Entwicklung und In vitro-Charakterisierung eines ...

Entwicklung und In vitro-Charakterisierung eines

Mikrodialysesystems zur intestinalen Anwendung am Menschen

I N AU G U RA L DI S SE R T A TI O N

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Dana Schönherr

geboren am 12. Mai 1976

in Eisenhüttenstadt

Greifswald, den 15. August 2015

Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser

1. Gutachter: Prof. Dr. Werner Weitschies

2. Gutachter: Prof. Dr. med. Thomas Gramatté

Tag der Promotion: 22. Januar 2016

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................................... V

1 Einleitung .................................................................................................................... 1

1.1 Ausgewählte Aspekte der Anatomie und Physiologie des Gastrointestinaltraktes

und deren Einfluss auf die Arzneistoffabsorption ..................................................... 1

1.1.1 Anatomie .......................................................................................................... 1

1.1.2 Sekretion .......................................................................................................... 2

1.1.3 Motilität und Transitzeiten ................................................................................ 4

1.1.4 Arzneistoffabsorption........................................................................................ 5

1.2 Einfluss der physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffes und der

Arzneiform auf die Arzneistoffabsorption ................................................................. 7

1.2.1 Physikochemische Eigenschaften des Arzneistoffes ........................................ 7

1.2.2 BCS-Klassifizierung des Arzneistoffes und dessen Einfluss auf die

Formulierung der Arzneiform ............................................................................ 8

1.3 Prinzipien der Untersuchung der intestinalen Arzneistoffabsorption ........................ 9

1.3.1 Indirekte Methoden .......................................................................................... 9

1.3.2 Direkte Methoden ............................................................................................10

1.4 Verwendung der Mikroperfusion mit offenem Fluss zur Bestimmung von

Stoffkonzentrationen ..............................................................................................12

1.5 Verwendung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen ..............13

1.6 Zielstellung .............................................................................................................16

2 Material und Methoden ..............................................................................................19

2.1 Arzneistoffe und Medien .........................................................................................19

2.1.1 Arzneistoffe .....................................................................................................19

2.1.2 Medien und Arzneistofflösungen .....................................................................20

2.2 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems ....................................21

2.3 Versuchsaufbau und Versuchsablauf .....................................................................24

2.3.1 Versuchsaufbau für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss ..........24

2.3.2 Versuchsablauf für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss ............26

Inhaltsverzeichnis

II

2.4 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems ..............................................................32

2.4.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des

Versuchsablaufes ............................................................................................32

2.4.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation

verwendeten Gerätes auf die relative Wiederfindung ...............................32

2.4.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative

Wiederfindung ..........................................................................................32

2.4.2 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei

Konzentrationsänderungen .............................................................................33

2.4.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei

Anwendung des diskontinuierlichen Flusses ...................................................33

2.4.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung ......................33

2.4.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung ...............................33

2.4.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung ....................34

2.4.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung ..............................34

2.4.4 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung

biorelevanter Medien .......................................................................................34

2.4.5 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im

Röhrenmodell ..................................................................................................34

2.5 Adaption und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems für eine mögliche

humane Anwendung ..............................................................................................36

2.5.1 Adaption des Mikrodialysesystems ..................................................................36

2.5.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems .....................................37

2.5.3 Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment über die Analyse der

Dialysatproben ................................................................................................37

2.5.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen .....................37

3 Ergebnisse .................................................................................................................39





Inhaltsverzeichnis

III

3.2.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation

verwendeten Gerätes auf die relative Wiederfindung ...............................42

3.2.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative

Wiederfindung ..........................................................................................43

3.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen .............46



3.2.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung ......................51

3.2.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung ...............................52

3.2.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung ....................53

3.2.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung ..............................54

3.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien ..55

3.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell..........57



3.3.1 Adaption des Mikrodialysesystems ..................................................................58



Dialysatproben ................................................................................................60


4 Diskussion .................................................................................................................63





4.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen .............76



4.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien ..87

4.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell..........87

Inhaltsverzeichnis

IV



4.3.1 Adaption des Mikrodialysesystem ...................................................................89



Dialysatproben ................................................................................................91


5 Zusammenfassung ....................................................................................................95

6 Literaturverzeichnis ....................................................................................................99

7 Anhang .................................................................................................................... 115

7.1 Geräteverzeichnis ................................................................................................ 115

7.2 Chemikalienverzeichnis ........................................................................................ 116

7.3 Materialverzeichnis............................................................................................... 117

Publikationen und Kongressbeiträge .................................................................................. 119

Danksagung ....................................................................................................................... 121

Abkürzungsverzeichnis

V


Amoxicillin Amoxicillin-Trihydrat

BCS Biopharmaceutics Classification System

CYP3A4 Cytochrom P450 Enzym 3A4

FaSSIF Fasted State Simulated Intestinal Fluid

FeSSIF Fed State Simulated Intestinal Fluid

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

IMMC Interdigestive Migrating Motor Complex

MP Medicoplast-Schlauch

MRT Magnetresonanztomographie

MW Mittelwert

NaCl-Lösung Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 % Braun Infusionslösung

OFM Mikroperfusion mit offenem Fluss

PEPT1 Peptidtransporter 1

RR Relative Wiederfindung

SD Standardabweichung

SF Skalierungsfaktor

USP Arzneibuch der Vereinigten Staaten von Amerika

VS Versilic®-Schlauch


VI

Einleitung

1

1 Einleitung

Die Applikation von Arzneistoffen ist auf vielen Wegen möglich. Der orale Applikationsweg

wird für die meisten Arzneistoffe bevorzugt, da dieser als weitgehend sicher gilt und die

Herstellung von oralen Darreichungsformen verhältnismäßig kostengünstig ist. Ein weiterer

Vorteil ist die einfache Anwendbarkeit durch den Patienten selbst, die in einer

vergleichsweise hohen Compliance resultiert. Oral applizierte Arzneistoffe können lokal in

der Mundhöhle, im Magen oder Darm wirken und zudem über die Mund- und Darm-

schleimhaut in den systemischen Kreislauf aufgenommen werden. Dabei ist die orale

Bioverfügbarkeit, also die systemisch verfügbare Arzneistoffmenge, das Resultat aus einem

Zusammenspiel von Liberations- und Absorptionsvorgängen. Dieses Zusammenspiel wird

von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Dazu zählen zum einen die anatomischen und

physiologischen Gegebenheiten des Gastrointestinaltraktes und zum anderen die

physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffes und der jeweiligen Formulierung der

Arzneiform. Prinzipiell erfolgt die Aufnahme eines oral verabreichten Wirkstoffes nach

vorheriger Freisetzung aus der jeweiligen Darreichungsform über die Absorption des

gelösten Stoffes aus dem Dünndarm. Für diesen Prozess werden insbesondere die intestinal

vorliegende Arzneistoffkonzentration und der für den Arzneistoff spezifische

Absorptionsprozess als wichtige Größen für das Verständnis der Arzneimittelwirkung

erachtet [1, 2].

Im Folgenden werden die für diese Arbeit relevanten Aspekte der Anatomie und Physiologie

des Gastrointestinaltraktes sowie Kenntnisse über die bisher zur Bestimmung von

Stoffkonzentrationen verwendeten Systeme und Methoden kurz erläutert.

1.1 Ausgewählte Aspekte der Anatomie und Physiologie des Gastrointestinaltraktes

und deren Einfluss auf die Arzneistoffabsorption

1.1.1 Anatomie

Das Verdauungssystem des Menschen besteht aus dem Mund-Rachen-Raum, der

Speiseröhre, dem Magen, dem Dünn- und Dickdarm sowie dem Mastdarm. Der Dünndarm

wird weiter in Duodenum (Zwölffingerdarm), Jejunum (Leerdarm) und Ileum (Krummdarm)

unterteilt. Im tonisierten Zustand hat der Dünndarm eine Gesamtlänge von 250 bis 350 cm

[3, 4] und einen Durchmesser von 1,9 bis 2,5 cm [5]. Das Duodenum stellt den proximalen

Abschnitt mit einer Länge von 20 bis 30 cm dar [3, 4]. Jejunum und Ileum besitzen jeweils

eine Länge von etwa 150 und 200 cm. Der Übergang zwischen beiden

Einleitung

2

Dünndarmabschnitten ist fließend [6]. Eine starke Oberflächenvergrößerung des Dünndarms

um den Faktor 130 wird durch die Faltung der Schleimhaut (Kerckringfalten), durch

fingerförmige Ausstülpungen (Zotten) und Fortsätze an den Enterozyten (Mikrovilli) erreicht

[7]. Da die Anzahl der Kerckringfalten und der Durchmesser in den distalen Bereichen des

Dünndarms abnimmt, verringert sich die verfügbare Absorptionsfläche zum terminalen Ileum

kontinuierlich [5]. Mit einer Gesamtoberfläche von 30 m2 ist der Dünndarm das größte

Absorptionsorgan des menschlichen Körpers [7].

1.1.2 Sekretion

Für die Arzneistoffabsorption ist das zur Verfügung stehende Flüssigkeitsvolumen ein

entscheidender Parameter, da nur gelöster Arzneistoff absorbiert werden kann. Täglich wird

dem Gastrointestinaltrakt ein Flüssigkeitsvolumen von 1,5 bis 2,0 L durch Nahrung und

Getränke zugeführt. Zudem werden im Rahmen der Verdauung über den Tag verteilt

verschiedene Flüssigkeiten in den Verdauungstrakt sekretiert. In Abhängigkeit von der

Nahrungsaufnahme werden bis zu 8 L Speichel, Magensaft, Galle, Pankreas- und

Dünndarmsekret ausgeschüttet [6, 8]. Eine Bilanz ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Gastrointestinaler Flüssigkeitshaushalt [6, 9].

Einleitung

3

Für die verschiedenen Funktionen im Verdauungstrakt sind die einzelnen Flüssigkeiten

unterschiedlich zusammengesetzt. Der Speichel enthält α-Amylase zur Stärkespaltung und

besitzt einen pH-Wert zwischen pH 6,8 und 7,3, dem Wirkoptimum der Amylase [6, 10, 11].

Im nüchternen Magen wurden pH-Werte von pH 1 bis 4 gemessen, die durch den Salzsäure-

anteil im Magensaft bedingt sind [12, 13]. Zum Schutz der Magenschleimhaut werden Muzin

und Hydrogencarbonat-Ionen in den Magen sekretiert. Die Hydrogencarbonat-Ionen werden

in der ungemischten Wasserschicht, die überwiegend aus Muzin besteht und sich direkt auf

der Schleimhaut befindet, festgehalten und bilden somit eine Barriere zum Inhalt des

Magens [6, 14]. Postprandial sind im Magen nahrungsabhängig initial pH-Werte von

durchschnittlich pH 5 bis maximal pH 7 messbar, die mit der Zeit wieder absinken [15]. In

den Dünndarm werden Galle, Pankreas- und Dünndarmsaft sekretiert. Im Dünndarmdarm-

sekret sind vor allem schleimhautschützende Muzine, im Gallensaft Gallensäuren und im

Pankreassekret Verdauungsenzyme (Amylasen, Lipasen und Peptidasen) enthalten. In allen

Sekreten sind Hydrogencarbonat-Ionen zur Neutralisierung der Säure und zur Einstellung

des Wirkoptimums der Verdauungsenzyme zu finden. Zum Schutz der Schleimhaut vor

verdauenden Enzymen und pH-Einflüssen ist ebenfalls die ungemischte Wasserschicht

vorhanden [6]. Im nüchternen Dünndarm werden pH-Werte von pH 6,0 bis 8,0 und

postprandial von pH 5,0 bis 6,5 berichtet [12, 13]. Die sezernierten Gallensäuren können

aufgrund ihrer grenzflächenaktiven Eigenschaften mit Nahrungsfetten Mizellen bilden. Diese

sind für die Absorption der enthaltenen Fettsäuren sowie für die in den Mizellen

inkorporierten fettlöslichen Arzneistoffe relevant [16]. Als Ausgleich zur gastrointestinalen

Sekretion wird Wasser aus dem Dünn- und Dickdarm absorbiert und eine kleine Menge mit

dem Faeces ausgeschieden [6]. Diese Flüssigkeitsbewegungen führen jedoch nicht zur

kompletten Füllung des Dünn- oder Dickdarms mit Wasser.

Bereits 2005 wurde von Schiller et al. mit Hilfe von magnetresonanztomographischen

Untersuchungen entdeckt, dass freies Wasser inhomogen im Darmlumen verteilt ist und in

separaten Flüssigkeitsnestern vorliegt [17]. Das Flüssigkeitsvolumen und die Anzahl der

einzelnen Nester sind dabei vom Füllungszustand des Darmes abhängig. Im nüchternen

Zustand liegt das Gesamtvolumen durchschnittlich bei 105 mL mit einem Medianwert von

12 mL pro Nest. Nach Nahrungsaufnahme ist die Anzahl der Flüssigkeitsnester erhöht, aber

deren Einzelvolumen auf 4 mL verringert und das Gesamtvolumen auf durchschnittlich

54 mL halbiert. Nach der Applikation von nicht zerfallenen Kapseln wurde der Flüssigkeits-

kontakt der Kapseln untersucht. Im nüchternen Zustand wurde die Hälfte der applizierten

Kapseln von Flüssigkeit umgeben vorgefunden. Die übrigen Kapseln befanden sich teilweise

von Flüssigkeit umgeben oder ohne direkten Flüssigkeitskontakt und dabei überwiegend im

Dünndarm. Eine Stunde nach der Nahrungsaufnahme wurden nur einzelne Kapseln im

Einleitung

4

Dünndarm detektiert, die hauptsächlich ohne Flüssigkeitskontakt vorlagen [17]. Die fehlende

intestinale Flüssigkeit kann in einem veränderten Freisetzungsverhalten des Arzneistoffes

aus der Arzneiform und einem veränderten Löslichkeitsverhalten des Arzneistoffes

resultieren. Dies kann zu einer Veränderung der intestinalen Arzneistoffkonzentration

und -absorption führen und damit die orale Bioverfügbarkeit entscheidend beeinflussen.

1.1.3 Motilität und Transitzeiten

Im Nüchternzustand wird die peristaltische Aktivität im Gastrointestinaltrakt durch den

INTERDIGESTIVE MIGRATING MOTOR COMPLEX (IMMC) bestimmt. Dabei handelt es sich um

elektrisch stimulierte Muskelkontraktionen mit variabler Intensität [18]. Der IMMC besteht aus

vier Phasen, die sich regelmäßig wiederholen und eine Gesamtdauer von durchschnittlich

2 h aufweisen [18, 19]. Die Phase I ist durch eine geringe Muskelaktivität gekennzeichnet

(30 bis 60 min). Während der Phase II treten für 30 bis 45 min unregelmäßig Kontraktionen

im Gastrointestinaltrakt auf [20]. Diese Phase endet abrupt durch das Auftreten von

rhythmischen Kontraktionen der Muskulatur in der Phase III. Die motorischen Bewegungen

der Phase III werden HOUSEKEEPER WAVES genannt, da der betreffende Abschnitt des

Gastrointestinaltraktes innerhalb von 5 bis 15 min von Nahrungsresten, unverdaulichen

Objekten und Bakterienansammlungen bereinigt wird [18, 20]. Die gastrointestinale

Reinigung wird durch die Sekretion von verschiedenen Verdauungssäften, wie Magensaft,

Galle und Pankreassekret, unterstützt [19]. Die leichten Muskelkontraktionen der Phase IV

(5 min) bilden den Übergang zur Phase I und damit dem Neubeginn des IMMC [20]. Ihren

Ursprung haben die Kontraktionen des Gastrointestinaltraktes im Bereich der Speiseröhre,

des Magens oder des proximalen Dünndarms [18, 21]. Danach wandern die

Kontraktionswellen zyklisch bis zum terminalen Ileum [19]. Die Häufigkeit der Kontraktionen

verringert sich in distalen Bereichen [21, 22].

Durch Nahrungsaufnahme wird der IMMC im gesamten Gastrointestinaltrakt abrupt gestoppt.

Im Magen setzten infolgedessen Kontraktionen ein, die der Phase II des IMMC entsprechen

und im Dünndarm treten unregelmäßige stationäre und propulsive Kontraktionen auf [22, 23].

Die stationären Bewegungen (nicht propulsive Peristaltik, Segmentation und

Pendelbewegungen) im Dünndarm führen zur Durchmischung des Darminhaltes und

ermöglichen damit eine erhöhte Absorption von Stoffen durch die verlängerte Kontaktzeit zur

Schleimhaut. Der Transport des Darminhaltes in distale Abschnitte wird durch die

propulsiven Bewegungen ermöglicht [6].

Die Magenentleerung kann nicht nur durch feste Nahrung verzögert werden, sondern auch

durch kalorische Flüssigkeiten [24]. Die Magenentleerungsrate ist unter anderem von deren

Einleitung

5

Zusammensetzung und Kaloriengehalt abhängig [20, 25-27]. Applizierte Arzneimittel werden

in Abhängigkeit von der Art und Zusammensetzung der Arzneiform nach wenigen Minuten

oder mehreren Stunden aus dem postprandialen Magen entleert [28].

Für den Dünndarm wurden konstante Transitzeiten zwischen 3 und 4 h für die

aufgenommene Nahrung publiziert [28-30]. Dieser Zeitraum wurde ebenfalls für den

postprandialen Transport von Arzneimitteln im Dünndarm bestätigt, wobei inter- und intra-

individuelle Schwankungen zu verzeichnen sind [30]. Die Beschaffenheit der Arzneiform und

der Füllungszustand des Magens haben demnach keinen Einfluss auf die intestinale Transit-

zeit [28]. Bei gesunden Probanden wurde zudem kein Einfluss des Alters ermittelt [29].

1.1.4 Arzneistoffabsorption

Es wird davon ausgegangen, dass nur gelöster Arzneistoff aus dem Dünndarmlumen

aufgenommen wird. Nach der Diffusion des Arzneistoffes zur Intestinalschleimhaut stehen

verschiedene Mechanismen zur Absorption zur Verfügung, die auch gleichzeitig genutzt

werden können. Bis zum Ende des 20. Jahrhunderts wurde der passive Transport durch

Diffusion als Hauptabsorptionsmechanismus für Arzneistoffe angenommen [31, 32]. Dabei ist

sowohl eine parazelluläre als auch eine transzelluläre Aufnahme der Arzneistoffe durch

Diffusion möglich. Die Diffusion ist eine dem Konzentrationsgradienten folgende Bewegung

gelöster Teilchen welche mit dem 1. FICK‘SCHEN GESETZ beschrieben werden kann [33, 34]:

𝐽 = −𝐷𝑑𝑐

𝑑ℎ (Gleichung 1).

Es besagt, dass der Diffusionsstrom (J) über eine definierte Fläche dem

Konzentrationsgradienten (dc/dh) und dem Diffusionskoeffizienten (D) direkt proportional ist.

Der Diffusionskoeffizient kann für runde Partikel mit der STOKES-EINSTEIN-GLEICHUNG

berechnet werden [35, 36]:

𝐷 =𝑅𝑇

6𝜋𝜂𝑟𝑁𝐴 (Gleichung 2).

In diese Gleichung gehen die Gaskonstante (R), die Temperatur (T), die Viskosität (η), der

Radius (r) und die Avogadrokonstante (NA) ein. Der Transport von kleinen hydrophilen

Einleitung

6

Molekülen kann parazellulär durch Poren mit dem Wasserstrom erfolgen, welches auch

SOLVENT DRAG PHENOMENON genannt wird [37, 38]. Zur transzellulären Diffusion durch die

lipophilen Zellmembranen benötigt der Arzneistoff eine gewisse Lipophilie [32], die bei

ungeladenen Stoffen stärker ausgeprägt ist als bei geladenen Stoffen.

In den letzten zwei Dekaden wurden zusätzlich viele intestinale Transporter identifiziert, die

das Ausmaß der Absorption von Arzneistoffen beeinflussen können [31, 32]. Dabei wird

zwischen dem erleichterten und dem aktiven Transport von Stoffen unterschieden. Während

der erleichterte Stofftransport durch einen Transporter entlang des Konzentrationsgradienten

vermittelt wird, erfolgt der aktive Transport unter Verwendung von Energie entgegen des

Konzentrationsgradienten. In der Literatur sind sowohl Aufnahme- als auch Effluxtransporter

für den Dünndarm beschrieben worden. Dabei wurde für einige Transporter eine

regioselektive Verteilung entlang des Darmes nachgewiesen. Für den Peptidtransporter 1

(PEPT1), einem Aufnahmetransporter für Di- und Tripeptide aus der Nahrung sowie für

peptidmimetische Arzneistoffe, wie ß-Lactam-Antibiotika (Amoxicillin, Cefadroxil), ACE-

Hemmer (Captopril, Enalapril und Fosinopril) und Virustatika (Valaciclovir und Oseltamivir)

wurde die Lokalisation anhand von mRNA-Expressionsdaten untersucht [39]. Vom

Duodenum zum Colon wurde ein abnehmendes Vorkommen des Transporters beschrieben

[39-42]. Für das Duodenum, Jejunum und Ileum konnten diese Daten mit Hilfe von

Proteinuntersuchungen bestätigt werden [40]. Es konnte bereits bestätigt werden, dass eine

erhöhte Absorption von Oligopeptiden in proximalen Darmabschnitten erfolgt, sodass von

einem Absorptionsfenster im oberen Dünndarm gesprochen werden kann [43, 44]. Für den

Effluxtransporter ABCB1, besser bekannt als P-Glycoprotein, konnte auf mRNA- und

Proteinebene eine zunehmende Verteilung in den distalen Bereichen des Darms

nachgewiesen werden [39, 40, 45-47]. Dies erklärt die verringerte Absorption von

Arzneistoffen wie Talinolol in distalen Darmabschnitten, da diese durch den ABCB1-

Transporter aus der Zelle zurück in das Lumen transportiert werden [48, 49].

Metabolisierende Enzyme, die in der Darmwand lokalisiert sind, können ebenfalls im distalen

Darmabschnitt verstärkt oder vermindert vorkommen, oder über den gesamten Bereich

gleichmäßig lokalisiert sein. Für das Cytochrom P450 Isoenzym 3A4 (CYP3A4) wurde eine

Abnahme des Vorkommens in distalen Bereichen des Darms ermittelt. Das erhöhte

Vorkommen an CYP3A4 in oberen Dünndarmabschnitten [50] kann zu einer verstärkten

Biotransformation und damit zu einer verringerten Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen, wie

zum Beispiel Simvastatin, in proximalen Bereichen führen [51]. Die oben genannten

Beispiele verdeutlichen somit, dass das intestinale Vorkommen von Transportern und

Enzymen eine effektive Absorptionsbarriere darstellen kann und somit die orale

Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen verringern kann.

Einleitung

7

1.2 Einfluss der physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffes und der

Arzneiform auf die Arzneistoffabsorption

1.2.1 Physikochemische Eigenschaften des Arzneistoffes

Die physikochemischen Eigenschaften eines Arzneistoffes können die intestinale Absorption

und damit dessen orale Bioverfügbarkeit beeinflussen. Dies ist vor allem für passiv

transportierte Arzneistoffe von Bedeutung, da dieser Prozess unter anderem durch die

Arzneistoffeigenschaften Molekulargewicht, Lipophilie, Löslichkeit und Ladung bestimmt

wird.

Der Zusammenhang zwischen der Lipophilie und der Aufnahme von Stoffen durch eine

Lipidmembran wurde bereits 1899 von Overton beschrieben [52]. Nachfolgende Arbeiten

zeigten, dass der Einfluss des Molekulargewichtes und der Ladung ebenfalls berücksichtigt

werden muss [53, 54]. Die Beeinflussung der Absorption durch den Ionisierungsgrad des

Stoffes kann anhand der HENDERSON-HASSELBALCH-GLEICHUNG beschrieben werden, die

hier für Säuren dargestellt ist [54]:

𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log𝑐𝑖𝑜𝑛𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑡

𝑐𝑢𝑛𝑖𝑜𝑛𝑖𝑠𝑖𝑒𝑟𝑡 (Gleichung 3).

Nach der HENDERSON-HASSELBALCH-GLEICHUNG gibt der pKa-Wert eines Stoffes an, bei

welchem pH-Wert die Hälfte des ionisierbaren Arzneistoffes geladen vorliegt. Geladene

Arzneistoffe sind im Allgemeinen besser wasserlöslich, aber schlechter permeabel als die

lipophilere ungeladene Form des Arzneistoffes. Durch den pKa-Wert des Stoffes und den pH-

Wert des Mediums sind somit dessen Lipophilie und Löslichkeit als Einflussfaktoren für die

Absorption festgelegt. Die Kenntnis des pH-Verlaufes im Gastrointestinaltrakt ermöglicht es

dementsprechend Voraussagen zur Löslichkeit eines Arzneistoffes in den betreffenden

Abschnitten des Verdauungstraktes zu treffen, wenn keine weiteren Einflussfaktoren, wie der

Einschluss des Arzneistoffes in Gallensalzmizellen, auftreten. Zusätzlich kann die intestinale

Permeabilität abgeschätzt werden, wenn die Diffusion den Hauptabsorptionsmechanismus

darstellt.

Lipinski et al. haben für den Zusammenhang zwischen physikochemischen Eigenschaften

eines Arzneistoffes und dessen Absorption über passiven Transport eine als RULE OF FIVE

bekannte Regel aufgestellt [55]. Es handelt sich dabei um eine Sammlung von Faktoren, die

die Wahrscheinlichkeit einer verringerten Absorption eines Arzneistoffes im Gastrointestinal-

trakt erhöhen. Dazu zählen ein Molekulargewicht über 500 Da und ein LogP-Wert über 5. Für

Einleitung

8

Stoffe mit mehr als fünf Donatoren und mehr als zehn Akzeptoren von Wasserstoffbrücken,

wird ebenfalls eine verringerte Absorption vorausgesagt, da dies den Transport durch die

lipophilen Membranen hemmt. Als Ausnahme von der Regel werden die Stoffe angesehen,

die Substrate für Transporter sind [55], da hier der passive Transport eine untergeordnete

Rolle bei der Absorption einnimmt.

1.2.2 BCS-Klassifizierung des Arzneistoffes und dessen Einfluss auf die Formulierung der

Arzneiform

Von Amidon et al. wurden die Parameter Löslichkeit und Permeabilität vorgeschlagen, um

das In vivo-Verhalten von Arzneistoffen vorherzusagen [56]. Dafür wurde das

BIOPHARMACEUTICS CLASSIFICATION SYSTEM (BCS) entwickelt. Bei dieser Klassifizierung

werden die Arzneistoffe in Abhängigkeit von ihrer Löslichkeit in Wasser und ihrer intestinalen

Permeabilität in die BCS-Klassen I bis IV eingeteilt (Abbildung 2).

Abbildung 2: Biopharmaceutics Classification System [56].

Für Arzneistoffe mit hoher Löslichkeit und hoher Permeabilität (BCS-Klasse I), hat die

Formulierung der Arzneiform gewöhnlich einen geringen Einfluss auf das In vivo-Verhalten

der Substanz. Bei Stoffen der Klasse II limitieren Ausmaß und Geschwindigkeit der

Freisetzung aus der Arzneiform die Absorption des Arzneistoffes. Dies ist mit Problemen

bezüglich der Löslichkeit oder Lösungsgeschwindigkeit zu erklären. Durch den Zusatz von

Tensiden oder Komplexbildnern, wie zum Beispiel Cyclodextrinen, kann eine Optimierung

der Löslichkeit erreicht werden. Die Verringerung der Teilchengröße kann in einer erhöhten

Lösungsgeschwindigkeit resultieren, wenn dabei keine Aggregate gebildet werden. Die

Permeation ist der kritische Schritt bei der Aufnahme von Arzneistoffen der BCS-Klasse III in

den systemischen Kreislauf. Bei Vorliegen linearer Absorptionsprozesse kann die absolut

Einleitung

9

aufgenommene Arzneistoffmenge erhöht werden, indem die zur Verfügung gestellte Dosis

erhöht wird. Die Arzneistoffe der Klasse IV sind durch eine geringe Löslichkeit und geringe

Permeabilität gekennzeichnet. Um die Eigenschaften dieser Stoffe hinsichtlich der

Absorption zu optimieren, können die bisher beschriebenen Maßnahmen angewendet

werden. Eine reduzierte interindividuelle Bioverfügbarkeit der Arzneistoffe der Klasse IV kann

ebenfalls mit diesen Maßnahmen erreicht werden [57, 58].

Als Besonderheiten einer negativen Beeinflussung der Absorption gelten die Bildung von

unlöslichen Komplexen mit Bestandteilen des Gastrointestinaltraktes, zum Beispiel die

Komplexbildung von Fluorchinolonen und Metallionen, die Instabilität des Arzneistoffes im

Gastrointestinaltrakt, zum Beispiel die Degradation von Erythromycin durch Magensäure

oder die enzymatische Hydrolyse von Peptiden und Proteinen [56, 58].

1.3 Prinzipien der Untersuchung der intestinalen Arzneistoffabsorption

Die Untersuchung von intestinalen Absorptionsprozessen kann über direkte und indirekte

Methoden erfolgen. In beiden Fällen wird ein Arzneistoff an verschiedenen Orten des

Gastrointestinaltraktes in das Lumen eingebracht. Für die Bestimmung der Arzneistoff-

absorption mit der indirekten Methode wird anschließend das Auftreten des Stoffes in der

systemischen Zirkulation über die Erstellung von Blutspiegel- und/oder Urinausscheidungs-

kurven erfasst. Bei Nutzung der direkten Methode wird das Verschwinden des Arzneistoffes

aus dem Darmlumen über die Gewinnung und Quantifizierung von Aspirationsproben

bestimmt [59]. Zur besseren Charakterisierung der Absorptionsprozesse können beide

Methoden auch kombiniert werden.

1.3.1 Indirekte Methoden

Zu den indirekten Methoden zählt die nicht invasive Applikation von modifizierten

Arzneiformen, wie zum Beispiel Tabletten und Kapseln. Je nach Freisetzungsprinzip, zum

Beispiel durch Änderung des pH-Wertes oder bakteriellen Abbau, wird die Freigabe des

Arzneistoffes im Bereich des Dünn- oder Dickdarmes erreicht [60]. Zudem besteht die

Möglichkeit Kapseln mit einem Arzneistoffreservoir zu verabreichen. In Abhängigkeit vom

Kapseltyp kann der Arzneistoff als Lösung, Pulver, Granulat oder Minitablette formuliert in

der Kapsel vorliegen. Die Bestimmung der intestinalen Lokalisation der Kapsel erfolgt

hauptsächlich mit konventionellen Verfahren wie der Fluoroskopie oder Szintigraphie. Nach

Erreichen des vorgesehenen Ortes im Gastrointestinaltrakt erfolgt die Freigabe des

gesamten Kapselinhaltes durch Radiowellen oder magnetische Wechselwirkungen [61]. Von

Einleitung

10

Gröning et al. wurde eine Kapsel entwickelt, die den Arzneistoff über Radiowellen gesteuert

zu unterschiedlichen Zeiten freigeben kann [62].

