Transduktion hämatopoetischer Stammzellen von Neuweltaffen ... · DNA desoxyribonucleic acid E....

Transduktion hämatopoetischer Stammzellen von Neuweltaffen

mit Foamyviren

Melanie Wurm

2007

Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) Braunschweig

Institut für Tierzucht (Mariensee)

Heinrich Heine Universität Düsseldorf

Klinik für Kinder -Onkologie, -Hämatologie und Klinische Immunologie

Transduktion hämatopoetischer Stammzellen von Neuweltaffen mit Foamyviren

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Melanie Wurm aus Bonn

Hannover 2007

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. H. Niemann Univ.-Prof. Dr. H. Hanenberg 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Niemann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.Y. Naim Tag der mündlichen Prüfung: 15.05.2007

Meinem Freund Heiko

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG 1

2. LITERATUR 3

2.1 HÄMATOPOETISCHE STAMMZELLEN ALS ZIELZELLEN SOMATISCHER GENTHERAPIE 3 2.2 ZYTOKINE 7 2.3 BIOLOGIE VON RETROVIREN 8 2.3.1 ORTHORETROVIREN 11 2.3.1.1 Replikationszyklus von Orthoretroviren 11 2.3.1.2 Orthoretrovirale Vektoren 12 2.3.1.3 Pseudotypisierung von Orthoretroviren 14 2.3.2 SPUMARETROVIREN 14 2.3.2.1 Merkmale der Spumaretroviren 14 2.3.2.2 Replikationszyklus von Foamyviren 16 2.3.2.3 Foamyvirale Vektoren 17 2.3.2.4 Verpacken von Foamyviren 19 2.4 SELEKTION TRANSGENER ZELLEN IN VITRO UND IN VIVO 20 2.5 INTERAKTIONEN ZWISCHEN VIRUSPARTIKELN UND ZIELZELLEN 23 2.6 NEUWELTAFFEN ALS MODELL FÜR GENTRANSFER 24

3. MATERIAL UND METHODEN 26

3.1 VERWENDETE MATERIALIEN 26 3.1.1 PLASMIDE 26 3.1.2 ZELLEN 31 3.1.3 TIERE 32 3.2 METHODEN 33 3.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE TECHNIKEN 33 3.2.1.1 Transformation von Bakterien und Isolierung von Plasmid DNA 33 3.2.1.2 Klonierung des Plasmids MH71.MGMTp140kIEG 34 3.2.2 ZELLKULTURTECHNIKEN 35 3.2.2.1 Kultivierung eukaryotischer Zelllinien 35 3.2.2.2 Kryokonservierung eukaryotischer Zellen 36 3.2.2.3 Mykoplasmentest 36 3.2.2.4 Gewinnung primärer Zellen 37 3.2.3 VIRUSPRODUKTION 38 3.2.3.1 Transiente Erzeugung virushaltiger Überstände 38 3.2.3.2 Konzentration von virushaltigen Überständen 40 3.2.4 TITRATION 41 3.2.5 TRANSDUKTION VON HÄMATOPOETISCHEN ZELLLINIEN 42 3.2.5.1 Transduktion von humanen CD34+ Zellen 43 3.2.5.2 Transduktion von Marmoset CD34+ Zellen 44 3.2.6 PROGENITOR-ASSAY 45 3.2.7 VIRUSBINDUNG AN FIBRONEKTIN 46 3.2.8 1,3-BIS-(2-CHLORETHYL)-1-NITROSOUREA (BCNU) 47 3.2.8.1 BCNU Selektion 47 3.2.8.2 BG - BCNU Selektion 48 3.2.8.3 BG - BCNU Selektion von CD34+ Marmoset Zellen 49 3.2.9 KNOCHENMARKENTNAHME BEI MARMOSETS 50 3.2.10 STATISTIK 51

4. ERGEBNISSE 52

4.1 HERSTELLUNG VON FOAMYVIREN 52 4.1.1 OPTIMIERUNG DES TRANSFEKTIONSPROTOKOLLS 52 4.1.2 VERGLEICH VON FOAMYVIRALEN 2,- 3- UND 4-PLASMIDSYSTEMEN 54 4.1.3 FOAMYVIRALE VERPACKUNGSPLASMIDE 55 4.1.4 EINFLUSS DES MGMTP140K TRANSGENS AUF DIE GFP EXPRESSION 57 4.1.5 KONZENTRIERUNG RETROVIRALER VIRUSÜBERSTÄNDE 58 4.1.6 ADHÄSION REKOMBINANTER RETROVIREN AN MOLEKÜLE DER FIBRONEKTIN-MATRIX 59 4.2 GENTRANSFER IN HUMANE CD34+ ZELLEN AUS NABELSCHNURBLUT 63 4.2.1 ANREICHERUNG HUMANER CD34+ ZELLEN 63 4.2.2 RETROVIRALER GENTRANSFER IN HUMANEN CD34+ ZELLEN 63 4.2.3 EINFLUSS DES TRANSGENS MGMTP140K AUF DIE GENTRANSFERRATE 66 4.2.4 TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ VERSCHIEDENER FOAMYVIRALER KONSTRUKTE 70 4.3 GENTRANSFER IN CD 34+ MARMOSET ZELLEN 76 4.3.1 GEWINNUNG UND AUFREINIGUNG VON CD34+ MARMOSET ZELLEN 76 4.3.2 RETROVIRALER GENTRANSFER IN CD34+ MARMOSET ZELLEN 77 4.4 MGMTP140K ALS TRANSGEN 84 4.4.1 TRANSDUKTION HÄMATOPOETISCHER ZELLLINIEN 84 4.4.2 SELEKTION VON TRANSDUZIERTEN ZELLLINIEN MITTELS BCNU IN VITRO 88 4.4.3 MEHRMALIGE BEHANDLUNG VON TRANSGENEN HL60 ZELLEN MIT BCNU 91 4.4.4 SELEKTION TRANSGENER HL60 ZELLEN MIT BG UND BCNU IN VITRO 94 4.4.5 SELEKTION TRANSGENER CD34+ MARMOSET ZELLEN MIT BG UND BCNU 95 4.4.6 SELEKTION TRANSGENER CD34+ MARMOSET PROGENITOREN MIT BG UND BCNU 100

5. DISKUSSION 104

5.1 OPTIMIERTE HERSTELLUNG VON FOAMYVIREN, LENTIVIREN UND GAMMARETROVIREN 105 5.2 GENTRANSFER IN HUMANE CD34+ ZELLEN AUS NABELSCHNURBLUT 111 5.3 GENTRANSFER IN CD34+ MARMOSET ZELLEN 113 5.4 MGMTP140K ALS TRANSGEN 115 5.5 SCHLUSSFOLGERUNG 119

6. ZUSAMMENFASSUNG 120

7. SUMMARY 122

8. LITERATURVERZEICHNIS 124

Verzeichnis der Abkürzungen

ADA Adenosindeaminase

BCNU 1, 3-bis-(2-chloroethyl)-1-Nitrosourea

BG O6-Benzylguanin

bGH pA bovine growth hormon polyA site

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

CAS cis acting sequence

CD cluster of differentition

cDNA complementary DNA

CMV Cytomegalyvirus

CFU colony forming units

ΔU3 U3-Promotor/Enhancer mit Deletion

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO Dimethylsulphoxid

DNA desoxyribonucleic acid

E. coli Escherichia coli

EM140 Verpackungsplasmid pczHFVenvEM140

EMCV Encephalomyelocarditisvirus

Env envelope, retrovirales Hüllprotein

et al. et alteres (und andere)

FACS fluorescence activated cell sorting

FFV Feline Foamy Virus

FKS Fötales Kälberserum

Flt3-L fetal liver tyrosine kinase 3 ligand

FN Fibronektin

FV Foamy Virus

g Gravitationskonstante

Gag group specific antigen

GaLV Gibbonape Leukemia Virus

G-CSF granulocyte-colony stimulating factor

GFP grün fluoreszierendes Protein

GVHD graft versus host disease

HFV Human Foamy Virus

HIV Human Immundeficiency Virus

HLA Humanes Leukozyten-Antigen

IL Interleukin

IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium

IP Interner Promotor

IRES internal ribosome entry site

kb Kilobasen

KMT Knochenmarktransplantation

l Liter

LB-Medium Luria-Bertani-Medium

LTRs long terminal repeats

µ mikro

M Mol

m milli

MACS magnet activated cell sorting

MD9.MGMT Vektorplasmid MD9.MGMTp140kIEG

MGMT O6-methylguanin-DNA-Methyltransferase

MH71.MGMT Vektorplasmid MH71.MGMTp140kIEG

min Minute

MLV Murine Leukemia Virus

mRNA messenger RNA

ORFs open reading frame

Ori origin of replikation

PBS phosphat buffered saline solution

PE Phycoerythrin

PEI Polyethylenimin

PFV Prototype Foamyvirus

PI Propidiumiodine

ψ, Psi Verpackungssignal

resp. respektive

RNA ribonucleic acid

rpm rounds per minute

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RT Raumtemperatur

Sav Streptavidin

SCF stem cell factor

SCID severe combined immune deficiency

sec Sekunde

SFFV Spleen Focus Forming Virus

SFV Simian Foamy Virus

SIN self-inactivating

SM04 Verpackungsplasmid pciSM04.seq

SV40 Simian Virus 40

TCD tissue culture dish

TE transduzierende Einheiten

TPO Thrombopoetin

VSV Vesicular Stomatitis Virus

VSV-G Glykoprotein des VSV

X-linked X-chromosomal

z.B. zum Beispiel

Einleitung

1. Einleitung

Hämatopoetische Stammzellen sind auf Grund ihrer guten Zugänglichkeit die am

besten untersuchten Stammzellen des Menschen. Sie sind die einzigen Stammzellen,

die bereits seit Jahrzehnten im Rahmen von Transplantationen klinisch eingesetzt

werden (THOMAS et al. 1957). Seit mehr als 20 Jahren ist der Ersatz eines defekten

oder fehlenden Gens in hämatopoetischen Stammzellen bei monogenen

Erkrankungen ein erklärtes Ziel der somatischen Gentherapie gewesen (WILLIAMS

et al. 1984). Obwohl der Transfer von Genen in hämatopoetische Stammzellen von

Mäusen schon frühzeitig gelang (DICK et al. 1985), konnte in Großtiermodellen erst

in den letzten 10 Jahren eine ausreichende Gentransfereffizienz erzielt werden.

Neben Studien an Hunden (NEFF et al. 2005) wurden auch verschiedene

Affenspezies wie Paviane (Papio cynocephalus anubis) (KIEM et al. 1997) und

Marmosets (Callithrix jacchus) (HIBINO et al. 1999) zur Prüfung gentherapeutischer

Ansätze erfolgreich eingesetzt.

Beim Menschen wurden bis zum März 2004 insgesamt 619 klinische

Gentherapiestudien beim National Institute of Health der U.S.A. angemeldet.

Weltweit wurden über 3.000 Patienten in klinischen Studien zur Gentherapie

eingeschlossen (vgl. www.asgt.org/history.shtml). Diese Phase I-Gentherapiestudien

testeten aber in erster Linie die Sicherheit und die Nebenwirkungen der Applikation

genetisch veränderter Zellen beim Menschen und waren hinsichtlich der erzielten

klinischen Ergebnisse enttäuschend. Bei allen klinischen Stammzellgentherapie-

studien wurden gammaretrovirale Vektoren als Transfersystem für die Übertragung

der therapeutischen Gene eingesetzt. Die erste Gentherapiestudie, bei der eine

Heilung von 9 von 10 mit genetisch modifizierten autologen Stammzellen

behandelten Patienten erzielt werden konnte, wurde in den letzten Jahren in Paris

bei Jungen mit der x-chromosomalen Form des schweren kombinierten

Immundefektes (X-linked SCID) durchgeführt (CAVAZZANA-CALVO et al. 2002;

HACEIN-BEY-ABINA et al. 2002). Leider zeigte diese erste erfolgreiche Studie aber

auch sehr eindrucksvoll, dass die bei Wildtyp-Gammaretroviren beobachte

Aktivierung von Onkogenen auch bei Nutzung dieser einfach Orthoretroviren als

1

http://www.asgt.org/history.shtml

Einleitung

replikationsdefiziente Vektoren zu beobachten ist. Drei der behandelten Patienten

entwickelten ein Malignom der T-Zellen, wobei bei mindestens zwei Patienten eine

pathologische Aktivierung des Proto-Onkogens LMO-2 durch den integrierten Vektor

nachgewiesen wurde (HACEIN-BEY-ABINA et al. 2003a; CHECK 2005). Diese

sogenannte Insertionsmutagenese von gammaretroviralen Vektoren wurde in den

letzten Jahren auch bei Mäusen (LI et al. 2002) und in jüngerer Vergangenheit bei

einem Rhesusaffen nachgewiesen (SEGGEWISS et al. 2006).

Wildtyp-Foamyviren sind die einzigen Retroviren, mit denen bisher keine Erkrankung

trotz chronisch-persistierenden Infektionen in ihren natürlichen tierischen Wirten und

in akzidentell infizierten Menschen assoziiert werden konnte. Replikationsdefekte

foamyvirale Vektoren wurden erfolgreich eingesetzt, um Resistenz- und Markergene

in hämatopoetische Stammzellen von Mäusen oder auch Menschen einzubringen

(VASSILOPOULOS et al. 2001; LEURS et al. 2003; POLLOK et al. 2005). Eine

kürzlich publizierte Studie an Hunden konnte zeigen, dass foamyvirale

Vektorsysteme in der Lage sind, hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen eines

Großtiers effizient zu transduzieren (KIEM et al. 2007).

Generell wird die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tierversuchen in der Regel

als eher gegeben akzeptiert, wenn das Tiermodel dem Menschen phylogenetisch

nahe steht. Daher befasst sich die vorliegende Untersuchung mit der Fragestellung,

welche Voraussetzungen erfüllt sein müssen, damit foamyvirale Vektoren dazu

genutzt werden können, um hämatopoetische Stammzellen der Primatenart Callitrix

jacchus auch Marmosets genannt, effizient zu transduzieren. In dieser Arbeit wurden

deshalb in vitro ähnliche aufgebaute foamy-, lenti- und oncoretrovirale

Vektorsysteme hinsichtlich ihrer Effizienz, ihres prinzipiellen Aufbaus und

verschiedene Transgene intensiv geprüft.

2

Literatur

2. Literatur

2.1 Hämatopoetische Stammzellen als Zielzellen somatischer Gentherapie

Die Hämatopoese ist ein hierarchisch aufgebautes flüssiges Organsystem, bei dem

sich aus einer pluripotenten Stammzelle alle Blutzellen entwickeln können. Aus

dieser Stammzelle entstehen pluripotente Vorläuferzellen, die in myeloische und

lymphatische Vorläuferzellen unterteilt werden. Aus den myeloischen pluripotenten

Vorläuferzellen entwickeln sich Erythrozyten, Neutrophile, Basophile und Eosinophile

Granulozyten, Thrombozyten, Makrophagen und Mastzellen. Aus den lymphatischen

pluripotenten Vorläuferzellen entstehen die lymphozytären Zellen: T-Zellen, B-Zellen

und natürliche Killerzellen. Der Ort der Entwicklung der Blutzellen ist das

Knochenmark. Bei einem gesunden Individuum gelangen nur die reifen Zellen der

Hämatopoese in das periphere Blut. Einzelne Erkrankungen des blutbildenden

Systems können durch die Transplantation von pluripotenten

„gesunden“ Stammzellen geheilt werden.

Hämatopoetische Stammzellen sind durch die Fähigkeit charakterisiert, nach

Transplantation einen myeloablativ behandelten Organismus langfristig zu

repopulieren und alle hämatopoetischen Zellen sowohl der myeloischen, als auch der

lymphatischen Zellreihe zu bilden (MORRISON et al. 1995). Hämatopoetische

Stamm- und Vorläuferzellen exprimieren auf ihrer Oberfläche neben anderen

Antigenen auch das CD34-Antigen (KRAUSE et al. 1996). Die Anzahl an CD34+

Zellen liegt im peripherem Blut bei unter < 0,1 % und im Knochenmark bei 0,5 bis

2 % aller mononukleären Zellen. Allerdings sind „echte“ hämatopoetische

Stammzellen im Sinne von Pluripotenz und Rekonstitutionspotential unter den CD34+

Zellen trotzdem sehr selten, da CD34 auch auf anderen Zellen exprimiert wird (HAAS

u. MUREA 1995; WANG et al. 1997). Stammzellen lassen sich phänotypisch nicht

von anderen CD34+ Zellen unterscheiden, so dass der sichere Nachweis nur durch

Funktionsprüfungen erfolgen kann.

Über klonogene in vitro Assays kann die Detektion von Progenitorzellen der

Erythropoese und der Granulopoese erfolgen. Diese Form der Detektion wird als

3

Literatur

Progenitor-Assay bezeichnet (METCALF 1977). Doch der in vitro Nachweis von

klonogenen Zellen lässt keine Aussage zu, wie viele Stammzellen tatsächlich im

Transplantat vorhanden sind und nach einer Transplantation wieder im menschlichen

Patienten anwachsen (ORKIN u. MOTULSKY 1995). Um die Zahl der

repopulierenden Zellen besser verifizieren zu können, wurde das

Xenotransplantationsmodell der nonobese diabetic / severe combined

immunodeficiency (NOD/SCID) Mäuse etabliert (LAROCHELLE et al. 1996; VAN

DER LOO et al. 1998).

Die Transpantation von Knochenmark als Quelle für Stammzellen schon seit 1957

klinisch eingesetzt, um eine hämatopoetische Aplasie nach Chemo- und/ oder

Radiotherapien zu behandeln (THOMAS et al. 1957). Daneben findet die

Knochenmarktransplantation (KMT) Anwendung bei der Behandlung von

angeborenen Erkrankungen des blutbildenden Systems (TO et al. 1997; THOMAS

1999). Initial wurden die Stammzelltransplantate aus dem Knochenmark gewonnen,

mittlerweile gibt es eine Alternative, bei der die Stammzellen aus dem peripheren

Blut mittels Zellseparation (Leukopherese) gewonnen werden.

Durch die Gabe von Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) werden

hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark ins periphere Blut mobilisiert.

Da durch dieses Verfahren in der Regel mehr Stammzellen bei der Entnahme aus

dem Spender gewonnen werden, ist nach einer Transplantation dieser Zellen

schneller mit einer Rekonstitution der Hämatopoese des Empfängers zu rechnen

(HAAS et al. 1995). Für eine KMT werden mittlerweile die meisten Stammzellen

mittels Leukopherese gewonnen. Von 1990 bis 1994 stieg der Anteil der KMT mit

durch Leukopherese gewonnenen Stammzellen von 15 % auf 75 % an (TO et al.

1997).

Der Mindestbedarf an hämatopoetischen Stammzellen für eine erfolgreiche

Rekonstruktion der Hämatopoese liegt für einen Menschen bei 2 x 106 CD34+ Zellen

pro Kilogramm Körpergewicht (BURMESTER u. PEZZUTTO 1998).

Bei Transplantationen unterscheidet man zwischen autologen Transplantationen, bei

der eigenes Organmaterial retransplantiert wird und allogenen Transplantationen, bei

denen Organmaterial eines Dritten übertragen wird. Autologe Transplantationen von

4

Literatur

kryokonservierten hämatopoetischen Stammzellen werden beispielsweise bei

therapieinduzierten Panzytopenien, wie nach Chemotherapie oder Bestrahlung,

durchgeführt. Allogene Transplantationen mit Transplantat eines gesunden Spenders

sind unter anderem Teil der Behandlung von Leukämien, angeborenen Immun- oder

Stoffwechselerkrankungen sowie bei der Behandlung des multiplen Myelom.

Für eine allogene Stammzelltransplantation steht bislang nur bei einem Teil der

Patienten ein humanes Leukozytenantigen (human leukozyt antigen, HLA)–

identischer Spender zur Verfügung. In der Regel wird zunächst im Familienkreis

nach einem kompatiblen Spender gesucht, denn für Geschwister besteht eine

Wahrscheinlichkeit von 1:4, dass alle HLA-Allele übereinstimmen (BURMESTER et

al. 1998). Da Familien in der westlichen Welt im Durchschnitt weniger als zwei Kinder

haben, findet man selten einen HLA-kompatiblen Spender in der Familie des

Patienten. Daneben besteht die Möglichkeit, geeignete Knochenmarkspender in

entsprechenden Datenbanken zu finden; weltweit sind etwa 10 Millionen Menschen

in solchen Datenbanken registriert. Von diesen Menschen ist etwa ein Fünftel in

Deutschland registriert (HO 2006). Eine allogene Transplantation geht jedoch mit

einem hohen Therapie-Assoziierten Morbiditäts- und Mortalitätsrisiko einher. An

erster Stelle ist hier die Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion (graft versus host disease

- GVHD) zu nennen (THOMAS 1999).

Eine alternative Therapiemöglichkeit zur Behandlung monogener Erkrankungen der

Hämatopoese bietet die Transplantation autologer genetisch korrigierter

Stammzellen. Stammzellen werden nach der Entnahme in vitro mit einem Vektor

behandelt, der das funktionelle Gen in das zelluläre Genom einbringt. Dieses

übernimmt dann die Aufgaben des körpereigenen, defekten Gens (WILLIAMS et al.

1984). Für monogene Erkrankungen, wie zum Beispiel dem schweren kombinierten

Immundefekt (severe combined immunodeficiency - SCID), dem

Adenosindeaminase-Mangel (ADA), der Fanconi-Anämie, der chronischen

Granulomatose, wird eine solche Therapie in Betracht gezogen (KOHN 1996;

WILLIAMS et al. 1997; DIRKSEN et al. 1999). In Zukunft könnten auch

Resistenzgene in Stammzellen eingebracht werden, die sie vor einer Behandlung mit

Chemotherapeutika schützen. So können schwere Nebenwirkungen, wie sie bei der

5

Literatur

chemotherapeutischen Behandlung bei onkologischen Erkrankungen auftreten,

vermindert werden (MAZE et al. 1997).

Das therapeutische Potenzial von gentechnisch veränderten, hämatopoetischen

Zellen konnte erstmals bei 19 Patienten gezeigt werden (CAVAZZANA-CALVO et al.

2000; AIUTI et al. 2002; GASPAR et al. 2004). Im Rahmen dieser Studie wurden, 14

Patienten mit X-linked-SCID und 5 Patienten mit ADA-SCID transplantiert. Obwohl

bei 18 von 19 behandelten Patienten die Grunderkrankung erfolgreich behandelt

werden konnte, ist heute bekannt, dass dieser Erfolg mit schwerwiegenden

Nebeneffekten verbunden war. Mindestens drei Kinder entwickelten eine der

Leukämie ähnliche Funktionsstörung. Bei zwei Patienten konnte gezeigt werden,

dass diese Funktionsstörung mit einer monoklonalen Vermehrung genetisch

modifizierter T-Zellen einherging (ASGT 2003; HACEIN-BEY-ABINA et al. 2003a;

KOHN et al. 2003).

6

Literatur

2.2 Zytokine

Zytokine übermitteln Informationen zwischen verschiedenen Zellen und regulieren so

Wachstum und Differenzierung. Zytokine sind auch notwendig, um Stammzellen zu

Expandierung anzuregen. Derzeit werden in vivo verschiedene Zytokine in

unterschiedlichen Kombinationen eingesetzt. Die wichtigsten Zytokine zum

Überleben von Stamm- und Progenitorzellen in vitro sind Stammzellfaktor (stem cell

factor - SCF) und Thrombopoietin (TPO) (BROUDY 1997; EATON u. DE SAUVAGE

1997; KIMURA et al. 1998). Darüber hinaus werden auch G-CSF, Interleukin (IL)-3

und IL-6 sowie der fetal liver tyrosine kinase 3 ligand (Flt3-L) eingesetzt (LUSKEY et

al. 1992; CROOKS u. KOHN 1993; KURRE et al. 2001). Hierbei scheint Flt3-L in der

Lage zu sein, die Differenzierung von CD34+ Zellen in vitro zu verhindern und so die

Repopulationskapazität bei einer Transplantation zu erhalten (DAO et al. 1997). Es

gibt allerdings auch Hinweise darauf, dass IL-3 in einer hohen Dosierung zu einer

Differenzierung von Stammzellen führt, so dass der klinische Einsatz fraglich ist

(YONEMURA et al. 1996). Kombinationen aus Flt3-L, TPO, IL-6 und SCF haben sich

im Rahmen von in vitro Gentherapieexperimenten (HANENBERG et al. 1997) und in

Untersuchungen an Hunden (GOERNER et al. 1999), Primaten und Menschen

(ABONOUR et al. 2000; AIUTI et al. 2002; CAVAZZANA-CALVO u. FISCHER 2004;

GASPAR et al. 2004) als besonders effizient erwiesen.

7

Literatur

2.3 Biologie von Retroviren

Unabhängig von der Taxonomie werden Retroviren aufgrund der Struktur ihres pro-

viralen Genoms in einfache und komplexe Retroviren unterteilt. Einfache Retroviren

enthalten in der Regel die drei Gene gag, pol und env und darüber hinaus identisch

aufgebaute long terminal repeats (LTRs) an beiden Enden des viralen Genoms

(Abbildung 1).

-gag kodiert die strukturellen Komponenten des Virus: Matrix-, Kapsid- und

Nukleokapsidproteine

-pol kodiert die Enzyme des Virus: Protease, Integrase und reverse

Transkriptase

-env kodiert für die viralen Hüllproteine

-LTRs Long terminal repeats: befinden sich am Anfang und am Ende des

Genoms; sie enthalten Steuersequenzen zur Genexpression und für die

Integration

-ψ Verpackungssignall: ψ (Psi) wird benötigt, damit das Genom der

Retroviren, die virale mRNA, mit in die infektiösen Partikel gelangt (über

Interaktion mit gag)

Komplexe Retroviren z.B. HIV-1, enthalten zusätzlich regulatorische Gene wie tat, ref,

vif, nef, vpu und vpr (MODROW et al. 2002).

8

Literatur

MLV

SFV

gagpol

env

ψ nef

vifvpu

vpr

tatrev5`LTR 3`LTR

HIV U3 U3

12

gag

5`LTR

ψ

gag polenv

5`LTR 3`LTR

ψ

U3

U3U3

pol3`LTR

envIP

tasOrf-2

ψU3

bet

1 432 765 1098 11 kBp

MLV

SFV

gaggagpolpol

env

ψ nefnef

vifvpu

vpr

tatrev5`LTR 3`LTR

HIV U3 U3

12

gag

5`LTR

ψ

gag polenv

5`LTR 3`LTR

ψ

U3

U3U3

pol3`LTR

envIP

tasOrf-2

ψU3

bet

1 432 765 1098 11 kBp

Abbildung 1: Genomaufbau verschiedener Retroviren Die proviralen Genome des Murinen Leukämie Virus (MLV), des Humanen Immundefizienz Virus

(HIV) und des Simian Foamy Virus (SFV) sind hier schematisch dargestellt. Sie werden zu beiden

Seiten von den „long terminal repeats“ (LTRs) begrenzt. Die einzelnen Gene gag, pol, env, vif, vpr,

vpu, nef, tas und Orf-2 sind durch Rechtecke dargestellt. Die Proteine, tat, rev und bet, die von

gespleißter mRNA translatiert werden, sind durch gestrichelte Linien miteinander verbunden. Offene

Leserahmen (ORFs) sind auf gleicher Höhe abgebildet. ORFs verschiedener Leseraster sind auf

unterschiedlichen Ebenen dargestellt. Das SFV hat neben den mit U3 bezeichneten Promotoren im

3`Bereich des env Gens einen Internen Promotor (IP). Mit ψ sind die Verpackungssignale bezeichnet,

die bei FV das diskontinuierliche Verpackungssignal beinhalten (verändert nach MODROW et al.

2002).

Eine charakteristische Besonderheit der Retroviren ist die reverse Transkriptase, die

es ihnen ermöglicht ihr RNA-Genom in DNA umzuschreiben und anschließend in das

Wirtsgenom zu integrieren. Durch diese Integration wird das Provirus ein Teil des

Genoms der Zielzelle und bei der Zellteilung an beide Tochterzellen weitergegeben.

Die Tatsache, dass die genetischen Informationen von Retroviren im Wirtsgenom

stabil integriert werden, macht diese Viren zu idealen Vehikeln für den Transfer von

Genen in Stammzellen.

9

Literatur

Ursprünglich wurden die Viren nach ihrem Erscheinungsbild in Typ A, B, C und D

Retroviren eingeteilt; heute werden sie aufgrund ihrer genetischen

Verwandtschaftsverhältnisse in sieben Genera unterteilt (Tabelle 1). Die Viren der

ersten fünf Genera besitzen onkogenes Potential und werden als Onkoretroviren

bezeichnet.

Tabelle 1: Taxonomie der Virusfamilie Retroviridae

Subfamilie Genus Beispiel Genom

Orthoretroviridae Alpharetroviren Avian Leukosis Virus

Rous Sarcoma Virus

einfach

Betaretroviren Mouse Mammary Tumor Virus

Mason Pfizer Monkey Virus

einfach

Gammaretroviren Murine Leukemia Virus (MLV) einfach

Deltaretroviren Bovine Leukemia Virus komplex

Epsilonretroviren Walleye Dermal Sarcoma Virus komplex

Lentiviren Human Immundeficiency Virus (HIV) komplex

Spumaretroviren Foamyviren Simian Foamy Virus (SFV)

Primate / Prototyp Foamy Virus (PFV)

komplex

10

Literatur

2.3.1 Orthoretroviren

2.3.1.1 Replikationszyklus von Orthoretroviren

Die spezifischen Hüllproteine auf der Oberfläche von Viren, auch als envelope

bezeichnet, binden initial an spezifische Oberflächenmoleküle der Zielzelle. Ohne die

spezifische Bindung können Retroviren Zellen nicht infizieren; beispielsweise kann

HIV Zellen nur über das Oberflächenmolekül CD4 Zellen infizieren. Da nur

Makrophagen, Lymphozyten und Gliazellen CD4 exprimieren, kann HIV nur diese

Zellen, nicht aber andere Zellen des humanen Organismus infizieren.

Der Eintritt in die Zelle ist nicht bei allen Retroviren gleich. Der Viruspartikel wird

entweder von der Zelle durch Endozytose aufgenommen oder die Virushülle

fusioniert mit der Zellmembran und das Kapsid wird freigesetzt. Bei den

Orthoretroviren setzt anschließend die reverse Transkription ein, wobei die virale

RNA durch die reverse Transkription in DNA umgeschrieben wird. Der benötigte

Primer für die reverse Transkription wird im Viruspartikel mitgeführt. Nachdem es zur

Bindung des Primers an die Primerbindungsstelle gekommen ist, erfolgt die

Synthese des DNA-Minusstranges. Vom Polypurintrakt aus findet dann die Synthese

des DNA-Plusstranges statt. Die neu gebildete lineare doppelsträngige DNA wird an

beiden Enden von LTRs abgeschlossen, die am 5’ und 3’ Ende in derselben

Orientierung vorliegen. Sie bestehen aus der U3 Region, die Promotor- und

Enhancer-Elemente enthält und so die Genexpression der viralen Gene kontrolliert,

der R-Region (R = redundant) und der U5 Region anschließt, welche die

Insertionssequenzen zur Integration in das Wirtsgenom enthält. Der

Präintegrationskomplex wird bei Lentiviren aktiv in den Zellkern transportiert.

Dagegen kann der Präintegrationskomplex von Gammaretroviren die Kernmembran

nicht überwinden und gelangt daher nur während der Zellteilung, wenn die

Kernmembran aufgelöst ist, zur DNA der Wirtszelle. Die virale Integrase katalysiert

die Insertion in das Genom der Zelle. Als Teil des Genoms dieser Zelle nutzt das

integrierte Virus (Provirus) jetzt die Transkriptions- und Translationsmachinerie der

11

Literatur

Zelle, um sich zu vermehren. Dabei werden Promotoren in der U3 Region des

Provirus durch zelleigene Transkriptionsfaktoren aktiviert; bei den komplexen

Retroviren ist eine Aktivierung über eigene Transaktivatoren essentiell. Der

Transaktivator des HIV ist tat, das durch basale Aktivität von einer gespleißten RNA

gebildet wird. Ist eine ausreichende Menge tat in der Zelle vorhanden, wird der 5’ U3

Promotor stark aktiviert und die anderen viralen Gene und das komplette

ungespleißte Genom wird abgelesen. Im 3`Bereich des Genoms ist das PolyA-Signal,

dass das Ende der mRNA für die Zelle definiert. Das 5`Ende wird mit einem 5`Cap-

Protein versehen; dieses wird benötigt, damit die mRNA an das Ribosom binden

kann. Beide Prozesse entsprechen denen, die auch jede andere mRNA der Zelle

durchläuft. Nachdem die mRNA in das Zytoplasma transportiert wurde, beginnt an

den Ribosomen die Translation. In komplexen Prozessen werden die Viruspartikel

zusammengefügt.

Eine zentrale Rolle im Vermehrungszyklus spielen die strukturellen Proteine des gag

Gens. Sie sind in der Lage „Pseudopartikel“ zu generieren (IORDANSKII et al. 1997).

„Pseudopartikel“ sind nicht infektiöse Partikel, die aus einer Hülle und inkorporierten

Proteinen bestehen, denen jedoch das Virusgenom fehlt. Die Knospung des Virus

oder der subviralen „Pseudopartikel“ findet an den zellulären Membranen statt, in

denen die env Proteine als Membran- oder als Transmembranproteine eingelassen

sind.

2.3.1.2 Orthoretrovirale Vektoren

Für den Einsatz als Transfervektor werden bis heute einfache Gammaretroviren

verwendet, denen alle Gene (gag, pol und env) entfernt wurde. An Stelle viraler

Gene wird ein therapeutisches Gen oder ein Markergen als Transgen in den Vektor

ligiert. Einige essentielle Elemente bleiben im Transfervektor: das Verpackungssignal

ψ ist notwendig, damit die virale mRNA in den neu gebildeten viralen Partikel

inkorporiert wird; der Vektor enthält die LTRs, die für die Integration in das Genom

12

Literatur

der Zielzelle nötig sind. Dazu gehören Primerbindungsstelle und der Polypurintrakt

als Startpunkt der reverse Transkription. Die Sequenzen, die für die viralen

Strukturproteine, Enzyme und das Hüllprotein kodieren, sind auf andere

Expressionsplasmide verteilt. Die transkribierte RNA von gag, pol und env werden

nicht in die viralen Partikel inkorporiert, da ihnen das Verpackungssignal ψ fehlt. Aus

diesem Grund kann die „Gensequenzen“ für gag, pol und env auch nicht in das

Genom der Zielzelle gelangen.

