher zu gehen, dass der markierte E. coli-57 während der Passage des Rattendarms

keinen Kontakt zu L-Arabinose hat und kein Gfp exprimiert wird, wurde der E. coli-57 mit

Rattenfutter über Nacht inkubiert. Bei der Betrachtung unter UV-Licht zeigte sich keine grüne

Fluoreszenz.

4.2.4 Kolonisierung des Rattendarms mit E. coli-57

Den Ratten wurde wie im Schema dargestellt über Sonde oder Trinkwasser entweder

E. coli-57-Suspension oder PBS verabreicht. Vor und nach der Kolonisation fanden

Kotabnahmen statt. Die Kolonisation des Rattendarms mit E. coli-57 war über ein halbes

Ergebnisse 96

Jahr stabil. Hierauf folgte die Ciprofloxacin-Gabe in unterschiedlicher Dosierung.

Wochen0 1 2 3 4 5 6 7 24 25 26 27

KolonisationKolonisation Ciprofloxacin-GabeKanamycin-Gabe

Kotabnahme Kotabnahme Kotabnahme

Abb. 17: Schema über zeitlichen Ablauf der Kolonisation

Den Ratten aus den Käfigen 1 und 3 (Ratte 1o, 1-, 3o und 3-) wurde des markierten

E. coli-57 per Sonde verabreicht, den Tieren aus den Käfigen 2 und 4 (Ratte 2o, 2-, 4o und

4-) wurde der Keim über das Trinkwasser gegeben. Die Ratten aus dem Käfig 5 (Ratte 5o

und 5-) wurden als Negativ-Kontrolle mitgeführt. Diesen Tieren wurde an jedem

Kolonisationstag PBS per Sonde verabreicht. Die Nummern der Ratten bestanden aus der

Käfignummer (1–4) und o, wenn die Tiere mit einem Loch ihm Ohr markiert waren. Die Ratte

mit der Bezeichnung 1o war aus dem Käfig 1 und hatte als Markierung ein Loch im Ohr. Das

Tier mit der Bezeichnung 2- war aus dem Käfig 2 und hatte kein Loch im Ohr.

4.2.4.1 Ablauf der Kolonisierung

1. Kolonisationstag

Die Zellen aus einer Übernachtkultur wurden wie in Materialien und Methoden unter 3.6.4

beschrieben vorbehandelt. Bei der OD-Messung bei 580 nm ergab sich ein Wert von 2,90.

Unter der Annahme, dass 1 OD 109 Zellen entspricht (Dneasy®Tissue Handbook, Qiagen),

kongruiert eine OD von 2,9 mit einer Keimkonzentration von 2,9 × 109 Zellen/ml. 300 µl

dieser Suspension wurden den Tieren aus Käfig 1 und 3 per Sonde appliziert. Diese 300 µl

entsprechen einer Keimmenge von 8,7 x 108 Zellen. Als Kontrolle wurde den Tieren aus

Käfig 5 300 µl PBSohne per Sonde appliziert. Den Tieren in Käfig 2 und 4 wurde der Keim

E. coli-57 per Trinkwasser verabreicht. Auf 300 ml Trinkwasser wurden 103 µl

Keimsuspension (OD580 = 2,9) gegeben. Dies entspricht einer Keimkonzentration von

106 Zellen/ml.

Ergebnisse 97

2. Kolonisationstag

Die OD-Messung bei 580 nm ergab 3, das entspricht eine Keimkonzentration von 3 ×

109 Zellen/ml. 300 µl dieser Suspension wurden den Tieren aus Käfig 1 und 3 per Sonde

appliziert. Diese 300 µl entsprechen einer Keimmenge von 9 x 108 Zellen. Als Kontrolle

wurde den Tieren aus Käfig 5 PBSohne (300 µl) per Sonde appliziert.

3. Kolonisationstag

Die Messung der OD bei 580 nm ergab 3,12 (3,12 x 109 Zellen/ml). 300 µl dieser

Keimsuspension wurde, wie am ersten Kolonisationstag, den Tieren aus Käfig 1 und 3 per

Sonde appliziert. 300 µl enthielten 9,36 x 108 Zellen. Als Kontrolle wurde den Tieren aus

Käfig 5 300 µl PBSohne per Sonde appliziert. Den Tieren in Käfig 2 und 4 wurde der Keim per

Wasser verabreicht. Auf 500 ml wurden 160,25 µl Keimsuspension (OD580 = 3,12) gegeben.

Dies entspricht einer Keimkonzentration von 106 Zellen/ml.

Nach dem dritten Kolonisationstag erfolgte eine Kontrolle des Status der Darmflora der

Ratten. Hierbei stellte sich heraus, dass die Kolonisation der Tiere per Trinkwasser nicht

erfolgreich war. Daraufhin wurden alle Tiere nochmals per Sonde kolonisiert.

4. Kolonisationstag

Die Messung der OD580 ergab 3,12 (3,12 × 109 Zellen/ml). 300 µl der Suspension wurden

wiederum den Tieren aus Käfig 1, 2, 3 und 4 per Sonde appliziert. Diese 300 µl enthalten

9,36 × 108 Zellen. Als Kontrolle wurde den Tieren aus Käfig 5 300 µl PBSohne per Sonde

appliziert.

5. Kolonisationstag

Über Nacht war die Ratte 1o aus dem Käfig 1 verstorben. Die durchgeführte Obduktion

ergab keine Hinweise auf die Todesursache (Dr. T. Spruss, Tierärztlicher Dienst,

Regensburg). Bei der Keimgabe per Sonde wurde wahrscheinlich der Ratte eine Verletzung

zugeführt, die zu einer Sepsis führte und somit zum Tod. Bei der Ratte 2o wurde von einer

weiteren Kolonisation abgesehen, da der Allgemeinzustand bedenklich war. Das Tier wirkte

im Vergleich zu den anderen Ratten erschöpft und müde.

Die OD-Messung bei 580 nm der gewaschenen und resuspendierten Keimsuspension ergab

2,6, das entspricht einer Keimkonzentration von 2,6 × 109 Zellen/ml. 300 µl dieser

Zellsuspension wurde den Tieren aus Käfig 1, 2, 3 und 4, mit Ausnahme der Ratte 2o, per

Sonde appliziert. Diese 300 µl entsprachen einer Keimmenge von 7,8×108 Zellen. Den

Kontrolltieren aus Käfig 5 wurde je 300 µl PBSohne per Sonde appliziert.

6. Kolonisationstag

Über Nacht war die Ratte 2o verstorben. Bei der Obduktion zeigten sich keine

Organveränderungen oder andere Hinweise auf Erkrankungen. Daher wurde als

Todesursache eine Sepsis angenommen, die durch eine Verletzung der Speiseröhre bei der

Ergebnisse 98

Keimapplikation per Sonde verursacht wurde. Da Ratten keine Einzelgänger sind, wurde

nach Befragung des Tierarztes die Ratte 1- mit einem Dreieck am Ohr markiert und zu Ratte

2- in den Käfig 2 gegeben, damit soziale Umgebung und somit die Versuchsbedingungen bei

allen Versuchstieren gleich waren.

Die OD-Messung bei 580 nm ergab 3,12 (3,12 x 109 Zellen/ml). 300 µl dieser Zellsuspension

wurden den Tieren aus Käfig 2, 3 und 4 per Sonde appliziert. Diese 300 µl entsprechen einer

Keimmenge von 9,36 × 108 Zellen. Als Kontrolle wurde den Tieren aus Käfig 5 300 µl

PBSohne per Sonde appliziert.

Sieben Tage nach der letzten Kolonisation wurde einmalig allen Tieren für 24 h Trinkwasser

mit einer Kanamycinkonzentration von 50 µg/ml gegeben. Durchschnittlich wurde pro Tier

eine Menge von 50 ml innerhalb dieser 24 h aufgenommen. Da Kanamycin oral nicht

resorbiert wird hat es eine sehr gute Wirksamkeit im Darm. Dies sorgte für einen

Selektionsvorteil des E. coli-57 innerhalb der Darmflora.

Die Kolonisation des Rattendarms mit E.coli-57 war über sechs Monate lang stabil.

Innerhalb von sechs Monate starben vier weitere Ratten aus der Versuchstiergruppe aus

ungeklärter Ursache (Obduktion Dr. T. Spruss)

4.2.5 Bestimmung des Gewichts der Ratten

Bei allen Ratten wurde eine stetige Zunahme des Gewichts beobachtet.

4.2.6 Gabe von Ciprofloxacin in unterschiedlichen Konzentrationen und

verschiedenen Dosierungsschemata

Für diese Versuchsreihe wurden alle Ratten in Einzelhaltung genommen, da nur auf diese

Weise die Trinkmenge pro Tier bestimmt werden konnte.

Die Tiere wurden in Zweier-Gruppen eingeteilt. Der ersten Gruppe, die aus zwei mit dem

Stamm E. coli-57 kolonisierten Tieren bestand, wurde sechs Tage lang jeden Tag eine

höhere Ciprofloxacinkonzentration verabreicht (siehe Tab. 18). Die zweite Gruppe, die aus

zwei Tieren der Kontrollgruppe bestand, bekam nur jeden zweiten Tag eine höhere

Ciprofloxacinkonzentration (siehe Tab. 19). Das Antibiotikum wurde über das Trinkwasser

nach folgenden Schemata verabreicht:

Ergebnisse 99

Tab. 18: Gruppe mit täglich höheren Ciprofloxacinkonzentration Tag 1 20 µg/ml

Tag 2 40 µg/ml

Tag 3 80 µg/ml

Tag 4 160 µg/ml

Tag 5 320 µg/ml

Tag 6 640 µg/ml

Tab. 19: Gruppe mit am zweiten Tag ändernder Ciprofloxacinkonzentration Tag 1 20 µg/ml

Tag 2 20 µg/ml

Tag 3 40 µg/ml

Tag 4 40 µg/ml

Tag 5 80 µg/ml

Tag 6 80 µg/ml

Bei den täglichen Kotabnahmen und dem Screening auf Gram-negative, Laktose-positive

Keime stellte sich heraus, dass sich ab einer Ciprofloxacinkonzentration von 640 µg/ml kein

Wachstum auf dem Selektivmedium McConkey mehr zeigte.

Bei der ersten Gruppe konnten zwei Kanamycin-resistente E. coli, E. coli-4o1 und

E. coli-4o2, nach der Gabe von 160 µg/ml Ciprofloxacin (Trinkwasser) aus dem Kot isoliert

werden.

4.2.6.1 Untersuchung der bei 160 µg/ml Ciprofloxacin isolierten

Kanamycin-resistenten E. coli-4o1 und E. coli-4o2

Die Keime E. coli-4o1 und E. coli-4o2 zeigten Wachstum auf Kanamycin-haltigen

LB-Agarplatten mit 0,1 % Arabinose, aber keine Fluoreszenz. Bei einer PCR mit den

Primerkombinationen #1117 und #1116, #1118 und #1523, #801 und #1523 und #213 und

#1523 zum Nachweis des Fragments araBPr-gfp im Ganzen oder nur einem Teil davon

entstanden keine Produkte. Um auszuschließen, dass sich die Kanamycin-Resistenz auf

einem replikationsfähigen Plasmid befindet, wurde bei beiden Klonen eine Plasmidisolierung

durchgeführt. Auf einem Standardgel war in der jeweiligen Plasmidisolierung eine Bande bei

circa 4.000 bp zu erkennen. Die Plasmidpräparation wurde in den zur

Arabinoseverstoffwechselung fähigen Wildtypstamm E. coli-2685 transformiert und auf

Kanamycin-haltigen LB-Agarplatten ausplattiert. Es wurde kein Wachstum beobachtet. Auch

eine PCR mit den Primerkombinationen #1523 + #1225 und #1223 + #1521 ergab keine

Produkte.

Ergebnisse 100

Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich die Resistenzkassette sowohl bei E. coli-4o1 als

auch bei E. coli-4o2 nicht auf einem Plasmid befindet.

Mittels Rep-PCR und der Bestimmung der phylogenetischen Gruppe konnte gezeigt werden,

dass beide Isolate im Genotyp dem markierten Stamm E. coli-57 entsprechen.

Auch bei der organic solvent tolerance waren keine Unterschiede zwischen E. coli-4o1,

E. coli-4o2 und dem Stamm E. coli-57 zu erkennen.

Die gesamten Ergebnisse lassen annehmen, dass die beiden Stämme E. coli-4o1 und

E. coli-4o2 von dem Stamm E. coli-57 abstammen, jedoch während der Behandlung der

Ratte mit Ciprofloxacin die Reportergenmarkierung komplett verloren haben.

Die Bestimmung der MHK gegenüber Ciprofloxacin mittels Mikrodilution ergab bei allen drei

Keimen den Wert 0,008 mg/l. Da es zu keiner Veränderung der MHK gegenüber

Ciprofloxacin bei E. coli-4o1 und E. coli-4o2 gekommen ist, waren diese Klone für weitere

Untersuchungen der Resistenzentwicklung nicht brauchbar.

4.2.6.2 Bestimmung der Ciprofloxacinkonzentration mittels HPLC

Die im Kot vorhandene Ciprofloxacinkonzentration wurde mit Hilfe von HPLC bestimmt

(genauen Daten siehe Anhang 8.3). Unter der Annahme, dass alles verbrauchte Trinkwasser

von den Tieren aufgenommen worden war, wurden 26,5 % der Dosis Ciprofloxacin im Kot

ausgeschieden. Der Prozentsatz der ausgeschiedenen Menge fiel auf 21,9 % ab, wenn nicht

die nominale Konzentration im Trinkwasser, sondern die tatsächlich gemessene

Ciprofloxacinkonzentration für die Berechnung verwendet wurde. Die Berechnung erfolgte

mit Hilfe der Formeln aus Materialien und Methoden (siehe 3.2.1.10.2.3).

Mit den Messungen im Kot konnte nicht unterschieden werden zwischen der nicht

resorbierten Menge Ciprofloxacin und der Menge Ciprofloxacin, die nach Resorption über die

Galle wieder ausgeschieden worden war. In der Massenbilanz sind auch Metabolite von

Ciprofloxacin nicht berücksichtigt, da diese nicht bestimmt wurden.

Ergebnisse 101

4.3 Wirkung humaner Pharmazeutika auf die Induktion von Efflux

Um pharmakologische Substanzen zu identifizieren, die Expressionssteigerungen

spezifischer Fluorchinolon-Transporter oder regulatorischer Proteine auslösen und damit die

intrinsische Resistenz von E. coli erhöhen, wurden in einem Gfp-Reportersystem klinisch

häufig verabreichte Pharmazeutika auf ihr induktives Potential untersucht. Es wurde ein

Screening-System für E. coli entwickelt, in dem eine Fluoreszenzänderung beobachtet wird,

wenn eine beliebige Substanz zur Veränderung der Expression Efflux-assoziierter Gene

führt. Das System basiert auf E. coli-Stämmen mit einem Reportergen-Plasmid, auf dem das

gfp-Gen jeweils unter der Kontrolle des Promotors eines der sieben

Fluorchinolon-Transporter bzw. der globalen Regulatoren MarA, Rob und SoxS steht. Um

das Fluoreszenzsignal zu verstärken, wurde zwischen Promotor und Reportergen ein von

Cheng und Patterson 37 beschriebener Translationsenhancer eingefügt, der laut Miller und

Lindow die Translation bis zu 80-fach verstärken kann 201. Diese Signalverstärkung erscheint

insbesondere dann wichtig, wenn der zu untersuchende Promotor nur zu einer schwachen

Transkription führt.

4.3.1 High copy-Plasmid-System

4.3.1.1 Klonierung der Reportergen-Vektoren

Folgende Reportergen-Vektoren wurden schon in Vorarbeiten kloniert:

• pUC-acrABPr-gfp

• pUC-acrEFPr-gfp

• pUC-acrDPr-gfp

• pUC-mdfAPr-gfp

• pUC-mdtHPr-gfp

• pUC-acrABPr-Tgfp

• pUC-mdtKPr-Tgfp

4.3.1.1.1 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des norE-Promotors

Um das gfp-Gen unter die Kontrolle des norE-Promotors zu bringen, wurde der Genabschnitt

per PCR mit den Primern #1049 und #1050 (972 bp) aus dem E. coli-Genom TM EPI300

vervielfältigt. Im E. coli-Genom K12 (Gene Bank #U00096) entspricht dieser Abschnitt dem

Bereich von 1.740.525 bp bis 1.741.478 bp und wurde als norEPrI bezeichnet. Als

Alternative wurde auch noch eine PCR mit den Primern #1113 und #1150 (233 bp)

durchgeführt. Der amplifizierte Abschnitt befindet sich im E. coli-Genom K12 (#U00096) an

der Position von 1.741.267 bp bis 1.741.479 bp und wurde als norEPrII benannt. Der

Ergebnisse 102

jeweilige Promotor wurde nach dem Verdau mit AatII und NdeI in den mit den gleichen

Enzymen geschnittenen Vektor pUC19 integriert. Die resultierenden Vektoren wurden als

pUC-norEPrI (3.396 bp)und pUC-norEPrII (2.657 bp) bezeichnet. In die beiden Vektoren

wurde nach einem Doppelverdau mit NdeI und XbaI das aus dem Vektor pCR4-gfpgenIV

(4.739 bp) mit FauI- und XbaI-geschnittene Fragment (762 bp) ligiert. Aus unklaren Gründen

ergab die Klonierung des Plasmids pUC-norEPrI-gfp keine Klone. Die Klonierung des

Vektors pUC-norEPrII-gfp (3.180 bp) war erfolgreich.

Um die Translation des gfp-Gens zu verstärken wurde über Fusions-PCR (#1113 und #1051)

aus den PCR-Produkten pUC-norEPrII-gfp mit #1113 und #1133 (242 bp) und pUC-acrABPr-

Tgfp mit den Primern #1131 und #1051 (795 bp) der norE-PromotorII vor das Tgfp-Gen

kloniert. Das Fusions-PCR-Produkt (1.012 bp) wurde nach einem BglII-Verdau in einen mit

BamHI-geschnittenen pUC19 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pUC-norEPrII-Tgfp

(3.685 bp) bezeichnet.

4.3.1.1.2 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des mdtM-Promotors

Der mdtM-Promtor wurde per PCR mit den Primern #1071 und #1072 (1.005 bp; mdtMPrI)

oder alternativ mit #1073 und #1072 (826 bp, mdtMPrII) aus dem E. coli-Genom DH5α

amplifiziert. Im E. coli-Stamm K12 (Gene Bank #U00096) ist der homologe Bereich des

mdtMPrI von 4.567.523 bp bis 4.566.540 bp zu finden. Der mdtMPrII entspricht bei E. coli

K12 dem Bereich von 4.567.343 bp bis 4.566.540 bp. Die Promotoren wurden nach einem

Doppelverdau mit AatII und BbsI in den mit denselben Enzymen geschnittenen Vektor pUC-

gfpgen (2.953 bp) kloniert. Die resultierenden Vektoren wurden als pUC-mdtMPrI-gfp

(3.939 bp) und pUC-mdtMPrII-gfp (3.760 bp) bezeichnet.

4.3.1.1.3 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des rob-Promotors

Im Genom des E. coli-Stammes K12 (#U00096) ist der rob-Promotor im Bereich von

4.633.544 bp bis 4.633.334 bp zu finden. Der Bereich wurde mit den Primern #1178 und

#1179 aus dem Genom von E. coli TM EPI300 amplifiziert. Seine Länge beträgt 249 bp. Das

mit dem enhancer (von Cheng und Patterson 37 beschrieben) verstärkte gfp wurde über eine

PCR mit den Primern #1131 und #979 aus dem Vektor pUC-acrABPr-Tgfp amplifiziert.

Dieses 790 bp lange Tgfp-Fragment wurde über Fusions-PCR mit dem rob-Promotor

verbunden. Die PCR wurde mit den Primern #1178 und #979 durchgeführt. Das entstandene

Fusions-PCR-Produkt (1.014 bp) wurde mit AatII und XbaI verdaut. Bei der Klonierung des

geschnittenen PCR-Produkts in den AatII- und XbaI-geschnittenen Vektor pUC-gfpgen

entstanden keine Klone.

Ergebnisse 103

4.3.1.1.4 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des soxS-Promotors

Der soxS-Promotor wurde über eine PCR mit den Primern #1180 und #1181 aus dem

E. coli-Genom TM EPI300 amplifiziert. Das entstandene Fragment ist 124 bp lang und

entspricht im E. coli-Genom K12 (#U00096) dem Bereich von 4.275.492 bp bis 4.275.407 bp.

Das gfp-Gen wurde mit enhancer aus dem Vektor pUC-acrABPr-Tgfp mit den Primern #1131

und #979 amplifiziert (790 bp) und über Fusions-PCR (#1180 und #979) hinter den

soxS-Promotor kloniert. Diese Fusions-PCR funktionierte aus unbekannter Ursache nicht.

Bei einem alternativen Klonierungsversuch wurde der Vektor pUC19 mit BamHI geschnitten.

Aus dem Vektor pCR4-soxSPr-Tgfp (4.968 bp) wurde über einen BglII-Verdau das für die

Ligation nötige Insert gewonnen (994 bp). Die Ligation des Fragments soxSPr-Tgfp in den

BamHI-geschnittenen Vektor funktionierte nicht.

4.3.1.1.5 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des marRA-Promotors

Um das gfp-Gen unter die Kontrolle des marRA-Promotors und unter die

Translationsverstärkung des enhancers (von Cheng und Patterson 37 beschrieben) zu

bringen wurde der Promotor per PCR mit den Primern #1176 und #1177 (249 bp) aus dem

E. coli-Genom TM EPI300 vervielfältigt. Im E. coli-Genom K12 (Gene Bank #U00096)

entspricht dieser Abschnitt dem Bereich von 1.616.933 bp bis 1.617.143 bp. Das gfp-Gen

wurde zusammen mit dem enhancer per PCR (#1131 und #979) aus dem Plasmid pUC-

acrABPr-Tgfp amplifiziert. Der marRA-Promotor und das Tgfp-Fragment wurden über

Fusions-PCR mit den Primern #1176 und #979 miteinander verbunden. Dieses Produkt

(1014 bp) wurde dann mit den Enzymen AatII und XbaI verdaut und in einen mit denselben

Enzymen geschnittenen Vektor pUC-gfpgen (2.198 bp) versucht zu ligieren. Diese Ligation

war aus unbekannter Ursache nicht erfolgreich.

Alternativ wurde versucht das BglII-Fragment (994 bp) aus pCR4-marRAPr-Tgfpa in einen

mit BamHI geschnittenen pUC19 zu klonieren, um das Plasmid pUC-marRAPr-Tgfp

(3.680 bp) zu erhalten. Bei dieser Klonierung entstanden keine korrekten Plasmide.

4.3.1.1.6 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrEF-Promotors

Der acrEF-Promotor wurde über eine PCR mit den Primern #977 und #1134 aus dem pUC-

acrEFPr-gfp amplifiziert. Das entstandene Fragment ist 437 bp lang und entspricht im

E. coli-Genom K12 (Gene Bank #U00096) dem Bereich von 3.411.487 bp bis 3.411.885 bp.

Das gfp-Gen wurde mit enhancer aus dem Vektor pUC-acrABPr-Tgfp mit den Primern #1131

und #979 amplifiziert (790 bp) und über Fusions-PCR (#977 und #979) mit dem

acrEF-Promotor verbunden. Dieses Fusions-PCR-Produkt war 1.232 bp lang und wurde mit

BglII verdaut (1.182 bp). Dieses Fragment wurde dann in einen mit BamHI geschnittenen

Ergebnisse 104

pUC19 ligiert. Der hieraus resultierende Vektor wurde als pUC-acrEFPr-Tgfp (3.868 bp)

bezeichnet.