Den indirekten Methoden wird weiterhin die minimalinvasive Applikation einer Kapsel mit

anhängender einlumiger Sonde zugeordnet. Nachdem die Kapsel oral appliziert wurde, kann

die erreichte Position im Gastrointestinaltrakt durch Befestigung der Sonde im

Wangenbereich des Probanden beibehalten werden. Die Lokalisation im Gastrointestinaltrakt

wird über die applizierte Sondenlänge bestimmt. Dieses System kann sowohl für die

einmalige Applikation von Pulvern oder Pellets als auch für die mehrmalige Applikation von

Lösungen verwendet werden. Dabei können Arzneistofflösungen zeitversetzt an

unterschiedlichen Orten im Gastrointestinaltrakt verabreicht werden, nachdem die Kapsel

über die natürliche Peristaltik zum nächsten Untersuchungsort transportiert wurde. Die

Bestimmung der regionalen Absorption von Arzneistoffen kann mit diesem System jedoch

nur über die Interpretation von Plasmakonzentrationen erfolgen [63].

1.3.2 Direkte Methoden

Die invasive Applikation von mehrlumigen Sonden kann zur direkten Bestimmung der intra-

luminalen Stoffkonzentration genutzt werden. Anfang des 20. Jahrhunderts wurden diese

Systeme zur Bestimmung der Zusammensetzung intraluminaler Flüssigkeiten verwendet

[64]. Die regiospezifische Absorption von Wasser und Nährstoffen, wie Glucose, Proteine

und Fette, wurde ebenfalls bestimmt [65]. Später rückte die Bestimmung der Arzneistoff-

absorption in den Vordergrund [59, 66, 67]. Dabei wurden verschiedene Sonden zur

Untersuchung der Absorption von Arzneistoffen verwendet (Abbildung 3). Bei allen Varianten

wird eine Öffnung der Sonde (Perfusionsport) genutzt, um ein definiertes Darmsegment mit

einer Länge von 10 bis 45 cm mit einer Arzneistofflösung zu perfundieren [68-70].

Einleitung

11

Abbildung 3: Schematische Darstellung verschiedener Sondentypen.

Die Aspiration von Proben (Aspirationsport) erfolgt dann an einer (zweilumige Sonde) oder

mehreren Stellen (drei- und mehrlumige Sonden), wobei die Absorption nur für das definierte

Darmsegment bestimmt werden kann. Für die Untersuchung eines weiteren Darm-

abschnittes ist der Weitertransport des Systems durch die natürliche Peristaltik oder ein

erneutes Applizieren des Systems nötig. Das perfundierte Darmsegment kann durch einen

aufblasbaren Ballon am proximalen Ende oder durch zwei aufblasbare Ballons am

proximalen und distalen Ende vom restlichen Darm abgeschirmt werden. Der Einfluss der

aufblasbaren Ballons auf die Absorption wurde in verschiedenen Studien untersucht. Dabei

wurde kein Unterschied zwischen der Verwendung von Systemen mit aufgeblasenem oder

nicht aufgeblasenem Ballon festgestellt. Weiterhin wird die Physiologie des

Verdauungstraktes kaum durch die applizierten Sonden beeinflusst. Durch den Einsatz von

nicht resorbierbaren Markersubstanzen, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, konnte eine

Verbesserung der Genauigkeit der Methode erreicht werden [59, 69, 71-74]. Als kritisch sind

jedoch die angewendeten Flussraten zu betrachten. Die kontinuierliche Perfusion der

Darmsegmente mit Flussraten von bis zu 20 mL/min kann zu einer Dehnung des Darmes

Einleitung

12

führen [66, 75]. In Abhängigkeit von der Flussrate können somit die Peristaltik und die

Durchblutung verändert werden. Der veränderte intestinale Transport kann die Lokalisation

des Arzneistoffes beeinflussen und damit dessen gemessene regionale Konzentration. Eine

Beeinflussung der intestinalen Blutzirkulation kann die natürliche Funktion des Darmes und

damit auch die Absorption des Arzneistoffes beeinträchtigen [71, 76]. Zusätzlich kann der

intestinale Wasserhaushalt durch die kontinuierliche Perfusion verändert werden. Die

einzelnen Flüssigkeitsnester im Dünndarm, die im nüchternen Zustand vorhanden sind [17],

werden durch größere Volumina der Perfusionslösung ersetzt. Damit ändern sich auch die

intraluminalen Bedingungen am Ort der Absorption.

Von Brouwers et al. wurde die Perfusion eines Darmsegments durch die orale Applikation

einer Arzneiform mit Wasser ersetzt [74]. Zur direkten Bestimmung der Arzneistoff-

konzentration im Dünndarm wurden zwei unabhängig voneinander arbeitende Sonden im

Duodenum und Jejunum platziert. Mit diesem Studiendesign konnte der Einfluss der

Freigabecharakteristik der Arzneiform im Zusammenhang mit den dynamischen

Bedingungen im Gastrointestinaltrakt untersucht werden. Die Aspiration von Proben erfolgte

in diesem Fall gleichzeitig im Duodenum und Jejunum. Die aspirierten Probenvolumina

variierten zwischen 0 und 10 mL, sodass der intestinale Wasserhaushalt ebenfalls

beeinflusst wurde [74].

1.4 Verwendung der Mikroperfusion mit offenem Fluss zur Bestimmung von

Stoffkonzentrationen

Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen, ist die Mikroperfusion

mit offenem Fluss (OFM) [77-79]. Bisher wurde diese Technik beim Menschen in der Haut

sowie beim Tier im Gehirn angewendet. Ein OFM-System besteht aus einer Sonde mit

makroskopischen Öffnungen und zwei angeschlossenen Pumpen im PUSH-PULL-Modus

(Abbildung 4). Das Perfusat wird dabei durch das System gepumpt und die Proben werden

mit der gleichen Flussrate aus dem System entfernt. Dabei ist auf die Einstellung und

Beibehaltung einer konstanten Flussrate für beiden Pumpen zu achten. Das System wird

kontinuierlich mit einer geringen Flussrate von 0,25 bis 2 µL/min perfundiert, sodass Proben

über einen längeren Zeitraum von 1 bis 2 h gesammelt werden, insofern sie nicht sofort

online analysiert werden. Die Entfernung der gewonnen Proben aus dem System ist ohne

Beeinflussung des PUSH-PULL-Modus der Pumpen durchzuführen.

Einleitung

13

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus Mikroperfusion mit offenem Fluss

(aus [78]).

Im Vergleich zur Mikrodialyse fehlt bei diesen Sonden eine Membran, durch die der

Stoffaustausch vonstattengeht. Stattdessen sind makroskopische Öffnungen zum

Stoffaustausch durch Konvektion vorhanden. Dadurch können größere oder lipophilere

Moleküle, wie zum Beispiel Proteine, aus dem Donor-Kompartiment in die Proben überführt

und später analysiert werden. Ein großer Nachteil ist allerdings die aufwändige

Vorbehandlung der gewonnenen Proben, zum Beispiel durch Flüssig-Flüssig-Extraktion, und

die Analyse der Zielmoleküle mit speziellen Methoden wie der SPE-MS/MS (Festphasen-

extraktion mit Tandem-Massenspektrometer) oder LC-MS/MS (Flüssigkeitschromatographie

mit Tandem-Massenspektrometer) [78, 80]. Dieser Aufwand ist für die Untersuchung der

Stoffkonzentration gerechtfertigt, wenn alternative Techniken, wie zum Beispiel die

Mikrodialyse, zur Probengewinnung nicht eingesetzt werden können.

1.5 Verwendung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen

Die Mikrodialyse ist eine Technik, mit der geringe Konzentrationen eines ungebundenen

Stoffes in Geweben und Organen bestimmt werden können. Grundlage ist der

Stoffaustausch durch eine semipermeable Membran ohne Beeinflussung der beteiligten

Flüssigkeitsvolumina. Die Molekülmassen-Ausschlussgrenze der Membran bezeichnet dabei

die Molekülmasse von Stoffen, die zu 90 % von der Membran zurückgehalten werden, das

Einleitung

14

heißt die Membran nicht passieren können. Ein Stoff mit einer entsprechend geringen

Molekülmasse kann somit aus dem Donor-Kompartiment, zum Beispiel der interstitiellen

Flüssigkeit, in das Akzeptor-Kompartiment, das Perfusat, diffundieren bis sich ein

Gleichgewicht eingestellt hat. Das Perfusat wird nach Passage der semipermeablen

Membran als Dialysat aufgefangen. Im Allgemeinen wird die Perfusionsflüssigkeit mit

Flussraten zwischen 0,1 und 5,0 µL/min kontinuierlich durch das System transportiert [81,

82]. Die verwendeten Flussraten bedingen ein geringes Probenvolumen des Dialysats und

entsprechend große Zeitabstände, um diese Volumen aufzufangen.

1974 erfolgte von Ungerstedt und Pycock der erste Einsatz der Mikrodialyse zur Bestimmung

des Neurotransmitters Dopamin im Gehirn von Ratten [83]. Dabei wurde eine einzelne

Hohlfaserkapillare mit einem Außendurchmesser von 0,25 mm implantiert und kontinuierlich

perfundiert. Der verwendete Aufbau entspricht der Darstellung in Abbildung 5. Die Stabilität

dieser einzeln verwendeten Hohlfaserkapillaren konnte durch einen sehr dünnen, in das

Lumen der Kapillare eingebrachten, Draht erhöht werden [84]. Somit konnte der Einsatz

ebenfalls in weichen, beweglichen Gewebestrukturen wie der Darmwand erfolgen.

Abbildung 5: Einzelne Hohlfaserkapillare (schraffiert) mit angebrachten Schläuchen (aus [85]).

Später wurden häufig Mikrodialysesonden mit definierter Geometrie (konzentrisches oder

lineares Sondendesign, Abbildung 6), Membrandurchmessern und -längen, eingesetzt [81,

86]. Die ersten Mikrodialysesonden mit konzentrischem Design wiesen einen Außen-

durchmesser von 0,5 mm und eine Membranlänge von 2, 4 oder 10 mm auf [87]. Heutzutage

sind Mikrodialysesonden mit Membranaußendurchmessern von 0,24 bis 0,5 mm und

Membranlängen von 1 bis 10 mm kommerziell erhältlich. Dabei sind verschiedene

Membranmaterialien, wie zum Beispiel Cuprophan, Polyarylethersulfon, Polyethersulfon und

Polyacrylnitril verfügbar. Konzentrische Mikrodialysesonden weisen den Vorteil auf, dass sie

über einen einzelnen Zugang im Gehirn, in Blutgefäßen oder in Organen platziert werden

können. Die geringe Flexibilität dieses Sondentyps führt zu einer hohen mechanischen

Stabilität, sodass eine präzise Sondenplatzierung erfolgen kann [88]. Mikrodialysesonden mit

linearem Design sind mit Cuprophan-, Polyethersulfon und Polyacrylnitrilmembranen und

einer Membranlänge von 5 bis 10 mm im Handel erhältlich. Sie werden aufgrund ihres

flexiblen Designs vorwiegend in peripheren Geweben angewendet. Da für diesen Sondentyp

Einleitung

15

ein Ein- und Austritt aus dem Gewebe erfolgt, kann der Untersuchungsort bei der

Implantation genau festgelegt werden [88].

Abbildung 6: Mikrodialysesonden, A: konzentrisches Design, B: lineares Design (aus [89]).

Über die Jahre etablierte sich die Mikrodialysetechnik in der Grundlagenforschung zur

Bestimmung von endogenen Stoffen, wie Adrenalin, Acetylcholin, Histamin, Lactat und

Pyruvat [90-93]. Die Methode wurde nicht nur in verschiedenen Tieren wie zum Beispiel

Raten, Schweinen und Pferden, sondern auch am Menschen eingesetzt [90-92, 94]. Dabei

wurden diverse Gewebe und Organe wie der Dünndarm, das Gehirn, das Herz und die

Lunge untersucht [85]. Die humane Anwendung der Mikrodialyse erfolgte unter anderem, um

die Konzentrationen oral oder intravenös verabreichter Arzneistoffe in der Haut, dem Wirkort

der Substanzen, zu bestimmen [95, 96]. Gemessene Blutspiegelkurven weisen in diesen

Fällen nur eine geringe Korrelation mit der Arzneistoffkonzentration in der Haut auf und damit

mit dessen Wirkung.

Der Gastrointestinaltrakt wurde bereits in Tierstudien mit der Technik der Mikrodialyse

untersucht. Bei Schweinen wurden gewebespezifische metabolische Veränderungen des

Verdauungstraktes mit dieser Technik bestimmt. Dafür wurden die Mikrodialysesonden nach

der Laparotomie mit oder ohne Nadel in der Darmwand oder im Lumen platziert [84, 97]. Zur

Untersuchung der metabolischen Veränderungen des humanen Gastrointestinaltraktes

wurde ebenfalls die intraperitoneale Mikrodialyse genutzt [98, 99]. Die intraperitoneale und

intraluminale Mikrodialyse wurde simultan von Pynnönen et al. in einer Studie am Menschen

angewendet [100]. Dabei wurden die intraluminalen Mikrodialysesonden im Rahmen einer

A B

Einleitung

16

Duodenopankreatektomie durch einen Schnitt in der Darmwand verlegt. Die Notwendigkeit

intraluminale, intramukosale oder intraperitoneale Mikrodialysesonden mit chirurgischen

Maßnahmen am Untersuchungsort zu platzieren, resultiert jedoch in einer fehlenden breiten

humanen Anwendung der Mikrodialysetechnik.

1.6 Zielstellung

Das Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Entwicklung und In vitro-

Charakterisierung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems zur Ermittlung von

Arzneistoffkonzentrationen im Dünndarmlumen des Menschen, mit dessen Hilfe die

komplexen Abläufe, die im Rahmen der intestinalen Absorption von Arzneistoffen auftreten,

untersucht werden können.

Das Mikrodialysesystem sollte unter Berücksichtigung der bisher für diesen Zweck

verwendeten Systeme entwickelt werden. Grundlegende Anforderungen waren Flexibilität

und Robustheit des Schlauchsystems, verbunden mit minimalen Durchmessern des

Gesamtsystems. Zudem sollte bei der Auswahl der Materialien darauf geachtet werden, dass

biokompatible Materialen, die gegenüber körpereigenen Stoffen des Gastrointestinaltraktes

und den eingesetzten Arznei- und Hilfsstoffen inert sind, eingesetzt werden und die

kombinierte Anwendung des Systems mit bildgebenden Verfahren, wie beispielsweise der

Magnetresonanztomographie (MRT), gewährleistet werden kann. Intestinale Proben sollten

innerhalb sehr kurzer Zeitabstände mit einem ausreichend großen Volumen und möglichst

ohne Verunreinigung durch vorherige oder nachfolgende Proben gewonnen und quantifiziert

werden. Zur gleichzeitigen Erfassung der lokalen Arzneistoffkonzentration an verschiedenen

Orten sollte das System mehrere Messstellen enthalten. Bei der Entwicklung sollte

außerdem darauf geachtet werden, dass der intestinale Wasserhaushalt nicht beeinträchtigt

wird. Weitere Anforderungen stellten die Reproduzierbarkeit der Herstellung der

Mikrodialysesysteme und der damit bestimmten Ergebnisse dar.

Im Anschluss an die Entwicklung sollte das Mikrodialysesystem umfangreich in vitro

charakterisiert werden. Zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des Versuchsablaufes

sollten der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten

Gerätes sowie der Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung des

Arzneistoffes im Dialysat bestimmt werden. Anschließend sollte die Sensitivität des

Mikrodialysesystems hinsichtlich der quantitativen Arzneistoffbestimmung ermittelt werden.

In weiterführenden Untersuchungen sollte dann der Einfluss der Nutzungsdauer eines

einzelnen Mikrodialysesystems, des Donor-Mediums und des Perfusats auf die relative

Einleitung

17

Wiederfindung ermittelt werden. Abschließend sollte die Sensitivität des Systems unter

Verwendung biorelevanter Bedingungen untersucht werden.

Um die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen zu ermöglichen, sollte in einem

weiteren Schritt eine Adaption des Systems an die humanen Gegebenheiten erfolgen.

Hierbei lag der Fokus hauptsächlich auf der Anpassung der Größe des Mikrodialysesystems

an die humanen Gegebenheiten. Anschließend sollte die Funktionsfähigkeit des adaptierten

Mikrodialysesystems hinsichtlich der Reproduzierbarkeit der Herstellung und des Einflusses

der verwendeten Materialien überprüft werden. Weiterhin sollte untersucht werden, inwieweit

der pH-Wert im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben abgebildet werden kann.

Abschließend stellte sich zudem die Frage, ob die Pumpen der Firma Braun, die zur

Anwendung am menschlichen Körper zugelassen sind, für die Verwendung mit dem

Mikrodialysesystem geeignet sind.

Mit der Entwicklung, Adaption und In vitro-Charakterisierung des Mikrodialysesystems sowie

der Identifizierung von geeigneten Pumpen sollte letztlich ein einsatzfertiges System zur

Bestimmung von intestinalen Arzneistoffkonzentrationen im Menschen zur Verfügung

stehen.

Einleitung

18

Material und Methoden

19

2 Material und Methoden

Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Geräte, Chemikalien und Materialien inklusive

ihrer jeweiligen Bezugsquellen sind im Anhang tabellarisch aufgeführt (Abschnitt 7.1 bis 7.3).

2.1 Arzneistoffe und Medien

2.1.1 Arzneistoffe

Die physikochemischen Eigenschaften der verwendeten Arzneistoffe Paracetamol,

Amoxicillin-Trihydrat (Amoxicillin) und Valsartan sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Tabelle 1: Eigenschaften der Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan.

Eigenschaften Paracetamol Amoxicillin-Trihydrat Valsartan

Molekulargewicht 151,2 g/mol

[101]

419,4 g/mol

[101]

435,5 g/mol

[101]

pKa-Wert 9,56

[102]

2,67, 7,11 und 9,55

[103]

3,9 und 4,73

[104]

Löslichkeit in

Wasser

14,7 g/L (20 °C)

23,7 g/L (37 °C)

[105]

4,49 g/L (20 °C)

5,45 g/L (37 °C)

[103]

0,12 g/L bei pH 2,3 (20 °C)

0,71 g/L bei pH 8,4 (20 °C)

[106]

BCS-Klasse I und III

[105, 107]

III

[108]

III

[107]

Chemische

Struktur

3 H2O


20

2.1.2 Medien und Arzneistofflösungen

Zur Prüfung des Mikrodialysesystems wurden verschiedene Medien als Lösungsmittel für

den jeweiligen Arzneistoff genutzt. Dabei fanden Phosphatpuffer pH 6,8 USP und Salzsäure

pH 1,2 Anwendung. Um den Einfluss biorelevanter Medien zu untersuchen, wurden ein

Bicarbonatpuffer pH 6,8, angelehnt an die Zusammensetzung der aspirierten humanen

Dünndarmflüssigkeit nach Lindahl et al. [109], Fasted State Simulated Intestinal Fluid

(FaSSIF) und Fed State Simulated Intestinal Fluid (FeSSIF) als Lösungsmittel eingesetzt. Als

Perfusionsmedien wurden Phosphatpuffer pH 6,8 USP und Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 %

Braun Infusionslösung (NaCl-Lösung) verwendet. Der pH-Wert der NaCl-Lösung wurde bei

Bedarf mit Natriumhydroxid-Lösung beziehungsweise Salzsäure auf den entsprechenden

pH-Wert eingestellt. Zur Verdünnung der Proben, die FaSSIF und FeSSIF als Lösungsmittel

enthielten, wurden die gallensalzfreien Medien blank FaSSIF und blank FeSSIF verwendet.

Die detaillierte Zusammensetzung der verwendeten Puffer und biorelevanten Medien ist in

den Tabellen 2 und 3 dargestellt.

Tabelle 2: Zusammensetzung des Phosphatpuffers pH 6,8 USP [110] und des Bicarbonatpuffers

pH 6,8.

Phosphatpuffer pH 6,8 USP

Kaliumdihydrogenphosphat, wasserfrei 6,805 g

0,2 M Natriumhydroxid-Lösung 112 mL

Gereinigtes Wasser ad 1000,0 mL

Bicarbonatpuffer pH 6,8

Natriumchlorid 2,66 g

Kaliumchlorid 0,66 g

Calciumchlorid-Dihydrat 0,047 g

0,001 M Salzsäure ad 1000,0 mL

Natriumchlorid-Lösung, gesättigt 16,66 mL

Natriumhydrogencarbonat-Lösung, gesättigt q.s. ad pH 6,8


21

Tabelle 3: Zusammensetzung von FaSSIF, blank FaSSIF, FeSSIF und blank FeSSIF [111].

FaSSIF blank FaSSIF FeSSIF blank FeSSIF

SIF® Powder Original* 2,24 g - 11,2 g -

Natriumdihydrogen-

phosphat-Monohydrat 3,95 g 3,95 g - -

Eisessig - - 8,65 g 8,65 g

Natriumchlorid 6,19 g 6,19 g 11,874 g 11,874 g

Natriumhydroxid q.s. ad pH 6,5 q.s. ad pH 6,5 q.s. ad pH 5,0 q.s. ad pH 5,0

Gereinigtes Wasser ad 1000,0 mL ad 1000,0 mL ad 1000,0 mL ad 1000,0 mL

* enthält Natriumtaurocholat und Lecithin im Verhältnis 4:1

Die In vitro-Untersuchungen erfolgten mit Arzneistofflösungen der Konzentrationen 0,02 und

2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie 0,016 und 0,16 g/L für Valsartan. Für die

Untersuchung der Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde mit doppelt so hoch

konzentrierten Lösungen (0,04 und 4 g/L Paracetamol oder Amoxicillin sowie 0,032 und

0,32 g/L Valsartan) gearbeitet. Alle Lösungen wurden vor Beginn der Versuche frisch

hergestellt und bis zur Verwendung vor Licht geschützt aufbewahrt.

2.2 Entwicklung eines oral anwendbaren Mikrodialysesystems

Die Grundlage für die im Rahmen dieser Arbeit erfolgte Entwicklung eines oral anwendbaren

Mikrodialysesystems bildeten die bisher zur Bestimmung von intraluminalen Arzneistoff-

konzentrationen im humanen Dünndarm angewendeten mehrlumigen Sonden (siehe 1.3.2).

Es wurde ein oral anwendbares Mikrodialysesystem (schematische Darstellung in

Abbildung 7) entwickelt, dass überwiegend aus elastischen Schläuchen besteht. Der

verwendete Silikonschlauch Tygon® 3350 ist platinvernetzt und biokompatibel [112]. Das

Schlauchsystem besteht aus einem Zuflussschlauch (Abbildung 7, Z) sowie einem

Ablaufschlauch (Abbildung 7, A) mit einer jeweiligen Länge von 500 oder 2500 mm, einem

Innendurchmesser von 1,85 mm und einem Außendurchmesser von 3,67 mm. Zur

Bestimmung der Arzneistoffkonzentration ist zusätzlich eine flexible Mikrodialyseeinheit

(Abbildung 7, M) enthalten.


22

Abbildung 7: Schematische Darstellung des Mikrodialysesystems mit Mikrodialyseeinheit (M),

Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A).

Die Mikrodialyseeinheit ist aus semipermeablen Hohlfaserkapillaren aus Fresenius

Polysulfon® aufgebaut (Abbildung 8).

Abbildung 8: Fresenius Polysufon® Hohlfaserkapillaren.

Eine einzelne Hohlfaserkapillare besitzt einen Innendurchmesser von 200 µm, eine

Wandstärke von 40 µm und eine Molekülmassen-Ausschlussgrenze von 5000 Da. Die

rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der Kapillaroberfläche, des Kapillarquer-

schnitts und der porösen Polysulfon-Membran sind in Abbildung 9 A-C dargestellt.

Abbildung 9: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Fresenius Polysufon® Hohlfaser-

kapillaren, A: Kapillaroberfläche, B: Kapillarquerschnitt, C: semipermeable Kapillar-

membran.


23

Zur Herstellung einer Mikrodialyseeinheit wurden im finalen Mikrodialysesystem

30 semipermeable Kapillaren an den Enden mit dem Zwei-Komponenten-Epoxid-Klebstoff

Loctite® M-31Cl, der für den Einsatz in Medizinprodukten zugelassen ist, verklebt [113]. Dies

erfolgte zuerst durch Einrollen der mit Klebstoff getränkten Kapillaren in Folie

(Abbildung 10 A) und später durch Einbettung der mit Klebstoff getränkten Kapillaren in einer

Silikonmanschette (Abbildung 10 B und C).

Abbildung 10: Mikrodialyseeinheit während des endständigen Verklebens der Kapillaren, A: Einrollen

in Folie, B und C: Einbetten in Silikonmanschetten.

Alle untersuchten Mikrodialyseeinheiten wurden vor ihrer Verwendung auf Kapillar-

durchlässigkeit untersucht. Dafür wurde die Mikrodialyseeinheit nach dem endständigen

Verkleben mit gereinigtem Wasser perfundiert und der Austritt der Wassertropfen aus jeder

einzelnen Kapillare optisch überprüft (Abbildung 11). Nach dem Entfernen der

überstehenden Kapillaren wurden die Silikonschläuche mit dem Medizinprodukte-Klebstoff

Loctite® 4011 [114] an beiden Enden der Mikrodialyseeinheit fixiert.


24

Abbildung 11: Versuchsaufbau für die Überprüfung der Kapillardurchlässigkeit.

Für die Versuchsdurchführung mit dem diskontinuierlichen Fluss (unter 2.3.2 beschrieben)

wurde in das Mikrodialysesystem ein zusätzlicher Schlauch (Abbildung 12, L) eingefügt.

Über diesen Schlauch (Länge: 500 oder 2500 mm, Innendurchmesser: 0,64 mm,

Außendurchmesser: 2,46 mm) wird die Luft zum Abtrennen der Proben im Ablaufschlauch

zugeführt.

Abbildung 12: Schematische Darstellung des Mikrodialysesystems mit Mikrodialyseeinheit (M),

Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A), sowie einem Schlauch zum Abtrennen der

Proben mit Hilfe von Luftblasen (L).

2.3 Versuchsaufbau und Versuchsablauf

Die In vitro-Untersuchungen wurden mit dem entwickelten Mikrodialysesystem, mit und ohne

zusätzlichen Luftschlauch, durchgeführt. Für die einzelnen Untersuchungen kamen der

Versuchsaufbau und -ablauf mit dem kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss des

Perfusats zum Einsatz, welche in den folgenden Abschnitten näher erläutert werden.

2.3.1 Versuchsaufbau für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss

Für den Versuchsaufbau mit dem kontinuierlichen Perfusatfluss wurde das

Mikrodialysesystem mit Mikrodialyseeinheit, einem Zu- und Ablaufschlauch verwendet


25

(vergleiche Abbildung 7). Die Mikrodialyseeinheit wurde in eine Schottflasche mit Deckel,

gefüllt mit 0,25 L der entsprechenden Arzneistofflösung, eingebracht (Abbildung 13). Das

jeweilige Perfusionsmedium wurde mit einer Flussrate von 1 mL/min mittels einer

Schlauchpumpe kontinuierlich durch das Mikrodialysesystem transportiert. Währenddessen

konnte im Bereich der Mikrodialyseeinheit mit den semipermeablen Kapillaren ein

Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment (Arzneistofflösung in der Schottflasche)

und Akzeptor-Kompartiment (Perfusat) stattfinden. Im Abstand von 1 min wurden

Dialysatproben mit einem Volumen von circa 300 µL manuell in Mikroreaktionsgefäßen

aufgefangen.

Abbildung 13: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus mit kontinuierlichem Fluss.

Der Versuchsaufbau mit dem diskontinuierlichen Fluss des Perfusats wurde unter

Verwendung des Mikrodialysesystems mit einem zusätzlichen Luftschlauch genutzt

(vergleiche Abbildung 12). Die Mikrodialyseeinheit wurde ebenfalls in das Donor-

Kompartiment, das 0,25 L Arzneistofflösung enthielt, eingebracht (Abbildung 14). Eine

Schlauchpumpe wurde zum diskontinuierlichen Transport des Durchflussmediums durch das

Mikrodialysesystem genutzt. Dabei wurde die identische Flussrate von 1 mL/min verwendet.

Während der Fluss des Perfusats pausierte, konnte ein Stoffaustausch zwischen der Lösung

im Donor-Kompartiment und dem Perfusat durch die semipermeablen Kapillaren der

Mikrodialyseeinheit erfolgen. Die Arzneistoffmoleküle konnten bei diesem Versuchsaufbau

über einen variablen Zeitraum von 1, 5 oder 60 min durch die Kapillarmembran diffundieren.

Zeitgleich wurde durch eine weitere Schlauchpumpe für 30 s Luft durch den Luftschlauch in

den Ablaufschlauch gepumpt, um die erhaltenen Proben im Ablaufschlauch voneinander zu


26

trennen. Nach Verlassen des Ablaufschlauches wurden die Dialysatproben (circa 300 µL)

einzeln in Mikroreaktionsgefäßen aufgefangen.

Abbildung 14: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus mit diskontinuierlichem Fluss.

Die Arzneistofflösungen im Donor-Kompartiment wurden bei Raumtemperatur (20 °C) oder

bei Körpertemperatur (37 °C, temperiertes Wasserbad) ohne aktive Durchmischung oder

mit einem Magnetrührer beziehungsweise mit einem Horizontalschüttler homogenisiert

verwendet.

2.3.2 Versuchsablauf für den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss

Die Charakterisierung des Mikrodialysesystems erfolgte durch Untersuchung des Einflusses

verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung (RR) der Arzneistoffe. In Anlehnung

an frühere Arbeiten [87, 115] wurde das Verhältnis der Konzentration des Arzneistoffes im

Dialysat (cDialysat) zur Konzentration des Arzneistoffes im Donor-Kompartiment (cDonor-Medium)

als relative Wiederfindung definiert. In dieser Arbeit wurde sie nach folgender Gleichung

berechnet:

𝑅𝑅 (%) = 𝑐𝐷𝑖𝑎𝑙𝑦𝑠𝑎𝑡

𝑐𝐷𝑜𝑛𝑜𝑟−𝑀𝑒𝑑𝑖𝑢𝑚 ∙ 100 (Gleichung 4).


