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Entwicklung von Markerimpfstoffen gegen die klassische Geflügelpest

Entwicklung von Markerimpfstoffen gegen die klassische Geflügelpest

Walter Fuchs, Katharina Kindermann, Dörte Lüschow, Thomas C. Mettenleiter, Egbert Mundt, Horst Schirrmeier, Elke Starick,

Jens P. Teifke, Jutta Veits, Ortrud Werner und Dorothee Wiesner

Aviäre Influenza A-Viren (AIV)

HA

NA

NP

• Alle bisherigen Geflügelpest-Ausbrüche: H5 oder H7

• V. a. Antikörper gegen HA des entsprechenden Subtyps immunrelevant

• Prophylaktische Immunisierung mit inaktiviertem AIV prinzipiell möglich, aber:

- behindert serodiagnostische Identifizierung Feldvirus-infizierter Tiere

- arbeits- und kostenintensiv

• Orthomyxoviren, segmentiertes Negativstrang-RNA-Genom

• Antigene Virionkomponenten: � Hämagglutinin (HA, 16 Typen)� Neuraminidase (NA, 9 Typen)� Nukleoprotein (NP, 1 Typ)

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Alternative Impfstoffe: Vektor-Vakzinen

HA

• Verwendete Vektoren: Hühnerpockenvirus, Newcastle Disease Virus, Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV)

• Immunisierte Tiere bilden nur HA-spezifische Antikörper � serologisch von natürlich infizierten Tieren unterscheidbar � Marker-Vakzinen

• Aber: Vermitteln Vektor-Impfstoffe ausreichenden Schutz gegen die Geflügelpest ?

Vorteile:

• Genetisch stabiles dsDNA-Genom� Passagierung gentechnisch veränderter Viren

• Großes Genom (> 150 kbp) � Insertion großer oder mehrerer Fremdgene möglich

• Sehr enges Wirtsspektrum (Hühner und Fasanen)� geringes Risiko einer unkontrollierten Ausbreitung

• Virusreplikation im oberen Respirationstrakt � Immunantwort am Eintrittsort

• Eignung von ILT-Lebendvirusvakzinen zur Massenapplikation (Aerosol,Trinkwasser)

Das aviäre Herpesvirus ILTV als Vektor

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A/chicken/Italy/445/99H7N1

UL0(ILTV-spez. Gen)

A/chicken/Italy/8/98H5N2

UL50(dUTPase)

Eingefügtes AIV-GenEntferntes ILTV-Gen

Nachteil:

Bislang eingesetzte Lebendvirusvakzinen genetisch nicht charakterisiert und z.T. nicht stabil attenuiert � Deshalb: Gezielte Deletion möglicher

Virulenzfaktoren

Das aviäre Herpesvirus ILTV als Vektor

H5-Expression durch ILTV-Rekombinanten(Western Blot)

ααααAIV (H5N1)

ααααILTV gC

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H7-Expression durch ILTV-Rekombinanten (Indirekte Immunfluoreszenz)

Durchführung der Tierversuche

0 1 2 3 4 5

Wochen6 7 8

SPF-Hühner(ca.10 Wochen alt)

Morbidität/Mortalität 1-10 d p.i.

Morbidität/Mortalität 1-10 d p.c.

Belastungsinfektion: ILTV-A489 (intratracheal)AIV H5N2, H5N1, H7N1 (okulonasal)

Immunisierung (i.t. oder okulär):ILTV-A489 (WT)ILTV-∆∆∆∆UL50H5ILTV-∆∆∆∆UL0H7

Virusausscheidung (Trachealtupfer 3-5 d p.i.)

Serum-AK gegen ILTV (IFT 14 + 21 d p.i.)

Serum-AK gegen HA (HAH 14 + 21 d p.i.)

Virusausscheidung (Rachen- und Kloakaltupfer2-10 d p.c.;Trachealtupfer 3-5 dpc)

Serum-AK gegen HA (HAH 7, 14 + 21 d p.c.)

Serum-AK gegen NP (ELISA 7, 14 + 21 d p.c.)

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Virulenz und Immunogenität von ILTV-∆∆∆∆UL50HA5

Virulenz und Immunogenität von ILTV-∆∆∆∆UL50HA5

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AIV-Ausscheidung nach Belastungsinfektion

Virulenz und Immunogenität von ILTV ∆∆∆∆UL0-H7

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Virulenz und Immunogenität von ILTV ∆∆∆∆UL0-H7

Wirksamkeit der Immunisierung mit ILTV ∆∆∆∆UL0-H7

d p.c.

Belastung mit AIV A/chicken/Italy/445/99 (H7N1)

0 2 4 6 8 10 12 14

∆∆∆∆UL0-H7N. I.

Klin

isch

er In

dex

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10 12 14

d p.c.

Belastung mit ILTV A489

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AIV-Ausscheidung nach Belastungsinfektion

Belastung mit AIV A/chicken/Italy/445/99 (H7N1)

Induktion HA-spezifischer Serumantikörper

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Eignung von ILTV ∆∆∆∆UL0-H7 als Marker-Vakzine gegen AIV

- Kompetitiver NP-ELISA -

Eignung von ILTV ∆∆∆∆UL0-H7 als DIVA-Vakzine gegen AIV

- Indirekter NP-ELISA -

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Zusammenfassung

� Durch Lebendvirus-Vakzination mit rekombinantem ILTV können Hühner wirksam gegen Belastungsinfektionen mit virulentem ILTV geschützt werden.

� UL50-negatives ILTV ist in vivo nur mäßig attenuiert.

� UL0-negatives ILTV ist in vivo stark attenuiert.

� Die Vakzination mit H5 oder H7 exprimierenden ILTV-Rekombinanten induziert HA-spezifische Antikörper und schützt Hühner gegen letale Belastungs-infektionen mit aviären Influenzaviren der entsprechenden Subtypen.

� Bei mit einer HA-exprimierenden ILTV-Rekombinante immunisierten Tieren kann eine nachfolgende AIV-Infektion anhand der Induktion von Antikörpern gegen das Nukleoprotein serologisch nachgewiesen werden. � Eignung als Marker-Vakzine (DIVA = Differentiation of infected fromvaccinated animals)

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

Publikationen:

D. Lüschow, O. Werner, T. C. Mettenleiter, and W. Fuchs (2001). Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin(H5) gene. Vaccine 19, 4249-4259.

J. Veits, D. Lüschow, K. Kindermann, O. Werner, J. P. Teifke, T. C. Mettenleiter, and W. Fuchs (2003). Deletion of the nonessential UL0 gene of infectious laryngotracheitis (ILT) virus leads to attenuation in chickens, and UL0 mutants expressing influenza virus hemagglutinin (H7) protect against ILT and fowl plague. Journal of General Virology 84, 3343-3352.

Die vorgestellten Arbeiten wurden gefördert durch:

Intervet International B.V.Deutsche Forschungsgemeinschaft