Promotor Vektor Größe (bp)

Pr pUC-acrABPr-gfp 3.153

pUC-acrEFPr-gfp 3.360

pUC-acrDPr-gfp 3.955

Pr pUC-mdtHPr-gfp 3.910

Pr pUC-norEPr-gfp 3.180

Pr pUC-mdtMPr-gfp 3.760

norE

acrAB

acrEF

acrD

mdfA

mdtH

norE

mdtM

Pr

Pr

Pr pUC-mdfAPr-gfp 3.941

PrII pUC-norEPr-Tgfp 3.685

gfpgfp

Pr /Pr-Tgfp

blaPr

bla

pUC19

Abb. 18: Aufbau der gfp-Reportergen-Vektoren

4.3.1.2 Screening-System

In einem Vorversuch mit dem Kontroll-Stamm (E. coli DH10B mit pUC-acrABPr-Tgfp) konnte

die Funktionalität des Systems gezeigt werden, in dem der Promotor des acrAB-Operons die

gfp-Transkription steuert. Abbildung 18 zeigt die Fluoreszenzänderung dieses Stammes

durch den bekannten Induktor Salizylat (0–5 mM). Ein induzierender Effekt ließ sich auch mit

Ethanol nachweisen (siehe Abbildung 19), allerdings nur bis zu einer Konzentration von

0,57 %. Die Induktoren in den entsprechenden Konzentrationen zeigten keine

Eigenfluoreszenz.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 mM Salizylat

Abb. 19: Fluoreszenz des Reporterstammes E. coli DH10B mit pUC-acrABPr-Tgfp nach Induktion durch Salizylat Angegeben sind die jeweiligen Konzentrationen des Induktors.

Ergebnisse 105

0,19 0,38 0,57 0,76 0,95 % Ethanol

Abb. 20: Fluoreszenz des Reporterstammes mit E. coli DH10B mit pUC-acrABPr-Tgfp nach Induktion durch Ethanol. Angegeben sind die jeweiligen Konzentrationen des Induktors.

4.3.1.3 Screening der Pharmazeutika

Die Untersuchung der potentiellen Induktoren wurde in Flüssigkultur durchgeführt. Dabei

wurden in 96-well-Mikrotiterplatten die Reporterstämme parallel mit unterschiedlicher

Konzentrationen des putativen Induktors kultiviert und einschließlich nicht induzierter

Kontrollkulturen hinsichtlich Fluoreszenzunterschieden untersucht.

Es wurden aus verschiedenen Kategorien Pharmazeutika gewählt, die aufgrund ihrer oralen

Gabe einen Einfluss auf die Flora des Intestinaltraktes ausüben können. Es wurde darauf

geachtet mit Konzentrationen des potentiellen Induktors zu arbeiten, die auch physiologisch

erreicht werden können. Als Anhaltspunkt dienten dabei entsprechende Angaben bzw.

bekannte Daten über die Konzentration des Medikaments im Serum bzw. Darm. Aufgrund

der schlechten Löslichkeit von Medikamenten wurde auf den jeweiligen Wirkstoff in

Reinsubstanz zurückgegriffen. Die Reinsubstanzen wurden entweder in 70 %igem oder

100 %igem Ethanol gelöst (siehe Tab: 20).

Tab. 20: Lösungsmittel der Reinsubstanz Reinsubstanz Lösungsmittel

Azetylsalizylsäure, Sigma-Aldrich, Steinheim 70 % Ethanol, Merck, Darmstadt

Ibuprofen, Sigma-Aldrich 100 % Ethanol, Merck

Ketoprofen, Sigma-Aldrich 100 % Ethanol

Paracetamol, Sigma-Aldrich 100 % Ethanol

Alle Substanzen wurden in einer Konzentration von 5 mM in die Versuche eingesetzt. Die

induzierten Proben wurden hinsichtlich ihrer Fluoreszenz untersucht. Grüne Fluoreszenz

wurde als positives und keine Fluoreszenz wurde als negatives Ergebnis gewertet.

Aufgrund von Eigenfluoreszenz konnten folgende Substanzen nicht auf ihren induktiven

Effekt hin ausgetestet werden:

• Ethacridinlactat (Aug.Hedinger GmbH & Co., Stuttgart)

• Citrofresh (GDM Technologies, Australien)

• Paracetamol Saft (Hexal, Holzkirchen)

• Multivitamin Akt (Lichtenstein Pharmazeutica GmbH & Co., Koblenz-Kesselheim)

Ergebnisse 106

• Dynexan® (Kreussler Pharma, Wiesbaden)

• Cranberries (Seeberger, Ulm)

• Braunol (B|raun, Melsungen)

• Magnesiocard (Verla pharm, Tutzing)

4.3.1.4 Induktion spezifischer Promotoren von Fluorchinolon-Transportern oder

regulatorischer Proteinen

Für diese Versuche wurden E. coli-Stämme mit den jeweiligen Vektoren im nicht-induzierten

Zustand beobachtet. Alle zeigten im nicht induzierten Zustand keine Fluoreszenz. In Tabelle

21 sind die Ergebnisse zu diesen Versuchen zusammengefasst.

Tab. 21: Übersicht zu Promotoren und Induktoren; T steht für enhancer; „+“ bedeutet Substanz hat induktiven Effekt auf Promotor; „—“ bedeutet Substanz hat keinen induktiven Effekt auf Promotor Promotor

Substanz acrAB acrEF acrD norE norE-T mdtH mdtM mdfA

Ethanol (70 %) + — + — + — — —

Ethanol (100 %) + — + — + — — —

Isopropanol + — + — — — — —

Methanol + — + — + — — —

Aceton + — + — — — — —

n-Dodekan + — + — + — — —

n-Oktan + — + — + — — —

Ibuprofen + — + — + — — —

Ketoprofen + — + — + — — —

Paracetamol + — + — + — — —

Azetylsalizylsäure + — + — + — — —

4.3.2 Low copy-Plasmid-System

Die Verwendung eines high copy-Plasmids als Screening-Instrument birgt die Gefahr, dass

durch die erhöhte Anzahl von Bindungsstellen eines Regulators nicht die exakten

physiologischen Auswirkungen einer Induktion widergespiegelt werden. Um

Gen-Dosis-Effekte durch die Verwendung eines high copy-Plasmides zu vermeiden, wurden

die Fragmente mit den Promotor-gfp-Sequenzen aus dem pUC19 in den low copy-Vektor

pCC1_dB von EPICENTRE kloniert.

Der pCC1-Vektor besitzt sowohl den E. coli-Faktor single copy- als auch den high

copy-(oriV)-Replikationsursprung. Die Initiation der Replikation über oriV erfordert das

Ergebnisse 107

TrfA-Protein. Im Stamm E. coli TM EPI300 steht trfA unter der Kontrolle des araB-Promotors,

daher kann in diesem Stamm über die Arabinosekonzentration im Medium die

TfrA-Expression und damit die Replikation von pCC1 in einem Bereich zwischen 1 und 70

Kopien pro Zelle sehr genau reguliert werden. Mittels eines pCC1-Derivates mit dem

gfp-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors konnte die lineare Abhängigkeit der

Kopienzahl von der Arabinosekonzentration visualisiert werden (siehe Abb. 21).

0 0.01 0.001 0.0002 0.00015 0.0001 %Arabinose

® CopyControl,Epicentre

Abb. 21: Induktion von pCC1-gfp mit Arabinose (Linde et al. ICCAC 2003). Angegeben werden die jeweiligen Konzentrationen von Arabinose

Durch die Verwendung von E. coli TM EPI300 mit pCC1 als Reportergen-Vektor können so

eventuell auftretende Gen-Dosis-Effekte analysiert und gegebenenfalls ausgeschlossen

werden.

Eine genaue Detektion und Quantifizierung der Fluoreszenz in 96-well-Mikrotiterplatten war

bei den pCC1-Konstrukten nicht möglich, da es sich bei dem Plasmid pCC1 um einen low

copy-Vektor handelt. Geringe Veränderungen der Gfp-Expression – ausgelöst durch

Induktion – konnten visuell nicht wahrgenommen werden. Aus diesem Grund wurde mittels

RT-PCR im LightCycler® unter Verwendung von gfp-Primern die Reaktion der Promotoren

auf Induktoren ausgetestet.

4.3.2.1 Klonierung der Reportergen-Vektoren

4.3.2.1.1 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrAB-Promotors

Das gfp-Gen unter die Kontrolle des acrAB-Promotors wurde zusammen mit dem

acrAB-Promotor per BglII-Verdau aus dem Vektor pUC-acrABPr-gfp gewonnen. Das 950 bp

große Fragment wurde in den mit BamHI geschnittenen pCC1_dB kloniert. Dieses Plasmid

wurde als pCC1-acrABPr-gfp bezeichnet und ist 9.077 bp groß.

Ergebnisse 108

4.3.2.1.2 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrEF-Promotors

Um das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrEF-Promtors in den pCC1_dB-Vektor zu bringen,

wurde das Plasmid pUC-acrEFPr-gfp mit BglII verdaut und das hieraus resultierende

Fragment (1.157 bp) in den BamHI-geschnittenen pCC1_dB ligiert. Der resultierende Vektor

ist pCC1-acrEFPr-gfp (9.284 bp).

4.3.2.1.3 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des acrD-Promotors

Der acrD-Promotor und das gfp-Gen wurden über einen BglII-Verdau aus dem Vektor pUC-

acrDPr-gfp erhalten. Der Vektor pCC1_dB wurde mit BamHI verdaut. Das BglII-verdaute

Fragment acrDPr-gfp (1.752 bp) wurde dann in den BamHI-geschnittenen pCC1_dB-Vektor

ligiert. Der Vektor wurde als pCC1-acrDPr-gfp bezeichnet und seine Größe beträgt 9.879 bp.

4.3.2.1.4 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des mdfA-Promotors

Das gfp-Gen unter der Kontrolle des mdfA-Promotors wurde zusammen mit dem

mdfA-Promotor per BglII-Verdau aus dem Vektor pUC-mdfAPr-gfp gewonnen. Das 1.738 bp

große Fragment wurde in den mit BamHI geschnittenen pCC1_dB kloniert. Dieses Plasmid

wurde als pCC1-mdfAPr-gfp bezeichnet und ist 9.865 bp groß.

4.3.2.1.5 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des marRA-Promotors

Um das gfp-Gen unter der Kontrolle des marRA-Promtors zusammen mit enhancer in den

pCC1_dB-Vektor zu bringen, wurde das Plasmid pCR4-marRAPr-Tgfp mit BglII verdaut und

das hieraus resultierende Fragment (994 bp) in den BamHI-geschnittenen pCC1_dB ligiert.

Der resultierende Vektor wurde als pCC1-marRAPr-Tgfp (9.121 bp) bezeichnet.

4.3.2.1.6 Das gfp-Gen unter der Kontrolle des rob-Promotors

Der rob-Promotor und das von einem enhancer verstärktem gfp-Gen wurden über einen

BglII-Verdau aus dem Vektor pCR4-robPr-Tgfp erhalten. Der Vektor pCC1_dB wurde mit

BamHI verdaut. Das BglII-verdaute Fragment robPr-Tgfp (994 bp) wurde dann in den

BamHI-geschnittenen pCC1_dB-Vektor ligiert. Der hier entstandene Vektor wurde als pCC1-

robPr-Tgfpa bezeichnet und seine Größe beträgt 9.121 bp.

4.3.2.2 Überprüfung der Arabinose-abhängigen Transkription von

pCC1_dB-Vektorgenen

Um die Arabinose-abhängige Replikation des pCC1_dB-Vektors zu überprüfen, wurde

mittels quantitativer Real Time RT-PCR die Transkription der Plasmidgene redF, repE und

parA (siehe Tab. 22) in Abhängigkeit von der Arabinosekonzentration untersucht. Als

chromosomales Kontrollgen wurde gapA verwendet. Der Stamm E. coli TM EPI300 mit dem

Ergebnisse 109

Vektor pCC1_dB wurde jeweils mit 0,001 %, 0,01 %, 0,1 % und 1 % Arabinose induziert.

Nach der RNA-Isolierung, einem DNaseI-Verdau und einer Kontroll-PCR mit den Primern

#776 und #777 wurde eine RT-PCR durchgeführt. Alle RT-Reaktionen waren aus derselben

DNaseI-verdauten RNA Präparation hergestellt worden.

Tab. 22: Template für die Reaktionen war je 1 µl cDNA Target Primer Länge (bp)

redF #1529/#1530 212

repE #1531/#1532 279

parA #1527/#1528 262

gapA #858/#859 591

Alle drei untersuchten Plasmidgene zeigten eine Steigerung der Transkription (siehe

Abb. 22). Bei gapA zeigte sich keine Veränderung der Expression durch eine Steigerung der

Arabinosekonzentration.

parA redF repE

R

0

1

2

3

4

5

6

0,001% Arabinose 0,01% Arabinose0,1% Arabinose

Abb. 22: Arabinose-abhängige Transkription der pCC1-Vektorgene parA, redF und repE; R steht für die relative Genexpression (ratio) 224

Ergebnisse 110

4.3.2.3 Screening von Pharmazeutika

Auf ihr Potential als Induktor von Efflux sollten folgende Substanzen untersucht werden:

• Paracetamol

• Azetylsalizylsäure

• Ibuprofen

• Ketoprofen

• Ethanol 100 %

• Ethanol 70 %

• Diclofenac

• Phenylbutazon

• Indomethacin

Außer Azetylsalizylsäure, die in 70 % Ethanol gelöst wurde, waren alle Substanzen in

100 %igem Ethanol gelöst, so dass eine Stocklösung mit einer Konzentration von 250 mM

entstand. Nach der Zugabe von gelöstem Phenylbutazon, Diclofenac oder Indomethacin zu

flüssigem LB-Medium prezipitierten die Substanzen aus. Aus diesem Grund wurden sie für

die Induktionsversuche nicht verwendet. Die restlichen Substanzen wurden mit einer

Konzentration von 5 mM in die Induktionsversuche eingesetzt.

Die untersuchten pCC1-Vektoren befanden sich alle in dem E. coli-Stamm TM EPI300. Zur

Isolierung von RNA wurde der Rneasy Mini Kit von QIAGEN verwendet.

Für die Herstellung der cDNA wurde spektrometrisch die Konzentration der Gesamt-RNA

vermessen. Diese Art der Konzentrationsbestimmung ist mit Fehlern behaftet, so dass nicht

exakt gleiche Mengen RNA in die Reverse Transkription eingesetzt werden konnten.

Zusätzlich entstehen bei der Reversen Transkription nicht zuverlässig gleiche Mengen an

cDNA in verschiedenen Ansätzen 32. Dieser Unterschied in der Konzentration der cDNA in

zwei Ansätzen lässt sich durch die parallele Bestimmung von housekeeping-Genen

normalisieren. Analog zu diesem Konzept wurde das Gen gapA, das für die

Glyerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase des Kohlenhydrat-Stoffwechsels kodiert. In den

vorliegenden Versuchen wurde als housekeeping-Gen das Plasmidgen redF verwendet, da

das zu untersuchende gfp-Gen ebenfalls auf diesem Plasmid liegt und nicht chromosomal

kodiert wird. Unter der Voraussetzung, dass die Menge an cDNA für diese Gene in allen

Ansätzen gleich ist, lassen sich mit dem Unterschied der Werte für die housekeeping-Gene

die Werte anderer Gene und zusätzlich die Kopienzahl des Plasmids normalisieren.

Bei jeder neuen cDNA-Präparation wurden die Werte für das housekeeping-Gen des

Plasmids, redF, neu bestimmt.

Ergebnisse 111

4.3.2.3.1 E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrABPr-gfp

4.3.2.3.1.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrABPr-gfp

Bei der Untersuchung des Wachstumsverhaltens zeigte sich, dass der Keim durch die

Zugabe von 5 mM Azetylsalizylsäure in seinem Wachstum stark gehemmt wird.

Durch die Zugabe von 70 %igem Ethanol, 100 %igem Ethanol und Paracetamol wurde das

Wachstum nur geringfügig beeinträchtigt. Stärkeren Einfluss auf das Wachstum hatten

Ketoprofen und Ibuprofen (siehe Abb. 23).

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12

OD

600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

nicht induziert100 % Ethanol70 % EthanolAzetylsalizylsäureParacetamolIbuprofenKetoprofen

Abb. 23: Wachstumskurve von E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrABPr-gfp in Abhängigkeit von der Pharmazeutikazugabe

Ergebnisse 112

4.3.2.3.1.2 Untersuchung der gfp-Expression von pCC1-acrABPr-gfp

Die gfp-Expression wurde durch Azetylsalizylsäure (ASS) um das 5-fache hochreguliert.

Paracetamol, das Lösungsmittel 70 %iger Ethanol und Ketoprofen bewirkten eine 2–2,5-

fache Hochregulation der gfp-Expression. Bei 100 %igem Ethanol zeigte sich keine Wirkung

(siehe Abb. 24). Bei Ibuprofen war es aus unbekannten Gründen zu Problemen bei der

RNA-Isolierung gekommen. Daher konnte das Induktionspotential von Ibuprofen nicht

überprüft werden.

Substanz [5mM]

ASS 70 % EtOH Paracetamol Ketoprofen 100 % EtOH

R

0

1

2

3

4

5

6

Abb. 24: Induktives Potential von Pharmazeutika auf die gfp-Expression bei pCC1-acrABPr-gfp in drei voneinander unabhängigen Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224.

4.3.2.3.2 E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrDPr-gfp

4.3.2.3.2.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrDPr-gfp

Die Untersuchung des Wachstumsverhaltens zeigte eindeutig, dass sich durch

Azetylsalizylsäure (ASS) das Wachstum verschlechtert. Zwischen der nicht induzierten

Probe, der Zugabe von 70 %igem Ethanol oder von 100 %igem und der Zugabe von

Paracetamol bestand ein geringer Unterschied im Wachstum. Ibuprofen verminderte das

Wachstum stärker als Ketoprofen (siehe Abb. 25).

Ergebnisse 113

Zeit [h]

0 2 4 6 8 10 12

OD

600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6


Abb. 25: Wachstumskurve von E. coli TM EPI300 mit pCC1-acrDPr-gfp in Abhängigkeit von der Pharmazeutikazugabe

4.3.2.3.2.2 Untersuchung der gfp-Expression von pCC1-acrDPr-gfp

Hier zeigte sich, dass Azetylsalizylsäure (ASS) 3,5-fach, Paracetamol 4,5-fach, Ibuprofen

4,5-fach, 70 %iger Ethanol 3-fach und 100 %iger Ethanol 3-fach die Transkription von gfp

hochregulieren (siehe Abb. 26).

Ergebnisse 114

Substanz [5mM]

ASS 70 % EtOH Paracetamol Ibuprofen 100 % EtOH

R

0

1

2

3

4

5

6

Abb. 26: Induktives Potential von Pharmazeutika auf die gfp-Expression bei pCC1-acrDPr-gfp in drei voneinander unabhängigen Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224.

4.3.2.3.3 E. coli TM EPI300 mit pCC1-marRAPr-Tgfp

4.3.2.3.3.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit pCC1-marRAPr-Tgfp

Wie bei den ersten beiden Konstrukten zeigte sich auch hier eindeutig, dass

Azetylsalizylsäure für ein langsameres Wachstum sorgt. Auch Ibuprofen und Ketoprofen

verringerten das Wachstum merklich. Bei der nicht induzierten Probe, der mit 70 %igem

Ethanol als Zusatz, der mit 100 %igem Ethanol als Zusatz und bei Paracetamol zeigten sich

nur geringfügige Unterschiede im Wachstumsverhalten (siehe Abb. 27).

Ergebnisse 115

Zeit [h]

0 2 4 6 8

OD

600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4


Abb. 27: Wachstumskurve von E. coli TM EPI300 mit pCC1-marRAPr-Tgfp in Abhängigkeit von der Pharmazeutikazugabe

4.3.2.3.3.2 Untersuchung der gfp-Expression von pCC1-marRAPr-Tgfp

Hier zeigte sich bei allen getesteten Substanzen eine eindeutige Induktion der

gfp-Expression. ASS reguliert die Expression von gfp 3-fach hoch. Bei Paracetamol zeigte

sich eine 3,5-fache Hochregulation. Bei Ketoprofen war eine 2-fache, bei Ibuprofen und

100 %igem Alkohol eine fast 7-fache Hochregulation der gfp-Expression zu beobachten

(siehe Abb. 28).

Ergebnisse 116

Substanz [5mM]

ASS Paracetamol Ketoprofen Ibuprofen 100 % EtOH

R

0

1

2

3

4

5

6

7

Abb. 28: Induktives Potential von Pharmazeutika auf die gfp-Expression bei pCC1-marRAPr-Tgfp in drei voneinander unabhängigen Versuchen. R ist die relative Genexpression (ratio) 224.

4.3.2.3.4 E. coli TM EPI300 mit pCC1-robPr-Tgfp

4.3.2.3.4.1 Wachstumsverhalten von E. coli TM EPI300 mit pCC1-robPr-gfp

Auch hier konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Zugabe von Azetylsalizylsäure das

Wachstum hemmt. Neben Ketoprofen sorgte auch Ibuprofen für eine Verringerung der

Wachstumsgeschwindigkeit. Die restlichen Proben (100 %iger Ethanol, 70 %iger Ethanol,

Paracetamol) zeigten nur einen kleinen Unterschied im Wachstumsverhalten (siehe Abb.

29).

Ergebnisse 117

Zeit [h]

0 2 4 6 8

OD

600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2


Abb. 29: Wachstumskurve von E. coli TM EPI300 mit pCC1-robPr-Tgfp in Abhängigkeit von der Pharmazeutikazugabe

4.3.2.3.4.2 Auswirkungen auf die gfp-Expression von pCC1-robPr-Tgfp

Bei diesem Experiment gab es Probleme bei der Effizienzbestimmung für das Primerpaar

#801 und #802. Aus unbekannten Gründen schwankte die Effizienz zwischen 1,85 und

82,67. Dieses Problem konnte nicht durch eine Veränderung der

Magnesiumchloridkonzentration behoben werden. Da es allerdings laut der Firma Roche

(Technischer Support) nicht notwendig ist, für alle Proben die Effizienz der Primer #801 und

#802 zu bestimmen, deren RNA-Isolierung und RT-PCR in einem Experiment gemacht

wurde, wurde als Effizienz 1,85 verwendet. Es zeigte sich, dass es sowohl bei Zugabe von

Azetylsalizylsäure (ASS) als auch bei der Zugabe von 70 %igem Ethanol oder von

Ketoprofen zu einer einfachen Abnahme der Genexpression kommt. Bei Paracetamol,

Ibuprofen und 100 %igem Ethanol kam es zu einer 1–2,5-fachen Zunahme der

gfp-Transkription (siehe Abb. 30).

Ergebnisse 118

Substanz [5mM]

ASS

70 % EtOH

Paracetamol

KetoprofenIbuprofen

100 % EtOH

R

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Abb. 30: Induktives Potential von Pharmazeutika auf die gfp-Expression bei pCC1-robPr-Tgfp in drei voneinander unabhängigen Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224.