27

Zur Bestimmung der relativen Wiederfindung des Arzneistoffes wurden die

Versuchsaufbauten mit dem kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss verwendet. Die

entsprechende Arzneistofflösung wurde in das Donor-Gefäß gegeben und die

Mikrodialyseeinheit in dieses Donor-Kompartiment eingebracht. Dialysatproben wurden beim

Versuchsaufbau mit dem kontinuierlichen Fluss minütlich und beim diskontinuierlichen Fluss

nach einem Zeitraum von 1, 5 oder 60 min aufgefangen. Dieser Zeitraum wurde im Rahmen

dieser Arbeit als Equilibrierzeit definiert. Der zeitliche Ablauf der Experimente mit

kontinuierlichem und diskontinuierlichem Flusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min ist in der

Abbildung 15 schematisch dargestellt. Für jeden Einzelversuch wurden 12 Dialysatproben

aufgefangen. Die Ausnahme bildeten die Experimente mit 60 min Equilibrierzeit, bei denen

jeweils drei Proben pro Einzelversuch aufgefangen wurden. Die Probenentnahme (Volumen

300 μL) aus dem Donor-Gefäß erfolgte zu Beginn und am Ende jedes Versuches. Alle

Versuche wurden, wenn nicht anders angegeben, als Dreifachbestimmung durchgeführt.

Abbildung 15: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Experimente, A: kontinuierlicher

Fluss, B: diskontinuierlicher Fluss mit einer Equilibrierzeit von 1 min.

Die Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems erfolgte, indem untersucht wurde,

ob Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment zeitnah in den Dialysatproben

abgebildet werden können. Die Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben wurde dabei

durch Multiplikation der gemessenen Arzneistoffkonzentration mit dem Skalierungsfaktor

(SF) ermittelt. Der Skalierungsfaktor wurde unter Einbeziehung der relativen Wiederfindung

nach folgender Gleichung berechnet:

𝑆𝐹 (%) = 1

𝑅𝑅 ∙ 100 (Gleichung 5).


28

Die Experimente wurden mit dem kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss mit einer

Equilibrierzeit von 1 min bei Körpertemperatur mit dem Mikrodialysesystem durchgeführt. Bei

diesen Untersuchungen wurde die Mikrodialyseeinheit in ein Donor-Gefäß mit 1 L

Fassungsvermögen eingebracht. 0,25 L arzneistofffreies Medium wurde in das Donor-Gefäß

gegeben, sodass die Mikrodialyseeinheit komplett mit Medium bedeckt war. Nachdem fünf

Dialysatproben gewonnen wurden, erfolgte die Zugabe von 0,25 L Arzneistofflösung, sodass

nach Homogenisation des Mediums (Magnetrührer, 100 Umdrehungen pro Minute) eine

theoretische Konzentration von 0,02 und 2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie

0,016 und 0,16 g/ L für Valsartan im Donor-Kompartiment resultierte. Nach dem Auffangen

von fünf weiteren Dialysatproben wurden 0,5 L des arzneistofffreien Mediums hinzugefügt,

um die Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment zu reduzieren. Es resultierten

theoretische Konzentrationen von 0,01 und 1,0 g/L für Paracetamol und Amoxicillin und

0,008 und 0,08 g/L für Valsartan. Danach wurden fünf weitere Dialysatproben aufgefangen.

Die fehlende Equilibrierzeit beim kontinuierlichen Fluss des Perfusats und die Equilibrierzeit

von 1 min beim diskontinuierlichen Fluss führten zu leicht unterschiedlichen zeitlichen

Abläufen während dieses Versuches (Abbildung 16). Die Probenentnahme (Volumen

300 μL) aus dem Donor-Gefäß erfolgte zu Beginn des Versuches sowie nach Zugabe der

Arzneistofflösung und des arzneistofffreien Mediums. Die Experimente wurden, wenn nicht

anders angegeben, als Dreifachbestimmung durchgeführt.

Abbildung 16: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Experimente zur Bestimmung

der Empfindlichkeit des Mikrodialysesystems, A: kontinuierlicher Fluss,

B: diskontinuierlicher Fluss mit einer Equilibrierzeit von 1 min.


29

Vor jedem Versuchsbeginn wurde das Mikrodialysesystem für 10 min equilibriert. Dabei

wurde die in der Donor-Lösung befindliche Mikrodialyseeinheit kontinuierlich perfundiert und

das erhaltene Dialysat verworfen. Nach jedem Versuch wurde die Mikrodialyseeinheit mit

dem entsprechenden Medium oder Phosphatpuffer pH 6,8 USP gespült, um ein

arzneistofffreies Mikrodialysesystem für das nächste Experiment zur Verfügung zu haben.

Nach Versuchsende erfolgte die Reinigung des Mikrodialysesystems durch Spülen mit

gereinigtem Wasser. Anschließend wurde das enthaltene Wasser entfernt und das

Mikrodialysesystem bis zur nächsten Verwendung trocken und vor Beschädigung geschützt

gelagert.

Die Arzneistoffkonzentration in den Proben wurde mit Hilfe der UV-Spektroskopie oder der

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Detektion bestimmt. Die

Quantifizierung der Arzneistoffe erfolgte bei den in Tabelle 4 gezeigten Wellenlängen und

Retentionszeiten.

Tabelle 4: Detektionswellenlängen und Retentionszeiten der untersuchten Arzneistoffe.

Arzneistoff UV-mini1240 Merck Hitachi HPLC-Anlage Shimadzu HPLC-Anlage

Wellenlänge Wellenlänge Retentionszeit Wellenlänge Retentionszeit

Paracetamol 242 nm 230 nm 2,1 min 242 nm 2,1 min

Amoxicillin 229 nm 230 nm 1,4 min - -

Valsartan 249 nm 230 nm 6,2 min - -

Die UV-metrische Konzentrationsbestimmung der Arzneistoffe in den Dialysat- oder Donor-

Proben mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP, Salzsäure pH 1,2, Bicarbonatpuffer pH 6,8 oder

NaCl-Lösung erfolgte nach einer 1:5 beziehungsweise 1:100 Verdünnung gegen eine

Blindprobe unter Verwendung einer Halbmikro-Küvette (Schichtdicke 10 mm) und des

Shimadzu UV-mini1240 Gerätes. Die Verdünnung erfolgte mit den in Tabelle 5 angegeben

Medien. Zusätzlich wurden die im Rahmen der Arbeit erhobenen Daten der Bestimmungs-

grenze tabelliert.


30

Tabelle 5: Medien zur Verdünnung der Proben zur UV-metrischen Bestimmung der

Arzneistoffkonzentration sowie die entsprechende Bestimmungsgrenze;

PCM: Paracetamol, AMX: Amoxicillin und VAL: Valsartan, PP: Phosphatpuffer pH 6,8

USP, HCl: Salzsäure pH 1,2, BP: Bicarbonatpuffer pH 6,8.

Arzneistoff/Donor-

Medium//Perfusat

Donor-

Kompartiment Dialysat

Bestimmungsgrenze

(g/L)

PCM/PP//PP PP PP 0,0005

PCM/HCl//PP HCl PP 0,0005

PCM/BP//PP BP PP 0,0005

PCM/PP//NaCl-Lösung PP PP 0,0005

AMX/PP//PP PP PP 0,001

AMX/PP//NaCl-Lösung PP PP 0,001

VAL/PP//PP PP PP 0,0005

VAL/PP//NaCl-Lösung PP PP 0,0004

Die Chromatographie wurde mit einer LiChroCART® 125-4 Säule mit vorgeschalteter

LiChroCART® 4-4 Vorsäule durchgeführt. Die simultane Quantifizierung der Arzneistoffe

Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan erfolgte mit der Merck Hitachi HPLC-Anlage.

Methanol und ein 10-fach verdünnter Phosphatpuffer pH 6,8 USP dienten bei einer Flussrate

von 1 mL/min als Elutionsmittel. Die Eluenten wurden als Gradient durch die Anlage

gepumpt. Der zeitliche Verlauf des verwendeten Gradienten ist in Abbildung 17 A aufgeführt.

Die Proben wurden unverdünnt oder wenn nötig 1:20 verdünnt (Tabelle 6) bei 35 °C

Säulentemperatur vermessen. Das Injektionsvolumen betrug jeweils 30 μL. Die

Quantifizierung von Paracetamol in den Proben der Experimente mit FaSSIF und FeSSIF

erfolgte mit der Shimadzu HPLC-Anlage. Die Proben wurden unverdünnt oder bei Bedarf

1:100 verdünnt vermessen (Tabelle 6). Das Elutionsmittel bestand aus Acetonitril und 0,02 M

Acetatpuffer pH 4,0, dessen Zusammensetzung in Tabelle 7 angegeben ist. Die Analyse

erfolgte bei einer Flussrate von 1,0 mL/min und einer Säulentemperatur von 35 °C. Das

Laufmittel wurde als Gradient durch die Anlage gepumpt (Abbildung 17 B). Pro Probe

wurden 10 μL injiziert. Die entsprechenden Bestimmungsgrenzen sind für alle Arzneistoffe in

Tabelle 5 aufgeführt. Die Integration der Flächen und die Berechnung der Peakhöhen und -

flächen erfolgten bei beiden HPLC-Anlagen mit dem Programm Shimadzu Class VP.


31

Abbildung 17: Zusammensetzung des Elutionsmittels, A: für die simultane Analyse von Paracetamol,

Amoxicillin und Valsartan in Phosphatpuffer pH 6,8 USP, B: für die Analyse von

Paracetamol in Fasted State Simulated Intestinal Fluid und Fed State Simulated

Intestinal Fluid.

Tabelle 6: Medien zur Verdünnung der Proben zur Bestimmung der Arzneistoffkonzentration

mittels HPLC sowie die entsprechende Bestimmungsgrenze; PCM: Paracetamol,

AMX: Amoxicillin und VAL: Valsartan, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP,

FaSSIF: Fasted State Simulated Intestinal Fluid, FeSSIF: Fed State Simulated

Intestinal Fluid.

Arzneistoff/Arzneistoff/

Arzneistoff//Donor-

Medium///Perfusat

Donor-

Kompartiment Dialysat

Bestimmungsgrenze

(g/L)

PCM/AMX/VAL//PP///PP PP PP 0,0005/0,0005/0,00032

PCM//FaSSIF///PP blank FaSSIF blank FaSSIF 0,0005

PCM//FeSSIF///PP blank FeSSIF blank FeSSIF 0,0005

Tabelle 7: Zusammensetzung des 0,02 M Acetat-Puffers pH 4,0.

0,02 M Acetat-Puffer pH 4,0

Natriumacetat, wasserfrei 1,64 g

Eisessig q.s. ad pH 4,0

Gereinigtes Wasser ad 1000,0 mL

A B


32

2.4 In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems

Alle Versuche zur Prüfung des Mikrodialysesystems wurden wie unter 2.3.2 beschrieben

durchgeführt. Dabei wurde, wenn nicht anders angegeben, bei Körpertemperatur mit

Phosphatpuffer pH 6,8 USP als Lösungsmittel, als arzneistofffreies Medium und als Perfusat

sowie mit Paracetamol als Arzneistoff gearbeitet. Außerdem wurde der Versuchsablauf

diskontinuierlicher Fluss mit einer Equilibrierzeit von 1 min verwendet. Die Durchmischung

der Arzneistofflösung erfolgte mit einem Magnetrührer bei 100 Umdrehungen pro Minute.

2.4.1 Untersuchungen zur Etablierung des Versuchsaufbaus und des Versuchsablaufes

Für In vitro-Untersuchungen werden Versuchsaufbauten und -abläufe benötigt, die einen

hohen Grad an Standardisierung bieten und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Aus diesem

Grund wurden der Einfluss der Homogenisierung des Donor-Mediums sowie der Einfluss der

Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative Wiederfindung des Arzneistoffes bestimmt.

2.4.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten

Gerätes auf die relative Wiederfindung

Der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten Gerätes

wurde mit dem kontinuierlichen Fluss bei Raumtemperatur bestimmt. Es wurden

Experimente ohne und mit Durchmischung der Donor-Lösung durchgeführt. Zur

Homogenisierung diente ein Horizontalschüttler mit 100 Bewegungen pro Minute sowie ein

Magnetrührer mit 100, 200 und 300 Umdrehungen pro Minute. Die ermittelten Werte für die

relative Wiederfindung sind Mittelwerte (MW) aus 3 bis 5 Einzelwerten.

2.4.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative Wiederfindung

Weiterhin wurde der Einfluss unterschiedlicher Equilibrierzeiten auf den Stofftransport durch

die Kapillarmembran bei Raumtemperatur und Körpertemperatur untersucht. Die

Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses entspricht einer Equilibrierzeit von 0 min.

Der Versuchsablauf mit dem diskontinuierlichen Fluss des Perfusats wurde mit variablen

Equilibrierzeiten von 1, 5 und 60 min genutzt. Mit Paracetamol wurden alle Equilibrierzeiten

untersucht. Für Amoxicillin und Valsartan erfolgte die Untersuchung des Einflusses von

1 und 5 min dauernden Equilibrierzeiten auf die relative Wiederfindung. Die erhaltenen

Ergebnisse sind Mittelwerte aus 1 bis 3 Einzeluntersuchungen.


33

2.4.2 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen

Die Empfindlichkeit des Mikrodialysesystems wurde mit beiden Versuchsabläufen

untersucht. Der Unterschied bestand in der sofortigen Abtrennung der Dialysatproben im

Ablaufschlauch durch Luftblasen beim diskontinuierlichen Fluss, welche bei der Verwendung

des kontinuierlichen Flusses fehlte. Paracetamol wurde in den Untersuchungen mit dem

kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fluss genutzt, während Amoxicillin und Valsartan nur

für die Untersuchungen mit dem diskontinuierlichen Fluss verwendet wurden. Die drei

Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan wurden in einem Einzelexperiment auch

simultan verwendet.

2.4.3 Einfluss verschiedener Parameter auf die relative Wiederfindung bei Anwendung des

diskontinuierlichen Flusses

2.4.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung

Zur Bestimmung des Einflusses der Nutzungsdauer der Mikrodialysesysteme wurde ein

repräsentatives System an 14 aufeinanderfolgenden Untersuchungstagen für unter-

schiedliche Experimente genutzt. Der Zeitraum der Lagerung wurde dabei nicht

berücksichtigt. An acht verschiedenen Tagen innerhalb dieses Intervalls wurde die relative

Wiederfindung für Paracetamol bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses mit einer

Equilibrierzeit von 1 min bestimmt. Diese Ergebnisse wurden zur Beurteilung der

Nutzungsdauer verwendet. An den anderen Tagen wurde das Mikrodialysesystem für

Experimente mit abweichenden Equilibrierzeiten verwendet. Das Mikrodialysesystem wurde

regelmäßig nach den einzelnen Versuchen und zum Versuchsende gespült und bis zur

Verwendung am nächsten Versuchstag trocken gelagert.

2.4.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung

Alle Mikrodialysesysteme wurden einzeln in Handarbeit hergestellt. Die Reproduzierbarkeit

der Herstellung der jeweiligen Mikrodialysesysteme wurde durch den Vergleich der relativen

Wiederfindung des Arzneistoffes von jeweils acht (Paracetamol) oder vier (Amoxicillin und

Valsartan) verschiedenen Systemen untersucht.


34

2.4.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung

Phosphatpuffer pH 6,8 USP diente im Allgemeinen als Lösungsmittel für die verwendeten

Arzneistoffe und damit als Referenzwert für deren relative Wiederfindung. Der Einfluss von

Salzsäure pH 1,2 und den biorelevanten Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und

FeSSIF als Lösungsmittel für den Arzneistoff Paracetamol auf den Stofftransport durch die

Kapillarmembran wurde in diesem Experiment untersucht.

2.4.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung

Aufgrund der geplanten humanen Anwendung des Mikrodialysesystems, wurden

Untersuchungen mit dem Fertigarzneimittel Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 % Braun

Infusionslösung (NaCl-Lösung) als Perfusat durchgeführt. Laut Produktspezifikation des

Herstellers kann die NaCl-Lösung pH-Werte zwischen pH 4,5 und 7,0 aufweisen. Um die

Grenzbedingungen im Versuch darzustellen, wurde die NaCl-Lösung vor ihrer Verwendung

mit Salzsäure beziehungsweise Natriumhydroxid-Lösung auf pH 4,5 oder 7,0 eingestellt. Die

Experimente wurden mit den drei Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan

durchgeführt.

2.4.4 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter

Medien

Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde zusätzlich zu dem verwendeten

Phosphatpuffer pH 6,8 USP (siehe 2.4.2) mit Salzsäure pH 1,2 und den biorelevanten

Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF als Donor-Medium untersucht.

2.4.5 Bestimmung der Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im

Röhrenmodell

Eine Annäherung des Versuchsaufbaus an die Anatomie des Dünndarms erfolgte durch die

Anwendung des Mikrodialysesystems im Röhrenmodell. Dafür wurde ein circa 2,5 m langer

Kunststoffschlauch mit einem Innendurchmesser von annähernd 2 cm und einem

Fassungsvolumen von circa 0,6 L als Reservoir für die Donor-Lösung genutzt. Das

Mikrodialysesystem wurde circa 0,5 m tief in den beidseitig offenen Kunststoffschlauch

eingebracht (Abbildung 18). Zur Bestimmung der Paracetamol-Konzentration direkt an der

Mikrodialyseeinheit wurden Proben mit Hilfe eines weiteren Schlauches, dessen Ende auf


35

Höhe der Mikrodialyseeinheit platziert war, aus dem Donor-Kompartiment entnommen. Der

Kunststoffschlauch wurde in einem Wasserbad auf Körpertemperatur temperiert. Um eine

mögliche durch die Atembewegung verursachte Durchmischung zu simulieren, wurde der

Kunststoffschlauch mit 12 vertikalen Bewegungen pro Minute leicht bewegt. In diesem

Versuch wurde das Gesamtvolumen der Untersuchungslösungen von 1 L auf 0,4 L

verringert, da die Kapazität des Kunststoffschlauches begrenzt war. Zu Beginn des

Versuches wurde 0,1 L arzneistofffreies Medium über einen Trichter in den

Kunststoffschlauch eingefüllt, sodass die Mikrodialyseeinheit komplett mit Flüssigkeit

bedeckt war. Die anschließende Zugabe der Arzneistofflösung sowie das abschließende

Einbringen des arzneistofffreien Mediums führten zur Füllung des Kunststoffschlauches in

weiter distal liegenden Bereichen.

Abbildung 18: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für die Bestimmung der Sensitivität

des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell.


36


humane Anwendung

Die vorgesehene humane Anwendung des Mikrodialysesystems führte zu einer Kooperation

mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed (Parchim, Deutschland). In Zusammenarbeit

erfolgte die Adaption des Mikrodialysesystems nach arbeitskreisinternen Vorgaben durch die

Firma RoweMed und anschließend dessen Produktion.

Die Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems und der entsprechenden Pumpen erfolgte,

wenn nicht anders angegeben, bei Körpertemperatur mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP als

Lösungsmittel und als Perfusat sowie mit Paracetamol als Arzneistoff. Der Versuchsablauf

des diskontinuierlichen Flusses wurde mit einer Equilibrierzeit von 1 min verwendet. Die

Homogenisierung der Arzneistofflösung erfolgte bei 100 Umdrehungen pro Minute mit einem

Magnetrührer.

2.5.1 Adaption des Mikrodialysesystems

Das bisher verwendete Mikrodialysesystem wurde an die Anwendung im Menschen

angepasst, indem zum einen die Gesamtlänge des Systems verändert wurde und zum

anderen zwei Mikrodialysesysteme in einem Set verarbeitet wurden. Für die Herstellung der

Sets wurden zwei verschiedene biokompatible Silikonschläuche mit Innendurchmessern von

jeweils 1,0 mm für den Zufluss- und Ablaufschlauch (Medicoplast- und Versilic®-Schlauch,

Außendurchmesser 3,0 und 2,0 mm) und 1,0 mm (Medicoplast-Schlauch, Außen-

durchmesser 3,0 mm) sowie 0,5 mm (Versilic®-Schlauch, Außendurchmesser 1,5 mm) für

den Luftschlauch verwendet. Die einzelnen Polysulfon-Kapillaren wurden verklebt, indem sie

in Loctite® M-31Cl Klebstoff eingebettet und von einer Silikonmanschette umhüllt wurden. Die

Prüfung der Kapillardurchlässigkeit der Mikrodialyseeinheiten erfolgte analog der

Prüfungsvorschrift der eigenen Herstellung. Das Verbinden der einzelnen Komponenten und

das Verkleben aller Bestandteile erfolgte mit dem Silikon Elastosil®. Am distalen Ende des

Mikrodialysesystems wurde ein Zuggewicht mit Titankugeln angebracht. Als letzter

Herstellungsschritt wurde eine Sterilisation mit Ethylenoxid durchgeführt. Die hergestellten

adaptierten Mikrodialysesets enthielten pro Set zwei komplett gefertigte, funktionstüchtige

Mikrodialysesysteme, die einzeln für In vitro-Untersuchungen genutzt wurden.


37

2.5.2 In vitro-Prüfung des adaptierten Mikrodialysesystems

Zur Beurteilung der externen Herstellung der adaptierten Mikrodialysesysteme durch

RoweMed und des Einflusses der modifizierten Bestandteile wurde die relative

Wiederfindung des Arzneistoffes Paracetamol von acht angefertigten Systemen bestimmt

und mit den Ergebnissen der bisher hergestellten Mikrodialysesysteme verglichen (siehe

2.4.3.2).


Dialysatproben

Zur Bestimmung der Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Magen oder Dünndarm des

Probanden soll der pH-Wert des Dialysats dienen. Aus diesem Grund wurden mit dem

Versuchsablauf des diskontinuierlichen Flusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min pro

Versuch jeweils zehn Dialysatproben (300 µL) aufgefangen und pH-metrisch mit der

Hamilton® Minitrode untersucht. Als Durchflussmedien wurden Phosphatpuffer pH 6,8 USP

und NaCl-Lösung pH 5,5 genutzt. Im Donor-Kompartiment wurden jeweils 0,25 L Salzsäure

mit einem eingestellten Wert von pH 1,2; 3,0; 4,0; 5,0 oder Phosphatpuffer pH 6,8 USP

verwendet.

2.5.4 Evaluation der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen

Die humane Anwendung des Mikrodialysesystems erfordert die Nutzung von CE-

zertifizierten Pumpen, die zum Einsatz am Menschen zugelassen sind. Die Braun Infusomat®

und Perfusor® Space Pumpen erfüllen diese Anforderungen. Zusätzlich sind beide Pumpen

im Minutenabstand programmierbar. Zur Beurteilung der Eignung der Braun Infusomat® und

Perfusor® Space Pumpen für den Versuchsaufbau mit dem diskontinuierlichen Fluss wurden

Untersuchungen mit veränderten Versuchsabläufen durchgeführt. Die Infusomat® Space

Schlauchpumpen wurden für diese Experimente mit einem Infusomat® Space Line Set und

die Perfusor® Space Spritzenpumpen mit 20 mL- und 50 mL-Spritzen bestückt. Bei

unterschiedlichen Zeiten für den Transport des Perfusats (15 bis 18 s) und für die

Equilibrierung (42 bis 60 s) wurde die relative Wiederfindung für Paracetamol bei

Verwendung eines repräsentativen Mikrodialysesystems ermittelt. Für diese Versuche

wurden ebenfalls die bisher verwendeten MCP-Schlauchpumpen genutzt, deren Ergebnisse

für die relative Wiederfindung als Referenz dienten. Jedes Ergebnis ist ein Mittelwert aus

jeweils drei Einzelversuchen für die hoch und niedrig konzentrierte Paracetamol-Lösung.


38

Ergebnisse

39

3 Ergebnisse


Das neuartige Mikrodialysesystem (Abbildung 19) wurde entwickelt, um intraluminale

Arzneistoffkonzentrationen im humanen Dünndarm zu bestimmen. Es wurde ein flexibles

aber dennoch robustes System aus biokompatiblen und MRT-geeigneten Materialien

entwickelt und hergestellt.

Abbildung 19: Mikrodialysesystem mit Mikrodialyseeinheit (M), Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A).

Für das Schlauchsystem wurde ein Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,85 mm

verwendet. Daraufhin wurde der Außendurchmesser der verklebten Kapillaren auf diesen

Durchmesser begrenzt. Die theoretisch für diesen Durchmesser benötigten

Mikrodialysekapillaren wurden mit 43 Stück berechnet. In der Praxis erwies sich diese

Anzahl als nicht praktikabel, da der Klebstoff zwischen den einzelnen Kapillaren ebenfalls

Raum beanspruchte. Daraufhin wurde die Anzahl der Kapillaren reduziert und mit dem

Verkleben durch Einrollen in Folie begonnen. Ein beidseitig verklebtes Kapillarbündel ist in

Abbildung 20 I A abgebildet. Zuerst wurden endständige Verklebungen erzielt, die

undurchlässige oder deformierte Kapillaren beinhalteten. Die Verbesserung der

Herstellungstechnik führte zu Verklebungen, bei denen die Kapillaren durchlässig und

größtenteils von Klebstoff umgeben waren (Abbildung 20 I B). Allerdings ist erkennbar, dass

bei dieser Herstellungstechnik eine tropfenförmige Verklebung der Kapillaren erhalten wurde.

Ergebnisse

40

Daraufhin wurde die Herstellung der endständigen Verklebungen nochmals optimiert. Durch

Einbettung der klebstoffgetränkten Kapillaren in eine Silikonmanschette konnten

Kapillarbündel mit kreisförmigen Verklebungen mit einem Außendurchmesser von 1,85 mm

hergestellt werden (Abbildung 20 II A). In der Abbildung 20 II B sind die Lumen der einzelnen

Kapillaren und das luftblasenfreie Verkleben der semipermeablen Kapillaren erkennbar. Die

finale Mikrodialyseeinheit enthielt 30 Kapillaren.

Abbildung 20: Endständig verklebte Mikrodialysekapillaren, I: Herstellung durch Einrollen in Folie,

II: Herstellung durch Einbettung in Silikonmanschette, A: Detailansicht, B: Querschnitt.

Die hergestellten Mikrodialyseeinheiten wurden vor ihrer Weiterverarbeitung auf Kapillar-

durchlässigkeit untersucht. Dafür wurde die Mikrodialyseeinheit mit gereinigtem Wasser

perfundiert. Dann erfolgte die optische Überprüfung des Austritts der Wassertropfen aus

jeder einzelnen Kapillare (Abbildung 21). Die hergestellten Mikrodialyseeinheiten wurden nur

zur Herstellung von Mikrodialysesystemen genutzt, wenn alle 30 Kapillaren durchlässig

waren. Die in den Versuchen verwendeten Mikrodialyseeinheiten waren circa 12 cm lang

und auf einer Länge von 10 cm für den Stoffaustausch geeignet. Damit ergibt sich eine

berechnete Stoffaustauschfläche von circa 26 cm2 und ein Gesamtkapillarinnenvolumen von

circa 100 µL.

Ergebnisse

41

Abbildung 21: Mikrodialyseeinheit während der Prüfung auf Kapillardurchlässigkeit.

Eine Modifizierung des Mikrodialysesystems für die Versuchsdurchführung mit dem

diskontinuierlichen Perfusatfluss (unter 2.3.2 beschrieben) erfolgte durch das Einfügen eines

zusätzlichen Schlauches zum Abtrennen der Proben durch Luftblasen (Abbildung 22, L).

Abbildung 22: Mikrodialysesystem mit Mikrodialyseeinheit (M), Zufluss- (Z) und Ablaufschlauch (A),

sowie einem Schlauch zum Abtrennen der Proben mit Hilfe von Luftblasen (L).

Für die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen wird eine Bestimmung der

Arzneistoffkonzentration an verschiedenen Stellen im Dünndarm angestrebt. Durch

Kombination von zwei einzelnen Mikrodialysesystemen kann dies erreicht werden

(Abbildung 23). Zur Stabilisierung der zurücklaufenden Schläuche und zum Vorwärts-

transport des Systems im Dünndarm wurde ein Zuggewicht mit Titankugeln angebracht

(Abbildung 23, G).

Ergebnisse

42

Abbildung 23: Mikrodialyseset mit je zwei Mikrodialyseeinheiten (M), Zufluss- und Ablaufschläuchen,

Schläuchen zum Abtrennen der Proben mit Hilfe von Luftblasen und einem

Zuggewicht (G).

Die nachfolgend beschriebenen Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen wurden mit den

Mikrodialysesystemen, die in den Abbildungen 19 und 22 dargestellt sind, durchgeführt.



3.2.1.1 Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten

Gerätes auf die relative Wiederfindung

Der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und des für die Homogenisation verwendeten Gerätes

auf die relative Wiederfindung wurde für Paracetamol mit dem kontinuierlichen Fluss ohne

sowie mit Homogenisation bei Raumtemperatur bestimmt. Die fehlende Durchmischung der

Donor-Lösung führte für die niedrig konzentrierte Paracetamol-Lösung zu relativen

Wiederfindungen von 10,0 ± 2,3 % (Abbildung 24). Für die hohe Paracetamol-Konzentration

wurden mit 16,5 ± 7,8 % vergleichsweise höhere Abweichungen zwischen den Einzelwerten

erhalten. Die Homogenisierung der Arzneistofflösung mit einem Horizontalschüttler bei

100 Bewegungen pro Minute führte zu einer höheren relativen Wiederfindung von 27,9 % mit

einer niedrigeren Standardabweichung von 1,1 %. Der Einfluss der Durchmischung bei

Nutzung eines Magnetrührers wurde mit Rührgeschwindigkeiten von 100 bis

300 Umdrehungen pro Minute untersucht. Alle getesteten Rührgeschwindigkeiten wiesen mit

relativen Wiederfindungen im Bereich von 34,0 bis 38,0 % nur einen geringen Unterschied

innerhalb dieser Gruppe auf. Bei der Nutzung der Rührgeschwindigkeiten von 200 und

300 Umdrehungen pro Minute war eine starke Bewegung der Mikrodialyseeinheit durch die

Strömungskräfte des Donor-Mediums zu beobachten. Da solche Kräfte in vivo im nüchternen

Ergebnisse

43

Zustand nicht anzunehmen sind, die Mikrodialysesysteme aber beschädigt werden können

und dadurch eine Mehrfachanwendung in vitro nicht möglich gewesen wäre, wurde für die

nachfolgend aufgeführten Experimente der Magnetrührer mit 100 Umdrehungen pro Minute

eingesetzt.