Die Plasmide, die nur strukturelle Komponenten für den Viruspartikel bereitstellen,

werden Helferplasmide genannt. Durch gleichzeitige Transfektion mit den

Transfervektorplasmiden und Helferplasmiden lassen sich effizient rekombinante,

replikationsdefekte Retroviren generieren (SONEOKA et al. 1995). Die Effektivität

der Virusproduktion kann gesteigert werden, indem die U3-Region des 5`LTRs im

Vektorplasmid durch die Promotorsequenz eines sehr starken Promotors wie z.B. der

intermediate early promotor des humanen Cytomegalyvirus (CMV-Promotor) ersetzt

wird. Die Helferplasmide können ebenfalls von einem CMV-Promotor aus abgelesen

werden. Auf diese Weise lassen sich hochtitrige Virusüberstände generieren (PEAR

et al. 1993; FINER et al. 1994; NAVIAUX et al. 1996). Der CMV-Promotor kann durch

die zusätzliche Gabe von Natriumbutyrat während der Virusproduktion aktiviert

werden (RADSAK et al. 1989; TANAKA et al. 1991). Der Virustiter eines so

erzeugten Überstandes kann 8- bis 12-mal höher sein, als ohne Natriumbutyrat

(LEURS et al. 2003).

Heterologe Promotoren können als interne Promotoren im Vektor vor das Transgen

gesetzt werden. Hierbei wird die Besonderheit der Retroviren, dass die 3’ U3 Region

bei der Integration auf den 5’ LTR übertragen wird, ausgenutzt. Eine Deletion im U3-

Promotor/Enhancer (ΔU3) des 3`LTRs wird bei der reverse Transkription auf den

5`LTR übertragen. Der provirale 5`LTR ist nun inaktiv und das Transgen wird vom

internen Promotor aus abgelesen; das 5’ gelegen virale Genom kann nicht mehr

abgelesen werden.

13

Literatur

2.3.1.3 Pseudotypisierung von Orthoretroviren

Pseudotypisierung beschreibt den Vorgang der Verpackung eines viralen Kapsids in

eine Virushülle (env), die nicht der natürlichen Hülle des Virus entspricht. Einige

Retroviren, wie z.B. Lenti- und Gammaretroviren, lassen sich pseudotypisieren.

Durch die Pseudotypisierung kann der Tropismus des retroviralen Vektors geändert

werden: so kann z.B. das G-Protein des Vesicular Stomatitis Virus (VSV-G) zur

Pseudotypisierung des Murine Leukemia Virus (EMI et al. 1991) und von Lentiviren

(YEE et al. 1994; BARTZ u. VODICKA 1997) verwendet werden. Die

Pseudotypisierung mit VSV-G führt zu einem sehr breiten Wirtsspektrum der

Retroviren (YEE et al. 1994). Die retroviralen Vektoren, die mit VSV-G verpackt

werden, erzeugen hohe Virustiter. Darüber hinaus sind die Viren sehr stabil und es

besteht die Möglichkeit, die Konzentration durch Ultrazentrifugation noch weiter zu

erhöhen (BURNS et al. 1993).

Gammaretroviren können nur sehr ineffektiv mit dem Wildtyp env des HFV

pseudotypisiert werden (LINDEMANN et al. 1997). Erst durch Ersetzen der

Transmembrandomäne des Foamyvirus mit der des amphotropen Hüllproteins

können MLV und HIV mit Hüllproteinen des Feline Foamy Virus (FFV) oder SFV

pseudotypisiert werden (LEURS 2003).

2.3.2 Spumaretroviren

2.3.2.1 Merkmale der Spumaretroviren

Foamyviren (FV) sind mit ca. 13 kb die größten, bisher bekannten Retroviren. Sie

werden aufgrund ihres Aufbaus mit gag, pol und env sowie den zusätzlichen

Leserahmen tas und bet den komplexen Retroviren zugeordnet (RETHWILM 2003).

Einige biologischen Eigenschaften teilen sie sich auch mit den Hepatitisviren, so

dass sie innerhalb der Retroviren eine eigene Subfamilie bilden (LINIAL 1999).

14

Literatur

Die ersten Foamyviren wurden 1971 aus den Zellen eines kenianischen Patienten

mit Nasopharynx-Karzinom isoliert (ACHONG et al. 1971). Aufgrund seines

Ursprungs wurde dieses Virus als Human Foamy Virus (HFV) bezeichnet. Später

konnte gezeigt werden, dass das HFV ein Derivat von einem Schimpansen FV ist

(HERCHENRÖDER et al. 1994); dieses FV wurde daraufhin als Prototyp FV (PFV)

bezeichnet. Zahlreiche Säugetiere stellen für Foamyviren einen natürlichen Wirt da.

Sie wurden in verschiedenen Affenarten wie Schimpansen, Gorillas und Orang-Utans,

sowie in Pferden, Kühen und Katzen nachgewiesen (MEIERING u. LINIAL 2001).

Der Mensch ist kein natürlicher Wirt von FV, allerdings können FV der verschiedenen

Spezies durch Biss auf den Menschen übertragen werden.

Im natürlichen Wirt führt eine Foamyvirus-Infektion zu einer lebenslangen

chronischen Persistenz des Virus in der Rachenschleimhaut der Tiere. Trotz der

Persistenz konnte bisher noch keine Erkrankung mit der Infektion assoziiert werden

(WEISS 1988). Menschen, die durch Bissverletzungen verschiedener Affen mit FV

infiziert worden sind, werden in den USA vom Center of Disease Control in Atlanta

erfasst und beobachtet (SCHWEIZER et al. 1997; CALLAHAN et al. 1999). In den

vergangenen 30 Jahren führten die Infektionen zu keiner nachweisbaren Erkrankung

(LINIAL 2000). Von diesen infizierte Menschen können FV nicht über Blut, Urin,

Speichel oder Samenflüssigkeit auf andere Menschen übertragen werden (WINKLER

et al. 2000; HENEINE et al. 2003).

Die Tatsache, das FV keine Pathogenität bei Mensch und Tieren aufweisen, nicht

von Mensch zu Mensch übertragbar sind und einen breiten Wirts- und

Gewebetropismus haben, machen sie möglicherweise zu idealen Vektoren für die

Gentherapie. In der menschlichen Population kommen Antikörper gegen das Virus

praktisch nicht vor.

15

Literatur

2.3.2.2 Replikationszyklus von Foamyviren

Spumaretroviren weisen einige Unterschiede zu Orthoretroviren auf.

Spumaretroviren enthalten im Gegensatz zu anderen Retroviren im Viruspartikel

doppelsträngige DNA (YU et al. 1999). Die reverse Transkription des viralen RNA

Genoms findet bei Foamyviren schon statt, bevor das Virus die Zelle verlässt. In

experimentellen Untersuchungen, bei denen die Zellen mit 3´-Azido-3`-

deoxythymidin, ein Hemmstoff der reverse Transkription, behandelt worden waren,

konnte die Infektiösität der foamyviralen Viruspartikel kaum beeinflusst werden.

Erfolgte die Behandlung der Zellen erst nach der Infektion mit den Foamyviren,

wurden deutlich weniger neue Viruspartikel gebildet und die produzierten Viren

waren weniger infektiös (MOEBES et al. 1997; YU et al. 1999). Durch den Umstand,

dass schon in der infizierten Zelle das virale Genom als DNA-Strang vorliegt, kann es

zur Reintegration des viralen Genoms, das die Zelle infiziert hat, kommen

(HEINKELEIN et al. 2000a). Die Foamyviren verhalten sich ähnlich wie

Retrotransposons; bis zu 10 % der Viren verlassen die Zelle nicht, sondern

reintegrieren wieder in das Genom (RETHWILM 2003). Es konnten bis zu 20

Integrationen pro Genom in infizierten Zellen gefunden werden (MEIERING et al.

2000).

Ein besonderes Charakteristikum der Foamyviren ist, dass sie nicht nur einen

Promotor in der U3 Region des 3`LTRs, sondern noch einen zusätzlichen internen

Promotor besitzen. Dieser interne Promotor ist im 3`Bereich des env Gens lokalisiert

(LÖCHELT et al. 1993). Beide Promotoren werden vom Transaktivator tas reguliert.

Der foamyvirale LTR ist in der Abwesenheit von tas transkriptionell stumm

(BAUNACH et al. 1993; YU u. LINIAL 1993). Der interne Promotor hat eine

schwache basale Aktivität (YANG et al. 1997) und bildet so in der Frühphase des

Replikationszyklus das Protein tas. Das tas Protein des FV bindet spezifisch an die

U3 Region des FV LTRs. Die Bindung von tas führt zu einer starken Steigerung der

Genexpression (LOCHELT 2003). Das tas ist nicht in der Lage andere Promotoren,

wie z.B. den von HIV, zu aktivieren (OMOTO et al. 2004).

16

Literatur

2.3.2.3 Foamyvirale Vektoren

Replikationskompetente foamyvirale Vektoren wurden zuerst von SCHMID und

RETHWILM (1995) entwickelt. Aufgrund der Größe des Genoms von 13 kb, haben

Foamyviren eine potentiell hohe Kapazität, große heterologe Gensequenzen zu

verpacken. Die Vektoren können eine Vielzahl von Säugerzellen transduzieren und

werden darüber hinaus von menschlichem Serum nicht inaktiviert (RUSSELL u.

MILLER 1996).

Die Vektoren haben Deletionen in der U3-Region und in der 3`Region des viralen

Genoms, die zum Teil in Kultur spontan entstanden sind. Mit diesen Vektoren konnte

eine kleine Transgenkassette in Zellen übertragen werden (SCHMIDT et al. 1995).

Die ersten replikationsinkompetenten foamyviralen Vektoren wurden dann 1996

etabliert (RUSSELL et al. 1996). Durch die Deletion des env Gens wurde der interne

Promotor entfernt und eine Replikation des Virus somit unterbunden. Die

Vektorherstellung erfolgte mit einem Helferplasmid, das für env kodiert.

Durch den Austausch des 5`LTR gegen einen CMV/LTR Hybridpromotor erfolgte die

Vektorherstellung tas unabhängig (FISCHER et al. 1998; HEINKELEIN et al. 1998;

TROBRIDGE u. RUSSELL 1998; WU u. MERGIA 1999). Auf getrennten Konstrukten

wurden gag/pol und env ebenfalls von einem CMV-Promotor aus abgelesen. Die

Expressionskassette hatte einen internen Promotor und in den Vektoren wurden

virale Sequenzen, soweit möglich, entfernt (HEINKELEIN et al. 1998; HEINKELEIN

et al. 2002a). Die foamyviralen Vektoren, die in dieser Arbeit verwendet wurden,

basieren auf den Vektoren MH5 und MH12, die in einer Veröffentlichung von

HEINKELEIN (1998) beschrieben sind.

Hämatopoetische Stammzellen haben nur eine geringe Teilungsaktivität und

befinden sich zum überwiegenden Teil in der G0-Phase (YU 1996). Mit VSV-G

pseudotypisierte Lentiviren können terminal differenzierte, teilungsinaktive Zellen,

wie z. B. Neurone, effektiv transduzieren (NALDINI et al. 1996). Die so

pseudotypisierten Viren können auch hämatopoetische Stammzellen effektiv

transduzieren (VON LAER et al. 2000; LEURS et al. 2003).

17

Literatur

Gammaretrovirale Vektoren sind dagegen auf eine Zellteilung angewiesen, damit der

virale Präintegrationskomplex in das Genom integrieren kann. Der

Präintegrationskomplex kann die intakte Kernmembran, die nur während der

Teilungsphase aufgelöst wird, nicht passieren (ROE et al. 1993; TROBRIDGE u.

RUSSELL 2004). Auch Foamyviren können nur in die DNA von Zellen integrieren,

wenn sich die Zelle teilt. Es wurde gezeigt, dass FV Zellen mit einer geringen

Teilungsaktivität effizienter transduzieren können als Gammaretroviren (RUSSELL et

al. 1996; MERGIA et al. 2001). Der foamyvirale Präintegrationskomplex bleibt in der

Zelle stabil und kann noch 14 Tage nach der Transfektion bei einer Zellteilung in das

Genom integrieren (TROBRIDGE et al. 2004).

Betrachtet man Integrationsstellen von foamyviralen Vektoren im Genom

transduzierter humaner Zellen, so unterscheiden sich diese deutlich von denen lenti-

und gammaretroviraler Vektoren. HIV-Vektoren integrieren besonders häufig in den

Chromosomen 16, 17, 19 und 22, wohingegen MLV in das Chromosom 17 integriert

(SCHRODER et al. 2002; WU et al. 2003; NOWROUZI et al. 2006). Foamyvirale

Vektoren haben keine besondere Präferenz für bestimmte Chromosomen

(NOWROUZI et al. 2006; TROBRIDGE et al. 2006). Darüber hinaus integrieren HIV-

Vektoren besonders häufig in aktive Gene, wie zum Beispiel in Onkogene; MLV

bevorzugt zur Integration in das Wirtsgenom Bereiche in der Nähe von

Transkriptionsstartpunkten. FV integrieren dagegen häufig in „CpG-Inseln“. Hierbei

handelt es sich um Regionen, die in der Nähe von Promotoren liegen oder es sind

nicht kodierende Genomabschnitte, wie sie an den Zentromeren vorkommen

(NOWROUZI et al. 2006; TROBRIDGE et al. 2006).

18

Literatur

2.3.2.4 Verpacken von Foamyviren

Foamyviren besitzen im Gegensatz zu anderen Retroviren ein diskontinuierliches

Verpackungssignal (ψ), das bei Foamyviren auch cis acting sequence

(CAVAZZANA-CALVO et al.) I und II genannt wird (HEINKELEIN et al. 2002a). CAS I

und II werden benötigt, damit das virale Genom in den Viruspartikel verpackt werden

kann. (HEINKELEIN et al. 1998; HEINKELEIN et al. 2000b). CAS I erstreckt sich

vom 5`LTR bis in das gag Gen. CAS II ist im 3`Bereich des pol Gens codiert

(Abbildung 2). Fehlt einer der beiden Regionen auf einer mRNA-Sequenz, kann

diese mRNA nicht verpackt werden. Das pol Protein kann bei FV allein in den

foamyviralen Partikel inkorporiert werden, unabhängig davon ob gag Proteine

anwesend sind (ENSSLE et al. 1996). Prägenomische RNA ist notwendig, damit die

pol Proteine in den Viruspartikel aufgenommen werden können (HEINKELEIN et al.

2002b).

Im Unterschied zu den anderen Retroviren können Foamyviren nur dann Partikel

bilden, wenn neben den Strukturgenen gag und pol auch das foamyvirale env

vorhanden ist (LINDEMANN u. GOEPFERT 2003). Da die Gegenwart des

foamyviralen env Proteins eine Voraussetzung für die Partikelbildung ist (RETHWILM

2003), lassen sich FV nicht mit heterologen Hüllproteinen oder dem VSV-

Glykoprotein pseudotypisieren (PIETSCHMANN et al. 1999).

19

Literatur

2.4 Selektion transgener Zellen in vitro und in vivo Bei manchen Erkrankungen, die gentherapeutisch behandelt werden, bietet das

Transgen den Zellen einen selektiven Überlebensvorteil. Der Einfluss einer in vivo

Selektion wird insbesondere durch die Gentherapie-Studien bei Patienten mit X-

linked-SCID und chronischer Granulomatose deutlich (CAVAZZANA-CALVO et al.

2000; HACEIN-BEY-ABINA et al. 2002).

Ein selektiver Wachstumsvorteil für genkorrigierte Zellen kann entscheidend für

einen klinisch-therapeutischen Erfolg sein. Für die Mehrzahl von Erkrankungen, die

mittels Gentherapie behandelbar sein könnten, existiert jedoch kein solcher

selektiver Wachstumsvorteil aufgrund der alleinigen Expression des therapeutischen

Transgens.

In vivo Selektion von gentechnisch veränderten Zellen durch einen artifiziell

erzeugten Selektionsvorteil der genkorrigierten Zellen kann in Fällen entscheidend

sein, in denen das Transgen selbst den Zellen keinen Selektionsvorteil bietet. Dies

ist beispielsweise bei der chronischen Granulomatose oder der Thalassaemie der

Fall (PFEIFER u. VERMA 2001). Mit Hilfe eines Selektionsvorteils kann die Anzahl

der transgenen Zellen im Organismus auf eine Zahl gesteigert werden, die

Bedingung für eine phänotypische Heilung des Patienten ist.

Das aussichtsreichste Chemotherapieresistenzgen für eine in vivo Selektion von

hämatopoetischen Stammzellen ist das Protein O6-Methylguanin-DNA-

Methyltransferase (MGMT). MGMT behebt DNA Schäden, die durch alkylierende

oder durch chlorethylierende Agenzien verursacht werden. Die bekanntesten

alkylierenden Substanzen sind Nitrosamine. 1,3-bis-(2-chloroethyl)-1-Nitrosourea

(BCNU), dessen Wirkstoffname Carmustin ist, gehört zu den chlorethylierenden

Substanzen. Einige Chemotherapeutika, die zur Behandlung von onkologischen

Erkrankungen eingesetzt werden, gehören zur Gruppe der alkylierenden

Substanzen; Beisiele hierfür sind Temozolomid und Streptozotozin.

Die aufgeführten Substanzen schädigen die DNA, indem sie Basen spezifisch

modifizieren. Dabei wird unter anderem die Alkylgruppe an der O6 Position des

Guanin methyliert, was wiederum zur Quervernetzungen der DNA führen kann

20

Literatur

(PEGG et al. 1995). Daneben treten noch andere DNA Schäden auf, die jedoch von

MGMT nicht korrigiert werden können; MGMT repariert nur Methylierungen an der O6

Position von Guanin. Die Alkylgruppe wird dabei vom Guanin zu einem Cysteinrest in

das katalytisches Zentrum des Proteins transferiert (BRENT u. REMACK 1988).

Benzylguanin (BG) ist ein Guanin-Analogon. BG kann an das katalytische Zentrum

von MGMT binden und es dadurch irreversibel inaktiviert (DOLAN et al. 1991).

Das Expressionslevel von MGMT ist nicht in allen menschlichen Geweben gleich

hoch. Die Leber hat eine hohe MGMT-Aktivität, die myeloischen Vorläuferzellen

kommen dagegen nur auf 6,6% der Aktivität von Hepatozyten (GERSON et al. 1985).

Auch in anderen Untersuchungen wurde gezeigt, dass hämatopoetische

Vorläuferzellen nur ein geringes MGMT Level haben und dadurch gegenüber einer

Behandlung mit BCNU empfindlich sind (GERSON et al. 1996).

Einige Tumore überexprimieren MGMT und sind so gegenüber alkylierenden

Chemotherapeutika resistent (PREUSS et al. 1996). Benzylguanin wird in einigen

Studien dazu verwendet, die Empfindlichkeit der Tumorzellen gegenüber

Chemotherapeutika zu erhöhen, indem durch BG die Aktivität des Wildtyp MGMT

inhibiert wird (Dolan et al. 1991; Kreklau et al. 1999).

In einer Phase I Studie bei Patienten mit Gliom oder Glioblastom, die nicht

empfindlich gegenüber alkylierenden Substanzen waren, konnte bei einer

Behandlung mit BG und BCNU eine Regression des Tumors festgestellt werden. Die

Behandlungsmöglichkeiten sind jedoch durch die gleichzeitige Myelosuppression

limitiert (QUINN et al. 2002).

Im Vergleich zum Wildtyp MGMT haben MGMT Mutanten, wie P140A und G156A,

eine 40- resp. 240-fach höhere Resistenz gegenüber BG. Diese kommt aufgrund

einer sterischen Hinderung zustande, die durch die Mutation entstanden ist und die

die Bindung von BG verhindert (XU-WELLIVER et al. 1998). Beide Mutanten können

in vitro hämatopoetische Zellen (REESE et al. 1996; MAZE et al. 1999) und im Maus

Modell Knochenmark vor den toxischen Schäden einer kombinierten Behandlung mit

BG und BCNU schützen (DAVIS et al. 1997). Auch die Mutante P140K weist diese

schützende Eigenschaft gegenüber der gleichzeitigen Gabe von BG und BCNU

21

Literatur

sowohl in vitro (DAVIS et al. 1999) als auch im Maus Modell in vivo auf (RAGG et al.

2000). Die Resistenz von P140K gegenüber BG ist etwa 40- bis 1000-fach höher als

die des Wildtyp MGMT (DAVIS et al. 1999).

Zur Expression von MGMT Mutanten wurden bisher ausschließlich gammaretrovirale

(CHINNASAMY et al. 2004) und lentivirale Vektoren (RAGG et al. 2000) eingesetzt.

In neueren in vitro Untersuchungen wurde die Effektivität von lentiviralen- und

gammaretroviralen Vektoren zur Expression von MGMT Mutanten verglichen

(SCHAMBACH et al. 2006). MGMTp140k wurde schon mittels gammaretroviraler

Vektoren erfolgreich in hämatopoetische Stammzellen von Hunden eingebracht, die

dann in vivo selektioniert werden konnten (NEFF et al. 2003).

In einem ersten Experiment mit FV als Gentransfervektor für MGMT wurde der

Vektor MD9.MGMTp140kIEG in einem 3-Plasmid-System verwendet; die Effizienz

wurde mit der eines gammaretroviralen Vektors in murinen CD34+ Zellen verglichen

(POLLOK et al. 2005). Die transduzierten Zellen wurden Mäusen transplantiert. Im

peripheren Blut dieser Tiere wurde anschließend die Anzahl transgener Zellen

gemessen, die bei dem gammaretroviralen Vektor deutlich höher war als bei dem

foamyviralen Vektor. Die transgenen Zellen ließen sich in vivo mit einer kombinierten

Behandlung mit BG und BCNU erfolgreich selektionieren.

22

Literatur

2.5 Interaktionen zwischen Viruspartikeln und Zielzellen

Hämatopoetische Stammzellen stellen ein wichtiges Ziel für genetische

Modifikationen mit retroviralen Vektoren dar. Die erzielten Gentransferraten lagen

jedoch nicht in Bereichen, die für eine Therapie zufrieden stellend sein könnten. Erst

mit Hilfe von Fragmenten der Extrazellulärmatrix des Knochenmarks konnten die

Gentransferraten gesteigert werden.

Fibronektin (FN) kommt in der Mikroumgebung des Knochenmarks vor und ist für die

Interaktion von Zellen untereinander und zwischen Zellen und Matrix von Bedeutung

(YODER u. WILLIAMS 1995). Die Transduktionsrate von humanen

hämatopoetischen Progenitorzellen konnte signifikant gesteigert werden, indem die

Transduktion der retroviralen Vektoren auf Fibronektinfragmenten aus dem

peripheren Blut durchgeführt wurde (MORITZ et al. 1994).

Um den Mechanismus des durch Fibronektin verbesserten Gentransfers beschreiben

zu können, wurden funktionelle Domänen von Fibronektin hinsichtlich ihres

Einflusses auf die Transduktionsrate untersucht. Das Fragment CH-296 hat zwei

Bindungsdomänen für Zellen (CBD und CS1) und eine weitere für Heparin. An die

Heparinbindungsdomäne binden Retroviren, die mit amphotropen Hüllproteinen

pseudotypisiert sind, wahrscheinlich über Proteoglykane an die Oberfläche. Viren

und Zellen werden so in eine räumliche Nähe gebracht und die Gentransfer wird

effektiv gesteigert (HANENBERG et al. 1996).

Gibt man Virusüberstand auf ein mit Fibronektin beschichtetes Zellkulturgefäß und

entfernt anschließend wieder den Überstand, so bleibt ein Teil der Viren am

Fibronektin haften. Gibt man wiederholt Virusüberstand auf das Fibronektin und

nimmt ihn wieder ab, so führt dieses zu einem Anstieg der Zahl gebundener

Viruspartikel am Fibronektin und zu eineme signifikanten Anstig der Gentransferrate

(HANENBERG et al. 1997). Auf diese Weise konnte FN für den Gentransfer in

hämatopoetische Zellen vor allem in Studien an Tieren etabliert werden (VON LAER

et al. 2000; NEFF et al. 2003).

23

Literatur

2.6 Neuweltaffen als Modell für Gentransfer

Viele präklinische Studien wurden initial in Mausmodellen durchgeführt. Mäuse

werden für Studien zur somatische Gentherapie schon seit über 20 Jahren

eingesetzt (DICK et al. 1985). In einigen Versuchen konnte Mäusen mit hoher

Effizienz transduzierte hämatopoetische Stammzellen transplantiert werden

(WILLIAMS et al. 1984; DICK et al. 1985; EGLITIS et al. 1985; WILLIAMS 1990).

Allerdings zeigten folgende Studien am Menschen, dass die Gentherapie unter

gleichen Bedingungen nicht zufrieden stellend verlief (CRYSTAL 1995; ORKIN et al.

1995). Unterschiede in der Hämatopoese beider Spezies sind mutmaßlich für diese

Diskrepanz der Versuchsergebnisse mitverantwortlich. In Mäuse kann mit nur fünf

aktiven Stammzellklonen die Hämatopoese aufrecht erhalten werden (SPANGRUDE

et al. 1988; SPANGRUDE et al. 1995), höhere Tiere wie Rhesusaffen haben

hingegen eine polyklonale Hämatopoese, d.h. sie sind auf wesentlich mehr

verschiede Klone angewiesen, um ihre Hämatopoese aufrecht zu erhalten

(SCHMIDT et al. 2002).

Um die Besonderheiten des Menschen in solchen Studie besser zu berücksichtigen,

wurden Tiere ausgewählt, zu denen ein engeres Verwandtschaftsverhältnis besteht.

Für Gentransferstudien der Hämatopoese wurden bereits verschiedene Affenspezies

wie Paviane (Papio cynocephalus anubis) (KIEM et al. 1997), Rhesusaffen (Macaca

mulatta) (DUNBAR et al. 1996), Javaneraffen (Macaca fascicularis) (HANAZONO et

al. 2002) und Marmosets (Callithrix jacchus) (HIBINO et al. 1999) eingesetzt. Sowohl

in Pavianen, als auch in Makaken konnten Foamyviren nachgewiesen werden; in

Marmosets gelang dieser Nachweis nicht (RETHWILM et al. 2005).

Marmosets, die zur Familie der Krallenaffen gehören, haben darüber hinaus weitere

Vorteile, die sie für Gentransferstudien der Hämatopoese besonders interessant

machen. Mit einem Gewicht von 300 bis 500 g und einer Körpergröße zwischen 18

und 30 cm sind diese Affen im Vergleich zu anderen Affenarten sehr klein, lassen

sich leicht halten und sind unkompliziert im Umgang. Die Lebenserwartung von

Marmosets beträgt etwa 10 Jahre in freier Wildbahn und bis zu 20 Jahre in

menschlicher Obhut, was für eine längerfristige Beobachtung der Hämatopoese nach

24

Literatur

einer Transplantation von Vorteil ist. In anderen Tiermodellen, wie z.B. Mäusen,

wurde erst spät erkannt, dass gammaretrovirale Vektoren Malignome induzieren

können (LI et al. 2002). Diese späte Erkenntnis hing wahrscheinlich mit der geringen

Lebenserwartung dieser Tiere zusammen. Mittlerweile wurde auch in einem

Affenmodel nachgewiesen, dass gammaretrovirale Vektoren Malignome induzieren

können (SEGGEWISS et al. 2006).

Hämatopoetische Zellen von Marmosets sind seit Anfang der 1980er Jahre

immunologisch charakterisiert (CRAWFORD et al. 1981). Eine Vielzahl humaner

Zytokine und Antikörper reagieren mit den hämatopoetischen Zellen von Marmosets

(HIBINO et al. 1999). Anti-humane monoklonale Antikörper lassen sich zur

Phänotypisierung von Leukozytensubpopulationen einsetzen (BROK et al. 2001). Für

die Analyse und Anreicherung CD34+ Zellen von Marmosets ist ein monoklonaler

Antikörper „MA24“ etabliert worden (IZAWA et al. 2004). Die Eignung von Marmosets

für hämatopoetische Gentherapiestudien ist erstmals an Vergleichsuntersuchungen

gezeigt worden, bei denen Knochenmarkzellen von Marmosets und humane

Vorläuferzellen mit retroviralen Vektoren transduziert wurden (HIBINO et al. 2001).

25

Material und Methoden

3. Material und Methoden

3.1 Verwendete Materialien

3.1.1 Plasmide Vektorplasmide

Die in der vorliegenden Untersuchung genutzten retroviralen Plasmiden gehören,

anhand ihres Aufbaus charakterisiert, zu den sogenannten self-inaktivating (SIN)

Vektoren, bei denen der Promotor- und Enhancer-Bereich im 3’ LTR deletiert ist.

Dadurch wird dieser defekte U3- Bereich des LTRs bei der Integration in das Genom

der Zielzelle auf den U3- Bereich der 5’ LTRs geschrieben; in der Folge sind beide

LTRs des Provirus transkriptionell stumm. Für die transiente Virusproduktion tragen

alle Plasmide statt des 5’ LTR den starken intermediate early Promotor des Human

Cytomegalyvirus. Zusätzlich tragen alle Vektoren einen Internen Promotor von dem

aus, der das aus der Qualle Aequorea victoria stammende und für das humane

coding optimierte grün fluoreszierende Protein (GFP) als Markergen für den

Gentransfer exprimiert wurde. Dieser Promotor stammt aus dem Spleen Focus

Forming Virus (SFFV), das zu der Familie der Murine Leukemia Viruses gehört. Die

beiden foamyviralen Vektoren MH71 und MD9 tragen außerdem eine

Expressionskassette, mit der cDNA für die p140k- Mutante des humanen MGMT-

Gens und des GFP, die durch eine IRES-site verbunden sind (Abbildung 2).

Die Markervektoren zur Überprüfung des Gentransfers basieren auf dem HIV, dem

MLV resp. dem PFV. Die Vektoren pCAMSΔU3E (MLV-Vektor) und MH71 (SFV-

Vektor), MD9 (SFV-Vektor) wurden von Herrn Dr. Lindemann und Prof. Rethwilm,

Institut für Virologie, Technischen Universität Dresden, zur Verfügung gestellt.

26


ΔU3

polgagCMVRU5

GFPU3

gag*CMV GFPU3envRRE

env

cPPT

RU5* *

ΔU3

MLV-Vektor

pCAMSΔU3E

HIV-Vektor

pCL1

SFFV

polgagCMV

RU5ΔU3GFPU3

ψ ψ

SFFV

SFFV

ψ

ψ

PFV-Vektor

MH71

pol*CMVRU5

ΔU3GFPU3gag*CMV

ψ ψ

SFFVPFV-Vektor

MD9

polgagCMV

RU5

ψ ψΔU3GFPU3 IRESMGMT

SFFVPFV-Vektor

MH71.MGMTp140kIEG

PFV-Vektor

MD9.MGMTp140kIEG pol*CMVRU5

ΔU3U3gag*CMV

ψ ψGFPIRESMGMT

SFFV

ΔU3

polgagCMVRU5

GFPU3

gag*CMV GFPU3envRRE

env

cPPT

RU5* *

ΔU3

MLV-Vektor

pCAMSΔU3E

HIV-Vektor

pCL1

SFFV

polgag

polgagCMV

RU5ΔU3GFPU3

ψ ψ

SFFV

SFFV

ψ

ψ

PFV-Vektor

MH71

pol*CMVCMVRU5

ΔU3GFPU3 ΔU3GFPU3gag*CMV

ψ ψ

SFFVPFV-Vektor

MD9

polgag

polgagCMV

RU5

ψ ψΔU3GFPU3 IRESMGMT

SFFV

ΔU3GFPU3 IRESMGMT

SFFVPFV-Vektor

MH71.MGMTp140kIEG

PFV-Vektor

MD9.MGMTp140kIEG pol*CMVCMVRU5

ΔU3U3gag*CMV

ψ ψGFPIRESMGMT GFPIRESMGMT

SFFV

Abbildung 2: Darstellung der verschiedenen Vektorplasmide Schematische Darstellung der verschiedenen Vektorplasmide. Gag und pol bezeichen kodierende

Sequenzbereiche des viralen Genoms. Bei gag* und pol* sind Teile der viralen Gene deletiert worden,

die nicht für das Verpackungssignal (ψ) kodieren. Der mit Env* bezeichnete Sequenzbereiche des

Hüllproteins wurde zum Teile deletiert. Der CMV-Promotor ersetzt die U3- Region des 5’ LTRs. Dann

folgt die redundanten Region (R), der sich die U5- Region des HIV, MLV oder PFV anschließt. SFFV

U3 bezeichnet den U3 Promotor des SFFV, der hier als internen Promotor für das Gen oder die

Genkassette dient. Das Gen, das durch den SSFV-Promotor angetrieben wird, ist das grün

fluoreszierende Protein (GFP). Bei den beiden unteren Vektoren besteht die Expressionskassette aus

dem MGMTp140k (MGMT) Transgen, der internal ribosome entry site (IRES) und dem GFP. In dem 3’

LTR, der auf das Gen bzw. die Genkassette folgt, sind Teile des ΔU3 der Promotor- und Enhancer-

Sequenz deletiert.

27


Der foamyviralen Vektor MD9.MGMTp140IEG (MD9.MGMT) wurde aus dem Vektor

MD9 und dem MGMTp140K Gen generiert und stand wie der Vektor pCL1 (HIV-

Vektor) aus Vorarbeiten zur Verfügung. Der Vektor MH71.MGMTp140kIEG

(MH71.MGMT), der von dem Vektor MH71 abgeleitet ist, wurde in Eigenarbeit

kloniert.

Helferplasmide Für die Produktion rekombinanter replikationsdefekter Retroviren wurde ein Teil der

viralen Gene getrennt vom Vektor zur Generierung des Virus zur Verfügung gestellt.

Diese nicht integrierenden Expressionsplasmide werden als Helferplasmide

bezeichnet. Die viralen Gene der verwendeten Helferplasmide stehen unter Kontrolle

des CMV-Promotors. Das Helferplasmid des HIV-Vektors, CD/NL-BH (MOCHIZUKI

et al. 1998) trägt kodierende Sequenzen für gag und pol, sowie für die Gene vif, vpr,

vpu, rev und tat und wurden von Herrn Dr. Reiser, Louisiana State University School

of Medicine, New Orleans, Louisiana 70112, USA zur Verfügung gestellt.

Bei der Herstellung der foamyviralen Virusüberstände wurden verschiedene

Helferplasmide für die Expression von foamyviralem gag und pol verwendet. Das

Plasmid cmvgp1 exprimiert gag und pol als zwei einzelne gespleißte RNAs

(Abbildung 3). Die anderen Helferplasmide kodieren entweder für gag (pcziGag und

p6iGag) oder für pol (pcziPol und p6iPol) und wurden immer so kombiniert, dass die

gag und pol Proteine gemeinsam in einer Zelle zur Verfügung standen. Sowohl die

pczi als auch die p6i Konstrukte haben in ihrem Backbone die bovine growth hormon

polyA site (bGH pA) (Abbildung 4). Diese DNA Sequenz führt dazu, dass das virale

Genprodukt in der Produzentenzelle polyadenyliert wird und verhindert so, dass

weitere Teile des Backbone abgelesen werden. Zudem tragen beide Vektoren eine

Ampicillinresistenzgen, ein Col El für multicopy Plasmide und den SV40ori, der im

pcziPol Helferplasmid im SV40 Promotor lokalisiert ist. In Zellen, die das large-tumor-

antigen des Simian Virus 40 (SV40) tragen, werden Plasmide mit einem SV40ori

verstärkt exprimiert. Origin of Replikation (ori) stellen DNA Sequenzen da, die als

28


Startpunkte der DNA Replikation für unterschiedliche Organismen dienen können.

Der pczi Backbone enthält zusätzlich noch ein Zeocinresistenzgen, einen ori für

Bakteriophagen f1 und ein poly Adenylierungssignal SV40pA (alle Teile des pcDNA3

Plasmids von Invitrogen).