4.3.2.4 Überprüfung auf Veränderung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK) bei

Substanzzusatz

Bei diesem Versuch wurden LB-Platten die jeweilige Substanz in einer Konzentration von

5 mM zugesetzt und ein Etest® durchgeführt. Hier kam es zu folgenden Ergebnissen:

Es wurden die Reportergen-Stämme E. coli DH10B mit pUC-acrDPr-gfp und E. coli TOP 10

mit pUC-acrABPr-gfp willkürlich ausgewählt. Alle Werte wurden doppelt bestimmt. Zur

Austestung der Substanzwirkung auf die Ampicillin-Resistenz wurde das Wildtyp-Isolat aus

der Ratte E. coli-4 verwendet. Bei Zugabe von Azetylsalizylsäure gab es bei den

E. coli-Stämmen DH10B und TOP10 kein Wachstum auf der Platte. Daher konnte auch

keine MHK-Bestimmung durchgeführt werden. Bei dem Wildtyp-Isolat E. coli-4 zeigte sich

Wachstum auf der Azetylsalizylsäure-haltigen Agarplatte.

Ergebnisse 119

Tab. 23: MHK-Werte (mg/l) für Gentamicin und Norfloxacin des Stammes E. coli DH10B mit pUC-acrDPr-gfp. Beide Werte der MHK-Bestimmung sind angegeben. „n.i.“ bedeutet nicht induziert.

MHK (mg/l)

Antibiotikum n.i. Paracetamol Ibuprofen 100 % Ethanol 70 % Ethanol

Gentamicin 0,38 0,75 1,5 0,75 0,75

Gentamicin 0,38 0,75 1,5 0,75 0,75

Norfloxacin 0,023 0,064 0,094 0,023 0,023

Norfloxacin 0,023 0,064 0,094 0,023 0,023

Diese Werte zeigten, dass es bei der Zugabe von Ibuprofen zu einer MHK-Steigerung

gegenüber Gentamicin und Norfloxacin von vier bis fünf Titerstufen kam. Bei Paracetamol

und Ethanol wurde gegenüber Gentamicin eine Steigerung von bis zu zwei Titerstufen

gezeigt. Die Zugabe von 100%igem oder 70%igem Ethanol führte zu keiner Veränderung der

MHK gegenüber der nicht-induzierten Probe.

Tab. 24: MHK-Werte (mg/l) für Gentamicin und Norfloxacin des Stammes E. coli TOP10 mit pUC-acrABPr-gfp. Beide Werte der MHK-Bestimmung sind angegeben. „n.i.“ bedeutet nicht induziert.

MHK (mg/l)


Gentamicin 0,5 0,75 1,5 0,75 0,75

Gentamicin 0,5 0,75 1,5 0,75 0,75

Norfloxacin 0,023 0,064 0,094 0,032 0,032

Norfloxacin 0,023 0,064 0,094 0,032 0,032

Auch hier konnte gezeigt werden, dass die MHK bei der Zugabe von Ibuprofen gegenüber

Gentamicin um drei Titerstufen ansteigt. Gegenüber Norfloxacin verursachte die Zugabe von

Ibuprofen einen Anstieg der MHK um ein vierfaches. Bei Paracetamol, 100%igem und

70%igem Ethanol kam es zu einer Steigerung der MHK um 1–2 Titerstufe.

Tab. 25: MHK-Werte (mg/l) für Ampicillin des Stammes E. coli-4. Beide Werte der MHK-Bestimmung sind angegeben. „n.i.“ bedeutet nicht induziert.

MHK (mg/l)


Ampicillin 4 4 6 4 6

Ampicillin 4 4 6 4 6

Ergebnisse 120

Auf die Ampicillin-MHK hatten Azetylsalizylsäure und Ibuprofen keine Wirkung. Bei

Paracetamol, 100 % EtOH und 70 % EtOH kam es zu einer Steigerung der MHK um eine

Titerstufe.

Ergebnisse 121

4.4 Untersuchung der Auswirkung von Salizylat auf Virulenz/Adhärenz der uropathogenen E. coli-Stämme 1173 und 1267

Die E. coli-Stämme 1173 und 1267 sind E. coli-Isolate aus dem Urin einer Patientin, die

zusätzlich zur Chemotherapie zweimal täglich 750 mg Ciprofloxacin erhalten hatte um eine

Darmdekontaminierung durchzuführen. Der Stamm 1173 wurde zuerst isoliert.

4.4.1 Phänotypische Charakterisierung der E. coli-Isolate 1173 und 1267

4.4.1.1 Resistenzbestimmung mittels Etest®

Gegenüber allen getesteten Fluorchinolonen zeigte der Stamm 1267 im Vergleich zum

Kontrollstamm E. coli ATCC 25922 eine starke Erhöhung der MHK. Auch gegenüber dem

Isolat 1173 war sie um ein vielfaches höher (siehe Tab. 26).

Tab. 26: MHK-Bestimmung der E. coli-Stämme 1173 und 1267 im Vergleich mit dem Kontrollstamm E. coli ATCC 25922

Minimale Hemmkonzentration MHK (mg/l) Antibiotikum

ATCC 25922 1173 1267

Nalidixinsäure 2 >256 >256

Chloramphenicol 2 2 16

Doxycyclin 2 6 32

Rifampicin 4 4 8

Imipenem 0,125 0,125 0,125

Ciprofloxacin 0,012 3 >32

Norfloxacin 0,047 8 >256

Ofloxacin 0,064 8 >32

Moxifloxacin 0,032 6 >32

Gatifloxacin 0,012 2 >32

Levofloxacin 0,064 4 >32

Clinafloxacin 0,008 1 4

4.4.1.2 OST

OST ist bei E. coli meist vermittelt durch Überexpression des Effluxsystemes AcrAB-TolC.

Auch das System AcrEF-TolC kann an der Ausbildung der organic solvent tolerance beteiligt

sein 11.

In Gegenwart von Cyclohexan zeigte der Stamm 1267 vergleichsweise stärkeres Wachstum.

Unter diesen Bedingungen zeigte der Stamm 1173 sehr langsames Wachstum. Der

Ergebnisse 122

Durchmesser der entstandenen Kolonien bei Stamm 1267 war dreimal größer als der

Durchmesser der Kolonien von Stamm 1173. Der Referenzstamm E. coli ATCC 25922 zeigte

kein Wachstum unter diesen Bedingungen.

Tab. 27: Wachstum der klinischen Isolate E. coli 1173 und 1267 und des Referenzstammes E. coli ATCC 25922 in Gegenwart von Lösungsmitteln. „+“ entspricht gutem Wachstum, „+/—“ schlechtem Wachstum und „—“ keinem Wachstum

4.4.2 Genotypische Charakterisierung der E. coli-Isolate 1173 und 1267

Im Bandenmuster der PFGE nach XbaI-Verdau zeigte sich kein Unterschied zwischen den

beiden Stämmen. Bei der vergleichenden Analyse der Sequenzen der Gene gyrA/B und

parC/E der Isolate zu der E. coli K12-Sequenz (Gene Bank #U00096) zeigten sowohl der

Stamm 1173 als auch 1267 identische Aminosäureaustausche in GyrA (S83L und D87Y)

und in ParC (S80I). In den Sequenzen von acrRAB von beiden klinischen Isolaten befanden

sich keine genomischen Veränderungen wie Insertion, Deletion oder Kettenabbruch durch

Mutation eines Sinncodons in ein Stopcodon. Auf der ganzen Länge von ca. 5 kb für acrRAB

befanden sich 4 Basenaustausche im Stamm 1173 gegenüber der Sequenz von E. coli K12

(#U00096), dagegen 49 Mutationen im Stamm 1267. Die 4 Basensubstitutionen des Stamms

1173 befinden sich nicht an den gleichen Positionen wie die Mutationen des Stamms 1267.

Die Mehrzahl der Basenaustausche innerhalb der Gene führen lediglich zu konservativen

Aminosäure-Austauschen. Des Weiteren wurde eine Deletion von 18 AS im C-terminalen

Bereich von MarR im Stamm 1267 mittels Sequenzierung nachgewiesen.

In acrF zeigten beide Stämme identische Basenaustausche im Vergleich zu E. coli K12

(#U00096). Beide Stämme unterschieden sich voneinander nur in einer einzigen

Substitution, die der Stamm 1267 gegenüber der E. coli K12-Sequenz (#U00096) besitzt.

Anstelle eines Cytosins an Position 3.046 im Gen acrF der Stämme 1173 und K12 besitzt

der Stamm 1267 ein Thymin.

Im Gen acrS besaßen die beiden Stämme 3 identische Mutationen gegenüber der Sequenz

von E. coli K12 (#U00096), im Gen acrE 11. Keine dieser in beiden Stämmen identischen

Mutationen führte zu einem Aminosäureaustausch im Protein. Im putativen Promotorbereich

Wachstum

Lösungsmittel ATCC 25922 1173 1267

n-Dekan + + +

n-Nonan + + +

n-Oktan + + +

Hexan + + +

Cyclohexan — +/— +

Ergebnisse 123

zwischen acrEF und acrS (398 bp) befanden sich mit 14 (Stamm 1173) bzw. 23 (Stamm

1267) Basensubstitutionen gegenüber der Sequenz von E. coli-K12 (U#00096; von

3.411.488 bp bis 3.411.885 bp) viele Mutationen. In diesem Bereich stimmten die beiden

klinischen Isolate in vier identischen Mutationen überein 284.

4.4.2.1 Gentranskription bei E. coli 1173 und E. coli 1267 im Vergleich

4.4.2.1.1 Untersuchung von Effluxgenen und deren Regulatoren

Mittels gezielter Quantifizierung der Transkription in einer LightCycler®-RT-PCR wurde eine

Gruppe von Genen untersucht, die für Effluxpumpen kodieren. Neben den Strukturgenen

acrAB, acrE, acrF, acrD, mdfA, norE, mdtC, mdtH, mdtM und emrB wurden auch die

Regulatorgene acrR, acrS, sdiA, baeR, evgA, rob und soxS untersucht. In diese

Untersuchung wurden auch die Poringene ompF und tolC mit einbezogen, da AcrAB und

AcrEF zusammen mit TolC ein funktionelles Effluxsystem bilden und eine Reduktion von

OmpF zum Resistenzphänotyp beitragen kann 17,85. Die Ergebnisse der

LightCycler®-RT-PCR zeigten, dass die beiden Gene acrF und marA signifikant häufiger in

Stamm 1267 transkribiert werden als im Stamm 1173. Die Erhöhung von MarA in der Zelle

reprimiert die Transkription von ompF um den Faktor 65 im Stamm 1267 in Vergleich zu

Stamm 1173 17,88. Außer bei ompF ließ sich keine signifikante Erniedrigung der Transkription

eines der getesteten Gene feststellen. Bei den Genen acrR, mdtC, soxS und tolC liegt die

Transkriptionsänderung im Bereich der Auflösungsgrenze des LightCycler®.

Hinweise auf eine erhöhte Transkription von acrAB im Stamm 1267 lieferte ein Northern

Blot 166. Im Gegensatz zu den Daten des Northern Blots 166 war keine Erhöhung der

Transkription von acrAB zu beobachten. Eine leichte Erhöhung der Transkription ergibt sich

auch für die Regulatoren acrS und sdiA. Der vom Gen sdiA kodierte Regulator aktiviert

sowohl acrEF als auch acrAB 284,302.

4.4.2.1.2 Microarray

Bei der anschließenden Untersuchung des Transkriptoms per Microarray stimmten die

Ergebnisse der Gene acrD, acrR, marA, ompD und soxS mit den LightCycler®-Ergebnissen

überein. Bei den Genen acrS, emrB, evgA, rob und tolC, deren gesteigerte bzw. verringerte

Transkription nahe an der Auflösungsgrenze des LightCycler® liegen, ergaben sich

Widersprüche zu den Ergebnissen des Microarray. Der Microarray ergab eine verringerte

Expression von rob und evgA, die in der Größenordnung des Wertes von ompF liegt.

Dagegen ist für ompF laut LightCycler® die Verringerung der Transkription mit dem Faktor

65 ein Vielfaches stärker ausgeprägt als für die Regulatoren acrR, acrS, sdiA, baeR, evgA,

Ergebnisse 124

rob und soxS. Bei acrA und acrB zeigte sich im Microarray eine gesteigerte Expression um

den Faktor 3,7 bzw. 2,5.

Der Microarray ergab keinen Hinweis auf eine Beteiligung anderer Faktoren und Gene an

der Ausbildung des Resistenzphänotyps. Alle weiteren Gene und ORF, für die der

Microarray Änderungen der Transkription von I > 3 bzw. D < -3 ergeben hatte (s. Anhang),

stehen vermutlich nicht in unmittelbarem Zusammenhang mit der Ausbildung von

Antibiotikaresistenz (außer emrAB, mdaA, ybjC und nfnB). Abgesehen von mdaA, ybjC und

nfnB sind diese Gene bislang nicht als Mitglieder der Regulons von MarA oder SdiA

identifiziert worden 17,302.

Bei den Genen fliA und motA zeigte sich eine verringerte Expression in E. coli 1267. Keine

Änderung der Transkription war bei sfa, hlyE und flhDC zu beobachten 284.

4.4.2.1.3 Untersuchung der Expression von Genen in Abhängigkeit von der

Salizylatkonzentration

Von dem Stamm 1173 wurden Gene ausgewählt, deren Expression sich eventuell in

Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration verändert 47,129,148,149,231. Hierfür wurde der

E. coli-Stamm 1173 mit 5 mM, 10 mM und 20 mM induziert. Nach der RNA-Isolierung und

der Umschreibung in cDNA wurde die Expression per LightCycler®RT-PCR überprüft.

Als Referenzgen wurde hier bei allen Teilversuchen das housekeeping-Gen gapA

verwendet, welches für die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) kodiert.

Mit den Primern #858 und #859 wurde innerhalb des gapA-Gens ein Fragment mit der

Größe von 591 bp amplifiziert. Bei den unterschiedlichen Teilversuchen entstanden folgende

Effizienzen:

Tab. 28: Effizienzen der RT-PCR-Reaktionen von gapA aus drei unabhängigen Versuchen Probe Effizienz 1 Effizienz 2 Effizienz 3

1173 nicht induziert 1,99 1,87 2,00

1173 5 mM Salizylat 1,92 2,02 2,00

1173 10 mM Salizylat 2,14 2,09 1,93

1173 20 mM Salizylat 1,87 1,90 1,93

Diese Effizienzen wurden jeweils in die Formel zur Berechnung der ratio 224 von acrB, hlyE,

sfaD/E und motB (siehe Materialien und Methoden 3.2.1.2.5.4) eingesetzt.

4.4.2.1.3.1 Untersuchung der acrB-Expression

Der Komplex aus AcrAB-TolC bildet bei E. coli die wichtigste Effluxpumpe zum Export von

Fluorchinolonen. In der Literatur ist bereits beschrieben, dass die Genexpression von acrAB

durch die Zugabe von Salizylat hochreguliert wird 47,177. Im E. coli-K12-Genom (#U00096)

Ergebnisse 125

befindet sich das Gen acrB im Bereich von 480.478 bp bis 483.627 bp. Aus diesem Bereich

wurde in der RT-PCR ein 429 bp großes Fragment mit den Primern #226 und #861

amplifiziert. Bei der Effizienzbestimmung zeigten sich folgende Werte:

Tab. 29: Effizienzen der RT-PCR von acrB aus drei unabhängigen Versuchen Probe Effizienz 1 Effizienz 2 Effizienz 3


1173 5 mM Salizylat 2,1 2,11 2,21

1173 10 mM Salizylat 2,09 1,95 2,25

1173 20 mM Salizylat 2,19 2,13 2,12

Bei der Berechnung des Expressionsunterschiedes von acrB zeigte sich ein bis zu 5-facher

Anstieg der Expression (siehe Abb. 31).

acrB-1 acrB-2 acrB-3

R

0

1

2

3

4

5

6

5 mM Salizylat10 mM Salizylat20 mM Salizylat

Abb. 31: Expressionsanstieg von acrB in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration bei drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224. „acrB-1“ bedeutet erster Versuch, „acrB-2“ bedeutet zweiter Versuch und „acrB-3“ bedeutet dritter Versuch.

4.4.2.1.3.2 Untersuchung der motB-Expression

MotB bildet zusammen mit MotA den so genannten Ständer des Flagellenmotors. Dieser

Komplex aus MotAMotB koppelt den Protonenfluss durch die Membran an die

Rotorbewegung. Das Gen motB entspricht im E. coli K12-Genom (#U00096) dem Bereich

Ergebnisse 126

1.973.353 bp bis 1.974.279 bp. In der RT-PCR wurde ein 362 bp großes Fragment innerhalb

des motB-Gens mit den Primern #1560 und #1561 amplifiziert. Es wurden folgende

Effizienzen bestimmt:

Tab. 30: Effizienzen der RT-PCR von motB aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen Probe Effizienz 1 Effizienz 2 Effizienz 3


1173 5 mM Salizylat 3,08 2,33 2,61

1173 10 mM Salizylat 2,11 2,43 3,03

1173 20 mM Salizylat 2,29 2,37 2,18

Bei der Berechnung der Ratio (Expressionsunterschied) ergab sich kein Zusammenhang

zwischen der Expression von MotB und der Salizylatkonzentration (siehe Abb. 32).

motB-1 motB-2 motB-3

R

0

1

2

3

4

5

6

7


Abb. 32: graphische Darstellung des Expressionsanstiegs von motB in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration bei drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224. „motB-1“ bedeutet erster Versuch, „motB-2“ bedeutet zweiter Versuch und „motB-3“ bedeutet dritter Versuch.

4.4.2.1.3.3 Untersuchung der hlyE-Expression

Das hlyE-Gen kodiert für ein latentes Hämolysin. Im E. coli K12-Genom (#U00096) befindet

es sich im Bereich 1.228.706 bp bis 1.229.617 bp. In der Real-Time-PCR wurde ein 209 bp

Ergebnisse 127

großes Fragment innerhalb des hlyE-Gens mit den Primern #1558 und #1559 amplifiziert.

Bei der Effizienzbestimmung ergaben sich folgende Werte:

Tab. 31: Effizienzen der RT-PCR von hlyE aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen Probe Effizienz 1 Effizienz 2 Effizienz 3


1173 5mM Salizylat 2,02 1,91 2,09

1173 10mM Salizylat 1,70 1,89 1,96

1173 20mM Salizylat 1,91 1,85 1,95

Die Zugabe von Salizylat verursachte eine bis zu 3-fache Zunahme der Expression von hlyE.

Durch Zugabe von unterschiedlichen Salizylatkonzentrationen zeigte sich hier weder eine

Zu- noch eine Abnahme der Expression in Abhängigkeit von steigender

Salizylatkonzentration (siehe Abb. 33).

hlyE-1 hlyE-2 hlyE-3

R

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5


Abb. 33: Expressionsanstiegs von hlyE in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration bei drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224. „hlyE-1“ bedeutet erster Versuch, „hlyE-2“ bedeutet zweiter Versuch und „hlyE-3“ bedeutet dritter Versuch

Ergebnisse 128

4.4.2.1.3.4 Untersuchung der sfaD/E-Expression

Die Gene sfaD und sfaE gehören zu dem so genannten S-Fimbriengencluster, das sich im

E. coli UTI89-Genom (#CP000243) im Bereich von 1.099.958 bp bis 1.101.242 bp befindet.

In der Real-Time-PCR wurde ein 332 bp großes Fragment innerhalb der beiden Gene mit

den Primern #1556 und #1557 amplifiziert. Bei der Effizienzbestimmung ergaben sich

folgende Werte:

Tab. 32: Effizienzen der RT-PCR von sfaD/E aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen Probe Effizienz 1 Effizienz 2 Effizienz 3


1173 5 mM Salizylat 2,4 2,09 2,08

1173 10 mM Salizylat 1,85 1,99 1,90

1173 20 mM Salizylat 2,14 2,34 1,95

Es zeigte sich ein Anstieg der Expression bei Salizylatzugabe. Es war aber kein

Gen-Dosis-Effekt zu erkennen, d.h. es zeigte sich kein Anstieg oder Abfall in Abhängigkeit

von steigender Salizylatkonzentration (siehe Abb. 34).

sfaD/E-1 sfaD/e-3 sfaD/E-3

R

0

1

2

3

4

5

6


Abb. 34: graphische Darstellung des Expressionsanstiegs von sfaD/E in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration bei drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224. „sfaD/E-1“ bedeutet erster Versuch, „sfaD/E-2“ bedeutet zweiter Versuch und „sfaD/E-3“ bedeutet dritter Versuch.

Ergebnisse 129

4.4.2.1.3.5 Untersuchung der marA-Expression

MarA erscheint in der Regulation von acrRAB als bedeutendster Induktor für das

acrRAB-Operon. In Wildtyp-Zellen wird MarA konstitutiv auf geringem Niveau exprimiert 208.

Bei Erhöhung des MarA-Spiegels in der Zelle z. B. aufgrund von Induktion durch Salizylat

(Bindung an MarR führt zu einer Konformationsänderung des Repressors), wird die

Transkription von acrAB und gleichzeitig seines Repressors acrR verstärkt 184. Bei E. coli

K12 (#U00096) befindet sich das Gen marA im Bereich von 1.617.598 bp bis 1.617.981 bp.

Innerhalb dieses Bereiches wurde ein 359 bp großes Genfragment mit den Primern #862

und # 863 amplifiziert. Hierfür wurde erneut RNA in cDNA umgeschrieben. Daher mussten

nicht nur die Effizienzen für marA bestimmt werden, sondern auch für das

housekeeping-Gen gapA. Bei der Effizienzbestimmung zeigten sich folgende Werte für

gapA.

Tab. 33: Effizienzen der RT-PCR von gapA aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen Probe Effizienz 1 Effizienz 2 Effizienz 3


1173 5 mM Salizylat 2,14 2,09 1,93

1173 10 mM Salizylat 2,18 1,91 1,94

1173 20 mM Salizylat 2,02 1,83 2,20

Für marA ergaben sich folgende Werte für die Effizienzen

Tab. 34: Effizienzen der RT-PCR von marA aus drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen Probe Effizienz 1 Effizienz 2 Effizienz 3


1173 5mM Salizylat 2,17 2,08 2,21

1173 10mM Salizylat 1,97 1,94 1,80

1173 20mM Salizylat 1,90 1,97 2,06

Die Berechnung der relativen Genexpression ergab einen eindeutigen,

konzentrationsabhängigen Anstieg der marA-Expression. Bei einer Salizylatkonzentration

von 20 mM wurde die Expression auf das 200-fache hochreguliert (siehe Abb. 35).

Ergebnisse 130

marA-1 marA-2 marA-3

R

0

50

100

150

200

250


Abb. 35: graphische Darstellung des Expressionsanstiegs von marA in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration bei drei unabhängig voneinander durchgeführten Versuchen. Bei R (ratio) handelt es sich um die relative Genexpression 224. „marA-1“ bedeutet erster Versuch, „marA-2“ bedeutet zweiter Versuch und „marA-3“ bedeutet dritter Versuch.

4.4.2.2 Adhärenzunterschiede der Isolate 1173 und 1267 in der Abhängigkeit von der

Salizylatkonzentration

Die E. coli-Isolate 1173 und 1267 wurden über Nacht bei Konzentration von 0 mM bis 20 mM

Salizylat in LB-Medium hochgezogen. Diese Flüssigkulturen wurden dann unter der Zugabe

von der jeweiligen Salizylatkonzentration für den Zelladhäsionsassay vorbereitet. Bei der

Auswertung der Ergebnisse zeigte sich bei dem Stamm 1173 eine der Adhäsion an

HT-29-Zellen (siehe Abb. 36). Die Adhärenz des Vergleichstammes 1267 blieb unverändert

(siehe Abb. 37).

Ergebnisse 131

CitrobacterE.coli HB101.1

1173 n.i.1173 5 mM Sal

1173 10 mM

1173

0

50

100

200

400

600

800

Citrobacter

E.coli HB101 1173 n.i.