Abbildung 24: Einfluss unterschiedlicher Rührgeschwindigkeiten und Geräte auf die relative

Wiederfindung (RR) von Paracetamol (PCM) bei Anwendung des kontinuierlichen

Flusses bei Raumtemperatur, HS: Horizontalschüttler, MR: Magnetrührer,

PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3 - 5).

3.2.1.2 Einfluss der Equilibrierzeit und der Temperatur auf die relative Wiederfindung

Der Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung wurde für alle drei Arzneistoffe

Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bei Raum- und Körpertemperatur ermittelt. Für

Paracetamol wurden Untersuchungen mit Equilibrierzeiten von 0, 1, 5 und 60 min

durchgeführt. Das Fehlen einer Equilibrierphase resultierte bei Raumtemperatur in relativen

Wiederfindungen von durchschnittlich 28 %. Die Untersuchungen mit einer Equilibrierzeit von

1 bis 60 min führten zu doppelt so hohen Werten für die relative Wiederfindung, wobei nur

geringe Unterschiede (53,6 bis 60,5 %) zwischen den einzelnen Equilibrierzeiten zu

verzeichnen waren (Abbildung 25 A). Der Anstieg der Untersuchungstemperatur auf 37 °C

führte bei allen Untersuchungen zu einer Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für

Versuche ohne Equilibrierung betrug die relative Wiederfindung im Mittel 47,3 %, während

für die Nutzung der Equilibrierzeiten von 1 bis 60 min ein deutlicher Anstieg auf

durchschnittlich 62,7 bis 68,4 % bestimmt wurde (Abbildung 25 B).

Ergebnisse

44

Abbildung 25: Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung (RR) von Paracetamol

(PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei A: Raumtemperatur und

B: Körpertemperatur, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3, * n = 1,

** nicht bestimmt).

Die Experimente mit Amoxicillin und Valsartan wurden mit einer Equilibrierzeit von 1 und

5 min ausgeführt. Die Ergebnisse für Amoxicillin sind in der Abbildung 26 I A und I B

graphisch dargestellt. Bei Raumtemperatur ergab sich für die Equilibrierzeit von 1 min eine

mittlere relative Wiederfindung von 40,5 % gegenüber einem durchschnittlichen Wert von

43,3 % bei Erhöhung der Equilibrierzeit auf 5 min. Untersuchungen bei Körpertemperatur

resultierten in leicht erhöhten Werten von durchschnittlich 49,6 und 52,5 % für die 1 und

5 minütige Equilibrierzeit. Für Valsartan wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Bei

Raumtemperatur lag die relative Wiederfindung durchschnittlich bei 40,8 % für eine

Equilibrierzeit von 1 min und bei 44,9 % bei 5 min (Abbildung 26 II A). Die

Temperaturerhöhung auf 37 °C resultierte in einem Anstieg der relativen Wiederfindung auf

durchschnittlich 48,2 und 51,3 % (Abbildung 26 II B). Die höher konzentrierten

Arzneistofflösungen wiesen im Allgemeinen etwas niedrigere relative Wiederfindungen als

die geringer konzentrierten Arzneistofflösungen auf.

B

** *

A

Ergebnisse

45

Abbildung 26: Einfluss der Equilibrierzeit auf die relative Wiederfindung (RR) von I: Amoxicillin (AMX)

und II: Valsartan (VAL) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei

A: Raumtemperatur und B: Körpertemperatur, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP

(MW + SD, n = 3).

Die geringen Unterschiede in der relativen Wiederfindung zwischen den Equilibrierzeiten von

1 und 60 min für Paracetamol beziehungsweise 1 und 5 min für Amoxicillin und Valsartan

führten, wenn nicht anders angegeben, zur ausschließlichen Anwendung des

diskontinuierlichen Flusses mit einer 1 min andauernden Equilibrierzeit in den nachfolgend

aufgeführten Experimenten.

Zur besseren Veranschaulichung wurden die Ergebnisse für den Einfluss der Temperatur bei

der relevanten Equilibrierzeit von 1 min nochmals herausgestellt (Abbildung 27). Für alle

Arzneistoffe wurde eine höhere relative Wiederfindung bei Körpertemperatur als bei

Raumtemperatur bestimmt. Bei Paracetamol wurde eine Erhöhung der relativen

Wiederfindung von durchschnittlich 53,6 auf 62,6 % ermittelt. Bei Amoxicillin und Valsartan

waren Anstiege der relativen Wiederfindung von jeweils circa 8 % zu verzeichnen.

I A I B

II A II B

Ergebnisse

46

Abbildung 27: Einfluss der Temperatur auf die relative Wiederfindung (RR) von A: Paracetamol

(PCM), B: Amoxicillin (AMX) und C: Valsartan (VAL) bei Anwendung des

diskontinuierlichen Flusses bei Raumtemperatur (RT) und Körpertemperatur (KT),

PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3).

3.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen

Die Sensitivität des Mikrodialysesystems hinsichtlich der Quantifizierung von

Konzentrationsänderungen in der Donor-Lösung wurde mit dem kontinuierlichen und

diskontinuierlichen Fluss mit den Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan

untersucht.

Die Ergebnisse für den Versuch mit Paracetamol bei Anwendung des kontinuierlichen

Perfusatflusses sind in Abbildung 28 dargestellt. Für dieses Experiment wurde zuerst die

Mikrodialyseeinheit in das Donor-Gefäß eingebracht und dann das arzneistofffreie Donor-

Medium hinzugefügt. Anschließend wurden fünf Dialysatproben aufgefangen. Die ersten vier

Dialysatproben bestätigten für beide verwendeten Paracetamol-Konzentrationen die

Arzneistofffreiheit des Donor-Mediums. Allerdings wurde in beiden Versuchen bereits in der

fünften Dialysatprobe Paracetamol quantifiziert. Erst nachdem sich die fünfte Probe im

Ablaufschlauch befand, wurde die Arzneistofflösung hinzugegeben, um die Paracetamol-

A B

C

Ergebnisse

47

Konzentration im Donor-Gefäß auf 0,02 und 2,00 g/L (theoretische Konzentration) zu

erhöhen. Danach wurden fünf weitere Dialysatproben gewonnen. Der erwartete sprunghafte

Anstieg der Paracetamol-Konzentration in der Donor-Lösung konnte in den Dialysatproben

nicht detektiert werden. Es wurden ein gleichmäßiger und moderater Anstieg der

Paracetamol-Konzentration in den Dialysatproben bei den Experimenten mit der niedrig

dosierten Paracetamol-Lösung und ein starker Anstieg bei der höher dosierten Paracetamol-

Lösung beobachtet. Das Maximum wurde erst nach 10 min mit 0,019 g/L (Abbildung 28 A)

und 9 min mit 1,89 g/L (Abbildung 28 B) detektiert, wobei die theoretische Paracetamol-

Konzentration in beiden Versuchen nicht erreicht wurde. Die Zugabe des Donor-Mediums

nach Gewinnung der 10. Dialysatprobe resultierte in geringeren theoretischen Paracetamol-

Konzentrationen von 0,01 und 1,00 g/L. Der erwartete sprunghafte Abfall der Paracetamol-

Konzentration in der Donor-Lösung konnte wiederum nicht in den Dialysatproben

nachgewiesen werden. Stattdessen erfolgte ein gleichmäßiger Abfall in Richtung der Soll-

Konzentration. Diese wurde bei den Untersuchungen der niedrig konzentrierten

Paracetamol-Lösung nach 15 min mit 0,012 g/L noch nicht erreicht. Für die höher

konzentrierte Paracetamol-Lösung war nach 15 min ein Abfall auf 1,07 g/L quantifizierbar.

Beide Paracetamol-Lösungen wiesen zum Teil große Standardabweichungen auf.

Abbildung 28: Vergleich der theoretisch und experimentell bestimmten Konzentrationen von

Paracetamol (PCM) bei Anwendung des kontinuierlichen Flusses bei

Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L und

B: 2,00 g/L, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW ± SD, n = 3).

Der Versuchsablauf des diskontinuierlichen Flusses wurde zuerst mit Paracetamol

untersucht. Dafür wurde die Mikrodialyseeinheit in das Donor-Gefäß eingebracht und die

arzneistofffreie Lösung hinzugefügt. Im Vergleich zum Versuchsablauf mit kontinuierlichem

Perfusatfluss enthielten die fünf aufgefangenen und quantifizierten Dialysatproben keinen

A B

Zugabe der

Arzneistofflösung

Zugabe der

Arzneistofflösung

Zugabe

des Mediums

Zugabe

des Mediums

Ergebnisse

48

Arzneistoff (Abbildung 29). Die Zugabe der Arzneistofflösung und der damit theoretisch

einhergehende Anstieg der Paracetamol-Konzentration (theoretische Konzentrationen von

0,02 und 2,00 g/L) in der Donor-Lösung konnte bei diesem Versuchsaufbau sofort in der

anschließend aufgefangenen Dialysatprobe detektiert werden. Die vier nachfolgend

gewonnenen Dialysatproben wiesen für beide verwendeten Lösungen Paracetamol-

Konzentrationen in Höhe der theoretischen Konzentration auf. Durch Zugabe des Donor-

Mediums wurde die Paracetamol-Konzentration (theoretische Konzentrationen von 0,01 und

1,00 g/L) im Donor-Gefäß verringert. Der erwartete Konzentrationsabfall konnte bei diesem

Versuchsaufbau sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe praktisch gemessen

werden (Abbildung 29). Die vier zuletzt gewonnenen Dialysatproben wiesen annähernd die

erwartete theoretische Konzentration auf. Für beide Graphen sind wesentlich geringere

Standardabweichungen als bei Anwendung des kontinuierlichen Flusses zu verzeichnen.


Paracetamol (PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei



In den Versuchen mit Amoxicillin und Valsartan bei Nutzung des diskontinuierlichen

Perfusatflusses konnten, wie bereits für Paracetamol beschrieben, zuerst fünf

Dialysatproben ohne Arzneistoff gewonnen werden (Abbildung 30). Nach Zugabe der

Arzneistofflösung und damit einem erwarteten Anstieg der Konzentration in der Donor-

Lösung (theoretische Konzentrationen von 0,02 und 2,00 g/L für Amoxicillin und 0,016 und

0,16 g/L für Valsartan) wurde für beide Arzneistoffe und alle Konzentrationen ein starker

Anstieg verzeichnet. Bei Amoxicillin erreichte die Konzentration in den Proben annähernd die

theoretische Konzentration und verblieb dann auf diesem Niveau. Für beide Valsartan-

Lösungen war, verglichen mit der theoretischen Konzentration, eine um circa 15 %

A B

Zugabe der

Arzneistofflösung

Zugabe

des Mediums Zugabe der

Arzneistofflösung

Zugabe

des Mediums

Ergebnisse

49

verringerte Konzentration in den Dialysatproben messbar. Durch Zugabe des Mediums

wurde die Arzneistoffkonzentration im Donor-Gefäß um die Hälfte verringert. Bei den

Untersuchungen mit Amoxicillin und Valsartan wurde, wie bereits für Paracetamol

nachgewiesen, ein Abfall der Arzneistoffkonzentration sofort in der anschließend

gewonnenen Dialysatprobe quantifiziert. Auch bei dieser Konzentrationsveränderung

erreichten die Kurven der Amoxicillin-Lösungen annähernd die erwartete Konzentration,

während für Valsartan leicht erniedrigte Werte gemessen wurden. Die Experimente mit

Amoxicillin führten zu geringeren Standardabweichungen als die Untersuchungen mit

Valsartan.


I: Amoxicillin (AMX) und II: Valsartan (VAL) bei Anwendung des diskontinuierlichen

Flusses bei Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von I A: 0,02 g/L,

I B: 2,00 g/L, II A: 0,016 g/L und II B: 0,16 g/L, PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP

(MW ± SD, n = 3).

Die Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan wurden zusätzlich simultan

verwendet und analysiert. Die Experimente wurden jeweils als Einzelversuch für die niedriger

und höher konzentrierte Arzneistofflösung durchgeführt. Zu Beginn des Versuches befand

sich die Mikrodialyseeinheit im Donor-Gefäß mit dem arzneistofffreien Donor-Medium. Die

I A I B

II A II B

Ergebnisse

50

dabei gewonnen Dialysatproben enthielten, wie bereits für die Einzelstoffe mit dem

diskontinuierlichen Fluss nachgewiesen, keinen Arzneistoff (Abbildung 31). Nach Zugabe der

Arzneistofflösung, die alle drei Arzneistoffe in der bisher verwendeten Konzentration enthielt,

konnte ein Anstieg der Arzneistoffkonzentration in den darauffolgend gewonnenen

Dialysatproben gemessen werden. Dabei war bei Verwendung der niedrig konzentrierten

Lösung für Paracetamol und Amoxicillin ein sprunghafter Anstieg und für Valsartan ein

moderater Anstieg zu beobachten. Für Valsartan konnte erst in der 9. Dialysatprobe die

maximale Konzentration bestimmt werden, die dabei noch circa 10 % unter der theoretischen

Konzentration lag. Die Konzentration in den Dialysatproben bewegte sich bei Paracetamol

annähernd auf Höhe der theoretischen Konzentration, während die gemessenen Werte von

Amoxicillin ebenfalls circa 10 % unter der theoretischen Konzentration lagen. Für die

Untersuchung mit der höher konzentrierten Lösung konnte, wie für alle Arzneistoffe erwartet,

ein sprunghafter Anstieg detektiert werden. Die gemessenen Konzentrationen lagen für

Paracetamol und Amoxicillin wie erwartet auf Höhe der theoretischen Konzentration. Für die

Valsartan-Konzentration wurde eine Unterschreitung der theoretischen Konzentration um

circa 10 % ermittelt. Die Verringerung der Arzneistoffkonzentration in der Donor-Lösung

durch Zugabe des arzneistofffreien Mediums wurde sofort in den Dialysatproben gemessen.

Die Ausnahme bildete Valsartan in der niedrig konzentrierten Lösung, bei der ein

langsamerer Abfall der Arzneistoffkonzentration als erwartet ermittelt wurde. Für die niedrig

konzentrierte Arzneistofflösung wurden Paracetamol-Konzentrationen gemessen, die den

theoretischen Konzentrationen entsprachen. Die Amoxicillin-Konzentration lag ebenfalls circa

10 % unter der theoretischen Konzentration und die Valsartan-Konzentration erreichte ab der

13. Dialysatprobe die theoretische Konzentration. Die Arzneistoffkonzentrationen, die bei der

Untersuchung mit der höher konzentrierten Lösung nach Zugabe des Mediums gewonnen

wurden, stimmten alle mit der theoretischen Konzentration überein.

Ergebnisse

51

Abbildung 31: Vergleich der theoretisch und simultan experimentell bestimmten Konzentration von

Paracetamol (PCM), Amoxicillin (AMX) und Valsartan (VAL) in Phosphatpuffer pH 6,8

USP bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur, maximal

theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie

0,016 g/L für Valsartan, und B: 2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie

0,16 g/L für Valsartan, (n = 1).



3.2.3.1 Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung

Die vorgesehene mehrmalige Nutzung der Mikrodialysesysteme für In vitro-Untersuchungen

war mit regelmäßigen Spülvorgängen und einer Lagerung im Trockenen über mehrere Tage

verbunden. Der Einfluss des wiederholten In vitro-Einsatzes der Mikrodialysesysteme wurde

durch die Bestimmung der relativen Wiederfindung eines repräsentativen Mikrodialyse-

systems an verschiedenen Tagen ermittelt. Für acht Tage, innerhalb eines Intervalls von

14 Nutzungstagen, wurde die relative Wiederfindung von Paracetamol bei Anwendung des

diskontinuierlichen Flusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min bei Körpertemperatur

bestimmt. Die Zeit für die Lagerung der Mikrodialysesysteme wurde bei den

14 Nutzungstagen nicht berücksichtigt. In Abbildung 32 ist zu erkennen, dass die relative

Wiederfindung zwischen 60,2 und 66,0 % schwankte. Es war kein Trend für steigende oder

sinkende Werte im Verlauf der untersuchten Zeitspanne zu erkennen.

A B

Ergebnisse

52

Abbildung 32: Einfluss der Nutzungsdauer auf die relative Wiederfindung (RR) von Paracetamol

(PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur,

PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3).

3.2.3.2 Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung

Die Reproduzierbarkeit der Herstellung der Mikrodialysesysteme wurde untersucht, indem

die Bestimmung der relativen Wiederfindung für die Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin

und Valsartan erfolgte. Für Paracetamol resultierten aus dem Vergleich von acht

verschiedenen Mikrodialysesystemen (P1 bis P8) konzentrationsunabhängig Werte von 62,4

bis 68,5 % (Abbildung 33 A). Für Amoxicillin und Valsartan wurden jeweils die Ergebnisse

von vier Mikrodialysesystemen (A1 bis A4 und V1 bis V4) verglichen. Dabei wurden für

Amoxicillin Werte zwischen 45,7 und 52,1 % ermittelt (Abbildung 33 B). Ähnliche Werte für

die relative Wiederfindung von Valsartan (47,1 bis 53,0 %) wiesen ebenfalls auf einen

geringen Unterschied zwischen den Systemen hin (Abbildung 33 C).

Ergebnisse

53

Abbildung 33: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Herstellung der Mikrodialysesysteme über die

Bestimmung der relativen Wiederfindung (RR) von A: Paracetamol (PCM, P1 bis P8),

B: Amoxicillin (AMX, A1 bis A4) und C: Valsartan (VAL, V1 bis V4) bei Anwendung

des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur, PP: Phosphatpuffer pH 6,8

USP (MW + SD, n = 3).

3.2.3.3 Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung

Die Medien Salzsäure pH 1,2, Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF wurden auf

ihren Einfluss auf den Stofftransport durch die semipermeable Kapillarmembran im Vergleich

zur Anwendung des Phosphatpuffers pH 6,8 USP untersucht. Die Werte der relativen

Wiederfindung von Paracetamol als Arzneistoff und Phosphatpuffer pH 6,8 USP als Donor-

Medium bildeten mit 68,5 und 67,9 % die Referenz für weitere Untersuchungen

(Abbildung 34). Für die Medien Salzsäure pH 1,2, Bicarbonatpuffer pH 6,8 und FaSSIF sind

relative Wiederfindungen von durchschnittlich 66,0 bis 71,2 % zu verzeichnen. Der Einsatz

von FeSSIF als Donor-Medium resultierte in niedrigeren Werten von durchschnittlich 63,4 %.

A B

C

Ergebnisse

54

Abbildung 34: Einfluss des Donor-Mediums auf die relative Wiederfindung (RR) von Paracetamol

(PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur,

PP: Phosphatpuffer pH 6,8 USP, HCl: Salzsäure pH 1,2, BP: Bicarbonatpuffer pH 6,8,

FaSSIF: Fasted State Simulated Intestinal Fluid, FeSSIF: Fed State Simulated

Intestinal Fluid (MW + SD, n = 3).

3.2.3.4 Einfluss des Perfusats auf die relative Wiederfindung

Mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP und NaCl-Lösung pH 7,0 und 4,5 als Perfusat wurde dessen

Einfluss auf die relative Wiederfindung der Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und

Valsartan untersucht. Für die untersuchten Perfusate wurden für Paracetamol relative

Wiederfindungen zwischen 64,1 und 67,5 % bestimmt (Tabelle 8). Die Untersuchungen mit

Amoxicillin führten zu Werten von 51,3 bis 55,6 %. Für Valsartan konnten ähnliche Werte für

die relative Wiederfindung von 52,2 bis 57,7 % für alle untersuchten Perfusate ermittelt

werden.

Ergebnisse

55

Tabelle 8: Relative Wiederfindung von Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bei Verwendung

von Phosphatpuffer pH 6,8 USP, NaCl-Lösung pH 7,0 und 4,5 als Perfusat und

Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur (MW ± SD (%),

n = 3).

Paracetamol Phosphatpuffer pH 6,8 USP NaCl-Lösung pH 7,0 NaCl-Lösung pH 4,5

0,02 g/L 66,6 ± 1,8 65,5 ± 2,4 66,5 ± 1,7

2,00 g/L 66,7 ± 1,0 67,5 ± 0,3 64,1 ± 1,3

Amoxicillin Phosphatpuffer pH 6,8 USP NaCl-Lösung pH 7,0 NaCl-Lösung pH 4,5

0,02 g/L 55,6 ± 1,3 51,3 ± 0,6 53,7 ± 0,4

2,00 g/L 53,7 ± 0,2 53,6 ± 0,5 54,1 ± 0,5

Valsartan Phosphatpuffer pH 6,8 USP NaCl-Lösung pH 7,0 NaCl-Lösung pH 4,5

0,016 g/L 55,4 ± 2,0 57,7 ± 1,4 57,6 ± 2,7

0,16 g/L 52,2 ± 0,8 56,0 ± 1,0 56,9 ± 0,2

3.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien

Die Sensitivität des Mikrodialysesystems, Konzentrationsänderungen im Donor-

Kompartiment in den Dialysatproben abbilden zu können, wurde ebenfalls mit Salzsäure

pH 1,2 und den biorelevanten Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF als

Donor-Medien überprüft.

In den nachfolgend aufgeführten Graphen sind die Ergebnisse für alle Medien und beide

Paracetamol-Konzentrationen dargestellt (Abbildung 35). Zu Beginn des Versuches enthielt

das Donor-Kompartiment keinen Arzneistoff. In den ersten fünf Dialysatproben ist deshalb

kein Arzneistoff quantifizierbar. Nach Zugabe der Paracetamol-Lösung wurde bei allen

Untersuchungen ein sprunghafter Anstieg der Paracetamol-Konzentration in der

darauffolgenden Dialysatprobe gemessen. Das erreichte Plateau entspricht annähernd den

theoretischen Konzentrationen von 0,02 und 2,00 g/L. Die Halbierung der Paracetamol-

Konzentration im Donor-Kompartiment konnte durch einen schlagartigen Abfall der

Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben gemessen werden. Unabhängig vom

verwendeten Donor-Medium erreichten die Paracetamol-Konzentrationen zum Ende der

Untersuchungen annähernd die angestrebten Konzentrationen von 0,01 und 1,00 g/L.

Ergebnisse

56

Abbildung 35: Vergleich der theoretisch und experimentell bestimmten Konzentrationen Paracetamol

(PCM) mit I: Salzsäure pH 1,2 (HCl), II: Bicarbonatpuffer pH 6,8 (BP), III: Fasted State

Simulated Intestinal Fluid (FaSSIF) und IV: Fed State Simulated Intestinal Fluid

(FeSSIF) als Donor-Medium bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei


B: 2,00 g/L (MW ± SD, n = 3).

I A I B

II A II B

III A III B

IV A IV B

Ergebnisse

57

3.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell

Zur Simulation der anatomischen Verhältnisse des Darmes wurden Untersuchungen in

einem Röhrenmodell durchgeführt. Dabei wurde das Mikrodialysesystem in einen

temperierten Kunststoffschlauch eingebracht und zur Simulation von atmungsindizierten

Darmbewegungen mit 12 Bewegungen pro Minute leicht bewegt. Die ersten fünf

Dialysatproben enthielten, wie bei den vorherigen Versuchen mit dem diskontinuierlichen

Perfusatfluss gezeigt, keinen Arzneistoff (Abbildung 36). Nach Zugabe der Paracetamol-

Lösung erfolgte unabhängig von der verwendeten Konzentration der Lösung ein starker

Anstieg der Paracetamol-Konzentration in den Dialysatproben (Abbildung 36, grüne

Quadrate). Die gemessenen Paracetamol-Konzentrationen waren jedoch fast doppelt so

hoch wie die theoretisch erwarteten Paracetamol-Konzentrationen (Abbildung 36, graue

Quadrate). Die Bestimmung der Arzneistoffkonzentrationen direkt an der Mikrodialyseeinheit

resultierte in abweichenden Paracetamol-Konzentrationen (Abbildung 36, violette Quadrate)

im Vergleich zu den theoretischen Paracetamol-Konzentrationen des Donor-

Kompartimentes. Die Dialysatproben 6 bis 10 ergaben für beide Paracetamol-Lösungen

Konzentrationen, die annähernd 10 % unter der gemessenen Paracetamol-Konzentration an

der Mikrodialyseeinheit lagen sowie sehr hohe Standardabweichungen aufwiesen. Die

Verringerung der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment resultierte in stark

fallenden Paracetamol-Konzentrationen in den Dialysatproben. Dabei verringerte sich die

Paracetamol-Konzentration stärker als es die theoretische Konzentration erwarten ließ. Zum

Ende der Versuchszeit näherte sich die gemessene Paracetamol-Konzentration sehr stark

der an der Mikrodialyseeinheit gemessenen Konzentration an.


Paracetamol (PCM) bei Anwendung im Röhrenmodell mit dem diskontinuierlichen

Fluss bei Körpertemperatur, maximal theoretische Konzentration von A: 0,02 g/L und


A B

Ergebnisse

58


humane Anwendung

3.3.1 Adaption des Mikrodialysesystems

Nach erfolgreicher Entwicklung und In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems wurde das

Mikrodialysesystem in Zusammenarbeit mit der Firma RoweMed an die humane Anwendung

angepasst und produziert. Dafür erfolgte zuerst der Transfer des Herstellungsprozesses.

Dabei wurden die Mitarbeiter vor Ort in die Herstellung der Mikrodialyseeinheiten

und -systeme, einschließlich der Prüfung auf Kapillardurchlässigkeit, eingewiesen.

Anschließend erfolgte die Adaption des Mikrodialysesystems nach arbeitskreisinternen

Vorgaben durch die Firma RoweMed. Die Gesamtlänge des Systems wurde auf 4 m

verlängert und zwei Mikrodialysesysteme in einem Set kombiniert (Abbildung 37). Die

Mikrodialysesysteme wurden zuerst mit den Medicoplast-Schläuchen, die gegenüber den

bisher verwendeten Tygon®-Schläuchen einen verringerten Außendurchmesser von 3,0 mm

aufwiesen, hergestellt.

Abbildung 37: Adaptiertes Mikrodialyseset bestehend aus jeweils zwei Mikrodialyseeinheiten (M),

Zufluss- und Ablaufschläuchen, Schläuchen zum Abtrennen der Proben mit Hilfe von

Luftblasen und einem Zuggewicht (G).

Ergebnisse

59

In einem zweiten Schritt konnte der Schlauchaußendurchmesser weiter reduziert werden,

sodass weitere Sets mit Außendurchmessern von 2,0 und 1,5 mm (Versilic®-Schlauch)

angefertigt wurden. Das Verbinden der einzelnen Komponenten erfolgte mit Hilfe von selbst

gegossenen Silikon-Verbindungsstücken aus Elastosil®, das Verkleben wurde mit dem

identischen Silikon durchgeführt. Die Stabilisierung des Mikrodialysesystems und der

Mikrodialyseeinheiten wurde durch anschließendes punktuelles Verkleben der Schläuche

und Verbindungstücke untereinander erreicht. Dabei blieb die bisherige Flexibilität des

Systems erhalten. Die Schläuche wurden am distalen Ende des Mikrodialysesystems in

Silikon eingegossen, um ein Abknicken der Schläuche zu verhindern und um das Anbringen

eines Zuggewichtes mit Titankugeln (Abbildung 38, G) zu ermöglichen. Für die Herstellung

des adaptierten Mikrodialysesystems wurden nachgewiesen biokompatible Materialien

verwendet.


Die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialysesysteme bei der Firma RoweMed wurde

durch den Vergleich der relativen Wiederfindung überprüft. Die untersuchten Mikrodialyse-

systeme wurden mit zwei unterschiedlichen Silikonschläuchen hergestellt. Die Systeme MP1

bis MP3 enthielten den Medicoplast-Schlauch und die Systeme VS1 bis VS5 wurden unter

Verwendung des Versilic®-Schlauches hergestellt. Die Untersuchungen mit Paracetamol

ergaben für alle Mikrodialysesysteme Werte von durchschnittlich 62,5 bis 70,2 % für die

relative Wiederfindung (Abbildung 38). Für die verwendeten Schläuche (Medicoplast- oder

Versilic®-Schlauch) konnte kein Einfluss auf die relative Wiederfindung von Paracetamol

nachgewiesen werden.

Ergebnisse

60

Abbildung 38: Prüfung der adaptierten Mikrodialysesysteme hinsichtlich der relativen Wiederfindung

(RR) von Paracetamol (PCM) bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei

Körpertemperatur, MP: Medicoplast-Schlauch, VS: Versilic®-Schlauch, PP: Phosphat-

puffer pH 6,8 USP (MW + SD, n = 3).


Dialysatproben

Zur Bestimmung des pH-Wertes im Donor-Kompartiment wurden Dialysatproben pH-

metrisch untersucht. Dabei wurden arzneistofffreie Medien unterschiedlicher pH-Werte

(Salzsäure pH 1,2, 3,0, 4,0, 5,0 und Phosphatpuffer pH 6,8 USP) als Donor-Medium und

Phosphatpuffer pH 6,8 USP und NaCl-Lösung pH 5,5 als Perfusat genutzt. Die Verwendung

von Salzsäure pH 1,2 führte unabhängig vom Perfusat zu pH-Werten von circa pH 1,3 in den

Dialysatproben (Tabelle 9). Der Anstieg des pH-Wertes im Donor-Medium auf pH 3,0

resultierte wie erwartet in erhöhten pH-Werten von durchschnittlich pH 3,6 in den Proben.

Durch den Einsatz von Salzsäure pH 4,0 und 5,0 sowie Phosphatpuffer pH 6,8 USP wurden

ähnliche pH-Werte von durchschnittlich pH 6,8 und pH 6,6 in den Dialysatproben für das

Perfusat Phosphatpuffer pH 6,8 USP und die NaCl-Lösung pH 5,5 gemessen.

Tabelle 9: Ermittelte pH-Werte in den Dialysatproben bei der Verwendung von Phosphatpuffer

pH 6,8 USP (PP) und NaCl-Lösung pH 5,5 als Perfusat sowie Salzsäure (HCl) pH 1,2;

3,0; 4,0; 5,0 und Phosphatpuffer pH 6,8 USP als Donor-Medium und Anwendung des

diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur (n = 1).

Donor-Medium

Perfusat HCl pH 1,2 HCl pH 3,0 HCl pH 4,0 HCl pH 5,0 PP

PP 1,33 3,74 6,84 6,92 6,81

NaCl-Lösung pH 5,5 1,27 3,48 6,44 6,63 6,76

Ergebnisse

61


Die zum Einsatz am Menschen zugelassen Pumpen der Firma Braun (Infusomat® und

Perfusor® Space Pumpen) wurden auf ihre Eignung bei Anwendung mit dem

diskontinuierlichen Perfusatfluss überprüft.