In Abbildung 3 ist der virale Teil der Vektoren schematisch dargestellt (Backbone

nicht gezeigt). Die foamyviralen Helferplasmide wurden vom Herrn Dr. Lindemann

zur Verfügung gestellt.

CMVCMV polgag

pA+RU5

ψ ψ

pA+CMVCMV gag

RU5

ψ

pA+CMVCMVRU5

polψ

PFV-Helferplasmid

cmvgp1

PFV-Helferplasmid

pcziGag oder

p6iGag

PFV-Helferplasmid

pcziPol oder

p6iPol

CMVCMV

polgag

pA+RU5

ψvif

vpr

vpu

tat

envdeletion

revHIV-Helferplasmid

CD/NL-BH

CMVCMV polgag

pA+RU5CMVCMVCMV pol

gagpol

gagpA+RU5

ψ ψ

pA+pA+CMVCMV gag

RU5

ψ

pA+CMVCMVCMVRU5

polψ

PFV-Helferplasmid

cmvgp1

PFV-Helferplasmid

pcziGag oder

p6iGag

PFV-Helferplasmid

pcziPol oder

p6iPol

CMVCMVCMV

polpolgag

pA+pA+RU5

ψvif

vprvif

vpr

vpu

tat

envdeletion

envdeletion

revHIV-Helferplasmid

CD/NL-BH

Abbildung 3: Darstellung des viralen Teils der Helferplasmide Schematische Darstellung des viralen Teils der verwendeten Helferplasmide. Die Expression der

viralen Strukturgene gag und pol, sowie der lentiviralen Gene vif, vpr, vpu, tat, rev und dem deletierten

env des lentiviralen Helferplasmids werden vom CMV-Promotor angetrieben. An den CMV-Promotor

schließt sich die redundante Region (R) und die U5 Region mit den Insertionssequenzen zur

Integration in die Produzentenzelle an. Die viralen Gene werden von dem Polyadenylierungssignal

(pA+) abgeschlossen. Psi (ψ) bezeichnet das Verpackungssignal.

29


Abbildung 4: Foamyvirale Helferplasmide pcziPol und p6iPol mit Backbone abgebildet Vom Promotor des Human Cytomegalievirus (CMV-Promotor) aus werden Exon 1 und 2, in deren

Mitte ein Intron liegt, direkt gefolgt vom pol Gen abgelesen. Durch das Spleißereignis wird die mRNA

stabiler und kann besser aus dem Zellkern transportiert werden. Beide Plasmide kodieren für das pol

und ein weitestgehend deletiertes env (Δenv) Gen des Prototyp Foamy Virus, hier bezeichnet als

Human Foamy Virus (HFV). Die viralen Gensequenzen werden von einem bovine growth hormon

polyA site (bGH pA) abgeschlossen. Im Backbone tragen beide Plasmide eine Ampicillinresistenzgen

(Amp), einen Col EL für high copy Plasmide und eine Origin of Replikation des Simian Virus 40

(SV40ori). Das Plasmid pcziPol hat im Backbone zusätzlich noch ein SV40pA Signal, ein

Zeocinresistenzgen und einen ori für Bakteriophagen f1. Durch den größeren Backbone ist das

pcziPol Plasmid mit 10185 Basenpaaren (bp) um 1954 bp größer als das p6iPol Plasmid.

Hüllplasmide / env Plasmide Bei allen verwendeten Hüllplasmiden wird das env Gen durch den CMV-Promotor

kontrolliert. Das Expressionskonstrukt pczVSV-G (VSV-G) kodiert für das

Glykoprotein (G) des Vesikular Stomatitis Virus (VSV). Das pALFGaLVTM (GaLV)

kodiert für die cDNA eines chimären env Gens, das aus der Oberflächendomäne des

Gibbonaffen Leukämie Virus sowie der Transmembran- und der zytoplasmatischen

Domäne des amphotropen MLV Hüllproteins zusammengesetzt ist (STITZ et al.

2000). Dieses env Protein kann von der HIV Protease prozessiert werden; eine

30


Vorraussetzung für die erfolgreiche Pseudotypisierung. Das Plasmid wurde von Prof.

Dr. Cichutek, Paul Ehrlich Institut, Langen, zur Verfügung gestellt. Als Hüllplasmide

für die foamyviralen Vektoren sind die Plasmide pczHFVenvEM140 (EM140) und

pciSM04 (SM04) von Herrn Dr. Lindemann verwendet worden. Die Hüllproteine

stammen aus verschiedenen Foamyviren. Das EM140 hat seinen Ursprung im PFV,

das SM04 Hüllprotein stammt aus einem SFV. In beiden Hüllproteinen wurden alle

fünf Ubiquitinierungsstellen in der leader-Region ladungsneutral von Lysin zu Arginin

punktmutiert (STANKE et al. 2005). Dadurch konnte das budding des foamyviralen

Hüllproteins deutlich verbessert werden.

3.1.2 Zellen Adhärent wachsende Zelllinien HEK293T Zellen, die mit dem Adenovirus Type 5 immortalisiert wurden, sind von der

humanen embryonalen Nierenzellenlinie HEK293 abgeleitet. Zusätzlich exprimieren

diese Zellen stabil das large-tumor-antigen des Simian Virus 40 (SV40), wodurch

Plasmide mit einem SV40ori besser abgelesen werden können (DUBRIDGE et al.

1987). HT1080 Zellen sind humane Fibrosarkomzellen, die von der Deutschen

Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultur GmbH (DSMZ, D-38124

Braunschweig) bezogen wurden.

Hämatopoetische Zelllinien Die Zelllinien HEL, HL60 und K562 sind humanen Ursprungs. HEL Zellen stammen

von einem Patienten mit einer Erythroleukämie, die K562 Zellen von einem Patienten

mit einer chronischen myeloischen Leukämie und die HL60 Zellen von einem

Patienten mit Blastenschub bei einer akuten promyelozytären Leukämie. Die

hämatopoetischen Zelllinien wurden alle von der DSMZ bezogen.

31


Primäre Zellen Humanes Nabelschnurblut für die Gewinnung von CD34+ Zellen wurde von Prof.

Kögler, Institut für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika des

Universitätsklinikum Düsseldorf, zur Verfügung gestellt. Das Material stammt aus

Nabelschnurblutspenden an die Nabelschnurblutbank, die jedoch aufgrund einer

unzureichenden Zellzahl nicht zur Transplantationszwecken kryokonserviert, sondern

zu Forschungszwecken freigegeben wurden.

Marmoset Knochenmark zur Gewinnung von CD34+ Zellen wurde Tieren entnommen,

die in der Tierversuchsanlage des Universitätsklinikums Düsseldorf gehalten werden.

Für die Knochenmarkentnahme wurden die Tiere narkotisiert.

Zellkulturmedien und Zusätze Die adhärenten Zelllinien wurden in Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium (Gibco®

DMEM) mit 4,5 g/l Glukose kultiviert. Die Kultivierung der hämatopoetischen

Zelllinien erfolgt in Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Beide Medien wurden

von Invitrogen bezogen. Zur Kultivierung der primären Zellen wurde Iscove`s

Modified Dulbecco`s Medium (IMDM; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-82024

Taufkirchen) eingesetzt.

Alle Medien wurden vor ihrer Verwendung mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS, PAN

Biotech GmbH, D-94501 Aidenbach), 2 mM Glutamin (Gibco® Glutamin, Invitrogen), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Gibco® Penicillin resp. Streptomycin,

Invitrogen) angereichert.

3.1.3 Tiere Marmosets wurden für die oben genannten Versuchszwecke in der zentralen

Tierversuchsanlage der Universitätsklinik Düsseldorf gehalten. Die

Tierversuchsanlage betreibt seit mehr als 10 Jahren eine eigene Marmoset Zucht.

Alle verwendeten Tiere sind in Düsseldorf geboren und aufgewachsen. Die Tiere

32


werden dort paarweise gehalten und nur während experimenteller Studien von ihren

Artgenossen getrennt.

Das Versuchsvorhaben „Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen von

Marmosets“ ist durch die Bezirksregierung Düsseldorf genehmigt (Aktenzeichen

50.05-230-43/04).

3.2 Methoden

3.2.1 Molekularbiologische Techniken

3.2.1.1 Transformation von Bakterien und Isolierung von Plasmid DNA

Für die Vermehrung der Plasmide wurden verschiedene, Rekombinase-negative

Escherichia (E.) coli Stämme verwendet. Die Plasmide MH71,

MH71.MGMTp140kIEG und pczHFVenvEM140 wurden im E. coli Stamm JM109

(Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA) vermehrt. Alle anderen Plasmide wurden in E.

coli One-Shot® TOP10 (Invitrogen) vermehrt. Dazu wurden jeweils 100 µl (d.h. eine

Verpackungseinheit) frisch aufgetaute, transformationskompetente E. coli mit 0,1 µg

Plasmid-DNA für 20 Minuten (min) auf Eis inkubiert. Anschließen wurden die

Reaktionsansätze für 45 Sekunden (sec) in einem Thermoblock auf eine Temperatur

von 42 °C erwärmt um dann wieder für 5 min auf Eis abgekühlt zu werden. Zu den

Reaktionsansätzen wurden 500 µl Luria-Bertani-Medium (LB-Medium; Sigma-

Aldrich) pipettiert. Die Kulturen wurden bei 37 °C für 45 min und 180 Umdrehungen

pro Minute (rpm) auf einem Thermomixer inkubiert. Zur Isolierung einzelner Kolonien

wurden Ausstriche auf Agarplatten (LB-Agar, Sigma-Aldrich) angelegt, denen 100

µg/ml Ampicillin zugesetzt wurde (Ampicillin; Sigma Aldrich). Die Platten wurden über

Nacht bei 37 °C inkubiert. Am folgenden Morgen wurden 5 ml LB-Medium, das

ebenfalls mit 100 µg/ml Ampicillin angereichert war, mit einer Bakterienkolonie

inokuliert und über Tag bei 37 °C und 180 rpm inkubiert. Am gleichen Abend wurden

33


5 ml Kulturmedium in 250 ml frisches LB- Medium überführt und über Nacht bei

37 °C und 180 rpm inkubiert. Die Übernachtkultur (Maxi) wurde für 10 min bei 4000 g

zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen. Die Aufreinigung der Plasmid DNA für

die Transfektion wurde mit dem PureLink™ HiPure Plasmid Kit (Invitrogen) nach

Anweisung des Herstellers durchgeführt. Die, in Tris-EDTA-Puffer (im Kit enthalten)

aufgenommene Plasmid-DNA wurde spektralphotometrisch mit einem Photometer

(Bio Photometer; Eppendorf AG, D-22339 Hamburg) quantifiziert. Die verschiedenen

Plasmid-Präparationen wurden mittels eines analytischen Restriktionsverdaus (alle in

dieser Arbeit verwendeten Enzyme stammten von New England Biolaps, D-65926

Frankfurt) und anschließender Gelelektrophorese (Biozym LE Agarose, Biozym, D-

31833 Hessisch Oldendorf) kontrolliert.

3.2.1.2 Klonierung des Plasmids MH71.MGMTp140kIEG

Aus dem Plasmid MD9.MGMTp140kIEG wurde das MGMT-Gen mit der

Punktmutation p140k mit Hilfe der Enzyme Asc I und Rsr II herausgeschnitten und in

den Vektor MH71 ligiert. Insgesamt 2 µg des Vektors MH71 und 3 µg des Vektors

MD9.MGMTp140kIEG, aus dem das Insert MGMT herausgeschnitten wurde, sind mit

den Enzymen AscI und RsrII zwei Stunden bei 37 °C verdaut worden. Der Vektor

(MH71) wurde nach dem Verdau eine Stunde bei 37 °C mit einer alkalischen

Phosphatase (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert. In einer anschließenden

Gelelektrophorese mit einem 0,4 %-igen Agarosegel (Biozym LE Agarose) wurden

die einzelnen DNA-Fragmente aufgetrennt. Die spezifische DNA für den Vektor

(MH71) und das Insert (MGMT) wurden aus dem Gel aufgereinigt. Die Extraktion der

DNA aus dem Gel erfolgte mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, D-

40724 Hilden) nach Anweisung des Herstellers. Im Anschluss an die Extraktion

wurde die DNA Konzentration photometrisch bestimmt. Vektor und Insert wurden im

Verhältnis 1:1 gemischt und anschließend unter Verwendung einer T4-Ligase und

eines Ligase-Puffers (beides New England Biolabs) für 10 min bei Raumtemperatur

ligiert. Die Hälfte des Reaktionsansatzes wurde in frisch aufgetaute E. coli One-Shot®

34


TOP 10 transformiert. Nach der Transformation wurden 500 µl LB-Medium zu dem

Ansatz pipettiert und die Kultur bei 37 °C und 180 rpm für 45 min inkubiert. Ein

Ausstrich zur Isolierung einzelner Klone wurde auf LB-Ampicillin-Platten angelegt.

Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 3 ml

LB-Medium, dem ebenfalls Ampicillin zugesetzt war, mit jeweils einer

Bakterienkolonie inokuliert und über Nacht inkubiert. Die Plasmid DNA wurde aus

den Bakterien mittels dem Fast Plasmid Mini Kit (Eppendorf) nach Anweisung des

Herstellers aufgereinigt. Die gewonnene Plasmid DNA wurde mit dem Enzym BSRG

I verdaut, um die Richtigkeit des neuen Plasmids zu überprüfen. Das neue Plasmid

MH71.MGMTp140kIEG wurde zur Vermehrung in den E. coli Stamm JM109

transformiert.

3.2.2 Zellkulturtechniken

3.2.2.1 Kultivierung eukaryotischer Zelllinien

Alle Zelllinien wurden in einem Inkubator bei 37 °C in feuchtigkeitsgesättigter

Atmosphäre mit 5 % CO2 in Zellkulturgefäßen (Corning® Costar®, Corning B.V. Life

Sciences, NE-1119 Schipol-Rilk) kultiviert. Abhängig von der Proliferationsrate

wurden die adhärenten Zellen zwei bis dreimal pro Woche passagiert. Dazu wurde

das Medium entfernt, die Zellen mit Ca2+/Mg2+ -freier, Phosphat gepufferter Saline

(PBS, Dulbecco`s (1x), PAA Laboratories GmbH, D- 35091 Cölbe) gewaschen und

für 5 min mit einer Trypsin / EDTA-Lösung (0,05 % Trypsin / 0,02 % EDTA-Lösung in

Dulbecco`s PBS, PAA) im Brutschrank inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden in

Medium resuspendiert und ein Fünftel der Zellen wurde in neue Zellkulturgefäße

überführt. Um die hämatopoetischen Zellen zu passagieren, wurden diese

gleichmäßig im Medium verteilt und 8/10 bis 9/10 des Zellmedium-Überstandes

verworfen. Das Volumen des verworfenen Mediums wurde durch frisches Medium

ersetzt. Die Zellzahlbestimmung erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer. Die Zellen

wurden für diesen Vorgang mit Trypanblau (Sigma-Aldrich) gefärbt.

35


3.2.2.2 Kryokonservierung eukaryotischer Zellen

Zur langfristigen Aufbewahrung wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff tiefgefroren.

Die Suspensionszellen und die adhärenten Zellen, die mit Trypsin abgelöst und in

Medium resuspendiert worden sind, wurden dafür bei 400 g, 5 min und

Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen (1 x

10 6 bis 3 x 106) wurden in Medium resuspendiert, dem 6% Dimethylsulphoxid

(DMSO, Sigma-Aldrich) zugesetzt war. Anschließend wurde die Zellsuspension in

Kryoröhrchen (Corning) überführt. Die Röhrchen wurden in Kryocontainern (Nalgene,

Nalge Nunc International, Rochester, NY 14625, USA) platziert, deren

Zwischenboden mit 2-Propanol (Merck KGaA, D-64271 Darmstadt) befüllt war. Diese

Container wurden bei -80 °C eingefroren. Am darauf folgenden Tag wurde der

Container mit Inhalt in den Stickstofftank überführt.

Zur Rekultivierung wurden die Röhrchen aus dem Stickstofftank entnommen und in

einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut. Die Zellen wurden dafür bei 400 g, 5 min und

RT zentrifugiert und das DMSO-haltige Medium anschließend verworfen. Die Zellen

wurden in frisches Medium aufgenommen und in eine Zellkultur-Flasche oder Platte

überführt.

3.2.2.3 Mykoplasmentest

Alle Zelllinien wurden vor der Verwendung auf eine mögliche Kontamination mit

Mykoplasmen untersucht. Diese Untersuchung wurde alle drei bis vier Monate

wiederholt. Der eingesetzte Mykoplasmen-ELISA (Mycoplasma Detection Kit, Roche

Diagnostics GmbH, D-82372 Penzberg) detektiert Kontaminationen mit folgenden

Mycoplasma species: Mycoplasma (M.) arginini, M. hyorhinis, M. orale und

Archeoplasma laidlawii. Die Nachweisgrenze wird vom Hersteller mit 106–107 colony

forming units (CFU)/ml für M. arginini und M. hyorhinis, mit 105-106 CFU/ml für M.

orale und mit 104-105 CFU/ml für Archeoplasma laidlawii angegeben.

36


3.2.2.4 Gewinnung primärer Zellen

Humanes Nabelschnurblut wurde mit 22 g/l Natriumcitrat, 28 g/l Glukose und 8 g/l

Zitronensäure (KAPLAN et al.) versetzt zur Verfügung gestellt. In den Proben waren

zwischen 50 und 70 ml Nabelschnurblut inklusive 10-20 ml ACD enthalten. Das Blut

wurde im Verhältnis 1:1 mit PBS verdünnt. Ficoll-Paque™ Plus (Amersham

Biosciences AB, SE-75184 Uppsala) wurde im Verhältnis 1:1 mit dem verdünnten

Nabelschnurblut überschichtet und mit dem Phasengemisch anschließend eine

Dichtegradientenzentrifugation (400 g, 25 min, RT) durchgeführt. Der „weiße

Ring“ aus mononukleären Zellen wurde abgenommen und die Erythrozyten mit

Ammoniumchlorid-Lösung (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,5 mM EDTA, sterilisiert,

Zentralapotheke des Universitätsklinikum Düsseldorf) lysiert. Die Zellen wurden

abschließend noch zweimal mit PBS gewaschen. Aus diesem Zellgemisch wurden

die CD34+ Zellen mittels magnetischer Zellseparation (MACS®; Miltenyi Biotec GmbH,

D-51429 Bergisch Gladbach) sortiert. Zunächst wurde das Oberflächenantigen CD34,

mit CD34 Antikörpern, die an Phycoerythrin (PE) gekoppelt sind, markiert (CD34-PE,

Klon 8G12, BD Biosciences, Tullastasse 8-12, D-69126 Heidelberg), indem die

Zellen mit dem Antikörper 12 min bei Dunkelheit inkubiert wurden. Die

überschüssigen Antikörper wurden entfernt, indem die Zellen einmal mit PBS

gewaschen wurden. In einem zweiten Schritt wurde ein Antikörper gegen PE, der an

ein paramagnetisches Eisenkügelchen (micro beads) gekoppelt ist (Anti-PE Micro

Beads, Miltenyi), nach den Angaben des Herstellers auf die Zellen gebracht. Die mit

dem Kügelchen-Antikörper-Konjugat markierten Zellen ließen sich in einem starken

Magnetfeld anreichern. Die Zellen wurden über eine Metallmatrix-Säule (MACS®

Separation Columns, 25MS Columns, Miltenyi) gegeben, die zuvor in einen starken

Permanentmagneten eingespannt worden war. Die Aufreinigung der Zellen mit der

Metallmatrix-Säule wurde nach der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Um die

Reinheit der CD34+ Zellen zu erhöhen, wurde die Positivfraktion ein weiteres Mal

über eine zweite MACS-Säule selektioniert. Die gewonnenen CD34+ Zellen wurden

entweder sofort verwendet oder kryokonserviert.

37


Das gewonnene Knochenmark von Marmosets wurde zunächst über einen cell

strainer 70 µm (BD Falkon™, Tullastasse 8-12, D-69126 Heidelberg) gegeben, der

anschließend intensiv mit PBS gespült wurde. Zur Isolierung der mononukleären

Zellen wurde mit dem Knochenmark eine Dichtegradientenzentrifugation

durchgeführt. Aus dieser Fraktion wurden die CD34+ Zellen mittels magnetischer

Zellseparation sortiert. Die Markierung der CD34+ Zellen erfolgte mit einem

biotinylierten CD34 Antikörper MA-24 (IZAWA et al. 2004), der von Prof. Dr. Tani,

Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University, Fukuoka, Japan, zur Verfügung

gestellt worden war. In einem zweiten Schritt wurden microbeads, an die Streptavidin

gekoppelt war (Streptavidin Micro Beads, Miltenyi), nach Angaben des Herstellers

auf die Zellen gebracht. Die nun markierten Zellen wurden, wie bereits beschrieben,

über eine Metallmatrix-Säule aufgereinigt. Die Aufreinigung der CD34+ Zellen von

Marmosets erfolgte ebenfalls über zwei Säulen. Zur Bestimmung der Reinheit der

isolierten Zellen im Durchflusszytometer wurden diese mit Antikörperkonjugat SAv-

PE (BD Biosciences) entsprechend den Angaben des Herstellers gefärbt.

3.2.3 Virusproduktion

3.2.3.1 Transiente Erzeugung virushaltiger Überstände

Bei der transienten Virusproduktion wurden alle, für die Viruspartikelbildung

benötigten Gene durch Kotransfektion mit mehreren Plasmiden in eine Zelle

eingebracht. Für alle Versuche wurden HEK293T Zellen zur Virusherstellung

verwendet. Es wurden zwei unterschiedliche Protokolle zur Transfektion von

HEK293T Zellen eingesetzt, die beide von Herrn Dr. Lindemann etabliert wurden und

Polyethylenimin (PEI, hochmolekular, Sigma-Aldrich) verwenden. PEI ist ein

kationisches Polymer, das Nukleinsäure bindet und darüber hinaus kondensierende

Eigenschaften besitzt. DNA-Polykationen-Komplexe werden effizient von

verschiedenen Zellarten aufgenommen und Polykationen selbst wirken einer

intrazellulären Degradierung der DNA entgegen.

38


Alle adhärent wachsenden Zellen wurden auf Zellkuturplatten, die für

Gewebekulturen vorbehandelt waren (tissue culture dish), kultiviert. Die Platten

wurden darüber hinaus mit 0,1 % Gelatinelösung (1 g Gelatine auf 1 l doppelt

desiliertes Wasser; Gelatine vom Schwein, Typ A, Sigma-Aldrich) beschichtet. Die

Gelatinelösung wurde für mindestens 30 min und maximal 3 Tage auf der

Zellkulturplatte belassen und im Brutschrank inkubiert. Bevor die Zellen ausgesät

wurden, ist die Gelatinelösung von der Platte abgenommen worden.

.Am ersten Tag der Transfektion wurden 6 x 106 HEK293T Zellen in 10 ml Medium

auf einer 10 cm Zellkulturschale ausgesät.

Am zweiten Tag wurde nach dem zuerst angewandten PEI-Protokoll (Protokoll „ohne

Serum“) vor der Transfektion das Medium, der am Vortag ausgesäten Zellen,

gewechselt. Das Medium vom Vortag wurde verworfen und durch 5 ml DMEM ohne

Serum ersetzt. Das Transfektionsgemisch, das für die beiden verwendeten

Protokolle identisch war, wurde in zwei Kryoröhrchen angesetzt. Im ersten Röhrchen

wurde die PEI-Lösung aus 45 µl PEI (1 mg/ml) und 955 µl DMEM ohne Zusätze

hergestellt und anschließend gut gemischt. Im zweiten Röhrchen wurde die DNA-

Lösung mit insgesamt 15 µg Gesamtmenge DNA (d.h. bei einem 3-Plasmidsystem 5

µg von jedem Plasmid, bei einem 2 Plasmidsystem 7,5 µg von jedem Plasmid) und

985 µl DMEM ohne Zusätze angesetzt. Die Protokolle wurden für die 4-Plasmid

Systeme leicht modifiziert, indem 7 µg DNA von jedem Plasmid eingesetzt wurden

(28 µg total DNA) und die eingesetzte PEI Menge (1 mg/ml) von 45 µl auf 84 µl

erhöht wurde. Anschließend wurde die PEI-Lösung zügig zur DNA-Lösung hinzu

pipettiert und gut gemischt. Das PEI-DNA-Gemisch wurde bei RT für 15 bis 30 min

inkubiert. Bei dem Protokoll „ohne Serum“ wurde wiederum das Medium von den

Zellen entfernt und durch die PEI-DNA-Transfektionslösung ersetzt, der zuvor noch 4

ml DMEM ohne Serum zugesetzt worden war. Nach fünf Stunden wurde das

Transfektionsgemisch abgenommen und durch DMEM mit Zusätzen ersetzt. Bei dem

später angewendeten, zweiten Protokoll „mit Serum“ wurde das Medium von den

Zellen entfernt und durch 4 ml DMEM inkl. der Zusätze in der üblichen Konzentration

und 15 % FKS ersetzt. In dieses Medium wurde dann das Transfektionsgemisch

pipettiert.

39


Am dritten Tag wurden nach dem Protokoll „ohne Serum“ 200 µl einer 500 mM

Natriumbutyratlösung (Buttersäure Natriumsalz, Merck) in PBS gelöst und den Zellen

zu pipettiert. Das Medium mit Natriumbutyrat wurde nach sechs Stunden von den

Zellen abgenommen und durch 5 ml frisches DMEM ersetzt. Nach dem Protokoll „mit

Serum“ wurde das alte Medium vom Vortag entfernt und die Zellen einmal mit

Medium gewaschen, bevor 5 ml frisches DMEM auf die Zellen gegeben wurde. Von

der Natriumbutyratlösung wurden dann 200 µl zu den Zellen pipettiert. Auch hier

wurde nach sechs Stunden das natriumbutyrathaltige Medium von den HEK293T

Zellen abgenommen und durch 5 ml DMEM ersetzt.

Am vierten Tag, frühestens aber 19 Stunden nach dem letzten Mediumwechsel,

wurde der virushaltige Überstand geerntet. Die Virusernte war für beide

Transfektionsprotokolle gleich. Der virushaltige Überstand wurde in einer Spritze

aufgezogen und dann mittels eines Spritzenfilters (0,45 µm, Sartorius AG, D-37075

Göttingen) filtriert. Durch das Filtrieren wurden die Produzentenzellen und deren

Überreste aus dem virushaltigen Überstand entfernt. Das virushaltige Medium wurde

entweder frisch verwendet oder bis zum Gebrauch bei -80 °C gelagert.

3.2.3.2 Konzentration von virushaltigen Überständen

Virushaltige Überstände mehreren Platten des gleichen Virus (i.d.R. von 8 Platten)

wurden in einem 50 ml Polypropylenröhrchen (BD Falkon™, BD Biosciences)

gepoolt. Das Röhrchen wurde bei 4 °C für zwei Stunden und 10.000 rpm zentrifugiert

(Zentrifuge: J2-21; Rotor JA-12; Beckmann-Coulter GmbH, D-47807 Krefeld).

Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und das nicht sichtbare Virus-

Sediment wurde in 1 bis 3 ml frischem Medium resuspendiert. Das Medium wurde

entsprechend den Bedürfnissen der Zellen, für die das Virus bestimmt war,

ausgewählt. Die Viruspräparationen wurden zumeist frisch verwendet.

40


3.2.4 Titration

Um eine Aussage über die Menge der infektiösen Viruspartikel pro Volumeneinheit

im produzierten Überstand treffen zu können, wurde der Virustiter im frischem,

virushaltigen Überstand ermittelt. Am Vortag der Titration wurden auf einer 6-

Wellplatte 35.000 HT1080-Zellen pro Well ausgesät. Die Zielzellen wurden mit einer

zunehmenden Verdünnung der Überstände von 10-1 bis 10-6 transduziert. Die

Verdünnungen wurden in 1,5 ml DMEM angesetzt und anschließend wurde davon 1

ml auf jedes Well pipettiert. Bei Viren, die mit VSV-G verpackt worden sind, wurden

10 µg/ml Protaminsulfat (Sigma-Aldrich) zum Virusüberstand zugegeben. Frühestens

16 Stunden nach der Transduktion erfolgte ein Mediumwechsel, bei dem das

Transduktionsmedium gegen 2 ml frisches DMEM pro Well getauscht wurde. An Tag

vier nach der Transduktion wurden die HT1080-Zellen abgelöst und in PBS, dem 4 %

Paraformaldehyd (Merck) zugesetzt worden sind, aufgenommen. Der Titer wurde

funktionell über die Expression des GFP Markergens bestimmt. Die Analyse des

Anteils an GFP+ Zellen an der Gesamtpopulation wurde durchflusszytometrisch

bestimmt. Unter der Annahme, dass sich die transduzierten Zellen genauso häufig

teilen wie die nicht transduzierten Zellen, kann mit Hilfe der folgenden Formel

bestimmt werden, wie viele ‚transduzierende Einheiten’ (TE) zum Zeitpunkt der

Transfektion im Überstand vorhanden waren.

41


0,01

0,1

1

10

100

-1 -2 -3 -4 -5 -6

Verdünnungsstufen (log10)

GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Abbildung 5: Verdünnungsreihe des Virustiter MH71 EM140

Die Virustiter, die als Ergebnis der einzelnen Versuche dargestellt werden, wurden

als arithmetische Mittelwerte aus jeweils 2 Einzelwerten die im linearen Bereich der

½ logarithmischen Kurve liegen ermittelt (Abbildung 5). In jeder Verdünnungsreihe

wurden 6 Verdünnungstufen angesetzt. In der Abbildung 5 sind die

Verdünnungsstufen 1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000 und 1:1.000.000

dargestellt. Vergleiche zwischen Mittelwerten werden nur innerhalb einer

Versuchsreihe durchgeführt, da geringgradige Schwankungen in der Virusproduktion

allein durch die Passage der Produzentenzellen für einen weiteren Versuchsansatz

bedingt sein können.

3.2.5 Transduktion von hämatopoetischen Zelllinien

6-Well Zellkulturplatten (BD Falcon), die nicht für Gewebekulturen vorbehandelt

waren, wurden mit dem rekombinanten Fibronektinfragment CH296 (Takara Bio Inc.,

Otsu, Shiga 520-2193, Japan) beschichtet. Die Platten wurden mit 4 µg CH296 pro

42


cm2 entweder für 2 Stunden im Inkubator oder über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C

beschichtet. Vor der Verwendung wurde das Fibronektin von der Platte abgenommen

und die Platte einmal mit Medium gewaschen. Es wurden 40 ml Virusüberstand, der

von insgesamt 8 Platten stammte, zentrifugiert, das Sediment in 3 ml Medium

aufgenommen und anschließend auf die Wells verteilt. Die so präparierten Platten

wurden in den Inkubator gestellt. Nach einer halben Stunde wurden 100.000 Zellen

der Zelllinien K562, HL60 und HEL, die in 50 bis 100 µl Medium aufgenommen

wurden, zum Viruszentrifugat pipettiert. Nach etwa 16 Stunden (über Nacht) wurde

frisches Medium auf die Zellen gegeben. Am vierten Tag nach der Transduktion

wurden die Zellen von den Fibronektinplatten genommen und zur weiteren

Kultivierung in Zellkulturflaschen überführt. Ein kleiner Teil der Zellen wurde für die

fluorescence activated cell sorting (FACS)-Analyse in FACS-Röhrchen (BD Falcon)

überführt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und dann in 500 µl einer

Propidiumjodid- (PI, Sigma-Aldrich) FACS-Lösung (PBS mit 1 % FKS und 1 µg PI/ml)

aufgenommen. Die Transduktionseffizienz wurde ermittelt, indem der Anteil GFP

positiver Zellen mittels FACS-Analyse gemessen wurde.

Ein Teil der Zellen wurde weiter kultiviert und der Anteil GFP positiver Zellen wurde

wöchentlich durchflusszytomerisch ermittelt.

3.2.5.1 Transduktion von humanen CD34+ Zellen

Die Transduktion der humanen CD34+ Zellen wurden auf 6-Wellplatten durchgeführt,

die mit Fibronektin beschichtet worden sind. Zur Transduktion wurden zwei

verschiedene Protokolle angewendet, die sich in der Grundstruktur nur minimal

unterscheiden.

Beim ersten Protokoll wurde das Fibronektin zweimal mit jeweils 1 ml Virusüberstand

vorgeladen. Alle verwendeten Virusüberstände waren zuvor kryokonserviert. Direkt

nach der Aufreinigung aus dem Nabelschnurblut wurden 100.000 CD34+ Zellen zum

Virusüberstand pipettiert. Zusätzlich wurden noch die Zytokine SCF, TPO und G-

CSF (Amgen GmbH, D-80992 München) in einer Konzentration von 100 ng/ml zu

43


den Ansätzen hinzugegeben. Frühestens 16 Stunden (über Nacht) nach der

Transduktion wurden die Zellen von der Platte abgenommen und in frisches Medium,

wie oben beschrieben, überführt. Vier Tage nach der Transduktion wurden die Zellen

in FACS-Röhrchen überführt und einmal mit PBS gewaschen. Am Tag 4 nach der

Transduktion wurde mittels eines Durchflusszytometers die Anzahl der

transduzierten Zellen bestimmt.

Im zweiten Protokoll wurde frischer Virusüberstand verwendet. Dazu wurden die

Viruskonstrukte von drei Platten gepoolt und zentrifugiert. Das Sediment wurde in 1

ml Medium aufgenommen. Der Virusüberstand wurde eine halbe Stunde vor Zugabe

der Zellen auf die Wells verteilt und die Platten in den Inkubator gestellt. Auch hier

wurden 100.000 CD34+ Zellen nach der Aufreinigung zum Virusüberstand pipettiert.

In einer Konzentration von 100 ng/ml wurden die Zytokine SCF, TPO und G-CSF

(Amgen) den Ansätzen hinzugegeben. Die Zellen wurden ca. 16 Stunden (über

Nacht) nach der Transduktion von der Platte abgenommen und in frisches Medium,

wie oben beschrieben, überführt. Vier Tage nach der Transduktion wurden die Zellen

in FACS-Röhrchen überführt und einmal mit PBS gewaschen. Der Anteil GFP

positiver Zellen wurde durchflusszytometrisch bestimmt.

3.2.5.2 Transduktion von Marmoset CD34+ Zellen

Die Transduktion der CD34+ Zellen von Marmosets erfolgte auf Fibronektin

beschichteten 6-Well Platten. Bei allen Transduktionen von Marmoset CD34+ Zellen

wurde der Virusüberstand von 8 Platten gepoolt, zentrifugiert und in 1 ml Medium

aufgenommen. Die Virusüberstände wurden eine halbe Stunde vor den Zellen auf

die Platten gegeben und in den Inkubator gestellt. Es wurden bei den verschiedenen

Tieren unterschiedlich viele Zellen zur Transduktion eingesetzt. Bei Tier 0224 wurden

60.000 Zellen pro Well ausgesät, bei Tier 3101 40.000 Zellen und bei Tier 0130

wurden 10.000 Zellen zur Transduktion eingesetzt. In allen drei Versuchen wurden

die Zytokine SCF, TPO (Amgen), IL-6 und Flt3-L (Pepro Tech EC Ltd, 29 Margravine

Road, London, UK) in einer Konzentration von 100 ng/ml eingesetzt. Frühestens 16

44


Stunden nach der Transduktion wurden die Zellen von der Platte abgenommen und

in frisches Medium überführt, dem wie oben beschrieben, Zytokine zugesetzt wurden.