1173 5 mM Sal.

1173 10 mM Sal1173 20 mM Sal

Kol

onie

anz

ahl /

Wel

l / 2

x 1

06 HT-

29-Z

elle

n

Abb. 36: Adhäsion von E. coli 1173 an HT-29-Zellen in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration. Citrobacter wurde als Positiv-Kontrolle verwendet (zeigt sehr gute Adhärenz), E. coli HB101 wurde als Negativ-Kontrolle verwendet (schlecht adhärierender Keim).

Ergebnisse 132

CitrobacterE.coli HB101.1

1267 n.i.1267 5 mM Sal

1267 10 mM Sal

1267 20 mM Sal

0

50

100

200

400

600

800

Citrobacter

E.coli HB101 1267 n.i.

1267 5 mM Sal.

1267 10 mM Sal1267 20 mM Sal

Kol

onie

anz

ahl /

Wel

l / 2

x

HT-

29-Z

elle

n 10

6

Abb. 37: Adhäsion von E. coli 1267 an HT-29-Zellen in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration. Citrobacter wurde als Positiv-Kontrolle verwendet (zeigt sehr gute Adhärenz), E. coli HB101 wurde als Negativ-Kontrolle verwendet (schlecht adhärierender Keim).

Diskussion 133

5 Diskussion

5.1 GFP als Fluoreszenzmarker

In dieser Arbeit wurde das gfp-Gen als chromosomale Markierung eines E. coli-Isolates aus

der Ratte verwendet. Für die Wahl von Gfp als Reporter war ausschlaggebend, dass es

außer Sauerstoff und UV-Licht zur Fluoreszenz keine weiteren exogenen Faktoren

benötigt 35. Dadurch ermöglicht Gfp eine direkte Erkennung des markierten E. coli in

Mischkulturen, die nach Passage des Rattendarms im Kot zu finden sind.

Im Gegensatz zu enzymatischen Reportern (wie z. B. Chloramphenicolacetyl-transferase 90,

Nuclease 54, β-Glucuronidase 123, β-Galactosidase 119 und Luciferase 50) benötigt GFP für die

Fluoreszenz außer Sauerstoff und UV-Licht keine anderen exogenen Substrate, Enzyme,

Kofaktoren oder andere Energiequellen 35. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Fluoreszenz des

Gfp tolerant gegenüber Hitze (bis 65 °C), alkalischem Milieu (pH 11), Detergentien (1 %

SDS), Guanidiniumchlorid (6 M), Fixierung mit Formaldehyd sowie vielen Proteasen ist. Gfp

zeigt auch im Fluoreszenzmikroskop praktisch keinen Photobleicheffekt 35,64. Aufgrund dieser

Eigenschaften bietet das Gfp-System neben anderen Anwendungsgebieten die Möglichkeit,

in vivo Untersuchungen an Zellen und Organismen durchzuführen.

Tab. 35: Übersicht zu den unterschiedlichen Einsatzgebieten von GFP als Reporter Untersuchung der Genexpression 35,226,291

Untersuchung der Proteinlokalisierung 291

Beobachtung der Motilität von Proteinen 291

Kontrolle des therapeutischen Gentransfers 152

Kontrolle von Transfektionen 28,291

in situ Beobachtung von Zellwachstum und Zellbewegung 5,291

Markierung von Organellen und Kompartimenten 59

Untersuchung der Interaktionen von Mikroorganismen mit spezifischen

Immunzellen 64,90

Untersuchung der Gründung und Entwicklung von gemischten Bakterien-Populationen

wie z. B. in Biofilmen und auf Pflanzenwurzeln 24

Da durch die Kopplung von gfp an multiple bakterielle Promotoren die Genexpression

untersucht werden kann, wurde es als Reporter für das in dieser Arbeit etablierte

Screening-System von Pharmazeutika ausgewählt. Andere ausgetestete Substanzen zeigten

unter UV-Licht Eigenfluoreszenz, die nicht von der Gfp-Fluoreszenz zu unterschieden war.

Diskussion 134

Daher konnten diese Pharmazeutika im Hinblick auf einen induktiven Effekt unter

Verwendung des Gfp als Reporter nicht weiter untersucht werden.

Die untersuchten markierten und entsprechend dem Promotor induzierten E. coli zeigten

sowohl als Kolonie auf der Agarplatte als auch im Flüssigmedium unter der UV-Lampe eine

grüne Fluoreszenz.

5.2 Verwendung des araB-Promotors zur Steuerung der Gfp-Produktion

Das bei plasmidmarkierten Keimen beobachtete schlechtere Wachstum von mit Gfp

markierten Stämmen hängt mit dem aus dem Wildtyp stammenden gfp-Gen und der

Expression von Gfp zusammen 53.

Konstitutiv transkribiertes gfp kann toxische Effekte und somit eine Veränderung der Fitness

des Bakteriums verursachen. Diesem Fitnessverlust liegt der Abzug an Aminosäuren und

Energie zu Grunde, die für die Expression von Gfp verwendet werden. Als Folge entsteht

eine verminderte Konkurrenzfähigkeit, wodurch der markierte E. coli von der ihn

umgebenden Normalflora im späteren Modell verdrängt werden könnte 105. Um diese

Nebenwirkungen der Expression des Reporterproteins Gfp in vivo möglichst zu vermeiden,

wurde das gfp-Gen unter die Kontrolle des induzierbaren araB-Promotors gebracht.

Aufgrund seiner Alles-oder-nichts-Genexpression und seiner „Dichtigkeit“ – d. h. im nicht-

indzuierten Zustand erfolgt keine Gfp-Expression – ist der araB-Promotor für die Kontrolle

des Reportergens geeignet. Alles-oder-nichts-Genexpression bedeutet, dass die Zellen

entweder maximal oder gar nicht induziert sind. Die induzierte Zellfraktion ändert sich, sobald

die Menge an Induktionsmittel im Wachstumsmedium verändert wird 137.

Bei den markierten Stämmen E. coli-57 und E. coli-32 war ohne den Induktor L-Arabinose

keine Fluoreszenz unter UV-Licht zu erkennen. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass der

araB-Promotor intakt ist.

Um sicher zu gehen, dass der markierte E. coli-57 während der Passage des Rattendarms

keinen Kontakt zu L-Arabinose hat und kein Gfp exprimiert wird, wurde das Rattenfutter im

Hinblick auf eine mögliche Induktion des araB-Promotors hin untersucht. Nach Inkubation

von E. coli-57 mit Rattenfutter zeigte sich keine Fluoreszenz. Dieses Ergebnis legt nahe,

dass im Rattenfutter keine L-Arabinose vorhanden ist. Somit kann es zu keiner Induktion der

Gfp-Expression während der Darmpassage kommen.

5.3 Chromosomale Markierung von E. coli mit gfp

Da der Reporterstamm über einen längeren Zeitraum innerhalb der Darmflora nachweisbar

sein sollte, war eine dauerhaft stabile Integration Voraussetzung für diese Arbeit. Gegenüber

den Markierungen durch eingebrachte Plasmide hat die chromosomale Markierung mehrere

Diskussion 135

Vorteile. Die Wahrscheinlichkeit eines Verlusts des Reportergens oder eine unerwünschte

Übertragung des Reportergens ist bei einer chromosomalen Markierung wesentlich geringer

als bei der plasmidischen Markierung 255,256. Ein weiterer Vorteil der chromosomalen

Markierung mit gfp zusammen mit einer Resistenzkassette besteht in der Stabilität. Auch in

der Abwesenheit von Antibiotikum als zusätzlichem Selektionsdruck ist diese Markierung

relativ stabil, was bei einer Plasmidmarkierung nicht der Fall ist 257. Diese Stabilität ist

wichtig, da der Reporterstamm über einen längeren Zeitraum in einer Mischflora

nachweisbar sein sollte. Diese dauerhafte stabile Integration war ausschlaggebend für die

Wahl der Markierung. Um die Kolonisation des Rattendarms zu erleichtern und die Detektion

des mit gfp markierten E. coli zu erleichtern, wurde zusätzlich eine Kanamycin-

Resistenzkassette zusammen mit dem gfp in das Chromosom des E. coli eingebracht.

Im Rahmen der Versuche konnte gezeigt werden, dass die chromosomale Markierung des

E. coli-57 unter normalen und nicht-selektiven Bedingungen über einen Zeitraum von sechs

Monaten im Darm stabil war.

5.3.1 Unterschiedliche Methoden zur chromosomalen Markierung durch homologe

Rekombination

5.3.1.1 Suicide-Vektor-System

In dieser Arbeit wurde das suicide-Vektor-System pIVET8 von Mahan et al. in modifizierter

Form verwendet 182. Die Replikation von pIVET8 ist am Startpunkt (origin) des Plasmids R6K

vom Transkriptionsfaktor Pir (pir-Genprodukt) abhängig 142. Das pir-Gen befindet sich nicht

auf dem Plasmid pIVET8. Daher kommt es in pir-exprimierenden Stämmen zu einer

Ausbildung der plasmidkodierten Gene wie z. B. der Ampicillinresistenz. Die Integration der

plasmidkodierten Gene über homologe Rekombination in das Wirtsgenom führt ebenfalls zu

deren Expression.

Ein Zielgen – in dieser Arbeit die homologen Bereiche des Zielgens, das unter der Kontrolle

eines induzierbaren oder konstitutiv exprimierenden Promotors stehende gfp-Gen und die

Kanamycin-Resistenzkassette – kann in dieses Plasmid eingebracht werden. Über die

Kanamycin-Resistenz konnten Stämme, in denen sich das gesamte Plasmid über homologe

Rekombination in das Zielgen integriert hat, isoliert werden. Da es für das in dieser Arbeit zu

etablierende in vivo-Modell von großer Bedeutung war, dass der markierte Keim wenig

Resistenzen mitbringt, wurde in den suicide-Vektor pIVET8 das Gen sacB außerhalb der

homologen Bereiche eingebracht, um nach der homologen Rekombination die

Vektorsequenz, die für eine Ampicillinresistenz kodiert, zu entfernen. Das Gen sacB stammt

aus Bacillus subtilis und kodiert für das Enzym Levansucrase, die aus Saccharose im

Medium für Gram-negative Organismen toxische Levane aufbaut 236,239,273.

Diskussion 136

Mit dem suicide-Marker sacB lassen sich Single-Rekombinanten, die den gesamten Vektor

integriert haben, von Doppel-Rekombinanten durch Wachstum auf Agarplatten mit 10 %

Saccharose und 50 µg/ml Kanamycin unterscheiden. Bei der Selektion – zunächst nur auf

Kanamycin-Resistenz ohne Saccharose – kann auf Single-Rekombinanten durch Wachstum

in Saccharose-haltigem Medium Selektionsdruck für eine Doppelrekombination ausgeübt

werden.

Im Rahmen der Versuche wurde kein markierter Klon mit Insertion der

Reportergen-Resistenzkassette (Promotor-gfp-neo) in das Zielgen nach Transformation oder

Konjugation der Konstrukte pMA360-lacPr-gfp und pMA363-hspPr-gfp in E. coli-2685

gefunden. Da die entstandenen Klone aber in der Lage sind, auf Selektivagarplatten mit

Kanamycin zu wachsen, müssen sie resistent gegen Kanamycin sein. Entweder haben die

Klone durch chromosomale Mutation oder durch den Erhalt eines Transposons eine

Resistenz gegen Kanamycin entwickelt, oder sie haben die Kassette oder das gesamte

Plasmid an einem anderen Ort in ihr Genom integriert als dem gewünschten. Ersteres ist

unwahrscheinlich, da eine einzelne Spontanmutation zu keiner Kanamycin-Resistenz führen

kann 266. Die Übertragung eines die Kanamycin-Resistenz enthaltenden, genetischen und

mobilen Elements wie z. B. eines Transposons ist unwahrscheinlich, da in diesem in

vitro-Experiment der Kontakt zu einem Donor der Resistenz nicht gegeben war. Weder der

Rezipient E. coli-2685 noch der Donor E. coli S17λpir ohne die Konstrukte pMA360-lacPr-gfp

und pMA363-hspPr-gfp zeigten vor Durchführung der Transformation oder Konjugation eine

Kanamycin-Resistenz.

Ein intrachromosomal vorhandenes Kanamycin-Resistenz-Gen kann nicht ausgeschlossen

werden, da eine „Revertierung“ der Resistenz über gene silencing – in Anwesenheit des

Selektionsdrucks Antibiotikum wird das Resistenz-Gen abgelesen, in Abwesenheit wird es

nicht exprimiert – möglich ist 171.

Das Vorhandensein des gesamten suicide-Plasmids könnte auf den Funktionalitätsverlust

von SacB durch Deletion oder Punktmutation von sacB oder auf lysogene Phagen λ, die im

Genom integriert sind und das zur Vermehrung des Plasmids nötige Pir-Protein produzieren,

zurückgehen. Die Anwesenheit von λ-Phagen im Genom von E. coli-2685 kann

ausgeschlossen werden, da die PCR auf die λ-Phagen-spezifischen Gene gam, bet und exo

keine Produkte lieferte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Reportergen-Resistenzkassette

bzw. der Plasmidrest an andere Stelle im Genom integriert worden ist.

Da die entstandenen Klone neben der Kanamycin-Resistenz auch Ampicillin-Resistenz

zeigten, muss das gesamte Konstrukt pMA360-lacPr-gfp oder pMA363-hspPr-gfp mit

defektem sacB-Gen an einer anderen Stelle ins Genom integriert worden sein. Da in den

Diskussion 137

Originalkonstrukten pMA360-lacPr-gfp und pMA363-hspPr-gfp das Gen sacB keine

Veränderung in der Sequenz zeigte ist die Deletion oder Punktmutation, die zum Defekt von

SacB führte, vermutlich während der Transformation und Integration in das Genom von

E. coli-2685 entstanden.

5.3.1.2 λ-Red-System

Die aus dem λ-Phagen stammenden Gene gam, bet und exo unterstützen die homologe

Rekombination bei E. coli. Die Genprodukte Gam und Bet leiten die Rekombination zwischen

eingebrachter linearer DNA und der Wirts-DNA ein. Gam inhibiert die RecBCD-

Exonuklease V. Die Gene gam, bet und exo befinden sich unter der Kontrolle des

induzierbaren araB-Promotors auf einem Plasmid. Neben dem high copy-Vektor pUC-

araBPr-gbx wurde auch unter der Verwendung des low copy-Vektors pKD46 versucht die

homologe Rekombination durchzuführen. Bei diesen beiden λ-Red-Systemen wird die zu

rekombinierende DNA als lineares PCR-Produkt über Transformation oder Elektroporation in

E. coli eingebracht.

Im Vergleich zur homologen Rekombination über suicide-Vektoren hat das λ-Red-System

mehrere Vorteile. Das für die homologe Rekombination benötigte Fragment muss in keinen

Vektor eingebracht werden, sondern kann als lineares PCR-Produkt transformiert werden, da

das Protein Gam durch Inaktivierung der Nukleasen RecBCD und SbcCD die Degradierung

linearer DNA verhindert 56,57,91. Außerdem kann über Entfernung des Selektionsdrucks

Antibiotikum (bei pUC-araBPr-gbx) oder über Hitze (42 °C bei pKD46) auf den Verlust des

die Gene gam, bet und exo tragenden Plasmids selektioniert werden. Zusätzlich ist bei

beiden λ-Red-Systemen eine Regulation der Genexpression durch den araB-Promotor

gegeben. Diese Regulation ist wichtig, da eine konstitutive und starke Expression von Gam

wahrscheinlich für E. coli toxisch ist 49,259. Ein Beweis dafür konnte nicht erbracht werden, da

kein Unterschied im Wachstum von λ-Red-System-beinhaltenden E. coli-2685 zwischen

Arabinose-induzierter und nicht-induzierter Kultur zu sehen war. Bei Maršić et al. zeigte sich

ebenfalls keine Auswirkung der erhöhten Gam-Expression auf die Wachstumsrate von

Wildtyp-E. coli 188.

Ein Defekt der λ-Red-Systemen konnte ausgeschlossen werden, da die Integration der

Kanamycin-Resistenzkassette über homologe Rekombination in das Zielgen acrB möglich

war.

Arbeiten von Datsenko et al. zur Analyse des λ-Red-Systems pKD46 zeigten, dass

homologe Bereiche von 36 bp bis 50 bp optimal sind, um eine homologe Rekombination mit

Hilfe von pKD46 durchzuführen. Längere homologe Bereiche führen zu keiner Steigerung

der Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination 56.

Diskussion 138

Laut Lui et al. ist eine identische Sequenz von 5 bp innerhalb von 45 bp homologen Bereichs

ausreichend, um eine unspezifische homologe Rekombination auszulösen 168. Um eine

homologe Rekombination an einer unerwünschten Stelle zu verhindern, wurden in dieser

Arbeit homologe Bereiche mit einer Länge von 638 bp und 791 bp verwendet. Die Größe der

homologen Bereiche beträgt das 12,7-fache bis 15,8-fache der von Datsenko et al. für das λ-

Red-System pKD46 optimierten Länge 56. Somit liegt die Vermutung nahe, dass die Länge

der homologen Bereiche der Grund für das Fehlschlagen der homologen Rekombination bei

der Verwendung des Systems pKD46 ist.

Ein weiterer Grund für das Fehlschlagen der homologen Rekombination kann ein geringer

Unterschied der Nukleasen RecBCD und SbcCD von E. coli-Isolaten der Ratte im Vergleich

zu Laborstämmen sein. Dieser Unterschied im Restriktionssystem führt zu einer

unvollständigen Inaktivierung der Nukleasen durch Gam und somit zu einer Degradierung

der transformierten PCR-Produkte. Da die homologe Rekombination der Kanamycin-

Resistenzkassette unter Verwendung des λ-Red-Systems pUC-araBPr-gbx zu Kanamycin-

resistenten Klonen führte, ist wahrscheinlich jedoch kein Unterschied im Restriktionssystem

vorhanden.

Da es sich bei dem Vektor pKD46 um ein low copy-Plasmid handelt, wird Gam nicht im

Überschuss produziert und somit kann womöglich die Gesamtmenge an Nukleasen nicht

inaktiviert werden. Dies hätte wiederum den Abbau der linearen PCR-Produkte zur Folge 205.

Da von RecBCD 10 Moleküle pro Zelle vorhanden sind ist es eher unwahrscheinlich, dass

die Gam-Expression für eine Inaktivierung nicht ausreicht 281.

Die Problematik der vollständigen Inaktivierung der Nukleasen ist bei dem λ-Red-System

pUC-araBPr-gbx nicht gegeben, da es sich um ein high copy-Plasmid handelt und Gam

somit nach Induktion durch Arabinose im Überschuss produziert wird.

Ein Problem dieses Systems liegt in der hohen Kopienzahl und der dadurch verstärkten

Genexpression des Vektors pUC-araBPr-gfp. Die Expression von Gam bewirkt, dass das

pUC-araBPr-gfp-Plasmid nicht zirkulär repliziert sondern lineare Multimere produziert. Diese

Multimere können die Rekombination inhibieren, da sie zum einen um Exo und Beta

konkurrieren 44,51,204,263, zum anderen kann die Bindung von Gam an den linearen Vektor

pUC-araBPr-gfp zu einer Degradierung der linearen PCR-Produkte führen 205. Diese

Problematik spiegelte sich in der geringen Ausbeute an Klonen im Vergleich zur

eingesetzten Keimzahl wieder. Bei einer erfolgten Transformation der von homologen

Bereichen flankierten Resistenzkassette in 1×109 Zellen von E. coli-2685 konnten zwischen

zwei und fünf Klonen isoliert werden.

Diskussion 139

Bei der homologen Rekombination der Reportergen-Resistenzkassette (araBPr-gfp-neo)

traten Probleme auf. Die erfolgte Integration der Resistenzkassette in den Bereich des

E. coli-2685-Genoms von 1.619.393 bp bis 1.620.806 bp lässt darauf schließen, dass die

homologen Bereiche keine oder für die homologe Rekombination nicht relevante Mutationen

in ihrer Sequenz aufweisen und deshalb eine Integration an dieser Stelle möglich ist 168. Die

Sequenzierung der homologen Bereiche zeigte eine 97 %ige Homologie von E. coli-2685 zu

E. coli-K12. Das Ausbleiben der homologen Rekombination bei der Reportergen-

Resistenzkassette steht daher wahrscheinlich nicht im Zusammenhang mit den homologen

Bereichen und der gewählten Integrationsstelle.

Auch die Länge der homologen Bereiche ist vermutlich nicht der Grund für das Ausbleiben

der Integration von araBPr-gfp-neo, da mit denselben homologen Bereichen die Integration

der Kanamycin-Resistenzkassette erfolgte. Murphy et al. und Poteete et al. zeigten, dass bei

langen homologen Bereichen die Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination 100-

fach niedriger ist, wenn RecA nicht vorliegt 204,229. Bei kurzen homologen Bereichen trat nur

eine geringfügige Reduktion der Wahrscheinlichkeit bei Abwesenheit von RecA auf. Das

Vorhandensein von RecA wird in dem verwendeten E. coli-2685 angenommen, da es sich

um ein Wildtyp-E. coli-Isolat handelt. Der Zusammenhang zwischen der Länge der

homologen Bereichen, RecA und der Wahrscheinlichkeit der homologen Rekombination ist

noch nicht geklärt, allerdings scheint die Länge der homologen Bereiche nicht die Ursache

für diesen Unterschied zu sein 49,206,262.

Die Bildung einer Sekundärstruktur nach dem Abbau von Monosacchariden am 5’-Ende der

linearen DNA durch Exo scheidet ebenfalls als Grund für die nicht funktionierende homologe

Rekombination aus, da die minimale freiwerdende Energie sowohl durch die

Sekundärstrukturbildung bei der Kanamycin-Resistenzkassette als auch bei der

Reportergen-Kanamycin-Resistenzkasssette – beide flankiert von den homologen

Bereichen – —138,94 kcal/mol beträgt. Außerdem bilden die für die homologe

Rekombination zuständigen Bereiche gleiche Sekundärstrukturelemente aus, was wiederum

gegen eine Beteiligung an der nicht richtig ablaufenden homologen Rekombination spricht.

Die Ausbildung einer Sekundärstruktur kann auch die Bindung von Bet behindern, was zur

Folge hat, dass es zu keinem annealing von komplementären DNA-Einzelsträngen und zu

keiner homologen Rekombination kommt. Da die Integration der Kanamycin-

Resistenzkassette über homologe Rekombination ohne Probleme erfolgte, kann die

Ausbildung von Sekundärstrukturen nicht der Grund für das Ausbleiben der homologen

Rekombination bei der Reportergen-Resistenzkassette sein.

Bei dem Versuch mit der von den homologen Bereichen flankierten Reportergen-

Resistenzkassette durchzuführen tauchte das Problem auf, dass das Fragment araBPr-gfp-

Diskussion 140

neo mit einem Vektor rekombinierte. Da aus dem Wildtyp E. coli-2685 vor dem Experiment

keine Plasmide isoliert werden konnten, erfolgte die Rekombination wahrscheinlich mit dem

im Versuch transformierten λ-Red-System pUC-araBPr-gbx. Diese unspezifische

Rekombination erfolgte vermutlich aufgrund einer Sequenzhomologie des araB-Promotors,

da kurze homologe Bereiche ausreichen, um eine unspezifische homologe Rekombination

auszulösen 168. Eine Isolierung des entstandenen Plasmids war nicht möglich. Die

Beobachtung der Neubildung oder Veränderung von Plasmiden wurde auch schon in

anderen Arbeiten gemacht 51,168,242.