Dafür wurden beide Pumpen zuerst auf ihre Transporteigenschaften bezüglich der Medien

(wässrige Zubereitungen als Perfusat und Luft zum Abtrennen der Dialysatproben im

Ablaufschlauch) untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Luftblasendetektor der Infusomat®

Space Schlauchpumpe sofort einen Luftblasen-Alarm auslöste, sobald Luft zum Abtrennen

der Dialysatproben in der Messzelle des Gerätes detektiert wurde. Das Gerät stellte

infolgedessen sofort den Betrieb ein. Demgegenüber erfolgte der Transport des Perfusats

bei Nutzung der Infusomat® Space Pumpe ohne Einschränkungen. Für die Abtrennung der

Dialysatproben im Ablaufschlauch wurde daraufhin ausschließlich die Perfusor® Space

Spritzenpumpe genutzt. Dafür wurde die Pumpe mit einer 50 mL-Spritze bestückt. Das

aufgezogene Luftvolumen betrug 10 bis 50 mL. Die komplett mit Luft befüllte 50 mL-Spritze

führte zu fehlenden Luftblasen zwischen den einzelnen Dialysatproben. Eine Verringerung

des aufgezogenen Luftvolumens auf 25 mL resultierte in abgetrennten Dialysatproben mit

unterschiedlich großen Luftblasen. Außerdem waren innerhalb der Dialysatproben kleine

Luftblasen vorhanden. Eine Abnahme des aufgezogenen Luftvolumens auf 20 und 10 mL

führte zu gleichmäßig abgetrennten, luftblasenfreien Dialysatproben im Ablaufschlauch. Der

Einsatz einer 20 mL Spritze mit einem aufgezogenen Volumen von 20 oder 10 mL führte

zum gleichen Ergebnis.

Aus diesem Grund wurde für die nachfolgenden Untersuchungen die Infusomat® Space

Schlauchpumpe zum Transport des Perfusats und die Perfusor® Space Spritzenpumpe zum

Transport der Luft genutzt. Die eingeschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen führte zu

Experimenten mit modifizierten Zeiten für den Transport des Perfusats und die

Equilibrierung. Die maximale Dauer eines Zyklus aus Pump- und Equilibrierzeit betrug dabei

1 min. Die Experimente wurden mit Pumpzeiten von 15 bis 18 s durchgeführt. Als Referenz

dienten die bisher verwendeten Untersuchungen mit den MCP Schlauchpumpen mit einer

Equilibrierzeit von 60 s und einem Fluss des Perfusats von 18 s. Die Ergebnisse, die mit

einem repräsentativen Mikrodialysesystem gewonnen wurden, sind nachfolgend aufgeführt

(Tabelle 10). Die Nutzung der bisher verwendeten MCP Pumpen resultierte in Werten für die

relative Wiederfindung von 69,3 %. Der Einsatz der Infusomat® und Perfusor® Space

Pumpen führte mit einer Pumpzeit von 15 bis 18 s zu sehr einheitlichen relativen

Wiederfindungen von 68,4 bis 70,0 %.

Ergebnisse

62

Tabelle 10: Relative Wiederfindung von Paracetamol bei Verwendung der MCP, Infusomat® und

Perfusor® Space Pumpen bei Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei

Körpertemperatur (MW ± SD (%), n = 6).

Pumpe zum Transport des Perfusat/

Pumpe zum Setzen von Luftblasen

Equilibrierzeit

(s)

Pumpzeit

(s)

relative

Wiederfindung

MCP/MCP 60 18 69,3 ± 0,7

Infusomat®/Perfusor® 45 15 70,0 ± 1,0




Diskussion

63

4 Diskussion


Die Mikrodialyse bietet die einzigartige Möglichkeit der Bestimmung von geringen

Konzentrationen eines wasserlöslichen und ungebundenen Stoffes in Geweben und

Organen. Die notwendige Wasserlöslichkeit des Stoffes wird hierbei durch die üblicherweise

verwendeten wässrigen Perfusionsflüssigkeiten, wie zum Beispiel Ringer-Lösung oder

salinen Phosphatpuffer bedingt [82], da ein Übertritt des untersuchten Stoffes ins Perfusat

erfolgen muss. Die Mikrodialysemembran bestimmt mit ihrer spezifischen Porengröße bis zu

welcher Molekülmasse ein Stoff die Membran passieren kann. Häufig werden

Mikrodialysesonden mit einer Molekülmassen-Ausschlussgrenze von 6 bis 100 kDa

eingesetzt. Diese sind für große Moleküle wie Proteine nicht permeabel, sodass nur der

ungebundene Stoff ins Perfusat diffundieren kann [85]. Daher wird mit dieser Methode nur

der Stoffanteil, der durch biologische Membranen diffundieren kann, bestimmt. Die

Mikrodialysetechnik wurde bereits zur Bestimmung von intraluminalen Stoffkonzentrationen

im Darm des Schweins und des Menschen genutzt [84, 97, 100]. Die bisherige Platzierung

der Mikrodialysesonden mit chirurgisch invasiven Verfahren bedingt jedoch eine geringe

Akzeptanz dieser Technik bei der Anwendung im Dünndarmlumen des Menschen. Weitaus

häufiger erfolgt die Bestimmung der intestinalen Konzentration und Absorption eines

Arzneistoffes im Menschen mit mehrlumigen Sonden. Dabei werden definierte Darm-

segmente perfundiert und entsprechende Proben aspiriert [59, 66, 67]. Mit dieser Technik

können jedoch der intestinale Wasserhaushalt und somit die intraluminalen Bedingungen

beeinflusst werden. Durch die Kombination beider Techniken können die genannten

Nachteile behoben werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein oral applizierbares

Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in

vitro geprüft. Die vorgesehene humane Anwendung wurde bei der Entwicklung durch die

Verwendung von Materialien, die beständig gegenüber Säuren und Gallensalzen, inert

gegenüber Arzneistoffen und biokompatibel sind, berücksichtigt. Dabei wurde vor allem auf

die Qualität der verwendeten Schläuche, Klebstoffe und Hohlfaserkapillaren geachtet, da

diese den größten Teil des Systems darstellen.

Das neu entwickelte Mikrodialysesystem besteht aus einer flexiblen Mikrodialyseeinheit und

elastischen Schläuchen. Der verwendete Tygon® 3350-Schlauch entspricht der

Biokompatibilitätsprüfung für Medizinprodukte und Implantate der USP mit der Einordnung in

die Klasse VI [110, 112]. Dies bedeutet, dass dieser Schlauch permanent im Blutgefäß-

system oder auf verletzten Geweben angewendet werden kann, da er nicht toxisch, nicht

hämolytisch und nicht pyrogen ist. Die Verbindung der einzelnen Komponenten des Systems

Diskussion

64

erfolgte mit Klebstoffen, deren Biokompatibilität ebenfalls durch Zertifikate der Hersteller

belegt wurde [113, 114].

Die flexible Mikrodialyseeinheit des Systems besteht aus Hohlfaserkapillaren (Fresenius

Polysulfon®) die üblicherweise in Dialysatoren zur Hämodialyse verarbeitet werden und damit

für den Kontakt mit Blut geeignet sind [116-118]. Die verwendeten Polysulfon-Kapillaren

können mit drei unterschiedlichen Methoden, der Behandlung mit gespannten und

gesättigten Wasserdampf, mit Ethylenoxid und mit Gamma-Strahlung, sterilisiert werden. Für

Kapillaren aus Polyacrylnitril oder Polyamid sind nur die Sterilisation mit Ethylenoxid und die

Bestrahlung möglich. Die Sterilisation mit Ethylenoxid kann zu akuten Überempfindlichkeits-

reaktionen bei den Patienten und die Bestrahlung zu strukturellen und optischen

Veränderungen des Polymers sowie zur Freisetzung von Nebenprodukten führen [117]. Da

die Dampfsterilisation in diesem Fall das produkt- und patientenschonendste Sterilisations-

verfahren darstellt, wurde sich im Rahmen der Systementwicklung für die Verwendung der

Polysulfon-Kapillaren entschieden. Das Material, der in der Mikrodialyseeinheit verwendeten

Hohlfaserkapillaren, ist eine Mischung aus Polysulfon und dem Additiv Polyvinylpyrrolidon.

Dabei ist das hydrophile Polyvinylpyrrolidon im hydrophoben Polysulfon eingebettet. Der

Zusatz des Additivs erhöht die Benetzbarkeit der Membranoberfläche und ermöglicht somit

den Einsatz der Kapillaren in wässrigen Medien wie zum Beispiel Blut [116, 119]. Die

Hohlfaserkapillaren des Mikrodialysesystems trennen das Donor-Kompartiment von der

Perfusionsflüssigkeit. Über die enthaltenen Poren der Kapillarmembran (Molekülmassen-

Ausschlussgrenze 5000 Da) ist jedoch ein Stoffaustausch zwischen beiden Kompartimenten

möglich. Im Vergleich zu den bisher verwendeten Schlauchsystemen, die über große

Öffnungen (bis zu 1,8 cm) zur Perfusion und Aspiration verfügen [59, 71], wird der intestinale

Wasserhaushalt durch die Verwendung des Mikrodialysesystems vermutlich nicht

beeinflusst, da es als volumeneutrale Technik beschrieben wird [82]. In diesem

Zusammenhang ist ebenfalls davon auszugehen, dass die einzelnen Flüssigkeitsnester, die

im nüchternen Zustand im Dünndarm vorhanden sind [17], nicht durch eingebrachte oder

entnommene Flüssigkeitsmengen in ihrer Anzahl und ihrem Volumen beeinflusst und lokal

gemessene Arzneistoffkonzentrationen nicht verändert werden. Eine unphysiologische

Dehnung des Dünndarms, die durch hohe Flussraten von bis zu 20 mL/min bei der Perfusion

des entsprechenden Darmabschnittes hervorgerufen werden kann, wird ebenfalls durch die

Verwendung des Mikrodialysesystems vermieden, da in diesem Fall eine geringe

Perfusatflussrate von 1 mL/min innerhalb des Mikrodialysesystems angewendet wird [66,

75]. Es ist dementsprechend davon auszugehen, dass die Absorption des Arzneistoffes

weder durch eine veränderte intestinale Durchblutung noch durch eine veränderte

Darmperistaltik und damit veränderte Lokalisation des Arzneistoffes beeinflusst wird [71, 76].

Diskussion

65

Bei der Entwicklung der Mikrodialyseeinheit bestand die Forderung, dass eine möglichst

große Austauschfläche zur Verfügung stehen sollte. Die angedachte Verwendung von

50 oder 100 Hohlfaserkapillaren in einer Mikrodialyseeinheit konnte nicht umgesetzt werden,

da der Tygon®-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,85 mm für die Zufluss- und

Ablaufschläuche verwendet werden sollte. Somit konnten theoretisch 43 Kapillaren verbaut

werden, um eine lückenlose Verbindung der Mikrodialyseeinheit mit den Schläuchen zu

erhalten. In der Praxis erwies sich die theoretisch berechnete Anzahl an Kapillaren als nicht

anwendbar, da der verwendete Klebstoff ebenfalls Raum beanspruchte. Die Herstellung von

Mikrodialyseeinheiten erfolgte dementsprechend mit einer reduzierten Anzahl an Kapillaren.

Die Verklebung der Kapillaren erfolgte, indem zuerst die Kapillaren mit Klebstoff umgeben

und dann für den Prozess des Aushärtens, durch Einrollen in Folie, in eine möglichst runde

Form gebracht wurden. Die erhaltenen Verklebungen wiesen teilweise undurchlässige und

deformierte Kapillaren auf. Eine weitere Verringerung der Anzahl an Kapillaren führte zu

Verklebungen mit durchlässigen Kapillaren, die größtenteils von Klebstoff umgeben waren.

Ein großer Nachteil dieser Herstellungstechnik war das tropfenförmige Aussehen der

Verklebung. Die Mikrodialyseeinheit konnte somit nicht in die entsprechenden Schläuche

eingefügt werden. Die optimierte Herstellung der endständigen Verklebung durch Einbettung

der Kapillaren in eine Silikonmanschette konnte dieses Problem beheben. So wies die finale

Mikrodialyseeinheit runde Verklebungen auf und enthielt fertigungsbedingt 30 Kapillaren. Um

die Integrität der Kapillaren und der Verklebung der hergestellten Mikrodialyseeinheiten zu

gewährleisten, wurden alle Einheiten vor der Weiterverarbeitung auf vollständige

Kapillardurchlässigkeit geprüft. Für die Herstellung der Mikrodialysesysteme wurden die

hergestellten Mikrodialyseeinheiten nur verwendet, wenn alle 30 Kapillaren durchlässig

waren und eine Austauschlänge von 10 cm aufwiesen. Dies resultierte in Mikrodialyse-

einheiten mit einer relativ großen Austauschfläche von circa 26 cm2 im Vergleich zu den

häufig eingesetzten kommerziell erhältlichen Mikrodialysesonden. Diese weisen im

Allgemeinen eine Membran mit Austauschlängen von 1 bis 10 mm und Durchmessern von

0,24 bis 0,5 mm auf, sodass eine maximale Austauschfläche von 0,16 cm2 zur Verfügung

steht. Die Austauschlänge der eigens hergestellten Mikrodialyseeinheit ist mit 10 cm im

Vergleich zu den bisher verwendeten Mikrodialysesonden, die kommerziell erhältlich oder

durch die Arbeitsgruppen hergestellt waren, ebenfalls relativ hoch [83, 84, 87, 91, 120], auf

den gesamten Dünndarm, mit einer Länge von 250 bis 350 cm [3, 4], als Untersuchungsort

bezogen, jedoch gering. Somit kann in später durchgeführten Untersuchungen am

Menschen eine ausreichend hohe räumliche Auflösung erreicht werden. Die

eigenentwickelte Mikrodialyseeinheit ermöglichte aufgrund ihrer Dimension die Anwendung

von Flussraten von 1 mL/min. Dies resultierte in Probenvolumina von 300 µL, unabhängig

davon, ob das Mikrodialysesystem mit dem kontinuierlichen oder diskontinuierlichen

Diskussion

66

Perfusatfluss verwendet wurde. Herkömmliche Mikrodialysesonden werden kontinuierlich mit

Flussraten von 1 bis 2 µL/min perfundiert, um eine ausreichend hohe relative Wiederfindung

in den Dialysatproben zu erhalten [82]. Diese Flussraten resultieren in geringen

Probenvolumina von 10 bis 60 µL und langen Zeitintervallen von 10 bis 60 min, um diese

Volumina zu generieren [92, 97, 100, 121, 122]. Chaurasia et al. berichtete bereits, dass

solch kleine Probenvolumina zu Problemen bei der Detektion von geringen Arzneistoff-

konzentrationen mit herkömmlichen analytischen Methoden führen können [82]. Bei

Anwendung des neu entwickelten Mikrodialysesystems konnte das Probenvolumen

vergleichsweise um das 5-fache erhöht werden. Dabei ist die relative Wiederfindung

höchstwahrscheinlich geringer als bei den bisher angewendeten Untersuchungen, allerdings

ist die absolute Wiederfindung aufgrund des großen Probenvolumens erhöht. Somit sollte

auch die Quantifizierung geringer Stoffmengen eines oder mehrerer Analyten in den

Dialysatproben problemlos möglich sein.

Zur zeitgleichen Bestimmung der luminalen Arzneistoffkonzentration an unterschiedlichen

Stellen im Dünndarm können zwei Mikrodialysesysteme in einem Set miteinander kombiniert

werden. Um ein Abknicken der zurücklaufenden Schläuche zu verhindern und zur

selbstständigen intraluminalen Vorwärtsbewegung des Mikrodialysesystems durch die

Peristaltik des Dünndarms, wurde ein Zuggewicht am distalen Ende des

Mikrodialysesystems angebracht. Zur Beschwerung des Zuggewichtes wurde, entgegen den

bisher in Studien verwendeten Materialien Quecksilber und Wolfram [59, 68, 75], Titan

ausgewählt. Dieses Material wurde gewählt, da in verschiedenen Untersuchungen bereits

gezeigt wurde, dass Titanimplantate für die Anwendung im MRT-Gerät gut geeignet sind, da

sie kaum Artefakte produzieren [123]. Eine mögliche Anwendung des Mikrodialysesystems in

Kombination mit bildgebenden Verfahren wie der MRT wurde somit bereits bei der

Entwicklung berücksichtigt. Die Verwendung des Mikrodialysesets bietet einige Vorteile. So

erfolgt bei den bisher verwendeten Systemen, die nur eine Messstelle besitzen, der

Transport des jeweiligen Systems zum nächsten, tiefergelegenen Darmabschnitt durch die

natürliche Peristaltik. Ein erforderlicher Vorwärtstransport von 100 cm kann so 6 bis 18 h

dauern [59]. Alternativ kann zeitversetzt eine erneute Applikation des Systems erfolgen. Dies

bedingt jedoch einen erhöhten zeitlichen Aufwand für Probanden und Mitarbeiter und führt

dementsprechend zu Mehrkosten bei der Untersuchung. Zudem sinkt die Bereitschaft der

Probanden, an solchen Studien zur Bestimmung der intestinalen Arzneistoffkonzentration

und Absorption mitzuwirken und diese zu vollenden. Bei Verwendung des neuen

Mikrodialysesets kann diese Zeit eingespart werden. Im zeitlichen Verlauf kann dann das An-

und Abfluten des Arzneistoffes in den unterschiedlichen Bereichen des Dünndarmes

simultan gemessen und Rückschlüsse auf dessen Absorption gezogen werden. Das von

Diskussion

67

Brouwers et al. verwendete Aspirationssystem ermöglicht ebenfalls die Sammlung von

intestinalen Proben an zwei unterschiedlichen Stellen im Dünndarm. Dafür werden jedoch

zeitgleich zwei Sonden platziert, eine im Duodenum und eine weitere im Jejunum [74]. Es

müssen dementsprechend zwei Sonden oral appliziert, an der entsprechenden Stelle

platziert und deren Position überprüft werden.

Da Perfusions- und Aspirationssysteme mit ähnlichen Dimensionen bereits erfolgreich zur

Bestimmung von intestinalen Arzneistoffkonzentrationen angewendet wurden [59, 68, 74], ist

davon auszugehen, dass die orale Applikation und Anwendung des neu entwickelten

Mikrodialysesystems nahezu ohne Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Probanden

erfolgen kann. Der größte Nachteil der bisher zur Untersuchung der intestinalen

Stoffkonzentration verwendeten Mikrodialysesonden, die verringerte Akzeptanz bei den

Probanden durch die Platzierung der Sonden mit chirurgisch invasiven Verfahren [100],

entfällt somit bei der oralen Anwendung des neuartigen Mikrodialysesystems.

Somit lässt sich feststellen, dass ein bewegliches aber dennoch ausreichend robustes

System für die vorgesehene intestinale Anwendung im Menschen zur Verfügung stand,

welches im nächsten Schritt in vitro charakterisiert werden sollte.


Das neu entwickelte Mikrodialysesystem wurde mit den Arzneistoffen Paracetamol,

Amoxicillin und Valsartan auf seine Eignung zur intestinalen Bestimmung von

Arzneistoffkonzentrationen untersucht. Die drei Arzneistoffe wurden hinsichtlich ihres

Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt und sollen in einer späteren

Studie am Menschen als Modellsubstanzen dienen.

Als Vertreter der nicht sauren antipyretischen Analgetika zeichnet sich Paracetamol durch

eine fiebersenkende und schmerzstillende Wirkung aus. Diese Wirkungen basieren auf

einem multifaktoriellen Wirkungsmechanismus, der eine selektive Hemmung der

Cyclooxygenase 2, eine Hemmung des Abbaus von Endocannabinoiden, eine Beeinflussung

der Signalgebung durch Serotonin und eine Hemmung der Bildung von Stickstoffmonoxid

umfasst [124-127]. Paracetamol wird aus dem gesamten Dünndarm transzellulär durch

Diffusion absorbiert. Dabei ist die Geschwindigkeit der Arzneistoffabsorption von der

Freisetzung aus der Arzneiform und der Geschwindigkeit der Magenentleerung abhängig

[24, 59, 128]. Die orale Bioverfügbarkeit von Paracetamol liegt dosisabhängig bei 70 bis

90 % und die Halbwertszeit beträgt 1,9 bis 2,5 h. Paracetamol wird vor allem in der Leber

durch Glucuronidierung und Sulfatierung metabolisiert. Ein geringer Anteil von 4 % wird

unverändert renal eliminiert [128]. Aufgrund der gleichmäßigen Absorption entlang des

Diskussion

68

gesamten Dünndarms kann Paracetamol als Referenzsubstanz für die Untersuchung der

regioselektiven Absorption von weiteren Arzneistoffen und zur Bestimmung der

Magenentleerung herangezogen werden.

Amoxicillin ist ein Vertreter der ß-Lactam-Antibiotika, genauer der Aminopenicilline. Es ist ein

selektiver Inhibitor bakterieller Transpeptidasen, die die Quervernetzung der Peptidoglykan-

Einheiten in der Zellwand katalysieren. Durch die Acylierung der Transpeptidasen wird die

Biosynthese der Zellwand inhibiert und damit deren Integrität und Stabilität gestört. Dies

hemmt das Wachstum proliferierender Bakterien und induziert deren Lyse [129, 130].

Amoxicillin weist eine orale Bioverfügbarkeit von 77 ± 17 % auf [131]. Die im Vergleich zu

anderen Penicillinen hohe Bioverfügbarkeit basiert auf der enthaltenen Aminogruppe, die für

die Säurestabilität des Amoxicillins verantwortlich ist [103]. Die intestinale Absorption des

Amoxicillins verringert sich vom Jejunum zum Colon [132]. Zusätzlich ist eine verringerte

AUC nach oraler Gabe von 750 bis 3000 mg Amoxicillin im Vergleich zur AUC von 325 mg

Amoxicillin zu beobachten. Dies spricht neben der passiven Diffusion auch für einen aktiven

Transport des Arzneistoffes [133]. Der Oligopeptid-Transporter PEPT1, der in der apikalen

Enterozytenmembran lokalisiert ist, wurde 1994 als Transporter für Amoxicillin identifiziert

[134]. Der Zusammenhang zwischen der regionalen Absorption von Amoxicillin, vor allen im

oberen Dünndarm, und der Lokalisation von PEPT1 im Darm konnte bereits bestätigt werden

[39, 40]. Amoxicillin wird zu 80 % renal eliminiert und besitzt eine Halbwertszeit von

1,4 ± 0,4 h [133, 135]. Mit seiner schnellen und guten Absorption in proximalen Dünndarm-

bereichen stellt Amoxicillin somit einen guten Modellarzneistoff für Untersuchungen mit

regioselektiv absorbierten Arzneistoffen dar.

Valsartan ist ein Angiotensin-II-Rezeptor Antagonist, der hochselektiv am AT1-Rezeptor-

Subtyp wirkt [136]. Die Blockade des Rezeptors führt unter anderem zu einer Verringerung

der koronaren und renalen Vasokonstruktion der Blutgefäße, zu einer Verminderung der

Aldosteron- und Vasopressinsekretion und damit zu einer erhöhten Natrium- und

Wasserausscheidung. In der Praxis wird Valsartan zur Behandlung der essentiellen

Hypertonie und Herzinsuffizienz eingesetzt [137]. Valsartan wird schnell aus dem Darm

absorbiert. Die orale Bioverfügbarkeit beträgt 39 % [138]. Die hepatische Aufnahme erfolgt

über OATP1B1 und OATP1B3 und die aktive Exkretion in die Galle über MRP2 [139].

Valsartan wird größtenteils unverändert fäkal ausgeschieden und nur zu 10 % durch

Hydroxylierung metabolisiert. Die Halbwertszeit von Valsartan beträgt 7 h [138, 140]. Die am

Absorptionsprozess beteiligten Transporter und Enzyme des humanen Darms konnten bis

jetzt nicht eindeutig identifiziert werden. Untersuchungen im Caco-2-Zellmodell zeigen

jedoch, dass Valsartan ein Substrat von ABCB1 sowie ein Inhibitor von PEPT1 ist [141, 142].

Aus diesem Grund eignet sich Valsartan als Modellarzneistoff für Untersuchungen zur

Diskussion

69

Bestimmung des Einflusses intestinaler Transporter auf die Absorption eines Arzneistoffes.

Zusätzlich können mit der simultanen Gabe von Arzneistoffen die den gleichen Transporter,

wie zum Beispiel PEPT1, beeinflussen, Wechselwirkungen zwischen den einzelnen

Arzneistoffen sowie dem Transporter untersucht werden.

Alle drei Arzneistoffe können gut in einer Studie am Menschen angewendet werden, da

durch ihre langjährige Anwendung die gute Verträglichkeit, Sicherheit und geringe Rate an

Nebenwirkungen bei der Applikation einer Einzeldosis belegt ist [138, 140, 143-145].

Für die In vitro-Untersuchungen wurden Daten über Arzneistoffkonzentrationen benötigt, die

im humanen Dünndarm zu erwarten sind. Dafür wurden Ergebnisse aus zwei Aspirations-

studien am Menschen herangezogen. Aus Untersuchungen bei denen schnelle freisetzende

Kapseln mit Theophyllin, einer BCS-Klasse I-Substanz [146], mit Wasser oral verabreicht

wurden, sind intestinale Arzneistoffkonzentrationen bekannt. Die maximal gemessene

duodenale Arzneistoffkonzentration von 3200 µM entsprach dabei der Konzentration der

verabreichten Kapsel mit 100 mg Theophyllin und den 180 mL verabreichten Wassers [74].

Für Amprenavir, ein Stoff der BCS-Klasse II [147], konnte ebenfalls bestätigt werden, dass

die Applikation von 1200 mg Arzneistoff in Weichgelatinekapseln mit lösungsverbessernden

Hilfsstoffen und 180 mL Wasser zu Konzentrationen führte die annähernd den intestinalen

Konzentrationen entsprachen. So lag die maximal gemessene Konzentration im Duodenum

bei 11 mM und die verabreichte Konzentration wurde mit 13 mM berechnet [148]. Für die

Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan, die laut der BCS-Klassifizierung

ebenfalls eine gute Löslichkeit aufweisen kann somit auch initial von einer ungefähren

Übereinstimmung der intestinalen Konzentration mit der verabreichten Konzentration

ausgegangen werden.

Die In vitro-Experimente wurden mit zwei unterschiedlich konzentrierten Lösungen für jeden

Arzneistoff durchgeführt, um den Einfluss der Arzneistoffkonzentration im Donor-

Kompartiment auf den Stoffdurchtritt durch die Kapillarmembran zu ermitteln. Die hohe

Konzentration von 2,00 g/L für Paracetamol und Amoxicillin sowie 0,16 g/L für Valsartan

entsprach der Applikation einer Tablette mit 0,25 L Wasser. Dabei wurde angenommen,

dass eine kommerziell erhältliche Tablette den Arzneistoff in der niedrigsten verfügbaren

Dosis enthielt, wobei keine weiteren Arzneistoffe in der Formulierung enthalten waren. Das

Volumen von 0,25 L wurde in Anlehnung an die Bestimmung der Löslichkeit eines

Arzneistoffes für die Einordnung in das BCS-System gewählt. Es setzte sich aus der Menge

an Wasser, die zur oralen Einnahme einer Arzneiform im Sinne der BCS-Klassifizierung

nötig ist (240 mL) und dem geringen Restvolumen an Magensaft im nüchternen Zustand

Diskussion

70

zusammen [149]. Die hierfür angenommenen 10 mL entsprachen dabei eher dem unteren

Bereich des ermittelten Magenrestvolumens im nüchternen Zustand [17]. Die niedrig

konzentrierten Lösungen entsprachen einem Hundertstel oder einem Zehntel der

Arzneistoffmenge einer Tablette gelöst in 0,25 L Medium, sodass auch für diese Arzneistoff-

konzentration eine UV-metrische Bestimmung realisierbar war.

Die In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems erfolgte hinsichtlich der Bestimmung der

relativen Wiederfindung der Arzneistoffe. Bereits 1982 wurde von Ungerstedt et al. die

relative Wiederfindung als Verhältnis zwischen der Substanzkonzentration im Dialysat und

im Donor-Kompartiment beschrieben und zur Charakterisierung des Dialyseprozesses

genutzt [87, 115]. Es ist bekannt, dass die relative Wiederfindung von vielen Faktoren

beeinflusst wird. Dazu gehören unter anderem Länge, Durchmesser, Material und

Molekülmassen-Ausschlussgrenze der Dialysemembran, die Flussrate des Perfusats, die

Diffusionsgeschwindigkeit des Arzneistoffes in der Membran und im Medium des äußeren

Kompartimentes sowie die Temperatur des Donor-Mediums [81, 88].

Mit der Entwicklung des Mikrodialysesystems waren die Faktoren, die die Dialysemembran

betrafen, bereits durch die Wahl der entsprechenden Hohlfaserkapillaren festgelegt. Die

Polysulfon-Kapillaren weisen eine Molekülmassen-Ausschlussgrenze von 5000 Da auf.

Diese Molekülmassen-Ausschlussgrenze ermöglicht den ungehinderten Transport von

kleinen Molekülen, wie Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan durch die Membran und

verhindert den Transport von größeren Molekülen, wie Proteinen oder anderen

Makromolekülen. Dieses hat den Vorteil, dass Dialysatproben häufig ohne Vorbehandlung

mit der HPLC analysierbar sind [81, 88]. Die verwendete Mikrodialyseeinheit begünstigt mit

ihrer großen Austauschfläche von circa 26 cm2 eine hohe relative Wiederfindung, da sich die

Diffusion des Arzneistoffes nach dem 1. FICK‘SCHEN GESETZ proportional zur Diffusionsfläche

verhält [85]. Die Flussrate von 1 mL/min wurde nach Vorversuchen festgelegt, um in einem

kurzen Zeitintervall ein entsprechend großes Dialysatvolumen von 300 µL zur Arzneistoff-

quantifizierung zur Verfügung zu haben.