Die Zellen der ersten beiden Tiere wurden nach 5 Tagen in FACS-Röhrchen

überführt und mit PBS gewaschen. Anschließend wurde der Anteil GFP positiver

Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. Bei Tier 3101 wurden nicht alle Zellen für

die FACS-Analyse verwendet, da ein Teil für weitere Untersuchungen kultiviert wurde.

Diese Zellen wurden nach 9 Tagen auf den Anteil an GPF positiver Zellen untersucht.

Die transduzierten Zellen des dritten Tieres 0130 wurden nach 4 Tagen auf den

Anteil der GFP positiver Zellen untersucht.

3.2.6 Progenitor-Assay

Der Progenitor-Assay erlaubt die Detektion klonaler Zellen innerhalb der Fraktion der

CD34+ Zellen. Die Zellen wurden dazu vereinzelt und in niedriger Konzentration in

einem viskösen Medium ausgesät, das Zellbewegungen weitestgehend verhindert.

Reife hämatopoetische Zellen sterben schon nach kurzer Zeit in der Kultur ab. Nach

14 Tagen erfolgte die Auszählung der Kolonien der klonogenen Vorläuferzellen unter

dem Mikroskop. Die CD34+ Zellen wurden am Tag nach der Transduktion

entnommen. Ausschließlich wurden die Zellen in Medium (Metho Cult®, GF H4434,

Stem Cell Technologies Inc, Vancouver, BC (604) 877-0713) ausgesät, in dem

sowohl Zytokine als auch alle anderen Substanzen, die die Zellen für das Wachstum

brauchen, vorhanden waren. Es wurden jeweils zwei Zellkonzentrationen ausgesät:

250 und 500 Zellen pro ml Metho Cult, (im Versuch mit Tier 0130 wurden 200 und

800 Zellen pro ml ausgesät). Jeder Versuch wurde dreifach angesetzt. Von dem

Metho Cult Medium mit den Zellen wurden jeweils 1 ml in Zellkulturschalen mit einem

Durchmesser von 3,5 cm gegeben, die am Boden ein Rastergitter (Nunc, Nalge

Nunc) aufwiesen. Dieses Raster hilft bei der genauen Quantifizierung der Anzahl der

Kolonien pro Platte. Jeweils 6 dieser kleinen Platten wurden in eine große

Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 15 cm gestellt. In der Mitte der Schale

wurde eine kleine Platte, die mit PBS gefüllt wurde und keinen Deckel trug, plaziert.

45


Die Schalen wurden 14 Tage in einen separaten Brutschrank, der in den 14 Tagen

nur selten geöffnet wurde, inkubiert. Die anschließende Auszählung der Kolonien

erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 25, Carl Zeiss Microlmaging

GmbH, D-37081 Göttingen). Bestimmt wurde der Anteil GFP positiver Kolonien an

der Gesamtzahl der gewachsenen Kolonien. Eine Ansammlung von mindestens 50

myeloische oder 200 erythrozytäre Vorläuferzellen wurden als eine Kolonie

angesprochen.

3.2.7 Virusbindung an Fibronektin

12-Wellplatten, die nicht für Gewebekultur vorbehandelt waren (non tissue culture

dish), wurden entweder mit 4 µg/cm2 Fibronektin oder mit 0,5 ml einer PBS-Lösung

mit 2 % Bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma-Aldrichs, gelöst in PBS) beschichtet.

Die Platten wurden über Nacht bei 4° C im Kühlschrank inkubiert. Vor der

Verwendung wurde das Fibronektin resp. BSA von der Platte abgenommen und die

Platten einmal mit Medium gewaschen. Die so beschichteten Platten wurden im

Versuch mit einer, für Gewebekultur konventionell vorbehandelten 12-Wellplatte

(tissue culture dish, TCD) verglichen. Kryokonservierte Virusüberstande, die jeweils

1:10 und 1:100 mit Medium verdünnt worden waren, wurde mit einem Volumen von 1

ml je Well auf die Platte gegeben. Anschließend wurden die Platten für eine halbe

Stunde im Brutschrank inkubiert. Bei einem Teil der Platten wurden jetzt die Zellen

zu dem Virusüberstand hinzubegeben, der andere Teil der Platten wurde weiter

behandelt.

Wurde der Virusüberstand von der Platte abgenommen, so wurde die Platte mit

Medium gewaschen. Ein Teil der Platten wurde dreimal für jeweils 30 min mit

Virusüberstand beladen, bevor die Platten dreimal mit Medium gewaschen wurden.

Das Behandlungsschema der einzelnen Platten ist der Tabelle 2 zu entnehmen.

Nach der Behandlung der Platten wurde in jedes Well 1 x 105 HEL Zellen ausgesät.

Jeder Versuch wurde dreifach angesetzt. Nach 6 Tagen wurde der Anteil an GFP

positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie ermittelt.

46


Tabelle 2: Behandlungsschema Adhäsion von rekombinanten Retroviren

Zellkulturplatten Behandlung

1 x Virus 1 x Virus + 3 x Waschen

3 x Virus + 3 x Waschen

TCD X -- --

BSA X X --

CH296 X X X

3.2.8 1,3-bis-(2-chlorethyl)-1-Nitrosourea (BCNU)

3.2.8.1 BCNU Selektion

Zur Selektion transduzierter HEL, HL60 und K562 Zellen wurden zwei

unterschiedliche Protokolle verwendet. Beim ersten Protokoll wurden transduzierte

HEL, HL60 und K562, sowie nicht transduzierte Zellen dieser Zelllinien in 12-

Wellplatten ausgesät. Dann wurden 2 x 105 Zellen in 1 ml Medium pro Well pipettiert.

Das Medium enthielt keine Zusätze. Das Zytostatikum Carmustin (BCNU,

Carmubris®, Bristol-Meyers Squibb GmbH & Co. KGaA, D-80637 München) wurde in

Ethanol (als Lösungsmittel Bestandteil von Carmubris) gelöst. Die Zellen wurden mit

Konzentrationen von 0, 20, 80 und 160 µM BCNU/ml Medium behandelt. Die Platten

wurden für drei Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach drei Stunden (Halbwertzeit

des BCNU 45 min) wurden zusätzliche 2,5 ml Medium mit Zusätzen in jedes Well

pipettiert. Sechs Tage nach der Selektion wurden die Zellen in FACS-Röhrchen

überführt, einmal mit PBS gewaschen und dann in 500 µl einer PI-FACS-Lösung

aufgenommen. Jeder Versuch wurde dreifach angesetzt. Der Anteil an GFP positiven

und toten Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie ermittelt.

Im zweiten Protokoll wurden nicht transduzierte und transduzierte HL60 Zellen

verwendet. Es wurden 2 x 105 Zellen in 1 ml Medium mit Zusätzen pro Well einer 12-

47


Wellplatte ausgesät. Das in Ethanol gelöste BCNU wurde an mehreren Tagen

hintereinander auf die Zellen aufgetragen (Tabelle 3). Das gelöste BCNU wurde

zwischen den Behandlungen bei -20°C gelagert.

Tabelle 3: BCNU Behandlung der HL60 Zellen

Behandlung mit BCNU (Konzentration) Gruppe

Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4

1 20 µM 20 µM 20 µM 20 µM

2 20 µM 20 µM 20 µM

3 20 µM 20 µM

4 20 µM 40 µM 80 µM

5 20 µM 40 µM

6 20 µM

7 40 µM

8 60 µM

9 80 µM

10 0 µM

Jeder Versuch wurde dreifach angesetzt. Eine Woche nach der ersten BCNU

Behandlung wurden die Zellen in FACS-Röhrchen überführt, einmal mit PBS

gewaschen und dann in 500 µl einer PI-FACS-Lösung aufgenommen. Der Anteil

GFP positiver Zellen wurde mittels FACS-Analyse ermittelt.

3.2.8.2 BG - BCNU Selektion

Es wurden je 2 x 105 transduzierte HL60 Zellen, sowie nicht transduzierte Zellen

dieser Zelllinie in 1 ml Medium auf 12-Wellplatten ausgesät. Das BG (Sigma-Aldrich)

wurde in Polyethyenglycol 400 (Merck) gelöst und ein Teil der BG-Stammlösung mit

48


Medium zu einer Konzentration von 40 µM verdünnt. Von dieser Lösung wurde

jeweils 1 ml zu den Zellen pipettiert, so dass die Zellen einer Konzentration von 20

µM pro ml Medium ausgesetzt waren. Die Platten wurden eine Stunde lang im

Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 0, 10, 20, 40 und 60 µM

BCNU/ml Medium (angesetzt wie unter ‚BCNU Selektion’ beschrieben) behandelt.

Die Kontrollgruppe wurde mit 0, 10, 20, 40 und 60 µM BCNU/ml Medium, aber nicht

mit BG behandelt; einige Zellen erhielten nur BG. Fünf Tage nach der Selektion

wurden die Zellen in FACS-Röhrchen überführt, einmal mit PBS gewaschen und

dann in 500 µl einer PI-FACS-Lösung aufgenommen. Der Anteil an GPF positiven

und toten Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie ermittelt.

3.2.8.3 BG - BCNU Selektion von CD34+ Marmoset Zellen

Eingefrorene CD34+ Zellen aus dem Knochenmark des Tieres 0224 wurden

aufgetaut und 5 Stunden in IMDM, ergänzt mit 100 ng SCF/ml, kultiviert.

Anschließend wurden die Zellen gezählt und jeweils 38.000 Zellen in jedes Loch

einer 6-Wellplatte ausgesät, die zuvor mit Fibronektin beschichtet und mit

Virusüberstand beladen worden waren. Zur Transduktion wurden die Zytokine SCF,

TPO, IL-6 und Flt-L in einer Konzentration von 100 ng/ml zugesetzt. Die Zellen

wurden anschließend zwei Tage im Brutschrank kultiviert, so dass zwei Tage nach

der Transduktion die Zellen vom Fibronektin abgenommen, geteilt und in einer

Konzentration von 9.500 Zellen pro Well auf einer 12-Wellplatten ausgesät wurden.

Von jedem eingesetzten Viruskonstrukt und der negativen Kontrolle wurden Zellen in

einem Well nicht behandelt, das andere Well wurde mit 20 µM BCNU behandelt. Der

Ansatz wurde eine Stunde im Brutschrank inkubiert. Zwei weitere Wells wurden mit

20 µM pro ml BG behandelt. Nach einer Stunde Inkubation wurde eins der zwei mit

BG behandelten Wells eines jeden Konstruktes zusätzlich mit 20 µM BCNU

behandelt und eine weitere Stunde im Brutschrank inkubiert. Aus jedem Well wurde

ein Teil der Zellen entnommen und in Progenitor-Assays ausgesät. Es wurden

jeweils zwei Zellkonzentrationen ausgesät: 250 und 500 Zellen/ml Metho Cult. Die

49


Progenitor-Assays wurden 14 Tage in einem separaten Brutschrank inkubiert. Die

Auszählung erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop. Der Anteil GFP positiver

Kolonien an der Gesamtzahl der gewachsenen Kolonien wurde bestimmt und die auf

den 12-Wellplatten verbliebenen Zellen wurden weiter kultiviert und dem Medium

wurden die Zytokine SCF, TPO, IL-6 und Flt-L in einer Konzentration von 100 ng/ml

zugesetzt. Am vierten Tag nach der Behandlung wurden die Zellen in FACS-

Röhrchen überführt, einmal mit PBS gewaschen und in 500 µl einer PI-FACS-Lösung

aufgenommen. Der Anteil an GFP positiven wurde mittels Durchflusszytometer

ermittelt. Jeder Versuch wurde dreifach angesetzt.

3.2.9 Knochenmarkentnahme bei Marmosets

Die Affen wurden durch intramuskuläre Injektion eines Narkosemittels in die kaudale

Oberschenkelmuskulatur narkotisiert. Zur Einleitung der Narkose wurde den Tieren

Ketamin (50 mg/kg Körpergewicht, Ketavet®, 100 mg/ml, Pfizer Pharma GmbH, D-

76139 Karlsruhe) verabreicht. Anschließend wurde die Narkose durch Inhalation von

2-3 % Enfluran (Forene®, Abbott GmbH, D-65205 Wiesbaden) über eine

Inhalationsmaske für Katzen aufrechterhalten. Die Punktionsstelle am Innenschenkel

wurde für einen aseptischen Eingriff vorbereitet. Mit einer

Knochenmarkspunktionskanüle (Illinois Sternal/Illiakal-Aspirationskanüle, 16 G,

Tyco/Healthcare Kendall, Mansfield, MA 02048 USA) wurde im distalen Drittel des

Humerus Knochenmark entnommen. Um eine Gerinnung zu verhindern, wurden

Punktionskanüle und Spritze, mit denen das Knochenmark aspiriert wurde, vor der

Entnahme mit Heparin (Heparin-Natrium 25.000 I.E./5ml, Ratiopharm GmbH, D-

89079 Ulm) gespült. Zum Zeitpunkt der Aspiration waren ca. 0,5 ml Heparin in der

Spritze vorgelegt. Die ersten beiden Tiere, 0224 und 3101, waren Marmosets, an

denen eine Finalversuch durchgeführt wurde. Post mortem wurden die Humeri sowie

die Femora entnommen und am proximalen und distalen Ende eröffnet.

Anschließend wurde die Knochenmarkhöhle mit IMDM gespült. Das Medium mit den

Knochenmarkzellen wurde in einem sterilen 50 ml Röhrchen aufgefangen. Bei dem

50


dritten Tier, 0130, wurde nur der rechte Humerus, wie oben beschrieben punktiert.

Nach der Punktion wurde die Punktionsstelle etwa 5 min mit einer Kompresse

abgedeckt und zur Stillung der Blutung Druck auf die Wundstelle ausgeübt. Nach der

Stillung der Blutung wurde die Narkose ausgeleitet.

3.2.10 Statistik

Die Ergebnisse der einzelnen Versuche wurden in einem Datenblatt erfasst

(Microsoft® Office Excel 2003; Microsoft Corporation, Redmond, NC, USA). Die

statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Statistical Analysis System for

Windows, SAS® (Version 9.1; SAS-Institute, Cary, NC, USA) auf einem PC unter

Windows XP SP2 (Microsoft).

Metrische Daten wurden getrennt für jede Variable (Vektor resp. Behandlung)

deskriptiv ausgewertet (Prozedur UNIVARIATE, SAS®). Es wurden die Anzahl der

Messungen, der arithmetische Mittelwert, die Standardabweichung, die Varianz

sowie Minimum und Maximum bestimmt.

Konnte eine Normalverteilung der Virustiter resp. der logarithmierten Werte

festgestellt werden, wurde die Verteilung der Werte in zwei Klassen mittels t-Test

verglichen (Prozedur TTEST, SAS®). Sollte die Verteilung von Ergebnissen zwischen

mehr als 2 Klassen verglichen werden, wurde eine globale Prüfung mittels F-Test

vorgenommen (Prozedur ANOVA, SAS®). Verteilungen nicht normalverteilter

metrischer Daten wurden mit dem Wilcoxon-Test analysiert (Prozedur NPAR1WAY,

SAS®). Verteilungen wurden als signifikant unterschiedlich betrachtet, wenn ein p-

Wert ≤ 0,05 ermittelt werden konnte. Die Unterschiede sind, sofern nicht eine globale

Prüfung der Daten vorgenommen wurde, durch verschiedene Buchstaben in den

Abbildungen gekennzeichnet.

51

Ergebnisse

4. Ergebnisse

4.1 Herstellung von Foamyviren

4.1.1 Optimierung des Transfektionsprotokolls

Lentivirale, foamyvirale und gammaretrovirale Konstrukte wurden mit einem

foamyviralen Hüllprotein EM140 verpackt. Erst mit der Verpackung in einem

strukturgleichen Hüllprotein (EM140) wurde ein echter Vergleich der einzelnen

Konstrukte möglich. Die bisher verwendeten foamyviralen Hüllproteine, die zuvor zur

Pseudotypisierung von gammaretroviralen und lentiviralen Konstrukten eingesetzt

worden sind, waren ergaben nur niedrige Virustiter. Die Transduktionseffizienz von

rekombinanten Retroviren, die mit Hilfe des VSV-G Glykoproteins pseudotypisiert

wurden, haben als Referenzwert gedient, da VSV-G seit einiger Zeit erfolgreich zur

Verpackung lentiviraler Konstrukte genutzt wird und ausreichend Daten vorlagen. Für

die Generierung der lentiviralen Konstrukte wurde das Helferplasmid CD/NL-BH

verwendet (Abbildung 6).

Die Verwendung verschiedener Konstrukte zur Transfektion von Zellen führt zu

deutlichen Unterschieden im Virustiter. Die arithmetischen Mittelwerte, die mit den

einzelnen Konstrukten erzielt wurden, weisen einen statistisch signifikanten

Unterschied auf (p = 0,0039).

Die Optimierung des Transfektionsprotokolls durch den Zusatz von Serum führt bei

allen Konstrukten zu einem Anstieg der Virustiter, verglichen mit den Werten einer

Transfektion ohne Serum. Der Titeranstieg ist bei den Konstrukten pCL1

pseudotypisiert mit EM140, MH71 verpackt mit dem EM140 und pCAMSΔU3E

pseudotypisiert mit dem EM140 statistisch signifikant (p = 0,0002, p = 0,0045 resp. p

= 0,0002). Der Unterschied zwischen dem Transduktionsprotokoll „mit Serum“ und

„ohne Serum“ für das Konstrukt pCL1, pseudotypisiert mit VSV-G, konnte dagegen

statistisch nicht abgesichert werden.

52

Ergebnisse

0,00E+00

2,00E+07

4,00E+07

6,00E+07

8,00E+07

1,00E+08

1,20E+08

1,40E+08

pCL1 CD/NL-BH VSV-G pCL1 CD/NL-BH EM140 MH71 EM140 pCAMSΔU3E EM140

TE /

ml

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

c

b

a a d e f g

Transfektion „ohne Serum“

Transfektion „mit Serum“

Abbildung 6: Vergleich von verschiedenen Transfektionsprotokollen, in denen die

Transfektion „mit Serum“ und „ohne Serum“ durchgeführt wurde

53

Ergebnisse

4.1.2 Vergleich von foamyviralen 2,- 3- und 4-Plasmidsystemen Das foamyvirale Konstrukt MH71 benötigte kein Helferplasmid, denn es trägt schon

die Gene gag und pol, die zur Generierung des Virus notwendig sind. Das Konstrukt

MD9 enthält nur Teile von gag und pol, die lediglich für das Verpackungssignal

kodieren. Um mit den Vektor MD9 Virusüberstand generieren zu können, müssen die

Gene gag und pol auf Helferplasmiden zur Verfügung gestellt werden. Das

Helferplasmid cmvgp1 kodiert für ein vollständiges gag und pol. Bei den andern

verwendeten Helferplasmiden liegen gag und pol auf zwei voneinander getrennten

Helferplasmiden vor. Die Plasmide pcziGag und p6iGag bzw. pcziPol und p6iPol

unterscheiden sich nur im Aufbau des Backbones, nicht aber im viralen Teil des

Vektors.

Zur Optimierung der foamyviralen Virusproduktion wurden verschiedene

Viruskonstrukte verglichen (Abbildung 7). Das Konstrukt MD9 wurde zusammen mit

den Helferplasmiden cmvgp1, einer Kombination aus p6i Gag mit p6i Pol und pczi

Gag mit pczi Pol generiert.

Durch den Einsatz des Helferplasmids p6iGag mit p6iPol konnte die Titerhöhe,

vergleichend zum Konstrukt mit dem Helferplasmid cmvgp1, um das 4,2 fache

gesteigert werden. Durch Verwendung der Helferplasmide pcziGag mit pcziPol ist

eine Steigerung um das 6,0 fache gegenüber dem drei Plasmidsystem möglich. Die

einzelnen Konstrukte weisen deutlich unterschiedliche Virustiter auf. Der Einfluss der

verwendeten Konstrukte auf den Virustiter ist statistisch signifikant (p = 0,0003).

54

Ergebnisse

0,00E+00

2,00E+06

4,00E+06

6,00E+06

8,00E+06

1,00E+07

1,20E+07

MH71EM140 MD9cmvgp1EM140 MD9p6iGag/p6iPolEM140 MD9pcziGag/pcziPolEM140

TE /

ml

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

cmvgp1

EM140

MD9

p6iGag / p6iPol

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

cmvgp1

EM140

MD9

p6iGag / p6iPol

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

cmvgp1

EM140

MD9

p6iGag / p6iPol

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

Abbildung 7: Gegenüberstellung foamyviraler 2- 3- und 4-Plasmidsysteme

4.1.3 Foamyvirale Verpackungsplasmide Das foamyvirale Hüllprotein EM140 wies bei den Produzentenzellen eine Toxizität

auf, die beim Hüllprotein VSV-G nicht beobachtet werden konnte. Die Zellen

fusionierten miteinander und bildeten mehrkernige Riesenzellen aus. Eine Zelle mit

mehreren Kernen ist nicht mehr in der Lage, gerichtete Proteinsynthese zu betreiben

und damit die einzelnen Elemente des Virus zu bilden. Dadurch fällt der Virustiter

letztlich niedriger aus. Das Hüllprotein SM04 ist, ebenso wie das Hüllprotein EM140,

in der Lage, lentivirale und gammaretrovirale Konstrukte zu pseudotypisieren und

wurde daher als alternatives foamyvirales Hüllprotein getestet. Die Hüllproteine

wurden mit zwei unterschiedlichen foamyviralen Konstrukten verglichen (Abbildung

55

Ergebnisse

8). Zu Generierung des Virus wurden die beiden Helferplasmide pcziGag und pcziPol

für das Konstrukt MD9 eingesetzt.

0,00E+00

1,00E+06

2,00E+06

3,00E+06

4,00E+06

5,00E+06

MH71 EM140 MD9 EM140 MH71 SM04 MD9 SM04

TE /

ml

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71

--

SM04

MD9

pcziGag / pcziPol

SM04

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71

--

SM04

MD9

pcziGag / pcziPol

SM04

Abbildung 8: Gegenüberstellung foamyviraler Verpackungsplasmide in einem 2- resp.

4-Plasmidsystem

Betrachtet man das Konstrukt MH71, so ist der Titer mit dem Hüllprotein EM140 um

das 1,9 fache höher als der von Zellen mit SM04. Bei dem Konstrukt MD9 ist der

Unterschied zwischen dem Hüllprotein EM140 und SM04 noch deutlicher; der Titer

des Hüllprotein EM140 ist um das 5,6 fache höher als der von Zellen mit Hüllprotein

SM04. Den einzelnen Konstrukten konnte ein signifikanter Einfluss auf die erzielte

Titerhöhe nachgewiesen werden (p= 0,0017).

56

Ergebnisse

4.1.4 Einfluss des MGMTp140k Transgens auf die GFP Expression Die Vektorplasmide MH71.MGMTp140kIEG und MD9.MGMTp140kIEG exprimieren

unter der Kontrolle des SFFV U3’ Promotors eine Expressionskassette mit

MGMTp140k, dass über eine IRES-site mit GFP verbunden ist. Um zu prüfen, in wie

weit die Expression des Markers GFP durch das 5’ gelegene MGMTp140k

beeinflusst wird, wurden die Virustiter der Konstrukte mit und ohne dem Transgen

MGMTp140k einander gegenübergestellt. Für die Plasmide MD9 und MD9.MGMT

wurden das 4-Plasmidsystem mit den Helferplasmiden pcziGag und pcziPol zur

Generierung des Virus genutzt. Bei MH71 und MH71.MGMT handelt es sich um ein

2-Plasmidsystem, in dem gag und pol schon auf dem Vektorplasmid vorhanden sind.

Als Hüllprotein wurde EM140 eingesetzt.

0,00E+00

1,00E+06

2,00E+06

3,00E+06

4,00E+06

MH71 MD9 MH71.MGMT MD9.MGMT

TE /

ml

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Abbildung 9: Vergleich der foamyviralen Vektorplasmide MH71 und MD9 mit und

ohne MGMTp140k

57

Ergebnisse

Der Abbildung 9 ist zu entnehmen, dass die Konstrukte ohne MGMTp140k immer

einen höheren Virustiter erzielen, als die mit MGMTp140k. Bei dem Konstrukt MH71

ist der Virustiter mit MGMTp140k um 12 % niedriger, bei dem Konstrukt MD9 ist der

Virustiter mit MGMTp140k um 19 % niedriger. Zwischen allen Konstrukten besteht

ein augenscheinlicher Unterschied in der Höhe der Virustiter. Der Einfluss der

verwendeten Konstrukte auf den Virustiter ist statistisch signifikant (p= 0,0297).

4.1.5 Konzentrierung retroviraler Virusüberstände

Der Virustiter kann erhöht werden, indem das Volumen des virushaltigen

Überstandes reduziert wird, ohne dabei infektiöse Viruspartikel zu verlieren. Die

Viruspartikel werden durch Zentrifugation sedimentiert und der restliche Überstand

abgenommen. Die so sedimentierten Viren können in neues Medium aufgenommen

werden und der Virusüberstand weist im Allgemeinen eine deutlich höhere

Konzentration als vor dieser Prozedur auf.

In Abbildung 10 sind die arithmetischen Mittelwerte aus 4 Werten dargestellt, von

denen je 2 aus einem Versuchsansatz stammen. Für die Plasmide MD9 und

MD9.MGMT wurden die Helferplasmide pcziGag und pcziPol zur Generierung des

Virus eingesetzt. Als Hüllprotein wurde EM140 verwendet. Der Virusüberstand von 8

Zellkulturplatten mit je 10 cm Durchmesser wurde gepoolt, zentrifugiert und das

Viruspellet in 1 ml Medium aufgenommen. Durch die Zentrifugation konnte der

Virustiter je nach Konstrukt um das 24,8 fache (MD9), 26,3 fache (MH71.MGMT),

26,5 fache (MH71) resp. um das 30 fache (MD9.MGMT) gegenüber dem

Ausgangswert gesteigert werden.

58

Ergebnisse

0,00E+00

1,00E+07

2,00E+07

3,00E+07

4,00E+07

5,00E+07

6,00E+07

7,00E+07

8,00E+07

9,00E+07

MH71 MD9 MH71.MGMT MD9.MGMT

TE /

ml

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Virustiter vor dem Zentrifugieren

Virustiter nach dem Zentrifugieren

Abbildung 10: Konzentration foamyviraler Virusüberstände

4.1.6 Adhäsion rekombinanter Retroviren an Moleküle der Fibronektin-Matrix

Transduktionseffizienz und Adhäsion von rekombinanten Retroviren, die mit

verschiedenen Hüllproteinen pseudotypisiert worden waren, wurden auf

unterschiedlich beschichteten Zellkulturplatten getestet. Die Zellkulturplatten waren

mit CH296 oder BSA beschichtet, oder es wurden TCD verwendet.

59

Ergebnisse

GaLV

0

10

20

30

40

1/10 BSA 1/10 BSA 1/100 CH296 1/10 CH296 1/100

GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Beschichtung

Verdünnung

Behandlung

TCD

1/10 1/100

1xV

BSA CH296

1/10

1xV

-- 3xW

1/100

1xV

-- 3xW

1/10

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

1/100

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

Beschichtung

Verdünnung

Behandlung

TCD

1/10 1/100

1xV

BSA CH296

1/10

1xV

-- 3xW

1/100

1xV

-- 3xW

1/10

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

1/100

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

VSV-G

0

20

40

60

80

100

1/10 BSA 1/10 BSA 1/100 CH296 1/10 CH296 1/100

GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Beschichtung

Verdünnung

Behandlung

TCD

1/10 1/100

1xV

BSA CH296

1/10

1xV

-- 3xW

1/100

1xV

-- 3xW

1/10

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

1/100

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

Beschichtung

Verdünnung

Behandlung

TCD

1/10 1/100

1xV

BSA CH296

1/10

1xV

-- 3xW

1/100

1xV

-- 3xW

1/10

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

1/100

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

60

Ergebnisse

EM140

0

20

40

60

80

1/10 BSA 1/10 BSA 1/100 CH296 1/10 CH296 1/100

GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Beschichtung

Verdünnung

Behandlung

TCD

1/10 1/100

1xV

BSA CH296

1/10

1xV

-- 3xW

1/100

1xV

-- 3xW

1/10

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

1/100

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

Beschichtung

Verdünnung

Behandlung

TCD

1/10 1/100

1xV

BSA CH296

1/10

1xV

-- 3xW

1/100

1xV

-- 3xW

1/10

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

1/100

1xV 1xV 3xV

-- 3xW 3xW

Abbildung 11: Bindung verschiedener Virushüllen an unterschiedlich beschichtete

Zellkulturplatten Zellkulturplatten (tissue culture dish) bzw. unbehandelten Platten, die dann mit 2 % bovinem

Serumalbumin (BSA) oder mit dem Fibronektinfragment CH296 beschichtet worden waren, wurden

mit Virusüberstand beladen. Der Vektor pCL1 mit dem Helferplasmid CD/NL-BH wurde mit den

Hüllproteinen GaLV, VSV-G und EM140 pseudotypisiert. Die Virusüberstände wurden 1:10 oder 1:100

verdünnt, bevor die Überstände zur Transduktion eingesetzt wurden. Die Platten wurden alle

mindestens einmal (1xV) mit Virusüberstand vorgeladen. Ein Teil der mit CH296 behandelten Platten

wurde dreimal Vorgeladen (3xV). Um die Adhäsion der Viruspartikel zu testen, wurde ein Teil der

Platten nach der Beladung mit Virusüberstand dreimal gewaschen (3xW), bevor die Zellen auf die

Platten gegeben wurden.

61

Ergebnisse

Der lentivirale Vektor pCL1 wurde zusammen mit dem Helferplasmid CD/NL-BH zur

Generierung der Viren mit den Hüllproteinen GaLV, VSV-G und EM140 eingesetzt.

Der Virustiter der Virusüberstände wurden auf HT1080 Zellen ermittelt. Das GaLV

Konstrukt hatte einen Titer von 850.000 TE / ml, das VSV-G Konstrukt einen Titer

von 29.000.000 TE / ml und das Konstrukt mit der foamyviralen Virushülle einen Titer

von 62.000.000 TE / ml. Die verwendeten Virustiter sind nicht auf ein gemeinsames

Niveau eingestellt, sondern 1:10 und 1:100 mit Medium verdünnt worden. Daher

kann nur einen relative Aussage zur Transduktionseffizienz der einzelnen

Hüllproteine getroffen werden.

Die Adhäsion der Hüllproteine an die beschichteten Zellkulturplatten wurde bestimmt,

indem der Virusüberstand wieder von der Platte entfernt wurde und diese mehrfach

mit Medium gewaschen wurde. Bei den CH296 beschichteten Platten wurde

zusätzlich dreimal Virusüberstand auf die Platte gegeben und wieder entfernt bevor

die Zellkulturplatte auch mehrfach mit Medium gewaschen wurde.

Alle Hüllproteine binden an das CH296 und auch nachdem die Zellkulturplatten

dreimal mit Medium (3xW) gewaschen worden sind, konnten die Zellen noch

transduziert werden. Bei allen verwendeten Hüllproteinen konnte die

Transduktionseffizienz gesteigert werden, indem CH296 dreimal mit Virusüberstand

beladen (vorgeladen) wurde (V 3xW), bevor die Zellkulturplatten dreimal mit Medium

gewaschen wurden. In der Verdünnung 1:10 konnte auf den CH296 beschichteten

Platten durch das dreimalige Vorladen eine Erhöhung der Transduktionseffizienz um

das 1,7- bis 2,7-fache gegenüber den Platten erreicht werden, die nur einmal mit

Virus beladen wurden. In der Verdünnung 1:100 konnte bei allen Hüllproteinen eine

Erhöhung der Transduktionseffizienz um das 3,5 fache erreicht werden, wenn die

Platten dreimal und nicht nur einmal mit Virusüberstand beladen wurden. Die

unterschiedliche Behandlung der Zellkulturplatten hatte einen signifikanten Einfluss

auf den Anteil GFP positiver Zellen (p=0,0111).

62

Ergebnisse

4.2 Gentransfer in humane CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut

4.2.1 Anreicherung humaner CD34+ Zellen Nach Aufreinigung der CD34+ Zellen aus etwa 50 bis 70 ml Nabelschnurblut konnten

zwischen 2 x 108 und 4 x 108 mononukleäre Zellen isoliert werden. Aus diesen

mononukleären Zellen konnten durch eine einmalige Aufreinigung in MACS-Säulen

zwischen 0,5 und 1,6 x 106 CD34+ Zellen isoliert werden. Der prozentuale Anteil der

CD34+ Zellen an den Zellen nach der Aufreinigung lag zwischen 45 und 75 %.

4.2.2 Retroviraler Gentransfer in humanen CD34+ Zellen

Lentivirale, gammaretrovirale und foamyvirale Konstrukte wurden mit einem

foamyviralen Hüllprotein verpackt. Zum Vergleich wurde ein lentivirales Konstrukt mit

dem Hüllprotein VSV-G verpackt. Für die Generierung des lentiviralen Konstrukts

wurde des Helferplasmid CD/NL-BH eingesetzt. Die Virustiter wurden vor und nach

der Zentrifugation gemessen. Der Virusüberstand von 8 Zellkulturplatten mit je 10 cm

Durchmesser wurde gepoolt, zentrifugiert und das Viruspellet in 1 ml Medium

aufgenommen.

Durch die Zentrifugation konnte der Virustiter je nach Konstrukt um das 1,4 fache

(pCL1 EM140), 2,9 fache (MH71 EM140), 5,8 fache (pCAMSΔU3E EM140) resp. um

das 7,3 fache (pCL1 VSV-G) gegenüber dem Ausgangswert gesteigert werden

(Abbildung 12). Die zentrifugierten Virusüberstände wurden bis zur weiteren

Verwendung kryokonserviert.

63

Ergebnisse

0,00E+00

1,50E+07

3,00E+07

4,50E+07

6,00E+07

pCL1 VSV-G pCL1 EM140 MH71 EM140 pCAMSΔU3E

TE /

ml

0,00E+00

1,50E+07

3,00E+07

4,50E+07

6,00E+07


TE /

ml

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140



Abbildung 12: Virustiter, gemessen auf HT1080 Zellen vor und nach dem

Zentrifugieren der Virusüberstände

Die Virusüberstände wurden zur Transduktion von humanen CD34+ Zellen eingesetzt.

Fünf Tage nach der Transduktion wurde die Gentransferrate mittels FACS-Analyse

gemessen.