Die Expression des gfp-Gens kann zu toxischen Effekten sowie zu einer Veränderung der

Fitness des Bakteriums führen. Diesem Fitnessverlust liegt der Abzug an Protein und

Energie zu Grunde, der für die Expression von Gfp verwendet wird. Die toxischen Effekte

machen sich in einem veränderten Wachstumsverhalten bemerkbar. Folglich entsteht eine

verminderte Konkurrenzfähigkeit, wodurch der markierte Stamm von der ihn umgebenden

Normalflora im späteren Modell verdrängt werden könnte 105. In mehreren Arbeiten wurde

keine Behinderung des Zellwachstums und der Zellfunktion aufgrund einer

Plasmidmarkierung nachgewiesen 35,42,95,255. In eigenen Versuchen zeigte sich jedoch ein

deutlicher Unterschied in der Koloniegröße zwischen Reportergen-exprimierenden und nicht

markierten E. coli-Stämmen. Dieser Effekt – ausgelöst durch die Gfp-Expression – war

sowohl bei high copy- als auch low copy-Konstrukten zu beobachten 241. Durch die

chromosomale Integration und durch die Verwendung eines induktiven Promotors z. B. araB-

Promotor können diese unerwünschten toxischen Effekte minimiert werden.

Die Gfp-Expression in dieser Arbeit war unter der Kontrolle des araB-Promotors. Dieser

Promotor benötigt für die Genexpression neben L-Arabinose auch das araC-Genprodukt 137.

Bei dieser Expression handelt es sich um eine Alles-oder-nichts-Genexpression, d. h. die

Zellen werden entweder maximal oder gar nicht induziert 136,137. Da das Nährmedium für

E. coli-2685 während der homologen Rekombination keine L-Arabinose enthält kann es zu

keiner Expression des gfp-Gens kommen. Somit können keine toxischen Effekte auftreten,

die zu einer Inhibierung der homologen Rekombination mit der Reportergen-

Resistenzkassette führen.

Aufgrund der erfolgten und ortspezifischen Integration der Kanamycin-Resistenzkassette

über homologe Rekombination ist es unwahrscheinlich, dass die Rekombination der

Reportergen-Resistenzkassette wegen der Schädigung des Gens nicht statt fand.

5.3.1.3 Generelle Transduktion

Beim Phagen P1 handelt es sich um den am häufigsten verwendeten, generell

transduzierenden Phagen für E. coli 275. Hierbei kann prinzipiell jedes chromosomale oder

plasmidkodierte bakterielle Gen über den „headful packaging“ Mechanismus in einen

Diskussion 141

Phagenpartikel verpackt und in E. coli transduziert werden 265. Befindet sich im Genom des

Rezipienten E. coli ein homologer Bereich zu der transduzierten DNA, so erfolgt homologe

Rekombination.

Der Grund für die Transduktion von bakteriellen Genen liegt in der relativ geringen

Sequenzspezifität des Genproduktes des Phagen P1, das für die Erkennung der pac-sites

verantwortlich ist. Dadurch kommt es zu einem Fehler in der DNA-Verpackung, da sowohl

auf Plasmiden als auch auf dem Bakterienchromosom pac-ähnliche Signale registriert

werden 265,275. Auf dem Chromosom von Salmonella typhimurium existieren mindestens 6 bis

10 pac-ähnliche Sequenzen, die versehentlich erkannt und geschnitten werden

können 252,296. Durch das schrittweise Voranschreiten der „Verpackung“ kann theoretisch

jedes bakterielle Gen anstelle der Phagen-DNA in den Phagenkopf gelangen. Die Häufigkeit,

mit der ein chromosomaler Marker durch P1 übertragen wird, hängt von seiner Entfernung zu

den pac-sites ab, sowie von der Ähnlichkeit der Basensequenz zur echten pac-site des

Phagen 252,296.

Als Donorstamm der bakteriellen DNA für die Transduktion wurde der den Vektor pMA364-

araBPr-gfp tragende E. coli-2685 mit dem Phagen P1 infiziert. Nach erfolgreicher Infektion

erfolgte die Transduktion in E. coli-2685. Da sich auf dem Plasmid pMA364-araBPr-gfp das

von homologen Bereichen flankierte Fragment araBPr-gfp-neo befindet, ist nach der

Transduktion eine homologe Rekombination zu erwarten.

Aus der Transduktion sind in diesen Versuchen Kanamycin-resistente Keime

hervorgegangen. Bei keinem der erhaltenen Klone zeigte sich nach Induktion mit 0,1 %iger

Arabinose grüne Fluoreszenz unter UV-Licht.

Da bei der Transduktion zwischen dem Donorstamm E. coli-2685, der das Plasmid pMA364-

araBPr-gfp trägt, und dem Rezipient E. coli-2685 Kanamycin-resistente Klone

hervorgegangen sind, kann ein Fehler bei der Transduktion ausgeschlossen werden.

Eine mögliche Ursache für die entstandenen Kanamycin-resistenten und nicht fluoreszenten

Klone kann die Entfernung von araBPr-gfp zu der pac-site auf dem Plasmid pMA364-araBPr-

gfp sein. Da aber die Länge des bei der P1-Transduktion übertragbaren Fragments bis zu

100 kb betragen kann 132,195,275und die Größe des gesamten Plasmids pMA364-araBPr-gfp

7.605 bp beträgt, können weder die pac-site noch die Länge des zu übertragenden

Fragments die Ursache für die Kanamycin-resistenten und nicht fluoreszenten Klone sein.

Wahrscheinlich liegt auch bei der homologen Rekombination über Transduktion das Problem

bei der Integration des gfp-Gens als Marker und nicht im System.

Diskussion 142

5.3.2 Chromosomale Markierung mit Transposonmutagenese

E. coli können drei Typen von transponierbaren genetischen Elementen besitzen:

Insertionssequenzen, Transposons und Bakteriophagen, die sich über den Weg der

Transposition vermehren. Insertionselemente und Transposons haben zwei wichtige

Merkmale gemeinsam. Sie tragen beide Gene, die für eine Transposase kodieren und

besitzen an ihren Enden umgekehrte Sequenzwiederholungen (inverted repeats) mit einer

Länge von 20–1.000 bp. Im Unterschied zu Insertionselementen tragen Transposons

zusätzliche Gene, die z. B. für eine Antibiotikaresistenz kodieren 139,179. Transposons werden

für die genetische Analyse und Manipulation von Bakterien häufig verwendet 20,61. Da der Ort

der Integration nicht vorhergesagt oder vorherbestimmt werden kann, können sie durch

Integration die Funktionsfähigkeit eines Gens stören. Ist dies für die Zelle ein essentielles

Gen, so hat die Integration für die Zelle unbekannte Konsequenzen. Diese kann störend oder

im schlimmsten Fall letal für die Zelle sein 31,105,227. Die Integration kann aber auch Vorteile

durch die Übertragung von z. B. Resistenzgenen bringen 290. Das in dieser Arbeit

verwendete System pLOF/Km-araBPr-gfp trägt ein zusammengesetztes Mini-Tn10-

Transposon. Die für den Phänotyp verantwortlichen DNA-Abschnitte (Kanamycin-Resistenz,

Fluoreszenz nach Induktion) werden von inverted repeats umgeben, die eine Länge von

70 bp haben. Die Transposase befindet sich außerhalb der mobilen Einheit und wird nicht

übertragen. Ein Vorteil von Mini-Transposons ist die stabile Integration der von den inverted

repeats flankierten Gene in das E. coli-Genom, da keine Übertragung der Transposase

erfolgt. Eine Retransposition des Mini-Transposons ist nicht möglich, da die Tn10-

Transposase schlecht in trans wirkt 290. Ein weiterer Vorteil des Verlusts der Transposase

besteht darin, dass der Rezipient nicht immun ist gegenüber weiteren Transpositionen. Die

Übertragung des Mini-Tn10 erfolgt mit Hilfe eines suicide-Vektors. Der Vektor pLOF/Km

besitzt den oriV R6K, der für eine autonome Replikation das Pir-Protein des Phagen λ

benötigt. Daher kann der Vektor nur in Stämmen replizieren, die das Pir-Protein exprimieren.

Ist dieses Protein nicht vorhanden, so kann der Vektor nicht replizieren. In diesem Fall kann

durch Selektionsdruck mit dem Antibiotikum Kanamycin auf die Transposition der mobilen

Einheit selektiert werden. Für den Transfer in verschiedene Gram-negative Bakterien ist der

RP4 conjugal transfer origin (oriT) notwendig 61,139,271.

Aus der Übertragung des pLOF/Km-araBPr-gfp von E. coli S17λpir über Konjugation in

E. coli-4 und E. coli-2685 gingen keine Klone mit erfolgter Transposition hervor. Dies kann

auf eine geringe Frequenz durch RP4-vermittelten Transfer zurückgeführt werden.

Verschiedene Eigenschaften wie z. B. das Restriktionssystem des Rezipienten oder das

Fehlen von essentiellen envelope functions können zu dieser geringen

Übertragungsfrequenz führen 61. Neben der geringen Transferfrequenz über Konjugation

Diskussion 143

kann es bei der Transposition selbst zu einem Problem kommen. Viele verschiedene

Wirtsfaktoren mit unterschiedlichen Funktionen können die Transposition beeinflussen 290.

Bei in vitro-Studien zeigte sich, dass für eine erfolgreiche Transposition ein DNA-Protein-

Komplex, auch Transposom genannt, benötigt wird. Die Bildung des Tn10-Transposoms wird

durch nucleoid-associated host proteins wie integration host factor (IHF), heat unstable

nucleoid protein (HU) und histone-like nucleoid structuring protein (H-NS)

erleichtert 36,52,154,187,277. Diese Proteine erleichtern durch Bindung der Transposon-DNA die

Ausbildung der richtigen Anordnung der Transposon-Enden und der Zielsequenz innerhalb

des Transposoms. Ihre Verfügbarkeit ist für das Auftreten der Transposition

entscheidend 290. Da die Menge an nucleoid-associated host proteins während den

unterschiedlichen Phasen des Wachstums variiert 3, ist ein Unterschied in der

Transpositionsfrequenz zu erwarten. Die Hypothese, dass die Abnahme von bestimmten

Nährstoffen, der Eintritt in die stationäre Phase oder andere stress-induzierende Situationen

die Transposition beeinflussen wurde bereits von McClintock aufgestellt 193. Da es bei der

Durchführung der Konjugation weder zu einer Abnahme der Nährstoffe noch zu einer

stress-induzierenden Situation oder zum Eintritt in die stationäre Phase gekommen ist, kann

dies nicht die Ursache für Ausbleiben der Transposition nach der Konjugation sein.

Eine weitere Ursache für das Fehlschlagen der Konjugation kann die Empfindlichkeit des

Systems sein. Bei der Konjugation handelt es sich um einen Vorgang der leicht unterbrochen

werden kann, da die während einer Konjugation ausgebildete Plasmidbrücke äußerst instabil

ist und schon bei geringster Erschütterung zerstört wird 139.

Da die Transposition nach Übertragung des Plasmids pLOF/Km-araBPr-gfp mittels

Transformation in E. coli-4 ohne Probleme ablief, ist es naheliegend, dass die Transposition

nach Konjugation entweder aufgrund einer geringen Transferfrequenz des pLOF/Km-araBPr-

gfp von E. coli S17λpir in E. coli-4 scheiterte oder es zu einer Zerstörung der Plasmidbrücke

kam.

Aufgrund der Tatsache, dass bei E. coli-2685 die Transposition weder nach Konjugation

noch nach Transformation Selektanten hervorbrachte, kann das Problem nicht in der

geringen Übertragungsfrequenz oder dem Verlust der Plasmidbrücke liegen, da die

Transformation unabhängig von der Übertragungsfrequenz abläuft. Daher trat das Problem

vermutlich während der Transposition auf. Die Abwesenheit eines der für die Bildung des

Transposoms wichtigen Proteine kann als Ursache in Frage kommen.

Diskussion 144

5.3.2.1 Detektion der Integrationsstelle

Zur Lokalisierung der genauen Integrationsstelle des Mini-Tn10-Transposons in E. coli-57

wurden mehrere Verfahren angewendet.

Inverse PCR war eine der ersten Methoden die es ermöglichte von einer bekannten

Gensequenz ausgehend unbekannte angrenzende DNA-Sequenzen zu analysieren. Die

Methode verwendet eine Strategie, bei der einige Restriktionsenzyme verwendet werden, um

ein geeignetes Fragment der DNA zu erhalten, die auch die bekannte Gensequenz

einschließt. Dieses Segment wird anschließend über intramolekulare Ligation zirkularisiert.

Die Ligation wird dann als template in die PCR mit divergenten Primer (aus der bekannten

Sequenz heraus) eingesetzt 286. Für die Lokalisation der Integrationsstelle des Mini-Tn10-

Transposons in E. coli-57 wurden die Enzyme BspEI, BstXI, NcoI, BbsI, AatII, SalI, SapI,

BlnI, NotI, BglI, PstI, BglII, KpnI oder SphI aufgrund ihrer Schnittstellen im Transposon

gewählt. Die Primer wurden in Abhängigkeit von der Restriktionsschnittstelle verwendet. Die

PCR, mit auf die Schnittstellen im Transposon abgestimmten Primern, ergab keine Produkte.

Ursächlich hierfür kann die Entfernung zwischen den jeweiligen Restriktionsschnittstellen

sein und damit die Länge des Fragments. Sind die Enden eines DNA-Fragments zu weit

voneinander entfernt, ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass diese sich für eine Ligation

finden und somit eine Zirkularisierung des Fragments stattfindet. Diese Zirkularisierung ist

Voraussetzung für die Entstehung von PCR-Produkten. Eine weitere Ursache für dieses

Ergebnis kann ein unvollständiger Restriktionsverdau sein. Schneidet das verwendete

Restriktionsenzym die DNA nicht vollständig, so sind zu große DNA-Fragmente die Folge. Es

kommt aufgrund des Abstands der Enden zu keiner Zirkularisierung.

Neben inverser PCR wurde auch die Methode der RS-PCR zur Lokalisation der

Integrationsstelle des Mini-Tn10-Transposons verwendet 249. Die Sequenzierung der bei

dieser Methode erhaltenen PCR-Produkte ergab neben der Transposonsequenz zwischen

50–200 bp lange DNA-Fragmente. Diese Fragmente zeigten laut dem Programm NCBI Blast

keine signifikante Ähnlichkeit zu der Sequenz aus E. coli.

Längere Elongationszeiten bei der RS-PCR ergaben keine längeren Produkte. Vermutlich

liegen die Restriktionsschnittstellen, die für die RS-Primer als Erkennungssequenz dienten,

zu nahe an der Transposon-Integrationsstelle. Es wurden 12 verschiedene Restriktions-

schnittstellen als Erkennungssequenz für die Primer gewählt. Es wäre möglich über weitere

RS-PCRs mit anderen RS-Primern die Integrationsstelle des Mini-Tn10-Transposons zu

lokalisieren.

Diskussion 145

5.4 Phänotypische Eigenschaften von E. coli-57, E. coli-32 und dem Wildtyp E. coli-4 im Vergleich

5.4.1 Biochemische Eigenschaften

Die Ergebnisse aus der Überprüfung der biochemischen Fähigkeiten mittels Phoenix®- und

API E20-System zeigten, dass bei E. coli-32 und E. coli-57 im Vergleich zu E. coli-4 kein

Unterschied in den biochemischen Eigenschaften besteht. Dieses Ergebnis lässt vermuten,

dass die Integration des gfp und der Kanamycin-Resistenzkassette über

Transposonmutagenese zu keiner Störung eines für die untersuchten Stoffwechselwege

wichtigen Gens geführt hat.

5.4.2 Wachstum

Als Indikator für die Konkurrenzfähigkeit wurde das Wachstum der markierten Stämme

E. coli-57 und E. coli-32 untersucht. Sowohl schlechteres Wachstum als auch verminderte

Adhärenz der markierten Stämme führen zu einer Abnahme der Konkurrenzfähigkeit. Die

Folge ist eine schlechte Detektion des markierten Stammes innerhalb der Kotflora, da er sich

gegenüber dieser nur sehr schwer durchsetzen kann.

Die markierten Stämmen E. coli-57, E. coli-32 und der Wildtyp E. coli-4 zeigten unter

aeroben Bedingungen keinen Unterschied im Wachstum. Da im Darm der Ratte anaerobe

Verhältnisse herrschen und in E. coli dadurch andere Stoffwechselwege als in aerober

Umgebung ablaufen, war auch die Untersuchung des Wachstums unter anaeroben

Bedingungen wichtig. Auch unter anaeroben Bedingungen war kein Unterschied im

Wachstum zwischen den einzelnen Stämmen zu erkennen.

Bei dem Vergleich des aeroben mit dem anaeroben Wachstums von E. coli-57, E. coli-32

und dem Wildtyp E. coli-4 war eine geringe Veränderung des Wachstums zu erkennen. Die

Wachstumsrate unter anaeroben Bedingungen war leicht erhöht gegenüber der Rate unter

aeroben Bedingungen. Ein Grund hierfür ist vielleicht, dass die unter aeroben

Wachstumsbedingungen von E. coli-57 gebildeten toxischen Produkte wie

Wasserstoffperoxid, Superoxid sowie Hydroxylradikale nicht ausreichend entgiftet werden

konnten 120. Ein weiterer Grund für den Wachstumsunterschied zwischen aeroben und

anaeroben Bedingungen kann die schlechte Löslichkeit von Sauerstoff in Flüssigkeiten sein.

Dieser kann nach Verbrauch nur durch Diffusion ersetzt werden kann 179. Da die

Wachstumsversuche von E. coli-57, E. coli-32 und dem Wildtyp E. coli-4 ohne Schütteln

durchgeführt wurden, war keine ausreichende Sauerstoffversorgung der Keime gegeben und

die Mikroorganismen konnten nicht unter optimalen aeroben Bedingungen ihr

Wachstumsverhalten zeigen. Die anaeroben Kulturen hatten optimale Bedingungen. Mit Hilfe

von Parafin wurde die Diffusion des Sauerstoffs in das Medium verhindert. Außerdem wurde

Diskussion 146

für die Untersuchung des Wachstums unter anaeroben Bedingungen Thioglykolat

verwendet. Dieses Medium schafft ein reduzierendes Milieu und ist mit einem Redoxindikator

versetzt. Dieser Farbstoff verändert in Gegenwart von Sauerstoff seine Farbe und zeigt somit

an ob und wieweit Sauerstoff in das Medium eingedrungen ist 40,179.

5.4.3 Antibiotikaresistenz

Die minimalen Hemmkonzentrationen von E. coli-57 und E. coli-32 gegenüber Ciprofloxacin,

Moxifloxacin, Chloramphenicol und Doxycyclin zeigten keinen Unterschied zu den MHKs von

E. coli-4. Daraus kann man schließen, dass keines der die minimale Hemmkonzentration

gegenüber den Antibiotika verursachenden Gene von der Integration des Transposons

betroffen war.

5.4.4 Organic solvent tolerance

Organic solvent tolerance (OST) wird bei E. coli meist vermittelt durch Überexpression des

Effluxsystems AcrAB-TolC 8,11,305. Auch das paraloge System AcrEF-TolC kann an der

Ausbildung von OST beteiligt sein 140.

In Bezug auf die organic solvent tolerance zeigte sich zwischen den Klonen E. coli-57,

E. coli-32 und dem Wildtypstamm E. coli-4 kein Unterschied. Dieses Ergebnis legt nahe,

dass durch die chromosomale Markierung bei E. coli-57 und E. coli-32 kein für die

Effluxsysteme AcrAB-TolC und AcrEF-TolC kodierendes oder regulierendes Gen in seiner

Funktion gestört wird.

5.4.5 Adhärenz

Um sich in einem Kompartiment des Wirtsorganismus auf Dauer niederlassen zu können,

muss ein Bakterium die Fähigkeit besitzen, Bindungsstellen an der Zellmembran zu finden

und an diesen zu adhärieren. Auf diese Weise können z. B. Bakterien, die den

Urogenitaltrakt besiedeln, verhindern, durch den Harnfluss weggespült zu werden. Auch wird

die massive Besiedlung mit adhärenten Darmbakterien auf der Epitheloberfläche des

Intestinaltraktes als Schutzmechanismus gegen pathogene Keime angesehen. Dabei bilden

apathogene Darmbakterien eine Art Schutzschicht auf dem Epithel und halten somit

mögliche Bindungsstellen für Pathogene besetzt. Auch im Zusammenhang mit probiotischen

Bakterien ist ein starkes Adhäsionsvermögen immer wieder als wichtiges Selektionskriterium

genannt worden 77. Als in vitro-Modell zur Adhäsionsprüfung dienen meist die intestinalen

Epithelzelllinien Caco-2 sowie HT-29 211.

In dieser Arbeit wurden im Zelladhäsionsassay HT-29-Zellen verwendet. Bei den

Untersuchungen von E. coli-57, E. coli-32 und dem Wildtyp E. coli-4 zeigte sich bei E. coli-32

Diskussion 147

eine stärkere Adhärenz im Vergleich zu E. coli-4. E. coli-57 unterschied sich in seinem

Adhärenzverhalten nicht von dem Wildtyp E. coli-4.

In den Versuchen dieser Arbeit wurde auch deutlich, dass bei den getesteten Stämmen

E. coli-57, E. coli-32 und dem Wildtyp E. coli-4 die Fähigkeit zur Adhäsion vorhanden, wenn

auch im Vergleich zur Positivkontrolle (Citrobacter) gering ausgeprägt ist.

Die Übertragung der Erfahrungen aus einem in vitro-Modell auf die Situation in vivo ist

allerdings problematisch, da das Adhäsionsvermögen nicht nur von spezies- sondern auch

von wirts- bzw. modellspezifischen Faktoren abhängen kann. Von Isolauri et al. wurde

bereits angedeutet, dass auch Stämme, die in vitro kein starkes Adhäsionsvermögen zeigen,

dennoch ein hohes Maß an Kompetitivität mit anderen Keimen aufweisen können 118.

Bei Untersuchungen des probiotischen Stammes E. coli Nissle zeigte sich diese

Abhängigkeit der Adhärenz von modell- sowie wirtsspezifischen Faktoren 26,169.

Hierbei können z. B. unterschiedliche Differenzierungsgrade der verwendeten Zelllinien eine

Rolle spielen oder die Palette an exprimierten Oberflächenmolekülen. Auch die komplexeren

Bedingungen in vivo wie verschiedene Zelltypen und eine breite Darmflora unterschiedlicher

Ausprägung im System können das Adhärenzvermögen eines Keims verändern.

Obwohl die Adhärenzfähigkeit in vitro nur eine geringe Aussage zu der Adhärenz in vivo

zulässt, wurde der Klon E. coli-57 im Selektionsmodell Ratte eingesetzt, da dieser Klon keine

Veränderung des Adhärenzverhaltens im Vergleich zu dem Wildtyp E. coli-4 in vitro zeigte.

5.5 Tierversuch

In diesem Teil der Arbeit wurde der Darm von Fischer-Ratten mit dem Reporterstamm

E. coli-57 kolonisiert. Ohne Selektionsdruck war die Kolonisation des Rattendarms über

sechs Monate lang stabil. Während einer Therapie mit Fluorchinolonen (Ciprofloxacin) sollte

die Resistenzentwicklung des markierten E. coli-57 beobachtet werden. Die hierbei aus dem

Kot der Ratten isolierten Klone E. coli-4o1 und E. coli-4o2 zeigten zwar Kanamycin-

Resistenz, aber keine Fluoreszenz, was auf den Verlust der gfp-Reportergenkassette

hindeutet. Die MHK gegenüber Ciprofloxacin der isolierten Klone E. coli-4o1 und E. coli-4o2

zeigte im Vergleich zu E. coli-57 keine Veränderung.