Zu Beginn der In vitro-Untersuchungen wurde der Einfluss der Rührgeschwindigkeit und der

Einfluss des verwendeten Gerätes auf die relative Wiederfindung bestimmt. Die

Untersuchungen wurden mit Homogenisierung bei 100 Bewegungen pro Minute mit einem

Horizontalschüttler, bei 100, 200 und 300 Umdrehungen pro Minute mit einem Magnetrührer

sowie ohne Homogenisierung durchgeführt. Die fehlende Homogenisierung führte zu stark

schwankenden Werten für die relative Wiederfindung von durchschnittlich 14 % bei

Diskussion

71

Verwendung der niedrig und hoch konzentrierten Paracetamol-Lösung, sodass eine

schlechte Reproduzierbarkeit gegeben war. Diese beruhte wahrscheinlich auf der vereinzelt

und unregelmäßig auftretenden Bewegung des Mikrodialysesystems bei der Nutzung und

Probennahme in Verbindung mit einer geringen Diffusionsgeschwindigkeit der

Arzneistoffmoleküle im Donor-Medium. Es ist anzunehmen, dass das große

Konzentrationsgefälle zwischen der Arzneistofflösung und dem Perfusat zu einem

Stoffdurchtritt durch die semipermeable Membran führte und die arzneistofffreien Bereiche

um die Kapillarmembran dann mit Arzneistoffmolekülen aus weiter entfernten Bereichen des

Donor-Mediums aufgefüllt wurden. Dies erfolgte relativ langsam entlang des

Konzentrationsgradienten über die Diffusion der Teilchen, sodass es zu einer Verarmung

des Arzneistoffes in den kapillarnahen Bereichen des Donor-Mediums kommen konnte. Mit

der Homogenisierung des Donor-Mediums wurde dieses Problem behoben und es konnten

reproduzierbare Ergebnisse in den In vitro-Untersuchungen gewonnen werden. Der Einsatz

des Horizontalschüttlers resultierte in einem erhöhten Wert von 28 % für die relative

Wiederfindung. Die ständige horizontale Bewegung des Donor-Kompartimentes, die durch

den Horizontalschüttler verursacht wurde, erschwerte allerdings die einheitliche

Probennahme sowie die Zugabe weiterer Lösungen. Daher erwies sich die Nutzung des

Horizontalschüttlers in der Praxis als unvorteilhaft. Die Verwendung des Magnetrührers zur

Homogenisierung des Mediums im Donor-Kompartiment führte dagegen für alle

untersuchten Rührgeschwindigkeiten (100 bis 300 Umdrehungen pro Minute) zu ähnlichen

Werten für die relative Wiederfindung von durchschnittlich 36 % mit geringen

Standardabweichungen. Die stärkere Bewegung der Mikrodialyseeinheit im Donor-

Kompartiment bei Verwendung von 200 und 300 Umdrehungen pro Minute beruhte auf der

kegelförmigen Kreisströmung des Donor-Mediums. Die dabei auf die Mikrodialyseeinheit

einwirkenden Strömungskräfte können zu einer Beschädigung der Mikrodialyseeinheit

führen, zum Beispiel durch Kollision der Mikrodialyseeinheit mit dem Magnetrührer, und

somit eine mehrmalige In vitro-Nutzung verhindern. Weiterhin kann diese Kreisströmung

nicht mit den Vorwärtsbewegungen des Mikrodialysesystems im nüchternen Dünndarm

verglichen werden. In vivo ist eine schnelle Vorwärtsbewegung des Mikrodialysesystems in

der Phase III des IMMC zu erwarten, da währenddessen gerichtete peristaltische

Kontraktionen zur Bereinigung des Dünndarmes von unverdaulichen Nahrungsresten und

anderen Bestandteilen auftreten. Ein Weitertransport des Mikrodialysesystems erfolgt

wahrscheinlich ebenfalls während der Phase II des IMMC durch die unregelmäßig

auftretenden intestinalen Kontraktionen [20]. Die Hauptbelastung des Mikrodialysesystems

durch die auftretenden Zugkräfte sollte dabei jedoch an den Schläuchen und dem

Zuggewicht hervorgerufen werden. Durch die Materialauswahl für das Zuggewicht und die

Schläuche wurde beides bereits bei der Entwicklung berücksichtigt.

Diskussion

72

Die Verwendung des Magnetrührers in den In vitro-Untersuchungen resultierte in einem

Versuchsaufbau der einen hohen Grad an Standardisierung und Reproduzierbarkeit bot, da

die Homogenisierung des Mediums ab 100 Umdrehungen pro Minute zu einer

gleichmäßigen Verteilung des Arzneistoffes im Medium führte. Deshalb wurde für alle

nachfolgend aufgeführten In vitro-Untersuchungen der Magnetrührer mit 100 Umdrehungen

pro Minute genutzt, um einen Versuchsaufbau zu Verfügung zu haben, der eine

beschädigungsfreie und zuverlässige In vitro-Prüfung des neu entwickelten und adaptierten

Mikrodialysesystems ermöglichte.

Zur Etablierung des Versuchsablaufes wurde der Einfluss der Equilibrierzeit und der

Temperatur auf die relative Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben

untersucht. Es wurden Experimente mit Equilibrierzeiten von 0 min, welches dem

kontinuierlichen Fluss des Perfusats entsprach, sowie mit Equilibrierzeiten von 1, 5 und

60 min durchgeführt. Die Equilibrierzeit bei Anwendung des diskontinuierlichen Perfusat-

flusses basierte auf dem modifizierten Versuchsablauf mit dem Eibringen von Luftblasen in

den Ablaufschlauch zum Abtrennen der gewonnenen Dialysatproben. Es wurde erwartet,

dass eine Equilibrierzeit von 1 min oder mehr mit einer erhöhten relativen Wiederfindung

verbunden ist, da ein längerer Zeitraum zum Erreichen des Konzentrationsgleichgewichtes

zwischen Donor-Kompartiment und Perfusat zur Verfügung stand.

Für Paracetamol wurde die relative Wiederfindung bei Anwendung einer Equilibrierzeit von

mindestens 1 min im Vergleich zur Anwendung ohne eine Equilibrierphase verdoppelt. Dabei

traten keine großen Unterschiede zwischen den Ergebnissen mit 1 und 60 min dauernden

Equilibrierzeiten auf. Die Erhöhung der Untersuchungstemperatur auf Körpertemperatur

resultierte für alle Equilibrierzeiten in erhöhten Werten für die relative Wiederfindung im

Vergleich zu den Ergebnissen, die bei Raumtemperatur erhalten wurden. Für Amoxicillin und

Valsartan konnten diese Ergebnisse ebenfalls bestätigt werden. Die relative Wiederfindung

für die Equilibrierzeiten von 1 und 5 min waren sehr ähnlich und die Untersuchungen bei

Körpertemperatur führten ebenfalls zu einer Erhöhung der Werte. Die Werte für die relative

Wiederfindung der eingesetzten niedriger konzentrierten Arzneistofflösungen im Donor-

Kompartiment waren im Allgemeinen minimal höher als für die verwendeten höher

konzentrierten Lösungen. Obwohl die Unterschiede größtenteils im Bereich der Streuung der

Werte lagen, ist dies wahrscheinlich auf die geringere Anzahl an Arzneistoffmolekülen im

Donor-Medium zurückzuführen. Beim Durchtritt durch die semipermeable Kapillarmembran

kann somit von einer geringeren Beeinflussung der Moleküle untereinander im Vergleich zur

höher konzentrierten Lösung ausgegangen werden.

Diskussion

73

Der Versuchsablauf mit dem kontinuierlichen Fluss des Perfusats führte über den gesamten

Versuchszeitraum zu einem gleichmäßigen Stoffaustausch zwischen dem Donor-

Kompartiment und dem Perfusat. Der Arzneistoff, der in das Perfusat übertrat, wurde sofort

in den Ablaufschlauch weitertransportiert. Die Flussrate von 1 mL/min bedingte einen

schnellen Weitertransport des Perfusats und damit das unvollständige Erreichen des

Gleichgewichtszustandes zwischen beiden Kompartimenten. Diese Flussrate war jedoch

notwendig, um in einem geeigneten Zeitintervall ausreichend große Dialysatproben für die

quantitative Analytik zu gewinnen.

Der diskontinuierliche Transport des Perfusats mit 1 mL/min führte mit einer Pumpzeit von

18 s zu den vorgesehenen Dialysatvolumina von jeweils 300 µL. Während der Transport des

Perfusats pausierte, wurde die in den Ablaufschlauch transportierte Dialysatprobe durch eine

Luftblase von der nächsten Probe abgetrennt. Zeitgleich erfolgte ein Stoffaustausch

zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat, wobei eine längere Kontaktzeit

zwischen beiden Kompartimenten im Vergleich zum kontinuierlichen Perfusatfluss bestand.

In Abhängigkeit vom Versuch waren 1, 5 oder 60 min für diesen Stoffaustausch vorgesehen.

Anhand der ähnlichen Werte für die relative Wiederfindung für die Equilibrierzeiten von 1, 5

und 60 min kann von einem sehr schnellen Stoffaustausch bereits in der 1. min

ausgegangen werden. Da das Gesamtkapillarinnenvolumen circa 100 µL betrug und das

gewonnene Dialysatprobenvolumen bei 300 µL lag, war die erhaltene relative Wiederfindung

ein Wert, der sich aus zwei Teilwerten zusammensetzte. Für die ersten 100 µL des Dialysats

konnte von einem nahezu vollständigen Erreichen des Equilibriums ausgegangen werden.

Die restlichen 200 µL des Dialysats kamen nur kurz beim kontinuierlichen Weitertransport in

den Ablaufschlauch mit dem Donor-Medium in Berührung. Dies entsprach dem

Stoffaustausch, der unter Verwendung des kontinuierlichen Flusses gegeben war. Somit ist,

für das mit dem diskontinuierlichen Fluss bei 1 mL/min gewonnene Dialysatvolumen von

300 µL, niemals eine relative Wiederfindung von 100 % zu erreichen. Die leicht erhöhten

Werte der relativen Wiederfindung bei einer Equilibrierzeit von 5 und 60 min gegenüber den

Werten die bei einer 1 minütigen Equilibrierzeit gewonnen wurden, können durch die

Diffusion der Arzneistoffmoleküle aus den ersten 100 µL in das nachfolgende Perfusat erklärt

werden. Somit führte das gewonnene Dialysatvolumen von 300 µL im Vergleich zum

Gesamtkapillarinnenvolumen von 100 µL zu einer verringerten Verunreinigung der

nachfolgenden Proben.

Die Anwendung des Versuchsablaufes mit dem kontinuierlichen Fluss ermöglichte die

Verwendung des einfach aufgebauten Mikrodialysesystems, mit Mikrodialyseeinheit sowie

Zu- und Ablaufschlauch. Die unkomplizierte Handhabung während der Untersuchungen

führte wahrscheinlich zur breiten Anwendung dieses Versuchsablaufes bei früheren

Diskussion

74

Untersuchungen von Stoffkonzentrationen mittels Mikrodialysesonden [92, 97, 100, 121,

122]. In diesen Untersuchungen werden häufig Perfusionsraten von 1 µL/min angewendet,

um mit einer einzelnen Mikrodialysekapillare oder Mikrodialysesonde einen vollständigen

Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat zu erhalten. Dies

bedingte wiederum größere Abstände von 10 bis 60 min, um ein entsprechend großes

Dialysatvolumen von bis zu 60 µL zur Stoffquantifizierung aufzufangen. Im Vergleich dazu

konnten mit dem neu entwickelten Mikrodialysesystem mit einer Mikrodialyseeinheit, die aus

30 Kapillaren bestand, eine höhere Perfusatflussrate von 1 mL/min angewendet werden und

somit Dialysatproben von 300 µL im Minutenabstand aufgefangen werden.

Der Versuchsablauf mit dem diskontinuierlichen Perfusatfluss von 1 mL/min ermöglichte bei

Nutzung des neu entwickelten Mikrodialysesystems eine Erhöhung der relativen

Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben. Bisher wurde dieser Versuchsablauf

zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen mittels Mikrodialysesonden nicht angewendet.

Dabei ist nicht bekannt, ob der modifizierte Aufbau eines solchen Systems oder die

Handhabung während des Versuches dafür verantwortlich sind. Ein weiterer Vorteil dieses

Versuchsablaufes war die Abtrennung der Proben durch Luftblasen, sodass die Proben

einfach aufgefangen und zugeordnet werden konnten. Die Ergebnisse der relativen

Wiederfindung für die Untersuchungen mit 1, 5 und 60 min dauernden Equilibrierzeiten

unterschieden sich kaum, sodass in den nachfolgenden Experimenten mit einer

Equilibrierzeit von 1 min weitergearbeitet wurde, um eine hohe zeitliche Auflösung bei der

Konzentrationsbestimmung im Donor-Kompartiment zu erhalten.

Bei den Untersuchungen zum Einfluss der Equilibrierzeit, die bei Raum- und

Körpertemperatur durchgeführt wurden, zeigte sich ein Einfluss der Temperatur auf die

relative Wiederfindung der Arzneistoffe. Aus diesem Grund wurden die Ergebnisse, die mit

der relevanten Equilibrierzeit von 1 min ermittelt wurden, nochmals separat dargestellt. Die

Temperierung auf Körpertemperatur führte in allen Experimenten zu erhöhten Werten für die

relative Wiederfindung im Vergleich zur Durchführung bei Raumtemperatur. Dies ist auf die

proportionale Abhängigkeit des Diffusionskoeffizienten von der Temperatur zurückzuführen,

die in der STOKES-EINSTEIN-GLEICHUNG (siehe Gleichung 2) festgeschrieben ist [35, 36].

Danach führt eine Temperaturerhöhung im Donor-Kompartiment zu einer Erhöhung des

Diffusionskoeffizienten des jeweiligen Arzneistoffes und somit zu einer verstärkten Diffusion

der Arzneistoffmoleküle im Donor-Medium und durch die Kapillarmembran. Bei Anwendung

des diskontinuierlichen Perfusatflusses ist der Wert der relativen Wiederfindung aus den

vorher beschrieben Teilwerten, mit vollständiger Equilibrierung für die ersten 100 µL und

unvollständigem Konzentrationsausgleich für die restlichen 200 µL, zusammensetzt. Somit

konnte von den Experimenten bei Raumtemperatur nicht auf die Ergebnisse bei

Diskussion

75

Körpertemperatur geschlossen werden. Mit 7 bis 9 % Unterschied in der relativen

Wiederfindung zwischen beiden Untersuchungstemperaturen war der Einfluss auch nicht zu

vernachlässigen, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen ausschließlich bei der im

Dünndarm herrschenden Temperatur von 37 °C durchgeführt wurden.

Bei der Auswertung der Daten, die bei Körpertemperatur und einer 1 minütigen Equilibrierzeit

gewonnen wurden, konnte ebenfalls ein Einfluss der Molekülmasse des Arzneistoffes

festgestellt werden. Zum besseren Vergleich wurden die entsprechenden Ergebnisse in

einem Diagramm zusammengefasst (Abbildung 39).

Abbildung 39: Einfluss der Molekülmasse des Arzneistoffes auf die relative Wiederfindung (RR) bei

Anwendung des diskontinuierlichen Flusses bei Körpertemperatur,

PCM: Paracetamol, AMX: Amoxicillin und VAL: Valsartan, PP: Phosphatpuffer pH 6,8

USP (MW + SD, n = 3).

Die verwendeten Arzneistoffe wiesen Molekülmassen von 151, 365 und 435 g/mol für

Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan auf. Daraus resultieren unterschiedliche

hydrodynamische Durchmesser, die laut der STOKES-EINSTEIN-GLEICHUNG (siehe

Gleichung 2) indirekt proportional zum Diffusionskoeffizienten sind [35, 36]. Somit wurde für

Paracetamol mit einer kleinen Molekülmasse ein größerer Diffusionskoeffizient im Vergleich

zu Amoxicillin und Valsartan erwartet. Folglich wurde für Paracetamol auch mit einem

höheren Wert für die relative Wiederfindung gerechnet, da pro Zeiteinheit mehr Teilchen

durch die Kapillarmembran diffundieren können. Mit den durchgeführten Experimenten

konnte für Paracetamol eine relative Wiederfindung von durchschnittlich 63 % ermittelt

werden. Für Amoxicillin und Valsartan wurden Werte bestimmt, die sich mit durchschnittlich

50 und 49 % nicht stark voneinander unterschieden, allerdings um 13 % gegenüber

Paracetamol verringert waren. Dies bestätigte, dass die Molekülmasse eines Arzneistoffes,

über dessen hydrodynamischen Durchmesser, den Diffusionskoeffizienten beeinflussen

Diskussion

76

kann und damit seinen Transport durch die semipermeable Membran. Die Ergebnisse der

drei verwendeten Arzneistoffe können für eine erste Abschätzung der relativen

Wiederfindung für weitere Arzneistoffe genutzt werden. Allerdings ist es notwendig, den Wert

für jeden Stoff individuell zu bestimmen, da Stoffe mit niedrigeren Molekülmassen

untereinander, mit den Medien oder der Kapillarmembran wechselwirken können und für

Stoffe mit Molekülmassen über 435 g/mol momentan keine Referenzwerte vorliegen.

4.2.2 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Konzentrationsänderungen

Zur weitergehenden Charakterisierung des neu entwickelten Mikrodialysesystems wurde die

Sensitivität des Systems untersucht. Dabei sollte ermittelt werden, ob und wie schnell

Arzneistoffkonzentrationen und Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment in den

Dialysatproben abgebildet werden konnten. Für diese Untersuchungen wurde die

Mikrodialyseeinheit zunächst in arzneistofffreies Medium eingebracht. Nach der Gewinnung

von fünf Dialysatproben wurde eine arzneistoffhaltige Lösung hinzugefügt und fünf weitere

Dialysatproben aufgefangen. Anschließend wurde die Arzneistoffkonzentration im Donor-

Kompartiment durch erneute Zugabe von arzneistofffreiem Medium halbiert. Nachfolgend

wurden fünf weitere Dialysatproben gewonnen. Die ermittelte Arzneistoffkonzentration wurde

unter Einbeziehung des Skalierungsfaktors berechnet. Obwohl der diskontinuierliche

Perfusatfluss, wie eben beschrieben, einige Vorteile gegenüber dem kontinuierlichen

Perfusatfluss bietet, wurde die Sensitivität, als wichtige Eigenschaft des Mikrodialysesystems

für die spätere Anwendung am Menschen, mit beiden Versuchsabläufen bestimmt.

Die Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses und Paracetamol als Arzneistoff

resultierte in ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben, die nicht den

theoretisch im Donor-Kompartiment vorliegenden Konzentrationen entsprachen. Bereits in

der fünften Dialysatprobe wurde Paracetamol nachgewiesen, obwohl zu diesem Zeitpunkt

noch kein Arzneistoff im Donor-Kompartiment vorhanden war. Zusätzlich war lediglich eine

langsame Erhöhung und Verringerung der Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben im

Vergleich zur sprunghaften Änderung der Konzentration im Donor-Kompartiment zu

verzeichnen. Diese Beobachtung lässt sich am wahrscheinlichsten auf die Strömung der

Flüssigkeit im Schlauch zurückzuführen. Es ist anzunehmen, dass während das Perfusat

und später das Dialysat durch den Schlauch transportiert wurden, in den wandnahen

Bereichen der Flüssigkeit Reibungseffekte durch den Kontakt mit dem Schlauch auftraten.

Dies würde zu einer niedrigen Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit in der Nähe der

Schlauchwand und in einer maximalen Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit in der Mitte des

Schlauches führen [150]. Das verwendete Perfusat wäre durch das parabolische

Diskussion

77

Strömungsprofil (Abbildung 40) nicht in der Zusammensetzung verändert worden, da es

ohne weitere Einflüsse aus dem Vorratsgefäß in das Mikrodialysesystem gepumpt wurde.

Abbildung 40: Schematische Darstellung des parabolischen Strömungsprofils in einem Schlauch,

D: Schlauchdurchmesser.

Für das kontinuierlich im Ablauflaufschlauch transportierte Dialysat würde dieses

Fließverhalten jedoch in einer Durchmischung der Proben, die zu unterschiedlichen Zeiten

erhalten wurden und dementsprechend unterschiedliche Bestandteile enthielten, resultieren.

So erfolgte die Zugabe der arzneistoffhaltigen Lösung in das Donor-Kompartiment nachdem

das Dialysat der fünften Probe in den Ablaufschlauch transportiert wurde. Sobald die ersten

Arzneistoffmoleküle im Donor-Medium enthalten waren, konnten sie durch die

Dialysemembran diffundieren. Damit würde dem arzneistofffreien Dialysat das später

gewonnene Dialysat mit einem geringen Arzneistoffanteil im Ablaufschlauch folgen. Durch

das parabolische Strömungsprofil würde sich das arzneistoffhaltige Dialysat während des

Transportes im Ablaufschlauch immer weiter in das vorangegangene arzneistofffreie Dialysat

ausbreiten. Dies würde zu Dialysatproben führen, die Arzneistoff enthielten, obwohl laut

Versuchsablauf noch kein Arzneistoff in der Probe vorhanden war. Für die in der Literatur

beschriebenen Versuche mit Mikrodialysesonden in Kombination mit dem kontinuierlichen

Perfusatfluss ist die Durchmischung der Dialysatproben im Ablaufschlauch von geringerer

Relevanz, da die einzelnen Proben üblicherweise in einem Zeitraum von 10 bis 60 min

aufgefangen werden [92, 97, 100, 121, 122] und im Allgemeinen eine vollständige

Einstellung des Gleichgewichtszustandes zwischen beiden Kompartimenten erfolgt. Somit ist

innerhalb des entsprechenden Probenzeitraums von 10 bis 60 min keine Aussage zur

Erhöhung oder Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment möglich,

sondern nur die durchschnittliche Stoffkonzentration in der Probe bestimmbar.

Die hohe Standardabweichung einzelner experimentell bestimmter Daten bei Anwendung

des kontinuierlichen Perfusatflusses ist insbesondere auf die manuelle Zugabe der

Arzneistofflösung und des arzneistofffreien Mediums zurückzuführen. Obwohl die Zugabe

der Paracetamol-Lösung abgeschlossen war bevor die nächste Probe gewonnen wurde, war

die Geschwindigkeit der Zugabe variabel. Damit unterschieden sich die

Diskussion

78

Arzneistoffkonzentrationen im Donor-Kompartiment zu einem definierten Zeitpunkt, was zu

unterschiedlichen Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben führte. Bei den

Untersuchungen mit dem kontinuierlichen Perfusatfluss wurde ebenfalls festgestellt, dass die

theoretische Arzneistoffkonzentration weder nach Zugabe der Paracetamol-Lösung noch

nach Verdünnung mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP in den Dialysatproben erreicht wurde.

Dies ist auf die kurze Versuchsdauer von jeweils 5 min mit der entsprechend eingestellten

Arzneistoffkonzentration zurückzuführen. Ein kontinuierlicher Perfusatfluss resultierte somit

in einer verzögerten Detektion von Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment. Die

ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben bildeten nicht die aktuelle

Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment ab, sondern waren eine Mischung aus

Arzneistoffkonzentrationen die zu unterschiedlichen Zeiten gewonnen wurden. Es ist

anzunehmen, dass bei der Nutzung des kontinuierlichen Perfusatflusses in In vivo-Studien

intraluminale Konzentrationsänderungen nicht mit der angestrebten zeitlichen Auflösung von

1 min bestimmt werden können. Die Sensitivität des Mikrodialysesystems unter Verwendung

des kontinuierlichen Perfusatflusses entsprach damit nicht den Anforderungen, die an das

System gestellt wurden.

Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde ebenfalls mit dem Versuchsablauf des

diskontinuierlichen Perfusatflusses untersucht. Ein zusätzlicher in das Mikrodialysesystem

integrierter Luftschlauch wurde genutzt, um die im Ablaufschlauch aufgefangene Dialysat-

probe durch eine Luftblase von der nachfolgend gewonnenen Probe abzutrennen. Zeitgleich

konnte während der einminütigen Equilibrierzeit ein verlängerter Stoffaustausch zwischen

dem Donor-Kompartiment und dem Dialysat erfolgen. Entsprechend den Erwartungen

zeigten die experimentell ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den Dialysatproben für

den kompletten Versuch und bei beiden Paracetamol-Lösungen eine gute Übereinstimmung

mit der jeweiligen theoretisch im Donor-Kompartiment enthaltenen Arzneistoffkonzentration.

Ein sprunghafter Anstieg oder Abfall der Paracetamol-Konzentration im äußeren

Kompartiment wurde immer sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe detektiert.

Dies ist höchstwahrscheinlich auf die sofortige Abtrennung der einzelnen Proben durch die

Luftblasen im Ablaufschlauch zurückzuführen, da somit keine Verunreinigung durch die

nachfolgenden Proben durch die parabolische Strömung im Schlauch auftreten konnte. Die

Separation der einzelnen Proben im Ablaufschlauch führte auch zu einer verringerten

Standardabweichung bei den experimentell bestimmten Daten im Vergleich zu den

Ergebnissen, die mit dem kontinuierlichen Perfusatfluss erhoben wurden. Änderungen der

Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment konnten mit einer sehr hohen zeitlichen

Auflösung sofort in den Dialysatproben abgebildet werden. Das Mikrodialysesystem wies

damit die angestrebte Sensitivität auf. In humanen Studien könnten somit

Diskussion

79

Arzneistoffkonzentrationen und Konzentrationsänderungen im Darmlumen im geringen

Abstand detektiert werden. Dies ist vor allem vor dem Hintergrund der schnellen Änderung

luminaler Arzneistoffkonzentrationen in einem definierten Darmabschnitt relevant, da

Absorptionsprozesse, Verdünnung mit intestinalen Sekreten sowie der Weitertransport des

Arzneistoffes innerhalb von Sekunden die Gegebenheiten im Dünndarm verändern können.

Bisher werden intestinale Proben im Abstand von 10 bis 20 min gewonnen und deren

Konzentration analysiert [59, 67, 68, 74], wobei Änderungen innerhalb dieses Zeitraumes

wegen der Durchmischung in der Probe nicht bestimmbar sind. Intraindividuelle

Schwankungen der maximalen Arzneistoffkonzentration, die im Dünndarm ermittelt wurden

[74], können somit auch auf dem zur Probengewinnung gewählten Zeitraum beruhen.

Obwohl die Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses einige Vorteile bietet, wurde

dies noch nicht in Untersuchungen der Stoffkonzentration mittels Mikrodialysesystemen

angewendet. Die Ursache könnte in dem veränderten Aufbau des Mikrodialysesystems

liegen oder auch in dem modifizierten Versuchsablauf mit der alternierenden Anwendung

von zwei Pumpen. Im Jahr 2011 wurde von Juluru et al. von einem intermittierenden

Versuchsablauf bei Anwendung eines Mikrodialysesystems mit linearer Sonde in der Haut

von Kaninchen berichtet [151]. Die Unterbrechung des Perfusatflusses bezieht sich hierbei

allerdings auf eine 4 bis 54 minütige Pause, in der keine Proben gewonnen werden. Die

Pausen sind in den Versuchsablauf integriert, um bei einer vorgesehenen Anwendung am

Menschen die Bewegungsfreiheit des Probanden zu erhöhen. Nach jeder Pause erfolgt

zunächst eine zweiminütige Spülung des Mikrodialysesystems. Anschließend wird das

Perfusat kontinuierlich mit einer geringen Flussrate von 5 µL/min durch das System

transportiert und die entsprechenden Proben aufgefangen. Diese Durchführung ist nicht mit

dem in dieser Arbeit angewandten diskontinuierlichen Perfusatfluss gleichzusetzen, da im

Gegensatz zu dem im Rahmen dieser Arbeit neu entwickelten Mikrodialysesystem weder die

Zeitspanne für den Stoffaustausch durch die Kapillarmembran vergrößert wird noch eine

Separation der Proben im Ablaufschlauch erfolgt.

Die verbesserte Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Mikrodialysesystems mit

zusätzlichem Luftschlauch und die Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit

einer Equilibrierzeit von 1 min sowie Paracetamol als Arzneistoff entsprachen der

geforderten Sensitivität und führten zur ausschließlichen Nutzung dieses Versuchsablaufes

in den nachfolgend beschrieben Experimenten.

Diskussion

80

Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde anschließend auch mit den Arzneistoffen

Amoxicillin und Valsartan untersucht. Für die Versuche mit Amoxicillin wurde ebenfalls eine

sofortige Detektion der Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment über die

Bestimmung der Arzneistoffkonzentration in der darauffolgenden Dialysatprobe nach-

gewiesen. Wie erwartet, gab es zwischen den ermittelten Arzneistoffkonzentrationen in den

Dialysatproben und den theoretisch im Donor-Kompartiment vorliegenden Konzentrationen

eine gute Übereinstimmung. Die Verwendung von Valsartan als Modellarzneistoff resultierte

ebenso in einer sofortigen Detektion der Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment in

der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe. Allerdings wurde mit diesem Arzneistoff die

theoretische Konzentration im Donor-Kompartiment nach Zugabe der Arzneistofflösung in

keiner der fünf aufgefangenen Dialysatproben bestimmt und große Standardabweichungen

ermittelt. Als Ursache dieser Abweichungen kommen ein unvollständiges Überführen der

Lösung in das Donor-Kompartiment, ein langsamerer Stoffaustausch durch die

Dialysemembran und Schwankungen im Bereich der normalen Leistungsfähigkeit des

Mikrodialysesystems in Betracht. Die genaue Ursache konnte im Rahmen dieser Arbeit

jedoch nicht mit Sicherheit bestimmt werden. Allerdings wurde festgestellt, dass die Differenz

von circa 15 % zwischen den experimentell ermittelten und theoretischen Werten für die

relative Wiederfindung außerhalb des Schwankungsbereiches, der im Rahmen der

mehrmaligen Nutzung des Mikrodialysesystems auftrat (siehe 3.2.3.1), lag.

Somit erfüllte das Mikrodialysesystem bei der Verwendung von Amoxicillin als Arzneistoff die

gestellten Anforderungen hinsichtlich der Sensitivität. Die Ergebnisse für Valsartan wiesen

große Standardabweichungen sowie Differenzen zu den theoretischen Werten auf. Im

Vergleich zu den Ergebnissen die mit Paracetamol und Amoxicillin gewonnen wurden, wurde

für das Mikrodialysesystems bei Anwendung mit Valsartan eine geringere Sensitivität

ermittelt.

Anschließend wurde die gegenseitige Beeinflussung der Arzneistoffe Paracetamol,

Amoxicillin und Valsartan bei der simultanen Verwendung sowie deren Einfluss auf die

Sensitivität des Mikrodialysesystems untersucht. Dafür wurden ein Einzelversuch mit einer

Lösung, die alle Arzneistoffe in der bisher verwendeten niedrigen Konzentration enthielt, und

ein Einzelversuch mit einer hoch konzentrierten Lösung aller Arzneistoffe durchgeführt. Zur

Berechnung der Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben wurden die vorher in den

Einzelversuchen der Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bestimmten

Skalierungsfaktoren genutzt.