Der Anteil GFP positiver Zellen, und somit die Gentransferrate, betrug bei den

transduzierten CD34+ Zellen 28 bis 77 % (Abbildung 13). Die Höhe des Virustiters

64

Ergebnisse

vor der Transduktion hat keinen Einfluss auf die Gentransferraten der einzelnen

Konstrukte. Das foamyvirale Konstrukt hatte den niedrigsten Virustiter, wies aber mit

74 % GFP positiver Zellen eine der höchsten Gentransferraten auf. Der Virustiter des

Konstruktes pCL1 EM140 war mehr als doppelt so hoch wie der des MH71 EM140

Konstruktes. Der Unterschied in der Gentransferrate betrug jedoch nur 3 %. Das

gammaretrovirale Konstrukt pCAMSΔU3E, pseudotypisiert mit dem EM140, zeigte

einen ähnlich hohen Titer wie das foamyvirale Konstrukt. Die Gentransferrate lag mit

28 % GFP positiver Zellen jedoch etwa 50 % unter der des foamyviralen Konstruktes.

0

20

40

60

80

pCL1 VSV-G pCL1 EM140 MH71 EM140 pCAMSΔU3E EM140

GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Abbildung 13: Gentransferraten humanen CD34+ Zellen nach transduktion mit lenti-,

ammaretro- und foamyviralen Viruskonstrukten g

65

Ergebnisse

4.2.3 Einfluss des Transgens MGMTp140k auf die Gentransferrate Die Transduktionseffizienz verschiedener foamyviraler Konstrukte wurde

vergleichend gegenübergestellt. Um den Einfluss des Transgens zu ermitteln,

wurden die Höhe des Virustiters, der Anteil GFP positiver Zellen nach Transduktion

von humanen CD34+ Zellen und der Anteil GFP-positiver Zellen im Progenitor-Assay

bestimmt.

Zur Generierung der Virusüberstände wurden bei den Konstrukten MD9 und

MD9.MGMT die Helferplasmide pcziGag und pcziPol eingesetzt. Als Hüllprotein

wurde für alle Konstrukte das EM140 eingesetzt. Der Virusüberstand von 8

Zellkulturplatten mit einem Durchmesser von 10 cm wurde gepoolt und zentrifugiert.

Das Viruspellet wurde in 1 ml Medium aufgenommen und frisch zur Transduktion der

humanen CD34+ Zellen eingesetzt.

Gegenüber den Ausgangswerten konnte der Virustiter durch das Zentrifugieren je

nach Konstrukt um das 19,7 fache (MD9.MGMT), 25,7 fache (MD9), 29,8 fache

(MH71.MGMT) resp. um das 30 fache (MH71) gesteigert werden (Abbildung 14).

66

Ergebnisse

0,00E+00

1,00E+07

2,00E+07

3,00E+07

4,00E+07

5,00E+07

6,00E+07

7,00E+07

8,00E+07

9,00E+07

/ m

l

1,00E+08

MH71.MGMT MD9 MD9.MGMTMH71

TE

Vektor MH710,00E+00

1,00E+07

2,00E+07

3,00E+07

4,00E+07

MH71

TE

Helferplasmid

Hüllprotein

--

EM140

--

EM140

pcziGag / pcziPol

EM140

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71.MGMT MD9 MD9.MGMT

5,00E+07

6,00E+07

7,00E+07

8,00E+07

9,00E+07

/ m

l

1,00E+08

MH71.MGMT MD9 MD9.MGMT0,00E+00

1,00E+07

2,00E+07

3,00E+07

4,00E+07

MH71

TE

5,00E+07

6,00E+07

7,00E+07

8,00E+07

9,00E+07

/ m

l

1,00E+08

MH71.MGMT MD9 MD9.MGMTVektor MH71

Helferplasmid

Hüllprotein

--

EM140

--

EM140

pcziGag / pcziPol

EM140

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71.MGMT MD9 MD9.MGMTVektor MH71

Helferplasmid

Hüllprotein

--

EM140

--

EM140

pcziGag / pcziPol

EM140

pcziGag / pcziPol

EM140

MH71.MGMT MD9 MD9.MGMT



Abbildung 14: Virustiter vor und nach dem Zentrifugieren der Virusüberstände

Die zentrifugierten Virusüberstände wurden zur Transduktion von humanen CD34+

Zellen eingesetzt. Ein Teil der Zellen wurde in Progenitor-Assays ausgesät, an dem

anderen Teil wurde 5 Tage nach der Transduktion die Anteil der GFP positiven

Zellen mittels FACS-Analyse ermittelt.

67

Ergebnisse

68

0

10

20

30

40

50

MH71 MH71.MGMT MD9 MD9.MGMT

GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Vektor

Helferplasmid

Hüllprote

MH71

EM140

MH71.MGMT

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

-- --

0

10

20

30

40

50

MH71 MH71.MGMT MD9 MD9.MGMT

GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

in

Vektor

Helferplasmid

Hüllprote

MH71

EM140

MH71.MGMT

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprote

MH71

EM140

MH71.MGMT

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

bbildung 15: Gentransferraten foamyviraler Konstrukte auf humanen CD34+ Zellen

ie Gentransferraten lagen, gemessen am Anteil GFP positiver Zellen, in diesem

ukt MH71 mit 66,5 Mio TE / ml mehr als 50 %

ber dem des MD9.MGMT mit 25,6 Mio TE / ml. Die Gentransferrate des Konstruktes

MH71 betrug 44,4 % GFP positiver Zellen, die des Konstruktes MD9.MGMT 25,2 %.

Die Gentransferraten der Konstrukte mit MGMTp140k lagen jeweils leicht unterhalb

der von Konstrukten ohne dieses Transgen.

inin

-- ---- --

A

(5 Tage nach der Transduktion mittels Durchflusszytometrie ermittelt)

D

Versuch zwischen 25,2 und 44,4 % (Abbildung 15) und zeigten damit eine deutliche

Korrelation zur Höhe der Virustiter. Dieser Einfluss wird bei einem direkten Vergleich

der Ergebnisse aus Zellen mit den Konstrukten MH71 und MD9.MGMT besonders

deutlich. Der Virustiter lag beim Konstr

ü

Ergebnisse

In Abbildung 16 sind die Ergebnisse des Progenitor-Assays als arithmetrischer

Mittelwert aus drei Ansätzen (Triplikate) mit je 250 Zellen / ml Methylzellulose

dargestellt. Die Anzahl der gezählten Kolonien wurde jeweils als 100 % betrachtet.

Die so bestimmte Gentransferrate betrug 67 % (MH71 resp. MH71.MGMT) resp.

66 % (MD9). Diese hohe Gentransferrate war unabhängig vom zuvor bestimmten

Virustiter und den im FACS gemessenen Gentransferraten. Das Konstrukt

MD9.MGMT wies mit einer Gentransfereffizienz von 53 % einen geringfügig

niedrigeren Wert auf. Die Gentransferrate in der FACS-Analyse war für das Konstrukt

MH71 um 34 % niedriger als im Progenitor-Assay. Für das Konstrukt MH71.MGMT

lag dieser Wert bei 38 %, für das Konstrukt MD9 bei 49 %. Bei dem Konstrukt

MD9.MGMT wurde in der FACS-Analys eine Gentransferrate von 25 % ermittelt und

die Gentransferrate des Progenitor-Assays lag hier um 52 % über dem Niveau der

FACS-Analyse.

69

Ergebnisse

0

8080

20

40

60

GFP

pos

itive

Kol

onie

n (%

)

20

40

60

GFP

pos

itive

Kol

onie

n (%

)

MH71 MH71.MGMT MD9 MD9.MGMTVektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

0MH71 MH71.MGMT MD9 MD9.MGMTVektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

MH71.MGMT

--

EM140

MD9

pcziGag / pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag / pcziPol

EM140

Abbildung 16: Progenitor-Assay von humanen Zellkolonien, die zuvor mit

foamyviralen Vektoren transduziert wurden

4.2.4 Transduktionseffizienz verschiedener foamyviraler Konstrukte

Das Hüllprotein EM140 zeigte auf den Produzentenzellen eine deutliche Toxizität.

Die Titer der unterschiedlichen foamyviralen Hüllproteine wurden bereits verglichen.

An dieser Stelle soll die Transduktionseffizienz verschiedener foamyviraler

Konstrukte und deren Abkömmlinge, die das Transgen MGMTp140k tragen und mit

den Hüllproteinen EM140 und SM04 verpackt sind, auf den Zielzellen verglichen

werden. Die Höhe des Virustiters wurde vor und nach dem Zentrifugieren ermittelt.

Die Gentransferrate der Konstrukte wurde an der Anzahl CD34+ Zellen in der FACS-

Analyse und dem Anteil GFP positiver Zellen im Progenitor-Assay bestimmt. Zur

70

Ergebnisse

Generierung der Virusüberstände wurde bei den Konstrukten MD9 und MD9.MGMT

die Helferplasmide pcziGag und pcziPol eingesetzt. Alle Konstrukte wurden einmal

mit dem Hüllprotein EM140 und einmal mit dem SM04 Hüllprotein verpackt. Von

jedem Konstrukt wurde der Virusüberstand von 8 Zellkulturplatten mit einem

Durchmesser von 10 cm gepoolt und zentrifugiert. Das Viruspellet wurde in 1 ml

Medium aufgenommen und frisch zur Transduktion von humanen CD34+ Zellen

eingesetzt. Durch das Zentrifugieren konnte das Volumen, in dem sich das Virus

befindet, um 97,5 % reduziert und die Konzentration entsprechend gesteigert werden.

Die Virustiter sind logarithmisch dargestellt.

1,00E-01SM04 SM04 EM140 EM140

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

MH71 SM04 MH71.MGMT MD9 SM04 MD9.MGMT MH71 EM140 MH71.MGMT MD9 EM140 MD9.MGMT

TE /

ml

1,00E+02

1,00E-01SM04 SM04 EM140 EM140

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

MH71 SM04 MH71.MGMT MD9 SM04 MD9.MGMT MH71 EM140 MH71.MGMT MD9 EM140 MD9.MGMT

TE /

ml

1,00E+02

Vektor

l

MH71 MD9

pcziPol

MH71MH71.MGMT MD9.MGMT

pcziPol

MH71.MGMT MD9

pcziPol

MD9

ag /

pcziPol

Vektor

l

MH71 MD9

pcziPol

MH71MH71.MGMT MD9.MGMT

pcziPol

MH71.MGMT MD9

pcziPol

MD9

ag /

pcziPol

Helferp asmid -- pcziGag / ---- pcziGag / -- pcziGag / pcziGHelferp asmid -- pcziGag / ---- pcziGag / -- pcziGag / pcziG

Hüllprotein SM04 SM04 EM140SM04 SM04 EM140 EM140 EM140Hüllprotein SM04 SM04 EM140SM04 SM04 EM140 EM140 EM140

Abbildung 17: Virustiter vor und nach der Zentrifugation der Virusüberstände

logarithmisch dargestellt

Durch die Zentrifugation konnte der Virustiter deutlich erhöht werden. In Abhängigkeit

des verwendeten Hüllproteins war die Konzentration von Virusüberstand

71

Ergebnisse

unterschiedlich erfolgreich. Der Virustiter der Konstrukte, die mit dem Hüllprotein

SM04 verpackt worden waren, konnten um das 9 fache (MD9), 11,7 fache (MH71),

14,7 fache (MH71.MGMT) resp. um das 17,9 fache (MD9.MGMT) gegenüber dem

Ausgangswert gesteigert werden. Virustiter der Konstrukte, die mit dem Hüllprotein

EM140 verpackt worden sind, konnten um das 27,6 fache (MH71), 28,3 fache

(MH71.MGMT), 28,3 fache resp. um das 46,5 fache (MD9.MGMT) gegenüber dem

Ausgangswert erhöht werden (Abbildung 17). Es ist deutlich zu erkennen, dass die

Zentrifugation der mit EM140 verpackten Viren zu einer wesentlich stärkeren

Zunahme des Virustiters führt, als es bei SM04 der Fall ist. Im Mittel erhöht sich der

irustiter bei den mit EM140 verpackten Viren um das 32,8 fache, während sich der

Titer bei den mit SM04 verpackten Viren nur um das 13,3 fache erhöhen ließ.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das Vermögen zur Konzentration

des Virustiters durch Zentrifugieren bei dem Hüllprotein EM140 etwa 60 % größer ist,

als bei SM04.

Die Höhe der Virustiter verschiedener Konstrukte unterscheiden sich signifikant

(p=0,0209), so dass ein Einfluss der Konstrukte auf die Titerhöhe angenommen

werden kann.

Die zentrifugierten Virusüberstände wurden zur Transduktion von humanen CD34+

Zellen eingesetzt. Ein Teil der Zellen wurde in Progenitor-Assays ausgesät, an einem

anderen Teil wurde 5 Tage nach der Transduktion der Anteil GFP positiver Zellen

mittels FACS-Analyse ermittelt. Die Ergebnisse einer solchen FACS-Messung sind in Abbildung 18 dargestellt.

V

72

Ergebnisse

0

10

20

30

40

50

60G

FP p

ositi

ve Z

elle

n (%

MH71 SM04 MH71.MGMTSM04

MD9 SM04 MD9.MGMTSM04

MH71 EM140 MH71.MGMTEM140

MD9 EM140 MD9.MGMTEM140

)

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

SM

MD9

pcziGag /

pcziPol

MH71

--

MH71.MGMT

--

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

MH71.MGMT

--

MD9

pcziGag /

pcziPol

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

0

10

20

30

40

50

60G

FP p

ositi

ve Z

elle

n (%

04 SM04 EM140SM04 SM04 EM140 EM140 EM140





)

0

10

20

30

40

50

60G

FP p

ositi

ve Z

elle

n (%

)





Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

SM

MD9

pcziGag /

pcziPol

MH71

--

MH71.MGMT

--

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

MH71.MGMT

--

MD9

pcziGag /

pcziPol

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

SM

MD9

pcziGag /

pcziPol

MH71

--

MH71.MGMT

--

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

MH71.MGMT

--

MD9

pcziGag /

pcziPol

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

04 SM04 EM140SM04 SM04 EM140 EM140 EM14004 SM04 EM140SM04 SM04 EM140 EM140 EM140

ie Gentransferrate war, gemessen anhand des Anteils GFP positiver Zellen, in

iesem Versuch für das Hüllprotein SM04 zwischen 1,7 und 21,0 % und für das

Hüllprotein EM140 zwischen 18,8 und 58,7 %. Die Gentransferrate zeigte eine

deutliche Abhängigkeit von der Höhe des Virustiters. Die Konstrukte MH71.MGMT

SM04, MH71.MGMT EM140 und MD9.MGMT EM140 hatten einen höheren Virustiter,

als die Varianten ohne MGMTp140k. Die Gentransferraten der Konstrukte mit

MGMTp140k waren geringgradig niedriger als die der Konstrukte ohne dieses

Transgen.

Abbildung 18: Gentransferrate von foamyviralen Konstrukten mit verschiedenen

Hüllproteinen auf humanen CD34+ Zellen (5 Tage nach Transduktion mittels

Durchflusszytometrie ermittelt)

D

d

73

Ergebnisse

Als Ergebnis des Progenitor-Assays sind die arithmetischen Mittelwerte von drei

Ansätzen (Triplikate) mit 250 Zellen / ml Methylzellulose dargestellt (Abbildung 19).

Die Anzahl der gezählten Kolonien wurde als 100 % betrachtet.

0

20

40

60

80

100





GFP

pos

itive

Kol

onie

n (%

)

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

SM04

MD9

pcziGag /

pcziPol

SM04

MH71

--

EM140

MH71.MGMT

--

SM04

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

SM04

MH71.MGMT

--

EM140

MD9

pcziGag /

pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

EM140

0

20

40

60

80

100





GFP

pos

itive

Kol

onie

n (%

)

0

20

40

60

80

100





GFP

pos

itive

Kol

onie

n (%

)

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

SM04

MD9

pcziGag /

pcziPol

SM04

MH71

--

EM140

MH71.MGMT

--

SM04

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

SM04

MH71.MGMT

--

EM140

MD9

pcziGag /

pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

SM04

MD9

pcziGag /

pcziPol

SM04

MH71

--

EM140

MH71.MGMT

--

SM04

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

SM04

MH71.MGMT

--

EM140

MD9

pcziGag /

pcziPol

EM140

MD9.MGMT

pcziGag /

pcziPol

EM140

Abbildung 19: Progenitor Assay von humanen Zellkolonien, die mit foamyviralen

ektoren transduziert wurden V

Die Gentransferraten der Konstrukte, die mit SM04 verpackt sind, unterscheiden sich

in den Progenitoren weniger deutlich von den mit EM140 verpackten Konstrukten, als

in der FACS-Analyse. Der Anteil GFP positiver Zellen aus den Ansätzen mit EM140

verpackter Viren zeigt eine Korrelation mit der Höhe der im FACS gemessenen

Gentransferrate. Die Konstrukte mit dem MGMTp140k haben eine niedrigere

Gentransferrate als Konstrukte ohne dieses Transgen. Die Konstrukte mit dem

Hüllprotein SM04 zeigen ein uneinheitliches Bild.

74

Ergebnisse

Die Gentransferraten der Progenitor-Assays lagen auch in diesem Versuch deutlich

über den Messwerten der FACS-Analyse. Für die Konstrukte, die mit dem Hüllprotein

SM04 verpackt wurden, lagen die Werte um 61 (MH71) bis 97 % (MD9.MGMT) über

en im FACS gemessenen Gentransferraten. Für das Hüllprotein EM140 lagen die

Zunahmen zwischen 30 (MH71) und 71 % (MD9.MGMT). Die Konstrukte, die das

Transgen MGMT trugen, zeigten eine höhere Zunahme der Gentransferrate

zwischen der FACS-Analyse und den Progenitor-Assays, als die Konstrukte ohne

MGTM. Diese Zunahme wurde unabhängig vom verwendeten Hüllprotein beobachtet.

d

75

Ergebnisse

4.3 Gentransfer in CD 34+ Marmoset Zellen

4.3.1 Gewinnung und Aufreinigung von CD34+ Marmoset Zellen

Die CD 34+ Zellen der Marmosets wurde aus dem Knochenmark isoliert. Das

Knochenmark wurde durch die Punktion der Femures gewonnen. Zur Kontrolle der

Punktionsstelle wurde der Femur des Tieres 0130 nach der Punktion röntgenologisch

untersucht (Abbildung 20). Von den Tieren 0224 und 3101 konnten in einem

Finalversuch etwa 2 ml Knochenmark entnommen werden; bei Tier 0130 konnten

durch die Punktion etwa 0,5 ml Knochenmark entnommen werden. Nach der

Aufreinigung der mononukleären Zellen aus dem Knochenmark wurden 500.000

Zellen von Tier 0224, 340.000 Zellen von Tier 3101 und 70.000 Zellen von Tier 0130

isoliert. Der Anteil CD34+ Zellen an der aufgereinigten CD34 Fraktion, lag bei 95 %.

Abbildung 20: Punktionsstelle im distalen Drittel des rechten Femurs (Tier 0130)

76

Ergebnisse

4.3.2 Retroviraler Gentransfer in CD34+ Marmoset Zellen

Abbildung 21 sind die Virustiter dargestellt, die zur Transduktion der CD34+ Zellen

rstände wurde

ei den lentiviralen Konstrukten pCL1 das Helferplasmid CD/NL-BH eingesetzt.

r

garithmisch dargestellt.

Gegenüber den Ausgangswerten konnte der Virustiter durch das Zentrifugieren je

nach Konstrukt um das 19,7 fache (MD9.MGMT), 25,7 fache (MD9), 29,8 fache

(MH71.MGMT) resp. um das 30 fache (MH71) erhöht werden. Für Tier 0224 lag die

Steigerung der Viruskonzentration durch das Zentrifugieren z

fachen (pCL1 VSV-G) resp. 22,4 fachen (pCAMSΔ lagen

die Werte zwischen 8,9 (pCL1 EM140) resp. 12,6 (pCL1 VSV-G) und bei Tier 0130

zeigten die Titrationen eine Erhöhung um das 6,6 fache (MH71 EM140) resp. um das

12,3 fache (pCAMSΔU3E EM140) gegenüber dem Ausgangswert.

In

von Marmosets eingesetzt worden sind. Zur Generierung der Virusübe

b

Als Hüllprotein wurde das VSV-G zur Pseudotypisierung des pCL1 eingesetzt.

Zusätzlich wurde das Konstrukt pCL1 mit dem foamyviralen Hüllprotein EM140

pseudotypisiert. Das foamyvirale und das gammaretrovirale Konstrukt wurden mit

dem Hüllprotein EM140 verpackt. Der Virusüberstand von 8 Zellkulturplatten mit

einem Durchmesser von 10 cm wurde gepoolt und zentrifugiert. Das Viruspellet

wurde in 1 ml Medium aufgenommen und frisch zur Transduktion der Marmoset

CD34+ Zellen eingesetzt. Durch das Zentrifugieren wurde das Volumen des

Virusüberstandes um 97,5 % verringert. Die zentrifugierten Virusüberstände, die zur

Transduktion der CD34+ Marmoset Zellen eingesetzt wurden, sind hier für jedes Tie

lo

wischen dem 10,5

U3E EM140), bei Tier 3101

77

Ergebnisse

1,00E+09

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06


TE /

ml

1,00E+07

1,00E+08

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1 MH71 pCAMSΔU3E

CD/NL-BH

EM140

--

EM140

--

EM140

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06


TE /

ml

1,00E+09

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+07

1,00E+08

1,00E-01

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06


TE /

ml

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1 MH71 pCAMSΔU3EVektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1 MH71 pCAMSΔU3E

CD/NL-BH

EM140

--

EM140

--

EM140

CD/NL-BH

EM140

--

EM140

--

EM140

ndet worden sind,

garithmisch dargestellt

Die zentrifugierten Virusüberstände wurden zur Transduktion von CD34+ Marmoset

Zellen eingesetzt. Ein Teil der Zellen wurde in Progenitor-Assays ausgesät, an einem

anderen Teil wurde am 5. Tag, bei Tier 3101 zusätzlich am Tag 9 nach der

Tier 0224

Tier 3101

Tier 0130

Abbildung 21: Virustiter nach dem Zentrifugieren der Virusüberstände, die zur

Transduktion der CD34+ Zellen der einzelnen Versuchstiere verwe

lo

78

Ergebnisse

Transduktion der Anteil der GFP positiven Zellen mittels FACS-Analyse ermittelt. Die

Messung der Zellen des Tieres 0224 ist in Scatter-Plots dargestellt (Abbildung 22).

Abbildung 22: Darstellungen der durchflusszytometrischen Messungen der

transduzierten CD34 Zellen des Tieres 0224. A: Zellen im Vorwärt rts-Scatter und das Gate um die lebenden Zellen, B-F Analyse der Gentransfereffizien Konstrukte 5 Tage nach Transfektion

+

s- und Seitwäder einzelnenz

F E D

C B

R1

A ohne Virus ohne Virus

0% 5%

88% 94% 55%

pCL1 VSV-G

pCL1 EM140 MH71 EM140 pCAMSΔU3E EM140

79

Ergebnisse

80

0

20

40

60

80

100


GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Tier 0224

0

20

40

P po

sitiv

e

60

Zel

len

(%)

80

100


GF

Tier 3101

am Tag 5 / 9

0

20

80

100


GF

40

P po

sitiv

e

60

Zel

len

(%)

Tier 3101

am Tag 5 / 9

Ergebnisse

0

20

40

60

80

100


GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Tier 0130

0

20

40

60

80

100


GFP

pos

itive

Zel

len

(%)

Tier 0130

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Abbildung 23: Transduktionseffizienzen von CD34+ Marmoset Zellen

Die Auswertung der FACS-Messung ist für alle Tiere in der Abbildung 23 gezeigt. Bei

Tier 0224 fällt auf, dass das foamyvirale Konstrukt mit 93 % die höchste

Gentransferrate aller verwendeten Konstrukte erzielt, der Titer aber niedriger ist, als

der des pCL1 EM140 und des pCAMSΔU3E EM140. Die Transduktionseffizienz des

foamyviralen Konstrukts ist auch bei Tier 3101 hoch. Hier hat das Konstrukt MH71

EM140 den niedrigsten Virustiter, die Transfektionsrate lag mit 78 % GFP positiver

Zellen aber deutlich über der des pCL1 VSV-G und auch 6 % über der des

Gammaretrovirus.

Vergleicht man die an Tag 5 und an Tag 9 durchflusszytometrisch gemessenen

Werte des Tieres 3101, so kann festgestellt werden, dass der Anteil GFP positiver

Zellen bei allen Konstrukten abnimmt und nur das foamyvirale Konstrukt einen gleich

bleibenden Anteil GFP positiver Zellen aufweist. Das Konstrukt pCL1 EM140 führte

nur zu einer geringen Abnahme des Anteils der GFP positiven Zellen, allerdings war

81

Ergebnisse

der Anteil GFP positiver Zellen beim Konstrukt pCAMSΔU3E EM140 37 % geringer

nd beim Konstrukt pCL1 VSV-G 66 % geringer als der Ausgangswertes. Das

foamyvirale Konstrukt führte bei Tier 0130 zu einem niedrigen Titer und erreicht eine

Transfektionsrate von 23 %, die mit der des pCL1 VSV-G (27 %) vergleichbar ist. Der

Virustiter des Konstruktes pCL1 VSV-G betrug 2 x 107 TE / ml und war damit höher

als der des Konstrukts MH71 EM140.

In den Abbildungen der Progenitor-Assays sind die arithmetischen Mittelwerte von

drei Ansätzen (Triplikate) mit 250 Zellen/ml Methylzellulose, bei Tier 0130 mit 200

Zellen/ml Methylzellulose dargestellt (Abbildung 24). Die Anzahl der insgesamt

gezählten Kolonien wurde gleich 100 % gesetzt.

u

Tier 0224

0

20

40


GFP

pos

itive

60

100

Kol

onie

n (%

)

80 Tier 0224

0

20

40


GFP

pos

itive

60

100

Kol

onie

n (%

)

80

82

Ergebnisse

Tier 3101

0

20

pCL1 VSV-G pCL1 EM140 M

GF

40

H71 EM140 pCAMSΔU3E

P po

s

60

80

100

itive

Kol

onie

n (%

)

Tier 3101

0

20

pCL1 VSV-G pCL1 EM140 M

GF

40

H71 EM140 pCAMSΔU3E

P po

s

60

80

100

itive

Kol

onie

n (%

)

Tier 0130

0

20

40

60

80


GFP

pos

itive

Kol

onie

n (%

)

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Tier 0130

0

20

40

60

80


GFP

pos

itive

Kol

onie

n (%

)

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

pCL1

CD/NL-BH

VSV-G

pCL1

CD/NL-BH

EM140

MH71

--

EM140

pCAMSΔU3E

--

EM140

keine lebenden

Zellen

Abbildung 24: Progenitor-Assay der transduzierten CD34+ Marmoset Zellen

Die Transduktionsergebnisse der Progenitor-Assays korrelierten eng mit den

Gentransferraten, die bereits im Durchflusszytometer ermittelt werden konnten. In

dem Ansatz pCL1 EM140 waren sowohl in dem Ansatz mit 200 als auch in dem mit

83

Ergebnisse

84

800 Zellen/ml Methylzellulose keine Kolonien gewachsen. In allen drei Versuchen

wies das lentivirale Konstrukt, verpackt mit dem VSV-G, in den Progenitoren

besonders schlechte Gentransferraten auf. Es konnten nur einzelne Kolonien erkannt

werden, die GFP positiv waren. Der Anteil der GFP positiven Kolonien war bei den

Konstrukten pCL1 und pCAMSΔU3E, pseudotypisiert mit dem EM140, immer kleiner

als bei den im FACS gemessenen Gentransferraten. Die an Tag 9 bei Tier 3101 im

FACS gemessenen Gentransferraten waren bei beiden Konstrukten den Werten des

Progenitor-Assays ähnlicher. Die Werte des foamyviralen Konstrukts liegen dagegen

alle über den im FACS ermittelten Anteilen GFP positiver Zellen.

.4 MGMTp140k als Transgen

4.4.1 Transduktion hämatopoetischer Zelllinien

Zellen der Zelllinien HL60, Hel und K562 wurden mit vier unterschiedlichen

Viruskonstrukten transduziert, um transgene Zelllinien zu generieren. Verwendet

wurden die Konstrukte MH71, MH71.MGMT, MD9 und MD9.MGMT. Die

Viruskonstrukte wurden alle mit dem Hüllprotein EM140 verpackt. Für die Konstrukte

MD9 und MD9.MGMT wurden die beiden Helferplasmide pcziGag und pcziPol zur

Generierung des Virus eingesetzt. Der Virusüberstand von 8 Zellkulturplatten mit je

10 cm Durchmesser wurde gepoolt, zentrifugiert und das Viruspellet in 3 ml Medium

aufgenommen. Durch die Zentrifugation konnte der Virustiter je nach Konstrukt um

as 6 fache (MH71.MGMT), 8,7 fache (MD9), 9,4 fache (MD9.MGMT) resp. um das

Virustiter

gen nach dem Zentrifugieren lagen bei 1,7 x 106 TE / ml (MH71.MGMT), 1,4 x 107

E / ml (MD9.MGMT), 1,8 x 107 TE / ml (MD9) und der höchste lag bei 2,5 x107 TE /

4

d

10 fache (MH71) gegenüber dem Ausgangswert gesteigert werden. Die

la

T

ml (MH71).

Ergebnisse

Nach der Zentrifugation sind die Virustiter der einzelnen Konstrukte unterschiedlich

hoch. Diese Unterschiede ließen sich statistisch absichern (p = 0,0117); daraus kann

ein Einfluss der verwendeten Konstrukte auf die Titerhöhe abgeleitet werden.

0

2

60

80

100

ive

Zelle

n (%

)

0

40

MH

71.M

MD

9.

MH

71.M

MD

9.M

GM

T

MH

71

MD

9

MH

71.M

GM

T

MD

9.M

GM

T

MH

71

MD

9

GM

T

MG

MT

MH

71

MD

9

GM

T

HL60 HEL K562

GFP

pos

it

enhang nachgewiesen werden (p = 0,0373).

Abbildung 25: Transduktion von hämatopoetischen Zelllinien mittels foamyviraler

Vektoren, die das Transgen GFP tragen und Konstrukten, die zusätzlich das Gen

MGMTp140k tragen

Die Größe des Anteils transduzierter Zellen (GFP positive Zellen) war unabhängig

vom verwendeten Konstrukt. Insgesamt konnten je nach Konstrukt und Zelllinie

Gentransferraten zwischen 14 und 93 % erreicht werden.

Dagegen zeigte der Anteil der GFP positiver Zellen und somit auch die

Gentransferrate deutliche Unterschiede in Abhängigkeit zur verwendeten Zelllinie.

Hier konnte ein signifikanter Zusamm

85

Ergebnisse

Die HEL Zellen ließen sich mit den verwendeten Konstrukten besonders effizient

transduzieren (Abbildung 25).

Transgene Zelllinien, die in diesem Versuch generiert wurden, sind im Anschluss zur

Ermittlung der Resistenz gegenüber Chemotherapeutika durch MGMTp140k

eingesetzt worden.

Die transgenen Zelllinien wurden weiter kultiviert und die Gentransferrate wurde

wöchentlich gemessen (Abbildung 26).

Bei den Zelllinien HEL und K562 war der Anteil GFP positiver Zellen bei den

Konstrukten MH71 und MD9 ohne MGMT in der ersten Woche immer höher als bei

den Konstrukten mit MGMT. In der zweiten und dritten Woche nach der Transduktion

nimmt der Anteil GFP positiver Zellen an der Gesamtpopulation bei den Konstrukten

ohne MGMT sogar leicht zu, bei den Konstrukten mit MGMT fällt er ab. Die

Gentransferraten von MH71 und MD9 blieben über Wochen hinweg auf einem gleich

bleibend hohen Niveau. Bei den Konstrukten MH71.MGMT und MD9.MGMT nahm

der Anteil GFP positiver Zellen von Woche zu Woche kontinuierlich ab. Bei den HL60

Zellen war die Abnahme bei den MGMT tragenden Konstrukten nicht so auffällig, der

nteil GFP positiver Zellen ist ehr als Konstant zu bezeichnen.

A

86

Ergebnisse

HL60

60

20

40

GFP

pos

itive

Zellen (%

)

01 2 3 4 5 6 7 8

AAAA BBBB CCCC DDDD

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8

GFP

pos

itive

Zellen (%

)

aaaa bbbb cccc dddd

HEL

0

20

40

60

1 2 3 4 5 6 7 8

GFP

pos

itive

Zellen (%

)

aaaa bbbb cccc dddd

K562

Vektor

Helferplasmid

Hüllprotein

MH71

--

EM140

Woche

MD9

pcziGag /

pcziPol

EM140

MH71.

MGMT

--

EM140

MD9.

MGMT

pcziGag /

pcziPol

EM140 Abbildung 26: Transgene Zelllinien, deren Gentransferraten über acht Wochen hinweg wöchentlich gemessen wurden

87

Ergebnisse

4.4.2 Selektion von transduzierten Zelllinien mittels BCNU in vitro

Die Resistenz transduzierter Zellen, die das Transgen MGMTp140k mittels der

Vektoren MH71.MGMT oder MD9.MGMT erhalten, wurde mit der Resistenz nicht

transduzierter Zellen verglichen. Die Zellen wurden einmalig mit 0, 20, 80 oder 160

µM BCNU behandelt. Die Messwerte aus drei Versuchen sind als arithmetische

Mittelwerte dargestellt (Abbildung 27). Die Grafik enthält die Prozentwerte der

lebenden und GFP positiven Zellen, gemessen an der Gesamtzahl, der im FACS

registrierten Ereignisse.

HL60

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Zelle

n (%

)

88

Ergebnisse

HEL

0

20

40

60

Zelle

n (

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

%)

K562

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Zelle

n (%

)

Virus

BCNU (μM)

--

--

MH71

MGMT

--

MD9

MGMT

--

--

20

MH71

MGMT

20

MD9

MG

20

G

20

MT

--

80

MH71

MGMT

80

MD9

MGMT

80

--

160

MH71

MGMT

160

MD9

MGMT

160

Virus

BCNU (μM)

--

--

MH71

MGMT

--

MD9

MGMT

--

--

20

MH71

MGMT

20

MD9

M MT

--

80

MH71

MGMT

80

MD9

MGMT

80

--

160

MH71

MGMT

160

MD9

MGMT

160

Anteil lebender Zellen (%)

Anteil GFP positiver Zellen unter den lebenden Zellen (%)

Abbildung 27: Selektion verschiedener transduzierter Zelllinien mittels BCNU

89

Ergebnisse

Die verschiedenen Zelllinien zeigten keine signifikanten Unterschiede in der

Überlebensrate nach Behandlung; somit ließ sich eine ähnlich hohe Sensitivität aller

Zellen gegenüber BCNU feststellen. Dagegen bestand zwischen den verwendeten

Konstrukten einen signifikanter Unterschied in der Überlebensrate der Zellen (p =

0,0050).

Betrachtet man den prozentualen Anteil GFP positiver Zellen an der Population

überlebender Zellen, so lässt sich feststellen, dass die Zelllinien HL60 und K562 mit

den Konstrukten MH71.MGMT und MD9.MGMT jeweils den höchsten prozentualen

Anteil GFP positiver Zellen innerhalb der gleichen Zelllinie aufwiesen. HEL Zellen

zeigten nur nach Verwendung des Konstrukts MD9.MGMT einen signifikant höheren

Anteil GFP positiver Zellen (p = 0,0004). Dem Konstrukt MH71.MGMT kann,

bezogen auf diesen Parameter, kein signifikanter Einfluss nachgewiesen werden.