5.5.1 Auswirkungen der Kolonisation des Rattendarms mit E. coli-57 auf die

Normalflora

Vor als auch nach der Kolonisation war in der Zusammensetzung der Darmflora kein

signifikanter Unterschied zu erkennen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die einmalige

Anwendung von Kanamycin nur einen geringen Einfluss auf den Gesamtstatus hatte. Auch

ein übermäßiges Durchsetzungsvermögen von E. coli-57 gegenüber den anderen Keimen

Diskussion 148

kann ausgeschlossen werden, da die Keimzahl der Gram-negativen Bakterien vor und nach

der Kolonisation keinen relevanten Unterschied zeigte und die Anzahl von E. coli-57 nicht

variierte.

5.5.2 Stabilität von E. coli-57 innerhalb der Normalflora

In Arbeiten von Schultz et al. wurde ein probiotischer, plasmidisch mit gfp markierter E. coli

Nissle in den Darm von Ratten eingebracht 254,255. Nach 14 Tagen war der Nissle-Stamm in

so geringer Konzentration vorhanden, dass er erst mit Hilfe von Selektionsdruck auf die

Resistenzkassette des Plasmids aus der Mischkultur des Rattenkots isoliert werden konnte.

Ein ebenfalls plasmidisch markiertes E. coli-Isolat aus der Ratte war ohne Selektionsdruck

über 45 Tage stabil Teil der Normalflora 254,255. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde in der

vorliegenden Arbeit ein E. coli-Isolat aus der Ratte für die chromosomale Markierung

verwendet. Durch eine bessere Adaptation und Adhäsionsmechanismen konnte der

chromosomal markierte Stamm E. coli-57 über einen Zeitraum von sechs Monaten lang im

Rattenkot nachgewiesen werden.

Die Gabe von Ciprofloxacin mit ansteigender Konzentration -von 20 µg/ml bis 640 µg/ml-

verursachte eine Abnahme der Gram-negativen Keime und auch eine Abnahme des

Kanamycin-resistenten E. coli-57. Am letzten Tag der Antibiose waren keine Gram-negativen

Keime im Kot nachweisbar. Zwei Tage nach Beendigung der Antibiose konnten Kanamycin-

resistente Keime (E coli-4o1; E. coli-4o2) isoliert werden, die nach Induktion mit Arabinose

keine Fluoreszenz zeigten. Die Ergebnisse der Rep-PCR und des Southern Blots deuten

darauf hin, dass es sich um Stämme handelt, die eng miteinander verwandt sind. E coli-4o1

und E. coli-4o2 wiesen einen kompletten Verlust des Reportergens (araBPr-gfp) auf, da bei

keiner PCR zum Nachweis dieses Fragments oder Teile dieses Fragments Produkte

entstanden. Auch sieben Tage nach Beendigung der Antibiotikagabe konnte der markierte

Keim E. coli-57 nicht nachgewiesen werden. Da ohne Antibiose der markierte Keim

E. coli-57 über sechs Monate lang im Darm der Ratte stabil war, muss ein direkter

Zusammenhang zwischen der Ciprofloxacin-Gabe und dem Verlust des Reportergens

araBPr-gfp bestehen. Bei Ciprofloxacin handelt es sich um ein Antibiotikum, das aufgrund

seiner Wirkung auf die Topoisomerasen II und IV einen Effekt auf das supercoiling der DNA

hat. In Arbeiten von Peter et al. und Bagel et al. konnte gezeigt werden, dass eine

Veränderung des Spiralisierungsgrades der DNA sowohl eine induktive als auch eine

hemmende Wirkung auf die Genexpression haben kann 14,223. Dieses Ergebnis legt nahe,

dass es durch die Gabe von Ciprofloxacin zu einer Auflockerung der negativen

Überspiralisierung der genomischen DNA von E. coli-57 kam. Dies führte wahrscheinlich zu

einer Induktion der Genexpression von gfp. Diese Gfp-Expression während der

Diskussion 149

Darmpassage war offensichtlich für E. coli-57 ein Fitness-Nachteil und führte zu einer

verminderten Konkurrenzfähigkeit. Vermutlich hat der markierte Keim E. coli-57 den

Störfaktor – das Fragment araBPr-gfp – aus seinem Genom entfernt.

Eine weitere Ursache für den Verlust des Reportergens bei den isolierten Klonen E coli-4o1

und E. coli-4o2 kann das Auslösen der gfp-Expression aufgrund einer Mutation im

araB-Promotor sein. Dies kann zu einer kontinuierlichen Expression des gfp-Gens führen.

Dadurch hat der markierte E. coli-57 einen Wachstumsnachteil. Um dies zu verhindern hat

der E. coli-57 wahrscheinlich das araBPr-gfp-Fragment aus seinem Genom entfernt.

Auch der nicht realisierbare Selektionsdruck auf das gfp-Gen kann ein Grund für den Verlust

des Reportergens sein. E. coli zeigen in Abhängigkeit von der Populationsstruktur, dem

Lifestyle und der ökologische Nische einen signifikanten Unterschied in ihren

Genverlust-Raten 106. Die Wahrscheinlichkeit des Verlusts der Kanamycin-Resistenzkassette

ist aufgrund des dadurch erworbenen Selektionsvorteils eher gering. Der Verlust des

Reportergens und nicht des gesamten Mini-Tn10-Transposons legt nahe, dass die

Integration des Transposons kein essentielles Gen in dessen Funktionalität behindert.

5.5.3 Selektion von Ciprofloxacin-resistenten Keimen in vivo

Die nach der Antibiotikagabe aus dem Kot isolierten Kanamycin-resistenten, von E. coli-57

abstammenden E. coli-4o1 und E. coli-4o2 zeigten keine Erhöhung in ihrer MHK gegenüber

Ciprofloxacin. Die Verwandtschaft dieser Stämme wurde durch ein identisches

Rep-PCR-Muster bestätigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es während der Antibiose

durch spontane Mutationen zu keiner für die Resistenzentwicklung gegenüber Ciprofloxacin

bedeutsamen Veränderung im Genom des E. coli-57 gekommen ist.

5.5.3.1 Einfluss der Mutationsrate auf die Entstehung von Resistenz

Normalerweise treten Mutationen mit einer Wahrscheinlichkeit von 10―9-10―12 pro

Basenpaar auf 30. Um einer Anhäufung von Mutationen entgegenzuwirken, haben Bakterien

Mechanismen entwickelt, die der Korrektur von mismatch nucleotides dienen und die

Genauigkeit der Replikation erhöhen. Das mismatch repair system (MMR) entfernt falsch

zugeordnete Basen aus dem neu synthetisierten Strang und bewahrt die Sequenz mit der

richtigen Base 199. Mutationen innerhalb der Gene mutHLS, uvrD und dam, die Teil des

MMRs sind, können bei E. coli eine bis zu 1.000-fach höhere Mutationsrate als

Wildtyp-E. coli verursachen. Diese Stämme werden Mutator-Stämme genannt 155,190,199,200.

Da die Mutationsrate eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Antibiotika-Resistenz spielt,

können die Anwesenheit von Mutator-Stämmen innerhalb einer Bakterienpopulation die

Entstehung von Resistenz-Mutationen verstärken 92,200. Eine Verbindung zwischen hoher

bakterieller Mutationsrate und schneller Resistenzentwicklung konnte bei in

Diskussion 150

vitro-Experimenten und in Tiermodellen (in vivo) gezeigt werden 92,250,280. Komp-Lindgren et

al. konnten zeigen, dass eine hohe Mutationsrate von klinischen E. coli-Isolaten eine

signifikante Rolle bei der Resistenzentwicklung durch Punktmutationen haben kann 145. Bei

Mutator-Stämmen aus der Gattung Pseudomonas aeruginosa konnte innerhalb einer

dreitägigen Antibiotikatherapie eine sofortige Resistenzentwicklung gegenüber den zur

Therapie verwendeten Antibiotika beobachtet werden 216. Die Tatsache, dass

Mutator-Stämme eher eine Akkumulation von Mutationen zeigen, kann auch zu einer

höheren Sterberate aufgrund von letalen Mutationen führen 93,190.

Theoretische und experimentelle Daten konnten auch zeigen, dass es unter bestimmten

Bedingungen von Vorteil ist ein Mutator zu sein 186,267,278. Aufgrund ihrer hohen Mutationsrate

können sich Mutator-Stämme schneller an Umweltveränderungen anpassen als ein

Wildtyp-Stamm 282. Dadurch kann der Mutator-Stamm eine höhere Zelldichte in

Zusammenhang mit adaptiven Mutationen erreichen, wenn diese einen Selektionsvorteil

bedeuten 60.

Cirz et al. konnten zeigen, dass Mutator-Stämmen von E. coli eine 800-fach höhere

Mutationsrate aufweisen als normale Wildtyp-E. coli. Das Antibiotikum Ciprofloxacin

verursachte bei E. coli-Mutator-Stämmen eine 4-fache Steigerung der Mutationsrate.

Ciprofloxacin verursacht die Spaltung des LexA-Repressors. Dies führt über eine Aktivierung

der SOS-Antwort zu einer Verringerung der 800-fachen Mutationsrate auf das 4-fache 39.

Die unveränderte MHK gegenüber Ciprofloxacin bei E. coli-4o1 und E. coli-4o2 im Vergleich

zu E. coli-57 deutet darauf hin, dass sich der markierte E. coli-57 nicht an die

Ciprofloxacin-Konzentration über Mutation adaptiert hat. Dieses Ergebnis legt nahe, dass es

sich bei E. coli-57 nicht um einen Mutator-Stamm handelt.

Um diese Vermutung zu bestätigen kann ein mutation frequency assay oder ein mutation

rate assay durchgeführt werden. Bei diesen Assays wird Rifampicin am häufigsten

verwendet, da Rifampicinresistenz durch eine von 69 verschiedenen Punktmutationen

innerhalb des Zielgens rpoB vermittelt wird89,153. Der Unterschied in der Mutationsrate

zwischen Wildtypstamm E. coli-4 und E. coli-57 kann bestimmt werden durch die Messung

des phänotypischen Auftretens von Rifampicinresistenz. Ist bei E. coli-57 eine Erhöhung der

Mutationsrate zu beobachten, so handelt es sich um einen Mutatorstamm.

Die Wahrscheinlichkeit der Resistenzentwicklung ist auch abhängig von der target size, das

heißt wie viele Gene und Basenveränderungen eine Resistenz vermitteln 190. Bei E. coli

werden sieben Punktmutationen in dem Gen gyrA benötigt um eine Fluorchinolon-Resistenz

zu verursachen, wobei nur drei Mutationen in parC zu einer Resistenz führen 110,190. Eine

Diskussion 151

Akkumulation von Punktmutationen führt zu einer schrittweisen Erhöhung der MHK. Die

einzelnen Mutationen in gyrA verursachen eine verschieden hohe Erhöhung der MHK vom

ein- bis zum 19-fachen Wert des Ausgangsstammes 87. Die Aminosäuresubstitution

Ser83Leu in GyrA verursacht eine minimale Hemmkonzentration ≥ 1 µg/ml 82,295. Eine

Doppelmutation in gyrA hat eine MHK von 0,5 µg/ml zur Folge 288.

Da sich keine Erhöhung der minimalen Hemmkonzentration gegenüber Ciprofloxacin bei

E. coli-4o1 und E. coli-4o2 im Vergleich zu E. coli-57 zeigte, ist es offensichtlich zu keiner für

die Resistenz gegen Ciprofloxacin relevanten Mutation gekommen.

5.5.3.2 Erwerb von Antibiotikaresistenz über horizontalen Gentransfer

Horizontaler Gentransfer kann durch den Austausch von Plasmiden, Transposons und

chromosomaler DNA Resistenz vermitteln. Da keine Erhöhung der Ciprofloxacin-MHK von

E. coli-57 und von E. coli-Isolaten aus dem Rattenkot vor der Ciprofloxacin-Gabe zu sehen

war, ist es wahrscheinlich, dass keine genetischen, mobilen Elemente vorhanden sind, die

eine Steigerung der Resistenz gegenüber Ciprofloxacin vermitteln können.

5.5.3.3 Auswirkung der Antibiotikum-Konzentration auf die Entstehung von

resistenten E. coli in vivo

Drlica et al. zeigte, dass bei Fluorchinolonen die Konzentration des Antibiotikums für die

Entstehung von resistenten Keimen eine entscheidende Bedeutung hat.

Der Konzentrationsbereich, der die Selektion auf resistente Einzelschrittmutanten unterstützt,

wird als mutant selection window (MSW) bezeichnet. Außerhalb dieses

Konzentrationsbereiches wird der Erwerb von Resistenz verringert oder sogar

verhindert 71,72,76. Diese Hypothese bestätigen in vitro- 76,94und in vivo-Experimente 4,55,81.

Almeida et al. konnten in einem Mausmodell beobachten, dass es zu keiner Selektion von

resistenten Mycobacterium tuberculosis kommt, wenn eine Moxifloxacinkonzentration

verwendet wird, die außerhalb des MSW liegt 4. Cui et al. und Etienne et al. zeigten, dass

eine Selektion von resistenten Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae ohne

Ausnahme innerhalb des MSW erfolgt.

Basierend auf der Annahme, dass Mengen von 1,77 µg/g bis 64,36 µg/g Ciprofloxacin im Kot

– das entspricht einer Ciprofloxacinkonzentration von 0,1–3,7 µg/ml– nicht zu einer

Konzentration innerhalb des mutant selection windows führte, ist das Ausbleiben einer

Selektion von Mutanten mit veränderter Mindesthemmkonzentration eine logische Folge.

Diskussion 152

5.5.3.4 Zeitraum bis zur Entdeckung von resistenten E. coli in vivo

Wie man in Abbildung 37 sehen kann, wird das MSW von der Konzentration des

Antibiotikums und der Zeit nach der Fluorchinolongabe bestimmt.

Abb. 38: Schematische Darstellung des mutant selection window (MSW)

Quelle: Marcusson,L. Resistance to Fluoroquinolones in Escherichia coli: Prevention, Genetics and Fitness Costs

Bei Almeida et al. zeigten sich erst vier Wochen nach Ende der Gabe von Moxifloxacin

resistente Keime von Mycobacterium tuberculosis 4. Daher ist anzunehmen, dass der

einwöchige Zeitraum nach der Antibiotikagabe für die Selektion von gegenüber

Ciprofloxacin-resistenten E. coli-57 zu kurz war.

5.6 RT-PCR als Verfahren zu relativen Quantifizierung der Genexpression

Das Verfahren der RT-PCR hat den Vorteil mehrere Gene gleichzeitig in sehr kurzer Zeit

vermessen zu können 309. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Sensitivität von PCR-Verfahren.

Trotz Unsicherheiten in der Bestimmung aufgrund der unterschiedlichen Effizienz der

Reversen Transkription und der PCR-Reaktion bei verschiedenen Ansätzen, die durch

Normalisierung abgeglichen werden müssen, kann man in einer RT-PCR eine genauere

Quantifizierung erreichen 32. Daher wurde kein Northern Blot durchgeführt, trotz der besseren

Spezifität im Vergleich zum in dieser Arbeit verwendeten LightCycler®-Verfahren mit SYBR

Green.

Bei dem LightCycler®-Verfahren wird die gesamte doppelsträngige DNA im Ansatz

erfasst 203. Unspezifische PCR-Produkte und Primer-Dimere werden dabei ebenso erfasst

wie das spezifische Produkt 32. Die Messung einer Schmelzkurve dient als Qualitätskontrolle.

Ein unspezifisches Produkt, wie z. B. Primer-Dimere in der Negativkontrolle, schmelzen bei

einer niedrigeren Temperatur als ein spezifisches Produkt auf. In der Messkurve entsteht bei

einer bestimmten Temperatur jeweils ein peak der Fluoreszenz 32,203,309. Für die

Diskussion 153

durchgeführten Experimente musste gewährleistet sein, dass trotz z. T. geringer

template-Konzentrationen kleine Unterschiede in der Expression zuverlässig quantifiziert

werden. Aus diesem Grund wurde aus Verdünnungsreihen mit cDNA der jeweiligen Probe

von 1:5, 1:10 und 1:50 die Effizienz der Umschreibung von RNA in cDNA bestimmt.

Abweichungen vom idealen Faktor 2 kommen aufgrund von Schwankungen der crossing

points und der daraus gebildeten Mittelwerte zustande 203. Unsauberkeiten beim Pipettieren

rufen, insbesondere bei niedrigen template-Konzentrationen, große Unterschiede in den

crossing points hervor 32. Neben Pipettierfehlern gehen statistisch erfassbare Schwankungen

der template-Konzentration bei der RT-Reaktion in die Berechnung der Unterschiede ein, so

dass die berechneten Faktoren des Transkriptionsunterschiedes mit großen Fehlern behaftet

sind 203. Fehler in der Vermessung der RNA vor dem Einsatz in die RT-Reaktion und

verschiedene Effizienzen der Reversen Transkriptase aufgrund der Sekundärstruktur der

RNA führen zu weiteren Unterschieden 32,86. Um diese Unterschiede zu normalisieren,

erfolgte eine Bestimmung der Konzentration der cDNA des housekeeping-Gens gapA, das

unabhängig von äußeren Bedingungen in jeder Zelle gleich transkribiert wird 32. Ohne

Normalisierung der Messwerte würden dann z. T. sehr große Transkriptionsunterschiede

vorgespiegelt, die tatsächlich auf unterschiedliche Konzentrationen von cDNA in der Probe

beruhen 86.

Bei dem housekeeping-Gen gapA handelt es sich um eines der am besten etablierten

Standards für die Normalisierung. Dieses Gen kodiert für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-

Dehydrogenase aus der Glykolyse und wird in jeder Zelle konstitutiv auf hohem Niveau

transkribiert 32. Fehler in der Bestimmung für ein Gen werden durch den Wert des

housekeeping-Gens normalisiert.

In die Berechnung des Transkriptionsunterschieds eines Gens wurde die Effizienz der

PCR-Reaktion miteinbezogen, da die Effizienz zweier Reaktionen selten identisch ist 86.

Kleine Veränderungen in der Effizienz bedingen einen großen Unterschied in den

berechneten Werten, weshalb die Bestimmung der Effizienz der PCR-Reaktionen eine der

größten Fehlerquellen darstellt 203. Theoretisch ist ein Wert der Effizienz größer als zwei nicht

möglich. Ergaben sich Werte größer als zwei und bestätigten sich diese in allen drei

voneinander unabhängigen Versuchen, wurden sie dennoch zur Berechnung verwendet.

5.7 Auswirkungen von pharmazeutischen Substanzen auf den Efflux

Im Hinblick auf die Regulation von MarA, SoxS oder Rob bzw. der Strukturgene der

Effluxsysteme sind bisher erst wenige Substanzen aus der Umwelt bekannt, die die

Expression beeinflussen. So induziert Salizylat in therapeutisch genutzten Konzentrationen

die Expression von MarA durch eine Aufhebung der MarR-Repression 2,189, während

Diskussion 154

Paraquat durch die Oxidation von SoxR die Expression von SoxS fördert. Rob wird durch

Decanoat und einige unkonjugierte Gallensäuren aktiviert 243. Zudem wird seine Expression

auf Transkriptionsebene durch SoxS beeinflusst 197.

Außerdem verursacht Ethanol, „pine oil“, Naphthochinolone (Plumbagin), einige Gewürze,

Haushaltsprodukte und Gallensalze (als mögliche natürliche Induktoren)

Efflux-Phänotypen 177,202,238,258,283 und rufen z. T. einen MAR Phänotyp hervor. Im Falle von

Salizylat ist die molekulare Wirkungsweise eines Induktors auf den Uptake/Efflux-Komplex

weitgehend aufgeklärt 47. Salizylat inaktiviert den Repressor MarR und verhindert dessen

Bindung an die Operator-Region des marRAB-Operons. Infolge der dadurch gesteigerten

Produktion des globalen Regulators MarA kommt es zu einer Verringerung der Produktion

von Membranproteinen, wie OmpF und möglicherweise OmpC 235,245, und einer

gleichzeitigen gesteigerten Expression von AcrAB, was zu einer verringerten Akkumulation

von Antibiotika in der Zelle führt 177. Die von Salizylat induzierte OmpF-Reduktion wird durch

die verstärkte Transkription der antisense-RNA micF gesteuert, deren Interaktion mit der

ompF-mRNA die Translation verhindert 235,245. Neben AcrAB-TolC wird zumindest die

Transkription der Gene zweier weiterer MDR-Efflux-Pumpen (emrAB und emrKY) in E. coli

von Salizylat, sowie zusätzlich von Tetrazyklin und Chloramphenicol induziert 170,279.

Die gesteigerte Expression von MarA und AcrAB bei Anwesenheit von Salizylat konnte auch

in dieser Arbeit über RT-PCR nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass es zu einer 3-

fachen Expressionssteigerung von AcrAB in Abhängigkeit von der Salizylatkonzentration

kommt. Die Expression von MarA konnte durch ansteigende Mengen an Salizylat erhöht

werden. Aufgrund der Regulationsverhältnisse war eine Erhöhung der Transkription von

acrAB bei erhöhter Transkription von marA zu erwarten.

Desweiteren konnte eine 1,5–2,5-fache Steigerung der relativen Genexpression (ratio) von

acrAB nach Induktion mit Paracetamol oder Ketoprofen in dieser Arbeit gezeigt werden.

Nach Induktion mit Paracetamol lag die relative Genexpression von acrAB bei einem Wert

von 2,5 und nach Induktion mit Ketoprofen ergab sich der Wert 1,5. Diese Werte stellen

keinen signifikanten Anstieg der Genexpression dar, da dieser Transkriptionsunterschied an

den zur Berechnung verwendeten Effizienzen (> 2) liegen kann. Auch Pipettierfehlern und

Schwankungen in der template Konzentration können einen scheinbaren Anstieg der

Expression zur Folge haben 203. Die 1,5-fache Steigerung der Genexpression nach Induktion

mit 70 %igem Ethanol war nicht überraschend, da diese Beobachtung bereits in der Literatur

beschrieben ist 115,177.

Der Anstieg der Genexpression von marRA durch Ibuprofen, Ketoprofen oder Paracetamol

wird wahrscheinlich nicht durch die jeweilige Substanz selbst ausgelöst, sondern durch das

Lösungsmittel 100 %iger Ethanol. Man sieht sowohl bei Ibuprofen, Ketoprofen und

Diskussion 155

Paracetamol als auch bei 100 % Ethanol als Induktor einen bis zu 7-fachen Anstieg der

Genexpression.

Auch bei acrD konnte durch Gabe von ASS, Paracetamol und Ibuprofen ein Anstieg der

Genexpression beobachtet werden. Dieser wurde vermutlich durch das jeweilige

Lösungsmittel - bei ASS 70 %iger Ethanol, bei Paracetamol und Ibuprofen 100 %iger

Ethanol - verursacht, da auch nach Induktion mit Ethanol eine Expressionssteigerung zu

beobachten war.

Die Ergebnisse der RT-PCR von pCC1-robPr-gfp sind aufgrund der Probleme bei der

Etablierung des Systems zweifelhaft. Starke Schwankungen in der Effizienz können zu

einem scheinbaren Anstieg oder Abfall der Genexpression führen 203.