Für Paracetamol und Amoxicillin konnte für beide Untersuchungslösungen, wie für die

Einzelarzneistoffe bereits nachgewiesen, ein sprunghafter Anstieg und Abfall der Arzneistoff-

konzentration in den Dialysatproben gezeigt werden. Die geringe Abweichung der

Diskussion

81

experimentell ermittelten Amoxicillin-Konzentration von der theoretischen Konzentration bei

Verwendung der niedriger konzentrierten Lösung beruhte vermutlich auf einer verringerten

Arzneistoffkonzentration in der zugegebenen Lösung. Für beide Arzneistoffe wurde nach

Zugabe des arzneistoffhaltigen Mediums eine Arzneistoffkonzentration in der darauffolgend

gewonnenen Dialysatprobe bestimmt, die unterhalb der theoretischen Konzentration lag. Die

Differenz war mit hoher Wahrscheinlichkeit auf ein zu langsames Zugeben des

arzneistoffhaltigen Mediums zurückzuführen, da in den nachfolgenden Dialysatproben

annähernd die theoretische Konzentration messbar war. In den Einzelversuchen mit

Paracetamol und Amoxicillin (Abbildung 29 und 30 I) wurde ein Einfluss der

Zugabegeschwindigkeit des Mediums auf die experimentell ermittelte Konzentration in den

Dialysatproben ebenfalls festgestellt, wobei dieser geringer ausgeprägt war. Der Anstieg und

die Verringerung der Valsartan-Konzentration im Donor-Kompartiment wurden mit

Verzögerung in den Dialysatproben nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die theoretische

Konzentration nicht erreicht, sodass hier ebenfalls die Ergebnisse der Untersuchungen mit

dem einzelnen verwendeten Arzneistoff bestätigt wurden. Obwohl bisher kein großer Einfluss

der Arzneistoffkonzentration auf die Diffusion der Arzneistoffmoleküle durch die

Kapillarmembran durch unterschiedlich konzentrierte Lösungen gezeigt werden konnte,

unterschieden sich beide Valsartan-Kurven in den Diagrammen mit den drei Arzneistoffen

deutlich voneinander (Abbildung 31). Zusätzlich konnte im Vergleich zu den Ergebnissen, die

mit Amoxicillin gewonnenen wurden, festgestellt werden, dass trotz dem ähnliche Werte für

die relative Wiederfindung ermittelt wurden, offensichtlich Unterschiede beim Stoffdurchtritt

durch die Kapillarmembran bestehen müssen. Als Ursache kann die Molekülstruktur von

Valsartan in Betracht gezogen werden. Valsartan erscheint als langgestrecktes Molekül, das

an einem Ende durch die Anordnung einer lipophilen Seitenkette gegenüber der hydrophilen

Carboxylgruppe große Dimensionen einnimmt (Abbildung 41 A). Für Amoxicillin sind

ähnliche Dimensionen in der Länge des Moleküls vorhanden, wobei die Ausdehnung des

gesamten Moleküls in der Breite viel geringer ausfällt (Abbildung 41 B). Somit wäre eine

Verzögerung bei der Diffusion durch die Poren der Membran durch die gegenseitige

Behinderung der Valsartan-Moleküle aufgrund der Molekülausdehnungen möglich.

Diskussion

82

Abbildung 41: Dreidimensionale Ansicht der Arzneistoffe, A: Valsartan und B: Amoxicillin (Sauerstoff

in rot, Stickstoff in blau, Schwefel in gelb und Wasserstoff in weiß).

Weiterhin könnten Wechselwirkungen des Valsartans mit der Dialysemembran aufgetreten

sein. So berichtet Lonnemann von Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Bereichen

einer Polysulfonmembran und hydrophoben Stoffen, wie zum Beispiel Lipopolysacchariden

[152]. Dies führt zur Adsorption entsprechender Endotoxine an die Kapillarmembran, sodass

sich eine reduzierte Endotoxinpermeabilität ergibt. Über den logP-Wert von Valsartan kann

dieses Verhalten jedoch nicht ausreichend erklärt werden, da für Amoxicillin und Valsartan

ähnliche logP-Werte von circa -1,4 im physiologischen pH-Bereich des nüchternen

Dünndarmes bestimmt wurden [153, 154]. Betrachtet man jedoch die Verteilung der

lipophilen und hydrophilen Bereiche beider Moleküle, so sind Unterschiede zu erkennen.

Während sich bei Amoxicillin die hydrophilen Bereiche relativ gleichmäßig über das gesamte

Molekül erstrecken sind bei Valsartan ausgedehnte lipophile Strukturen zu erkennen.

Aufgrund der ermittelten Ergebnisse kann mit hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen

werden, dass Valsartan an die Polysulfonmembran adsorbierte. Vor allem bei geringen

Arzneistoffkonzentrationen im Donor-Kompartiment adsorbierten vermutlich zuerst

Valsartan-Moleküle an der Membran, bevor die Diffusion durch die Kapillaren in das Dialysat

erfolgte (Abbildung 31 A). Bei der Anwendung höher konzentrierter Valsartan-Lösungen

erfolgte wahrscheinlich für eine größere Anzahl an Molekülen der Stoffdurchtritt durch die

Membran, da mehr Moleküle für beide Prozesse zur Verfügung standen (Abbildung 31 B).

Wenn davon ausgegangen wird, dass der adsorbierte Anteil an Valsartan nicht für die

Diffusion zur Verfügung stand, entsprach dies einer erniedrigten Ausgangskonzentration im

Donor-Kompartiment. Dies bedingte wiederum eine verringerte maximal gemessene

Konzentration in den Dialysatproben wie sie bei beiden Kurven ermittelt wurde. Die

Ergebnisse aus eigenen vorangegangenen Adsorptionsuntersuchungen mit Valsartan und

A B

Diskussion

83

Silikonschläuchen [155] ließen diese hydrophoben Wechselwirkungen nicht erkennen.

Inwieweit der Effekt der Molekülstruktur zu einer verringerten Valsartan-Konzentration im

Dialysat beitrug konnte nicht mit Sicherheit bestimmt werden.

Die erhaltenen Ergebnisse belegen, dass keine gegenseitige Beeinflussung der drei

Arzneistoffe Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bei der simultanen Verwendung der

niedriger oder höher konzentrierten Lösung vorlag. Die Adsorption des Valsartans an die

Kapillarmembran war mit hoher Wahrscheinlichkeit spezifisch für diesen Arzneistoff und auf

Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Stoffen zurückzuführen. Die geforderte

Sensitivität des Mikrodialysesystems konnte somit für Paracetamol und Amoxicillin bestätigt

werden. Die Untersuchungen mit Valsartan resultierten in der sofortigen Detektion von

Konzentrationsänderungen, wobei die theoretische Konzentration nicht erreicht wurde. Dies

entspricht bei allen Arzneistoffen den Ergebnissen, die bereits mit den Einzelstoffen erhalten

wurden. Der Einsatz des Mikrodialysesystems in humanen Studien ist somit für die

Arzneistoffe Paracetamol und Amoxicillin möglich. Für Valsartan sollten vorher weitere

Untersuchungen zur Bestimmung des Ausmaßes der vermuteten Adsorption vorgenommen

werden.

Nach Untersuchungen mit dem Versuchsablauf des kontinuierlichen und diskontinuierlichen

Perfusatflusses lässt sich feststellen, dass die Nutzung des diskontinuierlichen Flusses mit

einigen Vorteilen verbunden war. Die gewonnenen Dialysatproben konnten sehr gut durch

die Abtrennung durch Luftblasen in einzelnen Vials aufgefangen werden. Die damit

verbundene Separation von vorherigen und nachfolgenden Proben verhinderte eine

Durchmischung mit diesen Proben. Somit entsprachen die ermittelten Arzneistoff-

konzentrationen in den Dialysatproben der theoretischen Arzneistoffkonzentration im Donor-

Kompartiment. Außerdem konnten Konzentrationsänderungen im Donor-Kompartiment sehr

schnell detektiert werden. Als Ausnahme sind die Ergebnisse von Valsartan zu betrachten,

bei denen in allen Versuchen die theoretische Konzentration unterschritten wurde wurde.



Die hergestellten Mikrodialysesysteme sollten mehrmalig für verschiedene In vitro-

Untersuchungen verwendet werden. Deshalb wurde ein repräsentatives Mikrodialysesystem

über 14 Versuchstage genutzt und dessen relative Wiederfindung bei Anwendung einer

Equilibrierzeit von 1 min an acht verschiedenen Untersuchungstagen bestimmt. Um

identische Bedingungen im Vergleich zu den Versuchen mit anderen Mikrodialysesystemen

zu gewährleisten, wurde das Mikrodialysesystem nach jedem Einzelexperiment zur

Diskussion

84

Reinigung gespült und am Ende des Versuchstages bis zur nächsten Verwendung im

Trockenen gelagert. Die ermittelten Ergebnisse für die relative Wiederfindung wiesen nur

geringe Schwankungen um den Mittelwert von 63,6 % auf. Im Verlauf der 14 Versuchstage

war für die acht ausgewählten Untersuchungstage kein Trend für steigende oder sinkende

Werte zu erkennen. Somit konnte die uneingeschränkte Funktionalität des Mikrodialyse-

systems für In vitro-Untersuchungen innerhalb eines Untersuchungszeitraumes von

14 Untersuchungstagen bestätigt werden.

Kommerziell erhältliche Mikrodialysesonden wurden bereits mehrfach für In vitro-

Untersuchungen genutzt [156]. In diesen Experimenten wurden die Sonden zwischen den

einzelnen Untersuchungstagen zuerst zur Reinigung gespült und dann zur Lagerung mit

destilliertem Wasser perfundiert. Diese Vorgehensweise hatte ebenfalls keinen Einfluss auf

die Wiederfindung der Analyten.

Obwohl die Funktionsfähigkeit des Mikrodialysesystems über 14 Versuchstage nach-

gewiesen wurde, erfolgte in Abständen die Bestimmung der relativen Wiederfindung der

verwendeten Mikrodialysesysteme, um Hinweise auf eine Fehlfunktion des Systems durch

undichte Verklebungen oder defekte Kapillaren zu erhalten.

Alle Mikrodialysesysteme wurden einzeln in Handarbeit hergestellt. Um die

Reproduzierbarkeit der Systeme zu untersuchen, erfolgte der Vergleich der relativen

Wiederfindung. Dabei wurden die Ergebnisse von acht Mikrodialysesystemen für den

Arzneistoff Paracetamol und von jeweils vier Mikrodialysesystemen für die Arzneistoffe

Amoxicillin und Valsartan voneinander getrennt betrachtet. Für Paracetamol wurde für alle

untersuchten Mikrodialysesysteme ein ähnlicher Wert für die relative Wiederfindung von

65,6 ± 2,2 % bestimmt. Die Ergebnisse für Amoxicillin (48,9 ± 2,5 %) und Valsartan

(50,6 ± 2,5 %) unterschieden sich ebenfalls nur minimal.

Die ermittelten Standardabweichungen der relativen Wiederfindung für verschiedene

Mikrodialysesysteme entsprechen den von Abrahamson et al. ermittelten Abweichungen bei

Verwendung von 14 kommerziell erhältlichen Mikrodialysesonden einer Bauart [157]. Dabei

wurde Glucose, ein Molekül mit ähnlicher Molekülmasse wie Paracetamol, Amoxicillin und

Valsartan, verwendet und interindividuelle Abweichungen bei der relativen Wiederfindung

von durchschnittlich 5 % bestimmt. Dagegen ergaben In vitro-Experimente mit Makro-

molekülen, dass eine große Variabilität der relativen Wiederfindung zwischen einzelnen,

kommerziell erhältlichen Mikrodialysesonden einer Bauart bestand [158]. So wurden bei

diesen Untersuchungen keine signifikanten Änderungen der relativen Wiederfindung

ermittelt, wenn bei unterschiedlichen Temperaturen (20 und 37 °C) gearbeitet wurde. Für das

neu entwickelte Mikrodialysesystem wurden nur geringe Unterschiede hinsichtlich der

Diskussion

85

relativen Wiederfindung bei der Verwendung verschiedener Systeme bestimmt.

Temperaturänderungen resultieren allerdings in Werten für die relative Wiederfindung, die

sich mit 7 bis 9 % deutlich voneinander unterschieden. Somit konnte von einer

reproduzierbaren Einzelherstellung der Mikrodialysesysteme ausgegangen werden.

Die vorgesehene Nutzung des Mikrodialysesystems zur Bestimmung luminaler Arzneistoff-

konzentrationen im Dünndarm des Menschen wurde mit Untersuchungsmedien, die den

humanen intestinalen Flüssigkeiten nachempfunden sind, simuliert. Dabei wurde der Einfluss

eines einfachen Donor-Mediums wie Salzsäure pH 1,2 sowie komplexer zusammengesetzter

Medien wie Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF auf die relative Wiederfindung von

Paracetamol untersucht. Das bisherige Donor-Medium Phosphatpuffer pH 6,8 USP diente

mit einer relativen Wiederfindung von durchschnittlich 68 % als Referenz. Der Einsatz von

Salzsäure pH 1,2 erfolgte, um die Magenpassage des Mikrodialysesystems bei niedrigen

pH-Werten zu simulieren. Dies entsprach der vorgesehenen Anwendung bei nüchternen

Probanden, da bei jungen gesunden Personen mehrheitlich pH-Werte zwischen pH 1 und 4

gemessen wurden [12, 13]. Bei dieser Untersuchung sollte sowohl die Integrität der Kapillar-

membran nach Versuchsende als auch die Funktionsfähigkeit der Mikrodialyseeinheit

untersucht werden. Die ermittelten Werte für die relative Wiederfindung von durchschnittlich

71 % bestätigten, dass das Mikrodialysesystem auch bei niedrigen pH-Werten eingesetzt

werden kann. Der verwendete Bicarbonatpuffer pH 6,8 imitierte die Hydrogencarbonat-

sekretion im humanen Dünndarm. Dieses stellt das intestinale Hauptpuffersystem dar und

wird über die Kohlensäure- und Bicarbonatkonzentration gesteuert [64]. Das im Puffer

enthaltene Natriumhydrogencarbonat bildet im wässrigen Milieu Kohlensäure, welche zu CO2

und Wasser dissoziieren kann. Das entstehende CO2 wird dann abgegeben und einzelne

CO2-Bläschen könnten den Stofftransport durch die semipermeable Membran durch

Anheften und Verstopfen einiger Poren beeinträchtigen. Die relative Wiederfindung von

durchschnittlich 69 % stimmte mit dem für Phosphatpuffer pH 6,8 USP gewonnenen

Ergebnis sehr gut überein. Ein Einfluss des enthaltenen Hydrogencarbonats auf die

Funktionsfähigkeit der Mikrodialyseeinheit war somit nicht erkennbar. Die biorelevanten

Medien FaSSIF und FeSSIF simulierten neben dem intestinalen pH-Wert und der

Osmolalität auch den emulgierenden Effekt der Gallensalze während der Dünndarmpassage.

Der Anteil der Gallensalze ist bei FeSSIF, dem postprandialen Medium, um das Fünffache

gegenüber FaSSIF, dem Medium für den nüchternen Dünndarm, erhöht [109, 111, 159].

Beide Medien weisen eine Viskosität auf, die der humanen intestinalen Flüssigkeit aus dem

nüchternen Dünndarm entspricht [160]. Für FaSSIF wurde mit 66 % ein Wert für die relative

Wiederfindung bestimmt, der eine gute Übereinstimmung mit dem Referenzwert aufweist.

Somit war unter den simulierten Testbedingungen des nüchternen Dünndarmes in vitro keine

Diskussion

86

Beeinträchtigung der Funktion des Mikrodialysesystems zu beobachten. Der leicht

verringerte Wert von 63 % für die relative Wiederfindung für FeSSIF könnte auf der erhöhten

Osmolalität des Mediums [111] und damit auf der gegenseitigen Beeinflussung der Moleküle

beim Durchtritt durch die poröse Membran beruhen. Ebenso könnten die Adsorption der

enthaltenen Gallensalze an die Kapillarmembran oder die Verstopfung der Poren durch

selbige zu diesem Ergebnis geführt haben. Auch wenn das Mikrodialysesystem zur

Untersuchung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen im nüchternen Probanden genutzt

werden soll und die Ergebnisse, die mit FaSSIF gewonnen wurden, keine Beeinträchtigung

des Mikrodialysesystems erkennen lassen, sollte der Einfluss einer erhöhten

Gallensalzkonzentration und der Effekt aufgenommener Nahrung in weiteren Experimenten

untersucht werden.

Die Anwendung des Mikrodialysesystems in Studien am Menschen bedingt die Verwendung

von zugelassenen Arzneimitteln. Daraus ergab sich die Notwendigkeit, das bisherige

Perfusat Phosphatpuffer pH 6,8 USP zu ersetzen. Um den Einfluss des Perfusats auf die

Diffusion der Arzneistoffe durch die Kapillarmembran gering zu halten, sollte die

Zusammensetzung des Perfusats soweit wie möglich der Zusammensetzung des äußeren

Kompartiments entsprechen [81]. Zudem sollte der im Perfusat enthaltene Arzneistoff

möglichst schnell und ohne Probenaufarbeitung mit einer einfachen Analysenmethode

quantifizierbar sein. Nach Abwägung der einzelnen Punkte wurde das Perfusat

Phosphatpuffer pH 6,8 USP durch das Fertigarzneimittel Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 %

Braun Infusionslösung (NaCl-Lösung) ersetzt. Die Produktspezifikation des Herstellers gab

den pH-Wert der NaCl-Lösung mit pH 4,5 bis 7,0 an. Um den Einfluss der NaCl-Lösung mit

den möglichen pH-Werten von pH 4,5 bis 7,0 auf die relative Wiederfindung von

Paracetamol, Amoxicillin und Valsartan bestimmen zu können, wurden die NaCl-Lösungen

vor ihrer Verwendung auf pH 4,5 und 7,0 eingestellt. Für Amoxicillin und Valsartan ist die pH-

abhängige Löslichkeit beider Stoffe aufgrund ihrer Ionisierbarkeit bekannt. Allerdings sind

beide Arzneistoffe im Bereich zwischen pH 4,5 und 7,0 mit minimal 5,45 g/L für Amoxicillin

und 0,54 g/L für Valsartan für die durchgeführten Versuche ausreichend gut löslich [103,

106], sodass keine Beeinflussung der Ergebnisse aufgrund von Löslichkeitsproblemen

erwartet wurde. Für beide NaCl-Lösungen und alle Arzneistoffe wurden im Vergleich zum

bisherigen Perfusat ähnliche Werte für die relative Wiederfindung erhalten. Somit kann die

NaCl-Lösung als Perfusat in den geplanten Studien am Menschen verwendet werden.

Diskussion

87

4.2.4 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung biorelevanter Medien

Die vorgesehene In vivo-Anwendung des Mikrodialysesystems führte zur Untersuchung der

Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Verwendung der Medien Salzsäure pH 1,2,

Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und FeSSIF. Der Versuchsablauf mit arzneistofffreiem

Medium im Donor-Kompartiment zu Beginn des Experimentes, Zugabe der Paracetamol-

Lösung und Halbierung der Paracetamol-Konzentration im Donor-Kompartiment wurde, wie

bereits für Phosphatpuffer pH 6,8 USP beschrieben, angewendet. Die Arzneistoff-

konzentration in den Dialysatproben wurde mit dem vorher für Phosphatpuffer pH 6,8 USP

bestimmten Skalierungsfaktor berechnet. Für alle Medien wurden Ergebnisse erhalten, die

mit den theoretischen Werten gut übereinstimmten. Die Detektion von Konzentrations-

erhöhungen und -verringerungen im Donor-Kompartiment erfolgte für alle Medien ohne

erkennbare Verzögerung. Die minimale Abweichung der experimentell ermittelten

Arzneistoffkonzentration in den Dialysatproben die einer Konzentrationsänderung im

äußeren Kompartiment folgten (Probe 6 und 11), war auf die bereits diskutierte manuelle

Zugabe des Mediums innerhalb der einminütigen Equilibrierzeit zurückzuführen und somit

ein Artefakt des Versuchsablaufes.

Für Salzsäure pH 1,2 und die biorelevanten Medien Bicarbonatpuffer pH 6,8, FaSSIF und

FeSSIF wurde die Sensitivität des Mikrodialysesystems bestätigt. Die Ergebnisse belegen,

dass die Funktionsfähigkeit des Mikrodialysesystems im Dünndarmlumen durch die

vorhandenen intestinalen Medien des Gastrointestinaltraktes voraussichtlich nicht

beeinträchtigt wird. Eine nähere Betrachtung weiterer Einflüsse, die aufgrund verschiedener

gastrointestinal sekretierten Flüssigkeiten auftreten können, wie zum Beispiel die

Pufferkapazität oder die Oberflächenspannung, wurde nicht vorgenommen könnte aber

Gegenstand weiter Untersuchungen sein.

4.2.5 Sensitivität des Mikrodialysesystems bei Anwendung im Röhrenmodell

Die Anwendung des Mikrodialysesystems im Röhrenmodell erfolgte, um den In vitro-

Versuchsaufbau besser an die anatomischen Gegebenheiten des menschlichen Organismus

anzupassen. Dabei wurde der Einsatz des Systems im Dünndarm durch die Verwendung

eines Kunststoffschlauches zur Aufnahme der Lösung des Donor-Kompartiments simuliert.

Der Innendurchmesser des Kunststoffschlauches entsprach mit 2 cm annähernd dem

natürlichen Innendurchmesser des Dünndarmes [5]. In Anlehnung an die natürliche

Bewegung der Organe im Bauchraum, bedingt durch die Atmung des Probanden (10 bis

18 Atemzügen pro Minute, [6]), wurde der Kunststoffschlauch leicht bewegt. Für den Versuch

wurden 12 vertikale Bewegungen pro Minute ausgewählt, um eine adäquate Bewegung per

Diskussion

88

Hand ausüben zu können. Die eingesetzten Lösungen wurden mit einem verringerten

Volumen eingesetzt, da das Kunststoffschlauchvolumen nur zur Aufnahme von circa 0,6 L

Medium ausgelegt war. Die verwendeten Paracetamol-Lösungen enthielten den Arzneistoff

in der bislang verwendeten Konzentration, sodass die theoretische Konzentration im Donor-

Kompartiment im Vergleich zu den bisherigen Versuchen identisch war. Für beide

verwendeten Paracetamol-Lösungen konnte, wie in früheren Versuchen bereits nach-

gewiesen, eine Konzentrationserhöhung im Donor-Kompartiment sofort in der nachfolgend

gewonnenen Dialysatprobe detektiert werden. Die experimentell ermittelte Paracetamol-

Konzentration entsprach jedoch nahezu der doppelten theoretischen Konzentration. Die

Zugabe des arzneistofffreien Mediums resultierte in Paracetamol-Konzentrationen in den

Dialysatproben die sich mit leichter Verzögerung dem Nullpunkt näherten. Damit wichen

auch bei dieser Konzentrationsänderung die gemessenen Werte sehr stark von den

theoretischen Werten ab. Für diesen Versuch wurde die Paracetamol-Konzentration im

Donor-Kompartiment ebenfalls in der Nähe der Mikrodialyseeinheit bestimmt und die

ermittelten Werte in die Diagramme eingetragen. Es ist in beiden Diagrammen sehr gut

erkennbar, dass die gemessene Konzentration an der Mikrodialyseeinheit nach Zugabe der

Paracetamol-Lösung nahezu dem Zweifachen der theoretischen Konzentration entsprach.

Die Zugabe des arzneistofffreien Mediums resultierte wiederum in Paracetamol-

Konzentrationen an der Mikrodialyseeinheit, die unterhalb der Bestimmungsgrenze lagen.

Somit entsprach die experimentell ermittelte Paracetamol-Konzentration in den

Dialysatproben annähernd der gemessenen Konzentration an der Mikrodialyseeinheit. Die

unerwarteten Ergebnisse können mit dem Verhalten der Lösung im Kunststoffschlauch

erklärt werden. Zuerst wurde die Mikrodialyseeinheit vom Medium umgeben und der

Kunststoffschlauch manuell mit 12 Bewegungen pro Minute bewegt. Die Paracetamol-

Lösung wurde hinzugefügt, sodass das enthaltene Medium im Kunststoffschlauch weiter

transportiert wurde. Es traten nur geringe Durchmischungseffekte zwischen beiden

Lösungen auf, da die gemessenen Konzentrationen an der Mikrodialyseeinheit nahezu dem

Doppelten der theoretischen Konzentration entsprachen. Die anschließende Zugabe des

arzneistofffreien Mediums resultierte in einem identischen Verhalten der Lösungen. Die

Paracetamol-Lösung wurde weitertransportiert und das nachfolgend zugefügte Medium

umgab die Mikrodialyseeinheit. Der verzögerte Abfall der Paracetamol-Konzentration in den

Dialysatproben nach Zugabe des Mediums ist wahrscheinlich auf die langsamere

Vorwärtsbewegung der Paracetamol-Lösung zurückzuführen, da der Kunststoffschlauch zu

diesem Zeitpunkt zu 70 % mit Lösung gefüllt war. Für diesen Versuchsaufbau konnte die

Sensitivität des Mikrodialysesystems dahingehend bestätigt werden, dass Konzentrations-

änderungen im Donor-Kompartiment gut detektiert wurden und zwar unabhängig davon ob

diese der theoretischen Konzentration entsprachen oder nicht.

Diskussion

89

Mit diesem Versuchsaufbau konnten die physiologischen Bedingungen des Dünndarms nicht

simuliert werden. Der Einfluss der Darmperistaltik hinsichtlich der Durchmischung und des

Vorwärtstransportes der Flüssigkeit wurde nicht berücksichtigt, da die technischen

Möglichkeiten zur Umsetzung nicht vorhanden waren. Der wesentlich relevantere Aspekt des

intestinalen Flüssigkeitshaushaltes wurde in diesem Versuchsaufbau ebenfalls nicht

berücksichtigt, da die bisherige In vitro-Prüfung des Mikrodialysesystems unter idealen

Bedingungen erfolgte. Gleichwohl ist der komplett mit Medium gefüllte Kunststoffschlauch

nicht mit der Flüssigkeitsverteilung im nüchternen Zustand des humanen Dünndarms zu

vergleichen, da freies Wasser bekanntermaßen nur in einzelnen Flüssigkeitsnestern

vorhanden ist [17]. In Abhängigkeit von der Lage der Mikrodialyseeinheit im Dünndarm sind

Arzneistoffkonzentrationen somit mit einer geringeren Sensitivität bestimmbar. Allerdings

wird der Arzneistoff in der vorgesehenen Studie am Menschen mit 240 mL Wasser

verabreicht. Aus MRT-Untersuchungen ist bekannt, dass Wasser schnell aus dem Magen in

den Dünndarm entleert wird [24]. Dies führt zu einem moderaten Volumenanstieg im oberen

Dünndarm, sodass in diesem Bereich ausreichend Wasser für eine normale Funktion des

Mikrodialysesystems zur Verfügung stehen sollte. Die Absorption des Wassers in den

proximalen Dünndarmabschnitten und auch dessen Weitertransport in distale Bereiche

führen dann jedoch zu intestinalen Bedingungen, die in weiteren Experimenten simuliert

werden müssen.


humane Anwendung

4.3.1 Adaption des Mikrodialysesystem

In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed wurde das Mikrodialyse-

system nach erfolgreicher Entwicklung und In vitro-Charakterisierung an die humane

Anwendung angepasst. Dabei wurden die arbeitskreisinternen Vorgaben durch die

Mitarbeiter der Firma RoweMed technisch umgesetzt. Die aseptische Herstellung von

Mikrodialysesets, welche aus jeweils zwei Mikrodialysesystemen bestanden, erfolgte mit

biokompatiblen Bestandteilen, um später eine Zertifizierung als Medizinprodukt durchführen

zu können. Die adaptierten Mikrodialysesets wurden mit einer Länge von 4 m hergestellt.

Dies erfolgte in Anlehnung an die Untersuchungen, die von Gramatté mit ähnlichen

Systemen zur Perfusion und Aspiration durchgeführt wurden [59]. Dabei wurde festgestellt,

dass vor allem für Probanden mit weiblichem Geschlecht sowie mit geringer Körpergröße mit

einer Sondenlänge von 3 m das Caecum erreicht wird. Diese Angabe bezieht sich auf die

Länge des Systems ab Zahnreihe. Für Untersuchungen des Dünndarms und zum Anschluss

Diskussion

90

des Systems an die entsprechenden Pumpen wurde das System auf 4 m verlängert. Um die

Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten, lag der Fokus auf der

Verringerung der Schlauchdurchmesser. Diese weisen bislang einen sehr großen

Außendurchmesser von 2,46 mm für den Luftschlauch und von 3,67 mm für den Zufluss-

und Ablaufschlauch auf. Zu diesem Zweck wurde zuerst der biokompatible Medicoplast-

Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,0 mm und einem Außendurchmesser von

3,0 mm für alle Schläuche des Mikrodialysesystems verwendet. Eine weitere Optimierung

der Schlauchdurchmesser wurde erreicht, indem nachfolgend ausschließlich der Versilic®-

Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1,0 mm und einem Außendurchmesser von

2,0 mm für den Zufluss- und Ablaufschlauch und mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm

und einem Außendurchmesser von 1,5 mm für den Luftschlauch verwendet wurde. Somit

wurde für das adaptierte Mikrodialyseset, bestehend aus zwei Mikrodialysesystemen, ein

Gesamtaußendurchmesser von 5,5 mm erreicht. Im Vergleich zum Außendurchmesser von

jeweils 4,7 und 5,3 mm der zwei Sonden, die von Brouwers et al. zur Aspiration von Proben

an zwei unterschiedlichen Stellen im Dünndarm verwendet wurden [74], ist der Durchmesser

des Mikrodialysesets mit zwei Messstellen stark minimiert worden. Zusätzlich kann bei

Anwendung des Mikrodialysesets auf die doppelte Applikation und Kontrolle der Lokalisation

der Sonden verzichtet werden. Das Mikrodialysesystem wurde auch dahingehend

verbessert, dass die Verbindung der einzelnen Komponenten durch eigens von RoweMed

hergestellte Verbindungsstücke aus dem Silikon Elastosil® erfolgt. Das Stabilisieren der

Schläuche am distalen Ende des Systems, um ein Abknicken der Schläuche zu verhindern

und ein Anbringen des Zuggewichtes zu ermöglichen, erfolgt ebenso mit diesem Silikon. Die

einzelnen Bestandteile wurden ebenfalls mit diesem Silikon verklebt, um die Anzahl der

verwendeten Materialien gering zu halten. Weiterhin wurden die Schläuche des adaptierten

Mikrodialysesystems punktuell untereinander verklebt, um den Einfluss gedehnter Schläuche

weiter zu minimieren. Zusätzlich wurde durch das Verkleben der Verbindungsstücke vor und

nach der Mikrodialyseeinheit mit den vorhandenen Schläuchen, die Mikrodialyseeinheit vor

den eventuell auftretenden Zugkräften geschützt. Dies ist besonders wichtig, da die

Mikrodialysekapillaren die geringste Zugfestigkeit aller verwendeten Bestandteile des

Mikrodialysesets aufweisen.