90

Ergebnisse

4.4.3 Mehrmalige Behandlung von transgenen HL60 Zellen mit BCNU

In diesem Versuch sind exemplarisch HL60 Zellen verwendet worden. Es wurden die

Zahl überlebender Zellen und der Anteil GFP positiver Zellen von transduzierten

ellen mit nicht transduzierten Zellen verglichen. Die Zellen wurden über mehrere

die

ehandlung nicht zu einer Zunahme der GFP positiven Zellen am Anteil der

berlebenden Zellen. Dagegen zeigen die Konstrukte MH71.MGMT und MD9.MGMT

eine signifikante Zunahme der GFP positiven Zellen an dem Anteil Überlebender

Zellen (p = 0,0010 resp. p = 0,0013). Demnach ist die effektive Wirkung des

Transgen MGMTp140K als Resistenzgen gegenüber dem Chemotherapeutikum

BCNU nachgewiesen.

Z

Tage hinweg mit BCNU behandelt.

In der Grafik sind die arithmetische Mittelwerte der drei Wiederholungen dargestellt

(Abbildung 28).

Das verwendete Konstrukt und die Art der Behandlung hatten einen signifikanten

Einfluss auf den Anteil überlebender Zellen (p = 0,0011 resp. p = 0,0028). Bei den

beiden Konstrukte MH71 und MD9, die keine Resistenzgene tragen, führt

B

ü

91

Ergebnisse

ohne Virus

0ohne BCNU

20

80

20mM 40mM 60mM 80mM 20-20mM 20-20-20mM

20-20-20-20mM

20-40mM 20-40-80mM

40

60

Zelle

n (%

)

MH71

0

20

40

60

80

Zelle

n (%

)

ohne BCNU 20mM 40mM 60mM 80mM 20-20mM 20-20-20mM

20-20-20-20mM

20-40mM 20-40-80mM

MD9

0

20

40

60

80


20-20-20-20mM

20-40mM 20-40-80mM

Zelle

n (%

)

BCNU (μM) -- 20 40 60 80 20-20 20-20-20 20-20-

20-20

20-40 20-40-80BCNU (μM) -- 20 40 60 80 20-20 20-20-20 20-20-

20-20

20-40 20-40-80

92

Ergebnisse

MH71.MGMT

0

20

40

60

80


20-20-20-20mM

20-40mM 20-40-80mM

Zelle

n (%

)

MD9.MGMT

0

20

40

60

80


20-20-20-20mM

20-40mM 20-40-80mM

Zelle

n (%

)

BCNU (μM) -- 20 40 60 80 20-20 20-20-20 20-20-

20-20

20-40 20-40-80BCNU (μM) -- 20 40 60 80 20-20 20-20-20 20-20-

20-20

20-40 20-40-80


Anteil GFP positive Zellen unter den lebenden Zellen (%)

Abbildung 28: Selektion transduzierter HL60 Zellen mittels BCNU Behandlung über

mehrere Tage

93

Ergebnisse

4.4.4 Selektion transgener HL60 Zellen mit BG und BCNU in vitro

Der Anteil überlebender Zellen und der prozentuale Anteil GFP positiver Zellen am

Anteil der überlebenden Zellen wurde bei transduzierten und nicht transduzierten

HL60 Zellen verglichen, die vor der BCNU Behandlung mit BG inkubiert wurden.

Sowohl die mit BG vorbehandelten, als auch die nicht vorbehandelten Zellen wurden

einmalig mit 0, 10, 20, 40 oder 60 µM BCNU behandelt.

In der Grafik sind die arithmetischen Mittelwerte der drei Wiederholungen (Triplikate)

eines Versuchs dargestellt (Abbildung 29).

Bei allen verwendeten Konstrukten zeigte sich, das die Art der Behandlung einen

signifikanten Einfluss auf den Anteil überlebender Zellen und den Anteil GFP

positiver Zellen an den überlebenden Zellen hat. In der grafischen Darstellungen der

Versuchsergebnisse wird deutlich, dass die Überlebensrate der Zellen mit dem

Transgen MGMTp140k deutlich höher war, als die von Zellen, die mit anderen

Konstrukten transfiziert wurden. Der Unterschied wird nach einer Behandlung der

Zellen mit BG in den Konzentrationen 20 und 40 µM BCNU noch deutlicher. Der

Anteil GFP positiver Zellen an der Anzahl überlebender Zellen nimmt bei den

MGMTp140k tragenden Konstrukten stärker zu, als bei den Konstrukten ohne

MGMTp140k.

94

Ergebnisse

4.4.5 Selektion transgener CD34 Marmoset Zellen mit BG und BCNU

erung des Virus eingesetzt.

entrifugation lagen die Virustiter für die Konstrukte MH71 und MD9.MGMT bei 1 x 7 7 6

influss des verwendeten Konstrukts (p = 0,0281). Das verwendete

auf die numerische Überlebensrate der

Zellen.

+

Die CD34+ Zellen des Marmoset 0224 wurden mit vier unterschiedlichen

Viruskonstrukten transduziert. Die verwendeten Viruskonstrukte wurden alle mit dem

Hüllproteinen EM140 verpackt. Für die Konstrukte MD9 und MD9.MGMT wurden die

beiden Helferplasmide pcziGag und pcziPol zur Generi

Der Virusüberstand von 8 Zellkulturplatten mit je 10 cm Durchmesser wurde gepoolt,

zentrifugiert und das Viruspellet in 1 ml Medium aufgenommen. Nach der

Z

10 , für MD9 bei 1,5 x 10 und für MH71.MGMT bei 2 x 10 TE pro ml.

Die Transduktionseffizienz war bei dem Konstrukt MD9 mit 79 % transduzierter

Zellen am höchsten. Für die Konstrukte MH71 konnte ein Anteil von 68 %, für

MH71.MGMT von 61 % und für MD9.MGMT ein Anteil von 59 % GFP positiver Zellen

ermittelt werden.

Die unterschiedliche Behandlung der Zellen hatte einen signifikanten Einfluss auf

den Anteil der überlebenden Zellen (p = 0,0011). Der Anteil GFP positiver Zellen resp.

transgenen Zellen am Anteil der überlebenden Zellen stand ebenfalls unter einem

signifikanten E

Konstrukt zeigt hingegen keinen Einfluss

95

Ergebnisse

100

ohne Virus80

0

20

40

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zelle

n (%

)

MH71

0

100

20

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ze

60

80

llen

(%)

MD9

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zelle

n (%

)

MD9

0

20

40

60

80

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zelle

n (%

)

10

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

10

+

20

+

40

+

60

--

10

--

20

--

40

--

60

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

10

+

20

+

40

+

60

--

10

--

20

--

40

--

60

96

Ergebnisse

MH71.MGMT

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zelle

n (%

)

MD9.MGMT

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zelle

n (%

)

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

10

+

20

+

40

+

60

--

10

--

20

--

40

--

60

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

10

+

20

+

40

+

60

--

10

--

20

--

40

--

60



Abbildung 29: Selektion transduzierter HL60 Zellen mittels BG und BCNU

97

Ergebnisse

0

20

40

60

80

100

ohne BG u. BCNU BG 20mM BCNU BG + 20mM BCNU

Zelle

n (%

) ohne Virus

0

20

40

60

80

100


Zelle

n (%

)

MH71

0

20

40

60

80

100


Zelle

n (%

)

MD9

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

20

--

20

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

20

--

20

98

Ergebnisse

0

20

40

60

80

100


Zelle

n (%

) MH71.MGMT

0

20

40

60

80

100


Zelle

n (%

)

MD9.MGMT

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

20

--

20



Abbildung 30: Selektion transduzierter CD34+ Zellen des Tieres 0224 mittels BG und

BCNU

99

Ergebnisse

4.4.6 Selektion transgener CD34+ Marmoset Progenitoren mit BG und BCNU

Für diesen Versuch wurden Zellen aus dem vorangegangenen Experiment „Selektion

von transduzierten CD34+ Marmoset Zellen mit BG und BCNU“ verwendet. Nach

Behandlung mit BG und BCNU wurden transduzierte CD34+ Zellen entnommen und

in Methylzellulose ausgesät. Die Kolonien wurden nach 14 Tagen gezählt und die

Ergebnisse fotografisch dokumentiert (Abbildung 31). In der Abbildung stellten sich

monoklonale Zellkolonien, sofern sie nach erfolgreicher Transduktion das Transgen

GFP tragen, unter Fluoreszenzlicht als grüne Kolonie da. Zellen, die mit den

Konstrukten MH71 und MD9 transduziert und mit BG und BCNU behandelt wurden,

zeigen keine Koloniebildung, sondern nur das Überleben einzelner Zellen. Dagegen

konnte bei Zellen, die mit den Konstrukten MH71.MGMT und MD9.MGMT

transduziert und zusätzlich zu dem GFP Gen das Transgen MGMTp140k tragen, ein

deutliches Koloniewachstum festgestellt werden.

Unbehandelt Behandelt mit BG und 20 µM BCNU Beschreibung

CD34+ Marmoset Zellen MD9

monoklonale Zellkolonien von CD34+ Marmoset

Zellen

MD9.MGMT

Abbildung 31: Progenitor-Assay von Tier 0224 im Fluoreszenzlicht, behandelt mit BG

nd BCNU u

100

Ergebnisse

In Abbildung 32 sind die arithmetischen Mittelwerte der gezählten Kolonien aus den

nsätzen gezeigt, in denen 200 Zellen pro ml Methylzellulose ausgesät wurden. A

In den Versuchen, in denen die Zellen zuvor mit Virusüberständen transduziert

wurden, sind etwa 50 % weniger Kolonien gewachsen, als bei den nicht

transduzierten Zellen. Von den nicht mit MH71 oder MD9 transduzierten, wohl aber

mit BG und 20 µM BCNU behandelten Zellen, sind keine Kolonien gewachsen. In

Ansätzen, in denen die Zellen das Transgen MGMTp140k tragen, wuchsen

vereinzelte Kolonien. Bei dem Konstrukt MD9.MGMT konnten einige Kolonien

nachgewiesen werden, die jedoch nicht fluoreszieren.

101

Ergebnisse

0

10

20

30

unbehandelt BG 20 m

Kol

onie

n

40

M BCNU BG + 20 mM BCNU

50

ohne Virus

0

10

20

30

40

50

unbehandelt BG 20 mM BCNU BG + 20 mM BCNU

Kol

onie

n

MH71

0

10

20

30

40

50


Kol

onie

n

MD9

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

20

--

20

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

20

--

20

102

Ergebnisse

0

10

20

30

40

50


Kol

onie

nMH71.MGMT

0

10

20

30

40

50


Kol

onie

n

MD9.MGMT

BG

BCNU (μM)

--

--

+

--

+

20

--

20

Kolonien die GFP negativ sind

Anteil GFP positiver Kolonien unter den gewachsenen Kolonien

Abbildung 32: Progenitor-Assays transduzierter CD34+ Zellen des Tieres 0224,

behandelt mit BG und BCNU

103

Diskussion

5. Diskussion

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, foamyvirale Vektoren als Gentransfersystem

für humane und Marmoset CD34+ Zellen zu etablieren und ihre Effizienz mit anderen

Gentransfersystemen zu vergleichen. Als Transgen wurden dabei GFP und die

MGMT p140k-Mutante genutzt, um zum einen den Gentransfer zu optimieren und

zum anderen Selektionsstrategien der transduzierten CD34+ Zellen mit bestimmten

Chemotherapeutika systematisch zu untersuchen. Darüber hinaus sollte geprüft

werden, ob sich Marmosets als Großtiermodel für präklinische Gentherapiestudien

zur Validierung der Sicherheit und Effizienz foamyviralen Vektoren eignen.

Gammaretroviren sind bereits erfolgreich in klinischen Studien eingesetzt worden,

um therapeutische Gene stabil in CD34+ Stamm- und Progenitorzellen einzubringen.

Von 19 Patienten, die an X-linked-SCID oder ADA-SCID erkrankt waren, konnten 18

mit Hilfe von gammaretroviralen Vektoren phänotypisch geheilt werden

(CAVAZZANA-CALVO et al. 2000; AIUTI et al. 2002; GASPAR et al. 2004). Aus der

Gruppe von 10 Patienten mit SCID, deren CD34+ Zellen mit gammaretroviralen

Transfervektoren transduziert worden waren, entwickelten drei Patienten ein

Malignom (HACEIN-BEY-ABINA et al. 2003b). Bei zwei Patienten ist bekannt, dass

die Malignome auf Integrationen der gammaretroviralen Transfervektoren in die

Nähe des LMO2 Proto-Onkogen Promotors zurückzuführen sind (HACEIN-BEY-

ABINA et al. 2003b). Die Integration des retroviralen Vektors in diesem

Genomabschnitt führt zu einer aberranten Transkription und Expression des LMO2

Gens. Nach d en Vektoren zur Transduktion von

CD34+ Zellen wurden in verschiedenen Tieren wie Mäusen (LI et al. 2002) und Affen

(SEGGEWISS et al.

eitdem bekannt geworden ist, dass die Integration der Vektoren in der

ome

erden die Vor- und Nachteile, die integrierende

ektorsysteme mit sich bringen, sehr frequent und kontrovers diskutiert (DROPULIC

005; FERGUSON et al. 2005). Von Gammaretroviren ist schon seit längerem

em Einsatz von gammaretroviral

2006) ebenfalls das Entstehen von Malignome beobachtet.

S

Nachtbarschaft von Proto-Onkogenen ursächlich für die Entstehung der Malign

in diesen Studien war, w

V

2

104

Diskussion

bekannt, dass sie durch Insertationsmutagenese zur Entstehung von Malignomen

hren können. Gammaretroviren integrieren bevorzugt in zelluläre Promotorregionen

etroviren

tegrieren zweimal häufiger in diese CpG-Inseln als Foamyviren (NOWROUZI et al.

fü

(WU et al. 2003), dagegen integrieren Lentiviren besonders häufig in solche

Regionen, die transkriptionell aktiv sind (SCHRODER et al. 2002). Die, in der

vorliegenden Untersuchung eingesetzten Foamyviren zeigen dagegen keine

Präferenzen, in aktive Bereiche des Genoms zu integrieren (NOWROUZI et al. 2006;

TROBRIDGE et al. 2006). Auch die Aktivität der Gene hat keinen Einfluss auf die

Integrationsstellen von Foamyviren (TROBRIDGE et al. 2006). Die Bereiche des

Genoms, die besonders viel CpG Nukleotide (CpG-Inseln) enthalten, sind häufig vor

Genen lokalisiert und sind an deren Regulation beteiligt. Gammar

in

2006; TROBRIDGE et al. 2006). Das Integrationsprofil des Foamyvirus unterscheidet

sich somit zu einem nicht unwesentlichen Teil von dem Integrationsprofil anderer

Retroviren.

Für die Verwendung foamyviraler Vektoren spricht neben dem Integrationsprofil

dieser Viren auch die Tatsache, dass seit ihrer Entdeckung vor über 50 Jahren

(RUSTIGIAN et al. 1955) keine Erkrankung mit ihnen assoziiert werden konnte.

Diese Beobachtung kann auch als Hinweis dafür genommen werden, dass auch die

Wildtyp Foamyviren keine Insertionsmutagenese auslösen. Menschen, die durch

Affenbisse mit Foamyviren infiziert wurden, haben bis heute keine Erkrankung

aufgrund der Infektion erfahren (SCHWEIZER et al. 1997; CALLAHAN et al. 1999).

5.1 Optimierte Herstellung von Foamyviren, Lentiviren und Gammaretroviren

Toxizität von foamyviralen Hüllproteinen Um überhaupt die Effizienz des Gentransfers von Gammaretroviren und Lentiviren

direkt mit der von Foamyviren vergleichen zu können, ist es notwendig, ein

Hüllprotein zu verwenden, das sowohl foamyvirale Vektoren als auch

gammaretrovirale und lentivirale Vektoren effektiv verpacken kann. Diese

Grundvoraussetzung erlaubt den direkten Vergleich verschiedener Vektorsysteme,

105

Diskussion

weil nun alle drei rekombinanten Retroviren denselben zellulären Rezeptor zum

Eintritt in die Zelle nutzen und die Effizienz (bei gleichen Titern) wesentlich von der

Biologie des Wildtyp Virus abhängt. Dieser Vergleich ist legitim, wenngleich noch

nicht bekannt ist, welche zelluläre Membranstruktur den Foamyviren als Rezeptor

dient. Alle bisher getesteten Zellen von Vögeln, Reptilien und Säugetieren ließen sich

mit Foamyviren infizieren; daher ist zu vermuten, dass der Rezeptor ubiquitär auf

allen Zellmembranen exprimiert wird (RUSSELL et al. 1996; HILL et al. 1999;

MERGIA u. HEINKELEIN 2003).

In früheren Untersuchungen war ein effizienter Gentransfer mit gammaretroviralen

und lentiviralen Konstrukten, die mit foamyviralen Hüllproteinen pseudotypisiert

worden waren, nicht möglich (LEURS 2003). Diese Versuche wurden entweder mit

dem Wildtyp Hüllprotein des HFV durchgeführt, oder es wurden chimäre Hüllproteine

verwendet, die aus Teilen des HFV und des MLV Hüllproteins bestanden

(LINDEMANN et al. 1997; LEURS 2003). Durch Punktmutationen an den

),

ie zur Bildung von Riesenzellen und letztlich zum Absterben der Zellen führt. Diese

elltoxische Eigenschaft ist sowohl in vitro als auch in vivo zu beobachten. Humane

CD34+ Zellen, die zuvor mit Foamyviren transfiziert worden waren, wachsen nach

r

roviralen oder lentiviralen Vektoren

Ubiquitinierungsstellen der leader-Region des Hüllproteins wurde eine effiziente

Pseudotypisierung anderer Viren ermöglicht. Die Pseudotypisierung dieser

Hüllproteine ist bei gammaretroviralen und lentiviralen Vektoren so effektiv, dass der

auf HT1080 Zellen gemessenen Virustiter zum Teil deutlich über dem der

foamyviralen Vektoren lag.

Ein Nachteil foamyviraler Hüllproteine in Bezug auf ihrer Eignung in

Transfervektorsystemen ist ihre sehr starke fusiogene Wirkung (STANKE et al. 2005

d

z

eine Transplantation in NOD/SCID Mäuse schlechter an, als Zellen, die mit VSV-G

oder GaLV pseudotypisierten, gammaret

transduziert worden waren (LEURS et al. 2003). Die toxischen Eigenschaften des

Hüllproteins EM140 zeigten sich besonders bei der Transduktion von CD34+ Zellen

des Marmosets 0130. Hier hat der sehr hohe Virustiter des Konstruktes pCL1 in

Verbindung mit CD/NL-BH die Zellen, die zur Transduktion eingesetzt worden waren,

soweit geschädigt, dass im Progenitor-Assay keine Zellkolonien gewachsen sind. In

106

Diskussion

einer Untersuchung an transduzierten CD34+ Marmoset Zellen, die mit BG und

BCNU behandelt wurden, sind im Progenitor-Assay 50 % weniger Kolonien in den

transduzierten Ansätzen gewachsen, als in einem Ansatz ohne Virus. Eine

Zytotoxizität von 50 % kann insbesondere dann als zu hoch angesehen werden,

wenn man berücksichtig, dass für die Transduktion und die Transplantation oft nur

eine begrenzte Anzahl CD34+ Zellen zur Verfügung stehen.

Als alternatives foamyvirales Hüllprotein stand das SM04 zur Verfügung. Dieses

Hüllprotein stammt vom SFV und auch hier wurden die Ubiquitinierungsstellen in der

rs mit der fusiogenen Wirkung des Hüllproteins korreliert

leader-Region des Hüllproteins so punktmutiert, dass dieses Hüllprotein in der Lage

ist, auch Gammaretroviren und Lentiviren effektiv zu pseudotypisieren. Im Rahmen

dieser Untersuchung wurde die Transduktionseffizienz beider Verpackungsplasmide

verglichen. Die Fähigkeit der Hüllproteine EM140 und SM04 humane CD34+ Zellen

zu transduzieren wurde anhand verschiedener Versuche evaluiert. Das SM04

Hüllprotein übte auf die Produzentenzellen eine deutlich geringere fusiogene

Wirkung aus, als das EM140. Allerdings waren die Virustiter der foamyviralen

Konstrukte, die mit dem Hüllprotein SM04 verpackt wurden, niedriger als die

Virustiter der Viruskonstrukte die mit dem Hüllprotein EM140 verpackt wurden. Aus

diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass die Effektivität der Virusproduktion und

damit die Höhe des Virustite

sind.

Fragen des Vektordesigns Mit dem Ziel, einen möglichst effektiven Vektor etablieren zu können, wurden neben

den Hüllproteinen auch die foamyviralen Vektoren selbst auf zelltoxisch

Eigenschaften untersucht. Es konnte festegestellt werden, dass die Toxizität der

Hüllproteine unabhängig vom eingesetzten foamyviralen Vektor auftrat. Neben dem

Vektor MH71 wurde der foamyvirale Vektor MD9, der keine viralen Gene mehr

enthält, auf seine Eignung für den Gentransfer getestet. Da in diesem Vektor keine

viralen Gene mehr vorhanden sind, wird eine Rekombination des Virus in vivo

erschwert. Die einzelnen Gene, die zur Generierung eines Virus benötigt werden,

107

Diskussion

sind auf mehrere „Helferplasmide“ verteilt; diese müssen für die Virusproduktion der

Produzentenzelle gemeinsam und zeitgleich zur Verfügung gestellt werden.

Die Verteilung einzelner Signale auf unterschiedliche Plasmide führt zu einer

Erhöhung der Sicherheit eines Vektorsystems, sie ist jedoch mit dem Nachteil

behaftet, dass bei der Virusproduktion deutlich geringere Virustiter auf HT1080

Zellen erzielt werden. Der Virustiter des 2-Plasmidsystems MH71 EM140 war

ines Vektors nur Helferplasmide enthalten und somit nicht infektiös sind. Ein

rund, warum die Virustiter der beiden 4-Plasmidsysteme variierten, ist

der Helferplasmide lokalisiert, da sich die Plasmide nur

der vorliegenden Arbeit wurden die Titer durch Zentrifugation der Virusüberstände

deutlich höher, als der Virustiter anderer Konstrukte, die auf einem 3- oder 4-

Plasmidsystem basierten. Auffallend war, dass bei dem 3-Plasmidsystem mit dem

Helferplasmid cmvgp1, das für gag und pol kodiert, auf HT1080 Zellen ein niedrigerer

Virustiter, als bei den 4-Plasmidsystemen, in denen gag und pol auf

unterschiedlichen Plasmiden vorliegen erzielt wurde.

Foamyviren besitzen ein diskontinuierliches Verpackungssignal, das am 5’ Ende des

Genoms im LTR und am Anfang des gag Gens liegt und am 3’ Ende von pol

lokalisiert ist. Die gemeinsame Anwesenheit beider Teile des diskontinuierlichen

Verpackungssignals ist notwendig, damit der Vektor in den Viruspartikel verpackt

werden kann (HEINKELEIN et al. 1998). Prinzipiell besteht die Möglichkeit, dass ein

Helferplasmid, welches wie der hier verwendete Vektor, beide Teile des

diskontinuierlichen Verpackungssignals besitzt, also gag und pol enthält, mit dem

Vektor um die Virushülle konkurriert. In diesem Fall können Partikel entstehen, die

statt e

G

wahrscheinlich im Backbone

dort unterscheiden. Es ist beschrieben, dass Plasmide mit einem SV40ori bei der

Anwesenheit des SV40 large-T-Antigens in der Zelle zu einer vermehrten Ablesung

des Vektors führen (PEAR et al. 1993; SONEOKA et al. 1995). Da aber im Backbone

beider Vektoren ein SV40ori ist, kann dieses nicht der alleinige Grund für die

unterschiedlichen Virustiter sein.

Konzentration des viralen Überstandes Die Höhe des Virustiters hat einen großen Einfluss auf die Transduktionseffizienz. In

108

Diskussion

gesteigert. Eine Volumeneinengung des Virusüberstandes wurde mehrfach

beschrieben (BURNS et al. 1993; YANG et al. 2002; LEURS 2003). Rekombinante

t wurden, mittels Zentrifugation

(LEURS 2003). Letztendlich wird nach dem

entrifugieren auch das „verbrauchte“ Medium der Produzentenzellen gegen frisches

mal auf die Bedürfnisse der Zielzellen

Viren, die mit Hüllproteinen wie dem VSV-G pseudotypisiert sind, können durch

Ultrazentrifugation konzentriert werden (BURNS et al. 1993). Bei Viren, deren

Virushülle nicht so stabil wie VSV-G ist, wurde eine erfolgreiche Zentrifugation mit

Geschwindigkeiten zwischen 10.000 und 20.000 x g erreicht (YANG et al. 2002;

LEURS 2003). Foamyvirale Hüllproteine sind sehr stabil und können mittels

Ultrazentrifugation konzentriert werden, sie lassen sich aber auch mit

Geschwindigkeiten zwischen 10.000 und 20.000 x g konzentrieren (LEURS 2003). In

der vorliegenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass auch Retroviren, die

mit dem Hüllprotein EM140 oder dem SM04 verpack

erfolgreich konzentriert werden können. Bisher ist nicht untersucht, ob die

Viruspartikel miteinander eine Verbindung eingehen und sich so bei niedrigen

Drehgeschwindigkeiten sedimentieren lassen. Grundsätzlich werden zwei

Hypothesen diskutiert, warum es durch Zentrifugation zu einer Titererhöhung

kommen kann. Zum einen kann es durch die Einengung des Volumens, indem sich

die Viruspartikel befinden zu einer Konzentrationserhöhung kommen. Zum anderen

wird vermutet, dass Pseudopartikel sehr leicht sind und deshalb nicht sedimentiert

werden; so kommt es zu einer „Aufreinigung“ der Viren. Da die Pseudopartikel nach

ihrer Entfernung nicht mehr die Rezeptoren der Zielzellen blockieren können, erhöht

sich die Wahrscheinlichkeit, dass die Viruspartikel die Zellen transduzieren; in der

Folge steigt der Virustiter an. Auch die Entfernung des Natriumbutyrat, dass zur

Induktion des CMV-Promotors der Plasmide in den Produzentenzellen genutzt wurde,

ist ein Vorteil, der mit der Zentrifugation einhergeht (RADSAK et al. 1989; TANAKA

et al. 1991). Natriumbutyrat ist für die Zellen toxisch und es ist mit einem Verlust von

Zielzellen und einem geringeren Virustiter zu rechnen, wenn es nicht aus dem

Virusüberstand entfernt wird

Z

Medium ersetzt; dieses kann dann opti

abgestimmt werden.

109

Diskussion

Manipulation der Zielzellen auf CH296 Fibronektin ist bereits zur Transduktion von hämatopoetischen Zellen etabliert und

bietet ähnliche Vorteile im Rahmen der Transduktion von hämatopoetischen

Stammzellen (HANENBERG et al. 1997). Die Transduktionseffizienz von Retroviren,

die mit VSV-G pseudotypisiert worden waren, konnte gesteigert werden, indem die

Transduktion auf CH296 beschichteten Platten durchgeführt wurde (DONAHUE et al.

2001; RELANDER et al. 2001). Die Zellen haften sich an die zwei Zellbindedomänen

CBD und CS1 des Fibronektins an, wodurch die Zellen auf dem CH296

beschichteten Untergrund einzeln liegen. Systematische Untersuchungen zur

Bindung von Viruspartikelen wurden nur mit dem amphotropen Hüllprotein und GaLV

durchgeführt. Hier konnte die direkte Bindung von Hüllproteinen des GaLV und des

amphotropen Hüllproteins an die Heparinbindedomäne gezeigt werden

(HANENBERG et al. 1996). Untersuchungen zu Anheftung foamyviraler Hüllproteine

oder auch VSV-G pseudotypisierter Vektoren an CH296 sind bisher nicht

beschrieben.

Um einen Einfluss des Vektortyps auf die Anheftung an das Fibronektin ausschließen

zu können, wurden rekombinante Lentiviren mit den Hüllproteinen GaLV, VSV-G und

EM140 preudotypisiert. Die Transduktionseffizienz war bei Konstrukten, die mit GaLV

oder EM140 pseudotypisiert waren, auf Platten mit CH296 Fragment deutlich höher

als auf Platten, die mit BSA beschichtet waren oder auf TCDs. Dieser Effekt war bei

dem VSV-G Hüllprotein nicht zu erkennen und steht im Widerspruch zu früheren

Untersuchungen, in denen die Transduktionseffizienz durch eine Beschichtung der

Platten mit CH296 gesteigert werden konnte (DONAHUE et al. 2001; RELANDER et

al. 2001). In diesen Arbeiten wurden humane CD34+ Zellen transduziert, während in

der vorliegenden Untersuchung HL60 Zellen verwendet wurden. Dieser Unterschied

könnte eine Erklärung für die Diskrepanz der Untersuchungsergebnisse sein.

Darüber hinaus sind in allen angeführten Untersuchungen unterschiedliche Vektoren

mit VSV-G pseudotypisiert worden und es ist nicht bekannt, inwieweit der Vektor die

Bindung des Viruspartikels beeinflussen kann.

Nachdem der jeweilige Virusüberstand entfernt worden war und die Platten mehrfach

it Medium gewaschen worden sind, waren immer noch so viele Viren an CH296 m

110

Diskussion

gebunden, dass eine Transfektion von Zellen möglich war. In der mit BSA

sfer in humane CD34 Zellen aus Nabelschnurblut

kt MH71. Tragen beide Konstrukte

beschichteten Kontrolle blieben keine Viren haften und es konnten auch keine Zellen

transduziert werden, die nach Entfernung des Virusüberstandes und Waschen der

Platte mit Medium aufgegeben wurden. Wenn CH296 mehrfach mit Virusüberstand

beschichtet wurde (Vorladen), dieser anschließend wieder entfernt und die Platte

gewaschen wurde, konnte eine deutliche Steigerung der Transduktionsrate

gegenüber der einmaligen Beladung mit Virusüberstand beobachtet werden. Dieser

Versuch zeigt, dass sowohl das VSV-G Hüllprotein wie auch das foamyvirale EM140

an Fibronektin binden können. Zusätzlich ist eine Erhöhung der

Transduktionseffizienz bei dem foamyviralen Hüllprotein alleine durch die

Beschichtung der Platten mit Fibronektin möglich.

5.2 Gentran +

In der eigenen Arbeit konnte gezeigt werden, dass foamyvirale Vektoren trotz ihrer

geringen Virustiter auf HT1080 Zellen CD34+ Zellen effizienter als lenti- und

gammaretrovirale Vektoren transduzieren können. Lentivirale Vektoren, die mit VSV-

G pseudotypisiert worden waren, erreichten auf HT1080 Zellen einen höheren

Virustiter als das foamyvirale Konstrukt. Dennoch war die Gentransferrate der

foamyviralen Konstrukte in humane CD34+ Zellen höher als die Rate der lentiviralen

Konstrukte. Untersuchungen mit den foamyviralen Vektoren MH71, MH71.MGMT,

MD9 und MD9.MGMT haben gezeigt, das die Konstrukte mit dem

Chemotherapeutikumresistenzgen MGMT auf den humanen hämatopoetischen

Stammzellen immer niedrigere Gentransferraten erzielten als die Konstrukte, die nur

GFP als Transgen trugen. Die auf HT1080 gemessenen Virustiter lassen jedoch bei

Foamyviren keine präzise Aussage über die Effizienz der Vektoren bei der

Transduktion von CD34+ Zellen zu. Das Viruskonstrukt MD9 zeigte wiederholt

schlechtere Gentransferraten als das Konstru

zusätzlich zum Transgen GFP das Transgen MGMTp140k, so nimmt die

Transduktionseffizienz, gemessen als Anteil GFP positiver Zellen, weiter ab, auch

111

Diskussion

wenn der Virustiter im Einzelfall über dem der Konstrukte ohne MGMTp140k lag. Auf

mögliche Faktoren (IRES-site), die für dieses Problem verantwortlich sein könnten,

wird an späterer Stelle detailliert eingegangen.

An humanen CD34+ Zellen wurden zwei foamyvirale Hüllproteine getestet. Die mit

dem Hüllprotein SM04 verpackten Konstrukte erzielten grundsätzlich auf HT1080

Zellen einen niedrigeren Virustiter, als die mit dem Hüllprotein EM140 verpackten

Konstrukte. Entsprechend wurde in der FACS-Analyse an Tag 5 nach der

Transduktion bei Konstrukten mit SM04 eine deutlich niedrigere Gentransferrate

gemessen als bei Konstrukten mit EM140. Überraschend war, dass in den

Progenitor-Assays die Gentransferrate der mit dem SM04 verpackten Konstrukte nur

napp unterhalb der mit dem EM140 verpackten Konstrukte lag.

iese Ergebnisse können dahingehend interpretiert werden, dass die beiden

foamyviralen Verpackungsplasmide einen Einfluss auf die Geschwindigkeit haben, in

d n werden kann.

k

D

der as foamyvirale Genom in das Genom der Zielzelle integriere

Welche zellulären Rezeptoren die Hüllproteine zum Eintritt in die Zelle nutzen, und

ob beide Hüllproteine den gleichen Rezeptor nutzen, ist noch unbekannt. Es wäre

möglich, dass die Hüllproteine unterschiedlich schnell mit der Zellmembran der

Zielzelle fusionieren und so das Kapsid zeitlich versetzt in das Zytoplasma gelangt.

Das würde bedeuten, dass das Hüllprotein SM04 das virale Kapsid erst später als

das EM140 freigesetzt wird und dadurch die Transduktionsrate erst nach 14 Tagen

der des EM140 entspricht. Gegen diese Vermutung spricht allerdings, dass, wenn

SM04 den Einbau des viralen Genoms stark verzögert, es Kolonien geben müsste,

bei denen nur ein Teil der Zellen GFP positiv und ein Teil der Zellen GFP negativ ist.

Diese Beobachtung konnte nicht gemacht werden. Daher kann nicht von einem

unterschiedlichen Integrationszeitpunkt des viralen Genoms in das Genom der

Zielzelle ausgegangen werden. Die Ursachen für die unterschiedliche Genexpression

bleiben demnach unklar.

112

Diskussion

5.3 Gentransfer in CD34+ Marmoset Zellen

In der eigenen Arbeit konnte gezeigt werden, dass CD34+ Marmoset Zellen sich, wie

ndere Säugerzellen auch, gut mit Foamy-, Lenti- und Gammaretroviren infizieren

rneut, so lässt sich

Messung 5 Tage nach der Transduktion erzielt werden

önnen.

Es ist bekannt, dass Foamyviren nicht wie Lentiviren aktiv die Kernporen überwinden

können. Sie sind auf den Vorgang der Mitose und die damit verbundene Auflösung

a

lassen. Auch wenn der Virustiter des foamyviralen Konstrukts MH71 auf HT1080

Zellen meist unter denen der lenti- und gammaretroviralen Vektoren, die mit dem

gleichen Hüllprotein pseudotypisiert waren, lagen, entsprach die Gentransferrate, die

5 Tage nach der Transduktion ermittelt wurde, dem Niveau der anderen Viren. In

einem Versuch konnte im Vergleich mit der Gentransferrate des Konstrukts pCL1,

pseudotypisiert mit EM140, das sonst in allen Untersuchungen den höchsten

Virustiter aufwies, sogar eine geringfügig höhere Transferrate gezeigt werden.