Die Wachstumsuntersuchungen von E. coli TM EPI 300-Stämmen mit den pCC1-

Reportergen-Konstrukten wurden durchgeführt, da die Bindung von Regulationsfaktoren an

den Promotor auf dem Reportergen-Plasmid eine Veränderung der Regulation des

chromosomalen Promotors zur Folge haben kann. Dadurch kann es zu Veränderungen in

der Genexpression kommen. Diese Veränderung kann sich im Wachstumsverhalten von

E. coli TM EPI 300 bemerkbar machen. Bei den E. coli TM EPI 300-Stämmen mit pCC1-

acrABPr-gfp, mit pCC1-acrDPr-gfp, mit pCC1-marRAPr-Tgfp und mit pCC1-robPr-Tgfp

zeigte sich im nicht-induzierten Zustand kein Unterschied im Wachstumsverhalten. Dieses

Ergebnis lässt die Vermutung zu, dass durch die zusätzliche Bindungsstelle für

Regulationsfaktoren keine Veränderung der Expression von Genen, die mit dem

Wachstumsverhalten in Verbindung stehen, verursacht wurde. Die Zugabe von

Azetylsalizylsäure, Ibuprofen, Ketoprofen, Paracetamol, 70 %igem Ethanol und 100 %igem

Ethanol zeigte bei allen vier E. coli TM EPI 300-Stämmen (mit pCC1-acrABPr-gfp, mit pCC1-

acrDPr-gfp, mit pCC1-marRAPr-Tgfp und mit pCC1-robPr-Tgfp) eine Hemmung des

Wachstums. In der Reihenfolge 70 %iger Ethanol, 100 %iger Ethanol, Paracetamol,

Ketoprofen, Ibuprofen und Azetylsalizylsäure nahmen die Wachstumsraten ab. Die stärkere

Abnahme der Wachstumsrate bei Zugabe von Paracetamol, Ketoprofen, Ibuprofen und

Azetylsalizylsäure ist auf die jeweilige Reinsubstanz zurückzuführen, da die Zugabe von

70 %igem oder 100 %igem Ethanol zu einer geringen Veränderung der Wachstumskurve

führt.

5.8 Auswirkung von unterschiedlichen Salizylatkonzentrationen auf Virulenz und Adhärenz der E. coli-Stämme 1173 und 1267

Bei diesen beiden E. coli-Stämmen handelte es sich um klinische Isolate, die aus einem

Patienten nach Antibiotikatherapie gewonnen wurden. Das erste Isolat wird als Stamm 1173

bezeichnet, das zweite als Stamm 1267. Bei der Resistenzbestimmung wiesen die beiden

Diskussion 156

Stämme erhöhte MHK-Werte gegenüber Fluorchinolonen auf. Die Sequenzierung der Gene

gyrA und parC ergab Veränderungen der Topoisomerasen, welche zu einer MHK-Erhöhung

auf 16 mg/l führen können 166. Die MHK-Werte gegenüber allen Fluorquinolonen des

Stammes 1267 liegen um ein Vielfaches höher gegenüber den Werten von 1173. Der

E. coli-Stamm 1173 zeigt im Vergleich zum sensiblen Kontrollstamm ATCC 25922 eine

erhöhte MHK bei allen Antibiotika ausgenommen Imipenem, Chloramphenicol und

Rifampicin. Zwischen den einzelnen klinischen Isolaten bestehen die größten Unterschiede

in der MHK bei Fluorquinolonen, Chloramphenicol und Doxycyclin.

Das E. coli-Isolat 1267 zeigte im Vergleich zu 1173 in Gegenwart von Cyclohexan ein

stärkeres Wachstum. Der Kontrollstamm E. coli ATCC 25922 zeigte kein Wachstum in der

Anwesenheit von Cyclohexan. Microarray- und RT-PCR-Daten zeigten bei Stamm 1267 im

Vergleich zu Stamm 1173 eine erhöhte Transkription von marA und folglich eine verringerte

Transkription von ompF 284.

Eine induzierende Wirkung von Salizylat auf den Efflux ist bereits in der Literatur

beschrieben. Salizylat inhibiert den Repressor MarR. Als Folge wird der globale Regulator

MarA verstärkt exprimiert 47. Dies wiederum führt zu einer verringerten Expression von

OmpF 245 und zu einer verstärkten Expression von AcrAB 47. Die reprimierende Wirkung von

Salizylat auf OmpF wird bei E. coli 1267 durch die Überexpression von MarA verstärkt. Diese

beiden Tatsachen führen bei E. coli 1267 im Vergleich zum Stamm 1173 zu einer stärkeren

Reduktion der Anzahl der OmpF-Porine in der äußeren Membran 104,235,245. Dadurch wird der

Einstrom von Salizylat verringert und somit sein induzierender oder reprimierender Einfluss

auf die Genexpression gesenkt. Die Überexpression von AcrAB hat eine Steigerung des

Efflux zur Folge. Dadurch wird der Ausstrom von Salizylat gefördert und wiederum die

Wirkung von Salizylat auf die Genexpression verringert. Aus diesen Gründen zeigte sich

wahrscheinlich die Unabhängigkeit der Adhärenz von der Salizylatkonzentration bei E. coli

1267. Für die Hypothese, dass sowohl Salizylat als auch die MarA-Überexpression eine

Wirkung auf die Adhärenz haben, spricht auch die Tatsache, dass sowohl E. coli 1267 als

auch E. coli 1173 gleiche Adhärenz im nicht-induzierten Zustand - ohne Salizylatzugabe -

zeigten. Dieses Ergebnis spricht auch gegen einen starken Einfluss des LB-Mediums auf die

Expression von OmpF. LB-Medium reprimiert die lrp-Genexpression um das 4–10-fache.

Das Gen lrp kodiert für das leucine responsive regulatory protein (Lrp). Dieses Protein hat

sowohl eine Wirkung auf OmpF, als auch auf die Fimbriengencluster fim 25, pap 27,292und

sfa 293. In Leucin-reichen Medien, wie z. B. im LB-Medium wird die Genexpression von lrp

durch Leucin reprimiert. Diese Repression hat eine Verringerung der Genexpression von den

drei Fimbriengenclustern und von ompF zur Folge 33. Da sich im nicht-induzierten Zustand

sowohl bei E. coli 1267 als auch bei E. coli 1173 gleiches Adhärenzverhalten zeigt, spielt die

Diskussion 157

Regulation durch Lrp bei den Fimbriengene und bei ompF wahrscheinlich eine geringe Rolle.

Hätte Lrp eine starke Wirkung auf Fimbriengene und ompF, so müsste auch im

nicht-induzierten Zustand ein Unterschied zwischen dem MarA-überexprimierenden

E. coli 1267 und E. coli 1173 zu sehen sein.

Von Salizylat ist auch eine Wirkung auf die Flagellen- und Fimbrienbildung bekannt. Durch

Fimbrien, Außenmembranproteine (outer membrane proteins, OMPs) und andere Adhäsine

wird E. coli die Adhärenz an Epithelien ermöglicht 149.

P-Fimbrien werden häufig mit akuter, unkomplizierter Nierenbeckenentzündung in

Verbindung gebracht. Källenius et al. 126 konnten diese bei über 90 % der Stämme

nachweisen, die dieses Krankheitsbild verursachten, während bei den Krankheitsbildern

„Zystitis“ oder „asymptomatische Bakteriurie“ nur jeweils 20 % der Stämme diese Fimbrienart

besaßen. Das Gencluster der P-Fimbrien besteht aus elf Genen 127. Für die Bindung an die

αGal-β-(1-4)-Gal-haltigen Glykolipidrezeptoren der Uroepithelzellen und Endothelzellen der

Nieren ist die PapG-Untereinheit verantwortlich 311. Aufgrund der Tatsache, dass kein Gen

aus dem P-Fimbriengencluster über den durchgeführten Microarray auf Anwesenheit und auf

Expressionsstärke hin überprüft werden konnte, wurde auf eine weitere Untersuchung dieser

Gene bei E. coli 1173 und E. coli 1267 verzichtet.

Nicht nur bei UPEC, sondern auch bei einer Vielzahl von anderen Enterobakterien werden

Typ-1-Fimbrien häufig gefunden. Typ-1-Fimbrien sind für die Bindung an Rezeptoren des

Harntrakts und des Gastrointestinaltrakts verantwortlich 271. Im Harntrakt ist dieser

Fimbrientyp Voraussetzung für Persistenz und Wachstum in dieser Nische 217. Die

FimH-Untereinheit ist für die Bindung an mannosehaltige Rezeptoren verantwortlich.

Punktmutationen innerhalb von fimH können die Bindungskapazität und somit die Virulenz

der Erreger steigern 9. Holden et al. konnten zeigen, dass die Expression von Genen des

Typ-1-Fimbriengenclusters (bestehend aus den Genen fimA–fimI) durch PapB, eine

Untereinheit des P-Fimbriengenclusters, bei normaler Wildtyp-Expression inhibiert wird 109.

Da fimH über Microarray weder bei E. coli 1173 noch bei E. coli 1267 nachgewiesen werden

konnte, liegt die Vermutung nahe, dass die Expression von PapB zu einer Inhibierung der

fim-Genexpression führt. Aus diesem Grund wurde das fim-Gencluster in die Untersuchung

des Zusammenhangs zwischen Adhärenz und Salizylatgabe nicht mit einbezogen.

Neben den P-Fimbrien und den Typ-1-Fimbrien werden noch so genannte S-Fimbrien (Sfa)

bei uropathogenen E. coli gefunden. Das S-Fimbriengencluster besteht aus neun Genen

(sfaA–sfaH und sfaS). S-Fimbrien können bei E. coli aus verschiedenen Habitaten

nachgewiesen werden 220. Ihre sialinsäurehaltigen Rezeptoren finden sich nicht nur im

Harntrakt, sondern auch im Gehirn, so dass S-Fimbrien auch häufig bei E. coli-Isolaten der

Diskussion 158

Neugeborenenmeningitis nachgewiesen werden 101. Eine geringe klinische Relevanz zeigt

sich bezüglich Nierenbeckenentzündungen und Harnwegsinfektionen 156.

Neben der geringen Repression der sfa-Genexpression durch das LB-Medium 33,293 ist auch

eine inhibierende Wirkung von β-Lactoglobulin auf die Expression von Sfa bekannt 221.

Da die Gene sfaD und sfaE sowohl bei E. coli 1173 als auch bei E. coli 1267 im Microarray

nachweisbar waren, wurden sie in die nähere Betrachtung des Zusammenhangs von

Adhärenz und Salizylatgabe mit einbezogen. Die Gene sfaD und sfaE sind in die Biogenese

der S-Fimbrien involviert. Bei der Zugabe von Salizylat in unterschiedlichen Konzentrationen

zeigte sich bei E. coli 1173 keine Veränderung in der Genexpression. Dies lässt vermuten,

dass die sfa-Genexpression von Salizylat nicht beeinflusst wird und somit nicht

verantwortlich ist für die Abnahme der Adhärenz von E. coli 1173 an HT-29-Zellen.

Auch die Motilität von E. coli spielt eine wichtige Rolle bei der Adhäsion, Biofilmformierung

und Kolonisation von einem Wirt oder Zielorgan 230. Für die Flagellensynthese werden fast

50 Gene und viel Energie benötigt 144. Daher unterliegt die Synthese von Flagellen einer

strengen Regulation durch Außenfaktoren wie z. B. Temperatur, Osmolarität, pH oder

Interaktion des E. coli mit dem Wirt 162,178,261,272. Das Hauptoperon für die Regulation der

Flagellensynthese bei E. coli ist flhDC, welches für den Transkriptionsaktivator FlhD2C2

kodiert 143. Dieser Aktivator beeinflusst die Expression der Gene für die Regulation des

Flagellenaufbaus und für die Flagellenmotorproteine motA und motB, sowie diejenigen

Gene, die für die Chemotaxis zuständig sind 144. FlhD2C2 hat auch eine Wirkung auf das

Gen fliA, welches für den Faktor σ28 kodiert. Dieser Faktor wird speziell für die Expression

von Flagellenproteinen (Flagellin), Motor- und Chemotaxisproteinen benötigt 213. Die

Expressionsabnahme von fliA bei E. coli 1267 hängt wahrscheinlich mit der Überexpression

von marA zusammen. Bei Salmonella choleraesuis konnte neben dieser Beobachtung auch

eine Abnahme der Adhärenz an Caco-2-Zellen gezeigt werden. Diese wurde durch eine

Abnahme der Motilität und der Flagellinproduktion verursacht

(http://proquest.umi.com/pqdlink?did=1115102061&Fmt=7&clientI %20d= 79356&RQT=309&VName=PQD).

Aufgrund der Abnahme der fliA-Expression, verursacht durch die MarA-Überexpression bei

E. coli 1267 (Daten Microarray), wäre im Vergleich zu E. coli 1173 neben einer Abnahme der

Adhärenz auch eine Abnahme in der motA- und motB-Expression zu erwarten, da sowohl

motA und motB als auch fliA unter der Regulation von flhDC stehen. Bei motA zeigte sich

eine Abnahme der Expression bei dem Stamm 1267 im Vergleich zu dem Isolat 1173. Keine

Veränderung der Genexpression zeigte sich bei motB. Aufgrund der Tatsache, dass motA

und motB unter gleicher Kontrolle stehen, ist anzunehmen, dass es auch bei motB zu einer

Transkriptionsabnahme gekommen ist, die im Microarray aufgrund einer Ungenauigkeit nicht

beobachtet wurde.

Diskussion 159

Bei E. coli 1173 konnte die Beobachtung gemacht werden, dass durch steigende

Salizylatkonzentrationen die MarA-Expression zunimmt und die Adhärenz abnimmt. Bei

E. coli 1267 kam es trotz der Überexpression von MarA und der Gabe von Salizylat im

Zelladhäsionsassay zu keiner Verringerung der Adhärenz. Dieses Ergebnis legt nahe, dass

die Ausbildung von Adhärenz unter der Kontrolle einer komplexen Regulation steht. MarA

verursacht wahrscheinlich als eine Art Repressor eine Abnahme der Adhärenz.

In Bezug auf die Flagellensynthese konnte Kunin et al. zeigen, dass in der Anwesenheit von

Salizylat und der dadurch verursachten Steigerung der MarA-Expression keine

Flagellinproduktion stattfindet 148.

Die LightCycler®-Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit zeigten, dass in E. coli 1173

Salizylat keine Auswirkung auf die Genexpression von motB hat. Daher ist motB vermutlich

nicht für die Abnahme der Adhärenz – durch Salizylat ausgelöst – verantwortlich.

Es besteht nicht nur ein Zusammenhang zwischen Salizylat und der Fimbrien- oder

Flagellenproduktion, sondern auch zwischen Salizylat und Virulenzfaktoren. Salizylat

verursacht bei Klebsiella pneumoniae eine Verminderung der Proteinproduktion für die

Polysaccharid-Kapsel 67. Bei Staphylococcus aureus bewirkt Salizylat eine Reduktion der

hlyA-Expression 150. HlyA kann auch bei E. coli im Genom vorhanden sein. Die

phänotypische Testung der E. coli-Isolate 1173 und 1267 auf Salizylat-haltigem Blutagar

zeigte keine Hämolyse. Dies lässt vermuten, dass es sich um eine schwache Induktion der

hlyA-Transkription handelt oder dass das Gen hlyA bei den Isolaten nicht vorhanden ist.

Eine weitere mögliche Ursache für die geringe Expression oder das Fehlen des hlyA-Gens

bei E. coli 1173 und bei E. coli 1267 ist, dass eine Interferenz zwischen den

Regulationsmechanismen für die Produktion von HlyA und HlyE vermutet wird. Aus diesem

Grund können nicht beide Gene im E. coli-Chromosom vorhanden sein 133. Das Gen hlyA

konnte über den Microarray nicht ausgetestet werden. Die Untersuchung des Gens hlyE im

Microarray zeigte eine deutliche Expression von hlyE sowohl bei E. coli 1173 als auch bei

E. coli 1267. Das Gen hlyE kodiert für ein Poren-bildendes Toxin und kommt in

E. coli 12,63,83,173,218,219,299 und in den Salmonella enterica Serovaren Typhi und Paratyphi

vor 174. Ein funktionelles hlyE-Gen ist auch in dem nicht-pathogenen E. coli K12 vorhanden,

allerdings wird es unter normalen Laborbedingungen nur auf niedrigem Niveau

produziert 173,304. Erst durch eine verstärkte Expression kann HlyE in Epithelzellen die

Ca2+-Signaltransduktion beeinflussen, Apoptose von menschlichen und von aus der Maus

stammenden Makrophagen induzieren und Hämolyse von menschlichen Erythrozyten

verursachen 151,269,270. Die Zugabe von Salizylat in unterschiedlichen Konzentrationen

verursachte keine Veränderung in der hlyE-Genexpression von E. coli 1173. Dieses

Ergebnis lässt vermuten, dass Salizylat keine Wirkung auf die Expression von HlyE hat.

Diskussion 160

5.9 Auswirkung von Pharmazeutika auf die MHK gegenüber Gentamicin, Norfloxacin und Ampicillin

Bei Gentamicin handelt es sich um ein Antibiotikum aus der Gruppe der Aminoglykoside.

Gentamicin ist ein sekundäres Stoffwechselprodukt von Micromonospora. Über die

Blockierung der A-Stelle am Elongationsribosom wird die Bildung des für die

Proteinbiosynthese notwendigen Initiationskomplexes verhindert und somit kommt es zu

einer Störung in der Translation 141. In einer Deletionsstudie konnte gezeigt werden, dass in

E. coli die Expression der RND-Pumpe (resistance-nodulation-division) acrD für die

Resistenz gegen Aminoglykoside wie Gentamicin verantwortlich ist 244.

Bei der Zugabe von Azetylsalizylsäure zeigte sich bei den beiden Laborstämme

E. coli DH10B und E. coli TOP10 kein Wachstum auf der Platte. Das Lösungsmittel von

Azetylsalizylsäure war Ethanol. Da auf der Platte mit Ethanol in unterschiedlichen

Konzentrationen Wachstum zu sehen war, liegt die Vermutung nahe, dass für das

Ausbleiben des Wachstums die Reinsubstanz Azetylsalizylsäure verantwortlich ist. Sowohl

bei Wildtyp E. coli als auch bei Laborstämmen konnte dieses Phänomen des schlechteren

Wachstums in Flüssigkultur beobachtet werden. Vermutlich führt die Induktion des Efflux

durch Salizylat zu einer hauptsächlich auf Effluxpumpen ausgerichteten Proteinbiosynthese.

Dadurch verringert sich wahrscheinlich die Wachstumsrate aufgrund von Proteinmangel.

Die Zugabe von Paracetamol, 100%igem Ethanol oder 70%igem Ethanol führte zu einer

Erhöhung der Gentamicin-MHK um eine Titerstufe. Da die Auswertung des Etest® visuell

erfolgte, sind Schwankungen um eine Titerstufe möglich.

Eine MHK-Erhöhung von fünf Titerstufen zeigte sich in der Anwesenheit von Ibuprofen.

Wahrscheinlich handelt es sich bei Ibuprofen um eine Substanz, die auf die Genexpression

der Effluxpumpe acrD eine induzierende Wirkung hat. Diese Vermutung konnte auch durch

die Ergebnisse des Screening-Systems bestätigt werden. Die Inkubation mit Ibuprofen

verursachte eine eindeutige Fluoreszenz bei dem das Konstrukt pUC-acrDPr-gfp

enthaltenden E. coli. Auch eine Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Ibuprofen-

konzentration konnte beobachtet werden. Bei 1–2 mM Ibuprofen zeigte sich keine

Fluoreszenz. Von 3–5 mM Ibuprofen war eine eindeutige Fluoreszenz zu sehen, ab 6 mM

konnte aufgrund von ausbleibendem Wachstum die Fluoreszenz nicht bestimmt werden.

Auch im LightCycler® war eine Steigerung der gfp-Expression bei pCC1-acrDPr-gfp durch

die Zugabe von Ibuprofen zu beobachten. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass

Ibuprofen ein Induktor für acrD ist oder eine Wirkung auf das Regulationssystem von acrD

hat.

Diskussion 161

Norfloxacin zählt wie Ciprofloxacin zu der Gruppe der Fluorchinolone. Es hemmt neben der

Topoisomerase II (DNA-Gyrase) auch die Topoisomerase IV. Resistenz von E. coli gegen

Norfloxacin wird durch die Effluxpumpe NorE vermittelt 46,314. Die minimale

Hemmkonzentration von Norfloxacin veränderte sich nicht oder nur um eine Titerstufe durch

die Zugabe von 70 %igem Ethanol oder 100 %igem Ethanol. Im Screening-System konnte

nur unter der Verwendung eines Translationsverstärkers ein induktiver Effekt von Ethanol auf

die gfp-Expression bei pUC-norEPrII-Tgfp beobachtet werden. Diese Ergebnisse lassen

vermuten, dass Ethanol auf die Expression von norE einen geringen Einfluss hat. Daher führt

die Anwendung von Ethanol wahrscheinlich nicht zu einer klinisch relevanten

MHK-Erhöhung. Die Minimale Hemmkonzentration gegen Norfloxacin wurde von

Paracetamol um ein dreifaches erhöht. Die Auswertung der Ergebnisse des visuellen

Screening-Systems zeigte ebenfalls, dass Paracetamol eine induzierende Wirkung auf die

gfp-Expression des Plasmids pUC-norEPrII-Tgfp hat. Da die Verwendung von Ethanol zur

Induktion des norE-Promotors eine nicht signifikante Wirkung zeigte, ist wahrscheinlich

Paracetamol für die MHK-Erhöhung verantwortlich. Die induzierende Wirkung von

Paracetamol kann eine direkte Wirkung auf den Promotor haben oder die Regulatoren des

norE-Promotors beeinflussen.

Bei Ibuprofen zeigte sich eine MHK-Erhöhung gegenüber Norfloxacin. Die minimale

Hemmkonzentration wurde um ein vierfaches erhöht. Die Vermutung, dass Ibuprofen eine

induzierende Wirkung auf den norE-Promotor hat konnte auch durch die Ergebnisse des

Screening-Systems bestätigt werden. Mit Ibuprofen war eine eindeutige Fluoreszenz bei dem

das Konstrukt pUC-norEPrII-Tgfp enthaltenden E. coli zu beobachten.

Da Ibuprofen sowohl eine Wirkung auf die MHK gegen Norfloxacin als auch gegen

Gentamicin hat, besteht die Möglichkeit, dass Ibuprofen eine Wirkung auf einen

gemeinsamen Regulator von norE und acrD hat.

Coban et al. machten bei Salmonella enterica die Beobachtung, dass ein Defekt in AcrAB

oder SoxRS zu keiner Veränderung der MHK gegenüber Chinolonen führt, wenn Ibuprofen

als Induktor verwendet wird (Ausnahme Levofloxacin). Bei Wildtyp-E. coli zeigte sich ein 2-8-

facher Anstieg der MHK gegenüber Chinolonen durch Zugabe von Ibuprofen 43. SoxS ist ein

positiver Regulator des mar-Operons. Durch die Bindung von SoxS an marO wird die

marRAB-Transkription aktiviert. Die Folge ist eine gesteigerte Expression des

Effluxpumpensystems AcrAB-TolC 97. Dadurch kommt es zu einer Erhöhung der MHK

gegenüber Chinolonen. Aufgrund der Homologie von acrB zu acrD 207,247 kann die

Aktivierung der Transkription von marRAB eine Steigerung der AcrD-Expression

Diskussion 162

verursachen. Da AcrD laut einer Deletionsstudie für Aminoglykosidresistenz verantwortlich

ist, folgt der AcrD-Expressionssteigerung eine Erhöhung der MHK gegenüber Gentamicin 244.

Die Regulation der norE-Transkription bei E. coli ist bisher in der Literatur nicht beschrieben.