Diskussion

91


Die Herstellung von adaptierten Mikrodialysesystemen durch die Firma RoweMed erfolgte

ebenfalls in Handarbeit. Anhand von acht Mikrodialysesystemen wurde die

Reproduzierbarkeit der Herstellung durch den Vergleich der Werte der relativen

Wiederfindung untersucht. Gleichzeitig wurde der Einfluss des verwendeten Schlauches

bestimmt, da drei Mikrodialysesysteme mit Medicoplast-Schläuchen und fünf Systeme mit

Versilic®-Schläuchen hergestellt wurden. Nach Durchführung der Versuche konnte kein

Einfluss des verwendeten Schlauches festgestellt werden, da die ermittelten Ergebnisse für

die relative Wiederfindung von Paracetamol mit 65,6 ± 3,2 % für den Medicoplast-Schlauch

und 66,4 ± 3,9 % für den Versilic®-Schlauch keine Unterschiede aufwiesen. Zur Beurteilung

der reproduzierbaren Herstellung durch die Firma RoweMed erfolgte der Vergleich der Werte

für die relative Wiederfindung mit den bisher hergestellten Mikrodialysesystemen. Diese

wiesen für acht Mikrodialysesysteme eine relative Wiederfindung von durchschnittlich

65,6 ± 2,2 % für Paracetamol auf (siehe 3.2.3.2). Das stimmt sehr gut mit der relativen

Wiederfindung von 66,1 ± 3,7 %, die für die acht adaptierten Mikrodialysesysteme erhalten

wurde überein. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Herstellung durch

RoweMed reproduzierbar war und kein Einfluss des verwendeten Schlauches auf die relative

Wiederfindung erkennbar war. Obwohl für Valsartan keine Untersuchungen durchgeführt

wurden, gilt dies auch für Valsartan, da in vorangegangen Adsorptionsuntersuchungen keine

Wechselwirkungen zwischen Valsartan und dem Versilic®-Schlauch erkennbar waren [155].


Dialysatproben

Die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen soll nach oraler Applikation des

Systems erfolgen. Im Rahmen der Applikation wird hierbei zunächst das Zuggewicht

geschluckt. Der Vorwärtstransport des kompletten Mikrodialysesystems erfolgt dann durch

die natürliche Peristaltik des Gastrointestinaltraktes. Die Passage des Pylorus ist dabei von

entscheidender Bedeutung. Wenn das Mikrodialysesystem im Magen verbleibt und sich

große Schlauchmengen im Magen sammeln, kann die korrekte Platzierung der

Mikrodialyseeinheit nicht anhand der Markierung auf den außenliegenden Schläuchen

abgelesen werden. Eine mögliche Ansammlung der Schläuche im Magen kann jedoch durch

das Ziehen am oralen Ende der Schläuche identifiziert und behoben werden [59]. Weiterhin

kann die Lokalisation der Messeinheit über eine fluoroskopische Bestimmung [67, 68, 74]

oder eine zusätzlich gelegte Sonde durch einen Gastroenterologen erfolgen. Dies führt

jedoch zu einer weiteren Belastung für den Probanden. Um dies zu vermeiden, wurde

Diskussion

92

untersucht, ob eine Lagebestimmung der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über

den pH-Wert im Dialysat erfolgen kann. Dafür wurden mögliche pH-Werte des Magens mit

Salzsäure pH 1,2 bis pH 5,0 und des Dünndarmes mit Phosphatpuffer pH 6,8 USP simuliert

[12, 13]. Als Perfusat wurden der bisher verwendete Phosphatpuffer pH 6,8 USP sowie eine

NaCl-Lösung mit pH 5,5, welches annähernd dem mittleren pH-Wert der Isotonen Kochsalz-

Lösung 0,9 % Braun Infusionslösung entsprach, eingesetzt. Die Verwendung von Salzsäure

pH 1,2 und pH 3,0 im Donor-Kompartiment resultierte unabhängig vom verwendeten

Perfusat in pH-Werten in den Dialysatproben, die deutlich unter dem pH-Wert des Donor-

Mediums lagen. Eine Erhöhung des Donor-pH-Wertes auf pH 4,0 oder höher führte zu

ähnlichen pH-Werten in den Dialysatproben im Vergleich zu den originalen pH-Werten des

Perfusats. Somit ist die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit über die pH-metrische Analyse

der Dialysatproben lediglich bestimmbar, wenn der pH-Wert im Magen unter pH 3,0 liegt.

Dies entspricht bei jungen, gesunden Probanden dem mittleren pH-Wert im nüchternen

Zustand [12]. Des Weiteren kann die erfolgreiche Pyloruspassage durch eine Verfärbung des

Dialysates durch die enthaltene Galle identifiziert werden. Die pH-metrische Identifizierung

der Pyloruspassage sowie die Verfärbung des Aspirates durch Galle wurde bereits in

Perfusionsstudien als Indiz für den Übertritt in den Dünndarm genutzt [59]. Da duodenale

Bestandteile jedoch im nüchternen Zustand durch Retropulsion in den Magen gelangen

können [161], ist eine Bestimmung beider Parameter über einen ausreichend langen

Zeitraum nötig. Die Untersuchung von Dialysatproben im Abstand von 5 bis 10 min sollte

nach 30 min ein aussagekräftiges Ergebnis liefern, da innerhalb dieses Zeitraumes

Ausreißer durch Retropulsion oder konstant erhöhte pH-Werte im Dünndarm bestimmbar

sind [12]. Die anschließende Bestimmung der Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im

Dünndarm könnte über die abgelesene Schlauchlänge erfolgen. Ein Austausch des

Zuggewichtes gegen eine ähnlich dimensionierte PillCam® SB [162], einer oral applizierbaren

Kamerakapsel, könnte ebenfalls zur Überprüfung der Lage genutzt werden.


Die bisher mit dem Mikrodialysesystem durchgeführten Untersuchungen wurden mit MCP-

Schlauchpumpen durchgeführt, die für die Nutzung im Labor konzipiert sind. Die Anwendung

des Mikrodialysesystems in humanen Studien erfordert jedoch die Nutzung von CE-

zertifizierten Pumpen, die zum Einsatz am Menschen zugelassen sind. Die Alaris IVAV®

PCAM® Spritzenpumpe, die Braun Infusomat® Space Schlauchpumpe und die Braun

Perfusor® Space Spritzenpumpe entsprechen unter anderem dieser Anforderung. Im

Vergleich zur Alaris IVAV® PCAM® Spritzenpumpe bieten die Pumpen von Braun den Vorteil

Diskussion

93

der Programmierbarkeit. Beide Pumpen der Firma Braun können alternierend im Pump- und

Pausenmodus innerhalb eines Intervalls von 1 min betrieben werden, welches die

Grundvoraussetzung zur Realisierung einer hohen zeitlichen Auflösung in vivo darstellt.

Die Infusomat® Space Schlauchpumpe kann unter Verwendung des Infusomat® Space Line

Sets kontinuierlich betrieben werden, solange das Vorratsgefäß gefüllt ist. Der Transport des

Perfusats im zugehörigen Infusomat® Space Line Set erfolgte ohne Einschränkungen,

wohingegen die Beförderung der Luft zu Problemen mit der Pumpe führte. Sobald die Luft in

der entsprechenden Messzelle der Pumpe detektiert wurde, erfolgte der Luftblasenalarm des

Gerätes und der Betrieb der Pumpe wurde sofort eingestellt. Ein Abschalten dieser Funktion

durch den Hersteller würde zum Verlust der CE-Zertifizierung führen, sodass diese

Möglichkeit nicht in Betracht gezogen werden konnte. Aus diesem Grund wurde untersucht,

ob die Perfusor® Space Spritzenpumpe als Alternative für den Transport der Luft genutzt

werden kann. Das begrenzte Fassungsvermögen einer Perfusor®-Spritze führte zuerst zu

Untersuchungen mit einer 50 mL-Spritze. Dies führte allerdings nicht zur Abtrennung der

gewonnen Dialysatproben im Ablaufschlauch. Die Kompressibilität der Luft führte dazu, dass

die geringen Luftvolumina von 0,5 mL, die je gewonnener Probe zur Abtrennung verwendet

wurden, nicht ausreichten, um die Luft in den Ablaufschlauch zu befördern und dabei die

Dialysatprobe voranzuschieben. Eine Verringerung des aufgezogenen Volumens auf 25 mL

resultierte ebenso in unsauber abgetrennten Proben. Mit einer Minimierung des

aufgezogenen Spritzenvolumens auf 20 und 10 mL konnte dieses Problem behoben werden.

Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Infusomat® Space Schlauchpumpe zum Transport

des Perfusats und die Perfusor® Space Spritzenpumpe zum Abtrennen der Dialysatproben

durch Luft ausgewählt.

Zur Überprüfung der Eignung beider Pumpen hinsichtlich der Anwendung in Kombination mit

dem Mikrodialysesystem wurden Versuche mit einem repräsentativen Mikrodialysesystem

durchgeführt. Als Referenzwert diente die mittlere relative Wiederfindung, die mit den bislang

verwendeten MCP-Schlauchpumpen gewonnen wurde. Der bisher mit den MCP-

Schlauchpumpen genutzte Versuchsablauf, mit einer Equilibrierzeit von 1 min und dem

Transport des Mediums für 18 s bei einer Flussrate von 1 mL/min, musste für die Braun

Pumpen jedoch modifiziert werden. Dies war aufgrund der eingeschränkten

Programmierbarkeit, mit einem automatischen Ablauf von Pump- und Pausenzeiten

innerhalb eines Intervalls von 1 min nötig. Für die durchgeführten Untersuchungen wurden

Equilibrierzeiten von 42 bis 45 s und Pumpzeiten von 15 bis 18 s bei einer Flussrate von

1 mL/min genutzt. Der mit den MCP-Schlauchpumpen ermittelte Referenzwert der relativen

Wiederfindung betrug 69,3 %. Die Ergebnisse, die bei Anwendung der Braun Pumpen

gewonnen wurden, stimmten mit 68,4 bis 70,0 % gut mit dem zuvor bestimmten

Diskussion

94

Referenzwert überein. Die geringe Variation der Werte der Infusomat® und Perfusor® Space

Pumpen ist auf das Zusammenspiel der generell verkürzten Pump- und Equilibrierzeiten

zurückzuführen, wobei eine Verringerung der Equilibrierzeit innerhalb des Intervalls zu einer

gleichzeitigen Erhöhung der Pumpzeit führte. Um möglichst große Dialysatvolumina zur

Arzneistoffquantifizierung zur Verfügung zu haben, sollten die Versuchsabläufe mit einer

Pumpzeit von 17 oder 18 s genutzt werden.

Für die Verwendung in humanen Studien stehen damit zugelassene Pumpen zur Verfügung,

die mit der entsprechenden Programmierung gute Ergebnisse und ein ausreichend großes

Probenvolumen liefern. Als Nachteil ist jedoch das geringe Luftvolumen von maximal 20 mL

in der Spritze zu erwähnen. Für jede Dialysatprobe werden 0,5 mL Luft zum Abtrennen von

der vorherigen Probe genutzt, sodass spätestens nach 40 Proben ein Austausch der Spritze

erfolgen muss. Dafür wird dann eine zweite Perfusor® Space Spritzenpumpe benötigt, da die

vorgeschaltete Programmierung zum Betrieb der Pumpe mehr Zeit in Anspruch nimmt, als

durch die Pause von 30 s zur Verfügung steht.

Zusammenfassung

95

5 Zusammenfassung

Die Applikation von Arzneistoffen erfolgt sehr häufig über die orale Gabe. Die Kenntnis der

Arzneistoffkonzentration im humanen Darm ist somit essentiell für das Verständnis der

oralen Arzneimitteltherapie. Die intestinale Absorption wird von verschiedenen Faktoren

bestimmt. Dazu gehören die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des

Gastrointestinaltraktes sowie die Eigenschaften des Arzneistoffes und der Arzneiform. Das

komplexe Zusammenspiel dieser Faktoren kann die intestinale Konzentration des

Arzneistoffes und folglich dessen Absorption und daraus abgeleitet Wirkung und

Nebenwirkung beeinflussen. Zur Bestimmung der intraluminalen Arzneistoffkonzentration

und zur Charakterisierung des zugehörigen Absorptionsprozesses werden bisher Systeme

und Methoden verwendet, welche die Physiologie des Darmes beeinflussen können oder die

im Rahmen einer chirurgischen Intervention angewendet werden.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung eines

Mikrodialysesystems zur Bestimmung intraluminaler Arzneistoffkonzentrationen im humanen

Dünndarm. Dabei sollte das System die positiven Eigenschaften der bisher verwendeten

Methoden und Systeme kombinieren.

Die verwendeten Materialien wurden so ausgewählt, dass ein flexibles aber dennoch

robustes System aus biokompatiblen Bestandteilen erhalten wurde. Das entwickelte System

kann zudem mit bildgebenden Verfahren, wie der MRT, kombiniert werden. Das neu

entwickelte Mikrodialysesystem besteht letztendlich aus einer Mikrodialyseeinheit sowie

einem Zufluss- und Ablaufschlauch. Die finale Mikrodialyseeinheit ist aus

30 semipermeablen Kapillaren mit einer Austauschlänge von 10 cm zusammengesetzt, über

die der Stoffaustausch zwischen dem Perfusat als Akzeptor-Kompartiment und dem Medium

als Donor-Kompartiment erfolgt. Das System kann hierbei kontinuierlich oder

diskontinuierlich perfundiert werden. Für den diskontinuierlichen Perfusatfluss war es hierbei

nötig, einen zusätzlichen Schlauch in das System zu integrieren, der ein Abtrennen der

gewonnenen Proben im Ablaufschlauch mittels Luftblasen ermöglicht. Die vorgesehene

Anwendung des Mikrodialysesystems in klinischen Studien am Menschen wurde bei dessen

Entwicklung stets berücksichtigt. Die Einbettung der Mikrodialyseeinheit in ein

Schlauchsystem ermöglicht die orale Applikation und vereinfacht damit die Anwendung des

Mikrodialysesystems im Menschen. Mit der Kombination von zwei Mikrodialysesystemen in

einem Set kann weiterhin die gleichzeitige Erfassung von intraluminalen

Arzneistoffkonzentrationen in unterschiedlichen Abschnitten des humanen Darmes erfolgen.

Nach der erfolgreichen Entwicklung des Mikrodialysesystems erfolgte zunächst die

Charakterisierung der Funktionalität des Systems anhand der relativen Wiederfindung des

Zusammenfassung

96

Arzneistoffes in den Dialysatproben. Die Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen

Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan, die aufgrund ihres spezifischen

Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt wurden, und verschiedenen

biorelevanten Donor-Medien sowie Perfusaten durchgeführt. Das Mikrodialysesystem wurde

dabei kontinuierlich oder diskontinuierlich vom Perfusat durchströmt. Bei Verwendung des

diskontinuierlichen Perfusatflusses wurden jedoch vergleichsweise geringere Werte für die

relative Wiederfindung bestimmt. Die Verwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses

resultierte dagegen in einer Equilibrierzeit von 1 bis 60 min, welches einen verlängerten

Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat ermöglichte und somit

zu deutlich höheren relativen Wiederfindungen führte. Außerdem wurden die Proben im

Ablaufschlauch unverzüglich durch die Zufuhr von Luft, die über den zusätzlich enthaltenen

Schlauch zugeführt wurde, separiert. Bei Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses

wurden im Vergleich zum diskontinuierlichen Fluss geringere Werte für die relative

Wiederfindung bestimmt. Ein Anstieg der Equilibrierzeit von 1 auf 5 oder 60 min resultierte

hierbei allerdings nicht in einer deutlichen Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für

Amoxicillin und Valsartan wurden ähnliche Werte für die relative Wiederfindung bestimmt,

während für Paracetamol höhere Werte ermittelt wurden, die mit dem geringeren

Molekulargewicht und der damit verbundenen erhöhten Diffusionsgeschwindigkeit erklärt

werden können. Nachdem ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf die relative

Wiederfindung nachgewiesen wurde, erfolgte die Durchführung der In vitro-Untersuchungen

ausschließlich bei Körpertemperatur.

Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde untersucht, um dessen Eignung für In vivo-

Untersuchungen zu bestimmen. Dabei sollte geprüft werden, ob und wie schnell Änderungen

der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben nachweisbar

sind. Bei Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses erfolgte die Detektion der

Erhöhung und Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment verzögert. Im

Gegensatz dazu konnte bei Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit einer

Equilibrierzeit von 1 min eine Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment sofort in der

nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe nachgewiesen werden. Dies wurde für alle

verwendeten Arzneistoffe bestätigt, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen mit dem

diskontinuierlichen Perfusatfluss und einer Equilibrierzeit von 1 min durchgeführt wurden.

In den folgenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das Mikrodialysesystem

mehrmalig für In vitro-Untersuchungen genutzt werden konnte. Anhand von acht

untersuchten Mikrodialysesystemen für Paracetamol und jeweils vier Mikrodialysesystemen

für Amoxicillin und Valsartan konnte die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialyse-

Zusammenfassung

97

systeme nachgewiesen werden. Die Verwendung unterschiedlicher Donor-Medien und

Perfusate führte zu ähnlichen Ergebnissen.

Die anatomischen Gegebenheiten des Dünndarms wurden durch Untersuchungen in einem

Röhrenmodell simuliert. Erhöhungen oder Verringerungen der Konzentration im Donor-

Kompartiment wurden auch bei dieser Versuchsanordnung ohne zeitliche Verzögerung in

der darauffolgenden Dialysatprobe nachgewiesen. Allerdings entsprach die gemessene

Arzneistoffkonzentration annähernd der doppelten theoretischen Konzentration. Dies beruhte

auf dem Versuchsaufbau, bei dem sich die nacheinander in dem schmalen Kunststoff-

schlauch eingebrachten Lösungen nur minimal vermischten, sodass annähernd deren

Ausgangskonzentration an der Mikrodialyseeinheit vorlag.

In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed erfolgte anschließend die

Adaption des Mikrodialysesystems an die humane Anwendung. Dabei wurden modifizierte

Bestandteile, wie zum Beispiel Schläuche mit verringerten Durchmessern verbaut, um die

Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten. Die reproduzierbare

Herstellung der adaptierten Mikrodialysesysteme im Vergleich zu den eigenen Mikrodialyse-

systemen wurde anhand ähnlicher Ergebnisse für die relative Wiederfindung nachgewiesen.

Die Möglichkeit, die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über die pH-

metrische Analyse der Dialysatproben zu bestimmen, wurde anschließend untersucht. Bis zu

einem pH-Wert von pH 3 kann über den erniedrigten pH-Wert in den Dialysatproben der

Rückschluss auf die Lage im Magen gezogen werden. Dies entspricht dem üblicherweise

ermittelten pH-Wert im Magen von pH 2,7 bei nüchternen jungen, gesunden Probanden.

Abschließend wurde die Eignung der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen, die

zur humanen Anwendung zugelassen sind, für die Nutzung in Kombination mit dem

Mikrodialysesystem überprüft, um in einer Studie am Menschen CE-zertifizierte Geräte

einsetzten zu können. Die beschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen bei der

Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses erforderte eine erneute Modifikation des

Versuchsablaufes. Durch die Reduktion der Pump- und Equilibrierzeiten konnte ein

Versuchsablauf ermittelt werden, der ähnliche Ergebnisse wie mit den bisher verwendeten

Pumpen lieferte.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler

Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in vitro charakterisiert. Die mit dem

Mikrodialysesystem gewonnenen Daten könnten genutzt werden, um zukünftig das

komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren während der Arzneistoffabsorption besser

zu verstehen. Mit diesem Wissen könnten Nebenwirkungen und Wechselwirkungen oral

applizierter Arzneistoffe verringert und deren Bioverfügbarkeit erhöht werden.

Zusammenfassung

98

Literaturverzeichnis

99

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Gastroen; 22 (2006) 124-127.


114

Anhang

115

7 Anhang

7.1 Geräteverzeichnis

Gerät Bezugsquelle

Braun Infusomat® Space Schlauchpumpe B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Braun Perfusor® Space Spritzenpumpe B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Class VP Software Version 4.3 und 6.14 Shimadzu Europa GmbH, Duisburg

Fraktionssammler Pharmacia LKB

FRAC-100 Pharmacia, Uppsala (Schweden)

Horizontalschüttler KL-2 m. Uhr Edmund Bühler GmbH, Tübingen

Ismatec® MCP Schlauchpumpe IDEX Health & Science GmbH, Wertheim

LiChroCART® 4-4 Vorsäule (LiChrosper®

100 RP 18, 5 μm) Merck KGaA, Darmstadt

LiChroCART® 125-4 Säule (LiChrosper®

100 RP 18, 5 μm) Merck KGaA, Darmstadt

Magnetrührer Variomag Telesystem Thermo Fisher Scientific Inc., Langenselbold

Merck Hitachi HPLC-Anlage mit L-6200A

Pumpe, AS-2000A Autosampler, L-5025

Säulenthermostat, L-4250 UV/VIS-Detektor

und D-6000 Controller Interface

Merck KGaA, Darmstadt

pH-Messgerät Mettler Toledo FiveEasyTM

FE20 mit pH-Kunststoffelektrode LE438

Mettler-Toledo AG, Schwerzenbach

(Schweiz)

Shimadzu HPLC-Anlage mit LC-20AT

Pumpe, SGU-20A3 Entgaser, SIL-20A

Autosampler, CTO-10ASVP

Säulenthermostat, und SPD-M20A UV/VIS-

Diodenarray-Detektor und CBM-20A

Systemcontroller

Shimadzu Europa GmbH, Duisburg

Shimadzu UV-mini1240 Shimadzu Europa GmbH, Duisburg

Ultraschallbad 142-6009 VWR

pH-Messelektrode Hamilton® Minitrode Hamilton Bonaduz GmbH, Schweiz

Anhang

116

7.2 Chemikalienverzeichnis

Bezeichnung Bezugsquelle Charge

Amoxicillin-Trihydrat

Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel

AppliChem GmbH, Darmstadt

08G25-M09

2C006763

Calciumchlorid-Dihydrat Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel 10F23-N08

Eisessig Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe 489150478

Kaliumchlorid Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel 09I10-N01

Kaliumdihydrogenphosphat,

wasserfrei


Neolab

1X003040

6264-010

Natriumacetat, wasserfrei Merck KGaA, Darmstadt A0034968946

Natriumchlorid


Caesar & Loretz GmbH, Hilden

Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel

1X009358

09241023

09/10-N01

Isotone Kochsalz-Lösung

0,9 % Braun B. Braun Melsungen AG, Melsungen 124417641

Natriumdihydrogenphosphat-

Monohydrat Merck KGaA, Darmstadt A403446320

Natriumhydrogencarbonat Fagron GmbH & Co. KG, Barsbüttel 08J22-N03

Natriumhydroxid


Merck

Lachema

8T006494

A09915000

502490988

Paracetamol Caesar & Loretz GmbH, Hilden 10065105

Salzsäure Merck KGaA, Darmstadt

Bernd Kraft GmbH, Duisburg

K44568817321

1272038

SIF® Powder Original Biorelevant.com Ltd, Croydon, Surrey

(UK) PHAS1210 045/02

Valsartan Novartis Pharma AG, Basel

(Schweiz) C0015

Anhang

117

7.3 Materialverzeichnis

Bezeichnung Bezugsquelle Charge

Elastosil® M4600 Wacker Chemie AG, München 67350813

Halbmikro-Küvette,

Quarzglas Suprasil® 104-QS Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim -

Hohlfaserkapillaren

Fresenius Polysulfon®

Fresenius SE & Co. KGaA, Bad-

Homburg -

Infusomat® Line Set B. Braun Melsungen AG, Melsungen 1K12218SIB

Loctite® 4011 Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf

L39JAC2404

L31BAB0339

L33LAA4870

Loctite® M-31Cl Henkel AG & Co. KGaA, Düsseldorf LM0CA12922

Medicoplast-Schlauch Medicoplast International GmbH,

Illingen 11140631

20 mL-Spritzen, B. Braun Melsungen AG, Melsungen 0M13048

50 mL-Spritzen, B. Braun Melsungen AG, Melsungen 08H2282028

Titankugeln KGM Kugelfabrik GmbH & Co., Fulda 65731/239/W/

10.05.11

Tygon® 3350-Schlauch;

0,64 mm

Saint-Gobain Performance Plastics,

Beaverton, MI (USA) 687957

Tygon® 3350 2-Stopper-

Schlauch; 0,64 mm



Tygon® 3350-Schlauch;

1,85 mm



Tygon® 3350 2-Stopper-

Schlauch; 1,85 mm



Versilic®-Schlauch; 0,5 mm Saint-Gobain Performance Plastics,

Charny (Frankreich) -

Versilic®-Schlauch; 1,0 mm Saint-Gobain Performance Plastics,

Charny (Frankreich) -

Anhang

118

Publikationen und Kongressbeiträge

119


Publikationen

D. Schönherr, U. Wollatz, D. Haznar-Garbacz, U. Hanke, K.J. Box, R. Taylor, R. Ruiz,

S. Beato, D. Becker, W. Weitschies; Characterisation of selected active agents regarding pKa

values, solubility concentrations and pH profiles by SiriusT3; Eur J Pharm Biopharm; 92

(2015) 155-170.

Kongressbeiträge

Vorträge

D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, S. Beato, D. Becker and W. Weitschies; Intestinal

microdialysis: An experimental challenge to measure local drug concentrations on the

intestinal places of drug absorption; Clinical Pharmacology, a Bridge for Basic Sciences to

Clinical Applications; September 12 - 13, 2013; Greifswald, Germany

D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; Determinanten der

regionalen Substratkonzentration intestinaler Transporter; Initiation-Workshop -

Compartmental Drug Absorption and Transport (COM_DAT): Pharmakokinetische Konzepte

zur individualisierten Medizin; October 26, 2012; Greifswald, Deutschland

D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; A new small intestinal

microdialysis system; 8th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and

Pharmaceutical Technology; March 19 - 22, 2012; Istanbul, Turkey


120

Poster

D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, S. Beato, D. Becker and W. Weitschies; In vitro

characterization of a small intestinal microdialysis system; 9th World Meeting on

Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology; March 31 - April 03,

2014; Lisbon, Portugal

D. Schönherr, U. Wollatz, D. Haznar-Garbacz, U. Hanke, K. J. Box, R. Taylor, R. Ruiz, S.

Beato, D. Becker and W. Weitschies; Determination of pKa values and solubility-pH profiles

of selected ß-blockers; 27th AAPS Annual Meeting and Exposition; November 10 - 14, 2013;

San Antonio, TX, USA

D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; Investigating the

suitability of a new small intestinal microdialysis system in vitro for the determination of drug

concentrations in the small intestine; 26th AAPS Annual Meeting and Exposition; October 14 -

18, 2012; Chicago, IL, USA

D. Schönherr, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; Influence of different

solvents on the applicability of a small intestinal microdialysis system in vivo; Annual Meeting

of the German Pharmaceutical Society; October 11 - 13, 2012; Greifswald, Germany

D. Schönherr, K. Zippert, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies;

Development of a microdialysis system for monitoring of drug concentrations in the small

intestine; 25th AAPS Annual Meeting and Exposition; October 23 - 27, 2011; Washington,

D.C., USA

D. Schönherr, K. Zippert, U. Hanke, W. Siegmund, D. Becker and W. Weitschies; In vitro

establishment of a new microdialysis based system for determination of drug concentrations

in the small intestine; Joint Meeting of the Austrian and German Pharmaceutical Societies;

September 20 - 23, 2011; Innsbruck, Austria

Danksagung

121

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde im Fachbereich Biopharmazie und Pharmazeutische

Technologie des Institutes für Pharmazie der Universität Greifswald unter der Leitung von

Prof. Dr. Werner Weitschies angefertigt. Im Folgenden möchte ich mich für die tatkräftige

Unterstützung, Motivation und die konstruktive Diskussionen bedanken, die maßgeblich zum

Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Werner Weitschies für das entgegengebrachte

Vertrauen, die Überlassung dieses äußerst interessanten und vielversprechenden Themas,

die exzellenten Arbeitsbedingungen, das stete Interesse am Gelingen dieser Arbeit und die

Möglichkeit an nationalen und internationalen Kongressen teilnehmen zu können.

Ein herzliches Dankeschön geht an Dr. Ulrike Hanke für die fachliche und persönliche

Unterstützung bei der Erstellung und Durchsicht von Abstracts, Postern, Manuskripten,

Diplomarbeiten und dieser Promotionsarbeit.

Ich danke Dr. Christian Loch und Dr. Mirko Koziolek für die Durchsicht dieser Arbeit.

Bei Dr. Gunnar Glöckl möchte ich mich für die stete Diskussions- und Hilfsbereitschaft und

die gute Zusammenarbeit im Rahmen des COM_DAT-Projektes bedanken.

Ich danke Sabine Ristow und Thomas Brand für die Unterstützung bei der alltäglichen

Laborarbeit.

Meinen Diplomanden Katrin Zippert, Andrea Gliemann und Ulrike Wollatz sowie meinen

Wahlpflichtstudenten danke ich für ihr Engagement im Labor.

Ich möchte mich weiterhin bei allen aktuellen und ehemaligen Kollegen für die angenehme

Arbeitsatmosphäre im Arbeitskreis Biopharmazie und Pharmazeutische Technologie

bedanken.

Den beteiligten Partnern des COM_DAT-Projektes aus der Pharmakologie, Prof. Dr. Werner

Siegmund, Prof. Dr. Stefan Oswald und Dr. Eberhard Scheuch, von der Novartis Pharma

AG, Dr. Dieter Becker und Stefania Beato, sowie der RoweMed AG, Dr. Dirk Forberger,

Dipl.-Ing. Frank Dietrich, Dipl.-Ing. Jörg Reibert und Dipl.-Ing. Ulf Bahlke, danke ich für die

konstruktive Zusammenarbeit.

Danksagung

122

Für die finanzielle Unterstützung möchte ich mich bei der Novartis Pharma AG sowie dem

Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Projektes COM_DAT

(FKZ: 03IPT612X) ganz herzlich bedanken.

Bei der Fresenius SE & Co. KGaA, Bad-Homburg möchte ich mich für die Bereitstellung der

Fresenius Polysulfon® Hohlfaserkapillaren bedanken.

Ich danke meiner Familie und meinen Freunden für ihr Verständnis und den nie abreißenden

Zuspruch während der gesamten Promotion.

Entwicklung und In vitro-Charakterisierung eines ...

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