Bestimmt man die Gentransferrate 9 Tage nach Transduktion e

feststellen, dass die Gentransferrate des foamyviralen Konstrukts gegenüber dem an

Tag 5 gemessenen Wert leicht ansteigt. Die Gentransferraten der lentiviralen und

gammaretroviralen Konstrukte waren dagegen an Tag 9 nach der Transduktion

niedriger als an Tag 5. Die Gentranferrate des mit EM140 pseudotypisierten

lentiviralen Konstrukts zeigte nur eine geringe Abnahme, stattdessen konnt jedoch

bei dem mit VSV-G pseudotypisierten lentiviralen Konstrukt eine Abnahme von 66 %

und bei dem gammaretroviralen Konstrukt eine Abnahme um 37 % gegenüber der

Messung an Tag 5 nach Transduktion bestimmt werden.

Betrachtet man die Gentransferraten 14 Tage nach der Transduktion im Progenitor-

Assay, so ist deutlich zu erkennen, dass die Gentransferrate des foamyviralen

Konstrukts über die Zeit gleich bleibt oder sogar leicht ansteigt, während die

Gentransferraten der anderen Konstrukte deutlich abfallen (Abbildung 24). Vergleicht

man diese Daten mit denen der Progenitor-Assays humaner Zellen (Abbildung 16),

so ist weiterhin zu erkennen, dass bei der Verwendung foamyviraler Konstrukte im

Progenitor-Assay deutlich höhere Gentransferraten als in der

durchflusszytometrischen

k

113

Diskussion

der Kernmembran angewiesen, um ihr eigenes Genom in das Genom der Wirtszelle

tegrieren zu können (BIENIASZ et al. 1995; PATTON et al. 2004; TROBRIDGE et

gestellt, dass das Konstrukt

kann (CARNEIRO et al. 2006). Andere Untersucher vermuten, dass

hosphatidylserin VSV-G nicht als Rezeptor dient (COIL u. MILLER 2004). Wenn

in

al. 2004). Trotzdem sind Foamyviren in der Lage, auch effizient solche Zellen zu

infizieren, die sich selten teilen (TROBRIDGE et al. 2004).

Die längere Persistenz des Präintegrationskomplexes in infizierten Zellen ist

wahrscheinlich durch die Besonderheit der Foamyviren bedingt, dass sie die reverse

Transkription bereits in der Virus produzierenden Zelle abgeschlossen haben. Der

Viruspartikel enthält deshalb doppelsträngige DNA, die deutlich stabiler ist als RNA.

Man nimmt an, dass der foamyvirale Präintegrationskomplex bis zur Zellteilung im

Zytoplasma der Zelle stabil bleibt und dann im Moment der Zellteilung zum

Kernzentrum gelangt und dort in die DNA der Zelle integriert. Diese Art der

Replikation könnte ebenfalls eine Erklärung dafür sein, dass die Gentransferraten

foamyviraler Vektoren sowohl bei humanen als auch bei den von Marmosets

stammenden CD34+ Zellen mit der Zeit ansteigen. Da die Differenz der

Gentransferraten der FACS-Analyse, verglichen mit den Gentransferraten der

Progenitor-Assays, bei den humanen CD34+ größer ist als bei den Marmoset Zellen,

kann vermutet werden, dass die Teilungsrate der Marmoset Zellen höher ist als die

der humanen CD34+ Zellen.

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde fest

pCL1 pseudotypisiert mit dem VSV-G Hüllprotein in den CD34+ Marmoset Zellen,

verglichen mit den humanen CD34+ Zellen deutlich schlechtere Gentransferraten

erzielt. Einige Untersucher gehen davon aus, dass der zelluläre Rezeptor für das

VSV-G das Phosphatidylserin, ein Lipid der Zellmembran, die Bindung von VSV-G

an die Zellmembran vermittelt (SCHLEGEL et al. 1983a; SCHLEGEL u. WADE

1983b). Dieses Phosphatidylserin ist in allen Zellmembranen vorhanden, jedoch ist

die Zusammensetzung der Zellmembranen mit Phospholipiden nicht bei allen

Lebewesen gleich, sodass es zu unterschiedlich starken Bindung von VSV-G

kommen

P

Phosphatidylserin nicht der Rezeptor wäre, bestünde dennoch die Möglichkeit, dass

114

Diskussion

die Marmoset Zellen deutlich weniger von dem noch unbekannten Rezeptor für VSV-

G auf ihrer Zelloberfläche exprimieren als die humanen Zellen und deshalb

schlechter transduziert werden können. Eine unterschiedlich starke Bindung des

VSV-G an humane und Marmoset Zellen aufgrund einer unterschiedlichen

t wird. Die Nukleinsäure, die nicht in das Wirtsgenom

tegrieren konnte wird im Zytoplasma abgebaut.

Zusammensetzung der Zellmembranen mit Phospholipiden ist ebenfall ein mögliche

Erklärung für die ungleichen Gentransferraten.

Am Tag 5 nach der Transduktion sind bis zu 25 % der CD34+ Marmoset Zellen, die

mit dem mit VSV-G pseudotypisierten lentiviralen Konstrukt transduziert wurden, in

der FACS-Analyse GFP positiv. Dagegen sind 14 Tage nach der Transduktion im

Progenitor-Assay nur noch maximal 0,7 % der Kolonien GFP positiv. Diese

Diskrepanz lässt die Vermutung zu, dass ein Pseudogentransfer stattgefunden hat.

Ein Pseudogentransfer liegt vor, wenn Pseudopartikel, das sind Partikel die nur GFP

enthalten, in das Zytoplasma der Zielzelle gelangen. Das GFP im Zytoplasma der

Zelle wird im Laufe der Zeit wieder abgebaut und die Zelle wird wieder GFP negativ.

Daneben wäre auch ein Nukleinsäuretransfer denkbar, bei dem wohl eine Infektion

der Zelle, aber keine Integration in das Wirtsgenom stattgefunden hat. Die RNA

würde translatiert und im Anschluss GFP gebildet, das dann im Zytoplasma der Zelle

mit der Zeit wieder abgebau

in

5.4 MGMTp140k als Transgen

Bei Erkrankungen wie X-linked-SCID oder der chronischen Granulomatose bietet das

Transgen den genkorrigierte Zellen einen selektiven Wachstumsvorteil, so das es

durch die steigende Zahl an genkorrigierten Zellen zu einer phänotypischen Heilung

der Grunderkrankung kommt (CAVAZZANA-CALVO et al. 2000; PFEIFER et al.

2001; AIUTI et al. 2002). Jedoch bieten nicht alle therapeutischen Transgene, die in

Zukunft gentherapeutisch eingesetzt werden könnten, den Zellen einen solchen

Selektionsvorteil. Mittels Vektoren, die zwei Transgene gleichzeitig exprimieren

können, ist es möglich, ein therapeutisches Transgen und ein Resistenzgen, die über

115

Diskussion

eine IRES-site miteinander verbunden sind, in eine Zelle einzubringen. Ein

besonders aussichtsreiches Resistenzgen ist das MGMTp140k, welches DNA

Schäden, die durch alkylierende Substanzen wie BCNU hervorgerufen werden,

reparieren kann und so zu einer erhöhten Resistenz gegenüber bestimmten

Chemotherapeutika führt (QUINN 2001). Das MGMTp140k ist in mehreren

Gentherapiestudien an Mäusen (KREKLAU et al. 2003; CAI et al. 2006) und Hunden

wahrscheinlich die Lage des GFP

ens verantwortlich. Das GFP Gen liegt am 3’ Ende des Leserahmens und liegt

omit hinter der IRES-site. Es ist bekannt, dass Gene, die hinter der IRES-site liegen,

meist ineffizienter abgelesen werden. Im Progenitor-Assay der humanen CD34+

hiede auf und die Transduktionseffizienz der

(NEFF et al. 2005) schon erfolgreich zur Selektion der transgenen Zellen eingesetzt

worden. Um auch den mit foamyviralen Vektoren transduzierten Zellen einen

Selektionsvorteil zu verschaffen, wurde das MGMTp140k in foamyvirale Vektoren

kloniert und in diesem Vektor eingehend getestet. Dieses Selektionsprinzip wurde

auch in CD34+ Marmoset Zellen getestet, um später einmal Marmsets als

Gentransfermodel nutzen zu können.

Die Virustiter der foamyviralen Vektoren, die das Transgen MGMT tragen, waren

geringfügig niedriger, als die von Konstrukten ohne dieses zusätzliche Transgen. Die

Transduktionseffizienz in den Versuchen mit humanen CD34+ Zellen, gemessen

mittels FACS-Analyse, war bei Konstrukten mit MGMTp140k immer niedriger, als die

Transduktionseffizienz der Viruskonstrukte ohne MGMTp140k. Für die niedrigeren

Virustiter auf HT1080 Zellen und die schlechten Gentransferraten der MGMTp140k

tragenden Konstrukte in der FACS-Analyse ist

G

s

Zellen heben sich die Untersc

Konstrukte mit und ohne MGMTp140k liegen auf einem Niveau. Auch wenn das Gen

am 3’ Ende des Leserahmens schlechter abgelesen wird, so akkumuliert das

Genprodukt, in dem Fall das GFP, in der Zelle und kann dann nachgewiesen werden.

Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass der Gentransfer der Konstrukte, die das

zusätzliche Transgen MGMTp140k enthalten, nicht schlechter ist, als die

Gentransferrate der Konstrukte ohne das zusätzliche Transgen, sondern es nur

keine Möglichkeit gibt das Genprodukt nachzuweisen. Es bestünde die Möglichkeit

das MGMT Protein anzufärben, doch da dieses intrazellulär vorliegt, ist eine Färbung

116

Diskussion

mit einigen Einschränkungen verbunden. Zurzeit sind nur MGMT Antikörper

kommerziell erhältlich, die nicht an ein Fluorochrom gekoppelt sind. Aus diesem

Grund müsste der MGMT-Antikörper mit einem fluorochromkonjugierten Antikörper

gekoppelt werden. Diese Zweitantikörper zeichnen sich jedoch sehr häufig durch

eine geringe Spezifität aus und führen unter Umständen zu falsch positivern

Ergebnissen.

Bei den transduzierten hämatopoetischen Zelllinien liegt die Gentransferrate der

MGMTp140k Konstrukte niedriger, als die Zellen mit nur einem Transgen. Kultiviert

man diese Zellen über einen längeren Zeitraum, so kann man deutlich erkennen,

dass die Anzahl GFP positiver Zellen bei beiden MGMTp140k tragenden Konstrukten

mit der Zeit abnimmt. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung könnte ein

Abschalten des Transgens durch zelluläre Mechanismen sein. Gegen diese

Annahme spricht jedoch, dass die zwei Kontrollkonstrukte, die nur das Transgen

GFP über den gleichen Promotor exprimieren, über die Zeit hinweg ein gleich

bleibendes Expressionsniveau zeigen. Dies lässt vermuten, dass das MGMT-Protein

in Konzentration, die oberhalb des natürlichen Expessionsniveaus liegen, für die

Zelle toxisch ist. Aus verschiedenen Untersuchungen ist bekannt, dass eine

Überexpression von Resistenzgenen für Chemotherapeutika toxische Effekte haben

kann. So wurde z.B. bei der Überexpression der Methylpuringlykosylase, die

alkylierte Basen in der DNA abbaut, auch eine zelltoxische Wirkung festgestellt

(KAINA et al. 1993). Durch die toxische Wirkung des überexprimierten Genprodukts

kommt es zum Absterben der transgenen Zellen und dadurch zu einer negativen

Selektion.

Behandelt man Zellen, die das Transgen MGMTp140k tragen und transduzierte

Zellen, die nur GFP tragen, mit BCNU, dann überleben mehr Zellen mit MGMTp140k

die Behandlung als solche ohne das Transgen. War der Anteil GFP positiver Zellen

an der Gesamtpopulation der MGMTp140k tragenden Konstrukte vor der BCNU

Behandlung niedrig (< 5%), so konnte der Anteil durch die Behandlung deutlich

gesteigert werden (> 50%). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das MGMTp140k

im foamyviralen Kontext in der Lage ist, den Zellen eine Resistenz gegenüber

117

Diskussion

alkylierenden Substanzen wie BCNU zu vermitteln. Durch eine zusätzliche

Behandlung mit BG, welches das endogene MGMT irreversibel blockiert, konnte der

Selektionsdruck auf die Zellen noch zusätzlich erhöht werden und die Zellen mit dem

Transgen MGMTp140k konnten noch besser selektioniert werden.

Doch nicht alle überlebende Zellen waren nach der Behandlungen mit hohen BCNU

Konzentrationen oder der Kombination von BCNU und BG auch GFP positiv. Es gibt

wei Möglichkeiten, warum ein Teil der überlebenden Zellen GFP negativ ist. Zum

ative Möglichkeit zwei einzelne Proteine über eine Expressionskassette zu

z

einen könnte das endogene MGMT in der Zelle durch die Behandlung hochreguliert

worden sein, so dass auch Zellen ohne Transgen die chemotherapeutische

Behandlung überleben konnten. Dass das endogene MGMT hochreguliert wird, ist

nur über einen längeren Behandlungszeitraum zu erwarten und die

Behandlungsintervalle, die in dieser Untersuchung angesetzt worden sind, sind für

eine solche Hochregulationen nicht lang genug. Deswegen ist es wahrscheinlicher,

dass es Zellen gibt, die zwar eine Genkassette und damit auch das MGMTp140k

tragen, jedoch das GFP Gen nicht oder nicht in einem Maße exprimieren, dass es

mittels Durchflusszytometer nachgewiesen werden kann. Dieses Problem ist

wahrscheinlich durch die IRES-site bedingt, die zwischen dem MGMT Gen und dem

GFP liegt. Sie sorgt eigentlich dafür, dass beide Gene hintereinander translatiert

werden (JANG u. WIMMER 1990). Es ist jedoch bekannt, das 3’-liegende

Leserahmen, in diesem Fall das GFP, meist ineffizienter abgelesen wird. Diese

Tatsache würde auch die niedrigeren Titer auf HT1080 Zellen der MGMTp140k

tragenden Konstrukte und die damit verbundenen niedrigeren Gentransferraten auf

primären Zellen (5 Tage nach Transduktion) ausreichend erklären.

Eine altern

exprimieren bietet das 2A-Oligopeptid des Maul- und Klauenseuchevirus (RYAN et al.

1991; DE FELIPE et al. 2006). Es ist nur 19 Aminosäuren lang und verursacht bei

der Elongation des Proteins am Ribosom eine Unterbrechung der Elongation nach

dem 2A-Oligopetpid, wodurch die schon translatierte Peptidsequenz zusammen mit

dem 2A-Oligopeptid freigesetzt wird und so von dem noch zu translatierenden

zweiten Peptid getrennt wird. Auf diese Art lassen sich bis zu drei Proteine getrennt

von zwei 2A-Oligopeptiden stromabwärts eines Promotors exprimieren.

118

Diskussion

5.5 Schlussfolgerung

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich von Foamyviren abgeleitete Vektoren

ausgezeichnet zur Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen eignen. Sowohl

humane als auch hämatopoetische Stammzellen von Marmosets lassen sich effektiv

transduzieren und die Resultate sind miteinander vergleichbar. Die Gentransferraten

der foamyviralen Vektoren liegen in dieser Untersuchung über den bisher zur

Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen eingesetzten lenti- und

gammaretroviralen Vektorsystemen. Foamyviralen Konstrukte lassen sich auch zur

Expression von mehreren Transgenen einsetzen, wobei bezüglich des Mechanismus

der Koexpression noch weiterer Optimierungsbedarf besteht.

So stellt dieses Vektorsystem eine echte Alternative zu den bisher in

Gentherapiestudien verwendeten lenti- und gammaretroviralen Vektoren da. Es kann

empfohlen werden, Marmosets als Primatenmodell zur Erprobung der Effektivität und

Sicherheit von Foamyviralen Vektorsystemen einzusetzen.

119

Zusammenfassung

6 . Zusammenfassung

Melanie Wurm

„Transduktion hämatopoetischer Stammzellen von Neuweltaffen mit Foamyviren“

Die Transplantation von genetisch korrigierten, CD34+ autologen hämatopoetischen

Stammzellen hat 18 von insgesamt 19 Patienten mit schwerem kombiniertem

Immundefekt (SCID) von ihrer, ansonsten im ersten Lebensjahr tödlich verlaufenden,

hereditären Erkrankung geheilt. Dieser klinische Einsatz von replikationsdefekten

gammaretroviralen Vektoren als Gentransfersystem hat allerdings einige Jahre nach

der Gentherapie bei drei der Kinder zur Entstehung von T-Zell-Malignoms geführt.

Bei zwei Patienten konnte gezeigt werden, dass diese Malignome durch die bei

Wildtyp-Gammaretroviren bekannte Insertionsmutagenese mit Aktivierung von

zellulären Onkogenen induziert worden sind. Aufgrund dieser inzwischen in

verschiedenen Tiermodellen ebenfalls nachgewiesenen „Nebenwirkung“ von

gammaretroviralen Vektoren ist es äußerst wichtig, alternative Vektorsysteme zu

entwickeln, die nicht nur Stammzellen effektiv transduzieren können, sondern auch

ein hohes Maß an Sicherheit bieten. Diese neuen Vektorsysteme müssen vor einem

Einsatz beim Menschen in Großtiermodellen sicherheits- und effizienzgetestet

werden. Foamyviren als komplexe Retroviren könnten ein derartiges alternatives

Gentransfersystem sein, da sie als einzige Mitglieder der Retroviridae auch bei

chronisch-persistierender Infektion mit keinerlei Pathogenität bei Tieren oder auch

Menschen assoziiert werden konnten.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren optimiert, bei dem autologe CD34+

klonogene Zellen der Primatenspecies common marmosets (Callitrix jacchus) in vitro

genetisch verändert werden, um sie dann anschließend nach milder Myeloreduktion

den Tieren zurückzugeben. Initial wurden dabei verschiedene Parameter wie Einsatz

von Molekülen der extrazellulären Matrix, von verschiedenen foamyviralen

Hüllproteinen und Transfektionsprotokollen hinsichtlich des Einflusses auf den

120

Zusammenfassung

Virustiter und die Gentransfereffizienz mit GFP exprimierenden foamy-, lenti- und

ammaretroviralen Vektoren getestet. Um die nach Reinfusion der Zellen in die Tiere

niedrige Gentransfereffienz in repopulierende Stammzellen

usgleichen zu können, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein in vivo Selektionssytem,

NA-Methyltransferase (MGMTp140k) als Transgen in foamyviralen

ektoren und dem Chemotherapeutikum 1,3-bis-(2-chloroethyl)-1-Nitrosourea

n die Grundlagen für den Einsatz von

g

zu erwartende

a

bestehend aus der P140K Punktmutante des Chemotherapeutikumresistenzgen O6-

Methylguanin-D

V

(BCNU), an humanen hämatopoetischen Zelllinien und an CD34+ Zellen von

common Marmosets getestet.

Die Resultate zeigten, dass foamyvirale Vektoren in einem kurzen

Transduktionsprotokoll für 16 Stunden auf dem rekombinanten Fibronektinfragment

CH-296 und ohne Vorstimulation der Zielzellen mehr als 60% der humanen CD34+

Nabelschnurblutzellen und mehr als 80% der CD34+ Marmosetzellen genetisch

verändern können. Diese hohe Gentransfereffizienz lag deutlich über der von

gammaretroviralen Vektoren und war vergleichbar mit der von lentiviralen Vektoren,

wenn letztere mit dem gleichen foamyviralen Hüllprotein pseudotypisiert wurden.

Dagegen war das G-Protein des Vesicular Stomatitis Virus (VSV-G) als Hüllprotein

nicht geeignet, Marmoset CD34+ Zellen mit Lentiviren effektiv zu transduzieren. Mit

MGMTp140k als Transgen in zwei verschiedenen foamyviralen Vektoren war essehr

gut möglich, hämatopoetische Zellen von Menschen und Marmosets in vitro mit

BCNU zu selektionieren, so dass der Anteil von genetisch veränderten Zellen über

die Zeit deutlich erhöht werden konnte.

Mit diesen Untersuchungen konnte

foamyviralen Vektoren als effiziente Gentransfersysteme für die Transduktion von

humanen und Marmoset CD34+ Zellen etabliert werden, so dass zur Zeit die

Anwendung von foamyviralen Vektoren in Marmosets ausgetestet wird. Bei guter

Verträglichkeit und effizienter Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen der

Tiere wäre dann der Einsatz in klinischen Phase I-Studie beim Menschen zur

Korrektur genetischer Erkrankungen möglich.

121

Summary

7. Summary

Melanie Wurm

‘Transduction of hematopoietic stem cells from new world monkeys with Foamyviruses’

Transplantation of genetically corrected CD34+ autologous hematopoietic stem cells

has cured 18 out of 19 patients with severe combined immune deficiency (SCID), a

ereditary disorder to which patients generally succumb in their first year of life. This

the present thesis, procedures were optimized to genetically modify autologous

d repopulating stem cells, the second

h

clinical application of replication defective gammaretroviral vectors however induced

T cell malignancies in three children within a few years after gene therapy. For two

patients, it was shown that these malignancies occurred due to insertional

mutagenesis, well known for wild-type gammaretroviruses, leading to activation of

cellular proto-oncogenes. Due to the recent findings that this ‘side effect’ of

gammaretroviral vectors also occurred in animal models, it becomes mandatory to

develop alternative vector systems that are characterized not only by their capability

to transduce stem cells, but also by their high degree of safety. Prior to any clinical

application, these novel vector systems have to be evaluated for safety and efficacy

in a large animal model. Foamyviruses as complex retroviruses might be this

candidate vector system as they are the only members of the Retroviridae that

despite chronic persistent infections are non-pathogenic in animals and also humans.

In

CD34+ cells from common marmosets (Callitrix jacchus) with the ultimate aim to re-

infuse these cells to animals undergoing a mild myeloreductive treatment. Initially,

the influence of different parameters like molecules of the extracellular matrix,

different foamyviral envelopes and several transfection protocols on virus titers and

gene transfer efficiencies was analyzed using GFP expressing foamy-, lenti- and

gammaretroviral vectors. Considering the low transduction rates in animals that can

be expected after reinfusion of the transduce

122

Summary

part of the thesis evaluates an +

in vivo selection system in hematopoeitic cell lines and

armoset CD34 cells. This selection system is based on the P140K point mutant of

guanin-DNA-methyltranferase chemotherapy resistant gene as

ansgene in foamyviral vectors in combination with the chemotherapeutic substance

he results demonstrated high efficacy of foamyviral vectors, processed in only 16

m

the O6-methyl

tr

1,3-bis-(2-chlorethyl)-1-Nitrosourea (BCNU).

T

hours on recombinant fibronectin fragment CH296 coated plates. Genetic

modification was observed in 60 % of human and 80 % of marmoset CD34+ cells,

although cells were not stimulated previously. The gene transfection rate was

obviously higher in foamyviruses than in gammaretroviruses; it was equal to the

results from lentiviruses if these were pseudo typed by a foamyviral envelope.

Contrary, the G-protein derived from the vesicular stomatitis virus (VSV-G) was

insufficient when it was used as an envelope. An increase of a low transfection rate

can be triggered by in vitro selection of hematopoietic cells from humans and

marmosets, respectively. This was traced back to the foamyviral vectors that contain

MGMTp140k and the additional treatment of cells with BCNU.

In this study, foamyviral vectors were well evaluated to be very sufficient in gene

transfer into human and marmoset CD34+ cells. Further applications of gene transfer

into marmosets by foamyviral vectors should be tested. Phase I trials that aim at

gene therapy will be sensible, if the transduction of hematopoietic stem cells is

approved to be safe and efficient.

123

Literaturverzeichnis

8. Literaturverzeichnis

ABONOUR, R., D. A. WILLIAMS, L. EINHORN K. M. HALL, J. CHEN, J. COFFMAN,

C. M. TRAYCOFF, A. BANK, I. KATO, M. WARD, S. D. WILLIAMS, R.

HROMAS, M. J. ROBERTSON, F. O

,

. SMITH, D. WOO, B. MILLS, E. F.

SROUR u. K. CORNETTA (2000):

Efficient retrovirus-mediated transfer of the multidrug resistance 1 gene into

autologous human long-term repopulating hematopoietic stem cells.

Nat. Med. 6, 652-658

ACHONG, B. G., P. W. MANSELL, M. A. EPSTEIN u. P. CLIFFORD (1971):

An unusual virus in cultures from a human nasopharyngeal carcinoma.

J. Natl. Cancer Inst. 46, 299-307

AIUTI, A., S. SLAVIN, M. AKER, F. FICARA, S. DEOLA, A. MORTELLARO, S.

MORECKI, G. ANDOLFI, A. TABUCCHI, F. CARLUCCI, E. MARINELLO, F.

CATTANEO, S. VAI, P. SERVIDA, R. MINIERO, M. G. RONCAROLO u. C.

BORDIGNON (2002):

Correction of ADA-SCID by stem cell gene therapy combined with

nonmyeloablative conditioning.

Science 296, 2410-2413

ASGT (2003):

Report from the ASGT Ad Hoc Committee on Retroviral-mediated Gene

Transfer into Hematopoietic Stem cells, April 2003.

www.asgt.org; Abrufdatum: 02.06.2006

BARTZ, S. R., u. M. A. VODICKA (1997):

Production of high-titer human immunodeficiency virus type 1 pseudotyped

with vesicular stomatitis virus glycoprotein.

Methods 12, 337-342

124


BAUNACH, G., B. MAURER, H. HAHN, M. KRANZ u. A. RETHWILM (1993):

Functional analysis of human foamy virus accessory reading frames.

J. Virol. 67, 5411-5418

SZ, P. D., R. A. WEISS u. M. O. MCCLURE (1995):

Cell cycle dependence of foamy retr

BIENIA

ovirus infection.

J. Virol. 69, 7295-7299

BREN CK (1988):

Formation of covalent complexes between human O6-alkylguanine-DNA

ynthetic

T, T. P., u. J. S. REMA

alkyltransferase and BCNU-treated defined length s

oligodeoxynucleotides.

Nucleic Acids Res. 16, 6779-6788

BROK, H. P., R. J. HORNBY, G. D. GRIFFITHS, L. A. SCOTT u. B. A. HART (2001):

An extensive monoclonal antibody panel for the phenotyping of leukocyte

subsets in the common marmoset and the cotton-top tamarin.

Cytometry 45, 294-303

BROU

topoiesis.

Blood 90

DY, V. C. (1997):

Stem cell factor and hema

, 1345-1364

BURM

ESTER, G. R., u. A. PEZZUTTO (1998):

Taschenatlas der Immunologie.

Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 360 S.

125


BURNS, J. C., T. FRIEDMANN, W. DRIEVER, M. BURRASCANO u. J. K. YEE

rus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors:

concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and

(1993):

Vesicular stomatitis vi

nonmammalian cells.

Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 90, 8033-8037

AI, S., J. R. HARTWELL, R. J. COOPER, B. E. JULIAR, E. KREKLAU, R.

. POLLOK (2006):

C

ABONOUR, W. S. GOEBEL u. K. E

In vivo effects of myeloablative alkylator therapy on survival and differentiation

of MGMT(P140K)-transduced human G-CSF-mobilized peripheral blood cells.

Mol. Ther. 13, 1016-1026

ALLAHAN, M. E., W. M. SWITZER, A. L. MATTHEWS, B. D. ROBERTS, W. C

HENEINE, T. M. FOLKS u. P. A. SANDSTROM (1999):

Persistent zoonotic infection of a human with simian foamy virus in the

absence of an intact orf-2 accessory gene.

J. Virol. 73, 9619-9624

CARNEIRO, F. A., P. A. LAPIDO-LOUREIRO, S. M. CORDO, F. STAUFFER, G.

. A. JULIANO, L. JULIANO, P. M. BISCH

06):

Probing the interaction between vesicular stomatitis virus and

WEISSMULLER, M. L. BIANCONI, M

u. A. T. DA POIAN (20

phosphatidylserine.

Eur. Biophys. J. 35, 145-154

AVAZZANA-CALVO, M., u. A. FISCHER (2004):

Efficacy of gene therapy for SCID is being confirmed.

Lancet 364

C

, 2155-2156

126


CAVAZZANA-CALVO, M., S. HACEIN-BEY, G. DE SAINT BASILE, S. DUPUIS-

GIROD, A. THRASHER, N. WULFFRAAT, R. SORENSEN, J. L. CASANOVA,

F. LE DEIST u. A. FISCHER (2000):

Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1

disease.

Blood 96, 2533a

CHECK, E. (2005):

Gene therapy put on hold as third child develops cancer.

Nature 433, 561

CHINN AIRN, J. NEUENFELDT, J. S. TREISMAN, J. P.

HANSON, JR., G. P. MARGISON u. N. CHINNASAMY (2004):

uanine and 1,3-bis(2-

ASAMY, D., L. J. FAIRB

Lentivirus-mediated expression of mutant MGMTP140K protects human

CD34+ cells against the combined toxicity of O6-benzylg

chloroethyl)-nitrosourea or temozolomide.

Hum. Gene Ther. 15, 758-769

OIL, D. A., u. A. D. MILLER (2004): C

Phosphatidylserine is not the cell surface receptor for vesicular stomatitis virus.

J. Virol. 78, 10920-10926

CRAW

FFBRAND u. H. G. PRENTICE (1981):

n of hemopoietic cells in the common marmoset,

rhesus monkey, and man. In search of a model for human marrow

FORD, D. H., G. JANOSSY, C. M. HETHERINGTON, G. E. FRANCIS, A. J.

EDWARDS, A. V. HO

Immunological characterizatio

transplantation.

Transplantation 31, 245-250

127


CROOKS, G. M., u. D. B. KOHN (1993):

Growth factors increase amphotropic retrovirus binding to human CD34+ bone

marrow progenitor cells.

Blood 82, 3290-3297

CRYS :

Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success.

TAL, R. G. (1995)

Science 270, 404-410

DAO, M. A., C. H. HANNUM, D. B. KOHN u. J. A. NOLTA (1997):

FLT3 ligand preserves the ability of human CD34+ progenitors to sustain long-

term hematopoiesis in immune-deficient mice after ex vivo retroviral-mediated

transduction.

Blood 89, 446-456

, B. M., J. S. REESE, O. N. KOC, K. LEE

DAVIS , J. E. SCHUPP u. S. L. GERSON

Selection for G156A O6-methylguanine DNA methyltransferase gene-

enitors and protection from lethality in mice

(1997):

transduced hematopoietic prog

treated with O6-benzylguanine and 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea.

Cancer Res. 57, 5093-5099

therapy.

DAVIS, B. M., J. C. ROTH, L. LIU, M. XU-WELLIVER, A. E. PEGG u. S. L. GERSON

(1999):

Characterization of the P140K, PVP(138-140)MLK, and G156A O6-

methylguanine-DNA methyltransferase mutants: implications for drug

resistance gene

Hum. Gene Ther. 10, 2769-2778

128


DE FELIPE, P., G. A. LUKE, L. E. HUGHES, D. GANI, C. HALPIN u. M. D. RYAN

proteins from a self-processing polyprotein.

(2006):

E unum pluribus: multiple

Trends Biotechnol. 24, 68-75

D. HUSZAR, R. A. PHILLIPS u. A. BERNSTEIN (1985):

ng-term

mopoietic system of W/Wv mice.

Cell 42

DICK, J. E., M. C. MAGLI,

Introduction of a selectable gene into primitive stem cells capable of lo

reconstitution of the he

, 71-79

DIRKS

ia and beta c deficiency-associated pulmonary alveolar

hereditary diseases of childhood which are potentially

curable by stem cell gene therapy but require different therapeutic approaches.

EN, U., T. MORITZ, S. BURDACH, M. FLASSHOVE u. H. HANENBERG

(1999):

Fanconi anem

proteinosis as two

Klin. Pädiatr. 211, 329-335

DOLA

lls to

ting agents.

Cancer Res. 51

N, M. E., R. B. MITCHELL, C. MUMMERT, R. C. MOSCHEL u. A. E. PEGG

(1991):

Effect of O6-benzylguanine analogues on sensitivity of human tumor ce

the cytotoxic effects of alkyla

, 3367-3372

DONA E., B. P. SORRENTINO, R. G. HAWLEY, D. S. AN, I. S. CHEN u. R.

us and human lentivirus vectors independent of viral

4+ cells.

Mol. Ther. 3

HUE, R.

P. WERSTO (2001):

Fibronectin fragment CH-296 inhibits apoptosis and enhances ex vivo gene

transfer by murine retrovir

tropism in nonhuman primate CD3

, 359-367

129


DROPULIC, B. (2005):

Genetic modification of hematopoietic cells using retroviral and lentiviral

cells. vectors: safety considerations for vector design and delivery into target

Curr. Hematol. Rep. 4, 300-304

P.

ein-Barr virus shuttle

Mol. Cell. Biol. 7

DUBRIDGE, R. B., P. TANG, H. C. HSIA, P. M. LEONG, J. H. MILLER u. M.

CALOS (1987):

Analysis of mutation in human cells by using an Epst

system.

, 379-387

DUNBAR, C. E., N. E. SEIDEL, S. DOREN, S. SELLERS, A. P. CLINE, M. E.

ng factor.

Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 93

METZGER, B. A. AGRICOLA, R. E. DONAHUE u. D. M. BODINE (1996):

Improved retroviral gene transfer into murine and Rhesus peripheral blood or

bone marrow repopulating cells primed in vivo with stem cell factor and

granulocyte colony-stimulati

, 11871-11876

EATON, D. L., u. F. J. DE SAUVAGE (1997):

Thrombopoietin: the primary regulator of megakaryocytopoiesis and

thrombopoiesis.

Exp. Hematol. 25, 1-7

EMI, N., T. FRIEDMANN u. J. K. YEE (1991):

Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular

stomatitis virus.

J. Virol. 65, 1202-1207

130


ENSSLE, J., I. JORDAN, B. MAUER u. A. RETHWILM (1996):

Foamy virus reverse transcriptase is expressed independently from the Gag

protein.


em cell gene therapy: dead or alive?

FERGUSON, C., A. LAROCHELLE u. C. E. DUNBAR (2005):

Hematopoietic st

Trends Biotechnol. 23, 589-597

FINER D. FARSON u. M. R. ROBERTS (1994):

kat: a high-efficiency retroviral transduction system for primary human T

, M. H., T. J. DULL, L. QIN,

lymphocytes.

Blood 83, 43-50

FISCH

ER u. A. RETHWILM (1998):

J. Virol. 72

ER, N., M. HEINKELEIN, D. LINDEMANN, J. ENSSLE, C. BAUM, E.

WERDER, H. ZENTGRAF, J. G. MULL

Foamy virus particle formation.

, 1610-1615

GASP

. SCHMIDT, C. VON KALLE, T. BARINGTON, M. A.

RISTENSEN, A. AL GHONAIUM, H. N. WHITE, J. L.