Eine weitere Ursache für die Änderung der minimalen Hemmkonzentrationen kann die

Wirkung von Ibuprofen auf die Expression des Außenmembranproteins OmpF sein. Eine

verringerte Expression von OmpF führt zu einer Verringerung der intrazellulären Menge an

Gentamicin oder Norfloxacin. Dies hat allerdings nur eine geringe Veränderung der MHK zur

Folge 48. Daher ist es wahrscheinlich, dass Ibuprofen nicht nur auf die ompF-Expression

einwirkt, sondern auch Gene in deren Expression beeinflusst, die im Efflux und in der

Membranpermeabilität eine Rolle spielen.

Die minimale Hemmkonzentration gegenüber Ampicillin veränderte sich bei der Zugabe von

Paracetamol, 100 %igem Ethanol und 70 %igem Ethanol um eine Titerstufe. Diese

MHK-Veränderung ist aufgrund des visuellen Auswertungsverfahrens als nicht signifikant

einzustufen.

Ausblick 163

6 Ausblick

Die Kolonisation des Rattendarms mit E. coli-Stämmen, die durch ein Reportergen (gfp)

chromosomal markiert sind, bietet die Möglichkeit eines direkten phänotypischen und

genotypischen Vergleichs des sensiblen Ausgangsstammes mit einem rekultiviertem Isolat,

das im Laufe einer Antibiotika-Therapie im Kontext der Normalflora diese Empfindlichkeit

verloren hat.

Aufgrund des Verlustes der gfp-Reportergenkassette bei E. coli-57 nach Durchlauf der

Darmpassage unter Antibiose muss ein Wildtypstamm mit einem anderen Reportergen z. B.

dsred chromosomal markiert werden.

Mit derartig markierten Stämmen kann die Auswirkung unterschiedlicher Dosierungs-

Schemata des Antibiotikums und die Wirkung von z. B. Aspirin auf die Resistenzentwicklung

in vivo nachvollzogen werden.

Ciprofloxacin gehört zum Substratspektrum von MDR-Transport-Systemen in E. coli. Diese

Effluxsysteme spielen sowohl bei der Ausprägung als auch bei der Entstehung von

Fluorchinolon-Resistenz eine wichtige Rolle. Dementsprechend richtet sich ein

zunehmendes Interesse auf die Regulation solcher Efflux-Systeme. Diese Arbeit zielte auf

die Identifikation von induktiven Substanzen, die eine verstärkte Expression von spezifischen

MDR-Transportern auslösen. So generierte Daten bilden die Grundlage für den langfristigen

Erhalt der antimikrobiellen Aktivität vorhandener Fluorchinolone und eine Vermeidung von

Resistenzentwicklung. Der Zusammenhang zwischen der induktiven Wirkung von Ibuprofen

(5 mM) auf die Transkription von acrD und norE und die durch Ibuprofen verursachte MHK-

Steigerung sollte unter Verwendung von Deletionsmutanten genauer untersucht werden.

Die Abnahme der Adhärenz von E. coli 1173 an HT-29 bei steigender Salizylatkonzentration

(0 mM–20 mM) sollte im Vergleich zu der durch Salizylat unveränderten Adhärenz von

E. coli 1267 mittels Transkriptom-Analyse untersucht werden. Die subtraktive

Transkriptomanalyse solcher sehr eng verwandter Stämme mittels Microarray ermöglicht die

Identifizierung quantitativer Veränderungen im Transkriptionsmuster. Da sich bei einer

Salizylatkonzentration von 20 mM der Adhärenzunterschied am stärksten zeigte, sollte die

für den Microarray benötigte RNA aus E. coli 1173 und E. coli 1267 isoliert werden, die mit

20 mM Salizylat induziert wurden.

Verzeichnisse 164

7 Verzeichnisse

7.1 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung A Absent Abb. Abbildung acrB acrB-Gen

acrABPr Promotor der acrAB-Gene acrEFPr Promotor der acrEF-Gene acrDPr Promotor des acrD-Gens Amp Ampicillin ara Gene des araBAD-Operons

araBPr Promotor des araBAD-Operons ASS Azetylsalizylsäure ATCC American Type Culture Collection

ATP Adenosintriphosphat BLAST Basic Linear Alignment Search Tool

bp Basenpaar BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. circa CFU colony forming units

Cip Ciprofloxacin CIP Alkalische Phosphatase cm Zentimeter cp crossing point d. h. das heißt DNA Desoxyribnukleinsäure DABCO 1,4-DiAzaBiCyclo[2.2.2]oktan dATP desoxyAdenintriphosphat dCTP desoxyCytosintriphosphat ddUTP didesoxyUraciltriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat dGTP desoxyGuanidintriphosphat DNA desoxyribonucleic acid

dNTPS Nukleotid-Triphospate dsDNA double strand DNA dTTP desoxyThymidintriphosphat E Effizienz E. coli Escherichia coli

EAEC Enteroaggregative E. coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat EHEC Enterohämorrhagische E. coli

EPEC Enteropathogene E. coli

ETEC Enterotoxische E. coli

evtl. eventuell FACS Fluorescence Activated Cell Sorter

Gati Gatifloxacin HPLC High Performance Liquid Chromatography gDNA genomische DNA Gfp Green fluorescent protein

ggf. gegebenenfalls h Stunde

Verzeichnisse 165

Abkürzung Bedeutung HK Housekeeping-Gen hlyE hlyE-Gen H2O Wasser hsp Gene für Hitze-Schock-Proteine hspPr Promotor des Hitze-Schock-Gene HU heat unstable nucleoid protein HUS Hämolytisch-urämisches Syndrom H-NS histone-like nucleoid structuring protein IHF Integration Host Factor kb Kilobasenpaare KBE Koloniebildende Einheit Km Kanamycin lac Gene des Lactose-Operons lacPr Promotor des lac-Operons LB Luria-Bertani LPS Lipopolysaccharidschicht LT hitzelabil M Molar marA marA-Gen marRAPr Promotor des marRA-Operons MOI Multiplicity Of Infection MPC mutant prevention concentration mdfAPr Promotor des mdfA-Gens MDR multi drug resistance mdtHPr Promotor des mdtH-Gens mdtMPr Promotor des mdtM-Gens MHK Minimale Hemmkonzentration MIAME Minimum Information about a microarray experiment min Minute mm Millimeter MMR mismatch repair system MOPS Morpholinethan Sulfonsäure motB motB-Gen MSW mutant selection window NaCl Natriumchlorid pg, ng, µg, mg, g Pico-, Nano-, Mikro-, Milli-, Gramm pl, nl, µl, ml, l Pico-, Nano-, Mikro-, Milli-, Liter norEPr Promotor des norE-Gens OD Optische Dichte ORI origin of replication

ORF open reading frame

OST Organic Solvent Tolerance P Present PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PCR-Prod. PCR-Produkt PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis

pH pondus hydrogenii (negativer, dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration)

pIVET plasmid in vivo expression technology

Pr Promotor QRDR Quinolone resistance determining region RIMMH Regensburger Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene RNA Ribonukleinsäure RND resistance, nodulation, cell division

Verzeichnisse 166

Abkürzung Bedeutung rob rob-Gen robPr Promotor des rob-Gens RS restriction-site RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transcription-PCR SDS Natriumdodecylsulfat sfaD/E sfaD/E-Gen sec Sekunde sog. so genannt soxSPr Promotor des soxS-Gens ssRNA single strand RNA ST hitzestabil Tab. Tabelle Taq-Polymerase Thermophilus aquaticus-DNA-Polymerase TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan u und U Units U/min Umdrehungen pro Minute ÜN über Nacht UV Ultra Violett V Volt vs versus w/v weight per volume X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indoyl-D-galaktopyranosid z. B. zum Beispiel z. T. zum Teil

Verzeichnisse 167

7.2 Literaturverzeichnis

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Anhang 189

8 Anhang

8.1 Microarraydaten

8.1.1 Effluxsysteme

Tab.34: Transkription von Genen und Regulatoren der Effluxpumpen nach Microarray-Hybridisierung im Stamm E. coli 1267 verglichen mit Stamm E. coli 1173. Die Tabelle ist erstellt aus der Datei des Kompetenzzentrums für Fluoreszente Bioanalytik, Regensburg.

Pro

beS

et ID

1267

_vs_

1173

_Sig

nal

1267

_vs_

1173

_Det

ecti

on

1267

_vs_

1173

_Det

ecti

on

p-v

alu

e

1267

_vs_

1173

_Sig

nal

Lo

g R

atio

1267

_vs_

1173

_Fo

ld C

han

ge

1267

_vs_

1173

__C

han

ge

1267

_vs_

1173

_Ch

ang

e p

-val

ue

1173

_Sig

nal

1173

_Det

ecti

on

1173

_Det

ecti

on

p-v

alu

e

acrA_b0463_at 1031,2 P 0,000491 1,9 3,7 I 0,000002 304,9 P 0,001165

acrB_b0462_at 718,1 P 0,000613 1,3 2,5 I 0,000011 246,4 P 0,006575

acrD_b2470_at 72,6 A 0,069878 0,4 1,3 NC 0,196667 58,3 A 0,197123

acrF_b3266_at 27 A 0,345472 0,3 1,2 NC 0,520505 18,3 A 0,167138

acrR_b0464_at 97,9 P 0,000494 -0,6 -1,5 D 0,999996 150,7 P 0,000327

envR_b3264_at 18,2 P 0,034572 -0,7 -1,6 NC 0,971452 30,2 P 0,002693

baeR_b2079_at 77 A 0,127994 -0,1 -1,1 NC 0,5 90,4 A 0,230151

emrB_b2686_at 84,6 P 0,002693 1,1 2,1 I 0,00021 27,7 A 0,266065

evgA_b2369_at 47,7 P 0,000327 -1,6 -3,0 D 0,999999 137,1 P 0,000327

marA_b1531_at 2003,7 P 0,000491 4,5 22,6 I 0,000002 93,2 P 0,000491

cmr_b0842_at 79,1 P 0,000327 0 1,0 NC 0,5 79,5 P 0,000893

yegO_b2076_at 70,3 P 0,000893 -0,3 -1,2 NC 0,960677 93,4 P 0,001081

yceL_b1065_at 48,5 P 0,012921 -0,8 -1,7 NC 0,536288 101,3 P 0,004591

yjiO_b4337_at 52,4 P 0,003203 -0,3 -1,2 NC 0,5 50,1 P 0,011548

ydhE_b1663_at 67,3 P 0,003203 -0,2 -1,1 NC 0,5 79,2 P 0,013378

ompF_b0929_at 92,2 P 0,003799 -1,9 -3,7 D 0,999999 362,4 P 0,000403

rob_b4396_at 93,1 P 0,017732 -1,6 -3,0 D 0,999998 244 P 0,005504

sdiA_b1916_at 96,5 P 0,003815 0,4 1,3 NC 0,007414 56,9 P 0,006575

soxS_b4062_at 198,3 P 0,000735 0,3 1,2 NC 0,015005 159,4 P 0,000603

tolC_b3035_at 975,9 P 0,000327 1,3 2,5 I 0,000001 346,9 P 0,000403

Anhang 190

8.1.2 Differentielle Transkription

Tab.35: Differentiell transkribierte Gene und ORF im Stamm E. coli 1267 gegenüber E. coli 1173 mit I > 3 bzw. D < 3

Pro

beS

et ID

1267

_vs_

1173

_Sig

nal

1267

_vs_

1173

_Det

ecti

on

1267

_vs_

1173

_Det

ecti

on

p-v

alu

e

1267

_vs_

1173

_Sig

nal

Lo

g R

atio

1267

_vs_

1173

_Fo

ld C

han

ge

1267

_vs_

1173

__C

han

ge

1267

_vs_

1173

_Ch

ang

e p

-val

ue

1173

_Sig

nal

1173

_Det

ecti

on

1173

_Det

ecti

on

p-v

alu

e

clpB_b2592_at 77,5 P 0,009283 -3,2 -9,2 D 0,999998 793,4 P 0,000762

INM13X_II_5_at 0,5 P 0,028457 -2,5 -5,7 D 0,997902 10,2 P 0,026111

yjjM_b4357_at 58,9 P 0,000613 -2,4 -5,3 D 0,999998 296,3 P 0,000491

rbsD_b3748_at 199 P 0,000403 -2,3 -4,9 D 0,999999 741,7 P 0,000327

dppA_b3544_at 71,6 P 0,000944 -2,3 -4,9 D 0,999998 484,7 P 0,000491

yjfO_b4189_at 286,6 P 0,000327 -2,3 -4,9 D 0,999994 1543,4 P 0,000327

ybdQ_b0607_at 158,4 P 0,000494 -2,1 -4,3 D 0,999999 636,8 P 0,000403

yecI_b1902_at 69,8 P 0,005297 -2 -4,0 D 0,999999 243,3 P 0,001886

sseA_b2521_at 170 P 0,007298 -2 -4,0 D 0,999999 632,4 P 0,000603

yfiA_b2597_at 539,7 P 0,000327 -2 -4,0 D 0,999999 2085,2 P 0,000327

glgS_b3049_at 75,9 P 0,000327 -2 -4,0 D 0,999999 302,7 P 0,000327

ygfJ_b2877_at 49,5 P 0,000893 -1,9 -3,7 D 0,999998 194 P 0,000403

yjfN_b4188_at 155,3 P 0,012921 -1,9 -3,7 D 0,999983 564,6 P 0,005504

ybjW_b0873_at 50,5 P 0,007827 -1,8 -3,5 D 0,999998 171,3 P 0,000613

ynaF_b1376_at 223,2 P 0,000613 -1,8 -3,5 D 0,999998 801 P 0,000613

b2146_at 182,4 P 0,000491 -1,8 -3,5 D 0,999998 563,2 P 0,000491

mglB_b2150_at 134 P 0,001432 -1,8 -3,5 D 0,999997 498,1 P 0,000491

yhiI_b3487_at 98,4 P 0,000944 -1,8 -3,5 D 0,999922 325,2 P 0,000762

ybeL_b0643_at 217,9 P 0,000494 -1,7 -3,2 D 0,999999 693,4 P 0,000327

uspA_b3495_at 529,9 P 0,000327 -1,7 -3,2 D 0,999999 1595,8 P 0,000327

dctA_b3528_at 98,3 P 0,005297 -1,7 -3,2 D 0,999905 259,9 P 0,003203

araC_b0064_at 32,1 P 0,015454 -1,6 -3,0 D 0,999999 131,4 P 0,000893

yciD_b1256_at 99,2 P 0,000403 -1,6 -3,0 D 0,999999 314,2 P 0,000327

b1725_at 112,2 P 0,000327 -1,6 -3,0 D 0,999999 366,9 P 0,000327

melR_b4118_at 66,8 P 0,005504 -1,6 -3,0 D 0,999997 202,9 P 0,000944

yadG_b0127_at 241,8 P 0,000327 1,6 3,0 I 0,000016 89,2 P 0,002257

kdsA_b1215_at 234,5 P 0,000327 1,6 3,0 I 0,000002 72,9 P 0,002257

ribA_b1277_at 601,1 P 0,000491 1,6 3,0 I 0,000002 224,6 P 0,001165

yecS_b1918_at 147,1 P 0,001165 1,6 3,0 I 0,000019 114,4 P 0,015164

b2889_at 351,3 P 0,001886 1,6 3,0 I 0,000003 95 P 0,020444

yggJ_b2946_at 449,3 P 0,000327 1,6 3,0 I 0,000001 117,6 P 0,001081

yhdG_b3260_at 341,8 P 0,001081 1,6 3,0 I 0,000041 125,1 P 0,013378

tyrU_b3977_f_at 343,9 P 0,000491 1,6 3,0 I 0,000002 71,8 P 0,015164

Anhang 191

Pro

beS

et ID

1267

_vs_

1173

_Sig

nal

1267

_vs_

1173

_Det

ecti

on

1267

_vs_

1173

_Det

ecti

on

p-v

alu

e

1267

_vs_

1173

_Sig

nal

Lo

g R

atio

1267

_vs_

1173

_Fo

ld C

han

ge

1267

_vs_

1173

__C

han

ge

1267

_vs_

1173

_Ch

ang

e p

-val

ue

1173

_Sig

nal

1173

_Det

ecti

on

1173

_Det

ecti

on

p-v

alu

e

glyT_b3978_at 404,3 P 0,000327 1,6 3,0 I 0,000001 130,3 P 0,000603

8.2 Gelbilder

116414821515

19531882

27993639

8576742761064899

Spur 1 2 3 4

Abb. 39: Gelbild Plasmidisolierung aus E. coli-4 (Spur 1), E. coli-32 (Spur 2) und E. coli-57 (Spur3); Spur 4: Standard VII (Roche)

Anhang 192

992116414821515

19531882

27993639

8576742761064899

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Spur

1031900800700600500400

Abb. 40: Gelbild der Rep-PCR. Spur 1: Standard VII (Roche); Spuren 2–11: E. coli-Isolate aus dem Rattenkot; Spur 12: Standard VIII (Roche)

992116414821515

19531882

27993639

8576742761064899

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Spur

1031900800700600500

Abb. 41: Gelbild der Rep-PCR. Spur 1: Standard VII (Roche); Spuren 2–7: E. coli-Isolate aus dem Rattenkot; Spur 8: Positivkontrolle genomische DNA von E. coli-2685 mit #776 und #777; Spur 9: frei; Spur 10 und 11: pUC-araBPr-gfp mit #1116 und #1423 Spur 12: 100 bp DNA-Leiter (peqlab)

Anhang 193

992116414821515

19531882

27993639

8576742761064899

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Spur

710

Abb. 42: Gelbild der Rep-PCR. Spur 1: Standard VII (Roche); Spuren 2–15: E. coli-Isolate aus dem Rattenkot; Spur 16: Positivkontrolle genomische DNA von E. coli-2685 mit #776 und #777

992116414821515

19531882

27993639

8576742761064899

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Spur

710

Abb. 43: Gelbild der Rep-PCR. Spur 1: Standard VII (Roche); Spuren 2–11 und 13: E. coli-Isolate aus dem Rattenkot; Spur 12: Positivkontrolle genomische DNA von E. coli-2685 mit #776 und #777

Anhang 194

9921164148215151953

710

27993639

8576742761064899

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Spur

1031900800700600500400300200

359492

Abb. 44: Gelbild der Rep-PCR. Spur 1: Standard VII (Roche); Spuren 2–15: E. coli-Isolate aus dem Rattenkot; Spur 16: Positivkontrolle genomische DNA von E. coli-2685 mit #776 und #777; Spur 17: 100 bp DNA-Leiter (peqlab)

992116414821515

19531882

27993639

8576742761064899

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Spur

710

Abb. 45: Gelbild der Rep-PCR. Spur 1: Standard VII (Roche); Spuren 2–15: E. coli-Isolate aus dem Rattenkot; Spur 16: Positivkontrolle genomische DNA von E. coli-2685 mit #776 und #777

Anhang 195

8.3 HPLC-Daten

Konz. (µg/ml) Int. Standard Konz. (µg/ml) Konz. (µg/g) Cip Gati Cipro Cipro Gati Gati Cipro Cipro Cipro Cipro 4,4min 5,9min Fläche Höhe Fläche Höhe Fläche Höhe Fläche Höhe

SR 1,00 4,00 105977 10798 113363 9094 SR 1,00 4,00 99521 10235 108583 8701 MW 1,00 4,00 102749 10517 110973 8898 Gew I.S. I.S. RF 0,27 0,21 g µg/ml µg/g Ratte µg/ml

0,047 5,00 107 2- 0 0 0 138214 10772 0 0 0,00 0,00 0,145 5,00 34 2- 0 0 0 121923 9555 0 0 0,00 0,00

0,104 5,00 48 3o 0,8 23903 2437 118047 9524 0,22 0,22 2,62 2,60 0,070 5,00 72 4o 0,8 10926 1114 119121 9516 0,10 0,10 1,77 1,77 0,101 5,00 50 5o 0,8 20464 2129 113597 9109 0,19 0,20 2,41 2,45 0,113 5,00 44 5- 0,8 24001 2460 117119 9407 0,22 0,22 2,45 2,45

0,054 5,00 93 5o 0,8 18902 1946 127086 10241 0,16 0,16 3,73 3,73 0,114 5,00 44 5- 0,8 26797 2867 117912 9463 0,25 0,26 2,70 2,82 0,080 5,00 63 3o 1,6 55448 5797 123267 9838 0,49 0,50 7,60 7,80 0,051 5,00 97 4o 1,6 23614 2400 127797 10242 0,20 0,20 4,86 4,83

0,047 5,00 106 5o 1,6 30401 3194 125880 10083 0,26 0,27 6,93 7,12 0,058 5,00 86 5- 1,6 73144 7459 123267 9870 0,64 0,64 13,83 13,80 0,029 5,00 175 5o 1,6 72002 7424 120734 9651 0,64 0,65 28,20 28,49 0,047 5,00 106 5- 1,6 138154 14161 116499 9256 1,28 1,29 33,85 34,21

0,043 5,00 115 3o 3,2 79730 8265 138013 10405 0,62 0,67 17,99 19,37 0,040 5,00 125 4o 3,2 49411 5134 125535 10058 0,43 0,43 13,31 13,52 0,048 5,00 105 5o 3,2 80254 8287 124563 9943 0,70 0,71 18,31 18,55 0,056 5,00 90 5- 3,2 95629 9898 125098 9936 0,83 0,84 18,57 18,96

0,060 5,00 83 5o 3,2 88148 9034 126963 10067 0,75 0,76 15,60 15,79 0,100 5,00 50 5- 3,2 116735 12010 123824 9809 1,02 1,04 12,77 12,99 0,099 5,00 50 3o 6,4 48003 4985 119682 9660 0,43 0,44 5,45 5,49 0,030 5,00 165 4o 6,4 24677 2546 125236 10029 0,21 0,21 8,79 8,87

0,110 5,00 46 5o 25,6 263391 26533 75860 5939 3,75 3,78 42,66 43,00 0,064 5,00 78 5- 25,6 395119 40236 128516 10074 3,32 3,38 64,36 65,50 0,024 5,00 209 3o 12,8 96831 9816 133094 10666 0,79 0,78 41,15 40,77 0,065 5,00 77 4o 12,8 186846 19164 127733 10113 1,58 1,60 30,26 30,70

Danksagung 196

9 Danksagung

Zunächst bedanke ich mich ganz herzlich bei Herrn PD Dr. med. Hans-Jörg Linde, der mir

diese Promotion ermöglicht hat. Ohne seine kompetente Unterstützung und Betreuung wäre

diese Arbeit nicht zustande gekommen.

Herrn Prof. Dr. rer. nat. Michael Thomm danke ich für die bereitwillige und unkomplizierte

Übernahme des Erstgutachtens.

Bei der gesamten AG Linde möchte ich mich für die Hilfsbereitschaft, Kollegialität und

entspannte Arbeitsatmosphäre bedanken.

Ein ganz liebes Dankeschön geht an die AG Reischl, die mir in Sachen Real-Time-PCR mit

Rat und Tat zur Seite standen und die Benutzung des LightCyclers zu allen Zeiten

ermöglichten.

Herrn Dr. Thilo Spruss danke ich für die Unterstützung bei der Durchführung der

Tierversuche.

Bei Herrn Prof. Dr. Frieder Kees bedanke ich mich für die Hilfe und Unterstützung bei der

Durchführung der HPLC-Experimente.

Der größte Dank gilt meinen Eltern, die mir mein Studium ermöglicht haben und immer an

mich geglaubt haben.

Last but not least möchte ich mich bei Reinhard bedanken, der mich in schweren Zeiten stets

aufgemuntert und motiviert hat.

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