SMITH, R. J. LEVINSKY, R. R. ALI, C. KINNON u. A. J. THRASHER (2004):

bined immunodeficiency by use of a

AR, H. B., K. L. PARSLEY, S. HOWE, D. KING, K. C. GILMOUR, J. SINCLAIR,

G. BROUNS, M

JAKOBSEN, H. O. CH

Gene therapy of X-linked severe com

pseudotyped gammaretroviral vector.

Lancet 364, 2181-2187

ERSON, S. L., K. MILLER u. N. A. BERGER (1985):

O6 alkylguanine-DNA alkyltransferase activity in human myeloid cells.

J. Clin. Invest. 76

G

, 2106-2114

131


GERSON, S. L., W. PHILLIPS, M. KASTAN, L. L. DUMENCO u. C. DONOVAN

D34+ hematopoietic progenitors have low, cytokine-unresponsive

plus BCNU.

(1996):

Human C

O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase and are sensitive to O6-benzylguanine

Blood 88, 1649-1655

GOER SWEENEY, G. BURON, R. STORB u. H. P.

KIEM (1999):

nsduction

ells in dogs.

NER, M., B. BRUNO, P. A. MC

The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral tra

on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic

repopulating c

Blood 94, 2287-2292

tion and

od progenitor and stem cells.

HAAS, R., u. S. MUREA (1995):

The role of granulocyte colony-stimulating factor in mobiliza

transplantation of peripheral blo

Cytokines Mol. Ther. 1, 249-270

HACEIN-BEY-ABINA, S., F. LE DEIST, F. CARLIER, C. BOUNEAUD, C. HUE, J. P.

DE VILLARTAY, A. J. THRASHER, N. WULFFRAAT, R. SORENSEN, S.

DUPUIS-GIROD, A. FISCHER, E. G. DAVIES, W. KUIS, L. LEIVA u. M.

CAVAZZANA-CALVO (2002):

Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex

vivo gene therapy.

N. Engl. J. Med. 346, 1185-1193

132


HACEIN-BEY-ABINA, S., C. VON KALLE, M. SCHMIDT, F. LE DEIST, N.

WULFFRAAT, E. MCINTYRE, I. RADFORD, J. L. VILLEVAL, C. C. FRASER,

unodeficiency.

M. CAVAZZANA-CALVO u. A. FISCHER (2003a):

A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe

combined imm

N. Engl. J. Med. 348, 255-256

P. LEBOULCH, A. LIM, C. S. OSBORNE, R. PAWLIUK, E.

NNET, S. ROMANA, I. RADFORD-WEISS, F.

I, E. DELABESSE, E. MACINTYRE, F. SIGAUX, J.

SOULIER, L. E. LEIVA, M. WISSLER, C. PRINZ, T. H. RABBITTS, F. LE

CAVAZZANA-CALVO (2003b):

HACEIN-BEY-ABINA, S., C. VON KALLE, M. SCHMIDT, M. P. MCCORMACK, N.

WULFFRAAT,

MORILLON, R. SORENSEN, A. FORSTER, P. FRASER, J. I. COHEN, G. DE

SAINT BASILE, I. ALEXANDER, U. WINTERGERST, T. FREBOURG, A.

AURIAS, D. STOPPA-LYO

GROSS, F. VALENS

DEIST, A. FISCHER u. M.

LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy

for SCID-X1.

Science 302, 415-419

HANAZONO, Y., T. NAGASHIMA, M. TAKATOKU, H. SHIBATA, N. AGEYAMA, T.

ASANO, Y. UEDA, C. E. DUNBAR, A. KUME, K. TERAO, M. HASEGAWA u.

K. OZAWA (2002):

In vivo selective expansion of gene-modified hematopoietic cells in a

nonhuman primate model.

Gene Ther. 9, 1055-1064

ANENBERG, H., K. HASHINO, H. KONISHI, R. A. HOCK, I. KATO u. D. A.

WILLIAMS (1997):

Optimization of fibronectin-assisted retroviral gene transfer into human CD34+

hematopoietic cells.

Hum. Gene Ther. 8

H

, 2193-2206

133


HANENBERG, H., X. L. XIAO, D. DILLOO, K. HASHINO, I. KATO u. D. A. WILLIAMS

(1996):

Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments

increases genetic transduction of mammalian cells.

Nat. Med. 2, 876-882

EINKELEIN, M., M. DRESSLER, G. JARMY, M. RAMMLING, H. IMRICH, J. H

THUROW, D. LINDEMANN u. A. RETHWILM (2002a):

Improved primate foamy virus vectors and packaging constructs.

J. Virol. 76, 3774-3783

ELEIN, M., C. LEURS, M. RAMMLING, K. PETERS, H. HANENBERG u. A.

RETHWILM (2002b):

Pregenomic RNA is required for efficient incorporation of pol polyprotein into

foamy virus capsids.

HEINK

J. Virol. 76, 10069-10073

HEINK HMANN, G. JARMY, M. DRESSLER, H. IMRICH, J.

THUROW, D. LINDEMANN, M. BOCK, A. MOEBES, J. ROY, O.

ELEIN, M., T. PIETSC

HERCHENRODER u. A. RETHWILM (2000a):

Efficient intracellular retrotransposition of an exogenous primate retrovirus

genome.

Embo J. 19, 3436-3445

HEINKELEIN, M., M. SCHMIDT, N. FISCHER, A. MOEBES, D. LINDEMANN, J.

ENSSLE u. A. RETHWILM (1998):

vectors.

Characterization of a cis-acting sequence in the Pol region required to transfer

human foamy virus

J. Virol. 72, 6307-6314

134


HEINKELEIN, M., J. THUROW, M. DRESSLER, H. IMRICH, D. NEUMANN-

HAEFELIN, M. O. MCCLURE u. A. RETHWILM (2000b):

n Process Citation].

Complex effects of deletions in the 5' untranslated region of primate foamy

virus on viral gene expression and RNA packaging [I

J. Virol. 74, 3141-3148

HENEINE, W., M. SCHWEIZER, P. SANDSTROM u. T. FOLKS (2003):

Human infection with foamy viruses.

Curr. Top. Microbiol. Immunol. 277, 181-196

ERCHENRÖDER, O., R. RENNE, D. LONCAR, E. K. COBB, K. K. MURTHY, J.

sequencing of simian foamy viruses from chimpanzees

H

SCHNEIDER, A. MERGIA u. P. A. LUCIW (1994):

Isolation, cloning, and

(SFVcpz): high homology to human foamy virus (HFV).

Virology 201, 187-199

IBINO, H., K. TANI, K. IKEBUCHI, M. S. WU, H. SUGIYAMA, Y. NAKAZAKI, T.

rimate model for cytokine and

H

TANABE, S. TAKAHASHI, A. TOJO, S. SUZUKI, Y. TANIOKA, Y. SUGIMOTO,

T. NAKAHATA u. S. ASANO (1999):

The common marmoset as a target preclinical p

gene therapy studies.

Blood 93, 2839-2848

IBINO, H., K. TANI, H. SUGIYAMA, S. SUZUKI, M. S. WU, K. IZAWA, H. HASE, Y.

l and adenoviral vectors.

H

NAKAZAKI, T. TANABE, J. OOI, T. IZEKI, A. TOJO, I. SAITOH, Y. TANIOKA

u. S. ASANO (2001):

Haematopoietic progenitor cells from the common marmoset as targets of

gene transduction by retrovira

Eur. J. Haematol. 66, 272-280

135


HILL, C. L., P. D. BIENIASZ u. M. O. MCCLURE (1999):

Properties of human foamy virus relevant to its development as a vector for

gene therapy.

J. Gen. Virol. 80, 2003-2009

O, A. D. (2006):

s., Cologne, Proc., S. 12

RDANSKII, S. N., L. F. LIDEMAN, A. K. CHIKOVA u. R. A. GIBADULIN (1997):

mbinant strains of vaccinia

H

Connections determine life fate of adult stem cells.

in: 1st Cong. Germ. Soc. Stem Cell Re

IO

Interaction of gag polyprotein-precursors p55 and p48 with p160gag-pol during

formation of virus-like particles of HIV-1 with reco

virus.

Vopr. Virusol. 42, 205-208

AWA, K., K. TANI, Y. NAKAZAKI, H. HIBINO, H. SUGIYAMA, A. KAWASAKI, E.

armoset CD34 cells isolated by a novel

IZ

SASAKI, C. NISHIOKA, H. ISHII, Y. SODA, H. YAGITA, Y. TANIOKA, A.

TOJO u. S. ASANO (2004):

Hematopoietic activity of common m

monoclonal antibody MA24.


ANG, S. K., u. E. WIMMER (1990):

in.

J

Cap-independent translation of encephalomyocarditis virus RNA: structural

elements of the internal ribosomal entry site and involvement of a cellular 57-

kD RNA-binding prote

Genes Dev. 4, 1560-1572

136


KAINA, B., G. FRITZ u. T. COQUERELLE (1993):

Contribution of O6-alkylguanine and N-alkylpurines to the formation of sister

chromatid exchanges, chromosomal aberrations, and gene mutations: new

f genetically engineered mammalian cell lines.

Environ. Mol. Mutagen. 22

insights gained from studies o

, 283-292

KAPLA RAMLEY, L. VINCENT, C.

S, Z. ZHU, D.

HICKLIN, Y. WU, J. L. PORT, N. ALTORKI, E. R. PORT, D. RUGGERO, S. V.

438

N, R. N., R. D. RIBA, S. ZACHAROULIS, A. H. B

COSTA, D. D. MACDONALD, D. K. JIN, K. SHIDO, S. A. KERN

SHMELKOV, K. K. JENSEN, S. RAFII u. D. LYDEN (2005):

VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-

metastatic niche.

Nature , 820-827

IEM, H.-P., S. HEYWARD, A. WINKLER, J. POTTER, J. A. ALLEN, A. D. MILLER u.

eudotyped retroviral vectors in a competitive

K

R. G. ANDREWS (1997):

Gene transfer into marrow repopulating cells: comparison between

amphotropic and GALV ps

repopulation assay in baboons.

Blood 90, 4638-4645

IEM, H. P., J. ALLEN, G. TROBRIDGE, E. OLSON, K. KEYSER, L. PETERSON u. K

D. W. RUSSELL (2007):

Foamy-virus-mediated gene transfer to canine repopulating cells.

Blood 109, 65-70

KIMURA, S., A. W. ROBERTS, D. METCALF u. W. S. ALEXANDER (1998):

Hematopoietic stem cell deficiencies in mice lacking c-Mpl, the receptor for

thrombopoietin.


137


KOHN, D. B. (1996):

Gene therapy for hematopoietic and immune disorders.

Bone Marrow Transplant. 18 Suppl 3, S55-58

KOHN . BODINE, H. P. KIEM, F. CANDOTTI, J.

TISDALE, I. RIVIERE, C. A. BLAU, R. E. RICHARD, B. SORRENTINO, J.

, D. B., M. SADELAIN, C. DUNBAR, D

NOLTA, H. MALECH, M. BRENNER, K. CORNETTA, J. CAVAGNARO, K.

HIGH u. J. GLORIOSO (2003):

American society of gene therapy (ASGT) ad hoc subcommittee on retroviral-

mediated gene transfer to hematopoietic stem cells.

Mol. Ther. 8, 180-187

KRAU LER, C. I. CIVIN u. W. S. MAY (1996):

CD34: structure, biology, and clinical utility.

SE, D. S., M. J. FACK

Blood 87, 1-13

KREK

(6)-methylguanine DNA methyltransferase-

sive treatment of human glioma xenografts with

combination O(6)-benzylguanine and 1,3-bis-(2-chloroethyl)-1-nitrosourea.

LAU, E. L., K. E. POLLOK, B. J. BAILEY, N. LIU, J. R. HARTWELL, D. A.

WILLIAMS u. L. C. ERICKSON (2003):

Hematopoietic expression of O

P140K allows inten

Mol. Cancer Ther. 2, 1321-1329

KURR S u. H. P.

Gene transfer into baboon repopulating cells: A comparison of Flt-3 Ligand

ex vivo

E, P., J. MORRIS, P. A. HORN, M. A. HARKEY, R. G. ANDREW

KIEM (2001):

and megakaryocyte growth and development factor versus IL-3 during

transduction.

Mol. Ther. 3, 920-927

138


LAROCHELLE, A., J. VORMOOR, H. HANENBERG, J. C. Y. WANG, M. BHATIA, T.

TO, D. A. WILLIAMS

Identification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating

LAPIDOT, T. MORITZ, B. MURDOCH, X. L. XIAO, I. KA

u. J. E. DICK (1996):

NOD/SCID mouse bone marrow: implications for gene therapy.

Nat. Med. 2, 1329-1337

, C. (2003):

LEURS

issenschaftliche Fakultät Düsseldorf, Heinrich-Heine-

Universität, Diss.

LEURS HEINKELEIN, M. SCHMIDT, M.

INDEMANN, C. VON KALLE, A. RETHWILM, D. A. WILLIAMS

u. H. HANENBERG (2003):

ncy mice repopulating human CD34+

Etablierung foamyviraler Vektoren zur Transduktion humaner

hämatopoetischer Stammzellen.

Mathematisch- Naturw

, C., M. JANSEN, K. E. POLLOK, M.

WISSLER, D. L

Comparison of three retroviral vector systems for transduction of nonobese

diabetic/severe combined immunodeficie

cord blood cells.

Hum. Gene Ther 14, 509-519

LI, Z., R, M. SCHMIDT, C. VON KALLE, J. MEYER,

M. FORSTER, C. STOCKING, A. WAHLERS, O. FRANK, W. OSTERTAG, K.

ia induced by retroviral gene marking.

J. DULLMANN, B. SCHIEDLMEIE

KUHLCKE, H. G. ECKERT, B. FEHSE u. C. BAUM (2002):

Murine leukem

Science 296, 497.

MANN, D., M.

LINDE BOCK, M. SCHWEIZER u. A. RETHWILM (1997):

of murine leukemia virus particles with chimeric human

foamy virus envelope proteins.

J. Virol. 71

Efficient pseudotyping

, 4815-4820

139


LINDEMANN, D., u. P. A. GOEPFERT (2003):

The foamy virus envelope glycoproteins.


LINIAL

pathogenic?

Trends Microbiol. 8

, M. (2000):

Why aren't foamy viruses

, 284-289

LINIAL

l retroviruses.

, M. L. (1999):

Foamy viruses are unconventiona

J. Virol. 73, 1747-1755

OCHELT, M. (2003): L

Foamy virus transactivation and gene expression.


LÖCH

er.

ELT, M., W. MURANYI u. R. M. FLÜGEL (1993):

Human foamy virus genome possesses an internal, Bel-1-dependent and

functional promot


LUSKEY, B. D., M. ROSENBLATT, K. ZSEBO u. D. A. WILLIAMS (1992):

Stem cell factor, interleukin-3, and interleukin-6 promote retroviral-mediated

gene transfer into murine hematopoietic stem cells.

Blood 80, 396-402

AZE, R., H. HANENBERG u. D. A. WILLIAMS (1997): M

Establishing chemoresistance in hematopoietic progenitor cells.

Mol. Med. Today 3, 350-358

140


MAZE, R., C. KURPAD, A. E. PEGG, L. C. ERICKSON u. D. A. WILLIAMS (1999):

40A, but not P140A/G156A, mutant

sferase protects hematopoietic

cells against O6-benzylguanine sensitization to chloroethylnitrosourea

Retroviral-mediated expression of the P1

form of O6-methylguanine DNA methyltran

treatment.

J. Pharmacol. Exp. Ther. 290, 1467-1474

EIERING, C. D., K. E. COMSTOCK u. M. L. LINIAL (2000):

tions of human foamy virus in persistently infected human

M

Multiple integra

erythroleukemia cells.

J. Virol. 74, 1718-1726

MEIERING, C. D., u. M. L. LINIAL (2001):

and infection. Historical perspective of foamy virus epidemiology

Clin. Microbiol. Rev. 14, 165-176

MERGIA, A., S. CHARI, D. L. KOLSON, M. M. GOODENOW u. T. CICCARONE

an foamy virus vector type-1 (SFV-1) in nondividing cells

Virology 280

(2001):

The efficiency of simi

and in human PBLs.

, 243-252

MERG

l. Immunol. 277

IA, A., u. M. HEINKELEIN (2003):

Foamy virus vectors.

Curr. Top. Microbio , 131-159

ns.

METCALF, D. (1977):

In-vitro cloning techniques for hemopoietic cells: clinical applicatio

Ann. Intern. Med. 87, 483-488

141


MOCHIZUKI, H., J. P. SCHWARTZ, K. TANAKA, R. O. BRADY u. J. REISER (1998):

High-titer human immunodeficiency virus type 1-based vector systems for

gene delivery into nondividing cells.

J. Virol. 72, 8873-8883

MODROW, S, u. D. FALKE u. U. TRUYEN (2002):

Molekulare Virologie.

eidelberg, 750 S.

MOEBES, A., J. ENSSLE, P. D. BIENIASZ, M. HEINKELEIN, D. LINDEMANN, M.

u. A. RETHWILM (1997):

Human foamy virus reverse transcription that occurs late in the viral replication

Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH, H

BOCK, M. O. MCCLURE

cycle.

J. Virol. 71, 7305-7311

ORITZ, T., V. P. PATEL u. D. A. WILLIAMS (1994):

oietic cells via retroviral vectors.

M

Bone marrow extracellular matrix molecules improve gene transfer into human

hematop

J. Clin. Invest. 93, 1451-1457

MORRISON, S. J., N. UCHIDA u. I. L. WEISSMAN (1995):

The biology of hematopoietic stem cells.

Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11, 35-71

NALDI . MULLIGAN, F. H. GAGE, I. M.

VERMA u. D. TRONO (1996):

very and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral

NI, L., U. BLÖMER, P. GALLAY, D. ORY, R

In vivo gene deli

vector.

Science 272, 263-267

142


NAVIAUX, R. K., E. COSTANZI, M. HAAS u. I. M. VERMA (1996):

The pCL system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant

retroviruses.

J. Virol. 70, 5701-5705

NEFF, T., B. C. BEARD, L. J. PETERSON, P. ANANDAKUMAR, J. THOMPSON u.

l of

drug resistance gene therapy.

H. P. KIEM (2005):

Polyclonal chemoprotection against temozolomide in a large-animal mode

Blood 105, 997-1002

NEFF,

MS, M. SCHMIDT, G. E. GEORGES, C. VON KALLE u. H. P. KIEM

Methylguanine methyltransferase-mediated in vivo selection and

rge-animal model.

T., P. A. HORN, L. J. PETERSON, B. M. THOMASSON, J. THOMPSON, D. A.

WILLIA

(2003):

chemoprotection of allogeneic stem cells in a la

J. Clin. Invest. 112, 1581-1588

NOWR KLANKE, M. HEINKELEIN, M. RAMMLING, T.

DANDEKAR, C. VON KALLE u. A. RETHWILM (2006):

ations into a human cell

OUZI, A., M. DITTRICH, C.

Genome-wide mapping of foamy virus vector integr

line.

J. Gen. Virol. 87, 1339-1347

OMOTO, S., E. A. BRISIBE, H. OKUYAMA u. Y. R. FUJII (2004):

Feline foamy virus Tas protein is a DNA-binding transactivator.

J. Gen. Virol. 85, 2931-2935

143


ORKIN, S. H., u. A. G. MOTULSKY (1995):

Report and recommendations of the panel to assess the NIH investment in

research on gene therapy.

lrep.htmlwww.nih.gov/news/pane ; Abrufdatum: 07.12.1995

ce of foamy virus vectors.

PATTON, G. S., O. ERLWEIN u. M. O. MCCLURE (2004):

Cell-cycle dependen

J. Gen. Virol. 85, 2925-2930

PEAR M. L. SCOTT u. D. BALTIMORE (1993):

Production of high-titer helper-free retrovirus by transient infection.

, W. S., G. P. NOLAN,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8392-8396

PEGG, A. E., M. E. DOLAN u. R. C. MOSCHEL (1995):

Structure, function, and inhibition of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase.

Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51, 167-223

FEIFER, A., u. I. M. VERMA (2001): P

Gene therapy: promises and problems.

Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2, 177-211

PIETSCHMANN, T., M. HEINKELEIN, M. HELDMANN, H. ZENTGRAF, A.

N (1999):

Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export.

RETHWILM u. D. LINDEMAN

J. Virol. 73, 2613-2621

POLLO GER, S. GOEBEL, H. HANENBERG u. S. CAI

(2005):

In Vivo Selection of Murine Long-Term Repopulating Cells Transduced with a

Foamy Virus Vector That Expresses MGMTP140K.

in: ASH Ann. Meeting, Proc. 106

K, K. E., A. G. ERNSTBER

, 3061

144


PREUSS, I., S. HAAS, U. EICHHORN, I. EBERHAGEN, M. KAUFMANN, T. BECK,

6):

thyltransferase in

human tumor and corresponding normal tissue.

R. H. EIBL, P. DALL, T. BAUKNECHT, J. HENGSTLER, B. M. WITTIG, W.

DIPPOLD u. B. KAINA (199

Activity of the DNA repair protein O6-methylguanine-DNA me

Cancer Detect. Prev. 20, 130-136

QUINN

The DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating

, D. I. (2001):

agents.

N. Engl. J. Med. 344, 686

UINN, J. A., J. PLUDA, M. E. DOLAN, S. DELANEY, R. KAPLAN, J. N. RICH, A. H.

N, O. M. COLVIN, M. M.

M.

-UHLIG, J. E. HERNDON, 2ND,

D. D. BIGNER u. H. S. FRIEDMAN (2002):

plus O(6)-benzylguanine for patients with

ssive malignant glioma.

Q

FRIEDMAN, D. A. REARDON, J. H. SAMPSO

HAGLUND, A. E. PEGG, R. C. MOSCHEL, R. E. MCLENDON, J.

PROVENZALE, S. GURURANGAN, S. TOURT

Phase II trial of carmustine

nitrosourea-resistant recurrent or progre

J. Clin. Oncol. 20, 2277-2283

RADSAK, K., R. FUHRMANN, R. P. FRANKE, D. SCHNEIDER, A. KOLLERT, K. H.

BRUCHER u. D. DRENCKHAHN (1989):

Arch. Virol. 107

Induction by sodium butyrate of cytomegalovirus replication in human

endothelial cells.

, 151-158

145


RAGG, S., M. XU-WELLIVER, J. BAILEY, M. D'SOUZA, R. COOPER, S. CHANDRA,

R. SESHADRI, A. E. PEGG u. D. A. WILLIAMS (2000):

Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects

mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of

hematopoietic stem cells.

Cancer Res. 60, 5187-5195

REESE, J. S., O. N. KOC, K. M. LEE, L. LIU, J. A. ALLAY, W. P. PHILLIPS, JR. u. S.

l transduction of a mutant methylguanine DNA methyltransferase

lls confers resistance to O6-benzylguanine plus 1,3-

bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea.

L. GERSON (1996):

Retrovira

gene into human CD34 ce


DER, T., A. BRUN, R. G. HAWLEY, S. KARLSSON u. J. RICHTER (2001):

Retroviral transduction of human CD34+ cells on fibronectin fragment CH-296

is inhibited by high concentrations of vector

RELAN

containing medium.

J. Gene Med. 3, 207-218

RETH

The replication strategy of foamy viruses.

WILM, A. (2003):


ROE,

ne leukemia virus DNA depends on mitosis.

T., T. C. REYNOLDS, G. YU u. P. O. BROWN (1993):

Integration of muri

Embo J. 12, 2099-2108

RUSSELL, D. W., u. A. D. MILLER (1996):

Foamy virus vectors.

J. Virol. 70, 217-222

146


RUSTIGIAN, R., P. JOHNSTON u. H. REIHART (1955):

Infection of monkey kidney tissue cultures with virus-like agents.

Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 88, 8-16

, M. D., A. M. KING u. G. P

RYAN . THOMAS (1991):

disease virus polyprotein is mediated by residues

located within a 19 amino acid sequence.

Cleavage of foot-and-mouth

J. Gen. Virol. 72 ( Pt 11), 2727-2732

SCHA

l and lentiviral SIN vectors for expression of

ematopoietic cells.

Mol. Ther. 13

MBACH, A., J. BOHNE, S. CHANDRA, E. WILL, G. P. MARGISON, D. A.

WILLIAMS u. C. BAUM (2006):

Equal potency of gammaretrovira

O6-methylguanine-DNA methyltransferase in h

, 391-400

SCHLE

dylserine: is

-binding site?

Cell 32

GEL, R., T. S. TRALKA, M. C. WILLINGHAM u. I. PASTAN (1983a):

Inhibition of VSV binding and infectivity by phosphati

phosphatidylserine a VSV

, 639-646

SCHLE

"receptor".

GEL, R., u. M. WADE (1983b):

Neutralized vesicular stomatitis virus binds to host cells by a different

Biochem. Biophys. Res. Commun. 114, 774-778

SCHMIDT, M., u. A. RETHWILM (1995):

Replicating foamy virus-based vectors directing high level expression of

foreign genes.

Virology 210, 167-178

147


SCHMIDT, M., P. ZICKLER, G. HOFFMANN, S. HAAS, M. WISSLER, A. MUESSIG,

. KIEM, C. E.

Polyclonal long-term repopulating stem cell clones in a primate model.

J. F. TISDALE, K. KURAMOTO, R. G. ANDREWS, T. WU, H. P

DUNBAR u. C. VON KALLE (2002):

Blood 100, 2737-2743

SCHR RY, J. R. ECKER u. F. BUSHMAN

HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.

ODER, A. R., P. SHINN, H. CHEN, C. BER

(2002):

Cell 110, 521-529

SCHW

ted from an accidentally infected human individual.

J. Virol. 71

EIZER, M., V. FALCONE, J. GANGE, R. TUREK u. D. NEUMANN-HAEFELIN

(1997):

Simian foamy virus isola

, 4821-4824

SEGG

. S. YOUNG, 3RD, R. E. DONAHUE,

. W. NIENHUIS u. C. E. DUNBAR (2006):

Acute myeloid leukemia is associated with retroviral gene transfer to

a rhesus macaque.

EWISS, R., S. PITTALUGA, R. L. ADLER, F. J. GUENAGA, C. FERGUSON, I.

H. PILZ, B. RYU, B. P. SORRENTINO, W

C. VON KALLE, A

hematopoietic progenitor cells in

Blood 107, 3865-3867

SONE . GRIFFITHS, G. ROMANO,

S. M. KINGSMAN u. A. J. KINGSMAN (1995):

ion system for the production of high titer

es. 23

OKA, Y., P. M. CANNON, E. E. RAMSDALE, J. C

A transient three-plasmid express

retroviral vectors.

Nucleic Acids R , 628-633

148


SPANGRUDE, G. J., D. M. BROOKS u. D. B. TUMAS (1995):

Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified

hematopoietic stem cells: in vivo expansion of stem cell phenotype but not

function.

Blood 85, 1006-1016

SPANGRUDE, G. J., S. HEIMFELD u. I. L. WEISSMAN (1988):

Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.

Science 241, 58-62

TANKE, N., A. STANGE, D. LUFTENEGGER, H. ZENTGRAF u. D. LINDEMANN

ation of the prototype foamy virus envelope glycoprotein leader

S

(2005):

Ubiquitin

peptide regulates subviral particle release.

J. Virol. 79, 15074-15083

ns derived from

STITZ, J., C. J. BUCHHOLZ, M. ENGELSTADTER, W. UCKERT, U. BLOEMER, I.

SCHMITT u. K. CICHUTEK (2000):

Lentiviral vectors pseudotyped with envelope glycoprotei

gibbon ape leukemia virus and murine leukemia virus 10A1.

Virology 273, 16-20

ANAKA, J., H. SADANARI, H. SATO u. S. FUKUDA (1991): T

Sodium butyrate-inducible replication of human cytomegalovirus in a human

epithelial cell line.

Virology 185, 271-280

THOM

Bone marrow transplantation: a review.

Semin. Hematol. 36

AS, E. D. (1999):

, 95-103

149


THOMAS, E. D., H. L. LOCHTE, W. C. LU u. J. W. FERREBEE (1957):

. Med. 157

Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and

chemotherapy.

N. Engl. J , 491-496

O, L. B., D. N. HAYLOCK, P. J. SIMMONS u. C. A. JUTTNER (1997): T

The biology and clinical uses of blood stem cells.

Blood 89, 2233-2258

ROBRIDGE, G., u. D. W. RUSSELL (2004):

oncovirus and lentivirus vectors.

T

Cell cycle requirements for transduction by foamy virus vectors compared to

those of

J. Virol. 78, 2327-2335

TROB ER, M. A. JACOBS, J. M. ALLEN, H. P. KIEM, R.

KAUL u. D. W. RUSSELL (2006):

RIDGE, G. D., D. G. MILL

Foamy virus vector integration sites in normal human cells.


TROB

us vectors.

Hum. Gene Ther. 9

RIDGE, G. D., u. D. W. RUSSELL (1998):

Helper-free foamy vir

, 2517-2525

VAN D

. WILLIAMS (1998):

ere combined immunodeficiency (NOD/SCID) mouse

as a model system to study the engraftment and mobilization of human

tem cells.

ER LOO, J. C. M., H. HANENBERG, R. J. COOPER, F. Y. LUO, E. N.

LAZARIDIS u. D. A

Nonobese diabetic/sev

peripheral blood s

Blood 92, 2556-2570

150


VASSILOPOULOS, G., G. TROBRIDGE, N. C. JOSEPHSON u. D. W. RUSSELL

nto murine hematopoietic stem cells with helper-free foamy

Blood 98

(2001):

Gene transfer i

virus vectors.

, 604-609

VON L ROSCHER, B. FEHSE u. C.

Amphotropic and VSV-G-pseudotyped retroviral vectors transduce human

ar efficiency.

AER, D., A. COROVIC, B. VOGT, U. HERWIG, S.

BAUM (2000):

hematopoietic progenitor cells with simil

Bone Marrow Transplant. 25 Suppl 2, S75-79

WANG u. J. E. DICK (1997):

Primitive human hematopoietic cells are enriched in cord blood compared to

ing cell (SRC) assay.

, J. C. Y., M. DOEDENS

adult bone marrow or mobilized peripheral blood as measured by the

quantitative in vivo SCID-repopulat

Blood 89, 3919-3924

EISS, R. A. (1988):

disease.

W

Foamy retroviruses. A virus in search of a

Nature 333, 497-498

ILLIAMS, D. A., I. R. LEMISCHKA, D. G. NATHAN u. R. C. MULLIGAN (1984): W

Introduction of new genetic material into pluripotent haematopoietic stem cells

of the mouse.

Nature 310, 476-480

MS, D. A., H. I. LEVITSKY, M

WILLIA . C. DINAUER u. D. W. RUSSELL (1997):

ematology: human diseases, mouse models and new

approaches.

ASH Educ. Book 12

Genetic therapies in h

, 55-74

151


WINKLER, I. G., R. M. FLÜGEL, K. ASIKAINEN u. R. L. FLOWER (2000):

Antibody to human foamy virus not detected in individuals treated with blood

products or in blood donors.

Vox. Sang. 79, 118-119

U, M., u. A. MERGIA (1999): W

Packaging cell lines for simian foamy virus type 1 vectors.

J. Virol. 73, 4498-4501

WU, X

me are favored targets for MLV

integration.

., Y. LI, B. CRISE u. S. M. BURGESS (2003):

Transcription start regions in the human geno

Science 300, 1749-1751

XU-WE

rase mutants highly

by O6-benzylguanine.

Cancer Res. 58

LLIVER, M., S. KANUGULA u. A. E. PEGG (1998):

Isolation of human O6-alkylguanine-DNA alkyltransfe

resistant to inactivation

, 1936-1945

YANG , B. ROESSLER u. K. T.

Highly efficient genetic transduction of primary human synoviocytes with

, J., M. S. FRIEDMAN, H. BIAN, L. J. CROFFORD

MCDONAGH (2002):

concentrated retroviral supernatant.

Arthritis Res. 4, 215-219

YANG, P., M. ZEMBA, M. ABOUD, R. M. FLUGEL u. M. LOCHELT (1997):

Deletion analysis of both the long terminal repeat and the internal promoters of

the human foamy virus.

Virus Genes 15, 17-23

152


YEE, J. K., T. FRIEDMANN u. J. C. BURNS (1994):

Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host

range.

Methods Cell. Biol. 43, 99-112

S (1995):

YODER, M. C., u. D. A. WILLIAM

Matrix molecule interactions with hematopoietic stem cells.


u. M. OGAWA (1996):

ic stem cells.

A 93

YONEMURA, Y., H. KU, F. HIRAYAMA, L. M. SOUZA

Interleukin 3 or interleukin 1 abrogates the reconstituting ability of

hematopoiet

Proc. Natl. Acad. Sci. U S , 4040-4044

YU, J. (1996):

Regulation and reconstitution of human hematopoiesis.

J. Formos Med. Assoc. 95, 281-293

U, S. F., u. M. L. LINIAL (1993):

uantitative assay.

Y

Analysis of the role of the bel and bet open reading frames of human foamy

virus by using a new q

J. Virol. 67, 6618-6624

YU, S. . L. LINIAL (1999):

Evidence that the human foamy virus genome is DNA.

F., M. D. SULLIVAN u. M

J. Virol. 73, 1565-1572

153

Danksagung

Mein Dank gilt Prof. Dr. Helmut Hanenberg für die Überlassung des äußerst

interessanten Themas, die fachliche Unterstützung bei virologischen Fragen, seine

tändige Diskussionsbereitschaft und seine Betreuung bei dieser Arbeit.

Herrn erzeit angebotene,

gute f stets gewährte Diskussionsbereitschaft und die

onstruktive Kritik bei der Anfertigung der Arbeit, trotz der großen Entfernung. Vielen

Mein rof. Dr. Heiner Niemann; Institut für Tierzucht,

Bunde nsee, für die Betreuung der Arbeit

nd Verteidigung an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

Bei de Rethwilm möchte ich

mich für die gute Zusammenarbeit, die fachlich Unterstützung und vielen gute

atschläge im Umgang mit Foamyviren bedanken.

Ich da

eine angenehme Arbeitsatmosphäre sowie für die ständige Gesprächsbereitschaft

und Unterstützung bei Problemlösungen, insbesondere Herrn Dr. Michael Gombert

r die Einführung in die Geheimnisse von Microsoft-Word.

Gedan und Ingrid Wurm und

meine Bastian für die große Geduld und Aufmunterung bei

er Fertigstellung der Arbeit.

esonderer Dank gilt Heiko Nathues, der nicht nur viel Geduld bei der Erstellung

ieser Arbeit mit mir bewies, sondern mich auch im Vorfeld der Finalisierung dieses

erks stets motivierte, nicht den Kopf in den Sand zu stecken. Danke

s

PD. Dr. Peter A. Horn danke ich ganz besonders für die jed

achliche Unterstützung, die

k

Dank auch für die Unterstützung meiner Auslandsaufenthalte.

verbindlicher Dank gilt P

sforschungsanstalt für Landwirtschaft, Marie

u

n Virologen Herrn Dr. Dirk Lindemann und Prof. Axel

R

nke allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des KMT-Labor der Kinderklinik für

fü

kt sei an dieser Stelle auch meinen Eltern, Rainer

n Brüdern Bernhard und

d

B

d

W

Transduktion hämatopoetischer Stammzellen von Neuweltaffen ... · DNA desoxyribonucleic acid E....

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